TWI570135B - 高效、穩定且非免疫抑制之抗－ｃｄ４抗體 - Google Patents

Description

高效、穩定且非免疫抑制之抗-CD4抗體

本發明係關於抗-CD4抗體及其改善、治療或預防由因諸如人類免疫缺陷病毒(HIV)之病原體而使CD4活性或代謝不當或CD4之不適當或隨發性使用所產生之疾病或病症的用途。亦揭示包含彼等抗體之預防性、免疫治療性及診斷組合物及其在預防或治療包括人類之哺乳動物之疾病之方法中的用途，該等疾病係由主要標靶為CD4⁺T淋巴細胞之感染性病原體引起。該等疾病包括後天性免疫缺乏症候群("AIDS")、AIDS相關綜合症及人類免疫缺陷病毒感染。

本申請案主張2007年4月27日申請之美國臨時申請案第60/926,516號之權利，該案以引用的方式併入本文中。

CD4為在T淋巴細胞(輔助細胞及誘導細胞)、巨噬細胞及某些腦細胞之表面上表現之433個胺基酸之跨膜醣蛋白。載運細胞表面醣蛋白CD4之T淋巴細胞為參與控制B細胞之抗體產生、細胞毒性T淋巴細胞(殺傷T細胞)成熟、巨噬細胞及天然殺傷細胞之成熟及活性之免疫系統之重要組份。其亦直接或間接參與免疫系統之眾多其他調節及效應功能。

在T淋巴細胞("CD4+T淋巴細胞")中，已知CD4為多種感染性病原體之標靶，該等感染性病原體包括病毒，諸如人類免疫缺陷病毒 ("HIV")。由(例如)HIV感染及耗盡輔助T細胞一般以多步過程發生，該多步過程需要病毒附著於輔助T細胞上之CD4受體、病毒附著於輔助受體CXCR4或CCR5、病毒與細胞融合、病毒脫殼、病毒RNA逆轉錄以形成DNA、合成第二股DNA、DNA遷移至輔助T細胞核、病毒DNA整合至輔助T細胞基因組中、DNA轉錄以產生RNA、病毒RNA轉譯以產生病毒聚合蛋白質、病毒蛋白酶裂解聚合蛋白質以產生病毒蛋白質，及病毒蛋白質組裝及出芽以形成破壞宿主細胞之新病毒。

已設計多種藥物及治療方法以干擾此等步驟中之一或多者。舉例而言，已知可抑制病毒附著於輔助T細胞或諸如巨噬細胞之其他靶細胞(附著抑制劑)，抑制病毒與靶細胞融合(融合抑制劑)，阻止病毒DNA整合至輔助T細胞DNA中(整合酶抑制劑)，阻止自病毒RNA合成DNA(逆轉錄酶抑制劑)，或阻止由聚合酶使病毒聚合蛋白質裂解成病毒蛋白質(蛋白酶抑制劑)之化合物。

AIDS感染T細胞中之早期步驟為HIV-1抗原決定基與CD4之間的相互作用。CD4之胞外區由4個域(D1、D2、D3及D4)組成。CD4上之HIV-1 gp120結合位點包含CD4域1(D1)中之胺基酸40至60(股C'、C"及D)，其為一段免疫球蛋白(Ig)V域之CDR2之類似物。gp120與CD4結合之後，gp120經歷有利於其與趨化激素輔助受體(CCR5或CXCR4)結合之構形變化。

與淋巴細胞上之CD4抗原決定基結合之HIV-1上之抗原決定基位於外包膜醣蛋白gp120上。120用以指示gp120具有約120,000道爾頓(dalton)之分子量。HIV之包膜蛋白包括gp120與gp41之組合。gp120蛋白為約481個胺基酸之高度糖基化外膜蛋白。而gp41為約345個胺基酸之較小跨膜蛋白，其可經糖基化。(參見L.Ratner等人，Nature 313，第277-84頁(1985))。

試圖藉由抑制病毒附著預防HIV-1感染已獲得成功。舉例而言， Chang等人之美國專利第6,309,880號揭示位於gp120之CD4結合區內之抗原決定基及對彼抗原決定基具特異性的抑制由多種病毒株及分離株所引起之人類細胞HIV-1感染之抗體。Allaway等人之美國專利第5,817,767號揭示含有CD4基免疫接合物及對HIV-1之包膜醣蛋白具特異性之抗體的組合物，據稱該等接合物及抗體協同起作用以中和HIV-1。Tilley之美國專利第5,922,325號揭示據稱為對H-1包膜醣蛋白gp120具特異性之抗體之協同組合之組合物。據稱對V3環及另一抗體具特異性之抗體中之一者對gp120之CD-4結合位點具特異性。Zolla-Pazner之美國專利第6,241,986號揭示據稱對HIV gp120之CD4結合域具特異性且適用於中和HIV-1或適用於預防HIV感染或治療受HIV感染之個體的單株抗體。Hanna之美國專利第6,136,310號揭示對人類CD4抗原具特異性之嵌合抗體。另外，Burkly之美國專利第5,871,732號揭示適用於預防或治療哺乳動物之疾病(包括AIDS及尤其鼠類融合瘤5A8)之抗-CD4抗體且揭示人類化5A8抗體。

TNX-355為與CD4之V2區結合且抑制HIV-1進入之人類化IgG4單株抗體("Mab")(如美國專利第5,871,732號中所揭示，先前稱為人類化5A8)。TNX-355為結合CD4受體之細胞外部分之域2，進而阻斷HIV誘導之合胞體形成而不阻斷gp120結合且不具免疫抑制性之獨特抗-CD4抗體。然而，TNX-355分子具有若干伴隨其製造及治療用途之問題。舉例而言，TNX-355與IgG治療劑之其他實例之典型2-3週半衰期相比，具有數天之特徵上較短之半衰期。認為不穩定性之一來源為產生雙特異性單株抗體之不同IgG4抗體之間的IgG半部分之活體內交換。該等抗體為CD4之有效單價抗體。另外，咸信CD4受體之內化亦可為造成此縮短半衰期之原因。因此，需要具有改良之活體內穩定性及/或效能或具有改變之Fc受體結合性及下降之ADCC活性之新抗體。此外，始終對治療分子之改良表現存在需要。

本發明提供與CD4特異性結合之新穎抗體及其片段。該等抗體包括人類化抗體且可有效阻止HIV進入CD4⁺細胞中。揭示在鉸鏈區中具有防止鏈內雙硫鍵形成之胺基酸取代之抗體及其CD4結合片段，產生具有令人驚訝之改良二價穩定性之抗體分子。該等抗體經歷活體內最小鏈改組及/或與為CD4之有效單價抗體之抗體相比在阻斷病毒進入方面更高效。增加之穩定性有利於製造且提供增加之活體內穩定性。

亦揭示具有減少與Fc受體結合之胺基酸取代之抗體，該等胺基酸取代亦使得活體內穩定性令人驚訝地增加及其對CD4內化之令人驚訝的效應。另外，該等抗體之基因已經修飾以使得其具有超過其未經修飾對應物之增加表現。

在一實施例中，特異性結合CD4之本發明抗體或其抗原結合片段包含分別包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13中所列之序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中該抗體與TNX-355相比具有增加之活體內半衰期。在此實施例之一態樣中，抗體進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所列之序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3。在此實施例之另一態樣中，可變輕鏈區具有與SEQ ID NO：1中所列之序列具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列且輕鏈恆定區具有與SEQ ID NO：2中所列具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在此實施例之一特定態樣中，抗體之可變輕鏈區包含SEQ ID NO：1中所列之序列且輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：2中所列之序列。在此實施例之一態樣中，可變重鏈區具有與SEQ ID NO：3中所列 具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，其中抗體之殘基228為不為絲胺酸殘基之殘基。在此實施例之一特定態樣中，抗體之可變重鏈區包含SEQ ID NO：3中所列之序列，其中該抗體之殘基228為不為絲胺酸殘基之殘基。在又一態樣中，抗體之殘基228為脯胺酸殘基。根據此實施例，抗體為IgG抗體，其可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一者。

在另一實施例中，特異性結合CD4之本發明抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所列之序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中該抗體與TNX-355相比具有增加之活體內半衰期。在此實施例之一態樣中，可變輕鏈區具有與SEQ ID NO：1中所列之序列具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列且輕鏈恆定區具有與SEQ ID NO：2中所列具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在此實施例之一特定態樣中，抗體之可變輕鏈區包含SEQ ID NO：1中所列之序列且輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：2中所列之序列。在此實施例之一態樣中，可變重鏈區具有與SEQ ID NO：3中所列具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，其中抗體之殘基228為不為絲胺酸殘基之殘基。在此實施例之一特定態樣中，抗體之可變重鏈區包含SEQ ID NO：3中所列之序列，其中該抗體之殘基228為不為絲胺酸殘 基之殘基。在又一態樣中，抗體之殘基228為脯胺酸殘基。根據此實施例，抗體為IgG抗體，其可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一者。

在另一實施例中，特異性結合CD4之本發明抗體或其片段具有與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所列之序列中之任一者具有至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%、91%、92%、93%、94%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列，其中該抗體與TNX-355相比具有增加之活體內半衰期。在此實施例之一態樣中，抗體之可變輕鏈區包含SEQ ID NO：1中所列之序列且輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：2中所列之序列。在另一態樣中，抗體之可變重鏈區包含SEQ ID NO：3中所列之序列，其中該抗體之殘基228為不為絲胺酸殘基之殘基。在又一態樣中，抗體之殘基228為脯胺酸殘基。根據此實施例，抗體為IgG抗體，其可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一者。

在某些實施例中，本發明之抗體在鉸鏈區中具有修飾，且與未經修飾抗體、尤其TNX-355相比具有增加之穩定性及增加之半衰期。在一較佳實施例中，修飾或突變包含在殘基228處之取代。本發明之抗體包含與SEQ ID NO：5、6或7具有至少85%、90%、95%一致性之胺基酸序列；其中殘基228為脯胺酸殘基，且其中該抗體與未經修飾抗體(亦即，TNX-355)相比具有增加之半衰期。在一較佳實施例中，抗體係經人類化。

本發明之抗體包含與SEQ ID NO：5、6或7具有至少85%、90%、95%一致性之胺基酸序列；其中殘基228為脯胺酸殘基，且其中總抗體之至少60%至80%維持為二價抗體。在本發明之一實施例中，總抗體之至少60%至80%於血清中維持為二價抗體歷時至少200小時。

本發明之抗體包括在鉸鏈區中包含突變之二價抗-CD4抗體，其 中該抗體之半衰期比未經修飾之二價抗體、尤其TNX-355之半衰期長至少1.5至5倍。在一特定實施例中，抗體之半衰期比未經修飾之二價抗體、尤其TNX-355之半衰期長至少1.5倍。在一較佳實施例中，鉸鏈區中之突變包含在殘基228處之取代。在一較佳實施例中，本發明之抗體係經人類化。

揭示具有具改良之活體內穩定性及/或效能之胺基酸取代之抗體。本發明之抗體在較低劑量下具有治療作用；因此，此等抗體可以較低劑量投與或以較低頻率投與。在一較佳實施例中，抗體可每週一次或每隔一週投與。本發明之抗體可經調配以供靜脈內或皮下投藥。

在一較佳實施例中，本發明之抗體係每週一次以皮下劑型投與。在一較佳實施例中，本發明之抗體係以1至10mg/kg範圍內之劑量每週一次投與。在另一較佳實施例中，本發明之抗體係以1至15mg/kg範圍內之劑量每隔一週投與。

本發明包括抗體之可變重鏈及可變輕鏈之胺基酸序列及其相應核酸序列。

本發明之其他實施例包括在IgG4或IgG1之恆定區中具有一或多個修飾、取代或突變之抗體，該或該等修飾、取代或突變與此等抗體之可變區中之CDR序列組合以獲得包含一或多個保留獲得CDR之親本分子之CD4結合能力之CDR區或CDR衍生區的結合分子。

所關注之抗體可為阻止HIV進入CD4+細胞中之抗體。

本發明之其他實施例包括含有本發明之抗體序列之細胞株及載體。

本發明之其他實施例為抗體用於製備治療與CD4功能及代謝相關之疾病及病症之藥物或組合物之用途，該等疾病及病症包括感染，諸如病毒感染(例如HIV)。

本發明之其他實施例為此等抗體在治療與正常或異常CD4生物學 及功能相關之病症中之用途。本發明解決IgG4抗體之穩定性的問題且揭示已幫助解決IgG4抗體(諸如TNX-355)之穩定性下降之問題的引入IgG4分子或IgG1分子之鉸鏈區中及Fc區中之各種修飾、取代或突變。本發明亦解決對抗體之改良表現的需要且亦揭示經優化以供哺乳動物表現之載體。

其他特徵及優勢描述於本文中，且自以下[實施方式]及圖式將顯而易見。

圖1提供親本分子TNX-355(1A)及包括G4H(圖1B)、G4D(圖1C)及MV1(圖1D)之本發明之改良分子之胺基酸序列。

圖2提供編碼G4D、G4H及MV1之重鏈可變區及輕鏈可變區之密碼子優化核酸序列。

圖3提供圖2中所描繪之重鏈(3A)及輕鏈(3B)可變區核酸序列與TNX-355之核酸序列的比較。框表明在G4D、G4H及MV1中所使用之密碼子優化序列之核酸序列中經修飾之彼等核苷酸。

