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CN110054692A - 抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法 - Google Patents

抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法 Download PDF

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CN110054692A
CN110054692A CN201910115045.6A CN201910115045A CN110054692A CN 110054692 A CN110054692 A CN 110054692A CN 201910115045 A CN201910115045 A CN 201910115045A CN 110054692 A CN110054692 A CN 110054692A
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gcc
antibody
antibody molecule
seq
antibodies
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CN201910115045.6A
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塞缪尔·S·纳姆
爱德华·A·格林菲尔德
约翰·巴布库克
特雷莎·奥基夫
秦士新
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Amgen British Columbia Inc
Millennium Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Amgen British Columbia Inc
Millennium Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本发明揭示结合GCC的抗体和抗体的抗原结合片段。所述抗体结合GCC的细胞外结构域且可内在化。在一些实施例中，所述抗体为人源化、嵌合或人类抗体。也揭示编码所述抗体或其部分的核酸和载体、含有所述核酸的重组细胞以及包含所述抗体或抗原结合片段的组合物。本发明还提供利用本文所提供的抗体和抗原结合片段的治疗方法和诊断方法。

Description

抗GCC抗体分子及其相关组合物和方法
申请号为201410653631.3、发明名称为“抗GCC抗体分子及其相关组合物和方法”的发明专利申请是申请日为2010年10月22日、申请号为201080043591.0、发明名称为“抗GCC抗体分子及其相关组合物和方法”的发明专利申请的第一分案申请。本申请是基于该第一分案申请的第二分案申请。
相关申请案
本申请案主张2009年10月23日申请的美国临时申请案第61/254,474号的权益。美国临时申请案第61/254,474号的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及结合GCC的抗体分子，以及相关分子(例如编码所述抗体分子的核酸)、组合物和相关方法(例如治疗和诊断方法)。
背景技术
鸟苷酸环化酶C(Guanylyl cyclase C，GCC)是一种跨膜细胞表面受体，其功能在于维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖，参见例如凯里瑟(Carrithers)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100:3018-3020(2003)。GCC于衬在小肠、大肠和直肠内的粘膜细胞上表达(凯里瑟等人,结肠与直肠疾病(Dis Colon Rectum)39:171-181(1996))。GCC的表达在肠上皮细胞发生致瘤性转化时被维持，并且在所有原发性和转移性结肠直肠肿瘤中都有表达(凯里瑟等人,结肠与直肠疾病,39:171-181(1996)；布克(Buc)等人,欧洲癌症杂志(Eur J Cancer)41:1618-1627(2005)；凯里瑟等人,胃肠病学(Gastroenterology)107:1653-1661(1994))。
发明内容
本发明者已经发现众多抗GCC抗体，包括人类与鼠类抗体。因此，在一个方面中，本发明的特征在于一种抗GCC抗体分子，如本文所揭示。抗GCC抗体分子适用作裸抗体分子且适用作免疫偶联物的组分。因此，在另一个方面中，本发明的特征在于免疫偶联物，其包含抗GCC抗体分子和治疗剂或标记。本发明的特征也在于医药组合物，其包含本文所述的抗GCC抗体分子和免疫偶联物。本发明的特征还在于使用本文所述的抗GCC抗体分子和免疫偶联物用于以下的方法：检测GCC和表达GCC的细胞或组织；对GCC介导的疾病进行诊断、预后、成像或分期；调节GCC蛋白的活性或功能；和治疗GCC介导的疾病，如本文所述。在另一个方面中，本发明的特征也在于编码抗GCC抗体分子氨基酸序列的经分离和/或重组核酸，以及包含所述核酸的载体和宿主细胞，和用于制备抗GCC抗体分子的方法。
本文提到的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入本文中。
本文所揭示的本发明的其它特征、目的和优势将由实施方式和图式以及权利要求书而显而易知。
附图说明
图1描绘用5F9vc-MMAF、-DM1和-DM4以q14d时间表处理的带有293-GCC#2的SCID小鼠中的肿瘤生长。
图2描绘用0.9％NaCl；40mg/kg的209抗体；或10或40mg/kg的5F9抗体处理的小鼠的肿瘤增长。
图3描绘用0.9％NaCl；40mg/kg的209抗体；或10或40mg/kg的5F9抗体处理的小鼠在接种后第41天的肺重量。
图4描绘用5F9抗体处理的带有CT26-hGCC肿瘤的小鼠的存活曲线。
具体实施方式
鸟苷酸环化酶C
鸟苷酸环化酶C(GCC)(又称STAR、ST受体、GUC2C和GUCY2C)是一种跨膜细胞表面受体，其功能在于维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖(凯里瑟等人,美国国家科学院院刊,100:3018-3020(2003)；曼恩(Mann)等人,生物化学与生物物理学研究通讯(BiochemBiophys Res Commun)239:463-466(1997)；皮塔雷(Pitari)等人,美国国家科学院院刊,100:2695-2699(2003))；基因库(GenBank)寄存编号NM_004963，其各自均以引用的方式并入本文中)。此功能是经由结合鸟苷素(guanylin)介导(维嘉德(Wiegand)等人,欧洲生物学化学会联盟快报(FEBS Lett.)311:150-154(1992))。GCC也为热稳定肠毒素(ST，例如氨基酸序列为NTFYCCELCCNPACAGCY，SEQ ID NO:316)的受体，热稳定肠毒素是由大肠杆菌(E.coli)以及其它感染性生物体产生的肽(饶M.C.(Rao,M.C.),诺华基金会研讨会文集(Ciba Found.Symp.)112:74-93(1985)；克努普F.C.(Knoop F.C.)和欧文斯M.(Owens,M.),药理与毒理方法杂志(J.Pharmacol.Toxicol.Methods)28:67-72(1992))。ST结合于GCC活化导致肠道疾病(例如腹泻)的信号级联。
人类GCC的核苷酸序列(基因库寄存编号NM_004963)：
人类GCC的氨基酸序列(基因肽(GenPept)寄存编号NP_004954)：
GCC蛋白具有一些一般公认的结构域，其各自可促成GCC分子的可分离的功能。GCC的各部分包括SEQ ID NO:228的氨基酸残基1到约残基23或残基1到约残基21的信号序列(用于将蛋白质引向细胞表面)(经过切除以实现成熟，得到SEQ ID NO:228的约氨基酸残基22或24到1073的功能性成熟蛋白质)、SEQ ID NO:228的约氨基酸残基24到约残基420或约残基54到约残基384的供配体(例如鸟苷素或ST)结合的细胞外结构域、SEQ ID NO:228的约氨基酸残基431到约残基454或约残基436到约残基452的跨膜结构域、SEQ ID NO:228的约氨基酸残基489到约残基749或约残基508到约残基745的预期具有酪氨酸激酶活性的激酶同源结构域、以及SEQ ID NO:228对约残基750到约残基1007或约残基816到约残基1002的鸟苷酸环化酶催化结构域。
在正常人类组织中，GCC于衬在小肠、大肠和直肠内的粘膜细胞(例如顶端刷状缘膜(apical brush border membrane))上表达(凯里瑟等人,结肠与直肠疾病,39:171-181(1996))。GCC的表达在肠上皮细胞发生致瘤性转化时被维持，并且在所有原发性和转移性结肠直肠肿瘤中都有表达(凯里瑟等人,结肠与直肠疾病,39:171-181(1996)；布克等人,欧洲癌症杂志,41:1618-1627(2005)；凯里瑟等人,胃肠病学,107:1653-1661(1994))。来自胃、食道和胃食道交界处的致瘤性细胞也表达GCC(参见例如美国专利第6,767,704号；德布鲁尼(Debruyne)等人,胃肠病学,130:1191-1206(2006))。可利用组织特异性表达和与癌症(例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌、胃癌或食道癌)的相关性以使用GCC作为此疾病的诊断标记物(凯里瑟等人,结肠与直肠疾病,39:171-181(1996)；布克等人,欧洲癌症杂志,41:1618-1627(2005))。
作为细胞表面蛋白，GCC也可充当受体结合蛋白(例如抗体或配体)的治疗目标。在正常肠组织中，GCC表达于在内腔环境与血管隔室之间形成不渗透障壁层的上皮细胞紧密连接的顶面上(奥盟诺夫(Almenoff)等人,分子微生物学(Mol Microbiol)8:865-873)；高力诺(Guarino)等人,消化道疾病与科学(Dig Dis Sci)32:1017-1026(1987))。因此，全身性静脉内投予GCC结合蛋白治疗剂在接近胃肠系统的致瘤性细胞(包括侵袭性或转移性结肠癌细胞、肠外或转移性结肠肿瘤、食道肿瘤或胃肿瘤、胃食道交界处的腺癌)时将对肠GCC受体具有极小作用。此外，GCC在配体结合时经由受体介导的内吞作用而内在化(布克等人,欧洲癌症杂志,41:1618-1627(2005)；乌尔班斯基(Urbanski)等人,生物化学与生物物理学学报(Biochem Biophys Acta)1245:29-36(1995))。
针对GCC细胞外结构域产生的多克隆抗体(兰迪(Nandi)等人,蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)8:151-159(1996))能够抑制ST肽结合于人类和大鼠GCC，并且抑制ST介导的人类GCC产生cGMP。
GCC已经表征为一种涉及到癌症(包括结肠癌)的蛋白质。也参见凯里瑟等人,结肠与直肠疾病,39:171-181(1996)；布克等人,欧洲癌症杂志,41:1618-1627(2005)；凯里瑟等人,胃肠病学,107:1653-1661(1994)；乌尔班斯基等人,生物化学与生物物理学学报,1245:29-36(1995)。针对GCC的抗体分子治疗剂可以未偶联形式单独使用，由此抑制表达GCC的癌性细胞。本发明的抗GCC抗体分子可结合人类GCC。在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可抑制配体(例如鸟苷素或热稳定肠毒素)与GCC的结合。在其它实施例中，本发明的抗GCC抗体分子不抑制配体(例如鸟苷素或热稳定肠毒素)与GCC的结合。
对GCC具特异性的单克隆抗体包括GCC:B10(兰迪等人,细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)66:500-511(1997))、GCC:4D7(维亚查得拉(Vijayachandra)等人,生物化学(Biochemistry)39:16075-16083(2000))和GCC:C8(贝克尔(Bakre)等人,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)267:179-187(2000))。GCC:B10具有κ轻链和IgG2a同型，并与大鼠、猪和猴GCC交叉反应。GCC:B10结合于GCC细胞内结构域的前63个氨基酸，具体说来结合于SEQ ID NO:228的残基470-480(兰迪等人,蛋白质科学(Protein Sci.)7:2175-2183(1998))。GCC:4D7结合于在GCC的残基491-568内的激酶同源结构域(班达瑞(Bhandari)等人,生物化学,40:9196-9206(2001))。GCC:C8结合于在GCC的细胞质部分中的蛋白激酶样结构域。
定义和方法
除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科技术语应具有一般所属领域技术人员通常了解的含义。一般说来，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交利用的命名法及其技术是此项技术中已知的。基因库或基因肽寄存编号以及适用的核酸和肽序列可见于由位于马里兰州贝赛思达市的美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnological Information,BethesdaMD)所维护的网站。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化与转染(例如电穿孔、脂质体转染)。根据制造商的说明或如此项技术中通常完成或如本文所述来执行酶促反应和纯化技术。前述技术和程序一般是根据此项技术中已知的方法(例如，如本说明书全篇所引用和论述的各种一般和更特定的参考文献中所述)执行。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版,冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港(ColdSpring Harbor,N.Y.)(2000))或一般参见哈洛E.(Harlow,E.)和莱恩D.(Lane,D.)(1988)抗体实验指南(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港实验出版社,纽约冷泉港。结合本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学利用的命名法及其实验程序和技术是此项技术中已知的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、调配和传递以及患者的治疗。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
如本文所用的术语“抗体分子”是指抗体、抗体肽或免疫球蛋白，或上述任一者(例如抗体)的抗原结合片段。抗体分子包括单链抗体分子(例如scFv)(参见例如博德(Bird)等人,(1988)科学(Science)242:423-426；和休斯顿(Huston)等人,(1988)美国国家科学院院刊,85:5879-5883)和单结构域抗体分子(参见例如WO9404678)。尽管不属于术语“抗体分子”，但本发明也包括“抗体类似物”，基于其它非抗体分子蛋白质的骨架，例如使用CDR提供特异性抗原结合的融合蛋白和/或免疫偶联物。
“抗GCC抗体分子”是指与GCC(例如人类GCC)相互作用或识别(例如结合，例如特异性结合)GCC(例如人类GCC)的抗体分子(即抗体、抗体或抗体类似物的抗原结合部分)。示范性抗GCC抗体分子为例如表1和2中概述的分子。
如本文所用的术语“抗体”、“抗体肽”或“免疫球蛋白”是指单链、双链和多链蛋白质以及糖蛋白。术语抗体包括多克隆、单克隆、嵌合、CDR移植和人类或人源化抗体，所有这些抗体在本文别处更详细地论述。所述术语内也包括骆驼类抗体(camelid antibody)(参见例如US2005/0037421)和纳米抗体(nanobody)(例如IgNAR(鲨鱼抗体)，参见例如WO03/014161)。术语“抗体”也包括合成和遗传工程改造的变体。
如本文所用的术语“抗体片段”或抗体的“抗原结合片段”是指例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链抗体、功能性重链抗体(纳米抗体)以及抗体的对至少一种所需表位具有特异性且与完整抗体竞争特异性结合的任何部分(例如具有足够CDR序列且具有足够框架序列以特异性结合于表位的片段)。举例来说，抗原结合片段可竞争结合于与作为所述片段来源的抗体结合的表位。本文和类似情形中所用的来源(derived)不是指任何特定衍生方法或工艺，而仅指序列类似性。抗原结合片段可通过重组技术或通过酶促或化学裂解完整抗体而产生。术语抗原结合片段当用于具有轻链和重链的抗体的单一链(例如重链)时意谓所述链的所述片段足以使得在与另一链(例如轻链)的完整可变区配对时其结合可达成使用完整重链和轻链可变区可见的结合的至少25、50、75、85或90％。
如本文所用的术语“CDR的抗原结合集群(antigen binding constellation ofCDR)”或“足以允许结合的多个CDR”(和类似措辞)是指一条链(例如重链)的CDR当放于框架中且与另一链(例如轻链)的完整可变区或与另一链可变区的具有类似长度且具有相同数目的CDR的一部分配对时足以使得其结合可达成使用完整重链和轻链可变区可见的结合的例如至少25、50、75、85或90％。
如本文所用的术语“人类抗体”包括具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的序列的抗体，例如来源于具有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如XENOMOUSETM遗传工程改造小鼠(艾伯吉尼斯公司(Abgenix)，加利福尼亚州费力蒙(Fremont,CA)))、人类噬菌体呈现文库、人类骨髓瘤细胞或人类B细胞的抗体。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人类抗体(例如啮齿动物，例如鼠类)的抗体，其保留或实质上保留亲本抗体的抗原结合特性，但在人类中具有较低免疫原性。如本文所用的人源化意图包括脱免疫化抗体(deimmunized antibody)。通常人源化抗体包括非人类CDR和人类或人类来源的框架和恒定区。
如本文所用的术语“经修饰”抗体是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；自重组、组合抗体文库分离的抗体；自转殖人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠、绵羊或山羊)分离的抗体；或通过涉及使人类免疫球蛋白基因序列拼接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些经修饰抗体包括人源化抗体、CDR移植抗体(例如CDR来自第一抗体而框架区来自不同来源(例如第二抗体或共同框架)的抗体)、嵌合抗体、体外产生(例如通过噬菌体呈现)的抗体，且可任选包括来源于人类生殖系免疫球蛋白序列或人类免疫球蛋白基因，或通过涉及使人类免疫球蛋白基因序列拼接到替代性免疫球蛋白序列的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体的可变区或恒定区。在实施例中，经修饰抗体分子包括序列相比参考抗体有所变化的抗体分子。
术语“单特异性抗体”是指对特定表位呈现单一结合特异性和亲和力的抗体或抗体制剂。此术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”。
术语“双特异性抗体”或“双功能抗体”是指对两个表位呈现双重结合特异性的抗体，其中各结合位点不同且识别不同表位。
术语“非偶联抗体”和“裸抗体”可互换使用，意思指未结合于非抗体部分(例如治疗剂或标记)的抗体分子。
术语“免疫偶联物”、“抗体偶联物”、“抗体药物偶联物”和“ADC”可互换使用且指偶联于非抗体部分(例如治疗剂或标记)的抗体。
术语“试剂(agent)”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制得的萃取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。
术语“抗癌剂”或“化学治疗剂”在本文中用于指具有抑制人类赘瘤，尤其恶性(癌性)病变(例如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病)发生或发展的功能特性的试剂。抑制转移或血管生成通常为抗癌剂或化学治疗剂的特性。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或抑止细胞生长和/或细胞繁殖的试剂。
“细胞毒性剂”是指主要通过直接干扰细胞功能而引起细胞死亡的化合物，包括(但不限于)烷化剂、肿瘤坏死因子抑制剂、嵌入剂、微管抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。如本文所用的“毒性有效负载(toxic payload)”是指当传递到细胞时导致细胞死亡的足量细胞毒性剂。毒性有效负载的传递可通过投予足量包含本发明的抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂的免疫偶联物来实现。毒性有效负载的传递也可通过投予足量包含细胞毒性剂的免疫偶联物来实现，其中所述免疫偶联物包含识别且结合本发明的抗体或抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段。
如本文所用的短语“来源于指定序列”或“对指定序列具特异性”的序列是指包含与例如指定序列的邻接区域对应(即，一致或互补)的约至少6个核苷酸或至少2个氨基酸、至少约9个核苷酸或至少3个氨基酸、至少约10到12个核苷酸或4个氨基酸或者至少约15到21个核苷酸或5到7个氨基酸的邻接序列的序列。在某些实施例中，所述序列包含指定核苷酸或氨基酸序列的全部。所述序列可与特定序列特有的序列区域互补(在聚核苷酸序列的情况下)或一致，如由此项技术中已知的技术所确定。可作为序列来源的区域包括(但不限于)编码特定表位的区域、编码CDR的区域、编码框架序列的区域、编码恒定结构域区的区域、编码可变结构域区的区域以及非翻译和/或非转录区。所得序列未必在物理上来源于所研究的相关序列，而可基于由作为聚核苷酸来源的区域的碱基序列所提供的信息以任何方式产生，包括(但不限于)化学合成、复制、反转录或转录。因此，其可表示原始聚核苷酸的有义或反义定向。另外，对应于指定序列区域的区域的组合可用此项技术中已知的方式修饰或组合成符合预定用途。举例来说，序列可包含两个或两个以上邻接序列，其各包含指定序列的一部分，且穿插有与指定序列不一致但意图表示来源于指定序列的序列的区域。对于抗体分子，“来源于其”者包括在功能上或结构上与比较抗体有关的抗体分子，例如“来源于其”者包括具有类似或实质上相同的序列或结构(例如具有相同或类似CDR、框架或可变区)的抗体分子。对于抗体，来源于其者也包括以下残基，例如一个或一个以上，例如2、3、4、5、6个或更多个以下残基，所述残基可能邻接或可能不邻接，但根据编号方案或与比较序列的一般抗体结构的同源性或三维接近度(three-dimensional proximity)(即在CDR或框架区内)进行定义或鉴别。术语“来源于其”不限于在物理上来源于其，而是包括通过任何方式、例如通过使用来自比较抗体的序列信息设计另一抗体而产生。
如本文所用的短语“由……编码”是指核酸序列编码多肽序列，其中所述多肽序列或其部分含有来自由所述核酸序列所编码的多肽的至少3到5个氨基酸、至少8到10个氨基酸或至少15到20个氨基酸的氨基酸序列。
计算两个序列之间的“同源性”可如下执行。出于最佳比较目的对准序列(例如，为达成最佳对准可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入间隙，且出于比较目的可忽略非同源序列)。出于比较目的对准的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％、40％或50％、至少60％或至少70％、80％、90％、95％、100％。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某一位置由与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在此位置上一致(如本文所用的氨基酸或核酸“一致性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的一致性百分比随所述序列所共有的一致位置的数目而变化，其中考虑为两个序列的最佳对准而需要引入的间隙的数目和各间隙的长度。
可使用数学演算法完成两个序列之间的序列比较和同源性百分比测定。可使用此项技术中已知的任何方法测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比。举例来说，尼德曼(Needleman)和乌尼史(Wunsch)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:444-453(1970))演算法，其已被并入GCG软件包中的GAP程序中，所述演算法使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及间隙权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。也可使用GCG软件包(艾斯勒有限公司(Accelerys,Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及间隙权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比。用于测定同源性的示范性参数集为Blossum 62计分矩阵，其中间隙罚分(gap penalty)为12，间隙延长罚分为4，且读框转移间隙罚分为5。
如本文所用的术语“在严格条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。有关执行杂交反应的规则可见于现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology),约翰威立出版公司(John Wiley&Sons),纽约(N.Y.)(1989),6.3.1-6.3.6中。所述参考文献描述水性和非水性方法且可使用任一方法。本文提到的特定杂交条件如下：1)低严格度杂交条件，在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃(对于低严格度条件，洗涤温度可提高到55℃)下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤两次；2)中等严格度杂交条件，在约45℃下在6×SSC中，随后在60℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或一次以上；3)高严格度杂交条件，在约45℃下在6×SSC中，随后在65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或一次以上；和4)极高严格度杂交条件为在65℃下0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在65℃下用0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或一次以上。极高严格度条件(4)通常为优选的条件，且除非另外规定，否则应使用所述条件。
应了解，本发明的抗体和其抗原结合片段可具有额外保守性或非必需氨基酸取代，其对多肽功能无实质影响。特定取代是否容许(即，不会不利地影响所需生物特性，例如结合活性)可如鲍维JU(Bowie,JU)等人,科学,247:1306-1310(1990)或帕德兰(Padlan)等人,美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)9:133-139(1995)所述确定。“保守性氨基酸取代”为氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在此项技术中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“非必需”氨基酸残基是可由结合剂(例如抗体)的野生型序列改变而不会消除或不会实质上改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基会产生所述变化。在抗体中，必需氨基酸残基可为特异性决定残基(SDR)。
如本文所用的术语“经分离”是指物质自其原始环境(例如如果其天然存在，那么为自然环境)移出。举例来说，活体动物中存在的天然存在的聚核苷酸或多肽是未分离的，但与自然系统中共存物质中的一些或全部分离的相同聚核苷酸或DNA或多肽是经分离的。所述聚核苷酸可为载体的一部分，和/或所述聚核苷酸或多肽可为包含含有所述聚核苷酸或多肽的经分离细胞或培养细胞的组合物(例如混合物、溶液或悬浮液)的一部分，且其在所述载体或组合物不是自然环境的一部分的情况下仍为经分离的。
如本文所用的术语“复制子”是指在细胞内表达为聚核苷酸复制的自主单元的任何遗传元件，例如质粒、染色体或病毒。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指所述组分处于使其能以其预定方式发挥作用的关系中的情形。因此，例如，“可操作地连接”到编码序列的控制序列是以某种方式连接以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
如本文所用的术语“载体”是指连接有另一聚核苷酸区段例如以便引起所连接区段的复制和/或表达的复制子。
如本文所用的术语“控制序列”是指这样一种聚核苷酸序列，其为实现其所连接的编码序列的表达所必需的。所述控制序列的性质视宿主生物体而不同。在原核生物中，所述控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子，且在一些情况下包括强化子。因此，术语“控制序列”意图至少包括存在是表达所必需的所有组分，且也可包括存在将有利的其它组分，例如前导序列。
如本文所用的术语“经纯化产物”是指产物的制剂，其已与所述产物通常缔合的细胞组分和/或与可存在于相关样品中的其它类型的细胞分离。
如本文所用的术语“表位”是指能够特异性结合于抗体的蛋白质抗原决定子。表位抗原决定子通常由例如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面群组成，且通常具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。一些表位为线性表位，而其它为构象表位。线性表位是邻接氨基酸一级序列包含所识别的表位的表位。线性表位通常包括至少3个且更通常至少5个，例如约8到约10个邻接氨基酸。构象表位可由至少两种情形产生，例如：a)仅以某些蛋白质构象(例如取决于配体结合，或取决于信号传导分子进行的修饰(例如磷酸化))暴露于抗体结合的线性序列；或b)在蛋白质中超过一个部分或在多亚单元蛋白质中超过一个亚单元的结构特征的组合，其中所述特征在三维空间中足够紧密接近以参与结合。
如本文所用的“同型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
如本文所用的术语“可检测剂”、“标记”或“经标记”用于指在多肽或糖蛋白上并入可检测标记物。标记多肽和糖蛋白的各种方法是此项技术中已知的且都可使用。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如铟(111In)、碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、铋(212Bi或213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铑(188Rh)、锝(99mTc)、镨或磷(32P)或发射正电子的放射性核素，例如碳-11(11C)、钾-40(40K)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)和碘-121(121I))、荧光标记(例如FITC、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团(其可通过经标记的抗生物素蛋白(例如含有抗生蛋白链菌素部分的分子)和荧光标记物或可通过光学方法或量热法检测的酶促活性来检测)和由二次报导子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，标记通过各种长度的间隔子臂连接以减少可能的位阻。
对于抗GCC抗体分子，如本文所用的“特异性结合”或“结合特异性”意谓抗体分子结合于GCC(例如人类GCC蛋白)的亲和力大于其结合于非GCC蛋白(例如BSA)的亲和力。通常，抗GCC分子对于非GCC蛋白(例如BSA)的Kd将是其对于GCC(例如人类GCC蛋白)的Kd的大于2倍、大于10倍、大于100倍、大于1,000倍、大于104倍、大于105倍或大于106倍。在测定Kd时，对于GCC和非GCC蛋白(例如BSA)的Kd应在相同条件下测定。
如本文所用的术语“治疗”定义为向个体(例如患者)投予抗GCC抗体分子，或向个体的经分离组织或细胞投予(例如通过施用)，所述经分离组织或细胞将返回到个体中。抗GCC抗体分子可单独投予或与第二药剂组合投予。治疗可为治愈、复原、缓和、缓解、改变、补救、改善、减轻、改良或影响病症、病症的症状或病症(例如癌症)倾向。尽管不希望受理论束缚，但相信治疗可在体外或在体内抑制、消除或杀灭细胞，或以其它方式降低细胞(例如异常细胞)介导病症(例如，如本文所述的病症，例如癌症)的能力。
如本文所用的术语“个体”意图包括哺乳动物、灵长类动物、人类和非人类动物。举例来说，个体可为患有癌症(例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)、具有癌症(其中至少一些细胞表达GCC；例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)症状或具有癌症(其中至少一些细胞表达GCC；例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)倾向的患者(例如人类患者或兽类患者)。除非另外说明，否则术语本发明的“非人类动物”包括所有非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施例中，个体不包括小鼠、大鼠、兔或山羊中的一者或一者以上或全部。
如本文所用的抗GCC抗体分子“有效”或“足以”治疗病症的量，或“治疗有效量”或“治疗上足够的量”是指在投予个体单次或多次剂量后有效治疗细胞(例如癌细胞，例如表达GCC的肿瘤细胞)或延长患有本文所述病症的个体的生命、治愈、缓和、缓解或改良所述个体超过在无所述治疗的情况下预期的结果的抗体分子的量。如本文所用的“抑制肿瘤或癌症的生长”是指减缓、中断、停滞或停止其生长和/或转移且未必表示肿瘤生长的完全消除。
如本文所用的“GCC”(又称“STAR”、“GUC2C”、“GUCY2C”或“ST受体”蛋白)是指哺乳动物GCC，优选为人类GCC蛋白。人类GCC是指SEQ ID NO:228中所示的蛋白质和其天然存在的等位基因蛋白质变体。SEQ ID NO:228中的等位基因可由SEQ ID NO:227中所示的GCC核酸序列编码。其它变体是此项技术中已知的。参见例如寄存编号Ensp0000261170、恩瑟布数据库(Ensembl Database)、欧洲生物信息学研究院(European BioinformaticsInstitute)和韦尔科姆基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)，其在残基281处具有亮氨酸；公开的美国专利申请案第US 20060035852号的SEQ ID NO:14；或基因库寄存编号AAB19934。通常，天然存在的等位基因变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:228的GCC序列至少95％、97％或99％一致。转录物编码具有1073个氨基酸的蛋白质产物，且描述于基因库寄存编号NM_004963中。GCC蛋白表征为一种跨膜细胞表面受体蛋白，且相信其在维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖方面起关键作用。
除非另外说明，否则术语“烷基”是指具有约1到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选约1到约8个碳原子的饱和直链或分支烃。烷基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。
单独或作为另一基团的一部分的烷基可称作“经取代”。经取代烷基是经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代的烷基：包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下基团进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外说明，否则术语“烯基”和“炔基”是指具有约2到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选约2到约8个碳原子的直链和分支碳链。烯基链在链中具有至少一个双键，且炔基链在链中具有至少一个三键。烯基的实例包括(但不限于)乙烯(ethylene)或乙烯基、烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基和-2,3-二甲基-2-丁烯基。炔基的实例包括(但不限于)乙炔基(acetylenic)、炔丙基、乙炔基(acetylenyl)、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1-丁炔基。
与烷基一样，烯基和炔基可经取代。“经取代”烯基或炔基是经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代的烯基或炔基：包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外说明，否则术语“亚烷基”是指具有约1到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选具有约1到约8个碳原子且具有通过自母烷烃的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得的两个单价基团中心的饱和分支链或直链烃基。典型亚烷基包括(但不限于)亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1,4-亚环己基等。单独或作为另一基团的一部分的亚烷基可任选经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代：包括(但不限于)-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外说明，否则术语“亚烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的任选取代的亚烷基。示范性亚烯基包括例如亚乙烯基(-CH＝CH-)和亚丙烯基(-CH＝CHCH2-)。
除非另外说明，否则术语“亚炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的任选取代的亚烷基。示范性亚炔基包括例如亚乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
除非另外说明，否则术语“芳基”是指具有6到20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)且通过自母芳香族环系统的单一碳原子移除一个氢原子获得的单价芳香族烃基。一些芳基在示范性结构中以“Ar”表示。典型芳基包括(但不限于)衍生自苯、经取代苯、苯基、萘、蒽、联苯等的基团。
单独或作为另一基团的一部分的芳基可任选经一个或一个以上如下基团、优选1到5个或甚至1到2个如下基团取代：包括(但不限于)-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-NO2、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外说明，否则术语“亚芳基”是指任选取代的二价芳基(即，通过自母芳香族环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)且可呈如以下结构用苯基作为示范性芳基所示的邻位、间位或对位构型：
典型“-(C1-C8亚烷基)芳基”、“-(C2-C8亚烯基)芳基”和“-(C2-C8亚炔基)芳基”包括(但不限于)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基等。
除非另外说明，否则术语“杂环”是指至少一个环中的至少一个环原子为选自N、O、P或S的杂原子的具有3到14个环原子(又称环成员)的单环、双环或多环系统(和其中的碳原子和杂原子范围和特定数目的所有组合和子组合)。杂环可具有1到4个独立地选自N、O、P或S的环杂原子。杂环中的一个或一个以上N、C或S原子可经氧化。单环杂环优选具有3到7个环成员(例如2到6个碳原子和1到3个独立地选自N、O、P或S的杂原子)，且双环杂环优选具有5到10个环成员(例如4到9个碳原子和1到3个独立地选自N、O、P或S的杂原子)。包括杂原子的环可为芳香族或非芳香族环。除非另外说明，否则杂环在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接到其侧基。
杂环描述于以下文献中：帕奎特(Paquette),“当代杂环化学原理(Principles ofModern Heterocyclic Chemistry)”(W.A.本杰明(W.A.Benjamin),纽约,1968),尤其第1章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；“杂环化合物化学系列丛书(The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs)”(约翰威立出版公司,纽约,1950年至今),尤其第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；和美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)82:5566(1960)。
除非另外说明，否则术语“杂环”是指任选取代的如上文所定义的二价杂环基团(即通过自母杂环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)。
“杂环”的实例包括(例如且不限于)吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚烯基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、氮杂环庚烷基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基(xanthenyl)、啡噁噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4H-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基(furazanyl)、啡噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基(quinuclidinyl)、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。优选“杂环”基团包括(但不限于)苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基(coumarinyl)、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。
单独或作为另一基团的一部分的杂环基可任选经一个或一个以上如下基团、优选1到2个如下基团取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基。
举例来说且不限于，碳键接的杂环可在如下位置键接：吡啶的位置2、3、4、5或6；哒嗪的位置3、4、5或6；嘧啶的位置2、4、5或6；吡嗪的位置2、3、5或6；呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4或5；异噁唑、吡唑或异噻唑的位置3、4或5；氮丙啶的位置2或3；氮杂环丁烷的位置2、3或4；喹啉的位置2、3、4、5、6、7或8；或异喹啉的位置1、3、4、5、6、7或8。碳键接的杂环更通常包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
举例来说且不限于，氮键接的杂环可在如下位置键接：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉或1H-吲唑的位置1；异吲哚或异吲哚啉的位置2；吗啉的位置4；和咔唑或β-咔啉的位置9。氮键接的杂环更通常包括1-氮丙啶基、1-氮杂环丁烷基(1-azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
除非另外说明，否则术语“碳环”是指具有3到14个环原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)的饱和或不饱和非芳香族单环、双环或多环系统，其中所有环原子都为碳原子。单环碳环优选具有3到6个环原子，更优选具有5或6个环原子。双环碳环优选具有7到12个环原子，例如布置成双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，或9或10个环原子布置成双环[5,6]或[6,6]系统。术语“碳环”包括例如与芳环稠合的单环碳环(例如与苯环稠合的单环碳环)。碳环优选具有3到8个碳环原子。
单独或作为另一基团的一部分的碳环基团可任选经例如一个或一个以上如下基团、优选1或2个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代：包括(但不限于)-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代：包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R″、-OC(O)R″、-C(O)OR″、-C(O)NH2、-C(O)NHR″、-C(O)N(R″)2、-NHC(O)R″、-SR″、-SO3R″、-S(O)2R″、-S(O)R″、-OH、-N3、-NH2、-NH(R″)、-N(R″)2和-CN，其中各R″独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
单环碳环取代基的实例包括-环丙基、-环丁基、-环戊基、-1-环戊-1-烯基、-1-环戊-2-烯基、-1-环戊-3-烯基、环己基、-1-环己-1-烯基、-1-环己-2-烯基、-1-环己-3-烯基、-环庚基、-环辛基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基和-环辛二烯基。
单独或作为另一基团的一部分使用的“碳环”是指任选取代的如上文所定义的二价碳环基团(即通过自母碳环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)。
除非上下文另外指定，否则连字符(-)表示与侧位分子的连接点。因此，术语“-(C1-C8亚烷基)芳基”或“-C1-C8亚烷基(芳基)”是指这样一种如本文所定义的C1-C8亚烷基，其中所述亚烷基在所述亚烷基的任一碳原子处连接到侧位分子，且键接到亚烷基的一个碳原子的氢原子中的一者经如本文所定义的芳基置换。
当特定基团“经取代”时，所述基团可具有一个或一个以上取代基，优选1到5个取代基，更优选1到3个取代基，最优选1到2个取代基，所述取代基独立地选自取代基清单。然而，所述基团一般具有选自卤素的任何数目的取代基。经取代基团如所示。
预期在分子中特定位置处的任何取代基或变量的定义与其在所述分子中别处的定义无关。应了解，本发明化合物上的取代基和取代模式可由一般所属领域技术人员选择以提供化学上稳定且易于由此项技术中已知的技术以及本文所述的方法合成的化合物。
如本文所用的保护基是指暂时或永久选择性阻断多官能化合物中的一个反应性位点的基团。适用于本发明中的羟基保护基是医药学上可接受的，且可能需要或可能不需要在投予个体后自母化合物裂解以使化合物具有活性。裂解是经由体内的正常代谢过程实现。羟基保护基是此项技术中众所周知的，参见T.W.格里尼(T.W.Greene)和P.G.M伍兹(P.G.M.Wuts),有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)(约翰威立出版公司,第3版)(以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的)，且包括例如醚(例如烷基醚和硅烷基醚，包括例如二烷基硅烷基醚、三烷基硅烷基醚、二烷基烷氧基硅烷基醚)、酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯和磷酸酯保护基。羟基保护基的实例包括(但不限于)甲基醚；甲氧基甲基醚、甲基硫甲基醚、(苯基二甲基硅烷基)甲氧基甲基醚、苯甲氧基甲基醚、对甲氧基苯甲氧基甲基醚、对硝基苯甲氧基甲基醚、邻硝基苯甲氧基甲基醚、(4-甲氧基苯氧基)甲基醚、愈创木酚甲基醚、叔丁氧基甲基醚、4-戊烯氧基甲基醚、硅烷氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、2,2,2-三氯乙氧基甲基醚、双(2-氯乙氧基)甲基醚、2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基醚、甲氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、1-甲氧基环己基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1,4-二噁烷-2-基醚、四氢呋喃基醚、四氢硫呋喃基醚；经取代乙基醚，例如1-乙氧基乙基醚、1-(2-氯乙氧基)乙基醚、1-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]乙基醚、1-甲基-1-甲氧基乙基醚、1-甲基-1-苯甲氧基乙基醚、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙基醚、1-甲基-1苯氧基乙基醚；2-三甲基硅烷基醚、叔丁基醚、烯丙基醚、炔丙基醚、对氯苯基醚、对甲氧基苯基醚、苯甲基醚、对甲氧基苯甲基醚、3,4-二甲氧基苯甲基醚、三甲基硅烷基醚、三乙基硅烷基醚、三丙基硅烷基醚、二甲基异丙基硅烷基醚、二乙基异丙基硅烷基醚、二甲基己基硅烷基醚、叔丁基二甲基硅烷基醚、二苯基甲基硅烷基醚、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯基乙酸酯、苯甲酸酯、碳酸烷酯甲酯、碳酸烷酯9-芴基甲酯、碳酸烷酯乙酯、碳酸烷酯2,2,2,-三氯乙酯、碳酸1,1,-二甲基-2,2,2-三氯乙酯、烷基磺酸酯、甲烷磺酸酯、苯甲基磺酸酯、甲苯磺酸酯、亚甲基缩醛、亚乙基缩醛和叔丁基次甲基缩酮。优选保护基由下式表示：-R、-Si(R)(R)(R)、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NH(R)、-S(O)2R、-S(O)2OH、P(O)(OH)2和-P(O)(OH)OR，其中R为C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)，其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基任选经取代。
缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉索因(dolaisoleuine)-多拉普因(dolaproine)-苯丙氨酸-对苯二胺(参见下文式(XVIII))。
缩写“MMAE”是指单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E)(参见下文式(XIII))。
缩“AEB”是指通过使奥瑞他汀E(auristatin E)与对乙酰基苯甲酸反应产生的酯(参见下文式(XXII))。
缩写“AEVB”是指通过使奥瑞他汀E与苯甲酰基戊酸反应产生的酯(参见下文式(XXIII))。
缩写“MMAF”是指单甲基奥瑞他汀F(参见下文式(XXI))。
抗体
