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HK1255483A1 - 抗体和免疫结合物 - Google Patents

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HK1255483A1
HK1255483A1 HK18114660.0A HK18114660A HK1255483A1 HK 1255483 A1 HK1255483 A1 HK 1255483A1 HK 18114660 A HK18114660 A HK 18114660A HK 1255483 A1 HK1255483 A1 HK 1255483A1
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HK
Hong Kong
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hvr
seq
amino acid
acid sequence
antibody
Prior art date
Application number
HK18114660.0A
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English (en)
Inventor
Paul Polakis
Peter Dragovich
Thomas Harden Pillow
Shang-Fan Yu
Original Assignee
基因泰克公司
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Publication date
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Description

抗体和免疫结合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2015年6月15日提交的美国临时申请号62/175,802的优先权，该临时申请的全部内容出于任何目的以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及抗体和免疫结合物以及其使用方法。
背景
近年来，使用单克隆抗体(mAB)将抗癌药物直接递送至肿瘤细胞已引起较大关注。FDA已批准两种新抗体-药物结合物用于治疗癌症。(贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))是指定用于治疗复发性或难治性霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)和全身性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的CD30-定向抗体-药物结合物(ADC)。(阿多-曲妥珠单抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine))为被批准用于患有HER2-阳性、晚期(转移性)乳腺癌的患者的新治疗剂。为在ADC中获得治疗性(强效抗肿瘤活性和可接受的治疗指数两者)，可将设计的若干方面最佳化。具体地说，众所周知，接头的化学结构可对ADC的功效和安全性具有显著影响(Ducry和Stump,Bioconjugate Chem,2010,21,5-13)。选择适当接头会影响药物合理递送至癌细胞的预期细胞隔室。通常可将接头分成以下两类：可裂解接头(诸如肽、腙或二硫化物)或不可裂解接头(诸如硫醚)。已使用可由溶酶体酶(诸如细胞自溶酶B)水解的肽接头(诸如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit))来连结药物与抗体(US6214345)。它们尤其有用，这部分归因于它们在体循环中的相对稳定性和在肿瘤中有效释放药物的能力。含有Val-Cit接头的ADC已展示在体内相对稳定(关于药物释放的t1/2约为7天(Doronina等人(2008),Bioconjugate Chem.,19,1960-1963))。然而，由天然肽呈现的化学空间有限；因此，期望具有如同肽一般发挥作用并且可由溶酶体蛋白酶有效裂解的各种非肽接头。非肽结构的较大多样性可产生肽接头不能提供的新颖、有益性质。本文提供可由溶酶体酶裂解的用于ADC的不同类型非肽接头。
业内需要靶向抗原的用于诊断和治疗某些病状(诸如癌症)的药剂。本发明满足该需要并且提供其他益处。
概要
在各个实施方案中，本发明提供免疫结合物和其使用方法。
在一些实施方案中，提供免疫结合物，所述免疫结合物包含选自以下的结构：
以及
其中p为1至4，并且Ab为选自以下的抗体：
a)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
c)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
d)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
e)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
f)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
g)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；
h)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列；
i)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；以及
j)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Ab为选自以下的抗体：
a)包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
b)包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
c)包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
d)包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
e)包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
f)包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
g)包含含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
h)包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及
i)包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，Ab为结合Ly6E的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
b)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Ab为结合CD79b的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或
b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Ab为结合MUC16的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
b)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
c)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
d)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
e)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区；
f)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；
g)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；
h)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，Ab为结合STEAP1的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；
b)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Ab为结合HER2的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
b)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
c)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
d)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
在本文所提供的任何实施方案中，p可介于1至4之间。在本文所提供的任何实施方案中，p可约为2。
在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体为结合抗原的抗体片段。在一些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。在一些实施方案中，抗体在重链恒定区中包含至少一个选自A118C和S400C的突变。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:77或79的氨基酸序列的重链恒定区。在一些实施方案中，抗体在轻链恒定区中包含至少一个选自K149C和V205C的突变。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:76或78的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体在轻链恒定区中包含K149C突变。在一些实施方案中，轻链恒定区包含SEQID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供免疫结合物，其中抗体包含：
a)包含SEQ ID NO:10的序列的重链和包含SEQ ID NO:9的序列的轻链；或
b)包含SEQ ID NO:72的序列的重链和包含SEQ ID NO:71的序列的轻链。
在一些实施方案中，提供药物制剂，所述药物制剂包含本文所提供的免疫结合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包含向癌症个体施用有效量的本文所描述的免疫结合物或包含本文所描述的免疫结合物的药物制剂。
在一些实施方案中，癌症为Ly6E-阳性癌症。在一些实施方案中，免疫结合物包含结合Ly6E的抗体。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、转移性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌以及胃癌。
在一些实施方案中，癌症为CD79b-阳性癌症。在一些实施方案中，免疫结合物包含结合CD79b的抗体。在一些实施方案中，癌症选自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hogkinslymphoma，NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)以及套细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症为MUC16-阳性癌症。在一些实施方案中，免疫结合物包含结合MUC16的抗体。在一些实施方案中，癌症选自卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌以及三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，癌症为STEAP1-阳性癌症。在一些实施方案中，免疫结合物包含结合STEAP1的抗体。在一些实施方案中，癌症选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌或尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)。
在一些实施方案中，癌症为HER2-阳性癌症。在一些实施方案中，免疫结合物包含结合HER2的抗体。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌和胃癌。
在一些实施方案中，提供抑制细胞增殖的方法，所述方法包括在允许本文所描述的免疫结合物结合至细胞表面上的抗原的条件下将细胞暴露于免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在一些实施方案中，抗原选自Ly6E、CD79b、MUC16、STEAP1以及HER2。
在一些实施方案中，提供本文所描述的免疫结合物以用于治疗癌症。在一些实施方案中，提供本文所描述的免疫结合物用以制备用于治疗癌症的药剂的用途。
附图简述
图1展示如实施例2中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠HCC1569X2异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
图2展示如实施例2中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后具有HCC1569X2肿瘤的小鼠的体重随时间的变化。
图3展示如实施例2中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠HCC1569X2异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
图4展示如实施例2中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后具有HCC1569X2肿瘤的小鼠的体重随时间的变化。
图5展示如实施例3中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠NCI-H1781异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
图6展示如实施例3中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠PC-9异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
图7展示如实施例3中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠HCI-009异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
图8展示如实施例3中所描述在使用抗Ly6E免疫结合物治疗后小鼠HBCx9异种移植物模型中的肿瘤体积(mm3)随时间的变化。
详细说明
现将详细参照本发明的某些实施方案，其实例阐释于随附结构和化学式中。尽管将结合所列举的实施方案来描述本发明，但应理解，所述实施方案并不旨在将本发明限定至那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖随附权利要求所界定的本发明范围内可包括的所有替代、修改以及等效形式。本领域技术人员将了解多种与本文所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，这些方法和材料均可用于实践本发明。本发明决不受限于所描述的方法和材料。
本发明通篇所引用的所有参考文献的全部内容均以引用的方式明确并入本文中。倘若所并入的文献、专利以及类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾(包括(但不限于)所定义的术语、术语的使用、所描述的技术等)，那么以本申请为准。
I.定义
本说明书和权利要求书中所使用的词语“包含(comprise、comprising)”、“包括(include、including及includes)”意在指明所陈述特征、整体、组份或步骤的存在，但它们不排除存在或增加一个或多个其他特征、整体、组份、步骤或其群组。
出于本文目的，“受体人类框架”为包含如下文所定义源自人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的受体人类框架可包含其相同氨基酸序列，或它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些实施方案中，VL受体人类框架的序列与VL人类免疫球蛋白框架序列或人类共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)间的非共价相互作用的总强度。除非另外指示，否则如本文所用的“结合亲和力”是指固有结合亲和力，所述固有结合亲和力反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。可通过业内已知的常用方法(包括本文所描述的那些方法)来测量亲和力。下文描述了用于测量结合亲和力的具体阐释性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”的抗体是指相较于不具有改变的亲代抗体在一个或多个超变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，此类改变使得可改善抗体对抗原的亲和力。
术语“抗Ly6E抗体”和“结合Ly6E的抗体”是指能够以足够亲和力结合Ly6E从而使得抗体可用作靶向Ly6E的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)所测量，抗Ly6E抗体与无关非Ly6E蛋白结合的程度比所述抗体与Ly6E的结合低约10％。在某些实施方案中，结合Ly6E的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Ly6E抗体结合在来自不同物种的Ly6E中保守的Ly6E表位。
术语“抗STEAP1抗体”和“结合STEAP1的抗体”是指能够以足够亲和力结合STEAP1从而使得抗体可用作靶向STEAP1的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)所测量，抗STEAP1抗体与无关非STEAP1蛋白结合的程度比所述抗体与STEAP1的结合低约10％。在某些实施方案中，结合STEAP1的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗STEAP1抗体结合在来自不同物种的STEAP1中保守的STEAP1表位。
术语“抗CD79b抗体”和“结合CD79b的抗体”是指能够以足够亲和力结合CD79b从而使得抗体可用作靶向CD79b的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)所测量，抗CD79b抗体与无关非CD79b蛋白结合的程度比所述抗体与CD79b的结合低约10％。在某些实施方案中，结合CD79b的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CD79b抗体结合在来自不同物种的CD79b中保守的CD79b表位。
术语“抗MUC16抗体”和“结合MUC16的抗体”是指能够以足够亲和力结合MUC16从而使得抗体可用作靶向MUC16的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗MUC16抗体与无关非MUC16蛋白结合的程度比所述抗体与MUC16的结合低约10％，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合MUC16的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗MUC16抗体结合在来自不同物种的MUC16中保守的MUC16表位。
术语“抗HER2抗体”和“结合HER2的抗体”是指能够以足够亲和力结合HER2从而使得抗体可用作靶向HER2的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)所测量，抗HER2抗体与无关非HER2蛋白结合的程度比所述抗体与HER2的结合低约10％。在某些实施方案中，结合HER2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗HER2抗体结合在来自不同物种的HER2中保守的HER2表位。
术语“抗体”在本文中是以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其展现所期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双功能抗体、直链抗体、单链抗体分子(例如scFv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合相同表位的抗体”(作为参考抗体)是指在竞争分析中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更高的抗体，并且反之，参考抗体在竞争分析中将该抗体与其抗原的结合阻断50％或更高。本文中提供了示例性竞争分析。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述在哺乳动物中通常特征为细胞生长/增殖失控的生理学病状。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。所述癌症的更特定实例包括过表达Ly6E的癌症，所述癌症可包括(例如)乳腺癌和/或转移性乳腺癌(包括Her2阴性乳腺癌和/或三阴性乳腺癌)、胰脏癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)、胃癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌瘤、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、子宫内膜或子宫癌瘤、唾液腺癌瘤、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴组织增殖性病症以及各种类型的头颈癌。
如本文所用的术语“Ly6E”是指由在细胞中对Ly6E前体蛋白的处理产生的任何原始、成熟Ly6E。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的Ly6E，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括Ly6E的天然变体，例如剪接变体或对偶基因变体。UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q16553.1(日期为2015年5月27日)中展示了具有信号序列(氨基酸1-20＝信号序列)的示例性人类Ly6E前体蛋白的氨基酸序列。示例性成熟人类Ly6E的氨基酸序列为UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q16553.1(日期为2015年5月27日)的氨基酸21至101。
术语“Ly6E-阳性癌症”是指包含在表面上表达Ly6E的细胞的癌症。出于测定细胞是否在表面上表达Ly6E的目的，可将Ly6E mRNA表达视为与细胞表面上的Ly6E表达相关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定Ly6E mRNA的表达。或者，可(例如)使用Ly6E抗体以诸如免疫组织化学、FACS等方法来测定细胞表面上的Ly6E表达。在一些实施方案中，Ly6E-阳性癌症为乳腺癌、转移性乳腺癌(包括Her2阴性乳腺癌和/或三阴性乳腺癌)、胰脏癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)或胃癌。
术语“Ly6E-阳性细胞”是指在表面上表达Ly6E的癌细胞。
如本文所用的术语“STEAP1”是指由在细胞中对STEAP1前体蛋白的处理产生的任何原始、成熟STEAP1。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的STEAP1，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括STEAP1的天然变体，例如剪接变体或对偶基因变体。UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9UHE8.1(日期为2015年5月27日)中展示了示例性人类STEAP1蛋白质的氨基酸序列。
术语“STEAP1-阳性癌症”是指包含在表面上表达STEAP1的细胞的癌症。出于测定细胞是否在表面上表达STEAP1的目的，可将STEAP1mRNA表达视为与细胞表面上的STEAP1表达相关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定STEAP1mRNA的表达。或者，可(例如)使用STEAP1抗体以诸如免疫组织化学、FACS等方法来测定细胞表面上的STEAP1表达。在一些实施方案中，STEAP1-阳性癌症为前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌或尤文氏肉瘤。
术语“STEAP1-阳性细胞”是指在表面上表达STEAP1的癌细胞。
如本文所用的术语“CD79b”是指由在细胞中对CD79b前体蛋白的处理产生的任何原始、成熟CD79b。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的CD79b，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括CD79b的天然变体，例如剪接变体或对偶基因变体。NCBI登录号NP_000617.1(日期为2015年5月15日)中展示了具有信号序列(氨基酸1-28＝信号序列)的示例性人类CD79b前体蛋白的氨基酸序列。示例性成熟人类CD79b的氨基酸序列为NCBI登录号NP_000617.1(日期为15-MAR-2015)的氨基酸29至228。
术语“CD79b-阳性癌症”是指包含在表面上表达CD79b的细胞的癌症。出于测定细胞是否在表面上表达CD79b的目的，可将CD79b mRNA表达视为与细胞表面上的CD79b表达相关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定CD79bmRNA的表达。或者，可(例如)使用CD79b抗体以诸如免疫组织化学、FACS等方法来测定细胞表面上的CD79b表达。在一些实施方案中，CD79b-阳性病症或癌症为B细胞病症和/或B细胞增殖性病症，诸如(但不限于)淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。
术语“CD79b-阳性细胞”是指在表面上表达CD79b的癌细胞。
如本文所用的术语“MUC16”是指由在细胞中对MUC16前体蛋白的处理产生的任何原始、成熟MUC16。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的MUC16，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括MUC16的天然变体，例如剪接变体或对偶基因变体。UniProtKB/Swiss-Prot:Q8WXI7.2(日期为27-MAR-2015)中展示了示例性人类MUC16蛋白质的氨基酸序列。
术语“MUC16-阳性癌症”是指包含在表面上表达MUC16的细胞的癌症。出于测定细胞是否在表面上表达MUC16的目的，可将MUC16mRNA表达视为与细胞表面上的MUC16表达相关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定MUC16mRNA的表达。或者，可(例如)使用MUC16抗体以诸如免疫组织化学、FACS等方法来测定细胞表面上的MUC16表达。在一些实施方案中，MUC16-阳性癌症为卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)、胰脏癌或乳腺癌(诸如转移性乳腺癌，包括Her2阴性乳腺癌和/或三阴性乳腺癌)。
术语“MUC16-阳性细胞”是指在表面上表达MUC16的癌细胞。
如本文所用的术语“HER2”是指由在细胞中对HER2前体蛋白的处理产生的任何原始、成熟HER2。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的HER2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括HER2的天然变体，例如剪接变体或对偶基因变体。UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04626.1(日期为2015年5月27日)中展示了具有信号序列(氨基酸1-22＝信号序列)的示例性人类HER2前体蛋白的氨基酸序列。示例性成熟人类HER2的氨基酸序列为UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04626.1(日期为2015年5月27日)的氨基酸23至1255。
术语“HER2-阳性癌症”是指包含在表面上表达HER2的细胞的癌症。出于测定细胞是否在表面上表达HER2的目的，可将HER2mRNA表达视为与细胞表面上的HER2表达相关。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定HER2mRNA的表达。或者，可(例如)使用HER2抗体以诸如免疫组织化学、FACS等方法来测定细胞表面上的HER2表达。在一些实施方案中，HER2-阳性癌症为乳腺癌、转移性乳腺癌或胃癌。
