CN105228650B

CN105228650B - 用于hiv预防和治疗的聚糖修饰的抗-cd4抗体

Info

Publication number: CN105228650B
Application number: CN201380073311.4A
Authority: CN
Inventors: R·宋; D·D·贺
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: WO2014100139A1; US20160362493A9; JP2016503059A; US20150166662A1; ES2862950T3; JP6408487B2; EP2934589B1; EP2934589A4; US9790276B2; TWI630215B; CN105228650A; TW201441258A; EP2934589A1

Abstract

本发明公开了具有N‑连接聚糖类连接至可变区的聚糖修饰的抗‑CD4单克隆抗体。本发明还公开了用于生产此类抗体的表达载体和细胞株，和此类抗体在HIV预防和治疗的用途。本发明一般而言涉及HIV的预防和治疗。本发明一般而言还涉及抗体的聚糖修饰。具体而言，本发明涉及用于HIV预防和治疗的聚糖修饰的抗‑CD4抗体。

Description

用于HIV预防和治疗的聚糖修饰的抗-CD4抗体

技术领域

本发明一般而言涉及HIV和治疗。本发明一般而言还涉及抗体的聚糖修饰。具体而言，本发明涉及用于HIV预防和治疗的聚糖修饰的抗-CD4抗体。

背景技术

HIV-1藉由病毒包膜(Env)糖蛋白gp120与T细胞受体CD4结构域1(D1) 交互作用的驱使进入体内。Ibalizumab(iMab)是一种有效及广域的HIV-1 中和性Ab(Jacobson etal.,Antimicrob.Agents Chemother.53:450-457,2009； Kuritzkes et al.,J.Infect.Dis.189:286-291,2004)，其主要藉由与宿主T细胞 CD4受体结构域2(D2)结合以中和HIV，因而阻断HIV利用这些CD4受体进入T细胞并产生感染的能力(Burkly et al.,J.Immunol.149:1779-178, 1992)。在最近的一大组基础分离株(118株包膜假型病毒)的检测中，以抑制50％感染为定义时，ibalizumab中和所有病毒的92％，而以抑制90％感染为定义时，中和47.4％的病毒。虽然ibalizumab可有效抑制大范围的HIV 分离株，但是有明显一部分的HIV变体仍可逃脱ibalizumab的抑制。近来的报告指出，HIV第一型包膜可变区5的天门冬酰胺酸连结聚糖化位点的丧失与ibalizumab之抗性有关(Toma et al.,J.Virology85(8):3872-2880,2011； Pace et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.出版前之电子版本：2012年9月)。

抗体恒定区之保留位置会被聚糖化，而连接至所述恒定区的聚糖类的存在及结构可影响抗体的活性(请见Wright and Morrison,TIBTECH 15: 26-32,1997之回顾)。

有报告指出，以N-连结糖导入重链而非轻链造成改进的溶解度 (Pepinsky etal.,Protein Sci 19,954-966,2010；Wu,et al.,Protein Eng Des Sel 23,643-651,2010)。在Pepinsky之文献中，修饰位于恒定区而非可变区。然而，先前的研究并未提供策略性地以聚糖置于抗体可变区的功效。

发明内容

本发明提供一种以轻链可变区的醣修饰增强单克隆抗体活性的新颖方法。在本发明之各具体实施方式中，提供适于生产所述抗体的聚糖修饰的抗-CD4单克隆抗体、表达载体及细胞株，以及所述抗体在HIV预防和治疗之用途。

一方面，本发明提供一种聚醣修饰的抗-CD4抗体，其具有一个或一个以上的N-连结聚糖类连接至该抗体之可变区。在本发明的一些具体实施方式中，该N-连结聚糖类连接至抗体之轻链可变区。所述聚糖类的连接是经由在该抗体可变区的一个或一个以上的工程化N-链接聚糖化位点而达成。

本发明的一具体实施方式中，该聚糖修饰的抗-CD4抗体是一种在可变区具有一工程化N-链接聚糖化位点的抗-CD4抗体的修饰型。在一些具体实施方式中，该工程化N-链接聚糖化位点位于抗-CD4抗体的轻链可变区，所述抗体诸如ibalizumab之野生型(WT)或修饰型、ibalizumab突变克隆或抗 -CD4抗体之修饰型。在一些特定的具体实施方式中，该工程化N-链接聚糖化位点位于ibalizumab轻链的胺基酸位置或其相对应的位置，所述胺基酸位置选自于由残基30E、52、53、54、60、65、67、76及其组合所组成之群组。在本发明中，该聚糖化位点位于选自由30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、 65Ser、67Ser及76Ser所组成群组之胺基酸位置。在一些实施方式中，该位于30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、65Ser或67Ser之聚糖化位点提供改进的活性。在本发明的一具体实方式中，该聚糖化位点位于位置52Ser。

本发明的一特定实施方式中，该抗-CD4抗体为ibalizumab之修饰型，其包含在轻链可变区一工程化N-链接聚糖化位点。

本发明之另一特定实方式中，该聚糖修饰的抗-CD4抗体为MV1之修饰型，其包含在轻链可变区一工程化N-链接聚糖化位点。

本发明之一具体实方式提供一聚糖修饰的抗-CD4抗体，称作LM52，所述抗体是以制备成具有CD4(抗-CD4IgG 1抗体)亲和性的IgG 1抗体，并在位置52导入N-链接聚糖而修饰。

本发明之另一具体实方式中，提供一种具有改进抗体再利用性 (recycling)的聚糖修饰的抗-CD4抗体，其具有如SEQ ID NO:4所述的轻链胺基酸序列，以及具有如SEQ IDNO:5所述的重链胺基酸序列。

一些具体实施方式中，该连接至抗体之N-连结聚糖类是由至少7个糖单元组成。在其他具体实施方式中，该N-连结聚糖类是由10至11个糖单元组成。

本发明的其他具体实施方式中，提供表达载体及宿主细胞，其适合用于表达在可变区具有一工程化N-链接聚糖化位点的抗-CD4免疫球蛋白链。

另一方面，本发明提供一种具有改进活性的聚糖修饰的单克隆抗体，其中该聚糖修饰的抗-CD4抗体具有如前面所定义连接的可变区的N-连结聚糖类。本发明的抗体或抗原结合片段有效抑制、治疗或/及预防标的细胞免于受人类免疫缺乏病毒第一型(humanimmunodeficiency virus type 1，「HIV-1」)的感染。

又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含一治疗有效量的本发明的聚糖修饰的抗-CD4抗体及至少一药学上可接受的载体。

又另一方面，本发明提供一种用于抑制、治疗及/或预防HIV感染及传输的方法，其包含将一药物组合物给药于一有需求的个体，其药物组合物包含一治疗有效量的本发明的聚糖修饰的抗-CD4抗体及至少一药学上可接的受载体。

最后方面，本发明提供一种具有改进活性的聚糖修饰的单克隆抗体，其包含连接至该抗体可变区的N-连结聚糖类，具体而言是该抗体的轻链可变区。

附图说明

本发明的前述摘要及下列详尽说明将因配合附图阅读而能有更佳的理解。为了阐释本发明，图式具体实施方式中所示的内容为优选的呈现。然而，应理解的是，本发明未局限于那些具体实施方式。

在图式中：

图1显示与Ibalizumab抗性相关联的V5潜在性N-连结聚糖化位点 (potential N-linked glycosylation sites，PNGS)的数目(横条代表中位数)。

图2显示V5 N端PNGS的缺少赋予HIV具有ibalizumab抗性。

图3显示V5 N端PNGS导入后对于HIV的ibalizumab敏感性的影响。

图4提供一图像显示所描绘的ibalizumab-CD4复合体的晶体结构，其显示数个ibalizumab轻链的胺基酸位置是基于与gp120 V5的接近距离进行突变以导入一N-连结聚糖化位点。

图5提供HIV-1gp120 V5之糖基化模型，其结合于CD4及ibalizumab(使用PyMOL)；其中该复合体模型是藉由CD4之D1与D2结合于gp120结构(蛋白质数据库登录号2NXY)及CD4结合于ibalizumab的相同结构域(PDB 3O2D)的重迭而产生；以及藉由相对应之天门冬酰胺酸与取自PDB 3TYG 之糖结合型天门冬酰胺酸之重迭而将糖(蓝色)导入天门冬酰胺酸；以及 ibalizumab的重链及轻链分别以青绿色及洋红色条带表示。人类CD4的前两个结构域为绿色，而HIV-1gp120为棕褐色；其中图5A显示Man₅GlcNac₂位于gp120 V5环状结构(N端)之位置459；以及图5B显示Man₅GlcNac₂位于 gp120 V5环状结构(C端)之位置463。

