ES2694002T3 - Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante - Google Patents

Abstract

Una variante de un polipéptido original que comprende una región Fc de IgG1 humana, variante que se une a un receptor gamma de Fc III (FcγRIII) con mejor afinidad que el polipéptido original, y donde la variante comprende una región Fc de IgG1 humana variante con al menos una modificación de aminoácido en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360 o 430 de la región Fc, donde la numeración de los residuos de la región Fc corresponde al índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).

Description

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DESCRIPCION

Polipeptido que comprende una region Fc de IgG1 humana variante Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a polipeptidos que comprenden una region de Fc variante. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a polipeptidos que contienen una region de Fc que presentan una alteracion en la funcion efectora como consecuencia de una o mas modificaciones de aminoacidos en la region Fc de los mismos.

Descripcion de la tecnica relacionada

Los anticuerpos son protemas que exhiben especificidad de union a un antfgeno espedfico. Los anticuerpos nativos habitualmente son glicoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada a traves de un puente de disulfuro covalente, aunque el numero de puentes de disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien presenta puentes de disulfuro intra-cadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoacido concretos forman un interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.

El termino “variable” se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y son responsables de la especificidad de union de cada anticuerpo particular por su antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta distribuida uniformemente a traves de los dominios variables de anticuerpos. Esta concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) tanto en el dominio variable de la cadena ligera como en el de la cadena pesada. Las porciones mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando en gran parte una configuracion de lamina p, conectados por tres CDRs, que forman bucles que conectan la estructura de lamina p, y en algunos casos forman parte de la misma. Las CDRs de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FRs y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union de antfgeno de los anticuerpos (vease Kabal et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno, pero presentan varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos de la region constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar los anticuerpos o las inmunoglobulinas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de las mismas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), p.ej., IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. De las diversas clases de inmunoglobulina humana, solo se sabe que activen complemento la IgG1, IgG2, IgG3 e IgM; y la IgG1 e IgG3 median en ADCC mas eficientemente que la IgG2 e IgG4.

En la Figura 1 se muestra una representacion esquematica de la estructura de la IgG1 nativa, en la que se indican varias porciones de la molecula de anticuerpo nativa. La digestion con papama de anticuerpos produce dos fragmentos de union a antfgeno identicos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un unico sitio de union a antfgeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. La estructura cristalina de la region Fc de IgG humana ha sido determinada (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370 (1981)). En moleculas de IgG humana, la region de Fc se genera mediante ruptura con papama N-terminal al Cys 226. La region Fc es fundamental para las funciones efectoras de los anticuerpos.

Las funciones efectoras mediadas por la region Fc del anticuerpo se pueden dividir en dos categonas: (1) funciones efectoras que actuan tras la union del anticuerpo a un antfgeno (estas funciones implican la participacion de la cascada de complemento o de celulas portadoras de receptor de Fc (FcR)); y (2) funciones efectoras que actuan independientemente de la union a antfgeno (estas funciones confieren persistencia en la circulacion y la capacidad de ser transferidas a traves de barreras celulares mediante transcitosis). Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995).

Aunque la union de un anticuerpo al antfgeno requerido tiene un efecto neutralizante que podna evitar la union de un antfgeno extrano a su diana endogena (p.ej., receptor o ligando), la union por sf solo puede no eliminar el antfgeno extrano. Para ser eficaz en la eliminacion y/o destruccion de antfgenos extranos, un anticuerpo debena estar dotado de una elevada afinidad de union a su antfgeno, y de funciones efectoras eficientes.

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Union a receptor de Fc (FcR)

La interaccion de anticuerpos y complejos anticuerpo-antigeno con celulas del sistema immune produce una variedad de respuestas, que incluyen citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (revisado en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol. 2: 77-94 (1995); asf como Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)).

Varias funciones efectoras de anticuerpo estan mediadas por receptores de Fc (FcRs), que se unen a la region de Fc de un anticuerpo. Los FcRs se definen por su especificidad por los isotipos de inmunoglobulina; los receptores de Fc para anticuerpos de IgG se denominan FcyR, para IgE FceR, para IgA FcaR, etc. Se han identificado tres subclases de FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Puesto que cada subclase de FcyR esta codificada por dos o tres genes, y la division de ARN alternativa conduce a multiples transcritos, existe una amplia diversidad de isoformas de FcyR. Los tres genes que codifican la subclase FcyRI (FcyRIA, FcyRIB y FcyRIC) estan agrupados en la region 1q21.1 del brazo largo del cromosoma 1; los genes que codifican las isoformas FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC) y los dos genes que codifican FcyRIII (FcyRIIIA y FcyRIIIB) estan todos agrupados en la region 1q22. Estos subtipos de FcR diferentes se expresan sobre tipos de celulas diferentes (revisado en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Por ejemplo, en humanos, FcyRIIIB solo se observa en neutrofilos, mientras que FcyRIIIA aparece en macrofagos, monocitos, celulas asesinas naturales (NK), y en una subpoblacion de celulas T. Cabe destacar que FcyRIIIA es el unico FcR presente en celulas NK, uno de los tipos celulares implicados en ADCC.

FcyRI, FcyRII y FcyRIII son receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF); FcyRI presenta tres dominios de IgSF en su dominio extracelular, mientras que FcyRII y FcyRIII presentan solo dos dominios de IgSF en sus dominios extracelulares.

Otro tipo de receptor de Fc es el receptor de Fc neonatal (FcRn). El FcRn es similar estructuralmente al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y consiste en una cadena a unida no covalentemente a microglobulina p2.

El sitio de union en los anticuerpos humanos y murinos para FcyR ha sido mapeado previamente en la denominada “region de bisagra inferior” que consiste en los residuos 233-239 (numeracion de mdice EU segun Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Wood et al. Molec. Immunol. 23: 319-330 (1986); Duncan et al. Nature 332:563 (1988); Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 9036-9040 (1991). De los residuos 233-239, el P238 y el S239 han sido citados como posibles participates en la union, pero estos dos residuos nunca han sido evaluados en terminos de sustitucion o eliminacion.

Otras areas citadas previamente posiblemente implicadas en la union a FcyR son: G316-K338 (IgG humana) para FcyRI humano (solo por comparacion de secuencia; no se evaluaron mutantes de sustitucion) (Woof et al. Molec. Immunol. 23: 319-330 (1986)); K274-R301 (IgG1 humana) para FcyRIII humano (basada en peptidos) (Sarmay et al., Molec. Immunol. 21: 43-51 (1984)); Y407-R416 (IgG humana) para FcyRIII humano (basada en peptidos) (Gergely et al. Biochem. Soc. Trans. 12: 739-743 (1984)); asf como N297 y E318 (IgG2b murina) para FcyRiI murino (Lund et al., Molec. Immunol., 29:53-59 (1992)).

El residuo Pro331 en IgG3 se cambio a Ser, y se analizo la afinidad de esta variante por las celulas diana. Se observo que la afinidad era seis veces inferior a la de IgG3 no mutada, lo que indica la participacion del Pro331 en la union a FcyRI. Morrison et al., Immunologist, 2: 119-124 (1994); y Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-91 (1991).

Union de C1q

C1q y dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1, el primer componente de la ruta de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). C1q es una molecula hexavalente con un peso molecular de aproximadamente 460.000 y una estructura que se asemeja a un ramillete de tulipanes en la que seis “tallos” colagenosos estan conectados a seis regiones de cabeza globular. Burton y Woof, Advances in Immunol. 51: 1-84 (1992). Para activar la cascada de complemento, es necesario que el C1q se una a al menos dos moleculas de IgG1, IgG2 o IgG3 (el consenso es que IgG4 no activa complemento), pero solo a una molecula de IgM, unida a la diana antigenica. Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) en la pagina 80.

En base a los resultados de modificaciones qmmicas y estudios cristalograficos, Burton et al. (Nature, 288: 338-344 (1980)) propusieron que el sitio de union para el subcomponente de complemento C1q en IgG implica al menos dos cadenas-p (C-terminales) del dominio CH2. Burton sugirio mas tarde (Molec. Immunol., 22(3): 161-206 (1985)) que la region que comprende los residuos de aminoacido 318 a 337 podna estar implicada en la fijacion de complemento.

Duncan y Winter (Nature 332: 738-40 (1988)), usando mutagenesis sitodirigida, publicaron que los residuos Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de union a C1q. Los datos de Duncan y Winter fueron generados evaluando la union a un isotipo IgG2b de raton a C1q de cobaya. Se confirmo el papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys322 en la union de C1q a traves de la capacidad de un peptido sintetico corto que contema dichos residuos para inhibir la lisis mediada por complemento. Se describen resultados similares en la Patente de EE.UU. n° 5.648.260, emitida el 15 de julio de 1997, y en la Patente de EE.UU. n° 5.624.821 emitida el 29 de abril de 1997.

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El residuo Pro331 ha sido implicado en la union a C1q mediante el analisis de la capacidad de subclases de IgG humana para llevar a cabo la lisis celular mediada por complemento. La mutacion de Ser331 a Pro331 en IgG4 confirio la capacidad de activar complemento. (Tao et al., J. Exp. Med., 178: 661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24: 2542-47 (1994)).

A partir de la comparacion de los datos del grupo de Winter, y de los artfculos de Tao et al. y Brekke et al., Ward y Ghetie concluyeron en su artfculo de revision que existen al menos dos regiones diferentes implicadas en la union de C1q: una sobre la cadena p del dominio CH2 que porta los residuos Glu318, Lys320 y Lys322, y la otra a su vez localizada en estrecha proximidad a la misma cadena p, y que contiene un residuo de aminoacido clave en la posicion 331.

Otros informes sugirieron que los residuos de IgG1 humana Leu235 y Gly237, localizados en la region de bisagra inferior, desempenan una funcion cntica en la fijacion y activacion de complemento. Xu et al., Immunol. 150: 152A (Resumen) (1993). El documento WO94/29351, publicado el 22 de diciembre de 1994, indica que los residuos de aminoacido necesarios para la union de C1q y FcR de IgG1 humana estan localizados en la region N-terminal del dominio CH2, es decir, los residuos 231 a 238.

Se ha propuesto adicionalmente que la capacidad de la IgG para unirse a C1q y activar la cascada de complemento tambien depende de la presencia, ausencia o modificacion del resto de carbohidrato posicionado entre los dos dominios de CH2 (que normalmente esta anclado en Asn297). Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) en la pagina 81.

El documento US-A-5624821 se refiere a anticuerpos con funciones efectoras alteradas y evalua la union de mutantes de IgG2b murina y de IgG3 a FcyRI humano. Los mutantes Ala234, Glu235, Ala236 y Ala237 presentaron una afinidad reducida por FcyRI en comparacion con el anticuerpo natural (original). Adicionalmente, los mutantes de IgG2b murinos son evaluados para determinar la union a C1q. Los mutantes Glu318Ala, Lys320Ala y Lys322Ala presentaron una afinidad drasticamente reducida por C1q.

El documento WO 98/23289 se refiere a moleculas de IgG mutante que presentan secuencias de aminoacido alteradas en la region de union a FcRn y propone mutaciones en las regiones de IgG de raton y de IgY de pollo para la union a FcRn.

Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15: 637-640 (1997) trata sobre la afinidad creciente de un fragmento de Fcy1 murino para la union a FcRn murino mediante mutagenesis aleatoria de Thr252, Thr254 y Thr256.

Medesan et al., Eur. J. Immunol., 28: 2092-2100 (1998) describe fragmentos de bisagra de Fc de rata mutados y estudia la interaccion de IgG de rata con FcRn de rata.

Henry et al., Biochemistry, 36: 15568-15578 (1997) han investigado la implicacion de residuos concretos en el dominio Ce3 de IgE en su interaccion con FceRI.

Sarmay et al., Mol. Immunol. mayo de 1992; 29(5): 633-9 informa sobre anticuerpos espedficos de 3-iodo-4-hidroxi- 5-nitrofenacetilo (NIP) que fueron comparados en terminos de induccion de lisis dependiente de anticuerpos de globulos rojos derivatizados con NIP efectuada mediante celulas pre-estimuladas U937 o HL-60 y mediante celulas K. Los anticuerpos quimericos presentan cadenas pesadas que corresponden a las subclases de IgG humana 1-4, e incluyen mutantes sito-dirigidos de IgG3, asf como la forma aglicosilada de IgG3; tambien se examino un anticuerpo de IgG2b de raton y una IgG2b mutante sito-dirigida. Las celulas U937 o HL-60 estimuladas con rIFN expresan niveles incrementados de Fc gamma R1 en comparacion con las celulas no estimuladas; las celulas HL-60 y U937 estimuladas con PMA expresan un nivel incrementado de Fc gamma R11 en comparacion con las celulas no estimuladas, y las celulas K expresan Fc gamma R111.

El documento WO 99/51642 (publicado el 14.10.1999) describe variantes de anticuerpo que presentan una funcion efectora alterada y que comprenden una region de Fc de IgG humana que presenta una sustitucion de aminoacido en una o mas de las posiciones de aminoacido 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 o 334.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una variante de un polipeptido original que comprende una region Fc de IgG1 humana variante como se define en las reivindicaciones 1-8. El polipeptido variante puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o una inmunoadhesina. La region Fc del polipeptido original preferiblemente comprende una region Fc humana; p.ej., una region de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. El polipeptido variante preferiblemente comprende una modificacion de aminoacido (p.ej., una sustitucion) en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

Adicionalmente, la invencion proporciona un polipeptido que comprende una region Fc de IgG humana variante con una afinidad de union a receptor gamma de Fc (FcyR) alterada, polipeptido que comprende una modificacion de aminoacido en uno cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267,

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312, 315, 320, 324, 326, 327, 330, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 313, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416,

419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde

al mdice EU de Kabat. La region Fc de IgG humana variante es, p.ej. una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana variante. En relacion a esto, cabe destacar que en el trabajo de la tecnica citada anteriormente donde el polipeptido tema una region Fc murina no humana, se pensaba que residuos diferentes a los identificados en la presente memoria teman un impacto sobre la union a FcR. Por ejemplo, en el sistema FcyRII murino/IgG2b murina, se observo que el E318 de IgG era importante para la union (Lund et al. Molec. Immunol. 27(1): 53-59 (1992)), mientras que el residuo E318A no presentaba efecto en el sistema FcyRII humano/IgG humana (ver Tabla 6 mas adelante).

En una realizacion, el polipeptido variante con actividad de union a FcyRI alterada presenta una union reducida a un FcyR y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 324, 327, 333, 335, 338,

340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc, donde la numeracion de los

residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

Por ejemplo, el polipeptido variante puede presentar una union reducida a un FcyRI y comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 238, 265, 269, 270 o 327 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

El polipeptido variante puede presentar una union reducida a un FcyRII y comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

El polipeptido variante de interes puede presentar una union reducida a un FcyRIII y comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 265, 288, 269, 270, 272,

278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 327, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la region Fc,

donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

En otra realizacion, el polipeptido variante con una afinidad de union a FcyR alterada presenta una union mejorada al FcyR y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 255,

256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 333, 334,

337, 340, 360, 378, 398 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

Por ejemplo, el polipeptido variante puede presentar una union incrementada a un FcyRIII y, opcionalmente, puede presentar ademas una union reducida a un FcyRII. Un ejemplo de dicha variante comprende una(s) modificacion(es) de aminoacido en la(s) posicion(es) 298 y/o 333 de la region Fc, en donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

El polipeptido variante puede presentar una union incrementada a un FcyRII y comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 337, 340, 378, 398 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat. Dichos polipeptidos variantes con union incrementada a un FcyRII pueden presentar opcionalmente una union reducida a un FcyRIII y pueden, por ejemplo, comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 268, 272, 298, 301 o 340 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

La invencion proporciona ademas un polipeptido que comprende una region Fc variante con una afinidad de union a receptor de Fc neonatal (FcRn) alterada, polipeptido que comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 253, 255, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat. Dichos polipeptidos variantes con union reducida a un FcRn pueden comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, donde la numeracion del residuo en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat. Los polipeptidos variantes mencionados anteriormente, alternativamente, presentan una union incrementada a FcRn y comprenden una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos en la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat.

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende el polipeptido variante y un vehmulo o diluyente fisiologica o farmaceuticamente aceptable. Dicha composicion para potencial uso terapeutico es esteril y puede ser liofilizada.

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Los polipeptidos variantes descritos en la presente memoria son adecuados para usos diagnosticos y terapeuticos. En una aplicacion diagnostica, un metodo para determinar la presencia de un antigeno de interes comprende exponer una muestra que se sospecha que contiene el antigeno al polipeptido variante y determinar la union del polipeptido variante a la muestra. En una aplicacion terapeutica, el tratamiento de un mairnfero que padece o que tiene predisposicion a una enfermedad o trastorno, comprende la administracion al mai^ero de una cantidad terapeuticamente efectiva de un polipeptido variante como el descrito en la presente memoria, o de una composicion que comprende el polipeptido variante y un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

La invencion proporciona ademas: un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido variante; un vector que comprende el acido nucleico, opcionalmente, ligado operativamente a secuencias de control reconocidas por una celula hospedante transformada con el vector; una celula hospedante que contiene al vector; un metodo para producir el polipeptido variante que comprende cultivar dicha celula hospedante de tal modo que el acido nucleico sea expresado y, opcionalmente, recuperar el polipeptido variante del cultivo de celula hospedante (p.ej., del medio de cultivo de celula hospedante).

La invencion proporciona ademas un metodo para fabricar una region Fc variante con afinidad de union mejorada a receptor III de Fcy (Fcy RIII), o una actividad de citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC) mejorada, que comprende:

(a) Introducir una o mas modificaciones de aminoacido en una region Fc de un polipeptido original a fin de generar una region Fc variante;

(b) Identificar una region Fc variante con afinidad de union a Fcy RIII mejorada, o con una actividad de ADCC mejorada.

La invencion trata adicionalmente sobre un metodo para fabricar una region Fc variante tal como se define en las reivindicaciones.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: es una representacion esquematica de una IgG nativa. Los puentes de disulfuro se representan mediante lmeas gruesas entre los dominios CH1 y CL y los dos dominios CH2. V es dominio variable; C es dominio constante; L significa cadena ligera y H significa cadena pesada.

Figura 2: muestra la union a C1q de anticuerpo C2B8 natural (wt, del ingles “wild-type”); anticuerpo C2B8 con una region constante de IgG2 humana (IgG2); y las variantes K322A, K320A y E318A.

Figura 3: muestra la union a C1q de las variantes P331A, P329A y K322A.

Figuras 4A y 4B: muestran las secuencias de aminoacidos del anticuerpo anti-IgE E27, cadena ligera (Fig. 4A; SEQ ID NO:1) y cadena pesada (Fig. 4B; SEQ ID NO:2).

Figura 5: es un diagrama esquematico del “complejo inmune” preparado para uso en el ensayo de FcR descrito en el Ejemplo 1. Se muestra el hexamero que comprende tres moleculas de anticuerpo anti-IgE (el “polipeptido que contiene region Fc”) y tres moleculas de IgE (la “primera molecula diana”). IgE tiene dos “sitios de union” para el anticuerpo anti-IgE (E27) en la region Fc del mismo. Cada molecula de IgE del complejo es capaz ademas de unirse a dos moleculas de VEGF (“el segundo polipeptido diana”). VEGF tiene dos “sitios de union” para IgE.

Figura 6: muestra los resultados de union a C1q obtenidos para las variantes D270K y D270V en comparacion con C2B8 natural.

Figura 7: muestra la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de las variantes D270K y D270V, en comparacion con C2B8 natural.

Figura 8: muestra los resultados de ELISA de union a C1q para anticuerpo C2B8 natural producido en celulas 293 (293-Wt-C2B8), anticuerpo C2B8 natural producido en CHO (CHO-Wt-C2B8) y varios anticuerpos variantes.

Figura 9: muestra los resultados de ELISA de union a C1q obtenidos para C2B8 natural (wt) y varios anticuerpos variantes determinados en el Ejemplo 3.

Figura 10: muestra la estructura tridimensional de una region Fc de IgG humana, destacando los residuos: Asp270, Lys326, Pro329, Pro331, Lys322 y Glu333.

Figura 11: muestra los resultados de ELISA de union a C1q obtenidos para C2B8 natural y varios anticuerpos variantes determinados en el Ejemplo 3.

Figura 12: muestra los resultados ELISA de union a C1q obtenidos para C2B8 natural y variantes dobles, K326M- E333S y K326A-E333A.

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Figura 13: muestra la CDC de C2B8 natural y de variantes dobles, K326M-E333S y K326A-E333A.

Figura 14: muestra los resultados ELISA de union a C1q obtenidos para C2B8 con una IgG4 humana (IgG4), C2B8 natural (Wt-C2B8), C2B8 con una region constante de IgG2 humana (IgG2), y los anticuerpos variantes descritos en el Ejemplo 3.

Figuras 15A y 15B: muestra modelos de union de anticuerpo original (E27) a FcyRIIB y FcyRIIIA. La Figura 15A muestra el modelo de union para la IgG1 de E27 anti-IgE humanizada como monomero (drculos huecos), hexamero (cuadrados rellenos), y complejo inmune que consiste en hexameros multiples (triangulos rellenos) a una protema de fusion GST de la subunidad a de receptor FcyRIIB (CD32). El complejo hexamerico (cuadrados rellenos) se formo mediante la mezcla de concentraciones molares iguales de E27 (que se une a la region Fc de IgE humana) y una IgE de mieloma humano. El hexamero es un complejo estable de 1,1 kD que consiste en 3 moleculas de IgG (de 150 kD cada una) y 3 moleculas de IgE (de 200 kD cada una). El complejo inmune (triangulos rellenos) se formo secuencialmente mezclando en primer lugar concentraciones equimolares de E27 y de IgE anti-VEGF recombinante (IgE humana con dominios variables de Fab que se unen a VEGF humano) para formar el hexamero. A continuacion los hexameros fueron unidos para formar un complejo inmune mediante la adicion de 2x concentracion molar de VEGF humano, un homodfmero de 44 kD que tiene dos sitios de union para la IgE anti-VEGF por mol de VEGF. La Figura 15B muestra el modelo de union a una protema de fusion GST recombinante de la subunidad a de receptor FcyRIIIA (CD16).

Figura 16A: muestra la union de complejos inmunes usando diferentes pares antfgeno-anticuerpo a protema de fusion GST recombinante de la subunidad a de receptor FcyRIIA. La Figura 16B muestra la union de los mismos pares antfgeno-anticuerpo a la protema de fusion GST de la subunidad a de receptor FcyRIIIA. Los drculos rellenos representan la union de IgE humana:IgG1 E27 anti-IGE; los drculos huecos representan la union de VEGF humano:IgG1 anti-VEGF humanizada.

Figura 17: resume las diferencias en selectividad de union de algunas variantes de alanina entre los diferentes FcyRs. Se muestra la union de variantes de alanina en residuos del dominio CH2 de la IgG1 E27 anti-IgE con FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA. El Tipo 1 suprime la union a los tres receptores: D278A (265 en numeracion EU). El Tipo 2 mejora la union a FcyRIIA y FcyRIIB, mientras que la union a FcyRIIIA no se ve afectada: S280A (267 en numeracion EU). El Tipo 3 mejora la union a FcyRIIA y FcyRIIB, pero reduce la union a FcyRIIIA: H281A (268 en numeracion EU). El Tipo 4 reduce la union a FcyRIIA y FcyRIIB, aunque mejora la union a FcyRIIIA: S317A (298 en numeracion EU). El Tipo 5 mejora la union a FcyRIIIA, pero no afecta a la union a FcyRIIA y FcyRIIB: E352A, K353A (333 y 334 en numeracion EU).

Figuras 18A y 18B: comparan el ensayo de protema/protema FcyRIIIA y el ensayo basado en celula de CHO GPI- FcyRIIIA, respectivamente. La Figura 18A ilustra la union de variantes de alanina seleccionadas a protema de fusion FcyRIIIA-GsT. S317A (298 en numeracion EU) y S317A/K353A (298 y 334 en numeracion EU) se unen mejor que la E27 natural, mientras que D278A (265 en numeracion EU) suprime casi completamente la union. La Figura 18B ilustra que se obtiene un modelo de union similar en celulas CHO que expresan una forma ligada a GPI recombinante de FcyRIIIA.

