[go: up one dir, main page]

EA030827B1 - Анти-gcc антитело и его применения - Google Patents

Анти-gcc антитело и его применения Download PDF

Info

Publication number
EA030827B1
EA030827B1 EA201270365A EA201270365A EA030827B1 EA 030827 B1 EA030827 B1 EA 030827B1 EA 201270365 A EA201270365 A EA 201270365A EA 201270365 A EA201270365 A EA 201270365A EA 030827 B1 EA030827 B1 EA 030827B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
gcc
antibody
antibody molecule
antibodies
Prior art date
Application number
EA201270365A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270365A1 (ru
Inventor
Самьюэл С. Нам
Эдвард А. Гринфилд
Джон Бабкук
Тереза О'Киф
Шисинь Цин
Original Assignee
Милленниум Фармасьютикалз, Инк.
Эмджен Бритиш Коламбиа
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43900696&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA030827(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Милленниум Фармасьютикалз, Инк., Эмджен Бритиш Коламбиа filed Critical Милленниум Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201270365A1 publication Critical patent/EA201270365A1/ru
Publication of EA030827B1 publication Critical patent/EA030827B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)

Abstract

Описаны антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают GCC. Антитела связывают внеклеточный домен GCC и могут интернализоваться. В некоторых вариантах осуществления антитела являются гуманизированными, химерными или человеческими. Также описаны нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие антитела или их части, рекомбинантные клетки, которые содержат нуклеиновые кислоты, и композиции, содержащие антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Изобретение также обеспечивает терапевтические и диагностические способы с использованием антител и антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в настоящей заявке.

Description

Изобретение относится к молекулам антител, которые связывают GCC, а также к родственным молекулам, например, нуклеиновым кислотам, которые кодируют такие молекул антител, композициям, и соответствующим методам, например, терапевтическим и диагностическим методам.
Предпосылки создания изобретения
Гуанилил циклаза C (GCC) представляет собой трансмембранный рецептор клеточной поверхности, функция которой состоит в поддержании кишечного сока, гомеостаза электролитов и пролиферации клеток, см., например, Carrithers и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3018-3020 (2003). GCC экспрессируется в клетках слизистой оболочки, выстилающей тонкий кишечник, толстый кишечник и прямую кишку (Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). GCC экспрессия поддерживается при злокачественном перерождении эпителиальных клеток кишечника, с экспрессией во всех первичных и метастатических опухолях толстой и прямой кишки (Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc и др. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers и др., Gastroenterology 107: 1653-1661(1994)).
Сущность изобретения
Изобретателями были открыты различные анти-GCC антитела, включая как человеческие, так и мышиные антитела. Таким образом, в одном аспекте изобретение раскрывает молекулу анти-GCC антитела, как описано в настоящей заявке. Молекулы анти-GCC антител пригодны в качестве голых молекул антител и в качестве компонентов иммуноконъюгатов. Таким образом, в другом аспекте, изобретение раскрывает иммуноконъюгаты, содержащие молекулу анти-GCC антитела и терапевтическое средство или метку. Изобретение также раскрывает фармацевтические композиции, содержащие молекулы антиGCC антител и иммуноконъюгаты, описанные в настоящей заявке. Изобретение также раскрывает способы применения молекул анти-GCC антител и иммуноконъюгатов, описанных в настоящей заявке для обнаружения GCC и клеток или тканей, которые экспрессируют GCC; для диагностики, прогнозирования, визуализации или определения стадии GCC-опосредованного заболевания; для модулирования активности или функции GCC белка и для лечения GCC-опосредованного заболевания, такого как описанные в настоящей заявке. В другом аспекте изобретение также раскрывает выделенные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные последовательности молекулы анти-GCC антитела, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и способы молекул анти-GCC антител.
Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящей заявки, полностью включены в качестве ссылки.
Другие характерные особенности, объекты, и преимущества изобретения(й), раскрытые в настоящей заявке, будут понятны из описания и фигур, и из пунктов формулы изобретения.
Описание фигур
На фиг. 1 представлен рост опухоли у 293-GCC#2 несущих SCID мышей, которых лечили с помощью 5F9vc-MMAF, -DM1, и -DM4 по схеме q14d.
На фиг. 2 представлен вес легких мышей, леченных с помощью 0,9%NaCl; 209 антитела в дозе 40 мг/кг; или 5F9 антитела в дозе 10 или 40 мг/кг в день 41 и/п.
На фиг. 3 представлена кривая выживания CT26-hGCC мышей, несущих опухоль, леченных с помощью 5F9 антитела.
На фиг. 4 представлены ELISA анализы связывания с тестируемым антителом, перекрестно реагирующими GCC ортологами.
Подробное описание
Гуанилил циклаза C.
Гуанилил циклаза C (GCC) (также известна как STAR, ST Receptor, GUC2C, и GUCY2C) представляет собой трансмембранный рецептор клеточной поверхности, функция которого состоит в поддержании жидкости кишечника, баланса электролитов и пролиферации клеток (Carrithers и др., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020 (2003); Mann и др., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466 (1997); Pitari и др., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699 (2003)); № доступа NM 004963, каждый из которых включен в настоящую заявку в качестве ссылки). Ее функция опосредуется путем связывания гуанилина (Wiegand и др. FEBS Lett. 311:150-154 (1992)). GCC также представляет собой рецептор для термостабильного энтеротоксина (ST, например, имеющий аминокислотную последовательность NTFYCCELCCNPACAGCY, SEQ ID NO:316) который представляет собой пептид, продуцируемый Е. coli, а также другими возбудителями инфекции (Rao, M.C. Ciba Found. Symp. 112:74-93 (1985); Knoop F.C. и Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72 (1992)). Связывание ST с GCC активирует каскад сигналов, который приводит к заболеванию кишечника, например диарее.
- 1 030827
Нуклеотидная последовательность для GCC человека (№ доступа GenBank NM 004963):
atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg
121 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag
181 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct
241 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt
301 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata
361 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc
421 atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg
481 atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg
541 cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag
601 gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc
661 ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac
721 aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt
781 gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac
841 tttgaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct
901 cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac
961 tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt
1021 gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt
1081 gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg
1141 cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac
1201 gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt
1261 cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact
1321 ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat
1381 tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag
1441 accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc
1501 cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac
1561 aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagttgct tcagattgac
1621 tattacaacc tgaccaagtt ctacggcaca gtgaaacttg ataccatgat cttcggggtg
1681 atagaatact gtgagagagg atccctccgg gaagttttaa atgacacaat ttcctaccct
1741 gatggcacat tcatggattg ggagtttaag atctctgtct tgtatgacat tgctaaggga
1801 atgtcatatc tgcactccag taagacagaa gtccatggtc gtctgaaatc taccaactgc
1861 gtagtggaca gtagaatggt ggtgaagatc actgattttg gctgcaattc cattttacct
1921 ccaaaaaagg acctgtggac agctccagag cacctccgcc aagccaacat ctctcagaaa
- 2 030827
1981 ggagatgtgt acagctatgg gatcatcgca caggagatca tcctgcggaa agaaaccttc
2041 tacactttga gctgtcggga ccggaatgag aagattttca gagtggaaaa ttccaatgga
2101 atgaaaccct tccgcccaga tttattcttg gaaacagcag aggaaaaaga gctagaagtg
2161 tacctacttg taaaaaactg ttgggaggaa gatccagaaa agagaccaga tttcaaaaaa
2221 attgagacta cacttgccaa gatatttgga ctttttcatg accaaaaaaa tgaaagctat
OOQ 1 rHrrrmfn r>4· о лл+rrrrn о у» о ггп гг ζ,Λυι αι^,^,αιαννι ι^,αινν^,αν^, ινιανα^,νια ιαιινιν^,αα αννι^,^,αανα
2341 gaaaggacac agctgtacaa ggcagagagg gacagggctg acagacttaa ctttatgttg
2401 cttccaaggc tagtggtaaa gtctctgaag gagaaaggct ttgtggagcc ggaactatat
2461 gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc
2521 acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt
2581 gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt
2641 ttgcctaaga gaaatggcaa tcggcatgca atagacattg ccaagatggc cttggaaatc
2701 ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaat atggattcgc
2761 attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat gcctcgttat
2821 tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg
2881 agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt
2941 tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg
3001 actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag
3061 cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca
3121 gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tctggaatac
3181 ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa (SEQ Ш N0:227)
Аминокислотная последовательность для GCC человека (№ доступа GenPept NP 004954):
mktllldlal wsllfqpgwl sfssqvsqnc hngsyeisvl mmgnsafaep lknledavne
- 3 030827 gleivrgrlq naglnvtvna tfmysdglih nsgdcrsstc egldllrkis naqrmgcvli
121 gpsctystfq myldtelsyp misagsfgls cdyketltrl msparklmyf lvnfwktndl
181 pfktyswsts yvykngtete dcfwylnale asvsyfshel gfkvvlrqdk efqdilmdhn
241 rksnviimcg gpeflyklkg dravaedivi ilvdlfndqy fednvtapdy mknvlvltls
301 pgnsllnssf smlsptkrd falaylngil lfghmlkifl engenittpk fahafrnltf
361 egydgpvtld dwgdvdstmv llytsvdtkk ykvlltydth vnktypvdms ptftwknskl
421 pnditgrgpq ilmiavftlt gavvllllva llmlrkyrkd yelrqkkwsh ippenifple
481 tnetnhvslk idddkrrdti qrlrqckydk krvilkdlkh ndgnftekqk ielnkllqid
541 yynltkfygt vkldtmifgv ieycergslr evlndtisyp dgtfmdwefk isvlydiakg
601 msylhsskte vhgrlkstnc vvdsrmvvki tdfgcnsilp pkkdlwtape hlrqanisqk
661 gdvysygiia qeiilrketf ytlscrdrne kifrvensng mkpfrpdlfl etaeekelev
721 yllvkncwee dpekrpdfkk iettlakifg lfhdqknesy mdtlirrlql ysmlehlve
781 ertqlykaer dradrlnfml lprlvvkslk ekgfvepely eevtiyfsdi vgfttickys
841 tpmevvdmln diyksfdhiv dhhdvykvet igdaymvasg Ipkmgnrha idiakmalei
901 lsfmgtfele hlpglpiwir igvhsgpcaa gvvgikmpry clfgdtvnta srmestglpl
961 rihvsgstia ilkrtecqfl yevrgetylk grgnettywl tgmkdqkfnl ptpptvenqq
1021 rlqaefsdmi anslqkrqaa girsqkprrv asykkgtley lqlnttdkes tyf (SEQ Ш N0:228)
GCC белок имеет несколько общеизвестных доменов, каждый из которых способствует отдельной функции GCC молекулы. Части GCC включают сигнальную последовательность (для нацеливания белка на клеточную поверхность) от аминокислотного остатка 1 до приблизительно остатка 23, или остаток 1 до приблизительно остатка 21 SEQ ID NO: 228 (вырезается для созревания с образованием функционального зрелого белка от аминокислотных остатков 22 или 24 до 1073 SEQ ID NO: 228), внеклеточный домен для лиганда, например гуанилина или ST, связывание от аминокислотного остатка 24 до приблизительно остатка 420, или приблизительно остатка 54 до приблизительно остатка 384 SEQ ID NO: 228, трансмембранный домен от приблизительно аминокислотного остатка 431 до приблизительно остатка 454, или приблизительно остатка 436 до приблизительно остатка 452 SEQ ID NO: 228, домен гомологии киназы, предсказано, что имеет активность тирозинкиназы от приблизительно аминокислотного остатка 489 до приблизительно остатка 749, или приблизительно остатка 508 до приблизительно остатка 745 SEQ ID NO: 228 и каталитический домен гуанилил циклазы от приблизительно остатка 750 до приблизительно остатка 1007, или приблизительно остатка 816 до приблизительно остатка 1002 SEQ ID NO: 228.
В нормальных тканях человека, GCC экспрессируется в тканях слизистой оболочки, например, в мембранах апикальной щеточной каемки, выстилающей тонкий кишечник, толстый кишечник и прямую кишку (Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). GCC экспрессия поддерживается при опухолевой трансформации эпителиальных клеток кишечника, с экспрессией во всех первичных и метастатических опухолях ободочной и прямой кишки (Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc и др. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers и др., Gastroenterology 107: 1653-1661(1994)). Опухолевые клетки из желудка, пищевода и желудочно-пищеводного соединения также экспрессируют GCC (см., например, патент US № 6767704; Debruyne и др. Gastroenterology 130: 1191-1206 (2006)). Тканеспецифическая экспрессия и взаимосвязь со злокачественным новообразованием, например, желудочнокишечного происхождения, (например, раком ободочной кишки, раком желудка, или раком пищевода), может использоваться для применения GCC в качестве диагностического маркера для этого заболевания (Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc и др. Eur J Cancer 41: 1618-1627(2005)).
В качестве белка клеточной поверхности, GCC также служит в качестве терапевтической мишени для белков, связывающихся с рецептором, таких как антитела или лиганды. В нормальной ткани кишечника, GCC экспрессируется на апикальной стороне эпителиальных клеток плотных сочленений, которые образуют непроницаемый барьер между окружающей средой просвета и сосудистым компартментом (Almenoff и др., Mol Microbiol 8: 865-873); Guarino и др., Dig Dis Sci 32: 1017-1026 (1987)). В связи с этим системное внутривенное введение GCC-связывающего белка терапевтически будет оказывать минимальное влияние на кишечные GCC рецепторы, в то время как обеспечивая доступ к опухолевым клеткам желудочно-кишечной системы, включая инвазивные или метастатические клетки рака ободочной кишки,
- 4 030827 внекишечным или метастатическим опухолям ободочной кишки, опухолям пищевода или опухолям желудка, аденокарценоме в желудочно-пищеводном соединение. Дополнительно GCC интернализуется путем опосредованного рецептором эндоцитоза при связывании лиганда (Buc и др. Eur J Cancer 41: 16181627 (2005); Urbanski и др., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995)).
Поликлональные антитела, выработанные к внеклеточному домену GCC (Nandi и др. Protein Expr. Purif. 8: 151-159 (1996)), способны ингибировать связывание ST пептида с GCC человека и крысы и ингибировать ST-опосредованную cGMP продукцию с помощью GCC человека.
GCC охарактеризован в качестве белка, задействованного в злокачественные новообразования, включая злокачественные новообразования ободочной кишки. См. также, Carrithers и др., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc и др. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers и др., Gastroenterology 107: 1653-1661(1994); Urbanski и др., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995). Терапевтические средства молекулы антител, нацеленные на GCC, могут использовать самостоятельно в неконъюгированной форме, ингибируя, таким образом, GCC-экспрессирующие раковые клетки. Молекулы анти-GCC антител в соответствии с изобретением могут связывать GCC человека. В некоторых вариантах осуществления молекула анти-GCC антитела в соответствии с изобретением может ингибировать связывание лиганда, например гуанилин или термостабильного энтеротоксина с GCC. В других вариантах осуществления, молекула анти-GCC антитела в соответствии с изобретением не ингибирует связывание лиганда, например, гуанилина или термостабильного энтеротоксина с GCC.
Моноклональные антитела, специфические для GCC, включают GCC:B10 (Nandi и др., J. Cell. Biochem. 66: 500-511 (1997)), GCC:4D7 (Vijayachandra и др. Biochemistry 39:16075-16083 (2000)) и GCC:C8 (Bakre и др. Eur. J. Biochem. 267:179-187 (2000)). GCC:B10 имеет каппа легкую цепь и IgG2a изотип и перекрестно реагирует с GCC крысы, свиньи и обезьяны. GCC:B10 связывается с первыми 63 аминокислотами внеклеточного домена, специфически с остатками 470-480 SEQ ID NO: 228 (Nandi и др. Protein Sci. 7: 2175-2183 (1998)). GCC:4D7 связывается с доменом гомологии киназы, в пределах остатков 491568 GCC (Bhandari и др. Biochemistry 40: 9196-9206 (2001)). GCC:C8 связывается с протеин-киназа подобным доменом в цитоплазматической части GCC.
Определения и методы
Если специально в настоящей заявке не указано иначе, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области техники. В целом, номенклатура, используемая в связи с, и техниками, культур клеток и тканей, молекулярной биологии, и химии и гибридизации белков и олиго-или полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, представляет собой номенклатуру, известную в данной области. Номера доступов GenBank или GenPept и пригодные последовательности нуклеиновых кислот и пептидов можно найти на веб-сайте, поддерживаемым Национальным центром биотехнологической информации (National Center for Biotechnological Information, Bethesda MD). Стандартные техники используются для рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов, и культивирования тканей и трансформации и трансфекции (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и техники очистки осуществляли в соответствии с указаниями производителей или как общепринято осуществляется в данной области или как описано в настоящей заявке. Вышеприведенные техники и процедуры в целом осуществляли в соответствии с методами, известными в данной области, например, как описано в различных общих и более специфических ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящей заявке. См., например, Sambrook и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000)) или см. в целом, Harlow, E. и Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Номенклатура, используемая в связи с, и лабораторные процедуры и техники, аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящей заявке, известны в данной области техники. Стандартные техники используются для химических синтезов, химических анализов, фармацевтических препаратов, приготовлений, доставки и лечения пациентов. Кроме того, если контекстом не требуется иное, термины в единственном числе будут включать множественность и термины во множественном числе будут включать единственные числа.
Как используется в настоящей заявке, термин молекула антитела относится к антителу, пептиду (ам) антитела) или иммуноглобулину, или антигенсвязывающему фрагменту любой из вышеупомянутых структур, например, антитела. Молекулы антител включают одноцепочечные молекулы антител, например, scFv, см., например, Bird и др. (1988) Science 242: 423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), и молекулы антител с одним доменом, см., например WO 9404678. Хотя не в пределах термина молекулы антител, изобретение также включает аналог (и) антитела, другие каркасы на основе белков, отличающиеся от молекулы антитела, например, слитые белки и/или иммуноконъюгаты, которые используют CDR для обеспечения специфического связывания антигена.