术语“HER2-阳性细胞”是指在表面上表达HER2的癌细胞。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
抗体“种类”是指重链所拥有的恒定域或恒定区的类型。存在5大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的若干种可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶和其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如来自细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”是指那些可归因于抗体的Fc区的生物活性，所述生物活性可随抗体同种型而有所变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在所需剂量下并且在所需时间段中有效实现所期望的治疗或预防结果的量。用于治疗癌症的有效量的药物可减少癌细胞数目；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减慢并且优选终止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即在一定程度上减慢并且优选终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。在药物可预防生长和/或杀伤现有癌细胞的情况下，它可能会具有细胞生长抑制性和/或细胞毒性。有效量可延长无进展存活期(例如如通过实体瘤反应评估准则(Response Evaluation Criteria for Solid Tumor，RECIST)或CA-125变化所测量)，产生客观反应(包括部分反应PR或完全反应CR)，增加总存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状(例如如通过FOSI所评价)。
术语“表位”是指抗原分子上与抗体结合的特定位点。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链中含有恒定区的至少一部分的C-末端区域。所述术语包括原始序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人类IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)。除非在本文中另外指定，否则如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，Bethesda,MD,1991中所描述，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据也称为EU索引的EU编号系统来进行。
“框架”或“FR”是指除超变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR通常由4个FR结构域：FR1、FR2、FR3以及FR4组成。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”以及“整个抗体”在本文中可互换地用于指具有基本上与原初抗体结构类似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”以及“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的子代(与传代次数无关)。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，而是可含有突变。本文包括突变体子代，所述突变体子代具有与在原始转化细胞中所筛选或选择的相同的功能或生物活性。
“人类抗体”为具有对应于由人类或人类细胞产生或源自非人类来源的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，所述非人类来源利用人类抗体谱或其他人类抗体编码序列。此人类抗体的定义明确排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有框架”为代表在人类免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，从可变域序列的亚群组选择人类免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列亚群组为如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公布91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚群组。在一个实施方案中，对于VL来说，亚群组为如Kabat等人所描述的亚群组κI(见上文)。在一个实施方案中，对于VH来说，亚群组为如Kabat等人所描述的III亚组(见上文)。
“人源化”抗体是指包括来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且通常为两个可变域，其中全部或基本上全部的HVR(例如CDR)对应于非人类的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人类抗体的那些FR。人源化抗体任选可包含源自人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体(例如非人类抗体)是指已经历人源化的抗体。
如本文所用的术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变域区域中序列具有超变性和/或形成结构上限定的环(“超变环”)中的每一种。通常，原始四功能抗体包含六个HVR；三个位于VH中(H1、H2、H3)，并且三个位于VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包括来自超变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。示例性超变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65以及H3的95-102处。(Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成超变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，这些残基为接触抗原的残基。SDR含于CDR中称为缩短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2以及a-CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58以及H3的95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示，否则在本文中根据Kabat等人所描述对可变域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)进行编号(见上文)。
“免疫结合物”为结合至一个或多个异源分子(包括(但不限于)细胞毒性剂)的抗体。
“患者”或“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗以及马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，诸如猴子)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，患者或受试者为人类。在一些实施方案中，患者可为“癌症患者”，即患有癌症(尤其是胃癌或乳腺癌)的一种或多种症状或处于患有这些症状的风险下的患者。
“分离的抗体”为已与天然环境的组份分离的抗体。在一些实施方案中，如通过(例如)电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)所测定，将抗体纯化至具有大于95％或99％的纯度。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已与天然环境的组份分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“编码抗[靶]抗体的分离核酸”(诸如“编码抗Ly6E抗体的分离核酸”)是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或单独载体中的此类核酸分子以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的的抗体群体(即，构成该群体的个别抗体相同和/或结合相同表位)获得的抗体，除了例如含有天然突变或在产生单克隆抗体制剂期间产生的可能的变体抗体，，此类变体通常以微小量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每一种单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的性质，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。举例来说，可通过多种技术来制得根据本发明使用的单克隆抗体，包括(但不限于)杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有所有或一部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
“裸抗体”是指不与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记结合的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“原初抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。举例来说，天然IgG抗体为约150,000道尔顿(dalton)的异四聚体糖蛋白，所述异四聚体糖蛋白由二硫键键结的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N-端至C-端，每一重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变域，随后为三个恒定域(CH1、CH2以及CH3)。类似地，从N-端至C-端，每一轻链依次具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变域)和恒定轻链(CL)结构域。基于抗体恒定域的氨基酸序列，可将抗体的轻链分配为称为κ和λ的两种类型中的一种。
术语“包装插页”用于指通常包括于治疗产品的商业包装内的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或关于治疗产品的使用的警告的信息。
就参考肽序列来说，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(如果需要)以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以本领域技术人员所熟知的各种方式来实现比对，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。那些本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较序列的全长范围内实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列对比计算机程序ALIGN-2来产生氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech,Inc.设计，并且已将原代码与用户文件一起提交美国版权局(U.S.Copyright Office,WashingtonD.C.,20559)，其中它登记在美国版权登记号TXU510087下。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得，或可由源代码编译而来。应将ALIGN-2程序编译成用于UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)中。所有序列对比参数均由ALIGN-2程序设定并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列对比的情形下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B氨基酸序列同一性％(或者可表达为对、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)计算如下：
100×分数X/Y
其中X为在A与B的程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评定为同一匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y为B中氨基酸残基的总数。应了解，倘若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，那么A对B氨基酸序列同一性％将不等于B对A氨基酸序列同一性％。除非另外具体陈述，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％的值均是如前一段落中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”是指所呈现形式允许其中所含活性成份的生物活性有效，并且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的其他组份的制剂。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成份外对受试者无毒的成份。药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中所使用，“治疗(treatment)”(和其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床介入，并且可为进行预防而实施或在临床病程期间实施。治疗的期望效果包括(但不限于)预防疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明抗体来延迟疾病发生或减缓疾病进展。
“共施用”意指在同一施用期间静脉内施用两种(或更多种)药物，而非依序输注两种或更多种药物。
与一种或多种其他药物“同时”施用的药物是在同一治疗循环期间与一种或多种其他药物在治疗的同一天并且任选与一种或多种其他药物在同一时间施用。举例来说，对于每3周给予的癌症治疗来说，在3周循环的第1天各自施用同时施用的药物。
“化学疗法”是使用可用于治疗癌症的化学治疗剂。
“化学治疗剂”为不论作用机制如何可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的种类包括(但不限于)：烷基化剂、抗代谢物、纺锤体毒剂植物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂以及激酶抑制剂。化学治疗剂的实例包括：蒽环，诸如表柔比星(epirubicin)或多柔比星环磷酰胺蒽环与环磷酰胺的组合(“AC”)；紫杉烷，例如多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS编号：51-21-8)、拉帕替尼(lapatinib)卡培他滨(capecitabine)吉西他滨(gemcitabine)(Lilly)、PD-0325901(CAS编号：391210-10-9,Pfizer)、顺铂(cisplatin)(顺式-二胺二氯铂(II)，CAS编号：15663-27-1)、卡铂(carboplatin)(CAS编号：41575-94-4)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂二环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS编号：85622-93-1，Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基-乙胺，)。
化学治疗剂的其他实例包括：奥沙利铂(oxaliplatin)(Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(Millennium Pharm.)、索坦(sutent)(SU11248,Pfizer)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Novartis)、XL-518(MEK抑制剂，Exelixis,WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244,Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus),Wyeth)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASARTM,SCH 66336,Schering Plough)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM,Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(无克列莫佛(Cremophor))、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡徳他尼(vandetanib)(rINN、ZD6474、AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、替西罗莫司(temsirolimus)(Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、莰佛胺(canfosfamide)(Telik)、塞替派(thiotepa)以及环磷酰胺烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)以及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，诸如苯唑达帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美托达帕(meturedopa)以及尤里达帕(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺以及三甲醇蜜胺；多聚乙酰(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)以及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉斯他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙可地克因(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯代磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)以及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)、卡奇霉素γ1I、卡奇霉素ωI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；双磷酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、胺茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和去氧多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯；抗肾上腺剂，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸显影再生剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布什(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦素(maytansinoid)，诸如美坦素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合体(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西左非兰(sizofiran)；螺锗(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)以及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；环磷酰胺；塞替派；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，诸如视黄酸；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸以及衍生物。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中参与使抗体与抗原结合的结构域。原初抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)通常具有相似结构，其中各结构域包含4个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单一VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域以分别筛选互补VL或VH结构域文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括呈自复制核酸结构形式的载体以及合并至将其引入其中的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面中，本发明部分基于包含结合Ly6E、STEAP1、CD79b、MUC16或HER2的抗体的免疫结合物。本发明的抗体和免疫结合物可用于(例如)诊断或治疗表达Ly6E、STEAP1、CD79b、MUC16或HER2的癌症。
A.示例性抗体
本文提供包含结合选自Ly6E、STEAP1、CD79b、MUC16以及HER2的抗原的分离抗体的免疫结合物。在本文所描述的任何实施方案中，抗体可为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
示例性抗Ly6E抗体
淋巴细胞抗原6复合物基因座E(Ly6E)也称为视黄酸诱导的基因E(RIG-E)和干细胞抗原2(SCA-2)。它是具有未知功能并且并无已知结合配偶体的GPI连接、131氨基酸长、约8.4kDa蛋白质。它最初被鉴别为在小鼠中的不成熟胸腺细胞、胸腺髓质上皮细胞中表达的转录物。Mao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:5910-5914(1996)。
在一些实施方案中，本发明提供包含描述于PCT公布号WO2013/177055中的抗Ly6E抗体的免疫结合物。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗Ly6E抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在上文任何实施方案中，免疫结合物的抗Ly6E抗体为人源化抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含上文任何实施方案中的HVR，并且进一步包含人类受体框架，例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一方面中，免疫结合物的抗Ly6E抗体包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQ ID NO:2的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一方面中，提供免疫结合物的抗Ly6E抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:1中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQID NO:1的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列。
在另一方面中，提供包含抗Ly6E抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH和如上文所提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供一种免疫结合物，其中抗体包含分别在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1中的VH和VL序列，包括序列的翻译后修饰。
在另一方面中，本文提供包含与本文所提供的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体的免疫结合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体与包含分别地SEQ ID NO:2的VH序列和SEQ ID NO:1的VL序列的抗Ly6E抗体结合相同表位。
在本发明的另一方面中，上文任何实施方案的免疫结合物的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括人类抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗Ly6E抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，抗体为基本上全长抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文所定义的其他抗体种类或同种型。在一些实施方案中，免疫结合物包含抗Ly6E抗体，所述抗Ly6E抗体包含分别包含SEQ ID NO:10和9的氨基酸序列的重链和轻链。
在另一方面中，如下文在(1)至(7)中所描述，上文任何实施方案的抗Ly6E抗体可单独或组合合并任何特征。
示例性抗STEAP1抗体
例如美国专利号6,329,503中描述了细胞表面抗原STEAP-1。STEAP-1为细胞表面蛇形跨膜抗原的成员。它主要在前列腺癌中表达，并且由此此家族的成员称为“STEAP”(前列腺的六个跨膜上皮抗原)。人类STEAP蛋白质在家族内展现高结构保守程度，但并不对任何已知人类蛋白质展示显著结构同源性。STEAP-1似乎为IIIa型膜蛋白，所述IIIa型膜蛋白主要在正常人类组织中的前列腺细胞中表达。在结构上，STEAP-1为339氨基酸蛋白质，特征为6个跨膜结构域和细胞内N-末端和C-末端的分子拓扑，表明它以“蛇形”方式折叠成三个胞外环和两个胞内环。在各种状态的前列腺癌中STEAP-1蛋白质表达维持在较高水平。在其他人类癌症(诸如肺癌和结肠癌)中STEAP-1高度过表达。已针对人类STEAP-1片段提出鼠类抗体并且所述抗体展示结合细胞表面的STEAP-1(参见美国专利申请号20040253232A1)。
在一些实施方案中，本发明提供包含美国专利号8,436,147B2中所描述的抗STEAP1抗体的免疫结合物。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗STEAP1抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:55的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在上文的任何实施方案中，免疫结合物的抗STEAP1抗体为人源化抗体。在一个实施方案中，抗STEAP1抗体包含上文的任何实施方案中的HVR，并且进一步包含人类受体框架，例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一方面中，免疫结合物的抗STEAP1抗体包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗STEAP1抗体保留结合STEAP1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:61中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:61中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗STEAP1抗体包含SEQ IDNO:61的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面中，提供免疫结合物的抗STEAP1抗体，其中所述抗体包含与SEQ IDNO:62的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗STEAP1抗体保留结合STEAP1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:62中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:62中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗STEAP1抗体包含SEQ ID NO:62的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在另一方面中，提供包含抗STEAP1抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH和如上文所提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供一种免疫结合物，其中抗体包含分别在SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一方面中，本文提供包含与本文所提供的抗STEAP1抗体结合相同表位的抗体的免疫结合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体与包含分别地SEQ ID NO:61的VH序列和SEQ ID NO:62的VL序列的抗STEAP1抗体结合相同表位。