圖4說明第1天及第9週G4H變異體具有與親本TNX-355分子等效之活體內效能。

圖5提供對於變異體MV1、G4D、G4H及TNX-355之兩個樣本之二價抗體與總抗體隨時間之比率的圖示。

圖6提供展示在單次注射TNX-355(355-1、355-2)或變異體MV1、G4D及G4H之後猴血清中總MAb及二價MAb之半衰期的條形圖。

圖7A提供展示與表現經優化G4H序列之轉染瘤相比，表現原始TNX-355序列之轉染瘤之相對效價的圖表。圖7B描繪以圖表示之7A之表格式資料。

圖8提供將變異體MV1(IgG1)與TNX-355(IgG4)及兩個同型對照比較之CD4介導型細胞加工之圖示。

圖9提供與TNX-355或對照相比在G4H或G4D(9A)或MV1(9B)存在下對淋巴細胞上CD4含量之FACS分析。

序列簡單說明

SEQ ID NO：1為TNX-355之可變輕鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：2為TNX-355之輕鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：3為TNX-355之可變重鏈區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：4為TNX-355之IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：5為G4H之IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：6為G4D之IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：7為MV1之IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列。

SEQ ID NO：8為G4H之完整胺基酸序列。

SEQ ID NO：9為G4D之完整胺基酸序列。

SEQ ID NO：10為MV1之完整胺基酸序列。

SEQ ID NO：11為TNX-355之CDRL1之胺基酸序列。

SEQ ID NO：12為TNX-355之CDRL2之胺基酸序列。

SEQ ID NO：13為TNX-355之CDRL3之胺基酸序列。

SEQ ID NO：14為TNX-355之CDRH1之胺基酸序列。

SEQ ID NO：15為TNX-355之CDRH2之胺基酸序列。

SEQ ID NO：16為TNX-355之CDRH3之胺基酸序列。

SEQ ID NO：17為G4H、G4D及MVI之密碼子優化可變輕鏈序列之核酸序列。

SEQ ID NO：18為G4H、G4D及MVI之密碼子優化可變重鏈序列之核酸序列。

SEQ ID NO 19-24為構築G4H及G4D中所使用之寡核苷酸引子。

SEQ ID NO 25-33為構築MV1中所使用之寡核苷酸引子。

SEQ ID NO 34-37為自兩個患者樣本中D1及W9處所存在之HIV病毒產生包膜序列之群體中所使用之寡核苷酸引子。

實施方式

本發明並不限於本文所述之特定方法、方案、細胞株、載體或試劑，此係由於其皆可改變。另外，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的且並不意欲限制本發明之範疇。除非本文另有明確指示，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式"一"及"該"包括複數次提及，例如，提及"一宿主細胞"包括複數個該等宿主細胞。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語及任何首字母縮寫詞具有如由一般熟習本發明領域中之技術者通常所理解之相同含義。儘管類似於或等效於本文所述之方法及物質之任何方法及物質可用於實施本發明，但本文中描述例示性方法、裝置及物質。

本文中所提及之所有專利及公開案皆以引用的方式全部併入本文中或達到出於描述及揭示其中所報導之可用於本發明之蛋白質、酶、載體、宿主細胞及方法之目的而由法律允許之程度。然而，本文中無一者應解釋為承認本發明未授權先於根據先前發明之該揭示案。

定義

貫穿本申請案所使用之術語對於一般熟習此項技術者而言應解釋為具有普通及典型含義。然而，提供下列定義以有利於理解本發明。

關於抗體鏈多肽序列之短語"大體上一致"可解釋為與參考多肽序列展現至少70%或80%、81%、82%、83%、84%、85%或90%或95%(包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性之抗體鏈。關於核酸序列之該術語可解釋為與參考核酸序列展現至少約70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%或90%或95%或97%(包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性之核苷酸序列。

術語"一致性"或"同源性"應解釋為意謂在使序列對準且(必要時)引入間隙以獲得整個序列之最大一致性百分比之後且在不將任何保守取代視作序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與其所比較之相應序列之殘基一致之胺基酸殘基的百分率。N末端或C末端延伸抑或插入均不應解釋為降低一致性或同源性。對準之方法及電腦程式在此項技術中已為熟知。序列一致性可使用序列分析軟體量測。

除非另有指示，否則如本文所用之術語"約"係指不超過由該術語所修飾之值以上或以下10%之值。

術語"抗體"以最廣泛含義使用且特別涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要生物活性即可。抗體(Ab)及免疫球蛋白(Ig)為具有相同結構特徵之醣蛋白。儘管抗體對特定靶展現結合特異性，但免疫球蛋白包括缺乏靶特異性之抗體與其他類抗體分子。本發明之抗體可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。原生抗體及免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，其包含兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈。各重鏈在一端具有可變域(V_H)，繼而為許多恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(V_L)且在其另一端具有恆定域。抗體包括(但不限於)：單株抗體、多株抗體、多特異性抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、單域抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)、雙硫鍵鍵聯Fv(dsFv)、Fd、VH、VL、抗獨特型(抗-Id)抗體(包括(例如)針對本發明抗體之抗-Id抗體)及上述任一者之抗原決定基結合片段。

如本文所用之"抗-CD4抗體"意謂以有效減少、降低、阻斷或阻止HIV進入CD4⁺細胞中之方式與人類CD4特異性結合而不顯著阻斷 HIV gp120與人類CD4結合之抗體。

在抗體之可變域之情形中之術語"可變"係指抗體之間可變域之某些部分在序列方面大不相同且該等部分用於各特定抗體對其特定靶之結合性及特異性的實情。然而，可變性並非均勻分布於整個抗體可變域中。其集中於輕鏈可變域與重鏈可變域兩者中稱為互補判定區(CDR；亦即，CDR1、CDR2及CDR3)、亦稱為高變區之三個區段中。可變域之較高度保守部分稱為構架區(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β-摺疊構形由三個CDR連接的FR區，該三個CDR形成連接β-摺疊結構且在一些狀況下形成β-摺疊結構之一部分的環。各鏈中之CDR係由FR區緊密保持在一起，且與來自另一鏈之CDR促使形成抗體之抗體之靶結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1987))。除非另有指示，否則如本文所用之免疫球蛋白胺基酸殘基編號係根據Kabat等人之免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統來進行。

術語"抗體片段"係指全長抗體之一部分，一般為靶結合區或可變區。抗體片段之實例包括F(ab)、F(ab')、F(ab')₂及Fv片段。短語抗體之"功能片段或類似物"為具有與全長抗體相同之定性生物活性之化合物。舉例而言，抗-CD4抗體之功能片段或類似物為可以阻止或大體上降低受體與其配位體結合或引發信號轉導之能力的方式與CD4受體結合者。如本文所用之關於抗體之"功能片段"係指Fv、F(ab)及F(ab')₂片段。"Fv"片段由緊密非共價締合之一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域之二聚體(V_H-V_L二聚體)組成。在此構形中各可變域之三個CDR相互作用以界定V_H-V_L二聚體表面上之靶結合位點。總體而言，六個CDR賦予抗體靶結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對靶具特異性之CDR之一半Fv)亦具有識別及結合靶之能力，但親和 力比完整結合位點低。

"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體之V_H及V_L域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包含介於V_H域與V_L域之間的使得sFv能夠形成靶結合所要之結構的多肽連接子。

Fab片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。F(ab')片段與F(ab)片段不同之處為在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基末端處添加有數個殘基。F(ab')片段係藉由在F(ab')₂胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處裂解雙硫鍵而產生。抗體片段之其他化學偶合為一般熟習此項技術者所已知。

如本文所用之術語"單株抗體"係指自大體上同類抗體之群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可能的可少量存在之天然產生之突變以外皆相同。本文中之單株抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，該(等)鏈之其餘部分與來源於其他物種類或屬於其他抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現所要生物活性即可。單株抗體具高度特異性，其針對單一靶位點。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相對比，各單株抗體針對靶上之單一決定子。除其特異性以外，單株抗體之有利之處在於其可由融合瘤培養物合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語"單株"表明抗體當自抗體之大體上同源群體獲得時之特徵，且並不應解釋為需要由任何特定方法產生抗體。舉例而言，用於本發明之單株抗體可使用熟知技術自噬菌體抗體文庫分離。親本單株抗體可由首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)所述之融合瘤方法製造，或可由重組方法製造。

非人類(例如鼠類)抗體之"人類化"形式為含有來源於非人類免疫 球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗體之其他靶結合子序列)。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域中之大體上所有可變域，其中所有或大體上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白模板序列之FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、通常為所選人類免疫球蛋白模板之恆定區之至少一部分。

"抗體同源物"係指如本文所教示特異性結合CD4之任何分子。因此，抗體同源物包括經修飾或未經修飾之原生或重組抗體、保留所關注之生物特性(諸如結合CD4)之抗體之部分(諸如F_ab或F_v分子)、單鏈抗體、帶有一或多個CDR區之多肽等。同源物之胺基酸序列無需與天然產生之抗體之胺基酸序列一致，而可經改造或經修飾以帶有取代胺基酸、插入胺基酸、缺失胺基酸、不為蛋白質中通常存在之二十種胺基酸的胺基酸等以獲得具有增強之特性或其他有益特性之多肽。

術語"細胞"、"細胞株"及"細胞培養物"包括子代。亦應瞭解，歸因於有意或無意突變，所有子代在DNA含量方面可能並不精確一致。具有與在經初始轉型細胞中所篩選相同之功能或生物特性的變異體子代包括在內。本發明中所使用之"宿主細胞"一般為原核或真核宿主。

以DNA"轉型"細胞有機體、細胞或細胞株意謂將DNA引入靶細胞中從而該DNA可作為染色體外元件或藉由染色體整合複製。以DNA"轉染"細胞或有機體係指由實際上表現抑或不表現任何編碼序列之細胞或有機體吸收DNA(例如表現載體)。術語"經轉染之宿主細胞"及"經轉型"係指DNA所引入之細胞。細胞稱為"宿主細胞"且其可為原核或真核細胞。典型原核宿主細胞包括大腸桿菌(E.coli)之各種菌株。典型真核宿主細胞為哺乳動物，諸如中國倉鼠卵巢或人類來源之細胞。所引入之DNA序列可來自與不同於宿主細胞之物種之宿主細胞 相同之物種，或其可為含有一些外來DNA及一些同源DNA之雜交DNA序列。

術語"載體"意謂含有與能夠在合適宿主中實現DNA表現之合適控制序列操作性連接之DNA序列的DNA構築體。該等控制序列包括實現轉錄之啟動子、控制該轉錄之可選操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結合位點之序列及控制轉錄及轉譯終止之序列。載體可為質體、噬菌體粒子或僅為潛在基因組插入物。一旦轉化至合適宿主中，載體即可獨立於宿主基因組複製及執行功能，或在一些情況下可整合至自身基因組中。在本說明書中，"質體"及"載體"有時可互換使用，此係由於質體為載體之最常用形式。然而，本發明意欲包括發揮等效功能且在此項技術中已知或成為已知之該等其他形式載體。

詞"標記"當在本文中使用時係指可與分子或蛋白質(例如抗體)直接或間接接合之可偵測化合物或組合物。標記可自身可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶促標記之狀況下可催化可偵測之受質化合物或組合物發生化學改變。

如本文所用之"固相"意謂抗體可黏附之非液體基質。本文中所涵蓋之固相之實例包括部分或全部由玻璃(例如受控微孔玻璃)、多醣(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇及聚矽氧形成之固相。在某些實施例中，視情形而定，固相可包含檢定盤之孔；其他方面，其為純化管柱(例如親和力層析管柱)。

如本文所用之術語"病症"及"疾病"可互換使用以指代個體之病理學病狀。

如本文所用之術語"半衰期"係指自動物血清消除抗體之50%所需之時間。

如本文所用之術語"處於風險下"用於描述基於暴露於HIV增加而具有獲得HIV之高可能性之個體。獲得HIV之可能性增加可由許多因 素引起，該等因素包括(但不限於)："處於風險下"之個體之行為、活動、職業、家族歷史及/或環境。

如本文所用之術語"暴露"當在使靶細胞暴露於本發明之抗體或組合物之情形中使用時係指使該等靶細胞活體內接觸或經受該抗體或組合物，亦即，其中該等靶細胞處於個體體內，其中該個體為人類。

如本文所用之術語"有效量"係指足以使得病症及其一或多種症狀之發展、復發或發作得以預防、足以增強或改良另一療法之預防作用、降低病症之嚴重性、縮短病症之持續時間、改善病症之一或多種症狀、預防病症升級、致使病症衰退及/或增強或改良另一療法之治療作用之療法的量。

抗體產生

可改變抗體之恆定區之某些部分以提供具有優於親本抗體中所觀測到之特性的經改造或經改良特性之抗體同源物、衍生物、片段及類似物。舉例而言，此項技術中已知某些IgG4分子具有重排及交換Fab部分以與其他IgG4分子形成雜交體之趨勢。許多IgG4抗體在鉸鏈區附近形成鏈內雙硫鍵。認為鏈內鍵可使完整親本二價分子不穩定而形成包含重鏈與締合輕鏈之單價分子。該等分子可再締合(但以隨機為基礎)以形成具有不可預測特徵之雜交抗體分子。

揭示可使IgG4分子穩定且降低形成雙特異性分子之可能性的針對IgG4分子(包括鉸鏈區中)之胺基酸序列之修飾、取代或突變。若治療性抗體為IgG4分子，則該等修飾、取代或突變可為有益的，此係由於穩定性增強將使分子在產生及製造期間及當處於活體內時解離之可能性最小。單價抗體可能不具有與二價親本分子相同之有效性，儘管有效性之差異不可預測。舉例而言，當將原生二價IgG4投與患者時，二價IgG4之百分率經兩週時間衰減至約30%。然而，揭示可使活體內IgG4穩定性增強至令人驚訝之程度的(例如)位置228處之胺基酸取 代。胺基酸取代可尤其以重組抗體來進行，其中核酸編碼序列可經突變以得到置換胺基酸，例如，在位置228處，絲胺酸可經輔胺酸置換如本文所述。