Молекула анти-GCC антитела относится к молекуле антитела (то есть, антителу, антигенсвязывающему фрагменту антитела или аналогу антитела), который взаимодействует с или распознает, например, связывается (например, связывается специфически) с GCC, например, GCC человека. Примерами молекул анти-GCC антител являются молекулы, которые обобщенно представлены в табл. 1 и 2.
- 5 030827
Как используется в настоящей заявке, термин антитело, пептид(ы) антитела или иммуноглобулин относится к одноцепочечным, двухцепочечным, и многоцепочечным белкам и гликопротеинам. Термин антитело включает поликлональные, моноклональные, химерные, CDR-привитые и человеческие или гуманизированные антитела, все они обсуждаются более подробно в настоящей заявке ниже. Также этот термин охватывает верблюжьи антитела, см., например, US2005/0037421, и нанотела, например, IgNAR (акульи антитела), см., например, WO 03/014161. Термин антитело также включает синтетические и генетически сконструированные варианты.
Как используется в настоящей заявке, термин фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент антитела относится, например, к Fab, Fab', F(ab')2, и Fv фрагментам, одноцепочечным антителам, функциональным тяжелым цепям антител (нанотелам), а также к любой другой части антитела, имеющего специфичность по меньшей мере к одному желательному эпитопу, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание (например, фрагмент, имеющий достаточные CDR последовательности и имеющий достаточные последовательности каркасных участков таким образом, что он связывается специфически с эпитопом). Например, антигенсвязывающий фрагмент может конкурировать за связывание с эпитопом, который связывает антитело, из которого имеет происхождение фрагмент. Имеет происхождение, как используется в данном и аналогичном контексте, не предполагает любого конкретного метода или процесса дериватизации, но может относиться только к сходству последовательностей. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью рекомбинантных техник, или путем ферментативного или химического расщепления интактного антитела. Термин, антигенсвязывающий фрагмент, когда используется для одной цепи, например, тяжелой цепи, антитела, имеющего легкую и тяжелую цепь, обозначает, что фрагмент цепи является достаточным для того, чтобы при спаривании с полным вариабельным участков другой цепи, например, легкой цепи, предоставлял возможность связывания по меньшей мере 25, 50, 75, 85 или 90% этого указанного фрагмента с цельным тяжелым и легким вариабельным участком.)
Термин, антигенсвязывающая комбинация CDR или количество CDR, достаточных для предоставления возможности связывания (и сходные понятия), как используется в настоящей заявке, относится к достаточным CDR цепи, например, тяжелой цепи, таким образом, что при помещении в каркасный участок и спаривании с полным вариабельным участком другой цепи, или с частью вариабельного участка другой цепи сходной длины и имеющего аналогичное количество CDR, например, легкой цепи, предоставляется возможность связывания, например, по меньшей мере 25, 50, 75, 85 или 90% этого указанного фрагмента с цельным тяжелым и легким вариабельным участком.
Как используется в настоящей заявке, термин антитело человека включает антитело, которая имеет последовательность, имеющую происхождение из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, такое как антитело, полученное от трансгенных мышей, имеющих гены иммуноглобулинов человека (например, XENOMOUSE™ генетически сконструированные мыши (Abgenix, Fremont, CA)), библиотеки фаговых дисплеев человека, миеломные клетки человека, или B-клетки человека.
Как используется в настоящей заявке, термин гуманизированное антитело относятся к антителу, которое имеет происхождение из антитела, отличающегося от человека, например, грызуна (например, мышиное) которое сохраняет или существенно сохраняет антигенсвязывающие свойства родительского антитела, но является менее иммуногенным у людей. Гуманизированное, как используется в настоящей заявке, охватывает деммунизированные антитела. Типично гуманизированные антитела включают нечеловеческие CDR и человеческие или имеющие происхождение от человека каркасные и константные участки.
Термин модифицированное антитело, как используется в настоящей заявке, относится к антителам, которые приготовлены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных средств, такие как антитела, экспрессированные с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфектированного в клетку-хозяин, антитела, выделенные их рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши, овцы или козы), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека или антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других средств, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие модифицированные антитела включают гуманизированные, CDR привитые (например, антитело, имеющее CDR из первого антитела и каркасный участок из другого источника, например, второго антитела или консенсусного каркасного участка), химерные, созданные in vitro (например, путем фагового дисплея) антитела, и необязательно могут включать вариабельные или константные участки, имеющие происхождение их последовательностей зародышевых линий иммуноглобулинов человека или генов иммуноглобулинов человека или антитела, которые приготовлены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью любых средств, которые задействуют сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с альтернативными последовательностями иммуноглобулинов. В вариантах осуществления модифицированная молекула антитела включает молекулу антитела, имеющую последовательность, измененную относительно сравнительного антитела.
Термин моноспецифическое антитело относится к антителу или препарату антител, который про
- 6 030827 являет одну связывающую специфичность и аффинность к конкретному этитопу. Этот термин включает моноклональное антитело или композицию моноклональных антител.
Термин биспецифическое антитело или бифункциональное антитело относится к антителу, которое проявляет двойную связывающую специфичность к двум эпитопам, где каждый связывающий сайт отличается и распознает другой эпитоп.
Термины неконъюгированное антитело и оголенное антитело используются взаимозаменяемо по отношению к молекуле антитела, которая не конъюгирована с компонентом, не представляющим собой антитело, например, терапевтическим средством или меткой.
Термины иммуноконъюгат, конъюгат антитела, конъюгат лекарственного средства и антитела, и ADC используются взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое конъюгировано с компонентом, не представляющим собой антитело, например, терапевтическим средством или меткой.
Термин средство используется в настоящей заявке для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекуле, или экстракту, полученному из биологических материалов. Термин терапевтическое средство относится к агенту, который имеет биологическую активность.
Термин противораковое средство или химиотерапевтическое средство используется в настоящей заявке по отношению к средствам, которые имеют функциональное свойство ингибирования развития или прогрессирования опухоли у человека, в особенности злокачественного (ракового) очага, такого как карцинома, саркома, лимфома, или лейкоз. Ингибирование метастазирования или ангиогенеза часто является свойством противораковых или химиотерапевтических средств. Химиотерапевтическое средство может представлять собой цитотоксический или цитотоксический агент. Термин цитотоксический агент относится к агенту, который ингибирует или подавляет рост клеток и/или размножение клеток.
Цитотоксические агенты относится к соединениям, которые вызывают клеточную гибель главным образом путем нарушения непосредственно функционирования клеток, включая, но не ограничиваясь только ими, алкилирующие средства, ингибиторы фактора некроза опухоли, интеркаляторы, ингибиторы микротрубочек, ингибиторы киназы, ингибиторы протеасом и ингибиторы топоизомеразы. Токсичная нагрузка, как используется в настоящей заявке, относится к достаточному количеству цитотоксического агента, которое, при доставке в клетки, приводит к клеточной гибели. Доставка токсичной нагрузки может осуществляться путем введения достаточного количества иммуноконъюгата, содержащего антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению и цитотоксический агент. Доставка токсичной нагрузки также может осуществляться путем введения достаточного количества иммуноконъюгата, содержащего цитотоксический агент, где иммуноконъюгат включает вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который распознает и связывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению.
Как используется в настоящей заявке фраза, последовательность, имеющая происхождение из или специфическая для обозначенной последовательности относится к последовательности, которая содержит непрерывную последовательность около по меньшей мере 6 нуклеотидов или по меньшей мере 2 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 9 нуклеотидов или по меньшей мере 3 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10-12 нуклеотидов или 4 аминокислот, или по меньшей мере приблизительно 15-21 нуклеотидов или 5-7 аминокислот, соответствующих, то есть, идентичных или комплементарных, например, непрерывному участку указанной последовательности. В определенных вариантах осуществления, последовательность содержит все из указанной нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Последовательность может быть комплементарной (в случае полинуклеотидной последовательности) или идентичной участку последовательности, который является уникальным для конкретной последовательности, как определено с помощью техник, известных в данной области. Участки, из которых последовательности могут быть получены, включают, но ограничиваясь только ими, участки, кодирующие специфические эпитопы, участки, кодирующие CDR, участки, кодирующие каркасные последовательности, участки, кодирующие участки константных доменов, участки, кодирующие участки вариабельных доменов, а также нетранслируемые и/или нетранскрибируемые участки. Производная последовательность не обязательно физически имеет происхождение из последовательности, представляющей интерес в данном исследовании, но может быть создана любым способом, включая, но не ограничиваясь только ими, химический синтез, репликацию, обратную транскрипцию или транскрипцию, которая основывается на информацией, предоставляемой последовательностью оснований в участке (ах), из которых имеет происхождение полинуклеотид. Как таковая, она может представлять собой смысловую или антисмысловую ориентацию исходного полинуклеотида. Дополнительно, комбинации участков, соответствующие таковым указанной последовательности, могут быть модифицированы или комбинированы с помощью способов, известных в данной области, в соответствии с предназначенным применением. Например, последовательность может содержать две или больше непрерывные последовательности, где каждая содержит часть указанной последовательность и прервана участком, который не является идентичным указанной последовательности, но представляет последовательность, имеющую происхождение из указанной последовательности. По отношению к молекулам антител, имеющие происхождение из них включает молекулу антитела, которая функционально или структурно относится к сравниваемо
- 7 030827 му антителу, например, имеющие происхождение из них включает молекулу антитела, имеющую сходную или по существу аналогичную последовательность или структуру, например, имеющую аналогичные или сходные CDR, каркасные или вариабельные участки. Имеющие происхождение из них для антитела также включает остатки, например один или несколько, например 2, 3, 4, 5, 6 или больше остатков, которые могут быть непрерывными или могут не быть непрерывными, но определены или идентифицированы в соответствии со схемой нумерации или гомологии с общей структурой антитела или трехмерной близости, то есть, в пределах CDR или каркасного участка, сравниваемой последовательности. Термин имеющие происхождение из них не ограничиваются физически имеющими происхождение из них, но включают генерацию с помощью любого способа, например, путем применение информации о последовательности из сравниваемого антитела для создания другого антитела.
Как используется в настоящей заявке, фраза кодируется относится к нуклеиновокислотной последовательности, которая кодирует полипептидную последовательность, где полипептидная последовательность или ее часть содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 3-5 аминокислот, по меньшей мере 8-10 аминокислот, или по меньшей мере 15-20 аминокислот из полипептида, кодируемого нуклеиновокислотной последовательностью.
Расчет гомологии между двумя последовательностями можно осуществлять следующим образом. Последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, вводят бреши в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеотидную последовательность для оптимального выравнивания и негомологичные последовательности можно не учитывать для сравнения). Длина сравнительной последовательности, которую выравнивают для сравнения, составляет по меньшей мере 30, 40 или 50%, по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 100% длины сравнительной последовательности. После этого сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято аналогичным аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в указанном положении (как используется в настоящей заявке идентичность аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна гомологии аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества идентичных положений, общих для последовательностей, принимая во внимание количество брешей, и длину каждой бреши, которые необходимо включать для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Сравнение последовательностей и определение процента гомологии между двумя последовательностями может осуществляться с помощью математического алгоритма. Процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью любого метода, известного в данной области техники. Например, Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), алгоритм, который включен в программу GAP в пакет программного обеспечения GCG, используя либо матрицу Blossum 62 или матрицу PAM250, и вес бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5, или 6. Процент гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями также можно определить с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (Accelerys, Inc. San Diego, CA), используя NWSgapdna.CMP матрицу и вес бреши 40, 50, 60, 70, или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5, или 6. Примером набора параметров для определения гомологии является матрица подсчета Blossum 62 со штрафом за брешь 12, штрафом за удлинение бреши 4, и а штрафом за сдвиг рамки считывания бреши 5.
Как используется в настоящей заявке, термин гибридизируется в строгих условиях описывает условия для гибридизации и промывки. Указания относительно осуществления реакций гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Можно использовать водные и неводные методы, описанные в этой ссылке, и в другом источнике. Специфическими условиями гибридизации, как упоминается в настоящей заявке, являются следующие условия: 1) гибридизация в условиях пониженной строгости в 6X хлориде натрия /цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°C, с последующими двумя промывками в 0,2X SSC, 0,1% SDS по меньшей мере при 50°C (температуру промывок можно повысить до 55°C для условий пониженной строгости); 2) гибридизация в условиях средней строгости в 6X SSC приблизительно при 45°C, с последующими одной или двумя промывками в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 60°C; 3) гибридизация в условиях высокой строгости в 6X SSC приблизительно при 45°C, с последующей одной или двумя промывками в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 65°C; и 4) условиями для гибридизации при очень высокой строгости являются 0,5M фосфат натрия, 7% SDS при 65°C, с последующей одной или двумя промывками при 0,2X SSC, 1% SDS при 65°C. Чрезвычайно строгие условия (4) часто являются предпочтительными условиями и они должны использоваться, если специально не указано иначе.
Подразумевается, что антитела и их антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут иметь дополнительные консервативные или несущественные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на функции полипептидов. Будет или нет конкретная замена переносимой, то есть не будет отрицательно изменять желательные биологические свойства, такие как связывающая активность, можно определить, как описано в Bowie, JU и др. Science 247:1306-1310 (1990) или Padlan и др. FASEB J. 9:133-139 (1995). Консервативная аминокислотная замена представляет собой заме
- 8 030827 ну, при которой аминокислотный остаток замен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Заменимый аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен из последовательности дикого типа связывающего средства, например антитела, без аннулирования или, без существенного изменения биологической активности, тогда как для незаменимого аминокислотного остатка это приводит к такому изменению. В антителе, незаменимый аминокислотный остаток может представлять собой остаток, определяющий специфичность (SDR).
Как используется в настоящей заявке, термин выделенный относится к материалу, который удален из его исходной окружающей среды (например, естественной среды, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но аналогичный полинуклеотид или ДНК или полипептид, отделенный от части или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такой полинуклеотид может представлять собой часть вектора и/или такой полинуклеотид или полипептид может представлять собой часть композиции, например смеси, раствора или суспензии или содержится в выделенной клетке или культивируемой клетке, которая содержит полинуклеотид или полипептид, и также является выделенной, так как вектор или композиция не является частью его природной окружающей среды.
Как используется в настоящей заявке, термин репликон относится к любому генетическому элементу, такому как плазмида, хромосома или вирус, который ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке.
Как используется в настоящей заявке, термин функционально связанный относится к ситуации, где описанные компоненты находятся во взаимоотношениях, которые предоставляют возможность им функционировать их предназначенным образом. Таким образом, например, контрольная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности осуществляется в условиях, согласованный с контрольной последовательностью.
Как используется в настоящей заявке, термин вектор относится к репликону, к которому присоединен другой полинуклеотидный сегмент, таким образом, что осуществляется репликация и/или экспрессия кодирующей последовательности.
Как используется в настоящей заявке, термин контрольная последовательность относится к полинуклеотидной последовательности, которая необходима для осуществления экспрессии кодирующей последовательности, к которой она лигирована. Природа таких контрольных последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина. У прокариот такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и терминаторы и, в некоторых случаях, энхмансеры. Таким образом, термин контрольная последовательность включает как минимум все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии, и также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является благоприятным, например лидерные последовательности.
Как используется в настоящей заявке, термин очищенный продукт относится к приготовлению продукта, который был выделен из клеточных компонентов, с которыми продукт нормально связан и/или из других типов клеток, которые могут присутствовать в образце, представляющем интерес.
Как используется в настоящей заявке, термин эпитоп относится к белковой детерминанте, способности специфически связываться с антителом. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностно сгруппированных молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Некоторые эпитопы представляют собой линейные эпитопы, тогда как другие представляют собой конформационные эпитопы. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, где непрерывная аминокислотная первичная последовательность содержит распознаваемый эпитоп. Линейный эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, и чаще, по меньшей мере 5, например, от приблизительно 8 до приблизительно 10 непрерывных аминокислот. Конформационный эпитоп может возникать из по меньшей мере двух ситуаций, таких как: a) линейная последовательность, которая только подвергается связыванию антителом в определенных белковых конформациях, например, в зависимости от связывания лиганда, или в зависимости от модификации (например, фосфорилирования) сигнальными молекулами; или b) комбинирования характерных структурных признаков из более чем одной части белка, или в белках, состоящих из нескольких субъединиц, из более, чем одной субъединицы, где характерные признаки находятся в достаточно тесной близости в 3-х мерном пространстве для участвования в связыва
- 9 030827 нии.
Как используется в настоящей заявке, изотип относится к классу антител (например, IgM или IgGl), который кодируются генами константных участков тяжелых цепей.
Как используется в настоящей заявке, термины обнаруживаемый агент, метка или меченый используется для обозначения инкорпорации обнаруживаемого маркера в полипептид или глиеопротеин. Различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов известны в данной области и могут использоваться. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограниваются, следующие метки: радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, индий (1uIn), йод (131I или 125I), иттрий (90Y), лютеций (177Lu), актиний (225Ac), висмут (212Bi или 213Bi), сера (35S), углерод (14C), тритий (3H), родий (188Rh), технеций (99mTc), празеодимий, или фосфор (32P) или позитрон-эмитирующий радионуклид, например углерод-11 (11C), калий-40 (40K), азот-13 (13N), кислород-15 (15O), фтор-18 (18F), и йод-121 (121I)), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментативные метки (например пероксидаза хрена, бета-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные, биотинильные группы (которые можно обнаружить с помощью меченого авидина, например, молекулы, содержащей стрептавидиновый компонент и флуоресцентный маркер, или ферментативная активность, которая может быть обнаружена с помощью оптических или калориметрических методов), и предетерминированные полипептидные эпитопы, которые распознаются вторичным репортером (например, последовательности пар лейциновых застежек, связывающие сайты для вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяют с помощью спейсерных групп различной длины для уменьшения потенциального стерического затруднения.