图6A-6D显示ibalizumab轻链(L链)之N-连结聚糖化，其中：

图6A显示该构建的ibalizumab L链突变体(LMs)、与WT ibalizumab重链(H链)质粒共同转染至293A细胞、在蛋白质-A琼脂糖管柱纯化，以及藉由SDS-PAGE分析(WTibalizumab以相同方法分析)。

图6B显示在变性条件下使用或不使用PNGase F处理的纯化的WT、 LM30E、LM53与LM52抗体，并以SDS-PAGE分析。

图6C显示产生于293A细胞中LM52L链上N-连结糖基的质谱分析。

图6D显示于聚糖类大小与中和活性之间所观察到的正相关。

图7显示WT ibalizumab及其LMs之中和活性；其中对于一组ibalizumab 抗性或部分ibalizumab抗性假型病毒株或具复制能力的HIV-1病毒株的中和作用是以TZM-bl试验所测定；96USHIPs9、BK132/GS009与96USHIPs7是具复制能力的病毒株；CAAN5342.A2-dd与AC10.0.29-dd为V5中不具任何 PNGS的定点包膜突变体并对于野生型ibalizumab的中和作用具有抗性或部分抗性；9015-07A1与1051-D927为B分支传染型初始传播病毒(数据代表三次独立实验)。

图8A-8C显示聚糖大小对于LM52之HIV-1中和活性的影响，其中：

图8A显示LM52在具有或不具衣霉素(tunicamycin)(LM52-T)或 kifunensine(LM52-K)的HEK293A细胞中产生；或者，LM52在N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I阴性GnT1(-)HEK293S细胞(LM52-G)中产生；该纯化的LM52蛋白质以及未修饰的LM52及WT ibalizumab是由SDS-PAGE分析。

图8B显示ibalizumab及LM52之不同聚糖变体对于三种ibalizumab抗性假型病毒的和活性，如TZM-bl细胞所测定。

图8C显示当标记在ibalizumab的残基52时，空间的描绘(使用PyMOL) 是由糖类之代表性构象及大小所填充。根据图5产生之模型进行描绘且颜色一致；其中该7环N-糖Man₅GlcNac₂取自PDB登录号3TYG。11环N-糖 Man₃GlcNac₅Fuc取自PDB登录号3QUM(所述结果代表三次独立实验)。

图9显示一组118株HIV-1套膜假型病毒的中和作用；其中LM52与WT ibalizumab的中和作用是以TZM-bl试验所测定；其中针对每株病毒，当Ab 之测试浓度达到10μg/mL时，黑色条带代表最大抑制百分比(maximum percent inhibition，MPI)，及相对应之IC₅₀(μg/mL)或IC₈₀(μg/mL)；病毒是以ibalizumab之MPI递减顺序排列；基于庞大的病毒数量，本实验仅进行一次。

图10显示LM52之HIV-1病毒株覆盖率。WT ibalizumab、LM52，以及 PG9、10E8、VRC01与NIH45-46G54W HIV-1mAb的病毒覆盖率。LM52及 ibalizumab的检测浓度达到10μg/mL，而其他单克隆抗体的检测浓度达到50 μg/mL。

图11提供LM52及ibalizumab对于一组118株不同HIV-1包膜假型病毒的中和活性的摘录，并以其IC₅₀(μg/mL)与IC₈₀(μg/mL)表示；其中红线代表几何平均值及95％信赖区间(每个点代表个别的病毒株)。

图12显示LM52和ibalizumab对于ibalizumab敏感性或ibalizumab抗性病毒的IC₈₀值(抗性之定义为IC₈₀>10μg/mL)。

图13A显示ibalizumab H链与L链的大小及其单、双与三糖变体的 SDS-PAGE分析。

图13B显示在TZM-bl细胞中ibalizumab、LM52及数个双或三糖突变体对于两个ibalizumab抗性假型病毒的中和活性。

图14A和14B提供LM52多重反应性(polyreactivity)的分析结果，其中：

图14A显示LM52及ibalizumab之HEp-2反应性，如同使用Quanta Lite ANA ELISA套组(INOVA Diagnostics)的ELISA测定所示；其中阴性对照组为一不含细胞核与细胞质抗原的抗体的人类血清；以及强与弱阳性对照组为已知分别具有丰富与小量细胞核与细胞质抗原的抗体的人类血清。

图14B显示LM52及ibalizumab对于单股DNA、双股DNA、胰岛素、脂多糖、KLH及CD4之反应性，如ELISA试验之测定；其中所述结果取自三次独立实验。

具体实施方式

本发明首次证实经由可变区的聚糖修饰可改进单克隆抗体之功能。具体而言，本发明发现移植聚糖类至一抗-CD4单克隆抗体之轻链可变区可复原一抗体与HIV之间的糖媒介交互作用，因此该具有聚糖修饰的抗体可有效抑制病毒分离株的感染，该病毒分离株在正常情况下可逃脱亲本抗体分子活性(无聚糖修饰)。

据此，本发明提供聚糖修饰的抗-CD4单克隆抗体、用于生产此类抗体的组分如表达载体及细胞株，以及此类抗体于HIV预防及治疗之用途。

定义

本文使用的术语「抗原」是指含有一个或一个以上的表位的分子，且其可引发免疫反应。本文使用的术语「抗原性分子」在一般意义上是指可作为本发明所公开的聚糖修饰蛋白质的结合标的的分子。

本文使用的术语「表位」，亦称作抗原决定簇，是指抗原性分子的一部分或可被免疫系统(亦即，B细胞、T细胞或抗体)所辨识的分子。表位可以是一构象表位或一线性表位。一构象表位是由抗原分子的不连续区段组成，或由多个分子组成。在抗原为蛋白质的情况中，构象表位可由该相同蛋白质分子的不连续胺基酸残基组成，或由该蛋白质的不同分子的胺基酸残基组成(例如，由蛋白质多聚体所组成的四级表位)。一线性表位由抗原的连续区段组成，例如，蛋白质抗原的胺基酸的连续序列。

本文所使用的术语「抗体」广泛地包括完整的抗体分子，其包括具有想要的活性或功能的完整的多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、嵌合、人源化、人类、灵长类、单链、单结构域、合成型与重组型抗体以及抗体片段。

本文所使用的术语「抗体片段」具体而言包括完整抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL与CH1结构域组成)、Fab'片段(其不同于Fab片段的地方是CH1结构域之C端具有额外少数残基，包括抗体铰链区(hinge region)的一个或一个以上的半胱胺酸)、(Fab')₂片段(由二个Fab'片段组成，其中铰链区以双硫键相连接)、 Fd片段(由VH与CH1结构域组成)、Fv片段(是指一重链与一轻链的可变结构域之二聚体，其以紧密、非共价方式连接，并含有完整的抗原辨识和结合位置)、dAb片段(由VH结构域组成)、单一结构域片段(VH结构域、 VL结构域、VHH结构域、或VNAR结构域)、分离的CDR区、scFv(或「单链Fv」，是指VL与VH结构域的融合物，其经由一连接符连接)，以及其他保留抗原结合功能的抗体片段。

本文使用的术语「可变区」是指抗体的抗原结合区，其在不同的抗体分子间具有很大的差异。未以相同方式变化的抗体区域且通常具有免疫系统效应子(effector)的功能者，称作「恒定区」。免疫球蛋白链(成熟型) 的大约前面110个胺基酸构成其可变结构域。重链的二个可变结构域 (variable domains of the heavy chain，VH)及轻链的二个可变结构域 (variable domains of the light chain，VL)构成抗体可变区。重链的六个恒定结构域(constant domains of the heavy chain，CH₁、CH₂与CH₃)和轻链的二个恒定结构域(constant domains of the light chain，CL)构成抗体恒定区。

本文使用的术语「CDR」或「互补性决定区」是指抗体可变结构域内的高度可变区。重链和轻链可变结构域各有三个CDRs，并由负责抗原结合的胺基酸残基所组成。本文使用的术语「框架区」或「FR(framework region)」是指可变结构域的更具保留性的部位，且是由高度可变区残基以外的残基组成。