Figuras 19A y 19B: comparan el ensayo de protema/protema FcyRIIB y el ensayo basado en celula de CHO GPI- FcyRIIB, respectivamente. La Figura 19a ilustra la union de variantes de alanina seleccionadas a protema de fusion FcyRIIB-GsT. H281A (268 en numeracion EU) se une mejor que la E27 natural, mientras que S317A (298 en numeracion EU) presenta una union reducida. La Figura 19B ilustra que se obtiene un modelo de union similar en celulas CHO que expresan una forma ligada a GPI recombinante de FcyRIIB.

Figura 20: muestra sustituciones individuales de alanina en el dominio CH2 de IgG1 anti-HER2 (HERCEPTIN®) que influyen en la union a FcyRIIIA en celulas efectoras de celula mononuclear de sangre periferica (PBMC). El anti-HER2 humanizado recombinante (HERCEPTIN®), que se une a celulas tumorales de mama SK-BR-3 que expresan HER2, fue preincubado con celulas SK-BR-3 marcadas con 51Cr durante 30 minutos (opsonizacion) a 100 ng/mL (drculos rellenos) y 1,25 ng/mL (cuadrados rellenos). Manteniendo constante la concentracion de celulas diana tumorales SK- BR-3, se incremento la ratio de celulas efectoras desde 0 hasta 100. La citotoxicidad espontanea en ausencia de anticuerpo (cuadrados rayados) fue del 20% para una ratio efector:diana (E:T) de 100:1. Una mutacion individual de alanina que no afecto a la union de FcyRIIIA, la variante G31 = R309A (292 en numeracion EU), no efectuo ADCC (triangulos rellenos). Una mutacion individual de alanina que solo aumento ligeramente la union a FcyRIIIA, la variante G30 = K307A (290 en numeracion EU), tambien presento una ADCC ligeramente mejorada (es decir, una mejora de 1,1 veces en la actividad de ADCC, calculada como el area bajo la curva) a 1,25 ng/mL para todas las ratios E:T (diamantes rellenos) en comparacion con el anticuerpo natural a 1,25 ng/mL (cuadrados rellenos). Una mutacion individual de alanina que redujo la union a FcyRIIIA, la variante G34 = Q312A (295 en numeracion EU), tambien mostro una actividad ADCC disminuida (triangulos invertidos rellenos).

Figura 21: ilustra que una mutacion individual de alanina que presento la mayor mejora en la union a FcyRIIIA, la variante G36 = S317A (298 en numeracion EU), en los ensayos de protema-protema y basados en celula tambien mostro la mayor mejora en ADCC (triangulos rellenos) de todas las variantes con respecto a la natural (cuadrados rellenos) a 1,25 ng/mL. G36 mostro una mejora de 1,7 veces en la actividad de ADCC, calculada como el area bajo la

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curva. Las variantes G17 = E282A (269 en numeracion EU) y G18 = D283A (270 en numeracion EU) mostraron ambas una union reducida a FcyRIIIA, as^ como una eficacia reducida en ADCC. Las celulas efectoras fueron PBMCs.

Figura 22A: muestra alineamientos de regiones Fc de IgG de secuencia nativa. Se muestran las secuencias de region Fc de IgG humana de secuencia nativa, humIgGI (alotipos A y no A) (SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente), humIgG2 (SEQ ID NO:5), humIgG3 (SEQ ID NO:6) y humIgG4 (SeQ ID NO:7). La secuencia IgGl humana es el alotipo no A, y las diferencias entre esta secuencia y el alotipo A (en las posiciones 356 y 358; sistema de numeracion EU) se muestran debajo de la secuencia IgG1 humana. Tambien se muestran las secuencias de region Fc de IgG murina de secuencia nativa, murIgGI (SEQ ID NO:8), murIgG2A (SEQ ID NO:9), murIgG2B (SEQ ID NO:10) y murIgG3 (SEQ ID NO:11). La figura 22B muestra el porcentaje de identidad entre las secuencias de region Fc de la Figura 22A.

Figura 23: muestra alineamientos de secuencias de region Fc de IgG humana de secuencia nativa, humIgGI (alotipos A y no A; SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente), humIgG2 (SEQ ID NO:5), humIgG3 (SEQ ID NO:6) y humIgG4 (SEQ ID NO:7), marcando con asteriscos las diferencias entre secuencias.

Figura 24: muestra el area bajo la curva (UAC, del ingles “area under curve”) para variantes seleccionadas en comparacion con IgG1 anti-HER2 (HERCEPTIN®) en un ensayo de ADCC de 4 horas. Las celulas efectoras fueron PBMCs (N=5). La variante G36 (S317A; 298 en numeracion EU) con union mejorada a FcyRIIIA mostro una actividad mejorada de ADCC; la variante G31 (R309A; 292 en numeracion EU) que no presento una union alterada a FcyRIIIA, tampoco presento actividad alterada de ADCC; y la G14 (D265A; 278 en numeracion EU) que presento una union reducida a FcyRIIIA, tambien presento una actividad reducida de ADCC.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

I. Definiciones

A lo largo de la presente especificacion y reivindicaciones, la numeracion de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina corresponde al mdice EU, segun Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). El “mdice EU de Kabat” se refiere a la numeracion de residuos del anticuerpo IgG1 EU.

Un “polipeptido original” es un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacido que carece de una o mas de las modificaciones de la region Fc descritas en la presente memoria, y que difiere en la funcion efectora con respecto a un polipeptido variante como el descrito en la presente memoria. El polipeptido original puede comprender una region Fc de secuencia nativa o una region Fc con modificaciones de secuencia de aminoacidos pre-existentes (tal como adiciones, eliminaciones y/o sustituciones).

El termino “region Fc” se usa para definir una region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, p.ej., tal como se muestra en la Figura 1. La “region Fc” puede ser una region Fc de secuencia nativa o una region Fc variante. Aunque las fronteras de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la region Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente se define desde un residuo de aminoacido en la posicion Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la misma. La region Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1.

El “dominio CH2” de una region Fc de IgG humana (tambien referido como dominio “Cy2”) normalmente se extiende desde aproximadamente el aminoacido 231 hasta aproximadamente el aminoacido 340. El dominio CH2 es unico en que no esta emparejado estrechamente con ningun otro dominio. En su lugar, dos cadenas de carbohidrato ramificadas N-ligadas se interponen entre los dos dominios CH2 de una molecula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).

El “dominio CH3” comprende la serie de residuos C-terminales a un dominio CH2 de una region Fc (es decir, desde aproximadamente el residuo de aminoacido 341 hasta aproximadamente el residuo de aminoacido 447 de una IgG).

Una “region Fc funcional” posee una “funcion efectora” de una region Fc de secuencia nativa. Los ejemplos de “funciones efectoras” incluyen union a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; union a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulacion a la baja de receptores de superficie celular (p.ej., receptor de celula B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la region Fc este combinada con un dominio de union (p.ej., un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos como los descritos en la presente memoria, por ejemplo.

Una “region Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de una region Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa se muestran en la Fig. 23 e incluyen una region Fc de IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos A y no A); una region Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; una region Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y una region Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, asf como las variantes naturales de las mismas. Las regiones Fc murinas de secuencia nativa se muestran en la Fig. 22A.

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Una “region Fc variante” comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la de una region Fc de secuencia nativa en virtud a al menos una “modificacion de aminoacido” tal como se define en la presente memoria. Preferiblemente, la region Fc variante tiene al menos una sustitucion de aminoacido con respecto a una region Fc de secuencia nativa o con respecto a la region Fc de un polipeptido original, p.ej., entre aproximadamente una y aproximadamente diez sustituciones de aminoacido, y preferiblemente entre aproximadamente una y aproximadamente cinco sustituciones de aminoacido en una region Fc de secuencia nativa o en la region Fc del polipeptido original. La region Fc variante en la presente memoria preferiblemente poseera al menos un 80% de homologfa con respecto a una region Fc de secuencia nativa y/o con respecto a una region Fc de un polipeptido original, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de homologfa con respecto a las mismas, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de homologfa con respecto a las mismas.

“Homologfa” se define como el porcentaje de residuos de la secuencia de aminoacidos variante que son identicos tras alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para alcanzar el maximo porcentaje de homologfa. Los metodos y los programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la tecnica. Uno de dichos programas de ordenador es “Align 2”, propiedad de Genentech, Inc., que fue presentado con documentacion de usuario en la “United States Copyright Office”, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.

El termino “polipeptido que contiene region Fc” se refiere a un polipeptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina (ver las definiciones mas adelante), que comprende una region Fc.

Los terminos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Ademas, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y formas alternativamente divididas de dichos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activante”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que presentan secuencias de aminoacido similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmicos. El receptor activante FcyRIIA contiene una estructura de activacion basada en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene una estructura de inhibicion basada en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmico. (Vease la revision M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Se pueden encontrar revisiones sobre FcRs en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, quedan contemplados por el termino “FcR” de la presente memoria. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

“Citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo” y “ADCC” se refieren a una reaccion con mediacion celular en la que celulas citotoxicas no espedficas que expresan FcRs (p.ej., celulas asesinas naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) reconoce el anticuerpo ligado sobre una celula diana y a continuacion provocan la lisis de la celula diana. Las celulas principales en la mediacion de ADCC, las celulas NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 de la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991).

“Celulas efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o mas FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. Preferiblemente, las celulas expresan al menos FcyRIII y llevan a cabo la funcion efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), celulas asesinas naturales (NK), monocitos, celulas T citotoxicas y neutrofilos; siendo las preferidas las PBMCs y las celulas NK. Las celulas efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, p.ej., a partir de sangre o de PBMCs como se describe en la presente memoria.

Un polipeptido variante con afinidad de union a FcR o actividad de ADCC “alterada” es aquel que presenta actividad de union a FcR y/o actividad de ADCC aumentada o disminuida con respecto a un polipeptido original o un polipeptido que comprende una region de Fc de secuencia nativa. El polipeptido variante que “presenta una union aumentada” a un FcR se une a al menos un FcR con una afinidad mejor que el polipeptido original. El polipeptido variante que “presenta una union disminuida” a un FcR, se une a al menos un FcR con una afinidad peor que un polipeptido original. Dichas variantes que presentan una union disminuida a un FcR pueden poseer una union pequena o no apreciable a un FcR, p.ej., 0-20% de union al FcR en comparacion con una region Fc de IgG de secuencia nativa, p.ej., tal como se determina en los Ejemplos de la presente memoria.

El polipeptido variante que se une a un FcR con una “afinidad mejor” que un polipeptido original, es aquel que se une a uno cualquiera o mas de los FcRs identificados anteriormente con una afinidad de union sustancialmente mejor que el anticuerpo original, cuando las cantidades de polipeptido variante y de polipeptido original en el ensayo de union son esencialmente las mismas. Por ejemplo, el polipeptido variante con una afinidad de union a FcR mejorada puede presentar una mejora de entre aproximadamente 1,15 veces y aproximadamente 100 veces, p.ej., entre aproximadamente 1,2 veces y aproximadamente 50 veces, en la afinidad de union a FcR en comparacion con el polipeptido original, donde la afinidad de union a FcR se determina, por ejemplo, como se describen en la presente memoria en los Ejemplos.

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El polipeptido variante que “media en la citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC) en presencia de celulas efectoras humanas mas efectivamente” que un anticuerpo original es aquel que in vitro o in vivo es sustancialmente mas efectivo mediando en la ADCC, cuando las cantidades de polipeptido variante y anticuerpo original usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Generalmente, dichas variantes se identificaran usando el ensayo de ADCC in vitro como se ha descrito en la presente memoria, pero se contemplan otros ensayos y metodos para determinar la actividad de ADCC, p.ej., en un modelo animal, etc. La variante preferida es mas efectiva entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 100 veces, p.ej., entre aproximadamente dos veces y aproximadamente cincuenta veces, en la mediacion de la ADCC que el original, p.ej. en el ensayo in vitro descrito en la presente memoria.

Una “modificacion de aminoacidos” se refiere a un cambio en la secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos predeterminada. Los ejemplos de modificaciones incluyen una sustitucion, insercion y/o eliminacion de aminoacidos. La modificacion de aminoacidos preferida en la presente memoria es una sustitucion.

Una “modificacion de aminoacido en” una posicion especificada, p.ej., de la region Fc, se refiere a la sustitucion o eliminacion del residuo especificado, o a la insercion de al menos un residuo de aminoacido adyacente al residuo especificado. Por insercion “adyacente” a un residuo especificado se entiende la insercion a una distancia de uno o dos residuos del mismo. La insercion puede ser N-terminal o C-terminal con respecto al residuo especificado.

Una “sustitucion de aminoacido” se refiere al reemplazo de al menos un residuo de aminoacido existente de una secuencia de aminoacidos predeterminada por otro residuo de aminoacido de “reemplazo” diferente. El residuo o residuos de reemplazo pueden ser “residuos de aminoacido naturales” (es decir, codificados por el codigo genetico) y se seleccionan del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); acido aspartico (Asp); cistema (Cys); glutamina (Gln); acido glutamico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). Preferiblemente, el residuo de reemplazo no es cistema. La sustitucion con uno o mas residuos de aminoacido no naturales tambien se contempla en la definicion de una sustitucion de aminoacido de la presente memoria. Un “residuo de aminoacido no natural” se refiere a un residuo, diferente a los residuos naturales enumerados anteriormente, que es capaz de unirse covalentemente a residuo(s) de aminoacido adyacentes en una cadena de polipeptido. Los ejemplos de residuos de aminoacido no naturales incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros analogos de residuo de aminoacido tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991). Para generar dichos residuos de aminoacido no naturales, se pueden usar los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y Ellman et al., ver anterior. Resumidamente, estos procedimientos implican activar qmmicamente un tARN supresor con un residuo de aminoacido no natural seguido de la transcripcion in vitro y la traduccion del ARN.

Una “insercion de aminoacido” se refiere a la incorporacion de al menos un aminoacido en una secuencia de aminoacidos predeterminada. Aunque la insercion normalmente consistira en la insercion de uno o dos residuos de aminoacido, la presente solicitud contempla mayores “inserciones de peptido”, p.ej., la insercion de aproximadamente tres a aproximadamente cinco o incluso hasta aproximadamente diez residuos de aminoacido. El(los) residuo(s) insertado(s) puede(n) ser natural(es) o no natural(es), tal como se ha discutido anteriormente.

Una “eliminacion de aminoacido” se refiere a la eliminacion de al menos un residuo de aminoacido de una secuencia de aminoacidos predeterminada.

“Region de bisagra” se define generalmente como la cadena entre Glu216 y Pro230 de la IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando los residuos de cistema primero y ultimo formando puentes S-S inter-cadena pesada en las mismas posiciones.

La “region de bisagra inferior” de una region Fc normalmente se define como la cadena de residuos inmediatamente C-terminal a la region de bisagra, es decir, los residuos 233 a 239 de la region Fc. Antes de la presente invencion, la union de FcyR se atribda generalmente a los residuos de aminoacido de la region de bisagra inferior de una region Fc de IgG.

“C1q” es un polipeptido que incluye un sitio de union para la region Fc de una inmunoglobulina. C1q junto a dos serina proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1, el primer componente de la ruta de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). El C1q humano se puede adquirir comercialmente, p.ej., en Quidel, San Diego, cA.

El termino “dominio de union” se refiere a la region de un polipeptido que se une a otra molecula. En el caso de un FcR, el dominio de union puede comprender una porcion de una cadena de polipeptido del mismo (p.ej., una cadena a el mismo) que es responsable de la union a una region Fc. Un dominio de union util es el dominio extracelular de una cadena a de FcR.

El termino “anticuerpo” se usa en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (p.ej., anticuerpos bi-espedficos), y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biologica deseada.

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“Fragmentos de anticuerpo”, tal como se define para el proposito de la presente invencion, comprende una porcion de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye la region de union a antigeno o variable del anticuerpo intacto o la region Fc de un anticuerpo que retiene la capacidad de union a FcR. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multi-espedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo preferiblemente retienen al menos parte de la cadena y opcionalmente la region CH1 de una cadena pesada de IgG. Mas preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo retienen la region constante completa de una cadena pesada de IgG, e incluyen una cadena ligera de IgG.

El termino “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades menores. Adicionalmente, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un determinante individual del antigeno. El modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo de ser obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe considerarse que requiera la produccion del anticuerpo mediante ningun metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar segun la presente invencion pueden prepararse mediante el metodo del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinante (vease, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” tambien pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen espedficamente anticuerpos “quimericos” (inmunoglobulinas) en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadenas son identicas u homologas a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada (Patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (p.ej., murinos) son anticuerpos quimericos que contienen secuencias irnnimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la region estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se observan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Dichas modificaciones se realizan para mejorar los resultados del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina humana y todos o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op., Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

El termino “region hipervariable” cuando se usa en la presente memoria se refiere a los residuos de aminoacido de un anticuerpo que son responsables de la union a antfgeno. La region hipervariable comprende residuos de aminoacido de una “region determinante de la complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un “lazo hipervariable” (es decir, los residuos 2632 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Residuos “estructurales” o “FR” son aquellos residuos del dominio variable que no son residuos de la region hipervariable, tal como se ha definido en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino “inmunoadhesina” designa moleculas de tipo anticuerpo que combinan el “dominio de union” de una protema “adhesina” heterologa (p.ej., un receptor, ligando o enzima) con un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de la secuencia de aminoacidos de adhesina con la especificidad de union deseada que es diferente al sitio de reconocimiento y union de antfgeno (sitio de combinacion de antfgeno) de un anticuerpo (es decir, es “heterologa”) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.

El termino “dominio de union de ligando” tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier receptor de superficie celular nativo o cualquier region o derivado del mismo que retenga al menos un capacidad cualitativa de union a ligando de un receptor nativo correspondiente. En una realizacion espedfica, el receptor procede de un polipeptido de superficie celular que tenga un dominio extracelular que sea homologo para un miembro de la

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supergenefamilia de inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son miembros de la supergenefamilia de inmunoglobulinas, pero aun as^ quedan cubiertos espedficamente por esta definicion, son los receptores de citocinas, y en particular los receptores con actividad de tirosina quinasa (receptor tirosina quinasas), miembros de las superfamilias de receptores de hematopoyetina y factor de crecimiento nervioso, y moleculas de adhesion celular, p.ej., selectinas (E, L y P).

El termino “dominio de union de receptor” se usa para designar cualquier ligando nativo correspondiente a un receptor, que incluye moleculas de adhesion a celulas, o cualquier region o derivado de dicho ligando nativo que retenga al menos una capacidad cualitativa de union a receptor de un ligando nativo correspondiente. Esta definicion, entre otros, incluye espedficamente secuencias de union de ligandos para los receptores mencionados anteriormente.

Una “quimera de anticuerpo-inmunoadhesina” comprende una molecula que combina al menos un dominio de union de un anticuerpo (tal como se define en la presente memoria) con al menos una inmunoadhesina (tal como se define en esta solicitud). Los ejemplos de quimeras de anticuerpo-inmunoadhesina son las quimeras bi-espedficas CD4-IgG descritas en Berg et al., PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) y Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 (1994).

Un polipeptido “aislado” es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferinan con usos diagnosticos o terapeuticos del polipeptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos protemicos o no protemicos. En las realizaciones preferidas, el polipeptido se purificara (1) hasta mas de un 95% en peso de polipeptido, determinado mediante el metodo de Lowry, y lo mas preferiblemente hasta mas de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoacidos mediante el uso de un secuenciador de copa de giro, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tincion de plata. El polipeptido aislado incluye el polipeptido in situ dentro de celulas de celulas recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipeptido no estara presente. De forma ordinaria, sin embargo, el polipeptido aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.

“Tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapeutico y profilactico como a medidas preventivas. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen tanto a los que ya tienen el trastorno como a aquellos en los que se quiere prevenir el trastorno.

Un “trastorno” es cualquier afeccion que se beneficiana del tratamiento con el polipeptido variante. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas, que incluyen aquellas afecciones patologicas que predisponen al mairnfero al trastorno en cuestion. En una realizacion, el trastorno es cancer.

Los terminos “cancer” y “canceroso” se refieren o describen la afeccion fisiologica en mai^eras que se caracteriza tfpicamente por un crecimiento celular incontrolado. Los ejemplos de cancer incluyen, aunque sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celula escamosa, cancer de pulmon de celula pequena, cancer de pulmon de celula no pequena, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestintal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hngado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandula salivar, cancer de rinon, cancer de tngado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer tiroideo, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.

Un “cancer que expresa HER2” es aquel que comprende celulas que tienen la protema de receptor HER2 (Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (numero de acceso de Genebank X03363)) presente en sus superficies celulares, de tal modo que un anticuerpo anti-HER2 es capaz de unirse al cancer.

La palabra “etiqueta” cuando se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto o composicion detectable que se conjuga directa o indirectamente con el polipeptido. La etiqueta puede ser detectable en sf misma (p.ej., etiquetas de radioisotopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimatica, puede catalizar la alteracion qmmica de un compuesto o composicion sustrato que es detectable.

Una molecula de acido nucleico “aislada” es una molecula de acido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la cual se encuentra habitualmente asociada en la fuente natural de acido nucleico de polipeptido. Una molecula de acido nucleico aislada es diferente a la forma o presentacion en la que se encuentra en la naturaleza. Las moleculas de acido nucleico aislado, por tanto, se distinguen de la molecula de acido nucleico tal cual existe en las celulas naturales. Sin embargo, una molecula de acido nucleico aislado incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que habitualmente expresan el polipeptido, donde, por ejemplo la molecula de acido nucleico se encuentra en una localizacion cromosomica diferente de la de las celulas naturales.

La expresion “secuencias de control” se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificadora ligada operativamente de un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un

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sitio de union a ribosoma. Las celulas eucariotas son conocidas por utilizar promotores, senales de poliadenilacion y potenciadores.

El acido nucleico esta “ligado operativamente” cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o lfder secretor esta ligado operativamente a ADN correspondiente a un polipeptido si se expresa como una pre-protema que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosoma esta ligado operativamente a una secuencia codificadora si esta posicionada de tal modo que facilite la traduccion. Generalmente, “ligado operativamente” significa que las secuencias de ADN que estan siendo ligadas son contiguas, y, en el caso de un lfder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La union se logra mediante ligacion en sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o ligandos de oligonucleotido sinteticos de acuerdo a la practica convencional.

Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones “celula”, “lmea celular” y “cultivo celular” se usan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen la progenie. De este modo, las palabras “transformantes” y “celulas transformadas” incluyen la celula objetivo primaria y los cultivos derivados de la misma, independientemente del numero de transferencias. Debe entenderse que toda la progenie puede no ser precisamente identica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica buscada en la celula transformada originalmente. Cuando se pretenden usar designaciones distintas, quedara claro por el contexto.

El termino “complejo molecular” cuando se usa en la presente memoria se refiere a la estructura relativamente estable que se forma cuando dos o mas moleculas heterologas (p.ej., polipeptidos) se unen unas a otras (preferiblemente de forma no covalente). En la presente memoria el complejo molecular preferido es un complejo inmune.

“Complejo inmune” se refiere a la estructura relativamente estable que se forma cuando al menos una molecula diana y al menos un polipeptido que contiene region Fc heterologa se unen uno al otro formando un complejo de mayor peso molecular. Los ejemplos de complejos inmunes son agregados antfgeno-anticuerpo y agregados de molecula diana- inmunoadhesina. El termino “complejo inmune” tal como se usa en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, se refiere a un complejo ex vivo (es decir, diferente a la forma o presentacion en la que se puede encontrar en la naturaleza). Sin embargo, el complejo inmune puede administrarse a un mairnfero, p.ej. para evaluar la eliminacion del complejo inmune en el mamnfero.

