TW202237639A - 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係揭示一種與鳥苷酸環化酶C (GCC)結合之抗原結合劑（例如單域抗體）。亦揭示包含該等抗原結合劑及其片段之核酸、重組表現載體、宿主細胞、抗原結合片段及醫藥組成物。本發明亦提供利用本文所提供之抗體及抗原結合分子之治療方法。

Description

鳥苷酸環化酶C　(GCC)抗原結合劑之組成物及其使用方法

無

鳥苷酸環化酶C (GCC)為一種跨膜細胞表面受體，其功能為維持腸液、電解質體內平衡及細胞增殖，請參見例如Carrithers等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3018-3020 (2003)。GCC表現於小腸、大腸和直腸內襯的黏膜細胞(Carriters等人，Dis Colon Rectum 39： 171-181 (1996))。GCC的表現在腸上皮細胞腫瘤轉型之後仍維持，且表現在所有原發性及轉移性大腸直腸腫瘤中(Carriters等人，Dis Colon Rectum 39： 171-181 (1996)；Buc等人，Eur J Cancer 41： 1618-1627 (2005)；Carrithers等人，Genterology 107： 1653-1661 (1994))。目前需要新穎且增進的標靶GCC之方法。

GCC訊息傳遞途徑中斷與多種胃腸道疾病(包括大腸直腸癌)有關。本發明提供新穎的抗-GCC抗原結合分子（例如，單域抗體(sdAb)），除了其他事項外。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其係由以下組成：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其係由下列組成：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其係由以下組成：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其係由以下組成：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其係由以下組成：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含或由以下組成：一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一V _H區，其包含一與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一項至少95%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑由以下組成：一V _H區，其包含一與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一項至少95%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑包含一V _H區，其包含一與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一項一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑由以下組成：一V _H區，其包含一與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一項一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，該GCC結合劑係選自於由以下組成之群：IgA抗體、IgG抗體、IgE抗體、IgM抗體、雙或多特異性抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、經分離之CDR或其群組；單鏈可變異片段（scFv）、多胜肽-Fc融合物、單域抗體(sdAb)、駱駝源化抗體；掩蔽抗體、小型模組化免疫製藥（「SMIPsTM」）、單鏈、串聯雙價抗體、VHHs、抗運載蛋白(Anticalin)、奈米抗體、人源化抗體(humabody)、微型抗體、BiTE、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白、DARPIN、Avimer、DART、TCR-類似抗體、Adnectin、人類泛素(Affilin)、穿透抗體(Trans-body)；親和抗體(Affibody)、TrimerX、微型蛋白、Fynomer、Centyrin；以及KALBITOR。

在一些實施例中，該GCC結合劑為單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該GCC結合劑為V _H單域抗體。

在一些實施例中，該GCC結合劑為僅具重鏈之抗體。

在一些實施例中，該GCC結合劑係以介於約0.3奈米莫耳(nM)至約10 nM之間的KD與GCC結合。

在一些實施例中，該GCC結合劑係以介於約0.5 nM至約8 nM之間的EC50與標靶細胞上的GCC結合。

在一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與本文所述之GCC結合劑。

在一些實施例中，該癌症係選自於胃腸癌、大腸直腸癌、大腸直腸腺癌、大腸直腸平滑肌肉瘤、大腸直腸淋巴瘤、大腸直腸黑色素瘤、大腸直腸神經內分泌腫瘤、轉移性大腸癌、胃癌、胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肉瘤、食道癌、鱗狀細胞癌、食道腺癌或胰臟癌。

在一些實施例中，該癌症為胃腸癌。

在一些實施例中，該胃腸癌為大腸癌、大腸直腸癌、胃癌或食道癌。

在一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含GCC結合劑及醫藥學上可接受之載體，其中該GCC結合劑包含：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)；或一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與GCC結合劑，其中該GCC結合劑包含：一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)；一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)；或一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。

在一態樣中，本發明提供一種核酸，其編碼與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一者一致的V _H胺基酸序列。

在一態樣中，本發明提供一種載體，其包含編碼與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一者一致的V _H胺基酸序列之核酸。

在一態樣中，本發明提供一種經分離之細胞，其包含有包含編碼與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一者之V _H胺基酸序列的核酸之載體。

在一態樣中，本發明提供一種抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。

在一態樣中，本發明提供一種誘發免疫反應之方法，其包含將細胞與抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)接觸，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。

在一態樣中，本發明提供一種誘發細胞毒性之方法，其包含將細胞與抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)接觸，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。

在一態樣中，本發明提供一種偵測哺乳動物中癌症存在之方法，其包含：(a)將包含來自於該哺乳動物之一或多種細胞的樣本與如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑接觸，藉此形成複合物，以及(b)偵測該複合物，其中偵測到該複合物表示該哺乳動物中存在癌症。

在一些實施例中，該接觸相對於該哺乳動物為體外或體內。在一些實施例中，該接觸為體外。

應理解，前述一般描述及以下詳細描述二者僅為例示性及解釋性，且不限制本發明，如所申明者。

相關申請案之交互參考

本申請案主張2020年12月9日申請之美國臨時專利申請案第63/123,333號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式之電子方式提交，且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII文字檔案以全文引用之方式併入本文中，創建於2021年11月18日，名稱為「MIL-011WO_SL」且大小為36,864個位元組）。 定義

為使本發明更易於理解，首先在下文定義某些術語。隨附術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書記載。

除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「方法」包括一或多種方法，及/或本文所述類型之步驟，及/或熟習此項技術者將經由閱讀本發明及類似者時，變得顯而易見。

投與 ：如本文所用，向個體「投與」組成物係指提供、施用或使該組成物與該個體接觸。投與可藉由多種途徑中之任一者實現，諸如局部、口服、皮下、肌肉內、腹膜內、靜脈內、鞘內和皮內。

親和力 ：如本文中所使用，術語「親和力」係指結合部分（例如，抗原結合劑（例如，本文所述之可變域）與標靶（例如，抗原（例如GCC））之間的結合交互作用特性，且指示出該結合交互作用之強度。在一些實施例中，親和力之測量係以解離常數（K _D）表示。在一些實施例中，結合部分對於標靶具有高親和力（例如，小於約10 ^-7M、小於約10 ^-8M或小於約10 ^-9M之K _D）。在一些實施例中，結合部分對於標靶具有低親和力（例如，高於約10 ^-7M、高於約10 ^-6M、高於約10 ^-5M、或高於約10 ^-4M之K _D）。

動物 ：如本文所使用之術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於發育之任何階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於發育之任何階段之非人類動物。在某些實施例中，該非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥、爬蟲類、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蟲。在一些實施例中，動物可為基因轉殖動物、經基因工程改造之動物及/或純系。

自體 ：如本文所用，術語「自體」是指衍生自同一個體的任何材料，隨後將其重新引入該個體。

同種異體 ：「同種異體」係指衍生自一個體的材料被投與不同的個體或個體群。

抗體或抗原結合劑 ：如本文所用，術語「抗體」或「抗原結合劑」係指包括足以賦予特定標靶抗原的特異性結合之典型免疫球蛋白序列元件之多胜肽。熟習此項技術者將瞭解，該術語可在本文中互換使用。在一些實施例中，如本文中所使用，術語「抗體」或「抗原結合劑」亦指「抗體片段」或「抗體片段群」或「抗原結合部分」，其包括完整抗體之一部分，例如，例如抗體之抗原結合或可變區。「抗體片段」之實例包括Fab、Fab'、F(ab’)2及Fv片段；三抗體；四抗體；直線形抗體；單鏈抗體分子；單域抗體；以及由抗體片段形成之多特異性抗體中所包括之含CDR部分。熟習此項技術者應瞭解，術語「抗體片段」並不暗示且不限於任何特定產生模式。抗體片段可經由使用任何適當方法學製備，包括但不限於完整抗體的裂解、化學合成、重組製造等。如本領域已知，天然製造之完整抗體為約150 kD之四聚體試劑，包含兩個相同的重鏈多肽（各約50 kD）及兩個相同的輕鏈多肽（各約25 kD）相互結合形成所謂的「Y形」結構。各重鏈包含至少四個域（每個約110個胺基酸長）- 一個胺基端可變（V _H）域（位於Y結構之頂端），接著是三個恒定域：C _H1、C _H2 和羧基端C _H3（位於Y型主幹的底部）。短區（稱為「開關」）連接該重鏈可變區及恆定區。「鉸鏈」將C _H2及C _H3域連接至該抗體之其餘部分。此鉸鏈區中的兩個雙硫鍵將完整抗體中的兩個重鏈多肽彼此連接。各輕鏈包含兩個域- 胺基端可變（V _L）域，之後接著一個羧基端恆定（C _L）域，彼此以另一「開關」隔開。完整抗體四聚體是由兩個重鏈-輕鏈二聚體組成，其中重鏈及輕鏈藉由單一雙硫鍵彼此連接；兩個其他雙硫鍵將該重鏈鉸鏈區彼此連接，使得該二聚體彼此連接且形成四聚體。天然生成的抗體亦經醣基化，一般在C _H2域上。天然抗體中的每個結構域都具有以「免疫球蛋白折疊」為特徵的結構，該折疊由兩個β摺板（例如，3-、4-或5-股摺板），在壓縮的反向平行β桶中相互堆積而成。每個可變域包含三個高度變異環，稱為「互補決定區」（CDR1、CDR2和CDR3）和四個稍微不變的「框架」區（FR1、FR2、FR3和FR4）。當天然抗體折疊時，FR區形成β摺板，為結構域提供結構框架，而來自重鏈和輕鏈二者的CDR環區在三維空間中聚集在一起，因而在該Y結構的頂端創造出單一高度變異抗原結合位點。抗體多肽鏈之間的胺基酸序列比對已定義出兩種輕鏈(κ和λ)類別、數種重鏈(如μ、γ、α、ε、δ)類別，以及數種重鏈亞群(α1、α2、γ1、γ2、γ3和γ4)。抗體類別（IgA[包括IgA1、IgA2]、IgD、IgE、IgG[包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4]和IgM）是基於所使用的重鏈序列的類別而定義的。

出於本發明的目的，在某些實施例中，包括在天然抗體中發現的足夠免疫球蛋白域序列的任何多肽或多肽複合物，可被稱為及/或作為「抗體」或「抗原結合劑」，不論此種多肽是天然產生的（例如，由對某一抗原產生反應的生物體產生），或藉由重組工程、化學合成或其他人工系統或方法學產生。在一些實施例中，抗體為單株抗體；在一些實施例中，抗體為多株抗體。在一些實施例中，抗體具有小鼠、兔子、靈長類動物或人類抗體特徵的恆定區序列。在一些實施例中，如本技術領域中已知，抗體序列元件為人類化、靈長類化、嵌合化等。此外，本文使用的術語「抗體」或「抗原結合劑」將被理解為涵蓋（除非內文另有說明或澄清）在適當的實施例中，可以指任何本領域已知的或已開發的構建體或形式，用於在替代呈現中捕捉抗體結構性和功能性特徵。舉例而言，在一些實施例中，該等術語可指稱雙-或其它多-特異性（例如，酶親體等）抗體、小型模組免疫藥物（「SMIPs™」）、單鏈抗體、駱駝源化抗體及/或抗體片段。在一些實施例中，抗體可能缺乏它在天然產生時可能具有的共價修飾（例如，連接聚醣）。在一些實施例中，抗體可包含共價修飾（例如，連接聚醣、負載[例如可偵測部分、治療部分、催化部分等]、或其他側接基[例如聚乙二醇等]）。

大約或約 ：如本文所使用，術語「大約」或者「約」如應用於有興趣的一或者多個數值，係指類似於所陳述參考值之數值。在某些實施例中，除非另外說明或者另外自內文顯而易見，否則術語「大約」或者「約」係指在任一方向上(大於或者小於)落於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或者更小之數值範圍內(但此數值將超出可能性值之100%的情況除外)。

互補決定區（ CDR ）：可變域的「CDR」為可變區內的胺基酸殘基，其根據Kabat、Chothia、Kabat和Chothia的累加、AbM、接觸之定義、及/或構型定義或任何本領域公知的CDR測定方法而辨識出。抗體CDR可辨識為最初由Kabat等人定義的高度變異區。請參見，例如，Kabat等人，1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生服務處，NIH, Washington D.C。CDR的位置亦可辨識為最初由Chothia和其他人描述的結構環結構。請見如Chothia等人，Nature 342:877-883, 1989。其他的CDR辨識方法包括「AbM定義」，此為Kabat和Chothia之間的折衷，是使用Oxford Molecular的AbM抗體模擬軟體（現在名為Accelrys®）推導而來，或基於觀察到的抗原接觸的CDR之「接觸定義」，如MacCallum等人，J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996中所述。在另一方法中，在本文中稱為CDR的「構型定義」，該CDR的位置可辨識為對抗原結合做出焓貢獻的殘基。請參照如Makabe等人，Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1166, 2008。尚有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍將與至少一部分的Kabat CDR重疊，儘管根據特定殘基或殘基組的預測或實驗結果，它們可能會縮短或延長，甚至整段CDR都不會顯著影響抗原結合。

除非另有說明，如本文所用，CDR定義是根據Kabat CDR而來。

效應子功能： 如本文所用，術語「效應子功能」是指可歸因於本文所述的抗原結合劑的生物活性。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受器結合性；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）；吞噬作用；細胞表面受體（例如，B細胞受體；和B細胞活化）的調降。「降低或最小化」抗體效應子功能是指其較野生型或未修飾的抗體降低至少50%（或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。抗體效應子功能的測定可由本領域一般技術人員容易地確定和測量。在一些實施例中，補體結合、補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性的抗體效應子功能受到影響。在一些實施例中，效應子功能經由在恆定區中消除醣基化的突變而消除，例如「無效應子突變」。在一態樣中，該無效應子突變為CH2區域的N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields等人，J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)。此外，導致效應子功能降低或消除的額外突變包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，效應子功能可通過生產技術而降低或消除，例如在無醣基化作用的宿主細胞（例如大腸桿菌）中表現，或其中導致醣基化模式改變成在促進效應子功能方面無效或效果較差(如Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 (5):3466-3473 (2003))。

抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 或ADCC是指一種細胞毒性形式，其中分泌的Ig結合至某些細胞毒性細胞（例如，自然殺手(NK)細胞、中性顆粒細胞和巨噬細胞）上存在的Fc受器(FcR)，使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至攜帶抗原的標靶細胞，之後以細胞毒素殺死該標靶細胞。該抗體「武裝」該細胞毒性細胞，且為藉由這種機制殺死該標靶細胞所必需。介導ADCC的主要細胞為NK細胞，其僅表現FcγRIII，而單核細胞則表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的Fc表現係摘錄於Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)之第464頁的表3。為了評估感興趣的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，例如美國專利號5,500,362或5,821,337中所述。用於此種測定法的可使用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)和自然殺手(NK)細胞。替代地或額外地，可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，例如在Clynes等人，PNAS USA 95: 652-656 (1998)中所揭示的動物模型。

抗原 ：如本文所用，術語「抗原」是指引發免疫反應的試劑；及/或當暴露或投至生物體時，與T細胞受器（例如，當由MHC分子呈現時）或抗體（例如，由B細胞產生）結合的試劑。在一些實施例中，抗原在生物體中引發體液反應（例如，包括抗原特異性抗體的產生）；替代地或額外地，在一些實施例中，抗原在生物體中引發細胞反應(例如，涉及其受器與該抗原特異性交互作用的T細胞）。本領域技術人員將理解，特定抗原可在標靶生物體（例如，小鼠、兔、靈長類動物、人類）之一或數個成員中，而非在該標靶生物體物種的所有成員中，引發免疫反應。在一些實施例中，抗原在標靶生物體物種的至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的成員中引發免疫反應。在一些實施例中，抗原結合至抗體及/或T細胞受器，且可能會或可能不會在生物體中誘發特定生理反應。在一些實施例中，例如，抗原可在體外結合至抗體及/或T細胞受器，無論此作用是否在體內發生。在一些實施例中，抗原與特定體液或細胞免疫的產物反應，包括由異源性免疫原誘發者。在所揭示的組成物和方法的一些實施例中，GCC蛋白為抗原。

相關聯 ：作為本文使用之術語，若其中一者與另一者之存在、程度及/或形式相關，則此二事件或者實體彼此「相關聯」。舉例而言，若特定實體(例如多肽)之存在、程度及/或形式與特定疾病、病症或者病況之發生率及/或易感性相關(例如在相關群體中)，則該特定實體視為與該特定疾病、病症或者病況相關聯。在一些實施例中，若二或者更多個實體直接或者間接相互作用，以使得其彼此物理上接近且保持物理上接近，則其彼此物理上「相關聯」。在一些實施例中，彼此物理上相關聯之二或者更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，彼此物理上相關聯之二或者更多個實體彼此不共價連接，但以非共價形式相關聯，例如藉助於氫鍵、凡得瓦交互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。

結合： 應當理解，本文所用的術語「結合」通常是指二或多個實體之間的非共價結合。「直接」結合涉及實體或部分之間的物理接觸；間接結合涉及藉由與一或多個中間實體進行物理接觸的物理交互作用。二或多個實體之間的結合可在多種情況中的任一者下進行評估- 包括相互作用的實體或部分在隔絕或在更複雜系統的情況下（例如，與載體實體及/或在生物系統或細胞中以共價或其他方式結合）。如本文所使用之「K _a」係指特定結合部分與標靶形成結合部分/標靶複合物之結合速率。如本文所使用之「K _d」係指特定結合部分/標靶複合物之解離速率。如本文所使用之「K _D」係指解離常數，其得自K _d比K _a之比率(亦即K _d/K _a)，且以莫耳濃度(M)表示。K _D值可使用此項技藝中良好建立之方法(例如藉由使用表面等離子體共振)或者使用生物感測器系統(例如Biacore®系統)來測定。

載體 ：如本文所用，術語「載體」係指與組成物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。在一些例示性實施例中，載體可包括無菌液體，諸如（例如）水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如（例如）花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似物。在一些實施例中，載體為或包括一或多個固體成分。

特徵部分 ：如本文中所用，術語「特徵部分」在最廣義而言係指稱某一物質之一部份的存在（或不存在）與特定特徵、屬性或活性之存在（或不存在）相關聯。在一些實施例中，一物質的特徵部分是在該物質和相關物質中發現具有共享特定特徵、屬性或活性的部分，而非不共享特定特徵、屬性或活性者。

密碼子最佳化 ：如本文所用，「密碼子最佳化」的核酸序列是指已經改變，使得核酸序列的轉譯和所得蛋白質的表現，針對特定表現系統達增進之最佳化的核酸序列。「密碼子最佳化」的核酸序列係編碼與該「密碼子最佳化」核酸序列所基於的未最佳化親代序列相同的蛋白質。例如，一核酸序列可經「密碼子最佳化」，以在哺乳動物細胞（例如，CHO細胞、人類細胞、小鼠細胞等）、細菌細胞（例如，大腸桿菌）、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞中表現。