在本发明的另一方面中，上文任何实施方案的免疫结合物的抗STEAP1抗体为单克隆抗体，包括人类抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗STEAP1抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，抗体为基本上全长抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文所定义的其他抗体种类或同种型。
在另一方面中，如下文在(1)至(7)中所描述，上文任何实施方案的抗STEAP1抗体可单独或组合合并任何特征。
示例性抗CD79b抗体
CD79为由含有CD79a(Igα,mb-1)和CD79b(Igβ,B29)的共价异二聚体组成的B细胞受体的信号传导组份。CD79a和CD79b各自含有细胞外免疫球蛋白(Ig)结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域、免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构域。CD79在B细胞上和(例如)非霍奇金氏淋巴瘤细胞(NHL)上表达(Cabezudo等人，Haematologica,84:413-418(1999)；D’Arena等人，Am.J.Hematol.,64:275-281(2000)；Olejniczak等人，Immunol.Invest.,35:93-114(2006))。CD79a和CD79b以及sIg均为CD79的表面表达所需的(Matsuuchi等人，Curr.Opin.Immunol.,13(3):270-7))。CD79b在NHL上的平均表面表达类似于在正常B细胞上的表达，但范围更大(Matsuuchi等人，Curr.Opin.Immunol.,13(3):270-7(2001))。
在一些实施方案中，本发明提供包含美国专利号8,088,378B2中所描述的抗CD79b抗体的免疫结合物。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗CD79b抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在上文的任何实施方案中，免疫结合物的抗CD79b抗体为人源化抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗CD79b抗体包含上文的任何实施方案中的HVR，并且进一步包含人类受体框架，例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一方面中，免疫结合物的抗CD79b抗体包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD79b抗体保留结合CD79b的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:47中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:47中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗CD79b抗体包含SEQ IDNO:47的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在另一方面中，提供免疫结合物的抗CD79b抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD79b抗体保留结合CD79b的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:48中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:48中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗CD79b抗体包含SEQ ID NO:48的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一方面中，提供包含抗CD79b抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH和如上文所提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供包含抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含分别在SEQID NO:47和SEQ ID NO:48中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一方面中，本文提供包含与本文所提供的抗CD79b抗体结合相同表位的抗体的免疫结合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种免疫结合物，所述免疫结合物包含抗体，所述抗体与包含分别地SEQ ID NO:47的VH序列和SEQ ID NO:48的VL序列的抗CD79b抗体结合相同表位。
在本发明的另一方面中，上文任何实施方案的免疫结合物的抗CD79b抗体为单克隆抗体，包括人类抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗CD79b抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，免疫结合物包含为基本上全长抗体的抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文所定义的其他抗体种类或同种型。
在另一方面中，如下文在(1)至(7)中所描述，上文任何实施方案的免疫结合物的抗CD79b抗体可单独或组合合并任何特征。
示例性抗MUC16抗体
MUC16为大跨膜蛋白，所述大跨膜蛋白由大部分(80％)人类上皮卵巢癌过表达，但并不在正常卵巢的上皮中过表达(O'Brien等人(2001)Tumour Biol.22:348-366)，并且在PC细胞(50％)上过表达。尽管MUC16的功能尚不清楚，但MUC16可促进肿瘤细胞与内衬于腹腔的间皮细胞的结合并且可抑制天然杀伤细胞介导的抗肿瘤细胞毒性反应，并且它可在粘膜表面处提供针对颗粒和感染因子的保护性、润滑屏障。高度多形体MUC16由以下三个结构域构成：富Ser-/Thr N-末端结构域、具有11个至超过60个部分保守的串联重复序列(各自平均具有156个氨基酸)的重复结构域以及含有跨膜序列和短细胞质尾部的C-末端非重复结构域。MUC16为高度O-糖基化和N-糖基化的(O'Brien等人(2002)Tumour Biol.23:154-169；O'Brien等人(2001)Tumour Biol.22:348-366；Fendrick等人(1997)Tumour Biol.18:278-289；Wong等人(2003)J.Biol.Chem.278:28619-28634；McLemore等人(2005)Biol.Res.Nurs.6:262-267)。
在一些实施方案中，本发明提供包含美国专利号7,989,595B2中所描述的抗MUC16抗体的免疫结合物。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗MUC16抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含抗MUC16抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQID NO:27的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含抗MUC16抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含抗MUC16抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:44的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在上文的任何实施方案中，免疫结合物包含人源化的抗MUC16抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗MUC16抗体包含上文的任何实施方案中的HVR，并且进一步包含人类受体框架，例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一方面中，免疫结合物包含抗MUC16抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:22、30、38或46的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:22、30、38或46的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗MUC16抗体保留结合MUC16的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:22、30、38或46中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:22、30、38或46中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗MUC16抗体包含SEQ ID NO:22、30、38或46的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18、26、34或42的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19、27、35或43的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:20、28、36或44的氨基酸序列。
在另一方面中，提供免疫结合物的抗MUC16抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:21、29、37或45的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:21、29、37或45的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗MUC16抗体保留结合MUC16的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:21、29、37或45中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:21、29、37或45中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗MUC16抗体包含SEQ ID NO:21、29、37或45的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15、23、31或39的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16、24、32或40的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO:17、25、33或41的氨基酸序列。
在另一方面中，提供包含抗MUC16抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH和如上文所提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，免疫结合物的抗体包含分别在SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:21中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，免疫结合物的抗体包含分别在SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，免疫结合物的抗体包含分别在SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:37中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，免疫结合物的抗体包含分别在SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:45中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一方面中，本文提供包含与本文所提供的抗MUC16抗体结合相同表位的抗体的免疫结合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种免疫结合物，所述免疫结合物包含抗体，所述抗体与包含VH序列和VL序列的抗MUC16抗体结合相同表位，所述VH序列和VL序列分别包含SEQ ID NO:22和21或分别包含SEQ ID NO:30和29或分别包含SEQ ID NO:38和37或分别包含SEQ ID NO:46和45。
在本发明的另一方面中，免疫结合物包含上文任何实施方案的抗MUC16抗体，其中所述抗体为单克隆抗体(包括人类抗体)。在一个实施方案中，免疫结合物的抗MUC16抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，抗体为基本上全长抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文所定义的其他抗体种类或同种型。
在另一方面中，如下文在(1)至(7)中所描述，上文任何实施方案的免疫结合物的抗MUC16抗体可单独或组合合并任何特征。
示例性抗HER2抗体
HER2(ErbB2)受体酪氨酸激酶为跨膜受体中表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。在约20％的人类乳腺癌中观察到HER2过表现并且在与所述肿瘤有关的侵袭性生长和较差临床结果中暗示HER2过表达(Slamon等人(1987)Science 235:177-182)。可使用基于免疫组织化学的对固定肿瘤块的评价来确定HER2蛋白过表达(Press MF等人(1993)CancerRes 53:4960-70)。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗HER2抗体的免疫结合物。在一些实施方案中，抗HER2抗体包含WO 98/17797中所描述抗体的HVR。在一些实施方案中，抗体包含US5677171、US 5821337、US 6054297、US 6165464、US 6339142、US 6407213、US 6639055、US6719971、US 6800738或US 7074404中所描述抗体的HVR或人源化重链可变区和人源化轻链可变区。在一些实施方案中，本发明提供包含(曲妥珠单抗(trastuzumab))的重链可变区和轻链可变区的免疫结合物。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗HER2抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗HER2抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含抗HER2抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列。在一个方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列，及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:66的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:68的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明的免疫结合物包含含有以下的抗体：(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，以及(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO:82的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:66的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在另一方面中，本发明提供一种包含抗体的免疫结合物，所述抗体包含：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在上文的任何实施方案中，免疫结合物的抗HER2抗体为人源化抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗HER2抗体包含上文的任何实施方案中的HVR，并且进一步包含人类受体框架，例如人类免疫球蛋白框架或人类共有框架。
在另一方面中，免疫结合物的抗HER2抗体包含与SEQ ID NO:64或14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:64或14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗HER2抗体保留结合HER2的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:64或14中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:64或14中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:64或14的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在另一实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在另一方面中，提供免疫结合物的抗HER2抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:63或12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:63或12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗HER2抗体保留结合HER2的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:63或12中取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:63或12中取代、插入和/或缺失总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:63或12的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在另一方面中，提供包含抗HER2抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH和如上文所提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，提供包含抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含分别在SEQID NO:64和SEQ ID NO:63中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，提供包含抗体的免疫结合物，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:12中的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一方面中，本文提供包含与本文所提供的抗HER2抗体结合相同表位的抗体的免疫结合物。举例来说，在某些实施方案中，提供一种免疫结合物，所述免疫结合物包含抗体，所述抗体与包含分别地SEQ ID NO:64的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列的抗HER2抗体结合相同表位。在某些实施方案中，提供一种免疫结合物，所述免疫结合物包含抗体，所述抗体与包含分别地SEQ ID NO:14的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列的抗HER2抗体结合相同表位。
在本发明的另一方面中，上文任何实施方案的免疫结合物的抗HER2抗体为单克隆抗体，包括人类抗体。在一个实施方案中，免疫结合物的抗HER2抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，免疫结合物包含为基本上全长抗体的抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文所定义的其他抗体种类或同种型。
在另一方面中，如下文在(1)至(7)中所描述，上文任何实施方案的免疫结合物的抗HER2抗体可单独或组合合并任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文所提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM并且任选≥10-13M(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合分析(RIA)来测量Kd，所述放射性标记的抗原结合分析是使用所关注抗体的Fab形式和其抗原如下列分析中所描述来实施。通过如下方式来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在滴定系列的未标记抗原存在下，使用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后使用涂覆有抗Fab抗体的板捕获已结合的抗原(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立所述分析的条件，将多孔板(Thermo Scientific)利用5μg/ml于50mM碳酸钠(pH 9.6)中的捕获用抗Fab抗体(Cappel Labs)涂覆过夜，并且随后在室温下(大约23℃)利用于PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断2小时至5小时。在非吸收性板(Nunc编号：269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与连续稀释的所关注Fab混合(例如与Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评价一致)。然后将所关注Fab孵育过夜；然而，孵育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。然后，将混合物转移至捕获板中以在室温下进行孵育(例如1小时)。然后去除溶液并且使用于PBS中的0.1％聚山梨醇酯20将板洗涤8次。在板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上经10分钟对所述板进行计数。选择得到小于或等于20％的最大结合的每一Fab的浓度用于竞争性结合分析。
根据另一实施方案，使用表面等离子体共振分析来测量Kd，所述分析是在25℃下使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)利用约10个反应单元(RU)的固定抗原CM5芯片进行。简言之，按照供应商说明书使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。使用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以实现约10个反应单位(RU)的结合蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流速注射Fab于含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(评估软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。以比率k解离/k缔合的形式来计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振分析测得的缔合速率超过106M-1s-1，那么可通过使用荧光猝灭技术来测定缔合速率，所述技术在如于诸如带有搅拌比色杯的停流装备的分光光度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)等分光光度计中所测量增加浓度的抗原存在下，测量于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃下的荧光发射强度的增加或降低(激发波长＝295nm；发射波长＝340nm，16nm带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括(但不限于)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv以及scFv片段和下文所描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,New York)，第269-315页(1994)；还参见WO93/16185和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的论述，参见美国专利号5,869,046。
双功能抗体为具有两个抗原结合位点的可为二价或双特异性的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中还描述了三功能抗体和四功能抗体。
单域抗体为包含抗体中重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人类单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可通过各种技术来制备抗体片段，包括(但不限于)蛋白水解消化完整抗体以及如本文所描述通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)来产生。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为嵌合抗体。例如美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述了某些嵌合抗体。在一个实例中，嵌合抗体包括非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(诸如猴子)的可变区)和人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为种类或子类已相较于亲代抗体发生变化的“种类转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，将非人类抗体人源化以降低对人类的免疫原性，而保留亲代非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人类抗体，并且FR(或其部分)源自人类抗体序列。人源化抗体任选还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人类抗体(例如产生HVR残基的抗体)的相应残基取代以(例如)恢复或改善抗体特异性或亲和力。
例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述了人源化抗体和其制备方法，并且进一步描述于(例如)以下文献中：Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321以及7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”方法)中。
可用于人源化的人类框架区包括(但不限于)：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；源自具有轻链或重链可变区的特定亚群组的人类抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.，151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及源自筛选性FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人类抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为人类抗体。可使用业内已知的各种技术来产生人类抗体。van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中概述了人类抗体。