El termino “molecula diana” se refiere a una molecula, habitualmente un polipeptido, que es capaz unirse a una molecula heterologa y que tiene uno o mas sitios de union para la molecula heterologa. El termino “sitio de union” se refiere a una region de una molecula a la cual se puede unir otra molecula. La “primera molecula diana” en la presente memoria comprende al menos dos sitios de union distintos (por ejemplo, de dos a cinco sitios de union separados) para un analito (p.ej., un polipeptido que contiene una region Fc) de tal modo que al menos dos moleculas de analito se pueden unir a la primera molecula diana. Se prefiere que los dos o mas sitios de union sean identicos (p.ej., que tengan la misma secuencia de aminoacidos, donde la molecula diana es un polipeptido). En el Ejemplo 1 incluido mas adelante, la primera molecula diana era IgE y tema dos sitios de union separados en su region Fc, a los cuales se podfa unir el polipeptido que contiene region Fc (un anticuerpo anti-IgE, E27). Otras primeras moleculas diana incluyen dfmeros de monomeros sustancialmente identicos (p.ej., neurotrofinas, IL8 y VEGF) o son polipeptidos que comprenden dos o mas cadenas de polipeptidos sustancialmente identicas (p.ej., anticuerpos o inmunoadhesinas). La “segunda molecula diana” comprende al menos dos sitios de union distintos (por ejemplo, de dos a cinco sitios de union separados) para la primera molecula diana, de tal modo que al menos dos primeras moleculas diana se pueden unir a la segunda molecula diana. Preferiblemente, los dos o mas sitios de union son identicos (p.ej., tienen la misma secuencia de aminoacidos, donde la molecula diana es un polipeptido). En el Ejemplo 2, la segunda molecula diana fue VEGF, que tiene un par de sitios de union distintos a los cuales se podfa unir el dominio variable del anticuerpo de IgE. Se contemplan otras segundas moleculas diana, p.ej., otros dfmeros de monomeros sustancialmente identicos (p.ej., neurotrofinas o IL-8) o polipeptidos que comprenden dos o mas dominios sustancialmente identicos (p.ej., anticuerpos o inmunoadhesinas).

Un “analito” es una sustancia que va a ser analizada. El analito preferido es un polipeptido que contiene region Fc que va a ser analizado para determinar su capacidad de union a un receptor de Fc.

Un “receptor” es un polipeptido capaz de unirse a al menos un ligando. El receptor preferido es un receptor de superficie celular que tiene un dominio de union a ligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (p.ej., dominio transmembrana, dominio intracelular y/o ancla de membrana). El receptor a evaluar en el ensayo descrito en la presente memoria puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (p.ej., una protema de fusion que comprende el dominio de union del receptor fusionado a uno o mas polipeptidos heterologos). Ademas, el receptor a evaluar en terminos de propiedades de union puede estar presente en una celula o estar aislado y opcionalmente cubriendo una placa de ensayo o alguna otra fase solida.

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La frase “receptor de baja afinidad” denota un receptor que tiene una afinidad de union debil por un ligando de interes, p.ej., que tiene una constante de union de aproximadamente 50 nM o una afinidad peor. Los ejemplos de receptores de baja afinidad incluyen FcyRII y FcyRIII.

II. Modos de llevar a la practica la invencion

La invencion de la presente memoria se refiere a un metodo para fabricar un polipeptido variante. El polipeptido “original”, “inicial” o “no variante” se prepara usando tecnicas disponibles en la tecnica para generar polipeptidos que comprenden una region Fc. En la realizacion preferida de la invencion, el polipeptido original es un anticuerpo y los metodos de ejemplo para generar anticuerpo se describen con mas detalle en las siguientes secciones. Sin embargo, el polipeptido original puede ser cualquier otro polipeptido que comprende una region Fc, p.ej., una inmunoadhesina. Los metodos para fabricar inmunoadhesinas se elaboran con mas detalle en la presente memoria mas adelante.

En una realizacion alternativa, se puede generar una region Fc variante segun los metodos descritos en la presente memoria y dicha “region Fc variante” puede fusionarse a un polipeptido heterologo seleccionado, tal como un dominio variable de anticuerpo o un dominio de union de un receptor o ligando.

El polipeptido original comprende una region Fc. Generalmente la region Fc del polipeptido original comprendera una region Fc de secuencia nativa, y preferiblemente una region Fc de secuencia nativa humana. Sin embargo, la region Fc del polipeptido original puede presentar una o mas alteraciones o modificaciones de secuencia de aminoacidos pre-existentes respecto a una region Fc de secuencia nativa. Por ejemplo, la actividad de union C1q de la region Fc puede haber sido alterada previamente (mas adelante se describen en detalle otros tipos de modificaciones de region Fc). En una realizacion adicional la region Fc del polipeptido original es “conceptual” y, aunque no exista ffsicamente, el ingeniero de anticuerpos puede decidir sobre una secuencia de aminoacidos de region Fc variante deseada y generar un polipeptido que comprende dicha secuencia, o un ADN que codifica la secuencia de aminoacido de region Fc variante deseada.

Sin embargo, en la realizacion preferida de la invencion, se dispone de un acido nucleico que codifica una region Fc de un polipeptido original, y dicha secuencia de acido nucleico es alterada para generar una secuencia de acido nucleico variante que codifica la region Fc variante.

El ADN que codifica una secuencia de aminoacido variante del polipeptido inicial se prepara mediante una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Dichos metodos incluyen, aunque sin limitacion, preparacion mediante mutagenesis sito-dirigida (o mediada por oligonucleotido), mutagenesis de PCR, y mutagenesis de casete de un ADN preparado anteriormente que codifica el polipeptido.

La mutagenesis sito-dirigida es un metodo preferido para preparar variantes de sustitucion. Esta tecnica es bien conocida en el campo (vease, p.ej., Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)). Resumidamente, para llevar a cabo la mutagenesis sito-dirigida de ADN, el ADN de partida es alterado en primer lugar hibridando un oligonucleotido que codifica la mutacion deseada a una cadena individual de dicho ADN de partida. Tras la hibridacion, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena entera, usando el oligonucleotido hibridado como cebador, y usando la cadena individual del ADN de partida como plantilla. De este modo, el oligonucleotido que codifica la mutacion deseada es incorporado en el ADN de cadena doble resultante.

La mutagenesis de PCR tambien es adecuada para fabricar secuencias de aminoacido variantes del polipeptido de partida. Vease Higuchi, en PCR Protocols, pag. 177-183 (Academic Press, 1990); y Vallete et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). Resumidamente, cuando se usan cantidades pequenas de ADN plantilla como material de partica en una PCR, se pueden usar cebadores que difieren ligeramente en secuencia respecto a la region correspondiente de un ADN plantilla para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN espedfico que difiere de la secuencia de plantilla solo en las posiciones en las que los cebadores difieren de la plantilla.

Otro metodo para preparar variantes, la mutagenesis de casete, se basa en la tecnica descrita por Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985). El material de partida es el plasmido (u otro vector) que comprende el ADN polipeptido de partica que va a ser mutado. El(los) codon(es) del ADN de partida a mutar es(son) identificado(s). Debe haber un unico sitio de restriccion de endonucleasa en cada lado del sitio(s) de mutacion identificado(s). Si no existen dichos sitios de restriccion, pueden ser generados usando el metodo de mutagenesis mediada por oligonucleotido descrito anteriormente para introducirlos en las posiciones apropiadas del ADN polipeptido de partida. El ADN plasmido se corta en dichos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleotido de cadena doble que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restriccion, pero que contiene la(s) mutacion(es) deseada(s), usando procedimientos estandar, donde las dos cadenas del oligonucleotido se sintetizan por separado y a continuacion se hibridan juntas usando tecnicas estandar. Este oligonucleotido de cadena doble se denomina casete. Dicha casete se disena para tener extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plasmido linealizado, de tal modo que se pueden ligar directamente al plasmido. Dicho plasmido contiene ahora la secuencia de ADN mutado.

Alternativamente, o adicionalmente, se puede determinar la secuencia de aminoacido deseada que codifica un polipeptido variante, y se puede generar sinteticamente una secuencia de acido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoacido variante.

La secuencia de aminoacido del polipeptido original se modifica para generar una region Fc variante con una afinidad o actividad de union a receptor Fc alterada in vitro y/o in vivo y/o una actividad de citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC) alterada in vitro y/o in vivo.

Generalmente, la modificacion incluye una o mas sustituciones de aminoacido. En una realizacion, el residuo de 5 reemplazo no se corresponde con un residuo presente en la misma posicion en cualquiera de las regiones Fc de secuencia nativa de la Figura 22A. Por ejemplo, segun esta realizacion, Pro331 de una region Fc de IgG3 o IgG1 humana es reemplazado por un residuo diferente a Ser (el residuo alineado correspondiente observado en la secuencia nativa de la IgG4 humana). En una realizacion, el residuo del polipeptido original que es sustituido con un residuo de reemplazo no es una alanina y/o no es el residuo Ala339 de una region Fc. En el caso de una sustitucion 10 de aminoacido, preferiblemente el residuo del polipeptido original es reemplazado por un residuo de alanina. Sin embargo, la presente invencion contempla el reemplazo del residuo en el polipeptido original con cualquier otro residuo de aminoacido. La sustitucion puede ser, por ejemplo, una “sustitucion conservadora”. Dichas sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el tttulo de “sustitucion preferida”. Se pueden lograr cambios mas sustanciales haciendo una o mas “sustituciones ejemplares” que no son la sustitucion preferida de la Tabla 1.

15 Tabla 1

Residuo original

Ejemplos de sustituciones Sustitucion preferida

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gin; asn lys

Asn(N)

gin; his; lys; arg gln

Asp(D)

glu glu

Cys(C)

ser ser

Gin (Q)

asn asn

Glu (E)

asp asp

Gly (G)

pro; ala ala

His (H)

asn; gln; lys; arg arg

Ile (I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)

norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K)

arg; gln; asn arg

Met (M)

leu; phe; ile leu

Phe (F)

leu; val; ile; ala; tyr leu

Pro (P)

ala ala

Ser (S)

thr thr

Thr (T)

ser ser

Trp (W)

tyr; phe tyr

Tyr (Y)

trp; phe; thr; ser phe

Val (V)

ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Se pueden obtener modificaciones sustanciales en las propiedades biologicas de la region Fc seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipeptido en el area de la sustitucion, por ejemplo, como una helice o con conformacion helicoidal; (b) la carga o la hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen 20 en grupos en base a propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofobicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofflicos neutros: cys, ser, thr;

(3) acidos: asp, glu;

(4) basicos: asp, glu;

(5) residuos que influyen en la orientacion de la cadena: gly, pro; y

(6) aromaticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras comprenderan el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Los ejemplos de sustituciones de aminoacido conservadoras y no conservadoras se incluyen 5 en la Tabla 8 de la presente memoria.

Como se demuestra en el Ejemplo 4 de la presente memoria, se puede disenar una region Fc variante con una afinidad de union alterada con uno o mas FcRs. Como se muestra en dicho Ejemplo, se pueden preparar diferentes clases de variantes de region Fc, p.ej., como resume en la siguiente tabla. Cuando la region Fc variante tiene mas de una sustitucion de aminoacido, generalmente, pero no necesariamente, se combinan sustituciones de aminoacido en la 10 misma clase para alcanzar el resultado deseado.

Tabla 2

CLASES DE VARIANTES DE REGION Fc

Clase

Propiedad de union a FcR Posicion de la(s) sustitucion(es) de region Fc

1A

union reducida a todos los FcyR 238*, 265, 269, 270, 297°, 327, 329*,

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union reducida a FcyRII y FcyRIII 239*, 294, 295, 303, 338, 373, 376, 416, 435

2

union mejorada a FcyRII y FcyRIII 256, 290, 312, 326, 330, 339*, 378, 430

3

union mejorada a FcyRII y no efecto en la union a FcyRIII 255, 258, 267, 276, 280, 283, 285, 286, 305, 307, 309, 315. 320, 331, 337, 398

4

union mejorada a FcyRII y union reducida a FcyRIII 268, 272, 301, 322*, 340

5

union reducida a FcyRII y no efecto en la union a FcyRIII 292, 324, 335, 414, 419, 438, 439

6

union reducida a FcyRII y union mejorada a FcyRIII 298, 333

7

no efecto en la union a FcyRII y union reducida a FcyRIII 248, 249, 252, 254, 278, 289, 293, 296, 338, 382, 388, 389, 434, 437

8

no efecto en la union a FcyRII y union mejorada a FcyRIII 334, 360

° version desglicosilada * no segun la invencion # Preferiblemente combinada con otra(s) modificacion(es) de region Fc (p.ej., como las descritas en la presente memoria)

Aparte de las sustituciones de aminoacido, la presente invencion contempla otras modificaciones de la secuencia de aminoacidos de la region Fc original a fin de generar una region Fc variante con funcion efectora alterada.

Por ejemplo, se puede eliminar uno o mas residuos de aminoacido de la region Fc a fin de reducir la union a un FcR. 15 Generalmente, se eliminara uno o mas de los residuos de la region Fc identificados en la presente memoria como responsables de la union a FcR (vease mas adelante el Ejemplo 4) a fin de generar dicha region Fc variante. Generalmente, no se eliminaran mas de entre uno y aproximadamente diez residuos de la region Fc segun esta realizacion de la invencion. La region Fc de la presente memoria que comprende una o mas eliminaciones de aminoacidos preferiblemente retendra al menos aproximadamente el 80%, y preferiblemente al menos 20 aproximadamente el 90%, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, de la region Fc original o de una region Fc humana de secuencia nativa.

Tambien se pueden preparar regiones Fc variantes de insercion de aminoacido, variantes que presentan una funcion efectora alterada. Por ejemplo, se puede introducir al menos un residuo de aminoacido (p.ej., de uno a dos residuos de aminoacido y generalmente no mas de diez residuos) adyacentes a una o mas de las posiciones de region Fc 25 identificadas en la presente memoria como responsables de la union a FcR. Con “adyacente” se pretende indicar a una distancia de uno o dos residuos de aminoacido de un residuo de la region Fc identificado en la presente memoria. Dichas regiones Fc variantes pueden presentar una union mejorada o disminuida a FcR y/o una actividad de ADCC mejorada o disminuida. Para generar dichas variantes de insercion, se puede evaluar una estructura de co-cristal de un polipeptido que comprende una region de union de un FcR (p.ej., el dominio extracelular del FcR de interes) y la 30 region Fc en la que el(los) residuo(s) de aminoacido van a ser insertados (vease, por ejemplo, Deisenhofer, Biochemistry 20(9): 2361-2370 (1981); y Burmeister et al., Nature 342: 379-383, (1994)) a fin de disenar

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racionalmente una region Fc variante con, p.ej., una capacidad de union a FcR mejorada. Dicha(s) insercion(es) generalmente se haran en un bucle de la region Fc, pero no en la estructura secundaria (es decir, en una cadena p) de la region Fc.

Introduciendo las modificaciones de secuencia de aminoacido apropiadas en una region Fc original, se puede generar una region Fc variante que (a) medie en la citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC) en presencia de celulas efectoras humanas mas eficientemente y/o (b) se una a un receptor Fc gamma (FcyR) con una mejor afinidad que el polipeptido original. Dichas regiones Fc variantes generalmente comprenderan al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc. La combinacion de modificaciones de aminoacido se cree que es particularmente deseable. Por ejemplo, la region Fc variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc. sustituciones en su interior, p.ej., de las posiciones de la region Fc identificadas en la presente memoria.

Preferiblemente, la region Fc del polipeptido original es una region Fc humana, p.ej., una region Fc humana de secuencia nativa de las regiones Fc de IgG1 (alotipos A y no A), IgG2, IgG3 o IgG4 humanas. Dichas secuencias se muestran en la Figura 23.

Para generar una region Fc con una actividad ADCC mejorada, el polipeptido original preferiblemente presenta una actividad ADCC pre-existente, p.ej., comprende una region de Fc de IgG1 humana o de IgG3 humana. En una realizacion, la variante con ADCC mejorada media en la ADCC de forma sustancialmente mas efectiva que un anticuerpo con una region de Fc de IgG1 o IgG3 de secuencia nativa y que la region de union a antfgeno de la variante. Preferiblemente, la variante comprende, o consta esencialmente de, sustituciones de dos o tres de los residuos de la posiciones 298, 333 y 334 de la region Fc. Lo mas preferiblemente, los residuos de las posiciones 298, 333 y 334 son sustituidos, (p.ej., por residuos de alanina). Ademas, a fin de generar la region Fc variante con una actividad ADCC mejorada, se puede disenar de forma general una region Fc variante con una afinidad de union mejorada a FcyRIII, que se cree que es un FcR importante en la mediacion de la ADCC. Por ejemplo, se puede introducir una modificacion de aminoacido (p.ej., una sustitucion) en la region Fc original en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 para generar dicha variante. La variante con una afinidad de union a FcyRIII mejorada puede ademas presentar una afinidad de union a FcyRII reducida, especialmente una afinidad reducida de union al receptor FcyRIIB.

La(s) modificacion(es) de aminoacido se introducen preferiblemente en el dominio CH2 de una region Fc, ya que los experimentos de la presente memoria indican que el dominio CH2 es importante para la actividad de union a FcR. Ademas, al contrario que lo indicado por la tecnica citada anteriormente, la presente solicitud contempla la introduccion de una modificacion en una parte de la region Fc distinta a su region de bisagra inferior.

Las posiciones de aminoacido utiles para modificacion con el objetivo de generar una region Fc de IgG humana variante con afinidad o actividad de union a receptor gamma de Fc (FcyR) incluyen una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267. 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285,

286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 324, 326, 327, 330, 333, 334,

335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc.

Para generar una region Fc variante con una union reducida al FcyR se puede introducir una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 285, 268, 289, 270, 272,

278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 324, 327, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416,

419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc.

Las variantes que presentan una union reducida a FcyRI, incluyen aquellas que comprenden una modificacion de aminoacido en la region Fc en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 269, 270 o 327.

Las variantes que presentan una union reducida a FcyRII incluyen aquellas que comprenden una modificacion de aminoacido en la region Fc en una o mas de las posiciones de aminoacido 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439.

Las regiones Fc variantes que presentan una union reducida a FcyRIII incluyen aquellas que comprenden una modificacion de aminoacido en la region Fc en una o mas de las posiciones de aminoacido 248, 249, 252, 254, 265, 268, 289, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 298, 301, 303, 327, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437.

Tambien se pueden preparar variantes con una union mejorada a uno o mas FcyRs, de tal modo que las regiones Fc variantes pueden comprender una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 255, 258, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430 de la region Fc.

Por ejemplo, la variante con una actividad de union a FcyR mejorada puede presentar una union mejorada a FcyRIII, y opcionalmente puede presentar ademas una union disminuida a FcyRII; p.ej., la variante puede comprender una modificacion de aminoacido en la posicion 298 y/o 333 de una region Fc.

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Las variantes con una union mejorada a FcyRII incluyen aquellas que comprenden una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 255, 256, 258, 267, 268. 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 337, 340, 378, 398 o 430 de una region Fc. Dichas variantes pueden presentar ademas una union disminuida a FcyRIII. Por ejemplo, pueden incluir una modificacion de aminoacido en la region Fc en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 266, 272, 298, 301 o 340.

Aunque se prefiere alterar la union a un FcyR, en la presente memoria tambien se contemplan regiones Fc variantes con afinidad de union alterada por receptor neonatal (FcRn). Se anticipa que las regiones Fc variantes con afinidad mejorada por FcRn tienen mayores vidas medias en suero, y dichas moleculas tendran aplicaciones utiles en metodos de tratamiento de mairnferos cuando se desee una vida media larga del polipeptido administrado, p.ej., para tratar una enfermedad o trastorno cronico. Las regiones Fc variantes con una afinidad de union a FcRn disminuida, por el contrario, es de esperar que tengan vidas medias mas cortas, y dichas moleculas pueden administrarse, por ejemplo, a un mamffero cuando pueda ser ventajoso un tiempo en circulacion mas corto, p.ej., para obtencion de imagenes diagnosticas in vivo o para polipeptidos que tengan efectos secundarios toxicos cuando se encuentran circulando en el torrente sangumeo durante largos periodos de tiempo, etc. Se anticipa que las regiones Fc variantes con afinidad de union a FcRn disminuida tengan menos probabilidad de atravesar la placenta, y por tanto pueden ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas.

Las regiones Fc variantes con afinidad de union a FcRn alterada incluyen aquellas que comprenden una modificacion de aminoacido en la region Fc en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 253, 255, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447. Aquellas que presentan una afinidad reducida por FcRn generalmente comprenderan una modificacion de aminoacido en la region Fc en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400. 415, 433, 435, 436, 439 o 447; y aquellas con una union incrementada a FcRn normalmente comprenderan una modificacion de aminoacido en la region Fc en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434.

El(los) polipeptido(s) variante(s) preparados como se ha descrito anteriormente pueden ser sometidos a modificaciones adicionales, a menudo dependiendo del uso pretendido para el polipeptido. Dichas modificaciones pueden implicar una alteracion adicional de la secuencia de aminoacidos (sustitucion, insercion y/o eliminacion de residuos de aminoacido), fusion a polipeptido(s) heterologo(s) y/o modificaciones covalentes. Dichas “modificaciones adicionales” pueden realizarse antes, o simultaneamente, o despues de la(s) modificacion(es) de aminoacido descritas anteriormente que resultan en una alteracion de la union a receptor de Fc y/o de la actividad de ADCC. En una realizacion, se puede combinar la modificacion de la region Fc de la presente memoria con sustituciones de la region Fc descritas en las referencias citadas en la seccion de “Tecnica relacionada” de esta solicitud.

Alternativa o adicionalmente, puede ser util combinar las anteriores modificaciones de aminoacidos con una o mas modificaciones de aminoacido adicionales que alteren la union a C1q y/o la funcion de citotoxicidad dependiente de complemento de la region Fc.

El polipeptido de partida de interes particular en la presente memoria habitualmente es uno que se une a C1q y que presenta citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Las sustituciones de aminoacido adicionales descritas en la presente memoria generalmente serviran para alterar la capacidad del polipeptido de partida para unirse a C1q y/o modificar su funcion de citotoxicidad dependiente de complemento, p.ej., reducir y preferiblemente suprimir dichas funciones efectoras. Sin embargo, en la presente memoria se contemplan los polipeptidos que comprenden sustituciones en una o mas de las posiciones descritas con union mejorada a C1q y/o funcion mejorada de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Por ejemplo, el polipeptido de partida puede ser incapaz de unirse a C1q y/o mediar en la CDC y puede modificarse de acuerdo a los conocimientos descritos en la presente memoria, de tal modo que adquiere dichas funciones efectoras adicionales. Ademas, los polipeptidos con actividad de union a C1q pre- existente, que opcionalmente tienen la capacidad de mediar en la CDC, pueden ser modificados de tal modo que una o ambas de estas actividades sean potenciadas.

Para generar una region Fc con union a C1q alterada y/o funcion alterada de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), las posiciones de aminoacido a modificar generalmente se seleccionan de las posiciones de la cadena pesada 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 y 334, donde la numeracion de los residuos en una cadena pesada de IgG corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En una realizacion, solo una de las ocho posiciones identificadas anteriormente es alterada con el objetivo de generar la region de polipeptido variante con union a C1q alterada y/o funcion alterada de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Preferiblemente solo el residuo 270, 329 o 322 es alterado si se da el caso. Alternativamente, dos o mas de las posiciones identificadas anteriormente son modificadas. Si las sustituciones deben estar combinadas, generalmente se combinan las sustituciones que potencian la union a C1q humano (p.ej., en las posiciones de residuo 326, 327, 333 y 334) o las que disminuyen la union a C1q humano (p.ej., en las posiciones de residuo 270, 322, 329 y 331). En la ultima realizacion, las cuatro posiciones (es decir, 270, 322, 329 y 331) pueden ser sustituidas. Preferiblemente, las sustituciones adicionales en dos, tres o todas las posiciones 326, 327, 333 o 334 se combinan, opcionalmente con otras sustituciones de region

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Fc, para generar un polipeptido con union a C1q humano mejorada y preferiblemente con actividad de CDC mejorada in vitro o in vivo.