可比較 ：如本文所用，術語「可比較」是指二或多個試劑、實體、情況、條件組等，它們可能彼此不同但足夠相似，以允許在它們之間進行比較，因而可根據觀察到的差異或相似之處合理地得出結論。本領域普通技術人員將理解，在內文中，在任何特定情況下需要何種程度的一致性，才能將二或多個此類試劑、實體、情況、條件組等視為具有可比較性。

對應於 ：如本文所用，術語「對應於」通常用於指定有興趣多肽的胺基酸殘基的位置/一致性。普通技術人員將理解，為簡要起見，多肽中的殘基通常使用基於參考相關多肽的規範編號系統來命名，如此，「對應於」位置190殘基之胺基酸，舉例而言，實際上不必是特定胺基酸鏈中的第190個胺基酸，而是對應於該參考多肽中第190個殘基；本領域普通技術人員容易理解如何鑑定「相對應」的胺基酸。

衍生自： 如本文所用，片語「衍生自」或「特異於指定序列」的序列是指包含大約至少6個核苷酸或至少2個胺基酸、至少約9個核苷酸或至少3個胺基酸、至少約10-12個核苷酸或4個胺基酸、或至少約15-21個核苷酸或5-7個胺基酸對應於，即，一致於或互補於例如指定序列的連續區域。在某些實施例中，該序列包含所有指定的核苷酸或胺基酸序列。如通過本領域已知的技術確定，該序列可與特定序列獨特的序列區域互補（在多核苷酸序列的情況下）或一致。可衍生序列的區域包括但不限於：編碼特異性表位的區域、編碼CDR的區域、編碼框架序列的區域、編碼恆定域區域的區域、編碼可變域區域的區域，以及非轉譯及/或非轉錄區域。該衍生序列不一定是從研究中的感興趣序列生理性衍生而來，而可以任何方式產生，包括但不限於化學合成、複製、逆轉錄或轉錄，其基於該多核苷酸所衍生的區域中的鹼基序列提供的信息。因此，它可以代表該原始多核苷酸的同義或反義方向。此外，對應於指定序列的區域組合可以本領域已知的方式進行修飾或組合，以符合預期用途。例如，一序列可包含二或多個連續序列，每一者包含指定序列的一部分，且被與指定序列不同但用於代表衍生自該指定序列的序列的區域中斷。關於抗體分子，「衍生自」包括與比較抗體在功能或結構上相關的抗體分子，例如，「衍生自」包括具有相似或實質上相同的序列或結構，例如具有相同或類似的CDR、框架或可變區。抗體的「衍生自」亦包括殘基，例如一或多個，例如2、3、4、5、6個或更多個殘基，其可為連續或不連續，但根據編號流程，或與比較序列的一般抗體結構或三維鄰近性(即，在CDR或框架區內)的同源性，而定義出或辨識出。術語「衍生自」不限於生理性衍生，而是包括經由任何方式產生，例如藉由使用來自比較抗體的序列信息來設計另一抗體。

測定 ：本文所述之許多方法學包括一「測定」步驟。閱讀本說明書的本領域普通技術人員將理解，此「測定」可利用本領域技術人員可獲得的多種技術之任一者，包括例如本文明確提及的特定技術進行。在一些實施例中，測定涉及生理樣本的操作。在一些實施例中，測定涉及對數據或信息的考量及/或操作，例如利用適於執行相關分析的電腦或其他處理單元。在一些實施例中，測定涉及從來源接收相關信息及/或材料。在一些實施例中，測定涉及將樣本或實體的一或多個特徵與可比較的參考物進行比較。

改造： 如本文所用，術語「經改造」描述已由人為設計或修飾及/或其存在和生產需要人為干預及/或動作的多核苷酸、多肽或細胞。例如，旨在設計用於引發特定效果且與天然存在的相同類型細胞的效果不同的經改造細胞。在一些實施例中，經改造細胞表現本文所述的嵌合抗原受器。在詳細說明和實例部分中描述例示性改造方法。

表位 ：如本文所用，術語「表位」包括被免疫球蛋白（例如，抗體或受器）結合成分全部或部分特異性辨識出的任一部分。在一些實施例中，表位由抗原中的複數個胺基酸組成。在一些實施例中，當抗原採用相關三維構型時，此類胺基酸殘基暴露於表面。在一些實施例中，當抗原採用此種構型時，胺基酸殘基在空間上彼此物理性接近或等高。在一些實施例中，當抗原採用替代構型（例如，直線化；例如，非直線形表位）時，至少一些胺基酸彼此呈物理上分隔。

賦形劑： 如本文所用，術語「賦形劑」是指可包括在醫藥組成物中的非治療劑，舉例而言，以提供或有助於所需的稠度或穩定作用。合適的藥物賦形劑包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及類似物。

表現： 術語「表現」或「經表現」，當用於本文中的核酸時，是指以下事件中的一或多者：(1)DNA模板之RNA轉錄物產生(例如，藉由轉錄作用）；(2)RNA轉錄物的加工（例如，藉由剪接、編輯、5'端帽形成及/或3'末端形成）；(3)RNA轉譯成多肽；及/或(4)多肽的轉譯後修飾。

離體： 如本文所用，術語「離體」是指在外部環境中發生的事件，例如，在多細胞生物體外部。在一些實施例中，細胞或細胞群係於多細胞生物體（例如，哺乳動物，例如非人類靈長類動物或人類）的體外進行修飾，以表現本文所述的抗GCC分子，在將此類細胞或細胞群投與有需要的個體之前。

融合蛋白 ：如本文所用，術語「融合蛋白」是指由編碼兩種不同（例如，異源性）蛋白質的至少一部分的核酸序列改造而得之核酸序列編碼的蛋白質。技術人員無疑知道，為了產生融合蛋白，係將核酸序列連接而使所得讀框不包含內部終止密碼子。在一些實施例中，如本文所述的融合蛋白包括一流感HA多肽或其片段。

鳥苷酸環化酶 C(GCC) ： 如本文所用，「GCC」亦稱為「STAR」、「GUC2C」、「GUCY2C」或「ST受器」蛋白是指哺乳動物GCC，較佳為人類GCC蛋白。人類GCC是指GenBank登錄號：NM—004963中描述的蛋白質及其天然存在的等位基因蛋白質變異體。其他變異體為本領域已知的。請參見，例如，登錄號Ensp0000261170，Ensembl Database，European Bioinformatics Institute和Wellcome Trust Sanger Institute，美國專利申請號20060035852；或GenBank登錄號：AAB 19934。通常，天然存在的等位基因變異體具有與SEQ ID NO: 5的GCC序列至少95%、97%或99%一致的胺基酸序列。該轉錄物編碼具有1073個胺基酸的蛋白質產物，並描述於GenBank登錄號：NM—004963。GCC蛋白的特徵為一種跨膜細胞表面受器蛋白，一般相信在維持腸液、電解質體內穩定和細胞增殖中扮演關鍵角色。

宿主 ：術語「宿主」在本文中用於指其中存在感興趣多肽的系統（例如，細胞、生物體等）。在一些實施例中，宿主為表現感興趣之特定多肽的系統。

宿主細胞 ：如本文所用，片語「宿主細胞」是指已引入外源性DNA（重組性或其他）的細胞。例如，宿主細胞可用於藉由標準重組技術產生本文所述的多肽。技術人員在閱讀本揭示內容後將理解，此類術語不僅指稱特定個體細胞，並指稱此一細胞的後代。由於某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，因此，此後代實際上可能不與親代細胞完全一致，但仍包括在本文所用術語「 宿主細胞」的範圍內。在一些實施例中，宿主細胞包括適合於表現外源性DNA（例如，重組性核酸序列）的任何原核和真核細胞。例示性細胞包括原核生物和真核生物（單細胞或多細胞）、細菌細胞（例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬等之菌株）、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞（例如，釀酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、甲醇畢赤酵母(P. methanolica)等）、植物細胞、昆蟲細胞（例如，SF-9、SF-21、經桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等）、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合體，例如雜交瘤或四重雜交瘤。在一些實施例中，該細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，該細胞為真核細胞，並選自於以下細胞：CHO（例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO）、COS（例如，COS-7）、視網膜細胞、Vero、CV1、腎（例如HEK293、HEK293T、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK）、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60（例如BHK21）、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、支持細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞和衍生自前述細胞之細胞株。在一些實施例中，該細胞包含一或多種病毒基因，例如表現病毒基因的視網膜細胞（例如PER.C6™細胞）。

免疫反應 ：如本文所用，術語「免疫反應」是指免疫系統的細胞如B細胞、T細胞、樹突細胞、巨噬細胞或多形核細胞，對於刺激如抗原或疫苗之反應。免疫反應可包括參與宿主防禦反應的任何身體細胞，包括例如分泌干擾素或細胞因子的上皮細胞。免疫反應包括但不限於先天性及/或適應性免疫反應。如本文所用，保護性免疫反應是指保護個體不受感染（預防感染或防止與感染相關的疾病的發展）的免疫反應。測量免疫反應的方法為本領域眾所周知的，包括例如測量淋巴細胞（例如B或T細胞）的增殖及/或活性、細胞因子或趨化因子的分泌、發炎、抗體產生、及類似反應。

體外 ：如本文所用，術語「體外」是指在人為環境中發生的事件，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而不是在多細胞生物體內。

體內 ：如本文所用，術語「體內」是指在多細胞生物體內發生的事件，例如人類和非人類動物。在細胞基礎系統的內文中，該術語可用於指稱在活細胞內發生的事件（與例如體外或離體系統相反）。

經分離： 如本文所用，術語「經分離的」是指物質及/或實體(1)與最初生產時（無論是在自然界及/或在實驗環境中）相結合的至少一些成分分離，及/或（2）在人為干預下設計、生產、製備及/或製造。經分離的物質及/或實體可與其最初結合的其他成分之約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%分離。在一些實施例中，經分離的試劑的純度為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或超過約99%。如本文所用，如果該物質實質上不含其他成分，則該物質為「純的」。在一些實施例中，如本領域技術人員將理解的，該物質在與某些其他成分例如一或多種載體或賦形劑（例如，緩衝液、溶劑、水等）組合之後，仍可視為「經分離的」或甚至「純的」；在此類實施例中，計算物質的經分離百分比或純度時不包括此類載體或賦形劑。僅作為一實例，在一些實施例中，在以下情況下，自然界中存在的諸如多肽或多核苷酸的生物性聚合物被認為是「經分離的」，當：a)由於其起源或衍生來源不與某些或所有在自然狀態下伴隨它的成分結合；b)它實質上不含來自於自然界產生它的物種之相同物種的其他多肽或核酸；c)由非來自於自然界產生它的物種之細胞或其他系統表現，或與該細胞中的成分結合。因此，例如，在一些實施例中，化學合成的或在不同於天然產生它的細胞系統中合成的多肽被認為是「經分離的」多肽。替代地或額外地，在一些實施例中，已進行一或多種純化技術的多肽可被認為是「經分離的」多肽，因為它已與以下的其他成分分離：a)在天然狀態下與其結合者；及/或b)最初生產時與之結合者。在一些實施例中，細胞可與其他細胞「分離」（例如，純化或分離）。例如，在一些實施例中，可從未修飾的細胞中分離出經改造以表現本文所述的CAR之經基因修飾細胞。

核酸 ：如本文所用，片語「核酸」，就最廣義而言，係指其為寡核苷酸鏈或可加入寡核苷酸鏈中的任何化合物及/或物質。在一些實施例中，核酸為寡核苷酸鏈或可經由磷酸二酯連結加入寡核苷酸鏈中的化合物及/或物質。從內文可清楚地看出，在一些實施例中，「核酸」是指各核酸殘基（例如，核苷酸及/或核苷）；在一些實施例中，「核酸」是指包含各核酸殘基的寡核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸」為或包含RNA；在一些實施例中，「核酸」為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種核酸類似物組成。在一些實施例中，核酸類似物與核酸的不同之處在於它不利用磷酸二酯骨架。例如，在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種本領域已知，且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵的「肽核酸」組成，視為落入本發明範疇中。替代地或額外地，在一些實施例中，核酸具有一或多個硫代磷酸酯及/或5'-N-亞磷醯胺連結而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種天然核苷（例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷和去氧胞苷）組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種核苷類似物（例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯併-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5 丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)。在一些實施例中，與天然核酸相較，核酸包含一或多種經修飾的醣類（例如，2'-氟核醣、核醣、2'-去氧核醣、阿拉伯醣和己醣）。在一些實施例中，核酸具有編碼功能基因產物例如RNA或蛋白質的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，核酸由自天然來源分離、以互補模板為基礎進行聚合之酵素合成(體內或體外)、在重組細胞或系統中繁殖、及化學合成之一或多者製備。在一些實施例中，核酸為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多殘基長度。在一些實施例中，核酸為單股；在一些實施例中，核酸為雙股。在一些實施例中，核酸具有一核苷酸序列，其包含至少一編碼一多肽的元件，或為編碼一多肽之序列的互補物。在一些實施例中，核酸具有酵素活性。

醫藥學上可接受的載體 ：可用於本揭示的醫藥學上可接受的載體(媒劑)為常規性的。Remington's Pharmaceutical Sciences，E. W. Martin, Mack出版公司發行，Easton, PA, 第15版(1975)中，描述適用於一或多種治療組成物的藥物遞送的組成物和配方(例如，包含本文所述的嵌合性抗原受器的組成物)，以及額外醫藥試劑。一般而言，載體的性質將取決於所採用的特定投藥模式。例如，腸胃外配方通常包含可注射流體，其包括醫藥學上和生理學上可接受的流體，例如水、生理食鹽水、平衡鹽類溶液、葡萄糖水溶液、甘油或類似物作為媒劑。對於固體組成物而言(例如，粉末、藥片、錠劑或膠囊形式)，傳統的無毒固體載體可包括例如醫藥級的甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外，待投與的醫藥組成物可包含少量無毒性輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩衝劑及類似物，例如乙酸鈉或單月桂酸脫水山梨醣酯。

多肽 ：「多肽」，一般而言，為藉由一肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的串聯。在一些實施例中，多肽可包括至少3至5個胺基酸，每一胺基酸藉由至少一個肽鍵連接到其他胺基酸。本領域普通技術人員將理解，多肽有時包括「非天然」胺基酸或其他實體，儘管如此，它們仍能夠視情況整合到多肽鏈中。在一些實施例中，術語「多肽」用於指多肽的特定功能類別，例如抗體、嵌合性抗原受器或共刺激域多肽等。對於每一此種類別，本說明書提供及/或本領域已知該類別內已知例示性多肽的胺基酸序列的數個實例；在一些實施例中，一或多種此類已知多肽為該類別的參考多肽。在此類實施例中，術語「多肽」是指顯示出與相關參考多肽足夠的序列同源性或一致性的類別的任一成員，本領域技術人員將理解該參考多肽應包括在該類別中。在許多實施例中，代表性類別之成員亦與該參考多肽共享顯著的活性。例如，在一些實施例中，一成員多肽顯示出與參考多肽至少約30-40%的整體序列同源性或一致性，且通常大於約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，及/或包括至少一區域(即保守區域，通常包括特徵序序列元素)顯示出非常高的序列一致性，通常大於90%，甚至95%、96%、97%、98%或99%。此類保守區通常包含至少3-4個，且經常多達20個或更多個胺基酸；在一些實施例中，保守區包含至少一段至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個連續胺基酸。

應理解，本發明的抗體和抗原結合劑可具有額外的保守或非必需胺基酸取代，其對多肽功能沒有實質性影響。該特定取代是否可被容忍，即不會不利地影響所需的生物學特性(例如結合活性)，可如Bowie, J U等人，Science 247：1306-1310 (1990)或Padlan等人 FASEB J. 9：133-139 (1995)中所述決定。「保守性胺基酸取代」是其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中定義出。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。

預防 : 如本文所用，術語「預防」是指預防、避免疾病表現、延遲發作及/或降低特定疾病、病症或病況(例如，感染如流感病毒)的一或多種症狀的頻率及/或嚴重性。在一些實施例中，預防係以群體為基礎評估，若在對該疾病、病症或病況易感的人群中觀察到該疾病、病症或病症的一或多種症狀的發展、頻率及/或強度在統計學上顯著降低，則認為該試劑「預防」該特定疾病、病症或病況。

純的 ：如本文所用，如果試劑或實體實質上不含其他成分，則其為「純的」。例如，包含超過約90%的特定試劑或實體的製劑通常被認為是純製劑。在一些實施例中，試劑或實體為至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少為99%的純度。

重組 ：如本文所用，術語「重組」係指藉由重組方式設計、改造、製備、表現、創造或分離出的多肽(例如，如本文所述的多肽)，例如使用重組表現載體轉染宿主細胞而表現之多肽、由重組、組合式多肽庫中分離出的多肽、或藉由涉及將選定序列元件剪接成另一者之任何其他方式製備、表現、創造或分離出的多肽。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件是在自然界中發現的。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件及/或其組合是經電腦設計。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件由多個(例如，二或多個)已知序列元件的組合產生，這些已知序列元件並非天然存在於同一多肽中(例如，來自兩個單獨HA多肽的兩個表位)。

參考物 ：術語「參考物」在本文中經常用於描述標準或對照試劑、個體、群體、樣本、序列或數值，與感興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值進行比較。在一些實施例中，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值之測試或測定，實質上同時與感興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值進行測試及/或測定。在一些實施例中，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值是經驗參考物，視情況在有形媒介中具體化。通常，如本領域技術人員將理解的，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值，係用於在可比較的條件下測定或鑑定有興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值。

單域抗體： 如本文所用，術語「單域抗體(sdAb)」、「可變單域」或「免疫球蛋白單可變域(ISV)」、「單重鏈可變域(VH)抗體」是指在不存在輕鏈或其他抗體片段的情況下，與標靶抗原結合並保持對該抗原的結合特異性的抗體之單一可變片段。這些術語在本文中可互換使用。sdAb為具有三個互補決定區(CDR)的單一抗原結合多肽。僅具sdAb便能夠結合抗原，而不須與相對應的含CDR多肽成對。VH單域抗體是指具有一人類重鏈可變域或一衍生自人類重鏈可變域的結構域之單域抗體。在一些情況下，單域抗體由駱駝源化HCAb改造而成，而駱駝源化HCAb的重鏈可變域被稱為「VHH」。某些VHH亦可稱為奈米抗體。駱駝源化sdAb是最小的已知抗原結合抗體片段之一(請參見，例如Hamers-Casterman等人，Nature 363: 446-8 (1993)；Greenberg等人，Nature 374: 168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013))。基本VH或VHH單域抗體從N端到C端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4係分別指框架區1至4，其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。如下文所解釋，本發明各態樣的一些實施例相關於一種結合試劑，其包含單一重鏈可變域抗體/免疫球蛋白重鏈單一可變域，在不存在輕鏈的情況下，其可與GCC抗原結合。