可通过向转基因动物施用免疫原来制备人类抗体，所述转基因动物已被改善以产生完整人类抗体或具有响应于抗原激发的人类可变区的完整抗体。此类动物通常含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，所述基因座代替内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。关于从转基因动物获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870；以及描述技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900。可进一步(例如)通过与不同人类恒定区组合来修饰由此类动物产生的完整抗体的人类可变区。
还可通过基于杂交瘤的方法来制备人类抗体。已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中还描述了经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述来自杂交瘤细胞系的单克隆人类IgM抗体的产生)以及Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中所描述的那些方法。Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中还描述了人类杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)。
还可通过分离选自人类源噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列来产生人类抗体。然后，可将此类可变域序列与期望的人类恒定域组合。下文描述从抗体文库选择人类抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可通过从组合文库筛选具有所期望活性的抗体来分离本发明的抗体。举例来说，业内已知用于产生噬菌体展示文库和从此类文库筛选具有所期望的结合特性的抗体的各种方法。例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述了此类方法，并且进一步描述于(例如)以下文献中：McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述通过聚合酶链反应(PCR)来单独克隆VH和VL基因谱并且将其随机重组于噬菌体文库中，然后可筛选结合抗原的噬菌体。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫化来源的文库可向免疫原提供高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，可如由Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所描述克隆天然谱(例如从人类)以在无任何免疫的情况下向各种非自体抗原以及自体抗原提供单一抗体源。最后，还可如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述通过以下方式以合成方式制得天然文库：克隆来自干细胞的未重排V-基因片段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变CDR3区并在体外实现重排。描述人类抗体噬菌体文库的专利公布包括(例如)：美国专利号5,750,373以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936以及2009/0002360。
本文中将从人类抗体文库分离的抗体或抗体片段视为人类抗体或人类抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种是针对Ly6E、STEAP1、CD79b、MUC16或HER2，而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，结合特异性中的一种是针对HER2，而另一种是针对CD3。参见例如美国专利号5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至抗原的两个不同表位。还可使用双特异性抗体将细胞毒性剂局部化至表达抗原的细胞。可以全长抗体或抗体片段形式制得双特异性抗体。
制备多特异性抗体的技术包括(但不限于)重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829以及Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))以及“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。还可通过以下方式来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异源二聚分子的工程化静电牵引效应(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980以及Brennan等人，Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双功能抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.152:5368(1994))；以及例如如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所描述制备三特异性抗体。
本文还包括被工程化成具有三个或更多个功能抗原结合位点的抗体(包括“章鱼抗体”)(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括含有结合第一抗原(诸如Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2或MUC16)以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双效FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。可通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适宜修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括(例如)抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可实施缺失、插入以及取代的任何组合以实现最终构建体，限制条件为最终构建体具有所期望的特性，例如抗原结合性。
a)取代、插入以及缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的所关注位点包括HVR和FR。表1中的“优选取代”项下中示出了保守取代。表1中的“示例性取代”项下提供了其他基本变化，并且下文中参照氨基酸侧链类别进一步进行了描述。可将氨基酸取代引入所关注抗体和筛选后具有所期望活性的产物中，所述所期望活性为(例如)保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
可根据常见侧链性质将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代使得需要将这些种类中的一种的成员与另一种类交换。
一种取代变体类型涉及取代亲代抗体(例如人源化或人类抗体)的一个或多个超变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲代抗体在某些生物性质中具有修饰(例如改善)(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲代抗体的某些生物性质。示例性取代变体为亲和力成熟抗体，所述亲和力成熟抗体可便利地(例如)使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所描述的那些技术)产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示于噬菌体上并且筛检特定生物活性(例如结合亲和力)。
可对HVR作出变化(例如取代)以(例如)改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间发生高频率突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已描述了通过从二级文库构建和重新选择来实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的诱变)中的任一种将多样性引入所选用于成熟的可变基因中。然后建立二级文库。然后筛选文库以鉴别具有所期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR引导方法，其中将若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特定地鉴别参与抗原结合的HVR残基。通常靶向尤其CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不会基本上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可对HVR作出不基本上降低结合亲和力的保守改变(例如本文所提供的保守取代)。此类改变可位于HVR“热点”或SDR外部。在上文所提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每一HVR未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴别抗体中可被靶向用于诱变的残基或区域的适用方法如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴别残基或目标残基的群组(例如诸如arg、asp、his、lys以及glu等带电残基)，并且将其用中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)代替以确定是否会影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他取代。或者或另外，使用抗原-抗体复合体的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向此类接触残基和相邻残基作为取代候选物或将其排除。可筛选变体以确定它们是否含有所期望的性质。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合物(长度在一个残基至含有上百或更多残基的多肽范围内)以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽与抗体N端或C端的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来便捷地完成抗体糖基化位点的添加或缺失。
如果抗体包括Fc区，那么可改变其所附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的原初抗体通常包含分支链、双触角寡糖，所述分支链、双触角寡糖通常通过N-链接附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。所述寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖以及唾液酸以及附接至双触角寡糖结构的“茎部”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可修饰本发明抗体中的寡糖以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏附接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。举例来说，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如(例如)WO2008/077546中所描述，通过计算糖链内Asn297处的岩藻糖相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量附接至Asn 297的所有糖结构(例如复杂、杂合以及高甘露糖结构)的总和的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中大约297位处的天门冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，因抗体中具有微小序列变化，故Asn297还可位于297位上游或下游的大约±3个氨基酸处，即介于294位与300位之间。这些岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去海藻糖基化”或“缺乏海藻糖”的抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta,L；以及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在实施例11中)以及基因剔除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8剔除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
进一步提供二等分寡糖的抗体变体，例如，其中附接至抗体Fc区的双触角寡糖由GlcNAc二等分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利号6,602,684(Umana等人)以及US 2005/0123546(Umana等人)中描述了此类抗体变体的实例。还提供在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。例如WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)以及WO 1999/22764(Raju,S.)中描述了此类抗体变体。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些(但非全部)效应子功能的抗体变体，此情况使其成为许多应用的期望候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期为重要的，但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)为不必要或有害的。可实施体外和/或体内细胞毒性分析来确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可实施Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcRIII，而单核细胞表达FcRI、FcRII以及FcRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-492(1991)的第464页表3中汇总了FcR在造血细胞中的表达。美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述了评估所关注分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例。或者，可使用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)以及CytoTox非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用于此类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内(例如在诸如公开于Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中的动物模型等动物模型中)评价所关注分子的ADCC活性。还可实施C1q结合分析来确认抗体不能与C1q结合并且因此缺少CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评价补体活化，可实施CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用业内已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327以及329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297以及327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括在残基265和297处取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述具有改善或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056、WO 2004/056312以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述，在Fc区中进行改变，从而改变(即改善或减小)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了具有延长的半衰期和改善的与负责将母体IgG转移至胎中的新生Fc受体(FcRn)的结合的抗体(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc区残基434(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及与Fc区变体的其他实例有关的WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“THIOMABTM”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在抗体的可用于结合的位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点处并且可用于使抗体结合至其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)以产生如本文进一步所描述的免疫结合物。在某些实施方案中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任一个或多个：轻链的K149C(Kabat编号)、轻链的V205(Kabat编号)、重链的A118(EU编号)以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如(例如)美国专利号7,521,541号中所描述来产生半胱氨酸工程化的抗体。
SEQ ID NO:76中展示了示例性V205C半胱氨酸工程化的轻链。V205C半胱氨酸工程化的轻链可融合至本文所描述的轻链可变区的C-末端并且与重链配对以制备半胱氨酸工程化的抗体。
SEQ ID NO:78中展示了示例性K149C半胱氨酸工程化的轻链。V205C半胱氨酸工程化的轻链可融合至本文所描述的轻链可变区的C-末端并且与重链配对以制备半胱氨酸工程化的抗体。
SEQ ID NO:77中展示了示例性A118C半胱氨酸工程化的重链。A118C半胱氨酸工程化的轻链可融合至本文所描述的轻链可变区的C-末端并且与重链配对以制备半胱氨酸工程化的抗体。
SEQ ID NO:79中展示了示例性S400C半胱氨酸工程化的重链。A118C半胱氨酸工程化的轻链可融合至本文所描述的轻链可变区的C-末端并且与重链配对以制备半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可进一步修饰本文所提供的抗体以含有业内已知并且易于获得的额外非蛋白质部分。适于衍生抗体的部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化的多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有稳定性而在制造方面具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可为分支链或非分支链的。附接至抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接一个以上的聚合物，那么其可为相同或不同分子。一般来说，可根据包括(但不限于)以下在内的考虑因素来确定衍生化所用聚合物的数目和/或类型：所要改善的抗体特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于确定条件下的疗法等。
在另一实施方案中，提供抗体和非蛋白质部分的结合物，所述非蛋白质部分可通过暴露于辐射来选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括(但不限于)如下波长，所述波长不会危害正常细胞但将非蛋白质部分加热至可将毗邻抗体-非蛋白质部分的细胞杀死的温度。
B.重组方法和组合物
例如如美国专利号4,816,567号中所描述，可使用重组方法和组合物来产生抗体。在一个实施方案中，提供本文所述的编码抗体的分离核酸。此类核酸可编码抗体中包含VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含此类核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含以下物质(例如已用所述物质转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，以及包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上文所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为重组产生抗体，分离例如如上文所描述的编码抗体的核酸并且将其插入一个或多个载体中以进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可使用常规程序容易地分离此类核酸并测序(例如通过使用能与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适宜宿主细胞包括本文所描述的原核或真核细胞。举例来说，可在细菌中产生抗体，特别是在无需糖基化和Fc效应子功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199以及5,840,523(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，所述文献描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可从细菌细胞浆液以可溶部分形式分离出抗体并且可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母菌)也为适合用于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)以及Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的适宜宿主细胞还源自多细胞有机体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已确定多种杆状病毒株可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978以及6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANIBODIESTM技术)。
还可使用脊椎动物细胞作为宿主。举例来说，可使用适于悬浮液生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人类胚胎肾细胞系(293或293细胞，如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述)；幼小仓鼠肾脏(BHK)细胞；小鼠足细胞(TM4细胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0以及Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
C.分析
可通过业内已知的各种分析来鉴别本文所提供的抗体，筛检或表征其物理/化学性质和/或生物活性。
在一个方面中，举例来说，通过已知方法(诸如ELISA、FACS或西方印迹(Western blot))来测试本发明抗体的抗原结合活性。
在另一方面中，可使用竞争分析来鉴别与本文所描述的任何抗体竞争结合抗原(诸如Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2或MUC16)的抗体。在某些实施方案中，此类竞争抗体结合由本文所描述的抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”,Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供了定位抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在示例性竞争分析中，在包含结合抗原的第一标记抗体(例如本文所描述的任何抗体)和第二未标记抗体的溶液中孵育固定抗原(诸如Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2或MUC16)，测试所述第二未标记抗体与第一抗体竞争结合抗原的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育固定抗原。在允许第一抗体结合抗原的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并且测量与固定抗原缔合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中与固定抗原缔合的标记的量基本上减少，那么这表明第二抗体与第一抗体竞争结合抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫结合物
本发明还提供包含本文所提供的结合至一种或多种细胞毒性剂的任何抗体的免疫结合物，所述细胞毒性剂为(诸如)化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素、细菌的酶促活性毒素、真菌、植物或动物来源或其片段)或放射性同位素(即放射性结合物)。
免疫结合物容许将药物部分靶向递送至肿瘤并且在一些实施方案中在其中进行细胞内累积，其中全身性施用未结合的药物可对正常细胞产生不可接受水平的毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-药物结合物(ADC)为靶向的化学治疗分子，所述化学治疗分子通过将强力细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞来组合抗体和细胞毒性药物的性质(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)，由此通过最大化功效并且最小化脱靶毒性来增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107。
本发明的ADC化合物包括具有抗癌活性的那些ADC化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括结合(即共价附接)至药物部分的抗体。在一些实施方案中，抗体经由接头共价附接至药物部分。本发明的抗体-药物结合物(ADC)将有效剂量的药物选择性递送至肿瘤组织，由此可实现较大选择性(即较低有效剂量)，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。
抗体-药物结合物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞生长抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分可通过包括(但不限于)微管蛋白结合、DNA结合或插入以及RNA聚合酶抑制、蛋白质合成和/或拓扑异构酶的机制来赋予其细胞毒性和细胞生长抑制作用。示例性药物部分包括(但不限于)类美登素、多拉斯他汀、奥里斯他汀(auristatin)、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比辛(nemorubicin)和其衍生物、PNU-159682、蒽环、多卡米星、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢霉烯、CC1065、喜树碱、依利奈法德(elinafide)以及其具有细胞毒性活性的立体异构体、等排体、类似物以及衍生物。下文进一步详细论述了此类免疫结合物的非限制性实例。
1.示例性抗体-药物结合物
抗体-药物结合物(ADC)化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)以及将Ab附接至D的接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体经由一个或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸和/或半胱氨酸)附接至接头部分(L)。
示例性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p I