抗體之Fc區中之許多胺基酸可為修飾、取代或突變之候選者。舉例而言，在IgG1分子中，候選胺基酸可包括約位置233至約位置237(例如Glu-Leu-Leu-Gly-Gly)、約位置252至約位置256(例如Met-Ile-Ser-Arg-Thr)及約位置318(例如Glu)至約位置331(例如Pro)(包括(例如)Lys₃₂₀、Lys₃₂₂及Pro₃₂₉)之區域中之殘基。

另外，可繼而利用針對多肽(諸如CD4)之抗體以使用熟習此項技術者熟知之技術產生"模擬"該等多肽之抗獨特型抗體(參見，例如Greenspan等人，FASEB J 7：437(1989)；Nissinoff,J Immunol 147：2429(1991))。舉例而言，與多肽結合且競爭性抑制多肽多聚化及/或多肽與配位體結合之抗體可用於產生"模擬"多肽多聚化及/或結合域且因此與多肽及/或其配位體結合且中和多肽及/或其配位體之抗獨特型。該等中和抗獨特型或該等抗獨特型之Fab片段可在治療方案中使用以中和多肽配位體。舉例而言，該等抗獨特型抗體可用於結合諸如CD4之多肽及/或結合其配位體/受體，且進而阻斷其生物活性。

另外，可製造針對CD4之單域抗體。此技術之實例已描述於WO 9425591(對於來源於駱駝科重鏈Ig之抗體)中，以及描述自噬菌體文庫分離單域完全人類抗體之US 20030130496中。

亦可產生重鏈Fv區與輕鏈Fv區連接之單一肽鏈結合分子。單鏈抗體("scF_v")及其構築方法描述於美國專利第4,946,778號中。或者，可構築F_ab且由類似方式使其表現。所有完全及部分人類抗體與完全鼠類mAb相比具較低免疫原性，且片段及單鏈抗體亦具較低免疫原性。

根據本發明所產生之抗體與未經修飾抗體(亦即，TNX-355抗體) 相比顯示提高之穩定性及增加之半衰期。根據本發明所產生之抗體與未經修飾抗體(亦即，TNX-355)相比穩定地維持為二價抗體。根據本發明所產生之抗體涵蓋在鉸鏈區中包含突變之人類化二價抗體，其中該抗體之半衰期比未經修飾抗體(亦即，TNX-355)之半衰期長至少1.5倍。

在一實施例中，根據本發明所產生之抗體之CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13中所列之序列且在殘基228處具有脯胺酸。

在另一實施例中，根據本發明所產生之抗體之CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所列之序列且在殘基228處具有脯胺酸。

在另一實施例中，根據本發明所產生之抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13中所列之序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3；分別具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所列之序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3；及殘基228處之脯胺酸。

在另一實施例中，根據本發明所產生之抗體包含SEQ ID NO：1中所列之可變輕鏈；SEQ ID NO：2中所列之輕鏈恆定區；及殘基228處之脯胺酸。

在此等實施例之一態樣中，抗體之片段可結晶(Fc)區在核酸序列中相對於原生人類IgG1及/或原生人類IgG4抗體之序列包含突變。

該等突變可合乎需要以關於效應功能修飾本發明之抗體，以便增強抗體在治療HIV中之有效性。由此產生之抗體可具有改良之內化能力及/或增加之補體介導型細胞殺傷性及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)及Shopes,B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。或者，抗體可經工程化，其具 有雙重Fc區且可進而具有增強之補體溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。此等抗體與其野生型對應物相比將保留為治療效用所需之大體上相同之特徵。

為產生抗體變異體，可將一或多種核酸變異(例如取代)引入編碼抗體之起始多肽之Fc區中。編碼起始多肽之胺基酸序列變異體之DNA可由多種此項技術中已知之方法來製備。此等方法包括(但不限於)：藉由編碼多肽之早先製備DNA之定點(或寡核苷酸介導)突變誘發、PCR突變誘發及序列盒突變誘發來製備。

定點突變誘發技術在此項技術中已為熟知(參見，例如Carter等人，Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)及Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987))。簡言之，在進行DNA之定點突變誘發中，起始DNA係藉由首先使編碼所要突變之寡核苷酸與該起始DNA之單股雜交來改造。雜交之後，使用DNA聚合酶使用雜交寡核苷酸作為引子且使用起始DNA之單股作為模板來合成整個第二股。因此，使編碼所要突變之寡核苷酸併入所得雙股DNA中。

PCR突變誘發亦適合於製造起始多肽之胺基酸序列變異體。參見Higuchi,PCR Protocols，第177-183頁(Academic Press,1990)；及Vallette等人，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。簡言之，當少量模板DNA用作PCR中之起始物質時，可使用序列中稍不同於模板DNA中相應區的引子來產生相當大量僅在引子不同於模板之位置不同於模板序列之特異性DNA片段。

製備變異體之另一方法序列盒突變誘發係基於Wells等人，Gene 34：315-323(1985)所述之技術。起始物質為包含欲突變之起始多肽DNA之質體(或其他載體)。鑑別欲突變之起始DNA中之密碼子。在所鑑別之突變位點之每一側上必須有一個獨特限制性核酸內切酶位點。若無該等限制性位點存在，則可使用上述寡核苷酸介導之突變誘發方 法將該等限制性位點引入起始多肽DNA中適當位置來產生。在此等位點切割質體DNA以使其線性化。使用標準程序合成一個編碼限制性位點之間的DNA序列但含有所要突變之雙股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之兩股係分別合成且接著使用標準技術雜交於一起。此雙股寡核苷酸稱作序列盒。此序列盒經設計以具有與線性化質體之各端相容之5'及3'端，以使其可直接與該質體連接。此質體現在含有突變之DNA序列。

可使編碼具有突變Fc區之抗體之多肽變異體進一步修飾，常視多肽所欲用途而定。該等修飾可涉及進一步改變胺基酸序列、與異源多肽融合及/或共價修飾。關於進一步改變胺基酸序列，任何不涉及維持多肽變異體適當構形之半胱胺酸殘基一般亦可經絲胺酸取代以提高分子之氧化穩定性且防止異常交聯。具有改變之Fc區胺基酸序列之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號、WO 99/51642，及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中，其皆以引用的方式全部併入本文中。

抗-CD4抗體之鑑別

本發明提供與CD4結合之單株抗體。適用作製備本發明之抗體之起始物質的抗體包括命名為TNX-355之抗體(基於美國專利第5,871,732號中所述之5A8抗體)。本發明包括與TNX-355之抗體結合相同抗原決定基之抗體。

候選抗-CD4抗體可由酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)、西方免疫墨點法(Western immunoblotting)或其他免疫化學技術來測試。

抗體可為人類抗原結合抗體片段且包括(但不限於)：F_ab、F_ab'及F_(ab')2、F_d、單鏈F_v(scF_v)、單鏈抗體、雙硫鍵鍵聯F_v(sdF_v)及包含V_L域或V_H域之單域抗體。包括單鏈抗體之抗原結合抗體片段可包含單獨或與下列區域之整體或部分組合之可變區：鉸鏈區、C_H1、C_H2及C_H3 域。抗原結合片段包含可變區與鉸鏈區、C_H1、C_H2及C_H3域之任何組合。

本發明之抗體可根據其識別或特異性結合之CD4之抗原決定基或部分來描述或說明。抗原決定基或多肽部分可如本文所述來說明，例如由N末端及C末端位置、由相連胺基酸殘基之大小、構形抗原決定基或表格及圖中所列來說明。

本發明之抗體亦可根據其交叉反應性來描述或說明。結合CD4多肽之與CD4具有至少95%、至少90%(包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%及至少50%一致性(如使用此項技術中已知及本文所述之方法所計算)之抗體亦包括於本發明中。抗-CD4抗體亦可以小於約10^-7M、小於約10^-6M或小於約10^-5M之K_D與其他蛋白質結合，諸如來自不同於抗-CD4抗體所針對之物種之物種的抗-CD4抗體。

進一步包括結合由在嚴格雜交條件下與編碼CD4之聚核苷酸雜交之聚核苷酸編碼之多肽的抗體。本發明之抗體亦可根據其與CD4多肽之結合親和力來描述或說明。較佳之結合親和力包括具有10^-8至10¹⁵M、10⁸至10¹²M、10⁸至10¹⁰M或10¹⁰至10¹²M之平衡解離常數或K_D之結合親和力。本發明亦提供如由此項技術中已知用於測定競爭性結合之任何方法(例如本文所述之免疫檢定)所測定競爭性抑制抗體與CD4抗原決定基結合之抗體。在較佳實施例中，抗體使與抗原決定基之結合競爭性抑制至少95%、至少90%(包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。

載體及宿主細胞

在另一態樣中，本發明提供編碼包括如本文所揭示具有一或多 處修飾、取代或突變之抗體序列(例如抗體變異體)之抗-CD4抗體的分離核酸序列，包含編碼CD4結合多肽之核苷酸序列之載體構築體，包含該載體之宿主細胞，及產生抗體之重組技術。

對於抗體(包括抗體變異體)之重組產生而言，分離編碼其之核酸且插入可複製載體中以供進一步選殖(DNA擴增)或以供表現。編碼抗體(包括抗體變異體)之DNA易於分離且使用習知程序(例如藉由使用能與編碼抗體變異體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)定序。在製備表現本發明之抗體之細胞株中可使用選殖及轉型之標準技術。

載體

許多載體為可用的。載體組份一般包括(但不限於)下列組份中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。含有編碼本發明之抗體之核苷酸序列的重組表現載體可使用熟知技術來製備。表現載體可包括與合適之轉錄或轉譯調節核苷酸序列操作性連接之核苷酸序列，該等調節核苷酸序列諸如來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之調節核苷酸序列。調節序列之實例包括轉錄啟動子、操縱子、強化子、mRNA核糖體結合位點及/或控制轉錄及轉譯啟始及終止之其他適當序列。當調節序列與適當多肽之核苷酸序列功能上相關時，核苷酸序列係"操作性連接"。因此，若啟動子核苷酸序列控制適當核苷酸序列之轉錄，則該啟動子核苷酸序列與(例如)抗體重鏈序列操作性連接。

另外，可將編碼與抗體重鏈序列及/或輕鏈序列不天然相關之適當信號肽之序列併入表現載體中。舉例而言，可使信號肽之核苷酸序列(分泌前導序列)與多肽序列同框融合以使抗體分泌至周質空間或分泌至培養基中。在預定宿主細胞中具功能性之信號肽增強適當抗體之細胞外分泌。在抗體自細胞分泌之後即可將信號肽自多肽裂解。該等 分泌信號之實例已為熟知且包括(例如)美國專利第5,698,435號、第5,698,417號及第6,204,023號中所述之分泌信號。

載體可為質體載體、單股或雙股噬菌體載體，或單股或雙股RNA或DNA病毒載體。可由熟知之用於將DNA及RNA引入細胞中之技術將該等載體以聚核苷酸形式引入細胞中。在噬菌體載體及病毒載體之狀況下，亦可由熟知之用於感染及轉導之技術將載體以封裝或囊封病毒之形式引入細胞中。病毒載體可為複製勝任型或複製缺陷型。在後者狀況下，病毒繁殖一般將僅發生於互補宿主細胞中。亦可使用無細胞轉譯系統以使用來源於現有DNA構築體之RNA產生蛋白質。該等載體可包括編碼抗體分子之恆定區的核苷酸序列(參見，例如PCT公開案WO 86/05807及WO 89/01036；及美國專利第5,122,464號)且可將抗體之可變域選殖至該載體中以供表現完整重鏈或輕鏈。

宿主細胞

本發明之抗體可自任何合適之宿主細胞表現。宿主細胞之實例包括原核細胞、酵母細胞或較高等真核細胞且包括(但不限於)：微生物，諸如經含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型之細菌(例如大腸桿菌、枯草桿菌(B.subtilis))；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型之酵母(例如酵母(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia))；以含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒(Baculovirus))感染之昆蟲細胞系統；以重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic viru，CaMV)；煙草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus，TMV))感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、 CHO、BHK、293、3T3細胞)。

適用作宿主細胞之原核生物包括革蘭氏陰性(gram negative)或革蘭氏陽性(gram positive)有機體，諸如大腸桿菌、枯草桿菌、腸桿菌(Enterobacter)、伊文氏桿菌(Erwinia)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)及志賀桿菌(Shigella)，以及芽孢桿菌(Bacilli)、假單胞菌(Pseudomonas)及鏈黴菌(Streptomyces)。儘管諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其它菌株為適合的，但一較佳之大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)。此等實例為說明性而非限制性的。

在原核宿主細胞中使用之表現載體一般包含一或多個表型可選擇標記基因。表型可選擇標記基因為(例如)編碼賦予抗生素抗性或供給自養需求之蛋白質的基因。適用於原核宿主細胞之表現載體之實例包括來源於市售質體之表現載體，諸如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)、pGEM1(Promega Biotec,Madison,Wisconsin.,USA)及pET(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)及pRSET(Invitrogen,Carlsbad,CA)系列之載體(Studier,J Mol Biol 219：37(1991)；Schoepfer,Gene 124：83(1993))。重組原核宿主細胞表現載體所常用之啟動子序列包括T7(Rosenberg等人，Gene 56：125(1987))、β-內醯胺酶(青黴素酶)、乳糖啟動子系統(Chang等人，Nature 275：615(1978)；Goeddel等人，Nature 281：544(1979))、色胺酸(trp)啟動子系統(Goeddel等人，Nucl Acids Res 8：4057(1980))及tac啟動子(Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1990))。