個體 ：如本文所用，術語「個體」是指任何哺乳動物，包括人類。在本發明的某些實施例中，個體為成人、青少年或嬰兒。在一些實施例中，術語「個人」或「患者」被使用且可與「個體」互換。本發明亦涵蓋醫藥組成物的投與及/或子宮內治療方法的進行。例如，個體可為患有癌症(例如胃腸來源)、癌症症狀的患者(例如人類患者或動物患者)，其中至少一些細胞表現GCC，或有癌症傾向的患者，其中至少一些細胞表現GCC。本發明的術語「非人類動物」包括所有非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等，除非另有說明。

實質上 ：如本文所用，術語「實質上」是指具有感興趣的特徵或特性的全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域的普通技術人員將理解，生物和化學現象很少(若有的話)完成及/或繼續完成或達到或避免一絕對的結果。因此，術語「實質上」在本文中用於包羅許多生物及化學現象中固有之潛在缺乏的完全性。

治療劑： 如本文所用，術語「治療試劑」是指具有生物活性的試劑(例如，抗原結合劑)。該術語在本文中用於指稱化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料製成的萃取物。在一些實施例中，該治療劑可為抗癌劑或化學治療劑。如本文所用，術語「抗癌劑」或「化療劑」是指具有抑制人類腫瘤，特別是惡性(癌性)病變，例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的發展或進展的功能特性的試劑。抑制轉移或血管生成通常是抗癌劑或化學治療劑的特性。化學治療劑可為細胞毒性劑或細胞抑制劑。術語「細胞抑制劑」是指抑制或壓抑細胞生長及/或細胞增殖的試劑。在一些實施例中，該治療劑為經基因修飾的細胞或抗體。在一些實施例中，該治療劑為抗GCC CAR。在一些實施例中，該治療劑為表現本文所述的GCC CAR的細胞(例如，細胞群)。

轉型 ：如本文所用，係指將外源性DNA引入宿主細胞的任一過程。可使用本領域熟知的各種方法在自然或人工條件下進行轉型。轉型可依賴於將外源核酸序列插入原核或真核宿主細胞中的任何已知方法。在一些實施例中，係基於被轉型的宿主細胞而選擇特定的轉型方法學，且可包括但不限於：病毒感染、電穿孔、交配、轉染、脂質轉染。在一些實施例中，「 經轉型的」細胞被穩定轉型，因為插入的DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體的一部分而進行複製。在一些實施例中，經轉型的細胞在有限的時間段內瞬時表現引入的核酸。

治療或治療 ：如本文所用，術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」係定義為將抗GCC抗原結合劑（例如抗GCC抗體或其片段等）投與一個體，例如患者，或投至(例如藉由施加)從個體分離出的組織或細胞中，之後返回至該個體。該抗GCC抗原結合劑可單獨投藥或與第二試劑組合投藥。治療可為治癒、療癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、緩和、增進或影響該病症、該病症的症狀或該病症的傾向，例如癌症。儘管不希望受理論束縛，但一般相信治療可在體外或體內引起細胞的抑制、消融或殺傷，或以其他方式降低細胞（例如異常細胞）介導疾病，如本文所述的病症（例如，癌症）的能力。

可變區或域：如本文所用，術語抗體的「可變區」或「可變域」是指抗體重鏈或輕鏈的胺基端結構域。重鏈和輕鏈的可變域可分別稱為「VH」和「VL」。這些域通常是抗體中變化最大的部分（相對於同一類別的其他抗體）並包含抗原結合位點。僅具重鏈的抗體具有單一重鏈可變區。

載體 ：如本文所用，術語「載體」是指能夠傳送與其連接的另一核酸的核酸分子。其中一種載體類型為「質體」，其係指環狀雙股DNA環，其中可接合額外的DNA片段。另一種載體類型為病毒載體，其中額外的DNA片段可接合至該病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞後整合至宿主細胞的基因組中，因而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠主導與其操作性連接的基因之表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。 特定實施例之詳細描述

本發明係基於發現特異性結合至鳥苷酸環化酶C (GCC)之新穎抗原結合劑及其在治療方法中之用途。本申請案提供抗GCC單域抗體(sdAb)。

本發明不限於本文所述之特定方法或實驗條件，因為此方法或實驗條件可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅用於描述特定實施例之目的，且非用於限制，除非指明，因為本發明之範疇將僅受所附申請專利範圍限制。 鳥苷酸環化酶 C

鳥苷酸環化酶C(GCC)（亦稱為STAR、ST受器、GUC2C和GUCY2C）為一種跨膜細胞表面受器，其在維持腸液、電解質穩態和細胞增殖中發揮作用(Carrithers等人， Proc Natl Acad Sci USA100: 3018-3020 (2003)；Mann等人， Biochem Biophys Res Commun239: 463-466 (1997)；Pitari等人， Proc Natl Acad Sci USA100: 2695-2699 (2003))；GenBank登錄號NM _—004963，其每一者係以引用之方式併入本文中）。此功能是經由鳥苷酸的結合而介導（Wiegand等人，FEBS Lett. 311:150-154 (1992)）。GCC亦為熱穩定腸毒素（ST，例如，具有NTFYCCELCCNPACAGCY，SEQ ID NO: 29的胺基酸序列）的受器，它是由大腸桿菌以及其他感染性生物體產生的胜肽(Rao, M. C. Ciba Found. Symp.112:74-93 (1985)；Knoop F. C.和Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods28:67-72 (1992))。ST與GCC的結合活化導致腸道疾病（例如腹瀉）的信號級聯反應。人類GCC的核苷酸序列（GenBank登錄號NM-004963）。胺基酸(SEQ ID NO: 5)。

GCC蛋白具有一些一般可接受的結構域，每個結構域都有助於GCC分子的功能。GCC的功能包括將蛋白質引導至細胞表面的信號、細胞外配體之結合、酪胺酸激酶活性和鳥苷酸環化酶催化活性。在正常人體組織中，GCC係於黏膜細胞中表現，例如在小腸、大腸和直腸內襯的頂端刷狀緣膜(Carrithers等人， Dis Colon Rectum39: 171-181 (1996))。GCC的表現在腸上皮細胞發生腫瘤轉型後仍維持，其在所有原發性和轉移性大腸直腸腫瘤中表現(Carrithers等人， Dis Colon Rectum39: 171-181 (1996); Buc等人，Eur J Cancer41: 1618-1627 (2005); Carrithers等人， Gastroenterology107: 1653-1661 (1994))。來自胃、食道和胃食道交界處的腫瘤細胞亦表現GCC(請參見例如美國專利號6,767,704；Debruyne等人， Gastroenterology130:1191-1206 (2006))。組織特異性表現以及與癌症(例如胃腸來源的癌症(例如大腸癌、胃癌或食道癌))的關聯，可用於開發使用GCC作為該疾病的診斷標誌物(Carrithers等人， Dis Colon Rectum39: 171-181 (1996); Buc等人， Eur J Cancer41: 1618-1627 (2005))。

作為細胞表面蛋白，GCC亦可作為受器結合蛋白例如抗體或配體的治療標靶。在正常腸組織中，GCC在上皮細胞緊密連接的頂端表現，該緊密連接在腔內環境和血管隔室之間形成不可滲透的屏障(Almenoff等人， Mol Microbiol8: 865-873); Guarino等人， Dig Dis Sci32: 1017-1026 (1987))。因此，全身靜脈內投與GCC結合蛋白治療劑對腸道GCC受器的影響最小，同時可接觸胃腸系統的腫瘤細胞，包括侵襲性或轉移性大腸癌細胞、腸外或轉移性大腸腫瘤、食道腫瘤或胃腫瘤、胃食道交界處的腺癌。此外，GCC會由於配體結合而經由受器介導的內吞作用而內化(Buc等人， Eur J Cancer41: 1618-1627 (2005); Urbanski等人， Biochem Biophys Acta1245: 29-36 (1995))。

針對GCC的細胞外域產生的多株抗體(Nandi等人， Protein Expr. Purif.8:151-159 (1996))能夠抑制ST胜肽結合至人類和大鼠GCC，且抑制人類GCC造成的ST-介導cGMP產生。

GCC已被鑑定為一種涉及癌症(包括大腸癌)的蛋白質。亦請參見Carrithers等人， Dis Colon Rectum39: 171-181 (1996);Buc等人， Eur J Cancer41: 1618-1627 (2005); Carrithers等人， Gastroenterology107: 1653-1661 (1994); Urbanski等人， Biochem Biophys Acta1245: 29-36 (1995)。

本文描述的針對GCC的抗原結合分子治療劑可用於抑制表現GCC的癌細胞。本發明的抗GCC抗原結合分子可結合至人類GCC。在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合分子可抑制配體(例如鳥苷酸或熱穩定腸毒素)與GCC的結合。 抗原結合分子

本發明涉及抗GCC抗原結合分子。在一些實施例中，本發明的抗GCC分子在其結合的GCC表現細胞上與GCC結合後引起細胞反應。在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑可阻斷配體結合至GCC。

天然發生的哺乳動物抗體的典型結構單元為四聚體。每個四聚體由兩對多肽鏈組成，每對具有一條「輕」鏈(約25 kDa)和一條「重」鏈(約50-70 kDa)。每條鏈的胺基端部分包括主要負責抗原識別的約100至110個或更多個胺基酸的可變區。每條鏈的羧基端部分定義出主要負責效應子功能的恆定區。人類輕鏈可分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為mu、delta、gamma、alpha或epsilon，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區由一具約12個或更多胺基酸的「J」區連接，其中重鏈亦包括一具約10個以上的胺基酸的「D」區。一般請參見 Fundamental ImmunologyCh. 7 (Paul, W.編，二編，Raven Press, N.Y. (1989))。每一輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。抗GCC抗體分子的較佳同種型為IgG免疫球蛋白，其可分為四種亞型，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各具有不同的γ重鏈。大多數治療性抗體為IgG1類型的人類、嵌合性或人源化抗體。在一特定實施例中，該抗GCC抗體分子具有IgG1同種型。

每一重鏈和輕鏈對的可變區形成抗原結合位點。因此，完整的IgG抗體具有兩個相同的結合位點。然而，雙功能或雙特異性抗體為人工雜交構建體，其具有兩個不同的重/輕鏈對，導致兩個不同的結合位點。

這些鏈都具有由三個高度變異區(亦稱為互補決定區或CDR)連接的相對保守框架區(FR)的相同一般結構。來自每對兩條鏈的CDR藉由框架區對齊，而能夠與特異性表位結合。從N端到C端，輕鏈和重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每一結構域的胺基酸係依據下列文獻之定義指定：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987及1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia等人， Nature342:878-883 (1989)。如本文所用，CDR係依據Kabat針對重鏈(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和輕鏈(LCDR1、LCDR2、LCDR3)之每一者之規則而指稱。

抗GCC抗體分子可包含本文所述抗體的全部、或CDR或重鏈的抗原結合子集。本文描述的抗GCC抗原結合劑的胺基酸序列，包括可變區和CDR，可見於表1至3。

因此，在一實施例中，該抗體分子包括以下之一或二者： (a)一、二、三個或抗原結合數目之人類抗體之輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)，例如衍生自人類雜交瘤的抗體或鼠類抗體者(例如，US20180355062A1中描述的GCC抗體的輕鏈，其以全文引用之方式併入本文中)。在實施例中，該CDR可包含如下的LCDR1至3之一或多個或全部的胺基酸序列：LCDR1或經修飾的LCDR1，其中一到七個胺基酸經保守性取代；LCDR2或經修飾的LCDR2，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；或LCDR3或經修飾的LCDR3，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；以及 (b)一、二、三個或抗原結合數目之重鏈CDR (HCDR1、HCDR2及/或HCDR3)，如本文所述。在實施例中，CDR可包含如下的HCDR1至3中的一或多個或全部的胺基酸序列：HCDR1或經修飾的HCDR1，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；HCDR2或經修飾的HCDR2，其中一至四個胺基酸經保守性取代；或HCDR3或經修飾的HCDR3，其中一或兩個胺基酸經保守性取代。

在一些實施例中，本發明的抗GCC抗體分子可使表現GCC的細胞(例如腫瘤細胞)產生抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。由於其具有結合至Fc受器的能力，具有IgG1和IgG3同種型的抗體可用於引發抗體依賴性細胞毒性能力之效應子功能。具有IgG2和IgG4同種型的抗體可用於使ADCC反應最小化，因為它們結合至Fc受器的能力低。在相關實施例中，可進行抗體的Fc區取代或醣基化組成的變化，例如藉由在經修飾的真核細胞株中生長，以增強Fc受器辨識、結合及/或介導抗GCC抗體所結合之細胞的細胞毒性(請參見，例如，美國專利號7,317,091、5,624,821 、和文獻包括 WO 00/42072，Shields等人， J. Biol. Chem.276:6591-6604 (2001), Lazar等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103:4005-4010 (2006)，Satoh等人， Expert Opin Biol. Ther.6:1161-1173 (2006))。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段(例如，人源化抗體、人類抗體)可包括改變或裁剪功能(例如，效應子功能)的胺基酸取代或置換。例如，人類來源恆定區(例如，γ1恆定區、γ2恆定區)可設計為降低補體活化及/或Fc受器結合。(請參見，例如，美國專利第5,648,260號(Winter等人)、美國專利第5,624,821號(Winter等人)和美國專利第5,834,597號(Tso等人)，其全部教示係以全文引用之方式併入本文中)。較佳地，包含此類胺基酸取代或置換的人類來源恆定區胺基酸序列，與人類來源之未經改變恆定區胺基酸序列在全長上至少約95%一致，更佳地，與人類來源之未經改變恆定區胺基酸序列在全長上至少約99%一致。額外的抗GCC抗原結合分子進一步描述於美國專利號8,785,600 (Nam等人)，其全部教示係以引用之方式併入本文中。

在又一實施例中，效應子功能亦可藉由調節抗體的醣基化模式來改變。改變是指刪除抗體中發現的一或多個醣類部分，及/或加入一或多個抗體中不存在的醣基化位點。例如，在美國專利申請公開號2003/0157108 (Presta)中描述具有增強的ADCC活性和成熟的醣類結構的抗體，該結構缺乏連接到抗體Fc區的岩藻醣。亦請參見美國專利申請公開號2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo股份有限公司)。Glycofi亦開發出能夠產生抗體特異性醣型的酵母細胞株。

額外地或替代地，可製備具有醣基類型改變的抗體，例如具有降低量的岩藻醣基殘基的低岩藻醣基化抗體、或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。此種改變的醣基化模式已被證明可增加抗體的ADCC能力。此類醣類修飾可藉由例如在具有經改變的醣基化機制的宿主細胞中表現該抗體而達成。本領域已描述具有改變的醣基化機制的細胞，且可使用作為宿主細胞，其中經改造以表現本發明的重組抗體，因而產生具有改變的醣基化的抗體。例如，EP 1,176,195 (Hang等人)中描述具有功能被破壞的FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻醣基轉移酶，使得在此類細胞株中表現的抗體展現低岩藻醣基化。PCT公開號WO 03/035835 (Presta)描述一種變異性CHO細胞株--Lec13細胞，其將岩藻醣連接至Asn(297)-連接醣類上的能力降低，亦導致在該宿主細胞中表現的抗體呈現低岩藻醣基化(亦請見Shields, R. L.等人，2002 J. Biol. Chem.277:26733-26740)。PCT公開號WO 99/54342 (Umana等人)描述經改造以表現醣蛋白修飾醣基轉移酶(例如，β(1,4)-N 乙醯胺基葡萄醣基轉移酶III (GnTIII))的細胞株，使得在該經改造細胞株中表現的抗體表現出增加的等分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加(亦請參見Umana等人，1999 Nat. Biotech.17:176-180)。

人源化抗體亦可使用CDR-嫁接方法製備。產生此類人源化抗體的技術為本領域已知。通常，人源化抗體是藉由獲得編碼與GCC結合的抗體之可變重鏈和可變輕鏈序列的核酸序列、辨識該可變重鏈和可變輕鏈序列中的互補決定區或「CDR」，並將該CDR核酸嫁接至人類框架核酸序列上而產生。(請參見，例如，美國專利號4,816,567和5,225,539)。CDR和框架殘基的位置可確定(請參見Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部，NIH出版編號91-3242，以及Chothia, C.等人， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))。

本文所述的抗GCC抗體分子具有表5和6列出的CDR胺基酸序列和編碼各CDR的核酸序列。在一些實施例中，可將表5和6的序列加入可識別GCC的分子中，以用於本文描述的治療或診斷方法中。選出的人類框架為一種適合體內投藥的框架，這意味著它不具有免疫原性。例如，此種決定可經由此類抗體的體內使用和胺基酸相似性研究的先前經驗而進行。合適的框架區可選自於人類來源抗體，其在與供體抗體如抗GCC抗體分子(例如3G1)的等效部分(例如框架區)的胺基酸序列內的框架區長度上，具有至少約65%胺基酸序列一致性，較佳至少約70%、80%、90%或95%胺基酸序列一致性。可使用合適的胺基酸序列比對演算法，例如CLUSTAL W，使用預設參數來決定胺基酸序列一致性。(Thompson J. D.等人， Nucleic Acids Res.22:4673-4680 (1994))。

一旦辨識出待人源化的複製抗體之CDR和FR，便可辨識出編碼該CDR的胺基酸序列，並將相對應的核酸序列嫁接到選定的人類FR上。此可使用已知的引子和連接子來完成，其選擇為本領域已知。特定人類抗體的所有CDR可被非人類CDR的至少一部分替換，或者僅部分CDR可被非人類CDR替換。僅需要替換該人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數量。在CDR嫁接至選定的人類FR上後，所得的「人源化」可變重鏈和可變輕鏈序列係經表現，以產生與GCC結合的人源化Fv或人源化抗體。較佳地，經CDR-嫁接的(例如，人源化的)抗體係以與供體抗體的親和力相似、實質上相同或更好的親和力與GCC蛋白結合。通常，該人源化可變重鏈和輕鏈序列係表現為具有人類恆定域序列的融合蛋白，因此獲得與GCC結合的完整抗體。然而，可產生不包含該恆定序列的人源化Fv抗體。

如本文所述的抗體或其片段亦落於本發明範圍內，例如人源化抗體，其中特定胺基酸已經取代、刪去或加入至CDR或框架區。特別地，人源化抗體可在框架區具有胺基酸取代，例如以增進與抗原的結合。例如，經選定、小數目的人源化免疫球蛋白鏈的接受者框架殘基，可被相對應的供體胺基酸置換。取代的位置包括與CDR相鄰的胺基酸殘基，或能夠與CDR相互作用的胺基酸殘基(請參見例如美國專利號5,585,089或5,859,205)。接受者框架可為成熟的人類抗體框架序列或共通序列。如本文所用，術語「共通序列」是指在相關家族成員中的某一區域之序列的每一位置處最常見的或由最共通的殘基設計的序列。有多種人類抗體共通序列可使用，包括人類可變區不同亞群的共通序列(請參見Kabat, E. A.,等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部，美國政府印務局(1991))。Kabat數據庫及其應用可在線上免費獲得，例如經由IgBLAST，國家生物技術信息中心，貝塞斯達，馬里蘭州(亦請見，Johnson, G.及Wu, T. T., Nucleic Acids Research29:205-206 (2001))。