在某些方面中，本发明涉及具有例如表1和2中概述的特征的抗GCC抗体分子。在其它方面中，本发明涉及具有例如表3、4、5和/或6中概述的特征的抗GCC抗体分子。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子是人类杂交瘤抗体，且为抗体5F9、5H3、6H8、8C2、10C10、10D3和1D3中一者。在一个实施例中，抗GCC抗体分子来源于抗体5F9、5H3、6H8、8C2、10C10、10D3或1D3。在一个实施例中，抗GCC抗体分子是由杂交瘤5F9(PTA-8132)产生。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子为选择的淋巴细胞抗体，且为抗体Abx-12、Abx-020、Abx-106、Abx-198、Abx-221、Abx-229、Abx-338和Abx-393中一者。在一个实施例中，抗GCC抗体分子来源于抗体Abx-12、Abx-020、Abx-106、Abx-198、Abx-221、Abx-229、Abx-338和Abx-393。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子为鼠类抗体，且为抗体mAb 3G1、mAb 8E12、mAb10B8和mAb 8F1中一者。在一个实施例中，抗GCC抗体分子来源于抗体mAb 3G1、mAb 8E12和mAb 8F1。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子对于GCC的亲和力(例如，如由直接结合或竞争结合分析所测量)将在本文所述的范围内。在一个实施例中，抗GCC抗体分子的Kd小于1×10- 6M，小于1×10-7M，小于1×10-8M，小于1×10-9M，小于1×10-10M，小于1×10-11M，小于1×10- 12M或小于1×10-13M。在一个实施例中，抗体分子为IgG或其抗原结合片段，且Kd小于1×10- 6M，小于1×10-7M，小于1×10-8M或小于1×10-9M。在一个实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体或来源于其的抗体)的Kd为约80到约200pM，优选为约100到约150pM或约120pM。在一个实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体或来源于其的抗体)的ka为约0.9到约1.25×105M- 1s-1，优选为约1.1×105M-1s-1。在一个实施例中，抗体分子为ScFv，且Kd小于1×10-6M，小于1×10-7M，小于1×10-8M，小于1×10-9M，小于1×10-10M，小于1×10-11M，小于1×10-12M或小于1×10-13M。
在实施例中，抗体分子不为免疫偶联物，即为“裸”抗体，且在实施例中在结合于GCC时引起细胞反应。在相关实施例中，细胞反应是由抗体所结合的GCC表达细胞执行。所述细胞反应可为由GCC介导的信号转导，例如在抗体分子为GCC的激动剂的情况下(参见例如美国专利申请公开案第US20040258687号)。在其它实施例中，细胞反应是由识别结合于第一细胞上的GCC的抗体分子的第二细胞(例如免疫效应细胞，例如自然杀手细胞)执行。在一些实施例中，监视分子(surveillance molecule)，例如补体分子，接触结合GCC的抗体分子，随后发生细胞反应。这些实施例中的细胞反应可导致GCC表达细胞死亡。
在其它实施例中，作为免疫偶联物的抗体分子可在结合于GCC时引起细胞反应，且内在化以向其所结合的GCC表达细胞传递药剂。
在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可阻断配体结合于GCC。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子不能显示与大鼠GCC和小鼠GCC中的一者或两者的实质交叉反应。
在一个实施例中，抗体分子不为GCC:B10、GCC:4D7或GCC:C8。在另一个实施例中，抗GCC抗体分子不结合GCC的细胞内结构域，即SEQ ID NO:228的约氨基酸残基455到1073。举例来说，在此实施例中，抗GCC抗体分子不结合GCC的激酶同源结构域或鸟苷酸环化酶结构域。
天然存在的哺乳动物抗体结构单元通常为四聚体。各四聚体是由两对多肽链构成，每一对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分界定主要负责效应功能的恒定区。人类轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε重链，且抗体同型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见基础免疫学(Fundamental Immunology)第7章(保罗W.(Paul,W.)编,第2版,瑞文出版社(Raven Press),纽约(1989))。每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。抗GCC抗体分子的优选同型为IgG免疫球蛋白，其可分类成具有不同γ重链的4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。大多数治疗性抗体为IgG1型的人类、嵌合或人源化抗体。在一个特定实施例中，抗GCC抗体分子具有IgG1同型。
每一重链和轻链对的可变区形成抗原结合位点。因此，完整IgG抗体具有两个相同的结合位点。然而，双功能或双特异性抗体为人造杂交构筑体，其具有两个不同的重链/轻链对，从而产生两个不同的结合位点。
所述链都展现相对保守的框架区(FR)由三个高变区(又称互补决定区或CDR)接合的相同一般结构。各对的两条链的CDR由框架区对准，从而能够结合于特定表位。从N末端到C末端，轻链与重链包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据如下参考文献的定义将氨基酸分配于各结构域：卡贝特的免疫相关蛋白质序列(Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest)(马里兰州贝赛思达市国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.)(1987和1991))，或查塞(Chothia)和赖斯克(Lesk)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987)；查塞等人,自然(Nature)342:878-883(1989)。如本文所用，重链和轻链的CDR分别称为(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
抗GCC抗体分子可包含上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的重链和轻链中一者或两者的CDR的全部或抗原结合子集。人类杂交瘤、所选淋巴细胞和鼠类抗体部分(包括可变区和CDR)的氨基酸序列可见于表3和表5。
因此，在一个实施例中，抗体分子包括以下一者或两者：
(a)上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的一个、两个、三个或抗原结合数量的轻链CDR(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)。在实施例中，CDR可包含如下LCDR1-3中一者或一者以上或全部的氨基酸序列：LCDR1，或经修饰LCDR1，其中一到七个氨基酸经保守取代)；LCDR2，或经修饰LCDR2，其中一个或两个氨基酸经保守取代)；或者LCDR3或经修饰LCDR3，其中一个或两个氨基酸经保守取代；和
(b)上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的一个、两个、三个或抗原结合数量的重链CDR(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)。在实施例中，CDR可包含如下HCDR1-3中一者或一者以上或全部的氨基酸序列：HCDR1，或经修饰HCDR1，其中一个或两个氨基酸经保守取代；HCDR2，或经修饰HCDR2，其中一到四个氨基酸经保守取代；或者HCDR3，或经修饰HCDR3，其中一个或两个氨基酸经保守取代。
适用于产生抗GCC抗体的免疫原包括GCC(例如人类GCC)表达细胞(例如肿瘤细胞系，例如T84细胞，或新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞；表达GCC的重组细胞)；GCC表达细胞的膜部分(例如结肠肿瘤细胞系，例如T84细胞，或新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞；表达GCC的重组细胞，例如表达全长GCC的HT-29-GCC#2细胞，或表达GCC的一部分的重组细胞，例如表达包含GCC细胞外结构域(例如SEQ ID NO:318)的一部分的CHO GCC#27细胞)；经分离或纯化的GCC，例如人类GCC蛋白(例如以生物化学方式分离的GCC，例如自表达GCC或其变体的胃肠肿瘤细胞或重组细胞分离)或其部分(例如GCC的细胞外结构域、GCC的激酶同源结构域、或GCC的鸟苷酸环化酶催化结构域，或对应于其部分的肽，例如包含SEQ ID NO:228的至少约8、10、12、14、16、20、24、28或32个氨基酸残基)；或包含SEQ ID NO:229或包含其成熟部分且无信号序列(即无SEQ ID NO:229的氨基酸残基1到约21或23)的免疫原，例如成熟TOK107-hIgG蛋白，SEQ ID NO:317。
免疫原可与异源序列融合以有助于生物化学操作、纯化、免疫或抗体效价测量。所述免疫原可包含GCC的一部分，例如细胞外结构域，以及包含非GCC多肽的部分。有多种选择可用于构建融合蛋白以便利纯化或固定于固体支撑物(例如亲和柱或微量滴定板，或其它适合的分析衬底/芯片)上。举例来说，融合部分可添加结构域，例如谷胱甘肽-S-转移酶/激酶(GST)，其可结合谷胱甘肽；免疫球蛋白的Fc区，其可结合于蛋白质A或蛋白质G；氨基酸残基，例如两个、三个、四个、五个、优选六个组氨酸残基，其可结合亲和柱上的镍或钴；表位标签，例如c-myc致癌基因的一部分(myc标签)、FLAG标签(美国专利第4,703,004号)、血凝素(HA)标签、T7基因10标签、V5标签、HSV标签或VSV-G标签，其可结合标签特异性抗体；或辅因子，例如生物素，其可结合抗生蛋白链菌素。
包含免疫球蛋白的Fc部分的免疫原可使在溶液中或附着于细胞的GCC保持允许宿主免疫监视组分在结构上接近GCC表位的构型以便有效产生抗体。因为包含Fc区的免疫球蛋白重链经由链间二硫键缔合成二聚体，所以由与Fc区融合产生的免疫原为二聚体。融合蛋白的价态可反映提供Fc区的免疫球蛋白的类型。举例来说，与IgG蛋白形成的融合物可为二聚体，IgA融合物可制备四聚免疫原，且IgM融合物可制备十聚免疫原，后两者易于通过共转染J链获得。Fc融合蛋白的示范性免疫球蛋白为IgG1。所用部分通常具有由单一外显子编码的IgG1铰链、CH2和CH3结构域。因为此外显子也具有CH1区的一部分，其具有经定向以与轻链的半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸，所以适用的修饰是使CH1半胱氨酸突变为例如丝氨酸以确保融合蛋白中不存在未配对的半胱氨酸。这种突变也增加了铰链的柔性。
用于与免疫原融合以在宿主物种(例如小鼠、大鼠、兔、山羊)中进行免疫的来源于非宿主物种的Fc部分(例如人类Ig Fc区)可起辅助作用。此辅助功能可引发针对Fc与GCC表位的特异性抗体。在筛选期间可鉴别且去除Fc反应性抗体。Fc部分可具有野生型序列或经突变以改变效应功能的序列。举例来说，可将突变的恒定区(变体)并入融合蛋白中以使与Fc受体的结合和/或固定补体的能力减到最小(参见例如维特(Winter)等人,GB 2,209,757B；莫里森(Morrison)等人,WO 89/07142；摩根(Morgan)等人,WO 94/29351)。在一个优选实例中，使根据Fc区标准物编号的赖氨酸235和甘氨酸237突变为例如丙氨酸。具有突变Fc的IgG的免疫原/融合蛋白可具有减小的与宿主中Fc受体的相互作用。一种优选的可溶性免疫原融合蛋白(在成熟以裂解信号肽和分泌之后)为TOK-107-hIgG(又名hGCC-ECD/hIgG1Fc)，其由SEQ ID NO:228的氨基酸残基24到430与突变的人类IgG1免疫球蛋白Fc(SEQID NO:317)融合而组成。
为制备细胞表达的免疫原，免疫球蛋白部分可进行结构化以模拟B细胞受体的免疫球蛋白部分。举例来说，免疫球蛋白Fc区可进一步与包含免疫受体(例如Fcγ受体、Fcα受体、Fcα/μ受体或Fcε受体)跨膜区的多肽融合。如果表达免疫原融合蛋白的细胞进一步包含抗原受体复合物(例如B细胞IgM受体或IgD受体)的其它组分，那么可改良充分暴露于细胞表面上的所述Fc受体细胞结合的免疫原的适当定向。所述复合物的适合组分包括免疫球蛋白(Ig)鞘蛋白，例如MB-1和B29(CD79A和CD79B；霍姆贝奇(Hombach)等人,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)20:2795-2799(1990)，对于IgM受体)，其形成杂二聚体。Ig鞘蛋白可由转染细胞内源性产生，例如，如果转染B细胞淋巴瘤细胞系的话；或通过共转染例如在单独载体中或在同一载体中的免疫原与鞘蛋白来提供。用于在小鼠中进行免疫的优选IgG鞘蛋白为小鼠CD79a和CD79b(基因库寄存编号分别为NM_007655和NM_008339)。优选细胞结合的免疫原融合蛋白(在成熟以裂解信号肽和转位到细胞表面后)为TOK111产物，其由TOK-107hIgG(hGCC-ECD/hIgG1Fc)与小鼠IgG2a(例如基因肽寄存编号AAB59661)跨膜和细胞内结构域(SEQ ID NO:318)融合而组成。
可结合本文所述的抗GCC抗体分子(例如单克隆抗体、人类抗体或人源化抗体)的来自GCC分子的适用表位(例如参考表位)可在GCC的细胞外部分上发现。所述GCC表位可结合细胞表面上(例如细胞外部上)的抗体分子。
举例来说，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基：SEQ ID NO:228的残基1-50，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其5F9结合片段。所述片段可包含SEQ ID NO:228的残基1-25、5-30、10-35、15-40、20-45、25-50、5-45、10-40、15-35、20-30或33-50。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如5F9抗体)的表位为构象表位，其进一步包含GCC氨基酸序列中残基50以外(即选自SEQ ID NO:228的约残基50到1073)的一个或一个以上其它氨基酸残基。
在另一实例中，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基：SEQ ID NO:225，或SEQ ID NO:228的残基271-300，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其ABX-198、3G1、8F1或10B8结合片段。所述片段可包含SEQ ID NO:228的残基281-290，或SEQ ID NO:228的残基281-290(其中残基281为亮氨酸)，或SEQ ID NO:228的残基281-300或残基271-290。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如ABX-198、3G1、8F1或10B8抗体)的表位为构象表位，其进一步包含一个或一个以上其它氨基酸残基，即GCC氨基酸序列中的非SEQ ID NO:225残基，例如选自SEQ ID NO:228的约残基1到270和/或约301到1073者。
在另一实例中，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基：SEQ ID NO:226，或SEQ ID NO:228的残基351-375，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其ABX-012、ABX-338或ABX-106结合片段。所述片段可包含SEQ ID NO:228的356-370，或SEQ ID NO:228的残基351-370，或SEQ ID NO:228的残基356-375。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如ABX-012、ABX-338或ABX-106抗体)的表位为构象表位，其进一步包含一个或一个以上其它氨基酸残基，即GCC氨基酸序列中的非SEQ ID NO:226残基，例如选自SEQ ID NO:228的约残基1到350和/或约376到1073者。
针对所述表位或细胞外结构域(例如存在于以下中或包括来自以下的残基的表位：SEQ ID NO:228的氨基酸残基24到420或其参考部分，例如GCC的残基24到75、75到150、150到225、225到300、300到375或375到420)产生的抗体或来源于其的抗体分子可适用作如本文所述的治疗性或诊断抗体。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子具有一个或一个以上以下特性：
a)其与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者竞争结合，例如结合于细胞表面GCC或经纯化GCC；
b)其与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者结合于GCC上的相同或实质上相同的表位。在一个实施例中，如由一种或一种以上肽阵列分析法或通过结合于在细胞表面或膜制剂上表达的截短突变体、嵌合体或点突变体(例如，这些分析法如本文所述)所确定，所述抗体结合相同表位；
c)其结合于如下表位，所述表位具有至少1、2、3、4、5、8、10、15或20个邻接氨基酸残基与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者的表位相同；
d)其结合人类GCC中由本发明抗GCC抗体结合的区域，其中所述区域(例如细胞外或细胞质区)的长度为10-15、10-20、20-30或20-40个残基，且结合是例如通过结合于截短突变体来确定；在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合人类GCC的细胞外区。在一个实施例中，抗GCC抗体分子可结合人类GCC中由SEQ ID NO:228的氨基酸残基24到420界定的细胞外结构域部分。在一个实施例中，抗GCC抗体分子可结合在SEQ ID NO:228的氨基酸残基931到954处的鸟苷酸环化酶特征位点；或
e)其结合于本文所述的参考表位。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合GCC序列ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS(SEQ ID NO:225)。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合GCC序列FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV(SEQID NO:226)。
在一个实施例中，抗体分子结合构象表位。在其它实施例中，抗体分子结合线性表位。
抗GCC抗体分子可为多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、嵌合抗体(参见美国专利第6,020,153号)或人类或人源化抗体，或其抗体片段或衍生物。本发明也涵盖前述任一者的合成和遗传工程改造的变体(参见美国专利第6,331,415号)。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括常规鼠类单克隆抗体方法，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein),自然,256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。一般说来，参见哈洛E.和莱恩D.(1988)抗体实验指南,冷泉港实验出版社,纽约冷泉港。
用蛋白质(例如GCC或可溶性部分，或包含GCC的一部分的融合蛋白(例如TOK107-hIg)，或细胞或来源于其的膜部分(例如表达表面暴露的GCC的细胞)或其部分(例如pLKTOK4产物或pLKTOK111产物))免疫可用制备用于以诱导反应的方式(例如在佐剂，例如完全傅氏佐剂(complete Freund's adjuvant)存在下)注射的免疫原执行。其它适合的佐剂包括TITERMAX佐剂(赛特斯公司(CYTRX Corporation)，加利福尼亚州洛杉矶(Los Angeles,CA))和矾。小肽免疫原可连接到较大分子(例如匙孔螺血氰蛋白(keyholelimpet hemocyanin))。小鼠可以多种方式(例如皮下、静脉内或肌肉内)在多个部位(例如在腹膜中(i.p.)、尾基部或足垫中，或部位的组合，例如腹膜中和尾基部(BIP))注射。增强注射可包括相同或不同免疫原且可另外包括佐剂，例如不完全傅氏佐剂(incompleteFreund's adjuvant)。用DNA(例如编码GCC或其部分或者包含GCC或其部分的融合蛋白(例如编码TOK107-hIg)的DNA)免疫可使用基因枪技术进行注射。举例来说，将DNA装载于微观金粒子上且经短期以频繁的时间间隔注射到小鼠中。
一般说来，如果需要单克隆抗体，就通过将来自永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系，例如SP2/0、P3X63Ag8.653或杂骨髓瘤)的适合细胞与抗体产生细胞融合来制备杂交瘤。抗体产生细胞可自人类、人类抗体转基因动物或用相关抗原免疫的其它适合动物的周边血液或优选脾或淋巴结获得。产生人类起源的抗体(例如人类抗体)的细胞可使用适合方法制备，例如使人类抗体产生细胞与杂骨髓瘤或三体杂交瘤融合，或经由用艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)感染对活化的人类B细胞进行永生化。(参见例如美国专利第6,197,582号(特克特(Trakht))；尼德贝拉(Niedbala)等人,杂交瘤(Hybridoma),17:299-304(1998)；泽尼拉(Zanella)等人,免疫法杂志(J Immunol Methods),156:205-215(1992)；古斯塔夫松(Gustafsson)等人,人类抗体与杂交瘤(Hum Antibodies Hybridomas),2:26-32(1991)。)融合或永生化的抗体产生细胞(杂交瘤)可使用选择性培养条件分离，且通过限制稀释进行克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可使用适合分析(例如ELISA(例如用固定于微量滴定孔上的免疫原，例如TOK107-hIgG)或通过对表达GCC或其部分的细胞，例如表达pLKTOK111产物的细胞进行FACS)鉴别。举例来说，如果GCC-免疫原包含作为亲和试剂的融合部分，那么此部分可允许包含GCC或其部分的融合蛋白结合于基质，例如涂布蛋白质G、涂布抗生蛋白链菌素、经谷胱甘肽衍生化或涂布抗体的微量滴定板或分析芯片，随后将其与免疫血清或来自杂交瘤或抗体表达重组细胞的条件培养基组合，且在有助于复合物形成的条件(例如在盐和pH值的生理条件)下培育混合物。培育之后，洗涤微量滴定板孔或芯片单元以移除任何未结合组分且测量抗GCC抗体的结合。
在实施例中，为进行治疗性应用，本发明的抗体为人类或人源化抗体。人类或人源化抗体的优势在于其潜在地降低或消除抗体在宿主接受者中的免疫原性，由此允许增加生物利用率且降低不利免疫反应的可能性，从而潜在地使得能够进行多次抗体投予。
经修饰抗体包括人源化、嵌合或CDR移植抗体。人类抗小鼠抗体(HAMA)反应导致产生嵌合或人源化抗体。尽管嵌合抗体具有人类恒定区和鼠类可变区，但预期将会观测到某些人类抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其在抗体的长期或多剂量利用中。所述鼠类或大鼠来源的蛋白质的存在可能导致抗体快速清除或可导致患者产生针对抗体的免疫反应。为避免利用鼠类或大鼠来源的抗体，已开发将序列引入抗体序列以使抗体更接近人类抗体序列的人源化抗体或通过在啮齿动物中引入人类抗体功能而产生的完全人类抗体，以使啮齿动物将产生具有完全人类序列的抗体。人类抗体避免了与具有鼠类、兔或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的某些问题。
人类抗体
完全人类抗体分子可使小鼠mAb或小鼠来源的mAb所固有的免疫原性和过敏反应减到最少，并由此增加所投予抗体的功效和安全性。使用完全人类抗体分子可在治疗需要重复投予抗体的慢性和复发性人类疾病(例如发炎、自体免疫性和癌症)中提供相当大的优势。另外，人类抗体分子可使用遗传工程改造的动物品系制备，其中动物的抗体基因表达被抑制且在功能上用人类抗体分子基因表达置换。
用于制备人类抗体的方法是此项技术中已知的。一种用于制备人类抗体的方法使用转基因动物(例如转基因小鼠)。这些转基因动物含有产生人类抗体的基因组的相当大的部分，例如可进行功能性重排，插入其自身基因组中的人类免疫球蛋白基因座，且在抗体产生时使动物自身的内源性抗体产生缺乏。用于制备所述转基因动物的方法是此项技术中已知的。所述转基因动物可使用XENOMOUSETM技术或通过使用“微基因座(minilocus)”法制备。用于制备XENOMICETM的方法描述于美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598号和第6,075,181号中，所述专利以引用的方式并入本文中。使用“微基因座”法制备转基因动物的方法描述于美国专利第5,545,807号、第5,545,806号和第5,625,825号中；也参见国际公开案第WO93/12227号，所述文献各自以引用的方式并入本文中。其它转基因人类抗体产生小鼠包括KIRIN TC MOUSETM转染色体小鼠、(麦德瑞斯公司(MEDAREX)，新泽西州普林斯顿(Princeton,NJ))。
使用人类抗体转基因动物技术(例如XENOMOUSETM技术)，可通过用相关抗原免疫XENOMOUSETM小鼠(艾伯吉尼斯公司，加利福尼亚州佛力蒙)来获得人类抗体。自表达抗体的小鼠回收(例如自脾组织分离)淋巴细胞(例如B细胞)。可使用标准方法将这些回收的细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系。可对这些杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴别产生对相关抗原具特异性的抗体的杂交瘤细胞系。
人类抗体转基因动物提供可富集编码具有所需特性(例如特异性和亲和力)的抗体的核酸的核酸来源。举例来说，可自已用GCC蛋白或其变体或部分免疫的人类抗体转基因小鼠分离编码抗体或抗体可变区的核酸。分离的核酸或其部分(例如编码可变区、CDR、框架区的部分)可使用任何适合方法(例如噬菌体呈现)表达，以产生富集结合GCC蛋白的抗体或抗原结合片段的抗体或抗体的抗原结合片段(例如单链抗原结合片段、双链抗原结合片段)的文库。相对于经免疫的人类抗体转基因动物中所产生的抗体谱系，所述文库可展现增强的多样性(例如经由重链可变区与轻链可变区配对产生的组合多样性)。文库可使用任何适合的分析(例如GCC蛋白结合分析)进行筛选以鉴别具有所需特性(例如特异性、亲和力)的抗体或抗原结合片段。编码具有所需特性的抗体或抗原结合片段的核酸可使用任何适合方法回收。(参见例如美国专利第5,871,907号(维特等人)和美国专利第6,057,098号(布奇勒(Buechler)等人)。)
或者，抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。更具体说来，可自产生抗体的细胞克隆编码特定抗体的序列，且用于转化适合的哺乳动物宿主细胞。在一种优选方法中，自经免疫小鼠分离所述小鼠的脾和/或淋巴结淋巴细胞，且如先前在巴布库克(Babcook)等人,美国国家科学院院刊,93:7843-8(1996)(其以引用的方式并入本文中)中所述涂于斑块分析中。简单说来，将细胞涂于含有绵羊红细胞且用GCC抗原涂布的琼脂中，且分泌针对GCC抗原的mAb的细胞将固定补体且溶解紧邻mAb产生细胞周围的红细胞。将透明斑块内的细胞挑出以进行免疫球蛋白序列定序且亚克隆到表达载体中。随后通过ELISA且对于结合于细胞通过流式细胞术筛选含有GCC特异性mAb的经短暂转染细胞的上清液。所产生人类抗体的包含结合特定表位的CDR的可变序列或其部分可用于制备修饰的抗体。举例来说，可将所产生抗体的可变区拼接到表达盒中以便于转移构筑体、增加构筑体的表达和/或将构筑体并入能够表达全长抗体的载体中，参见例如US20060147445。在一个特定实施例中，表达盒包含IgG1同型的重链恒定区。
也可使用选择淋巴细胞抗体法(Selected Lymphocyte Antibody Method，SLAM；参见美国专利第5,627,052号，巴布库克等人,美国国家科学院院刊,93:7843-7848(1996))来鉴别可提供相关抗体的细胞。在SLAM中，直接培养B细胞，由此绕过通常仅捕捉低百分比的由小鼠最初产生的抗体的杂交瘤技术。使用基于微板的分析，可经数天的时间快速分析B细胞。通常，鉴别出数千个抗原反应性细胞克隆，代表数千个个别抗原特异性(例如GCC特异性)单克隆抗体。通常使单一实验中鉴别出的不同抗原反应性单克隆抗体的数目增加许多倍。在应用其它基于微板的快速分析测量抗体且通过亲和力和功能对抗体进行分级之后，可选择产生极高质量抗体的个别B细胞克隆。另外，通过绕过杂交瘤产生步骤，制备可快速进入重组体制造细胞系。分离使用所述技术选择的个别B细胞且可将抗体基因直接引入制造细胞系中。所得细胞系可随后经与杂交瘤细胞系产生所需基本上相同的时间进行发展以用于临床试验测试。
人类mAb 5F9(IgG2，κ)可由杂交瘤5F9产生，杂交瘤5F9又称杂交瘤46.5F9.8.2，其在2007年1月10日以千年制药公司(Millennium Pharmaceuticals Inc.)(美国马萨诸塞州剑桥市兰斯唐大街40号，02139(40Landsdowne Street,Cambridge,MA,02139,USA))的名义以寄存编号PTA-8132寄存于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，20110(10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110,U.S.A.))。(所述寄存是根据国际承认用于专利程序目的的微生物寄存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of theDeposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)进行且满足所述条约。)本发明涉及杂交瘤5F9、其产生的抗体、其抗原结合片段以及编码所述抗体和其部分(例如重链、重链可变区、轻链、轻链可变区、CDR)的核酸。如本文所述，杂交瘤5F9产生IgG2κ抗体。
抗体的人源化和呈现技术以及修饰
如上所述，宜制备具有降低的免疫原性的抗体。此可结合使用适当文库的人源化和呈现技术来完成。应了解，鼠类抗体或来自其它物种的抗体可使用此项技术中已知的技术进行人源化或灵长类化(primatized)。参见例如维特和哈里斯(Harris),今日免疫学(Immunol Today)14:43-46(1993)，以及怀特(Wright)等人,免疫学评论综述(Crit.Reviews in Immunol.)12125-168(1992)。相关抗体可通过重组DNA技术进行工程改造以用相应人类序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92/02190以及美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号)。另外，使用Ig cDNA来构建嵌合免疫球蛋白基因是此项技术中已知的(刘(Liu)等人,美国国家科学院院刊,84:3439(1987)，和免疫学杂志(J.Immunol.)139:3521(1987))。自杂交瘤或产生抗体的其它细胞分离mRNA且用于产生cDNA：相关cDNA可通过聚合酶链反应使用特定引物进行扩增(美国专利第4,683,195号和第4,683,202号)。
或者，可使用噬菌体呈现技术(参见例如麦卡夫提(McCafferty)等人,自然,348:552-553(1990))，由例如来自未免疫供体的谱系的免疫球蛋白可变(V)结构域基因在体外制备人类抗体和抗体片段。根据此技术，使抗体V结构域基因同框克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，且以功能性抗体片段形式呈现于噬菌体粒子的表面上。由于丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，故基于抗体的功能特性进行的选择也使得可选择编码展现所述特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以多种格式进行噬菌体呈现；关于其评述参见例如琼森(Johnson)和克利斯维尔(Chiswell),结构生物学新观点(Current Opinion in Structural Biology),3:564-571(1993)。V基因区段的若干来源可用于噬菌体呈现。克拉克森(Clackson)等人,自然,352:624-628(1991)自来源于经免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库分离出不同抗噁唑酮抗体阵列。可构建未免疫人类供体的V基因的谱系，且可基本上按照马克斯(Marks)等人,分子生物学杂志(J.MoI.Biol.),222:581-597(1991)或格里夫斯(Griffith)等人,欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.),12:725-734(1993)所述的技术分离针对不同抗原(包括自体抗原)阵列的抗体。也参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。呈现文库可含有包含人工氨基酸序列的抗体或抗体的抗原结合片段。举例来说，文库可含有Fab片段，其含有人工CDR(例如随机氨基酸序列)和人类框架区。(参见例如美国专利第6,300,064号(克纳皮克(Knappik)等人)。)
人类抗体也可由体外活化的B细胞产生(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。
人类恒定区基因的序列可见于卡贝特等人,(1991)免疫相关蛋白质序列,N.I.H.出版号91-3242中。人类C区基因易于自已知克隆获得。同型的选择受所需效应功能影响，例如补体固定，或在抗体依赖性细胞毒性中的活性。同型可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定实施例中，本发明的抗体分子为IgG1和IgG2。可使用任一人类轻链恒定区κ或λ。嵌合、人源化抗体随后通过常规方法进行表达。
在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可对表达GCC的细胞(例如肿瘤细胞)引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具有IgG1和IgG3同型的抗体因其能够结合Fc受体而适用于引发抗体依赖性细胞毒性能力中的效应功能。具有IgG2和IgG4同型的抗体因其结合Fc受体的能力弱而适用于使ADCC反应减到最小。在相关实施例中，可例如通过在经修饰真核细胞系中生长来在抗体的Fc区中进行取代或改变抗体的糖基化组成以增强Fc受体识别、结合和/或介导抗GCC抗体所结合的细胞的细胞毒性的能力(参见例如美国专利第7,317,091号、第5,624,821号和公开案，包括WO 00/42072，谢尔德(Shields)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276:6591-6604(2001)；拉泽(Lazar)等人,美国国家科学院院刊,103:4005-4010(2006)；佐藤(Satoh)等人,生物疗法专家评论(Expert Opin Biol.Ther.)6:1161-1173(2006))。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段(例如人类来源的抗体、人类抗体)可包括改变或调整功能(例如效应功能)的氨基酸取代或置换。举例来说，人类来源的恒定区(例如γ1恒定区、γ2恒定区)可设计成减少补体活化和/或Fc受体结合。(参见例如美国专利第5,648,260号(维特等人)、第5,624,821号(维特等人)和第5,834,597号(卓(Tso)等人)，其全部教示内容以引用的方式并入本文中。)优选地，含有所述氨基酸取代或置换的人类来源恒定区的氨基酸序列在全长范围内与未改变的人类来源恒定区的氨基酸序列至少约95％一致，更优选在全长范围内与未改变的人类来源恒定区的氨基酸序列至少约99％一致。
在另一个实施例中，效应功能也可通过调节抗体的糖基化模式来改变。改变意谓缺失抗体中所发现的一个或一个以上碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或一个以上糖基化位点。举例来说，美国专利申请公开案第2003/0157108号(普雷斯塔(Presta))中描述具有增强的ADCC活性的抗体，其具有缺乏连接到抗体Fc区的海藻糖的成熟碳水化合物结构。也参见美国专利申请公开案第2004/0093621号(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。格莱科菲公司(Glycofi)也已开发出能够产生特定糖型的抗体的酵母细胞系。
或者或另外，可制备糖基化类型已改变的抗体，例如海藻糖基残基量减少的低海藻糖基化抗体或对分GlcNac结构增加的抗体。已证明所述改变的糖基化模式将增加抗体的ADCC能力。所述碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机构改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机构改变的细胞已描述于此项技术中且可用作经工程改造以表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例来说，杭(Hang)等人的EP 1,176,195描述具有功能被破坏的FUT8基因(其编码海藻糖基转移酶)的细胞系，以致在所述细胞系中表达的抗体展现低海藻糖基化。普雷斯塔的PCT公开案WO03/035835描述一种变体型CHO细胞系Lec13细胞，其使海藻糖连接到Asn(297)-连接型碳水化合物的能力降低，也使得在所述宿主细胞中表达的抗体具有低海藻糖基化(也参见谢尔德R.L.等人,2002生物化学杂志,277:26733-26740)。乌玛纳(Umana)等人的PCT公开案WO 99/54342描述如下细胞系，其经工程改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))，以致在所述工程改造的细胞系中表达的抗体展现对分GlcNac结构增加，此使得所述抗体的ADCC活性增加(也参见乌玛纳等人,1999,自然生物技术(Nat.Biotech.)17:176-180)。
人源化抗体也可使用CDR移植法制备。产生所述人源化抗体的技术是此项技术中已知的。一般说来，人源化抗体是通过获得编码结合于GCC的抗体的可变重链和可变轻链序列的核酸序列，鉴别所述可变重链和可变轻链序列中的互补决定区或“CDR”并将CDR核酸序列移植到人类框架核酸序列上来制备。(参见例如美国专利第4,816,567号和第5,225,539号)。可确定CDR和框架残基的位置(参见卡贝特E.A.等人(1991)免疫相关蛋白质序列,第5版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版号91-3242；和查塞C.等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987))。本文所述的抗GCC抗体分子具有表5和表6中所列的CDR氨基酸序列和编码CDR的核酸序列。在一些实施例中，表5和表6的序列可并入识别GCC的分子中以用于本文所述的治疗或诊断方法中。所选人类框架为适于体内投药的框架，意谓其不展现免疫原性。举例来说，所述确定可利用关于所述抗体的体内用法和氨基酸类似性研究的先前经验来进行。适合框架区可选自如下人类来源的抗体，其在框架区的长度范围内与供体抗体(例如抗GCC抗体分子，例如3G1)的等效部分(例如框架区)的氨基酸序列具有至少约65％氨基酸序列一致性，且优选至少约70％、80％、90％或95％氨基酸序列一致性。氨基酸序列一致性可使用适合的氨基酸序列比对演算法(例如CLUSTAL W)使用预设参数来测定。(汤普森J.D.(Thompson J.D.)等人,核酸研究(Nucleic Acids Res.)22:4673-4680(1994)。)
一旦鉴别出待人源化的克隆抗体的CDR和FR，就鉴别编码CDR的氨基酸序列且将相应核酸序列移植到所选人类FR上。此可使用已知引物和连接子进行，所述引物和连接子的选择是此项技术中已知的。特定人类抗体的全部CDR可用非人类CDR的至少一部分置换，或仅一些CDR可用非人类CDR置换。仅需要置换人源化抗体结合于预定抗原所需数目的CDR。在CDR移植到所选人类FR上之后，表达所得“人源化”可变重链和可变轻链序列以产生结合于GCC的人源化Fv或人源化抗体。优选地，CDR移植(例如人源化)抗体以与供体抗体类似、实质上相同或比其更佳的亲和力结合GCC蛋白。通常，人源化可变重链和轻链序列与人类恒定域序列表达成融合蛋白形式，从而获得结合于GCC的完整抗体。然而，可产生不含恒定序列的人源化Fv抗体。
特定氨基酸已经取代、缺失或添加的人源化抗体也在本发明的范围内。详细说来，人源化抗体可在框架区中具有氨基酸取代，例如以便改良与抗原的结合。举例来说，人源化免疫球蛋白链的所选少数受体框架残基可经相应供体氨基酸置换。取代位置包括与CDR相邻或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如美国专利第5,585,089号或第5,859,205号)。受体框架可为成熟人类抗体框架序列或共同序列。如本文所用的术语“共同序列”是指在相关家族成员中的区域的序列中的各位置最常发现或根据各位置的最常见残基设计的序列。可获得多个人类抗体共同序列，包括人类可变区的不同子群的共同序列(参见卡贝特E.A.等人,免疫相关蛋白质序列,第5版,美国卫生与公众服务部,美国政府印刷局(U.S.Government Printing Office)(1991))。可线上自由获得卡贝特数据库和其应用，例如经由马里兰州贝赛思达市的美国国立生物技术信息中心的IgBLAST(也参见琼森G.和吴T.T.(Wu,T.T.),核酸研究,29:205-206(2001))。
用于使抗体人源化的其它技术描述于1992年12月23日公开的帕德兰等人,EP519596A1中。
抗GCC抗体分子包括也可通过PCT公开案第WO 98/52976号和WO 00/34317(其内容以引用的方式并入本文中)中所揭示的方法特定缺失人类T细胞表位或进行“脱免疫化”而修饰的其它人源化抗体。简单说来，可分析抗GCC抗体的鼠类重链和轻链可变区中结合于II类MHC的肽；这些肽代表潜在T细胞表位。为检测潜在T细胞表位，可应用称作“肽穿线(peptide threading)”的计算机模型化法，且另外可在人类II类MHC结合肽的数据库中搜索鼠类VH和VL序列中存在的基元，如PCT公开案第WO98/52976号和第WO 00/34317号中所述。这些基元结合于18种主要II类MHC DR异型中的任一者，并由此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可通过取代可变区中的少数氨基酸残基或优选通过单一氨基酸取代来消除。尽可能进行保守性取代，通常但非排他地，可使用在人类生殖系抗体序列中此位置常见的氨基酸。人类生殖系序列揭示于汤姆林森I.A.(Tomlinson,I.A.)等人,分子生物学杂志,227:776-798(1992)；库克G.P.(Cook,G.P.)等人,今日免疫学,第16卷(5):237-242(1995)；查塞D.等人,分子生物学杂志,227:799-817(1992)中。V BASE目录提供了人类免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(汤姆林森I.A.等人汇编,医学研究理事会蛋白质工程中心(MRC Centre for Protein Engineering)，英国剑桥(Cambridge,UK))。在通过对鼠类VH和VL基因进行诱变来构建抗GCC抗体的脱免疫化VH和VL之后，可任选使经诱变的可变序列与人类恒定区(例如人类IgG1或κ恒定区)融合。
在其它实施例中，减少CDR移植抗体的免疫原性反应可通过改变(例如缺失、取代)CDR中的氨基酸残基来实现(克什米尔(Kashmiri)等人,方法(Methods)36:25-34(2005)；美国专利第6,818,749号；谭(Tan)等人,免疫学杂志(J.Immunol.)169:1119-1125(2006))。举例来说，优选不改变接触抗原所涉及的位置的残基。通常，所述残基(SDR)处于在抗体间呈现高度可变性的位置中。举例来说，通过克鲁斯塔(Clustal)法(海金斯D.G.(HigginsD.G.)等人,酶学方法(Meth.Enzymol.)266:383-402(1996))自抗GCC抗体分子(例如本文所述的抗体)获得的共同序列(例如SEQ ID NO:302-307，表5)可帮助鉴别SDR。在本文所述的人类抗GCC抗体分子中，SDR为以下：重链CDR1的至少第一个残基或在一些实施例中前4个残基；重链CDR2的至少N末端部分，例如前7个、10个或13个残基；重链CDR3的几乎全部；轻链CDR1的C末端部分，例如残基6、8或9后的部分；轻链CDR2的大致第一残基、中间的残基和/或最后一个残基；和轻链CDR3的大部分，或至少残基2或3后的部分。因此，为使抗GCC抗体分子在进行人源化或修饰之后维持与GCC蛋白的结合，抗GCC抗体分子的CDR中的所述SDR残基相较于CDR的其它残基或框架区中的残基不太适合例如自鼠类残基变为人类共同残基。相反，宜将非人类(例如鼠类)CDR中的残基变为鉴别为人类CDR(例如本文所述的抗GCC抗体分子的CDR，例如表5中所列的序列)的共同残基的残基。举例来说，丝氨酸可代表重链CDR1C末端的人类残基，和/或酪氨酸可代表重链CDR1的第二和/或第三残基的人类残基；重链CDR2可以S-(L/V)-K-(S/G)(SEQ ID NO:312)为末端以代表人类CDR；为代表人类CDR3，在重链CDR3中的4到6个残基和/或天冬氨酸6到9个残基之后可存在甘氨酸；轻链CDR1可由(K/R)-(A/S)-SQS-(V/L)-(S/L)(SEQ ID NO:313)开始以代表人类CDR；轻链CDR2可在第三残基中具有丝氨酸和/或在第五残基中具有精氨酸以代表人类CDR；和/或轻链CDR3可在第二残基中具有谷氨酰胺和/或在第三残基中具有酪氨酸或丝氨酸以代表人类CDR。
呈不完整抗体形式的抗GCC抗体也适用于本发明。所述抗体可来源于上述任何抗体。此类型的适用抗体分子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(沃德(Ward)等人,自然,341:544-546(1989))；(vii)由VHH结构域组成的单结构域功能性重链抗体(称作纳米抗体)，参见例如科提兹-雷塔莫佐(Cortez-Retamozo)等人,癌症研究(Cancer Res.)64:2853-2857(2004)和其中所引用的参考文献；和(vii)分离的CDR，例如一个或一个以上分离的CDR连同足够框架一起提供抗原结合片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独基因编码，但其可使用重组方法通过合成连接子接合，所述合成连接子使其能够制成VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链(称作单链Fv(scFv)；参见例如博德等人,科学,242:423-426(1988)；和休斯顿等人,美国国家科学院院刊,85:5879-5883(1988))。所述单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用所属领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式针对效用对所述片段进行筛选。例如Fv、F(ab')2和Fab等抗体片段可通过对完整蛋白质进行裂解(例如，通过蛋白酶或化学裂解)来制备。
在实施例中，重链和轻链中一者或两者的CDR序列中的一些或全部可用于另一抗体分子中，例如CDR移植、人源化或嵌合抗体分子中。
实施例包括包含足够CDR(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的全部六个CDR)以允许结合于细胞表面GCC的抗体分子。
在一个实施例中，将CDR(例如全部HCDR或全部LCDR或所有六个CDR)嵌入人类框架区或人类来源的框架区中。人类框架区的实例包括人类生殖系框架序列、已进行亲和力成熟(体内或体外)的人类生殖系序列，或合成的人类序列，例如共同序列。在一个实施例中，重链框架为IgG1或IgG2框架。在一个实施例中，轻链框架为κ框架。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子(例如CDR移植或人源化抗体分子)包含足够CDR(例如本文所述抗体中一者的全部六个CDR，例如表5中所列的序列)以允许结合于GCC。(可编码表5中所列的CDR氨基酸序列的示范性核酸序列提供于本文的表6中)。在特定实施例中，抗GCC抗体分子可包含来自5F9或Abx-229的CDR。
用于体内治疗或诊断用途的抗体片段可获益于改良其血清半衰期的修饰。旨在增加抗体的体内血清半衰期的适合有机部分可包括选自以下的一个、两个或两个以上线性或分支部分：亲水性聚合基团例如线性或分支聚合物(例如聚烷二醇，例如聚乙二醇、单甲氧基-聚乙二醇等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物和聚乙烯吡咯烷酮)、脂肪酸基团(例如单羧酸或二羧酸)、脂肪酸酯基、脂质基团(例如二酰基甘油基、鞘脂基(例如神经酰胺基))或磷脂基(例如磷脂酰乙醇胺基)。优选地，有机部分结合于使有机部分相较于非偶联抗体部分不会削弱所得免疫偶联物的功能(例如降低抗原结合亲和力)的预定位点。有机部分的分子量可为约500Da到约50,000Da，优选为约2000、5000、10,000或20,000Da。用有机部分修饰多肽(例如抗体)的实例和方法可见于例如美国专利第4,179,337号和第5,612,460号、PCT公开案第WO 95/06058号和第WO 00/26256号以及美国专利申请公开案第20030026805号中。
抗GCC抗体分子可包含上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的重链和轻链中一者或两者的可变区的全部或抗原结合片段。
在一个实施例中，(a)的轻链氨基酸序列与(a)(i-ii)中所提到的参考氨基酸序列中一者可存在多达1、2、3、4、5、10或15个残基差异。在实施例中，所述差异为保守性取代。在实施例中，差异是在框架区中。在一个实施例中，(b)的重链氨基酸序列与(b)(i-ii)中所提到的参考氨基酸序列中一者可存在多达1、2、3、4、5、10或15个残基差异。在实施例中，所述差异为保守性取代。在实施例中，差异是在框架区中。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者：
(a)具有(i)表3的轻链可变区氨基酸序列(例如SEQ ID NO:20)或(ii)由表4的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸(SEQ ID NO:19)的全部或抗原结合片段的轻链氨基酸序列；和
(b)具有(i)表3的重链可变区氨基酸序列(例如SEQ ID NO:18)或(ii)由表4的核苷酸序列编码的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:17)的全部或抗原结合片段的重链氨基酸序列。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者：
a)与本发明的抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的轻链可变区具有至少85、90、95、97或99％同源性的轻链可变区，或其抗原结合片段；和
(b)与本发明的抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的重链可变区具有至少85、90、95、97或99％同源性的重链可变区，或其抗原结合片段。
人类杂交瘤、所选淋巴细胞和鼠类抗体的可变区的氨基酸序列可见于表3中。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子为5F9抗体分子且包括以下中的一者或两者：a)来自SEQ ID NO:231的重链恒定区的全部或片段；和b)来自SEQ ID NO:233的轻链恒定区的全部或片段。
在另一个实施例中，抗GCC抗体分子为Abx-229抗体分子且包括以下中的一者或两者：a)来自SEQ ID NO:46的重链可变区的全部或GCC结合片段；和b)来自SEQ ID NO:48的轻链可变区的全部或GCC结合片段。
在一种方法中，可使用编码重链和轻链J区的共同序列来设计用作引物的寡核苷酸以将适用的限制性位点引入J区中，以便随后将V区区段连接到人类C区区段。可通过定点诱变来修饰C区cDNA以将限制性位点放于人类序列中的类似位置。