本文使用的术语，抗体的「抗原结合位置」是指由一结合至抗原之抗体的胺基酸组成的构象和/或构造。举例而言，每一VH与VL结构域的三个 CDRs可交互作用以在VH-VL二聚体(dimer)表面上定义一抗原结合位置。总之，所述六个CDRs使抗体具有抗原结合的特异性。然而，应注意的是，一单一可变结构域(亦即，VH或VL)亦可辨识及结合抗原，尽管其功效低于全部六个CDRs位置的结合。

本文使用的术语「嵌合抗体」是指含有取自不同来源之多肽的抗体，例如，不同物种或不同抗体类型或子类型。嵌合抗体的实例包括以鼠单克隆抗体的抗原结合部位融合至人类免疫球蛋白的Fc片段。嵌合抗体的制造方法是本技术领域习知的；例如，Boss等人于美国专利号4,816,397及Cabilly 等人于美国专利号4,816,567所公开的方法。

本文使用的术语「人源化抗体」是指在人类免疫球蛋白骨架或框架中含有非人类序列要素的抗体。一般而言，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其受体的高度可变区(CDRs)残基是由非人类物种(供体抗体) 的高度可变区残基取代，所述非人类物种包括具有想要的特异性、亲合性和能力的小鼠、大鼠、兔子或非人类的灵长类。在某些情况中，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基亦可被非人类残基取代。在某些情况中，人源化抗体亦可含有未出现在受体抗体或供体抗体的残基，并可导入残基以进一步调整抗体性能。一般而言，一人源化抗体实质上包含所有至少一个，且典型地二个可变结构域，其中所有或实质上所有的高度可变区相对应于那些非人类免疫球蛋白及所有或实质上所有的框架区是那些人类免疫球蛋白序列。一人源化抗体亦可选地含有至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地如人类免疫球蛋白。人源化抗体之制造方法如本技术领域之文献所示；请见，例如，Winter之美国专利号5,225,539及Boss等人之美国专利号 4,816,397。

本文使用的术语「非人类灵长类抗体」是指在非人类灵长类免疫球蛋白骨架或框架中含有人类序列要素或非灵长类序列要素的抗体。举例而言，非人类灵长类抗体可由非人类灵长类免疫球蛋白(受体抗体)所制备，其藉由人类或非灵长类物种，例如，具有想要的特异性、亲合性和能力之小鼠、大鼠或兔子的供体抗体高度可变区残基取代其受体抗体高度可变区 (CDRs)残基。或者，藉由使用具有人类或非灵长类序列或不同灵长类物种序列的受体免疫球蛋白及将想要的灵长类Fc片段及/或残基(包括具体而言框架区残基)导入受体免疫球蛋白，以将非人类灵长类抗体制成适合给药于想要的灵长类物种的抗体。非人类灵长类抗体的实例包括本文实施方式一节所公开的「猴源化」抗体。

本文使用的术语「单特异性抗体」是指辨识及结合至一表位的抗体。

本文使用的术语「多特异性抗体」是指由至少二个单独抗体组成并结合至多个(亦即，二或多个)单独表位的抗体。

本文使用的术语「中和性抗体」是指抗体可抑制、降低或完全预防HIV-1 感染。可藉由以下实施方式一节所述之体外试验测定一抗体是否为中和性抗体。

本文使用的术语「有效中和性抗体」是指一抗体以低浓度使用时，可减少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的HIV-1感染。浓度低于50μg/ml、介于1与50μg/ml之间、或甚至低于1μg/ml者，皆视为「低浓度」。在一些具体实施方式中，低浓度为浓度位于皮莫耳(picomolar)范围者，例如10-900ng/ml，并包括此范围内之任何浓度，例如800、700、600、 500、400、300、200、100、75、50、25、10ng/ml，或甚至低于10ng/ml。

本文使用的术语「广域中和性抗体」是指一抗体对于HIV-1感染的抑制可达到所定义的体外50％感染抑制，甚至可抑制高于50％、60％、70％、80％、 90％、95％、99％、或更高之一大组(大于100)HIV-1包膜假型病毒与病毒分离株；举例而言，一大组分离株代表包膜具有地域、分化、向性及感染阶段等多样性。

本文所使用的术语「片段」是指生物分子一级结构的实际连续部分。在蛋白质的情况中，一片段可定义为蛋白质胺基酸序列的连续部分并可为至少3-5个胺基酸、至少6-10个胺基酸、至少11-15个胺基酸、至少16-24个胺基酸、至少25-30个胺基酸、至少30-45个胺基酸及至多为所述蛋白质之全长减去数个胺基酸。在多核苷酸的情况中，一片段被定义为多核苷酸的核酸序列的连续部分并可为至少9-15个核苷酸、至少15-30个核苷酸、至少31-45个核苷酸、至少46-74个核苷酸、至少75-90个核苷酸，及至少90-130个核苷酸。在某些具体实施方式中，生物分子的片段为免疫原性片段(immunogenic fragments)。

本文使用的术语「融合蛋白」是指二或多个不同来源的胜肽经由连接符彼此相连。举例而言，一融合蛋白可包括一蛋白质连接至一抗体。其他实例包括一抗体连接至一不同抗体或一抗体连接至一Fab片段。该Fab片段可连接至抗体的重链或轻链的N端或C端，或抗体内的其他区域。

「胜肽」是以酰胺(胜肽)键连接二或多个胺基酸所组成的任何化合物，通常是α-胺基酸之聚合物，其中每一胺基酸残基的α-胺基(除了NH2 端以外)以直链形式连接至下一残基之α-羧基。本文所使用的胜肽、多肽和聚(胺基酸)等术语皆同义地意指此类化合物而未局限其分子量大小，除非有另外说明。此类别之成员具有大分子量者也称作蛋白质并可包括抗体。

聚糖修饰的抗-CD4单克隆抗体

本文所公开的聚糖修饰方法可应用于抗-CD4单克隆抗体，其可为单特异性、多特异性、嵌合、人源化、人类、非人类灵长类、单链、及/或单一结构域抗体之单克隆抗体。本发明之方法亦可应用于抗-CD4单克隆抗体之片段，尤其是抗-CD4单克隆抗体之抗原结合片段。

抗-CD4抗体已在本技术领域中描述且亦可容易产生，这是因为CD4受体的蛋白质序列是本领域的技术人员习知的。CD4具有四个位于细胞外表面的免疫球蛋白结构域(D1至D4)，并以其D1结构域与主要组织兼容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)第二型分子之β₂结构域交互作用。在某些具体实施方式中，该抗-CD4抗体结合至一个或一个以上的D1、 D1-D2连结区、D2、D2之BC或FG环状结构，或其任何结合物。在特定具体实施方式中，本发明所公开的抗-CD4抗体主要针对所述CD4受体的类第二免疫球蛋白结构域(D2)(胺基酸位置98-180)。CD4的D2结构域的抗体具有想要的阻断HIV感染的特性而不会干扰CD4与主要组织兼容性复合体 (MHC)第二型分子交互作用所媒介之免疫功能。在其他具体实施方式中，本发明所使用的抗-CD4抗体结合至位于CD4受体D1-D2连结区附近的D2的BC环状结构(胺基酸121-127)之表位。又其他具体实施方式中，该抗-CD4 抗体结合至D2的FG环状结构(胺基酸163-165)及部分D1(胺基酸77-96)。该胺基酸编号对应于成熟型CD4受体的位置，但不包括信号肽。该人类CD4 受体之胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中胺基酸1-25代表一信号肽、胺基酸26-122构成D1，以及胺基酸123-205构成D2。

一特定具体实施方式中，该抗-CD4单克隆抗体为人源化抗体ibalizumab 或「iMab」(先前称作TNX-355或hu5A8)。Ibalizumab有效地阻断一广谱 (broad spectrum)的HIV-1分离株感染并标靶一位于CD4受体D1-D2连结区附近的D2的BC环状结构的表位，而不会干扰CD4与主要组织兼容性复合体 (MHC)第二型分子交互作用所调节的免疫功能。所述抗-CD4抗体之一实例在美国专利申请号5,871,732提供，在此全部通过引用并入本案以作为参考文献。

另一具体实施方式中，该抗-CD4抗体或其片段为具有改善的稳定性的ibalizumab突变体。一实施方式为该抗-CD4抗体之铰链区具有一个或一个以上的取代，其可防止链内双硫键形成，而所得的抗体分子具有令人惊讶地增进的二价稳定性，如WO2008134046(A1)所公开，其于2007年4月27日公开，在此通过引用并入本案以作为参考文献。