Как используется в настоящей заявке, специфическое связывание, связывает(ют) специфически или специфичность связывания обозначает, для молекулы анти-GCC антитела, что молекула антитела связывается с GCC, например, белок GCC человека, с большей аффинностью, чем она связывается с неGCC белком, например, BSA. Обычно анти-GCC молекула будет иметь Kd для не-GCC белка, например, BSA, которое больше чем в 2, больше чем в 10, больше, чем в 100, больше чем в 1,000 раз, больше чем в 104, больше чем в 105, или больше чем в 106 раз его Kd для GCC, например, белка GCC человека. При определении Kd, Kd для GCC и не-GCC белка, например, BSA, должны осуществляться в аналогичных условиях.
Как используется в настоящей заявке, термин лечить или лечение определяется как введение молекулы анти-GCC антитела субъекту, например, пациенту, или введение, например, путем нанесения, на выделенную ткань или клетку из субъекта, которую возвращают субъекту. Молекула анти-GCC антитела может вводиться отдельно или в комбинации с другим средством. Лечение можно осуществлять для лечения, излечения, облегчения, ослабления, изменения, вылечивания, улучшения, смягчения, оздоровления или воздействия на нарушение, симптомы нарушения или предрасположенность к нарушению, например, злокачественное новообразование. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что лечение вызывает ингибирование, удаление, или уничтожение клетки in vitro или in vivo, или других образом уменьшение способности клетки, например, аберрантной клетки, опосредовать нарушение, например, нарушение, как описано в настоящей заявке (например, злокачественное новообразование).
Как используется в настоящей заявке, термин субъект включает млекопитающих, приматов, людей и животных, отличающихся от людей. Например, субъект может представлять собой пациента (например, пациента-человека или ветеринарного пациента), имеющего злокачественное новообразование, например, желудочно-кишечного происхождения (например, рак ободочной кишки), симптом злокачественного новообразования, например, желудочно-кишечного происхождения (например, рак ободочной кишки), где по меньшей мере некоторые клетки экспрессируют GCC, или предрасположенность к злокачественному новообразованию, например, желудочно-кишечного происхождения (например, рак ободочной кишки), где, по меньшей мере, некоторые клетки экспрессируют GCC. Термин животные, отличающиеся от человека согласно изобретению включают всех позвоночных, отличающихся от человека, например, млекопитающих и не-млекопитающих, отличающихся от человека, таких как отличающиеся от человека приматы, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии, рептилии, и др., если специально не указано иначе. В варианте осуществления субъект исключает одну или несколько или все из мышей, крыс, кроликов или коз.
Как используется в настоящей заявке, количество молекулы анти-GCC антитела, эффективное или достаточное для лечения нарушения, или терапевтически эффективное количество или терапевтически достаточное количество относится к количеству молекулы антитела, которого достаточно, при введении в однократной или многократной дозе субъекту, для лечения клетки, например, раковой клетки (например, GCC-экспрессирующей опухолевой клетки), или для пролонгирования выживания, ослабления, облегчения или улучшения для субъекта с нарушением, таким как описанные в настоящей заявке по сравнению с тем, что ожидается при отсутствии такого лечения. Как используется в настоящей заявке, ингибирование роста опухоли или злокачественного новообразования относится к замедлению, прерыванию, купированию или остановке его роста и/или метастазирования и не обязательно включает полное элиминирование роста опухоли.
- 10 030827
Как используется в настоящей заявке, GCC также известен как белок STAR, GUC2C, GUCY2C или ST рецептора относится к GCC млекопитающего, предпочтительно белку GCC человека. GCC человека относится к белку, представленному в SEQ ID NO:228 и его встречающимся в природе аллельным белковым вариантам. Аллель в SEQ ID NO: 228 может кодироваться последовательностью нуклеиновых кислот GCC, представленных в SEQ ID NO: 227. Другие варианты известны в данной области. См., например, номер доступа Ensp0000261170, Ensembl Database, European Bioinformatics Institute and Wellcome Trust Sanger Institute, который имеет лейцин в остатке 281; SEQ ID NO: 14 опубликованной US патентной заявки номер US 20060035852; или GenBank номер доступа AAB19934. Обычно, встречающийся в природе аллельный вариант имеет аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95%, 97% или 99% идентичную GCC последовательности SEQ ID NO:228. Транскрипт кодирует белковый продукт из 1073 аминокислот, и он описан в № доступа GenBank: NM 004963. GCC белок охарактеризован в виде трансмембранного белка клеточной поверхности, и полагают, что он играет решающую роль в поддержании кишечной жидкости, гомеостаза электролитов и пролиферации клеток.
Если специально не указано иначе, термин алкил относится к насыщенному или разветвленному углеводороду, имеющему от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов углерода в них), предпочтительно с от приблизительно 1 до приблизительно 8 атомов углерода. Примерами алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2метил-2-бутил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, и 3,3-диметил-2-бутил.
Алкильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут обозначаться как замещенные. Замещенная алкильная группа представляет собой алкильную группу, которая замещена одной или несколькими группами, предпочтительно 1-3 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из галогена), включая, но не ограничиваясь только ими, -галоген, Ю-ТОТО-алкил), -O(d-C-алкенил), Ю-ТОТО-алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -d-Q-алкенила, -d-Q-алкинила, или -арила, и где указанные Ю-ТОТО-алкил), -O-TO-Q-алкенил), Ю-ТОТО-алкинил), -арильные, -Q-Q-алкильные, -d-Q-алкенильные, и -TOQ-алкинильные группы необязательно могут быть дополнительно замещены одно или несколькими группами, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -C2-C8алкенил, -Q-Q-алкинил, галоген, Ю-Щ-С-алкил), -O-TO-Q-алкенил), Ю-ТОТО-алкинил), -арил, -C(O)R, OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)N(R)2, -NHC(O)R, -SR, SO3R, -S(O)2R, -S(O)R, -OH, -N3, -NH2, -NH(R), -N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -C1-C8алкила, -Q-Q-алкенила, -d-Q-алкинила, или -арила.
Если специально не указано иначе, термины алкенил и алкинил относятся к неразветвленным и разветвленным углеродным цепям, имеющим от приблизительно 2 до приблизительно 20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов углерода в них), предпочтительно с от приблизительно 2 до приблизительно 8 атомов углерода.
Алкенильная цепь имеет по меньшей мере одну двойную связь в цепи и алкинильная цепь имеет по меньшей мере одну тройную связь в цепи. Примеры алкенильных групп включают, но не ограничиваясь только ими, этилен или винил, аллил, -1-бутенил, -2-бутенил, -изобутиленил, -1-пентенил, -2-пентенил, -3-метил-1-бутенил, -2-метил-2-бутенил, и -2,3-диметил-2-бутенил. Примеры алкинильных групп включают, но не ограничиваясь только ими, ацетиленовую, пропаргил, ацетиленил, пропинил, -1-бутинил, -2бутинил, -1-пентинил, -2-пентинил, и -3-метил-1-бутинил.
Как для алкильных групп, алкенильные и алкинильные группы могут быть замещены. Замещенная алкенильная или алкинильная группа представляет собой группу, которая замещена одной или несколькими группами, предпочтительно 1-3 группами (и любые дополнительные заместители выбирают из галогена), включая, но не ограничиваясь только ими, -галоген, Ю-ТОТО-алкил), -O-TO-C-алкенил), Ю-ТО-С-алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -Q-Q-алкиенла, -d-Q-алкинила, или -арила и где указанные -O-(C1-C8алкил), -O-TO-Q-алкенил), -O-TO-Q-алкинил), -арильные, -Q-Q-алкильные, -Q-Q-алкенильные и -C2Q-алкинильные группы необаятельно могут быть дополнительно замещены одним или несколькими заместителями, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -d-Q-алкенил, -d-Q-алкинил, -галоген, Ю-ТОТО-алкил), -O-TO-Q-алкенил), -O-TO-Q-алкинил), -арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)N(R)2, -NHC(O)R, -SR, -SO3R, -S(O)2R, -S(O)R, -OH, -N3, -NH2, -NH(R), -N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -d-Q-алкенила, -C2ТОалкинила, или -арила.
Если специально не указано иначе, термин алкилен относится к насыщенному разветвленному или неразветвленному углеводородному радикалу, имеющему от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов уг
- 11 030827 лерода в них), предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 8 атомов углерода, и имеющему два моновалентные радикальные центры, полученные путем удаления двух атомов водорода от одного или двух различных атомов углерода исходного алкана. Типичные алкилены включают, но не ограничиваясь только ими, метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, окитилен, нонилен, декален, 1,4-циклогексилен и др. Алкиленовые группы, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно могут быть замещены одной или несколькими группами, предпочтительно 1-3 группами (и любые дополнительные заместители выбирают из галогена), включая, но не ограничиваясь только ими, -галоген, -O-(Cl-C8-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -H, -Cl-C8-алкил, -Q-^-алкенил, -Q-Q-алкинил, или -арил и где указанные -O-(Cl-C8-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -арильные, -Q-Q-алкильные, -Q-Q-алкенильные, и -Q-Q-алкинильные группы могут быть необязательно дополнительно замещены одним или несколькими заместителями, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -Q-Q-алкинил, -галоген, -O-(C1-C8-алкил), -O-(C2-C8алкенил), ^-^-^-алкинил), -арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)N(R”)2, -NHC(O)R, -SR,-SO3R,-S(O)2R,-S(O)R,-OH, -N3,-NH2, -NH(R),-N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -Q-Q-алкенила, -Q-Q-алкинила или -арила.
Если специально не указано иначе, термин алкенилен относится к необязательно замещенной алкиленовой группе, содержащей по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Примеры алкениленовых групп включают, например, этенилен (-CH=CH-) и пропенилен (-CH=CHCH2-).
Если специально не указано иначе, термин алкинилен относится к необязательно замещенной алкиленовой группе, содержащей по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь. Примеры алкиниленовых групп включают, например, ацетилен (-CAC-), пропаргил (-CH2C=C-) и 4-пентинил (-CH;,CH;.CH;.C CH-).
Если специально не указано иначе, термин арил относится к моновалентному ароматическому углеводородному радикалу, содержащему 6-20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов углерода в них), полученному путем удаления одного атома водорода от единичного атома углерода исходной ароматической кольцевой системы. Некоторые арильные группы представлены в характерных структурах как Ar. Типичные арильные группы включают, но не ограничиваясь только ими, радикалы, имеющие происхождение из бензола, замещенного бензола, фенила, нафталина, антрацена, бифенила и др.
Арильная группа, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно может быть замещена одной или несколькими, предпочтительно 1-5, или даже 1-2 группами, включая, но не ограничиваясь только ими, -галоген, -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -Q-Q-алкинил, -O-(C1-C8-алкил), -O-(C2-C8алкенил), ^-^-^-алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R% -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO2, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -Q-Q-алкенила, -Q-Q-алкинила, или -арила и где указанные -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенильные, -Q-Q-алкинильные, O-(C1-C8-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2Q-алкинил), и -арильные группы могут быть необязательно дополнительно замещены одним или несколькими заместителями, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -C2Q-алкинил, -галоген, -O-(C1-C8-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)N(R)2, -NHC(O)R, -SR, -SO3R, -S(O)2R, -S(O)R, -OH, -N3, -NH2, -NH(R), -N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -C2Q-алкенила, -Q-Q-алкинила или -арила.
Если специально не указано иначе, термин арилен относится к необязательно замещенной арильной группе, которая является двухвалентной (то есть, получена путем удаления двух атомов водорода из одного и того же или двух различных атомов углерода исходной ароматической кольцевой системы) и может находиться в орто-, мета-, или пара-конфигурациях, как представлено на следующих структурах с фенилом в качестве типично арильной группы:
Типичные -(C1-C8-алкилен)арильные, -(C2-C8-алкенилен)арильные и -(Q-Q-алкинилен)арильные группы включают, но не ограничиваясь только ими, бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан1-ил и др.
Если специально не указано иначе, термин гетероцикл, относится к моноциклической, бициклической, или полициклической кольцевой системе, имеющей от 3 до 14 кольцевых атомов (также обозначаются как кольцевые члены), где по меньшей мере один кольцевой атом по меньшей мере в одном кольце представляет собой гетероатом, выбранный из N, O, P, или S (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов углерода и гетероатомов в них). Гетероцикл может иметь от 1
- 12 030827 до 4 кольцевых гетероатомов, независимо выбранных из N, O, P, или S. Один или несколько атомов N, C, или S в гетероцикле могут быть окислены. Моноциклический гетероцикл предпочтительно имеет от 3 до 7 кольцевых членов (например, 2-6 атомов углерода и 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, O, P, или S), и бициклический гетероцикл предпочтительно имеет от 5 до 10 кольцевых членов (например, 4-9 атомов углерода и 1-3 гетероатома, независимо выбранных из N, O, P или S). Кольцо, которое включает гетероатом, может быть ароматическим или не-ароматическим. Если специально не указано иначе, гетероцикл присоединен к его боковой подвешенной группе на любом гетероатоме или атоме углерода, что приводит к стабильной структуре.
Гетероциклы описаны в Paquette, Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, New York, 1968), в особенности разделы 1, 3, 4, 6, 7 и 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs (John Wiley & Sons, New York, 1950 до настоящего времени), в частности тома 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960).
Если специально не указано иначе, термин гетероцикло относится к необязательно замещенной гетероцикличной группе, как определено выше, которая является двухвалентной (то есть, образована путем удаления двух атомов водорода из одного и того же или двух разных атомов углерода исходной гетероциклической кольцевой системы).
Примеры гетероцикличных групп включают в качестве примера и без ограничений пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксантинил, ЗИ-пирролил. изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3Н-индолил, 1Н-индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4Н-карбазолил, карбазолил, βкарболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксизинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил, и изатиноил. Предпочтительные гетероцикличные группы включают, но не ограничиваясь только ими, бензофуранил, бензотиофенил, индолил, бензопиразолил, кумаринил, изохинолинил, пирролил, тиофенил, фуранил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, триазолил, хинолинил, пиримидинил, пиридинил, пиридонил, пиразинил, пиридазинил, изотиазолил, изоксазолил и тетразолил.
Гетероцикличная группа, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно может быть замещена одной или несколькими группами, предпочтительно 1-2 группами, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -C^Q-алкенил, -C^Q-алкинил, -галоген, -O+Q-Q^km), -O-(C2Cg-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -Н, -Q-Cg-алкила, -C^Cg-алкенила, -C^Cg-алкинила, или -арила и где указанные -O(Q-Cs-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -Q-Q-алкильные, -Q-Q-алкенильные, -C2-C8алкинильные, и -арильные группы могут быть необязательно дополнительно замещены одним или несколькими заместителями, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -C2Q-алкинил, -галоген, O+Q-Q^km), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -арил, -C(O)R,
-OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)N(R)2, -NHC(O)R, -SR, -SO3R, S(O)2R, -S(O)R, -OH, -N3, -NH2, -NH(R), -N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -C2Q-алкенила, -C^Q-алкинила, или арила.
В качестве примера и без ограничений углерод-связанные гетероциклы могут быть связаны в следующих положениях: положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина; положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина; положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина; положении 2, 3, 5 или 6 пиразина; положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола; положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола; положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола, или изотиазола; положении 2 или 3 азиридина; положении 2, 3 или 4 азетидина; положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина; или положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. Еще более типично, углерод-связанные гетероциклы включают 2-пиридил, 3пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, или 5-тиазолил.
В качестве примера и без ограничений азот-связанные гетероциклы могут быть связаны в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина или Ш-индазола; положении 2 изоиндола, или изоиндолина; положении 4
- 13 030827 морфолина; и положении 9 карбазола, или β-карболина. Еще более типично, азот-связанные гетероциклы включают 1-азиридил, 1-азетидил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.
Если специально не указано иначе, термин карбоцикл, относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической моноциклической, бициклической, или полициклической кольцевой системе, имеющей от 3 до 14 кольцевых атомов (и все комбинации и подкомбинации диапазонов и указанных количеств атомов углерода в них), где все из кольцевых атомов представляют собой атомы углерода. Моноциклические карбоциклы предпочтительно имеют от 3 до 6 кольцевых атомов, еще более предпочтительно 5 или 6 кольцевых атомов. Бициклические карбоциклы предпочтительно имеют от 7 до 12 кольцевых атомов, например, организованы в виде бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6] системы, или 9 или 10 кольцевых атомов организованы в виде бицикло [5,6] или [6,6] системы. Термин карбоцикл включает, например, моноциклическое карбоциклическое кольцо, сопряженное с арильным кольцом (например, моноциклическое карбоциклическое кольцо, сопряженное с бензольным кольцом). Карбоциклы предпочтительно имеют от 3 до 8 углеродных кольцевых атомов.