表达载体包括质粒、反转录病毒、粘质粒(cosmid)、YAC、EBV来源的游离基因体等。适宜载体为编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经工程改造的适当限制性位点以便能容易地插入和表达任何VH或VL序列。在所述载体中，拼接通常在插入的J区中的拼接供体位点与在人类C区前的拼接受体位点之间进行，且也在人类CH外显子内存在的拼接区进行。适合表达载体可含有多个组分，例如复制起点、可选择标记基因、一个或一个以上表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、强化子、终止子))和/或一个或一个以上翻译信号、信号序列或前导序列等。聚腺苷酸化和转录终止在编码区下游的原生染色体位点处进行。所得嵌合抗体可接合到任何强启动子。可使用的适合载体的实例包括适用于哺乳动物宿主和基于病毒复制系统的载体，例如猿猴病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)、腺病毒2、牛乳突状瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK突变体(BKV)或小鼠和人类巨细胞病毒(CMV)和莫洛尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemiavirus，MMLV)、原生Ig启动子等。多种适合载体是此项技术中已知的，包括维持于单一拷贝或多个拷贝中或例如经由LTR或经由经工程改造成具有多个整合位点的人工染色体而整合到宿主细胞染色体中的载体(林登贝姆(Lindenbaum)等人,核酸研究,32:e172(2004)；克纳德(Kennard)等人,生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)(在线),2009年5月20日)。适合载体的其它实例列于以下章节中。
因此，本发明提供一种表达载体，其包含编码结合GCC蛋白的抗体、抗体的抗原结合片段(例如人类、人源化、嵌合抗体或前述任一者的抗原结合片段)、抗体链(例如重链、轻链)或抗体链的抗原结合部分的核酸。
在真核宿主细胞中表达是适用的，因为这些细胞相较于原核细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。然而，所产生的因不适当折叠而无活性的任何抗体可根据已知方法(吉姆(Kim)和博得韦(Baldwin),“小蛋白质折叠反应中的特定中间物以及蛋白质折叠机制(Specific Intermediates in the Folding Reactions of SmallProteins and the Mechanism of Protein Folding)”,生物化学年评(Ann.Rev.Biochem.)51,第459-89页(1982))复性。宿主细胞有可能产生完整抗体的部分，例如轻链二聚体或重链二聚体，其也为本发明的抗体同源物。
另外，如本文别处所述，人类抗体或来自其它物种的抗体可经由呈现型技术(包括(但不限于)噬菌体呈现、反转录病毒呈现、核糖体呈现和其它技术)使用此项技术中众所周知的技术来产生，且可使所得分子再经历成熟(例如亲和力成熟)，所述技术是此项技术中已知的。维特和哈里斯,今日免疫学,14:43-46(1993)；和怀特等人,免疫学评论综述,12125-168(1992)；汉斯(Hanes)和普鲁索(Plucthau),美国国家科学院院刊(PNAS USA)94:4937-4942(1997)(核糖体呈现)；帕姆雷(Parmley)和史密斯(Smith),基因(Gene)73:305-318(1988)(噬菌体呈现)；斯科特(Scott),生物化学趋势(TIBS)17:241-245(1992)；卡维拉(Cwirla)等人,美国国家科学院院刊,87:6378-6382(1990)；鲁塞尔(Russel)等人,核酸研究,21:1081-1085(1993)；霍根布姆(Hoganboom)等人,免疫学评论(Immunol.Reviews)130:43-68(1992)；克利斯维尔和麦卡夫提,生物技术趋势(TIBTECH)10:80-84(1992)；和美国专利第5,733,743号。如果利用呈现技术来制备非人类抗体，那么所述抗体可如上所述进行人源化。
应了解，所产生的抗体最初无需具有特定所需同型，而是相反，所产生的抗体可具有任何同型。举例来说，由5F9杂交瘤(ATCC寄存编号PTA-8132)产生的抗体具有IgG2同型。所述抗体的同型可在之后使用此项技术中已知的常规技术转变为例如IgG1或IgG3以在抗体结合细胞上的GCC时引发ADCC反应。所述技术包括使用定向重组技术(参见例如美国专利第4,816,397号)、细胞与细胞融合技术(参见例如美国专利第5,916,771号)和其它技术。在细胞与细胞融合技术中，制备具有具任何所需同型的重链的骨髓瘤或其它细胞系，并制备具有轻链的另一骨髓瘤或另一细胞系。之后，所述细胞可进行融合且可分离表达完整抗体的细胞系。
在某些实施例中，GCC抗体分子为人类抗GCC IgG1抗体。因为所述抗体具有所需的与GCC分子的结合性，所以所述抗体中任一者都容易发生同型转变，以产生例如人类IgG4同型，同时仍具有相同可变区(其在某种程度上确定抗体的特异性和亲和力)。因此，由于所产生的抗体候选物满足上述所需“结构”特征，故其一般可经由同型转变而具有至少某些所需的其它“功能”特性。
在一个实施例中，可使可变区或其抗原结合片段与除与其一起产生的恒定区以外的恒定区(或其片段)，例如与来自另一抗体的恒定区(或其片段)或与合成恒定区(或其片段)偶合。在实施例中，恒定区为IgG1或IgG2恒定区(或其片段)。可在可变区或恒定区中进行序列改变，以改良抗体分子的效应活性。
其它治疗剂的设计和产生
本文中针对GCC产生和表征的抗体有助于设计其它治疗形式，包括其它抗体、其它拮抗剂或除抗体以外的化学部分。所述形式包括(但不限于)具有类似结合活性或功能的抗体、先进的抗体治疗剂(例如双特异性抗体、免疫偶联物和放射性标记的治疗剂)、产生肽治疗剂(尤其细胞内抗体)和小分子。此外，如上所述，本发明抗体的效应功能可通过同型转变成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE或IgM而发生改变，以用于各种治疗用途。
对于双特异性抗体，可产生包含以下的双特异性抗体：(i)偶联在一起的两个抗体，一者对GCC具特异性且另一者对第二分子具特异性；(ii)具有一条对GCC具特异性的链和对第二分子具特异性的第二链的单一抗体；或(iii)对GCC和另一分子具特异性的单链抗体。所述双特异性抗体可使用已知技术产生。举例来说，可通过使两个或两个以上抗体(相同类型或不同类型)交联来制备双特异性抗体。合适交联剂包括具有由适当间隔子隔开的两个不同反应性基团的杂双官能交联剂(例如间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯)；或同双官能交联剂(例如辛二酸二丁二酰亚胺酯)。所述连接子可自伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company,Rockford,IL)获得。也参见例如凡格(Fanger)等人,免疫学方法(Immunomethods)4:72-81(1994)；以及维特和哈里斯,今日免疫学,14:43-46(1993)；和怀特等人,免疫学评论综述,12125-168(1992)，且对于(iii)参见例如特劳内克(Traunecker)等人,国际癌症杂志(Int.J.Cancer)(增刊)7:51-52(1992)。松斯维拉(Songsivilai)和拉奇曼(Lachmann),临床和实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)79:315-321(1990)；科斯特尼(Kostelny)等人,免疫学杂志(J.Immunol.)148:1547-1553(1992)。
此外，也可制备“κ型抗体(Kappa body)”(伊尔(Ill.)等人,“具有重链和轻链可变区特性的杂交免疫球蛋白结构域的设计和构建(Design and construction of a hybridimmunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variableregions)”,蛋白质工程(Protein Eng)10:949-57(1997))、“微型抗体”(马丁(Martin)等人,欧洲分子生物学学会杂志,13:5303-9(1994)，美国专利第5,837,821号)、“双功能抗体”(Holliger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448(1993))或“两面蛋白”(特劳内克等人,欧洲分子生物学学会杂志,10:3655-3659(1991)，和特劳内克等人,国际癌症杂志,增刊,7:51-52(1992))。
核酸和多肽
在另一个实施例中，本发明涉及编码或代表本文所述的抗体分子的聚核苷酸和多肽序列。所述聚核苷酸编码重链和轻链各自的可变区与恒定区，但根据本文所述的组合物，本发明也涵盖其它组合。本发明也涵盖来源于所揭示的聚核苷酸的寡核苷酸片段和与这些聚核苷酸互补的核酸序列。
聚核苷酸可呈RNA或DNA的形式。DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA形式的聚核苷酸在本发明的范围内。DNA可为双链或单链DNA，且如果为单链DNA，那么可为编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可与本文所提供的编码序列一致，或可为不同编码序列，所述编码序列由于遗传密码子的冗余或简并性而与本文所提供的DNA编码相同多肽。
在所提供的实施例中，聚核苷酸编码本发明的至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，例如，如表4中所概述。
本发明也包括含有修饰(例如聚核苷酸缺失、取代或添加)的变体聚核苷酸和由所述变体聚核苷酸序列引起的任何多肽修饰。本发明的聚核苷酸也可具有作为本文所提供的编码序列的变体的编码序列。举例来说，变体聚核苷酸可与表4中所列的聚核苷酸具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％一致性。在实施例中，变体聚核苷酸编码抗GCC抗体分子。
本发明进一步涉及代表本发明的抗体的多肽以及所述多肽的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽可为重组多肽、天然产生的多肽或合成多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可为如下片段、衍生物或类似物：其中一个或一个以上氨基酸残基经保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，且所述取代的氨基酸残基可能为或可能不为由遗传密码子编码的氨基酸残基；或其可为如下片段、衍生物或类似物：其中一个或一个以上氨基酸残基包括取代基；或其可为如下片段、衍生物或类似物：其中所述多肽与另一化合物(例如增加多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或其可为如下片段、衍生物或类似物：其中其它氨基酸融合于所述多肽，例如前导序列或分泌序列或用于纯化多肽的序列或原蛋白序列。所述片段、衍生物和类似物在本发明的范围内。在各种方面中，本发明的多肽可为部分纯化或纯化的产物。
本发明的多肽可具有与本文所述的抗体(例如表2或表3中所概述者)一致或因一个或一个以上氨基酸取代所致少量变化而不同的氨基酸序列。所述变化可为通常在约1到5个氨基酸范围内的“保守性改变”，其中取代的氨基酸具有类似结构或化学特性，例如用异亮氨酸置换亮氨酸或用丝氨酸置换苏氨酸；用精氨酸或组氨酸置换赖氨酸。相反，变化可包括非保守性改变，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似的少量变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者。可使用此项技术中已知的计算机程序，例如DNASTAR软件(丹斯塔公司(DNASTAR,Inc.)，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))发现用于确定何种和多少种氨基酸残基可经取代、插入或缺失而不会改变生物或免疫活性的规则。
在另一个方面中，本发明的特征在于编码抗GCC抗体分子的经分离和/或重组核酸。在实施例中，核酸编码以下中的一者或一者以上：本文所述的抗体分子、抗体分子的重链、轻链、轻链可变区、重链可变区、重链和轻链的部分(例如当与全长重链可变区配对时结合抗原的轻链可变区片段，或当与全长轻链可变区配对时结合抗原的重链可变区片段)，和CDR。实施例包括安置于载体(例如表达载体)中的所述核酸。在特定实施例中，本发明包括质粒pTOK58D-5F9LC和pTOK58D-5F9HC。此外，本发明涵盖由宿主细胞(例如表达由质粒pTOK58D-5F9LC和pTOK58D-5F9HC编码的抗体分子的宿主细胞)产生的抗体分子。
在一个实施例中，提供一种载体，例如表达载体，其包含以下中的一者或两者：
编码轻链可变区(例如表4中所列的序列)、其抗原结合片段，或本文例如在表6中所述的轻链的一个、两个或三个CDR(和任选存在的框架区)的序列；和
编码重链可变区(例如表4中所列的序列)、其抗原结合片段，或本文例如在表6中所述的重链的一个、两个或三个CDR(和任选存在的框架区)的序列。
在所提供的实施例中，聚核苷酸编码本发明抗体的至少一个重链可变区或至少一个轻链可变区。在所提供的实施例中，多肽可编码本发明抗体的至少一个重链可变区和一个轻链可变区。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者：
(a)由在所选严格度条件下与以下杂交的核酸编码的轻链可变区或其抗原结合片段：(i)本文例如在表4中所述的编码抗GCC抗体分子的核酸序列的互补序列，或(ii)编码表1和表2中所概述的本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的轻链的任何核酸序列；和
(b)由在所选严格度条件下与以下杂交的核酸编码的重链可变区或其抗原结合片段：(i)本文例如在表4中所述的编码抗GCC抗体分子的核酸序列的互补序列，或(ii)编码表1和表2中所概述的本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的重链的任何核酸序列。
在一个实施例中，所选严格度条件为高严格度或极高严格度条件，例如，如本文所述的条件。
在其它方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC寄存编号PTA-8132的DNA编码的抗体的轻链可变区氨基酸序列的氨基酸序列。在其它方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC寄存编号PTA-8132的DNA编码的抗体的重链可变区序列的氨基酸序列。
本发明也提供包括本发明的聚核苷酸的载体、用本发明的载体遗传工程改造的宿主细胞和通过重组技术制备本发明的抗体。
适当DNA序列可通过多种程序插入载体中。一般说来，DNA序列是通过此项技术中已知的程序插入适当的限制性核酸内切酶位点中。表达载体中的聚核苷酸序列可操作地连接到适当表达控制序列(即启动子)以引导mRNA合成。所述启动子的实例包括(但不限于)劳斯肉瘤病毒LTR或者早期或晚期SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子和已知控制原核(例如大肠杆菌的tac、T3、T7启动子)或真核(例如巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子、EF-1a启动子)细胞或其病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可包括适用于扩增表达的序列。举例来说，载体可含有强化子，其为病毒来源的刺激转录的DNA序列(例如来源于猿猴病毒(例如SV40)、多瘤病毒、巨细胞病毒、牛乳突状瘤病毒或莫洛尼肉瘤病毒(Moloney sarcomavirus)的DNA序列)或基因组来源的刺激转录的DNA序列。载体优选还含有复制起点。载体可构建成含有外源复制起点，或所述复制起点可来源于SV40或另一病毒来源，或通过宿主细胞染色体复制机制获得。
此外，载体任选含有用于选择经转染宿主细胞的标记基因，例如允许在多种宿主中用甲氨蝶呤(methotrexate)进行选择的二氢叶酸还原酶标记基因；或抗生素标记基因，例如β-内酰胺酶基因(安比西林(ampicillin)抗性)、Tet基因(四环素(tetracycline)抗性)(用于原核细胞中)，或新霉素(neomycin)、GA418(遗传霉素(geneticin)，一种新霉素衍生物)、gpt(霉酚酸)、安比西林或潮霉素(hygromycin)抗性基因；或补充宿主细胞的遗传损伤(例如无胸苷激酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、二氢叶酸还原酶等)的基因。通常使用编码宿主的营养缺陷标记物的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)作为酵母中的可选择标记物。
为获得本发明的抗体，应将编码本发明抗体的轻链和重链可变区以及轻链和重链恒定区的一个或一个以上聚核苷酸序列并入载体中。可将编码本发明抗体的轻链和重链的聚核苷酸序列并入一个或多个载体中，随后并入宿主细胞中。
用于在哺乳动物细胞中表达的适合表达载体包括例如pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1(英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1(斯塔杰公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla,CA))、pCDEF3(古德曼(Goldman,L.A.)等人,生物技术(Biotechniques),21:1013-1015(1996))、pSVSPORT(英杰生命技术公司吉博分公司(GIBCO division,Invitrogen Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、pEF-Bos(水岛S.(Mizushima,S.)等人,核酸研究,18:5322(1990))、双顺反子反转录病毒载体(盖拉生物技术公司(Gala Biotech)，威斯康星州米德尔顿(Middleton,WI))等。也可利用适用于各种表达宿主中的表达载体，所述宿主例如原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇施耐德S2细胞(Drosophila Schnieder S2cell)，Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))。示范性载体为pLKTOK58(野生型IgG1Fc序列)和pLKTOK59(突变型IgG1Fc序列)(参见美国专利申请公开案第20060147445号)。
应了解，本发明的抗体可在除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可用于适合哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。转化可如下进行：通过用于将聚核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法，包括例如将聚核苷酸包装于病毒中(或病毒载体中)并用所述病毒(或载体)转导宿主细胞；或通过此项技术中已知的用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的转染程序，例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核苷酸囊封于脂质体中和直接显微注射DNA分子。所用转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是此项技术中已知的，且包括(但不限于)：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、将聚核苷酸囊封于脂质体中、肽偶联物、树枝状聚合物和将DNA直接显微注射到细胞核中。
在另一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述核酸的宿主细胞。在实施例中，所述细胞表达本文所述的抗体分子或其组分。另一个实施例提供一种制备抗体分子(例如本文所述的抗GCC抗体分子，例如人类或人源化抗体分子)的方法，其包含将宿主细胞维持于适于表达的条件下，借此表达免疫球蛋白链且产生抗体分子。另一个实施例提供一种宿主细胞，其包含编码重链和轻链抗体序列的任何前述表达载体。宿主细胞可为真核细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；或原核细胞，例如大肠杆菌。举例来说，哺乳动物细胞可为培养的细胞或细胞系。示范性哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如NS0)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞。在一个特定实施例中，培养的宿主细胞为包含编码5F9抗体分子的核酸序列的COS细胞。在另一个实施例中，宿主细胞为杂交瘤5F9(PTA-8132)。另外，细胞包括卵母细胞，和来自转基因动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。举例来说，编码本文所述的抗体分子的核酸可在转基因非人类动物中表达。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是此项技术中已知的且包括可自美国菌种保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、海拉细胞(HeLa cell)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其它细胞系。非哺乳动物细胞，包括(但不限于)细菌、酵母、昆虫和植物，也可用于表达重组抗体。为防止由非人类糖基化作用引起的免疫原性、药物动力学和/或效应功能的变化，可优选对抗体CH2结构域进行定点诱变以消除糖基化作用。通过确定哪一系统产生最高表达水平且产生具有组成型GCC结合特性的抗体来选择表达方法。
另一个实施例提供一种制备抗GCC抗体分子(例如人类或人源化抗体分子)的方法，其包含将包含本文所述的核酸(例如表4或表6中所列的一个或一个以上核酸序列)的宿主细胞维持于适于表达免疫球蛋白的条件下，借此表达免疫球蛋白链且产生结合GCC的抗体分子(例如人类或人源化抗体分子)或其片段或变体。举例来说，表达抗体分子的方法包括使用宿主细胞，其中编码抗体分子(例如人类或人源化抗体)轻链的第一重组核酸分子和编码抗体分子(例如人类或人源化抗体)重链的第二重组核酸分子被包含在单一表达载体中。在其它实施例中，其处于单独载体中。必要时，所述方法可进一步包含分离或回收抗体、抗体的抗原结合片段、抗体链或抗体链的抗原结合片段的步骤。
举例来说，可使用适于所选宿主细胞的任何方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)将编码结合GCC蛋白的人类抗体的重链和轻链的核酸分子(即一个或一个以上核酸分子)，或包含所述核酸分子的表达构筑体(即一个或一个以上构筑体)引入适合宿主细胞中以产生重组宿主细胞，以致所述核酸分子可操作地连接到一个或一个以上表达控制元件(例如在载体中、在通过于细胞中的处理产生的构筑体中、整合到宿主细胞基因组中)。可将所得重组宿主细胞维持于适于表达的条件下(例如在诱导剂存在下、在适合非人类动物中、在补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的适合培养基中)，借此产生所编码的多肽。必要时，可分离或回收(例如自动物、宿主细胞、培养基、奶)编码的蛋白质。此方法涵盖在转基因非人类动物(参见例如WO 92/03918，吉恩法玛国际公司(GenPharm International))或植物的宿主细胞中进行表达。
另外，可使用多种已知技术增强生产细胞系中本发明抗体(或来源于其的其它部分)的表达。举例来说，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常用方法。可使用常规技术，例如限制性稀释克隆、微滴技术(Microdrop technology)或此项技术中已知的任何其它方法来鉴别高表达细胞克隆。GS系统完全或部分结合欧洲专利第0 216 846号、第0 256 055号和第0 323 997号以及欧洲专利申请案第89303964.4号进行了论述。
在用于重组表达本发明的经修饰抗体或其抗原结合部分的示范性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链与抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到强化子/启动子调节元件(例如来源于SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV强化子/AdMLP启动子调节元件或SV40强化子/AdMLP启动子调节元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体也带有DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链且自培养基回收完整抗体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和自培养基回收抗体。
也可以转基因方式经由产生转殖相关免疫球蛋白重链和轻链序列的基因的哺乳动物或植物且自其产生可回收形式的抗体来制备本发明的抗体。对于在哺乳动物中以转基因方式制备，可在山羊、母牛或其它哺乳动物的奶中产生且自其回收抗体。参见例如美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号和第5,741,957号。
本文所述的抗体、抗原结合片段、抗体链和其抗原结合部分也可在适合的体外表达系统中，通过化学合成或通过任何其它适合方法制备。
融合蛋白和免疫偶联物
本文所述的抗GCC抗体可通过任何适合方法(例如化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方法)功能性连接到一个或一个以上非抗体分子实体。
可制备如下融合蛋白，其中本文所述的抗GCC抗体分子和非抗体部分是单个连续多肽链的组分。非抗体部分可相对于抗体部分位于N末端、C末端或内部。举例来说，一些实施例可通过将编码免疫球蛋白序列的核酸插入适合表达载体，例如pET载体(例如pET-15b，诺瓦杰公司(Novagen))、噬菌体载体(例如pCNATAB 5E，法玛西亚公司(Pharmacia))或其它载体(例如pRIT2T蛋白质A融合载体，法玛西亚公司)中来制备。所得构筑体可经表达以产生包含非抗体部分(例如组氨酸标签、E标签或蛋白质A IgG结合结构域)的抗体链。可使用任何适合技术分离或回收融合蛋白，例如使用适合亲和基质进行色谱法(参见例如现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)(奥苏贝尔F.M(Ausubel,F.M)等人编,第2卷,增刊26,第16.4.1-16.7.8页(1991))。
本发明提供被引导到细胞中且在实施例中内在化到细胞中的抗GCC抗体分子。其能够将治疗剂或可检测试剂传递到或传递入表达GCC的细胞中，但不会传递到或传递入不表达目标的细胞中。因此，本发明也提供包含如本文所述的抗GCC抗体分子的抗GCC免疫偶联物，所述抗GCC抗体分子偶联于治疗剂或可检测试剂。在实施例中，抗GCC免疫偶联物对GCC的亲和力是未偶联抗体对GCC的亲和力的至少10、25、50、75、80、90或95％。此可使用细胞表面GCC或经分离的GCC来测定。在一个实施例中，如由本文所述的分析所测定，抗GCC抗体分子(例如免疫偶联物)的LD50小于1,000、500、250、100或50pM。
抗GCC抗体分子可利用此项技术中已知的技术进行修饰从而以免疫偶联物形式发挥作用。参见例如维特塔(Vitetta),今日免疫学,14:252(1993)。也参见美国专利第5,194,594号。放射性标记的抗体的制备也易于利用此项技术中已知的技术来制备。参见例如嘉格汉斯(Junghans)等人,癌症化学疗法与生物疗法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版,察夫纳(Chafner)和隆格(Longo)编,利平科特雷文出版公司(LippincottRaven)(1996))。也参见美国专利第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990号(美国再颁发专利第35,500号)、第5,648,471号和第5,697,902号。
在一些实施例中，抗体分子与非抗体部分借助于连接子连接。在所述实施例中，免疫偶联物由式(I)表示：
其中，
Ab为本文所述的抗GCC抗体分子；
X为连接Ab与Z的部分，例如本文所述的连接子在共价连接于Ab和Z中的一者或两者之后的残基；
Z为治疗剂或标记；且
m在约1到约15范围内。
变量m表示式(I)免疫偶联物中每个抗体分子所对应-X-Z部分的数目。在各种实施例中，m的范围为1到15、1到10、1到9、1到8、1到7、1到6、1到5、1到4、1到3或1到2。在一些实施例中，m的范围为2到10、2到9、2到8、2到7、2到6、2到5、2到4或2到3。在其它实施例中，m为1、2、3、4、5或6。在包含多种式(I)免疫偶联物的组合物中，m为每个Ab所对应-X-Z部分的平均数，又称平均药物负载率。平均药物负载率的范围可为每个Ab对应1到约15个-X-Z部分。在一些实施例中，当m表示平均药物负载率时，m为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在示范性实施例中，m为约2到约8。在一个实施例中，m为约8。在另一个实施例中，m为约4。在另一个实施例中，m为约2。
每个Ab所对应-X-Z部分的平均数可通过常规方式(例如质谱、ELISA分析和HPLC)进行表征。也可依据m测定免疫偶联物的定量分布。在一些情况下，分离、纯化和表征m为特定值的均质免疫偶联物(不同于具有其它药物负载率的免疫偶联物)可通过例如逆相HPLC或电泳等方式达成。
式(I)的免疫偶联物可以混合物形式存在，其中混合物的各组分具有不同m值。举例来说，式(I)免疫偶联物可以两种独立免疫偶联物组分的混合物形式存在：m为7的一种免疫偶联物组分和m为8的另一免疫偶联物组分。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为1、2和3。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为3、4和5。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为5、6和7。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为7、8和9。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为9、10和11。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为11、12和13。
在一个实施例中，式(I)免疫偶联物以三种独立免疫偶联物的混合物形式存在，其中所述三种独立免疫偶联物的m分别为13、14和15。
多种适合连接子(例如用于将抗体分子连接于治疗剂或标记的杂双官能试剂)和用于制备免疫偶联物的方法是此项技术中已知的。(参见例如查理(Chari)等人,癌症研究,52:127-131(1992)。)连接子可例如在生理条件下(例如在细胞内条件下)裂解，使得连接子的裂解在细胞内环境中释放药物(治疗剂或标记)。在其它实施例中，连接子不可裂解，且药物例如通过抗体降解而释放。
连接子可键接于抗体部分上的化学反应性基团，例如键接于游离氨基、亚氨基、羟基、硫氢基或羧基(例如键接于N末端或C末端、一个或一个以上赖氨酸残基的ε氨基、一个或一个以上谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或一个以上半胱胺酰基残基的氢硫基)。连接子所结合的位点可为抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或其可例如通过DNA重组技术(例如通过在氨基酸序列中引入半胱氨酸或蛋白酶裂解位点)或通过蛋白质生物化学(例如还原、pH值调整或蛋白水解)引入抗体部分中。
共价连接的一种最常用非特异性方法是进行碳化二亚胺反应以使化合物的羧基(或氨基)连接到抗体分子的氨基(或羧基)。此外，已使用双官能试剂(例如二醛或酰亚胺酯)将化合物的氨基连接到抗体分子的氨基。席夫碱反应(Schiff base reaction)也可用于将药物连接到抗体分子。此方法涉及对含有二醇或羟基的药物进行高碘酸盐氧化，由此形成醛，所述醛随后与抗体分子反应。连接经由与抗体分子的氨基形成席夫碱来进行。也可使用异硫氰酸酯作为偶合剂将药物共价连接于抗体分子。其它技术是所属领域技术人员已知的且在本发明的范围内。
在某些实施例中，作为连接子(X)前体的中间物与药物(Z)在适当条件下反应。在某些实施例中，使用药物和/或中间物上的反应性基团。随后使药物与中间物之间反应的产物或经衍生化的药物与抗体分子在适当条件下反应。
可通过采用所属领域技术人员众所周知的方法从反应物纯化免疫偶联物，所述方法为例如柱色谱法(例如亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤法、疏水性相互作用色谱法)、透析、透滤或沉淀。可通过采用所属领域技术人员众所周知的方法(例如SDS-PAGE、质谱法或毛细管电泳法)对免疫偶联物进行评估。
在一些实施例中，连接子可由细胞内环境中(例如溶酶体或内体或胞膜窖(caveolea)内)存在的裂解剂裂解。连接子可为例如由细胞内的肽酶或蛋白酶(包括(但不限于)溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基连接子。在一些实施例中，肽基连接子为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤维蛋白溶酶，已知其全部都能水解二肽药物衍生物，从而使活性药物在目标细胞内释放(参见例如杜博基克(Dubowchik)和沃克(Walker),1999,药理学与治疗学(Pharm.Therapeutics)83:67-123)。最典型连接子为可由GCC表达细胞中存在的酶裂解的肽基连接子。举例来说，可使用可由在癌性组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的肽基连接子(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly连接子(SEQ ID NO:319))。所述连接子的其它实例描述于例如美国专利第6,214,345号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的。在一个特定实施例中，可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接子为Val-Cit连接子或Phe-Lys连接子(参见例如美国专利6,214,345，其描述具有val-cit连接子的多柔比星(doxorubicin)的合成)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优势为药剂在偶联时通常会衰减且偶联物的血清稳定性通常较高。
在其它实施例中，可裂解连接子对pH值敏感，即对在某些pH值下水解敏感。通常，pH值敏感性连接子可在酸性条件下水解。举例来说，可使用可在溶酶体中水解的酸不稳定性连接子(例如腙、半卡巴腙(semicarbazone)、硫半卡巴腙(thiosemicarbazone)、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮或其类似物)。(参见例如美国专利第5,122,368号；第5,824,805号；第5,622,929号；杜博基克和沃克,1999,药理学与治疗学,83:67-123；奈维勒(Neville)等人,1989,生物化学(Biol.Chem.)264:14653-14661。)所述连接子在中性pH值条件(例如血液中的pH值条件)下相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(近似溶酶体的pH值)下不稳定。在某些实施例中，可水解连接子为硫醚连接子(例如经由酰基腙键连接于治疗剂的硫醚(参见例如美国专利第5,622,929号))。
在其它实施例中，连接子可在还原条件下裂解(例如二硫化物连接子)。多种二硫化物连接子是此项技术中已知的，包括例如可使用SATA(N-丁二酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SMPT(N-丁二酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT形成的二硫化物连接子(参见例如曲普(Thorpe)等人,1987,癌症研究,47:5924-5931；瓦日泽亚克(Wawrzynczak)等人,免疫偶联物：癌症放射显像与疗法中的抗体偶联物(Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy ofCancer)(C.W.沃杰(C.W.Vogel)编,牛津大学出版社(Oxford U.Press),1987)；也参见美国专利第4,880,935号。)
在其它特定实施例中，连接子为丙二酸酯连接子(琼森等人,1995,抗癌研究(Anticancer Res.)15:1387-93)、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基连接子(刘(Lau)等人,1995,生物有机化学与医药化学(Bioorg Med Chem.)3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(刘等人,1995,生物有机与药物化学,3(10):1305-12)。
在其它实施例中，连接子单元不可裂解，且药物通过抗体降解而释放。(参见例如美国公开案第20050238649号，其以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的)。
通常，连接子对细胞外环境实质上不敏感。在连接子的情形中，如本文所用的“对细胞外环境实质上不敏感”意谓当免疫偶联物存在于细胞外环境中(例如血浆中)时，免疫偶联物样品中不超过约20％、通常不超过约15％、更通常不超过约10％且甚至更通常不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％的连接子裂解。连接子是否对细胞外环境实质上不敏感可例如通过将免疫偶联物与血浆一起培育预定时段(例如2、4、8、16或24小时)，并随后对血浆中存在的游离药物的量定量来确定。
在其它非互斥实施例中，连接子促进细胞内在化。在某些实施例中，连接子当偶联于治疗剂或标记(Z)时促进细胞内在化。在其它实施例中，连接子当偶联于Z部分与抗GCC抗体分子时促进细胞内在化。
可用于本发明的组合物和方法的多种示范性连接子描述于WO 2004-010957、美国公开案第20060074008号、美国公开案第20050238649号和美国公开案第20060024317号(其各自以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的)中。
能够用于将抗体分子偶合于治疗剂或标记的连接子的实例包括例如顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)；氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-对氨基苯甲基酯；氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-肽-氨基苯甲基酯连接子，例如氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-L-苯丙氨酸-L-赖氨酸-对氨基苯甲基酯和氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-对氨基苯甲基酯(vc)；3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(又称4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-丁二酰亚胺酯或SPP)；4-丁二酰亚胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)；3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)；4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二酰亚胺酯(SPDB)；2-亚氨基硫杂环戊烷；S-乙酰基丁二酸酐；二硫化苯甲基氨基甲酸酯；碳酸酯；腙连接子；N-(α-顺丁烯二酰亚胺基乙酰氧基)丁二酰亚胺酯；N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(AMAS)；N-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙氧基]丁二酰亚胺酯(BMPS)；[N-ε-顺丁烯二酰亚胺基己酰氧基]丁二酰亚胺酯(EMCS)；N-[γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]丁二酰亚胺酯(GMBS)；丁二酰亚胺基-4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己酸酯](LC-SMCC)；6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸丁二酰亚胺酯(LC-SPDP)；间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)；[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-丁二酰亚胺酯(SIAB)；4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯(SMCC)；N-丁二酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基(SPDP)；[N-ε-顺丁烯二酰亚胺基己酰氧基]磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)；N-[γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-GMBS)；4-磺酸基丁二酰亚胺基-6-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(Sulfo-LC-SMPT)；6-(3'-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-LC-SPDP)；间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-MBS)；[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-SIAB)；4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-SMCC)；4-[对顺丁烯二酰亚胺基苯基]丁酸磺酸基丁二酰亚胺酯(Sulfo-SMPB)；乙二醇-双(丁二酸N-羟基丁二酰亚胺酯)(EGS)；酒石酸二丁二酰亚胺酯(DST)；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；二亚乙基三胺-五乙酸(DTPA)；和硫脲连接子。
在一些实施例中，连接子-X-具有式-Aa-Ww-Yy-，且式(I)的免疫偶联物的特征为式(II)：
其中，
Ab为本文所述的抗GCC抗体分子；
-A-为延伸子单元(Stretcher unit)；
a为0或1；
各-W-独立地为氨基酸单元；
w为0到12范围内的整数；
-Y-为自我分解型(self-immolative)间隔子单元；
y为0、1或2；
Z为治疗剂或标记；且
m在约1到约15的范围内。
延伸子单元(A)当存在时能够将Ab单元连接于氨基酸单元(-W-)(如果存在)、连接于间隔子单元(-Y-)(如果存在)；或连接于治疗剂或标记(Z)。可存在于抗GCC抗体分子上的适用官能团(天然存在或经由化学操作而存在)包括(但不限于)氢硫基、氨基、羟基、碳水化合物的变旋异构羟基以及羧基。适合官能团为氢硫基和氨基。在一个实例中，氢硫基可通过还原抗GCC抗体分子的分子内二硫键而产生。在另一个实施例中，氢硫基可通过使抗GCC抗体分子的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷(乔特氏试剂(Traut's reagent))或其它氢硫基产生试剂反应而产生。在某些实施例中，抗GCC抗体分子为重组抗体，且经工程改造成携带一个或一个以上赖氨酸。在某些其它实施例中，重组抗GCC抗体分子经工程改造成携带其它氢硫基，例如其它半胱氨酸。
在一个实施例中，延伸子单元与Ab单元的硫原子形成键结。硫原子可来源于Ab的氢硫基。此实施例的代表性延伸子单元描绘于式(IIIa)和(IIIb)的方括号中，其中Ab-、-W-、-Y-、-Z、w和y如上文所定义，且Ra选自：-C1-C10亚烷基-、-C2-C10亚烯基-、-C2-C10亚炔基-、-碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、O-(C2-C8亚烯基)-、-O-(C2-C8亚炔基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-C2-C10亚烯基-亚芳基、-C2-C10亚炔基-亚芳基、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-亚芳基-C2-C10亚烯基-、-亚芳基-C2-C10亚炔基-、-C1-C10亚烷基-(碳环基)-、-C2-C10亚烯基-(碳环基)-、-C2-C10亚炔基-(碳环基)-、-(碳环基)-C1-C10亚烷基-、-(碳环基)-C2-C10亚烯基-、-(碳环基)-C2-C10亚炔基、杂环基-、-C1-C10亚烷基-(杂环基)-、-C2-C10亚烯基-(杂环基)-、-C2-C10亚炔基-(杂环基)-、-(杂环基)-C1-C10亚烷基-、-(杂环基)-C2-C10亚烯基-、-(杂环基)-C2-C10亚炔基-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-CH2-，且r为1-10范围内的整数，其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环基和亚芳基任选经取代。在一些实施例中，单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环基和亚芳基未经取代。在一些实施例中，Ra选自-C1-C10亚烷基-、-碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(碳环基)-、-(碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(杂环基)-、-(杂环基)-C1-C10亚烷基-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为1-10范围内的整数，其中所述亚烷基未经取代且其余基团任选经取代。
从所有示范性实施例可了解到，即使不明确表示，1到15个药物部分可连接于Ab(m＝1-15)。
说明性延伸子单元为式(IIIa)的延伸子单元，其中Ra为-(CH2)5-：
另一说明性延伸子单元为式(IIIa)的延伸子单元，其中Ra为-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为2：
另一说明性延伸子单元为式(IIIa)的延伸子单元，其中Ra为-亚芳基-或亚芳基-C1-C10亚烷基-。在一些实施例中，芳基为未取代的苯基。
另一说明性延伸子单元为式(IIIb)的延伸子单元，其中Ra为-(CH2)5-：
在某些实施例中，延伸子单元经由Ab单元的硫原子与延伸子单元的硫原子之间的二硫键连接于Ab单元。此实施例的代表性延伸子单元描绘于式(IV)的方括号中，其中Ra、Ab-、-W-、-Y-、-Z、w和y如上文所定义。
应注意，除非上下文另外指定，否则在整篇本申请案中，下式中的S部分是指Ab单元的硫原子。
在其它实施例中，延伸子在连接于Ab之前含有可与Ab的伯胺或仲胺形成键结的反应性位点。这些反应性位点的实例包括(但不限于)活化酯，例如丁二酰亚胺酯、4硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯、酸酐、酰基氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。此实施例的代表性延伸子单元描绘于式(Va)和(Vb)的方括号中，其中-Ra-、Ab-、-W-、-Y-、-Z、w和y如上文所定义；
在一些实施例中，延伸子含有可与Ab上存在的经修饰碳水化合物的(-CHO)基团反应的反应性位点。举例来说，碳水化合物可使用例如过碘酸钠等试剂适度氧化，且可使经氧化碳水化合物的所得(-CHO)单元与含有例如酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、硫半卡巴腙、肼羧酸酯和芳基酰肼等官能团的延伸子(例如金子(Kaneko)等人,1991,生物偶联化学(Bioconjugate Chem.)2:133-41所述)缩合。此实施例的代表性延伸子单元描绘于式(VIa)、(VIb)和(VIc)的方括号中，其中-Ra-、Ab-、-W-、-Y-、-Z、w和y如上文所定义。
氨基酸单元(-W-)当存在时，在存在间隔子单元情况下，将延伸子单元连接于间隔子单元；在不存在间隔子单元情况下，将延伸子单元连接于药物部分，且在不存在延伸子单元和间隔子单元的情况下，将Ab单元连接于治疗剂或标记部分。
Ww-可为例如单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。各-W-单元独立地具有以下方括号中所示的式，且w为0到12范围内的整数：
其中Rb为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苯甲基、对羟基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
在一些实施例中，氨基酸单元可由一种或一种以上酶(包括癌症或肿瘤相关蛋白酶)酶促裂解以释放治疗剂或标记部分(-Z)，在一个实施例中所述治疗剂或标记部分(-Z)在释放时在体内质子化以提供治疗剂或标记(Z)。
在某些实施例中，氨基酸单元可包含天然氨基酸。在其它实施例中，氨基酸单元可包含非天然氨基酸。说明性Ww单元由式(VII)-(IX)表示：
其中Rc和Rd为如下：
其中Rc、Rd和Re为如下：
<u>R<sup>c</sup></u> <u>R<sup>d</sup></u> <u>R<sup>e</sup></u>
苯甲基 苯甲基 (CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>NH<sub>2</sub>；
异丙基 苯甲基 (CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>NH<sub>2</sub>；和
H 苯甲基 (CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>NH<sub>2</sub>；
其中Rc、Rd、Re和Rf为如下：
<u>R<sup>c</sup></u> <u>R<sup>d</sup></u> <u>R<sup>e</sup></u> <u>R<sup>f</sup></u>
H 苯甲基 异丁基 H；和
甲基 异丁基 甲基 异丁基。
示范性氨基酸单元包括(但不限于)式(VII)的单元，其中：Rc为苯甲基且Rd为-(CH2)4NH2；Rc为异丙基，且Rd为-(CH2)4NH2；或Rc为异丙基，且Rd为-(CH2)3NHCONH2。另一示范性氨基酸单元为式(VIII)的单元，其中Rc为苯甲基，Rd为苯甲基，且Re为-(CH2)4NH2。
适用-Ww-单元可关于其对由特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶)酶促裂解的选择性进行设计和最佳化。在一个实施例中，-Ww-单元为裂解由组织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶催化的单元。
在一个实施例中，-Ww-为二肽、三肽、四肽或五肽。当Rb、Rc、Rd、Re或Rf不为氢时，Rb、Rc、Rd、Re或Rf所连接的碳原子具有手性。
Rb、Rc、Rd、Re或Rf所连接的各碳原子独立地为(S)或(R)构型。
在氨基酸单元的一个方面中，所述氨基酸单元为缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)。在另一个方面中，氨基酸单元为苯丙氨酸-赖氨酸(即fk)。在氨基酸单元的另一个方面中，所述氨基酸单元为N-甲基缬氨酸-瓜氨酸。在另一个方面中，氨基酸单元为5-氨基戊酸、高苯丙氨酸赖氨酸、四异喹啉甲酸赖氨酸、环己基丙氨酸赖氨酸、异哌啶酸(isonepecoticacid)赖氨酸、β-丙氨酸赖氨酸、甘氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺和异哌啶酸。