在某些實施例中，該GCC抗體分子為人類抗GCC IgG1抗體。由於此類抗體具有與GCC分子所希望的結合，因此此類抗體中的任一者皆可容易地進行同種型轉換，以產生人類IgG4同種型，例如，同時仍具有相同的可變區(其定義該抗體的特異性和親和力，在一定程度上)。因此，當產生滿足如上文所討論的希望「結構」屬性的抗體候選物時，它們通常可提供至少某些經由同種型轉換所希望的額外「功能」屬性。

在一些態樣中，包含一抗體片段的本發明CAR組成物的一部分經人源化或最佳化，其中保留對標靶抗原的高親和力和其他有利的生物學特性。根據本發明之一態樣，人源化抗體和抗體片段是藉由使用親本和人源化序列的三維模型分析該親本序列和各種概念性人源化產物的方法而製備。三維免疫球蛋白模型為一般可獲得，且為本領域技術人員所熟悉的。可使用電腦程式來演示和展示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構。檢查這些展示允許分析該殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能扮演的角色，例如影響候選免疫球蛋白結合至標靶抗原的能力的殘基分析。

以此方式，可從接受和導入序列中選擇和組合FR殘基，以獲得期望的抗體或抗體片段特徵，例如對標靶抗原的親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最實質地涉及影響抗原結合。

人源化或最佳化的抗體或抗體片段可保留與原始抗體相似的抗原特異性，例如，在本發明中，與人類GCC結合的能力。在一些實施例中，人源化抗體或抗體片段可具有增進的與人類GCC結合的親和力及/或特異性。

在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑包含表1中提供的一或多個CDR序列。在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑包含具有表1中提供的CDR 1的重鏈可變區。在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑包含具有表1中提供的CDR 2的重鏈可變區。在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑包含具有表1中提供的CDR 3的重鏈可變區。在一些實施例中，抗GCC抗原結合劑包含具有表1中提供的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區。在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑係由具有表1中提供的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區組成。在一些實施例中，抗GCC抗原結合劑包含表1中提供的一或多個CDR序列，其中該CDR包含1、2或3個胺基酸取代。在一實施例中，該取代不會不利地影響結合劑與其標靶之結合。 表 1. 根據 Kabat 的例示性抗 GCC CDR 序列

	HCDR 1	HCDR 2	HCDR 3
V1	HYYWS (SEQ ID NO: 8)	RIYPSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 11)	DRSTGWSEWNSDL (SEQ ID NO: 16)
V1-01	HYYWS (SEQ ID NO: 8)	RIYPSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 11)	DRSTGWSEWNSDL (SEQ ID NO: 16)
V5	RYWMS (SEQ ID NO: 9)	KIRHDGGEKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 12)	DYTRDV (SEQ ID NO: 17)
V36	RYWMT (SEQ ID NO: 10)	KI KYDGSEKYYADSVKG (SEQ ID NO: 13)	DYNKDY (SEQ ID NO: 18)
V48	RYWMT (SEQ ID NO: 10)	KI RHDGGEKYYPDSVKG (SEQ ID NO: 14)	DYNKDL (SEQ ID NO: 19)
V51	RYWMT (SEQ ID NO: 10)	KIRHDGGEKYYADSVKG (SEQ ID NO: 15)	DYNKDY (SEQ ID NO: 18)

非完整抗體的抗GCC抗體亦可用於本發明。在一些實施例中，抗GCC抗原結合劑為包含具有表1中提供的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區的單域抗體。此類抗體可衍生自上述任何抗體。此類可使用的抗體分子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；(ii)一F(ab′) ₂片段，此為一個二價片段，包含在鉸鏈區經雙硫鍵連接的兩個Fab片段；(iii)由VH和CH1域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人， Nature341:544-546 (1989))，其由VH域組成；(vii)單域功能性重鏈抗體，其由VHH域(稱為奈米抗體)組成，請參見例如Cortez-Retamozo等人， Cancer Res.64: 2853-2857 (2004)，以及引用於此的參考文獻；(vii)經分離的CDR，例如一或多個經分離的CDR與足夠的框架一起提供一抗原結合片段。此外，雖然Fv片段的兩個域VL和VH由不同的基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接子將它們連接起來，使它們能夠成為單一蛋白鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；請參見例如，Bird等人， Science242:423-426 (1988)；以及Huston等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 (1988)。此類單鏈抗體亦包含在術語抗體的「抗原結合片段」內。這些抗體片段是使用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並以與完整抗體相同的方式進行效用篩選。抗體片段，例如Fv、F(ab′) ₂和Fab可藉由切割完整蛋白質(例如藉由蛋白酶或化學切割)而製備。 單域抗體

單域抗體(sdAb)與傳統4-鏈抗體的不同之處在於具有單一單體抗體可變域。例如，駱駝科動物和鯊魚產生稱為僅具重鏈之抗體(HcAbs)的sdAb，其天生缺乏輕鏈。駱駝源化僅具重鏈之抗體的每一臂中的抗原結合片段，具有單一重鏈可變域(VHH)，它可以在沒有輕鏈幫助的情況下對抗原具有高親和力。駱駝源化VHH被稱為最小的功能性抗原結合片段，分子量約為15 kD。在一些實施例中，該抗原結合劑為單一人類重鏈可變域(VH)抗體。此種結合分子也稱為Humabody®且在本文中可互換使用。Humabody®為Crescendo Biologics有限公司的註冊商標。

本申請案之一態樣係提供一種特異性結合至GCC(例如人類GCC)的經分離單域抗體(本文稱為「抗GCC sdAb」)。在一些實施例中，抗GCC sdAb調節GCC活性。在一些實施例中，抗GCC sdAb為拮抗劑抗體。進一步提供衍生自本文描述的任一抗GCC sdAb的抗原結合片段，以及包含本文描述的任一抗GCC sdAb的抗原結合蛋白。在一些實施例中，該抗GCC sdAb包含表1中提供的一、二及/或三個CDR序列。例示性抗GCC sdAb列於表2和3中。在一些實施例中，該抗GCC sdAb包含表2或表3中提供的可變重鏈域。在一些實施例中，抗GCC sdAb由表2或表3中提供的可變重鏈域組成。

在一些實施例中，一些或所有CDR序列、VH結構域或重鏈可用於另一抗原結合劑中，例如用於CDR嫁接、人源化或嵌合性抗體分子。實施例包括一抗體分子，其包含足夠的CDR，例如來自上述重鏈可變區之一的所有三個CDR，以允許結合至細胞表面的GCC。

在一些實施例中，該CDR，例如所有的HCDR，被嵌入人類或人類衍生的框架區中。人類框架區的實例包括人類生殖系(germline)框架序列、已親和力成熟化(體內或體外)的人類生殖系序列，或合成的人類序列，例如共通序列。在一實施例中，該重鏈框架為IgG1或IgG2框架。

在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含表2中提供的重鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，該抗GCC抗原結合劑為僅具單域重鏈的抗體(例如，不包含免疫球蛋白輕鏈的抗原結合劑)。 表 2. 例示性重鏈可變區（ VH ）胺基酸序列

描述	VH胺基酸序列
V1	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1)
V1-01	EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20)
V5	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDYTRDVWGQGTAVTVSS (SEQ ID NO: 21)
V36	EVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGGRLEWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26)
V48	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYPDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDNLRAEDTAMYYCTRDYNKDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27)
V51	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28)

在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含一重鏈可變區胺基酸序列，其與表2中提供的VH序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含如表2中所示的重鏈可變區胺基酸序列，其中該序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。在一實施例中，該取代落於CDR區之外。在一些實施例中，VH抗GCC抗原結合劑(例如，單域抗體)包含一前導序列。在一些實施例中，該VH抗-GCC抗原結合劑包含一前導序列，其包含MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 6)、MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)或MEFGLSWVFLVAIIKGVQC (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，該VH抗GCC抗原結合劑包含一前導序列，其包含MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 4)。

在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含一重鏈可變區胺基酸序列，其與表3中提供的VH序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含如表3中所示的重鏈可變區胺基酸序列，其中該序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。在一實施例中，該取代落於CDR區之外。在一些實施例中，本發明的抗GCC抗原結合劑包含一重鏈可變區胺基酸序列，其與表3中提供的VH序列一致。

在一些實施例中，該VH抗GCC抗原結合劑(例如，單域抗體)包含一前導序列，其條件為與表3中提供者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VH抗GCC抗原結合劑(例如，單域抗體)包含表3中提供之一前導序列。 表 3. 例示性重鏈可變區（ VH ）胺基酸序列

	前導序列	VH序列
V1	MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 6)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1)
V1-01	MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 6)	EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20)
V5	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDYTRDVWGQGTAVTVSS (SEQ ID NO: 21)
V8	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTGVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 22)
V9	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGRGLEWVAKIRYDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 23)
V30	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFGRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24)
V31	MEFGLSWVFLVAIIKGVQC (SEQ ID NO: 2)	QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 25)
V36	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	EVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGGRLEWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26)
V48	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYPDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDNLRAEDTAMYYCTRDYNKDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27)
V51	MELGLSWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO: 7)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28)

用於體內治療或診斷用途的抗體片段可受益於增進其血清半衰期的修飾。適用於增加該抗體的體內血清半衰期的有機部分可包括一、二或更多個直線或分支片段，選自於：親水性聚合物基團(例如，直線或分支聚合物(例如，聚烷二醇如聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇及類似物)、醣類(例如葡聚醣、纖維素、多醣及類似物)、親水性胺基酸的聚合物(例如聚離胺酸、聚天冬胺酸及類似物)、聚烷類氧化物和聚乙烯吡咯烷酮)、脂肪酸基團(例如單羧酸或二羧酸)、脂肪酸酯基團、脂質基團(例如二醯基甘油基團、神經鞘脂基團(例如神經醯胺基))或磷脂基團(例如，磷脂醯乙醇胺基團)。較佳地，該有機部分結合至預定位點，在該處有機部分不會損害所得免疫共軛物的功能(例如，降低抗原結合親和力)，與未共軛抗體部分相較。該有機部分可具有約500 Da至約50,000 Da，較佳約2000、5000、10,000或20,000 Da的分子量。以有機部分修飾多肽(例如抗體)的實例和方法可見於例如美國專利號4,179,337和5,612,460、PCT公開號WO 95/06058和WO 00/26256，以及美國專利申請公開號20030026805。 嵌合性抗原受器

嵌合性抗原受器(CAR)為包含三個必要單元的雜合分子：(1)一細胞外抗原結合模體，(2)連接/跨膜模體，以及(3)細胞內T細胞信號模體(Long A H, Haso W M, Orentas R J. Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigen receptor. Oncoimmunology. 2013; 2 (4):e23621)。在本文揭示的GCC特異性CAR的各種實施例中，一般流程示於圖1中。在一些實施例中，該抗GCC CAR從N端到C端包含一信號或前導胜肽、抗原結合域、跨膜及/或鉸鏈域、共刺激域和細胞內域。

本發明提供包含一CAR (例如，CAR多肽)，其包含一抗-GCC結合域(例如，如本文所述的GCC結合域)、一跨膜域、和一細胞內信號域，且其中該抗-GCC結合域包含在表1或8中列出的任何抗GCC重鏈結合域胺基酸序列之一重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、一重鏈互補決定區2 (HC CDR2)和一重鏈互補決定區3 (HC CDR3)。在一些實施例中，該抗GCC CAR從N端到C端包含一信號或前導胜肽、抗GCC VH、CD28跨膜和鉸鏈、CD28共刺激域和CD3 zeta胞內域。

該抗原結合域可為與該抗原結合的任何蛋白質，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人源化抗體及其功能片段，包括但不限於：單域抗體，例如重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)和駱駝源衍生奈米抗體的可變域(VHH)，以及替代骨架，其為本領域已知可作為抗原結合域，例如重組纖連蛋白域及類似物。在一些實施例中，該抗原結合域。

CAR的抗原結合模體通常在單鏈片段可變域(ScFv)、免疫球蛋白(Ig)分子的最小結合域或單域抗體之後形成(例如，WO2018/028647A1)。替代的抗原結合模體，例如受器配體(即，IL-13已被改造為與腫瘤表現IL-13受器結合)、完整的免疫受器、基因庫衍生的胜肽、和先天免疫系統效應子分子(例如 NKG2D)亦經改造。

CAR的連接模體可為相對穩定的結構域，例如IgG的恆定域，或被設計為延伸的彈性連接子。在一些實施例中，抗GCC結合結構域(例如，包含表1或表8中提供的序列之多肽)經由連接子(例如本文所述的連接子)連接至該跨膜域。在一些實施例中，該抗GCC CAR包括(Gly4-Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6。

結構模體，例如衍生自IgG恆定域者，可用於將ScFv結合域延伸遠離T細胞膜表面。這對於結合域特別靠近腫瘤細胞表面膜的某些腫瘤標靶可能很重要(例如二唾液酸神經節苷脂GD2；Orentas等人，未發表的觀察)。迄今為止，CAR中使用的信號模體始終包括CD3-ζ鏈，因為此核心模體是T細胞活化的關鍵信號。首個報導的第二代CAR具有CD28信號域和CD28跨膜序列。此模體也用於包含CD137 (4-1BB)信號模體的第三代CAR中(Zhao Y等人，J Immunol. 2009; 183 (9): 5563-74)。隨著新技術的出現，以與抗-CD3和抗-CD28抗體連結的微珠活化T細胞，以及來自CD28的經典「信號2」的出現，不再需要由CAR本身編碼。使用微珠活化，發現第三代載體在體外試驗中並不優於第二代載體，且它們在白血病小鼠模型中沒有明顯優於第二代載體(Haso W, Lee D W, Shah N N, Stetler-Stevenson M, Yuan C M, Pastan I H, Dimitrov D S, Morgan R A, FitzGerald D J, Barrett D M, Wayne A S, Mackall C L, Orentas R J. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia, Blood. 2013; 121 (7):1165-74；Kochenderfer J N等人，Blood. 2012; 119 (12):2709-20)。第二代CD28/CD3-ζ中的CD19特異性CAR (Lee D W等人，American Society of Hematology Annual Meeting. New Orleans, La.; Dec. 7-10, 2013)和CD137/CD3-ζ信號格式(Porter D L等人，N Engl J Med. 2011; 365 (8): 725-33)的臨床成功證明了這一點。除了CD137，其他腫瘤壞死因子受器超級家族成員如OX40也能夠在CAR轉導的T細胞中提供重要的持續信號(Yvon E等人，Clin Cancer Res. 2009; 15(18):5852-60)。同樣重要的是培養CAR T細胞群的培養條件。 跨膜域

關於跨膜域，在各種實施例中，CAR可被設計為包含一連接到CAR的胞外域(例如，抗GCC抗原結合域)的跨膜域。跨膜域可包括與該跨膜區相鄰的一或多個額外胺基酸，例如與衍生該跨膜區的蛋白質的胞外區相關的一或多個胺基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至多達15個胺基酸的細胞外區域)、及/或與衍生該跨膜蛋白的蛋白質的細胞內區域相關的一或多個額外胺基酸(例如，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10至多達15個胺基酸的細胞內區域)。

在一態樣中，該跨膜域是與所使用的CAR的其他結構域之一相關者。在一些情況下，該跨膜域可經由胺基酸取代來選擇或修飾，以避免此類結構域與該 相同或不同表面膜蛋白的跨膜域結合，例如使與該受器複合物的其他成員的相互作用最小化。在一態樣中，該跨膜域能夠與表現CAR的細胞(例如CART細胞)表面上的另一CAR進行同型二聚化。在一不同態樣中，該跨膜域的胺基酸序列可經修飾或取代，以使與該相同CAR表現細胞(例如CART)中存在的天然結合配偶體(partner)的結合域相互作用最小化。

如本文所述，該CAR包含一跨膜域。關於跨膜域，該CAR包含與CAR的細胞外GCC抗原結合域融合的一或多個跨膜域。該跨膜域可衍生自天然或合成來源。若來源是天然的，則該域可衍生自任何膜-結合蛋白或跨膜蛋白。

或者，該跨膜域可為合成性，在此情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。在一些實施例中，在合成性跨膜域的每一端會發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。視情況，短寡-或多肽連接子，長度較佳在2到10個胺基酸之間，可形成跨膜域和CAR的細胞質信號域之間的連結。在一些實施例中，該連接子為甘胺酸-絲胺酸雙聯體或三聯體丙胺酸連接子。

在一些實施例中，除了如前述之跨膜域之外，亦使用天然地與CAR的結構域之一結合的跨膜域。在一些實施例中，該跨膜域可藉由胺基酸取代來選擇，以避免此類結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜域結合，藉此使與該受器複合物的其他成員的相互作用最小化。 細胞内域

CAR的細胞質域或細胞內信號域負責活化已有CAR的免疫細胞的至少一種正常效應子功能。術語「效應子功能」是指細胞的特殊功能。例如，T細胞的效應子功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因子的分泌。因此，術語「細胞內信號域」是指轉導效應子功能信號並指導細胞執行特定功能的蛋白質之一部分。雖然通常可以使用完整細胞內信號域，但在許多情況下沒有必要使用整個鏈。就使用細胞內信號域的截短部分而言，此種截短部分可用於代替完整鏈，只要它能轉導效應子功能信號即可。因此，術語「細胞內信號域」意在包括足以轉導效應子功能信號的細胞內信號域的任何截短部分。

用於CAR的細胞內信號域的實例包括T細胞受器(TCR)和共受器的細胞質序列，其共同作用以在抗原受器接合後啟動信號轉導，以及這些序列的任何衍生物和變異體，和任何具有相同功能的合成序列。僅通過TCR產生的信號不足以完全活化T細胞，還需要次級或共刺激信號。因此，T細胞活化可視為由兩種不同類型的細胞質信號序列介導的：經由TCR(初級細胞質信號序列)啟動抗原依賴性初級活化者，以及以非抗原-依賴性的方式發揮作用，以提供次級或共刺激信號(次級細胞質信號序列)。

初級細胞質信號序列以刺激方式或抑制方式調節TCR複合物的初級活化。以刺激方式作用的初級細胞質信號序列可能包含信號模體，這些模體被稱為免疫受器酪胺酸-基礎活化模體或ITAM。在一些實施例中，CAR內的含ITAM域涵蓋與內源性TCR複合物無關之初級TCR信號傳導。在一態樣中，該初級信號由例如TCR/CD3複合物與裝載有胜肽的MHC分子結合引發，並導致T細胞反應之介導，包括但不限於增殖、活化、分化及類似作用。以刺激方式作用的初級細胞質信號序列(亦稱為「初級信號域」)可包含稱為免疫受器酪胺酸-基礎活化模體或ITAM的信號模體。