適用作宿主細胞之酵母或絲狀真菌包括來自酵母屬、畢赤酵母屬、放線菌屬(Actinomycetes)、刻魯維拉菌屬(Kluyveromyces)、裂殖 酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、木黴菌屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)者及諸如脈孢菌、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴(Tolypocladium)及黑麴菌(Aspergillus)之絲狀真菌。酵母載體通常含有來自2μ酵母質體之複製起點序列、自主複製序列(ARS)、啟動子區、多聚腺嘌呤化序列、轉錄終止序列及可選擇標記基因。酵母載體之合適啟動子序列尤其包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J Biol Chem 255：2073(1980))或其他醣解酶(Holland等人，Biochem 17：4900(1978))之啟動子，該等醣解酶諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己醣激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶及葡糖激酶。在酵母表現中使用之其他合適載體及啟動子進一步描述於Fleer等人，Gene 107：285(1991)中。用於酵母及酵母轉型方案之其他合適啟動子及載體在此項技術中已為熟知。酵母轉型方案已為熟知。一種該方案係由Hinnen等人，Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)描述。Hinnen方案在選擇性培養基中針對Trp⁺轉型體選擇。

亦可使用哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統來表現重組抗體。原則上，來自脊椎動物抑或無脊椎動物培養物之任何較高等真核細胞培養物皆可採用。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞(Luckow等人，Bio/Technology 6：47(1988)；Miller等人，Genetics Engineering,Setlow等人編，第8卷，第277-9頁，Plenam Publishing (1986)；Mseda等人，Nature 315：592(1985))。舉例而言，桿狀病毒系統可用於產生異源蛋白質。在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)可用作載體以表現外來基因。該病毒生長於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞中。可將抗體編碼序列個別選殖至病毒之非必需區(例如多角體 蛋白(polyhedrin)基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)控制下。已鑑別之其他宿主包括伊蚊(Aedes)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)及家蠶(Bombyx mori)。供轉染用之多種病毒株可公開獲得，例如AcNPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且該等病毒可用作於本文中尤其用於轉染草地黏蟲細胞之病毒。此外，棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物亦可用作宿主。

脊椎動物細胞及脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。參見Tissue Culture,Kruse等人編，Academic Press(1973)。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為猴腎；人類胚胎腎株；幼倉鼠腎細胞；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞；人類肺細胞；人類肝細胞；小鼠乳腺腫瘤；及NS0細胞。

宿主細胞經供抗體產生用之載體轉型且在適當時經改良以供誘導啟動子、轉錄及轉譯控制序列，選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。常用啟動子序列及強化子序列係來源於多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)及人類細胞巨大病毒(CMV)。來源於SV40病毒基因組之DNA序列可用於提供在哺乳動物宿主細胞中表現結構基因序列之其他遺傳元件，例如SV40起點、早期及晚期啟動子、強化子、剪接位點及多聚腺嘌呤化位點。病毒早期啟動子及病毒晚期啟動子尤其適用，此係由於二者均易於自病毒基因組以亦可含有病毒複製起點之片段形式獲得。在哺乳動物宿主細胞中使用之例示性表現載體可在市面上購得。

適用於產生如本文所述之抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如漢氏F10(Ham's F10)(Sigma,St Louis,MO)、最低必需培養基 (MEM，Sigma,St Louis,MO)、RPMI-1640(Sigma,St Louis,MO)及杜貝卡氏改良依格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM，Sigma,St Louis,MO)之市售培養基適合於培養宿主細胞。另外，Ham等人，Meth Enzymol 58：44(1979)；Barnes等人，Anal Biochem 102：255(1980)；及美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,560,655號、第5,122,469號、第5,712,163號或第6,048,728號中所述之培養基中之任一者可用作供宿主細胞用之培養基。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如X-氯化物，其中X為鈉、鈣、鎂；及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如Gentamycin^TM藥物)、痕量元素(定義為通常以在微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。任何其他必需補充物亦可以將為熟習此項技術者所已知之適當濃度包括在內。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為先前用於經選擇以供表現之宿主細胞之彼等培養條件且對一般熟習此項技術者將顯而易見。

編碼抗體之聚核苷酸

本發明進一步提供包含編碼本發明之抗體及其片段之核苷酸序列的聚核苷酸或核酸(例如DNA)。例示性聚核苷酸包括編碼包含本文所述之胺基酸序列中之一或多者之抗體鏈的聚核苷酸。本發明亦涵蓋在嚴格或較低嚴格度雜交條件下與編碼本發明之抗體之聚核苷酸雜交之聚核苷酸。

聚核苷酸可由此項技術中已知之任何方法獲得，且聚核苷酸之核苷酸序列可由此項技術中已知之任何方法測定。舉例而言，若抗體之核苷酸序列為已知的，則編碼該抗體之聚核苷酸可自化學合成寡核苷酸組裝(例如，如Kutmeier等人，Bio/Techniques 17：242(1994)中所 述)，簡言之，其涉及合成含有編碼抗體之序列部分的重疊寡核苷酸，黏接且連接彼等寡核苷酸，且接著由PCR擴增經連接之寡核苷酸。

或者，編碼抗體之聚核苷酸可自來自合適來源之核酸產生。若含有編碼特定抗體之核酸的純系不可用，但抗體分子之序列為已知的，則編碼免疫球蛋白之核酸可以化學方式合成或自合適來源(例如抗體cDNA文庫，或自分離自表現抗體之任何組織或細胞(諸如經選擇以表現本發明之抗體之融合瘤細胞)之核酸、較佳多聚A⁺RNA產生之cDNA文庫)藉由使用可與序列之3'及5'末端雜交之合成引子進行PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具特異性以自編碼抗體之cDNA文庫鑑別(例如)cDNA純系之寡核苷酸探針選殖來獲得。可接著使用此項技術中所熟知之任何方法將由PCR產生之經擴增核酸選殖至可複製選殖載體中。

一旦確定抗體之核苷酸序列及相應胺基酸序列，即可使用此項技術中熟知之用於操縱核苷酸序列之方法來操縱該抗體之核苷酸序列以產生具有不同胺基酸序列之抗體，例如以產生胺基酸取代、缺失及/或插入，該等方法例如重組DNA技術、定點突變誘發、PCR等(參見，例如Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1990)；Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)中所述之技術，二者均以引用的方式全部併入本文中)。

在一些實施例中，可由熟知方法檢查重鏈可變域及/或輕鏈可變域之胺基酸序列以鑑別CDR之序列，例如藉由與其他重鏈可變區及輕鏈可變區之已知胺基酸序列比較以確定序列高變區。使用常規重組DNA技術，可將CDR中之一或多者插入構架區內(例如人類構架區內)以使如上文所述之非人類抗體人類化。構架區可為天然產生之構架區 或一致構架區，且較佳為人類構架區(對於人類構架區之清單，參見，例如Chothia等人，J Mol Biol 278：457(1998))。較佳地，由構架區與CDR之組合產生之聚核苷酸編碼特異性結合本發明之多肽之抗體。較佳地，如上文所討論，可在構架區內進行一或多處胺基酸取代，且較佳地，該等胺基酸取代改良抗體與其抗原之結合。另外，該等方法可用於進行一或多個參與鏈內雙硫鍵之可變區半胱胺酸殘基之取代或缺失以產生缺乏一或多個鏈內雙硫鍵之抗體分子。針對聚核苷酸之其他改變處於此項技術內。

或者，對於產生單鏈抗體所述之技術(美國專利第4,946,778號；Bird,Science 242：423(1988)；Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；及Ward等人，Nature 334：544(1989))可適於產生單鏈抗體。單鏈抗體係藉由經由胺基酸橋連接F_v區之重鏈片段與輕鏈片段產生單鏈多肽而形成。亦可使用用於在大腸桿菌中組裝功能性F_v片段之技術(Skerra等人，Science 242：1038(1988))。

產生抗-CD4抗體之方法

本發明之抗體可由此項技術中已知用於合成抗體之任何方法來產生，尤其藉由化學合成或較佳藉由重組表現技術產生。

本發明之抗體或其片段、衍生物或類似物(例如抗體或單鏈抗體之重鏈或輕鏈)之重組表現涉及構築含有編碼抗體或抗體片段之聚核苷酸之表現載體。一旦已獲得編碼抗體分子之聚核苷酸，即可由重組DNA技術產生供產生抗體用之載體。可構築含有抗體編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括(例如)活體外重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。

可由習知技術將表現載體轉染至宿主細胞中且可由習知技術培養經轉染之細胞以產生抗體。在一態樣中，如下詳述，編碼重鏈與輕鏈之載體可在供表現完整免疫球蛋白分子之宿主細胞中共同表現。

可利用多種宿主表現載體系統以表現如上所述之抗體分子。該等宿主表現系統表示所關注之編碼序列可由其產生且隨後純化之媒介，但亦表示當經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時可就地表現抗體分子之細胞。細菌細胞(諸如大腸桿菌)及真核細胞通常用於表現重組抗體分子，尤其用於表現完整重組抗體分子。舉例而言，與諸如來自人細胞巨大病毒之主要中間早期基因啟動子元件之載體聯合之哺乳動物細胞(諸如CHO)為供抗體用之有效表現系統(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。

另外，可選擇調節所插入序列之表現或以所要特定方式修飾及加工基因產物之宿主細胞株。蛋白質產物之該等修飾(例如糖基化)及加工(例如裂解)對於蛋白質之功能而言可較重要。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾之特徵及特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白質之正確修飾及加工。為此，可使用具有用於基因產物之初級轉錄物之適當加工、糖基化及磷酸化之細胞機構的真核宿主細胞。該等哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)：CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤細胞。

對於長期、高產量產生重組蛋白質而言，穩定表現為較佳。舉例而言，穩定表現抗體分子之細胞株可經工程化。勝於使用含有病毒複製起點之表現載體，宿主細胞可以由適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、多聚腺嘌呤化位點等)及可選擇標記控制之DNA轉型。繼引人外來DNA之後，可允許經工程化細胞在富集培養基中生長一至兩天，且接著轉換至選擇性培養基中。重組質體中之可選擇標記賦予針對選擇之抗性且允許細胞將該質體穩定整合至其染色體中且生長以形成變異區，繼而可將該變異區選殖及擴展至細胞株中。可有利地使用此方法以工程化表現抗體分子之細胞株。該等經工程化細胞株可尤其適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相 互作用之化合物。

可使用許多選擇系統，其包括(但不限於)：單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska等人，Proc Natl Acad Sci USA 48：202(1992))及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980))基因，該等基因可分別在tk細胞、hgprt細胞或aprt細胞中使用。又，抗代謝物抗性可用作針對下列基因進行選擇之基礎：dhfr，其賦予針對甲胺喋呤(methotrexate)之抗性(Wigler等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：357(1980)；O'Hare等人，Proc Natl Acad Sci USA 78：1527(1981))；gpt，其賦予針對黴酚酸(mycophenolic acid)之抗性(Mulligan等人，Proc Natl Acad Sci USA 78：2072(1981))；neo，其賦予針對胺基糖苷G-418之抗性(Wu等人，Biotherapy 3：87(1991))；及hygro，其賦予針對潮黴素(hygromycin)之抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可常規應用重組DNA技術中通常已知之方法來選擇所要重組純系，且該等方法描述於(例如)Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press(1990)；及第12章及第13章，Dracopoli等人編，Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons(1994)；Colberre-Garapin等人，J Mol Biol 150：1(1981)中，其皆以引用的方式全部併入本文中。

抗體分子之表現量可藉由載體擴增而增加(對於回顧，參見Bebbington等人，"The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells",DNA Cloning，第3卷Academic Press(1987))。當表現抗體之載體系統中之標記可擴增時，宿主細胞之培養物中所存在之抑制劑之含量增加將增加標記基因之複本數。由於擴增區與抗體基因相關，因此抗體的產生亦將增加 (Crouse等人，Mol Cell Biol 3：257(1983))。

宿主細胞可用兩個表現載體共同轉染，第一載體編碼來源於重鏈之多肽且第二載體編碼來源於輕鏈之多肽。該兩個載體可含有能使重鏈多肽及輕鏈多肽同等表現之相同可選擇標記。或者，可使用編碼重鏈多肽與輕鏈多肽兩者且能表現重鏈多肽與輕鏈多肽兩者之單一載體。在該等情況下，輕鏈應置於重鏈之前以避免無毒重鏈過量(Proudfoot,Nature 322：52(1986)；Kohler,Proc Natl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。

一旦抗體已由動物產生、經化學合成或經重組表現，即可由此項技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之任何方法將其純化，例如，藉由層析(例如離子交換層析，親和力層析、尤其藉由在蛋白質A層析之後對特定抗原之親和力層析，及尺寸排阻層析)、離心、差異溶解度或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術。另外，可使抗體或其片段與本文所述或此項技術中另外已知之異源多肽序列融合以有利於純化。

抗體可與多肽以重組方式融合或以化學方式接合(包括共價接合與非共價接合)。經融合或經接合之抗體可用於使純化易化。參見，例如PCT公開案WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等人，Immunol Lett 39：91(1994)；美國專利第5,474,981號；Gillies等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；Fell等人，J Immunol 146：2446(1991)，其皆以引用的方式全部併入。