根据本发明之具体实施方式，所述抗-CD4抗体可由IgG 4或IgG 1所产生。在本发明一实施方式中，一具有CD4结合亲合性之抗-CD4IgG 1抗体被制备并命名为MV1。该MV1具有IgG 1恒定区的位置234之白胺酸(leucine) 至苯丙胺酸(phenylalanine)的变更、位置235之白胺酸至麸胺酸(glutamic acid)的变更，以及位置331之脯胺酸(proline)至丝胺酸(serine)的变更。该MV1的重链和轻链胺基酸序列分别如SEQ ID NOS:2-3所示。

本发明一些实施方式中，该抗-CD4抗体的重链Fc区或FcRn区可包含一个或一个以上的修饰以改进抗-CD4抗体的再利用性。一具体实施方式为该抗-CD4抗体包含如SEQ IDNO:5所示的重链胺基酸序列。

本文所公开的聚糖修饰涉及将聚糖类添加于一抗-CD4抗体可变区的内工程化N-链接聚糖化位点。在真核细胞中，聚糖类连接至由核糖体离开的新合成多肽的共有序列(consensus sequence)Asn-X-Ser/Thr中的天门冬酰胺酸残基。此种N-连结聚糖化过程为一酵素导向过程，其发生于内质网(ER) 及高尔基体(Golgi apparatus)。为了本发明之目的，所述共有序列 Asn-X-Ser/Thr中的Asn残基指的是「N-连结聚糖化位点」。本领域的技术人员可应用多种分子选殖技术以工程化一抗-CD4单克隆抗体可变区内N-连结聚糖化位点，其可包括一个或一个以上的胺基酸之插入、删除及/或取代以取得共有的N-连结聚糖化序列Asn-X-Ser/Thr。

一些具体实施方式中，一工程化N-链接聚糖化位点位于一抗-CD4单克隆抗体之轻链(VL)V结构域内。可考虑进行相关抗体、CD4受体及HIV gp120蛋白的三维结构模型分析以辅助确定抗体内的适合或更想要的N-连结聚糖化位点。如所描绘的，本发明证实，针对ibalizumab或其他抗-CD4 抗体，三维结构模型分析可将一N-连结聚糖化位点导入与CD4结构域1结合的HIV gp120蛋白的V5环状结构邻近的位置。

一些具体实施方式中，一N-连结聚糖化位点在ibalizumab之轻链胺基酸位置或其相对应之位置被工程化，那些位置是选自于残基30E、52、53、 54、60、65、67与76，及其组合。具体而言，所述胺基酸位置是选自于由 30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser及76Ser所组成群组之位置。根据本发明，为了在那些位置导入新的N-链接聚糖化位点，在「30E Gln」、「52Ser」、「53Thr」、「54Arg」、「60Asp」、「65Ser」、「67Ser」及「76Ser」代表的序列中所改变的每一个胺基酸位置显示如下：

30E Gln：30E Gln、31Lys、32Asn变更为30E Asn、31Ala、32Thr

52Ser：52Ser、53Thr、54Arg变更为52Asn、53Ser、54Thr

53Thr：53Thr、54Arg、55Glu变更为53Asn、54Ala、55Thr

54Arg：54Arg、55Glu、56Ser变更为54Asn、55Ala、56Thr

60Asp：60Asp、61Arg、62Phe变更为60Asn、61Ala、62Thr

65Ser：65Ser、66Gly、67Ser变更为65Asn、66Ala、67Thr

67Ser：67Ser、68Gly、69Thr变更为67Asn、68Ala、69Thr

76Ser：76Ser、77Ser、78Val变更为76Asn、77Ala、78Thr。

本发明实施方式中，胺基酸位置30EGln、52Ser、53Thr、54Arg、65Ser 及67Ser的个别或组合的N-链接聚糖化可提供一改进活性。在一特定实施方式中，该胺基酸位置为位置52Ser。那些胺基酸位置的编号是基于ibalizumab 的成熟型轻链(不含前面16个胺基酸信号序列)或其相对应的位置为基准。在特定具体实施方式中，在该ibalizumab轻链的30EGln、52Ser、或53Thr 之一者是工程化N-链接聚糖化位点。在一具体实施方式中，该工程化N-链接聚糖化位点位于胺基酸位置52Ser。

本发明之一具体实施方式中，一经修饰以改进稳定性的ibalizumab衍生性IgG1变体，称作MV1，是用于产生所述聚糖修饰的抗-CD4抗体。所述MV1 的重链及轻链分别具有如SEQ ID NOS:2及3所示的胺基酸序列。所述轻链的胺基酸位置52具有工程化N-链接聚糖化位点，其具有如SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。所述MV1重链的Fc区或FcRn区可具有进一步的修饰以改善抗体的再利用性。本发明的一具体实施方式是提供一具有改进活性及稳定性的聚糖修饰的抗-CD4抗体，包含如SEQ ID NO:4所述之轻链胺基酸序列及如SEQ ID NO:5所述之重链胺基酸序列。

一旦抗-CD4单克隆抗体可变区内之N-连结聚糖化位点被工程化，利用适当的重组表达系统可轻易产生此类抗体之聚糖修饰形式。举例而言，可将编码抗-CD4抗体轻链之表达载体转染至一适合抗体分子重组表达及能产生N-连结聚糖化之细胞株，其中该轻链的至少一可变结构域经工程化以纳入N-连结聚糖化位点。可收取含抗体的培养基上清液并进行任何适当的层析法以取得实质上纯化的抗体制备物。

本领域的技术人员容易取得适合抗体分子重组表达的细胞株，且一般而言能进行N-连结聚糖化。在真核生物中，所述N-连结聚糖化过程在转译作用时共同发生且该初始步骤发生于内质网膜腔面(luminal side)，其涉及将一Glc₃Man₉GlcNAc₂寡糖运送至新生多肽链。此前驱物结构随即进一步经一系列的糖苷酶(glycosidases)及糖基转移酶(glycosyltransferases)修饰。在以葡萄糖苷酶I与II移除三个葡萄糖残基后，以甘露糖苷酶I移除一特定的终端α-1,2-甘露糖。所述那些反应在最低等与最高等真核生物之间具有高度保留性。此时，正确折迭的Man₈GlcNAc₂ N-连结糖化蛋白可离开聚糖化机构；或者，其可继续并进行进一步的物种及细胞类型特异性加工，经由一系列的酵素催化以产生杂合体及/或复合体类型之聚糖类。请见图7A。亦请见例如，Wright与Morrison,TIBTECH 15:26-32(1997)之回顾；美国专利号6,602,684；以及美国专利号7,029,872，在此通过引用并入本案以作为参考文献。在高等真核生物中，进一步以数个α-1,2-甘露糖苷酶 (α-1,2-mannosidases)修整Man₈GlcNAc₂结构。随后，于GlcNAc转移酶I (GlcNAc transferase I，GnT-I)催化之反应中加入β-1,2-连结GlcNAc残基以修饰所得之Man₅GlcNAc₂ N-连结聚糖类，该所得的GlcNAcM₈GlcNAc₂结构导致最终「杂合体类型」N-连结聚糖类之形成。或者，以甘露糖苷酶II (mannosidase II，Man-II)作用于GlcNAcM₈GlcNAc₂结构，移除二个甘露糖，并随后以GnT-II加入第二个β-1,2-GlcNAc。所得之聚糖类结构称作「复合类型」N-连结聚糖类，其中以至少一GlcNAc残基修饰两个核心-α-甘露糖残基。可藉由GnT-IV、GnT-V及GnT-VIs附加至其他分支。半乳糖及唾液酸残基进一步分别以半乳糖转移酶及唾液酸转移酶附加。

根据本发明，附加至抗-CD4抗体可变区之N-连结聚糖类应包括至少7、 8、9、10、11或12个糖单元或「环」。本文使用的术语「糖单元」是指个别之糖分子彼此连接以于真核细胞形成原始N-聚糖类；也就是说，其包括葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺、半乳糖及唾液酸。该抗体的N-聚糖类之确切结构(亦即，其组成和一系列的连接)未必完全关键，只要该N-聚糖类包括至少7个单元。N-链接聚糖类之实例包括那些典型可见于哺乳类动物细胞的，例如，Man₈GlcNAc₂(末端的GlcNAc连接至Asn)、Man₅GlcNAc₂、 GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、 (唾液酸)₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂，以及美国专利号6,602,684所公开的二等分(bisected)双链复合体、三链复合体、三’链(tri'-antennary)复合体及四链复合体N-聚糖类(例如，请见该说明书之图1)，在此通过引用并入本案以作为参考文献。