在一實施例中，細胞內信號域可包含初級細胞內信號域。例示性初級細胞內信號域包括衍生自負責初級刺激或抗原依賴性刺激的分子者。在一實施例中，細胞內信號域可包含一共刺激細胞內域。例示性共刺激細胞內信號域包括衍生自負責共刺激信號或非抗原依賴性刺激的分子者。例如，在CART的情況下，初級細胞內信號域可包含T細胞受器的細胞質序列，而共刺激細胞內信號域可包含來自共受器或共刺激分子的細胞質序列。

在一實施例中，初級信號域包含一經修飾的ITAM域，例如，與天然ITAM域相較，具有改變(例如增加或降低)活性的突變ITAM域。在一實施例中，初級信號域包含經修飾的含ITAM初級細胞內信號域，例如最佳化及/或截短的含ITAM初級細胞內信號域。在一實施例中，初級信號域包括一、二、三、四或更多個ITAM模體。 取代和變異

在一些實施例中，考慮本文提供的抗體之胺基酸序列變異體。例如，可能希望增進抗體或抗體片段(如sdAb)的結合親和力及/或其他生物學特性。抗體的胺基酸序列變異體可藉由引入適當的修飾至編碼該抗體的核酸序列中、或藉由胜肽合成而製備。此類修飾包括，例如，抗體胺基酸序列內殘基的刪去及/或插入及/或取代。可進行刪去、插入和取代的任何組合，以完成最終構建體，條件為該最終構建體具有希望的特徵，例如抗原結合。 a)取代、插入和刪除變異

在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。進行取代突變的有興趣位點包括HVR和FR。以下進一步描述胺基酸側鏈類別。可將胺基酸取代引入至有興趣的抗體中，並將產物進行希望之活性篩選，例如抗原結合度維持/增進、免疫原性降低、或ADCC或CDC增進。

胺基酸可根據共同側鏈特性來分組： （1）疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； （2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； （3）酸性：Asp、Glu； （4）鹼性：His、Lys、Arg； （5）影響鏈位向之殘基：Gly、Pro； （6）芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代係為將這些類別之一的成員交換為另一類別。

在一些態樣中，該抗原結合域為人源化。非人類抗體為人源化，其中該抗體的特定序列或區域經修飾，以增加與在人類中天然產生的抗體或其片段的相似性。在一態樣中，該抗原結合域為人源化。人源化抗體(或抗原結合片段)可使用本領域已知的各種技術產生，包括但不限於：CDR嫁接(請參見例如歐洲專利號EP 239,400；國際公開號WO 91/ 09967；和美國專利號5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每一者係以全文引用之方式併入本文中)、飾面或表面重修(請參見，例如，歐洲專利號EP 592,106和EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka等人，1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；以及Roguska等人，1994, PNAS, 91:969-973，其每一者係以全文引用之方式併入本文中)、鏈改組(請參見例如美國專利號5,565,332，其係以全文引用之方式併入本文中)，以及揭示於例如美國專利申請公開號US2005/0042664、美國專利申請公開號US2005/0048617、美國專利號6,407,213、美國專利號5,766,886、國際專利公開號WO 9317105、Tan等人，J . Immunol., 169:1119-25 (2002)、Caldas等人，Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)、Morea等人，Methods, 20(3):267-79 (2000)、Baca等人，J . Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997)、Roguska等人，Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)、Couto等人，Cancer Res., 55 (23增刊):5973s-5977s (1995)、Couto等人，Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)，以及Pedersen等人，J . Mol. SBiol., 235(3):959-73 (1994)，其每一者係以全文引用之方式併入本文中。通常，框架區中的框架殘基將被來自於CDR供體抗體的相對應殘基取代，以改變(例如增進)抗原結合。這些框架取代，例如保守取代是藉由本領域熟知的方法辨識出，例如，藉由對CDR和框架殘基的相互作用進行模擬，以辨識出對於抗原結合和序列比對重要的框架殘基，以辨識出在特定位置的不尋常框架殘基。(請參見例如，Queen等人，美國專利號5,585,089；以及Riechmann等人，1988, Nature, 332:323，其係以全文引用之方式併入本文中)。

人源化抗體或抗體片段具有一或多個來自非人類來源的胺基酸殘基保留在其中。這些非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，通常取自「輸入」可變域。如本文所提供，人源化抗體或抗體片段包含來自非人類免疫球蛋白分子和框架區的一或多個CDR，其中包含該框架的胺基酸殘基完全或大部分衍生自人類生殖系。用於抗體或抗體片段人源化的多種技術為本領域已知。

取代變異體之一種類型涉及取代親本抗體(例如，人源化或人抗體)的一或多個高度變異區殘基。通常，經選擇用於進一步研究的所得變異體，相較於親本抗體，在某些生物學特性(例如增加的親和力、降低的免疫原性)方面將具有修飾(例如，增進)，及/或將實質上保留該親本抗體的某些生物學特性。例示性取代變異體為親和力成熟的抗體，其可方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，如本文所述者。簡而言之，一或多個HVR殘基發生突變，而該變異抗體展示在噬菌體上，並針對特定的生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

可在HVR中進行改變(例如，取代)，以例如增進抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」中進行，即由在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變的密碼子編碼的殘基(請參見，例如，Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))，及/或SDR(a-CDR)，其中所得變異體VH或VL的結合親和力係經測試。藉由構建及自二級庫中重新篩選而達成親和力成熟，已描述於如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’ Brien等人編，Human Press, Totowa, NJ, (2001))。在親和力成熟的一些實施例中，在選定用於成熟化的可變基因中引入多樣性，藉由多種方法之任一者達成(例如，易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸-定向突變)。之後創建二級庫。之後篩選該庫，以辨識出具有希望親和力的任何抗體變異體。另一種引入多樣性的方法涉及HVR-導向法，其中數個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)被隨機化。參與抗原結合的HVR殘基可被特異性辨識出，例如，使用丙胺酸掃描突變或模擬。尤其是CDR-H3和CDR-L3經常成為標靶。

在一些實施例中，取代、插入或刪去可發生在一或多個HVR內，只要此類改變實質上不降低抗體結合抗原的能力。例如，可在HVR內進行實質上不會降低結合親和力的保守性改變(例如，本文提供的保守性取代)。此類改變可能在HVR「熱點」或CDR之外。在上文提供的變異體VH序列的一些實施例中，每一HVR未經改變或包含不超過一、二或三個胺基酸取代。

一種用於辨識抗體中目標用於突變的殘基或區域的可用方法被稱為「丙胺酸掃描突變」，描述於Cunningham和Wells (1989) Science, 244: 1081-1085中。在此方法中，目標殘基之一殘基或殘基組(例如帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被辨識出，並被中性或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代，以決定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。其他取代可引入至顯示出對初始取代的功能敏感性的胺基酸位置處。替代地或額外地，抗原-抗體複合物的晶體結構係用於辨識抗體和抗原之間的接觸位點。此類接觸殘基和相鄰殘基可被靶向或消除，而作為取代的候選物。可篩選變異體以確定其是否含有所希望的特性。

胺基酸序列的插入包括胺基及/或羧基端融合，長度範圍從一個殘基到含有一百個或更多個殘基的多肽，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N-端甲硫胺醯殘基的抗體。該抗體分子的其他插入型變異體包括抗體的N-或C-端融合至一酵素(例如，針對ADEPT)或一增加該抗體之血清半衰期的多肽。 b)醣基化變異體

在一些實施例中，本文提供的抗體經改變以增加或減少抗體被醣基化的程度。向抗體加入或刪除醣基化位點可方便地藉由改變胺基酸序列，藉此創造或移除一或多個醣基化位點而達成。

在抗體包含一Fc區時，與其相連的碳水化合物可被改變。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支、雙觸角寡醣，其藉由N-橋聯連結至Fc區之CH2域的Asn297。請參見例如，Wright等人 TIBTECH 15: 26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯葡醣胺(GlcNAc)、半乳醣和唾液酸，以及在雙觸角寡醣結構的「主幹」中連接至GlcNAc的岩藻醣。在一些實施例中，本申請案的抗體可進行寡醣修飾，以創造具有某些增進特性的抗體變異體。

在一些實施例中，係提供具有醣類結構的抗體變異體，該醣類結構缺乏(直接或間接)連接到Fc區的岩藻醣。例如，此類抗體中岩藻醣的含量可為1至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻醣的量是藉由計算Asn297醣鏈內的岩藻醣平均含量而決定的，相對於與Asn 297相連的所有醣結構(例如，複合、雜合和高度甘露醣結構)的總和，以MALDI-TOF質譜法測量，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區約位置297的天冬醯胺殘基(Fc區殘基的EU編號)；然而，由於抗體的微小序列差異，Asn297也可能位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，即介於位置294和300之間。此類岩藻醣基化變異體可具有增進的ADCC功能。請參見，例如，美國專利公開號US 2003/0157108 (Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo股份有限公司)。與「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺失」抗體變異體相關的文獻實例包括：US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體的細胞株實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化的Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986)；US專利申請案號US 2003/0157108 A1, Presta, L；及WO 2004/056312 A1, Adams等人)，以及敲除細胞株，例如α-1, 6-岩藻醣基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(請參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng., 94 (4):680-688 (2006)；以及WO2003/085107)。

抗體變異體更提供二等分的寡醣，例如，其中連接到抗體Fc區的雙觸角寡醣被GlcNAc二等分。此類抗體變異體可能具有降低的岩藻醣基化及/或增進的ADCC功能。此類抗體變異體的實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利號6,602,684 (Umana等人)；以及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供在連接到Fc區的寡醣中具有至少一個半乳醣殘基的抗體變異體。此類抗體變異體可具有增進的CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；以及WO 1999/22764 (Raju, S.)。

CAR (包括其功能部分和功能變異體)可藉由本領域已知的方法獲得。CAR可經由任何製備多肽或蛋白質的合適方法製備。自始合成多肽和蛋白質的合適方法描述於參考文獻中，例如Chan等人，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；Peptide and Protein Drug Analysis, Reid, R.編, Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, Westwood等人編， Oxford University Press， Oxford， United Kingdom， 2001；以及美國專利號5,449,752。此外，多肽和蛋白質可使用本文所述的核酸使用標準重組方法重組產生。請參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, N Y, 1994. 此外，一些CAR (包括其功能部分和功能變異體)可從來源，例如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物(例如大鼠、人類)等中分離及/或純化出。分離和純化的方法為本領域已知。或者，本文所述的CAR (包括其功能部分和功能變異體)可由工廠工業合成。在此態樣中，CAR可為合成性、重組性、經分離及/或經純化。 可偵測標記物與標籤

對本文揭示的一或多種抗原具有特異性的抗體抗原結合片段亦可與標籤蛋白一起表現(例如，共表現)。在一些實施例中，弗林蛋白酶識別位點和下游2A自切割胜肽序列被設計用於該標籤序列和抗體序列同步雙基因表現。在一些實施例中，該2A序列包含核酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，弗林蛋白酶和P2A序列包含編碼SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之核酸序列。在一些實施例中，P2A標籤包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或具有與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性的序列。

在一些實施例中，對本文揭示的一或多種抗原具有特異性的抗體或其抗原結合片段，亦可與EGFR一起表現。在一些實施例中，對本文揭示的一或多種抗原具有特異性的抗體或其抗原結合片段，係與截短的EGFR (tEGFR)一起表現(例如，共表現)。在一些實施例中，tEGFR包含與SEQ ID NO: 43至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致的胺基酸序列。 tEGFR：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM (SEQ ID NO: 43)

對本文揭示的一或多種抗原具有特異性的抗體或其抗原結合片段，亦可與可偵測標記物共軛；例如，能夠藉由ELISA、分光光度法、流式細胞術、顯微術或診斷成像技術(例如電腦斷層掃描(CT)、電腦軸向斷層掃描(CAT)掃描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)、磁共振斷層掃描(MTR)、超音波、光纖檢查和腹腔鏡檢查)偵測的可偵測標記物。可偵測標記物的具體、非限制性實例包括螢光基團、化學發光劑、酵素聯結、放射性同位素和重金屬或化合物(例如用於以MRI偵測的超順磁性氧化鐵奈米晶體)。例如，可使用的可偵測標記物包括螢光化合物，包括螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白、鑭系元素磷光體、及類似物。亦可使用生物發光標記物，例如螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)。

抗體或其抗原結合部分亦可與用於偵測的酵素共軛，例如辣根過氧化酶、β-半乳醣苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄醣氧化酶、及類似物。當抗體或其抗原結合部分與可偵測的酵素共軛時，可藉由加入額外的試劑進行偵測，該酵素使用該額外試劑產生可辨別的反應產物。例如，當辣根過氧化酶試劑存在時，加入過氧化氫和二胺基聯苯胺會產生有色反應產物，該產物可目視偵測。抗體或其抗原結合部分亦可與生物素共軛，並經由抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)結合的間接測量來偵測。應當注意的是，抗生物素蛋白本身可與酵素或螢光標記共軛。

抗體或其抗原結合部分可與順磁性劑例如釓共軛。順磁性試劑如超順磁性氧化鐵亦可作為標記物。抗體亦可與鑭系元素(例如銪和鏑)和錳共軛。抗體或抗原結合片段亦可標記有可被二級報導子辨識的預定多肽表位(例如白胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合位點、金屬結合域、表位標籤)。

抗體或其抗原結合部分亦可與放射性標記的胺基酸共軛。放射性標記可用於診斷和治療目的。例如，放射性標記可用於藉由X射線、發射光譜或其他診斷技術偵測本文揭示的一或多種抗原和抗原表現細胞。此外，該放射性標記可在治療上作為毒素，以治療個體的腫瘤，例如治療神經母細胞瘤。多肽之標籤的實例包括但不限於以下放射性同位素或放射性核苷酸： ³H、 ¹⁴C、 ¹⁵N、 ³⁵S、 ⁹⁰Y、 ⁹⁹Tc、 ¹¹¹In、 ¹²⁵I、 ¹³¹I。

偵測此類可偵測標記物的方法為本領域技術人員眾所周知的。因此，例如，放射性標記可使用照相底片或閃爍計數器偵測，螢光標記物可使用光偵測器偵測發出的光線而偵測。酵素性標記物通常藉由提供酵素與受質，並偵測酵素對受質作用產生的反應產物，且藉由簡單地觀察有色標記物而偵測該顯色標記物。 核酸、表現載體及宿主細胞

本發明之一實施例進一步提供一種核酸，其包含編碼本文所述的抗體或其抗原結合部分(包括其功能部分和功能變異體)的核苷酸序列。本發明的核酸可包含編碼本文所述的前導序列、抗原結合域、跨膜域及/或細胞內T細胞信號域之任一者的核苷酸序列。在一態樣中，本發明包括包含編碼抗體或其片段的核酸分子的重組核酸構建體，其中該核酸分子包含編碼抗GCC結合域的核酸序列。在一態樣中，本發明提供編碼SEQ ID No: 1、20、21、26、27或28的VH胺基酸序列，或具有與SEQ ID No: 1、20、21、26、27或28至少75%、80%、90%或95%的序列一致性。在一些實施例中，該核酸包含與SEQ ID No: 30-34至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列。

在一些實施例中，該核苷酸序列可經密碼子修飾。不受特定理論的束縛，一般相信該核苷酸序列的密碼子最佳化可增加mRNA轉錄物的轉譯效率。該核苷酸序列的密碼子最佳化可能涉及以天然密碼子取代另一個編碼相同胺基酸的密碼子，但可藉由細胞內更容易獲得的tRNA轉譯，因而提高轉譯效率。該核苷酸序列的最佳化亦可降低會干擾轉譯的二級mRNA結構，因而提高轉譯效率。

在一態樣中，本發明涉及一載體，其包含本文所述的核酸分子，例如編碼本文所述的抗體或抗原結合片段的核酸分子。在一實施例中，該載體選自於由以下組成之組：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。

在一實施例中，該載體為慢病毒載體。在一實施例中，該載體進一步包含一啟動子。在一實施例中，該啟動子為EF-1啟動子。

表現載體包括質體、逆轉錄病毒、黏接質體、YAC、EBV衍生的附加體、及類似物。一種方便的載體為編碼功能完整人類CH或CL免疫球蛋白序列的載體，其具有經改造的適當限制性位點，以便可以輕鬆插入和表現任何VH或VL序列。在此種載體中，剪接通常發生在插入J區的剪接供體位點和人類C區之前的剪接受體位點之間，也發生在人類CH外顯子內的剪接區。合適的表現載體可包含許多組件，例如複製起點、可選擇標記基因、一或多種表現控制元件，例如轉錄控制元件(例如啟動子、增強子或終止子)、及/或一或多個轉譯信號、一信號序列或前導序列、及類似物。聚腺苷酸化和轉錄終止發生在該編碼區下游的天然染色體位點。所得嵌合性抗體可與任何強啟動子連接。可使用的合適載體實例包括適用於哺乳動物宿主並以病毒複製系統為基礎者，例如猿猴病毒40(SV40)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK突變體(BKV)，或小鼠和人類巨細胞病毒(CMV)，以及莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、天然Ig啟動子等。多種合適的載體為本領域已知，包括維持在單副本或多副本、或整合到宿主細胞染色體中的載體，例如，經由LTR，或經改造而具有多個整合位點的人工染色體(Lindenbaum等人， Nucleic Acids Res.32:e172 (2004)、Kennard等人， Biotechnol. Bioeng. Online May 20, 2009)。合適載體的額外實例在後面章節中列出。

本發明亦包括可直接轉染到細胞中的RNA構建體。一種產生用於轉染的mRNA的方法，涉及以特別設計的引子對模板進行體外轉錄(IVT)，之後進行polyA加入步驟，以產生含有3'和5'未轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核醣體進入位點(IRES)、待表現的核酸和polyA尾部，長度通常為50至2000個鹼基。如此產生的RNA可有效地轉染不同種類的細胞。在一實施例中，該模板包括用於該CAR之序列。在一實施例中，藉由電穿孔將RNA CAR載體轉導至細胞例如T細胞或NK細胞中。

因此，本發明提供一種包含一核酸的表現載體，該核酸編碼一抗體、抗體的抗原結合片段(例如，人類、人源化、嵌合抗體或任何前述的抗原結合片段)、抗體鏈的核酸(例如，重鏈、輕鏈)或結合至GCC蛋白的抗體鏈的抗原結合部分。

在真核宿主細胞中的表現是有用的，因為此類細胞比原核細胞更有可能組裝和分泌出正確折疊的和具有免疫學活性的抗體。然而，任何所得由於不正確折疊而失活之抗體，可根據已知方法重新恢復活性(Kim及Baldwin, “Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding”, Ann. Rev. Biochem.51, 第459-89頁(1982))。宿主細胞可能會產生完整抗體的一部分，例如輕鏈二聚體或重鏈二聚體，其亦為本發明的抗體類似物。

在一實施例中，可將核酸加入重組表現載體中。在此方面，一實施例提供包含該核酸任一者的重組表現載體。出於本文目的，術語「重組表現載體」是指基因經修飾的寡核苷酸或聚核苷酸構建體，當該構建體包含編碼該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽的核苷酸序列時，其允許宿主細胞表現該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽，且該載體在足以在細胞內表現該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽的條件下與該細胞接觸。這些載體並非以一個整體天然發生。