此外，抗體或其片段可與標記序列(諸如肽)融合以有利於純化。舉例而言，標記胺基酸序列可為六聚組胺酸肽，尤其諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA)中所提供之標籤，其中許多可在市面上購得。舉例而言，如Gentz等人，Proc Natl Acad Sci USA 86：821(1989)中所述，六聚組胺酸提供融合蛋白質之便利純化。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)：對應於來源於流感病毒血球凝集素蛋白之抗原決定基的"HA"標籤(Wilson等人，Cell 37：767(1984))，及"flag"標籤。

抗體純化

當使用重組技術時，抗體可於細胞內、周質空間中產生或直接分泌至培養基中。若抗體於細胞內產生，則作為第一步驟，可(例如)藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。Carter等人，Bio/Technology 10：163(1992)描述分離分泌至大腸桿菌之周質空間中之抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘將細胞團解凍。可藉由離心移除細胞碎片。當抗體分泌至培養基中時，一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自該等表現系統之上清液。諸如PMSF之蛋白酶抑制劑可包括於前述步驟中之任一者中以抑制蛋白質水解且抗生素可包括在內以防止外來污染物生長。

自細胞製備之抗體組合物可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和力層析來純化，其中親和力層析為較佳之純化技術。蛋白質A作為親和力配位體之適宜性視物種及存在於抗體變異體中之任何免疫球蛋白Fc域之同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈之抗體(Lindmark等人，J Immunol Meth 62：1(1983))。蛋白質G經推薦用於所有小鼠同型及人類IgG3(Guss等人，EMBO J 5：1567(1986))。親和力配位體所附著之基質最通常為瓊脂糖，但其他基質為可用的。與使用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比，諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定基質允許更快之流動速率及更短之處理時間。當抗體包含C_H3域時，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker；Phillipsburg,N.J.)可適用於純化。 視待回收之抗體而定，用於蛋白質純化之其他技術亦可用，諸如以離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、以二氧化矽層析、以肝素SEPHAROSE^TM層析、以陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。

繼任何初步純化步驟之後，可使用pH值介於約2.5-4.5之間的溶離緩衝液使包含所關注之抗體及污染物之混合物經受低pH值疏水性相互作用層析，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行。

為判定抗體是否與人類CD4結合，可使用任何習知結合檢定(參見，例如美國專利第5,871,732號)。適用之CD4結合檢定包括Biacore、FACS分析、ELISA檢定、放射性免疫檢定及類似檢定，其偵測抗體與人類CD4之結合。適用於該等檢定之全長及可溶形式之人類CD4描述於PCT專利申請案PCT/US88/02940中，其以引用的方式併入本文中。Littman等人，Cell,55,541,1988描述前人類CD4之正確信號序列裂解位點且其係於PCT/US88/02940之申請日之後公開。抗體與CD4或與其可溶片段(諸如rsCD4)之結合可經由使用對測試中之抗體所來源之物種之免疫球蛋白具特異性之二次抗體來便利地偵測。

為判定抗體是否顯著阻斷HIV gp120與人類CD4之結合，可使用任何合適之競爭檢定(參見，例如美國專利第5,871,732號)。適用之檢定包括(例如)ELISA檢定、放射性免疫檢定及類似檢定，其量化抗體交叉阻斷HIV gp120與人類CD4結合之能力。較佳地，量測過量HIV gp120阻斷經標記人類rsCD4與經固定抗體結合之能力。

較佳地，藉由測試抗體與人類CD4⁺細胞結合之能力來評估該抗體與人類CD4結合之能力(參見，例如美國專利第5,871,732號)。用於測定抗體是否與人類CD4結合之較佳CD4⁺細胞可為經編碼全長人類CD4之DNA轉型且在其表面上表現CD4之哺乳動物組織培養細胞。該等細胞包括(例如)描述於R.A.Fisher等人，Nature,331,76-78(1988) 中之經編碼全長CD4之DNA轉型之CHO細胞("r-CD4-CHO細胞")。合適之r-CD4-CHO細胞以寄存編號IVI-10260寄存於英弗特國際公司培養物保藏中心(In Vitro International,Inc.culture collection)(Linthicum,Md.)且以寄存編號CRL 10884轉移至美國培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville,Md.)。

抗體與CD4⁺細胞之結合可藉由用對所測試抗體所來源之同一物種之免疫球蛋白具特異性之經螢光標記二次抗體將細胞染色來偵測。螢光活化細胞分選器("FACS")可用於偵測及量化任何結合。一般參見H.M.Shapiro,Practical Flow Cytometry,Alan R.Liss,Inc.,New York,N.Y.(1985)。

抗體阻斷HIV gp120與人類CD4結合之能力可藉由免疫螢光染色來測定。製備CD4+細胞之平行組，一組僅用抗-CD4抗體染色且另一組中之細胞與過量HIV gp120一起預培育，且量化所結合之HIV gp120阻斷抗體與細胞結合之程度。抗體與CD4⁺細胞之結合可藉由使用對所測試抗體所來源之同一物種之免疫球蛋白具特異性之經螢光標記二次抗體進行FACS分析來量化。

檢定中所使用之HIV gp120可由受HIV感染之細胞、由HIV自身、由經HIV gp120之基因轉型之宿主細胞或由經分離gp120提供。較佳地，將使用自經編碼HIV gp120之截斷HIV gp160基因轉型之單細胞宿主分離之經純化、可溶性HIV gp120。經純化之重組HIV gp120可在市面上購得，例如來自Repligen(Cambridge,Mass.)及來自Celltech(Berkshire,United Kingdom)。產生重組gp120之細胞描述於(例如)Lasky等人，Science,233,209-12(1986)中。合適之可溶性重組HIV gp120多肽係由經帶有編碼CD4之DNA序列的重組桿狀病毒轉型之草地黏蟲細胞產生。

為判定抗體是否阻斷CD4⁺細胞之間HIV誘導之合胞體形成，可使 用任何已知之合胞體檢定(參見，例如B.D.Walker等人"Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Syncytium Formation and Virus Replication by Castanospermine",PNAS 84：8120-8124(1984))。一種方法利用受HIV感染之CD4⁺組織培養細胞(例如H9)及未受感染之C8166細胞，二者均可獲自AIDS Reference Reagent Program,NIH,Bethesda,MD。在此方法中，在連續稀釋量之待測試抗-CD4抗體存在下培育長期感染之H9細胞，接著添加未受感染之C8166細胞。培育樣本且接著對所形成之合胞體之數目進行記分。將此數目與在無抗-CD4存在下或以如所測試抗-CD4抗體之相同同型之不相關抗體形成之合胞體之最大數目相比較。

比較抗體之合胞體阻斷能力之一替代方法如下(參見美國專利5,871,732)。在已知之CD4抗體(待測試抗體)存在下或無抗體存在下將在其表面上表現重組HIV包膜醣蛋白(亦即，HIV gp160之轉譯後裂解之後的HIV gp120/gp41)之經轉型組織培養細胞與含有可偵測物質之人類CD4⁺細胞(例如Jurkat細胞，諸如經⁵¹Cr標記之ATCC TIB152)一起培育。培育後，針對可偵測物質檢定培養上清液(例如量測⁵¹Cr)。細胞溶解為HIV誘導之合胞體形成之必然結果。因此，因細胞溶解而釋放至培養上清液中之可偵測物質之量與合胞體形成直接成比例。以此方式，易於量化及比較對照CD4抗體與特定抗體阻斷合胞體形成之程度。

用於上述檢定之較佳經轉型組織培養細胞為在其表面上表現重組HIV包膜醣蛋白之CHO細胞("r-gp160-CHO細胞")。該等r-gp160-CHO細胞係由以寄存編號IVI-10261寄存於英弗特國際公司培養物保藏中心(Linthicum,Md.)中且以寄存編號CRL 10885轉移至美國菌種保藏中心(Rockville,Md.)之培養物例示。

為判定抗體是否比已知CD4抗體或需要改良之所關注抗體之免疫 抑制性低，在活體外類破傷風毒素特異性增殖檢定中，可使用E.G.Engleman等人，J.Immunol.,127,2124-29(1981)中所述之一般方案。在該類破傷風毒素檢定中，量化抗體及對照CD4抗體減少類破傷風毒素誘導之T細胞增殖的能力。通常，藉由T細胞之³H-胸苷併入來量測增殖。

為判定抗體是否不與由人類CD4 V1區組成之多肽結合或其是否與由人類CD4 V1V2區組成之多肽結合，舉例而言，ELISA檢定、放射性免疫檢定(RIA)、FACS分析或類似檢定為適用的。在該等檢定中，抗體與彼等多肽中之任一者結合之能力可經由使用對抗體所來源之物種之免疫球蛋白具特異性之二次抗體來偵測。

特異性結合可經由使用CD4 V1及CD4 V1V2多肽(V1V2為含有CD4 EC域之V1及V2部分之多肽)作為抗體與CD4⁺細胞表面上所呈現之人類CD4結合之競爭者進行抑制研究來測定，使用FACS分析以量化任何抑制。

或者，判定抗體與CD4 V1多肽或CD4 V1V2多肽結合抑或不結合係使用RIA競爭檢定來實現，其中抗體與盤結合(直接或間接)，且CD4 V1多肽或CD4 V1V2多肽同時與經可偵測標記之rsCD4競爭結合抗體。將所結合之rsCD4的量與在無CD4 V1或CD4 V1V2多肽存在下所結合之rsCD4的量相比較，從而允許計算由CD4 V1或CD4 V1V2多肽所引起之對rsCD4結合之抑制百分比。

由人類CD4 V1或CD4 V1V2區組成之多肽分別為具有PCT第PCT/US88/02940號中或Maddon等人，Cell(同上)中所陳述之CD4序列的CD4 AA₃-AA₁₁₅或CD4 AA₃-AA₁₈₂，其可用於實施所關注之篩選檢定。使用Littman等人，Cell(同上)之經校正編號系統，此等多肽分別對應於人類CD4 AA₁-AA₁₁₃及人類CD4 AA₁-AA₁₈₀。合適之CD4 V1多肽亦描述於Chao等人，J.Biol.Chem.,264,5812-17(1989)中。合適之 CD4 V1V2多肽亦描述於Garlick等人，AIDS Res.Hum.Retroviruses,6,465-79(1990)中。

為判定抗體是否抑制HIV對CD4⁺細胞之感染，可監測HIV感染之任何指征。HIV感染之適用指標包括(例如)受HIV長期感染之細胞分泌HIV核心抗原p24及HIV誘導之合胞體形成。對HIV感染的抑制可藉由使用如本文所述及如此項技術中已知之對於p24之檢定比較在受HIV感染之CD4⁺細胞培養物中所關注之抗體存在及不存在下HIV p24之含量來測定。

為判定抗體是否使得活體內循環CD4⁺細胞之數目無顯著減少，量化在將抗體投與具有正常免疫功能之哺乳動物之後24小時內自哺乳動物分離之循環CD4⁺細胞之數目，且與投藥前數目或已替代本發明之抗體投與具有不相關特異性之同型匹配抗體之對照哺乳動物體內之數目相比較。CD4⁺細胞之量化可(例如)藉由用不與抗體交叉阻斷結合CD4之經螢光標記抗-CD4抗體將細胞染色、隨後進行FACS分析來實現。

醫藥調配物

抗體之治療調配物可藉由將具有所要純度之抗體與此項技術中通常使用之可選"醫藥學上可接受"之載劑、賦形劑或穩定劑(其全部稱為"賦形劑")(亦即，緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等張劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑及其他混雜添加劑)混合來製備以供以凍乾調配物或水溶液之形式儲存。參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol編(1980)。該等添加劑在所使用之劑量及濃度下須對接受者無毒。

緩衝劑有助於將pH值維持於接近生理條件之範圍內。其較佳以約2mM至約50mM範圍內之濃度存在。合適之緩衝劑包括有機酸與無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混 合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、丁二酸鹽緩衝劑(例如丁二酸-丁二酸一鈉混合物、丁二酸-氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩衝劑(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸一鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩衝劑(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸一鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸一鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝劑(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)及乙酸鹽緩衝劑(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可提及磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑及三甲胺鹽(諸如Tris)。

可添加防腐劑以阻礙微生物生長，且可以0.2%-1%(w/v)範圍內之量添加。合適之防腐劑包括苯酚、苄醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄銨、鹵化苯甲烴銨(例如氯化苯甲烴銨、溴化苯甲烴銨、碘化苯甲烴銨)、氯化六烴季銨及對羥基苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。

可添加"穩定劑"以確保抗體之液體組合物之等張性且其包括多元糖醇，較佳為三元或更高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。

穩定劑係指自增積劑至溶解治療劑或有助於防止變性或黏附於容器壁之添加劑之功能範圍內的一大類賦形劑。典型穩定劑可為多元糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺 酸、天冬醯胺酸、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及其類似物，包括環醇，諸如環己六醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(亦即，<10個殘基)；蛋白質，諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖；及三醣，諸如蜜三糖；及多醣，諸如葡聚糖。穩定劑可在每重量份活性蛋白質0.1至10,000重量份之範圍內存在。

可添加非離子型界面活性劑或清潔劑(亦稱為"濕潤劑")以幫助溶解治療劑以及保護治療抗體免受攪動誘導之凝集，其亦允許調配物暴露於受應力之剪切表面而不引起蛋白質變性。合適之非離子型界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(poloxamer)(184、188等)、Pluronic^TM多元醇及聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN-20^®、TWEEN-80^®等)。非離子型界面活性劑可在約0.05mg/ml至約1.0mg/ml、較佳約0.07mg/ml至約0.2mg/ml之範圍內存在。