La prolina esta conservada en la posicion 329 de las IgGs humanas. Este residuo preferiblemente es reemplazado con alanina, sin embargo, se contempla la sustitucion con cualquier otro aminoacido, p.ej., serina, treonina, asparagina, glicina o valina.

La prolina esta conservada en la posicion 331 de la IgG1, IgG2 e IgG3 humanas, pero no en la IgG4 humana (que tiene un residuo de serina en la posicion 331). El residuo 331 preferiblemente es reemplazado por alanina u otro aminoacido, p.ej., serina (para regiones de IgG diferentes a IgG4), glicina o valina.

La lisina 322 esta conservada en las IgGs humanas, y este residuo preferiblemente esta reemplazado por un residuo de alanina, pero se contempla la sustitucion con cualquier otro residuo de aminoacido, p.ej., serina, treonina, glicina o valina.

D270 esta conservado en las IgGs humanas, y este residuo puede estar reemplazado por otro residuo de aminoacido, p.ej., alanina, serina, treonina, glicina, valina o lisina.

K326 tambien esta conservado en IgGs humanas. Este residuo puede ser sustituido por otro residuo que incluye, aunque sin limitacion, valina, acido glutamico, alanina, glicina, acido aspartico, metionina o triptofano, siendo preferido el triptofano.

Del mismo modo, E333 tambien esta conservado en las IgGs humanas. E333 preferiblemente es reemplazado por un residuo de aminoacido con un volumen de cadena lateral mas pequeno, tal como valina, glicina, alanina o serina, siendo preferida la serina.

K334 esta conservado en las IgGs humanas y puede sustituirse por otro residuo tal como alanina u otro residuo.

En la IgG1 e IgG3 humanas, el residuo 327 es una alanina. Para generar una variante con union mejorada a C1q, dicha alanina puede ser sustituida por otro residuo tal como glicina. En la IgG2 y la IgG4, el residuo 327 es una glicina y esta puede reemplazarse por alanina (u otro residuo) para disminuir la union a C1q.

Tal como se ha descrito anteriormente, se puede disenar una region Fc con funcion efectora alterada, p.ej., mediante la modificacion de la union a C1q y/o la union a FcR, cambiando con ello la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC. Por ejemplo, se puede generar una region Fc variante con union a C1q mejorada y una union a FcyRIII mejorada; p.ej., que tenga tanto una actividad de ADCC mejorada como una actividad de CDC mejorada. Alternativamente, cuando se desea que la funcion efectora se reduzca o se suprima, se puede disenar una region Fc variante con actividad reducida de CDC y/o con actividad reducida de ADCC. En otras realizaciones, se puede aumentar solo una de dichas actividades, y opcionalmente tambien reducir la otra actividad, p.ej. para generar una region Fc variante con actividad de ADCC mejorada, pero con actividad de CDC reducida y viceversa.

Con respecto a otras alteraciones de secuencia de aminoacido adicionales, tambien se puede sustituir cualquier residuo de cistema que no este implicado en el mantenimiento de la conformacion apropiada del polipeptido variante, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula y prevenir un reticulamiento aberrante.

Otro tipo de sustitucion de aminoacido sirve para alterar el patron de glicosilacion del polipeptido. Esto puede lograrse eliminando uno o mas restos de carbohidrato presentes en el polipeptido, y/o anadiendo uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el polipeptido. La glicosilacion de polipeptidos tfpicamente es N-ligada u O- ligada. N-ligada se refiere a la union del resto carbohidrato a la cadena latera de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptfdicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de dichas secuencias tripeptfdicas en un polipeptido crea un sitio potencial de glicosilacion. Glicosilacion O-ligada se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un acido hidroxiamino, lo mas habitualmente serina o treonina, aunque tambien se pueden usar 5- hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adicion de sitios de glicosilacion al polipeptido se lleva a cabo de forma conveniente alterando la secuencia de aminoacidos de tal modo que contenga una o mas de las secuencias tripeptfdicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilacion N-ligados). La alteracion tambien puede realizarse mediante la adicion, o la sustitucion, de uno o mas residuos de serina o treonina a la secuencia del polipeptido original (para sitios de glicosilacion O-ligados). Un ejemplo de variante de glicosilacion tiene una sustitucion de aminoacido del residuo Asn 297 de la cadena pesada.

Ademas, la clase, subclase o alotipo de la region Fc puede ser alterada mediante una o mas sustituciones de aminoacido adicionales para generar una region Fc con una secuencia de aminoacidos mas homologa a una clase, subclase o alotipo diferente, segun se desee. Por ejemplo, se puede alterar una region Fc para generar una secuencia de aminoacido mas homologa a una region Fc humana; una region Fc de IgG1 humana de alotipo no A puede ser modificada para obtener una region Fc de IgG1 humana de alotipo A, etc. En una realizacion, la(s) modificacion(es) de aminoacido de la presente memoria que altera(n) la union a FcR y/o la actividad de ADCC se realizan en el dominio CH2 de la region Fc y el dominio CH3 es eliminado o reemplazado por otro dominio de dimerizacion. Preferiblemente,

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sin embargo, el dominio CH3 es mantenido (aparte de las modificaciones de aminoacido realizadas en el mismo que alteran la funcion efectora, tal como se describe en la presente memoria).

El polipeptido variante puede ser sometido a uno o mas ensayos para evaluar cualquier cambio en la actividad biologica con respecto al polipeptido de partida.

Preferiblemente, el polipeptido variante retiene esencialmente la capacidad para unirse a antigeno en comparacion con el polipeptido no variante, es decir, la capacidad de union no es peor de aproximadamente 20 veces, p.ej., no peor de aproximadamente 5 veces, la del polipeptido no variante. La capacidad de union del polipeptido variante puede determinarse usando tecnicas tales como el analisis de clasificacion celular activado por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA), por ejemplo.

La capacidad del polipeptido variante para unirse a un FcR puede ser evaluada. Cuando el FcR es un receptor de Fc de alta afinidad, tal como FcyRI, FcRn o FcyRIIIA-V158, la union se puede medir mediante una valoracion del polipeptido variante monomerico y midiendo el polipeptido variante ligado usando un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido variante en un formato ELlSA estandar (vease el Ejemplo 2 mas adelante). Otro ensayo de union a FcR para FcRs de baja afinidad se describe en los Ejemplos 1 y 4.

Para determinar la actividad de ADCC del polipeptido variante, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en el Ejemplo 4, usando ratios efector:diana variables. Las “celulas efectoras” utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares sangumeas perifericas (PBMC) y celulas asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC del polipeptido variante se puede determinar in vivo, p.ej., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

Se puede determinar la capacidad de la variante para unirse a C1q y mediar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

Para determinar la union a C1q, se puede llevar a cabo un ELISA de union a C1q. Resumidamente, se puede recubrir placas de ensayo durante una noche a 4°C con polipeptido variante o polipeptido de partida (control) en tampon de recubrimiento. A continuacion, las placas pueden ser lavadas y bloqueadas. Despues del lavado, se puede anadir una alfcuota de C1q humano a cada pocillo e incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de un lavado adicional, se puede anadir a cada pocillo 100 |jL de un anticuerpo conjugado a peroxidasa de C1q anti-complemento de oveja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se puede volver a lavar con tampon de lavado y se puede anadir a cada pocillo 100 jL de tampon de sustrato que contiene OPD (dihidrocloruro de O-fenilendiamina (Sigma)). La reaccion de oxidacion, observada a traves de la aparicion de un color amarillo, se deja evolucionar durante 30 minutos y se detiene mediante la adicion de 100 jL de H2SO4 4,5 N. A continuacion, se puede leer la absorbancia a (492-405) nm.

Un ejemplo de polipeptido variante es aquel que presenta una “reduccion significativa en la union a C1q” en este ensayo. Esto significa que aproximadamente 100 jg/mL del polipeptido variante dan lugar a una reduccion de 50 veces o mas en la union a C1q con respecto a 100 jg/mL de un anticuerpo de control que tenga una region Fc de IgG1 no mutada. En la realizacion mas preferida, el polipeptido variante “no se une a C1q”, es decir, 100 jg/mL del polipeptido variante dan lugar a una reduccion de aproximadamente 100 veces en la union a C1q con respecto a 100 jg/mL del anticuerpo de control.

Otro ejemplo de variante es una que “presenta una mejor afinidad de union a C1q humano que el polipeptido de partida”. Dicha molecula puede presentar una mejora de la union a C1q, por ejemplo, de aproximadamente dos veces o mas, y preferiblemente de aproximadamente cinco veces o mas, con respecto al polipeptido de partida (p.ej., a los valores de IC50 correspondientes a estas dos moleculas. Por ejemplo, la union a C1q humano puede ser de aproximadamente dos veces a aproximadamente 500 veces, y preferiblemente de aproximadamente dos veces o de aproximadamente cinco veces a aproximadamente 1000 veces la del polipeptido original.

Para determinar la activacion de complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), p.ej., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Resumidamente, diversas concentraciones del polipeptido variante y de complemento humano pueden diluirse con tampon. Las celulas que expresan el antfgeno al cual se une el polipeptido variante se pueden diluir hasta una densidad de ~1 x 106 celulas/mL. Las mezclas de polipeptido variante, complemento humano diluido y celulas que expresan el antfgeno se pueden anadir a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo plano y dejar incubar durante 2 h a 37°C y 5% de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por complemento. A continuacion se pueden anadir 50 jL de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubar durante una noche a 37°C. La absorbancia se mide usando un fluorometro de 96 pocillos con excitacion a 530 nm y emision a 590 nm. Los resultados se pueden expresar en unidades de fluorescencia relativas (RFU). Las concentraciones de muestra se pueden calcular a partir de una curva de calibrado y se puede presentar la actividad porcentual correspondiente al polipeptido variante de interes en comparacion con un polipeptido no variante.

Otro ejemplo de variante adicional “no activa complemento”. Por ejemplo, 0,6 jg/mL del polipeptido variante dan lugar a aproximadamente 0-10% de actividad de CDC en este ensayo en comparacion con 0,6 jg/mL de un anticuerpo de

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control que tiene una region Fc de IgG1 no mutada. Preferiblemente, la variante no parece tener ninguna actividad de CDC en el anterior ensayo de CDC.

La invencion tambien incluye un polipeptido variante con CDC potenciada en comparacion con un polipeptido original, p.ej., que presenta aproximadamente dos veces a aproximadamente 100 veces de mejora en la actividad de CDC in vitro o in vivo (p.ej., a los valores de IC50 correspondientes a cada molecula que este siendo comparada).

A. Ensayo de union a receptor y complejo inmune

Se ha desarrollado un ensayo de union en la presente memoria que es particularmente util para determinar la union de un analito de interes a un receptor, donde la afinidad del analito por el receptor es relativamente debil, p.ej., en el rango micromolar como es el caso para FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y FcyRIIIB. El metodo implica la formacion de un complejo molecular que tiene una avidez mejorada por el receptor de interes en comparacion con el analito no acomplejado. El complejo molecular preferido es un complejo inmune que comprende: (a) un polipeptido que contiene region Fc (tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina): (b) una primera molecula diana que comprende al menos dos sitios de union para el polipeptido que contiene region Fc; y (c) una segunda molecula diana que comprende al menos dos sitios de union para la primera molecula diana.

En el Ejemplo 1 incluido a continuacion, el polipeptido que contiene region Fc es un anticuerpo anti-IgE, tal como el anticuerpo E27 (Figs. 4A-4B). E27, cuando se mezcla con IgE humana en una ratio molar 1:1, forma un hexamero estable que consiste en tres moleculas de E27 y tres moleculas de IgE. En el Ejemplo 1 presentado mas adelante, la “primera molecula diana” es una forma quimerica de IgE en la que la porcion Fab de un anticuerpo anti-VEGF esta fusionada a la porcion Fc de IgE humana y la “segunda molecula diana” es el antfgeno al cual se une Fab (es decir, VEGF). Cada molecula de IgE se une a dos moleculas de VEGF. VEGF tambien se une a dos moleculas de IgE por molecula de VEGF. Cuando se anade VEGF humano recombinante en una ratio molar 2:1 a los hexameros de IgE:E27, los hexameros fueron ligados en complejos de mayor peso molecular a traves de la interaccion IgE:VEGF (Fig. 5). La region Fc del anticuerpo anti-IgE del complejo inmune resultante se une a FcR con mayor avidez que el anti-IgE no acomplejado o que los hexameros anti-IgE:IgE.

Se contemplan otras formas de complejos moleculares para uso en el ensayo de receptor. Los ejemplos que comprenden solo una combinacion de polipeptido que contiene region Fc:primera molecula diana incluye una combinacion de inmunoadhesina:ligando tal como inmunoadhesina de receptor de VEGF (KDR):VEGF y un anticuerpo biespedfico de longitud completa (bsAb):primera molecula diana. Un ejemplo adicional de una combinacion de polipeptido que contiene region Fc:primera molecula diana:segunda molecula diana incluye una combinacion de anticuerpo no bloqueante:receptor soluble:ligando tal como anticuerpo anti-Trk:receptor de Trk soluble:neurotrofina (Urfer et al., J. Biol. Chem. 273(10): 5829-5840 (1998)).

Aparte del uso en un ensayo de union a receptor, los complejos inmunes descritos anteriormente tienen usos adicionales que incluyen la evaluacion de la funcion de polipeptido que contiene region Fc y la eliminacion in vivo del complejo inmune. Por tanto, el complejo inmune puede administrarse a un mairnfero (p.ej., en un estudio pre-clmico con animales) y evaluarse para determinar su vida media, etc.

Para determinar la union a receptor, un polipeptido que comprende al menos el dominio de union del receptor de interes (p.ej., el dominio extracelular de una subunidad a de un FcR) se puede extender sobre una fase solida, tal como una placa de ensayo. El dominio de union del receptor solo de una protema receptor-fusion se puede extender sobre la placa usando procedimientos estandar. Los ejemplos de protemas de fusion de receptor incluyen la protema de fusion receptor-glutationa S-transferasa (GST), la protema de fusion receptor-dominio de union a quitina, la protema de fusion receptor-etiqueta hexaHis (extendidas sobre placas recubiertas de glutationa, quitina y mquel, respectivamente). Alternativamente, se puede extender una molecula de captura sobre la placa de ensayo y usarse para ligar el receptor-protema de fusion a traves de la porcion que no es receptor de la protema de fusion. Los ejemplos incluyen anti-hexaHis F(ab')2 extendido sobre la placa de ensayo usada para captura el receptor-fusion de cola hexaHis o anticuerpo anti-GST extendido sobre la placa de ensayo usada para captura un receptor-fusion GST. En otras realizaciones, la union a celulas que expresan al menos el dominio de union del receptor puede evaluarse. Las celulas pueden ser celulas hematopoyeticas naturales que expresan el FcR de interes o pueden transformarse con acido nucleico que codifica el FcR o un dominio de union del mismo, de tal modo que el dominio de union se expresa en la superficie de la celula que va a ser evaluada.

El complejo inmune descrito anteriormente en la presente memoria se anade a las placas recubiertas con receptor y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente, de tal modo que el analito se une al receptor. Las placas pueden ser lavadas entonces para eliminar los complejos no ligados, y la union del analito se puede detectar segun metodos conocidos. Por ejemplo, la union se puede detectar usando un reactivo (p.ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) que se une espedficamente al analito, y que opcionalmente esta conjugado con una etiqueta detectable (las etiquetas detectables y los metodos para conjugarlas a polipeptidos se describen mas adelante, en la seccion titulada “Usos no terapeuticos del polipeptido variante”).

Por conveniencia, los reactivos se pueden proporcionar en un kit de ensayo, es decir, una combinacion empaquetada de reactivos, para combinacion con el analito a la hora de determinar la capacidad del analito para unirse a un receptor

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de interes. Los componentes del kit generalmente seran proporcionados en ratios predeterminadas. El kit puede proporcionar la primera molecula diana y/o la segunda molecula diana, opcionalmente formando un complejo juntas. El kit puede incluir ademas placas de ensayo recubiertas con el receptor o un dominio de union del mismo (p.ej., el dominio extracelular de la subunidad a de un FcR). Habitualmente, en el kit se proporcionaran otros reactivos, tales como un anticuerpo que se une espedficamente al analito a ensayar, marcado directa o indirectamente con una etiqueta enzimatica. Cuando la etiqueta detectable es una enzima, el kit incluira los sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p.ej., un precursor de sustrato que proporciona el cromoforo o fluoroforo detectable). Adicionalmente, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (p.ej., tampon de ensayo y/o de lisis de lavado) y otros similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en disolucion de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que en disolucion proporcionaran una disolucion de reactivo que tiene la concentracion apropiada. El kit tambien incluye de forma adecuada instrucciones para llevar a cabo el ensayo.

B. Preparacion de anticuerpos

En la realizacion preferida de la invencion, el polipeptido que contiene region Fc que es modificado segun lo mostrado en la presente memoria es un anticuerpo. A continuacion se indican las tecnicas para producir anticuerpos:

(i) Seleccion y preparacion de antigeno

Cuando el polipeptido es un anticuerpo, esta dirigido contra un antigeno de interes. Preferiblemente, el antigeno es un polipeptido biologicamente importante y la administracion del anticuerpo a un mairnfero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapeutico para dicho marnffero. Sin embargo, tambien se contemplan anticuerpos dirigidos contra antigenos que no son polipeptidos (tales como antigenos de glicolfpido asociados a tumor; vease la Patente de EE.UU. 5.091.178).

Cuando el antfgeno es un polipeptido, puede ser una molecula transmembrana (p.ej., un receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Los ejemplos de antfgenos incluyen moleculas tales como renina; una hormona de crecimiento, que incluye hormona de crecimiento humano y hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante tiroidea; lipoprotemas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimulante de folmulo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores coagulantes tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF), y factor de von Willebrands; factores anti-coagulacion tales como Protema C; factor natriuretico atrial; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado por activacion normalmente celula T expresada y secretada); protema inflamatoria de macrofago humano (MIP-1-alfa); una albumina de suero tal como albumina de suero humana; sustancia inhibidora de Muellerian; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; pro-relaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una protema microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; IgE; un antfgeno asociado a linfocito T citotoxico (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; protema A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina- 3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EgF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, que incluye TGF-p1, TGF-P2, TGF-P3, TGF-p4 o TGF-p5; factor I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), protemas de union a factor de crecimiento de tipo insulina; protemas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una protema morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonia (CSFs), p.ej., M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), p.ej., de iL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celula T; protemas de membrana superficial; factor de aceleracion de decaimiento; antfgeno vmco tal como, por ejemplo, una porcion de la envoltura del SIDA; protemas de transporte; receptores albergadores; adresinas; protemas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antfgeno asociado a tumor tal como receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente.

Las moleculas diana preferidas para anticuerpos incluyen protemas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; los miembros de la familia de receptor ErbB tales como el receptor de EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina a4/p7 e integrina av/p3, que incluyen tanto las subunidades a de la misma como las subunidades p (p.ej., anticuerpos anti-CD11a, anti- CD18 o anti-CDl1b); factores de crecimiento tales como VEGF; factor tisular (TF); interferon alfa (a-IFN); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antfgenos de grupo sangumeo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; protema C, etc.

Los antfgenos solubles o los fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados a otras moleculas, se pueden usar como inmunogenos para generar anticuerpos. Para moleculas transmembrana, tal como receptores, fragmentos de estos (p.ej., el dominio extracelular de un receptor) se pueden usar como inmunogeno. Alternativamente, se pueden usar como inmunogeno celulas que expresan la molecula transmembrana. Dichas celulas pueden derivarse de una

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fuente natural (p.ej., lmeas de celulas cancerosas) o pueden ser celulas que han sido transformadas mediante tecnicas recombinantes para expresar la molecula transmembrana. Otros antigenos y formas de los mismos, utiles para preparar anticuerpos, seran evidentes para los especialistas en la tecnica.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser util para conjugar el antfgeno relevante a una protema que sea inmunogenico en la especie a inmunizar, p.ej., hemocianina de lapa de ojo de cerradura, albumina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida ester (conjugacion a traves de residuos de cistema), N- hidroxisuccinimida (a traves de los residuos de lisina), glutaraldehfdo, anhfdrido succmico, SOCl2 o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales son inmunizados contra el antigeno, conjugados inmunogenicos o derivados, combinando, p.ej., 100 |jg o 5 jg de la protema o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolucion intradermicamente en multiples sitios. Un mes despues, se aplica un recuerdo a los animales de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de peptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples sitios. De siete a 14 dfas despues, se toman muestras sangumeas de los animales y se evalua el tftulo de anticuerpos en suero. Se aplican nuevos recuerdos hasta que el tftulo alcanza un valor constante. Preferiblemente, se aplica un recuerdo al animal con el conjugado del mismo antfgeno, pero conjugado a una protema diferente y/o a traves de un reactivo de reticulacion diferente. Los conjugados tambien se pueden preparar en cultivo celular recombinante como protemas de fusion. Asimismo, de forma adecuada se usan agentes agregantes tales como alumbre para potenciar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el metodo de hibridoma descrito originalmente por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinantes (Patente de EE.UU. n° 4.816.567).

En el metodo del hibridoma, un raton u otro animal hospedante apropiado, tal como un hamster o un mono macaco, es inmunizado como se ha indicado previamente en la presente memoria para activar linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente a la protema usada para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuacion los linfocitos son condensados con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilen glicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pag. 59-103 (Academia Press, 1986)).

Las celulas de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se crecen en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma originales, no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas tfpicamente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.

Las celulas de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, apoyan la produccion a alto nivel y estable de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las lmea celulares de mieloma preferidas son las lmeas de mieloma murino, tal como las derivadas de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el “Salk Institute Cell Distribution Center”, San Diego, California, EE.UU., y las celulas SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la “American Type Culture Collection”, Rockville, Maryland, EE.UU. Las lmeas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano tambien han sido descritas para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pag. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se crecen las celulas de hibridoma es evaluado para la produccion de anticuerpo monoclonales dirigidos contra el antfgeno. Preferiblemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).

Despues de identificar las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse limitando procedimientos de dilucion y creciendo mediante metodos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pag. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Adicionalmente, las celulas de hibridoma se pueden crecer in vivo como tumores asdticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados de forma adecuada del medio de cultivo, fluido asdtico, o suero mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tales como, por

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ejemplo, protema A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis de gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es aislado y secuenciado facilmente usando procedimientos convencionales (p.ej., usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las celulas de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, que a continuacion son transferidos a celulas hospedantes tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que no producen de otro modo protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas hospedantes recombinantes. La produccion recombinante de anticuerpos se describira con mas detalle mas adelante.

En una realizacion adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar a partir de bibliotecas de fagos generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad (en el rango de nM) mediante barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), asf como mediante infeccion combinatoria y recombinacion in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por tanto, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN tambien puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de EE.UU. n° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina parte o toda la secuencia codificadora para un polipeptido no inmunoglobulina.

Tfpicamente, dichos polipeptidos no inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinacion a anffgeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion a anffgeno que tiene especificidad por un anffgeno y otro sitio de combinacion a anffgeno que tiene especificidad por un anffgeno diferente.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacido introducidos en su interior procedentes de una fuente no humana. Dichos residuos de aminoacido no humanos a menudo se denominan residuos “importados”, que son tomados habitualmente de un dominio variable “importado”. La humanizacion se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo CDRs o secuencias de CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quimericos (Patente de EE.UU. n° 4.816.567) donde se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados ffpicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos procedentes de sitios analogos en anticuerpos de roedor.