Карбоцикличные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно могут быть замещены, например, одной или несколькими группами, предпочтительно 1 или 2 группами (и любые дополнительные заместители выбирают из галогена), включая, но не ограничиваясь только ими, -галоген, -Ci-G-алкил, -Q-G-алкенил, -G-G-алкинил, -О-Щ-^-алкил), -О-^-^-алкенил), -O-(C2-C8алкинил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH3, -NH(R'), -N(R')2 и -CN, где каждый R' независимо выбирают из -H, -Q-Q-алкила, -G-Q-алкенила, -G-Q-алкинила, или -арил и где указанные -Ci-Q-алкильные. -C2Q-алкенильные, -G-Q-алкинильные, -О-Щ-^-алкил), -О-^-^-алкенил), -О-^-^-алкинил), и -арильные группы могут быть необязательно дополнительно замещены одним или несколькими заместителями, включая, но не ограничиваясь только ими, -Q-Q-алкил, -G-Q-алкенил, -G-Q-алкинил, -галоген, -О-Щ-^-алкил), -О-^-^-алкенил), -О-Щ^^-алкинил), -арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(Q)NHR, -C(Q)N(R)2, -NHC(Q)R, -SR, -SQ3R, -S^R, -S(Q)R, OH, -N3, -NH2, -NH(R), -N(R)2 и -CN, где каждый R независимо выбирают из -H, -Q-G-алкила, -G-G-алкенила, -C2G-алкинила, или -арила.
Примеры моноциклических карбоциклических заместителей включают -циклопропил, -циклобутил, -циклопентил, -1-циклопент-1-енил, -1-циклопент-2-енил, -1-циклопент-3-енил, циклогексил, -1циклогекс-1-енил, -1-циклогекс-2-енил, -1-циклогекс-3-енил, -циклогептил, -циклооктил, -1,3циклогексадиенил, -1,4-циклогексадиенил, -1,3-циклогептадиенил, -1,3,5-циклогептатриенил, и
-циклооктадиенил.
Карбоцикло, независимо от того, используется отдельно или в виде части другой группы, относится к необязательно замещенной карбоцикльной группе, как определено выше, которая является двухвалентной (то есть, получена путем удаления двух атомов водорода из одного и того же или двух различных атомов углерода исходной карбоциклической кольцевой системы).
Если из контекста очевидно не следует иное, дефис (-) обозначает точку присоединения боковой молекулы. Таким образом, термин -(C1-C8-алкилен)арил или
-C1-C8-алкилен(арил) относится к Q-G-алкиленовому радикалу, как определено в настоящей заявке, где алкиленовый радикал присоединен к боковой молекуле на любом из атомов углерода алкиленового радикала и один из атомов водорода, связанный с атомом углерода алкиленового радикала, заменен арильным радикалом, как определено в настоящей заявке.
Если конкретная группа является замещенной, то эта группа может иметь один или несколько заместителей, предпочтительно от одного до пяти заместителей, более предпочтительно от одного до трех заместителей, наиболее предпочтительно от одного до двух заместителей, независимо выбранных из перечня заместителей. Тем не менее, группа может в целом иметь любое количество заместителей, выбранных из галогена. Группы, которые замещены, таким образом указаны.
Подразумевается, что определение любого заместителя или переменной в конкретной локализации в молекуле является независимым от его определения где-нибудь в другом месте в этой молекуле. Подразумевается, что заместители и характер замещения на соединениях согласно изобретению может быть выбран специалистом в данной области техники таким образом, чтобы обеспечить соединения, которые химически стабильны и которые легко могут быть синтезированы с помощью техник, известных в данной области, таких как методы, как указано в настоящей заявке.
Защитные группы, как используется в настоящей заявке, относятся к группам, которые селективно блокируют, либо временно или постоянно, один реакционно-способные сайт во многофункциональном соединении. Подходящие гидрокси-защитные группы для применения в настоящем изобретении являются фармацевтически приемлемыми и могут нуждаться или не нуждаться в отщеплении от исходного соединения после введения субъекту для проявления активности соединения. Отщепление осуществляется путем нормальных метаболических процессов в организме. Гидроксизащитные группы хорошо известны в данной области, см., Protective Groups in Огдашс Synthesis под ред. Т. W. Greene и Р. G. M. Wuts (John Wiley & sons, 3-ье издание), включенное в настоящую заявку полностью в качестве ссылки и для всех
- 14 030827 целей и включают, например, простоэфирные (например, алкиловые эфиры и силиловые эфиры, включая, например, диалкилсилиловый эфир, триалкилсилиловый эфир, диалкилалкоксисилиловый эфир), сложноэфирные, карбонатные, карбаматные, сульфонатные, и фосфатные защитные группы. Примеры гидрокси защитных групп включают, но не ограничиваясь только ими, метиловый эфир; метоксиметиловый эфир, метилтиометиловый эфир, (фенилдиметилсилил)метоксиметиловый эфир, бензилоксиметиловый эфир, н-метоксибензилоксиметиловый эфир, р-нитробензилоксиметиловый эфир, онитробензилоксиметиловый эфир, (4-метоксифенокси)метиловый эфир, гваяколметиловый эфир, третбутоксиметиловый эфир, 4-пентенилоксиметиловый эфир, силоксиметиловый эфир, 2метоксиэтоксиметиловый эфир, 2,2,2-трихлорэтоксиметиловый эфир, бис(2-хлорэтокси)метиловый эфир, 2-(триметилсилил)этоксиметиловый эфир, ментоксиметиловый эфир, тетрагидропираниловый эфир, 1метоксициклогексиловый эфир, 4-метокситетрагидротиопираниловый эфир, 4-метокситетрагидротиопираниловый эфир S,S-диоксид, 1-[(2-хлор-4-метил)фенил]-4-метоксипиперидин-4-иловый эфир, 1-(2-фторфнеил)-4-метоксипиперидин-4-иловый эфир, 1,4-диоксан-2-иловый эфир, тетрагидрофураниловый эфир, тетрагидротиофураниловый эфир; замещенные этиловые эфиры, такие как 1этоксиэтиловый эфир, 1-(2-хлорэтокси)этиловый эфир, 1-[2-(триметилсилил)этокси]этиловый эфир, 1метил-1-метоксиэтиловый эфир, 1-метил-1-бензилоксиэтиловый эфир, 1-метил-1-бензилокси-2фторэтиловый эфир, 1-метил-1-феноксиэтиловый эфир, 2-триметилсилиловый эфир, трет-бутиловый эфир, аллиловый эфир, пропаргиловые эфиры, н-хлорфениловый эфир, н-метоксифениловый эфир, бензиловый эфир, н-метоксибензиловый эфир 3,4-диметоксибензиловый эфир, триметилсилиловый эфир, триэтилсилиловый эфир, трипропилсилиловый эфир, диметилизопропилсилиловый эфир, диэтилизопропилсилиловый эфир, диметилгексилсилиловый эфир, t-бутилдиметилсилиловый эфир, дифенилметилсилиловый эфир, бензоилформиатный сложный эфир, ацетатный сложный эфир, хлорацетатный сложный эфир, дихлорацетатный сложный эфир, трихлорацетатный сложный эфир, трифторацетатный сложный эфир, метоксиацетатный сложный эфир, трифенилметоксиацетатный сложный эфир, фенилацетатный сложный эфир, бензоатный сложный эфир, алкил метил карбонат, алкил 9-флуоренилметил карбонат, алкил этил карбонат, алкил 2,2,2,-трихлорэтил карбонат, 1,1,-диметил-2,2,2-трихлорэтил карбонат, алкилсульфонат, метансульфонат, бензилсульфонат, тозилат, метиленацеталь, этилиденацеталь, и третбутилметилиден кеталь. Предпочтительные защитные группы представлены формулами -R, -Si(R)(R)(R), -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH(R), -S(O^R, -S(O)2OH, P(O)(OH)2, u-P(O)(OH)OR, где R представляет собой Ci-C^-алкил, Q-C^-алкенил, G-C^-алкинил, -Cl-C20-алкилен(карбоцикл), -Q-C^-алкенилен(карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(карбоцикл), -C^Cw-арил, -C1-C20-алкилен(арил), -C^C^-алкенилен(арил), -C2-C20-алкинилен(арил), -C1-C20-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20-алкинилен(гетероцикл), где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, арильные, карбоцикличные, и гетероцикличные радикалы либо отдельно или в виде части другой группы необязательно замещены.
Сокращение AFP относится к диметилвалин-валин-долаизолеиин-долапроин-фенилаланин-nфенилендиамину (см. формулу (XVIII) ниже).
Сокращение MMAE относится к монометил ауристатину E (см. формулу (XIII) ниже).
Сокращение AEB относится к сложному эфиру, полученному путем взаимодействия ауристатина E с параацетил бензойной кислотой (см. формулу (XXII) ниже).
Сокращение AEVB относится к сложному эфиру, полученному путем взаимодействия ауристатина E с бензоилвалериановой кислотой (см. формулу (XXIII) ниже).
Сокращение MMAF относится к монометил ауристатину F (см. формулу (XXI) ниже).
Антитела
В определенных аспектах, изобретение относится к молекулам анти-GCC антител з характерными особенностями, обобщенными в табл. 1 и 2. В других аспектах изобретение относится к молекулам антиGCC антител с характерными особенностями, обобщенными в табл. 3, 4, 5 и/или 6.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела представляет собой антитело гибридомы человека и представляет собой одно из антител 5F9, 5H3, 6H8, 8C2, 10C10, 10D3 и 1D3. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела имеет происхождение из антитела 5F9, 5H3, 6H8, 8C2, 10C10, 10D3, или 1D3. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела продуцируется гибридомой 5F9(PTA-8132).
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела представляет собой выбранное лимфоцитное антитело и представляет собой одно из антител Abx-12, Abx-020, Abx-106, Abx-198, Abx-221, Abx229, Abx-338, и Abx-393. В варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела имеет происхождение из антитела Abx-12, Abx-020, Abx-106, Abx-198, Abx-221, Abx-229, Abx-338, и Abx-393.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела представляет собой мышиное антитело и представляет собой одно из антител mAb 3G1, mAb 8E12, mAb10B8, и mAb 8F1. В варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела имеет происхождение из антитела mAb 3G1, mAb 8E12 и mAb 8F1.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела будет иметь аффинность для GCC, например, как измеряют путем прямого связывания или анализов конкурентного связывания, в диапазоне, описанном в настоящей заявке. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела имеет Kd меньше
- 15 030827 чем 1х10-6М, меньше чем 1х10-7 М, меньше чем 1х10-8 М, меньше чем 1х10-9 М, меньше чем 1х10-10 M, меньше чем 1х10-11 M, меньше чем 1х10-12 M, или меньше чем 1х10-13 M. В варианте осуществления молекула антитела представляет собой IgG, или его антигенсвязывающий фрагмент и имеет Kd меньше чем 1х10-6М, меньше чем 1х10-7 М, меньше чем 1х10-8 M, или меньше чем 1х10-9 M. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела, например 5F9 антитело или антитело, имеющее происхождение из него, имеет Kd от приблизительно 80 до приблизительно 200 рМ, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 150 пМ или приблизительно 120 пМ. В варианте осуществления молекула антиGCC антитела, например 5F9 антитело или антитело, имеющее происхождение из него, имеет ka от приблизительно 0,9 до приблизительно 1,25х105 М-1с-1, предпочтительно приблизительно 1,1х105 M-^-1. В варианте осуществления молекула антитела представляет собой ScFv и имеет Kd меньше чем 1х10-6М, меньше чем 1х10-7 М, меньше чем 1х10-8 M, меньше чем 1х10-9 M, меньше чем 1х10-10 M, меньше чем 1х10-11 M, меньше чем 1х10-12 M, или меньше чем 1х10-13 M.
В вариантах осуществления молекулы антител не представляют собой иммуноконъюгаты, то есть являются оголенными и в вариантах осуществления вызывают клеточную реакцию при связывании с GCC. В родственных вариантах осуществления, клеточная реакция осуществляется с помощью GCCэкспрессирующей клетки, к которой связывается антитело. Такая клеточная реакция может представлять собой передачу сигналов, опосредованную GCC, например, если молекула антитела представляет собой агонист GCC (см., например, опубликованную заявку на патент US № US 20040258687. В других вариантах осуществления клеточная реакция осуществляется вторичной клеткой, например иммунной эффекторной клеткой (например, природной клеткой-киллером), которая распознает молекулу антитела, связанную с GCC на первой клетке. В некоторых вариантах осуществления, контролирующие молекулы, например, молекулы комплементов, контактируют с GCC-связанной молекулой антитела перед клеточной реакцией. Клеточная реакция в этих вариантах осуществления может вызывать смерть GCCэкспрессирующей клетки.
В дальнейших вариантах осуществления молекулы антител, которые представляют собой иммуноконъюгаты, могут вызывать клеточную реакцию при связывании с GCC, а также интернализироваться для доставки агента в GCC-экспрессирующую клетку, с которой они связываются.
В некоторых вариантах осуществления молекула анти-GCC антитела в соответствии с изобретением может блокировать связывание лиганда с GCC.
В варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела не способна проявить существенную перекрестную реакцию с одной или обеими крысиной GCC и мышиной GCC.
В варианте осуществления молекула антитела не представляет собой GCC:B10, GCC:4D7 или GCC:C8. В другом варианте осуществления молекула анти-GCC антитела не связывает внеклеточный домен GCC, приблизительно аминокислотные остатки от 455 до 1073 SEQ ID NO:228. Например, в этом варианте осуществления молекула анти-GCC антитела не связывает домен гомологии киназы или домен гуанилилциклазы GCC.
Встречающаяся в природе структурная единица антитела млекопитающего представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельный участок от приблизительно 100 до 110 или больше аминокислот, первоначально отвечающий за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константный участок, первоначально отвечающий за эффекторную функцию. Легкие цепи можно классифицировать как каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи можно классифицировать как мю, дельта, гамма, альфа, или эпсилон, и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA, и IgE соответственно. В пределах легких и тяжелых цепей, вариабельные и константные участки соединены J участком от приблизительно 12 или больше аминокислот, где тяжелая цепь также включает D участок от приблизительно 10 больше аминокислот. См. в целом, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ред., 2-ое изд. Raven Press, N.Y. (1989)). Вариабельные участки каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют связывающий сайт антитела. Предпочтительные изотипы для молекул анти-GCC антител представляют собой IgG иммуноглобулины, которые можно классифицировать на четыре подкласса, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, имеющие различные гамма тяжелые цепи. Большинство терапевтических антител представляют собой человеческие, химерные или гуманизированные антитела IgG1 типа. В предпочтительном варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела имеет IgG1 изотип.
Вариабельные участки каждой пары тяжелой и легкой цепи образуют антигенсвязывающий сайт. Таким образом, интактное IgG антитело имеет два связывающих сайта, которые являются идентичными. Тем не менее, бифункциональные или биспецифические антитела представляют собой искусственные гибридные конструкции, которые имеют две различные пары тяжелая /легкая цепь, что приводит к двум различным связывающим сайтам.
Цепи все проявляют идентичную общую структуру консервативных каркасных участков (FR), соединенных тремя гипервариабельными участками, также называемых комплементарно определяемые области или CDR. CDR из двух цепей каждой пары выровнены каркасными участками, что предоставля
- 16 030827 ет возможность связываться со специфическим эпитопом. От N-конца до C-конца, как легкие, так и тяжелые цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот в каждом домене осуществляется в соответствии с определениями последовательностями Кабат белков, представляющих иммунологический интерес (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest) (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia и др. Nature 342:878-883 (1989). Как используется в настоящей заявке, CDR обозначаются для каждой тяжелой (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и легкой (LCDR1, LCDR2, LCDR3) цепей.
Молекула анти-GCC антитела может содержать все, или поднабор антигенсвязывающих CDR, одной или обеих, тяжелой и легкой цепи, одного из вышеуказанных антител гибридом человека, выбранного лимфоцита, или мышей. Аминокислотные последовательности участков антител гибридом человека, выбранного лимфоцита, и мышей, включая вариабельные участки и CDR, можно найти в табл. 3 и 5.
Таким образом, в варианте осуществления молекула антитела включает одну или обе из:
(a) одну, две, три, или антигенсвязывающее количество из, CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) одного из вышеуказанных антител гибридом человека, выбранного лимфоцита, или мышей. В вариантах осуществления CDR может (могут) включать аминокислотную последовательность одной или нескольких или всех из LCDR1-3, как указано ниже: LCDR1, или модифицированная LCDR1, где однасемь аминокислот консервативно замещены) LCDR2, или модифицированная LCDR2, где одна или две аминокислоты консервативно замещены); или LCDR3, или модифицированная LCDR3, где одна или две аминокислоты консервативно замещены; и (b) одну, две, три, или антигенсвязывающее количество из, CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3) одного из вышеуказанных антител гибридом человека, выбранного лимфоцита, или мышей. В вариантах осуществления CDR может (могут) включать аминокислотную последовательность одной или нескольких или всех из HCDR1-3, как указано ниже: HCDR1, или модифицированная HCDR1, где одна или две аминокислоты консервативно замещены; HCDR2, или модифицированная HCDR2, где одна-четыре аминокислоты консервативно замещены; или HCDR3, или модифицированная HCDR3, где одна или две аминокислоты консервативно замещены.
Пригодные иммуногены для продуцирования анти-GCC антител включают GCC например, клетки человека, экспрессирующие GCC, (например, опухолевую клеточную линию, например, Т84 клетки, или свежие или замороженные клетки опухоли ободочной кишки, рекомбинантные клетки, экспрессирующие GCC); мембранная фракция клеток, экспрессирующих GCC (например, клеточная линия опухоли ободочной кишки, например, T84 клетки, или свежие или замороженные опухолевые клетки ободочной кишки, рекомбинантные клетки, экспрессирующие GCC, например, HT-29-GCC#2 клетки, которые экспрессируют полноразмерный GCC, или его часть, например, CHO GCC #27 клетки, которые экспрессируют часть, содержащую GCC внеклеточный домен, например, SEQ ID NO: 318); выделенный или очищенный GCC, например, белок GCC человека (например, биохимически выделенный GCC, например, выделенный из клеток опухоли желудочно-кишечного тракта или рекомбинантных клеток, экспрессирующих GCC или его вариант), или его часть (например, внеклеточный домен из GCC, домен гомологии киназы из GCC или каталитический домен гуанилил циклазы из GCC или пептид, соответствующий его части, например, содержащий меньшей мере приблизительно 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 или 32 аминокислотных остатков из SEQ ID NO: 228); или иммуноген, содержащий SEQ ID NO:229 или содержащий его зрелую часть без сигнальной последовательности (то есть без аминокислотных остатков от 1 до приблизительно 21 или 23 SEQ ID NO: 229), например, зрелый TOK107-hIgG белок, SEQ ID NO: 317.