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可结合至抗体的药物部分的数目受游离半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施方案中，通过本文所描述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。式I的示例性ADC包括(但不限于)具有1个、2个、3个或4个工程化半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，在不使用工程化的情况下，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体中，在此情形下可使用现有游离半胱氨酸残基将抗体结合至药物。在一些实施方案中，在结合抗体之前将抗体暴露于还原条件以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)示例性接头-药物部分
“接头”(L)为可用于将一个或多个药物部分(D)连接至抗体(Ab)以形成式I的抗体-药物结合物(ADC)的双功能或多功能部分。在一些实施方案中，可使用具有用于共价附接至药物和抗体的反应性官能团的接头来制备抗体-药物结合物(ADC)。举例来说，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一个方面中，接头具有能够与存在于抗体上的游离半胱氨酸反应形成共价键的官能团。此类反应性官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、活化酯(诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯以及异硫氰酸酯。参见例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773第766页的结合方法和本文中的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与存在上的抗体亲电子基团发生反应的官能团。示例性此类亲电子基团包括(但不限于)醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团进行反应并且与抗体单元形成共价键。此类反应性官能团的非限制性实例包括(但不限于)酰肼基、肟基、氨基、肼基、硫代半卡腙基、肼羧酸酯基以及芳基酰肼基。
在一些实施方案中，接头-药物部分的药物部分包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。DNA小沟烷基化剂的5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(氨基CBI)种类为强力细胞毒素(Atwell等人(1999)J.Med.Chem.,42:3400)，并且已在诸多种类被设计成用于癌症疗法的前药中用作效应子单元。这些物质包括抗体结合物(Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.,48:1344)、用于基于硝基苯甲基氨基甲酸酯的基因疗法的前药(Hay等人(2003)J.Med.Chem.46:2456)以及作为低氧活化前药的相应硝基-CBI衍生物(Tercel等人(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50:2606-2609)。在一些实施方案中，接头-药物部分的药物部分包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体。在一些实施方案中，接头-药物部分包含CBI/吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(PBD)二聚体。
在一些实施方案中，用于形成本发明的免疫结合物的接头-药物中间体具有结构(LD-1)：
在一些实施方案中，用于形成本发明的免疫结合物的接头-药物中间体具有结构(LD-2)：
在一些实施方案中，用于形成本发明的免疫结合物的接头-药物中间体具有结构(LD-3)：
在一些实施方案中，抗体-药物结合物具有结构(I)：
其中Ab为抗体并且p为1至4。在一些实施方案中，p为1至2。在一些实施方案中，p约为2。
在一些实施方案中，抗体-药物结合物具有结构(II)：
其中Ab为抗体并且p为1至4。在一些实施方案中，p为1至2。在一些实施方案中，p约为2。
在一些实施方案中，抗体-药物结合物具有结构(III)：
其中Ab为抗体并且p为1至4。在一些实施方案中，p为1至2。在一些实施方案中，p约为2。
在一些实施方案中，抗体(Ab)为结合选自Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2以及MUC16的抗原的抗体。在一些实施方案中，抗体(Ab)为本文所描述的抗体。
b)药物载量
将药物载量表示为p，即式I分子中每一抗体的药物部分的平均数。药物载量可在每一抗体1至20个药物部分(D)范围内。式I ADC包括与1至20个范围内的药物部分结合的抗体的集合。可通过诸如质谱、ELISA分析以及HPLC等常规方式来表征来自结合反应的ADC制剂中的每一抗体中药物部分的平均数。还可测定ADC按照p的定量分布。在一些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳等方式从具有其他药物载量的ADC分离、纯化以及表征均质ADC(其中p为某一值)。
对于一些抗体-药物结合物来说，p可受抗体上的附接位点数限制。举例来说，倘若附接为半胱氨酸硫醇(如在上文的某些示例性实施方案中)，那么抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个可附接接头的具足够反应性的硫醇基。在某些实施方案中，较高药物载量(例如p>5)可引起某些抗体-药物结合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性损失。在某些实施方案中，ADC的平均药物载量介于1至约8、约2至约6或约3至约5之间。实际上，已证实，对于某些ADC来说，每一抗体中药物部分的最佳比率可小于8，并且可为约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中，少于理论最大值的药物部分在结合反应期间结合至抗体。如下文所论述，抗体可含有(例如)不与药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基。通常，抗体不含有许多可连接至药物部分的游离并且具反应性的半胱氨酸硫醇基；实际上抗体中的多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙膦(TCEP)等还原剂在部分或完全还原条件下将抗体还原，以生成反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件以显露诸如赖氨酸或半胱氨酸等反应性亲核基。
可以不同方式控制ADC的载量(药物/抗体比)，并且(例如)通过以下方式来控制：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，以及(iii)偏向或限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原条件。
应理解，倘若超过一个亲核基与药物-接头中间体或接头试剂反应，那么所得产物为分布有一个或多个附接至抗体的药物部分的ADC化合物混合物。可由混合物通过对抗体具有特异性并且对药物具有特异性的双重ELISA抗体分析来计算每一抗体的药物的平均数。可通过质谱鉴别混合物中的个别ADC分子并且通过HPLC(例如疏水相互作用色谱)分离(参见例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等人，“Effect of drugloading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drug conjugate”，摘要编号：624,American Association for CancerResearch,2004年年度会议，2004年3月27至31日，AACR会议纪录，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人，“Controlling the location of drug attachment in antibody-drugconjugates”，摘要编号：627,American Association for Cancer Research,2004年年度会议，2004年3月27至31日，AACR会议纪录，第45卷，2004年3月)。在某些实施方案中，可通过电泳或色谱从结合混合物中分离具有单一载量值的均质ADC。
c)制备免疫结合物的某些方法
可通过采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件以及试剂的若干途径来制备式I ADC，包括：(1)抗体的亲核基与二价接头试剂反应以经由共价键形成Ab-L，随后与药物部分D反应；以及(2)药物部分的亲核基与二价接头试剂反应以经由共价键形成D-L，随后与抗体的亲核基反应。US 7498298中描述了经由后一途径制备式I ADC的示例性方法，该专利以引用的方式明确并入本文中。
抗体上的亲核基包括(但不限于)：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，例如，赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；以及(iv)糖羟基或氨基，其中抗体为糖基化的。氨基、硫醇基以及羟基具有亲核性并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯基，诸如NHS酯基、HOBt酯基、卤代甲酸酯基以及酰基卤基；(ii)烷基卤基和苯甲基卤基，诸如卤代乙酰胺基；以及(iii)醛基、酮基、羧基以及马来酰亚氨基。某些抗体具有可还原链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过使用诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙膦(TCEP)等还原剂处理使抗体完全或部分还原来使抗体具有反应性以供与接头试剂结合。因此，每一半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核剂。可经由赖氨酸残基的修饰(例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂(Traut’sreagent))反应)从而将胺转化成硫醇来将其他亲核基引入抗体中。还可通过引入1个、2个、3个、4个或更多个半胱氨酸残基来将反应性硫醇基引入抗体中(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)。
还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基之间的反应来产生本发明的抗体-药物结合物。接头试剂上的可用亲核基包括(但不限于)酰肼基、肟基、氨基、肼基、硫代半卡腙基、肼羧酸酯基以及芳基酰肼基。在一个实施方案中，对抗体进行修饰以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一实施方案中，可利用(例如过碘酸盐氧化试剂)氧化糖基化抗体的糖以形成可与接头试剂或药物部分的氨基反应的醛基或酮基。所得亚胺希夫碱基(Schiff base group)可形成稳定键联，或可通过例如硼氢化物试剂还原以形成稳定胺键联。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏过碘酸钠的反应可在抗体中产生可与药物上的适当基团反应的羰基(醛基和酮基)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可与偏过碘酸钠反应，从而产生代替第一氨基酸的醛(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。此类醛可与药物部分或接头亲核剂反应。
药物部分上的示例性亲核基团包括(但不限于)：氨基、硫醇基、羟基、酰肼基、肟基、肼基、硫半卡腙基、肼羧酸酯基以及芳基酰肼基，所述基团能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯基，诸如NHS酯基、HOBt酯基、卤代甲酸酯基以及酰基卤基；(ii)烷基卤基和苯基卤基，诸如卤代乙酰胺基；(iii)醛基、酮基、羧基以及马来酰亚氨基。
在另一实施方案中，抗体可结合至“受体”(诸如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向，其中向患者施用抗体-受体结合物，随后使用清除剂从循环中去除未结合的结合物并且随后施用结合至细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如亲和素)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文所提供的抗体中的任一种均可用于检测生物样品中抗原的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物样品”包含(例如)细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性乳房组织)。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法中的本文所描述的抗体。在另一方面中，提供检测生物样品中的抗原(诸如Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2或MUC16)的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物样品与本文所描述的抗体在允许抗体与抗原结合的条件下接触，并且检测在抗体与生物样品中的抗原之间是否形成复合物。此类方法可为体外或体内方法。在一个实施方案中，使用本文所描述的抗体来选择适用于使用本文所描述的免疫结合物的受试者的疗法，举例来说，其中抗原(诸如Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2或MUC16)为用于选择患者的生物标记物。在另一实施方案中，生物样品为细胞或组织。
在另一实施方案中，在体内使用本文所描述的抗体通过(例如)体内成像来检测受试者的抗原阳性癌症，例如用于对癌症进行诊断、预后或分期、确定适当疗程或监测癌症对疗法的反应的目的。业内已知用于体内检测的一种方法为如(例如)van Dongen等人，TheOncologist12:1379-1389(2007)以及Verel等人，J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所描述的免疫-正电子发射断层摄影术(免疫-PET)。在此类实施方案中，提供检测受试者的抗原-阳性癌症的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有抗原-阳性癌症的受试者施用标记抗体，以及检测受试者中的标记抗体，其中标记抗体的检测指示受试者的抗原-阳性癌症。在某些此类实施方案中，标记抗体包含结合至正电子发射体(诸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr以及124I)的本文所描述的抗体。在一个特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。在一些实施方案中，抗原选自Ly6E、STEAP1、CD79b、HER2以及MUC16。
在其他实施方案中，诊断或检测方法包括使固定至基底上的第一抗体与要测试抗原存在的生物样品接触，使基底暴露于第二抗体，以及检测第二抗体是否结合于第一抗体与生物样品中的抗原之间的复合物。基底可为任何支持介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合物珠粒、玻片、芯片以及其他基底。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在某些实施方案中，第一或第二抗体为本文所描述的抗体中的任一种。
在某些实施方案中，提供标记过的抗体。标记包括(但不限于)直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记以及放射性标记)以及经由(例如)酶反应或分子相互作用间接检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括(但不限于)放射性同位素32P、14C、125I、3H以及131I、荧光团(诸如稀土螯合物或萤光黄和其衍生物)、若丹明(rhodamine)和其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶等采用过氧化氢来氧化染料前体的酶结合)、生物素/亲和素、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等。在另一实施方案中，标记为正电子发射体。正电子发射体包括(但不限于)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr以及124I。在特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物制剂
通过将具有期望纯度的抗体或免疫结合物与一种或多种药学上可接受的可选载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编(1980))混合以冻干制剂或水溶液形式制得如本文所描述的抗体或免疫结合物(诸如免疫结合物的抗Ly6E抗体)的药物制剂。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括(但不限于)：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、麸胺酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International Inc.)。美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种额外糖胺多糖酶(诸如软骨素酶)组合。
美国专利号6,267,958中描述了示例性冻干抗体或免疫结合物制剂。水性抗体或免疫结合物制剂包括描述于美国专利号6,171,586和WO2006/044908中的那些，后面的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本发明制剂还可视需要含有一种以上用于所治疗的特定适应症的活性成份，优选为相互间不会产生不利影响的具有补充活性的那些成份。
还可将活性成份装入通过(例如)凝聚技术或介面聚合制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶质药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)或粗乳液中。Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编(1980)中公开了此类技术。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适宜实例包括含有抗体或免疫结合物的固态疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质呈成形物件形式，例如薄膜或微胶囊。
要用于体内施用的制剂通常为无菌的。可通过(例如)使用无菌过滤膜进行过滤来容易地实现无菌性。
G.治疗方法和组合物
本文所提供的任何免疫结合物均可用于例如治疗方法等方法中。
在一个方面中，将本文所提供的抗Ly6E抗体或免疫结合物用于抑制Ly6E-阳性细胞的增殖的方法中，所述方法包括将细胞在允许抗Ly6E抗体或免疫结合物结合至细胞表面上的Ly6E的条件下暴露于抗Ly6E抗体或免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外方法或体内方法。在一些实施方案中，细胞为乳腺癌细胞、胰脏癌细胞、结肠癌细胞、结肠直肠癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、非小细胞肺癌细胞(鳞状和/或非鳞状)或胃癌细胞。
在一个方面中，将本文所提供的抗STEAP1抗体或免疫结合物用于抑制STEAP1-阳性细胞的增殖的方法中，所述方法包括将细胞在允许抗STEAP1抗体或免疫结合物结合至细胞表面上的STEAP1的条件下暴露于抗STEAP1抗体或免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外方法或体内方法。在一些实施方案中，细胞为前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞或尤文氏肉瘤细胞。
在一个方面中，将本文所提供的抗CD79b抗体或免疫结合物用于抑制CD79b-阳性细胞的增殖的方法中，所述方法包括将细胞在允许抗CD79b抗体或免疫结合物结合至细胞表面上的CD79b的条件下暴露于抗CD79b抗体或免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外方法或体内方法。在一些实施方案中，细胞为淋巴瘤细胞、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、白血病细胞、毛细胞白血病(HCL)细胞、急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞或套细胞淋巴瘤细胞。
在一个方面中，将本文所提供的抗MUC16抗体或免疫结合物用于抑制MUC16-阳性细胞的增殖的方法中，所述方法包括将细胞在允许抗MUC16抗体或免疫结合物结合至细胞表面上的MUC16的条件下暴露于抗MUC16抗体或免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外方法或体内方法。在一些实施方案中，细胞为卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、非小细胞肺癌细胞(鳞状和/或非鳞状)、胰脏癌细胞或乳腺癌细胞(包括Her2阴性乳腺癌细胞和/或三阴性乳腺癌细胞)。
在一个方面中，将本文所提供的抗HER2抗体或免疫结合物用于抑制HER2-阳性细胞的增殖的方法中，所述方法包括将细胞在允许抗HER2抗体或免疫结合物结合至细胞表面上的HER2的条件下暴露于抗HER2抗体或免疫结合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外方法或体内方法。在一些实施方案中，细胞为乳腺癌细胞或胃癌细胞。
可使用可购自Promega(Madison,WI)的CellTiter-GloTM发光细胞存活率分析来分析体外细胞增殖抑制。所述分析基于所存在ATP的定量来测定培养物中活细胞的数目，ATP可指示代谢活性细胞。参见Crouch等人，(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88、美国专利号6602677。所述分析可以96孔或384孔模式实施，从而使其适用于自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等人，(1995)AntiCancer Drugs6:398-404。分析程序涉及直接向所培养的细胞中添加单一试剂(CellTiter-试剂)。这使得发生细胞裂解并且产生由荧光素酶反应产生的荧光信号。发光信号与所存在ATP的量成正比，ATP的量与培养物中所存在活细胞的数目成正比。可通过发光计或CCD照相机成像装置来记录数据。将发光输出表示为相对光单位(RLU)。
在另一方面中，提供用作药剂的免疫结合物。在其他方面中，提供用于治疗方法中的抗Ly6E免疫结合物。在某些实施方案中，提供用于治疗Ly6E-阳性癌症的抗Ly6E免疫结合物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有Ly6E-阳性癌症的个体的方法中的抗Ly6E免疫结合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗Ly6E免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗Ly6E免疫结合物在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗Ly6E-阳性癌症。在另一实施方案中，将所述药剂用于治疗Ly6E-阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有Ly6E-阳性癌症的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供治疗Ly6E-阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此类Ly6E-阳性癌症的个体施用有效量的抗Ly6E免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
根据上文任何实施方案的Ly6E-阳性癌症可为(例如)Ly6E-阳性乳腺癌、Ly6E-阳性转移性乳腺癌(包括Ly6E-阳性/Her2阴性乳腺癌和/或Ly6E-阳性/三阴性乳腺癌)、Ly6E-阳性胰脏癌、Ly6E-阳性结肠癌、Ly6E-阳性结肠直肠癌、Ly6E-阳性黑色素瘤、Ly6E-阳性卵巢癌、Ly6E-阳性非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)或Ly6E-阳性胃癌。
在另一方面中，提供用作药剂的免疫结合物。在其他方面中，提供用于治疗方法中的抗STEAP1免疫结合物。在某些实施方案中，提供用于治疗STEAP1-阳性癌症的抗STEAP1免疫结合物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有STEAP1-阳性癌症的个体的方法中的抗STEAP1免疫结合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗STEAP1免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗STEAP1免疫结合物在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗STEAP1-阳性癌症。在另一实施方案中，将所述药剂用于治疗STEAP1-阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有STEAP1-阳性癌症的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供治疗STEAP1-阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此类STEAP1-阳性癌症的个体施用有效量的抗STEAP1免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
根据上文任何实施方案的STEAP1-阳性癌症可为(例如)STEAP1-阳性前列腺癌、STEAP1-阳性肺癌、STEAP1-阳性结肠癌、STEAP1-阳性膀胱癌、STEAP1-阳性卵巢癌或STEAP1-阳性尤文氏肉瘤。
在另一方面中，提供用作药剂的免疫结合物。在其他方面中，提供用于治疗方法中的抗CD79b免疫结合物。在某些实施方案中，提供用于治疗CD79b-阳性癌症的抗CD79b免疫结合物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有CD79b-阳性癌症的个体的方法中的抗CD79b免疫结合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗CD79b免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗CD79b免疫结合物在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗CD79b-阳性癌症。在另一实施方案中，将所述药剂用于治疗CD79b-阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有CD79b-阳性癌症的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供治疗CD79b-阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此类CD79b-阳性癌症的个体施用有效量的抗CD79b免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
根据上文任何实施方案的CD79b-阳性癌症可为(例如)CD79b-阳性淋巴瘤、CD79b-阳性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、CD79b-阳性侵袭性NHL、CD79b-阳性复发性侵袭性NHL、CD79b-阳性复发性无痛性NHL、CD79b-阳性难治性NHL、CD79b-阳性难治性无痛性NHL、CD79b-阳性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、CD79b-阳性小淋巴细胞性淋巴瘤、CD79b-阳性白血病、CD79b-阳性毛细胞白血病(HCL)、CD79b-阳性急性淋巴细胞性白血病(ALL)、CD79b-阳性伯基特氏淋巴瘤以及CD79b-阳性套细胞淋巴瘤。