La eleccion de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para su uso en la fabricacion de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Segun el metodo denominado de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es cribada contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que esta mas proxima a la de roedor es aceptada entonces como la region estructural humana (FR) correspondiente al anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro metodo usa una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede usarse para diferentes anticuerpos humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

Ademas es importante que los anticuerpos sean humanizados reteniendo la alta afinidad por el anffgeno, asf como otras propiedades biologicas favorables. Para alcanzar este objetivo, segun un metodo preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de analisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y de las humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran disponibles habitualmente y son familiares para los especialistas en la tecnica. Se dispone de programas de ordenador que ilustran y presentan las estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis de la funcion probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su anffgeno. De este modo, se pueden seleccionar residuos FR y combinarlos

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a partir de secuencias de importacion y receptoras de tal modo que se alcance la caractenstica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada por el(los) antigeno(s) diana. En general, los residuos CDR estan implicados directamente y lo mas sustancialmente en la influencia sobre la union a antigeno.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgenicos (p.ej., ratones) que son capaces, tras inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminacion homocigota del gen de region de union de cadena pesada (Jh) del anticuerpo en ratones mutantes quimericos y de lmea germinal da como resultado la inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia del sistema de genes de inmunoglobulina de lmea germinal humanos a dichos ratones mutantes de lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras exposicion a antfgeno. Vease, p.ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992). Los anticuerpos humanos tambien se pueden derivar de bibliotecas de presentacion de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991): Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1996)).

(v) Anticuerpos multi-espedficos

Los anticuerpos multi-espedficos tienen especificidades de union por al menos dos antfgenos diferentes. Aunque dichas moleculas normalmente se uniran solamente a dos antfgenos (es decir, anticuerpos bi-espedficos, BsAbs), tambien se incluyen en la expresion cuando se usa en la presente memoria los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como anticuerpos tri-espedficos. Los ejemplos de BsAbs incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antfgeno de celula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molecula de activacion citotoxica tal como anti- FcYRI/anti-CD15, anti-p185HER2/ FcyRIII (CD16), anti-CD3/anti-celula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185HER2, anti- CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de celula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-analogo de hormona estimulante de melanocito, anti-receptor de EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti- CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molecula de adhesion de celula neural (NCAM)/anti-CD3, anti- protema de union a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antfgeno asociado a pan-carcinoma (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs con un brazo que se une espedficamente a un antfgeno tumoral y un brazo que se une a una toxina tal como anti- saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena A de ricina, anti-interferon a (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-vinca alcaloide; BsAbs para convertir profarmacos activados por enzima tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversion del profarmaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina); BsAbs que pueden usarse como agentes fibrinoltticos tales como anti-fibrina/anti-activador de plasminogeno de tejido (tPA), anti-fibrina/anti-activador de plasminogeno de tipo uroquinasa (uPA); BsAbs para dirigir complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como anti- lipoprotema de baja densidad (LDL)/anti-receptor de Fc (p.ej., FcyRI, FcyRII o FcyRIII); BsAbs para uso en terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus de herpes simple (HSV), anti-complejo de receptor de celula T:CD3/anti-gripe; anti-FcYR/anti-VIH; BsAbs para deteccion de tumores in vitro o in vivo tales como anti-CEA/anti- EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacuna; y BsAbs como herramientas diagnosticas tales como anti-IgG de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rabano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galactosidasa. Los ejemplos de anticuerpos tri-espedficos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos bi-espedficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (p.ej., anticuerpos bi-espedficos F(ab')2).

Los metodos para preparar anticuerpos bi-espedficos son conocidos en la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos bi-espedficos de longitud completa se basa en la co-expresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305: 537539 (1983)). Debido a la clasificacion aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura bi-espedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que habitualmente se hace mediante etapas de cromatograffa de afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos a producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Segun una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antfgeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados, y son co-transfectados en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptido en realizaciones cuando ratios desiguales de las tres cadenas de polipeptido en la construccion proporcionan los rendimientos optimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o para las tres cadenas de polipeptido en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas de polipeptido en ratios iguales da como resultado rendimientos elevados, o cuando las ratios no tienen una significancia particular.

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En una realizacion preferida de esta estrategia, los anticuerpos bi-espedficos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina dbrida con una primera especificidad de union en un brazo, y un par de cadena pesada- cadena ligera de inmunoglobulina dbrido (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se observo que esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto bi-espedfico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solo en una mitad de la molecula bi-espedfica proporciona un modo sencillo de separacion. Esta estrategia se describe en el documento WO 94/04690. Para mas detalles de la generacion de anticuerpos bi-espedficos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). Segun otra estrategia descrita en el documento Wo 96/27011, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo se puede disenar para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que son recuperados de un cultivo de celulas recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacido pequenas de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales de mayor tamano (p.ej., tirosina o triptofano). Las “cavidades” compensatorias de tamano identico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean sobre la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoacido grandes por otras pequenas (p.ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodfmero con respecto a otros productos finales no deseados, tal como homodfmeros.

Los anticuerpos bi-espedficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir celulas del sistema inmune a celulas no deseadas (Patente de EE.Uu. n° 4.676.980), y para el tratamiento de infeccion de VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Los agentes reticulantes adecuados son bien conocidos en la tecnica, y se describen en la Patente de EE.UU. n° 4.676.980, junto con una serie de tecnicas de reticulacion.

Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos tri-espedficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Aunque el polipeptido de interes en la presente memoria es preferiblemente un anticuerpo, se contemplan otros polipeptidos que contienen region Fc que pueden ser modificados segun los metodos descritos en la presente memoria. Un ejemplo de dichas moleculas es una inmunoadhesina.

C. Preparacion de inmunoadhesina

El diseno de inmunoadhesina mas simple y mas directo combina el(los) dominio(s) de union de la adhesina (p.ej., el domino extracelular (ECD) de un receptor) con la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. De forma ordinaria, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente invencion, el acido nucleico que codifica el dominio de union de la adhesina se fusionara C-terminalmente a acido nucleico que codifica el extremo-N de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo, tambien son posibles las fusiones N-terminales.

Tfpicamente, en dichas fusiones el polipeptido quimerico codificado retendra al menos los dominios funcionalmente activos de bisagra, Ch2 y Ch3 de la region constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Tambien se realizan fusiones en el extremo-C de la porcion Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminal al Ch1 de la cadena pesada o de la region correspondiente de la cadena ligera. El sitio exacto en el que se realiza la fusion no es cntico; sitios concretos son bien conocidos y pueden seleccionarse para optimizar la actividad biologica, la secrecion o las caractensticas de union de la inmunoadhesina.

En una realizacion preferida, la secuencia de adhesina se fusiona al extremo-N de la region Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG-i). Es posible fusionar la region constante de cadena pesada entera a la secuencia de adhesina. Sin embargo, mas preferiblemente, en la fusion se usa una secuencia que empieza en la region de bisagra justo por encima del sitio de ruptura de papama que define qdmicamente la Fc de IgG (es decir, el residuo 216, considerando que el primer residuo de la region constante de cadena pesada es el 114), o sitios analogos de otras inmunoglobulinas. En una realizacion particularmente preferida, la secuencia de aminoacido de adhesina esta fusionada a (a) la region de bisagra y los dominios Ch2 y Ch3, o (b) los dominios Ch1, de bisagra, Ch2 y Ch3, de una cadena pesada de IgG.

Para inmunoadhesinas bi-espedficas, las inmunoadhesinas se construyen como multimeros, y particularmente como heterodfmeros o heterotetrameros. Generalmente, dichas inmunoglobulinas construidas tendran estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural basica de cuatro cadenas es la forma en la que existen la IgG, la IgD y la IgE. En las inmunoglobulinas de mayor peso molecular se repite una unidad de cuatro cadenas; IgM existe de forma general como un pentamero de cuatro unidades basicas unidas mediante puentes de disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, tambien pueden existir en forma multimerica en suero. En el caso de un multimero, las cuatro unidades pueden ser iguales o diferentes.

A continuacion se ilustran esquematicamente varios ejemplos de inmunoadhesinas construidas dentro del alcance de la presente memoria:

(a) ACl-ACl;

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(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

(c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, o VLCL-VHCH)

(d) ACl-VhCh-(ACh, or ACl-VhCh, o VlCl-ACh);

(e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, o VlCl-ACh); y

(f) (A-YMVlCl-VhCh)2,

donde cada A representa secuencias de aminoacido de adhesina identicas o diferentes:

Vl es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;

Vh es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;

Cl es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

Ch es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina; n es un numero entero mayor que 1;

Y designa el residuo de un agente de reticulacion covalente.

Por brevedad, las anteriores estructuras solo muestras las caractensticas clave; no indican la union (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los enlaces de disulfuro. Sin embargo, cuando dichos dominios son requeridos para la actividad de union, deben construirse para estar presentes en las localizaciones ordinarias que ocupan en las moleculas de inmunoglobulina.

Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, de tal modo que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimerica. En esta realizacion, las secuencias de adhesina se fusionan al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina de cada brazo de una inmunoglobulina, tanto entre la bisagra y el dominio Ch2, como entre los dominios Ch2 y Ch3. Se han publicado construcciones similares, Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28: 1027-1037 (1991).

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no es obligatoria en las inmunoadhesinas de la presente invencion, podna haber presente una cadena ligera de inmunoglobulina asociada covalentemente a un polipeptido de fusion de cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina, o directamente fusionada a la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina tfpicamente es co-expresado con el ADN que codifica la protema de fusion de cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina. Con la secrecion, la cadena pesada hforida y la cadena ligera se asociaran covalentemente para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina ligados mediante puentes de disulfuro. Los metodos adecuados para la preparacion de dichas estructuras se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 4.816.567, presentada el 28 de marzo de 1989.

Las inmunoadhesinas se construyen de la forma mas conveniente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porcion de adhesina en estructura a una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, tambien se puede usar la fusion a fragmentos de inmunoglobulina genomica (vease, p.ej., Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 (1990); y Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 (1991)). El ultimo tipo de fusion requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresion. Los ADNcs que codifican las regiones constantes de cadena pesada de IgG pueden aislarse en base a secuencias publicadas procedentes de bibliotecas de ADNc derivadas de bazo o de linfocitos de sangre periferica, mediante hibridacion o mediante tecnicas de reaccion en cadena de polimerasa (PCR). Los ADNcs que codifican la “adhesina” y las partes de inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tandem en un vector plasmido que dirige la expresion eficiente en las celulas hospedantes seleccionadas.

D. Vectores, celulas hospedantes y metodos recombinantes

La invencion tambien proporciona acido nucleico aislado que codifica un polipeptido variante como el descrito en la presente memoria, vectores y celulas hospedantes que comprenden el acido nucleico, y tecnicas recombinantes para la produccion del polipeptido variante.

Para la produccion recombinante del polipeptido variante, el acido nucleico que lo codifica es aislado e insertado en un vector replicable para clonacion adicional (amplificacion del ADN) o para expresion. El ADN que codifica el polipeptido variante se afsla y secuencia facilmente usando procedimientos convencionales (p.ej., usando sondas de oligonucleotido que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican el polipeptido variante). Se dispone de muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion.

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(i) Componente de secuencia senal

El polipeptido variante de esta invencion puede ser producido de forma recombinante no solo directamente, sino tambien como un polipeptido de fusion con un polipeptido heterologo, que preferiblemente es una secuencia senal u otro polipeptido que tiene un sitio de ruptura espedfico en el extremo-N de la protema o polipeptido maduro. La secuencia senal heterologa seleccionada preferiblemente es tal que es reconocida y procesada (es decir, se rompe mediante una senal peptidasa) por la celula hospedante. Para celulas hospedantes procarioticas que no reconocen y procesan la secuencia senal de polipeptido variante nativa, la secuencia senal es sustituida por una secuencia senal procariotica seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o lfderes de enterotoxina II termo-estable. Para la secrecion de levadura, la secuencia senal nativa puede ser sustituida, p.ej., por el lfder de invertasa de levadura, lfder de factor a (que incluyen los lfderes de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces), o lfder de fosfatasa acida, el lfder de glucoamilasa de C. albicans, o la senal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresion de celula de mairnfero, se dispone de secuencias senal de mairnfero, asf como de lfderes secretores vmcos, por ejemplo, la senal gD de herpes simple.

El ADN para dicha region precursora esta ligado en el marco de lectura a, ADN que codifica el polipeptido variante.

(ii) Componente de origen de replicacion

Tanto los vectores de expresion como los de clonacion contienen una secuencia de acido nucleico que permite al vector replicarse en una o mas celulas hospedantes seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonacion dicha secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomico del hospedante, e incluye ongenes de replicacion o secuencias autonomamente replicantes. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayona de las bacterias Gram negativas, el origen del plasmido 2|j es adecuado para levadura, y varios ongenes vmcos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son utiles para vectores de clonacion en celulas de mairnfero. Generalmente, el componente de origen de replicacion no es necesario para vectores de expresion de mairnfero (el origen de SV40 se puede usar tfpicamente solo debido a que contiene el promotor temprano).

(iii) Componente de gen de seleccion

Los vectores de expresion y clonacion pueden contener un gen de seleccion, tambien denominado marcador seleccionable. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes cnticos no disponibles a partir de medios complejos, p.ej., el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de un esquema de seleccion utiliza un farmaco para detener el crecimiento de una celula hospedante. Aquellas celulas que son transformadas con exito con un gen heterologo producen una protema que confiere resistencia a farmaco y por tanto sobrevive al regimen de seleccion. Los ejemplos de dicha seleccion dominante usan los farmacos neomicina, acido micofenolico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mairnfero son aquellos que permiten la identificacion de celulas competentes para procesar el acido nucleico del polipeptido variante, tal como DHFr, timidina quinasa, metalotionema I y II, preferiblemente genes de metalotionema de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las celulas transformadas con el gen de seleccion DHFR son identificadas primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una celula hospedante apropiada cuando se emplea DHFR natural es la lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.

Alternativamente, celulas hospedantes (particularmente hospedantes naturales que contienen DHFR endogeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el polipeptido variante, la protema DHFR natural, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionadas mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de seleccion para el marcador seleccionable, tal como un antibiotico aminoglicosfdico, p.ej., canamicina, neomicina o G418. Vease la Patente de EE.UU. n° 4.965.199.

Un gen de seleccion adecuado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plasmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC n° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesion trpl en el genoma de celula hospedante de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para la deteccion de la transformacion a traves del crecimiento en ausencia de triptofano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas con plasmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Adicionalmente, los vectores derivados del plasmido circular de 1,6 jm pKD1 pueden usarse para la transformacion de levaduras de Kluyveromyces. Alternativamente, se ha publicado un sistema de expresion para la produccion a gran

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escala de quimosina de ternero recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Tambien se han descrito vectores de expresion multi-copia para secrecion de albumina de suero humano recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(iv) Componente de promotor

Los vectores de expresion y de clonacion habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y que esta ligado operativamente al acido nucleico del polipeptido variante. Los promotores adecuados para uso con hospedantes procarioticos incluyen el promotor phoA, p-lactamasa y sistemas de promotor de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp), y promotores hforidos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para uso en sistemas bacterianos tambien contendran una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) ligada operativamente al ADN que codifica el polipeptido variante.

Se conocen secuencias promotoras para eucariontes. Virtualmente todos los genes eucarioticos tienen una region rica en AT localizada aproximadamente entre 25 y 30 bases por encima del sitio donde se inicia la transcripcion. Otra secuencia observada entre 70 y 80 bases por encima del inicio de la transcripcion de muchos genes es una region de CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayona de los genes eucarioticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la senal para la adicion de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresion eucarioticos.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con hospedantes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolfticas, tal como enolasa, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripcion controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradadoras asociadas al metabolismo de nitrogeno, metalotionema, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilizacion de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresion de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. De forma ventajosa, tambien se usan potenciadores de levadura con promotores de levadura.

La transcripcion de polipeptido variante a partir de vectores en celulas de hospedante de mairnfero es controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de gripe aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y, lo mas preferiblemente, virus de simio 40 (SV40), procedentes de promotores de mamffero heterologos, p.ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque termico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la celula hospedante.

Los promotores tempranos y tardfos del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restriccion de SV40 que tambien contiene el origen de replicacion vmca del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restriccion HindIII E. Un sistema para expresar ADN en hospedantes mamfferos usando el virus de papiloma bovino como vector se describe en la Patente de EE.UU. n° 4.419.446. Una modificacion de este sistema se describe en la Patente de EE.UU. n° 4.601.978. Vease tambien Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresion de ADNc de interferon p humano en celulas de raton bajo el control de un promotor de timidina quinasa procedente de virus de herpes simple. Alternativamente, se puede usar como promotor la repeticion terminal larga del virus de sarcoma de Rous.

(v) Componente de elemento potenciador

La transcripcion de un ADN que codifica el polipeptido variante de esta invencion mediante eucariontes superiores a menudo es incrementada insertando una secuencia potenciadora en el vector. Hoy dfa se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de marnffero (globina, elastasa, albumina, a-fetoprotema e insulina). Tfpicamente, sin embargo, se usara un potenciador procedente de un virus de celula eucariotica. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 sobre el lado posterior del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma del lado posterior del origen de replicacion, y potenciadores de adenovirus. Vease tambien Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activacion de promotores eucarioticos. El potenciador puede dividirse en el vector en una posicion 5' o 3' respecto a la secuencia codificadora de polipeptido variante, pero preferiblemente esta localizado en un sitio 5' respecto al promotor.

(vi) Componente de terminacion de la transcripcion

Los vectores de expresion usados en celulas hospedantes eucarioticas (celulas de levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano o nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) tambien contendran secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles habitualmente en regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucarioticos o vmcos.

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Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porcion no traducida del ARNm que codifica el polipeptido variante. Un componente de terminacion de la transcripcion util es la region de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina. Vease el documento WO 94/11026 y el vector de expresion descrito en la presente memoria.

(vii) Seleccion y transformacion de celulas hospedantes

Las celulas hospedantes adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente memoria son celulas de procarionte, levadura o eucarionte superior descritas anteriormente. Los procariontes adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceae tales como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescans, y Shigella, asf como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedante de clonacion de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque tambien son adecuadas otras cepas, tal como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y

E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos, mas que limitantes.

Ademas de los procariontes, tambien los microbios eucarioticos, tal como hongos filamentosos o levaduras, son hospedantes de clonacion o expresion adecuados para vectores que codifican polipeptido variante. Saccharomyces cerevisiae, o levadura comun de panadena, es la utilizada mas habitualmente entre los microorganismos hospedantes eucarioticos. Sin embargo, se dispone habitualmente de una serie de otros generos, especies y cepas, que son utiles en la presente memoria, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedantes de Kluyveromyces tales como, p.ej., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, p.ej. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedantes de Aspergilus tal como A. nidulans y A. niger.

Las celulas hospedantes adecuadas para la expresion de polipeptido variante glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de celulas de invertebrado incluyen celulas vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovmcas y las correspondientes celulas hospedantes de insecto permisivas de hospedantes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyxmori. Se dispone publicamente de una variedad de cepas vmcas para transfeccion, p.ej., la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de NPV de Bombyx mori, y dichos virus pueden usarse como virus de la presente memoria, particularmente para la transfeccion de celulas de Spodoptera frugiperda.

Tambien se pueden utilizar como hospedantes cultivos de celulas vegetales de algodon, mafz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el mayor interes esta en las celulas de vertebrado, y la propagacion de celulas de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de lmeas celulares de hospedante mairnfero utiles son la lmea de CV1 de rinon de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la lmea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de hamster bebe (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); celulas sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1, ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (vErO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma cervical humano (HElA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de tegado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humanas (W138, ATCC CCL 75); celulas de tegado humanas (Hep g2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2).

Las celulas hospedantes son transformadas con los vectores de expresion o clonacion descritos anteriormente para la produccion de polipeptido variante, y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las celulas hospedantes

Las celulas hospedantes usadas para producir el polipeptido variante de esta invencion se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mmimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las celulas hospedantes. Adicionalmente, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de EE.UU. n° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Re. de Patente de EE.UU. 30.985, se pueden usar como medio de cultivo para las celulas hospedantes. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor de crecimiento

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epidermico), sales (tales como cloruro sodico, calcico, magnesico y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleotidos (tal como adenosina y timidina), antibioticos (tal como el farmaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como compuestos inorganicos presentes habitualmente en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente energetica equivalente. Tambien se puede incluir cualquier otro suplemento necesario a la concentracion apropiada, segun el conocimiento de los especialistas en la tecnica. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH, y similares, son las usadas previamente con la celula hospedante seleccionada para la expresion, y seran evidentes para el especialista en la tecnica.

(ix) Purificacidn de polipeptido variante

Cuando se usan tecnicas recombinantes, el polipeptido variante puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmico, o secretarse directamente al medio. Si el polipeptido variante es producido intracelularmente, como una primera etapa, los restos particulados, tanto de celulas hospedantes como de fragmentos lisados, son eliminados, por ejemplo, mediante centrifugacion o ultrafiltracion. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplasmico de E. coli. Resumidamente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sodico (pH 3,5), EDTa y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) a lo largo de aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares pueden eliminarse mediante centrifugacion. Cuando el polipeptido variante es secretado al medio, los sobrenadantes procedentes de dichos sistemas de expresion generalmente son concentrados primero usando un filtro de concentracion de protemas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis, y se pueden incluir antibioticos para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.

La composicion del polipeptido variante preparada a partir de las celulas se puede purificar usando, por ejemplo, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis de gel, dialisis y cromatograffa de afinidad, siendo la tecnica de purificacion preferida la cromatograffa de afinidad. La adecuacion de la protema A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier region Fc de inmunoglobulina que este presente en el polipeptido variante. La protema A puede usarse para purificar polipeptidos variantes basados en cadenas pesadas humanas y1, y2 o y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La protema G esta recomendada para todos los isotipos de raton y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a la cual esta unido el ligando de afinidad casi siempre es agarosa, pero tambien existen otras matrices. Las matrices mecanicamente estables, tal como vidrio poroso controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten mayores velocidades de flujo y tiempos de procesamiento mas cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el polipeptido variante comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es util para la purificacion. Otras tecnicas de purificacion de protemas tal como el fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, la precipitacion en etanol, HPLC de fase inversa, cromatograffa de sflice, cromatograffa de heparina SEPHAROSE™ en una resina de intercambio anionico o cationico (tal como una columna de acido poliaspartico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitacion de sulfato amonico, tambien se encuentran disponibles dependiendo del polipeptido variante a recuperar.

Despues de una(s) etapa(s) de purificacion preliminar(es), la mezcla que comprende el polipeptido variante de interes y los contaminantes puede someterse a una cromatograffa de interaccion hidrofobica a bajo pH usando un tampon de elucion a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente llevada a cabo a bajas concentraciones de sal (p.ej., de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

E. Formulaciones farmaceuticas

Las formulaciones terapeuticas del polipeptido variante se preparan para almacenamiento mezclando el polipeptido variante que tiene el grado deseado de pureza con vehmulos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiologicamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehmulos, excipientes o estabilizantes aceptables son no toxicos para receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonioi; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol bufflico o bendlico; alquil parabenos tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexano; 3-pentanol y m-cresol); polipeptido de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos); protemas, tal como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; poffmeros hidrofobicos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos, que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metalicos (p.ej., complejos de Zn-protema); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG).

La formulacion de la presente memoria tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion particular que este siendo tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sf. Dichas moleculas estan presentes de forma adecuada en combinacion en cantidades que son efectivas para el proposito pretendido.

Los ingredientes activos tambien pueden estar atrapados en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsula de gelatina y microcapsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nano-partfculas y nanocapsulas) o 5 en macroemulsiones. Dichas tecnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a usar en administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.