间隔子单元(-Y-)当存在时，在存在氨基酸单元时，将氨基酸单元连接于治疗剂或标记部分(-Z-)。或者，当不存在氨基酸单元时，间隔子单元将延伸子单元连接于治疗剂或标记部分。当氨基酸单元与延伸子单元都不存在时，间隔子单元也将治疗剂或标记部分连接于Ab单元。
间隔子单元具有两种一般类型：非自我分解型或自我分解型。非自我分解型间隔子单元为在氨基酸单元自抗体-药物偶联物裂解(尤其酶促裂解)后，部分或全部间隔子单元仍结合于治疗剂或标记部分的间隔子单元。非自我分解型间隔子单元的实例包括(但不限于)(甘氨酸-甘氨酸)间隔子单元和甘氨酸间隔子单元(两者都描绘于方案1中)(下文)。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元或甘氨酸间隔子单元的偶联物经由酶(例如肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶)进行酶促裂解时，甘氨酸-甘氨酸-Z部分或甘氨酸-Z部分自Ab-Aa-Ww-裂解。在一个实施例中，目标细胞内发生独立的水解反应，从而使甘氨酸-Z部分的键裂解且释放治疗剂或标记。
方案1
在一些实施例中，非自我分解型间隔子单元(-Y-)为-Gly-。在一些实施例中，非自我分解型间隔子单元(-Y-)为-Gly-Gly-。
在一个实施例中，本发明提供一种式(II)免疫偶联物，其中不存在间隔子单元(y＝0)，或其医药学上可接受的盐。
或者，含有自我分解型间隔子单元的偶联物可释放-Z。如本文所用的术语“自我分解型间隔子”是指能够将两个间隔开的化学部分共价连接在一起形成稳定三联分子的双官能化学部分。如果其与第一部分的键裂解，那么其将自发地与第二化学部分分离。
在一些实施例中，-Yy-为对氨基苯甲醇(PAB)单元(参见方案2和3)，其亚苯基部分经Qn取代，其中Q为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；且n为0-4范围内的整数。单独或作为另一基团的一部分的烷基、烯基和炔基可任选经取代。
在一些实施例中，-Y-为经由PAB基团的氨基氮原子连接于-Ww-且经由碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连接于-Z的PAB基团。不受任何特定理论或机制束缚，方案2描绘一种自经由氨基甲酸酯或碳酸酯基直接连接于治疗剂或标记(-Z)的PAB基团释放-Z的可能机制，如土岐(Toki)等人,2002,有机化学杂志(J.Org.Chem.)67:1866-1872所述。
方案2
在方案2中，Q为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0-4范围内的整数；且m在1到约20范围内。单独或作为另一基团的一部分的烷基、烯基和炔基可任选经取代。
不受任何特定理论或机制束缚，方案3描绘一种自经由醚或胺键联直接连接于治疗剂或标记部分(-Z)的PAB基团释放-Z的可能机制，其中-Z包括作为治疗剂或标记部分的一部分的氧或氮基。
方案3
在方案3中，Q为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；n为0-4范围内的整数；且m在1到约20范围内。单独或作为另一基团的一部分的烷基、烯基和炔基可任选经取代。
自我分解型间隔子的其它实例包括(但不限于)在电子上类似于PAB基团的芳香族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(海(Hay)等人,1999,生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)9:2237)和邻氨基苯甲基缩醛或对氨基苯甲基缩醛。可使用在酰胺键水解后经历环化的间隔子，例如经取代和未经取代的4-氨基丁酰胺(罗德雷格(Rodrigues)等人,1995,化学与生物学(Chemistry Biology)2:223)；经适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(斯托姆(Storm)等人,1972,美国化学协会杂志,94:5815)；和2-氨基苯基丙酰胺(埃姆斯伯雷(Amsberry)等人,1990,有机化学杂志,55:5867)。消除甘氨酸的α位经取代的含氨基药物(金斯伯雷(Kingsbury)等人,1984,医药化学杂志,27:1447)也为自我分解型间隔子的实例。
在一个实施例中，间隔子单元为如方案4中所描绘的分支双(羟基甲基)-苯乙烯(BHMS)单元，其可用于并入和释放多种药物。
方案4
在方案4中，Q为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；n为0-4范围内的整数；o为0或1；且m为1到约20的整数。单独或作为另一基团的一部分的烷基、烯基和炔基可任选经取代。
在一些实施例中，-Z部分相同。在另一个实施例中，-Z部分不同。
在一个方面中，间隔子单元(-Yy-)由式(X)-(XII)表示：
其中Q为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m为0-4范围内的整数。单独或作为另一基团的一部分的烷基、烯基和炔基可任选经取代。
和
在一组所选实施例中，式(I)和式(II)的偶联物为：
其中w和y各自为0、1或2；
其中w和y各自为0；
其中Aa、Ww、Yy、Z和Ab具有上文所提供的含义。
式(I)中的变量Z为治疗剂或标记。治疗剂可为能够发挥所需生物作用的任何药剂。在一些实施例中，治疗剂使细胞对第二治疗形式(例如化学治疗剂、辐射疗法、免疫疗法)敏感。
在一些实施例中，治疗剂为细胞生长抑制剂或细胞毒性剂。实例包括(但不限于)抗代谢物(例如硫唑嘌呤(azathioprine)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他汀(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)、胞嘧啶阿拉伯糖(阿糖胞苷(cytarabine))、甲氨蝶呤、甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim)、嘧啶甲胺(pyrimethamine)、培美曲唑(pemetrexed))；烷化剂(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、乌拉莫司汀(uramustine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、塞替派(thiotepa)/苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链佐星(streptozocin)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannitol)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥赛力铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine))、达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide))；蒽环霉素(anthracycline)(例如道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依达比星(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin))；抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、安曲霉素(anthramycin)、链尿霉素(streptozotocin)、短杆菌肽D(gramicidin D)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C(mitomycin C))、倍癌霉素(duocarmycin)(例如CC-1065)、刺孢霉素(calicheamicin))；抗有丝分裂剂(包括例如类美登素(maytansinoid)、奥瑞他汀(auristatin)、海兔毒素(dolastatin)、念珠藻环肽(cryptophycin)、长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)或新颖紫杉烷(参见例如2001年5月31日公开的国际专利公开案第WO01/38318号))和秋水仙碱(colchicine))；拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、米托蒽醌(mitoxantrone))；和蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)。
类美登素免疫偶联物
在一些实施例中，治疗剂为类美登素。类美登素化合物和用于将其结合于抗体的方法描述于例如查理等人,癌症研究,52:127-131(1992)；维蒂森(Widdison)等人,医药化学杂志,49:4392-4408(2006)；和美国专利第5,208,020号和第6,333,410号中。类美登素的实例包括具有经修饰芳香族环(例如C19-脱氯、C20-脱甲氧基、C20-酰氧基)的美登素类似物和在其它位置具有修饰(例如C9-CH、C14-烷氧基甲基、C14-羟基甲基或酰氧基甲基、C15-羟基/酰氧基、C15-甲氧基、C18-N-脱甲基、4,5-脱氧)的美登素类似物。在某些实施例中，类美登素为N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素(DM3)、N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
包含氢硫基的类美登素化合物可使用杂双官能连接子偶合于抗体，所述杂双官能连接子经由硫醚或二硫键联连接于类美登素化合物。在一些所述实施例中，连接子偶合于抗体上的氨基(例如末端氨基或赖氨酸残基的ε氨基)。在一些实施例中，用于使类美登素化合物偶合于抗体的杂双官能连接子为3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(又称4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-丁二酰亚胺酯或SPP)、4-丁二酰亚胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸N-丁二酰亚胺酯(SMCC)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)；4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二酰亚胺酯(SPDB)、2-亚氨基硫杂环戊烷或S-乙酰基丁二酸酐。
在某些实施例中，式(I)的免疫偶联物的特征为式Ab-(SMCC-DM1)m(式(I-1))；Ab-(SPP-DM1)m(式(I-2))；或Ab-(SPDB-DM4)m(式(I-3))，其中Ab为如本文所述的抗GCC抗体分子，且m具有上文对于式(I)所述的值和优选值。
在一些实施例中，式(I-1)、(I-2)或(I-3)中的变量Ab为具有表1到表6中所概述的特征的抗体分子。在某些实施例中，变量Ab为5F9抗体分子或Abx-229抗体分子。
在一些实施例中，式(I-1)、(I-2)或(I-3)中的变量m在约1到约10、约3到约7或约3到约5的范围内。
在某些特定实施例中，本发明涉及式(I-1)、(I-2)或(I-3)的免疫偶联物，其中Ab为5F9抗体分子且m为约4。
海兔毒素和奥瑞他汀免疫偶联物
在一些其它实施例中，治疗剂为海兔毒素。在一些实施例中，治疗剂为奥瑞他汀，例如奥瑞他汀E(此项技术中又称海兔毒素-10的衍生物)或其衍生物。在一些实施例中，治疗剂为选自式(XIII)-(XXIII)化合物的化合物，或其医药学上可接受的盐形式：
奥瑞他汀化合物和用于将其与抗体结合的方法描述于例如以下文献中：多伦纳(Doronina)等人,自然生物技术(Nature Biotech.),21:778-784(2003)；哈布雷特(Hamblett)等人,临床癌症研究(Clin.Cancer Res.),10:7063-7070(2004)；卡特(Carter)和森特(Senter),癌症杂志(Cancer J.),14 154-169(2008)；美国专利第7,498,298号、第7,091,186号、第6,884,869号；第6,323,315号；第6,239,104号；第6,034,065号；第5,780,588号；第5,665,860号；第5,663,149号；第5,635,483号；第5,599,902号；第5,554,725号；第5,530,097号；第5,521,284号；第5,504,191号；第5,410,024号；第5,138,036号；第5,076,973号；第4,986,988号；第4,978,744号；第4,879,278号；第4,816,444号；和第4,486,414号；美国专利公开案第20090010945号、第20060074008号、第20080300192号、第20050009751号、第20050238649号和第20030083236号；以及国际专利公开案第WO 04/010957号和第WO 02/088172号，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的。
奥瑞他汀可为例如奥瑞他汀E与酮酸之间形成的酯。举例来说，可使奥瑞他汀E分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以产生AEB和AEVB。其它典型奥瑞他汀包括奥瑞他汀苯丙氨酸苯二胺(AFP；(XVIII))、单甲基奥瑞他汀E(MMAE；(XIII))和单甲基奥瑞他汀F(MMAF；(XXI))。
经显示，奥瑞他汀可干扰微管动力学以及细胞核和细胞分裂且具有抗癌活性。用于本发明中的奥瑞他汀结合微管蛋白且可对表达GCC的细胞系发挥细胞毒性或细胞生长抑制作用。用于确定化合物是否结合微管蛋白的方法是此项技术中已知的。参见例如穆勒(Muller)等人,分析化学(Anal.Chem.)2006,78,4390-4397；哈默(Hamel)等人,分子药理学(Molecular Pharmacology),1995 47:965-976；和哈默等人,生物化学杂志(The Journalof Biological Chemistry),1990 265:28,17141-17149。出于本发明的目的，可测定化合物对微管蛋白的相对亲和力。本发明的一些优选奥瑞他汀结合微管蛋白的亲和力在MMAE与微管蛋白的结合亲和力的1/10(较弱亲和力)到MMAE与微管蛋白的结合亲和力的10倍、20倍或甚至100倍(较高亲和力)的范围内。
此项技术中已知多种不同分析可用于确定奥瑞他汀或所得免疫偶联物是否对所需细胞系发挥细胞生长抑制或细胞毒性作用。举例来说，免疫偶联物的细胞毒性或细胞生长抑制活性可通过以下测量：使表达免疫偶联物的目标蛋白质的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；培养细胞约6小时到约5天；和测量细胞活力。可使用基于细胞的体外分析来测量活力(增殖)、细胞毒性和免疫偶联物的细胞凋亡诱导作用(卡斯蛋白酶活化)。
为确定免疫偶联物是否发挥细胞生长抑制作用，可使用胸苷并入分析。举例来说，可在96孔板中以每孔5,000个细胞的密度培养表达目标抗原的癌细胞72小时，且在72小时时期的最后8小时期间暴露于0.5μCi 3H-胸苷。在免疫偶联物存在和不存在下测量培养物的细胞中3H-胸苷的并入。
为测定细胞毒性，可测量坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴随质膜的渗透性增加；细胞膨胀和质膜破裂。细胞凋亡通常特征为膜起泡、细胞质凝聚和内源核酸内切酶活化。对癌细胞的任何所述作用的确定都表明免疫偶联物适用于治疗癌症。
细胞活力可通过测定细胞中染料(例如中性红(neutral red)、锥虫蓝(trypanblue)或ALAMARTM蓝)的吸收来测量(参见例如帕吉(Page)等人,1993,国际肿瘤学杂志(Intl.J.Oncology)3:473-476)。在所述分析中，在含有染料的培养基中培育细胞，洗涤细胞且以分光光度法测量剩余染料，其反映细胞对染料的吸收。也可使用结合蛋白质的染料磺酸基若丹明B(sulforhodamine B，SRB)测量细胞毒性(思科汗(Skehan)等人,1990,国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)82:1107-12)。
或者，在定量比色分析中使用四唑鎓盐(例如MTT或WST)，通过检测活细胞而非死亡细胞来测定哺乳动物细胞存活和增殖(参见例如莫斯曼(Mosmann),1983,免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)65:55-63)。
细胞凋亡可通过测量例如DNA断裂来定量。可利用用于体外定量测定DNA断裂的市售光度测定法。所述分析的实例，包括TUNEL(其检测断裂DNA中经标记核苷酸的并入)和基于ELISA的分析，描述于生物化学(Biochemica),1999,第2期,第34-37页(罗氏分子生物化学品公司(Roche Molecular Biochemicals))中。
细胞凋亡也可通过测量细胞中的形态变化来测定。举例来说，与坏死相同，质膜完整性的丧失可通过测量某些染料(例如荧光染料，例如吖啶橙或溴化乙锭)的吸收来确定。用于测量凋亡细胞数目的方法已由杜克(Duke)和克汗(Cohen),现代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)(克里根(Coligan)等人编,1992,第3.17.1-3.17.16页)描述。也可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记细胞，且观测细胞的染色质凝聚和沿内部核膜的着边现象。可经测量以确定细胞凋亡的其它形态变化包括例如细胞质凝聚、膜起泡增加和细胞收缩。
可在培养物的附着和“漂浮”部分(compartment)中测量凋亡细胞的存在。举例来说，可通过移除上清液，将附着的细胞胰蛋白酶化，在离心洗涤步骤(例如在2000rpm下10分钟)后合并制备物并检测细胞凋亡(例如通过测量DNA断裂)来收集两个部分。(参见例如皮亚扎(Piazza)等人,1995,癌症研究,55:3110-16)。
可在动物模型中测试或验证免疫偶联物的作用。所属领域技术人员已知多种已建立的动物癌症模型，其中任何模型都可用于分析免疫偶联物的功效。下文描述所述模型的非限制性实例。此外，检验免疫偶联物的体内功效的小动物模型可通过将人类肿瘤细胞系植入适当免疫缺陷型啮齿动物品系(例如无胸腺裸小鼠或SCID小鼠)中来产生。
在一些实施例中，式(I)中的变量-Z为式(X-A)或式(X-B)的奥瑞他汀部分：
其中在各位置，独立地：
波形线表示键结；
R2为-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R3为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R4为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R5为-H或-C1-C8烷基；
或R4和R5共同形成碳环且具有式-(CRaRb)s-，其中Ra和Rb独立地为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳环，且s为2、3、4、5或6，
R6为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R7为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；
各R8独立地为-H、-OH、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C1-C20炔基)或-碳环；
R9为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R19为-芳基、-杂环或-碳环；
R20为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C2-C20炔基)或OR18，其中R18为-H、羟基保护基，或当OR18表示＝O时为直接键；
R21为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基、-芳基、-杂环或-碳环；
R10为-芳基或-杂环；
G为-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12为-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基；
R11为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-杂环、-(R13O)s-R14或-(R13O)s-CH(R15)2；
s为0-1000范围内的整数；
R13为-C2-C20亚烷基、-C2-C20亚烯基或-C2-C20亚炔基；
R14为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；
R15在每次出现时独立地为-H、-COOH、-(CH2)t-N(R16)2、-(CH2)t-SO3H、-(CH2)t-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)t-SO3-C2-C20烯基或-(CH2)t-SO3-C2-C20炔基；
R16在每次出现时独立地为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)t-COOH；且
t为0到6范围内的整数；其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基任选经取代。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基未经取代。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中基团R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9未经取代且基团R19、R20和R21任选如本文所述经取代。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中：
R2为-C1-C8烷基；
R3、R4和R7独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、单环C3-C6碳环、-C1-C20亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚炔基(单环C3-C6碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚炔基(C6-C10芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环、芳基和杂环基任选经取代；
R5为-氢；
R6为-C1-C8烷基；
各R8独立地选自-OH、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)或-O-(C2-C20炔基)，其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
R9为-氢或-C1-C8烷基；
R19为任选取代的苯基；
R20为OR18；其中R18为H、羟基保护基，或当OR18表示＝O时为直接键；
R21选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳环；其中所述烷基、烯基、炔基和碳环基任选经取代；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中：
R2为甲基；
R3为-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基，其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
R4为-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、单环C3-C6碳环、-C6-C10芳基、-C1-C8亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚炔基(C6-C10芳基)、-C1-C8亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚炔基(单环C3-C6碳环)；其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基和碳环基任选经取代；
R5为H；R6为甲基；
R7为-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基；
各R8为甲氧基；
R9为-氢或-C1-C8烷基；
R19为苯基；
R20为OR18；其中R18为-H、羟基保护基，或当OR18表示＝O时为直接键；
R21为甲基；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中：
R2为甲基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为甲基；R7为异丙基或仲丁基；R8为甲氧基；R9为氢或C1-C8烷基；R19为苯基；R20为OR18；其中R18为H、羟基保护基，或当OR18表示＝O时为直接键；且R21为甲基；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-A)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中：
R2为甲基或C1-C3烷基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为C1-C3烷基；R7为C1-C5烷基；R8为C1-C3烷氧基；R9为氢或C1-C8烷基；R19为苯基；R20为OR18；其中R18为H、羟基保护基，或当OR18表示＝O时为直接键；且R21为C1-C3烷基；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中：
R2为甲基；
R3、R4和R7独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、单环C3-C6碳环、-C1-C20亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚炔基(单环C3-C6碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚炔基(C6-C10芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C20亚炔基(杂环)；其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环、芳基和杂环基任选经取代；
R5为-H；
R6为甲基；
各R8为甲氧基；
R9为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
R10为任选取代的芳基或任选取代的杂环；
G为-O-、-S-、-NH-或-NR12-，其中R12为-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基，其各自任选经取代；
R11为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-杂环、-(R13O)s-R14或-(R13O)s-CH(R15)2，其中所述烷基、烯基、炔基、芳基和杂环基任选经取代；
s为0-1000范围内的整数；
R13为-C2-C20亚烷基、-C2-C20亚烯基或-C2-C20亚炔基，其各自任选经取代；
R14为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基，其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
R15在每次出现时独立地为-H、-COOH、-(CH2)t-N(R16)2、-(CH2)t-SO3H、-(CH2)t-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)t-SO3-C2-C20烯基或-(CH2)t-SO3-C2-C20炔基，其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
R16在每次出现时独立地为-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)t-COOH，其中所述烷基、烯基和炔基任选经取代；
t为0到6范围内的整数；或其医药学上可接受的盐形式。
在某些所述实施例中，R10为任选取代的苯基；
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中基团R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9未经取代，且基团R10和R11如本文所述。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基未经取代。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中
R2为C1-C3烷基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为C1-C3烷基；R7为C1-C5烷基；R8为C1-C3烷氧基；R9为氢或C1-C8烷基；
R10为任选取代的苯基；G为O、S或NH；且R11如本文所定义；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中
R2为甲基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为甲基；R7为异丙基或仲丁基；R8为甲氧基；R9为氢或C1-C8烷基；
R10为任选取代的苯基；G为O、S或NH；且R11如本文所定义；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中
R2为甲基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为甲基；R7为异丙基或仲丁基；R8为甲氧基；R9为氢或C1-C8烷基；R10为苯基；且G为O或NH，且R11如本文所定义，优选为氢；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中
R2为C1-C3烷基；R3为H或C1-C3烷基；R4为C1-C5烷基；R5为H；R6为C1-C3烷基；R7为C1-C5烷基；R8为C1-C3烷氧基；R9为氢或C1-C8烷基；
R10为苯基；且G为O或NH，且R11如本文所定义，优选为氢；或其医药学上可接受的盐形式。
式(X-A)或(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基，且R5为-H。在一个示范性实施例中，R3和R4各自为异丙基，R5为H，且R7为仲丁基。其余取代基如本文所定义。
式(X-A)或(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R2和R6各自为甲基，且R9为H。其余取代基如本文所定义。
式(X-A)或(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R8在每次出现时为-OCH3。其余取代基如本文所定义。
式(X-A)或(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为H，R7为仲丁基，R8在每次出现时为-OCH3，且R9为H。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中G为-O-或-NH-。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R10为芳基。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中R10为-苯基。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中G为-O-，且R11为H、甲基或叔丁基。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中当G为-NH时，R11为-(R13O)s-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)t-N(R16)2，且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)t-COOH。其余取代基如本文所定义。
式(X-B)的奥瑞他汀包括如下奥瑞他汀，其中当G为-NH时，R11为-(R13O)s-CH(R15)2，其中R15为H或-(CH2)t-SO3H。其余取代基如本文所定义。
在式(II)免疫偶联物的优选实施例中，当Z为式(X-A)的奥瑞他汀分子时，w为1到12，优选为2到12范围内的整数，y为1或2，且a优选为1。
在式(II)免疫偶联物的一些实施例中，当Z为式(X-B)的奥瑞他汀分子时，a为1，且w和y为0。
说明性治疗剂(-Z)包括具有以下结构的治疗剂(-Z)：
在一个方面中，亲水性基团(例如(但不限于)三乙二醇酯(TEG))可连接于式(X-B)奥瑞他汀分子的R11。不受理论束缚，亲水性基团有助于治疗剂的内在化和不聚结。
在一些实施例中，治疗剂不为TZT-1027。在一些实施例中，治疗剂不为奥瑞他汀E、海兔毒素10或奥瑞他汀PE。
在一些实施例中，奥瑞他汀分子经由含有顺丁烯二酰亚胺部分(例如顺丁烯二酰亚胺基己酰基部分)的连接子连接于抗体分子上的半胱氨酸部分。
在一些实施例中，奥瑞他汀分子使用连接于奥瑞他汀分子上的羟基的杂双官能连接子偶合于抗体分子。在一些所述实施例中，连接子包含腙。在一些实施例中，连接子是由顺丁烯二酰亚胺基己酰肼与酮基羧酸(例如5-苯甲酰基戊酸)反应形成的腙化合物。在特定实施例中，连接子为(Z)-6-(2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)-6-苯基己酸。
在一些其它实施例中，奥瑞他汀分子使用连接于奥瑞他汀分子上的单甲基氨基的杂双官能连接子偶合于抗体。在一些实施例中，连接子包含可裂解部分，例如肽部分，以及自我分解型氨基甲酸对氨基苯甲基酯间隔子。示范性连接子包括顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-L-苯丙氨酸-L-赖氨酸-对氨基苯甲基酯和氨基甲酸顺丁烯二酰亚胺基己酰基-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-对氨基苯甲基酯(vc)。
在某些实施例中，式(I)免疫偶联物的特征为式Ab-(vc-MMAF)m(式(I-4))；Ab-(vc-MMAE)m(式(I-5))；Ab-(mc-MMAE)m(式(I-6))；或Ab-(mc-MMAF)m(式(I-7))，其中Ab为如本文所述的抗GCC抗体分子，S为抗体的硫原子且m具有上文对于式(I)所述的值和优选值。在某些实施例中，m为1到约5的整数。
在一些实施例中，式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)中的变量Ab为具有表1到表6中所概述的特征的抗体分子。在某些实施例中，变量Ab为5F9抗体分子或Abx-229抗体分子。
在一些实施例中，式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)中的变量m在约2到约10、约6到约8或约4到约6的范围内。
在某些特定实施例中，本发明涉及式(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)的免疫偶联物，其中Ab为5F9抗体分子且m为约4。
本文所揭示的免疫偶联物可用于调节指定生物反应。治疗剂不应解释为限于典型化学治疗剂。举例来说，治疗剂可为具有所需生物活性的核酸、蛋白质或多肽。举例来说，抗体分子可偶联于可干扰基因表达的反义分子、siRNA分子、shRNA分子或miRNA分子，由此产生所需生物作用。
可偶联于本发明的抗体分子的蛋白质和多肽包括例如毒素和其组分，例如相思豆毒素(abrin)、相思豆毒素A链、蓖麻毒素(ricin)、蓖麻毒素A链、莫迪素(modeccin)、莫迪素A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、外毒素A(exotoxin A)(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、PE38(截短型绿脓杆菌外毒素)、白树素(gelonin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、白喉毒素A片段、某些油桐(Aleurites fordii)蛋白质、某些香石竹(Dianthuscaryophyllus)蛋白质(例如康乃馨蛋白(dianthin)30和康乃馨蛋白32)、某些美洲商陆(Phytolacca Americana)蛋白质(例如PAP、PAPII和PAP-S)、某些石碱草(Saponariaofficinlis)蛋白质(例如沙泊宁6(saporin 6))、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、米托洁林(mitogillin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和伊诺霉素(enomycin)；参与针对肿瘤的免疫系统或诱导针对肿瘤的效应功能的蛋白质，例如肿瘤坏死因子、干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子和组织纤维蛋白溶酶原活化因子；和生物反应调节剂，例如细胞因子和淋巴因子(例如介白素-1(“IL-1”))、介白素-2(“IL-2”)、介白素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)和其它生长因子。
本发明的抗体也可与病毒粒子上存在的病毒表面蛋白质偶联或融合。举例来说，本发明的单链抗GCC抗体可与病毒表面蛋白质融合(例如形成融合蛋白)。或者，本发明的完整抗GCC抗体或其片段可以化学方式偶联(例如经由化学连接子结合)于病毒表面蛋白质。优选地，病毒为与内吞膜(endocytic membrane)融合的病毒(例如流感病毒)，因此病毒与抗GCC抗体一起内在化且由此感染表达GCC的细胞。病毒可遗传工程改造为细胞毒素。举例来说，病毒可表达对细胞具有毒性的基因(例如细胞死亡促进基因)或诱导所述基因的表达。优选地，所述病毒不能进行病毒复制。
本文所述的抗GCC抗体分子也可偶联于前药或前药活化剂。在用于杀灭或抑制肿瘤细胞的一种方法中，使本发明的第一抗GCC抗体分子与仅在与前药活化剂紧密接近时活化的前药偶联。使前药活化剂与第二抗体分子偶联，所述第二抗体分子优选为结合于GCC分子上的非竞争位点的抗体分子。两种抗体结合于竞争还是非竞争结合位点可由常规竞争性结合分析确定。适用于实施本发明的药物-前药对描述于布拉克利(Blakely)等人,“ZD2767，一种用于在结肠直肠肿瘤异种移植物中产生肿瘤消退作用的抗体导向酶前药疗法的改良系统(ZD2767,an Improved System for Antibody-directed Enzyme ProdrugTherapy That Results in Tumor Regressions in Colorectal Tumor Xenografts),”(1996)癌症研究,56:3287-3292中。
也可将治疗活性放射性同位素与抗GCC抗体或其抗原结合片段或衍生物偶合。放射性同位素可用于诊断或治疗应用。可与抗GCC抗体偶合的放射性同位素包括(但不限于)α-、β-或γ-发射体或β-和γ-发射体。参见例如S.E.沃德(S.E.Order),“放射性标记的抗体在癌症疗法中的治疗应用的分析、结果和未来展望(Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy),”用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy),R.W.博得韦等人,(编),第303-316页(学术出版社(AcademicPress)1985。所述放射性同位素包括(但不限于)铜(64Cu)、碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)。适用作治疗剂的放射性同位素包括钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)和铑(188Rh)。适用作标记以例如用于诊断中的放射性同位素包括碘(131I或125I)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、碳(14C)和氚(3H)，或上文所列治疗用同位素中的一者或一者以上。
使用以131I、90Y和177Lu标记的抗体进行的放射免疫疗法(RIT)正在深入的临床研究中。这三种核素的物理特征显著不同，且因此放射性核素的选择将重要，以便向肿瘤传递最大辐射剂量。90Y的较高β能量粒子可能适用于大肿瘤，但小肿瘤且尤其骨转移可能并不需要。131I的相对低能量β粒子为理想的，但放射性碘化分子的体内脱卤作用为内在化抗体的主要缺点。相比之下，177Lu具有范围仅为0.2-0.3mm的低能量β粒子，且相较于90Y，向骨髓传递低得多的辐射剂量。此外，由于物理半衰期较长(相较于90Y)，故肿瘤滞留时间较长。因此，可以相对较低辐射剂量向骨髓投予较高活性(较多mCi量)的经177Lu标记的药剂。有数个临床研究调查了经177Lu标记的抗体在治疗各种癌症中的使用。(穆里根T(Mulligan T)等人,临床癌症研究(Clin Cancer Res.)1:1447-1454(1995)；梅尔迪斯RF(Meredith RF)等人,核医学杂志(J Nucl Med)37:1491-1496(1996)；阿尔瓦雷兹RD(Alvarez RD)等人,妇科肿瘤学(Gynecologic Oncology)65:94-101(1997))。
可用于衍生化(或标记)本发明的抗体或抗体部分的适用可检测剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光物质、生物发光物质、发射荧光的金属原子(例如铕(Eu)和其它镧系元素)和放射性物质(如上所述)。示范性荧光可检测剂包括荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红素(phycoerythrin)等。也可用例如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等可检测酶对抗体进行衍生化。当用可检测酶对抗体进行衍生化时，通过添加所述酶用于产生可检测反应产物的其它试剂对其进行检测。举例来说，当存在可检测剂辣根过氧化酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺会产生可检测的有色反应产物。抗体也可用辅基(例如抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)进行衍生化。举例来说，抗体可用生物素进行衍生化且经由间接测量抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合来检测。适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；且生物发光物质的实例包括荧光素酶(luciferase)、萤火虫荧光素(luciferin)和水母素(aequorin)。
医药组合物
在另一个方面中，本发明的特征在于组合物，例如医药学上可接受的组合物，其包括与医药学上可接受的载剂一起调配的如本文所述的抗GCC抗体分子或其免疫偶联物。在实施例中，抗GCC抗体分子为具有表1和表2中所概述的示范性特征的抗GCC抗体分子。
如本文所用的“医药学上可接受的载剂”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、等张剂和吸收延迟剂等。载剂可适于静脉内、肌肉内、皮下、不经肠、经直肠、经脊椎或表皮投药(例如通过注射或输注)。医药组合物可包括一种或一种以上其它赋形剂，例如盐。缓冲剂、张力调节剂、低温保护剂、非离子型清洁剂、表面活性剂和防腐剂。
组合物可呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。优选形式取决于预定投药模式和治疗应用。一些典型组合物呈欲用于不经肠投药(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的可注射或可输注溶液的形式。在一些实施例中，抗体是通过静脉内输注或注射投予。在其它实施例中，抗体是通过肌肉内或皮下注射投予。
如本文所用的短语“不经肠投药”和“不经肠投予”意谓除肠内和局部投药以外的通常通过注射进行的投药模式，且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一些实施例中，医药组合物在制造和储存条件下无菌且稳定。组合物可调配成溶液、微乳液、分散液、脂质体、微球体或适于高抗体浓度的其它有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(即抗体或抗体部分)与上文所列举的成分中一者或组合一起并入适当溶剂中，必要时随后例如通过过滤进行灭菌来制备。一般说来，分散液是通过将活性化合物并入含有基础分散介质和上文所列举的所需其它成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，所提供的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。溶液的适当流动性可例如通过使用例如卵磷脂等包衣、在分散液的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
本发明的抗体和抗原结合片段可通过此项技术中已知的多种方法投予，但对于许多治疗应用，投药途径/模式是静脉内注射或输注。如所属领域技术人员所了解，投药途径和/或模式应视所需结果而变化。在某些实施例中，活性化合物可用将会保护所述化合物以防快速释放的载剂来制备，例如控制释放调配物，包括植入物、透皮贴片和微囊化传递系统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述调配物的许多方法已获得专利权或一般为所属领域技术人员所知。参见例如持续和控制释放药物传递系统(Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems),J.R.罗宾森(J.R.Robinson)编,马塞尔戴克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,1978。
在某些实施例中，本文所述的抗GCC抗体分子或免疫偶联物可例如与惰性稀释剂或可吸收的可食用载剂一起经口投予。所述化合物(和必要时其它成分)也可封装于硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂、颊内片剂、锭锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉片等。为通过除不经肠投药以外的方式投予本发明的抗体或抗体片段，可能必需将化合物用防止其失活的物质包覆，或将化合物与防止其失活物质共投予。
可用此项技术中已知的医疗装置投予治疗组合物。举例来说，可将医药制剂安置在含有一个或一个以上剂量的装置(例如不透气或不透液容器)中。传递装置的实例包括(但不限于)小瓶、套管、针、滴液袋和管线。本发明也提供将本文所述的抗体分子或免疫偶联物放于所述装置中的方法。
在一些实施例中，本发明提供调配于脂质体组合物中的本文所述的抗GCC抗体分子或免疫偶联物。在一些实施例中，脂质体包覆有抗体分子。在一些所述实施例中，脂质体填充有治疗剂。脂质体传递可允许传递未与抗体连接的药剂，例如治疗剂。此方法可用于传递不适合与抗体分子交联的药剂(例如治疗剂)或将会螯合或与非目标细胞的接触应减到最少的药剂(例如治疗剂)。在特定实施例中，脂质体填充有细胞生长抑制剂或细胞毒性剂。在某些特定实施例中，治疗剂选自由以下组成的群组：类美登素、奥瑞他汀、海兔毒素、倍癌霉素、念珠藻环肽、紫杉烷、DNA烷化剂刺孢霉素和前述治疗剂的衍生物。在其它实施例中，脂质体填充有包含RNA干扰分子(例如反义分子、siRNA、hsRNA或miRNA分子)的核酸序列，其能够减少表达GCC的细胞中的GCC表达或另一基因(例如致癌基因)的表达。在一些其它实施例中，脂质体包覆或填充有包含抗GCC抗体分子和治疗剂或标记的免疫偶联物。
调整给药方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。举例来说，可投予单次剂量，可随时间投予数个分次剂量，或剂量可根据治疗情况的紧急性的指示按比例减少或增加。尤其宜调配呈单位剂型的不经肠组合物以便于投药和剂量均一。如本文所用的术语“单位剂型”是指适于作为单一剂量用于待治疗个体的物理个别单元；各单元含有经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需医药载剂。本发明的单位剂型的规格由以下因素指定或直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和打算达成的特定治疗作用，和(b)混配所述活性化合物以治疗个体敏感性的技术中固有的限制。
本发明的抗体或抗原结合片段的治疗或预防有效量的示范性非限制性范围为0.1-20mg/kg，或1-10mg/kg。应注意，剂量值可能随待缓和的病状的类型和严重性而变化。应进一步了解，对于任何特定个体，特定给药方案应根据个体需要和投予或监视组合物投予的人士的专业判断随时间进行调整，且本文所述的剂量范围仅为示范性的且不打算限制所主张组合物的范围或实践。
本发明的医药组合物可包括“治疗有效”量的本发明抗体或抗原结合片段。“治疗有效”量是指在必需剂量下且持续必需时间段有效达成所需治疗结果的量。经修饰抗体或抗体片段的治疗有效量可根据以下因素改变，例如疾病状态；个体的年龄、性别和体重；和抗体或抗体部分在个体中引发所需反应的能力。治疗有效量也是使经修饰抗体或抗体片段的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用的量。“治疗有效剂量”优选使所治疗个体中可测量的参数(例如肿瘤生长速率)相对于未治疗个体抑制至少约20％、至少约40％、至少约60％且在一些实施例中至少约80％。化合物抑制可测量参数(例如癌症)的能力可在预测在人类肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评估。或者，组合物的此特性可通过所属领域技术人员已知的分析检验化合物抑制(例如体外抑制)的能力来评估。
包含本文所述的抗GCC抗体分子或免疫偶联物的试剂盒也在本发明的范围内。进一步包括包含含有抗GCC抗体分子或免疫偶联物的脂质体组合物的试剂盒。试剂盒可包括一个或一个以上其它要素，包括：使用说明；其它试剂，例如标记、治疗剂或适用于使抗体螯合或以其它方式偶合于标记或治疗剂的试剂，或放射防护组合物；用于制备供投药的抗体的装置或其它物质；医药学上可接受的载剂；和用于投予个体的装置或其它物质。使用说明可包括关于抗GCC抗体分子或免疫偶联物在体外(例如在样品中，例如活检物或来自患有癌症的患者的细胞)或体内检测GCC的诊断应用的说明。所述说明可包括治疗应用的规则，包括例如患有癌症(例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌、胃癌、食道癌)的患者的建议投药剂量和/或模式。其它说明可包括关于使抗体与螯合剂、标记或治疗剂偶合的说明或关于例如自未反应的偶联组分纯化已偶联的抗体的说明。如上所述，试剂盒可包括标记，例如本文所述的任何标记。如上所述，试剂盒可包括治疗剂，例如本文所述的治疗剂。在一些应用中，抗体将与其它组分(例如螯合剂或标记或治疗剂，例如放射性同位素，例如钇或镥)反应。在所述情况下，试剂盒可包括一个或一个以上用于进行反应的反应容器或用于使最终产物与起始物质或反应中间物分离的分离装置(例如色谱柱)。
试剂盒可进一步含有至少一种其它试剂，例如诊断或治疗剂，例如本文所述的诊断或治疗剂，和/或一种或一种以上其它抗GCC抗体分子或免疫偶联物，其适当时调配于一种或一种以上独立医药制剂中。
试剂盒可进一步含有放射防护剂。已知同位素(例如90钇(90Y))的放射分解性质。为克服此放射分解作用，可例如在反应缓冲液中包括放射防护剂，只要所述放射防护剂为良性的即可，意谓其不会抑制或以其它方式不利地影响例如同位素(例如90Y)对抗体的标记反应。本发明的调配缓冲液可包括放射防护剂，例如人类血清白蛋白(HSA)或抗坏血酸盐，其使因钇或其它强放射性核素引起的放射分解作用减到最小。其它放射防护剂是此项技术中已知的且也可用于本发明的调配缓冲液中，即自由基清除剂(苯酚、亚硫酸盐、谷胱甘肽、半胱氨酸、龙胆酸、烟酸、棕榈酸抗坏血基酯、HOP(:O)H2I甘油、甲醛合次硫酸氢钠、Na2S2O.、Na2S2O3和SO2等)。