根据本发明，适用于聚糖修饰抗体重组表达的细胞株为真核细胞，尤其是包括哺乳类动物细胞株如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO) 细胞、幼仓鼠肾脏(BabyHamster Kidney，BHK)细胞、(鼠骨髓瘤)NSO 细胞、鼠骨髓瘤SP2/0细胞、人类胚胎肾脏293(HEK293或293)细胞、小鼠胚胎纤维母细胞3T3，及其衍生的细胞株，只要衍生的细胞可有效表达具有N-连结聚糖化的重组型抗体。该等细胞有许多可购自美国组织培养保存中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)或商业管道。基因改造细胞产生具有聚糖形式改变的糖蛋白，例如，具有特定类别的N-连结聚糖类(例如，双链复合体N-连结寡糖)并以二等分N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) 修饰的糖蛋白，如美国专利号6,602,684所公开的，在此通过引用并入本案以作为参考文献，亦可用于生产本发明的抗体。其他适用的真核细胞可包括昆虫细胞及酵母菌细胞，例如面包酿酒酵母菌(S.cerevisiae)及嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)，包括具体而言基因改造酵母菌株以产生具有人类 N-聚糖类形式的蛋白质。请见，例如，美国专利号7,029,872及美国专利号 7,449,308，两者在此通过引用并入本案以作为参考文献。

根据本发明之实施方式，以酵素(例如，PNGase)处理分离自细胞培养基的抗体分子可将该N-连结聚糖类连接至细胞所生产的抗体分子。经前述处理所造成的抗体表观分子量改变(其可由SDS-PAGE、西方墨点法，及其类似物检测)显示N-链接聚糖类确实连接至抗体分子。N-连结聚糖类的分子量大小可以通过与已知分子量大小之N-连结聚糖类相比较来估计而得。在更详尽的分析方面，可藉由例如DNA定序仪辅助(DNA sequencer assisted，DSA)，荧光团辅助糖电泳法(fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis，FACE)，或MALDI-TOF MS分析连接至抗体之N-连结聚糖类，所有这些技术于本领域皆有完整文献。举例而言，于一DSA-FACE分析中，N-连结聚糖类是从聚糖化的抗体胜肽释出：以N-糖苷酶F(PNGase F) 处理。该释出的N-连结聚糖类随即于还原氨化反应中以荧光团8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐(fluorophore 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，APTS)进行衍生化。移除多余的APTS之后，以一ABI 3130DNA定序仪分析经标记的 N-链接聚糖类。请见，例如，Laroy等人(Nat Protoc.1:397-405(2006))，美国专利号6,602,684公开的重组所产生的蛋白质的N-连结聚糖类 MALDI-TOF MS分析，在此并入本案以作为参考数据。

可由多种功能性试验评估聚糖修饰抗体以确认其中和HIV的功效，包括测定抗体对于一大组病毒分离株的广度及效力的试验，如实施方式一节所述。

本发明的具体实施方式中，可确认的是一gp120N端之糖填补一 ibalizumab轻链与gp120 V5之间空出的空间，且ibalizumab对于HIV-1进入的作用是由此糖的空间上的质量效应所调节。在检测轻链具有不同PNGS位置的一组ibalizumab突变体对于体内中和HIV-1感染性的能力方面，发现在位于ibalizumab-CD4-gp120复合体V5附近之含糖ibalizumab突变体可有效中和 HIV-1。那些ibalizumab突变体亦可中和具有野生型ibalizumab抗性之HIV-1 病毒株。在本发明的一具体实施方式中，一ibalizumab的突变体LM52可100％中和受测之118株HIV-1分离株，其效用高于野生型ibalizumab十倍以上，此测试以IC₈₀几何平均值判定，也就是所述抗体浓度需中和80％之感染。其结果指出，ibalizumab藉由位组机制阻断HIV-1进入，并提供一策略性置入N- 连结聚糖化位点能够如何被用于改进单克隆抗体活性的实例。

基于本发明的发现，其指出糖附加(glycan-addition)方法可用于提升单克隆抗体的功能活性。利用结构-活性关系(structural-activity relationship， SAR)，可想象在抗体关键位置上增加体积可改进活性，以产生优选的单克隆抗体产物。

在本发明之一些具体实施方式中，其可能需要产生实质上同质的N-连结聚糖类抗体或同一类型N-连结聚糖类。「实质上同质」一术语是指在抗体分子制备物上有至少50％、60％、75％、80％、85％、90％或甚至95％之N- 连结聚糖类具有相同结构、相同大小(也就是相同分子量，或者，相同数量之糖「环」)，或相同范围之大小(例如，9-12个「环」、或10-11个「环」) 及/或种类。此目的可藉由使用基因工程细胞株以表达或过度表达一组经选取涉及N聚糖化的酵素(请见，例如，美国专利号6,602,684及美国专利号 7,029,872，在此通过引用并入本案以作为参考文献)，或于N聚糖化作用途径之中间阶段破坏酵素(例如，GnT1剔除细胞株)，或使用一个或一个以上的标靶特定加工酵素之抑制剂，或其组合来达成。抑制剂之实例包括 Kifunensine、DMJ(即「deoxymannojirimycin，脱氧甘露糖野尻霉素」)及苦马豆素(Swainsonine)。

药物组合物

可藉由混合抗体和一个或一个以上的任选的药学上可接受的载体以制备含有本发明所公开的聚糖修饰抗体的药物组合物。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、等张剂及其类似物。载体可为液体、半固体(例如，糊状物)，或固体载体。载体之实例包括水、盐类溶液或其他缓冲液(例如，磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液)、油、醇类、蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶)、糖类(例如，单糖、双糖及其他糖类，包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇或糊精)、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、黏合剂、填充剂、涂料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫胺酸、螯合剂如EDTA；成盐抗衡离子(salt formingcounter-ions)如钠离子；非离子型界面活性剂如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，或其结合物。

药物组合物可包含以大于一者的活性化合物(例如，一个或一个以上的抗体)结合一个或一个以上的额外之有益化合物以抑制、预防及治疗HIV 感染。

可由任选的便利及实际的方式结合活性成分及载体，例如藉由混合物、溶液、悬浮液、乳化、包囊、吸收及其类似物，并可制成适于注射、摄入、输注或其类似物的制剂，例如锭剂、胶囊、粉末(包括冻干粉末)、糖浆及悬浮液。亦可制成缓释制剂。

治疗及预防之方法

另一方面，本文所公开的聚糖修饰的抗体，任选地配合药学上可接受的载体来供应，是应用于治疗及预防个体的HIV感染，以及预防HIV的传输。

本文使用的HIV感染之「治疗」一术语是指有效抑制HIV感染以延迟发病、减缓进展、降低病毒载量，及/或改善HIV感染造成之症状。

本文使用的术语「HIV感染预防」是指延迟HIV感染的发生，及/或降低或消除HIV感染的发生率或可能性。

本文使用的术语「HIV传输预防」是指降低或消除HIV由一个体传输至另一个体之发生率或可能性(例如，怀孕、分娩或生产期间由HIV阳性母体传输至胎儿，或母乳哺育；或由HIV阳性个体传输至HIV阴性伴侣)。

本文使用的术语「个体」是指任何灵长类动物个体，包括人类及非人类个体(例如，恒河猴个体)。

为抑制、治疗及/或预防HIV感染，一本文所公开的聚糖修饰的抗体的治疗有效量是给药于有需求的个体。

本文使用的术语「治疗有效量」是指HIV感染抑制所需的有效剂量以治疗及/或预防HIV感染。该抗体剂量取决于疾病状态及其他临床因素，例如个体的体重及条件、个体对治疗的反应、制剂类型及给药途径。治疗有效及无害的准确剂量可为本领域之技术人员所决定。常规上，成人的非肠道抗体给药的合适剂量范围为每日约0.1至20mg/kg病患体重，每周一次或甚至每月一次，其中所使用的典型初始范围为约2至10mg/kg。由于抗体最终会在血流中清除，再次给药可能是需要的。或者，可使用控制释放基质以提供抗体输注或注射。