在另一方面中，提供用作药剂的免疫结合物。在其他方面中，提供用于治疗方法中的抗MUC16免疫结合物。在某些实施方案中，提供用于治疗MUC16-阳性癌症的抗MUC16免疫结合物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有MUC16-阳性癌症的个体的方法中的抗MUC16免疫结合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗MUC16免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括例如如下文所描述向个体施用有效量的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗MUC16免疫结合物在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗MUC16-阳性癌症。在另一实施方案中，将所述药剂用于治疗MUC16-阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有MUC16-阳性癌症的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供治疗MUC16-阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此类MUC16-阳性癌症的个体施用有效量的抗MUC16免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
根据上文任何实施方案的MUC16-阳性癌症可为(例如)MUC16-阳性卵巢癌、MUC16-阳性子宫内膜癌、MUC16-阳性非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状)、MUC16-阳性胰脏癌或MUC16-阳性乳腺癌(诸如MUC16-阳性转移性乳腺癌，包括MUC16-阳性Her2阴性乳腺癌和/或MUC16-阳性三阴性乳腺癌)。
在另一方面中，提供用作药剂的抗HER2免疫结合物。在其他方面中，提供用于治疗方法中的抗HER2免疫结合物。在某些实施方案中，提供用于治疗HER2-阳性癌症的抗HER2免疫结合物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有HER2-阳性癌症的个体的方法中的抗HER2免疫结合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗HER2免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗HER2免疫结合物在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗HER2-阳性癌症。在另一实施方案中，将所述药剂用于治疗HER2-阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有HER2-阳性癌症的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在另一方面中，本发明提供治疗HER2-阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此类HER2-阳性癌症的个体施用有效量的抗-HER2免疫结合物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
根据上文任何实施方案的HER2-阳性癌症可为(例如)HER2-阳性乳腺癌或HER2-阳性胃癌。在一些实施方案中，HER2-阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(IHC)分值和/或≥2.0的原位杂交(ISH)扩增比。
根据上文任何实施方案的“个体”、“患者”或“受试者”」可为人类。
在另一方面中，本发明提供用于(例如)上文任何治疗方法中的包含本文所提供的任何免疫结合物的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含本文所提供的任何免疫结合物和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文所提供的任何免疫结合物和至少一种如(例如)下文所描述的其他治疗剂。
可将本发明的抗体或免疫结合物单独或与其他药剂组合用于疗法中。举例来说，可将本发明的免疫结合物与至少一种额外治疗剂共施用。
上文提到的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一或分开的制剂中包括两种或更多种治疗剂)和分开施用(在此情况下，可在施用额外治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体或免疫结合物)。还可将本发明的抗体免疫结合物与放射疗法组合使用。
可通过任何适宜方式施用本发明的抗体或免疫结合物(和任何额外治疗剂)，包括肠胃外、肺内以及鼻内以及(如果期望用于局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜腔内或皮下施用。可通过任何适宜途径(例如通过注射、诸如静脉内或皮下注射)投药，这部分取决于是短期施用还是长期施用。本文涵盖各种投药方案，包括(但不限于)在不同时间点单次或多次施用、快速施用以及脉冲输注。
应以符合良好医疗实践的方式调配、投用以及施用本发明的抗体或免疫结合物。在此背景下需考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病因、药剂递送位点、施用方法、施用时程以及从业医师所知的其他因素。抗体或免疫结合物不一定需要(但任选)与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量取决于制剂中所存在的抗体或免疫结合物的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其他因素。这些药剂通常以相同剂量并且以如本文所描述的施用途径来使用，或以本文所描述剂量的约1％至99％来使用，或以凭经验/临床确定适宜的任何剂量和任何途径来使用。
对疾病的预防或治疗来说，本发明的抗体或免疫结合物的合适剂量(在单独使用或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于要治疗疾病的类型、抗体或免疫结合物的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体或免疫结合物是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体或免疫结合物的反应以及主治医师的判断。一次性或历经一系列治疗以适当方式向患者施用抗体或免疫结合物。视疾病的类型和严重性而定，不论(例如)是通过一次或多次分开施用还是通过连续输注来施用，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)抗体或免疫结合物可为向患者施用的初始候选剂量。视上述因素而定，一种典型日剂量可介于约1μg/kg至100mg/kg之间或更高。在历经若干天或更长时间重复施用时，视病状而定，治疗通常会持续至对疾病症状的期望阻抑出现为止。抗体或免疫结合物的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一个或多个剂量(或其任何组合)。可间歇性施用此类剂量，例如每周一次或每三周一次(例如使得患者接受约两个至约20个或例如约6个剂量的抗体)。可在开始时施用较高载量剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，可使用其他剂量方案。可容易地通过常规技术和分析来监测此疗法的进展。
应理解，可使用本发明的免疫结合物和抗体来实施上述任何制剂或治疗方法。
H.制品
提供含有本文所描述的用于本文治疗方法中的免疫结合物的制品或“试剂盒”。试剂盒可包括位于容器上或与容器缔合的标记或包装插页。术语“包装插页”用于指通常包括于治疗产品的商业包装内的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或关于此类治疗产品的使用的警告的信息。适宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、泡罩等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器可容纳有效用于本文治疗方法中的免疫结合物或其制剂，并且可具有无菌存取口(举例来说，容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标记或包装插页指示将组合物用于如本文所描述和要求的治疗方法中。制品还可含有另一容器，所述另一容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)以及右旋糖溶液。它可进一步包括由商业和用户角度来看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针以及注射器。
试剂盒可进一步包括关于免疫结合物的施用的说明书。举例来说，如果试剂盒包含含有本文所描述的免疫结合物的第一组合物和第二药物制剂，那么试剂盒可进一步包括向有需要的患者同时、依序或分开施用所述第一和第二药物组合物的说明书。
在另一实施方案中，试剂盒适于经口递送免疫结合物(诸如片剂或胶囊)。此类试剂盒优选包括多个单位剂量。此类试剂盒可包括将剂量按其预期使用顺序定向的卡片。此类试剂盒的实例为“泡罩包装”。泡罩包装为包装工业所熟知的并且广泛用于包装医药单位剂型。如果需要，那么可以(例如)数字、字母或其他标记物形式或用日历插页提供记忆帮助，标明在治疗时间表中可施用剂量的日期。
III.实施例
以下为本发明方法和组合物的实施例。应理解，鉴于上文所提供的一般说明可实践各种其他实施方案。
实施例1：抗体药物结合物的制备
对于较大规模抗体制备来说，可在CHO细胞中产生抗体。可将编码重链和轻链的载体转染至CHO细胞中并且通过标准柱色谱(诸如蛋白质A亲和色谱)从细胞培养基纯化IgG。
如下文所描述来合成表2中所示的CBI-CBI二聚体和CBI-PBD二聚体肽模拟物接头药物中间体。
表2：CBI-CBI二聚体和CBI-PBD二聚体肽模拟物接头药物中间体
A.CBI-PBD肽模拟物接头药物中间体的合成
如下合成具有下式的CBI-PBD二聚体肽模拟物接头-药物中间体(8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-10(5H)-甲酸(11aS)-4-((S)-6-氨基-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)己酰胺基)苯甲酯；LD-3)：
步骤A：磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1u的合成
在20℃下在氮气氛下，向(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚3-甲酸叔丁酯(3.34g，10.0mmol)于无水DCM(25mL)中的搅拌过的均质溶液中添加4M HCl二噁烷溶液(12.5mL，50.0mmol)。在添加之后，将反应混合物在20℃下在氮气下再搅拌20h。使用石油醚(250mL)稀释混合物并在20℃下在氮气下搅拌20min。倾析溶剂并且使用石油醚(250mL)将程序再重复一次。将所得固体在真空下在25℃下干燥1h，得到(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-醇盐酸盐(2.7g,100％)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.80(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,1H),7.58(br t,J＝7.5Hz,1H),7.43(br t,J＝7.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.27-4.17(m,1H),4.01(dd,J＝11.0,3.2Hz,1H),3.93-3.74(m,3H)，未观察到2个质子。未进一步纯化就将粗产物用于下一步骤中。
在0℃下在氮气氛下，向(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-醇盐酸盐(2.7g，10.0mmol)于无水DCM(10mL)和二噁烷(30mL)中的搅拌过的异质混合物中添加三氟乙酸酐(TFAA)(3.4mL，24.0mmol)，随后添加二异丙基乙胺(DIPEA)(8.71mL，50.0mmol)。在添加之后，将反应混合物在0℃下在氮气下再搅拌50min。添加乙酸乙酯(400mL)并且在0℃下添加1N HCl(200mL)并将混合物在氮气下搅拌20min。分离乙酸乙酯层，使用1N HCl(200mL)和水(2×200mL)连续洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在减压下在25℃浴温下蒸发，得到呈绿灰色固体形式的(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-2,2,2-三氟乙烷-1-酮(3.3g，100％)。未进一步纯化就将此材料用于下一步骤中。
在20℃下在氮气氛下，向(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-2,2,2-三氟乙烷-1-酮(3.3g，10.0mmol)于无水THF(40mL)中的搅拌过的均质溶液中添加二-叔丁基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(4.31mL，13.0mmol)。在添加之后，将反应混合物在20℃下在氮气下搅拌5-10min并且然后历经17min逐滴添加四唑(3％CH3CN溶液，38.0mL，13.0mmol)。将最终反应混合物进一步在20℃下在氮气下搅拌19h。在冰浴中冷却混合物且添加30％H2O2(11.3mL，100.0mmol)。在添加之后，将反应混合物在20℃下再搅拌1h30min。使用乙酸乙酯(300mL)和10％Na2S2O3水溶液(500mL)在搅拌下在0℃下将混合物稀释20min。分离乙酸乙酯层并且使用水(200mL)、饱和NaHCO3(200mL)以及水(200mL)连续洗涤并且然后干燥(MgSO4)并在减压下在25℃浴温下蒸发，得到琥珀色油状物。通过色谱在硅胶上纯化，使用1:3的乙酸乙酯:石油醚洗脱，得到呈无色泡沫状固体形式的1u(4.7g，90％)，mp 39-42℃；[α]D-61.8°(c 1.02,CHCl3)。分析.(C23H28ClF3NO5P)计算值：C,52.93；H,5.41；N,2.68。实验值：C,53.05；H,5.43；N,2.80。
步骤B：乙酸((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)苯甲基)氧基)羰基)氨基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-5-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-2-基)甲酯3g的合成
向(S)-6-(5-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-4-(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙酯3a(4.14g，6.95mmol)(J.Med.Chem.2003,46,2132-2151)于无水DCM(25mL)中的搅拌过的溶液中添加乙酸酐(3.30mL，34.8mmol)和三乙胺(5.81mL，41.7mmol)。将混合物在20℃下搅拌3h 30min。添加无水MeOH(4.0mL)并且将混合物搅拌30min。将混合物分配于EtOAc(400mL)与水(400mL)之间。分离EtOAc层，使用水(2×200mL)洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并蒸发，得到呈油状物形式的(S)-6-(4-(2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙酯3b(4.28g，96％)；[α]D-57.4°(c 0.21,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.10(s,1H),7.17(s,1H),6.87(s,1H),6.01-5.87(m,1H),5.32(dd,J＝17.2,1.5Hz,1H),5.21(dd,J＝10.4,1.4Hz,1H),4.89(s,2H),4.54(d,J＝5.4Hz,2H),4.39-4.20(m,3H),3.93(t,J＝6.4Hz,2H),3.75(s,3H),3.46-3.27(m,2H),2.13-1.90(m,4H),1.89-1.60(m,7H),1.54-1.40(m,2H)，2个质子由DMSO峰遮蔽。C27H36Cl3N2O9的HRMS(ESI)m/z计算值：637.1481，实验值：637.1475[MH+]；C27H35Cl3N2NaO9的计算值：659.1300，实验值：659.1303[MNa+]；C27H35Cl3KN2O9的计算值：675.1040，实验值：675.1035[MK+]。
向3b(4.27g，6.69mmol)于丙酮(75mL)、水(50mL)以及THF(30mL)中的搅拌过的溶液中添加锌粉(17.5g，268mmol)和NH4Cl(28.6g，535mmol)。将混合物在20℃下在氮气氛下搅拌42h。添加丙酮(100mL)，将混合物搅拌10min，并且倾析上清液。将程序重复两次并且将合并的上清液在减压下蒸发以去除丙酮和THF。使用水(50mL)稀释残余物并使用1N HCl水溶液酸化至pH约为1。使用石油醚(2×200mL)洗涤酸性混合物并使用EtOAc(400mL)萃取。使用水(200mL)洗涤EtOAc萃取物并且干燥(MgSO4)并蒸发溶剂，得到呈油状物形式的(S)-6-(4-(2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酸3c(2.72g，80％)；[α]D-73.5°(c 1.12,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ11.99(s，可与D2O交换，1H),9.10(s，可与D2O交换，1H),7.17(s,1H),6.87(s,1H),6.00-5.86(m,1H),5.32(dd,J＝17.2,1.5Hz,1H),5.20(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),4.57-4.52(m,2H),4.37-4.03(m,3H),3.93(t,J＝6.5Hz,2H),3.75(s,3H),3.40-3.10(m,2H),2.23(t,J＝7.3Hz,2H),2.07-1.93(m,4H),1.89-1.66(m,5H),1.62-1.49(m,2H),1.47-1.34(m,2H)。C25H35N2O9的HRMS(ESI)m/z计算值：507.2337，实验值：507.2340[MH+]；C25H34KN2O9的计算值：545.1896，实验值：545.1906[MK+]；C25H34N2NaO9的计算值：529.2157，实验值：529.2169[MNa+]。
在0℃下在氮气氛下，向磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1u(1.38g，2.64mmol)于MeOH(10mL)中的搅拌过的溶液中添加Cs2CO3(1.03g，3.17mmol)。将混合物在0℃下搅拌2h 30min并且然后分配于EtOAc(200mL)与水(150mL)之间。分离EtOAc层并且使用水(100mL)再次洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在减压下在25℃浴温下蒸发，得到呈浅黄色泡沫状固体形式的磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1v(1.17g)，将其在0-20℃下于无水DMA(14mL)中使用3c(1.24g，2.45mmol)、EDCI.HCl(1.41g，7.35mmol)以及对甲苯磺酸(84mg，0.49mmol)处理22h。将混合物分配于EtOAc(400mL)与水(300mL)之间。分离EtOAc层并使用水(100mL)再次洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并蒸发。通过色谱在硅胶上纯化，使用2:1的EtOAc:石油醚洗脱，得到浅黄色泡沫状固体形式的乙酸((S)-1-(2-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-5-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-2-基)甲酯3d(1.49g，66％)，mp 55-59℃；[α]D-68.0°(c1.00,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.10(s，可与D2O交换，1H),8.56(s,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(t,J＝8.1Hz,1H),7.47(t,J＝7.6Hz,1H),7.19(s,1H),6.86(s,1H),5.99-5.86(m,1H),5.32(dd,J＝17.2,1.6Hz,1H),5.20(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),4.53(d,J＝5.4Hz,2H),4.45-3.84(m,10H),3.74(s,3H),3.44-3.26(m,2H),2.68-2.47(m,2H),2.02(br s,3H),1.93-1.43(m,10H),1.474及1.469(2s,18H)。C46H62ClN3O12P的HRMS(ESI)m/z计算值：914.3754，实验值：914.3749[MH+]；C46H61ClKN3O12P的计算值：952.3313，实验值：952.3381[MK+]；C46H61ClN3NaO12P的计算值：936.3574，实验值：936.3589[MNa+]。
在20℃下在氮气氛下，向3d(548mg，0.60mmol)于DCM(8mL)中的搅拌过的溶液中添加Pd(Ph3P)4(17.1mg；9.8％Pd)和吡咯烷(0.49mL，6.00mmol)。将混合物在20℃下搅拌30min并且然后分配于EtOAc(200mL)与水(150mL)之间。分离EtOAc层并使用水(50mL)再次洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在减压下在25℃浴温下蒸发。通过色谱在硅胶上纯化粗产物，使用50:1的EtOAc:MeOH洗脱，得到呈浅黄色泡沫状固体形式的乙酸((S)-1-(2-氨基-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-5-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-2-基)甲酯3e(323mg，65％)，mp 46-49℃；[α]D-85.2°(c 0.36,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.56(s,1H),8.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(t,J＝8.2Hz,1H),7.47(t,J＝8.1Hz,1H),6.67(s,1H),6.37(s,1H),5.09(s，可与D2O交换，2H),4.46-3.85(m,10H),3.63(s,3H),3.52-3.34(m,2H),2.69-2.50(m,2H),2.08-1.94(m,1H),2.01(s,3H),1.91-1.61(m,7H),1.58-1.44(m,2H),1.476及1.470(2s,18H)。C42H58ClN3O10P的HRMS(ESI)m/z计算值：830.3522，实验值：830.3543[MH+]。
在20℃下在氮气氛下，向3e(293mg，0.35mmol)和DMAP(202mg，1.65mmol)于无水DCM(7mL)中的搅拌过的溶液中添加二光气的无水DCM溶液(0.05M，6.7mL，0.33mmol)。将混合物搅拌25min并且然后添加(6-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)(S)-二氨基甲酸烯丙基酯叔丁酯3f(1.54g，3.54mmol)于无水DCM(20mL)中的溶液。将混合物在20℃下在氮气氛下搅拌68h并且然后分配于EtOAc(300mL)与水(200mL)之间。分离EtOAc层，使用水(100mL)再次洗涤并且然后干燥(MgSO4)并在30℃浴温下蒸发。通过色谱在硅胶上纯化所得橙色油状物，使用30:0.5:10的EtOAc:MeOH:石油醚洗脱以提供呈泡沫状固体形式的乙酸((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)苯甲基)氧基)羰基)氨基)-4-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-5-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-2-基)甲酯3g(385mg，84％)，mp 72-75℃；[α]D-55.2°(c 0.53,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.04(s，可与D2O交换，1H),9.12(br s，可与D2O交换，1H),8.56(s,1H),8.03(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.65-7.52(m,3H，在D2O之后减至2H),7.46(t,J＝7.8Hz,2H),7.31(d,J＝8.5Hz,2H),7.20(br s,1H),6.86(s,1H),6.75(不良拆分的t，可与D2O交换，1H),5.97-5.83(m,1H),5.30(br d,J＝17.3Hz,1H),5.17(br d,J＝10.6Hz,1H),5.18-4.97(m,2H),4.51-3.85(m,13H),3.74(s,3H),3.43-3.23(m,2H，部分由水峰遮蔽),2.94-2.83(m,2H),2.65-2.50(m,2H，部分由DMSO峰遮蔽),2.07-1.91(m,1H),2.01(br s,3H),1.88-1.43(m,11H),1.473-1.468(2s,18H),1.43-1.20(m,4H),1.35(s,9H)。C65H89ClN6O17P的HRMS(ESI)m/z计算值：1291.5665，实验值：1291.5705[MH+]；C65H88ClKN6O17P的计算值：1329.5262，实验值：1329.5264[MK+]；C65H88ClN6NaO17P的计算值：1313.5554，实验值：1313.5524[MNa+]。
步骤C：LD-3的合成
将3g(366mg，0.28mmol)和K2CO3(1.14g，8.24mmol)于DCM(9mL)和MeOH(9mL)中的混合物在0℃下搅拌3h 30min。将混合物与冷EtOAc(200mL)和冰-水(150mL)一起搅拌10min。分离EtOAc层，使用水(100mL)再次洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在25℃浴温下蒸发，得到呈无色泡沫状固体形式的((S)-6-((4-((((5-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-2-((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸烯丙酯叔丁酯3h(343mg，97％)，mp 71-75℃；[α]D-58.2°(c 0.57,CHCl3)；1HNMR[(CD3)2SO]δ10.04(s，可与D2O交换，1H),9.11(br s，可与D2O交换，1H),8.56(s,1H),8.03(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.65-7.53(m,3H，在D2O之后减至2H),7.46(t,J＝7.6Hz,2H),7.32(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(br s,1H),6.93(s,1H),6.75(不良拆分的t，可与D2O交换，1H),5.97-5.82(m,1H),5.29(br d,J＝17.2Hz,1H),5.17(br d,J＝10.5Hz,1H),5.03(br s,2H),4.73(t,J＝5.8Hz，可与D2O交换，1H),4.50-3.82(m,11H),3.74(s,3H),3.62-3.44(m,2H),3.40-3.21(m,2H，部分由水峰遮蔽)，2.95-2.80(m,2H),2.65-2.50(m,2H，部分由DMSO峰遮蔽),1.93-1.21(m,16H),1.473-1.468(2s,18H),1.35(s,9H)。C63H86ClKN6O16P的HRMS(ESI)m/z计算值：1287.5158，实验值：1287.5113[MK+]；C63H86ClN6NaO16P的计算值：1271.5419，实验值：1271.5381[MNa+]。