Иммуногены могут быть сопряжены с гетерологичными последовательностями для биохимической манипуляции, очистки, иммунизации или определения титра антител. Такие иммуногены могут содержать часть GCC, например, внеклеточный домен, и часть, содержащую не-GCC полипептид. Существует множество вариантов для конструирования слитого белка для облегчения очистки или иммобилизации на твердую подложку, например, аффинную колонку или микротитровальный планшет или другой подходящий анализируемый субстрат/чип. Например, слитая часть может добавлять домен, например, глутатион^-трансферазы/киназы (GST), который может связывать глутатион; Fc участок иммуноглобулина, который может связывать белок A или белок G; аминокислотные остатки, например, два, три, четыре, пять, предпочтительно шесть гистидиновых остатков, которые могут связывать никель или кобальт на аффинной колонке; эпитопную метку, например, часть c-myc онкогена (myc-метка), FLAG метку (патент US № 4703004), метку гемагглютинина (HA), метку T7 гена 10, метку V5, метку HSV, или метку VSV-G, которая может связывать антитело, специфичное для метки; или кофактор, например, биотин, который может связывать стрептавидин.
Иммуногены, которые содержат Fc часть иммуноглобулина, может удерживать GCC, либо в растворе или присоединенного к клетке, в конфигурации, которая позволяет осуществить структурный доступ к GCC для иммунных контролирующих компонентов хозяина для эффективного создания антитела. Поскольку тяжелые цепи иммуноглобулина, содержащие Fc участки, ассоциированы в димеры с помощью междуцепочечных дисульфидных связей, то иммуногены, получаемые при слиянии с Fc участками, представляют собой димеры. Валентность слитых белков может отображать тип иммуноглобулина, способствующего Fc участку. Например, слияния с IgG белками могут представлять собой димеры, IgA сли
- 17 030827 яния могут создавать тетрамерные иммуногены, и IgM слияния могут создавать декамерные иммуногены, последние два облегчены с ко-трансфекцией J цепи. Примером иммуноглобулина для белка слияния Fc является IgG1. Часть, которая обычно используется, имеет IgG1 шарнир, CH2 и CH3 домены, кодируемые одним экзоном. Поскольку этот экзон также имеет часть CH1 участка, который имеет цистеин, ориентированный на дисульфидную связь с цистеином из легкой цепи, то пригодной модификацией является мутация CH1 цистеина, например, на серин, для обеспечения того, что не будет неспаренного цистеина в слитом белке. Такая мутация также повышает гибкость шарнира.
Fc участок, имеющий происхождение из нехозяйских видов, например, Fc участок Ig человека, для слияния с иммуногеном для иммунизации в хозяйских видах, например, мышах, крысах, кроликах, козах, действует в качестве адъюванта. Эта адъювантная функция может запускать специфические антитела к обеим Fc и GCC эпитопам. Fc-реагирующие антитела могут быть идентифицированы и отбракованы в процессе скрининга. Fc участок может иметь последовательность дикого типа или последовательность, которая была мутирована для модификации эффекторной функции. Например, мутированный константный участок (вариант) может быть инкорпорирован в слитый белок для иммунизации связывания с Fc рецепторами и/или способности фиксировать комплемент, (см., например Winter и др., GB 2209757 B; Morrison и др., WO 89/07142; Morgan и др., WO 94/29351). В предпочтительном примере, лизин 235 и глицин 237, пронумерованные в соответствии со стандартами Fc участка, мутированы, например, на аланин. Иммуноген /слитый белок с Fc-мутированным IgG может иметь уменьшенное взаимодействие с Fc рецепторе в хозяине. Предпочтительный растворимый иммуногенный слитый белок (после созревания для отщепления сигнального пептида и секреции) представляет собой TOK-107-hIgG (старое название hGCC-ECD/hIgG1 Fc), который состоит из аминокислотных остатков от 24 до 430 SEQ ID NO: 228, слитых с мутированным Fc иммуноглобулина IgG1 человека (SEQ ID NO:317).
Для приготовления клеток, экспрессирующих иммуноген, часть иммуноглобулина может быть структурирована для имитирования части иммуноглобулина рецептора B-клетки. Например, Fc участок иммуноглобулина может быть дополнительно слит с полипептидом, содержащим трансмембранный участок из иммунного рецептора, такого как Fcy рецепторы, Fca рецепторы, Fca/μ, рецептор или Fce рецепторы. Надлежащая ориентация такого связанного с клеткой иммуногена Fc рецептора с соответствующей экспозицией на поверхности клетки может быть улучшена, если клетка, экспрессирующая иммуногенный слитый белок, будет также содержать дополнительные компоненты антигенного рецепторного комплекса, например, IgM рецептор B-клетки или IgD рецептор. Подходящие компоненты комплекса включают белки оболочки иммуноглобулина (Ig), такие как MB-1 и B29 (CD79A и CD79B; Hombach и др. Eur. J. Immunol. 20: 2795-2799 (1990) для IgM рецептора), которые образуют гетеродимер. Белки оболочки Ig могут быть обеспечены эндогенно с помощью трансфектированной клетки, например, если трансфектировать клеточную линии лимфомы B-клеток; или путем ко-трансфекции иммуногена с оболочечными белками, например, в отдельном векторе или в одном и том же векторе. Предпочтительные оболочечные белки IgG для иммунизации у мышей представляют собой мышиные CD79a и CD79b (№ доступа GenBank NM 007655 и NM 008339 соответственно). Предпочтительный слитый белок иимуногена, связанного с клеткой (после созревания путем отщепления сигнального пептида и транслокацию на клеточную поверхность) представляет собой TOK111 продукт, состоящий из TOK-107hIgG (hGCC-ECD/hIgG1 Fc), слитого с мышиным IgG2a (например, № доступа GenPept AAB59661) трансмембранным и внутриклеточным доменами (SEQ ID NO: 318).
Пригодные эпитопы, например, эталонные эпитопы, из молекулы GCC, с которыми молекулы антиGCC антител, например, моноклональные антитела, человеческие антитела или гуманизированные антитела, как описано в настоящей заявке, могут связываться, могут быть обнаружены на внеклеточной части GCC. Такие GCC эпитопы могут связывать молекулы антител на поверхности клеток, например, на внешней части клеток.
Например, эпитоп для молекулы анти-GCC антитела может находиться в пределах остатков, или включать остаток (и) от, остатки 1-50 SEQ ID NO: 228, или их фрагмент, который связывает молекулу анти-GCC антитела согласно изобретению, например, их 5F9-связывающий фрагмент. Такие фрагменты могут включать остатки 1-25, 5-30, 10-35, 15-40, 20-45, 25-50, 5-45, 10-40, 15-35, 20-30 или 33-50 SEQ ID NO: 228. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп для молекулы анти-GCC антитела, например, 5F9 антитело, представляет собой конформационный эпитоп, который дополнительно содержит один или больше дополнительных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности GCC за пределами остатка 50, то есть, выбранные от приблизительно остатка 50 до 1073 SEQ ID NO: 228.
В другом примере эпитоп для молекулы анти-GCC антитела может находиться в пределах остатков, или включать остаток (и) от, SEQ ID NO: 225, или остатки 271-300 SEQ ID NO: 228, или их фрагмент, который связывает молекулу анти-GCC антитела согласно изобретению, например, их ABX-198-, 3G1-, 8F1-, или 10B8-связывающий фрагмент. Такие фрагменты могут включать остатки 281-290 SEQ ID NO: 228, или остатки 281-290 SEQ ID NO: 228, где остаток 281 представляет собой лейцин, или остатки 281300 или остатки 271-290 SEQ ID NO: 228. В некоторых вариантах осуществления эпитоп для молекулы анти-GCC антитела, например ABX-198-, 3G1-, 8F1-, или 10B8 антитело, представляет собой конформационный эпитоп, который дополнительно содержит один или больше дополнительных аминокислотных
- 18 030827 остатков, то есть, не-SEQ ID NO: 225 остатки в аминокислотной последовательности GCC, например, выбранные от приблизительно остатка 1 до 270 и/или приблизительно от 301 до 1073 SEQ ID NO: 228.
В другом примере эпитоп для молекулы анти-GCC антитела может находиться в пределах остатков, или включать остаток (и) от SEQ ID NO: 226, или остатки 351-375 SEQ ID NO: 228, или их фрагмент, который связывает молекулу анти-GCC антитела согласно изобретению, например, их ABX-012-, ABX338-, или ABX-106-связывающий фрагмент. Такие фрагменты могут включать 356-370 SEQ ID NO: 228, или остатки 351-370 SEQ ID NO: 228, или остатки 356-375 SEQ ID NO: 228. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп для молекулы анти-GCC антитела, например, ABX-012-, ABX-338-, или ABX-106 антиетло, представляет собой конформационный эпитоп, который дополнительно содержит один или больше дополнительных аминокислотных остатков, то есть, не-SEQ ID NO: 226 остатки в аминокислотной последовательности GCC, например, выбранные от приблизительно остатка 1 до 350 и/или от приблизительно 376 до 1073 SEQ ID NO: 228.
Антитела, выработанные к таким эпитопам или внеклеточному домену, например эпитопам, которые находятся в пределах остатков, или включают остаток (и) от аминокислотных остатков 24 до 420 SEQ ID NO: 228, или их ссылочная часть, например остатки 24-75, 75-150, 150-225, 225-300, 300-375 или 375-420 для GCC, или молекулы антител, имеющие происхождение из них, могут быть пригодны в качестве терапевтических или диагностических антител, как описано в настоящей заявке.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела имеет одно или несколько следующих свойств:
a) она конкурирует за связывание, например, связывание с GCC клеточной поверхности или очищенным GCC, с одной из вышеуказанных молекул анти-GCC антител, обобщенных в табл. 1 и 2, например, антителами гибридомы человека (например, 5F9), выбранными антителами лимфоцитов (например, Abx-229), или мышиными антителами (например, 3G1);
b) она связывается с аналогичным или, по существу, аналогичным, эпитопом на GCC, как и одна из вышеуказанных молекул анти-GCC антител, обобщенных в табл. 1 и 2, например антителами гибридомы человека (например, 5F9), выбранными антителами лимфоцитов (например, Abx-229), или мышиными антителами (например, 3G1). В варианте осуществления, антитело связывается с аналогичным эпитопом, как определено с помощью одного или нескольких пептидных матричных анализов или путем связывания с усеченными мутантами, химерами или точечными мутантами, экспрессируемыми на клеточной поверхности или мембранных препаратах, например, как анализы, которые описаны в настоящей заявке;
c) она связывается с эпитопом, которых имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15 или 20 непрерывных аминокислотных остатков, общих с эпитопом одной из вышеуказанных молекул анти-GCC антител, обобщенных в табл. 1 и 2, например антител гибридомы человека (например, 5F9), выбранных антител лимфоцитов (например, Abx-229) или мышиных антител (например, 3G1);
d) она связывается с участком GCC человека, который связывается анти-GCC антителом согласно изобретению, где участок, например, внеклеточный или цитоплазматический участок, имеет 10-15, 1020, 20-30, или 20-40 остатков в длину, и связывание определяется, например, путем связывания с усеченными мутантами; В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела связывает внеклеточный участок GCC человека. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела может связывать часть GCC человека внеклеточного домена, определяемого аминокислотными остатками 24-420 SEQ ID NO: 228. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела может связывать сайт распознавания гуанилат циклазы в аминокислотных остатках 931-954 SEQ ID NO: 228; или
e) она связывается с эталонным эпитопом, описанным в настоящей заявке.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела связывает GCC последовательность ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEQ ID NO: 225).
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела связывает GCC последовательность FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV (SEQ ID NO: 226).
В варианте осуществления молекула антитела связывает конформационный эпитоп. В других вариантах осуществления молекула антитела связывает линейный эпитоп.
Молекулы анти-GCC антител могут представлять собой поликлональные антитела, моноклональные антитела, моноспецифические антитела, химерные антитела (см. патент US № 6020153) или человеческие или гуманизированные антитела или фрагменты антител или их производные. Синтетические и генетически сконструированные варианты (см. патент US № 6331415) любого из вышеуказанных антител также охватываются настоящим изобретением. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью различных техник, включая общепринятые технологии мышиных моноклональных антител, например, стандартную технику гибридизации соматических клеток Kohler и Milstein, Nature 256: 495 (1975). См. в целом, Harlow, E. и Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Иммунизацию с белком, например GCC или растворимой частью, или слитым белком, содержащим часть GCC (например, TOK107-hIg), или клетками или их мембранными фракциями, например, клетками, экспрессирующими представленные на поверхности GCC или их часть (например, pLKTOK4 продукт или pLKTOK111 продукт), можно осуществлять с иммуногеном, приготовленным для инъекции
- 19 030827 таким образом, чтобы индуцировать ответ, например, с адъювантом, например, полным адъювантом Фрейнда. Другие подходящие адъюванты включают, TITERMAX GOLD® адъювант (CYTRX Corporation, Los Angeles, CA) и квасцы. Небольшие пептидные иммуногены могут быть связаны с более крупной молекулой, такой как гемоцианин лимфы улитки. Мышам можно инъецировать различными способами, например подкожно, внутривенно или внутримышечно в различные участки, например в брюшину (в.б.), основание хвоста, или подушечку лапы, или комбинацию участков, например iP и основание хвоста (BIP). Бустерные инъекции могут включать один и тот же или различный иммуноген и могут дополнительно включать адъювант, например, неполный адъювант Фрейнда. Иммунизацию с ДНК, например, ДНК, кодирующим GCC или его часть или слитый белок GCC или его часть (например, кодирующий TOK107-hIg), можно инъецировать, используя технологию генетической пушки. Например, ДНК загружают на микроскопические частицы золота и инъецируют мышам через частые интервалы в течение небольшого периода времени.
В целом, если желательно моноклональное антитело, то гибридому получают путем слияния подходящей клетки из иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как SP2/0, P3X63Ag8.653 или гетеромиеломой) с антитело-продуцирующими клетками. Антителопродуцирующие клетки могут быть получены из периферической крови или, предпочтительно из селезенки или лимфоузлов, человека, трансгенных животных по антителам человека или других подходящих животных, иммунизированных с помощью антигена, представляющего интерес. Клетки, которые продуцируют антитела человеческого происхождения (например, антитела человека), могут быть получены с помощью подходящих способов, например, слияния антитело-продуцирующей клетки человека и гетеромиеломы или триомы, или иммортализации активированных B-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна-Барра. (см., например, патент US № 6197582 (Trakht); Niedbala и др., Hybridoma, 17: 299-304 (1998); Zanella и др., J Immunol Methods, 156: 205-215 (1992); Gustafsson и др., Hum Antibodies Hybridomas, 2: 26-32 (1991).) Слитые или иммортализованные антитело-продуцирующие клетки (гибридомы) могут быть выделены, используя селективные условия культивирования, и клонированы путем предельного разведения. Клетки, которые продуцируют антитела с желательной специфичностью, могут быть идентифицированы с помощью подходящего анализа (например, ELISA (например, с иммуногеном, например, TOK107-hIgG, иммобилизованным на микротитровальной лунке) или с помощью FACS на клетке, экспрессирующей GCC или его часть, например, клетке, экспрессирующей pLKTOK111 продукт). Например, если GCC-иммуноген содержит слитую часть, которая представляет собой аффинный реагент, то это часть может предоставлять возможность слитому белку, содержащему GCC или его часть, связываться с матриксом, например, покрытых G-белком, покрытых стрептавидином, дериватизированных глутатионом или покрытых антителом микротитровальных планшет или анализируемых чипов, которые затем комбинируют с иммунной сывороткой или кондиционированной средой из гибридомы или экспрессирующей антитело рекомбинатной клетки, и смесь инкубируют в условиях, способствующих образованию комплекса (например, при физиологических условиях для соли и pH). После инкубирования лунки микротитровальных планшет или ячейки чипов промывают для удаления любых несвязанных компонентов и измеряют связывание с помощью анти-GCC антитела.
В вариантах осуществления для терапевтических применений антитела согласно настоящему изобретению представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. Преимущества человеческих или гуманизированных антител заключаются в том, что они потенциально снижают или элиминируют иммуногенность антитела в реципиенте-хозяине, таким образом предоставляя возможность повышения биодоступности и уменьшения возможности нежелательных иммунных реакций, таким образом потенциально позволяя многократное введение антител.
Модифицированные антитела включают гуманизированные, химерные или CDR-привитые антитела. Ответы на антимышиные антитела человека (HAMA) привело к развитию химерных или другим способам гуманизированных антител. Поскольку химерные антитела имеют константный участок человека и мышиный вариабельный участок, то полагают, что будут наблюдаться определенные ответы на антихимерное антитело человека (HACA), в особенности при хроническом или многодозовом использовании антитела. Присутствие таких мышиных или крысиных дериватизованных белков может приводить к быстрому клиренсу антител или может приводить к созданию иммунного ответа на антитело у пациента. Для избежания использования мышиных или крысиных дериватизованных антител, разработаны гуманизированные антитела, где последовательности вводят в последовательность антитела для достижения его схожести с последовательностью антитела человека, или полностью человеческие антитела, созданные путем интродукции функции антитела человека в грызуна, таким образом, что грызун будет продуцировать антитела, имеющие полностью человеческие последовательности. Человеческие антитела позволяют избежать определенных проблем, связанными с антителами, которыми обладают мышиные, кроличьи, или крысиные вариабельные и/или константные участки.