其他各種賦形劑包括增積劑(bulking agents)(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)及共溶劑。調配物亦可含有一種以上如治療特定適應症所需之活性化合物，較佳為具有彼此無不利影響之互補活性之活性化合物。該等分子適宜以對於所欲達成之目的有效之量組合存在。活性成份亦可以(例如)凝聚技術或界面聚合而截留於所製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨 乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osal編(1980)中。

欲用於活體內投藥之調配物必須為滅菌的。舉例而言，此易由經滅菌濾膜過濾而實現。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品之形式，(例如薄膜或微囊)。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT^TM(包含乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質較短時段。當囊封之抗體長時間保留於體內時，其因暴露於37℃之濕度而可能變性或聚集，造成生物活性損失且免疫原性可能改變。可設計合理的穩定策略，視所涉及之機制而定。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-雙硫鍵互換而形成分子間S--S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及發展特定聚合物基質組合物來達成穩定。

有效治療特定病症或病狀之治療多肽、抗體或其片段之量將視病症或病狀之性質而定，且可由標準臨床技術確定。在有可能之情況下，在人體內測試之前，需要首先於活體外及接著於適用之動物模型系統中測定抗體之劑量反應曲線及醫藥組合物。

在一較佳實施例中，藉由皮下注射投與治療抗體或其片段之水溶液。每一劑量可處於約0.5微克/公斤體重至約50微克/公斤體重或更佳約3微克/公斤體重至約30微克/公斤體重之範圍內。

皮下投藥之給藥時程可在每月一次至每日一次之間變化，其視 許多臨床因素而定，該等臨床因素包括疾病類型、疾病嚴重度及個體對治療劑之敏感性。

抗-CD4抗體之治療用途

預期本發明之抗體可用於治療哺乳動物。舉例而言，在一些實施例中，可將所關注之抗體投與非人類哺乳動物以達成獲得臨床前資料之目的。待治療之例示性非人類哺乳動物包括進行臨床前研究之非人類靈長類動物、犬、貓、齧齒類動物及其他哺乳動物。該等哺乳動物可為待用抗體治療之疾病的經確立動物模型且可用於研究所關注抗體之毒性。在此等實施例中之每一者中，可針對哺乳動物進行劑量遞增研究。

具有或不具有與之接合之治療部分、單獨或與其他治療因子組合投與之抗體可用作治療劑。本發明包括基於抗體之療法，其涉及將本發明之抗體投與動物、哺乳動物或人類以供治療CD4介導之疾病、病症或病狀。動物或個體可為需要特定治療之哺乳動物，諸如已經診斷患有特定病症(例如與CD4相關之病症)之哺乳動物。針對CD4之抗體適用於對抗AIDS或其他HIV相關病症。舉例而言，藉由投與治療上可接受之劑量的抗-CD4抗體或本發明抗體之混合物或與不同來源之其他抗體之組合，可改善或預防所治療之哺乳動物、尤其人類之疾病症狀。

本發明之治療化合物包括(但不限於)：本發明之抗體(包括如本文所述之其片段、類似物及衍生物)及如下文所述編碼本發明之抗體(包括其片段、類似物及衍生物)之核酸。本發明之抗體可用於治療、抑制或預防與CD4相關之疾病、病症或病狀，其包括(但不限於)本文所述之疾病、病症或病狀中之任一或多者。與CD4相關之疾病、病症或病狀的治療及/或預防包括(但不限於)減輕至少一種與彼等疾病、病症或病狀相關之症狀。本發明之抗體可在如此項技術中已知或如本文 所述之醫藥學上可接受之組合物中提供。

有效治療、抑制及預防與CD4相關之疾病或病症之抗體的量可由標準臨床技術確定。劑量將視待治療之疾病類型、疾病之嚴重度及病程、抗體係出於預防目的抑或治療目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。抗體可以符合疾病之治療方案來投與，例如一至數天內之單次或數次給藥以改善疾病病況或延長時間內之週期性給藥以抑制疾病進程且預防疾病復發。另外，可視情況使用活體外檢定以幫助鑑別最佳劑量範圍。待於調配物中使用之精確劑量亦將視投藥途徑及疾病或病症之嚴重性而定，且應根據行醫者之判斷及各患者之情況來決定。有效劑量可由來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線推斷出。

對於抗體而言，投與患者之劑量通常為0.1毫克/公斤患者體重至150毫克/公斤患者體重。較佳地，投與患者之劑量介於0.1毫克/公斤患者體重與20毫克/公斤患者體重之間，更佳為1毫克/公斤患者體重至10毫克/公斤患者體重。一般而言，人類抗體在人體內比來自其他物種之抗體具有更長之半衰期，此係歸因於對外來多肽之免疫反應。因此，人類抗體之較低劑量及較低頻率投藥可有可能。另外，抗體之劑量及投藥頻率可藉由經修飾(諸如脂化)而增強抗體之吸收及組織穿透(例如穿透至腦內)來降低。對於經數天或更長時間重複投藥而言，視病狀而定，持續治療直至出現對疾病症狀之所要抑制為止。然而，其他給藥方案可適用。此療法之進程易於由習知技術及檢定來監測。

根據本發明，抗體可以符合疾病之治療方案來投與，例如一至數天內之單次或數次給藥或延長時間內之週期性給藥以改善疾病病況、抑制疾病進程及/或預防疾病復發。詳言之，抗體可以有效使病毒負荷自基線降低50%至90%及較佳使病毒負荷自基線降低65%至95%之劑量來投與。根據本發明，病毒負荷之降低可為短暫的，病毒 負荷之降低較佳可持續至少一週且最佳可持續兩週至三週或更長時間。

預防及/或治療方案中所使用之有效預防、治療及/或控制病症之本發明抗體或醫藥組合物的量可由本文中所揭示之方法來確定。頻率及劑量亦將根據各患者特有之因素而變，其視所投與之特定抗體、病狀之嚴重度、投藥途徑以及患者之年齡、體重、反應及以往病史而定。舉例而言，有效治療、預防及/或控制疾病之本發明抗體之劑量可藉由將抗體投與諸如本文中所揭示或熟習此項技術者已知之動物模型的動物模型來確定。另外，可視情況使用活體外檢定以幫助鑑別最佳劑量範圍。

在一些實施例中，預防及/或治療方案包含滴定投與患者之劑量以達成對治療功效之指定量測。該等量測包括CD4活性或代謝之改良；病毒負荷之降低；及病毒學失敗率。

在某些實施例中，調整預防及/或治療方案中之抗體(本發明之抗體)之劑量以在經歷治療方案後與參考樣本相比在自患者提取之測試試樣中達成CD4活性或代謝改良、病毒負荷降低或病毒學失敗率改良。此處，參考樣本為自經歷療法之患者提取之試樣，其中該試樣係於較早時間點處自患者提取。在一實施例中，參考樣本為在接受預防或治療方案之前自同一患者提取之試樣。在特定實施例中，測試試樣中之病毒負荷比參考樣本中之病毒負荷低至少2%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。

在其他實施例中，調整預防及/或治療方案中之本發明抗體之劑量以在經歷預防及/或治療方案之後與參考樣本相比在自患者提取之測試試樣中達成病毒負荷降低，其中該參考樣本試樣係自健康患者提取。

在一些實施例中，調整預防及/或治療方案中之本發明抗體之劑量以達成屬於預定參考範圍內之病毒負荷。在此等實施例中，將測試試樣中之病毒負荷與預定參考範圍相比較。

在一實施例中，預防及/或治療方案包含以多次劑量投與本發明之抗體或其醫藥組合物。當以多次劑量投與時，抗體或醫藥組合物係以足以預防、治療及/或控制病狀之頻率及量來投與。在一實施例中，預防及/或治療方案包含每週一次、每兩週一次或每月一次投與本發明之抗體。

在一實施例中，投藥頻率處於每天一次至約每八週一次之範圍內。在另一實施例中，投藥頻率處於約每週一次至約每六週一次之範圍內。在另一實施例中，投藥頻率處於約每三週一次至約每四週一次之範圍內。在某些實施例中，抗體係投與持續一週至兩年之時段。在另一實施例中，抗體係投與持續兩週或更長之時段。在其他實施例中，抗體係投與持續兩週至一年之時段。在其他實施例中，抗體係投與持續兩週至六個月之時段。在一些實施例中，抗體係投與持續兩週至十二週之時段。在其他實施例中，抗體係投與持續兩週至六週之時段。在某些實施例中，抗體係每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每週五次、每週六次或每週七次投與。在較佳實施例中，抗體係每週投與至少三次。在其他較佳實施例中，抗體係每日投與歷時連續五天或每日投與歷時連續七天。在其他實施例中，抗體係每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次或每天五次投與。在較佳實施例中，抗體係每週投與三次持續兩週之時段。

本發明之抗體已經修飾以增加活體內穩定性且增加活體內半衰期，由此本發明之抗體在減少之劑量下具有治療功效。在一些實施例中，每次投與抗體時，其係以每週10mg/kg或更少之劑量投與，或以每隔一週15mg/kg或更少之劑量投與。在一些實施例中，投與抗體歷 時一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個週期。

在一特定實施例中，抗體係以0.001毫克/公斤/週至100毫克/公斤/週之劑量投與。在另一實施例中，抗體係以0.001毫克/公斤/週至10毫克/公斤/週之劑量投與。在某些實施例中，抗體係以0.1毫克/公斤/天或更高之劑量投與。在其他實施例中，抗體係以範圍介於約0.01毫克/公斤/天至約20毫克/公斤/天之間的劑量投與。在特定實施例中，當疾病為後天性免疫缺乏症候群("AIDS")、AIDS相關綜合症及人類免疫缺陷病毒感染時，所給予之劑量處於高於0.01毫克/公斤/天至約60毫克/公斤/天之間的範圍內。

一般而言，投與個體之本發明抗體之劑量處於0.1毫克/公斤個體體重至50毫克/公斤個體體重或1毫克/公斤個體體重至50毫克/公斤個體體重之範圍內，更佳處於0.1毫克/公斤個體體重至25毫克/公斤個體體重或1毫克/公斤個體體重至25毫克/公斤個體體重之範圍內，最佳處於0.1毫克/公斤患者體重至10毫克/公斤患者體重或1毫克/公斤患者體重至10毫克/公斤患者體重之範圍內。

在一特定實施例中，投與個體之本發明抗體之劑量為1毫克/公斤/週、2毫克/公斤/週、3毫克/公斤/週、4毫克/公斤/週、5毫克/公斤/週、6毫克/公斤/週、7毫克/公斤/週、8毫克/公斤/週、9毫克/公斤/週或10毫克/公斤/週。

在一特定實施例中，預防方案包含以約0.1至約100,000微克/公斤接受抗體之個體體重範圍內之劑量投與患者。

在一特定實施例中，投與個體之本發明抗體之劑量處於0.01至10公克/平方公尺個體體重之範圍內，且更為通常處於0.1公克/平方公尺個體體重至7.5公克/平方公尺個體體重之範圍內。在一實施例中，投與個體之劑量處於0.5公克/平方公尺個體體表面積至5公克/平方公尺 個體體表面積或1公克/平方公尺個體體表面積至5公克/平方公尺個體體表面積之範圍內。

在其他實施例中，預防及/或治療方案包含將一或多次劑量之有效量之本發明抗體投與患者，其中有效量之劑量達成至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、至少400μg/ml或至少500μg/ml本發明抗體之血漿含量。

抗體組合物將以符合優良醫學規範之方式來調配、給藥及投與。在一較佳實施例中，抗體組合物經調配用於皮下投藥。在另一較佳實施例中，抗體組合物經調配用於靜脈內投藥。在此情形中所考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之原因、藥劑傳遞之部位、投藥方法、投藥時程及從業醫師已知之其他因素。待投與之抗體變異體之"治療有效量"將由該等考慮因素所主導且為預防、改善或治療疾病或病症所必需之最小量。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視存在於該調配物中之抗體量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因素而定。此等藥劑一般以如上文所使用之相同劑量及投藥途徑使用或以迄今所使用之劑量之約1%至99%使用。

本發明之抗體可單獨或與其他類型之藥劑或治療(包括對於HIV之任何可用治療)組合投與。舉例而言，本發明之抗體可與抑制CXCR4或CCR5輔助受體功能之療法或gp41抑制劑組合投與。本發明 之抗體亦可與核苷抑制劑、融合抑制劑、附著/進入抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑或抗-HIV抗體組合使用，諸如由Tilley等人於美國專利第5,922,325號中或Chang等人於美國專利第6,309,880號中所揭示者。

組合投與此等治療劑係進行持續規定時段(視所選擇之組合而定通常為數分鐘、數小時、數天或數週)。組合療法意欲涵蓋以依序方式投與此等治療劑，亦即，其中各治療劑係在不同時間投與；以及以大體上同時之方式投與此等治療劑或治療劑中之至少兩者。大體上同時投藥可(例如)藉由將具有固定比率之各治療劑的單膠囊或以治療劑中之每一者之多個單膠囊劑形式投與個體而實現。依序或大體上同時投與各治療劑可由包括(但不限於)經口途徑、靜脈內途徑、肌肉內途徑及經黏膜組織直接吸收之任何適當途徑實現。該等治療劑可由相同途徑或由不同途徑投與。舉例而言，特定組合之一種組份可藉由靜脈內注射投與，而組合之其他組份可經口投與。組份可以任何治療有效次序投與。