Se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion 10 sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros hidrofobicos solidos que contienen el polipeptido variante, matrices que estan en la forma de artfculos conformados, p.ej., pelfculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de EE.UU. n° 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico tales como LUPRON DEPOT™ 15 (microesferas inyectables compuestas por copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolide), y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Aunque polfmeros tales como el acetato de etilen-vinilo y el acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas a lo largo de mas de 100 dfas, determinados hidrogeles liberan protemas durante periodos de tiempo mas cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposicion a la humedad a 37°C, dando como 20 resultado una perdida de actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden contemplar estrategias racionales para la estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es la formacion de enlaces S-S intermoleculares a traves de intercambio de tio-disulfuro, la estabilizacion se pueden lograr modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz 25 polimerica espedficas.

F. Usos no terapeuticos para el polipeptido variante

El polipeptido variante puede usarse como agente de purificacion por afinidad. En este proceso, el polipeptido variante se inmoviliza sobre una fase solida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando metodos bien conocidos en la tecnica. El polipeptido variante inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antfgeno a 30 purificar, y despues el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminara sustancialmente todo el material de la muestra excepto el antfgeno a purificar, que esta ligado al polipeptido variante inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampon de glicina, pH 5,0, que liberara el antfgeno del polipeptido variante.

El polipeptido variante tambien puede ser util en ensayos diagnosticos, p.ej., para detectar la expresion de un antfgeno 35 de interes en celulas espedficas, tejidos o suero.

Para aplicaciones diagnosticas, el polipeptido variante tfpicamente estara marcado con un resto detectable. Se dispone de numerosas etiquetas que pueden agruparse de forma general en las siguientes categonas:

(a) Radioisotopos, tal como 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. El polipeptido variante puede marcarse con el radioisotopo usando las tecnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volumenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience,

40 Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radioactividad se puede medir usando recuento de centelleo.

(b) Se dispone de marcas fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluorescema y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansyl, lissamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse al polipeptido variante usando las tecnicas descritas en Current Protocols in Immunology (ver arriba), por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar usando un fluonmetro.

45 (c) Se dispone de diversas marcas enzima-sustrato y la Patente de EE.UU. n° 4.275.149 proporciona una revision de

algunas de las mismas. El enzima generalmente cataliza una alteracion qmmica del sustrato cromogenico que puede medirse usando diversas tecnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotometricamente. De forma alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Las tecnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen arriba. El 50 sustrato quimioluminiscente se vuelve excitado electronicamente a traves de una reaccion qmmica y entonces puede emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminometro, por ejemplo) o dona energfa a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimaticas incluyen luciferasa (p.ej., luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE.UU. n° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rabano (HRPO), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacarido oxidasas (p.ej., 55 glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterodclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las tecnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., “Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme

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Immunoassay”, en Methods in Enzym. (ed. J. Langone y H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73: 147-166 (1981).

Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:

(i) Peroxidasa de rabano (HRPO) con hidrogeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrogeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (p.ej., ortofenilen diamina (OPD) o 3,3',5,5'-tetrametil bencidina hidrocloruro (TMB));

(ii) Fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogenico;

(iii) p-D-galactosidasa (p-D-Gal) con un sustrato cromogenico (p.ej., p-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-p-galactosidasa.

Los especialistas en la tecnica disponen de otras numerosas combinaciones enzima-sustrato. Para una revision general de las mismas, veanse las Patentes de EE.UU. n° 4.275.149 y 4.318.980.

Algunas veces, la etiqueta esta conjugada indirectamente con el polipeptido variante. El especialista en la tecnica es consciente de varias tecnicas para lograr esto. Por ejemplo, el polipeptido variante puede estar conjugado con biotina y cualquiera de las tres amplias categonas de etiquetas mencionadas antes puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y de este modo la etiqueta se puede conjugar con el polipeptido variante de este modo indirecto. Alternativamente, para lograr una conjugacion indirecta de la etiqueta con el polipeptido variante, el polipeptido variante se conjuga con un hapteno pequeno (p.ej., digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionado antes se conjuga con un polipeptido variante anti-hapteno (p.ej., anticuerpo anti- digoxina). De esta manera, se puede lograr la conjugacion indirecta de la etiqueta con el polipeptido variante.

En otra realizacion de la invencion, el polipeptido variante no necesitar estar marcado, y la presencia del mismo se puede detectar usando un anticuerpo marcado que se une al polipeptido variante.

El polipeptido variante de la presente invencion puede emplearse en cualquier metodo de ensayo conocido, tal como ensayos de union competitiva, ensayos de sandwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitacion. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pag. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

El polipeptido variante tambien puede usarse para ensayos diagnosticos in vivo. Generalmente, el polipeptido variante es marcado con un radionucleido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de tal modo que el antfgeno o las celulas que lo expresan pueden ser localizados usando inmunocentellograffa.

G. Usos in vivo del polipeptido variante

Se contempla que el polipeptido variante de la presente invencion pueda usarse para tratar un mairnfero, p.ej., un paciente que padece, o que esta predispuesto a, una enfermedad o trastorno que se beneficiana de la administracion del polipeptido variante. Las afecciones que pueden ser tratadas con el polipeptido variante son muchas e incluyen cancer (p.ej., donde el polipeptido variante se une al receptor HER2, CD20 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)); afecciones alergicas tales como asma (con un anticuerpo anti-IgE); y trastornos mediados por LFA-1 (p.ej., cuando el polipeptido variante es un anticuerpo anti-LFA-1 o anti-ICAM-1), etc.

Cuando el anticuerpo se une al receptor HER2, el trastorno preferiblemente es cancer que expresa HER2, p.ej. un tumor benigno o maligno que se caracteriza por la sobreexpresion del receptor HER2. Dichos canceres incluyen, aunque sin limitacion, cancer de mama, cancer de celula escamosa, cancer de pulmon de celula pequena, cancer de pulmon de celula no pequena, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glandula salivar, cancer de rinon, cancer de hngado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.

Segun lo mostrado en la presente memoria, se puede preparar un polipeptido con una region Fc variante que presenta una actividad de ADCC mejorada, o disminuida. Dichas moleculas tendran aplicacion en el tratamiento de diferentes trastornos.

Por ejemplo, el polipeptido variante con actividad de ADCC mejorada puede emplearse en el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que se desee la destruccion o eliminacion de tejido o de microorganismos extranos. Por ejemplo, el polipeptido se puede usar para tratar cancer; trastornos inflamatorios; infecciones (p.ej., infecciones bacterianas, vmcas, fungicas o de levadura); y otras afecciones (tales como bocio) en las que se desea la eliminacion de tejido, etc.

Cuando el polipeptido variante presenta una actividad de ADCC disminuida, dichas variantes pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos en los que se desea un polipeptido que contiene region Fc con una larga vida media, pero el polipeptido preferiblemente no presenta funcion(es) efectora(s) no deseada(s). Por ejemplo, el polipeptido que contiene region Fc puede ser un anticuerpo anti-factor de tejido (TF); un anticuerpo anti-IgE; y un anticuerpo anti- integrina (p.ej., un anticuerpo anti-a4p7). El mecanismo deseado de accion de dichos polipeptidos que contienen

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region Fc puede ser bloquear pares de union ligando-receptor. Ademas, el polipeptido que contiene region Fc con actividad de ADCC disminuida puede ser un anticuerpo agonista.

El polipeptido variante se administra mediante cualquier medio adecuado, que incluye la administracion parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento inmunosupresivo, administracion intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. Adicionalmente, el polipeptido variante se administra de forma adecuada mediante infusion de pulsos, particularmente con dosis declinantes del polipeptido variante. Preferiblemente, la dosificacion se realiza mediante inyecciones, lo mas preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica.

Para la prevencion o el tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada del polipeptido variante dependera del tipo de enfermedad a tratar, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si el polipeptido variante es administrado con fines preventivos o terapeuticos, de terapias previas, del historial clmico del paciente y de la respuesta del paciente al polipeptido variante, y del criterio del medico responsable. El polipeptido variante se administra de forma adecuada de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificacion inicial candidata para administracion al paciente del polipeptido variante es de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (p.ej., 0,1-20 mg/kg), tanto, por ejemplo, para una administracion unica o para mas administraciones separadas, o mediante infusion continua. Una dosificacion diaria tfpica podna oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios dfas o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento es sostenido hasta que se produce una supresion deseada de los smtomas de la enfermedad. Sin embargo, tambien pueden ser utiles otros regfmenes de dosificacion. El progreso de esta terapia se monitoriza facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.

La composicion de polipeptido variante se formulara, dosificara y administrara de un modo consistente con la correcta practica medica. Los factores para consideracion en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mairnfero concreto que va a ser tratado, la condicion clmica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administracion del agente, el metodo de administracion, el calendario de administracion, y otros factores conocidos por los practicantes de medicina. La “cantidad terapeuticamente efectiva” del polipeptido variante a administrar estara gobernada por tales consideraciones, y es la cantidad minima necesaria para prevenir, aliviar o tratar una enfermedad o trastorno. El polipeptido variante, aunque no tiene porque, esta formulado opcionalmente con uno o mas agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestion. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de polipeptido variante presente en la formulacion, del tipo de trastorno o tratamiento, y de otros factores discutidos anteriormente. Generalmente, estos se usan en las mismas dosificaciones y con las mismas rutas de administracion usadas aqu anteriormente o aproximadamente entre el 1 y el 99% de las dosificaciones empleadas con anterioridad.

La invencion se entendera mas completamente en referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben considerarse como limitativos del alcance de esta invencion.

Ejemplo 1

Ensayo de union de receptor de baja afinidad

Este ensayo determina la union de una region Fc de IgG a subunidades a de FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA recombinantes expresadas como protemas de fusion marcadas con His6-glutationa S transferasa (GST). Puesto que la afinidad de la region Fc de IgG1 por el FcyRI se encuentra en el rango nanomolar, la union de las variantes de Fc de IgG1 se puede medir valorando IgG monomerica y midiendo la IgG ligada con un anti-IgG policlonal en un formato ELISA estandar (Ejemplo 2, a continuacion). Sin embargo, la afinidad de los otros miembros de la familia FcyR, es decir, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, por IgG se encuentra en el rango micromolar, y la union de IgG1 monomerica a estos receptores no se puede medir con fiabilidad en un formato ELISA.

El siguiente ensayo utiliza variantes de Fc de E27 anti-IgE recombinante (Figuras 4A y 4B) que, cuando se mezcla con IgE humana en una ratio molar 1:1, forma un hexamero estable que consiste en tres moleculas anti-IgE y tres moleculas de IgE. Se diseno una forma quimerica recombinante de IgE (IgE quimerica) que consiste en una region Fc de IgE humana y el Fab de un anticuerpo anti-VEGF (Presta et al. Cancer Research 57: 4593-4599 (1997)) que se une a dos moleculas de VEGF por mol de anti-VEGF. Cuando se anade VEGF humano recombinante en una ratio molar 2:1 a los hexameros quimericos de IgE:E27, los hexameros se unen formando complejos de mayor peso molecular a traves de la interaccion de VEGF:Fab de IgE quimerica. El componente E27 de este complejo se une a las subunidades a de FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA con mayor avidez, para permitir la deteccion en un formato ELISA.

Materiales y metodos

Disposicion de receptores: se expresaron subunidades a de receptor de Fcy como fusiones GST de dominios extracelulares (ECDs) marcados con His6 en celulas 293 dando como resultado una protema de fusion ECD-6His- GST (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977) y Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)) y se

purifico mediante cromatograffa de columna Ni-NTA (Qiagen, Australia) y se cambio de tampon a salino tamponado con fosfato (PBS). Se determinaron las concentraciones mediante absorcion a 280 nm usando coeficientes de extincion derivados del analisis de composicion de aminoacidos. Los receptores fueron dispuestos sobre placas Nunc F96 maxisorb (n° de cat. 439454) a 100 ng por pocillo anadiendo 100 pL de fusion receptor-GST a 1 pg/mL en PBS y 5 se incubaron durante 48 horas a 4°C. Antes del ensayo, las placas fueron lavadas 3x con 250 pL de tampon de lavado

(PBS, pH 7,4, que contema 0,5% de TWEEN 20™) y bloqueados con 250 pL de tampon de ensayo (salino tamponado con Tris 50 mM, 0,05% de TWEEN20™, 0,5% de albumina bovina de grado RIA (Sigma A7888), y EDTA 2 mM, pH 7,4).

Formacion de complejo inmune: se anaden cantidades molares iguales (1:1) de E27 e IgE quimerica recombinante, 10 que se une a dos moles de VEGF humano recombinante por mol de IgE quimerica, a un tubo de polipropileno de 12

x 75 mm en PBS y se mezcla mediante rotacion durante 30 minutos a 25°C. Los hexameros de E27 (anti-IgE)/IgE quimerica (IgE) se forman durante esta incubacion. El VEGF humano recombinante (forma 165, PM 44.000) se anade en una ratio molar 2:1 a la concentracion de IgE y se mezcla mediante rotacion otros 30 minutos adicionales a 25°C. La union VEGF-IgE quimerica enlaza hexameros E27:IgE quimerica para formar complejos de mayor peso molecular, 15 que se unen a las placas recubiertas de ECD de subunidad a de FcyR a traves de la region Fc del anticuerpo E27.

E27:IgE quimerica:VEGF: se anaden complejos (ratio molar 1:1:2) a placas recubiertas de subunidad a de FcyR a concentraciones de E27 de 5 pg y 1 pg de IgG total por cuadriplicado en tampon de ensayo y se incubaron durante 120 minutos a 25°C en un agitador orbital.

Deteccion de complejo: las placas fueron lavadas 5x con tampon de lavado para eliminar los complejos no ligados y 20 la union de IgG se detecto mediante la adicion de 100 pL de peroxidasa de rabano (HRP) conjugada a anti-cadena pesada espedfica (y) de IgG humana de cabra (Boehringer Mannheim 1814249) a 1:10.000 en tampon de ensayo y se incubo durante 90 minutos a 25°C en un agitador orbital. Las placas fueron lavadas 5x con tampon de lavado para eliminar HRP de cabra anti-IgG humana y el anti-IgG ligado es detectado anadiendo 100 pL de disolucion sustrato (0,4 mg/mL de dihidrocloruro de O-fenilendiamina, Sigma P6912, H2O2 6 mM en PBS) e incubando durante 8 minutos 25 a 25°C. La reaccion enzimatica se detiene mediante la adicion de 100 pL de H2SO4 4,5 N y el producto colorimetrico se mide a 490 nm en un densitometro de placa de 96 pocillos (Molecular Devices). La union de complejos de variante E27 se expresa como un porcentaje del complejo que contiene E27 natural.

Ejemplo 2

Identificacion de sitios de union unicos de C1q en anticuerpo de IgG humano

30 En el presente estudio, se identificaron mutaciones en el dominio CH2 de un anticuerpo de IgG1 humano, “C2B8” (Reff et al., Blood 83: 435 (1994)), que suprimio la union del anticuerpo a C1q pero no altero la conformacion del anticuerpo ni afecto a la union a cada uno de los FcyRs. Mediante mutagenesis de escaneo de alanina, se identificaron cinco variantes en IgG1 humana, D270K, D270V, K322A, P329A y P331, que fueron no ltticas y presentaron una union disminuida a C1q. Los datos sugirieron que los sitios de union a C1q centrales en IgG1 humana son diferentes a los 35 de IgG2b murina. Adicionalmente, se observo que K322A, P329A y P331A se unen de forma normal al antfgeno CD20, y a los cuatro receptores de Fc, FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn.

Materiales y metodos

Construccion de variantes de C2B8: Se usaron las cadenas quimericas ligera y pesada del anticuerpo anti-CD20 C2B8 (Reff et al., Blood 83: 435 (1994)) subclonadas por separado en vectores PRK descritos previamente (Gorman 40 et al., DNA Protein Eng. Tech. 2: 3 (1990)). Mediante mutagenesis dirigida a sitio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)), se construyeron variantes de escaneo de alanina de la region Fc en la cadena pesada. Los plasmidos de cadena pesada y ligera fueron co-transfectados en una lmea celular embrionaria humana transformada con adenovirus, como se ha descrito previamente (Werther et al, J. Immunol. 157: 4986 (1996)). El medio se cambio a libre de suero 24 horas despues de la transfeccion y se recolecto el anticuerpo secretado despues de cinco dfas. 45 Los anticuerpos fueron purificados usando Protema A-SEPHAROSE CL-4B™ (Pharmacia), se cambio el tampon y se concentro a 0,5 mL con PBS usando una Centricon-30 (Amicon), y se almaceno a 4°C. Se determino la concentracion de anticuerpo usando ELISA de union a Ig.

ELISA de union a C1q: Se recubrieron placas de 96 pocillos Costar durante una noche a 4°C con las concentraciones indicadas de C2B8 en tampon de recubrimiento (tampon de carbonato sodico 0,05 M), pH 9. A continuacion las placas 50 fueron lavadas 3x con PBS/ 0,05% de TWEEN 20™, pH 7,4, y bloqueadas con 200 pL de diluyente ELISA sin timerosal (NaPO4 0,1M / NaCl 0,1M / 0,1% de gelatina / 0,05% de TWEEN 20™ / 0,05% de ProClin300) durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavo 3x con tampon de lavado, se anadio una alfcuota de 100 pL de 2 pg/mL de C1q (Quidel, San Diego, CA) a cada pocillo y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuacion la placa se lavo 6x con tampon de lavado. Se anadio a cada pocillo 100 pL de una dilucion 1:1000 de anticuerpo 55 conjugado anti-complemento de peroxidasa C1q de oveja (Biodesign) y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavo nuevamente 6x con tampon de lavado y se anadio a cada pocillo 100 pL de tampon de sustrato (PBS/0,012% de H2O2) que contema OPD (dihidrocloruro de O-fenilendiamina (Sigma)). La reaccion de oxidacion, observada a traves de la aparicion de un color amarillo, se dejo evolucionar durante 30 minutos y se detuvo

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mediante la adicion de 100 pL de H2SO4 4,5 N. A continuacion se leyo la absorbancia a (492-405) nm usando un lector de microplaca (SPECTRA MAX 250™, Molecular Devices Corp.). Se ejecutaron los controles apropiados en paralelo (es decir, se llevo a cabo el ELISA sin C1q para cada concentracion de C2B8 usada y tambien se llevo a cabo el ELISA sin C2B8). Para cada variante, se midio la union a C1q representando la absorbancia a (492-405) nm frente a la concentracion de C2B8 en pg/mL usando un programa de ajuste de curva de 4 parametros (KALEIDAGRAPH™) y comparando los valores de EC50.

Ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (ADCC'). Este ensayo se llevo a cabo esencialmente como se ha descrito previamente (Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202. 163 (1996)). Se diluyeron varias concentraciones de C2B8 (0,08-20 pg/mL) con tampon de RHB (RPMI 1640/HEPES 20 mM (pH 7,2)/Glutamina 2 mM(0,1% de BSA/100 pg/mL de Gentamicina). Se diluyo complemento humano (Quidel) 1.3 en tampon RHB y celulas WIL2-S (disponibles en ATCC, Manassas, VA) que expresan el antigeno CD20 fueron diluidas hasta una densidad de 1 x 106 celulas/mL con tampon RHB. Se anadieron mezclas de 150 pL que conteman volumenes iguales de C2B8, complemento humano diluido y celulas WIL2-S a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo plano y se dejo incubar durante 2 h a 37°C y 5% de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por complemento. A continuacion se anadieron 50 pL de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo y se incubo durante una noche a 37°C. Se midio la absorbancia usando un fluorometro de 96 pocillos con excitacion a 530 nm y emision a 590 nm. Tal como describen Gazzano-Santoro et al., los resultados se expresan en unidades de fluorescencia relativas (RFU). Las concentraciones de muestra se calcularon a partir de una curva de calibrado CDB8 y para cada variante se presenta el porcentaje de actividad en comparacion con C2B8 natural.

Potencia de union a CD20 de las variantes de C2B8. La union de C2B8 y variantes al antfgeno CD20 se determino mediante un metodo descrito previamente (Reff et al., (1994), ver anterior; revisado en Gazzano-Santoro et al., (1996), ver anterior). Se crecieron celulas WIL2-S durante 3-4 dfas hasta una densidad celular de 1 x 106 celulas/mL. Las celulas fueron lavadas y giradas dos veces en tampon FACS (PBS/0,1% de BSA/0,02% de NaN3) y se resuspendieron hasta una densidad celular de 5 x 106 celulas/mL. Se anadieron 200 pL de celulas (5 x 106 celulas/mL) y 20 pL de muestras de C2B8 diluido a un tubo de 5 mL y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacion. A continuacion la mezcla se lavo con 2 mL de tampon FACS fno, se precipito mediante centrifugacion y se resuspendio en 200 pL de tampon FACS fno. A la suspension, se anadieron 10 pL de anti-IgG humana-FITC de cabra (American Qualex Labs.) y la mezcla se incubo a oscuras a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacion. Tras la incubacion, la mezcla se lavo con 2 mL de tampon FACS, se precipito mediante centrifugacion y se resuspendio en 1 mL de tampon fijador fno (1% de formaldehfdo en PBS). Las muestras fueron analizadas mediante citometna de flujo y los resultados se expresaron como unidades de fluorescencia relativas (RFU) frente a las concentraciones de anticuerpo usando un programa de ajuste de curvas de 4 parametros (KALEIDAGRAPH™). Los valores de EC50 se presentan como un porcentaje del material de referencia de C2B8.

ELISAs de union a FcyR. la fusion subunidad a de FcyRI-GST se extendio sobre placas maxisorb Nunc F96 (n° cat. 439454) anadiendo 100 pL de fusion receptor-GST a 1 pg/mL en PBS y se incubo durante 48 horas a 4°C. Antes del ensayo, las placas fueron lavadas 3x con 250 pL de tampon de lavado (PBS, pH 7,4, que contema 0,5% de TWEEN 20™) y se bloqueo con 250 pL de tampon de ensayo (salino tamponado con Tris 50 mM, 0,05% de TWEEN 20™, 0,5% de albumina bovina de grado RIA (Sigma A7888), y EDTA 2 mM pH 7,4). Las muestras diluidas a 10 pg/mL en 1 mL de tampon de ensayo son anadidas a las placas recubiertas de subunidad a de FcyRI y se incuban durante 120 minutos a 25°C en un agitador orbital. Las placas se lavan 5x con tampon de lavado para eliminar los complejos no ligados y la union a IgG se detecta anadiendo 100 pL de anti-IgG (y) humana espedfica de cadena pesada, de cabra conjugado a peroxidasa de rabano (HRP) (Boehringer Mannheim 1814249) a 1.10.000 en tampon de ensayo y se incubo durante 90 minutos a 25°C en un agitador orbital. Las placas son lavadas 5x con tampon de lavado para eliminar el anti-IgG humana de cabra HRP no ligado y el anti-IgG ligado se detecta anadiendo 100 pL de disolucion sustrato (0,4 mg/mL de dihidrocloruro de O-fenilendiamina, Sigma P6912, H2O2 6 mM en PBS) y se incuba durante 8 minutos a 25°C. La reaccion enzimatica se detiene mediante la adicion de 100 pL de H2SO4 4,5 N y el producto colorimetrico se mide a 490 nm en un densitometro de placa de 96 pocillos (Molecular Devices). La union de la variante se expresa como un porcentaje de la molecula natural.

Se llevaron a cabo ELISAs de union a FcyRII y III como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior.