抗体可由标准途径给药于个体，包括口服、透皮或非肠道(例如，静脉、腹腔、皮内、皮下或肌内)。此外，该抗体可由注射或手术移植或固位 (attachment)导入体内，因此一显著量的想要的抗体是能以控制释放方式进入血流的。

序列表

SEQ ID NO:1：人类CD4受体的胺基酸序列(胺基酸1-25代表一信号肽、胺基酸26-122构成D1，以及胺基酸123-205构成D2)：

MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLL SEKKTCQCPHRFQKTCSPI

SEQ ID NO:2：MV1重链的胺基酸序列(471个胺基酸，包括前面19个胺基酸残基构成的前导序列)：

MEWSGVFMFLLSVTAGVHSQVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SEQ ID NO:3：MV1轻链的胺基酸序列(238个胺基酸，包括前面19个胺基酸构成的前导序列)：

SEQ ID NO:4：LM52轻链的胺基酸序列：

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWANSTESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:5：具有改进的抗体再利用性的经修饰MV1重链的胺基酸序列(452个胺基酸，其中有二个修饰位置)：

QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSH YTQKSLSLSPGK*

一些特定具体实施方式的说明目的在提供足够的信息，使他人可利用现今之知识而易于变更或修改并进行各种应用，那些特定具体实施方式未背离通用概念，因此那些修改或变更应该且目的在于所公开的具体实施方式的相当意义和范围内能充分理解。应理解的是，本文所使用的用语或术语的目的在于说明而不是局限。在图示及说明中，揭示了示例性具体实施方式，虽然可能使用特定术语，除非有特别指明，仅为通用及描述意图且目的并非在于局限，因此本发明主张的范畴不受局限。此外，本领域的技术人员将理解的是本文提到的方法的某些步骤可能会以另一顺序编排或步骤可能重新组合。因此，本发明所附的权利要的目的不是为了局限于所公开的具体实施方式。

实施方式

材料及方法

1.细胞株、试剂、及假型病毒

TZM-bl细胞(目录编号8129)取自美国国家卫生研究院(NIH)过敏与传染性疾病国家研究所(NIAID)AIDS部门的AIDS研究与参考试剂计划 (AIDS Research and ReferenceReagent Program，ARRRP)。所述细胞为经基因工程之HeLa细胞株，其表达CD4、CXCR4及CCR5并含有对Tat反应的报导子(Tat-responsive reporter)基因以用于在HIV-1长末端重复序列的控制下启动荧光素酶和β-半乳糖苷酶。来自急性及早期感染的B亚型HIV-1包膜选殖株及包膜缺失骨架质粒(SG3ΔEnv)之标准参考规模(Standard Reference Panels)亦取自NIH ARRRP。HIV-1包膜假型病毒是以具有包膜表达质粒及 SG3Δenv之293A细胞(Invitrogen)共同转染所制备。含有人类CD4的全长细胞外结构域的重组型sCD4获自于Progenics Pharmaceuticals,Inc. (Tarrytown,NY)。Ibalizumab蛋白质是由TaiMedBiologics(Irvine,CA)所提供。质粒pMV1及pLC，分别编码ibalizumab H链及L链，是由cDNA所放大(amplified)并选殖至pCDNA3.1(+)(Invitrogen)。N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I-阴性GnT1(-)人类胚胎肾脏(HEK)293S细胞是取自ATCC(目录编号CRL-3022)。

2.将N-连结聚糖化位点加至抗-CD4抗体L链

藉由突变作用导入Asn-Ala-Thr(LM30E、LM53、LM54、LM60、LM65、 LM67与LM76)或Asn-Ser-Thr(LM52)序列以在如WT ibalizumab或MV1 的抗-CD4抗体的轻(L)链建立突变体。突变作用是以Quikchange突变作用试剂盒(Stratagene,Santa Clara,VA)所进行。该L(轻)链突变体(LM) 构建体是由抗-CD4IgG1抗体(例如，MV1)所产生，且随即进行定序并利用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)-DNA复合体短暂转染至HEK293A 细胞(重链与轻链质粒的比例为1:1)。在转染后第5天收取上清液并以蛋白质-A琼脂糖(protein-A agarose)(Thermo Scientific,Rockford,IL)管柱纯化 LM蛋白。在进行SDS-PAGE分析之前，于变性条件下以PNGase F(New England Biolabs,Ipswich,MA)处理WT ibalizumab及LM30E、LM52与LM53。

3.利用TZM-bl细胞之病毒中和试验

中和试验是根据Wei等人的方法(Wei et al.,Nature 422,307-312，2003) 并加以修改以进行。简单而言，细胞以每孔10,000个的数量种植于96孔盘，各孔内含补充有10％胎牛血清(D10)之100μL DMEM并整夜培养。隔日，将连续稀释的ibalizumab或LM蛋白加入该细胞培养基中并培养1小时。随后，以含DEAE-聚葡萄糖(DEAE-Dextran)的D10(Sigma,St.Louis,MO) 制备200X 50％-组织-培养-感染-剂量(50％-tissue-culture-infective-doses， TCID₅₀)之具复制能力的或假型HIV-1，并加入前述细胞。细胞培养48小时，并以Galacto-Star系统(Applied Biosystems,Cedarville,OH)测定β半乳糖苷酶的活性。病毒感染力抑制百分比是以1减去经抗体处理的孔与未处理的感染孔的比例再乘以100所计算。利用非线性回归分析计算IC₅₀及IC₈₀值(分别为具备50％及80％中和作用的抗体浓度)。

4.表面等离子体共振

利用Biacore T3000光学生物感测仪(GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行结合亲合性分析。根据标准胺耦合(amine coupling)流程进行ibalizumab 及所有聚糖变体的固定化。简而言之，以每分钟5μL的流速将含有0.2M N- (3-二甲基胺基丙基)-N-乙基碳二亚胺 (N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)与0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)的35μL溶液注入以活化感测芯片表面上的羧基。接着，将ibalizumab或其突变体以pH 4.5之10mM醋酸钠缓冲液配制成2 μg/mL浓度，并以每分钟10μL的速度流过芯片表面直到反应蛋白质之反应单位达到想要的程度(150-200RU)。将未反应的蛋白质洗去之后，以每分钟5μL流速将35μL之pH 8.0的1M乙醇胺注入，以将感测表面上过多活化的酯基加盖(capped)。在相同条件下产生省略蛋白质配体的参考物以作为背景值校正仪器及缓冲液假数值。结合实验是在25℃下于HBS-EP缓冲液 (0.01M HEPES、0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％vol/vol界面活性剂 P20(GE Healthcare))进行。结合动力学是以每分钟30μL流速将各浓度的分析物(人类sCD4蛋白)流过芯片表面3分钟以测定。芯片表面于第10分钟的时，可侦测结合分析物之解离。以每分钟50μL流速将pH 2.0之10mM甘胺酸-HCl(glycine-HCl)进行二次30秒之注入以移除残存的分析物。在动力学数据分析方面，利用BIAevaluation 4.1软件将局部覆盖的感应图集体拟合至1:1朗格谬尔结合模型(Langmuir binding model)以测定动力学参数。

5.LM52上N-连结聚糖化之鉴定

将3微克LM52蛋白质溶于50mM碳酸氢铵(ammonium bicarbonate， ABC)/50％四氟乙烯(tetrafluoroethylene)，并加入40mM二硫苏糖醇 (dithiothreitol，DTT)以进行还原反应。在65℃下培养1小时后，加入40mM 碘乙酰胺(iodoacetamide)，并在室温下避光反应1小时以进行蛋白质样本的烷化。所述反应是以加入40mM DTT并接着培养1小时所终止。接着，进行胰蛋白酶分解之前加入25mM ABC。蛋白质样本随即以0.2μg胰蛋白酶 (Promega)处理整夜。在进行LC-MS/MS分析前，将前述分解的蛋白质样本干燥并再溶解于20μL水。在抗体上N-聚糖类的指定方面，将所测得的经胰蛋白酶分解的抗体的质量与一结合预测的胰蛋白酶分解胜肽及N-链接聚糖类的数据库比对。以MS/MS光谱上出现的糖片段确认所指定之糖胜肽。在PNGase分解方面，LM52以PNGase F(New England Biolabs)处理整夜。

6.统计学分析

抗体功效差异评估是利用GraphPad Prism v5.03软件进行50％与80％抑制浓度之参数(Students配对t检定)分析。若P≤0.05，代表具有统计学上显著差异。

结果

实施方式1.