Человеческие антитела
Полностью человеческие молекулы антител могут иммунизировать иммуногенные и аллергические ответные реакции, характерные для мышиных или деривантизированных от мышиных mAbs и таким образом повышается эффективность и безопасность вводимых антител. Применение полностью челове
- 20 030827 ческих молекул антител может обеспечивать существенное преимущество для лечения хронических и рецидивирующих заболеваний человека, таких как воспаление, аутоиммунные заболевания, и злокачественное новообразование, для которых необходимы повторные введения антител. Также человеческие молекулы антител могут быть получены с использованием полученных методом генетической инженерии штаммов животных, в которых подавлена экспрессия гена антитела животного и функционально заменена на экспрессию гена молекулы антитела человека.
Способы получения человеческих антител известны в данной области. Одним из методов получения человеческих антител является применение трансгенных животных, таких как трансгенные мыши. Эти трансгенные животные содержат существенную часть генома человека, продуцирующего антитела, например локус иммуноглобулина человека, который может подвергаться функциональной перестановке, встраиваться в их собственный геном и продукция собственных эндогенных антител животного становиться недостаточность относительно продукции антител. Способы получения таких трансгенных животных известны в данной области. Такие трансгенные животные могут быть получены, используя технологию XENOMOUSE™ или путем применения минилокусного подхода. Способы получения XENOMICE™ описаны в патентах US №№ 6162963, 6150584, 6114598 и 6075181, которые включены в настоящую заявку в качестве ссылки. Способы получения трансгенных животных, используя минилокусный подход, описаны в патентах US №№ 5545807, 5545806 и 5625825; также см. международную опубликованную заявку WO93/12227, каждый из которых включен в настоящую заявку в качестве ссылки. Другими трансгенными животными, продуцирующими антитела человека, являются HUMABMOUSE ®, KIRTN ТС MOUSE™ трансхромосомная мышь, KM-MOUSE® (MEDAREX, Princeton, NJ).
При использовании технологии трансгенных животных для антител человека, например XENOMOUSE™ технологии, человеческие антитела могут быть получены путем иммунизации XENOMOUSE™ мыши (Abgenix, Fremont, Calif.) с помощью антигена, представляющего интерес. Лимфатические клетки (такие как B-клетки) восстановлены (например, выделены из ткани селезенки) от мышей, которые экспрессиируют антитела. Эти восстановленные клетки можно сливать с клеточной линией миелоидного типа для приготовления иммортализованных гибридомных клеточных линий, используя стандартную методологию. Эти гибридомные клеточные линии можно подвергать скринингу и отбирать для идентификации гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфические к антигену, представляющему интерес.
Трансгенные животные по антителам человека обеспечивают источник нуклеиновых кислот, который обогащен нуклеиновыми кислотами, которые кодируют антитела, имеющие желательные свойства, такие как специфичность и аффинность. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или вариабельные участки антител, могут быть выделены из трансгенных мышей по антителам человека, которые были иммунизированы с помощью GCC белка или его варианта или части. Выделенные нуклеиновые кислоты или их части (например, части, кодирующие вариабельные участки, CDR, каркасные участки) могут быть экспрессированы, используя любой подходящий метод (например, фаговый дисплей) для получения библиотек антител или антигенсвязывающих фрагментов антител (например, одноцепочечных антигенсвязывающих фрагментов, двухцепочечных антигенсвязывающих фрагментов), которые обогащены относительно антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают GCC белок. Такая библиотека может проявлять увеличенное разнообразие (например, комбинаторное разнообразие путем спаривания вариабельных участков тяжелой цепи и вариабельных участков легкой цепи) относительно репертуара антител, продуцированных в иммунизированном трансгенном животном по антителам человека. Библиотеку можно подвергать скринингу с помощью подходящего анализа (например, анализа связывания GCC белка) для идентификации антител или антигенсвязывающих фрагментов, имеющих желательные свойства (например, специфичность, аффинность). Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, имеющие желательные свойства, могут быть восстановлены с помощью любого подходящего способа (См., например, патент US № 5871907 (Winter и др.) и патент US № 6057098 (Buechler и др.)).
Альтернативно, антитела можно экспрессировать в клеточных линиях, отличающихся от гибридомных клеточных линий. Более специфически, последовательности, кодирующие конкретные антитела, могут быть клонированы из клеток, продуцирующих антитела, и использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В предпочтительном методе, лимфоциты селезенки и/или лимфоузлов из иммунизированных мышей выделяют из мышей и наносят на чашки для анализа бляшкообразования, как ранее описано в Babcook и др., Proc Natl Acad Sci USA. 93: 7843-8 (1996), которая включена в настоящей заявку в качестве ссылки. Вкратце, клетки наносят на чашки в агар с эритроцитами овцы, покрытыми GCC антигеном, и клетки, секретирующие mAb к GCC антигену, будут фиксировать комплемент и лизировать эритроциты, непосредственно окружающие mAb продуцирующие клетки. Клетки в прозрачных пятнах отбирают для секренирования последовательностей иммуноглобулинов и субклонирования в экспрессионных векторах. Супернатанты от кратковременно трансфектированных клеток, содержащих GCC специфические mAb, впоследствии подвергают скринингу с помощью ELISA и относительно связывания клетками с помощью проточной цитометрии. Вариабельные последовательно
- 21 030827 сти, или их часть, продуцирующих человеческих антител, содержащих CDR, которые связывают конкретные эпитопы, можно использовать для продукции модифицированных антител. Например, вариабельные участки продуцированных антител могут подвергаться сплайсингу в экспрессионной кассете для облегчения переноса конструкций, повышения экспрессии конструкций, и/или инкорпорации конструкций в векторы, способные экспрессировать полноразмерные антитела, см., например, US 20060147445. В предпочтительном варианте осуществления экспрессионная кассета содержит константный участок тяжелой цепи IgG1 изотипа.
Методы выбранных антител лимфоцитов (SLAM, см. патент US № 5627052, Babcook и др. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7843-7848 (1996)) также можно использовать для идентификации клеток, которые могут обеспечивать антитело, представляющее интерес. В SLAM, B-клетки культивируют непосредственно, таким образом обходя гибридомную технологию, которая обычно вылавливает только небольшой процент антител, изначально генерированных мышей. Используя анализы на основе микропланшет, B-клетки быстро анализируют в течение нескольких дней. Обычно идентифицируют тысячи клетокклонов, реагирующих с антигеном, представляющих тысячи индивидуальных антигенспецифических, например GCC-специфических, моноклональных антител. Количество различных реагирующих с антигеном моноклональных антител, идентифицированных в одном эксперименте, обычно многократно возрастает. После применения дополнительных быстрых анализов на основе микропланшет для измерения и классифицирования антител посредством аффинности и функционирования, могут быть выбраны индивидуальные клоны B-клеток, продуцирующие чрезвычайно высококачественные антитела. Дополнительно, посредством обхода стадии создания гибридом, продукция может быстро переходить в рекомбинантную производящую клеточную линия. Индивидуальные B-клетки, выбранные с помощью технологии, выделяют и гены антител непосредственно могут быть интродуцированы в производящую клеточную линию. После этого полученная клеточная линия может быть разработана для клинических испытаний, тестируя по существу в течение аналогичного промежутка времени, как необходимо для разработки гибридомной клеточной линии.
mAb 5F9 человека (IgG2, каппа) могут быть продуцированы с помощью гибридомы 5F9, также обозначаемой как гибридома 46.5F9.8.2, которая задепонирована 10 января 2007 г., на имя Millennium Pharmaceuticals Inc., 40 Landsdowne Street, Cambridge, MA, 02139, USA, в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, U.S.A., под регистрационным № PTA8132. (Депонирование произведено в соответствии с, и при полном удовлетворении, требований Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.) Изобретение относится к гибридоме 5F9, к антителу, которое она продуцирует, его антигенсвязывающим фрагментам, и к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело и их части (например, тяжелую цепь, вариабельный участок тяжелой цепи, легкую цепь, вариабельный участок легкой цепи, CDRs). Как описано в настоящей заявке, гибридома продуцирует 5F9 IgG2, каппа антитело.
Гуманизация и дисплей-технологии и модификации антител
Как обсуждалось выше, существуют преимущества в получении антител со сниженной иммуногенностью. Этого можно достичь с помощью технологий гуманизирования и дисплей-методов с использованием соответствующих библиотек. Известно, что мышиные антитела или антитела других видов могут быть гуманизированы или приматизированы с помощью методов, используемых в данной области. См., напр., Winter и Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) и Wright и др. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Нужные антитела можно модифицировать с помощью методов рекомбинантной ДНК, чтобы заменить CH1, CH2, CH3, петлевые участки и/или каркасные участки на соответствующие последовательности человека (см. WO 92/02190 и U.S. Pat. Nos. 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). Также в данной области известно об использовании к ДНК иммуноглобулинов для создания химерных генов иммуноглобулинов (Liu и др. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 3439 (1987) и J. Immunol. 139:3521 (1987)). мРНК изолируется из гибридом или других клеток, продуцирующих антитела, и используется для получения кДНК. Нужная кДНК может быть амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции, используя специфичные праймеры (патенты US №№ 4683195 и 4683202).
В качестве альтернативы для получения антител человека или фрагментов антител in vitro, из генов вариабельных (V) участков иммуноглобулинов, например, из репертуаров от неиммунизированных доноров, может использоваться фаговая дисплей-технология (см., напр., McCafferty и др., Nature, 348: 552553 (1990)). В соответствии с данным методом гены V участка антител клонируются внутри рамки гена большого или малого белка оболочки филаментного бактериофага, например, M13 или fd, и выводятся как функциональные фрагменты антител на поверхности частицы фага. Так как филаментная частица содержит одноцепочечную ДНК копию генома фага, селекции, базирующиеся на функциональных характеристиках антитела, также приводят к селекции гена, кодирующего антитело, обладающего данными характеристиками. Таким образом, фаг копирует некоторые свойства B-клеток. Фаговый дисплей может быть осуществлен в разных форматах, для их обзора см., напр., Johnson и Chiswell, Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Некоторые источники сегментов V-гена могут быть использованы для фагового дисплея. Clackson и др., Nature, 352: 624-628 (1991) изолировали разноплановый набор антиоксазолоновых антител из небольшой рандомизированной комбинаторной библиотеки, полученных из
- 22 030827 селезенок иммунизированных мышей. Возможно получить репертуар V-генов от неиммунизированных человеческих доноров и изолировать антитела к разноплановому набору антигенов (включая аутоантигены), в основном руководствуясь методами, описанными Marks и др., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или Griffith и др., EMBO J., 12:725-734 (1993). См. также патенты US №№ 5565332 и 5573905. Дисплей-библиотеки могут содержать антитела или антиген-связывающие фрагменты антител, которые содержат синтетические аминокислотные последовательности. Например, библиотека может содержать Fab фрагменты, имеющие в своем составе синтетические CDR (напр., случайные аминокислотные последовательности) и каркасные участки человека (см., напр., патент US № 6,300,064 (Knappik, и др.)).
Антитела человека могут также продуцироваться in vitro активированными B-клетками (см. патенты US №№ 5567610 и 5229275).
Последовательности генов константных участков человека можно найти в Kabat и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. публикация № 91-3242. Гены C-участков человека общедоступны из известных клонов. Выбор изотопа должен обуславливаться желаемыми эффекторными функциями, такими как фиксация комплемента или активность в зависимой от антител клеточной цитотоксичности. Изотопы могут быть IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В данном примере молекулы антител в изобретении IgG1 и IgG2. Любая из легких цепей константных участков человека, каппа или лямбда, может быть использована. Химерное гуманизированное антитело затем экспрессируется с помощью обычных методов.
В некоторых примерах изобретения молекула анти-GCC антитела может вызывать зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) в клетке, экспрессирующей GCC, например, в опухолевой клетке. Антитела с IgG1 и IgG3 изотопами полезны для стимулирования эффекторной функции в зависимой от антител цитотоксичной способности, благодаря их свойству связывать Fc рецептор. Антитела с IgG2 и IgG4 изотопами полезны для минимизации ADCC ответа, благодаря их низкой способности связывать Fc рецептор. В подобных примерах замены в Fc области или изменения в структуре гликозилирования антитела, например, вызванные ростом в модифицированной эукариотической клеточной линии могут быть совершены с целью усилить способность Fc рецепторов распознавать, связывать и/или опосредовать цитотоксичность клеток, с которыми связываются анти-GCC антитела (см., напр., U.S. Pat No. 7,317,091, 5,624,821 и публикации включая WO 00/42072, Shields и др. J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001), Lazar и др. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 4005-4010 (2006), Satoh и др. Expert Opin Biol. Ther. 6: 1161-1173 (2006)). В определенных примерах антитело или антиген-связывающий фрагмент (напр., антитело человеческого происхождения, человеческое антитело) может иметь аминокислотные замены или перестановки, которые изменяют или варьируют функцию (напр., эффекторную функцию). Например, константный участок человеческого происхождения (напр., γ1 константный участок, γ2 константный участок) может быть синтезирован так, чтобы ослабить активацию комплемента и/или связывание Fc рецептора (см., напр., патенты US №№ 5648260 (Winter и др.), 5624821 (Winter и др.) и 5834597 (Tso и др.), идеи которых полностью представлены там в ссылках). Предпочтительно аминокислотная последовательность константного участка человеческого происхождения, содержащая подобные аминокислотные замены или перестановки должна быть как минимум 95% идентична полноразмерной аминокислотной последовательности неизмененного константного участка человеческого происхождения, оптимально - около 99% идентична полноразмерной аминокислотной последовательности неизмененного константного участка человеческого происхождения.
В дальнейшем примере эффекторные функции могут быть также изменены путем модулирования структуры гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается удаление одной или нескольких углеводных частиц, содержащихся в антителе и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые ранее не присутствовали в антителе. Например, антитела с повышенной ADCC активностью с полноценной углеводной структурой, в которой не хватает фукозы, присоединенной к Fc участку антитела, описаны в U.S. Patent Application Publication No. 2003/0157108 (Presta). См. также U.S. Patent Application Publication No. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Фирма Glycofi также разработала дрожжевые клеточные линии, способные продуцировать специфические гликоформы антител.
Кроме того (или же в дополнение) можно создать антитело, обладающее измененным типом гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело с меньшим содержанием остатков фукозы, или же антитело, содержащее большее количество разделяющих GlcNac структур. Было продемонстрированно, что такие измененные структуры гликозилирования повышают ADCC свойство антител. Данные углеводные модификации могут быть получены, например, путем экспрессирования антитела в клеткехозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в данной области, и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, которые так модифицированы, чтобы экспрессировать рекомбинантные антитела данного изобретения, и таким образом продуцировать антитело с измененным гликозилированием. Например, в EP 1176195 (Hang и др.) описана клеточная линия с функционально нарушенным геном FUT8, кодирующим фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессирующиеся в данной линии, гипофукозилированы. В PCT публикации WO 03/035835 Presta описывается вариант CHO клеточной линии, клетки Lec13 со сниженной способностью присоединять фукозу к Асн(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофуко
- 23 030827 зилированию антител, экспрессирующихся в данной клетке-хозяине (см. также Shields, R. L. и др., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В PCT Публикации WO 99/54342 (Umana и др.) описаны измененные клеточные линии, экспрессирующие гликопротеин-модифицирующие гликозил-трансферазы (напр., бета(1,4)-Ы ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTIII)), так что антитела, экспрессирующиеся в данных модифицированных клеточных линиях содержат большее количество разделяющих GlcNac структур, что приводит к повышенной ADCC активности антител (см. также Umana и др., 1999 Nat. Biotech. 17: 176180).
Гуманизированные антитела можно также получить с помощью CDR-привитого подхода. Методы получения таких гуманизированных антител известны в данной области. В общем, гуманизированные антитела продуцируют путем получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные тяжелые и вариабельные легкие последовательности антитела, которое связывается с GCC, выявляя комплементарный определяющий участок (CDR) в вариабельных тяжелых и вариабельных легких последовательностях и прививая CDR нуклеотидные последовательности к каркасным нуклеотидным последовательностям человека (см., напр., U.S. Pat. Nos. 4,816,567 и 5,225,539). Локализацию CDRs и каркасных остатков можно определить (см. Kabat, E.A., и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Публикации No. 91-3242, и Chothia, С. и др. J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Молекулы анти-GCC антител, описанные там, имеют CDR аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие CDRs, перечисленные в табл. 5 и 6. В некоторых примерах последовательности из табл. 5 и 6 могут быть вставлены в молекулы, которые распознают GCC с целью использования в терапевтических или диагностических методах, описанных там. Выбранный каркасный участок человека подходит для введения in vivo, то есть он не обладает иммуногенностью. Например, это может быть установлено с помощью опытов с применением таких антител in vivo и изучением сходства аминокислот. Подходящий каркасный участок можно выбрать из антитела человеческого происхождения, имеющего как минимум 65% аминокислотной гомологии, и желательно как минимум около 70, 80, 90 или 95% аминокислотной гомологии с длиной каркасного участка внутри аминокислотной последовательности эквивалентной порции (напр., каркасного участка) донорного антитела, например, молекулы анти-GCC антитела (напр., 3G1). Аминокислотную гомологию можно определить с помощью подходящего алгоритма для выравнивания аминокислотных последовательностей, например CLUSTAL W, используя стандартные параметры (Thompson J.D. и др., Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)).