提供的试剂盒是适用于用治疗性放射性同位素对偶联螯合剂的蛋白质或肽进行放射性标记以供投予患者的试剂盒。试剂盒包括(i)含有偶联螯合剂的抗体的小瓶；(ii)含有调配缓冲液的小瓶，其用于使放射性标记的抗体稳定并投予患者放射性标记的抗体；和(iii)关于执行放射性标记程序的说明。试剂盒可供将偶联螯合剂的抗体在温和条件(例如说明中推荐的条件)下暴露于放射性同位素或其盐一段足够的时间量。产生的放射性标记的抗体具有足够纯度、比放射性和结合特异性。放射性标记的抗体可例如用调配缓冲液稀释到适当浓度，且在进行或不进行进一步纯化的情况下直接投予患者。偶联螯合剂的抗体可以冻干形式提供。
用途
本文所述的抗GCC抗体分子具有在体外和体内诊断、预后、成像、治疗和预防效用。举例来说，可将这些抗体分子例如在体外或离体投予培养中的细胞，或例如在体内投予个体，以治疗、预防和/或诊断多种病症。
本文所述的抗体分子、免疫偶联物和融合蛋白可用于调节GCC蛋白的活性或功能，例如配体结合(例如结合ST或鸟苷素)、GCC介导的信号转导、维持肠液、电解质体内平衡、细胞内钙释放(钙流出)、细胞分化、细胞增殖或细胞活化。
在一个方面中，本发明的特征在于一种杀灭、抑制或调节GCC表达细胞的生长或干扰GCC表达细胞的代谢的方法。在一个实施例中，本发明提供一种抑制GCC介导的细胞信号传导的方法或杀灭细胞的方法。所述方法可用于表达GCC的任何细胞或组织，例如癌性细胞(例如来自胃肠系统癌症，例如结肠、胃或食道癌症的细胞)或转移性病变。GCC表达细胞的非限制性实例包括T84人类结肠腺癌细胞、新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞和包含编码GCC或其部分的重组核酸的细胞。
本发明的方法包括如下步骤：使细胞与有效量(即足以抑制GCC介导的细胞信号传导的量或足以杀灭细胞的量)的如本文所述的抗GCC抗体分子或其免疫偶联物接触。所述方法可例如在体外、体内、离体或当场用于培养中的细胞。举例来说，可在体外在培养基中培养表达GCC的细胞(例如通过肿瘤或转移性病变的活检收集的细胞；来自建立的癌细胞系的细胞；或重组细胞)，且可通过向培养基中添加抗GCC抗体分子或免疫偶联物来实现接触步骤。在杀灭细胞的方法中，所述方法包含使用裸抗GCC抗体分子或包含抗GCC抗体分子和细胞毒性剂的免疫偶联物。所述方法将导致杀灭表达GCC的细胞，尤其包括表达GCC的肿瘤细胞(例如结肠肿瘤细胞)。
参考表7可充当选择用于各种方法的抗体的指南。举例来说，表7指示哪些抗体经证实在结合GCC之后内在化。所述抗体将在连接到细胞毒性部分或用于细胞成像的部分时适用。不内在化的抗体可用于诊断目的或使用设计用于引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应的裸抗体的治疗方法，或可能用于脂质体传递方法。
本发明的抗GCC抗体分子结合于表达GCC的细胞中的所述抗原的细胞外结构域或其部分。因此，当实施本发明的方法以杀灭、抑制或检测癌性细胞时，抗体或抗原结合片段结合于所有所述细胞，不仅结合于固定的细胞，还结合于细胞内抗原结构域以其它方式暴露于细胞外环境的细胞。因此，抗体或抗原结合片段的结合集中在存在表达GCC的细胞的区域，而与这些细胞固定抑或未固定、有活力抑或坏死无关。或者或另外，抗GCC抗体分子结合于GCC且在结合表达GCC的细胞时与所述抗原一起内在化。
所述方法也可对存在于个体中的细胞执行，作为体内方案的一部分。在一个实施例中，个体为人类个体。或者，个体可为表达与本文所揭示的抗GCC抗体分子交叉反应的GCC抗原的哺乳动物。可出于治疗目的向人类个体投予抗GCC抗体分子或其免疫偶联物。也可出于兽医目的或作为人类疾病的动物模型向表达与抗GCC抗体交叉反应的GCC样抗原的非人类哺乳动物(例如灵长类动物、猪或小鼠)投予抗GCC抗体分子或免疫偶联物。动物模型可适用于评估本发明抗体的治疗功效(例如测试投药的剂量和时间表)。对于体内实施例，接触步骤是在个体中实施，且包括在有效允许抗体分子结合在细胞上表达的GCC的细胞外结构域且允许处理所述细胞的条件下投予个体抗GCC抗体分子或其免疫偶联物。
在一个实施例中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其是通过投予需要所述治疗的患者抗GCC抗体分子或包含抗GCC抗体分子和细胞毒性剂的免疫偶联物来达成。所述方法可用于治疗包括至少一些表达GCC抗原的细胞的任何癌性病症。如本文所用的术语“癌症”意图包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。术语“癌症”与“肿瘤”可互换使用(例如，当在治疗方法的上下文中使用时，“治疗癌症”与“治疗肿瘤”具有相同含义)。
在实施例中，治疗足以减少或抑制个体肿瘤的生长，减小转移性病变的数目或尺寸，减少肿瘤负载，减少原发性肿瘤负载，降低侵袭性，延长存活时间，或维持或改良生活质量。
癌性病症的实例包括(但不限于)实体肿瘤、软组织肿瘤和转移性病变。实体肿瘤的实例包括各种器官系统的恶性疾病，例如肉瘤、腺癌和癌瘤，例如影响结肠和胰腺的恶性疾病。腺癌包括例如非小细胞肺癌等恶性疾病。上述癌症的转移性病变也可使用本发明的方法和组合物进行治疗或预防。在一些实施例中，待治疗的癌症为胃肠系统的癌症(例如结肠直肠癌、食道癌或胃癌)。在一些实施例中，胰腺癌。
在一个实施例中，癌症为结肠直肠癌，例如结肠直肠腺癌、结肠直肠平滑肌肉瘤、结肠直肠淋巴瘤、结肠直肠黑色素瘤或结肠直肠神经内分泌肿瘤。在一个特定实施例中，癌症为转移性结肠癌。在另一个实施例中，癌症为胃癌(例如胃腺癌、淋巴瘤或肉瘤)或其转移。在另一个实施例中，癌症为食道癌(例如食道的鳞状细胞癌或腺癌)。
所述方法可适用于治疗任何分期或子类的相关病症。举例来说，方法可用于治疗早期或晚期结肠癌，或0、I、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IIIC和IV期中任一者的结肠癌。
在一些实施例中，治疗癌症(例如结肠直肠癌、食道癌或胃癌)的方法包含投予需要所述治疗的患者本文所述的裸抗GCC抗体分子。在其它实施例中，所述方法包含投予包含本文所述的抗GCC抗体分子和细胞毒性剂的免疫偶联物。在一些所述实施例中，免疫偶联物的特征为如本文所述的式(I)。在某些实施例中，免疫偶联物的特征为如本文所述的式(I-1)、(I-2)、(I-3)、(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)。在特定实施例中，免疫偶联物的特征为式(I)、(I-1)、(I-2)、(I-3)、(I-4)、(I-5)、(I-6)或(I-7)，其中变量Ab为具有表1到表6中所概述的特征的抗体分子。在某些实施例中，变量Ab为5F9抗体分子或Abx-229抗体分子。在某些特定实施例中，免疫偶联物的特征为式(I-5)或(I-7)，其中变量Ab为5F9抗体分子。
投予抗体分子和免疫偶联物的方法如上文所述。所用分子的适合剂量将取决于个体的年龄和体重以及所用特定化合物。
在一些实施例中，抗GCC抗体分子或免疫偶联物是以治疗循环投予。“治疗循环”由以下组成：治疗期，在此期间如上文所述投予抗GCC抗体分子或免疫偶联物；随后为中止期，在此期间不投予抗GCC抗体分子或免疫偶联物。可视需要重复治疗循环以达成所需效果。
本文所述的抗GCC抗体(例如裸抗GCC抗体分子或包含抗GCC抗体分子和治疗剂的免疫偶联物)可与其它疗法组合使用。举例来说，组合疗法可包括与一种或一种以上其它治疗剂(例如一种或一种以上抗癌剂，例如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)、激素治疗、疫苗和/或其它免疫疗法共调配和/或共投予本发明的组合物。在其它实施例中，抗GCC抗体与其它治疗性治疗形式(包括手术、辐射、冷冻手术和/或热疗法)组合投予。所述组合疗法宜使用较低剂量的所投予治疗剂，从而避免与各种单药疗法有关的可能毒性或并发症。
如本文所用的“组合”投予意谓在个体罹患病症的过程中将两种(或两种以上)不同治疗传递到个体，例如在个体已诊断患有病症之后且在所述病症治愈或消除之前传递两种或两种以上治疗。在一些实施例中，一种治疗的传递在第二治疗的传递开始时仍存在，因此存在重叠。有时本文中将此称作“同时”或“共同传递”。在其它实施例中，一种治疗的传递在另一治疗传递开始之前结束。在任一情况的一些实施例中，治疗因组合投药而更有效。举例来说，相较于在无第一治疗存在下投予第二治疗时将观察到的情形，第二治疗更有效，例如同等效果利用较少第二治疗就能观察到，或第二治疗在较大程度上减少症状；或利用第一治疗观察到类似情形。在一些实施例中，传递使得症状减少或与病症有关的其它参数大于在无另一治疗存在下传递一种治疗所观测到的参数。两种治疗的作用可部分加和，完全加和或大于加和。传递可使得所传递第一治疗的作用在传递第二治疗时仍可检测。
在一些实施例中，抗GCC抗体分子或其免疫偶联物与化学治疗剂组合使用。损伤DNA的化学治疗剂的非限制性实例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、拓朴替康、喜树碱和其类似物或代谢物，和多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷和道诺霉素)；烷化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、塞替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、氮烯唑胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如顺铂、奥赛力铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基产生剂(例如博来霉素)；和核苷模拟物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitibine)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀和羟基脲)。
干扰细胞复制的化学治疗剂包括：太平洋紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春新碱、长春花碱(vinblastin)和相关类似物；沙力度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和相关类似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)和吉非替尼(gefitinib))；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))；NF-κB抑制剂，包括IκB激酶的抑制剂；结合于在癌症中过度表达的蛋白质且由此下调细胞复制的抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗(bevacizumab))；和已知在癌症中上调、过度表达或活化的蛋白质或酶的其它抑制剂，其抑制作用下调细胞复制。
打算与本发明的抗GCC抗体分子或免疫偶联物组合的治疗剂或治疗形式的选择将取决于待治疗的病症。其它药剂或治疗形式可包括例如批准用于所治疗的适应症的标准疗法。举例来说，当使用抗GCC抗体分子或其免疫偶联物来治疗结肠癌时，其可与以下组合使用：例如手术；辐射疗法；5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥赛力铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumum)或其组合(例如奥赛力铂/卡培他滨(XELOX)、5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/奥赛力铂(FOLFOX)、5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/伊立替康(FOLFIRI)、FOLFOX加贝伐单抗或FOLFIRI加贝伐单抗)。
在另一个方面中，本发明的特征在于本文所述的抗GCC抗体分子或免疫偶联物用于制造药物的用途。在一个实施例中，所述药物是用于治疗癌症，例如胃肠癌症。在一些实施例中，药物包含具有表1-6中所概述的特征的抗GCC抗体分子。在一些实施例中，药物包含5F9抗体分子或Abx-229抗体分子。
本文所述的抗GCC抗体和免疫偶联物可用于检测GCC的存在，例如检测生物样品中GCC的存在，或检测个体中GCC的存在或分布。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。如本文所用的检测GCC或GCC蛋白意谓检测完整GCC蛋白或检测GCC蛋白中包含抗GCC抗体分子所结合的表位的部分。
因此，在另一个方面中，本发明的特征在于一种检测GCC蛋白，例如检测表达GCC的细胞或组织(例如肿瘤细胞)或具有表达GCC的细胞的肿瘤的方法。所述方法包含：使表达GCC的物质(例如细胞或组织，例如肿瘤的样品)与抗GCC抗体分子(例如本文所述的抗GCC抗体分子)在允许抗GCC抗体分子与GCC蛋白之间形成复合物的条件下接触；和检测抗体分子与GCC蛋白之间复合物的形成，由此检测GCC蛋白的存在，例如检测表达GCC的细胞或肿瘤。
在一个实施例中，抗GCC抗体分子为一种包含可检测标记的免疫偶联物。
在某些实施例中，所述组织包括正常组织和/或相对于其它组织(例如B细胞和/或B细胞相关组织等其它组织)以较高水平表达GCC的癌性组织。
可使用本文所述的体外或体内检测方法评估个体。在一个实施例中，所述方法是在体内执行且可用于例如对患者进行成像、分期、评估或诊断。在某些实施例中，病症为细胞增殖病症，例如癌症或肿瘤，例如结肠癌。
因此，在另一个方面中，本发明提供一种用于在体外(例如，在例如来自肿瘤组织、来自个体的生物样品中，例如组织活检样品)或体内(例如通过在个体中进行体内成像)检测GCC蛋白的方法。所述方法包含：(i)使样品与抗GCC抗体分子或其免疫偶联物接触，或投予个体抗GCC抗体分子或其免疫偶联物；和(ii)检测抗GCC抗体分子与GCC蛋白之间复合物的形成。复合物形成指示GCC的存在或含量。
在实施例中，将样品或个体中所检测到的复合物的含量与参考值(例如复合物形成的值或GCC的含量)相比较。在一个实施例中，超过参考值的GCC含量指示GCC介导的病症。
在一个实施例中，所述方法包含使参考样品，例如对照样品(例如对照生物样品，例如血浆、组织、活检物)或对照个体)与抗GCC抗体分子或其免疫偶联物接触，且将其中所检测到的复合物含量与在样品或个体中所检测到的含量相比较。
在某些实施例中，自怀疑患有与GCC表达增加有关的病症的个体获得测试细胞或组织。
在一个实施例中，将来自个体的样品中或个体中的GCC含量与参考含量相比较，所述参考含量为例如对照物质(例如与个体细胞具有相同组织来源的正常细胞，或GCC含量与所述正常细胞相当的细胞)中的GCC含量。所述方法可包含例如对检测到的含量的GCC作出反应，由此提供对病症的诊断、预后、治疗功效评估或分期。相较于对照物质，样品或个体中的GCC含量较高表明存在与GCC表达增加有关的病症。相较于对照物质，样品或个体中的GCC含量较高也可表明对疾病的治疗功效相对缺乏、预后相对不良或疾病处于较晚期。GCC的含量也可用于评估或选择将来的治疗，例如需要侵袭性较强或较弱的治疗、或需要由一种治疗方案换为另一治疗方案。
GCC的含量也可用于选择或评估患者。举例来说，在实施例中，肿瘤细胞表面表达大量GCC的患者将被认为是用偶联毒素的抗GCC抗体分子治疗的良好候选者。在实施例中，肿瘤细胞表面表达少量GCC的患者将不作为此疗法的良好候选者，或可能是抗GCC抗体分子与另一治疗方法组合的候选者，或为裸抗体疗法的候选者。在另一实例中，可调整偶联毒素的抗GCC抗体分子的剂量以反映在肿瘤细胞表面上表达的GCC分子的数目。肿瘤细胞表面上具有大量GCC分子的患者相较于具有少量GCC分子的患者可用较低剂量治疗。体内检测表达GCC的肿瘤细胞的存在可允许鉴别原发性GCC表达肿瘤所转移到的组织。了解哪些组织具有转移可引起肿瘤疗法的靶向应用。
如上文所论述，本文所述的抗体分子允许评估正常与致瘤性组织中GCC蛋白的存在，经由所述评估可对疾病的存在或严重性、疾病发展和/或疗法的功效进行评估。举例来说，可对疗法进行监测且对功效进行评估。在一个实例中，可检测和/或测量自患有发炎性疾病的个体获得的第一样品中的GCC蛋白且可起始疗法。随后，可自所述个体获得第二样品，且可检测和/或测量所述样品中的GCC蛋白。在第二样品中检测或测量到的GCC蛋白的量的减少可指示治疗功效。
可使用本文所揭示的抗体评估(例如诊断)的示范性细胞增殖病症包括增生性病症，包括(但不限于)结肠癌、胃癌、食道癌。
在某些实施例中，方法(例如上述方法)包含检测抗GCC抗体与在细胞表面上表达或自表面上表达GCC的细胞获得的膜制剂中的GCC的结合。在某些实施例中，所述方法包含使细胞与抗GCC抗体在允许抗GCC抗体结合于GCC的条件下接触，和检测抗GCC抗体与细胞表面上的GCC之间是否形成复合物。用于检测抗GCC抗体与在细胞表面上表达的GCC的结合的示范性分析为“FACS”分析。
用于本文所述方法的示范性样品包含组织或体液，例如炎性渗出物、血液、血清、肠液、粪便样品或活检物。在一个实例中，可自个体获得样品(例如组织和/或体液)且可使用适合免疫学方法检测和/或测量GCC蛋白表达。用于检测或测量GCC蛋白表达的适合免疫学方法包括酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)、放射免疫分析、免疫组织学、流式细胞术等。
本文所述方法(例如体内和体外检测法，例如诊断、分期或成像方法)中所用的抗GCC抗体分子可直接或间接用可检测物质标记以便检测结合或未结合的结合剂。适合的可检测物质包括各种生物活性酶、配体、辅基、荧光物质、发光物质、化学发光物质、生物发光物质、发色团物质、电子致密物质、顺磁(例如核磁共振活性)物质和放射性物质。在一些实施例中，抗GCC抗体分子偶合于放射性离子，例如铟(111In)、碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、铋(212Bi或213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铑(188Rh)、锝(99mTc)、镨或磷(32P)；或发射正电子的放射性核素，例如碳-11(11C)、钾-40(40K)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)和碘-121(121I)。
示范性标记包括荧光团，例如稀土螯合物或荧光素和其衍生物；若丹明和其衍生物；丹磺酰基；伞酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)；萤火虫荧光素；和2,3-二氢酞嗪二酮。其它示范性标记包括辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；与使用过氧化氢来氧化染料前体的酶(例如HRP)偶合的杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶；乳过氧化酶或微过氧化酶；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基等。
经荧光团和发色团标记的抗体分子可由此项技术中已知的标准部分制备。因为抗体和其它蛋白质吸收波长高达约310nm的光，所以应选择在高于310nm且优选高于400nm的波长下具有大量吸收的荧光部分。斯代尔(Stryer),科学,162:526(1968)和布兰德L.(Brand,L.)等人,生物化学年评,41:843-868(1972)描述了多种适合的荧光化合物和发色团。可通过常规程序(例如美国专利第3,940,475号、第4,289,747号和第4,376,110号中所揭示的程序)用荧光发色团标记抗体。
具有上述多种所需特性的一组荧光剂为呫吨染料，其包括衍生自3,6-二羟基-9-苯基呫吨醇(xanthhydrol)的荧光素和瑞沙明(resamine)，以及衍生自3,6-二氨基-9-苯基呫吨醇的若丹明和丽丝胺若丹明B(lissanime rhodamine B)。9-邻羧基苯基呫吨醇的若丹明和荧光素衍生物具有9-邻羧基苯基。易于获得具有反应性偶合基团(例如氨基和异硫氰酸酯基)的荧光素化合物，例如异硫氰酸荧光素和荧光胺(fluorescamine)。另一组荧光化合物为萘胺，其在α位或β位具有氨基。
经标记抗体分子可例如在诊断上和/或实验上用于多种情形，包括(i)通过标准技术(例如亲和色谱或免疫沉淀)分离预定抗原；(ii)检测预定抗原(例如在细胞溶胞物或细胞上清液中)以评估蛋白质表达的丰度及模式；(iii)监测组织中的蛋白质含量，作为临床测试程序的一部分，例如以确定指定治疗方案的功效。
可使用某些其它方法来检测抗GCC抗体与GCC的结合。所述方法包括(但不限于)此项技术中已知的抗原结合分析，例如蛋白质印迹法(western blot)、放射免疫分析、ELISA(酶联结免疫吸附剂分析)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析和免疫组织化学(IHC)。
抗GCC抗体分子与GCC之间复合物的形成可通过测量或观测结合于GCC抗原的抗体(或抗体片段)或未结合的抗体分子来检测。可使用常规检测分析，例如蛋白质印迹法、放射免疫分析、ELISA(酶联结免疫吸附剂分析)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析和免疫组织化学(IHC)或放射免疫分析(RIA)。
作为对抗GCC抗体分子进行标记的替代，可通过竞争免疫分析，利用经可检测物质标记的标准物和未标记的抗GCC抗体分子来分析样品中GCC的存在。在此分析中，将生物样品、经标记标准物和GCC结合剂组合且测定结合于未标记抗体的经标记标准物的量。样品中GCC的量与结合于GCC结合剂的经标记标准物的量成反比。
也有可能在不对任一组分(GCC或抗体分子)进行进一步操作或标记情况下，例如通过利用荧光能量传递(FET，参见例如拉科维兹(Lakowicz)等人,美国专利第5,631,169号；斯塔维诺普洛斯(Stavrianopoulos)等人,美国专利第4,868,103号)的技术直接检测GCC与抗GCC抗体分子复合物的形成。选择第一“供体”分子上的荧光团标记以致在用适当波长的入射光激发时其发射的荧光能量将被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，所述第二“受体”分子上的荧光标记又因所吸收的能量而能够发荧光。或者，“供体”蛋白质分子可简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，由此可区别“受体”分子标记与“供体”的标记。因为各标记之间的能量传递效率与分子的间隔距离有关，所以可评估分子之间的空间关系。在分子之间存在结合的情况下，分析中“受体”分子标记的荧光发射应最大。FET结合事件宜经由此项技术中众所周知的标准荧光测定检测方式(例如使用荧光计)进行测量。
在另一个实施例中，测定抗体分子识别GCC的能力可在不对任一分析组分(GCC或抗体分子)进行标记的情况下通过利用例如即时生物分子相互作用分析(BiomolecularInteraction Analysis，BIA)(参见例如修兰德S.(Sjolander,S.)和乌班斯基C.(Urbaniczky,C.),1991,分析化学,63:2338-2345；和萨博(Szabo)等人,1995,结构生物学新见(Curr.Opin.Struct.Biol.)5:699-705)的技术来完成。如本文所用的“BIA”或“表面等离子共振”是用于在不对任何相互作用物进行标记的情况下即时研究生物特异性相互作用的技术(例如BIACORETM)。结合表面的质量变化(指示结合事件)使表面附近的光的折射率改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，产生可用作生物分子之间即时反应的指示的可检测信号。
在另一个实施例中，本发明提供一种用于体内检测表达GCC的肿瘤组织的存在的方法。所述方法包括(i)投予个体(例如患有癌症的患者)抗GCC抗体或其抗原结合片段，优选偶联于可检测标记或标记物的抗体或其抗原结合片段；(ii)使个体暴露于用于检测表达GCC的组织或细胞的所述可检测标记或标记物的构件。
根据本发明，适用于诊断成像的标记的实例为放射性标记，例如131I、111In、68Ga、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C和188Rh；荧光标记，例如荧光素和若丹明；核磁共振活性标记；可通过单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography，“SPECT”)检测器或正电子发射断层显像(positron emission tomography，“PET”)扫描仪检测的发射正电子的同位素；化学发光剂，例如萤火虫荧光素；和酶标记物，例如过氧化酶或磷酸酶。也可使用短程辐射发射体，例如可通过短程检测探针(例如经直肠探针)检测的同位素。可使用此项技术中已知的技术用所述试剂标记抗体。举例来说，关于与抗体的放射性标记有关的技术，参见文赛尔(Wensel)和米尔斯(Meares)(1983)放射免疫成像与放射免疫疗法(Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy),爱思唯尔出版社(Elsevier),纽约。也参见D.寇彻(D.Colcher)等人,酶学方法,121:802-816(1986。
在放射性标记的抗体的情况下，向患者投予所述抗体，所述抗体定位于具有与所述抗体反应的抗原的肿瘤，且使用已知技术(例如，使用例如γ相机进行的放射性核素扫描，或发射断层显像法，或计算机断层显像法)进行体内检测或“成像”。参见例如A.R.布拉德威尔(A.R.Bradwell)等人,“抗体成像的发展(Developments in Antibody Imaging)”,用于癌症检测和疗法的单克隆抗体,R.W.博得韦等人,(编),第65-85页(学术出版社,1985)。或者，可使用正电子发射横轴断层显像扫描仪(例如位于布鲁克赫文国家研究所(Brookhaven National Laboratory)的指定Pet VI)，其中放射性标记发射正电子(例如，11C、18F、15O和13N)。
在其它实施例中，本发明提供用于确定当投予个体(例如人类个体)偶联到放射性同位素的抗GCC抗体分子时不同组织所暴露的剂量(例如辐射剂量)的方法。所述方法包括：(i)投予个体经放射性同位素标记的本文所述的抗GCC抗体分子，例如抗GCC抗体分子；(ii)测量各个时间点位于不同组织(例如肿瘤)或血液中的放射性同位素的量，直到放射性同位素中的一些或全部已自个体体内去除；和(iii)计算所分析的每一组织所接受的总辐射剂量。测量可在预定时间点，例如投予个体放射性标记的抗GCC抗体分子(第0天)后第1天、第2天、第3天、第5天、第7天和第12天进行。指定组织中所存在的放射性同位素的浓度随时间进行积分且乘以放射性同位素的比放射性的结果可用于计算指定组织所接受的剂量。使用经一种放射性同位素(例如γ-发射体，例如111In)标记的抗GCC抗体分子产生的药理学信息可用于计算相同组织将自可能不易测量的不同放射性同位素(例如β-发射体，例如90Y)接受的预期剂量。
抗GCC抗体序列
抗GCC抗体是通过若干方法产生，所述方法更详细地论述于实例中。简单说来，小鼠单克隆抗体3G1 8F1和10B8是通过传统免疫技术在常规小鼠中产生。人类单克隆抗体1D2、5F9、5H3、6H8、8C2和10C10是使用产生完全人类IgG2抗体的转基因小鼠，利用艾伯吉尼斯公司XENOMOUSE转基因技术产生，且使用杂交瘤技术分离。人类mAb Abx-012、mAb Abx-020、mAb Abx-106、mAb Abx-198、mAb Abx-221、mAb Abx-229、mAb Abx-338和mAb Abx-393是使用产生完全人类IgG2抗体的转基因小鼠产生。单一抗体是使用艾伯吉尼斯公司SLAM技术分离。这些都用于制备完全人类IgG1抗体。抗体针对GCC的特异性是通过ELISA和流式细胞术(FCM)测试。选择所产生的抗体的子集以供进一步表征。
下表1概述若干种抗GCC抗体的抗体名称、用于产生所述抗体的免疫原、所用动物、来源、物种和同型分离株。
表1
测定轻链和重链可变区的序列。下表2为若干种抗体的可变区的SEQ ID NO的概述。表3和表4分别显示鼠类和人类抗GCC抗体的重链和轻链各自的可变区的氨基酸和核酸序列。
表5和表6分别显示抗GCC抗体的重链和轻链的各CDR的氨基酸和核酸序列。
举例来说，表3第9行说明mAb 5F9的成熟重链可变区的编码的氨基酸序列(SEQ IDNO:18)；且表4第9行描述编码mAb 5F9的成熟重链可变区的核酸序列(SEQ ID NO:17)。表5第25-27行分别描述mAb 5F9重链CDR(CDR)1的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:106)、CDR2的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:108)和CDR3的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)；且表6第25-27行分别显示mAb 5F9重链CDR1的核酸序列(SEQ ID NO:105)、CDR2的核酸序列(SEQID NO:107)和CDR3的核酸序列(SEQ ID NO:109)。
表3第10行说明mAb 5F9的成熟轻链可变区的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)；且表4第10行描述编码mAb 5F9的成熟κ轻链可变区的核酸序列(SEQ ID NO:19)。表5第28-30行分别描述mAb 5F9轻链CDR(CDR)1的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:112)、CDR2的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:114)和CDR3的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:116)；且表6第28-30行分别显示mAb 5F9轻链CDR1的核酸序列(SEQ ID NO:111)、CDR2的核酸序列(SEQ IDNO:113)和CDR3的核酸序列(SEQ ID NO:115)。
CDR的定序允许测定可用作毒素偶联位点的残基的丰度。抗原结合区中的未配对游离半胱氨酸可为奥瑞他汀偶联位点且赖氨酸可为美登素偶联位点。毒素偶联于CDR的氨基酸将产生改变抗体对GCC的结合亲和力的问题。因此，在实施例中，CDR缺乏可偶联于治疗剂的氨基酸。
表2.单克隆抗体可变区的SEQ ID NO的概述
表3.mAb可变区的氨基酸序列
表4.mAb可变区的核酸序列
表5：CDR的氨基酸序列
表6.CDR的核酸序列
如上文所述产生表达载体，其含有mAb 5F9和Abx-229各自的重链与轻链的编码序列。
本发明通过以下实例来说明，所述实例不应视为进一步限制本发明。
实例
实例1：抗GCC抗体的产生和表征
如下产生用于免疫和筛选的GCC蛋白。通过将GCC基因中编码包含以下GCC序列(信号序列和细胞外结构域)的序列的部分亚克隆到表达载体中来制备GCC抗原。
表达载体(pLKTOK107)提供C末端IgG1Fc区以与GCC序列融合。此载体包含外显子，其中IgG1铰链、CH2和CH3结构域经突变以消除此外显子中CH1片段的未配对半胱氨酸。此IgG1Fc区在赖氨酸235和甘氨酸237处进一步突变为丙氨酸。所述构筑体在用SV40T-抗原基因转染的人类胚肾(HEK)293细胞中重组表达为与C末端人类IgG1Fc融合的分泌型GCC序列(SEQ ID NO:228的氨基酸残基24到430)的形式。通过蛋白质A色谱法和尺寸排阻色谱法纯化所述蛋白质(称作TOK107-hIg，又名hGCC-ECD/hIgG1Fc，SEQ ID NO:317)。
也通过将上述融合蛋白亚克隆到允许鼠类IgG2a跨膜区融合到C末端上的表达载体(例如pLKTOK111)中来制备GCC抗原。当在CHO细胞中重组表达此构筑体时，在细胞表面上检测到GCC细胞外结构域。当pLKTOK111载体与包含鼠类CD79a(MB-1)和CD79b(B29)的pLKTOK123共转染时，实现GCC-Ig融合蛋白(SEQ ID NO:318)的高细胞表面表达。使用来自此转染的克隆#27(CHO-GCC#27)作为免疫原。也使用HT-29-GCC#2细胞作为免疫原。
为利用ELISA筛选杂交瘤上清液和纯化的mAb，将编码GCC融合构筑体的核酸克隆到pCMV1表达载体(西格玛公司(Sigma))中。也将纯化标签：FLAG标签(在N末端中)和His标签(在C末端中)克隆到构筑体中。将融合蛋白构筑体转染到293细胞中，表达，且用抗M2-琼脂糖亲和柱(西格玛公司)对重组蛋白进行纯化。
试剂和细胞系。HEK293细胞、CHO和T84人类结肠癌细胞是从ATCC获得并根据ATCC方案维持。
小鼠：雌性C57BL/6小鼠(4-6周龄)是购自塔康农场公司(Taconic Farms,Inc.)(纽约州杰曼敦(Germantown,NY))，用于产生鼠类杂交瘤。室内饲养到4-6周龄且产生人类IgG2抗体的异种小鼠(Xenomice)是从艾伯吉尼斯公司(加利福尼亚州佛力蒙)获得，用于产生人类杂交瘤。所有动物都是根据千年制药公司的研究动物照护与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的准则获得和维持。
细胞系：用于功能分析的细胞系为GCC转染细胞和载体对照HEK293或HT29细胞的细胞对。用受EF-1α启动子控制的全长GCC或用空载体(pLKTOK4)转染HT29细胞且于G418中选择。经证实，这些细胞中的GCC当与ST肽(1-18或5-18)接触时具有cGMP反应。用受CMV启动子控制的全长GCC或用空载体(pN8mycSV40)转染HEK293细胞且于杀稻瘟菌素(blasticidin)中选择。这些细胞中的GCC具有myc标签。所选最高GCC表达的克隆为293-GCC#2、HT29-GCC#2和HT29-GCC#5。也使用HT29-GCC#2作为产生抗GCC抗体分子的免疫原。其它GCC表达细胞为CT26细胞。为产生表达GCC的CT26细胞系，使用pTOK58D载体。将全长GCC克隆到通常用于重链克隆的位点中，且将荧光素酶克隆到通常用于轻链克隆的位点中。转染到CT26细胞中后，证实GCC与荧光素酶都独立表达。通过流式细胞术，使用5F9抗体证实GCC的表面表达。选择克隆#32用于进一步研究。
T84结肠癌细胞系内源性表达GCC。在一大组细胞系中对GCC进行的塔克曼(Taqman)分析揭示，T84是唯一表达GCC的mRNA的细胞系。在T84细胞的细胞小球上用GCC选择性mAb对GCC染色显示显著GCC蛋白表达。
用放射性标记的配体(ST-毒素)对GCC受体含量进行的定量表明，293-GCC#2细胞所表达的GCC多于T84细胞，而HT29-GCC#2或#5每个细胞表达的GCC分子最少。
通过蛋白质免疫产生鼠类mAb：将人类GCC细胞外结构域/人类Ig融合蛋白(TOK107-hIg，50μg)悬浮于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco's phosphatebuffered saline)(PBS；吉博公司，纽约州格兰德岛(Grand Island,NY))中且用等体积完全傅氏佐剂(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))乳化。通过在三个皮下部位和一个腹膜内(i.p.)部位注射所述乳液来对C57BL/6小鼠进行免疫。初始免疫后两周，用含25μg TOK107-hIg的不完全傅氏佐剂对小鼠进行腹膜内增强免疫。一周后，自尾静脉收集少量血液且通过ELISA滴定针对TOK107-Ig的血清结合活性。选择效价超过1:24,300(通过ELISA)或1:500(通过FACS)的小鼠用于融合。通过注射含25μgTOK107-hIg的PBS对所选小鼠进行增强免疫。四天后，对一只小鼠实施安乐死，并制备脾细胞悬浮液且用PBS洗涤以供与P3细胞融合。一个月后，准备来自另一只小鼠的脾细胞以供与P3细胞融合。测试融合细胞中特异性结合于GCC的抗体的产生，其中对于与非GCC抗原或与IgG的Fc区相比较测试与TOK107-hIg的结合通过ELISA进行，且对于与载体对照组相比较和与不表达GCC的MCF-7细胞相比较测试与T84细胞或Caco-2细胞或HT-29克隆#2细胞的结合通过FACS进行。使用小鼠单克隆抗体同型分析试剂盒(德国曼海姆罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics Mannheim Germany))确定同型。这些免疫方案和杂交瘤融合物产生1D3、8E12、3G1和10B8鼠类抗GCC抗体分子。
产生人类mAb。对XENOMOUSE遗传工程改造小鼠(艾伯吉尼斯公司；加利福尼亚州佛力蒙)(8到10周龄)进行免疫以产生人类单克隆抗体。参见门德兹(Mendez)等人,自然遗传学(Nature Genetics)15:146-156(1997)；格林(Green)和雅各布维(Jakobovits)实验医学杂志(J.Exp.Med.)188:483-495(1998)。使用若干种免疫方案。在一种方案中，将100微克人类GC-C细胞外结构域/人类Ig融合蛋白(TOK107-hIg)悬浮于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理盐水(PBS；吉博公司，纽约州格兰德岛)中且用等体积完全傅氏佐剂(西格玛化学品公司，密苏里州圣路易斯)乳化。通过在三个皮下部位、尾基部和一个腹膜内(i.p.)部位注射所述乳液来对XENOMOUSETM进行免疫。初始免疫后14天，用含50μg TOK107-hIg的不完全傅氏佐剂对小鼠进行增强免疫。血清测试指示效价不足，故在中止数周后，给与50μg人类TOK107-hIg进行第二次增强免疫。两周后，自尾静脉收集少量血液，并通过ELISA滴定针对TOK107-Ig的血清活性且通过FACS滴定针对HT29-GCC#2细胞的血清活性。选择效价超过1:24,300(通过ELISA)或1:500(通过FACS)的小鼠用于融合。增强免疫后约三个月，用含107个HT29#2细胞的不完全傅氏佐剂对小鼠进行增强免疫，且次日用含50μg TOK107-hIg的不完全傅氏佐剂进行增强免疫。用此方案免疫的小鼠产生5F9和1D2人类抗GCC抗体分子。用此方案免疫的小鼠产生5F9和1D2人类抗GCC抗体分子。
四天后，对所述小鼠实施安乐死，并制备脾细胞悬浮液且用PBS洗涤以进行融合。测试融合细胞中特异性结合于GCC的抗体的产生，其中对于与非GCC抗原或与IgG的Fc区相比较测试与TOK107-hIg的结合通过ELISA进行，且对于与载体对照组相比较和与不表达GCC的MCF-7细胞相比较测试与T84细胞或HT-29克隆#2细胞的结合通过FACS进行。使用ELISA或通过FACS使用IgG或IgM特异性二次抗体确定同型。用此方案免疫的小鼠产生5F9和1D2人类抗GCC抗体分子。
在另一方案中，两次使用包含pkTOK111载体且在表面上表达GCC细胞外结构域的CHO-GCC#27细胞(5×106个)作为免疫原，其中BIP(尾基部+腹膜内)免疫之间间隔两周。在进行血液取样以通过ELISA鉴别针对TOK107-hIg的抗GCC反应性之后，用HT-29GCC#2细胞对小鼠进行增强免疫(前一次增强免疫之后三周或超过两个月)。最后一次增强免疫之后四天，收集相应的以进行细胞融合。测试融合细胞中特异性结合于GCC的抗体的产生，其中对于与非GCC抗原或与IgG的Fc区相比较测试与TOK107-hIg的结合通过ELISA进行，且对于与载体对照组、T84细胞或不表达GCC的MCF-7细胞相比较测试与HT-29克隆#2细胞的结合通过FACS进行。使用ELISA确定同型。这些免疫方案和杂交瘤融合物产生5H3、6H8、8C2、10C10、10D3和1C9人类抗GCC抗体分子。
产生人类mAb的杂交瘤：对脾细胞进行计数且将其与不能分泌重链或轻链免疫球蛋白链的SP 2/0骨髓瘤细胞(ATCC编号CRL8-006，马里兰州洛克威尔(Rockville,MD))以2:1的脾:骨髓瘤比率混合。根据标准程序使细胞在聚乙二醇1450(ATCC)存在下，于12个96孔组织培养板中，在HAT选择培养基中融合。在融合之后10天与21天之间，杂交瘤集落变得可见，且收集培养物上清液，随后通过ELISA和FACS进行筛选。
基于SLAM技术的抗体产生：也通过艾伯吉尼斯公司的SLAM技术(巴布库克等人,美国国家科学院院刊,93:7843-7848(1996))分离单克隆抗体。此方法的初始步骤是通过下述方案中的一种用GCC抗原对XENOMOUSE小鼠进行免疫。随后SLAM(选择淋巴细胞抗体法)步骤涉及首先在一大群淋巴细胞内鉴别产生具有所需特异性或功能的抗体的单个淋巴细胞，随后自所述淋巴细胞获取编码所述抗体特异性的遗传信息。扩增所述淋巴细胞(最初产生IgG2或IgG4抗体)的可变区且转移到具有IgG1同型的载体中。
SLAM抗体(例如Abx-229、-012、-221、-020、-338、-106、-198或-393)的免疫方案包括使用偶联于匙孔螺血氰蛋白的TOK-hIg或TOK-hIg。免疫是经由足垫或尾基部与腹膜内的组合进行。用10μg免疫原的初始免疫包括金佐剂或完全傅氏佐剂。使用矾、金佐剂或不完全傅氏佐剂，用5μg免疫原执行六到八次增强免疫。如果TITERMAX金为初始佐剂，那么矾为增强佐剂且以3到4天的间隔进行增强免疫。如果初始免疫和增强免疫依序使用完全傅氏佐剂和不完全傅氏佐剂，那么所执行的增强免疫之间的时间间隔为约两周。在第四次到第六次增强免疫时的效价的血清测试之后有时再进行增强免疫。四天后在收集之前的最后一次增强免疫使用含免疫原的PBS。
通过ELISA分析mAb。用每孔50μl的2μg/ml TOK107-hIg溶液(每孔0.1μg TOK107-hIg)涂布高蛋白质结合96孔EIA板(科斯塔(Costar)/康宁公司(Corning,Inc.)，纽约州康宁(Corning,NY))且在4℃下培育过夜。吸出过量溶液且用PBS/0.05％吐温-20(Tween-20)洗涤板(三次)，随后在室温(RT)下用1％牛血清白蛋白(BSA，部分V，西格玛化学品公司，密苏里州)阻断1小时以抑制非特异性结合。移除BSA溶液，且每孔添加50μl来自每一融合物板孔的杂交瘤上清液。随后在37℃下培育板45分钟且用PBS/0.05％吐温-20洗涤三次。向各孔中添加在1％BSA/PBS中以1:4000稀释的偶联辣根过氧化酶(HRP)的山羊抗小鼠或抗人类IgG F(ab)2(H&L公司)(杰克森研究实验公司(Jackson Research Laboratories,Inc.)，宾夕法尼亚州西格里夫(West Grove,PA))，随后在37℃下培育板45分钟。洗涤后，每孔添加50μl ABTS溶液(今迈公司(Zymed)，加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco,CA))。在威曼斯(Vmax)微量滴定板读取器(分子装置公司(Molecular Devices Corp.)，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))上评估在405nm下阳性孔的绿色的强度。随后将所有提供阳性反应的杂交瘤孔扩增成24孔培养物，通过限制稀释进行亚克隆且通过ELISA和FACS进行分析。进一步扩增三个最佳产生亚克隆。
通过流式细胞术分析mAb。同时对所有融合物板上清液进行流式细胞术(FACS)筛选和ELISA筛选。使HT-29克隆#2或未转染的HT-29细胞在T225烧瓶(科斯塔/康宁公司，纽约州康宁)中补充有10％胎牛血清(吉博公司)的DMEM(吉博公司)中生长。使用维耳新(Versene，吉博公司)使细胞自烧瓶表面脱落，收集且用DMEM洗涤两次，随后用1％BSA/PBS溶液洗涤一次。将细胞再悬浮于1％BSA/PBS中，且向V形底96孔板(科斯塔公司)的各孔中添加2×106个细胞，且在2500RPM下离心5分钟(洗涤)。丢弃洗涤液，且每孔添加50μl来自各融合物板孔洗涤液的上清液。应用板封口膜(林博(Linbro)/MP生物医学有限公司(MPBiomedicals,LLC)，俄亥俄州索伦(Solon,OH))，且随后温和地涡旋培养板以使细胞再悬浮，并使细胞与上清液混合，且在4℃(于冰上)下培育30分钟。随后用冷1％BSA/PBS洗涤板(三次)，且在4℃下(于冰上，在黑暗中)向各孔中每孔添加50μl以1:50稀释的偶联FITC的驴抗小鼠IgG F(Ab)2(H&L公司)或偶联FITC的山羊抗人类IgG F(Ab)2(H&L公司)(杰克森公司)，保持30分钟。再用冷1％BSA/PBS洗涤板三次且固定于冷1％三聚甲醛(西格玛公司)/PBS中。将细胞转移到排管(cluster tube；科斯塔公司)且在法卡布(FACScalibur)流式细胞仪(贝克顿迪金森公司(Becton Dickenson)，加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))上分析。随后将显示阳性转变的任何杂交瘤孔扩增成24孔培养物，通过限制稀释进行亚克隆。
内在化分析。在GCC表达细胞与载体对照细胞中使用免疫荧光显微术测试抗GCC抗体分子的内在化。使细胞于盖玻片上生长，且放在冰上10分钟，随后与10μg/ml抗体一起在冰上于冷培养基中培育20分钟。为进行内在化，将含抗体培养基置换为新鲜培养基，且将细胞变为37℃培育2-3小时或维持于冰上。用PBS冲洗且在室温下于4％三聚甲醛中短暂固定之后，在0/5％TRITON X-100中使细胞渗透化(permeabilize)15分钟。通过激光扫描共焦显微术，使用经荧光标记的抗IgG抗体确定测试抗体的位置。当在冰上时，抗体分子定位于GCC表达细胞的细胞表面。在37℃下培育时，5F9在细胞膜内显示点状染色，指示发生了内在化。利用载体细胞未检测到内在化。
抗GCC抗体分子特性的概述。在上述多种分析中测试了本文产生的大多数抗体。表7概述各自的体外特性。(T84＝人类结肠肿瘤细胞，MCF7＝人类乳房肿瘤细胞，WB＝蛋白质印迹法，IP＝免疫沉淀，IHC＝免疫组织化学；内在化是使用T84细胞与MCF-7细胞相比较)
表7.抗GCC抗体分子的特性
此外，在GCC表达细胞中测试了一些抗体抑制ST肽诱导的钙离子流出的能力。cGMP分析是在HT29-GCC#18中，在50nM ST存在下，在抗GCC抗体分子存在或不存在下执行。5F9对钙离子流出存在剂量依赖性抑制。其它抗体5H3和Abx-338也抑制ST诱导的钙离子流出。
估算抗GCC抗体分子的相对亲和力。由针对TOK107-hIg的ELISA测量值和利用GCC表达细胞的FACS测量值估算一些抗GCC抗体分子的相对亲和力(EC50；半数最大结合的抗体浓度)。下表呈现一些结果。
表8.抗GCC抗体分子的EC50
抗体 EC50，TOK107-hIg，M EC50，细胞，M
5F9 3.65×10<sup>-8</sup> 1.24×10<sup>-9</sup>
5H3 4.16×10<sup>-9</sup> 4.7×10<sup>-7</sup>
Abx-338 4.9×10<sup>-12</sup> 9.0×10<sup>-8</sup>
3G1 2.28×10<sup>-8</sup> 5.8×10<sup>-10</sup>
Abx-229 2.95×10<sup>-8</sup>
Abx-221 6.55×10<sup>-9</sup>
Abx-020 4.58×10<sup>-9</sup>
Abx-012 5.55×10<sup>-10</sup>
Abx-198 4.77×10<sup>-8</sup>
测量抗GCC抗体分子的亲和力。在22℃下使用BIACORETMT100系统(GE医疗集团(GEHealthcare)，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))测量抗GCC 5F9抗体的亲和力。
步骤1：用10mM乙酸钠(pH 4.0)将MAb 5F9(Prep A)稀释到20μg/mL，且用10mM乙酸钠(pH 4.0)将参考5F9MAb(Prep B)稀释到10μg/mL。使用标准胺偶合将各mAb共价固定到若干个CM4BIACORE芯片。对于所制备的各CM4芯片，Prep A5F9以约75-100RU固定在两个流槽上，而Prep B 5F9以约70-80RU固定于一个流槽。使用各CM4芯片的剩余第四流槽作为参考流槽。
步骤2：使用帕斯(Pace)等人,蛋白质科学(Protein Science),4:2411(1995)、以及帕斯和吉姆斯雷(Grimsley),现代蛋白质科学实验指南(Current Protocols inProtein Science)3.1.1-3.1.9(2003)详述的方法测定GCC-ECD-Fc(TOK107-hIg)的储备液浓度。
步骤3：对于如步骤1中所述制备的各CM4芯片，注射浓度范围为202nM-1.6nM(2倍连续稀释)的GCC-ECD-Fc，历时2分钟，继而进行7分钟解离。一式三份随机注射样品，其中间杂有若干个缓冲液注射循环，以供双重参考。为获得更显著的解离速率衰减(off-ratedecay)数据，执行三次额外的101nM GCC-ECD-Fc注射和三次额外的缓冲液注射，其中注射时间为2分钟且解离时间为4小时。对于所有实验使用100μL/min的流速，且所有表面都用20秒的10mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)脉冲再生。所有样品都在操作缓冲液中制备，所述操作缓冲液为添加有100μg/mL BSA的Hepes缓冲生理盐水、0.005％聚山梨醇酯20(pH 7.4)(HBS-P)。
步骤4：所有传感器图谱(sensorgram)(表面等离子共振相对于时间的图)数据都用Scrubber 2.0软件(拜尔罗技软件公司(BioLogic Software)，澳大利亚坎贝尔(Campbell,Australia))处理，且使用CLAMPTM软件(米兹卡(Myszka)和莫顿(Morton)生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)23:149-150(1998))全面拟合成1:1相互作用模型(纳入项质量传输常数km)。
只要mAb固定量保持足够低以使各表面由全面分析传感器图谱数据产生的Rmax至少低于12RU，所述1:1模型就提供数据的极佳拟合。在大多数情况下，两个Prep A 5F9表面中一者的Rmax过低(低于2RU)而不能获得可靠的动力学测量值。然而，只要有可能，就要将来自结合于同一CM4芯片上的Prep A 5F9的GCC-ECD-Fc的两个流槽的数据同时拟合。当mAb表面经制备而得到较高Rmax(>12RU)时，传感器图谱明显显示复杂的动力学且因此1:1模型拟合所述数据不良。这并不令人惊讶，因为实情为GCC-ECD-Fc为二价构筑体，且经固定mAb的较高表面密度很可能使GCC-ECD-Fc过度结合于所述表面的可能性增加。关于此研究报导的重复实验仅包括良好地拟合成1:1相互作用模型的数据。关于Prep A 5F9和Prep B参考mAb的所有重复实验所得的KD值和速率常数分别列于表9和表10中。
表9：结合于经固定Prep A 5F9mAb的GCC-Fc
表10：结合于经固定Prep B 5F9mAb的GCC-Fc
重复实验 R<sub>max</sub>(RU) k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(pM)
F 9 9.68×10<sup>4</sup> 7.64×10<sup>-6</sup> 78.9
G 8 1.20×10<sup>5</sup> 1.24×10<sup>-5</sup> 103
H 7 9.09×10<sup>4</sup> 9.57×10<sup>-6</sup> 105
I 12 1.21×10<sup>5</sup> 1.54×10<sup>-5</sup> 127
平均值(95％置信区间) 1.07(0.25)×10<sup>5</sup> 1.13(0.54)×10<sup>-5</sup> 103(31)
毒素与抗体的偶联
美登素。根据如美国专利第6,441,163号中所述制备类美登素的细胞毒性偶联物的单步骤方法，产生小鼠抗人类(MAH)-IgG-DM1和抗GCC-DM1。
简单说来，使用公开的程序使类美登素偶联于抗体。使用SMCC杂双官能交联剂(丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯；查理等人,癌症研究,52:127-131(1992))使DM1偶联于抗体。使用SPDB杂双官能交联剂(维蒂森等人,医药化学杂志,49:4392-4408(2006))使DM4偶联于抗体。通过凝胶过滤色谱法，使用SEPHADEXTMG-25柱分离经偶联抗体与未反应的反应副产物。
奥瑞他汀。可使用公开的程序(例如多伦纳等人,自然生物技术,21:778-784(2003))进行奥瑞他汀的偶联。一般而言，使奥瑞他汀连接到抗体链的半胱氨酸。与半胱氨酸的连接首先通过还原抗体分子中的二硫键实现。控制还原过程可设法限制一些(但不必所有)链间二硫键的还原。因此，奥瑞他汀能够结合于游离半胱氨酸。淬灭偶联反应，随后移除反应副产物且进行缓冲液交换，得到所需调配物。
简单说来，在37℃下预先平衡7.6mg/mL的抗GCC抗体分子，随后添加15体积％的500mM硼酸钠(pH 8.0)，使pH值升到7.5-8.0。所述溶液也含有1mM DTPA。通过每摩尔抗GCC抗体分子添加2.6当量三(2-羧基乙基)膦(TCEP)且在37℃下搅拌，使抗体部分还原。28分钟后，将经还原抗GCC抗体分子的溶液放于冰上，随后立即用4.8-4.9摩尔当量(相对于抗GCC抗体分子)的药物连接子(例如mc-vc-MMAF或mc-vc-MMAE或mc-MMAF)处理为20.5mM的DMSO溶液。再引入DMSO，使混合物含有10体积％的DMSO。在冰上搅拌反应混合物约90分钟，随后用5倍摩尔过量的N-乙酰基半胱氨酸(相对于mc-vc-MMAF)处理。通过切向流动过滤分离偶联物，首先浓缩到约10mg/mL，随后用约10置换体积(diavolume)的PBS透滤。所得抗体药物偶联物的平均药物负载率为每个抗体负载有约四个药物-连接子单元。为方便起见，在以下实例和附图中，奥瑞他汀免疫偶联物以如下简写形式提及，不管药物负载率如何：“Ab-vc-MMAF”是指与mc-vc-MMAF结合的抗GCC抗体分子；“Ab-vc-MMAE”是指与mc-vc-MMAE偶联的抗GCC抗体分子；且“Ab-mc-MMAF”是指与mc-MMAF偶联的抗GCC抗体分子。包含特异性抗GCC抗体分子的免疫偶联物以相同形式提及，例如5F9-vc-MMAF、5F9-vc-MMAE和5F9-mc-MMAF。