然而，該載體之一部分可為天然發生。重組表現載體可包含任一類型的核苷酸，包括但不限於DNA和RNA，其可為單鏈或雙鏈、合成或部分來自天然來源，且可包含天然的、非天然的或經改變的核苷酸。該重組表現載體可包含天然發生或非天然發生的核苷酸間聯結，或兩種類型的聯結兼具。較佳地，非天然發生或經改變的核苷酸或核苷酸間聯結並不阻礙載體的轉錄或複製。

在一實施例中，該重組表現載體可為任何合適的重組表現載體，且可用於轉型或轉染任何合適的宿主細胞。合適的載體包括設計用於繁殖和擴增或用於表現、或兩者兼有的載體，例如質體和病毒。該載體可選自於由下組成之組：pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, CA)、pET系列 (Novagen, Madison, WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。

亦可使用噬菌體載體，例如λ、λZapII (Stratagene)、EMBL4和λNMI 149。植物表現載體的實例包括pBIO1、pBI101.2、pBHO1.3、pBI121 和 pBIN19(Clontech)。動物表現載體的實例包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo (Clontech)。重組表現載體可為病毒載體，例如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。慢病毒載體是衍生自慢病毒基因組的至少一部分的載體，尤其包括自失活慢病毒載體，如提供於Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)。可用於臨床的慢病毒載體的其他實例包括，例如但不限於，來自Oxford BioMedica plc 的LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen的LENTIMAX™載體系統、及類似技術。非臨床類型的慢病毒載體亦可獲得，且為本領域技術人員已知。

許多轉染技術為本領域已知(請參見，例如Graham等人，Virology, 52: 456-467 (1973)；如前述之Sambrook等人；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986)；以及Chu等人，Gene, 13: 97 (1981))。

轉染方法包括磷酸鈣共沉澱(請參見例如如前述之Graham等人)、直接微量注射到培養細胞中(請參見例如Capecchi, Cell, 22:479-488 (1980))、電穿孔(請參見例如，Shigekawa等人，BioTechniques, 6: 742-751 (1988))、微脂體介導的基因轉移(請參見例如，Mannino等人，BioTechniques, 6: 682-690 (1988))、脂質介導的轉導(請參見例如，Feigner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987))、和使用高速微彈的核酸遞送(請參見例如，Klein等人，Nature, 327: 70-73 (1987))。

在一實施例中，重組表現載體可使用(例如)如前述之Sambrook等人及如前述之Ausubel等人所描述之標準重組DNA技術製備。可製備環狀或直線表現載體的構建體，以包含在原核或真核宿主細胞中發揮作用的複製系統。複製系統可衍生自例如ColE1、2μ質體、λ、SV40、牛乳突狀瘤病毒、及類似病毒。

重組表現載體可包含調控序列，例如轉錄和轉譯起始和終止密碼子，其特異於待引入該載體的宿主細胞類型(例如細菌、真菌、植物或動物)，若合適的話，並考慮該載體是基於DNA還是基於RNA。該重組表現載體可包含限制性位點，以幫助選殖。

重組表現載體可包括一或多種標記基因，其允許篩選出經轉型或經轉染的宿主細胞。標記基因包括殺生物劑抗性，例如對抗生素、重金屬等的抗性，在營養缺陷型宿主中的互補，以提供原養型及類似物。適用於本發明表現載體的標記基因包括，例如，新黴素/G418抗性基因、潮黴素抗性基因、組胺醇抗性基因、四環素抗性基因、和胺芐青黴素抗性基因。

重組表現載體可包含天然或非天然啟動子，其可操作地連接至編碼抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列、或與編碼一抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列互補或雜合的核苷酸序列。啟動子的選擇，例如強、弱、可誘導、組織特異性和發育特異性，係落於技術人員的一般技能範圍內。類似地，核苷酸序列與啟動子的組合也落於技術人員的一般技能範圍內。該啟動子可為非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子、EFl α啟動子或在鼠幹細胞病毒的長末端重複序列中發現的啟動子。

重組表現載體可設計為用於瞬時表現、穩定表現或兩者皆是。此外，重組表現載體可製備為用於組成型表現或誘導型表現。

此外，重組表現載體可製備為包括一自殺基因。如本文所用，術語「自殺基因」是指導致表現該自殺基因的細胞死亡的基因。自殺基因可為賦予表現基因的細胞對試劑(例如藥物)的敏感性，並在細胞與試劑接觸或暴露於試劑時導致細胞死亡的基因。自殺基因為本領域已知的(請參見，例如，Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004)，包括例如單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺基酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基還原酶。

一實施例進一步提供包含本文所述的任何重組表現載體的宿主細胞。如本文所用，術語「宿主細胞」是指可含有本發明的重組表現載體的任一類型細胞。該宿主細胞可為真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，或可為原核細胞，例如細菌或原生動物。該宿主細胞可為培養細胞或初代細胞，即直接從生物體例如人類分離出。該宿主細胞可為附著細胞或懸浮細胞(即懸浮生長的細胞)。合適的宿主細胞是本領域已知，包括例如DH5a大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、及類似細胞。為了擴增或複製該重組表現載體目的，該宿主細胞可為原核細胞，例如DH5a細胞。為了產生重組抗體或其抗原結合片段的目的，該宿主細胞可為哺乳動物細胞。該宿主細胞可為人類細胞。當宿主細胞可為任何細胞類型、可衍生自任何類型的組織且可處於任何發育階段時，該宿主細胞可為周邊血液淋巴細胞(PBL)或周邊血液單核細胞(PBMC)。該宿主細胞可為T細胞。

本申請案之一態樣提供一種經改造之免疫效應細胞，其包含本文所述的任何一種抗體或其抗原結合片段，或上述任何一種經分離的核酸，或上述任何一種載體。

一實施例亦提供包含至少一種本文所述宿主細胞的細胞群。該細胞群可為異質群，其包含含有所述的任何重組表現載體的宿主細胞，以及至少一種其他細胞(例如不包含任何該重組表現載體的宿主細胞(如T細胞))、或T細胞以外的細胞，例如B細胞、巨噬細胞、中性顆粒細胞、紅血球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等。或者，該細胞群可為實質上同質之群體，其中該群體主要包含含有該重組表現載體(例如基本上由其組成)的宿主細胞。該群體亦可為細胞的複製群體，其中該群體的所有細胞皆為包含一重組表現載體的單一宿主細胞的複製株，而使得該群體的所有細胞都包含該重組表現載體。在本發明之一實施例中，該細胞群為包含宿主細胞的複製株群，該宿主細胞包含如本文所述的重組表現載體。

編碼所希望分子的核酸序列可使用本領域已知的重組方法獲得，例如藉由篩選來自表現該基因的細胞之基因庫、藉由從已知包括相同基因的載體中衍生出基因、或藉由使用標準技術直接從含有它們的細胞和組織中分離出。

或者，感興趣的基因可合成產生，而非複製。本發明亦提供插入本發明DNA的載體。衍生自逆轉錄病毒(如慢病毒)的載體為達成長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因長期穩定整合並在子細胞中繁殖。慢病毒載體比衍生自癌-逆轉錄病毒(例如鼠白血病病毒)的載體具有額外的優勢，因為它們可以轉導非增殖細胞(例如肝細胞)。它們亦具有低免疫原性的額外優勢。

編碼本文所述的抗 GCC結合劑的天然或合成核酸的表現，可藉由將編碼該抗GCC結合劑多肽或其部分的核酸可操作地連接至一啟動子，並將該構建體加入表現載體中。該載體可適用於複製和整合至真核生物中。典型的複製載體包含轉錄和轉譯終止子、起始序列和用於調控所希望核酸序列表現的啟動子。

本發明的表現構建體亦可用於核酸免疫化和基因治療，使用標準基因遞送流程。基因遞送的方法為本領域已知。請參見例如，美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，其係以全文引用之方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供一種基因治療載體。

可將核酸選殖至多種類型的載體中。例如，可將核酸選殖到以下載體中，包括但不限於：質體、噬菌體、噬菌體衍生物、動物病毒和黏接質體。特別感興趣的載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體和定序載體。此外，該表現載體可以病毒載體形式提供至細胞中。

病毒載體技術為本領域已知，並描述於例如Sambrook等人 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)，以及其他病毒學和分子生物學手冊。可作為載體的病毒包括但不限於：逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。一般而言，合適的載體包含在至少一種生物體中有功能的複製起點、一啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點、和一或多種可篩選標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美國專利號6,326,193)。

目前已開發多種基於病毒的系統，用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因傳遞系統提供一個方便的平台。可使用本領域已知的技術將選定的基因插入載體，並包裝在逆轉錄病毒顆粒中。之後可分離出該重組病毒，並將其經體內或離體遞送至個體的細胞中。許多逆轉錄病毒系統為本領域已知。在一些實施例中，使用腺病毒載體。有多種腺病毒載體為本領域已知。在一實施例中，使用慢病毒載體。

額外的啟動子元件，例如增強子，係調控轉錄啟動的頻率。通常，它們位於起始位點上游30-110 bp的區域，儘管最近證實有許多啟動子亦包含位於起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間距通常是可調整的，因此當元件相互倒置或移動時，啟動子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)啟動子中，在活性開始下降之前，啟動子元件之間的間距可增加到50 bp。取決於啟動子，單獨元件可協同或獨立地發揮功能以活化轉錄作用。

合適的啟動子之一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為強組成型啟動子序列，能夠驅動與其可操作地連接的任一多核苷酸序列的高位準表現。

合適的啟動子之另一實例為延長生長因子-l a (EF-la)。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於：猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒立即早期啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，例如但不限於：肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子和肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限於使用組成型啟動子。誘導型啟動子亦被考慮作為本發明的一部分。誘導型啟動子的使用提供一種分子開關，當需要此種表現時，它能夠開啟與其可操作連接的多核苷酸序列的表現，或者在不需要表現時關閉該表現。誘導型啟動子的實例包括但不限於：金屬硫胺酸啟動子、醣皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。

為了評估抗GCC結合劑(例如，單域抗體)多肽或其部分的表現，待引入細胞的表現載體亦可包含一可篩選標記基因或報導子基因或兩者，以促進從經病毒載體轉染或感染的細胞群中辨識和篩選出有表現的細胞。在其他態樣中，該可篩選標記物可攜帶在分隔的DNA片段上，並用於共轉染程序中。

可篩選標記和報導子基因都可側接合適的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。可使用的可篩選標記物包括例如抗生素抗性基因，例如neo及類似基因。報導子基因用於辨識潛在的轉染細胞和評估調控序列的功能性。一般而言，報導子基因並不存在於接受者生物體或組織中，或不由接受者生物體或組織表現，且編碼其表現可經一些易於偵測的特性例如酵素活性來證明之多肽。在將DNA引入接受者細胞後，在合適的時間測定報導子基因的表現。合適的報導子基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳醣苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合之表現系統為已知，且可使用已知技術或經商業上獲得而製備。一般而言，具有最小5'側翼區域並顯示出最高報導子基因表現位準的構建體，被辨識為啟動子。此類啟動子區域可與報導子基因連接，並用於評估試劑調控啟動子驅動轉錄的能力。

將基因引入細胞和表現的方法為本領域已知。在表現載體的情況下，係藉由本領域已知的任何方法將該載體輕易地引入宿主細胞中，例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，可藉由物理、化學或生物方法將該表現載體轉移到宿主細胞中。將聚核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及類似方法。生產包含載體及/或外源核酸之細胞的方法為本領域已知。請參見例如Sambrook等人 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。將聚核苷酸引入宿主細胞之一較佳方法為磷酸鈣轉染。

將感興趣的聚核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，尤其是逆轉錄病毒載體，已成為將基因插入哺乳動物(例如人類細胞)最廣泛使用的方法。其他病毒載體可衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺相關病毒及類似病毒。請參見，例如，美國專利號5,350,674和5,585,362。將聚核苷酸引入宿主細胞的化學方法包括膠體分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球、微珠、和基於脂質的系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞和微脂體。

使用作為體外和體內遞送載體的例示性膠體系統為微脂體(例如，人工脂質媒劑)。在使用非病毒遞送系統的情況下，例示性遞送媒劑為奈米顆粒，例如微脂體或其他合適的次微米尺寸遞送系統。考慮使用脂質配方將核酸引入宿主細胞中(體外、離體或體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質結合。與脂質結合的核酸可被包裹在微脂體的水性內部，散佈在微脂體的脂質雙層內，通過同時與微脂體和寡核苷酸二者結合的連接分子連結到微脂體，包裹在微脂體中，與微脂體複合，分散在含有脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質結合，作為懸浮液包含在脂質中，包含或與微胞複合，或以其他方式與脂質結合。脂質、脂質/DNA、或脂質/表現載體結合組成物不限於溶液中的任何特定結構。例如，它們可能以雙層結構、微胞或「坍塌」結構存在。它們也可能簡單地散佈在溶液中，可能形成大小或形狀不均勻的聚集體。脂質為脂肪物質，可以是天然發生或合成的脂質。例如，脂質包括天然存在於細胞質中的脂肪滴，以及含有長鏈脂肪烴及其衍生物的化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇和醛。

適用的脂質可得自商業來源。例如，二肉荳蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可得自Sigma, St. Louis, MO；磷酸二十六酯(「DCP」)可得自K & K Laboratories (Plainview, NY)；膽固醇(「Choi」)可得自Calbiochem-Behring；二肉荳蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)和其他脂質可得自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)。脂類在氯仿或氯仿/甲醇中的儲存液可在約-20°C下儲存。氯仿被用作唯一的溶劑，因為它比甲醇更容易揮發。「微脂體」為通用術語，包括藉由產生封閉的脂質雙層或聚集體而形成的各種單層和多層脂質媒劑。微脂體的特徵在於具有囊泡結構，該結構具有磷脂雙層膜和內部水性介質。多層微脂體具有由水性介質隔開的多脂質層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，多脂質層會自發形成。脂質成分在形成封閉結構之前會先進行自我重排，並在脂質雙層之間捕捉水和溶解的溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10)。

然而，亦考量在溶液中具有與正常囊泡結構不同的組成物。例如，脂質可能假設是微胞結構或僅作為脂質分子的不均勻聚集體存在。亦考量lipofectamine-核酸複合物。無論用於將外源核酸引入宿主細胞或以其他方式將細胞暴露於本發明抑制劑的方法如何，為了確認宿主細胞中重組DNA序列的存在，可進行多種測定法。此類測定法包括例如本領域技術人員熟知的「分子生物學」測定法，例如南方和北方印跡、RT-PCR和PCR；「生化」測定法，例如偵測特定胜肽的存在或不存在，例如藉由免疫學方法(ELISA和西方印跡)或藉由本文所述的測定法，來辨識出落入本發明範圍內的試劑。

本發明進一步提供包含編碼核酸分子的抗GCC結合劑(例如，單域抗體)的載體。在一態樣中，抗GCC結合劑(例如單域抗體)載體可直接轉導至細胞(例如T細胞)中。在一態樣中，該載體為選殖或表現載體，例如包括但不限於一或多種質體(例如，表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒和慢病毒載體構建體的載體。在一態樣中，該載體能在哺乳動物T細胞中表現抗GCC結合劑構建體。在一態樣中，該哺乳動物T細胞為人類T細胞。

在一些態樣中，非病毒方法可用於將編碼本文所述的抗GCC結合劑的核酸遞送至細胞或組織或個體中。在一些實施例中，該非病毒方法包括使用轉座子(也稱為轉位元)。在一些實施例中，轉座子為一段可將自身插入基因組中某個位置的DNA，例如，一段能夠自我複製並將其副本插入基因組的DNA，或一段可從更長的核酸中剪出並插入基因組中的另一位置的DNA。

額外的和例示性轉座子和非病毒遞送方法係描述於2016年4月8日申請的國際申請案WO 2016/164731的第196-198頁，其係以全文引用之方式併入本文中。 治療方法

本發明相關於包含向個體投與如本文所述的抗GCC抗原結合分子的治療方法。在一些實施例中，本文揭示的抗GCC抗原結合分子(例如，單域抗體)可用於治療或預防哺乳動物疾病的方法中。在此方面，一實施例提供一種治療或預防哺乳動物癌症的方法，包含向哺乳動物投與有效治療或預防哺乳動物癌症之量的抗原結合分子(例如單域抗體)、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群、抗體及/或其抗原結合部分、及/或醫藥組成物。本發明亦相關於如本文所述的抗GCC抗原結合分子(例如sdAb)，其用於治療疾病。本發明亦相關於如本文所述的抗GCC抗原結合分子(例如sdAb)，其用於治療癌症。本發明亦相關於如本文所述的抗GCC抗原結合分子(例如sdAb)，其用於製備治療癌症的藥物。

本文所述的組成物投與可以任何方便的方式進行，包括藉由氣霧吸入、注射、攝取、輸血、植入或移植。本文所述的組成物可經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射或腹膜內投與患者。在一實施例中，本文所述的組成物，例如，包含表現抗原結合分子(例如，單域抗體)的細胞，藉由皮內或皮下注射投與患者。在一實施例中，本文所述的組成物，例如，包含表現抗原結合分子(例如，單域抗體)的細胞，藉由靜脈注射投與。本文所述的組成物，例如，包含表現抗原結合分子(例如，單域抗體)的細胞，可直接注射到腫瘤、淋巴結或感染部位。

就其中投與宿主細胞或細胞群的方法目的而言，細胞可為與該哺乳動物同種異體或自體的細胞。較佳地，該細胞為與該哺乳動物自體。如本文所用，同種異體是指衍生自與引入材料的個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座上的基因不相同時，該二或多個個體被稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自同一物種個體的同種異體材料可能在基因上完全不同，而有抗原性相互作用。如本文所用，「自體」是指衍生自同一個體的任何材料，之後將其重新引入該個體。

本文所提及之哺乳動物可為任何哺乳動物。如本文所用，術語「哺乳動物」是指任何哺乳動物，包括但不限於：囓齒目哺乳動物，例如小鼠和倉鼠，以及兔形目哺乳動物，例如兔。哺乳動物可來自食肉目，包括貓科動物(貓)和犬科動物(狗)。哺乳動物可來自偶蹄目，包括牛(母牛)和豬(豬)，或來自偶蹄目，包括馬(馬)。哺乳動物可為靈長類、四足猴(Ceboids)或原猴(Simoids)(猴子)或類人猿目(人類和猿)。在一些實施例中，該哺乳動物為人類。

關於所述方法，該癌症可為任何癌症，包括急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱肉瘤)、骨癌、腦癌(例如，神經管母細胞瘤)、乳癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸部癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌，或中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、纖維肉瘤、胃腸道類癌瘤、頭頸癌(如頭頸鱗狀細胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、白血病、液體腫瘤、肝癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、間皮瘤、肥大細胞瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)和勃氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌和腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、實體瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌和輸尿管癌之任一者。