Para medir la actividad de union a FcRn de las variantes de IgG, se recubrieron placas ELISA con 2 pg/mL de estreptavidina (Zymed, South San Francisco) en tampon de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4°C durante una noche y se bloquearon con PBS-0,5% de BSA, pH 7,2 a temperatura ambiente durante una hora. Se anadio a la placa FcRn biotinilado (preparado usando biotina-X-NHS de Research Organics, Cleveland, OH, y usado a 1-2 pg/mL) en PBS- 0,5% de BSA, 0,05% de polisorbato 20, pH 7,2, y se incubo durante una hora. Dos diluciones en serie a la mitad de patron de IgG (1,6-100 ng/mL) o de variantes en PbS-0,5% de BSA, 0,05% de polisorbato 20, pH 6,0, fueron anadidas a la placa y se incubaron durante dos horas. La IgG ligada fue detectada usando F(ab')2 anti-IgG humana de cabra marcado con peroxidasa en el tampon anterior de pH 6,0 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) seguido de 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (Kirgaard & Perry Laboratories) como sustrato. Las placas fueron lavadas entre etapas con PBS-0,05% de polisorbato 20 a pH 7,2 o 6,0. La absorbancia se leyo a 450 nm en un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Se ajustaron las curvas de valoracion con un programa de ajuste de curvas de regresion no lineal de cuatro parametros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Se calcularon las concentraciones de las variantes de IgG correspondientes a la absorbancia de punto medio de la curva de valoracion

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del patron y a continuacion se dividieron por la concentracion del patron correspondiente a la absorbancia del punto medio de la curva de valoracion de patron.

Resultados y discusion

Mediante mutagenesis de escaneo de alanina, se construyeron varias mutaciones puntuales individuales en el dominio CH2 de C2B8 comenzando con E318A, K320A y K322A. Todas las variantes construidas se ligaron de forma normal al antfgeno de CD20 (Tabla 3).

Tabla 3

wt (natural) E318A K320A *K322A *P329A P331A

FcRn

+ + + +

CD20

+ + + + + +

FcyRI

+ + + + + +

FcyRII

+ + + + + +

FcyRIII

+ + + + + +

**C1q

+ + + + + + + + - - -

CDC

+ + + - - -

(+) indica union y (-) significa supresion de la union. ** Con respecto a la union de C1q, cada signo + es equivalente a aproximadamente un 33% de union. * no segun la invencion.

Cuando se analizo la union de complemento humano a un anticuerpo con un Fc humano, la capacidad de E318A y K320A para activar el complemento fue esencialmente identica a la de C2B8 natural (Tabla 3). Cuando se compara con C2B8 natural, parece que hay poca diferencia en la union de E318A y K320A a C1q. Solo hay un 10% de disminucion en la union de K320A y aproximadamente un 30% de disminucion en la union de E318A a C1q (Fig. 2). Los resultados indican que el efecto de la sustitucion de E318A y K320A sobre la activacion de complemento y la union de C1q es mmimo. Asimismo, la IgG1 humana de C2B8 fue sustituida por IgG2 humana y se uso como control negativo en los estudios de union a C1q. La variante de IgG2 parece tener mucha menor afinidad por C1q que las variantes E318A y K320A (Fig. 2). Por tanto, los resultados demuestran que E318 y K320 no constituyen los sitios de union a C1q nucleares para la IgG1 humana. Inversamente, la sustitucion K322A presente un efecto significativo tanto sobre la actividad de complemento como sobre la union a C1q. La variante de K322A no presento actividad de CDC cuando se evaluo en el anterior ensayo de CDC y fue mas de 100 veces inferior al C2B8 natural en union a C1q (Fig. 2). En el sistema humano, K322 es el unico residuo de los sitios de union a C1q nucleares propuestos que resulto tener un efecto significativo sobre la activacion de complemento y la union a C1q.

Puesto que el estudio de Duncan y Winter se llevo a cabo usando IgG2b de raton y los anteriores resultados revelan que K320 y E318 en la IgG1 humana no estan implicados en la union a C1q, y sin pretender establecer ninguna teona, los datos anteriores sugieren que la region de union a C1q en las IgGs murinas es diferente a las humanas. Para profundizar en este aspecto, y tambien para identificar variantes adicionales que no se unen a C1q y por tanto no activan complemento, se construyeron varias mutaciones puntuales adicionales en las proximidades de K322, determinadas mediante la estructura tridimensional de la Fc de C2B8. Las variantes construidas, K274A, N276A, Y278A, S324A, P329A, P331A, K334A y T335A, fueron evaluadas en terminos de capacidad de union a C1q y tambien para activar complemento. Muchas de estas sustituciones tuvieron poco o ningun efecto sobre la union a C1q o la activacion de complemento. En los anteriores ensayos, las variantes P329A y P331A no activaron complemento y presentaron una union reducida a C1q. La variante P331A no activo complemento y fue 60 veces inferior a la union a C1q (Fig. 3) cuando se compara con el C2B8 natural (Fig. 2). El rango de concentracion de los anticuerpos variantes usados en la Fig. 3 se expande a 100 pg/mL a fin de observar la saturacion de la union a C1q a la variante P331A. La mutacion P329A da como resultado un anticuerpo que no activa complemento y que es mas de 100 veces inferior en union a C1q (Fig. 3) en comparacion con el C2B8 natural (Fig. 2).

Las variantes que no se unieron a C1q y que por tanto no activan complemento cuando se examinan en terminos de capacidad de union a los receptores de Fc: FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y FcRn. Este estudio concreto se llevo a cabo usando un anticuerpo anti-IgE humanizado, un anticuerpo de IgG1 con dichas mutaciones (vease el Ejemplo 1 anterior). Los resultados revelaron que las variantes, K322A y P329A, se unen a todos los receptores de Fc en la misma medida que la protema natural (Tabla 4). Sin embargo, se produjo una pequena disminucion en la union de P331A a FcyRIIB.

En conclusion, se identifico que dos sustituciones de aminoacido en la region terminal COOH del dominio CH2 de la IgG1 humana, K322A y P329a, dan como resultado una reduccion de mas de 100 veces en la union a C1q y que no

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activan la ruta de CDC. Estas dos variantes, K322A y P329A, se unen a todos los receptores de Fc con la misma afinidad que el anticuerpo natural. En base a los resultados, resumidos en la Tabla 4, y sin pretender establecer ninguna teona, se propone que el epicentro de la union a C1q de la IgG1 humana esta centrado alrededor de K322, P329 y P331 y es diferente del epicentro de la IgG2b murina, que constituyen E318, K320 y K322.

Tabla 4

wt (natural) E318A K320A *K322A *P329A P331A

CD20

100 89 102 86 112 103

aFcYRI

100 93 102 90 104 74

aFcYRIIA

100 113 94 109 111 86

aFcYRIIB

100 106 83 101 96 58

aFcYRIII

100 104 72 90 85 73

CDC

100 108 108 nada nada nada

a Para la union a los FcyRs las variantes se prepararon en el fondo de E27 (anti-IgE). Los resultados se presentan como porcentaje del natural. * no segun la invencion.

Se identifico un residuo adicional implicado en la union a C1q humano usando los metodos descritos en el presente ejemplo. El residuo D270 fue reemplazado por lisina y valina para generar las variantes D270K y D270V, respectivamente. Estas variantes mostraron ambas un descenso en la union a C1q humano (Fig. 6) y fueron no ltticas (Fig. 7). Las dos variantes ligaron el antfgeno CD20 de forma normal y reclutaron ADCC.

Ejemplo 3

Variantes con union a C1q mejorada

El siguiente estudio demuestra que la sustitucion de residuos en las posiciones K326, A327, E333 y K334 dio como resultado variantes con al menos aproximadamente un 30% de incremento en la union a C1q cuando se compara con el anticuerpo natural. Esto indico que K326, A327, E333 y K334 son sitios potenciales para mejorar la eficacia de anticuerpo a traves de la ruta de CDC. El objetivo de este estudio fue mejorar la actividad de CDD de un anticuerpo aumentando la union a C1q. Mediante mutagenesis sitodirigida en K326 y E333, se construyeron varias variantes con union mejorada a C1q. Los residuos en orden de union incrementada a en K326 son K<V<E<A<G<D<M<W, y los residuos en orden de union incrementada en E333 son E<Q<D<V<G<A<S. Se construyeron cuatro variantes, K326M, K326D, K326E y E333S con un incremento de al menos dos veces en la union a C1q con respecto al tipo natural. La variante K326W presento un incremento de aproximadamente cinco veces en la union a C1q.

Las variantes del anticuerpo C2B8 natural se prepararon como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Un anticuerpo de control adicional, C2B8 natural, producido en celulas de ovario de hamster chino (CHO) esencialmente como se describe en la Patente de EE.UU. 5.736.137, se incluyo en un ELISA de union a C1q para confirmar que el C2B8 wt producido en la lmea celular renal 293 tema la misma actividad de union a C1q que el anticuerpo producido en CHO (vease “CHO-wt-C2B8” en la Fig. 8). El ELISA de union a C1q, el ensayo de CDC y el ensayo de potencia de union a CD20 de este ejemplo se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2.

Tal como se muestra en la Fig. 8, la sustitucion de alanina en K326 y E333 en C2B8 dio como resultado variantes con aproximadamente un 30% de incremento en la union a C1q.

Se construyeron otras varias variantes de punto individual en K326 y E333 y se evaluaron en terminos de su capacidad para unirse a C1q y activar complemento. Todas las variantes construidas se ligaron de forma normal al antfgeno CD20.

Con respecto a K326, las otras variantes de punto individual construidas fueron K326A, K326D, K326E, K326G, K326V, K326M y K326W. Tal como se muestra en la Fig. 9, estas variantes se ligaron todas a C1q con mejor afinidad que el anticuerpo natural. K326W, K326M, K326D y K326E mostraron un aumento de al menos dos veces en la union a C1q (Tabla 5). Entre las variantes de K326, la K326W presento la mejor afinidad por C1q.

Tabla 5

Variante

Valor EC50

Natural (“Wild type”)

1,53

K326V

1,30

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Variante

Valor EC50

K326A

1,03

K326E

1,08

K326G

0,95

K326D

0,76

K326M

0,67

K326W

0,47

E333S

0,81

E333A

0,98

E333G

1,14

E333V

1,18

E333D

1,22

E333Q

1,52

K334A

1,07

Las sustituciones con residuos hidrofobicos y cargados dieron como resultado variantes con union a C1q incrementada. Incluso la sustitucion con glicina, que se sabe que confiere flexibilidad a una cadena y esta bien conservada en la naturaleza, dio como resultado una variante con una mayor afinidad por C1q en comparacion con el tipo natural. Parecena que cualquier sustitucion de aminoacido en este sitio dana como resultado una variante con mayor afinidad por C1q. Segun se ha determinado a traves de la estructura tridimensional, K326 y E333 estan en las proximidades de los sitios de union a C1q nucleares (Fig. 10).

Ademas de por alanina, E333 tambien fue sustituido por otros residuos de aminoacido. Estas variantes, E333S, E333G, E333v, E333D y E333Q, presentaron todas un aumento de la union a C1q en comparacion con el tipo natural (Fig. 11). Tal como se muestra en la Tabla 5, el orden de afinidad de union a C1q fue como se indica a continuacion: E333S>E333A>E333G>E333V>E333D>E333Q. Las sustituciones con residuos de aminoacido con volumenes de cadena lateral pequenos, es decir, serina, alanina y glicina, dieron como resultado variantes con mayor afinidad por C1q en comparacion con las otras variantes, E333V, E333D y E333Q, de mayores volumenes de cadena lateral. La variante E333S presento la mayor afinidad por C1q, presentando un aumento de dos veces en la union con respecto al tipo natural. Sin pretender establecer ninguna teona, esto indica que el efecto sobre la union a C1q en 333 tambien puede ser debido en parte a la polaridad del residuo.

Tambien se generaron variantes dobles. Tal como se muestra en las Figs. 12 y 13, las variantes dobles K326M-E333S y K326A-E333A fueron al menos tres veces mejores en la union a C1q humano que el C2B8 natural (Fig. 12) y al menos dos veces mejores en mediar en la CDC con respecto al C2B8 natural (Fig. 13). La aditividad indica que estas son variantes que actuan de forma independiente.

Tal como se muestra en la Fig. 14, se preparo una variante adicional con union a C1q mejorada (50% de aumento) cambiando A327 de una region constante de IgG1 humana por glicina. Inversamente, en una region constante de IgG2 humana, el cambio de G327 a alanina redujo la union a C1q del anticuerpo de IgG2.

Ejemplo 4

Identificacion de los sitios de union a FcR en anticuerpos de IgG humanos

En el presente estudio, se evaluo el efecto de mutar varios residuos de la region Fc de un anticuerpo de IgG1 con respecto a la union a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, asf como a FcRn. Se identificaron las variantes de anticuerpo con union a FcR mejorada y reducida.

Materiales y metodos

Construccion de variantes de IgG1: E27 anti-IgE recombinante que tiene las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de las Figuras 4A y 4B, respectivamente, se uso como anticuerpo original en los siguientes experimentos. Este anticuerpo se une al antfgeno de IgE y tiene una region Fc de IgG1 de alotipo no A. Mediante mutagenesis sitodirigida (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)), se construyeron variantes de la region Fc de la cadena pesada del anticuerpo original anterior. Se co-transfectaron los plasmidos de cadena pesada y ligera en una lmea celular embrionaria humana transformada con adenovirus como se ha descrito previamente (Werther et al., J. Immunol. 157: 4986 (1996)). Se cambio el medio a libre de suero 24 horas despues de la transfeccion y se recolecto el anticuerpo secretado despues de cinco dfas. Los anticuerpos fueron purificados mediante Protema G

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SEPHAROSE® (Pharmacia), se cambio el tampon y se concentro hasta 0,5 mL con PBS usando una Centricon-30 (Amicon), y se almaceno a 4°C. La concentracion se determino mediante adsorcion a 280 nm usando coeficientes de extincion derivados del analisis de composicion de aminoacidos.

ELISA de union a FcyRIA de alta afinidad: Se expreso FcyRIA como una fusion GST de dominio extracelular marcado con His6 en celulas 293 y se purifico mediante cromatograffa en columna de Ni-NTA.

Para purificar el FcyRIA, el sobrenadante de las celulas 293 transfectadas fue eliminado despues de tres dfas. Se anadieron inhibidores de proteasa; 50 pL de aprotinina (Sigma)/ 50 mL de sobrenadante, y PMSF (1 mM). Los sobrenadantes fueron concentrados hasta 10 mL en una celula agitada (Amicon), y se dializaron durante una noche a 4°C contra 1 litro de tampon de columna (Tris 50 mM, pH 8,0, Imidazol 20 mM, NaCl 300 mM). Se realizo una dialisis adicional a la manana siguiente contra tampon de columna fresco durante 4 horas a 4°C. La disolucion se cargo en una columna de 1 mL de Ni++ (resina de superflujo NTA, Qiagen) equilibrada previamente con 10 mL de tampon de columna. Las columnas se lavaron con 10 mL de tampon de columna, y se eluyo la protema con 2,5 mL de tampon de elucion (Tris 50 mM pH 8,0, imidazol 250 mM, NaCl 300 mM). La protema se concentro hasta 0,5 mL y se cambio el tampon a PBS. Se determinaron las concentraciones mediante adsorcion a 280 nm usando un coeficiente de extincion derivado del analisis de composicion de aminoacidos.

Los receptores purificados fueron extendidos sobre placas maxisorb Nunc F96 (n° cat. 439545) a aproximadamente 150 ng por pocillo anadiendo 100 pL de receptor a 1,5 pg/mL en PBS y se incubo durante 24 horas a 4°C. Antes del ensayo, las placas fueron lavadas 3x con 250 pL de tampon de lavado (salino tamponado con fosfato pH 7,4, que contema 0,5% de TWEEN 20®) y se bloqueo con 250 pL de tampon de ensayo (salino tamponado con Tris 50 mM, 0,05% de TWEEN 20®, 0,5% de albumina bovina de grado RIA (Sigma A7888), y EDTA 2 mM, pH 7,4).

Se anadieron 100 pL de E27 a los primeros cuatro pocillos de la placa recubierta con subunidad de FcyRIA a una concentracion de 10 pg/mL. Se anadieron 80 pL de tampon de ensayo a los siguientes cuatro pocillos, seguido de 20 pL de la IgG de E27 a 10 pg/mL para dar lugar a una concentracion final de 2 pg/mL. Las placas fueron incubadas a 25°C durante 2 horas en un agitador orbital.

Para la deteccion, las placas fueron lavadas 5x con tampon de lavado para eliminar el anticuerpo no ligado. Se detecto la union de IgG a GST-FcyRIA anadiendo 100 pL de protema G conjugada a peroxidasa de rabano (HRP) (BIORAD) a 1:5000. Los conjugados de HRP fueron incubados durante 1,5 horas a 25°C en un agitador orbital. Las placas se lavaron 5x con tampon de lavado para eliminar el conjugado de HRP no ligado. La union se detecto anadiendo 100 pL de disolucion de sustrato (0,4 mg/mL de dihidrocloruro de O-fenilendiamina, Sigma P6912, H2O2 6 mM en PBS) e incubando durante 10 minutos a 25°C. La reaccion enzimatica se detuvo mediante la adicion de 100 pL de H2SO4 4,5 N y el producto colorimetrico se midio a 490 nm en un densitometro de placa de 96 pocillos (Molecular Devices).

La union de las variantes de E27 a una concentracion de IgG de 2 pg/mL se expreso como la ratio respecto al tipo natural de E27.

Ensayo de THP-1 de FcyRIA: Se anadieron 100 pL de E27 a los primeros tres pocillos de una placa de serocluster (Costar) a una concentracion de 20 pg/mL en tampon de ensayo (1x PBS, 0,1% de BSA, 0,01% de NaN3). Se anadieron 92,5 pL de tampon de ensayo a los siguientes tres pocillos, seguido de 7,5 pL de la IgG de E27 a 20 pg/mL para dar lugar a una concentracion final de 1,5 pg/mL. A cada pocillo se anadieron 100 pL de THP-1 a una concentracion de 5 millones de celulas/mL en tampon de ensayo FACS. La placa se incuba en hielo durante 30 minutos.

Para la deteccion, las celulas se lavaron 2x con tampon de ensayo para eliminar el anticuerpo no ligado. Se detecto IgG ligada a FcyRIA anadiendo 100 pL de fragmento F(ab')2 conjugado a FITC de anti-cadena pesada espedfica de IgG humana (Jackson Immunoresearch) a 1:200. Los conjugados de FITC se incubaron con celulas durante 30 minutos en hielo. Las celulas fueron lavadas x3 con tampon de ensayo para eliminar conjugado de FITC no ligado. Las celulas se tineron con P.I. (SIGMA) a 2,5 pg/mL y se analizaron mediante citometna de flujo.

La union de variantes de E27 a una concentracion de IgG de 1,5 pg/mL se expreso como una ratio respecto al tipo natural de E27.

Los datos del ensayo de placa (ELISA de FcyRIA) y del ensayo basado en celula (ensayo THP-1 de FcyRIA) se promediaron para obtener una actividad de union a FcyRIA.

ELISA de union a FcyR de baja afinidad: Se llevaron a cabo ELISAs de union a FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, con deteccion del hexamero estable (que consiste en tres moleculas anti-IgE y tres moleculas de IgE).

ELISA de union a FcRn: Para medir la actividad de union a FcRn de las variantes de IgG, se recubrieron placas ELISA con 2 pg/mL de estreptavidina (Zymed, South San Francisco) en tampon de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4°C durante una noche y se bloqueo con PBS-0,5% de BSA, pH 7,2, a temperatura ambiente durante una hora. Se anadio a la placa FcRn biotinilado (preparado usando biotina-X-NHS de Research Organics, Cleveland, OH, y usado a 1-2 pg/mL) en PBS-0,5% de BSA, 0,05% de polisorbato 20, pH 7,2, y se incubo durante una hora. Se anadieron a la placa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

diluciones en serie a la mitad de patron de IgG (1,6-100 ng/mL) o de variantes en PBS-0,5% de BSA, 0,05% de polisorbato 20, pH 6,0, y se incubo durante dos horas. La IgG ligada fue detectada usando F(ab')2 de cabra marcado con peroxidasa anti-F(ab')2 de IgG humana en el anterior tampon de pH 6,0 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) seguido de 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (Kirgaard & Perry Laboratories) como sustrato. Las placas fueron lavadas entre etapas con PBS-0,05% de TWEEN 20® a pH 7,2 o 6,0. Se leyo la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Se ajustaron curvas de valoracion con un programa de ajuste de curvas de regresion no lineal de cuatro parametros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Se calcularon las concentraciones de variantes de IgG correspondientes a la absorbancia de punto medio de la curva de valoracion de calibrado y a continuacion se dividieron por la concentracion del patron correspondiente a la absorbancia de punto medio de la curva de valoracion de calibrado.

Ensayo de ADCC in vitro, para preparar celulas diana marcadas con 51, se crecieron lmeas de celulas tumorales en placas de cultivo de tejido y se recolectaron usando EDTA 10 mM esteril en PBS. En todos los ensayos se usaron como dianas celulas sK-BR-3, una lmea celular de cancer de mama humano que sobreexpresa 3+ HER2. Las celulas desprendidas fueron lavadas dos veces en medio de cultivo celular. Las celulas (5x106) se marcaron con 200 pCi de cromo 51 (New England Nuclear/DuPont) a 37°C durante una hora con mezcla ocasional. Las celulas marcadas fueron lavadas tres veces con el medio de cultivo celular, a continuacion se resuspendieron hasta una concentracion de 1x105 celulas/mL. Las celulas fueron usadas sin opsonizacion, o fueron opsonizadas antes del ensayo mediante incubacion con rhuMAb HER2 natural (HERCEPTIN®) o siete mutantes de Fc (G14, G18, G17, G36, G30, G31 y G34) a 100 ng/mL y 1,25 ng/mL en el ensayo de PBMC o 20 ng/mL y 1 ng/mL en el ensayo de NK.

Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica tomando muestras de sangre en heparina de donantes sanos normales y mediante dilucion con un volumen igual de salino tamponado con fosfato (PBS). A continuacion la sangre se extendio en capas sobre LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM® (LSM, Organon Teknika) y se centrifugo segun las instrucciones del fabricante. Las celulas mononucleares fueron recolectadas de la interfaz LSM-plasma y se lavaron tres veces con PBS. Las celulas efectoras fueron suspendidas en medio de cultivo celular hasta una concentracion final de 1x107 celulas/mL.

Tras purificacion a traves de LSM, las celulas asesinas naturales (NK) fueron aisladas de las PBMCs mediante seleccion negativa usando un kit de aislamiento de celulas NK y una columna magnetica (Miltenyi Biotech) segun las instrucciones del fabricante. Se recolectaron las celulas NK aisladas, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo hasta una concentracion de 2x106 celulas/mL. La identidad de las celulas nK fue confirmada mediante analisis de citometna de flujo.

Se prepararon ratios variables de efector.diana mediante dilucion en serie de las celulas efectoras (tanto PBMC como NK) a la mitad a lo largo de las filas de una placa de microtitulacion (volumen final de 100 pL) en medio de cultivo celular. La concentracion de celulas efectoras oscilo entre 1,0 x 107/mL y 2,0 x 104/mL para PBMC y entre 2,0 x 106/mL y 3,9 x 103/mL para NK. Tras la valoracion de las celulas efectoras, se anadieron a cada pocillo de la placa 100 pL de celulas diana marcadas con cromo 51 (opsonizadas o no opsonizadas) a 1x105 celulas/mL. Esto dio como resultado una ratio inicial efector.diana de 100,1 para celulas PBMC y de 20,1 para celulas NK. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado, y cada placa contema controles tanto para lisis espontanea (sin celulas efectoras) como para lisis total (celulas diana mas 100 pL de dodecil sulfato sodico al 1%, hidroxido sodico 1 N). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 18 horas, tras lo cual se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular usando un sistema de recoleccion de sobrenadante (Skatron Instrument, Inc.) y se contabilizaron en un contador gamma Minaxi auto-gamma 5000 series (Packard) durante un minuto. Los resultados se expresaron entonces como porcentaje de citotoxicidad usando la formula.

% Citotoxicidad = (cpm muestra - lisis espontanea) / (lisis total - lisis espontanea) x 100 A continuacion se uso un ajuste de curva de cuatro parametros para evaluar los datos (KaleidaGraph 3.0.5). Resultados

Se genero una variedad de variantes de anticuerpo que teman una actividad de union a FcR que difena del anticuerpo original. Los datos de union a FcR correspondientes a las variantes generadas se muestran a continuacion en las Tablas 6 y 7. Una variante adicional, T307q, tambien presento una union a FcRn mejorada en comparacion con el anticuerpo original E27.