为制备平均药物负载率为每个抗体负载有约两个药物-连接子单元的抗体药物偶联物，(以上)方案修改为TCEP的量减少50％。药物连接子的量也减少50％。相应的抗体药物偶联物简写为Ab-vc-MMAF(2)。
制备5F9vcMMAE
使用类似于上文所述一般方法的方法，使用本文所述的vc(Val-Cit)连接子使5F9mAb偶联于称作MMAE的奥瑞他汀衍生物(式(XIII))，产生称作5F9vcMMAE的免疫偶联物。如先前所述(参见例如US 2006/0074008)完成vc连接子与MMAE(希特遗传公司(SeattleGenetics,Inc.)，华盛顿州巴索(Bothell,WA))的偶联。
简单说来，用0.3M磷酸氢二钠将5F9mAb于100mM乙酸盐中的17.8mg/mL溶液(pH5.8)调到pH 8，得到11.3mg/ml的最终mAb浓度。随后，添加DTPA以使其在反应混合物中的最终浓度为1mM。随后通过添加2.28摩尔当量TCEP(相对于mAb的摩尔数)使mAb部分还原，随后在37℃下搅拌1.5小时。随后将部分还原的mAb溶液冷却到4℃，且添加4.4摩尔当量的vcMMAE(相对于抗体的摩尔数)得到20.3mM的DMSO溶液。在22℃下搅拌混合物30分钟，随后在添加5摩尔当量N-乙酰基半胱氨酸(相对于vcMMAE的摩尔数)之后再搅拌15分钟。通过用10置换体积的PBS(pH 7.4)对免疫偶联物进行超滤/透滤，移除过量已淬灭的vcMMAE和其它反应组分。所得免疫偶联物称作5F9vcMMAE且具有下式：
其中Ab为5F9mAb，且m为1到8。平均药物负载率(m)为约3.6。
细胞毒性分析。为测量各抗体结合、内在化和杀灭目标表达细胞的能力，进行细胞毒性分析。在此分析中，将细胞与各种浓度的未偶联一次抗GCC抗体和固定无毒浓度的偶联DM1的抗人类Fc二次抗体(间接细胞毒性)或与各种浓度的偶联毒素的抗GCC mAb(直接细胞毒性)一起培育。培育4天后，通过WST分析测量细胞活力。人类抗GCC抗体对293-GCC#2细胞的相对功效显示于表8中，且使用偶联DM1的小鼠抗人类IgG mAb(MAH-IgG是自克隆HP607(CRL1753，ATCC)纯化)测定。5F9和229是最有效的抗GCC mAb，其中LD50值为26和78pM。尽管此处未显示，但如重复实验的范围或超过2个重复实验的标准差所测量，误差一般在这些平均值的20％以内。
表11.抗GCC抗体对293-GCC#2细胞的细胞毒性分析结果
抗GCC Ab LD50(pM)
5F9 26
229 78
106 166
221 207
338 267
12 279
20 569
5H3 722
10D3 1596
8C2 2038
10C10 2443
1D2 >3055
6H8 >4818
393 >5400
198 >5400
细胞表面结合。通过间接免疫荧光分析使用流式细胞术来评估未偶联的5F9或偶联于奥瑞他汀的5F9的结合。将每孔1×106个细胞涂于V形底96孔板中，且与1-0.001μg/ml的连续抗体稀释液一起在冰上培育1小时。用含3％FBS的冰冷PBS洗涤细胞两次且与1:200小鼠抗人类PE IgG(南方生物技术公司(Southern Biotech)2043-09)一起在冰上培育1小时。再次洗涤细胞且通过流式细胞术在BD FACS Canto II流式细胞仪上进行分析。使用FACS Canto II系统软件对数据进行分析且测定平均荧光强度。
表位定位。起始多种策略来鉴别表位。
肽阵列。产生具有15个aa重叠的20-mer肽，覆盖GCC的细胞外结构域(ECD)到跨膜结构域(aa 1-440)。合成肽且以固定于玻璃载片上的阵列形式提供。使阵列与各抗GCC抗体杂交以确定线性肽是否足以进行结合。Abx-198结合肽55和56，而3G1、8F1和10B8抗体结合肽55、56和57。这些肽横跨序列ILVDLFNDQYLEDNVTAPDYMKNVLVLTLS(SEQ ID NO:225)。所述肽中重叠的区域为LEDNVTAPDY(SEQ ID NO:314)。Abx-012、Abx-338和Abx-106结合肽71和72。序列FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV(SEQ ID NO:226)和序列RNLTFEGYDGPVTLD(SEQ IDNO:315)在这两个肽中重叠。
细胞表面与GCC截短突变体的结合。产生呈经FLAG标记的构筑体(pFLAG-CMV-3)形式的GCC ECD的截短突变体(FL成熟肽和8个截短形式(Δ1-32、Δ1-49、Δ1-94、Δ1-128、Δ1-177、Δ1-226、Δ1-279、Δ1-229和Δ1-379)，表示约50个aa的缺失增量。在293细胞中表达构筑体，随后利用抗GCC抗体分子进行免疫沉淀且对用GCC ECD突变体转染的293细胞的溶胞物中的FLAG表位进行蛋白质印迹。抗体5F9结合具有Δ1-32突变的细胞，但不结合具有Δ1-49突变的细胞。当所述蛋白质在aa33-50之间截断时，5F9与GCC的结合丧失，表明此区域涉及5F9对GCC上其结合表位的识别。然而，因为大鼠和小鼠GCC序列与人类GCC在此区域中一致，且5F9不结合小鼠或大鼠GCC，所以5F9抗体可能结合因存在人类GCC的氨基酸33到50而形成的构象表位。
实例2.毒素-连接子选择/ADC表征
在抗体药物偶联物(ADC)策略中，高度有效的毒素偶联于抗体，毒素的细胞毒性可以目标特异性方式引导到肿瘤，由此将毒素传递到表达抗原的肿瘤细胞而不会影响正常组织中的抗原阴性细胞，从而降低全身毒性。奥瑞他汀(海兔毒素10的类似物)和美登素类毒素以与抗GCC mAb结合的ADC形式进行评估。这些毒素都为微管聚合的抑制剂，可充当抗有丝分裂剂。使细胞与游离毒素接触的测试表明游离毒素的细胞毒性不能区分表达GCC的细胞与无GCC的对照细胞。这些游离毒素对293-载体、293-GCC#2细胞有效，且在HT29-载体与HT29-GCC#5细胞中有效，如表9所示。
表12.游离毒素的细胞毒性
使不同毒素偶联于抗体的化学不同且影响连接子稳定性。连接子稳定性通过影响血液或非目标组织中的药物释放与在肿瘤处的药物释放来影响治疗窗。理想的ADC连接子在血液中具有高稳定性，但在经目标介导进入细胞后有效释放。
奥瑞他汀
评估三种奥瑞他汀-连接子对。为首先在体外评估这些偶联物，且随后确定何种毒素-连接子适于大规模体内研究，使5F9偶联于vcMMAE、vcMMAF和mcMMAF(20mg/偶联物)。
奥瑞他汀是与天然产物海兔毒素10有关的合成毒素。MMAE与MMAF略有不同，其中MMAF形式在R2位置具有羧酸基团，由此降低了游离毒素的细胞渗透性和效力。MMAE为Pgp药物泵底物，而MMAF不是。
奥瑞他汀经由如下方法偶联于链间半胱氨酸：部分抗体还原；与顺丁烯二酰亚胺基药物衍生物反应，用过量半胱氨酸淬灭，浓缩且缓冲液交换成PBS。奥瑞他汀可与在细胞摄取后裂解的组织蛋白酶B敏感性二肽连接子或与不可裂解连接子连接。
在vc单甲基奥瑞他汀(vcMonoMethylAuristatin)连接子中，缬氨酸瓜氨酸二肽键联经由氨基甲酸对氨基苯甲酯(PAB)基团连接到药物，且经由顺丁烯二酰亚胺基己酰基偶联基团连接到抗体。内在化后，二肽连接子被溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B裂解，PAB基团自毁且释放游离毒素。此连接子被设计成可维持血清稳定性，同时使由组织蛋白酶B释放的细胞内药物最多。
奥瑞他汀也可经由不可裂解连接子连接到抗体，例如MMAF不经肽酶敏感性连接子直接连接到顺丁烯二酰亚胺基偶联基团。偶联MC的ADC在目标介导的细胞杀灭方面也有效。
认为不可裂解奥瑞他汀偶联物的药物释放机制是经由溶酶体中的一般性抗体降解作用。经由LC/MS研究，已报导Ab-mcMMAF偶联物释放呈单半胱氨酸加合物形式的毒素。
抗体药物偶联物的结合
所有5F9抗体药物偶联物都同样良好地结合于293-GCC#2细胞。表10显示293-GCC#2细胞上递增浓度的5F9偶联物的平均荧光强度。其它研究确定5F9-SPDB-DM4偶联物以浓度依赖性方式结合293-GCC#2细胞，而209-SPDB-DM4抗体不结合所述细胞。
表13.来自293GCC#2细胞中5F9和5F9偶联物的结合分析的MFI的图表：
在用GCC核酸转染且选择用于表达GCC的多种细胞的直接细胞毒性分析中测试5F9-奥瑞他汀毒素偶联物。研究GCC的表面表达水平发现，293GCC#2细胞表达大量GCC；HT29#2和CT 26#2.5细胞中等到低水平表达GCC；CT 26#32细胞高水平表达GCC；而HT 29GCC#5和HT 29GCC#18表达少量GCC。表11显示得到三种奥瑞他汀偶联物在目标表达细胞或在野生型细胞或载体对照细胞中的细胞毒性数据的多项研究的汇编。在偶联5F9的毒素的所有情况下都观测到对293GCC#2细胞的目标杀灭增强，其中相对于MMAE，当使用MMAF时治疗窗大幅增加。可裂解与不可裂解形式的MMAF都类似地有效。作为阴性对照组，抗体药物偶联物也用sc209抗体制备，所述sc209抗体是针对不相关目标产生且对GCC无反应性的人类IgG1单克隆抗体。用209ADC与5F9vcMMAF ADC进行的直接细胞毒性分析显示在293细胞模型和HT29细胞模型中目标细胞杀灭增强。在细胞系间进行的偶联5F9的毒素的活性比较表明，细胞毒性水平与细胞所表达的GCC的量有一定关联。这些数据表明至少一些表达最多GCC的细胞系比表达较少量GCC的细胞更易受偶联物的细胞毒性活性影响。关于每个细胞的相对GCC数目，参见实例1。引起细胞毒性水平差异的另一因素可能是偶联物的内在化或细胞内加工的差异，所述偶联物的内在化或细胞内加工在野生型细胞系间可能不同。
表14.抗GCC奥瑞他汀ADC的细胞毒性。
如果这些效力在体内转化，其中mc与vcMMAF之间的功效相等，那么mcMMAF的较高预期MTD将表明此偶联物的治疗窗较大。
美登素
5F9-美登素ADC显示在293-GCC#2细胞中有效目标杀灭增强(表12)。有趣的是，5F9-美登素偶联物在293模型中都显示目标杀灭增强，但在HT29模型中未观测到目标杀灭增强，由此产生有关此模型用于体内评估美登素偶联物的效用的担忧。此外，此差异的原因不易解释，但可能归因于不同受体密度和/或偶联物在细胞内的内在化或加工的差异。作为阴性对照组，抗体药物偶联物也用sc209抗体制备，所述sc209抗体是针对不相关目标产生且对GCC无反应性的人类IgG1单克隆抗体。用209ADC与5F9ADC进行的直接细胞毒性分析显示在293细胞模型中所有5F9偶联物都实现目标细胞杀灭增强。在HT29细胞模型中，5F9-DMx偶联物和209-DMx偶联物能同等良好地进行杀灭，表明在这些细胞中为非目标特异性杀灭机制。
表15抗GCC美登素ADC的细胞毒性
实例3：体内评估
肿瘤模型：
在小鼠异种移植模型中评估5F9ADC的体内细胞毒性。用HT29-GCC#5和#18细胞系进行初始体内研究。也测试293-GCC#2细胞系的体内生长，且将其发展为连续可移植套管针模型。
为解答异种移植模型中GCC的表达水平是否与患有转移性结肠癌的患者的GCC表达水平有关的问题，通过对异种移植组织、人类原发性结肠肿瘤和转移进行IHC分析来比较GCC表达水平。使用一组新鲜冷冻细胞系和组织，通过rIHC用针对GCC 3G1的小鼠mAb进行GCC定量。为进行IHC定量，使用半定量0-3评分系统进行评分。如果肿瘤模型GCC含量≤临床GCC含量，那么模型建立将可能为精确的或高估了临床上所需的暴露。如果肿瘤模型GCC含量>临床GCC含量，那么模型建立可能低估了临床上所需的暴露。
虽然转移性样品中GCC的表达存在一定程度的可变性，但HT29-GCC#5和#18细胞的表达在许多转移性样品的范围内。通过IHC，HT29-GCC#5和#18细胞上GCC的染色等于或少于转移性细胞。这些数据表明所述肿瘤模型的GCC表达水平相当于在metCRC的临床样品中所发现的水平。
表16表示在192小时时间点收集的各种组织的闪烁计数，其为所提供的三个动物的平均值。相对于在HT29-载体肿瘤中，5F9优先在HT29-GCC#5肿瘤中积累，而209未显示很大差异的积累。所提供的此结果证明，可预期5F9抗体药物偶联物于GCC表达肿瘤中积累。在所评估的所有其它组织中，5F9与mAb 209抗体积累程度具有极小差异。
放射性标记的5F9在带有HT29-GCC#5和HT29-载体肿瘤的小鼠中的体内分布
在带有肿瘤的小鼠中执行放射成像研究以评估抗GCC抗体5F9黄阴性对照抗体sc209(靶向不相关细胞表面目标的人类IgG1单克隆抗体)的肿瘤靶向和体内生物分布。使用DTPA作为双官能螯合剂，用111In对抗体进行放射性标记。利用具有GCC(-)与GCC(+)肿瘤的鼠类双肿瘤模型研究体内行为，包括肿瘤靶向和在正常组织中随时间的生物分布。获取体内影像(SPECT/CT)，且使用组织放射性计数来补充空间分辨率。
使皮下肿瘤于裸小鼠中生长，其中HT29-载体肿瘤在右边，而HT29-GCC#5肿瘤在左边。以每只动物0.3mCi(＝15μg)给与抗体。每组有三只动物，且在1小时、24小时、48小时、72小时、120小时和192小时对所述组进行收集。
审视来自192小时组中动物的组织指示5F9与209在大多数正常组织(例如血液、心脏、胃、小肠、大肠、肌肉和皮肤)和HT29-载体对照肿瘤中积累程度类似。在肝脏中Ab 209的积累量略高于5F9，而在肺、脾和肾脏中5F9的积累量略高于209。在HT29-GCC#5肿瘤中，5F9优先积累，积累量是209含量的超过两倍。所提供的此结果证明，可预期5F9抗体药物偶联物于GCC表达肿瘤中积累。
为了解肿瘤中抗体积累的动力学，获得整个研究所有时间点各抗体的肿瘤数据。显示积累的唯一组织为5F9抗体于GCC表达肿瘤中积累。在所有其它组织中放射性水平保持相对平稳，其中5F9含量与209含量之间差异极小。5F9优先于HT29-GCC#5肿瘤中积累，而209不显示任何积累。所提供的此结果证明，可预期5F9抗体药物偶联物于GCC表达肿瘤中积累。
表16.经111In标记的GCC特异性mAb而非对照mAb于表达GCC的肿瘤中积累。
5F9平均ID％ 对照IgG平均ID％
1小时 2.816+/-0.133 2.494+/-0.167
24小时 3.057+/-0.107 3.010+/-0.630
72小时 4.485+/-1.029 3.564+/-0.152
120小时 5.162+/-1.012 3.412+/-0.048
192小时 6.550+/-1.015 2.782+/-0.085
历经7天放射性标记的5F9于GCC表达肿瘤中的积累支持每周一次的给药方案。
HT29-GCC#5皮下肿瘤中的预备功效研究
执行研究以确定在带有HT29-GCC#5肿瘤的小鼠中的有效偶联物和给药方案。给与小鼠单次或多次剂量。这些研究确定以较高含量的毒素偶联物过于频繁地给药(例如150μg/kg 5F9vcMMAF，按q3d×5时间表)存在毒性。另一研究确定在此模型中q14d×5时间表的频率过低以致一些毒素偶联物相对于对照组未显示显著功效。此外，在此模型中用类美登素-抗体偶联物进行的PD研究显示仅利用DM4毒素存在剂量依赖性磷酸化组蛋白积累，而DM1毒素不存在。在此模型中的另一研究显示非特异性209-毒素偶联物在一定程度上抑制肿瘤生长。这些结果表明需要评估其它体内模型。
用5F9ADC在携带293-GCC#2肿瘤的小鼠中进行PK/PD研究。
替代性肿瘤模型使用293-GCC#2细胞。在带有293-GCC#2肿瘤的小鼠中执行针对5F9ADC的PD研究。以75μg/kg或150μg/kg给与小鼠单次剂量的5F9vcMMAF，且在1小时到4天的时间点采集血清进行磷酸化组蛋白H3的PD分析，以测试所述毒素对肿瘤细胞的抗有丝分裂作用。通过利用抗体(优普塔特生物技术公司(Upstate Biotechnology),现为密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA))对石蜡包埋的肿瘤切片进行染色来检测磷酸化组蛋白H3。表17中的数据显示每一ADC都引起肿瘤中pH3阳性细胞群体显著增加，表明在75μg/kg与150μg/kg毒素剂量当量下所述ADC中每一者都能够到达肿瘤且对肿瘤细胞具有所需抗有丝分裂作用。
表17.如通过在单次静脉内给与5F9ADC后细胞有丝分裂停滞(pH3阳性肿瘤细胞％)所评估的PD反应。
类似研究测量用5F9vcMMAF、5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1处理的带有293-GCC#2肿瘤的小鼠中的磷酸化组蛋白含量。以150μg/kg给与小鼠单次剂量，且在1小时到21天的时间点采集血清以对总抗体和偶联毒素的抗体进行PK分析。293-GCC#2肿瘤中磷酸化组蛋白H3阳性细胞的百分比响应于全部三种ADC(5F9vcMMAF、5F9-SMCC-DM1和5F9-SPDB-DM4)而增加。最大磷酸化组蛋白H3含量超过基线3到5倍，其中在注射后24小时达到峰值。
利用5F9vcMMAF和5F9-DMx于293-GCC#2皮下肿瘤中进行的功效研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)按q14d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4、5F9-SMCC-DM1和5F9vcMMAF在293-GCC#2肿瘤模型中的功效。具体说来，此研究包括媒剂处理对照组、Sc209-DM1(150μg/kg DM1eq)、Sc209-DM4(150μg/kg DM4eq)、Sc209-vcMMAF(150μg/kg MMAF eq)、5F9-DM1(150μg/kg DM1eq)、5F9-DM1(75μg/kg DM1eq)、5F9-DM4(150μg/kgDM4eg)、5F9-DM4(75μg/kg DM4eq)、5F9-vcMMAF(150μg/kg MMAF eq)和5F9-vcMMAF(75μg/kg MMAF eq)。使用带有293-GCC#2细胞的塔康雌性小鼠(每组10只小鼠)。
图1描绘在用5F9vc-MMAF、-DM1和-DM4按q14d时间表处理的带有293-GCC#2的SCID小鼠中的肿瘤生长。观测到5F9-SPDB-DM4在293-GCC#2模型中存在剂量依赖性功效，而209-SPDB-DM4对照组无作用。5F9-SMCC-DM1也有效，但在150μg/kg下功效远低于5F9-SPDB-DM4。5F9vcMMAF(75μg/kg和150μg/kg)最有效，但209vcMMAF也具有一定程度的活性。因此，在这些剂量和时间表下，5F9-SPDB-DM4与其对照偶联物具有最大有效性差异。
利用5F9vcMMAF和5F9-DMx在293-GCC#2皮下肿瘤中进行的功效研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)按q7d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1在293-GCC#2肿瘤模型中的功效。具体说来，此研究包括媒剂处理对照组、单独5F9(15mg/kg)、DM1(300μg/kg)、DM4(300μg/kg)、Sc209-DM1(150μg/kg DM1eq)、Sc209-DM4(150μg/kg DM4eq)、Sc209-vcMMAF(150μg/kg MMAF eq)、5F9-DM1(150μg/kg DM1eq)、5F9-DM1(75μg/kg DM1eq)、5F9-DM4(150μg/kg DM4eq)和5F9-DM4(75μg/kg DM4eq)。使用带有293-GCC#2细胞的塔康雌性小鼠(每组10只小鼠)。
利用奥瑞他汀偶联物在293GCC#2肿瘤中进行的功效研究
用5F9与vc MMAE、vcMMAF或mcMMAF的偶联物以三种剂量处理带有293GCC#2肿瘤的SCID小鼠，并与这些毒素的209偶联物或与游离毒素或媒剂对照组进行比较。按q7d×4时间表静脉内投予剂量。在第3天、第7天、第10天、第13天和第17天收集肿瘤。用对照试剂处理的小鼠的肿瘤显示体积不断增加。用5F9奥瑞他汀偶联物处理的肿瘤显示对此肿瘤生长的剂量和时间依赖性抑制。表18提供结果的概述(TGI＝肿瘤生长抑制，T/C＝处理组/对照组，TGD＝肿瘤生长延迟，CR/PR＝完全反应/部分反应；p值＝判断统计显著性的量度，NS＝不明显)。
表18.在带有293GCC#2肿瘤的小鼠中进行的对奥瑞他汀ADC的分析
组 TGI T/C TGD CR/PR P值
209-vcMMAE 300μg/kg 24.5 0.76 0.9 0 0.38>0.05NS
209-vcMMAF 150μg/kg 29.4 0.71 1.4 0 0.27>0.05NS
209-mcMMAE 150μg/kg 36.5 0.63 1.4 0 0.15>0.05NS
游离MMAE 300μg/kg 35.6 0.64 2 0 0.18>0.05NS
游离mcMMAF 150μg/kg -3.4 1.03 -1.3 0 0.73>0.05NS
5F9-vcMMAE 300μg/kg 96.9 0.03 9/10PR <0.001
5F9-vcMMAE 150μg/kg 83.5 0.17 2/10PR <0.01
5F9-vcMMAF 150μg/kg 97 0.03 9/10PR <0.001
5F9-mcMMAF 150μg/kg 97 0.03 9/10PR <0.001
5F9-vcMMAE 75μg/kg 54.5 0.45 4.4 0.01<p<0.05
5F9-vcMMAF 75μg/kg 88.5 0.12 6/10PR <0.001
5F9-mcMMAF 75μg/kg 87.5 0.13 7/10PR ＝0.001
5F9-vcMMAF 37.5μg/kg 65.2 0.35 7.1 ＝0.01
5F9-mcMMAF 37.5μg/kg 63.6 0.36 5.8 ＝0.01
按q7d时间表使用的全部三种所述ADC在293GCC#2模型中都有效。5F9-vcMMAF和5F9-mcMMAF比5F9-vcMMAE更有效，此与体内PD(pHisH3)和体外细胞毒性数据相关。
利用5F9vcMMAF和5F9-DMx在T84皮下肿瘤中进行的功效研究
以两种剂量(75μg/kg和150μg/kg毒素)按q7d×5时间表测试5F9-SPDB-DM4和5F9-SMCC-DM1在T84肿瘤模型中的功效。具体说来，此研究包括媒剂处理对照组、单独5F9(15mg/kg)、DM1(300μg/kg)、DM4(300μg/kg)、Sc209-DM1(150μg/kg DM1eq)、Sc209-DM4(150μg/kgDM4eq)、Sc209-vcMMAF(150μg/kg MMAF eq)、5F9-DM1(150μg/kg DM1eq)、5F9-DM1(75μg/kgDM1eq)、5F9-DM4(150μg/kg DM4eq)和5F9-DM4(75μg/kg DM4eq)。使用带有T84细胞的塔康雌性小鼠(每组10只小鼠)。
免疫组织化学
可通过免疫组织化学检测和测量GCC在组织(例如活检物和异种移植物)中的相对量。在室温下将冷冻组织切片于丙酮与甲醇的1:1溶液中固定20分钟。用1×PBS洗涤载片5分钟。用自动染色装置(例如维塔纳迪卡维XT(Ventana Discovery XT)自动染色器(维塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems)，亚利桑那州图森(Tucson,AZ))，使用制造商建议的反应缓冲液处理载片。用5％山羊血清将抗GCC抗体稀释到5μg/ml。对于人类抗GCC抗体，例如5F9，二次检测抗体为山羊抗人类生物素标记抗体于达可(Dako)蛋白质阻断剂(达可公司(Dako)，加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria,CA))中的1:500溶液。在自动染色器处理抗体反应物后，从自动染色器移出载片，用反应缓冲液冲洗，经由标准系列最后用二甲苯脱水，且提供盖玻片以基于二甲苯的封固介质。
在原发性肿瘤模型中进行的ADC功效研究
原发性结肠直肠癌和胃癌的模型发展为小鼠中的皮下肿瘤。在带有PHTX-11c原发性肿瘤的小鼠中测试5F9-vcMMAE和5F9-mcMMAF ADC。按q7d×4时间表静脉内投予剂量。向对照小鼠投予毒素与209的偶联物。
ADC在原发性肿瘤模型中的抗肿瘤活性
进行两个类似研究以确定5F9-vcMMAE的体内抗肿瘤活性，且比较各种剂量和给药时间表下5F9-vcMMAE与游离毒素MMAE以及与非免疫性vcMMAE抗体毒素偶联物(209-vcMMAE)在PHTX-9c原发性人类结肠肿瘤异种移植小鼠中的抗肿瘤活性，且确定处理之后的再生长动力学。在雌性CB-17SCID小鼠(八周龄)的侧腹中皮下(SC)接种PHTX-9c肿瘤片段(2mm×2mm)。每周两次使用游标测径器监测肿瘤生长且使用公式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积。当平均肿瘤体积到达约150mm3(研究A)或160mm3(研究B)时，将动物随机分到处理组中(n＝10个/组(研究A)且n＝9个/组(研究B))。
用0.938、1.875、3.75或7.5mg/kg 5F9-vcMMAE按每周一次(QW)给药时间表(3剂)静脉内(IV)处理(研究A)小鼠20天，或用对照组(包括媒剂(0.9％生理盐水)、按QW时间表静脉内投予的0.075或0.15mg/kg MMAE，或按QW给药时间表静脉内投予的1.875或3.75mg/kg209-vcMMAE)处理20天。在第二个研究(研究B)中，用0.938、1.875、3.75、7.5或10.0mg/kg5F9-vcMMAE按QW时间表(3剂)静脉内或用3.75mg/kg按每周两次(BIW)时间表(6剂)静脉内，或用对照组(包括按QW时间表静脉内投予的媒剂、7.5或10mg/kg 209-vcMMAE，或0.135或0.18mg/kg MMAE)处理小鼠20天。对于QW时间表在第1天、第8天和第15天投予剂量，且对于BIW时间表在第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天投予剂量。通过以下原理计算游离MMAE的剂量以匹配免疫偶联物剂量中MMAE的量：MMAE的等效剂量为MLN0264剂量的1.8％。连接子+MMAE的等效剂量为5F9-vcMMAE剂量的4％。这些计算是基于每个抗体平均3.9个MMAE分子以及游离抗体分子量为150kD。实际抗体分子量将因糖基化程度而略有变化。
每周两次测量肿瘤体积和体重，且在处理期后继续以测量再生长动力学，如由肿瘤生长延迟(TGD)所证明。继续测量肿瘤体积直到肿瘤体积达到处理组中单个小鼠体重的10％，此时结束所述组。在第20天测定肿瘤生长抑制(TGI)百分比([对照组平均肿瘤体积-处理组平均肿瘤体积]/对照组平均肿瘤体积；T/C比率)。使用双尾韦尔奇氏t测试法(two-tailed Welch's t-test)比较处理组的T/C比率与对照组的T/C比率。因为在一个肿瘤达到尺寸界限(约1000mm3)时即结束整个组，所以无法计算平均再生长缓慢的组的TGD。
使用线性混合作用回归模型(linear mixed effects regression model)评估处理组对之间肿瘤生长趋势随时间的差异。这些模型说明在多个时间点测量各动物的原因。单独模型适合于各比较，且使用所述模型的预测值计算各处理组的曲线下面积(AUC)。随后计算相对于参考组的AUC减少(dAUC)百分比。统计上显著的P值(<0.05)表明两个处理组随时间的趋势不同。结果概述于下表19和20中。
在两个研究中，在所有5F9-vcMMAE处理组中都观测到抗肿瘤活性，且所述作用显示出剂量依赖性。两个研究的结果类似。在用0.938mg/kg的5F9-vcMMAE按QW时间表静脉内处理的小鼠中，相较于媒剂组，TGI为20.7-21.4％，p值<0.05。在按QW时间表静脉内投予的1.875mg/kg处理组中，TGI为41.3-44.7％，p值<0.001。在按QW时间表静脉内投予的3.75mg/kg处理组中，相较于媒剂组，TGI为65.3-65.7％(p<0.001)。按QW时间表静脉内投予的7.5mg/kg 5F9-vcMMAE得到的TGI为84.1-84.3％(p<0.001)，且按QW时间表静脉内投予的10mg/kg 5F9-vcMMAE(仅研究B)得到的TGI为91.2％(p<0.001)。当按BIW时间表静脉内投予3.75mg/kg时，观测到显著抑制，其中TGI为84.9％(p<0.001)。
在7.5和10.0mg/kg的较高剂量209-vcMMAE下观测到中等抗肿瘤活性，其中TGI分别为35.7和45.4％(p<0.001)，但低剂量的209-vcMMAE(1.875和3.75mg/kg)未展现抑制(p>0.05)。利用高剂量209-vcMMAE所观测到的抗肿瘤活性可能归因于免疫偶联物的MMAE部分的非特异性活性。
投予游离毒素MMAE得到混合的结果：按QW时间表静脉内投予0.075、0.135和0.15mg/kg未产生肿瘤生长抑制作用(p>0.05)，但按QW时间表静脉内投予0.18mg/kg得到的TGI为50.4％(p<0.001)。
在处理期中，在第7天，在研究B的游离毒素0.18mg/kg MMAE组和同一研究的0.938mg/kg 5F9-vcMMAE组中观测到2.3％的最大体重减轻。此表明所述药物具有良好耐受性。
在处理期后继续测量肿瘤体积，直到肿瘤体积达到处理组中单个小鼠体重的10％，随后结束所述处理组。在这些研究中，肿瘤再生长呈现出剂量依赖性。
表19.对SCID小鼠中原发性人类结肠肿瘤异种移植物进行处理的研究A结果。
表20.对SCID小鼠中原发性人类结肠肿瘤异种移植物进行处理的研究B结果。
利用裸5F9抗hGCC抗体在CT26hGCC/luc#32播散性模型(balb/c小鼠)中进行的初步功效研究
此模型测试裸抗体结合于循环中表达GCC的肿瘤细胞和预防新肿瘤形成的能力。用每只小鼠1×105个和每只小鼠5×105个CT26hGCC/luc#32细胞静脉内接种雌性balb/c小鼠。向对照组投予媒剂0.9％NaCl和非特异性抗体(裸209)以供与投予裸5F9进行比较。将两种抗体工程改造(在pLKTOK58载体中)成具有IgG1同型，以使得在结合于细胞表面抗原(即，对于5F9为GCC且对于209为不相关目标)之后其Fc区可引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应。接种前一日开始通过静脉内给药，给药时间表为每周一次静脉内×4(q7d×4)。一周两次通过斯诺杰(Xenogen)成像系统监测肿瘤生长。也一周两次监测体重和存活率。在此研究结束时获得肺重量和影像(包括MRI影像)。
如图2中所示，两个5F9组(40mg/kg和10mg/kg；每只小鼠1×105个)都显示功效(在接种后(p.i)第34天：T/C(处理组/对照组)为0.04到0.05)。在接种后第34天，相较于209组，5F9组的T/C为0.18到0.14。相较于0.9％NaCl(生理盐水)组，209 40mg/kg组的T/C为0.64。在5×105组中利用5F9未见效益。
在此研究结束时各组的肺重量显示于图3中。T测试法：媒剂相对于209 40mg/kg，P＝0.4；媒剂相对于5F9 40mg/kg，P<0.05；媒剂相对于5F9 10mg/kg，P<0.01。对肺进行目测证实相较于媒剂或209处理组，5F9处理组中的肿瘤结节较少。小鼠的体内MRI显示媒剂处理小鼠中大量肺肿瘤外渗到周围组织以及心脏移位。在5F9 40mg/kg处理小鼠中，可见正常肺外观，不存在肿瘤迹象。
存活曲线显示于图4中。在5F9处理组(1×105)观测到存活率显著增加，且5F910mg/kg组与40mg/kg组之间无差异。
实例4：产生抗体生产细胞系
为以>600mg/L的生产力产生表达5F9的稳定CHO细胞系克隆，通过将轻链可变区(SEQ ID NO:19)和重链可变区(SEQ ID NO:17)亚克隆到含有WT人类IgG1Fc和新霉素抗性基因的pLKTOK58表达载体中，来产生5F9的表达载体。5F9可变区-IgG1融合产物的表达受EF-1a启动子的控制。
抗GCC人类单克隆抗体5F9可变区的克隆和定序
自人类杂交瘤46.5F9亚克隆8.2分离(凯杰公司(Qiagen)的RNeasy试剂盒)总RNA。此杂交瘤携带轻链的“标准”公开κ恒定区(基因库寄存编号AW383625或BM918539)和重链的“标准”公开IgG2恒定区(基因库寄存编号BX640623或AJ294731)。通过传统方法(自然方法学(Nature Methods)2,629-630(2005))合成备用快速5'末端扩增(5'race-ready)聚G尾cDNA。由cDNA通过快速5'末端扩增，使用聚C锚定寡聚物(poly-C anchor oligo)与κ恒定区特异性反向引物的组合PCR扩增轻链可变区。用IgG2恒定区特异性反向引物与已知重链前导序列特异性正向引物的多个组合扩增重链可变区。用克隆PCR产物(英杰生命技术公司(InvitrogenTM,Life Technologies,Inc.))且用M13F和M13R引物进行定序。
构建携带抗GCC人类单克隆抗体5F9的哺乳动物表达载体
构建携带5F9轻链和重链可变区的哺乳动物表达载体以产生生产CHO细胞系。对于原生构筑体，将5F9轻链和重链的可变区亚克隆到pLKTOK58D中(美国专利申请案第20040033561号)。此载体携带两个哺乳动物选择标记物：新霉素抗性标记物和DHFR/甲氨蝶呤标记物(用于扩增)。所述载体允许由串联的EF1α启动子共表达轻链和重链，所述启动子各自位于载体前导序列-κ恒定区和前导序列-IgG1(野生型Fc)恒定区的上游。为进行亚克隆，由序列确定的TOPO克隆用含有独特限制性位点的基因特异性引物PCR扩增轻链和重链的可变区以便定向克隆到载体的相应前导序列-κ和前导序列-IgG1区的接合点中。引物的序列如下(5F9可变区特异性序列以粗体表示)：
原生5F9轻链前导序列-可变区引物：
正向NotI
反向BsiWI
原生5F9重链前导序列-可变区引物
正向EcoRI
反向Blpl
克隆通过轻链与重链的双链DNA定序证实。
使用两种转染方法将构筑体引入CHO细胞中：传统MPI法和克鲁塞尔(Crucell)法。用原生5F9构筑体使用传统MPI法起始CHO细胞转染。使用线性化和非线性化DNA进行电穿孔或脂染胺2000 CD(Lipopfectamine 2000 CD)转染。经由于G418、非核苷培养基和5nM甲氨蝶呤中选择产生约30个稳定池。基于对抗体产生量的FMAT分析，选择三个稳定池进行克隆。产量最高的池分泌12.2μg/ml的抗体。将这三个池冷冻。
可评估克鲁塞尔STAR元件以制备含有STAR元件的5F9表达载体。
5F9/hIgG1重链核苷酸序列为：
5F9/hIgG1重链蛋白质序列为：
5F9/hκ轻链核苷酸序列为：
5F9/hκ轻链蛋白质序列为：
将下列5F9的重链和轻链核酸序列插入pTOK58D载体中：
将以下编码Abx-229重链和轻链序列的序列插入pTOK58D载体中：
虽然本发明已参考其所提供的实施例进行显示和描述，但所属领域技术人员应了解，在不背离所附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下，可对其中的形式和细节进行各种改变。
序列表
<110> 米伦纽姆医药公司
安美基卑斯公司
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<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 1
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctctgggtt ctcattaagc agaaatgcta taagctgggt tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggactg gtggaggcac aaattataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatccgc aaagagaact ccaagagtca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctacaaac tgaagacaca gccaggtact tctgtgccag aagtggttac 300
gacgggtttg attactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Glu Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 3
cagattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcaccagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtggtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaaactgg aaataaaa 318
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 5
caggtccagt tgaagcagtc tggagctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggaaag attggtcctc gaagtggtaa tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcgtccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatgggat 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctct 336
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Gly Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 7
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaag cacctaatgt atcaggtgtc caaactggac 180
cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc 240
agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac atattatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaag 336
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 9
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgcagatg 60
tcctgtaagg cttctggcta tattttcacc ggctactgga tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggccaag gccttgagtg gattggaagg attcatcctt ctgatagtaa tactaactac 180
aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac ccatgccctt 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctct 336
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr His Ala Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
<210> 11
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 11
gatgttgtgt tgacccagac tccactcact ttgtcgatta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgagttgg 120
ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tcaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtg tattactgcg tgcaaggtac acatttattc 300
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Gln Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 13
caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggaaag attggtccta gaagtggtag tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatgggat 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgca 339
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Gly Pro Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 15
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaag cacctaatgt atcaggtgtc caaactggac 180
cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc 240
agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac atattatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 17
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctttggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caacgacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttcgccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agaacgtgga 300
tacacctatg gtaactttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 19
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agaaacttag cctggtatca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg aatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcggcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataaaacct ggcctcggac gttcggccaa 300
gggaccaacg tggaaatcaa a 321
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 21
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactgctaca tgagctggat ccgccagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attactacta gtggtaatac catttactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagactgg 300
ggatggttct acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Cys
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Thr Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Gly Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (216)..(217)
<223>a、c、t、g、未知或其它
<400> 23
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg cataatgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacaa ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtagcagc gggtcnngga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttcct 300
cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (73)..(73)
<223> 任何氨基酸
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Asn
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Xaa Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Ile Gln Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 25
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt actttgacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 27
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagacttc taaccgcttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg gagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac gcaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Gly Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 29
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagcctccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat tttactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 31
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagacttc taaccgcttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg gagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac gcaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Gly Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt actttgacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 35
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
ttctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacacgta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 37
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatttcatac attactagta gtggtagtac catatactac 180
tcagcctctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatttc 300
agtggctggt tcggagtcca ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcg 363
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Ser Gly Trp Phe Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 39
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgta agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc caaataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acaacttacg 300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Ile Gln Leu Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 41
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggactg ggtctcagat attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgc acagcctgag cgccgaggac acggccatat attactgtgc gaaacggcgg 300
tggcaggggt acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Arg Trp Gln Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 43
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccaggca gcgtgttgac agcaggtact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Arg Gln Arg Val Asp Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 45
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cgctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggga gtggtggtag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactatat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgc 300
gatttttgga gtggtccatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 47
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agaaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcaccag tatagtaact ggatgtgcag ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Glu Ile Val Met Thr Pro Ser Ser Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ser Asn Trp Met Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaga agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattggacgt atttatatca gtgggaggac caccttcaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agatagatat 300
tatggctacc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 50
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Thr Phe Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 51
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc cgcagttact tagcctggta ccaacagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccgag caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 52
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 53