在一較佳態樣中，抗體大體上經純化(例如，大體上不含限制其作用或產生不當副作用之物質)。

各種傳遞系統為已知的且可用於投與抗體，包括注射，例如囊封於脂質體、微粒子、微膠囊中、能夠表現化合物之重組細胞、受體介導之內飲作用(參見，例如Wu等人，J Biol Chem 262：4429(1987))、構築作為反轉錄病毒或其他載體之一部分之核酸等。

抗-CD4抗體可以任何可接受之方式投與哺乳動物。引入之方法包括(但不限於)：非經腸、皮下、腹膜內、肺內、鼻內、硬膜外、吸入及經口途徑，且必要時對於免疫抑制治療而言包括病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、皮內、靜脈內、動脈內或腹膜內投藥。抗體或組合物可由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射，藉由經上 皮或黏膜與皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部性投藥。另外，可需要由任何合適途徑(包括心室內及鞘內注射)將治療抗體或抗體組合物引入中樞神經系統中；心室內注射可由(例如)連接至儲集器(諸如Ommaya儲集器)之心室內導管來推動。另外，抗體適宜藉由脈衝輸注投與，尤其以遞減劑量投與抗體。較佳藉由注射給藥，最佳藉由靜脈內或皮下注射給藥，其部分取決於投藥為短暫性抑或長期投藥。

亦可(例如)藉由使用吸入器或噴霧器及具有噴霧劑之調配物來採用肺部投藥。抗體亦可以乾粉組合物之形式投與患者肺中(參見，例如美國專利第6,514,496號)。

在一些實施例中，可需要將治療抗體局部投與需要治療之區域；此可藉由(例如且並非作為限制)局部輸注、表面施用、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植入物來達成，該植入物為多孔、非多孔或凝膠材料，包括膜(諸如sialastic膜)或纖維。較佳地，當投與抗體時，須小心使用蛋白質不吸附之材料。

在另一實施例中，抗體可在微脂粒、尤其脂質體中傳遞(參見Langer,Science 249：1527(1990)；Treat等人，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein等人編，353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-27)。

在另一實施例中，抗體可以受控釋放系統傳遞。在一實施例中，可使用泵(參見Langer,Science 249：1527(1990)；Sefton,CRC Crit Ref Biomed Eng 14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等人，N Engl J Med 321：574(1989))。在另一實施例中，可使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release,Langer等人，CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen等人編，Wiley(1984)； Ranger等人，J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23：61(1983)；亦參見Levy等人，Science 228：190(1985)；During等人，Ann Neurol 25：351(1989)；Howard等人，J Neurosurg 71：105(1989))。在另一實施例中，可接近治療靶置放受控釋放系統。

本發明亦提供醫藥組合物。該等組合物包含治療有效量之抗體及生理學上可接受之載劑。在一特定實施例中，術語"生理學上可接受"意謂由聯邦政府或州政府之管理機構批准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或用於動物及更特定言之用於人類之其他一般公認藥典中。

術語"載劑"係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。該等生理學載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似油。當醫藥組合物經靜脈內投與時，水為較佳載劑。生理食鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。合適之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。可將組合物與傳統黏合劑及載劑(諸如甘油三酯)一起調配成栓劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適載劑之實例描述於E.W.Martin之"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。該等組合物含有有效量之抗體(較佳呈經純化形式)連同合適量之載劑以提供適當投與患者之形式。如此項技術中已知，調配物將經構築以適於投藥模式。

在一實施例中，根據常規程序將組合物調配成適於靜脈內投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投藥之組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。視需要，組合物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以舒緩注射部位處之疼痛。一般而言，成份係單獨供給或以單位劑型混合於一起，例如以於指示活性劑量之密封容器(諸如安瓿或藥囊)中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。當組合物有待藉由輸注投與時，其可以含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。當組合物係藉由注射投與時，可提供注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿，以便成份可於投藥前混合。

本發明亦提供包含一或多個以本發明之醫藥組合物之成份中之一或多者填充之容器的醫藥封裝或套組。視情況與該(等)容器相關聯者可為由管理醫藥品或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之通知，該通知反映由製造、使用或銷售機構批准用於人類投藥。

另外，抗體可與諸如異源多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素之各種效應分子接合。參見，例如PCT公開案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美國專利第5,314,995號；及EP 396,387。使該治療部分與抗體接合之技術已為熟知，參見，例如Arnon等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld等人(編),243-56Alan R.Liss(1985)；Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編，623-53,Marcel Dekker(1987)；Thorpe,Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人編，475-506(1985)；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy,Baldwin等人編，303-16,Academic Press (1985)；及Thorpe等人，Immunol Rev 62：119(1982)。或者，抗體可與第二抗體接合以形成抗體異質接合物，參見，例如美國專利第 4,676,980號。

抗體接合物可用於修飾給定生物反應，治療劑或藥物部分並不應解釋為限於典型化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所要生物活性之蛋白質或多肽。該等蛋白質可包括(例如)生物反應改質劑，諸如淋巴激素、介白素-1("IL-1")、介白素-2("IL-2")、介白素-6("IL-6")、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子("GM-CSF")、顆粒球群落刺激因子("GCSF")或其他生長因子。

製品

在本發明之另一實施例中，提供含有適用於治療上述病症之物質的製品。該製品包含容器及標籤。合適之容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納有效預防或治療病狀之組合物且可具有無菌接取口(例如，該容器可為靜脈內溶液包或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之活性劑為抗體。容器上或與容器相關聯之標籤指示組合物用於治療所選病狀。製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點出發合乎需要之其他物質，其包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明書之包裝插頁。

實例

本發明現將出於技工利益由描述可由其實施本發明且本發明可於其中實施之一些實施例之以下非限制性實例來例示。

實例1

此實例描述G4D及G4H抗-CD4抗體的產生。下表提供用於在G4H及G4D之IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列中產生取代之引子的序列。

A.G4H的產生

進行三個PCR反應以產生IgG4H。PCR1及PCR2使用IgG4 WT作為模板且PCR3使用PCR1+PCR2之產物作為模板。PCR1反應包含使用引子C4E1(含有BamHI位點)及引子C4m1-3(IgG4突變體1鉸鏈S229P 3')。PCR2包含使用引子C4m1-5(IgG4突變體1鉸鏈S229P 5')及引子C4E2(含有BamHI位點)。PCR3包含使用引子C4E1及C4E2。接著，將PCR3之產物連接至市售載體中，接著用BamHI消化。使用限制性消化來檢查定向且驗證最終序列。

B.G4D的產生

類似於上文對於G4H所述之程序，進行三個PCR反應以產生G4D。PCR1包含使用C4E1及C4m2-3(IgG4突變體2 CH2 L235E 3')。PCR2包含使用引子C4m2-5(IgG4突變體2 CH2 L235E 5')及引子C4E2。PCR3包含使用引子C4E1及C4E2。接著，將PCR3之產物連接至市售載體中，接著用BamHI消化。使用限制性消化來檢查定向且驗證最終序列。

G4H及G4D重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別在圖1B及圖1C中列出。G4H之恆定區序列中之加粗P表示置換原生TNX-355 Vh序列之鉸鏈區中位置228處之絲胺酸的脯胺酸。此鉸鏈突變防止原生IgG4之股分離特徵。除Pro至Ser突變以外，G4D亦含有在位置235處麩胺酸取代白胺酸，其中Fcγ受體結合改變，進而降低IgG4之效應功能。

另外，將取代引入G4H及G4D之核酸序列中以使用供在哺乳動物細胞(諸如NS0細胞)中表現用之更佳密碼子。重鏈及輕鏈之優化核酸序列呈示於圖2中。圖3描繪與親本TNX-355核酸序列相比較核酸序列之變化。無胺基酸由此等取代改變。

實例2

根據上述方法製備對CD4具有結合親和力之IgG1抗體。命名為MV1之抗體在IgG1恆定區之位置234處白胺酸變成麩醯胺酸，在IgG1恆定區之位置235處白胺酸變成甘胺酸且在IgG1恆定區之位置331處脯胺酸變成絲胺酸。

為產生IgG1 MV1，首先由PCR擴增3kb IgGγ1恆定區基因組DNA片段且將其選殖至市售載體中且接著定序。接著，藉由使用WT IgG1作為模板，在L234F、L235E及P331S處引入取代。下表提供用於在MV1之IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列中產生取代之引子的序列。

為產生3kb IgGγ1恆定區基因組DNA片段，在PCR反應中在含有IgGγ1之載體模板存在下使用引子CE1(5'引子，具有SpeI位點)及CE2(3'引子，具有FseI位點)。選殖此PCR產物且驗證序列。

A.L234F及L235E取代(片段1)的產生

進行三個PCR反應以產生L234F及L235E取代。PCR1反應包含在上述IgG1 DNA片段存在下使用引子CE1及引子CE4(3'引子，L234F、L235E)。PCR2反應包含在上述IgG1 DNA片段模板存在下使用引子CE5(5'引子，L234F、L235E)及CE3(具有DrdI之3'引子)。PCR3反應包含在PCR1+PCR2產物存在下使用引子CE1及CE3以產生片段1。

B.P331S取代(片段2)的產生

進行三個PCR反應以產生P331S取代。PCR1反應包含在IgG1 DNA片段模板存在下使用引子CE7(5'引子，具有DrdI位點)及引子CE9(3'引子P331S)。PCR2反應包含在IgG1 DNA片段模板存在下使用引子CE8(5'引子P331S)及引子CE6(3'引子，具有SfiI位點)。PCR3反應包含在PCR1+PCR2產物存在下使用引子CE7及引子CE6以產生片段2。

C.選殖片段1及2以產生MV1

用SpeI及DrdI消化片段1。用DrdI及SfiI消化片段2。亦用SpeI及SfiI消化含有3kb IgG1 DNA片段之載體。將片段1及片段2連接至載體中，進而用含有經取代胺基酸之片段置換原始序列中之區段。接著驗證序列。

實例3

此實例展示絲胺酸228變成脯胺酸之G4H抗體與親本TNX-355相比具有類似抑制特性及血清穩定性。

使用QIAamp分離套組(Qiagen,Hilden,Germany)自患者血清提取HIV RNA且將其用於產生具有隨機六聚體引子之cDNA(RT-PCR之上標第一股合成系統(SuperScript First Strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen,Carlsbad,CA))。使用巢式PCR程序以下列外部PCR引子特異性擴增HIV包膜蛋白開放閱讀框架序列： 5'-GGCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAA-3'(SEQ ID NO：34)及5'-CTGCCAATCAGGGAAGTAGCCTTGTGT-3'(SEQ ID NO：35)

該等外部PCR引子分別引發包膜開放閱讀框架之上游239鹼基及下游349鹼基起始合成。用於擴增包膜開放閱讀框架之內部引子為：5'-GATCGAATTCACGCGTAGCAGAAGACAGTGGCAATGA-3'(SEQ ID NO：36)及5'-GATCGTCGACTCTAGATTTTGACCACTTGCCACCCAT-3'(SEQ ID NO：37)

此等引子分別引發包膜開放閱讀框架之密碼子2處及緊接包膜終止密碼子下游起始合成。所得PCR產物代表來自存在於兩個樣本PT1 D1(第1天)及PT1 W9(第9週)中之HIV病毒之包膜序列的群體。接著用適當限制酶消化該等PCR產物且將其選殖至市售表現載體中。

自來自(第1天)或(第9週)之載體之來源於患者之HIV包膜蛋白群體構築為達成此實驗目的之HIV報導體病毒。藉由用上述包膜載體及編碼螢光素酶報導體基因之包膜缺陷前病毒DNA共同轉染人類胚胎腎細胞株HEK293FT(Invitrogen,Carlsbad,CA)來產生報導體病毒。在補充有10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)之杜貝卡氏改良依格氏培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中繁殖細胞。使用脂質體轉染劑2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行轉染。轉染後48小時收集培養物上清液且經0.45微米過濾器將其過濾，接著感染靶細胞。此瞬間轉染使得產生包含螢光素酶報導體基因及來源於上述包膜蛋白載體中之一者之包膜蛋白的新病毒粒子。

在表現人類CD4受體及人類CCR5趨化激素受體之人類惡性神經膠質瘤(U87)靶細胞中進行病毒感染。將靶細胞以3000個細胞/孔之密度接種至96孔盤中之補充有10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)之 杜貝卡氏改良依格氏培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中且培養18-24。接著將靶細胞暴露於上文所產生之病毒且在40-80微升之最終體積中與不同濃度之G4H或TNX-355抗-CD4 MAb混合。藉由在25℃下以1200×g使96孔盤離心1.5-2.0小時(亦即，旋轉接種(spinoculation))觸發感染。旋轉接種後，添加培養基至每孔80微升之最終體積且將受感染之培養物在37℃下培育3天。3天後，如由製造商所述，使用螢光素酶報導體基因檢定試劑(Promega,Madison,WI)量測靶細胞中所表現之螢光素酶含量。結果展示於圖4中。

實例4

此實例證實與獼猴中之原生TNX-355相比，MV1、G4D及G4H之血清半衰期大體上增加。將自兩個不同細胞株製備之TNX-355 MAb投與兩組猴子。如下表中所指示，將G4H、G4D及MV1各自投與一組猴子。對於組1及組2而言以5.2mg/mL之濃度且對於組3、組4及組5而言以3.4mg/mL之濃度製備MAb之水溶液。基於體重確定個別動物之劑量體積。限制對猴子給藥但不使其鎮靜。以團式靜脈內注射形式將劑量投與隱靜脈或頭靜脈中。給藥當天指定為研究第1天。