Tabla 6

VARIANTES DE DOMINIO CH2

IG2

Res n° EU (Kabat) FcRn FcyRI FcyRIIA FcyRIIB FcyRI IIIA

med. sd n med. sd n med. sd med. sd med. sd

UNION REDUCIDA A TODOS LOS FcyR

1

233-236 ELLG > PVA- 0,54 (0,20) 3 0,12 (0,06) 6 0,08 (0,01) 0,12 (0,01) 0,04 (0,02) n=2

2*

P238A(251) 1,49 (0,17) 3 0,60 (0,05) 5 0,38 (0,14) 0,36 (0,15) 0,07 (0,05) n=4

14

D265A(278) 1,23 (0,14) 4 0,14 (0,04) 6 0,07 (0,01) 0,13 (0,05) 0,09 (0,06) n=4

17

E269A(282) 1,05 0,52 (0,03) 6 0,65 (0,18) 0,75 (0,29) 0,45 (0,13) n=5

18

D270A(283) 1,05 0,76 (0,12) 6 0,06 (0,01) 0,11 (0,05) 0,14 (0,04) n=5

58

N297A(314) 0,80 (0,18) 8 0,15 (0,06) 7 0,05 (0,00) 0,10 (0,02) 0,03 (0,01) n=3

52

A327Q(346) 0,97 0,63 (0,15) 7 0,13 (0,03) 0,14 (0,03) 0,06 (0,01) n=4

64*

P329A(348) 0,80 0,48 (0,10) 6 0,08 (0,02) 0,12 (0,08) 0,21 (0,03) n=4

UNION REDUCIDA A FcyRII Y FcyRIII

3

S239A(252) 1,06 0,81 (0,09) 7 0,73 (0,25) 0,76 (0,36) 0,26 (0,08) n=3

33

E294A(311) 0,75 0,90 (0,08) 4 0,87 (0,19) 0,63 (0,17) 0,66 (0,14) n=5

34

Q295A(312) 0,79 1,00 (0,11) 4 0,62 (0,20) 0,50 (0,24) 0,25 (0,09) n=5

39

V303A(322) 1,26 (0,21) 3 0,91 (0,11) 5 0,86 (0,10) 0,65 (0,17) 0,33 (0,09) n=8

11

T256A(269) 1,91 (0,43) 6 1,14 (0,14) 4 1,41 (0,27) 2,06 (0,66) 1,32 (0,18) n=9

30

K290A(307) 0,79 (0,14) 3 1,01 (0,08) 4 1,29 (0,21) 1,40 (0,18) 1,28 (0,21) n=7

44

D312A(331) 1,50 (0,06) 4 1,01 (0,12) 5 1,20 (0,24) 1,19 (0,07) 1,23 (0,14) n=3

51

K326A(345) 1,03 1,04 (0,05) 4 1,26 (0,21) 1,49 (0,27) 1,22 (0,28) n=5

197

A330(349)K 1,28 1,25 1,28 n=1

273

A339(359)T 1,23 1,11 1,23 1,42 n=1

EFECTO DE FcyRII

10

R255A(268) 0,59 (0,19) 4 1,26 (0,26) 8 1,30 (0,20) 1,59 (0,42) 0,98 (0,18) n=5

12

E258A(271) 1,18 1,18 (0,13) 4 1,33 (0,22) 1,65 (0,38) 1,12 (0,12) n=5

15

S267A(280) 1,08 1,20 (0,14) 4 1,64 (0,18) 2,06 (0,35) 1,14 (0,25) n=7

16

H268A(281) 1,02 (0,22) 3 1,05 (0,11) 4 1,22 (0,14) 1,45 (0,23) 0,52 (0,09) n=12

19

E272A (285) 1,34 (0,24) 4 1,04 (0,06) 4 1,24 (0,11) 1,58 (0,19) 0,74 (0,12) n=4

21

N276A(289) 1,15 (0,21) 3 1,05 (0,14) 4 1,29 (0,20) 1,34 (0,40) 0,95 (0,04) n=4

23

D280A(295) 0,82 0,97 (0,06) 4 1,34 (0,14) 1,60 (0,31) 1,09 (0,20) n=10

25

E283A(300) 0,71 0,97 (0,03) 4 1,24 (0,23) 1,20 (0,17) 1,01 (0,14) n=5

26

H285A(302) 0,85 0,96 (0,07) 4 1,26 (0,12) 1,23 (0,15) 0,87 (0,04) n=4

27

N286A(303) 1,24 (0,04) 2 0,94 (0,20) 13 1,28 (0,23) 1,39 (0,14) 1,03 (0,08) n=5

31

R292A (309) 0,81 (0,18) 4 0,93 (0,02) 4 0,27 (0,14) 0,18 (0,07) 0,90 (0,18) n=9

36

S298A(317) 0,80 1,10 (0,04) 3 0,40 (0,08) 0,21 (0,11) 1,30 (0,18) n=12

38

R301A(320) 0,86 1,06 (0,10) 4 1,12 (0,12) 1,26 (0,14) 0,21 (0,08) n=6

38B

R301M(320) 0,88 1,06 (0,12) 4 1,29 (0,17) 1,56 (0,12) 0,48 (0,21) n=4

40

V305A(324) 1,46 (0,48) 6 1,04 (0,19) 10 1,12 (0,12) 1,23 (0,22) 0,84 (0,15) n=4

41

T307A(326) 1,81 (0,32) 6 0,99 (0,14) 4 1,19 (0,37) 1,35 (0,33) 1,12 (0,18) n=12

42

L309A(328) 0,63 (0,18) 4 0,93 (0,18) 6 1,13 (0,08) 1,26 (0,12) 1,07 (0,20,) n=3

45

N315A(334) 0,76 (0,14) 3 1,27 (0,36) 6 1,15 (0,06) 1,30 (0,17) 1,07 (0,21) n=5

48

K320A(339) 1,10 0,98 (0,09) 5 1,12 (0,11) 1,22 (0,05) 0,87 (0,17) n=4

49*

K322A(341) 0,98 0,94 (0,05) 6 1,15 (0,11) 1,27 (0,24) 0,61 (0,14) n=5

50

S324A(343) 1,08 (0,05) 4 0,82 (0,22) 0,70 (0,12) 1,12 (0,17) n=4

65

P331A(350) 0,85 (0,34) 8 1,29 (0,14) 1,47 (0,28) 1,03 (0,19) n=3

54

E333A(352) 1,03 (0,01) 2 0,98 (0,15) 5 0,92 (0,12) 0,76 (0,11) 1,27 (0,17) n=10

56

T335A(354) 0,98 (0,05) 4 0,79 (0,22) 0,65 (0,26) 0,92 (0,54) n=3

57

S337A(356) 1,03 1,17 (0,23) 3 1,22 (0,30) 1,26 (0,06) 0,94 (0,18) n=4

EFECTO DE FcyRIII

5

K248A(261) 0,87 0,95 (0,05) 5 1,06 (0,12) 1,01 (0,12) 0,71 (0,05) n=4

6

D249A(262) 0,93 1,04 (0,10) 4 1,02 (0,12) 0,94 (0,02) 0,66 (0,07) n=5

7

M252A(265) 0,64 (0,13) 4 0,99 (0,10) 5 1,01 (0,18) 1,15 (0,22) 0,65 (0,17) n= 6

9

S254A(267) < 0,10 0,96 (0,08) 4 0,97 (0,24) 1,15 (0,38) 0,73 (0,14) n=3

16

H268A(281) 1,02 (0,22) 3 1,05 (0,11) 4 1,22 (0,14) 1,45 (0,23) 0,52 (0,09) n=12

19

E272A(285) 1,34 (0,24) 4 1,04 (0,06) 4 1,24 (0,11) 1,58 (0,19) 0,74 (0,12) n=4

22

Y278A(291) 0,90 0,96 (0,02) 4 1,11 (0,08) 1,1,0 (0,16) 0,67 (0,11) n=4

29

T289A(306) 0,86 0,93 (0,03) 4 0,96 (0,33) 0,83 (0,22) 0,62 (0,19) n=7

32

E293A(310) 0,85 1,11 (0,07) 4 1,08 (0,19) 1,07 (0,20) 0,31 (0,13) n=6

35

Y296F(313) 0,79 1,07 (0,12) 4 0,97 (0,26) 0,84 (0,18) 0,52 (0,09) n=5

36

S298A(317) 0,80 1,10 (0,04) 3 0,40 (0,08) 0,21 (0,11) 1,30 (0,18) n=12

38

R301A(320) 0,86 1,06 (0,10) 4 1,12 (0,12) 1,26 (0,14) 0,21 (0,08) n=6

38B

R301M(320) 0,88 1,06 (0,12) 4 1,29 (0,17) 1,56 (0,12) 0,48 (0,21) n=4

49*

K322A(341) 0,98 0,94 (0,05) 6 1,15 (0,11) 1,27 (0,24) 0,61 (0,14) n=5

54

E333A(352) 1,03 (0,01) 2 0,98 (0,15) 5 0,92 (0,12) 0,76 (0,11) 1,27 (0,17) n=10

55

K334A(353) 1,05 (0,03) 2 1,10 (0,06) 4 1,01 (0,15) 0,90 (0,12) 1,39 (0,19) n=17

NO EFECTO SOBRE FcyR

4

K246A(259) 1,03 0,94 (0,06) 4 1,02 (0,10) 0,92 (0,15) 1,14 (0,38) n=4

4B

K246M(259) 0,69 0,83 (0,05) 5 0,83 (0,06) 0,76 (0,05) 0,95 (0,09) n=3

5B

K248M(261) 0,79 0,95 (0,06) 4 0,89 (0,09) 0,83 (0,04) 1,01 (0,23) n=3

8

I253A(266) < 0,10 0,96 (0,05) 4 1,14 (0,02) 1,18 (0,06) 1,08 (0,14) n=3

13

T260A(273) 1,09 0,93 (0,09) 4 0,89 (0,14) 0,87 (0,10) 0,89 (0,08) n=4

20

K274A(287) 1,18 1,02 (0,04) 4 0,86 (0,09) 0,96 (0,10) 1,11 (0,08) n=3

Claims (47)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una variante de un polipeptido original que comprende una region Fc de IgG1 humana, variante que se une a un receptor gamma de Fc III (FcyRIII) con mejor afinidad que el polipeptido original, y donde la variante comprende una region Fc de IgG1 humana variante con al menos una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
2. 2. La variante de la reivindicacion 1, que comprende un anticuerpo.
3. 3. La variante de la reivindicacion 1, que media en ADCC entre 1,5 veces y 100 veces mas efectivamente que el polipeptido original.
4. 4. La variante de la reivindicacion 1, que ademas se une a un FcyRII con una peor afinidad que el polipeptido original.
5. 5. La variante de la reivindicacion 1, que comprende al menos una modificacion de aminoacido en un dominio CH2 de la region Fc.
6. 6. La variante de la reivindicacion 1, que comprende al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc, diferente a la region de bisagra inferior de la misma.
7. 7. La variante de la reivindicacion 1, que comprende dos o mas sustituciones de aminoacido en las posiciones de aminoacido enumeradas en ella.
8. 8. La variante de la reivindicacion 1, que comprende tres o mas sustituciones de aminoacido en las posiciones de aminoacido enumeradas en ella.
9. 9. Un anticuerpo o polipeptido de inmunoadhesina que comprende una region Fc de IgG1 humana variante con una

   afinidad de union a receptor gamma de Fc (FcyR) alterada, polipeptido que comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268,

   269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312,

   315, 320, 324, 326, 327, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430,

   434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc, y donde la modificacion de aminoacido en la posicion de aminoacido 340, si

   se produce, es K340M, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
10. 10. El polipeptido de la reivindicacion 9, que presenta una union reducida a un FcyR y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 324, 327, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la region Fc, y donde la modificacion de aminoacido en la posicion de aminoacido 340, si se produce, es K340M, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
11. 11. El polipeptido de la reivindicacion 9, que presenta una union reducida a un FcyRI.
12. 12. El polipeptido de la reivindicacion 11, que presenta una union reducida a un FcyRI y comprende una modificacion de aminoacido en uno cualquiera o mas de los aminoacidos 265, 269, 270 o 327 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
13. 13. El polipeptido de la reivindicacion 9, que presenta una union reducida a un FcyRII.
14. 14. El polipeptido de la reivindicacion 13, que presenta una union reducida al FcyRII y que comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
15. 15. El polipeptido de la reivindicacion 9, que presenta una union reducida a un FcyRIII.
16. 16. El polipeptido de la reivindicacion 15, que presenta una union reducida al FcyRIII y que comprende una modificacion de aminoacido en uno cualquiera o mas de los aminoacidos 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 327, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50
17. 17. El polipeptido de la reivindicacion 16, que comprende una de las sustituciones de aminoacido D265A, D265N o D265E.
18. 18. El polipeptido de la reivindicacion 9, que presenta una union incrementada a un FcyR y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
19. 19. El polipeptido de la reivindicacion 18, que presenta una union incrementada a un FcyRIII.
20. 20. El polipeptido de la reivindicacion 19, que comprende las sustituciones de aminoacido S298A/E333A/K334A en combinacion.
21. 21. El polipeptido de la reivindicacion 18, que ademas presenta una union reducida a un FcyRII.
22. 22. El polipeptido de la reivindicacion 21, que presenta una union incrementada al FcyRIII y ademas presenta una union reducida al FcyRII, donde el polipeptido comprende una modificacion de aminoacido en las posiciones 298 y/o 333 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice Eu de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
23. 23. El polipeptido de la reivindicacion 18, que presenta una union incrementada a un FcyRII.
24. 24. El polipeptido de la reivindicacion 23, que presenta una union incrementada al FcyRII y comprende una modificacion de aminoacido en uno cualquiera o mas de los aminoacidos 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 326, 330, 337, 340, 378, 398 o 430 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
25. 25. El polipeptido de la reivindicacion 23, que ademas presenta una union reducida a un FcyRIII.
26. 26. El polipeptido de la reivindicacion 25, que presenta una union incrementada al FcyRII y ademas presenta una union reducida al FcyRIII, donde el polipeptido comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 268, 272, 298, 301 o 340 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
27. 27. Un anticuerpo o polipeptido de inmunoadhesina que comprende una region Fc de IgG1 humana variante con afinidad de union a receptor de Fc neonatal (FcRn) alterada, polipeptido que comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 253, 255, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
28. 28. El polipeptido de la reivindicacion 27, que presenta una union reducida a un FcRn.
29. 29. El polipeptido de la reivindicacion 28, que presenta una union reducida al FcRn y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
30. 30. El polipeptido de la reivindicacion 27, que presenta una union incrementada a FcRn.
31. 31. El polipeptido de la reivindicacion 30, que presenta una union incrementada a FcRn y comprende una modificacion de aminoacido en una cualquiera o mas de las posiciones de aminoacido 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la region Fc, donde la numeracion de los residuos de la region Fc corresponde al mdice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
32. 32. El polipeptido de la reivindicacion 31, que comprende al menos una de las sustituciones de aminoacido N434A, T307Q, T307A y E380A.
33. 33. Una composicion que comprende el polipeptido variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
34. 34. Un polipeptido variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 para uso como medicamento.
35. 35. Acido nucleico aislado que codifica el polipeptido variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.
36. 36. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 35.
37. 37. Una celula hospedante que contiene el vector de la reivindicacion 36.

    5 38. Un metodo para producir un polipeptido variante que comprende cultivar la celula hospedante de la reivindicacion

    37 de tal modo que el acido nucleico es expresado, y recuperar el polipeptido variante del cultivo de la celula hospedante.
38. 39. Un metodo in vitro para fabricar una region Fc variante con afinidad de union mejorada a receptor gamma de Fc III (FcyRIII), o una actividad mejorada de citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC), que

    10 comprende: (a) introducir una o mas modificaciones de aminoacido como las definidas en la reivindicacion 1 en una region Fc de un polipeptido original para generar una region Fc variante; (b) identificar una region Fc variante con afinidad de union mejorada a FcyRIII, o con actividad de ADCC mejorada.
39. 40. El metodo de la reivindicacion 39, donde la etapa (b) comprende determinar la union de la region Fc variante a un FcR in vitro.

    15 41. El metodo de la reivindicacion 39, donde la etapa (b) comprende determinar la union de la region Fc variante a al

    menos dos FcRs diferentes.
40. 42. El metodo de la reivindicacion 41, donde los receptores de Fc incluyen el receptor gamma de Fc II humano (FcyRII) y el receptor gamma de Fc III humano (FcyRIII).

    imagen1

    DO (492-405) nm

    —>

    - K322A

    —▼—

    - fgG2

    —*—

    - K320A

    —

    -E318A

    —

    - w t

    imagen2

    Concentracion en ug/mL

    FIG. 2

    DO (492-405) nm

    —• -

    - K322A

    —r—

    - P329A

    —*—

    -P331A

    imagen3

    FIG. 3

    FIG. 4A

    (E27) - Cadena ligera

    DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASKPVD GEGDSYMNWY QQKPGKAPKL LIYAASYLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSHEDPY TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT

    KSFNRGEC

    FIG. 4B <E27) - Cadena pesada

    EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYSIT SGYSWNWIRQ APGKGLEWVA SIKYSGETKY NPSVKGRITI SRDDSKNTFY LQMNSLRAED TAVYYCARGS HYFGHWHFAV WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGKVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K

    imagen4

    imagen5

    Natural

    D270K

    D270V

    Concentracion ae C2B8 (ug/mL)

    FIG. 6

    FSU

    imagen6

    Log de concentracion de C2B8 (ug/mL)

    FIG. 7

    O— K274A Q— S324A K326A ■X— K334A H— P329A •— P331A

    imagen7

    FIG. 8

    DO (492-405) nm

    imagen8

    FIG. 9

    imagen9

    DO (492-405) nm

    imagen10

    FIG. 11

    imagen11

    imagen12

    imagen13

    EC50 de wt-C2B8

    ECHO de A327g (C2B8) = 1,08

    H-----lgG4

    •— W1-C2B8 *— lgG2 A— g327A (tgG4) O— A327g (C2B8) B----g327A (!gG2)

    Concentracion en jig/mL

    FIG. 14

    CD

    4^

    imagen14

    Vnraj^d

    imagen15

    P1

    <X

    70

    &

    CD

    cn

    imagen16

    vwajpj

    FIG. I6A

    o

    11 4 -x fO ro CO CO

    cn

    o 1_____1______ cn © i______i______» ~oi i © 1----------1---------- CJ1 1----------1

    imagen17

    RllA

    Ratio (Fcmutante:E27WT)

    imagen18

    FIG. 17

    20-

    imagen19

    G36E (S317A)

    G14E (D278A)

    G109-1E (S317A+K353A) E27WT

    lgG (jjg/ml)

    imagen20

    o

    *

    h-1

    CO

    >

    CD

    00

    (O

    O

    imagen21

    imagen22

    o p

    CD

    bd

    —O G16E(H281A)

    ----&— G36E(S317A)

    800 ' ----•— E27WT

    0,2 H

    Union a Complejo de Hexamero (D.O. 490 nm)

    imagen23

    G16E(H281A)

    G36E(S317A)

    imagen24

    Citotoxicidad (%)

    imagen25

    Ratio E:T

    FIG. 21

    230 240 250 260 270

    humlgGl PAP ELLGGPS VFLFP PKPKDTLMISRTPEVTC VWDV SHEDPEVKFNWYV

    hum!gG2 PAP - PVAGPS VFL FP PKPKDTLMI SRTPEVTC VWDV S HEDPE VQ FNWYV

    humIgG3 PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFKWYV

    humIgG4 PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV

    murlgGl TVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISKDDPEVQFSWFV

    murIgG2A PAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQISWFV

    mur!gG2B PAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCWVDVSEDDPDVQISWFV

    murIgG3 PPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCWVDVSBDDPDVHVSWFV

    280 290 300 310 320

    humlgGl DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP

    hum!gG2 DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLWGKEYKCKVSNKGLP

    humXgG3 DGVE VHNAKTKPREEQFNST FRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKV S NKALP

    humIgG4 DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP

    murlgGl DDVEVHTAQTQ PREEQ FN5 TFRS VS ELPIMIIQD CLNGKE FKCRVNS AAFP

    mur!gG2A NNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLP

    mur!gG2B NNVE VHTAQTQTHREDYN S TIRWSHLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLP

    murIgG3 DNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRWSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALP

    330 340 350 360 370

    humlgGl APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

    D L

    hum!gG2 AFIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGPYPSDIAV

    humlgG3 APIBKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

    humlgG4 SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

    murlgGl APIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITV

    murIgG2A APIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYV

    mur!gG2B SPIERTISKPKGLVRAPQVYTLPPPAEQLSRKDVSLTCLWGFNPGDISV

    murIgG3 AP I ERT IS KPKGRAQTPQVYTIPP PREQMSKKKV SLTCLVTNF F SEAIS V

    380 390 400 410 420

    humlgGl EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKItTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

    humlgG2 EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK5RWQQGNVFS CSVMH

    hum!gG3 EWE SSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNIFS C SVMH

    hura!gG4 EWZSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH

    murlgGl EWQWNGQ PAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSRWEAGNTFTCSVLH

    murIgG2A E WTMN G KTELNYKNTEP VLD 3 DCS YFMY S KLRVEKKKWVERNS Y S C SWH

    murIgG2B EWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLMMKTSKWEKTDSFSCNVRH

    mur!gG3 EWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSWH

    430 440

    humlgGl EALHNHYTQKSLS LS PGK

    humIgG2 EALHNHYTQKSLSLSPGK

    humIgG3 EALHNRFTQKSLSLSPGK

    humIgG4 EALHWHYTQKSLSLSLGK

    murlgGl EGLHKHHTE KSLS H S PGK

    mur!gG2A EGLHNHHTTKSFSRTPGK tnur!gG2B EGLKNYYLKKTISRSPGK tnur!gG3 EALHNHHTQKNLSRS PGK

    FIG. 22A

    Porcentaje de identidad entre secuencias Fc

    12 3 4 5 6 7 8

    1.

    humlgGl - 94 94 94 64 66 63 68

41. 2 .

    humIgG2 - 93 92 65 63 60 67

42. 3 .

    hiimIgG3 - 91 64 64 61 67

43. 4 .

    humlgG4 - 62 64 61 64

44. 5 .

    murlgGl - 65 61 67

45. 6 .

    murIgG2A - 77 70

46. 7 .

    murIgG2B - 68

47. 8 .

    murIgG3 -

    FIG. 2211

    humlgGl

    humIgG2

    humIgG3

    humlgG4

    230 240 250 260 270

    PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV PAP-PVAGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYV PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFRWYV PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFKTWYV * * * * * * +

    humlgGl

    humlgG2

    hum!gG3

    hum!gG4

    humlgGl

    humXgG2

    humIgG3

    hum!gG4

    280 290 300 310 320

    DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP DGVEVHNARTKP RE EQFN S TYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP * * * *

    330 340 350 360 370

    APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

    D L

    APIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

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    SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

    ★ ■*

    *

    rk

    humlgGl

    humIgG2

    hum!gG3

    hum!gG4

    380 390 400 410 420

    EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EWE S S GQ P ENNYNTTP PMLD SDGS FFLY S KLTVD KS RW QQGNIFSCSVMH EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH * * * * * *

    430 440

    humlgGl EAT.HNHYTQKSLSLSPGK

    hum!gG2 EALHNHYTQKSLSLSPGK

    humIgG3 EAL1INRFTQKSLSLSPGK

    humIgG4 EALHNHYTQKSLSLSLGK

    ■*r "k -k

    FIG. 23

    AUC (% Citotoxicidad ■ Ratio E:T)

    5000

    4000

    3000

    2000

    1000

    0

    imagen26

    wt w t G36 G31 G14

    iOOvs^fwvL

    Variantes Fc

    o

    FIG. 24