在某些實施例中，該癌症是胃腸癌。在一些實施例中，該癌症是胃癌。在一些實施例中，該癌症是大腸直腸癌。在一些實施例中，該癌症是大腸癌。在一些實施例中，該癌症具有GCC的異常表現。

如本文所用，術語「治療」和「預防」以及其衍生詞不一定意味著100%或完全治療或預防。相反地，存在不同程度的治療或預防，本領域普通技術人員認為其具有潛在益處或治療效果。在此方面，該方法可提供任何量或任何位準的哺乳動物癌症的治療或預防。

此外，由該方法提供的治療或預防可包括治療或預防一或多種待治療或預防的疾病(例如癌症)的病況或症狀。此外，出於本文目的，「預防」可包括延遲疾病或其症狀或病況的發作。

另一實施例提供一種偵測哺乳動物中癌症存在的方法，包含：(a)將包含來自哺乳動物的一或多個細胞的樣本與該抗原結合分子(例如單域抗體)、其抗原結合部分或醫藥組成物接觸，藉此形成複合物，(b)並偵測該複合物，其中偵測到該複合物表示該哺乳動物中存在癌症。在一些實施例中，該接觸可在哺乳動物的體外或體內發生。在一些實施例中，該接觸為體外。

該樣本可藉由任何合適的方法獲得，例如活體切片或屍體解剖。活體切片是從個體中取出組織及/或細胞。此取出可以是從該個體收集組織及/或細胞，以便對取出的組織及/或細胞進行實驗。此實驗可包括測定該個體是否具有及/或正患有某病症或疾病狀態的實驗。該病症或疾病可為如癌症。

關於在哺乳動物中偵測增殖性病症(例如癌症)的存在之方法之一實施例，該包含哺乳動物細胞的樣本可為包含全細胞、其裂解物或全細胞裂解物之分液(例如細胞核或細胞質分液、完整蛋白分液或核酸分液)。若樣本包含全細胞，則該細胞可為哺乳動物的任何細胞，例如任何器官或組織的細胞，包括血液細胞或內皮細胞。

此外，複合物的偵測可經由本領域已知的多種方式進行。例如，本文所述的抗體或其抗原結合部分可經可偵測標記物標記，例如放射性同位素、螢光基團(例如異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE))、酵素(例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)、及如前述所揭示之元素顆粒(例如金顆粒)。

測試抗原結合分子(例如，單域抗體)識別標靶細胞的能力和抗原特異性的方法為本領域已知。例如，Clay等人，J. Immunol, 163: 507-513 (1999)，揭示測量細胞因子(例如干擾素-γ、顆粒細胞/單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤因子a (TNF-α)或白細胞介素2 (IL-2))釋放的方法。

另一實施例提供本發明的抗原結合分子(例如，單域抗體或其抗原結合部分)及/或醫藥組成物於治療或預防哺乳動物之增殖性病症(例如癌症)之用途。該癌症可為本文所述的任何癌症。

任何投與方法均可用於所揭示的治療劑，包括局部和全身投與。例如可使用局部、口服、血管內(例如靜脈內)、肌肉內、腹膜內、鼻內、皮內、鞘內和皮下投與。特定的投與方式和給藥方案將由主治臨床醫生選擇，考慮到病例的細節（例如個體、疾病、所涉及的疾病狀態以及治療是否為預防性）。在投與大於一種試劑或組成物的情況下，可使用一或多種投與途徑；例如，化療劑可口服投與，而抗體或抗原結合片段或共軛物或組成物可靜脈投與。投與方法包括注射，其中抗體、抗原結合片段或組成物係於無毒的醫藥學上可接受的載體中提供，例如水、生理食鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、5%人類血清白蛋白、非揮發性油、油酸乙酯或微脂體。在一些實施例中，可使用所揭示的化合物之局部投藥，例如藉由將抗體或抗原結合片段施加至已移除腫瘤的組織區域，或懷疑傾向於發展腫瘤的區域。在一些實施例中，包括治療有效量的抗體或抗原結合片段的醫藥製劑的持續性腫瘤內（或腫瘤附近）釋放可能有助益。在其他實例中，共軛物作為滴眼劑局部施加至角膜，或經玻璃體內施加至眼睛。

所揭示的治療劑可配製成適合精確劑量單獨投藥的單位劑型。此外，所揭示的治療劑可以單劑量或多劑量方案投藥。多劑量方案為其中主要治療過程可為大於一個單獨的劑量，例如1至10個劑量，之後根據需要在隨後的時間間隔投與其他劑量，以維持或加強該組成物的作用。治療可涉及在幾天至幾個月甚至幾年的時間內，每天或每天多次投與化合物。因此，該投藥方案也將，至少部分地，基於待治療對象的特定需要而決定，並將取決於投藥醫師的判斷。

在一實施例中，本揭示提供一種醫藥組成物，其包含至少一本揭示之治療劑（例如，本揭示的治療劑）或其醫藥學上可接受的鹽、以及適合一起投與人類或動物個體之醫藥學上可接受的載體，不論是單獨或與其他抗癌劑一起使用。

在一實施例中，本揭示提供治療患有細胞增殖性疾病(例如癌症)的人類或動物個體的方法。本揭示提供治療需要此類治療的人類或動物個體的方法，包括向該個體投與治療有效量的本揭示之治療劑或其醫藥學上可接受的鹽，不論是單獨或與其他抗癌劑一起投與。

特別地，組成物將配製為組合治療劑或分開投與。在組合治療中，本揭示的化合物和其他抗癌劑可同步、同時或依序投與，沒有特定的時間限制，其中此種投與提供該二化合物在患者體內的治療有效位準。

在一些實施例中，本揭示的化合物和其他抗癌劑通常藉由輸注或口服、以任何順序依次投與。投藥方案可根據疾病的階段、患者的身體健康狀況、個別藥物的安全性、個別藥物的耐受性、以及主治醫師和執業醫師熟知投與該組合的其他標準，而有所不同。

本揭示的化合物可特別作為放射線增敏劑，特別是用於治療對放射療法表現出不良敏感性的腫瘤。

在另一態樣中，本發明提供一種套組，例如用於治療或預防疾病或免疫反應及/或用於偵測GCC，以診斷、預後或監測疾病，其包含一抗體，例如本文所述的單域抗體。此類套組可包含其他成分、包裝、說明或材料，以幫助偵測GCC蛋白。該套組可包括如本文所述的經標記單域抗體或結合劑，以及一或多種用於偵測該標記的化合物。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語和片語與本領域普通技術人員通常理解的含義相同。儘管在本發明的實施或測試中可使用與本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但現在描述較佳的方法和材料。本文提及的所有文獻均以引用方式併入本文中。

標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉型（例如，電穿孔、脂質轉染）。酵素反應和純化技術可根據製造商的說明書或如本領域中通常完成者或如本文所述進行。前述技術和程序一般可根據本領域已知的常規方法進行，並如在本說明書整篇引用和討論的各種一般性和更具體的參考文獻中所描述的。請參見例如 Sambrook等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的經由引用方式併入本文中。

本文提及的所有文獻、專利申請案、專利案和其他參考文獻均以全文引用方式併入本文中。本發明將藉由參考以下實例而更臻清楚。 實例

這些實例的提出是為了幫助理解本發明，但並非旨在，也不應解釋為以任何方式限制其範圍。實例不包括對本領域普通技術人員已知的常規方法（分子選殖技術等）的詳細描述。 實例 1. GCC V _H 抗體之分離與篩選

係製備特異性靶向人類GCC的單域重鏈抗體(V _H)（例如，表1至3中提供的抗GCC結合劑）。如表5所示，評估重組單域抗GCC V _H構建體在體外對GCC的結合親和力。結合動力學使用Octet結合測定法測定。這些係於即時生物層干涉儀基礎之生物感測器Octet(ForteBio)中測量。所有結合研究均在HBS-ET Octet動力學緩衝液中進行。生物感測器總是在不同步驟之間以Octet動力學緩衝液洗滌。對每一V _H進行七點、兩倍的稀釋系列。結合步驟的每一者的接觸時間為300秒，解離步驟在400-600秒之間變化。動力學結合(ka)和解離(kd)速率常數藉由使用ForteBio分析軟體處理數據，並將其套用至1:1結合模型而確定。親和力計算值和動力學常數列於表4。

使用流式細胞術測量單域抗體與CT26細胞的結合。CT26細胞與系列稀釋的V _H一起培養，並藉由流式細胞術測量螢光值。藉由FACS劑量反應測定法證實抗GCC V _H抗體與CT26細胞結合，以獲得細胞結合EC50 (nM)，如表4所示。 表 4. GCC VH 抗體之結合親和力

GCC 抗原結合劑	Koff (1/s)	KD(M)	與細胞結合之 EC50 (M)
V1	0.00020795	3.2935E-10	7.2E-10
V5	0.000718667	7.713E-09	1.52E-09
V36	0.0035	0.000000105	N/A
V48	0.000341	1.375E-09	1.01E-09
V51	0.00185	9.544E-09	N/A

為了測定穩定性，對V _H構建體進行尺寸排阻層析法(SEC)。簡而言之，將純化的V _H以不同濃度儲存在PBS緩衝液中，並於4°C 過夜，之後使用SEC管柱在不同時間點進行分析。將樣本注入磷酸鈉緩衝液中。隨時間收集數據，並計算儲存後剩餘的單體峰面積，與開始時(T=0)存在者相較。獲得穩定性結果，如下表5所示。 表 5. 使用 SEC 的隔夜穩定度

抗-GCC VH抗體	% 4°C單體（%）	純度（%）	RT (分鐘）
V1	108.4	91.5	3.586
V5	123.04	79.2	3.17
V36	92.43	79.36	3.08
V48	104.54	73.91	3.208
V51	109.2	59.22	3.304

進行ELISA以測量VH與人類輕鏈的結合。每一VH的結合值（於OD450nm測量）皆小於0.1，其為此測定法的背景訊號。 實例 2. GCC 嵌合性抗原受器的設計與鑑定

嵌合性抗原受體構建體被設計成包括一胞外結合域（例如，抗GCC結合物序列），其包含上述單域抗體（例如，表2或表3中提供的VH）。CAR T構建體是藉由將框架內的結合子序列連接到CD28鉸鏈/跨膜域和共刺激域以及CD3 zeta-1xx信號域而產生。例示性CAR構建體的流程圖示於圖1A和1B。

將編碼CAR構建體序列的核酸選殖到逆轉錄病毒質體骨架中。藉由瞬時轉染phenix ampho細胞(ATCC CRL-3213)產生含有逆轉錄病毒載體的上清液，收穫含有逆轉錄病毒載體的上清液，並儲存於-80°C。

來自健康供應者的人類初級T細胞，係純化自由leukopaks (購自經捐贈者書面同意的商業提供者)分離出的周邊血液單核細胞(PBMC)，使用CD3+細胞進行免疫磁珠篩選，根據製造商提供的流程(EasySep™ Human T Cell Isolation Kit, Stem Cell Technologies #17951)。T 細胞在補充有10% 青黴素-鏈黴素 (Gibco 15140-122)和2 ng/ml IL-2 (Milteyni 130-097-743))之X-vivo 15培養基(（Lonza #04-744Q）中，以1百萬個細胞/毫升之密度培養。細胞以CD3/CD28 MACS® T Cell TransAct試劑（Miltenyi Biotec MACS #130-111-160）活化，並在第2天或第3天以編碼CAR構建體的逆轉錄病毒載體轉導過夜。隔日，將CAR-T細胞培養物轉移到G-Rex6® 孔盤（WilsonWolf P/N 80240M），並在補充有10% 青黴素-鏈黴素(Gibco 15140-122)和2 ng/ml IL-2 (Milteyni 130-097-743)的X-vivo 15培養基（Lonza #04-744Q）中繁殖，直到第7-10天收穫。每2-3天進行一次培養基更換和IL-2補充。

CAR T細胞表現係藉由流式細胞術評估，使用抗EGFR抗體(R&D systems: FAB9577R)或用於CAR表面表現之可溶性GCC胞外域重組蛋白。 實例 3. GCC CAR T 細胞體外活性

本實施例描述體外之抗GCC CAR T細胞活性。檢驗CAR-T細胞對表現GCC和GCC陰性的標靶癌細胞株的細胞毒性。標靶癌細胞株包括內源性表現GCC的GSU、LS1034和HT55，以及HT29-GCC（一種經改造以穩定表現GCC的人類大腸直腸癌細胞株）及其載體對照細胞株(即GCC陰性)HT29-vec。每一標靶細胞株係接種在384孔盤中，並以效應子-比-標靶(E:T)為10:1、3:1、1:1 和0.3:1之比例加入GCC CAR-T或非靶向CAR-T細胞（陰性對照組）。僅包含標靶細胞之孔和僅包含效應細胞之孔作為對照組。兩天後，使用CellTiter-Glo® One Solution Assay (Promega, G8462)測量細胞存活率。標靶細胞的存活率百分比係由共培養孔的發光訊號計算，首先減去僅有效應細胞之孔的信號，之後除以僅有標靶細胞之孔的信號。殺傷百分比係由100%  GCC CAR-T細胞減去標靶細胞的存活百分比而計算出。

與作為對照組的非靶向CD19 CAR-T細胞(1928z-1xx)相較，V _H抗GCC結合劑表現出針對表現GCC的標靶細胞株的細胞殺傷。如圖2A-2D所示，在不存在截短EGFR (tEGFR)的情況下表現抗GCC CAR的CAR-T細胞，證實對GCC表現細胞HT29-GCC細胞(被改造為可穩定表現GCC人類的大腸直腸癌細胞株HT29)的體外細胞毒性(圖2A)；和內源性表現GCC的細胞株GSU（圖2C）和LS1034（圖2D）。如圖3A-3D所示，在截短的EGFR (tEGFR)存在下表現抗GCC CAR的CAR-T細胞，亦證實對GCC表現細胞HT29-GCC（圖3A）；GSU（圖3C）和LS1034（圖3D）的體外細胞毒性。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。數據代表來自＞3個供體的抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。GCC CAR-T細胞並未表現出對GCC陰性HT29-vec細胞的細胞殺傷（圖2B和圖3B），表示GCC CAR-T細胞殺傷活性為抗原-依賴性。

除了抗原-依賴性細胞殺傷，GCC CAR-T細胞的體外活性亦藉由評估該細胞的IFNγ和IL2的抗原-依賴性分泌情況而評估。具有抗GCC V _H結合劑的GCC CAR-T細胞與表現GCC和GCC陰性的標靶癌細胞係以E:T 比例10:1、3:1、1:1和0.3:1共培養。共培養兩天後收集上清液。使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen kit (Sartorius, 90702)偵測上清液中分泌的IFNγ和IL2。當與表現GCC的標靶細胞共培養時，具有所有VH結合劑的GCC CAR-T細胞，在tEGFR存在(5A-5D)和不存在(4A-4D)的情況下都會分泌IFNγ，但與GCC-陰性標靶細胞共培養時則不然（圖4B和5B），指出此為抗原-依賴性細胞因子釋放。當與表現GCC的標靶細胞共培養時，具有所有V _H結合劑的GCC CAR-T細胞，在tEGFR存在(7A-7D)和不存在(6A-6D)的情況下都會分泌IL2，但與GCC-陰性標靶細胞共培養時則不然（圖6B和7B），指出此為抗原-依賴性細胞因子釋放。

已描述本發明的至少一實施例的幾個態樣，應當理解，各種改變、修飾和增進對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。此類變更、修飾和增進旨在成為本揭示的一部分，且旨在落入本發明的精神和範圍內。因此，前面的描述和附圖僅作為示範，本發明由後附的申請專利範圍詳細描述。 序列表

下表6提供本文揭示之描述及序列。 表 6. 序列表

SEQ ID NO	描述	序列
1	V1 VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS
2	v31前導序列	MEFGLSWVFLVAIIKGVQC
3	P2A	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
4	前導序列	MALPVTALLLPLALLLHAARP
5	GCC AA序列	MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQILMIAVFTLTGAVVLLLLVALLMLRKYRKDYELRQKKWSHIPPENIFPLETNETNHVSLKIDDDKRRDTIQRLRQCKYDKKRVILKDLKHNDGNFTEKQKIELNKLLQIDYYNLTKFYGTVKLDTMIFGVIEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLYDIAKGMSYLHSSKTEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQANISQKGDVYSYGIIAQEIILRKETFYTLSCRDRNEKIFRVENSNGMKPFRPDLFLETAEEKELEVYLLVKNCWEEDPEKRPDFKKIETTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADRLNFMLLPRLVVKSLKEKGFVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDHIVDHHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGNRHAIDIAKMALEILSFMGTFELEHLPGLPIWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHVSGSTIAILKRTECQFLYEVRGETYLKGRGNETTYWLTGMKDQKFNLPTPPTVENQQRLQAEFSDMIANSLQKRQAAGIRSQKPRRVASYKKGTLEYLQLNTTDKESTYF
6	前導序列（v1）	MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
7	前導序列（v5、v36、v48、v51）	MELGLSWVFLVAILEGVQC
8	V1 HCDR1	HYYWS
9	V5 HCDR1	RYWMS
10	V36 HCDR1	RYWMT
10	V48 HCDR1	RYWMT
10	V51 HCDR1	RYWMT
11	V1 HCDR2	RIYPSGSTSYNPSLKS
12	V5 HCDR2	KIRHDGGEKYYVDSVKG
13	V36 HCDR2	KIKYDGSEKYYADSVKG
14	V48 HCDR2	KIRHDGGEKYYPDSVKG
15	V51 HCDR2	KIRHDGGEKYYADSVKG
16	V1 HCDR3	DRSTGWSEWNSDL
17	V5 HCDR3	DYTRDV
18	V36 HCDR3	DYNKDY
19	V48 HCDR3	DYNKDL
18	V51 HCDR3	DYNKDY
20	V1-01	EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSS
21	V5	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDYTRDVWGQGTAVTVSS
22	V8	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTGVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS
23	V9	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGRGLEWVAKIRYDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS
24	V30	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFGRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS
25	V31	QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS
26	V36	EVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGGRLEWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS
27	V48	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYPDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDNLRAEDTAMYYCTRDYNKDLWGQGTLVTVSS
28	V51	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSS
29	熱穩定型腸毒素	NTFYCCELCCNPACAGCY
30	V1-01 核酸序列	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAATAGTTATTGGATGAGTTGGGACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGGGGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACAGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGGAGCCACGGCGTCCGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
31	V5 核酸序列	CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCGGTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAAGGCACGATGGAGGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGACAGACTATACGAGGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCA
32	V36 核酸序列	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCGGGATTCACCTTTAGTCGCTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGGGAGACTGGAGTGGGTGGCCAAGATAAAGTACGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTACGAGAGACTATAATAAAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
33	V48 核酸序列	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCACCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTAGGTATTGGATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAAATAAGACACGATGGAGGTGAGAAATACTATCCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTACAAATGGACAACCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATGTATTACTGTACGAGAGACTACAATAAGGACCTTTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTCTCCTCA
34	V51 核酸序列	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGGTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTGGCCAAGATAAGACACGATGGAGGTGAGAAATATTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATTCACTATATCTACAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAAGACACGGCTGTGTATTATTGTACGAGAGACTACAATAAAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