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggcgg ctccatccgt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180
ctctccctca agagtcgagt caccatatca agagacacgt ccaagaatca ggtctccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcggc gggtatgggc 300
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342
<210> 54
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg His Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 55
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 55
gacatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggccattaga aatgatttag gctggtatca gctgaaaccg 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctattct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaggattctg caacttatta ctgtctacag cataatagtt tccctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 57
agaaatgcta taagc 15
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Arg Asn Ala Ile Ser
1 5
<210> 59
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 59
gtaatatgga ctggtggagg cacaaattat aattcagctc tcaaatcc 48
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 60
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 61
agtggttacg acgggtttga ttac 24
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 62
Ser Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 63
agtgccagct caagtgtaaa ttacatgcac 30
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 65
gacacatcca aactggcttc t 21
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 67
cagcagtgga gtggtaaccc gtacacg 27
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 69
gactactata taaac 15
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 70
Asp Tyr Tyr Ile Asn
1 5
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 71
aagattggtc ctcgaagtgg taatacttac tacaatgaga agttcaaggg c 51
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Lys Ile Gly Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 73
tgggatgctt ac 12
<210> 74
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Trp Asp Ala Tyr
1
<210> 75
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 75
aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaagacat atttgaat 48
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 77
caggtgtcca aactggaccc t 21
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro
1 5
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 79
ttgcaaggta catattatcc gtacacg 27
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Leu Gln Gly Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 81
ggctactgga tgtac 15
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Gly Tyr Trp Met Tyr
1 5
<210> 83
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 83
aggattcatc cttctgatag taatactaac tacaatcaaa agttcaaggg c 51
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 85
gcccttgctt ac 12
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Ala Leu Ala Tyr
1
<210> 87
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 87
aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaaaacct atttgagt 48
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 89
ctggtgtctc aactggactc t 21
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Leu Val Ser Gln Leu Asp Ser
1 5
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 91
gtgcaaggta cacatttatt cacg 24
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Val Gln Gly Thr His Leu Phe Thr
1 5
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 93
gactactata taaac 15
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Asp Tyr Tyr Ile Asn
1 5
<210> 95
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 95
aagattggtc ctagaagtgg tagtacttac tacaatgaga agttcaaggg c 51
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Lys Ile Gly Pro Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 97
tgggatgctt ac 12
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Trp Asp Ala Tyr
1
<210> 99
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 99
aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaagacat atttgaat 48
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 101
caggtgtcca aactggaccc t 21
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 102
Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro
1 5
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 103
ttgcaaggta catattatcc gtacacg 27
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 104
Leu Gln Gly Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 105
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 105
ggttactact ggagc 15
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 107
gaaatcaatc atcgtggaaa caccaacgac aacccgtccc tcaag 45
<210> 108
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 108
Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 109
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 109
gaacgtggat acacctatgg taactttgac cac 33
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His
1 5 10
<210> 111
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 111
agggccagtc agagtgttag cagaaactta gcc 33
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 112
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 113
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 114
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 115
cagcagtata aaacctggcc tcggacg 27
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 116
Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 117
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 117
gactgctaca tgagc 15
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 118
Asp Cys Tyr Met Ser
1 5
<210> 119
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 119
tacattacta ctagtggtaa taccatttac tacgcagact ctgtgaaggg c 51
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 120
Tyr Ile Thr Thr Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 121
gactggggat ggttctacgg tatggacgtc 30
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 122
Asp Trp Gly Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 123
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 123
aagtctagtc agagcctcct gcataatgat ggaaagacct atttg 45
<210> 124
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 124
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Asn Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 125
gaagtttcca accggttctc t 21
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 126
Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 127
atgcaaagta tacagcttcc tcggacg 27
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 128
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 129
agctatggca tgcac 15
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 130
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 131
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 131
gctatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 132
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 133
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 133
gggaggagca gctcgtactt tgactat 27
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 134
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 135
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 135
aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacct acttgagt 48
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 136
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 137
aagacttcta accgcttctc t 21
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 138
Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 139
atgcaagcta cgcaatttcc aacc 24
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 140
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Thr
1 5
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 141
agctatggca tgcac 15
<210> 142
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 142
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 143
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 143
gctatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagcct ccgtgaaggg c 51
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 144
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 145
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 145
gggaggagca gctcgtattt tgactac 27
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 146
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 147
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 147
aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacct acttgagt 48
<210> 148
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 148
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 149
aagacttcta accgcttctc t 21
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 150
Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 151
atgcaagcta cgcaatttcc a 21
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 152
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Thr
1 5
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 153
agctatggca tgcac 15
<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 154
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 155
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 155
gctatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 156
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 156
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 157
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 157
gggaggagca gctcgtactt tgactat 27
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 158
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 159
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 159
aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacgt acttgagt 48
<210> 160
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 160
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 161
aagatttcta accggttctc t 21
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 162
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 163
atgcaagcta cacaatttcc aacc 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 164
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Thr
1 5
<210> 165
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 165
gactactaca tgagc 15
<210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 166
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 167
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 167
tacattacta gtagtggtag taccatatac tactcagcct ctgtgaaggg c 51
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 168
Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 169
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 169
gatttcagtg gctggttcgg agtccacttt gactac 36
<210> 170
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 170
Asp Phe Ser Gly Trp Phe Gly Val His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 171
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 171
aagtctagtc agagcctcct gcatagtgat ggaaagacct atttgtat 48
<210> 172
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 172
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 173
gaagtttcca accggttctc t 21
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 174
Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 175
atgcaaagta tacaacttac gtggacg 27
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 176
Met Gln Ser Ile Gln Leu Thr Trp Thr
1 5
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 177
agctatgcca tgagc 15
<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 178
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 179
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 179
gatattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 180
Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 181
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 181
cggcggtggc aggggtactt cgatctc 27
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 182
Arg Arg Trp Gln Gly Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 183
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 183
agggccaggc agcgtgttga cagcaggtac ttagcc 36
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 184
Arg Ala Arg Gln Arg Val Asp Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 185
ggtgcatcca gcagggccac t 21
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 186
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 187
cagcagtatg gtagctcacc gctcact 27
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 188
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 189
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 189
cgctatgcca tgaac 15
<210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 190
Arg Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 191
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 191
ggtattagtg ggagtggtgg taggacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 192
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 193
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 193
gatcgcgatt tttggagtgg tccatttgac tac 33
<210> 194
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 194
Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 195
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 195
agggccagtc agagtgttag tagaaactta gcc 33
<210> 196
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 196
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 197
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 198
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 199
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 199
caccagtata gtaactggat gtgcagt 27
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 200
His Gln Tyr Ser Asn Trp Met Cys Ser
1 5
<210> 201
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 201
agttactact ggagc 15
<210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 202
Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 203
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 203
cgtatttata tcagtgggag gaccaccttc aacccctccc tcaagagt 48
<210> 204
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 204
Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Thr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 205
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 205
gatagatatt atggctacct tgactac 27
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 206
Asp Arg Tyr Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr
1 5
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 207
agggccagtc agagtgttag ccgcagttac ttagcc 36
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 208
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 209
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 209
gatgcatcca gcagggccac t 21
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 210
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 211
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 211
cagcagtatg gtagttcacc gagcacc 27
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 212
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Thr
1 5
<210> 213
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 213
cattactact ggagc 15
<210> 214
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 214
His Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 215
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 215
tatatctatt acagtgggag caccaactac aacctctccc tcaagagt 48
<210> 216
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 216
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Leu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 217
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 217
ggtatgggct ttgactac 18
<210> 218
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 218
Gly Met Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 219
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 219
cgggcaagtc aggccattag aaatgattta ggc 33
<210> 220
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 220
Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 221
tctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 222
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 222
Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 223
ctacagcata atagtttccc tccgacg 27
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 224
Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 225
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln Tyr Leu Glu Asp Asn Val Thr
1 5 10 15
Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser
20 25 30
<210> 226
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro
1 5 10 15
Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val
20 25
<210> 227
<211> 3222
<212> DNA
<213> 智人
<400> 227
atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360
gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480
atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540
cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600
gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660
ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720
aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780
gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840
tttgaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900
cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960
tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020
gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080
gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140
cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200
gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260
cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320
ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380
tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440
accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500
cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560
aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagttgct tcagattgac 1620
tattacaacc tgaccaagtt ctacggcaca gtgaaacttg ataccatgat cttcggggtg 1680
atagaatact gtgagagagg atccctccgg gaagttttaa atgacacaat ttcctaccct 1740
gatggcacat tcatggattg ggagtttaag atctctgtct tgtatgacat tgctaaggga 1800
atgtcatatc tgcactccag taagacagaa gtccatggtc gtctgaaatc taccaactgc 1860
gtagtggaca gtagaatggt ggtgaagatc actgattttg gctgcaattc cattttacct 1920
ccaaaaaagg acctgtggac agctccagag cacctccgcc aagccaacat ctctcagaaa 1980
ggagatgtgt acagctatgg gatcatcgca caggagatca tcctgcggaa agaaaccttc 2040
tacactttga gctgtcggga ccggaatgag aagattttca gagtggaaaa ttccaatgga 2100
atgaaaccct tccgcccaga tttattcttg gaaacagcag aggaaaaaga gctagaagtg 2160
tacctacttg taaaaaactg ttgggaggaa gatccagaaa agagaccaga tttcaaaaaa 2220
attgagacta cacttgccaa gatatttgga ctttttcatg accaaaaaaa tgaaagctat 2280
atggatacct tgatccgacg tctacagcta tattctcgaa acctggaaca tctggtagag 2340
gaaaggacac agctgtacaa ggcagagagg gacagggctg acagacttaa ctttatgttg 2400
cttccaaggc tagtggtaaa gtctctgaag gagaaaggct ttgtggagcc ggaactatat 2460
gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc 2520
acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt 2580
gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt 2640
ttgcctaaga gaaatggcaa tcggcatgca atagacattg ccaagatggc cttggaaatc 2700
ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaat atggattcgc 2760
attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat gcctcgttat 2820
tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg 2880
agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt 2940
tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg 3000
actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag 3060
cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca 3120
gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tctggaatac 3180
ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa 3222
<210> 228
<211> 1073
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile
50 55 60
Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala
100 105 110
Gln Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys
165 170 175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val
210 215 220
Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
245 250 255
Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu
260 265 270
Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp
305 310 315 320
Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu
325 330 335
Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala
340 345 350
His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Ile Leu
420 425 430
Met Ile Ala Val Phe Thr Leu Thr Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Leu
435 440 445
Val Ala Leu Leu Met Leu Arg Lys Tyr Arg Lys Asp Tyr Glu Leu Arg
450 455 460
Gln Lys Lys Trp Ser His Ile Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu
465 470 475 480
Thr Asn Glu Thr Asn His Val Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Lys Arg
485 490 495
Arg Asp Thr Ile Gln Arg Leu Arg Gln Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg
500 505 510
Val Ile Leu Lys Asp Leu Lys His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys
515 520 525
Gln Lys Ile Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gln Ile Asp Tyr Tyr Asn Leu
530 535 540
Thr Lys Phe Tyr Gly Thr Val Lys Leu Asp Thr Met Ile Phe Gly Val
545 550 555 560
Ile Glu Tyr Cys Glu Arg Gly Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr
565 570 575
Ile Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser
580 585 590
Val Leu Tyr Asp Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys
595 600 605
Thr Glu Val His Gly Arg Leu Lys Ser Thr Asn Cys Val Val Asp Ser
610 615 620
Arg Met Val Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro
625 630 635 640
Pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gln Ala Asn
645 650 655
Ile Ser Gln Lys Gly Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gln Glu
660 665 670
Ile Ile Leu Arg Lys Glu Thr Phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp Arg
675 680 685
Asn Glu Lys Ile Phe Arg Val Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe
690 695 700
Arg Pro Asp Leu Phe Leu Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Val
705 710 715 720
Tyr Leu Leu Val Lys Asn Cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro
725 730 735
Asp Phe Lys Lys Ile Glu Thr Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe
740 745 750
His Asp Gln Lys Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu
755 760 765
Gln Leu Tyr Ser Arg Asn Leu Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gln
770 775 780
Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu
785 790 795 800
Leu Pro Arg Leu Val Val Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Val Glu
805 810 815
Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Val Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly
820 825 830
Phe Thr Thr Ile Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Met
835 840 845
Leu Asn Asp Ile Tyr Lys Ser Phe Asp His Ile Val Asp His His Asp
850 855 860
Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly
865 870 875 880
Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn Arg His Ala Ile Asp Ile Ala Lys Met
885 890 895
Ala Leu Glu Ile Leu Ser Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu
900 905 910
Pro Gly Leu Pro Ile Trp Ile Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro Cys
915 920 925
Ala Ala Gly Val Val Gly Ile Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly
930 935 940
Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu
945 950 955 960
Arg Ile His Val Ser Gly Ser Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu
965 970 975
Cys Gln Phe Leu Tyr Glu Val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg
980 985 990
Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gln Lys Phe
995 1000 1005
Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr Val Glu Asn Gln Gln Arg Leu Gln
1010 1015 1020
Ala Glu Phe Ser Asp Met Ile Ala Asn Ser Leu Gln Lys Arg Gln
1025 1030 1035
Ala Ala Gly Ile Arg Ser Gln Lys Pro Arg Arg Val Ala Ser Tyr
1040 1045 1050
Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu Gln Leu Asn Thr Thr Asp Lys
1055 1060 1065
Glu Ser Thr Tyr Phe