一组118株病毒分离株之序列分析显示ibalizumab抗性与gp120 V5环状结构潜在的N-链接聚糖化位点(potential N-linked glycosylation sites，PNGS) 的数目有关(Pace et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Epub ahead of print: Sept.2012)。如图1所示，V5中具有两个N-连结聚糖化位点的病毒对于 ibalizumab有敏感性，而V5中不具N-连结聚糖化位点之病毒则具有抗性。横条代表中位数。有趣的是，因ibalizumab单一药物治疗而发展出抗性的临床病毒分离株亦显示缺少潜在的V5聚糖化位点(Toma et al.,J.Virology 85(8): 3872-2880,2011)。

在所述组的一株野生型病毒(AC10.0.29)，其V5中具有二个N-连结聚糖化位点并自然对于ibalizumab有敏感性。利用定点突变有系统地删除此病毒的V5 N-链接聚糖化位点，所得的突变体病毒对于ibalizumab变得有抗性 (见图2)。

在所述组的另一野生型病毒(RHPA4259.7)，其V5中不具N-连结聚糖化位点并自然对于ibalizumab有抗性。所述病毒被修饰以将N-连结聚糖化位点有系统地加入V5。如图3所示，所得之突变体病毒对于ibalizumab变得有敏感性。

Ibalizumab、CD4及HIV gp120之重迭晶体结构分析显示该gp120 V5环状结构系相邻于ibalizumab轻链与CD4之间的交互作用位点。其他模型分析显示ibalizumab正常而言可经由位组抑制HIV，而gp120 V5上糖的缺少可允许病毒绕过此位组并躲避该ibalizumab之抗HIV活性。本发明假设在ibalizumab 上接近gp120 V5的位点(例如，V5 N端附近)附加N-连结聚糖位点可使经修饰的ibalizumab能中和正常情况下具有ibalizumab抗性的病毒。下列实验是为了验证此假设所进行。

根据ibalizumab-CD4复合体之晶体结构，基于其与gp120 V5假定的接近的距离选择数个ibalizumab轻链的胺基酸位点。那些胺基酸位点包括30E、 67、65、52、53、54、60及76，其编号是根据不具19个胺基酸信号序列(也就是一前导序列(leader sequence))的成熟型轻链，并遵照Kabat与Chothia 编号方法其亦计算原始编号未计算的胺基酸残基。举例而言，位置「30E」是指原始位置编号为30与31之间的一段胺基酸(30A、30B、30C、30D、30E、…)中的第5个胺基酸。将潜在的N-连结聚糖化位点导入这些位置的每一者(图6A )。如图6B 所示，突变体轻链之分子量皆高于野生型轻链(上面部分)，显示这些突变体存在有附加的糖。当以去糖基化试剂PNGase F处理突变体轻链时(下面部分)，其分子量降至正常ibalizumab野生型轻链之大小。这些数据证实，N-链接聚糖化位点确实被附加在突变体轻链。

实施方式2.Ibalizumab变体之设计

Ibalizumab抗性HIV-1病毒株的研究显示其抗性主要是来自HIV-1包膜 gp120 V5环状结构糖类的缺少。为了进一步探究V5糖基化在ibalizumab易感受性的角色，本发明利用蛋白质数据库(登录号2NXY与3O2D)所报告的结构仿真gp120、CD4与ibalizumab之间的交互作用。该V5 N端糖位点最靠近ibalizumab L链(图5A)，而该V5C端糖则较远离ibalizumab(图5B)。此模型提供一可能性，也就是将N端糖置入gp120与ibalizumab之间的空间会对gp120施加质量效应，因此破坏HIV-1进入标的细胞所必需的构象变化(扭型及弯曲)。此模型亦显示将类似大小的糖导入ibalizumab L链可提升其抑制缺少V5 N端糖的HIV-1病毒株的进入的能力。

因此本发明将PNGS导入ibalizumab L链可变区之残基(30E、52、53、 54、60、65、67及76)，那些残基靠近gp120 V5环状结构。那些ibalizumab L 链突变体(LMs)是经构建、定序及转染至293A细胞以产生突变体蛋白质。本发明以蛋白质-A琼脂糖层析法纯化变体mAbs，并以SDS-PAGE分析(图 6A)。于293A细胞短暂表达LMs的产率可与野生型ibalizumab的产率相比较 (数据未显示)。每一LMs相较于野生型L链可观察到稍大之L链。为了证实分子量变大是因为糖基化，在变性条件下以PNGase F处理LMs 30E、52与53 并以SDS-PAGE分析(图6B)。如所预期的，那些变体的L链在PNGase F处理后分子量减少成野生型之大小。本发明接着以质谱鉴定在293A细胞常规产生的LM52L链所导入的N-聚糖类形式。在L链上鉴定出超过六种形式之具有8-12个环之复杂型N-聚糖类，所述等形式中有80％为9-11个环(图6C)。将那些LM52突变体以中和试验检测，而它们的突变体差异在于其聚糖的大小。在所有三种受测病毒中，具有较大N-连结聚糖类的LM52突变体蛋白质被观察到具有较高的中和活性(图6D)。总之，那些数据证实N-链接聚糖类被导入想要的ibalizumab L链残基。

实施方式3.LMs之CD4结合作用及HIV-1中和作用

本发明接着以表面等离子体共振评估那些ibalizumab LMs对于人类可溶性CD4(sCD4)的结合动力学。在一使用sCD4作为分析物的Biacore试验中，WT ibalizumab及LMs两者与sCD4的结合作用具有类似的结合动力学。那些LMs的六者与sCD4的结合作用的K_D范围在0.19nM至0.8nM间(表1)，而那些数字在野生型ibalizumab K_D的2倍以内(0.43nM)。那些数据显示在 ibalizumab L链的那些特定位点附加N-连结聚糖不会明显影响其结合CD4的能力。

表1 Ibalizumab及其LMs于人类CD4的结合动力学

本发明接着探究该LMs相较于WT ibalizumab之HIV-1中和能力。为此，本发明检测该LMs对一组HIV-1病毒的中和能力，那些病毒对于ibalizumab 具有抗性或部分抗性，包括3种具复制能力型HIV-1病毒株(图7)。利用这组ibalizumab抗性病毒，当WT ibalizumab的测试浓度达到2μg/mL时，观察到平均MPI为75％及IC₈₀为1.43μg/mL。四种LMs(LM30E、LM52、LM53 与LM67)观察到明显改进之中和活性，其平均MPI为91-99％及IC₈₀为 0.05-0.14μg/mL(图7及表2)。其中，LM52似乎有最好的HIV-1中和功效。相较于ibalizumab，其他两个变体(LM54与LM65)产生较适度改进的病毒中和活性。有趣的是，该具有改进HIV-1中和活性之六个LMs的PNGS亦比HIV-1中和活性可比WT ibalizumab的LM60与LM76之PNGS更靠近gp120的V5(459)(表2)。因此，将N-聚糖类置于靠近V5似乎能改进ibalizumab变体的中和作用的情况。然而，本发明人注意到除了与V5之距离以外，聚糖的方向亦可扮演关键角色。

表2 Ibalizumab及其轻链突变体的比较

实施方式4.糖之大小影响LM52活性

本发明研究糖的大小是否影响LMs改进的HIV-1中和活性。此研究针对 LM52，因其具有优异的HIV-1中和作用情况(图7)。要产生一缺少任何N- 连结聚糖之LM52型，293A细胞以LM52构建体短暂转染之后，立即加入衣霉素(tunicamycin)，其抑制GlcNAc磷酸转移酶。同样地，为产生一标记有 10-11环糖(高Man型之N-糖Man₈GlcNAc₂(Man8)或Man₉GlcNAc₂(Man9)) 的LM52，本发明将kifunensine加入293A细胞。最后，为产生一具有7环糖(高甘露糖(Man)型N-糖Man₅GlcNAc₂(Man5))的LM52，使用N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I-阴性GnT1(-)HEK293S细胞。如SDS-PAGE所示，虽然加入kifunensine不会明显改变L链的大小，加入衣霉素在GnT1(-)细胞的生长明显减少L链的大小(图8A)。同样地，相较于kifunensine存在下所产生之抗体，在衣霉素存在下或生长于GnT1(-)细胞所产生的抗体对于三种 HIV-1病毒株的中和活性更严重降低(图8B)。因此，当L链残基52存在较大之聚糖类时，其观察到较强的HIV-1中和活性。仿真结果显示较大聚糖类较易置入L链与gp120之间的空间(图8C )，然而聚糖的支链本质亦可影响LM52 的HIV-1中和活性。