等效物

在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等序數術語來修飾申請專利範圍要件本身，並不意味著某一申請專利範圍要件相對於另一個申請專利範圍要件的任何優先、先行或順序，或方法執行的時間順序，而僅作為標示，以將具有特定名稱的一個申請專利範圍要件與具有相同名稱(但使用該序數術語）的另一個要件區分開來，以區分各申請專利範圍要件。

如本文在說明書和申請專利範圍中使用的冠詞「一(a)」和「一(an)」，除非明確指出相反，否則應理解為包括複數參考物。除非另有說明，否則若該群組之一個、多個或所有成員存在於、使用於或以其他方式相關於一特定產物或方法，則在一或多個群組成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述被視為已滿足，除非上下文相反或以其他方式明顯指出。本發明包括其中該群組中恰好有一個成員存在於、使用於或以其他方式相關於特定的產品或過程的實施例。本發明亦包括其中大於一個或整個群組成員存在於、使用於或以其他方式相關於特定的產品或過程的實施例。此外，應當理解，本發明涵蓋所有變化、組合和排列，其中來自所列申請專利範圍的一或多個限制、要件、子句、描述性術語等，係引入另一從屬申請專利範圍中相同的基本申請專利範圍（或相關的任何其他申請專利範圍）中，除非另有說明或除非本領域普通技術人員可明顯看出矛盾或不一致。在要件以列表形式呈現的情況下（例如，以馬庫什組(Markush group)或類似格式），應當理解，亦揭示該要件的每個子群，且可從該群組中移除任一要件。應當理解，一般而言，本發明或本發明態樣被稱為包含特定要件、特徵等的情況下，本發明的某些實施例或本發明的各態樣由或基本上由此類要件、特徵等組成。為了簡單起見，在本文中這些實施例並未在每種情況下以如此多的詞語具體闡述。亦應當理解，本發明的任何實施例或態樣都可明確地從申請專利範圍中排除，而不論特定的排除是否在說明書中有陳述。用於描述本發明的背景並提供關於其實施的額外細節所引用的文獻、網站和其他參考資料均以引用方式併入本文中。

本文所含之圖式，其由以下各圖組成，僅用於說明目的而非限制。

圖 1A 及 1B 描繪例示性嵌合抗原受體(CAR)構築體。

圖 2A-2D 顯示使用四種腫瘤細胞株進行之例示性抗GCC CAR-T體外細胞毒性試驗。HT29-GCC細胞(一種經改造以穩定表現GCC之人類大腸直腸癌細胞株HT29）（圖2A）；HT29-VEC（載體對照組GCC陰性細胞株）（圖2B）；及兩種內源性表現GCC之腫瘤細胞株：GSU(圖2C）和LS1034（圖2D）。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。數據代表來自＞3個供體的抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。CAR T細胞毒性係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。

圖 3A-3D 顯示使用四種腫瘤細胞株進行之例示性抗GCC CAR-T體外細胞毒性試驗。HT29-GCC細胞(一種經改造以穩定表現GCC之人類大腸直腸癌細胞株HT29）（圖3A）；HT29-VEC（載體對照組GCC陰性細胞株）（圖3B）；及兩種內源性表現GCC之腫瘤細胞株：GSU(圖3C）和LS1034（圖3D）。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。各資料代表來自＞3個供體之使用抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。CAR T細胞毒性係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。

圖 4A-4D 顯示由與表現GCC（HT29-GCC）（圖4A）、GSU（圖4C）、LS1034（圖4D）及GCC-陰性（HT29-VEC，圖4B）腫瘤細胞體外共培養之抗GCC CAR-T細胞分泌之例示性IFN-g細胞激素。上清液中之分泌IFNg係使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen套組(Sartorius, 90702)測定。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。各數據代表來自＞3個供體之使用抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。細胞激素分泌係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。

圖 5A-5D顯示由與表現GCC（HT29-GCC）（圖5A）、GSU（圖5C）、LS1034（圖5D）及GCC-陰性（HT29-VEC，圖5B）腫瘤細胞體外共培養之抗GCC CAR-T細胞分泌之例示性IFN-g細胞激素。上清液中之分泌IFNg係使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen套組(Sartorius, 90702)測定。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。各數據代表來自＞3個供體之使用抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。細胞激素分泌係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。

圖 6A-6D 顯示顯示由與表現GCC（HT29-GCC）（圖6A）、GSU（圖6C）、LS1034（圖6D）及GCC-陰性（HT29-VEC，圖6B）腫瘤細胞體外共培養之抗GCC CAR-T細胞分泌之例示性IL-2細胞激素。上清液中之分泌IFL-2係使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen套組(Sartorius, 90702)測定。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。各資料代表來自＞3個供體之使用抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。細胞激素分泌係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。

圖 7A-7D 顯示由與表現GCC（HT29-GCC）（圖7A）、GSU（圖7C）、LS1034（圖7D）及GCC-陰性（HT29-VEC，圖7B）腫瘤細胞體外共培養之抗GCC CAR-T細胞分泌之例示性IL-2細胞激素。上清液中之分泌IFL-2係使用Intellicyt QBeads Human PlexScreen套組(Sartorius, 90702)測定。長條代表來自三次技術重複的平均值+SD值。各資料代表來自＞3個供體之使用抗GCC CAR T細胞進行的＞3個獨立實驗。細胞激素分泌係於截短EGFR (tEGFR)不存在的情況下測定。


          <![CDATA[<110> 日商武田藥品工業股份有限公司/TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED]]>
                英商克雷森多生物製劑有限公司/CRESCENDO BIOLOGICS LTD
          <![CDATA[<120> 鳥苷酸環化酶C (GCC)抗原結合劑之組成物及其使用方法 ]]>
          <![CDATA[<130> MIL-011WO]]>
          <![CDATA[<140> TW 110145785]]>
          <![CDATA[<141> 2021-12-08]]>
          <![CDATA[<150> US 63,123,333]]>
          <![CDATA[<151> 2020-12-09]]>
          <![CDATA[<160> 36    ]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn版本3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser His Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Ala Met Ser Val Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Arg Ser Thr Gly Trp Ser Glu Trp Asn Ser Asp Leu Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys 
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Asn Pro Gly Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Ala Arg Pro 
                      20      
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 1073]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn 
                      20                  25                  30          
          Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala 
                  35                  40                  45              
          Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg 
                          85                  90                  95      
          Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala 
                      100                 105                 110         
          Gln Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala 
                  195                 200                 205             
          Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr 
                          245                 250                 255     
          Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu 
                      260                 265                 270         
          Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro 
                  275                 280                 285             
          Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu 
                          325                 330                 335     
          Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala 
                      340                 345                 350         
          His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr 
                  355                 360                 365             
          Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr 
              370                 375                 380                 
          Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His 
          385                 390                 395                 400 
          Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys 
                          405                 410                 415     
          Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Ile Leu 
                      420                 425                 430         
          Met Ile Ala Val Phe Thr Leu Thr Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Leu 
                  435                 440                 445             
          Val Ala Leu Leu Met Leu Arg Lys Tyr Arg Lys Asp Tyr Glu Leu Arg 
              450                 455                 460                 
          Gln Lys Lys Trp Ser His Ile Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Thr Asn Glu Thr Asn His Val Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Lys Arg 
                          485                 490                 495     
          Arg Asp Thr Ile Gln Arg Leu Arg Gln Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg 
                      500                 505                 510         
          Val Ile Leu Lys Asp Leu Lys His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Gln Lys Ile Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gln Ile Asp Tyr Tyr Asn Leu 
              530                 535                 540                 
          Thr Lys Phe Tyr Gly Thr Val Lys Leu Asp Thr Met Ile Phe Gly Val 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Glu Tyr Cys Glu Arg Gly Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr 
                          565                 570                 575     
          Ile Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser 
                      580                 585                 590         
          Val Leu Tyr Asp Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys 
                  595                 600                 605             
          Thr Glu Val His Gly Arg Leu Lys Ser Thr Asn Cys Val Val Asp Ser 
              610                 615                 620                 
          Arg Met Val Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro 
          625                 630                 635                 640 
          Pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gln Ala Asn 
                          645                 650                 655     
          Ile Ser Gln Lys Gly Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gln Glu 
                      660                 665                 670         
          Ile Ile Leu Arg Lys Glu Thr Phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp Arg 
                  675                 680                 685             
          Asn Glu Lys Ile Phe Arg Val Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe 
              690                 695                 700                 
          Arg Pro Asp Leu Phe Leu Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Val 
          705                 710                 715                 720 
          Tyr Leu Leu Val Lys Asn Cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro 
                          725                 730                 735     
          Asp Phe Lys Lys Ile Glu Thr Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe 
                      740                 745                 750         
          His Asp Gln Lys Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu 
                  755                 760                 765             
          Gln Leu Tyr Ser Arg Asn Leu Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gln 
              770                 775                 780                 
          Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu 
          785                 790                 795                 800 
          Leu Pro Arg Leu Val Val Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Val Glu 
                          805                 810                 815     
          Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Val Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Thr Thr Ile Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Met 
                  835                 840                 845             
          Leu Asn Asp Ile Tyr Lys Ser Phe Asp His Ile Val Asp His His Asp 
              850                 855                 860                 
          Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn Arg His Ala Ile Asp Ile Ala Lys Met 
                          885                 890                 895     
          Ala Leu Glu Ile Leu Ser Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu 
                      900                 905                 910         
          Pro Gly Leu Pro Ile Trp Ile Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro Cys 
                  915                 920                 925             
          Ala Ala Gly Val Val Gly Ile Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly 
              930                 935                 940                 
          Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu 
          945                 950                 955                 960 
          Arg Ile His Val Ser Gly Ser Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu 
                          965                 970                 975     
          Cys Gln Phe Leu Tyr Glu Val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg 
                      980                 985                 990         
          Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp Leu  Thr Gly Met Lys Asp  Gln Lys Phe 
                  995                 1000                 1005             
          Asn Leu  Pro Thr Pro Pro Thr  Val Glu Asn Gln Gln  Arg Leu Gln 
              1010                 1015                 1020             
          Ala Glu  Phe Ser Asp Met Ile  Ala Asn Ser Leu Gln  Lys Arg Gln 
              1025                 1030                 1035             
          Ala Ala  Gly Ile Arg Ser Gln  Lys Pro Arg Arg Val  Ala Ser Tyr 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Lys  Gly Thr Leu Glu Tyr  Leu Gln Leu Asn Thr  Thr Asp Lys 
              1055                 1060                 1065             
          Glu Ser  Thr Tyr Phe 
              1070             
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 
          1               5                   10                  15      
          Val Leu Ser 
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys 
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          His Tyr Tyr Trp Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Arg Tyr Trp Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Arg Tyr Trp Met Thr 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Asp Arg Ser Thr Gly Trp Ser Glu Trp Asn Ser Asp Leu 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Asp Tyr Thr Arg Asp Val 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Asp Tyr Asn Lys Asp Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Asp Tyr Asn Lys Asp Leu 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser His Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Ala Met Ser Val Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Arg Ser Thr Gly Trp Ser Glu Trp Asn Ser Asp Leu Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 115]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Ala Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
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                          85                  90                  95      
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          Val Ser Ser 
                  115 
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr 
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210> 23]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
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          Val Ser Ser 
                  115 
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          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
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          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
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          Ala Thr Asp Phe Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Val Ser Ser 
                  115 
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          <![CDATA[<400> 26]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
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          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
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          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
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                          85                  90                  95      
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          Val Ser Ser 
                  115 
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          <![CDATA[<400> 27]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
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          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 115]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
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          Ala Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
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          Thr Arg Asp Tyr Asn Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
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          <![CDATA[<400> 29]]>
          Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Cys Tyr 
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 342]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多核苷酸"]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc       60
          tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat agttattgga tgagttggga ccgccaggct      120
          ccagggaagg gcctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaatactat      180
          ggggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat      240
          ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagaaggagc      300
          cacggcgtcc gggggcaagg gaccacggtc accgtctcct ca                         342
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 345]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多核苷酸"]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc       60
          tcctgtacag cctctggatt cacctttagt cggtattgga tgagctgggt ccgccaggct      120
          ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaag ataaggcacg atggaggtga gaaatactat      180
          gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactgtat      240
          ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacagactat      300
          acgagggacg tctggggcca agggaccgcg gtcaccgtct cctca                      345
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 345]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多核苷酸"]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcccagc ctggggggtc cctgagactc       60
          tcctgtgcag cctcgggatt cacctttagt cgctattgga tgacctgggt ccgccaggct      120
          ccagggggga gactggagtg ggtggccaag ataaagtacg atggaagtga gaaatactat      180
          gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat      240
          ctgcaaatgg acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtac gagagactat      300
          aataaagact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca                      345
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 345]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多核苷酸"]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc ccttagactc       60
          acctgtgcag cctctggatt cacttttagt aggtattgga tgacttgggt ccgccaggct      120
          ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaaa ataagacacg atggaggtga gaaatactat      180
          ccggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ttcactgtat      240
          ctacaaatgg acaacctgag agccgaggac acggctatgt attactgtac gagagactac      300
          aataaggacc tttggggcca gggaacactg gtcaccgtct cctca                      345
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 345]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多核苷酸"]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc       60
          tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aggtattgga tgacctgggt ccgccaggct      120
          ccagggaagg ggctggaatg ggtggccaag ataagacacg atggaggtga gaaatattat      180
          gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactatat      240
          ctacaaatga acagtctgag agccgaagac acggctgtgt attattgtac gagagactac      300
          aataaagact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca                      345
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 357]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 
                  35                  40                  45              
          Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 
                      100                 105                 110         
          Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 
                      180                 185                 190         
          Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 
              210                 215                 220                 
          Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 
                          245                 250                 255     
          Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 
                      260                 265                 270         
          His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 
                  275                 280                 285             
          Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 
              290                 295                 300                 
          Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 
                      340                 345                 350         
          Ile Gly Leu Phe Met 
                  355         
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /說明="人工序列之描述：合成多肽"]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 位置]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(30) ]]>
          <![CDATA[<223> /說明="此序列可包含1-6個'Gly Gly Gly Gly Ser'重複單元"]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25                  30  
          

Claims (25)

1. 一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含： 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)；或 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。
2. 如請求項1所述之GCC結合劑，其包含： 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列；或 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。
3. 一種鳥苷酸環化酶C (GCC)結合劑，其包含： 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 21至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 26至少90%一致的胺基酸序列； 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 27至少90%一致的胺基酸序列；或 一免疫球蛋白重鏈可變(V _H)區，其包含一與SEQ ID NO: 28至少90%一致的胺基酸序列。
4. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該V _H區包含一與SEQ ID NO：1、20、21、26、27或28之任一者至少95%一致的胺基酸序列。
5. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該V _H區包含一與SEQ ID NO：1、20、21、26、27或28之任一者一致的胺基酸序列。
6. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該GCC結合劑係選自於由以下組成之群：IgA抗體、IgG抗體、IgE抗體、IgM抗體、雙或多特異性抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、經分離之CDR或其群組；單鏈可變異片段(scFv)、多胜肽-Fc融合物、單域抗體(sdAb)、駱駝源化抗體；掩蔽抗體、小型模組化免疫製藥（「SMIPsTM」）、單鏈、串聯雙價抗體、VHHs、抗運載蛋白(Anticalin)、奈米抗體、人源化抗體(humabody)、微型抗體、BiTE、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白質、DARPIN、Avimer、DART、TCR-類似抗體、Adnectin、人類泛素(Affilin)、穿透抗體(Trans-body)；親和抗體(Affibody)、TrimerX、微型蛋白、Fynomer、Centyrin；以及KALBITOR。
7. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該GCC結合劑為單域抗體(sdAb)。
8. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該GCC結合劑為僅具重鏈之抗體。
9. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，其中該結合劑係以介於約0.3奈米莫耳(nM)至約10 nM之間的K _D與GCC結合。
10. 如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑，該結合劑係以介於約0.5 nM至約8 nM之間的EC ₅₀與標靶細胞上的GCC結合。
11. 一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與如前述請求項中任一項所述之GCC結合劑。
12. 如請求項 11所述之方法，其中該癌症係選自於胃腸癌、大腸直腸癌、大腸直腸腺癌、大腸直腸平滑肌肉瘤、大腸直腸淋巴瘤、大腸直腸黑色素瘤、大腸直腸神經內分泌腫瘤、轉移性大腸癌、胃癌、胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肉瘤、食道癌、鱗狀細胞癌、食道腺癌或胰臟癌。
13. 如請求項11所述之方法，其中該癌症為胃腸癌。
14. 如請求項13所述之方法，其中，該胃腸癌為大腸癌、大腸直腸癌、胃癌或食道癌。
15. 一種醫藥組成物，其包含一GCC結合劑及一醫藥學上可接受之載體，其中該GCC結合劑包含： 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)；或 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。
16. 一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與GCC結合劑，其中該GCC結合劑包含： 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：HYYWS (HCDR1) (SEQ ID NO: 8)、RIYPSGSTSYNPSLKS (HCDR2) (SEQ ID NO: 11)和DRSTGWSEWNSDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 16)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMS (HCDR1) (SEQ ID NO: 9)、KIRHDGGEKYYVDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 12)和DYTRDV (HCDR3) (SEQ ID NO: 17)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIKYDGSEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 13)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)； 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYPDSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 14)和DYNKDL (HCDR3) (SEQ ID NO: 19)；或 一重鏈可變區(V _H)，其具有下列互補決定區(CDR)序列：RYWMT (HCDR1) (SEQ ID NO: 10)、KIRHDGGEKYYADSVKG (HCDR2) (SEQ ID NO: 15)和DYNKDY (HCDR3) (SEQ ID NO: 18)。
17. 一種核酸，其編碼與SEQ ID NO： 1、20、21、26、27或28之任一者一致的VH胺基酸序列。
18. 一種載體，其包含如請求項17所述之經分離核酸序列。
19. 一種經分離之細胞，其包含如請求項18之載體。
20. 一種抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。
21. 一種誘發免疫反應之方法，其包含 將細胞與抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)接觸，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。
22. 一種誘發細胞毒性之方法，其包含 將細胞與抗鳥苷酸環化酶C (GCC)嵌合抗原受體(CAR)接觸，其中該抗GCC CAR包含如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑。
23. 一種偵測哺乳動物中癌症存在之方法，其包含： (a)將包含來自於該哺乳動物之一或多種細胞的樣本與如請求項1至10中任一項所述之抗GCC結合劑接觸，藉以形成複合物，以及 (b)偵測該複合物，其中偵測到該複合物表示該哺乳動物中存在癌症。
24. 如請求項23所述之方法，其中該接觸相對於該哺乳動物為體外或體內。
25. 如請求項24所述之方法，其中該接觸為體外。

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