1070
<210> 229
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 229
Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile
50 55 60
Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala
100 105 110
Gln Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys
165 170 175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val
210 215 220
Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
245 250 255
Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu
260 265 270
Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp
305 310 315 320
Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu
325 330 335
Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala
340 345 350
His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu
420
<210> 230
<211> 1444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 230
gaattcctca ccatgggatg gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac agctacaggt 60
gtccactccc aggtgcagct acagcagtgg ggcgcaggac tgttgaagcc ttcggagacc 120
ctgtccctca cctgcgctgt ctttggtggg tctttcagtg gttactactg gagctggatc 180
cgccagcccc cagggaaggg gctggagtgg attggggaaa tcaatcatcg tggaaacacc 240
aacgacaacc cgtccctcaa gagtcgagtc accatatcag tagacacgtc caagaaccag 300
ttcgccctga agctgagttc tgtgaccgcc gcggacacgg ctgtttatta ctgtgcgaga 360
gaacgtggat acacctatgg taactttgac cactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 420
agctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataat agggataaca gggtaatact 1440
agag 1444
<210> 231
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 231
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 232
<211> 722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 232
gcggccgcct caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60
gtgtccactc cgaaatagtg atgacgcagt ctccagccac cctgtctgtg tctccagggg 120
aaagagccac cctctcctgc agggccagtc agagtgttag cagaaactta gcctggtatc 180
agcagaaacc tggccaggct cccaggctcc tcatctatgg tgcatccacc agggccactg 240
gaatcccagc caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga gttcactctc accatcggca 300
gcctgcagtc tgaagatttt gcagtttatt actgtcagca gtataaaacc tggcctcgga 360
cgttcggcca agggaccaac gtggaaatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca 420
tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga 480
ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg 540
gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca 600
gcaccctgac cctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca 660
cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttagtcta 720
ga 722
<210> 233
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 233
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser
85 90 95
Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr
100 105 110
Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 234
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 234
ataagaatgc ggccgcctca ccatgggatg gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac 60
agctacaggt gtccactccg aaatagtgat gacgcagtct ccagccaccc tg 112
<210> 235
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 235
gccaccgtac gtttgatttc cacgttggtc ccttggccga acgtc 45
<210> 236
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 236
ccggaattcc tcaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60
ggtgtccact cccaggtgca gctacagcag tggggcgcag gac 103
<210> 237
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 237
ggaggctgag ctgacggtga ccagggttcc ctggccccag tggtc 45
<210> 238
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 238
caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgc ctccatcagt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggaatg gattgggcgt atctatatca gtgggaggac cagctacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccgtgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatcggcta 300
actgggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag 352
<210> 239
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 239
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser His Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 240
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 240
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccgc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa ac 322
<210> 241
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 241
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 242
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 242
caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgc ctccatcagt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggaatg gattgggcgt atctatatca gtgggaggac cagctacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccgtgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatcggcta 300
actgggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agc 353
<210> 243
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 243
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser His Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 244
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 244
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagact ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtgcagtttt 300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaacg 329
<210> 245
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 245
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Met Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 246
<211> 362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 246
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cgctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgc 300
gatttttgga gtggtccatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
gc 362
<210> 247
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 247
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 248
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 248
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgta gggccagtca gagtgttagt agaagcttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctacggt gcatccacca gggccactgg gatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagatgttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggatgtgcag ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acg 323
<210> 249
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 249
Glu Ile Val Met Thr Pro Ser Ser Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Met Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 250
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 250
cattactact ggagc 15
<210> 251
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 251
His Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 252
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 252
cgtatctata tcagtgggag gaccagctac aacccctccc tcaagagt 48
<210> 253
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 253
Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 254
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 254
gatcggctaa ctgggtactt tgactac 27
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 255
Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 256
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 256
agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36
<210> 257
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 257
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 258
ggtgcatcca gcagggccgc t 21
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 259
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala
1 5
<210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 260
cagcagtatg gtagctccct cact 24
<210> 261
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 261
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr
1 5
<210> 262
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 262
cattactact ggagc 15
<210> 263
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 263
His Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 264
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 264
cgtatctata tcagtgggag gaccagctac aacccctccc tcaagagt 48
<210> 265
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 265
Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 266
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 266
gatcggctaa ctgggtactt tgactac 27
<210> 267
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 267
Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 268
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 268
agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36
<210> 269
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 269
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 270
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 270
ggtacatcca gcagggccac t 21
<210> 271
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 271
Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 272
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 272
cagcagtatg gtagctcacc catgtgcagt 30
<210> 273
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 273
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser
1 5 10
<210> 274
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 274
cgctatgcca tgaac 15
<210> 275
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 275
Arg Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 276
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 276
ggtattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 277
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 277
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 278
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 278
gatcgcgatt tttggagtgg tccatttgac tac 33
<210> 279
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 279
Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 280
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 280
agggccagtc agagtgttag tagaagctta gcc 33
<210> 281
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 281
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 282
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 282
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 283
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 283
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 284
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 284
cagcagtata ataactggat gtgcagt 27
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 285
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Met Cys Ser
1 5
<210> 286
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 286
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctttggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caacgacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttcgccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agaacgtgga 300
tacacctatg gtaactttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 287
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 287
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 288
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 288
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaggtact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcacccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta tttctgtcag cagtatgaaa ggtcattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggat 315
<210> 289
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 289
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Ser Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp
100 105
<210> 290
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 290
ggttactact ggagc 15
<210> 291
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 291
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 292
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 292
gaaatcaatc atcgtggaaa caccaacgac aacccgtccc tcaag 45
<210> 293
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 293
Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 294
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 294
gaacgtggat acacctatgg taactttgac cac 33
<210> 295
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 295
Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His
1 5 10
<210> 296
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 296
agggccagtc agagtgttag cagcaggtac ttagcct 37
<210> 297
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 297
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 298
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 298
ggtgcatcca gcagggccac tg 22
<210> 299
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 299
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 300
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 300
cagcagtatg aaaggtcatt cactt 25
<210> 301
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 301
Gln Gln Tyr Glu Arg Ser Phe Thr
1 5
<210> 302
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Met或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Asn
<400> 302
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 303
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Thr或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Tyr, Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Ser或Gly
<400> 303
Xaa Ile Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa
1 5 10 15
<210> 304
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(6)
<223> 任何氨基酸且此区域可包含4到6个残基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(10)
<223> 任何氨基酸且此区域可包含2到3个残基
<400> 304
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Asp Tyr
1 5 10
<210> 305
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ala或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(16)
<223> 任何氨基酸且此区域可包含5到9个残基
<400> 305
Xaa Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> 任何氨基酸
<400> 306
Xaa Xaa Ser Xaa Arg Xaa Xaa
1 5
<210> 307
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共同序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln、His或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(10)
<223> 任何氨基酸且此区域可包含5到7个残基
<400> 307
Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 308
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 308
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgaa 60
atagtgatga cgcagtctcc agccaccctg tctgtgtctc caggggaaag agccaccctc 120
tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcaga aacttagcct ggtatcagca gaaacctggc 180
caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccaccaggg ccactggaat cccagccagg 240
ttcagtggca gtgggtctgg gacagagttc actctcacca tcggcagcct gcagtctgaa 300
gattttgcag tttattactg tcagcagtat aaaacctggc ctcggacgtt cggccaaggg 360
accaacgtgg aaatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgaccctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702
<210> 309
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 309
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60
gtgcagctac agcagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120
tgcgctgtct ttggtgggtc tttcagtggt tactactgga gctggatccg ccagccccca 180
gggaaggggc tggagtggat tggggaaatc aatcatcgtg gaaacaccaa cgacaacccg 240
tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt cgccctgaag 300
ctgagttctg tgaccgccgc ggacacggct gtttattact gtgcgagaga acgtggatac 360
acctatggta actttgacca ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtcag ctcagcctcc 420
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380
agcctctccc tgtctccggg taaataa 1407
<210> 310
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 310
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagccgc tatgccatga actgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaggtatt agtgggagtg gtggtaggac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actatatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcgcgat 360
ttttggagtg gtccatttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt cagctcagcc 420
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 1410
<210> 311
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400> 311
atgaggctcc ctgctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agaaacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcaccag tatagtaact ggatgtgcag ttttggccag 360
gggaccaagc tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
<210> 312
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ser或Gly
<400> 312
Ser Xaa Lys Xaa
1
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ala或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser或Leu
<400> 313
Xaa Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa
1 5
<210> 314
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 314
Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 315
Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 316
<211> 18
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 316
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 317
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 317
Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu
20 25 30
Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn
35 40 45
Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu
85 90 95
Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys
115 120 125
Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu
130 135 140
Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr
165 170 175
Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr
180 185 190
Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu
195 200 205
Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile
210 215 220
Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln
245 250 255
Tyr Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu
260 265 270
Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser
275 280 285
Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn
290 295 300
Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr
325 330 335
Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val
340 345 350
Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr
355 360 365
Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val
370 375 380
Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp
385 390 395 400
Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
405 410 415
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
420 425 430
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
450 455 460
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
465 470 475 480
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
485 490 495
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
500 505 510
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
515 520 525
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
530 535 540
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
545 550 555 560
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
565 570 575
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
580 585 590
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
595 600 605
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
610 615 620
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630 635
<210> 318
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 318
Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu
20 25 30
Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn
35 40 45
Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu
85 90 95
Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys
115 120 125
Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu
130 135 140
Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr
165 170 175
Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr
180 185 190
Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu
195 200 205
Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile
210 215 220
Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln
245 250 255
Tyr Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu
260 265 270
Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser
275 280 285
Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn
290 295 300
Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr
325 330 335
Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val
340 345 350
Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr
355 360 365
Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val
370 375 380
Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp
385 390 395 400
Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
405 410 415
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
420 425 430
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
450 455 460
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
465 470 475 480
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
485 490 495
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
500 505 510
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
515 520 525
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
530 535 540
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
545 550 555 560
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
565 570 575
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
580 585 590
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
595 600 605
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
610 615 620
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu Asp Leu
625 630 635 640
Asp Asp Val Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp
645 650 655
Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr
660 665 670
Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val
675 680 685
Val Glu Leu Lys Gln Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly
690 695 700
Gln Gly Ala
705
<210> 319
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 319
Gly Phe Leu Gly
1

Claims (23)

1.一种抗GCC抗体分子，其包含：
(i)三个重链互补决定区(HCDR)，由SEQ ID NO:190(HCDR1)、SEQ ID NO:192(HCDR2)和SEQ ID NO:194(HCDR3)的氨基酸序列组成；和三个轻链互补决定区(LCDR)，由SEQ ID NO:196(LCDR1)、SEQ ID NO:198(LCDR2)和SEQ ID NO:200(LCDR3)的氨基酸序列组成；或
(ii)三个重链互补决定区(HCDR)，由SEQ ID NO:58(HCDR1)、SEQ ID NO:60(HCDR2)和SEQ ID NO:62(HCDR3)的氨基酸序列组成；和三个轻链互补决定区(LCDR)，由SEQ ID NO:64(LCDR1)、SEQ ID NO:66(LCDR2)和SEQ ID NO:68(LCDR3)的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中抗体分子包含三个重链互补决定区(HCDR)，由SEQ ID NO:190(HCDR1)、SEQ ID NO:192(HCDR2)和SEQ ID NO:194(HCDR3)的氨基酸序列组成；和三个轻链互补决定区(LCDR)，由SEQ ID NO:196(LCDR1)、SEQ ID NO:198(LCDR2)和SEQ ID NO:200(LCDR3)的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的抗体分子，其中抗体分子包含人类或人类来源的重链和轻链可变区框架。
4.根据权利要求1所述的抗体分子，其中抗体分子包含：
(i)由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的重链可变区；和由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的轻链可变区；或
(ii)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的重链可变区；和由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的轻链可变区。
5.根据权利要求1中所述的抗体分子，其中抗体分子包含由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的重链可变区；和由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的轻链可变区。
6.根据权利要求1中所述的抗体分子，其中抗体分子是完整抗体或抗原结合片段。
7.根据权利要求1中所述的抗体分子，其中抗体分子包含人IgG1重链恒定区。
8.根据权利要求1中所述的抗体分子，其中抗体分子包含人Igκ轻链恒定区。
9.根据权利要求1中所述的抗体分子，其中抗体分子是偶联于治疗剂或可检测标记。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子，其可用于治疗个体中表达GCC的癌症的方法。
11.根据权利要求10中所述的抗体分子，其中表达GCC的癌症是胃肠系统癌症或其转移性病变。
12.根据权利要求10中所述的抗体分子，其中表达GCC的癌症是原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌或肺癌。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子，其可制备用于治疗表达GCC的癌症的药物。
14.根据权利要求13所述的用途，其中表达GCC的癌症是胃肠系统癌症或其转移性病变。
15.根据权利要求13所述的用途，其中表达GCC的癌症是原发性或转移性结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌或肺癌。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物包含一种或多种附加的治疗剂，或用于与一种或多种附加的治疗剂组合使用。
17.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子，或根据权利要求1-9中任一项所述抗体分子的可变区。
18.一种分离的细胞，其包含根据权利要求17所述的分离的核酸序列。
19.一种制备根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子的方法，其包含在允许抗体分子表达的条件下培养权利要求18中所述细胞，由此产生根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子。
20.一种包含分离的核酸的载体，所述核酸编码根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子的所述轻链和重链可变区中的一者或两者。
21.一种医药组合物，其包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子和医药学上可接受的载剂。
22.一种容器，其包含根据权利要求21所述的医药组合物。
23.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-9中任一项所述的抗体分子。
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