После идентифицирования CDR и FR клонированного антитела, которое было гуманизировано, идентифицируют аминокислотные последовательности, кодирующие CDR, и соответствующие нуклеиновокислотные последовательности, привитые на выбранные человеческие FR. Это также можно осуществить с использованием известных праймеров и линкеров, выбор которых известен в данной области. Все из CDR конкретного антитела человека могут быть заменены по меньшей мере частью нечеловеческого CDR или только некоторые из CDR могут быть заменены нечеловеческими CDR. Необходимо только заменить количество CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с заранее установленным антигеном. После того, как CDR прививают на выбранные человеческие FR, полученные гуманизированные вариабельные тяжелые и вариабельные легкие последовательности экспрессируют, продуцируя гуманизированное Fv или гуманизированное антитело, которое связывается с GCC. Предпочтительно, CDR-привитое (например, гуманизированное) антитело связывает GCC белок с аффинностью, сходной с, по существу аналогичной, или лучшей за аффинность донорского антитела. Типично, гуманизированные вариабельные тяжелые и легкие последовательности экспрессируют в виде слитого белка с последовательностями константного домена человека, таким образом получая интактное антитело, которое связывается с GCC. Тем не менее, может быть получено гуманизированное Fv антитело, которое не содержит константных последовательностей.
Также объемом изобретения охватываются гуманизированные антитела, в которых специфические аминокислоты были заменены, удалены или добавлены. В частности, гуманизированные антитела могут иметь аминокислотные замены в каркасном участке, таким образом, что улучшается связывание с антигеном. Например, выбранное, небольшое количество акцепторных каркасных остатков гумманизированной цепии иммуноглобулина могут быть заменены соответствующими донорными аминокислотами. Расположение замещений включает аминокислотные остатки, смежные с CDR, или которые способны взаимодействовать с CDR (см, например, патенты US №№ 5585089 или 5859205). Акцепторный каркас может представлять собой каркасную последовательность зрелого антитела человека или консенсусную последовательность. Как используется в настоящей заявке, термин консенсусная последовательность относится к последовательности, обнаруживаемой наиболее часто, или выведенной из наиболее общих остатков в каждом положении в последовательности среды родственных членов семейств. Доступны различные консенсусные последовательности антител человека, включая консенсусные последовательности для различных подгрупп вариабельных участков человека (см., Kabat E. А., и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). База данных Kabat и ее применения свободно доступны он-лайн, например с помощью IgBLAST на сайте National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD (также см., John
- 24 030827 son, G. и Wu, T.T., Nucleic Acids Research 29: 205-206 (2001)).
Другие техники для гуманизации антител описаны в Padlan и др. EP 519596 A1, опубликованной 23 декабря 1992 г.
Молекула анти-GCC антитела включает другие гуманизированные антитела, которые также могут быть модифицированы путем специфической делеции эпитопов T-клеток человека или деиммунизации с помощью методов, описанных в PCT публикациях №№ WO 98/52976 и WO 00/34317, содержания которых включены в настоящую заявку в качестве ссылки. Вкратце, мышиные вариабельные участки тяжелой и легкой цепи анти-GCC антитела могут анализироваться относительно пептидом, которые связываются с MHC класс II; эти пептиды представляют потенциальные эпитопы T-клеток. Для обнаружения потенциальных эпитопов T-клеток, можно применять подход компьютерного моделирования, обозначаемый термином нарезка пептида, и, дополнительно, можно осуществлять поиск в базе данных связывающихся пептидов MHC класса II человека относительно мотивов, присутствующих в мышиных VH и VL последовательностях, как описано в PCT публикациях №№ WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любым из 18 основных MHC класса IIDR аллотипов, и таким образом составляя потенциальные эпитопы T-клеток. Потенциальные обнаруженные эпитопы T-клеток могут быть элиминированы путем замены небольшого количества аминокислотных остатков в вариабельных участках, или предпочтительно, путем единичных аминокислотных замен. В максимально возможной степени, осуществляют консервативные замены, часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоту, общую в этом положении в последовательностях антител зародышевых линий человека. Последовательности зародышевых линий человека описаны в Tomlinson, I.A. и др., J. Mol. Biol. 227: 776-798 (1992); Cook, G. Р. и др., Immunol. Today том 16 (5): 237-242 (1995); Chothia, D. и др., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992). V BASE директория обеспечивает всестороннее руководство относительно последовательностей вариабельных участков иммуноглобулинов человека (собранная, I. А. и др. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). После деиммунизации VH и VL анти-GCC антитела конструируют путем мутагенеза мышиных VH и VL генов, мутированные вариабельные последовательности необязательно можно сливать с константным участком человека, например, IgG1 или к константными участками человека.
В других вариантах осуществления, уменьшение иммуногенного ответа с помощью CDR-привитого антитела можно осуществлять путем изменений, например, делеций, замен, аминокислотных остатков в CDR (Kashmiri и др. Methods 36:25-34 (2005), патент U.S. № 6,818,749, Tan и др. J. Immunol. 169:11191125 (2006)). Например, остатки в положениях, задействованных в контактирование с антигеном, предпочтительно не будут изменять. Типично, такие остатки, SDR, находятся в положениях, которые проявляют высокий уровень вариабельности среди антител. Консенсусные последовательности (например, SEQ ID NO:302-307, табл. 5), выведенные, например, путем метода Clustal (Higgins D. G. и др., Meth. Enzymol. 266:383-402 (1996)), из молекул анти-GCC антител, например, из антител, описанных в настоящей заявке, помогают при идентификации SDR. В молекулах анти-GCC антител человека, описанных в настоящей заявке, SDR представляют следующий, по меньшей мере, первый остаток или в некоторых вариантах осуществления, первые четыре остатка тяжелой цепи CDR1; по меньшей мере, N-концевую часть, например первые семь, десять или 13 остатков тяжелой цепи CDR2; почти все из тяжелой цепи CDR3; С-концевой участок, например, после остатка шесть, восемь, или девять легкой цепи CDR1; приблизительно первый, средний и/или последний остаток легкой цепи CDR2; и большинство легкой цепи CDR3, или, по меньшей мере, после остатка два или три. Таким образом, для поддержания связывания с GCC белком для гуманизации или модификации молекул анти-GCC антитела, таких SDR остатки в CDR молекул анти-GCC антител менее подвержены изменениям, например, от мышиных остатков до человеческих консенсусных остатков, которые представляют собой остатки в других остатках CDR или каркасных участках. Наоборот, может быть благоприятным изменять остатки в нечеловеческих, например, мышиных CDR на остатки, идентифицированные как консенсусные в человеческих CDR, например CDR молекул анти-GCC антител, описанные в настоящей заявке (например, последовательности, перечисленные в табл. 5). Например, серин может представлять собой человеческий остаток для C-конца тяжелой цепи CDR1, и/или тирозин может представлять собой человеческий остаток для второго и/или третьего остатков тяжелой цепи CDR1; тяжелая цепь CDR2 может оканчиваться в S-(L/V)-K-(S/G) (SEQ ID NO:312) для представления CDR человека; для представления CDR3 человека, может находиться глицин после четырех-шести остатков и/или аспартат шесть-девять остатков в тяжелой цепи CDR3; легкая цепь CDR1 может начинаться с (K/R)-(A/S)-SQS-(V/L)-(S/L) (SEQ ID NO:313) для представления CDR человека; легкая цепь CDR2 может иметь серин в третьем остатке и/или аргинин в пятом остатке, представляя CDR человека; и/или легкая цепь CDR3 может иметь глутамин во втором остатке и/или тирозин или серин в третьем остатке, представляя CDR человека.
Анти-GCC антитела, которые не являются интактными антителами, также пригодны в настоящем изобретении. Такие антитела могут иметь происхождение из любого из антител, описанных выше. Пригодные молекулы антител этого типа включают (i) Fab фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных путем дисульфидного мостика в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, (v) dAb
- 25 030827 фрагмент (Ward и др., Nature 341:544-546 (1989)), который состоит из VH домена; (vii) единственный домен функциональной тяжелой цепи антитела, который состоит из VHH домена (известное как нанотело) см., например, Cortez-Retamozo, и др., Cancer Res. 64: 2853-2857 (2004), и ссылки, процитированные в этом источнике; и (vii) выделенные CDR, например, одна или несколько выделенных CDR совместно в достаточной каркасной областью для обеспечения антигенсвязывающего фрагмента. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, с использованием рекомбинантных методов, с помощью синтетического линкера, который предоставляет им возможность существовать в виде единственной белковой цепи, в которой VL и VH области спарены с образованием моновалентных молекул (известные как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird и др. Science 242: 423-426 (1988); и Huston и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином термин антигенсвязывающий фрагмент антитела. Эти фрагменты антител получают с использованием общепринятых технологий, известных специалисту в данной области техники, и фрагменты подвергаются скринингу для определения пригодности с помощью метода, аналогичного для интактных антител. Фрагменты антитела, такие как Fv, F(ab')2 и Fab, могут быть получены путем расщепления интактного белка, например, с помощью протеаз или химического расщепления.
В вариантах осуществления некоторые или все CDR последовательности одной или обеих тяжелой и легкой цепи могут использоваться в другой молекуле антитела, например в CDR-привитой, гуманизированной или химерной молекуле антитела.
Варианты осуществления включают молекулу антитела, которая содержит достаточно CDR, например, все шесть CDR из одного из вышеуказанных человеческих гибридом, выбранного лимфоцита, или мышиных антител для предоставления возможности связывания с GCC на клеточной поверхности.
В варианте осуществления CDR, например, все из HCDR, или все из LCDR, или все шесть, заделаны в человеческие или производные человеческих каркасную (ые) область (и). Примеры каркасных областей человека включают каркасные последовательности зародышевых линий человека, последовательности зародышевых линий человека, которые были аффинно созрелыми (либо in vivo или in vitro), или синтетические последовательности человека, например, консенсусные последовательности. В варианте осуществления каркасная область тяжелой цепи представляет собой IgG1 или IgG2 каркасную область. В варианте осуществления каркасная область легкой цепи представляет собой каппа каркасную область.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела, например CDR-привитая или гуманизированная молекула антитела, содержит достаточно CDR, например, все шесть CDR из одного из антител, описанных в настоящей заявке, например, последовательности, перечисленные в табл. 5, для предоставления возможности связывания с GCC. (Примерами последовательности нуклеиновых кислот, которые могут кодировать аминокислотные последовательности CDR, перечисленные в табл. 5, обеспечены, в табл. 6 в настоящей заявке). В предпочтительных вариантах осуществления молекула анти-GCC антитела может содержать CDR из 5F9 или Abx-229.
Фрагменты антител для терапевтического или диагностического применения in vivo могут иметь преимущества вследствие модификаций, которые улучшают их период полужизни в сыворотке. Подходящие органические компоненты, предназначенные для повышения периода полужизни антитела in vivo в сыворотке могут включать один, два или больше линейных или разветвленных компонентов, выбранных из гидрофильной полимерной группы (например, линейного или разветвленного полимера (например, полиалкангликоль, такой как полиэтилен гликоль, монометоксиполиэтилен гликоль и другие), углевода (например, декстран, целлюлоза, полисахарид и другие), полимера гидрофильной аминокислоты (например, полилизин, полиаспартат и другие), полиалкан оксида и поливинил пирролидон), группы жирной кислоты (например, монокарбоновой кислоты или дикарбоновой кислоты), группы сложного эфира жирной кислоты, липидной группы (например, диацилглицерольная группа, сфинголипидная группа (например, церамидил)) или фосфолипидной группы (например, фосфатидил этаноламиновой группы). Предпочтительно, органический компонент связывают с заранее определенных сайтом, где органический компонент на нарушает функцию (например, снижение антгенсвязывающей аффинности) полученного иммуноконъюгата по сравнению с компонентом неконъюгированного антитела. Органический компонент может иметь молекулярный вес от приблизительно 500 до приблизительно 50000 Да, предпочтительно приблизительно 2000, 5000, 10000 или 20000 Да. Примеры и методы модификации полипептидов, например, антител, с помощью органических компонентов, описаны, например, в патентах US №№ 4179337 и 5612460, PCT публикациях №№ WO 95/06058 и WO 00/26256, и опубликованной патентной заявки US № 20030026805.
Молекула анти-GCC антитела может содержать все, или антигенсвязывающий фрагмент вариабельного участка, одну или обе, тяжелую и легкую цепь, одного из вышеуказанных антител гибридом человека, выбранного лимфоцита, или мышей.
В варианте осуществления аминокислотная последовательность легкой цепи из (a) может отличаться от одной из сравнительных аминокислотных последовательностей, обозначенных в (a)(i-ii), на 1, 2, 3, 4, 5, 10, или 15 остатков. В вариантах осуществления отличия представляют собой консервативные замены. В вариантах осуществления, отличия находятся в каркасных участках. В варианте осуществления
- 26 030827 аминокислотная последовательность тяжелой цепи из (b) отличаться от одной из сравнительных аминокислотных последовательностей, обозначенных в (b)(i-ii) на 1, 2, 3, 4, 5, 10, или 15 остатков. В вариантах осуществления отличия представляют собой консервативные замены. В вариантах осуществления отличия находятся в каркасных участках.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела содержит одну или обе из:
(a) аминокислотная последовательность легкой цепи из всех, или антигенсвязывающий фрагмент из, либо, (i) аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой цепи из табл. 3, например, SEQ ID NO: 20, или (ii) аминокислота вариабельного участка легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью из табл. 4, например SEQ ID NO: 19; и (b) аминокислотная последовательность тяжелой цепи из всех, или антигенсвязывающий фрагмент из, либо (i) аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи из табл. 3, например SEQ ID NO: 18, или (ii) аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью из табл. 4, например SEQ ID NO: 17.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела содержит одну или обе из:
(a) вариабельный участок легкой цепи, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий по меньшей мере 85, 90, 95, 97 или 99% гомологии с вариабельным участком легкой цепи молекулы анти-GCC антитела согласно изобретению, например, одного из вышеуказанных человеческих гибридомных, выбранных лимфоцитных, или мышиных антител; и (b) вариабельный участок тяжелой цепи, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий по меньшей мере 85, 90, 95, 97 или 99% гомологии с вариабельным участком тяжелой цепи молекулы антиGCC антитела согласно изобретению, например, одного из вышеуказанных человеческих гибридомных, выбранных лимфоцитных, или мышиных антител.
Аминокислотные последовательности вариабельных участков человеческих гибридомных, выбранных лимфоцитных, или мышиных антител можно найти в табл. 3.
В варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела представляет собой 5F9 молекулу антитела и включает одну или обе из: а) все или фрагмент константного участка тяжелой цепи из SEQ ID NO: 231; и b) все или фрагмент константного участка легкой цепи из SEQ ID NO: 233.
В другом варианте осуществления, молекула анти-GCC антитела представляет собой Abx-229 молекулу антитела и включает одну или обе из: a) все или GCC-связывающий фрагмент вариабельного участка тяжелой цепи из SEQ ID NO: 46; и b) все или GCC-связывающий фрагмент вариабельного участка легкой цепи из SEQ ID NO: 48.
В одном подходе, консенсусные последовательности, кодирующие J области тяжелой и легкой цепи, могут использоваться для создания олигонуклеотидов для применения в качестве праймеров для интродукции пригодных рестрикционных сайтов в J область для последующего расщепления сегментов V области на сегменты С области человека. кДНК С области может модифицироваться путем сайтнаправленного мутагенеза для расположения рестрикционного сайта в аналогичном положении в последовательности человека.
Экпрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, космиды, YAC, EBV дириватизованные эписомы, и др. Подходящим вектором является вектор, который кодирует функционально полную CH или CL иммуноглобулиновую последовательность человека, с подходящими рестрикционными сайтами, сконструированными таким образом, что любая VH или VL последовательность легко может быть вставлена и экспрессироваться. В таких векторах обычно происходит сплайсинг между донорным сайтом сплайсинга во вставленной J области и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим C области человека, и также в областях сплайсинга, которые встречаются в пределах CH экзонов человека. Подходящие экспрессионные векторы могут включать различные компоненты, например, начало репликации, селектируемый маркерный ген, один или больше элементов, контролирующих экспрессию, такие как элемент, контролирующий транскрипцию (например, промотор, энхансер, терминатор) и/или один или несколько трансляторов сигналов, сигнальную последовательность или лидерную последовательность, и др. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходит в природных хромосомных сайтах, расположенных ниже кодирующих областей. Полученное химерное антитело может быть соединено с любым сильным промотором. Примеры подходящих векторов, которые можно использовать, включают те векторы, которые пригодны для хозяев-млекопитающих и основаны на репликационных системах вирусов, такие как вирус обезьян 40 (SV40), вирус саркомы Рауса (RSV), аденовирус 2, бычий папиломавирус (BPV), мутант паповавируса BK (BKV), или мышиный и человеческий цитомегаловирус (CMV), и вирус мышиного лейкоза Молони (MMLV), нативные Ig промоторы, и др. различные подходящие векторы известные в данной области, включая векторы, которые поддерживаются в одной копии или многократных копиях, или которые интегрируются в хромосому клетки-хозяина, например, посредством LTR, или посредством искусственных хромосом, сконструированных с множественными интеграционными сайтами (Lindenbaum и др. Nucleic Acids Res. 32:e172 (2004), Kennard и др. Biotechnol. Bioeng. Online May 20, 2009). Дополнительные примеры подходящих векторов перечислены в последующем разделе.
Таким образом, изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую ки
- 27 030827 слоту, кодирующую антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, человеческое, гуманизированное, химерное антитело или антигенсвязывающий фрагмент любого из вышеуказанных антител), цепь антитела (например, тяжелую цепь, легкую цепь) или антиген-связывающую часть цепи антитела, которая связывает GCC белок.