在0℃下历经3min，向3h(322mg，0.26mmol)于无水DCM(14mL)中的搅拌过的溶液中逐份添加戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin periodinane，DMP)(131mg，0.31mmol)。将反应混合物在0℃下再搅拌2h，然后在20℃下搅拌50h。使用DCM(40mL)和10％Na2S2O3(40mL)稀释混合物，在20℃下搅拌10min，并且然后分配于DCM(200mL)与饱和NaHCO3溶液(150mL)之间。分离DCM层并且使用DCM(2×50mL)进一步萃取水层。将合并的DCM萃取物使用饱和NaHCO3溶液(2×100mL)和水(2×100mL)洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在25℃浴温下蒸发。通过色谱在硅胶上纯化所得橙色油状物，使用40:1的CHCl3:MeOH洗脱，得到呈浅褐色泡沫状固体形式的(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-10(5H)-甲酸4-((S)-2-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)苯甲酯3i(228mg，71％)，mp 98℃(分解)；[α]D+74.5°(c 0.26,CHCl3)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.02(s，可与D2O交换，1H),8.56(s,1H),8.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.65-7.47(m,5H，在D2O之后减至4H),7.25-7.12(m,2H，在D2O交换后br s及1H),7.03(s,1H),6.83-6.64(m,2H),6.48(br s，可与D2O交换，1H),5.96-5.80(m,1H),5.52-5.39(m，在D2O交换后d，J＝9.6Hz,1H),5.27(br d,J＝16.8Hz,1H),5.21-5.10(m,2H),4.81(br d,J＝12.3Hz,1H),4.54-3.85(m,8H),3.83-3.70(m,5H),3.53-3.21(m,3H，部分由水峰遮蔽),2.93-2.82(m,2H),2.64-2.47(m,2H，部分由DMSO峰遮蔽),2.10-1.20(m,16H),1.470和1.464(2s,18H),1.34(s,9H)。C63H84ClKN6O16P的HRMS(ESI)m/z计算值：1285.5002，实验值：1285.4938[MK+]；C63H84ClN6NaO16P的计算值：1269.5262，实验值：1269.5220[MNa+]。
在20℃下在氮气氛下，向3i(125mg，0.10mmol)于DCM(2mL)中的搅拌过的溶液中添加Pd(Ph3P)4(2.9mg；9.8％Pd)和吡咯烷(0.08mL，1.00mmol)。在20℃下搅拌混合物并且通过TLC(EtOAc:MeOH20:1)监测。在40min之后，添加额外的Pd(Ph3P)4(5.8mg；9.8％Pd)和吡咯烷(0.16mL，2.00mmol)并且将混合物再搅拌3h。将混合物分配于EtOAc(100mL)与水(100mL)之间。分离EtOAc层并使用水(50mL)再次洗涤，并且然后干燥(MgSO4)并在25℃浴温下蒸发。未进一步纯化就将粗(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-10(5H)-甲酸4-((S)-2-氨基-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)苯甲酯3j(94mg，81％)用于下一步骤中。C59H81ClN6O14P的HRMS(ESI)m/z计算值：1163.5231，实验值：1163.5188[MH+]。
在20℃下在氮气氛下，使用1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸1p(36mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(34mg，0.18mmol)以及TsOH(4.0mg，0.023mmol)于无水DMA(0.5mL)中的预形成(在20℃下，10min)混合物处理3j(91mg，0.078mmol)于无水DMA(1.0mL)中的溶液。在10min之后，添加DIPEA(0.016mL，0.078mmol)并且将反应混合物搅拌23h。将混合物分配于EtOAc(100mL)与水(100mL)之间。分离EtOAc层并进一步使用饱和NaHCO3(50mL)、水(50mL)洗涤，并且然后干燥(MgSO4)。在25℃浴温下蒸发溶剂，得到粗产物，将所述粗产物通过色谱在硅胶上纯化，使用30:10:2的CHCl3:EtOAc:MeOH洗脱，得到呈浅褐色泡沫状固体形式的(11aS)-8-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-10(5H)-甲酸4-((S)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)己酰胺基)苯甲酯3k(63mg，56％)；mp67-70℃；[α]D+23.9°(c 2.09,CHCl3)；1HNMR[(CD3)2SO]δ10.05(s，可与D2O交换，1H),8.56(s,1H),8.03(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.84-7.71(m,2H，可与D2O交换),7.62-7.52(m,3H),7.46(t,J＝7.7Hz,1H),7.22-7.13(m,2H),7.03(br s,1H),6.96(s,2H),6.71(br s,2H，在D2O之后减至1H),6.49(br s，可与D2O交换，1H),5.51-5.41(m，但在D2O交换后为d，J＝9.5Hz,1H),5.15(d,J＝12.2Hz,1H),4.82(br d,J＝12.4Hz,1H),4.47-3.85(m,8H),3.77(br s,3H),3.52-3.20(m,3H，部分由水峰遮蔽),3.12-3.20(m，但在D2O交换后为t，J＝6.7Hz,2H),2.92-2.80(m,2H),2.65-2.50(m,2H，部分由DMSO峰遮蔽),2.39(t,J＝7.9Hz,2H),2.07-1.24(m,28H),1.469及1.463(2s,18H),1.33(s,9H)。C74H98ClN8NaO18P的HRMS(ESI)m/z计算值：1475.6317，实验值：1475.6267[MNa+]。
在20℃下在氮气下，向3k(45mg，0.031mmol)于DCM(1.0mL)中的搅拌过的溶液中添加TFA(1.0mL)并且将混合物搅拌15min。添加石油醚(20mL)并且将混合物搅拌30min。倾析上清液并且使用EtOAc:石油醚(1:5)(2×20mL)重复程序。收集所得固体并通过制备型HPLC[Synergi PolarRP柱；TFA水溶液(pH＝2.56；90％至2％)/10％水的CH3CN溶液(10％至98％)；梯度洗脱，23min，流速为12mL/min]纯化，得到呈灰褐色固体形式的纯LD-3(17.5mg，38％)，纯度(HPLC)：99.1％；[α]D+54.9°(c 0.18,MeOH)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.20(s，可与D2O交换，1H),8.50(s,1H),8.20-7.78(m,7H，在D2O之后减至1H),8.12(d,J＝9.1Hz,1H),7.72-7.47(m,4H，在D2O之后减至3H),7.40(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(br d,J＝7.3Hz,2H),7.03(br s,1H),6.97(s,2H),6.66(br s，可与D2O交换，1H),5.51(br s,1H),5.48(br d,J＝9.7Hz,1H),5.32-5.18(m，但在D2O之后为d，J＝12.6Hz,1H),4.75(br d,J＝12.4Hz,1H),4.44-3.81(m,8H),3.77(s,3H),3.52-3.21(m,5H，部分由水峰遮蔽),3.04(q，但在D2O之后为t，J＝6.8Hz,2H),2.80-2.68(m,2H),2.39(t,J＝7.7Hz,2H),2.12-1.08(m,28H)。C61H75ClN8O16P的HRMS(ESI)m/z计算值：1241.4722，实验值：1241.4700[MH+]；C61H74ClN8NaO16P的计算值：1263.4541，实验值：1263.4531[MNa+]。
B.CBI二聚体接头药物中间体的合成
1.LD-1
以以下三个步骤(步骤A、B以及C)来合成具有下式的CBI-CBI肽模拟物接头二聚体((2,5-双((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)氨基甲酸4-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲酯，LD-1)：
步骤A：(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二甲酰胺1m的合成
将马来酸酐(呋喃-2,5-二酮)1a(150g，1.53mol)添加至6-氨基己酸1b(201g，1.53mol)于HOAc(1000mL)中的搅拌过的溶液中。在将混合物在r.t.(室温)下搅拌2h之后，在回流下加热8h。在减压下去除有机溶剂并且使用EtOAc(500mL×3)萃取残余物，使用H2O洗涤。将合并的有机层通过Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物。将其使用石油醚洗涤，得到呈白色固体形式的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸1c(250g，77.4％)。
将DPPA(130g，473mmol)和TEA(47.9g，473mmol)添加至1c(100g，473mmol)于t-BuOH(200mL)中的溶液中。将混合物在回流下在N2下加热8h。浓缩混合物，并且通过柱色谱在硅胶上(PE:EtOAc＝3:1)纯化残余物，得到(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酸叔丁酯1d(13g，10％)。
向1d(28g，992mmol)于无水EtOAc(30mL)中的溶液中逐滴添加HCl/EtOAc(50mL)。在将混合物在室温下搅拌5h之后，过滤并且干燥固体，得到1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐1e(16g，73.7％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.02(s,2H),6.99(s,2H),3.37-3.34(m,2H),2.71-2.64(m,2H),1.56-1.43(m,4H),1.23-1.20(m,2H)。
向(S)-2-氨基-5-脲基戊酸1f(17.50g，0.10mol)于二噁烷和H2O(50mL/75mL)的混合物中的混合物中添加K2CO3(34.55g，0.25mol)。在0℃下缓慢添加Fmoc-Cl(30.96g，0.12mol)。将反应混合物历经2h升温至室温。在减压下去除有机溶剂，并且使用6M HCl溶液将水浆液调节至pH＝3，并且使用EtOAc(100mL×3)萃取。通过Na2SO4干燥有机层，过滤，并在减压下浓缩，得到(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸1g(38.0g，95.6％)。
向1g(4g，10mmol)于DCM和MeOH(100mL/50mL)的混合物中的溶液中添加4-氨基-苯基-甲醇(1.6g，13mmol，1.3当量)和EEDQ(3.2g，13mmol，1.3当量)。在将混合物在室温下在N2下搅拌16h之后，将其浓缩，得到褐色固体。添加MTBE(200mL)并且在15℃下搅拌2h。通过过滤收集固体，使用MTBE(50mL×2)洗涤，得到呈橙色固体形式的(S)-(1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯1h(4.2g，84％)。LCMS(ESI):m/z503.0[M+1]。
在室温下，向1h(4.2g，8.3mmol)于无水DMF(20ml)中的搅拌过的溶液中逐滴添加哌啶(1.65mL，17mmol，2当量)。将混合物在室温下搅拌30min，并形成固体沉淀物。添加无水DCM(50mL)，并且混合物立即变透明。将混合物在室温下再搅拌30min，并且LCMS展示1h已被消耗。在减压下浓缩至干燥(确保不剩余哌啶)，并且将残余物分配于EtOAc与H2O(50mL/20mL)之间。使用EtOAc(50mL×2)洗涤水相并浓缩，得到呈油性残余物形式的(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺1i(2.2g，94％)(含有少量DMF)。
向环丁烷-1,1-二甲酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯1-乙酯1j(8g，29.7mmol)于DME(50mL)中的溶液中添加化合物1i(6.0g，21.4mmol)和NaHCO3(7.48g，89.0mmol)于水(30mL)中的溶液。在将混合物在室温下搅拌16h之后，将其在减压下浓缩至干燥并且通过柱色谱(DCM:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到呈白色固体形式的粗(S)-1-((1-(4-(羟基甲基)苯基)-2-氧代-6-脲基己烷-3-基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸乙酯1k(6.4g，68.7％)。LCMS(ESI):m/z 435.0[M+1]。
在室温下，向1k(6.4g，14.7mmol)于THF和MeOH(20mL/10mL)的混合物中的搅拌过的溶液中添加LiOH/H2O(1.2g，28.6mmol)于H2O(20mL)中的溶液。在将反应混合物在室温下搅拌16h之后，在减压下去除溶剂，通过制备型HPLC纯化所获得残余物，得到(S)-1-((1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸1l(3.5g，产率：58.5％)。LCMS(ESI):m/z 406.9[M+1]。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.86(d,J＝8.4Hz,2H),8.51(d,J＝8.4Hz,2H),5.88-5.85(m,1H),5.78(s,2H),4.54-4.49(m,3H),4.38-4.32(m,1H),3.86-3.75(m,1H),3.84-3.80(m,2H),3.28-3.21(m,1H),3.30-3.24(m,1H),3.00-2.80(m,1H),2.37-2.28(m,2H)。
在0℃下，将DIPEA(1.59g，12.3mmol)和BOP-Cl(692mg，2.71mmol)添加至1l(1.0g，2.46mmol)于DMF(10mL)中的溶液中，随后添加1e(592mg，2.71mmol)。将混合物在0℃下搅拌0.5h。使用柠檬酸溶液(10mL)使反应混合物骤冷，使用DCM/MeOH(10:1)萃取。干燥有机层并浓缩，并且通过柱色谱在硅胶上(DCM:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二甲酰胺1m(1.0g，71％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.00(s,1H),7.82-7.77(m,2H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),6.96(s,2H),5.95(t,J＝6.4Hz,1H),5.39(s,2H),5.08(t,J＝5.6Hz,1H),4.40-4.35(m,3H),4.09(d,J＝4.8Hz,1H),3.01(d,J＝3.2Hz,2H),3.05-2.72(m,4H),2.68-2.58(m,3H),2.40-2.36(m,4H),1.72-1.70(m,3H),1.44-1.42(m,1H),1.40-1.23(m,6H),1.21-1.16(m,4H)。
步骤B：(2E,2'E)-3,3'-(2-((4-((S)-2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基氧基)羰基氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸1t的合成
向1-(叔丁氧基羰基)环丁烷甲酸1n(200mg，1.00mmol)(WO2002/076968)、1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐1e(218mg，1.00mmol)(J.Med.Chem.2013,56,7890-7901)、EDCI.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐，CAS登记号：25952-53-8)(576mg，3.00mmol)以及TsOH(35mg，0.20mmol)的混合物中添加DMA(2mL)。将混合物在20℃下搅拌15min并且添加DIPEA(0.17mL，1.00mmol)。将反应混合物再搅拌20h并分配于EtOAc(200mL)与水(100mL)之间。分离EtOAc层并使用冷1N HCl(100mL)、饱和NaHCO3(100mL)以及水(100mL)连续洗涤，并且然后干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到呈浅黄色固体形式的1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸叔丁酯1o(290mg，80％)，mp 63-65℃。1H NMR[(CD3)2SO]δ7.58(t,J＝5.6Hz,1H),7.00(s,2H),3.37(t,J＝7.0Hz,2H),3.03(q,J＝6.0Hz,2H),2.40-2.23(m,4H),1.85-1.64(m,2H),1.55-1.32(m,4H),1.38(s,9H),1.26-1.01(m,2H)。C19H29N2O5的HRMS(ESI)m/z计算值：365.2071，实验值：365.2071[MH+]；C19H28N2NaO5的计算值：387.1890，实验值：387.1898[MNa+]；C19H28KN2O5的计算值：403.1630，实验值：403.1629[MK+]。
向1o(794mg，2.18mmol)于DCM(50mL)中的搅拌过的溶液中添加甲烷磺酸(2.83mL，43.6mmol)。将浑浊混合物在20℃下搅拌2h30min。使用DCM(200mL)稀释混合物并使用水(2×50mL)洗涤。干燥(MgSO4)DCM溶液并在25℃(浴温)下蒸发，得到呈浅黄色固体形式的1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸1p(636mg，95％)，mp 100-102℃；1H NMR[(CD3)2SO]δbr s,1H),7.63(t,J＝5.4Hz,1H),7.00(s,2H),3.37(t,J＝7.0Hz,2H),3.02(q,J＝5.9Hz,2H),2.42-2.28(m,4H),1.89-1.63(m,2H),1.55-1.32(m,4H),1.29-1.11(m,2H)。分析.(C15H20N2O5)计算值：C,58.43；H,6.54；N,9.09。实验值：C，58.54；H，6.39；8.84。
向1,4-二溴-2-硝基苯(1.5g，21.4mmol)于二噁烷(4.0mL)中的溶液中添加丙烯酸叔丁酯(2.74g，85.6mmol)、DIPEA(3.45g，107mmol)以及Pd(t-Bu3P)2(0.55g，4.30mmol)。将反应液在120℃下在微波辐照下搅拌2.0h。将反应重复4次(总共使用6.0g 1,4-二溴-2-硝基苯)。浓缩合并的反应混合物，使用水(20mL)稀释并使用EtOAc(100.0mL×3)萃取。合并有机层，通过Na2SO4干燥。浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝10:1)纯化，得到(2E,2'E)-3,3'-(2-硝基-1,4-亚苯基)二丙烯酸二-叔丁酯1q(3.8g，47％)。
向1q(3.8g，10.1mmol)于EtOH/H2O(120.0mL)中的溶液中添加Fe(2.83g，50.7mmol)和NH4Cl(5.4g，101mmol)，并且将反应混合物在100℃下搅拌2.0h。过滤反应混合物并且浓缩滤液并使用EtOAc(60.0mL×3)萃取。合并有机层，通过Na2SO4干燥并浓缩，得到(2E,2'E)-3,3'-(2-氨基-1,4-亚苯基)二丙烯酸二-叔丁酯1r(2.5g，72％)。
在冰浴中，向三光气(224mg，0.76mmol)的溶液中逐滴添加1r(725mg，2.1mmol)和Et3N(530.3mg，5.25mmol)于DCM(5.0mL)中的溶液。将反应混合物在21℃下搅拌1.0h直至无起始物质剩余为止。使用水(5.0mL×2)洗涤反应混合物，并通过Na2SO4干燥。将其浓缩并溶于DCM(5.0mL)中。添加1m(1.0g，1.75mmol)的溶液并且将反应混合物在21℃下搅拌3.0h。使用MeOH(2.0mL)终止反应，并通过柱(DCM:MeOH＝10:1)纯化，得到1s(380mg，23％)。
向1s(300.0mg，0.32mmol)于DCM(10.0mL)中的溶液中添加TFA(2.0mL)，并且将混合物在21℃下搅拌30min。使用NH3·H2O将混合物调节至pH 6。通过过滤收集沉淀物，得到产物(2E,2'E)-3,3'-(2-((4-((S)-2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲基氧基)羰基氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸1t(112.0mg，产率为42％)。LCMS(10-80,AB,2.0min)RT＝0.962min,[M+1]+＝830.0；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45(br,2H),10.10(s,1H)，9.55(s,1H),7.50-7.81(m,8H),7.34(m,2H),6.95(s,2H),6.47-6.57(m,2H),5.96(s,1H),5.40(s,2H),5.05(s,2H),4.36-4.39(m,1H),2.98-3.06(m,6H),2.35-2.39(m,4H),1.15-1.73(m,13H)。
步骤C：LD-1的合成
向磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1u(230mg，0.44mmol)于MeOH(2mL)中的在冰浴中冷却的溶液中添加Cs2CO3(287mg，0.88mmol)和数滴水。将混合物在冰浴中搅拌1h并且然后再分布于乙酸乙酯与水之间。使用乙酸乙酯将水相萃取三次。使用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，通过无水Na2SO4干燥，经由硅藻土过滤，并且去除溶剂。将所得残余物溶于乙酸乙酯中并经由Florisil垫过滤，得到呈灰白色胶形式的粗磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1v(188mg，100％)，未进一步纯化就将其直接使用。
向184mg(0.43mmol)1v中添加1t(80mg，0.11mmol)、EDCI.HCl(165mg，0.86mmol)、甲苯磺酸(2.0mg，0.011mmol)以及DMA(0.5mL)。在将混合物搅拌过夜之后，在真空下去除大部分DMA并且将残余物再分布于乙酸乙酯与NaHCO3水溶液之间。使用乙酸乙酯将水相萃取三次。使用水洗涤合并的有机萃取物，随后使用盐水洗涤，通过无水Na2SO4干燥，并经由硅藻土垫过滤。去除溶剂并且将所得残余物溶于极少的DCM中并通过添加庚烷来使其沉淀，得到粗产物(195mg)，将粗产物通过制备型HPLC[柱：Synergi-Max RP 4μ，250×21.20mm；流动相：A/B＝90％至2％(A：pH 3.45甲酸铵，B：90％乙腈水溶液)；流速：12mL/min]进一步纯化，得到呈黄色固体形式的(2,5-双((E)-3-((1S)-5-((叔丁氧基(羟基)磷酰基)氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)氨基甲酸4-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯甲酯1w(56mg，34％)。1H NMR(DMSO)δ10.02(s,1H),8.67(s,2H),8.14-8.06(m,4H),7.97(d,J＝8.4Hz,2H),7.86-7.76(m,4H),7.70(d,J＝15.2Hz,1H),7.63-7.59(m,2H),7.53-7.49(m,2H),7.29-7.23(m,2H),6.96(s,2H，马来酰亚胺),5.91(br s,1H),5.36(brs,2H),4.65-4.50(m,4H),4.44-4.37(m,2H),4.28-4.22(m,2H),4.05-3.95(m,4H),3.60(t,J＝6.6Hz,1H),3.07-3.00(m,2H),2.95-2.88(m,2H),2.68-2.58(m,2H),2.42-2.32(m,3H),1.78-1.62(m,4H),1.51,1.50,1.49,1.48(4s,36H),1.49-1.28(m,11H)。31P NMR(CDCl3)δ-15.44(s),15.46(s)。HRMS(ESI)m/z实验值：1588.5827(M+Na)。C78H99Cl2N9NaO17P2需要1588.5903。
向1w(25mg，0.015mmol)于DCM(0.6mL)中的在冰浴中冷却的溶液中添加TFA(0.2mL，2.61mmol)。将混合物在冰浴中搅拌0.5h。添加乙醚并且通过过滤收集所得沉淀物并使用乙酸乙酯、THF以及石油醚洗涤，得到呈褐色固体形式的LD-51(18mg，86％)。1H NMR(DMSO)δ10.01(br s,1H),8.60(br s,2H),8.16-8.09(m,4H),7.96-7.93(m,2H),7.88-7.58(m,8H),7.46(t,J＝7.7Hz,2H),7.30-7.25(m,2H),6.97(s,2H，马来酰亚胺),6.10(br s,1H),5.35(br s,2H),4.60-4.18(m,6H),4.05-3.95(m,4H),3.45-3.29(m,5H),3.04-2.87(m,4H),2.68-2.60(m,2H),2.40-2.30(m,4H),1.72-1.57(m,4H),1.43-1.28(m,5H),1.20-1.07(m,3H)。31P NMR(DMSO)δ-5.82(s)。HRMS(ESI)m/z实验值：1342.3562(M+H)。C62H68Cl2N9O17P2需要1342.3580。
2.LD-2
如下合成具有下式的CBI-CBI肽模拟物接头二聚体(双(二氢磷酸(1S,1'S)-3,3'-((2E,2'E)-3,3'-(2-(3-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)双(丙烯酰基))双(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚5,3-二基)酯)，LD-2)：
步骤A：(S)-1-((1-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯2b的合成
向(S)-2-氨基-5-脲基戊酸1f(3.0g，17.1mmol)于DME/H2O(40mL/20mL)中的溶液中添加NaHCO3(2.88g，34.3mmol)。在将混合物在25℃下搅拌15min之后，添加环丁烷-1,1-二甲酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯1-乙酯1j(5.54g，20.6mmol)。将混合物在25℃下在N2下搅拌16h。去除溶剂并且添加H2O(5mL)。使用EtOAc(30mL×3)萃取。使用HCl溶液将水相的pH值调节至3，并且使用EtOAc(120mL×3)萃取。将合并的有机相通过Na2SO4干燥，并浓缩，得到呈无色油状物形式的粗(S)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酸2a。
向2a(5.64g，17.1mmol)于无水THF(120mL)中的溶液中添加HOSu(2.07g，17.98mmol)和DCC(3.70g，17.98mmol)。将混合物在25℃下在N2下搅拌15h。将其过滤并浓缩。使用石油醚(PE)(30mL×3)洗涤残余物，干燥并浓缩，得到呈白色固体形式的粗2b(8.30g)。
步骤B：1-(((S)-1-((3-((2,5-双((E)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸2f的合成
向3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(1.35g，4.34mmol)于无水DMF(20mL)中的搅拌过的溶液中添加HATU(2.20g，5.79mmol)、DIEA(1.12g，8.68mmol)。在将混合物在25℃下搅拌10min之后，添加(2E,2'E)-3,3'-(2-氨基-1,4-亚苯基)二丙烯酸二-叔丁酯1r(1.0g，2.89mmol)。将反应混合物在25℃下在N2下搅拌15h。添加水(20mL)并且使用EtOAc(30mL×3)萃取。使用盐水洗涤合并的有机相，通过Na2SO4干燥，并浓缩。通过急骤柱(PE:EtOAc＝1:1)纯化，得到呈黄色固体形式的粗3,3'-(2-(3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)(2E,2'E)-二丙烯酸二-叔丁酯2c(2.25g)。LCMS:(5-95AB,1.5min),1.075min,[M-114]+＝527.0。
向2c(1.95g，3.05mmol)于无水DCM(30mL)中的搅拌过的溶液中添加哌啶(2.60g，30.5mmol)。将混合物在25℃下在N2下搅拌2.5h。使用H2O(20mL×3)、盐水(15mL)洗涤，并通过Na2SO4干燥。将其浓缩，使用PE(20mL×3)洗涤，并干燥，得到呈黄色固体形式的粗3,3'-(2-(3-氨基丙酰胺基)-1,4-亚苯基)(2E,2'E)-二丙烯酸二-叔丁酯2d(2.4g)。