实施方式5.LM52的中和广度及功效

本发明接着检测LM52对于一组涵盖11个分支之118株不同HIV-1病毒株的HIV-1中和活性。在此单循环TZM-bl试验中，相较于WT ibalizumab， LM52显示明显改进的中和广度及功效(图9及表3)。LM52对于阴性对照组病毒(鼠白血病病毒)不具中和活性(表3)，不过其中和(其定义为≥50％之抑制作用)所有受测的HIV-1病毒株，对比于WT ibalizumab 92％的病毒株中和能力。事实上，LM52中和97％的病毒并达到≥95％抑制，对比于WTibalizumab仅31％有此结果(图5，上面部分)。针对所有118株病毒，LM52 亦具有IC₅₀值<0.1μg/mL，对比于WT ibalizumab对75％病毒有此结果(图9，中间部分)。的确，LM52中和所有的病毒且IC₈₀<0.3μg/mL，而有36％的病毒即使以浓度10μg/mL之WT ibalizumab中和仍未达80％之抑制功效(图9，下面部分)。

表3 Ibalizumab及LM52之体外中和情况，以IC₅₀(μg/mL)、IC₈₀(μg/mL) 及MPI(％)表示

整体而言，LM52的IC₅₀几何平均值为14ng/mL，对比于WT ibalizumab 的74ng/mL，以及LM52的IC₈₀几何平均值为37ng/mL，对比于WT ibalizumab 的510ng/mL(图11)。当病毒分为ibalizumab敏感性病毒株(MPI>80％) 与ibalizumab抗性病毒株(MPI≤80％)时，其明显发现LM52的提升的功效在ibalizumab抗性病毒株最显著(图12)。在ibalizumab抗性病毒方面，LM52 之IC₈₀几何平均值为50ng/mL，对比于WT ibalizumab的几乎10,000ng/mL。即使是在ibalizumab敏感性病毒，LM52功效的提升约在3倍。

所述LM52改进活性亦可在比较其HIV-1病毒株覆盖率相对于渐增的抗体浓度的的比较图中观察得到(图10)。针对WT ibalizumab之活性改进显而易见，并优于已知具有广域及有效HIV-1中和活性的mAbs(PG9、VRC01、 10E8及NIH45-46G54W)。LM52在所有浓度>0.01μg/mL之情况下具有最大病毒覆盖率，并于浓度低于0.1μg/mL时达到100％。只有在浓度低于0.01 μg/mL时，LM52之覆盖率不如NIH45-46G54W，一gp120上CD4结合位点的人类mAb修饰型。然而，应注意的是，ibalizumab藉由结合至CD4以抑制HIV-1 感染，而VRC01、PG9、10E8及NIH45-46G54W藉由直接结合至病毒以抑制HIV-1感染。尽管如此，无论是否这些mAbs结合于病毒包膜或CD4，它们都以阻断病毒进入的方式中和HIV-1感染。

实施方式6.多重糖类之效用

本发明接着测定于ibalizumab L链之感兴趣区域附加二或三种聚糖类的效用。本发明于293A细胞产生LM30E-52、LM30E-53与LM52-67双突变体，及LM30E-52-67与LM30E-53-67三突变体，且随即纯化并以SDS-PAGE分析抗体(图13A)。相较于WT ibalizumab或单突变体LMs，双突变体之每一者可观察到稍大的L链，且三突变体之每一者可观察到更大的L链。本发明接着探究这些变体mAbs对于一组已知完全或部分具有ibalizumab抗性之HIV-1 病毒株之HIV-1中和情况。一般而言，所述双与三突变体所显示的中和活性可相较于LM52的活性(表4；图13B，左边部分)。事实上，IC₈₀几何平均值显示相较于LM52，三突变体的功效可能稍低。唯一的例外在于 SHIVsf162P3N病毒，一种对于双与三突变体的敏感性高于对于LM52的病毒 (表4；图13B，右边部分)。整体而言，本发明没有发现证据显示附加一个以上的聚糖可进一步改进LM52对于ibalizumab敏感性病毒的HIV-1中和情况。藉由附加第二种聚糖的LM52活性的改进可能仅显见于具有LM52抗性或部分抗性的病毒。

表4 Ibalizumab及其单、双与三突变体LMs之IC₈₀(μg/mL)的比较

实施方式7.LM52多重反应性之分析

一些HIV-1中和性mAbs的常见特性为其和自体抗原的交叉反应性。即使在浓度为10μg/mL，LM52及ibalizumab皆无法结合至HEp-2上皮细胞萃取物(图14A)。此外，LM52及ibalizumab皆未显示与单股DNA、双股DNA、胰岛素、脂多糖或钥孔虫戚血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH) 具有反应性(图14B)。人类CD4蛋白质是ibalizumab的预期标的，是LM52 仅能辨识的受测自体抗原。因此，本发明没有发现证据显示LM52对于自体抗原具有多重反应性。

结论

在本发明中，提供一种由MV1产生的优异型HIV-1进入阻断性mAb产物，称作变体LM52，其在相对低之浓度下能中和所有受测之HIV-1病毒株。 LM52之病毒中和特性明显优于野生型ibalizumab及现今许多据报告最好的抗包膜mAbs，例如，VRC01、PG9、10E8及NIH45-46G54W。结合已建立的ibalizumab人体安全记录，这些观察显示LM52应是发展临床上HIV-1治疗或预防的良好选项。考虑预期的(根据习知亲本ibalizumab的药代动力学特性)每月给药时间表，此修饰的抗体可具体而言适合作为长效型PrEP试剂。

该等发现亦提供对于ibalizumab作用机制之洞悉。也就是，HIV-1于 gp120 V5之N端失去一个糖以变成具有ibalizumab抗性。结果显示由糖调结的ibalizumab作用机制导致抗体L链与病毒包膜聚糖蛋白之间的空间冲突 (steric clash)，从而于空间上破坏HIV-1进入的步骤。本发明指出L链上的聚糖恢复ibalizumab对于ibalizumab抗性病毒株的抗病毒活性，其中将此糖置于空间上最接近V5的关键残基造成最大的抗病毒效用，以及较大之聚糖类具有较大的病毒中和效用，其共同支持但非证明，ibalizumab经由位组机制阻断HIV-1感染。

所有公开和专利文献、专利申请公开文献，和本文所引用的专利申请在此通过引用全部并入本文作为参考文献，其范围如同其中每一者单独通过引用以并入本文作为参考文献。

Claims

1.一种聚糖修饰的抗-CD4抗体，其在轻链可变区包含一或多个工程化的N-连接聚糖化位点，其中该抗体具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包括SEQID NO:2所含的三个CDR，所述轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:3所含的三个CDR，且含一或多个工程化的N-连接聚糖化位点，位于SEQ ID NO:3序列中选自于由SEQ ID NO:3中第54个氨基酸(30E Gln)、SEQ ID NO:3中第77个氨基酸(52Ser)、SEQ ID NO:3中第78个氨基酸(53Thr)、SEQ ID NO:3中第79个氨基酸(54Arg)、SEQ ID NO:3中第85个氨基酸(60Asp)、SEQID NO:3中第90个氨基酸(65Ser)、SEQ ID NO:3中第92个氨基酸(67Ser)、SEQ ID NO:3中第101个氨基酸(76Ser)所组成的群组的氨基酸位置。

2.如权利要求1所述的抗体，其中该工程化的N-连接聚糖化位点位于SEQ ID NO:3序列中选自于由30EGln、52Ser、53Thr、54Arg、65Ser和67Ser组成的群组的氨基酸位置。

3.如权利要求1所述的抗体，其中该工程化的N-连接聚糖化位点位于52Ser。

4.如权利要求1所述的抗体，其包含如SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列。

5.一种药物组合物，其包含如权利要求1-4中任一项所述的抗体和至少一个药学上可接受的载体。

6.一种如权利要求1-4中任一项所述的抗体用于制备抑制HIV感染药剂的应用。

7.一种如权利要求1-4中任一项所述的抗体用于制备治疗HIV感染的药剂的应用。

8.一种如权利要求1-4中任一项所述的抗体用于制备预防HIV感染药剂的应用。