在給藥前及給藥後15分鐘、1小時、2小時、4小時、24小時、48 小時、72小時及96小時時間間隔及在第7天及第10天自每隻猴子收集血樣。超出第10天後數天提取樣本，但猴免疫系統所產生之抗體量干擾檢定且由此可不使用來自此等樣本之資料。在特定時間點中之每一者處，經由外周靜脈自每隻動物收集約1ml血液且根據標準技術處理成血清。豎直儲存所有血清樣本以避免與橡膠塞子接觸；在-20℃下或低於-20℃儲存樣本。

使用二價ELISA來定量單特異性二價MAb。一般而言，本發明方法涉及在適當條件下且持續允許結合之足夠時段將樣本與捕捉劑及偵測劑一起培育，其中對所結合之免疫複合物的偵測與樣本中所存在之二價抗體之相對量直接成比例。

檢定使用抗獨特型抗體以捕捉與偵測二價抗體。將二價抗體夾在與固體支撐物結合之捕捉劑與用可偵測標記作標記、處於液相中之偵測劑之間。僅二價抗體能夠形成可偵測之複合物。樣本中所存在之單價抗體能夠結合與固體支撐物結合之捕捉劑或存在於液相中之偵測劑。在洗滌步驟期間自固體支撐物移除未與固體支撐物上之捕捉劑結合之單價抗體及其他物質。該檢定不偵測與捕捉劑結合而未與偵測劑結合之分子，從而允許特異性定量二價分子。

對於捕捉步驟而言，用捕捉劑塗佈固體支撐物。捕捉步驟中所使用之捕捉劑可與固體支撐物直接或間接連接。用10μg/ml抗-Id-抗-CD4單株抗體塗佈盤。在磷酸鹽緩衝生理食鹽水中將抗體稀釋至10μg/ml以製成塗佈溶液。將200μl塗佈溶液添加至Costar 96孔盤之各孔中且在加濕箱中培育16-24小時。抽吸盤且藉由在紙巾上拍擊該等盤移除過量溶液。將200μl阻斷溶液(10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)，含有0.5% ProClin-300(Supelco)、1% BSA及2.5%蔗糖)立即添加至各孔中且將盤在加濕箱中培育隔夜。接著抽吸盤且移除過量溶液，隨後在室溫下乾燥。將經乾燥之盤密封於塑膠袋中且儲存於2-8℃下。

根據製造商之說明(Zymed Laboratories)使用活化過氧化物酶製備HRP接合之抗-CD4抗體。在具有1%牛血清白蛋白(BSA)之50%甘油/PBS中製成100μg/ml之結合儲備液且將其儲存於-20℃下。藉由在相同緩衝液中進一步稀釋儲備溶液以製成50×溶液來製備工作稀釋液。檢定中所使用之最終濃度為143ng/ml抗-CD4-HRP(在含有1% BSA、0.05% TWEEN® 20及0.5% ProClin-300(Zymed)之50mM Tris緩衝液(pH 7.4)中以1：700稀釋之原始儲備液)。

對於單一檢定操作使用兩個微量滴定盤。一盤為未經塗佈之低結合性圓底盤且另一者為經抗-Id-抗-CD4塗佈之盤。首先將樣本添加至未經塗佈之盤中且接著轉移至經抗-Id-抗-CD4塗佈之盤以藉由減少將樣本添加至孔中所需之時間來消除任何時間位移效應。將10μl參考、對照或樣本添加至未經塗佈之96孔盤之每孔中。每份參考及樣本使用三個孔。使用多通道吸液管將60μl檢定緩衝液(50mM Tris緩衝液(pH 7.4)，含有1% BSA、0.05% TWEEN® 20及0.5% ProClin-300)吸入含有參考或樣本之未經塗佈盤之各孔中。在上述檢定緩衝液中製成抗-Id-抗-CD4-HRP接合物之稀釋液(6毫升/盤)且將其傾至儲集器中。稀釋因子係基於以1：700稀釋或143ng/ml之接合物批次。使用多通道吸液管將50μl經稀釋之接合物吸入經抗-Id-抗-CD4(10μg/ml)塗佈之盤的各孔中。使用多通道吸液管將來自未經塗佈盤之各孔之樣本與檢定緩衝液之50μl等分試樣混合物轉移至每孔含有50μl抗-Id-抗-CD4接合物之經抗-Id-抗-CD4塗佈之盤中。

在室溫下將檢定盤於700rpm之震盪器上培育90±5min。在含有0.9% NaCl、0.05% TWEEN® 20及0.5% ProClin-300之50mM Tris緩衝液(pH 7.4)中洗滌檢定盤。將各孔洗滌4次。使用多通道吸液管將100μl TMB吸入各孔中且在室溫下將各盤於700rpm之震盪器上培育10min。將100μl停止溶液(0.2N H₂SO₄)添加至各孔中且將盤暫置於盤震 盪器上。在450nm下使用590nm作為參考濾波器、使用REVALATION®軟體中所設置之程式在Dynex盤讀取器中讀取各孔之OD，使用針對對數變換濃度及對數變換OD之線性回歸使其擬合為校正曲線。

使用標準競爭ELISA測定每隻猴子之MAb之血清濃度以定量總MAb。在此檢定中，將塗佈於固相(諸如微量滴定盤)上之二次抗體山羊抗小鼠IgG(Fc特異性)用作捕捉劑。參考或測試樣本中之MAb與經辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記之MAb競爭針對抗-CD4抗體之抗獨特型抗體上之有限結合位點，該抗-CD4抗體隨後由塗佈於盤上之二次抗體捕捉。接著可藉由添加TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)作為HRP之受質來偵測孔中之此複合物。

用可與固體支撐物直接或間接連接之山羊抗小鼠IgG(Fc特異性)塗佈該固體支撐物。使用如上所述之活化過氧化物酶製備經HRP標記之抗-CD4抗體。將20ml參考、對照或樣本(經稀釋或未經稀釋)添加至經山羊抗小鼠IgG Fc塗佈之微量滴定盤之每孔中。隨後，添加50ml待測試之抗體-HRP(亦即，TNX-355-HRP、G4H-HRP、G4D-HRP或MV1-HRP)，接著將50ml抗獨特型抗體添加至各孔中。在室溫下將盤於震盪器(約700rpm)上培育90分鐘。使用含有0.9% NaCl、0.05% TWEEN® 20及0.5% ProClin-300之50mM Tris緩衝液(pH 7.4)將檢定盤洗滌4次。將100ml TMB受質溶液添加至各孔中且在室溫下以700rpm培育10分鐘。將100μl停止溶液(0.2N H₂SO₄)添加至各孔中且將盤暫置於盤震盪器上。在450nm下使用590nm作為參考濾波器讀取各孔之OD。使用REVALATION®軟體中所設置之程式在Dynex盤讀取器中分析資料，使用針對對數變換濃度及線性OD之四個參數(4PL)使其擬合為校正曲線。

二價MAb對於總抗體之百分率展示於圖5中。與總MAb相比， TNX-355、MV1、G4D及G4H之二價形式之各別半衰期以條形圖形式呈示於圖6中。

實例5

此實例證實G4H抗體的表現可藉由將編碼供哺乳動物細胞表現用之更盛行密碼子之核苷酸取代至G4H基因中而得以改良。將該等改良與TNX-355之未經修飾基因相比較。核苷酸取代於圖3中指示。

使NS0-eu細胞在哺乳動物細胞培養基(例如DMEM)中生長至10⁶個細胞/毫升之密度。將細胞維持於指數生長期中，且轉染前一天更換培養基。轉染當天，將40×10⁶個細胞洗滌且收集於0.8ml之DMEM+2% FBS中。接著，將10μg線性化核酸(諸如輕鏈DNA)及10μg(例如)線性化重鏈DNA添加至細胞懸浮液中(總DNA體積應小於50μl)且將培養物於冰上培育15min。將DNA及細胞混合物轉移至經冷卻之BioRad比色管(0.4cm)且施加電脈衝(750V及25μF)。電脈衝之後立即將比色管置於冰上且於冰上保持10-15min。將細胞以0.3-0.4×10⁶個細胞/毫升之密度收集於DMEM+2% FBS中歷時48小時。將所回收之細胞以0.1×10⁶個細胞/毫升(200微升/孔)之密度於DMEM+2% FBS+0.1μg/ml HXM溶液(次黃嘌呤、黃嘌呤及黴酚酸)+150μg/ml G418中塗鋪。將細胞在CO₂下培育12-16天或直至群落出現為止。由ELISA測試所培養之懸浮液中生長之細胞群落或細胞之上清液(捕捉抗體為山羊抗人類k且偵測抗體為山羊抗人類FcHRP標記抗體)且將陽性轉染瘤選殖至新鮮培養基中。為進一步篩選陽性轉染瘤，進行滴定ELISA或Biacore檢定。將擴展之轉染瘤維持於震盪器燒瓶中。

自來自原始序列及來自密碼子優化序列之TNX-355轉染瘤而得之效價以圖表形式展示於圖7B中。此實例證實TNX-355的表現可藉由將密碼子選擇優化成供哺乳動物細胞用之更佳密碼子而得以增加。在圖7A之圖表中將表現優化G4H序列之轉染瘤之效價與原始TNX-355序列 之效價相比較。

實例6

如由圖9A及圖9B中所呈示之數據所說明，此實例證實MV1及G4D具有類似及大體上降低之CD4受體內化，而G4H似乎類似於TNX-355內化。藉由降低由抗-CD4抗體所佔據之CD4受體之內化率及及週轉率，抗體之半衰期得以改良。

自健康志願者獲得白血球層細胞(Gulf Coast Blood Center,Houston,TX)。以標準Ficol-Hypaque梯度法分離人類外周單核細胞(PBMC)。在4℃下於96孔盤中培養PBMC(0.5×10⁶個細胞/孔)。在存在/不存在單株抗體(10μg/ml)G4H(帶有S228P取代之IgG4)、G4D(帶有S228P及L235E取代之IgG4)、MV1(帶有L234E、L235G及P331S取代之IgG1)及/或同型對照之情況下各孔含有0.2ml補充有10% FBS之RPMI 1640。30分鐘後，用補充有10% FBS且無抗體之新鮮、冷RPMI1640置換培養基。將細胞轉移至含有5% CO₂之37℃加濕組織培養箱中。將細胞轉移至37℃後立即、2小時或24小時後收集經單株抗體處理之細胞。將細胞用PBS洗滌一次且在含有1% BSA之冷PBS(PBSB)中培育30分鐘。接著用經PE接合之抗人類CD4(BD Biosciences)將細胞染色。30分鐘後，將細胞用PBSB洗滌3次且於1%三聚甲醛溶液中固定隔夜。次日，用BD FACSCalibur^TM系統流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)分析CD4。

分析PMBC淋巴細胞。"無抗體"對照及同型對照抗體在時間O處及兩小時處不引起CD4內化。在淋巴細胞中，G4D(雙重突變體)不引起CD4內化。然而，G4H突變體致使CD4內化。MV1在任一細胞類型中兩個多測試時間點內不引起CD4內化。以對照百分比形式計算圖9中之數據：

應瞭解，本文所述之實施例之各種變化及修改對熟習此項技術者而言將顯而易見。該等變化及修改可在不悖離本發明主題之精神及範疇的情況下及不減少其所欲之優勢的情況下作出。因此希望該等變化及修改由隨附申請專利範圍所涵蓋。

<110> 美商建南德克公司

<120> 高效、穩定且非免疫抑制之抗-CD4抗體

<130> CASE 1131(12279-167-185)

<140> 高效、穩定且非免疫抑制之抗-CD4抗體

<141>

<160> 37

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之可變輕鏈序列

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之輕鏈恆定區

<400> 2

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之重鏈可變區

<400> 3

<210> 4

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之重鏈恆定區

<400> 4

<210> 5

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之重鏈恆定區

<400> 5

<210> 6

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4D之重鏈恆定區

<400> 6

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MV1之重鏈恆定區

<400> 7

<210> 8

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4D胺基酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 671

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MV1胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRL1

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRL2

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRL3

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRH1

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRH2

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNX-355之CDRH3

<400> 16

<210> 17

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 優化可變重鏈序列

<400> 17

<210> 18

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 優化可變重鏈序列

<400> 18

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 19

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 20

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 21

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 22

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 23

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 24

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 25

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 26

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 27

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 28

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 29

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 30

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 31

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 32

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 33

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 34

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 35

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 36

<210> 37

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引子

<400> 37

Claims (10)

1. 一種特異性結合CD4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)輕鏈可變區，其包含具SEQ ID NO：11之序列的CDRL1、具SEQ ID NO：12之序列的CDRL2及具SEQ ID NO：13之序列的CDRL3，(b)重鏈可變區，其包含具SEQ ID NO：14之序列的CDRH1、具SEQ ID NO：15之序列的CDRH2及具SEQ ID NO：16之序列的CDRH3；及(c)IgG4重鏈恆定區，其中位置228(EU編號系統)處之絲胺酸係以脯胺酸取代。
2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具SEQ ID NO：5之序列的重鏈恆定區。
3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：1之序列。
4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3之序列。
5. 如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具SEQ ID NO：38之序列的輕鏈。
6. 如請求項5之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具SEQ ID NO：8之序列的重鏈。
7. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係經人類化。
8. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：1之序列且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3之序列。
9. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合 片段包含具SEQ ID NO：38之序列的輕鏈。
10. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具SEQ ID NO：8之序列的重鏈。