向化合物2d(1.65g，3.96mmol)于无水DMF(20mL)中的溶液中添加2b(2.03g，4.75mmol)。将混合物在25℃下在N2下搅拌15h。添加水(30mL)并且使用EtOAc(30mL×3)萃取。使用盐水(30mL)洗涤合并的有机相，并通过Na2SO4干燥。将其浓缩，得到粗产物，将所述粗产物使用PE(30mL×4)和MTBE/PE(15mL/45mL×2)洗涤，并干燥，得到呈浅黄色固体形式的3,3'-(2-(3-((S)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)(2E,2'E)-二丙烯酸二-叔丁酯2e(0.96g，产率：33％)。
向2e(0.96g，1.32mmol)于MeOH(4mL)、THF(8mL)以及H2O(8mL)中的溶液中添加LiOH-H2O(111mg，2.64mmol)。将混合物在25℃下在N2下搅拌30min。在减压下去除有机溶剂并且添加H2O(10mL)。添加HCl溶液以将pH值调节至3-4。将其使用EtOAc(50mL×4)萃取，通过Na2SO4干燥，并浓缩，得到粗产物。使用PE(30mL)和MTBE(10mL×3)洗涤粗产物，并干燥，得到呈白色固体形式的2f(620mg，产率：67％)。
步骤C：(2E,2'E)-3,3'-(2-(3-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸2h的合成
在0℃下，向2f(620mg，0.89mmol)于无水DMF(10mL)中的溶液中添加DIEA(573mg，4.43mmol)和Bop-Cl(248mg，0.97mmol)。添加1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮(177.59mg，0.97mmol)。在将混合物在0℃下在N2下搅拌30min之后，添加H2O(20mL)并且使用EtOAc(30mL×3)萃取。使用盐水(30mL)洗涤合并的有机相，通过Na2SO4干燥，并浓缩，得到粗产物。将其使用MTBE(10mL×2)和PE(50mL×3)洗涤，并干燥，得到呈白色固体形式的3,3'-(2-(3-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)(2E,2'E)-二丙烯酸二-叔丁酯2g(690mg，产率：90％)。LCMS:(5-95AB,1.5min),0.875min,MS＝864.2[M+1]；
向2g(300mg，0.347mmol)于无水DCM(4.0mL)中的搅拌过的溶液中逐滴添加TFA(2.0mL)。在将混合物在25℃下在N2下搅拌30min之后，去除溶剂。将残余物溶于DMF中并通过制备型HPLC(HCOOH)纯化，得到呈浅黄色粉末形式的2h(81.4mg，产率：31％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.93(s,2H),6.13(s,1H),7.82–7.46(m,8H),6.98(s,2H),6.55–6.51(d,J＝16.0Hz,2H),5.98(s,1H),5.41(s,2H),4.22(s,1H),3.03–2.90(m,6H),2.67–2.50(m,4H),2.36(s,4H),1.69(s,3H),1.46–1.33(m,7H),1.23–1.16(d,J＝28Hz,2H)。
步骤D：LD-2的合成
向180mg(0.42mmol)磷酸二-叔丁酯(S)-(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯1v(通过上文所提到的程序新制)中添加2h(100mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(185mg，0.96mmol)、甲苯磺酸(2.1mg，0.012mmol)以及DMA(0.5mL)。在将混合物搅拌过夜之后，在真空下去除大部分DMA并且将残余物再分布于乙酸乙酯与NaHCO3水溶液之间。使用乙酸乙酯将水相萃取三次。使用水洗涤合并的有机萃取物，随后使用盐水洗涤，通过无水Na2SO4干燥，并经由硅藻土垫过滤。去除溶剂并且将所得残余物溶于极少的DCM中并通过添加庚烷使其沉淀，得到粗产物(207mg)，将所述粗产物通过制备型HPLC[柱：Synergi-Max RP4μ，250×21.20mm；流动相：A/B＝20％至1％(A：pH 3.45甲酸铵，B：90％乙腈水溶液)；流速：12mL/min]进一步纯化，得到呈黄色固体形式的双(磷酸)四-叔丁酯((1S,1'S)-((2E,2'E)-3,3'-(2-(3-((R)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)丙酰胺基)-1,4-亚苯基)双(丙烯酰基))双(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚3,5-二基))酯2i(65mg，33％)。1H NMR(CDCl3)δ9.67(br s,1H),8.67(br s,2H),8.18-7.98(m,4H),7.90-7.72(m,3H),7.66-7.58(m,6H),7.50-7.28(m,8H),6.84-6.62(m,4H),6.66(s,2H，马来酰亚胺),6.00(br s,1H),5.23-5.13(m,2H),4.80-4.70(m,1H),4.40-3.85(m,6H),3.50-3.40(m,6H),3.20-3.14(m,2H),2.90-2.75(m,2H),2.60-2.45(m,4H),1.92-1.80(m,2H),1.62,1.60,1.57,1.56(4s,36H),1.55-1.40(m,6H),1.30-1.20(m,3H)。31P NMR(CDCl3)δ-15.44(s),15.82(s)。HRMS(ESI)m/z实验值：1666.6051(M+Na)。C83H101Cl2N9NaO18P2需要1666.6009。
向2i(25mg，0.015mmol)于DCM(0.6mL)中的在冰浴中冷却的溶液中添加TFA(0.2mL，2.61mmol)。将混合物在冰浴中搅拌0.5h。在0℃下抽空所有挥发性组份并且使用乙酸乙酯湿磨所得残余物，然后使用THF和石油醚洗涤，得到呈黄色固体形式的LD-2(19mg，88％)。1H NMR(DMSO)δ10.33(br s,1H),9.63(s,1H),8.70(s,1H),8.95(s,1H),8.14-8.11(m,4H),7.96-7.90(m,4H),7.81-7.69(m,6H),7.64-7.54(m,2H),7.50-7.39(m,4H),7.33-7.26(m,2H),6.97(s,2H，马来酰亚胺),6.13(br s,2H),5.14(s,2H),4.58(s,4H),4.40-4.30(m,4H),4.08-3.95(m,4H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),2.99-2.94(m,4H),2.39-2.33(m,2H),1.71-1.67(m,4H),1.40-1.35(m,6H),1.12-1.10(m,3H)。31P NMR(DMSO)δ-5.91(s)。HRMS(ESI)m/z实验值：1442.3438(M+Na)。C67H69Cl2N9NaO18P2需要1442.3505。
C.接头-药物部分至抗体的结合
通过使所选抗体(在一些实施方案中，举例来说，在轻链K149处具有工程化半胱氨酸)结合至所选药物-接头部分(即中间体)来产生抗体药物结合物。举例来说，通过使具有轻链K149C突变的hu9B12v12(“硫代-hu9B12v12K149C”或“硫代Hu抗Ly6E LC K-149C”)结合至所选药物-接头部分来产生抗Ly6E hu9B12v12抗体-药物结合物(ADC)。
在最初分离时，抗体中的工程化半胱氨酸残基以具有细胞硫醇(例如谷胱甘肽)的混合二硫化物形式存在并且由此不可用于结合。如先前在(例如)Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26:925-932以及US2011/0301334中所描述，对这些抗体部分还原(例如使用DTT)、纯化以及使用去氢抗坏血酸(DHAA)再氧化会得到具有可用于结合的游离半胱氨酸硫氢基的抗体。简言之，将抗体与药物-接头部分组合以使得药物-接头部分结合至抗体的游离半胱氨酸残基。在数小时之后，纯化ADC。测定每一ADC的药物载量(每一抗体的药物部分的平均数)并且约为2。
表3中展示了所得ADC结构和用于它们的术语。
表3：Ly6E抗体-药物结合物(ADC)
实施例2：hu9B12v12抗体药物结合物在HCC1569X2人类肿瘤异种移植物模型中的功效
从ATCC(美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)；Manassas,VA)获得HCC1569人类乳腺癌细胞系并且在Genentech处生成亚系HCC1569X2以用于在小鼠中获得最佳生长。
将雌性C.B-17SCID-灰褐色小鼠(查理士河实验室(Charles River Laboratory))各自在胸部乳腺脂肪垫区接种500万个悬浮于HBSS/基质胶(1:1比率)中的HCC1569X2细胞。在异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积时(称为第0天)，将动物随机化至各自具有5只小鼠人组中并且使其经由尾静脉接受抗体-药物结合物的单一静脉内注射。在整个研究中，每周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在体重损失>起始重量的20％时，迅速对小鼠实施安乐死。在肿瘤达到3000mm3或展示即将溃疡的体征之前，对所有动物实施安乐死。使用测径器以两个维度(长度和宽度)测量肿瘤体积并且使用下式计算肿瘤体积：肿瘤大小(mm3)＝(较长测量值×较短测量值2)×0.5。
在第一实验中，向小鼠施用以下单一静脉内注射：硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LCK149C-(LD-1)，0.2mg/kg、0.5mg/kg或1mg/kg；或硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-2)，0.2mg/kg、0.5mg/kg或1mg/kg；同种型匹配的硫代对照抗体LC K149C-(LD-1)，0.5mg/kg；或同种型匹配的硫代对照抗体LC K149C-(LD-2)，0.5mg/kg。
图1中展示了该实验的结果。硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-1)在所有剂量下展示功效，并且硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-2)在0.5mg/kg和更高剂量下展示功效。如图2中所示，所有剂量均不在小鼠中产生显著体重变化。
在第二实验中，向小鼠施用以下单一静脉内注射：硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LCK149C-(LD-3)，0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg；或同种型匹配的硫代对照抗体LC K149C-(LD-3)，3mg/kg。
图3中展示了该实验的结果。硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-3)在1mg/kg和更高剂量下展示功效。如图4中所示，所有剂量均不在小鼠中产生显著体重变化。
实施例3：Ly6E免疫组织化学(IHC)染色和hu9B12v12抗体药物结合物在其他人类肿瘤异种移植物模型中的功效
使用不同Ly6E表达肿瘤细胞和组织，包括具有异质Ly6E表达的患者源异种移植物(PDX)来实施其他人类肿瘤异种移植物模型。在NCI-H1781(肺腺癌)、PC-9(人类非小细胞肺癌)、HCI-009(患者源三阴性乳腺癌)以及HBCx9(患者源三阴性乳腺癌)的小鼠异种移植物模型中探究LY6E抗体药物结合物的功效。
在如通过IHC所测量显示可变Ly6E表达水平的各种人类肿瘤源异种移植物模型中测试抗体-药物结合物。使用用于检测福尔马林(formalin)固定石蜡包埋组织(FFPE)中的Ly6E的自动化免疫组织化学程序来实施人类肿瘤和匹配正常组织中Ly6E表达的表达和评分。基于Ly6E至细胞膜和细胞质的局部化来进行评分。参见Asundi等人，Clin CancerRes.，2015年7月15日；21:3252-3262。
计算两个染色分值“整体分值”和“组织学分值”(或H分值)。“整体分值”涉及阈值百分比(例如至少50％的细胞在任何强度下表达一定信号)和主要染色强度的测定。参见表4。
表4：用于Ly6E免疫组织化学的具体染色准则
另外，计算“组织学分值(H-分值)”以捕获所测试人类肿瘤细胞系中的Ly6E表达异质性。参见例如McClelland等人，Cancer Res.1990Jun 15；50(12):3545-50。以0(阴性)至3+(阳性)的半定量整数标度对染色强度进行评分，并且记录在每一强度值下具有阳性染色的活恶性细胞的百分比。H-分值将染色强度分量与阳性细胞的百分比组合。在一些实施方案中，此方法通过对强度与表达频率取平均值来评价组织IHC实验中的免疫反应性程度。通过下式获得H-分值：
[3×强(3+)表达百分比+2×中等(2+)表达百分比+1×弱(1+)表达百分比]＝H-分值。
通常介于0至300之间的最终H-分值给予既定肿瘤样品中的较高强度免疫反应性更多相对权重。表5中汇总了Ly6E免疫组织化学(IHC)染色分值。
表5：人类肿瘤细胞系的Ly6E IHC分值
从ATCC(美国模式培养物保藏所；Manassas,VA)获得NCI-H1781并且从Genentech,Inc.细胞系储存库获得PC-9。使用Promega PowerPlex 16系统通过短串联重复序列(STR)图谱分析来鉴认细胞系并且与细胞系的外部STR图谱进行比较以确定细胞系血统。为确立模型，将雌性C.B-17SCID-灰褐色小鼠(查理士河实验室)各自在侧腹区皮下接种500万个悬浮于HBSS/基质胶(1:1比率)中的肿瘤细胞。
从犹他大学(University of Utah)的亨斯迈癌症研究所(Huntsman CancerInstitute)获取HCI-009模型。为确立模型，将肿瘤片段(15-30mm3大小)以手术方式植入雌性NOD SCID小鼠(查理士河实验室)的胸部乳腺脂肪垫中。
在Xentech,Inc处研发HBCx9模型。为确立模型，将肿瘤片段(20mm3大小)以手术方式皮下植入雌性无胸腺裸小鼠(哈伦实验室(Harlan Laboratories))的肩胛间区中。
在肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积时，将动物随机化至各自具有5-10只小鼠的组中并且使其以指示剂量接受硫代Hu抗Ly6E9B12.v12LC K149C-(LD-2)或同种型匹配的硫代对照抗体LC K149C-(LD-2)的单一静脉内注射(称为第0天)。在整个研究中，每周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。在体重损失>起始重量的20％时，迅速对小鼠实施安乐死。在肿瘤达到3000mm3或展示即将溃疡的体征之前，对所有动物实施安乐死。使用测径器以两个维度(长度和宽度)测量肿瘤体积并且使用下式计算肿瘤体积：肿瘤大小(mm3)＝0.5×(长度×宽度×宽度)。
图5至8中展示了所述实验的结果。硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-2)在NCI-H1781肺癌异种移植物模型中在0.5mg/kg和更高剂量下展示功效，并且甚至具有低Ly6E IHC分值。参见图5。在PC-9非小细胞肺癌异种移植物模型中，硫代Hu抗Ly6E9B12.v12LC K149C-(LD-2)在1mg/kg和更高剂量下展示抗原特异性功效；此模型还具有低Ly6E IHC分值。参见图6。
在HCI-009三阴性乳腺癌PDX模型中，硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-2)在所测试剂量下不展示可观的特异性抗肿瘤活性，并且甚至具有低至中等Ly6E IHC分值。参见图7。在HBCx9三阴性乳腺癌PDX模型中，硫代Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C-(LD-2)在0.6mg/kg的较高剂量下展示抗肿瘤活性，并且具有低至中等LY6E染色分值。参见图8。
实施例4：食蟹猴中的重复剂量毒性研究
每三周一次向食蟹猴静脉内给予2个剂量以了解(例如)毒性进展、任何药物相关效应的可逆性和持续性，并且使用抗体-药物结合物测定治疗指数(TI)。下表6中展示了实验设计的汇总。简言之，用于每一动物的剂量水平为2、4以及8mg/kg，以两个剂量施用并且相隔3周。对于组1-4、7以及8来说，在第1和22天施用两个剂量。对于组5、6、9以及10来说，在第1、22、43以及64天施用4个剂量。
表6：食蟹猴实验设计
*一个动物是在第1天投药，三个动物是在14天之后投药。
评估每一动物的新观察或现有观察在剂量施用后的严重程度的增加。观察每一动物的一般外观和行为的变化。在治疗前至少两次(例如在第-2和-1周，相隔至少一周)并且在第-1天和治疗后每周获取体重。生物分析样品分析包括(但将不限于)收集血浆样品以获得毒性动力学(TK)稳定性；并且如果毒性动力学结果展示高可变性，那么将收集抗治疗性抗体(ATA)样品。测试参数包括(但不限于)浓度-时间曲线下面积(AUC)、最大浓度、终末半衰期、清除率以及分布体积。
选择用于食蟹猴研究的剂量水平是基于在来自投用结合至非Ly6E抗体的相同药物的大鼠中的先前毒性研究的信息。因体重损失过大，对以20mg/kg投药的大鼠实施安乐死，并且最大耐受剂量(MTD)约为10mg/kg(数据未展示)。
在食蟹猴猴中发现，4mg/kg充分耐受，但8mg/kg并不耐受，因此，向研究中增加较低剂量水平(在10号测试组中为2mg/kg)并且每三周一次投用4个剂量。
虽然已出于理解清楚的目的通过阐释和实施例相当详细地对上述发明进行了描述，但说明和实施例不应解释为限制本发明范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用的方式明确并入本文中。
序列表

Claims (43)

1.一种免疫结合物，所述免疫结合物包含选自以下的结构：
其中p为1至4并且Ab为选自以下的抗体：
a)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
b)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
c)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
d)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
e)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
f)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
g)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；
h)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQID NO:70或75的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
i)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；以及j)包含以下各项的抗体：HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的免疫结合物，其中Ab为选自以下的抗体：
a)包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
b)包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
c)包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
d)包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
e)包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
f)包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
g)包含含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
h)包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及
i)包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
3.如权利要求1或2所述的免疫结合物，其中Ab为结合Ly6E的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
b)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如权利要求1或2所述的免疫结合物，其中Ab为结合CD79b的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或
b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
5.如权利要求1或2所述的免疫结合物，其中Ab为结合MUC16的抗体，其中所述抗体包含：
c)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
d)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
e)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
f)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
g)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区；
h)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；
i)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；
j)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区。
6.如权利要求1或2所述的免疫结合物，其中Ab为结合STEAP1的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；
b)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
7.如权利要求1或2所述的免疫结合物，其中Ab为结合HER2的抗体，其中所述抗体包含：
a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69、73或74的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70或75的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
b)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
c)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；以及HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
d)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
8.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体为单克隆抗体。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体为人源化或嵌合抗体。
10.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体为结合抗原的抗体片段。
11.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
12.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体在所述重链恒定区中包含至少一个选自A118C和S400C的突变。
13.如权利要求12所述的免疫结合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:77或79的氨基酸序列的重链恒定区。
14.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体在所述轻链恒定区中包含至少一个选自K149C和V205C的突变。
15.如权利要求14所述的免疫结合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:76或78的氨基酸序列的轻链恒定区。
16.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中所述抗体在所述轻链恒定区中包含K149C突变。
17.如权利要求16所述的免疫结合物，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
18.如权利要求1所述的免疫结合物，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO:10的序列的重链和包含SEQ ID NO:9的序列的轻链；或
b)包含SEQ ID NO:72的序列的重链和包含SEQ ID NO:71的序列的轻链。
19.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中p介于1至4之间。
20.如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物，其中p约为2。
21.一种免疫结合物，所述免疫结合物包含以下结构：
其中Ab为包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:10的序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:9的序列；并且p为1至2。
22.如权利要求21所述的免疫结合物，其中p约为2。
23.一种药物制剂，其包含如前述权利要求中任一项所述的免疫结合物和药学上可接受的载体。
24.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的个体施用有效量的如权利要求1至22中任一项所述的免疫结合物或如权利要求23所述的药物制剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为Ly6E-阳性癌症。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫结合物包含结合Ly6E的抗体。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、转移性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌以及胃癌。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为CD79b-阳性癌症。
29.如权利要求24或28所述的方法，其中所述免疫结合物包含结合CD79b的抗体。
30.如权利要求24、28以及29中任一项所述的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、伯基特氏淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。
31.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为MUC16-阳性癌症。
32.如权利要求24或31所述的方法，其中所述免疫结合物包含结合MUC16的抗体。
33.如权利要求24、31以及32中任一项所述的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌以及三阴性乳腺癌。
34.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为STEAP1-阳性癌症。
35.如权利要求24或34所述的方法，其中所述免疫结合物包含结合STEAP1的抗体。
36.如权利要求24、34以及35中任一项所述的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌或尤文氏肉瘤。
37.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为HER2-阳性癌症。
38.如权利要求24或37所述的方法，其中所述免疫结合物包含结合HER2的抗体。
39.如权利要求24、37以及38中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌和胃癌。
40.一种抑制细胞增殖的方法，所述方法包含在允许如权利要求1至22中任一项所述的免疫结合物结合至所述细胞的表面上的抗原的条件下将所述细胞暴露于所述免疫结合物，由此抑制所述细胞的增殖。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述抗原选自Ly6E、CD79b、MUC16、STEAP1以及HER2。
42.如权利要求1至22中任一项所述的免疫结合物，所述免疫结合物用于治疗癌症。
43.一种如权利要求1至22中任一项所述的免疫结合物的用途，所述免疫结合物用以制备用于治疗癌症的药剂。
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