Экспрессия в эукариотических клетках-хозяевах является пригодной, поскольку такие клетки более вероятно по сравнению с прокариотическими клетками собирают и секретируют правильно уложенное и иммунологически активное антитело. Тем не менее, любое продуцированное антитело, которые является неактивным вследствие неправильной укладки, можно ренатурировать в соответствии с известными методами (Kim и Baldwin, Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding, Ann. Rev. Biochem. 51, pp. 459-89 (1982)). Представляется возможным, что клетки-хозяева будут продуцировать интактные антитела, такие как димеры легкой цепи или димеры тяжелой цепи, которые также представляют собой гомологи антител в соответствии с настоящим изобретением.
Кроме того, как было описано в настоящей заявке ранее, человеческие антитела или антитела из других видов могут быть созданы с помощью технологий дисплейного типа, включая, без ограничений, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомный дисплей, и другие техники, использование техник хорошо известно в данной области и полученные молекулы могут подвергаться дополнительному созреванию, такому как созревание аффинности, такие техники известны в данной области. Winter and Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993) и Wright и др. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997) (рибосомный дисплей), Parmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988) (фаговый дисплей), Scott TIBS 17: 241-245 (1992), Cwirla и др. Proc Natl Acad Sci USA 87: 63786382 (1990), Russel и др. Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993), Hoganboom и др. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), и патент US № 5733743. Если технологии дисплеев используются для получения антител, которые не являются человеческими, то такие антитела могут быть гуманизированы, как описано выше.
Следует принять во внимание, что антителам, которые были созданы, не нужно изначально обладать желательным изотипом, но антитела, которые создаются, могут обладать любым изотипом. Например, антитело, продуцируемое гибридомой 5F9 (ATCC задепонированный № PTA-8132) имеет IgG2 изотип. Изотип антитела можно переключить позже, например, на IgG1 или IgG3 для вызывания ADCC ответа, когда антитело связывает GCC на клетке, с использованием общепринятых техник, которые известны в данной области. Такие техники включают применение, в частности, прямых рекомбинантных техник (см., например, патент US № 4816397), технологии слияния клеток с клетками (см., например, патент US № 5916771). В технологии слияния клеток с клетками, приготавливают миелому или другую клеточную линию, которая имеет тяжелую цепь с любым желательным изотипом, и приготавливают другую миелому или иную клеточную линию, которая имеет легкую цепь. После этого такие клетки можно сливать и можно выделять клеточную линию, экспрессирующую интактное антитело.
В определенных вариантах осуществления, GCC молекула антитела представляет собой анти-GCC IgG1 антитело человека. Поскольку такие антитела обладают желательным связыванием с GCC молекулой, для любого из таких антител может быть легко переключен изотип для создания изотипа IgG4 человека, например, поскольку все еще обладает аналогичным вариабельным участком (который определяет, до некоторой степени, специфичность и аффиность антитела). Таким образом, создаются кандидаты антител, которые имеют желательные структурные атрибуты, как обсуждается выше, они в целом могут обеспечиваться с по меньшей мере определенными дополнительными функциональными антибутаи, которые являются желательными посредством переключения изотипа.
В варианте осуществления вариабельный участок или его антигенсвязывающий фрагмент может быть соединен с константным участком (или его фрагментом), отличающимся от константного участка, который создают, например, с константным участком (или его фрагментом) из другого антитела или с синтетическим константным участком (или его фрагментом). В вариантах осуществления константный участок представляет собой IgG1 или IgG2 константный участок (или его фрагмент). Изменения последовательностей можно осуществлять с вариабельных или константных участках для модификации эффекторной активности молекулы антитела.
Схема и создание других лекарственных средств
Антитела, которые продуцируются и характеризуются в настоящей заявке по отношению к GCC, обеспечиваются для облегчения создания других терапевтических модальностях, включая другие антитела, другие антагонисты, или химические компоненты, химических компонентов, отличающихся от антител. Такие модальности включают, без ограничений, антитела, имеющие сходную связывающую активность или функциональность, улучшенные лекарственные средства на основе антител, такие как биспецифические антитела, иммуноконъюгаты, и меченные радиоактивными изотопами лекарственные средства, создание пептидных лекарственных средств, в особенности интрател, и небольших молекул. Кроме того, как обсуждается выше, эффекторная функция антител в соответствии с изобретением может изменяться путем переключения изотопов на IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE или IgM для различных терапевтических применений.
- 28 030827
В отношении биспецифических антител могут быть созданы биспецифические антитела, которые содержат (i) два антитела, одно со специфичностью к GCC и другое ко второй молекуле, которые конъюгированы вместе, (ii) единственное антитело, которые имеет одну цепь, специфическую к GCC, и вторую цепь, специфическую ко второй молекуле, или (iii) одноцепочечное антитело, которое имеет специфичность к GCC и другая молекула. Такие биспецифические антитела могут быть созданы с использованием технологий, которые известны. Например, биспецифические антитела могут быть получены путем перекрестного связывания двух или больше антител (аналогичного типа или различных типов). Подходящими Suitable кросс-линкерами, которые являются гетеробифункциоанальными, имеющими две разные реакционноспособные группы, разделенные подходящим спейсером (например, м-малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимид сложный эфир) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидил суберат). Такие линкеры доступны от Pierce Chemical Company, Rockford, IL. См. также, например, Fanger и др. Immunomethods 4: 72-81 (1994) и Winter и Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993) и Wright и др. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) и в связи с (iii) см., например, Traunecker и др. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny и др. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
Дополнительно, также могут быть получены Каппа-тела (Ill. и др. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)), Minibodies (Martin и др. EMBOJ 13: 5303-9 (1994), US Patent No. 5837821), Diabodies (Holliger и др. Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448 (1993)), или Janusins (Traunecker и др. EMBOJ 10: 3655-3659 (1991) и Traunecker и др. Int J Cancer Suppl 7: 51-52 (1992)) may also be prepared.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды
В другом варианте осуществления, В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к полинуклеотидным и полипептидным последовательностям, которые кодируют или представляют молекулы антител, описанные в настоящей заявке. Такие полинуклеотиды кодируют оба вариабельный и константный участки каждой из тяжелой и легких цепей, хотя другие комбинации также охватываются настоящим изобретением в соответствии с композициями, описанными в настоящей заявке. Настоящее изобретение также охватывает олигонуклеитидные фрагменты, имеющие происхождение из описанных полинуклеотидов и последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные этим полинуклеотидам.
Полинуклеотиды могут находиться в форме РНК или ДНК. Полинуклеотиды в форме ДНК, кДНК, геномной ДНК, аналогов нуклеиновых кислот и синтетические ДНК охватываются объемом настоящего изобретения. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочесной, и если она является одноцепочечной, то может представлять собой кодирующую (смысловую) цепь или некодирующую (антисысловую) цепь. Кодирующая последовательность, которая кодирует полипептид, может быть идентичной кодирующей последовательности, раскрытой в настоящей заявке, или может представлять собой отличающуюся кодирующую последовательность в результате избыточности или вырожденности генетчиеского кода, кодирующую аналогичный полипептид, как и ДНК, раскрытая в настоящей заявке.
В вариантах осуществления обеспечиваются полинуклеотиды, которые кодируют по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи и по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи согласно настоящему изобретению, например, как обобщено в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает варианты полинуклеотидов, содержащие модификации, такие как делеции, замены или добавления полинуклеотидов, и любые полипептидные модификации, возникающие вследствие варианта полинуклеотидной последовательности. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению также может иметь кодирующую последовательность, которая представляет собой вариант кодирующей последовательности, раскрытой в настоящей заявке. Например, вариант полинуклеотида может иметь по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 97% идентичность с полинуклеотидом, перечисленным в табл. 4. В вариантах осуществления, вариант полинуклеотида кодирует молекулу анти-GCC антитела.
Настоящее изобретение также относится к полипептидам, которые представляют represent антитела согласно настоящему изобретению, а также к фрагментам, аналогам и производным таких полипептидов. Полипептиды согласно настоящему изобретению могут представлять собой рекомбинантные полипептиды, встречающиеся в природе полипептиды или синтетические полипептиды. Фрагмент, производное или аналоги полипептидов согласно настоящему изобретению могут представлять собой структуру, в которой один или несколько аминокислотных остатков замещены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком) и такой замененный аминокислотный остаток может или не может представлять собой остаток, кодируемый генетическим кодом; или может представлять собой структуру, в которой один или несколько аминокислотных остатков включают замещающую группу; или может представлять собой структуру, в которой полипептид слит с другим соединением, таким как соединение, повышающее период полужизни полипептида (например, полиэтилен гликоль); или может представлять собой структуру, в которой дополнительные аминокислоты слиты с полипептидом, такие как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая применяется для очистки полипептида или пропротеиновой последова
- 29 030827 тельности. Такие фрагменты, производные и аналоги охватываются объемом настоящего изобретения. В различных аспектах, полипептиды согласно изобретению могут представлять собой частично очищенный, или очищенный продукт.
Полипептид согласно настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность, которая идентична антителам, описанным в настоящей заявке, например, как обобщено в табл. 2 или 3, или которая отличается минорными вариациями вследствие одной или нескольких аминокислотных замен. Вариации могут представлять собой консервативное изменение обычно в интервале от приблизительно 1 до 5 аминокислот, где замененная аминокислота имеет сходные структурные или химические свойства, например, замена лейцина на изолейцин или треонина на серин; замена лизина на аргинин или гистидин. В отличие от этого, вариации могут включать неконсервативные изменения, например, замену глицина на триптофан. Сходные минорные вариации также могут включать делеции или инсерции аминокислот или обе. Руководства относительно определения того, какие и сколько аминокислотных остатков может быть заменено, инсертировано, или делетировано без изменения биологической или иммунологической активности, можно найти с использованием компьютерных программ, известных в данной области, например DNASTAR программного обеспечения (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.).
В другом аспекте, изобретение раскрывает выделенные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы анти-GCC антител. В вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты кодируют одну или несколько молекул антитела, тяжелую цепь, легкую цепь, вариабельный участок легкой цепи, вариабельный участок тяжелой цепи, части тяжелых цепей и легких цепей молекул антител, описанных в настоящей заявке (например, фрагмент вариабельного участка легкой цепи, который затем спаривают с полноразмерным вариабельным участком тяжелой цепи, представляет собой антигенсвязывающий, или фрагмент вариабельного участка тяжелой цепи, который затем спаривают с полноразмерным вариабельным участком легкой цепи, представляет собой антиген-связывающий), и CDR. Варианты осуществления включают такие нуклеиновые кислоты, расположенные в векторах, например, экспрессионных векторах. В специфических вариантах осуществления изобретение включает плазмиды pTOK58D-5F9LC и pTOK58D-5F9HC. Также, изобретение охватывает молекулы антител, продуцируемые клетками-хозяевами, например, экспрессирующими молекулы антител, кодируемыми плазмидами pTOK58D-5F9LC и pTOK58D-5F9HC.
В варианте осуществления, обеспечивается вектор, например, экспрессионный вектор, содержащий одну или обе из:
(a) последовательности, кодирующие вариабельный участок легкой цепи, например, последовательности, перечисленные в табл. 4, их антигенсвязывающий фрагмент, или одну, две или три CDR из легкой цепи (и необязательно каркасный участок), описанные в настоящей заявке, например, в табл. 6; и (b) последовательности, кодирующие вариабельный участок тяжелой цепи, например, последовательности, перечисленные в табл. 4, их антигенсвязывающий фрагмент, или одну, две или три CDR из тяжелой цепи (и необязательно каркасный участок), описанные в настоящей заявке, например, в табл. 6.
В вариантах осуществления обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи антител согласно настоящему изобретению. В вариантах осуществления обеспечиваются полипептиды, которые могут кодировать по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи и один вариабельный участок легкой цепи антител согласно настоящему изобретению.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела содержит один или оба из:
(a) вариабельный участок легкой цепи, или его антигенсвязывающий фрагмент, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в выбранных условиях жесткости с, (i) комплементом молекулы анти-GCC антитела, кодируемой последовательностью нуклеиновых кислот, описанной в настоящей заявке, например, в табл. 4, или (ii) любой последовательностью нуклеиновых кислот, которая кодирует легкую цепь молекулы анти-GCC антитела согласно изобретению, например, одного из вышеуказанных человеческих гибридомных, выбранных лимфоцитных, или мышиных антител, обобщенных в табл. 1 и 2; и (b) вариабельный участок тяжелой цепи, или его антигенсвязывающий фрагмент, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в выбранных условиях жесткости с, (i) комплементом молекулы анти-GCC антитела, кодируемой последовательностью нуклеиновых кислот, описанной в настоящей заявке, например, в табл. 4, или (ii) любой последовательностью нуклеиновых кислот, которая кодирует тяжелую цепь молекулы анти-GCC антитела согласно изобретению, например, одного из вышеуказанных человеческих гибридомных, выбранных лимфоцитных, или мышиных антител, обобщенных в табл. 1 и 2.
В варианте осуществления выбранные условиях жесткости представляют собой условия строгой жесткости или условиях чрезвычайно строгой жесткости, например условиях, как описано в настоящей заявке.
В дополнительных аспектах антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела, кодируемого ДНК, имеющей ATCC номер доступа PTA-8132. В других дополнительных аспектах,
- 30 030827 антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, кодируемого ДНК, имеющей ATCC номер доступа PTA-8132.
Настоящее изобретение также обеспечивает векторы, которые включают полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, клетки-хозяева, которые генетически сконструированы с векторами согласно настоящему изобретению и продукцию антител согласно настоящему изобретению с помощью рекомбинантных техник.
Подходящая последовательность ДНК может быть вставлена в вектор с помощью различных процедур. В целом, последовательность ДНК вставляют в подходящие рестрикционные эндонуклеазные сайты с помощью процедур, известных в данной области. Полинуклеотидная последовательность в экспрессионном векторе функционально связана с подходящей последовательностью, контролирующей экспрессию (то есть промотором) для направления синтеза мРНК. Примеры таких промоторов включают, но не ограничиваясь только ими, вирус саркомы Payca LTR или ранний или поздний SV40 промотор, Е. coli lac или trp, промотор фага лямбда PL и другие промоторы, которые, как известно, контролируют экспрессию генов у прокариотических (например, tac, T3, T7 промоторы для Е. coli) или эукариотических (например, промотор цитомегаловируса, поздний промотор аденовируса, EF-1a промотор) клетках или их вирусах. Экспрессионный вектор также содержит сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминации транскрипции. Вектор также может включать подходящие последовательности для амплификации экспрессии. Например, вектор может содержать энхансеры, которые представляют собой стимулируемые транскрипцией последовательности ДНК вирусного происхождения, такие как те, которые получены из вируса обезьян, такого как SV40, вируса полиомы, цитомегаловируса, бычьего папиломавируса или вируса саркомы Молони, или геномного происхождения. Вектор предпочтительно также содержит начало репликации. Вектор может быть сконструирован таким образом, чтобы содержать экзогенное начало репликации, или, такое начало репликации может иметь происхождение из SV40 или другого вирусного источника, или путем механизма репликации хромосом клеток-хозяев.
Дополнительно, векторы необязательно содержат маркерный ген для селекции трансфектированных клеток-хозяев, такие как дигидрофолат редуктаза маркерные гены для предоставления возможности селекции с метотрексатом в различных хоязевах, или антибиотиков, такие как ген β-лактамазы (резистентность к ампициллину), ген Tet gene (для резистентности к тетрациклину), используемые в прокариотических клетках, или гены резистентности к неомицину, GA418 (генетицину, производное неомицина) gpt (микофеноловой кислоте), ампициллину, или гигромицина, или гены, которые дополняют генетическое повреждение клеток-хозяев, такое как отсутствие тимидин-киназы, гипоксантин фосфорибозил трансферазы, дигидрофолта редуктазы, и др. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, LEU2, URA3, HIS3), часто используются в качестве селектируемых маркеров на дрожжах.
Для получения антител согласно настоящему изобретению, одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют вариабельные участки легкой и тяжелой цепи и константные участки легкой и тяжелой цепей антител согласно настоящему изобретению, необходимо инкорпорировать в вектор. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие легкие и тяжелые цепи антител согласно настоящему изобретению, могут быть инкорпорирован в один или несколько векторов и затем инкорпорированы в клетки-хозяева.
Подходящие экспрессионные векторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают, например, pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., и др., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GIBCO division of Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), pEF-Bos (Mizushima, S., и др., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)), Bicistronic GPEX® Retrovector (Gala Biotech, Middleton, WI) и др. Также доступны экспрессионные векторы, которые пригодны для применения в различных экспрессирующих хозяевах, таких как прокариотические клетки (Е. coli), клетки насекомых (Drosophila Schnieder S2 cells, Sf9) и дрожжи (P. metanolica, P. pastoris, S. cerevisiae). Примерами векторов являются pLKTOK58 (дикий тип IgG1 Fc последвоательность) и pLKTOK59 (мутированная IgG1 Fc последовательность) (см. опубликованную патентную заявку US № 20060147445).
Следует понимать, что антитела в соответствии с настоящим изобретением могут экпрессироваться в клеточных линиях, отличающихся от гибридомных клеточных линий. Последовательности, кодирующие кДНК или геномные клоны для предпочтительных антител, можно использовать для подходящих клеток-хозяев млекопитающих или немлекопитающих. Трансформацию можно осуществить с помощью любого известного метода для интродукции полинуклеотидов в клетку-хозяин, включая, например упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукции клетки-хозяина с помощью вируса (или вектора) или посредством процедур трансфекции, известных в данной области, для интродукции гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих, например, декстран-опосредованная трансфекция, осаждение фосфатом кальция, опосредованная полибреном трансфекция, слияние протопластов, электропорация, инкапсулирование полинуклеотида (ов) в липосомы и непосредственная инъекция мо
- 31 030827 лекулы ДНК. Использование процедуры трансформации зависит от хозяина, подвергаемого трансформации. Методы интродукции гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают, но не ограничиваясь только ими, декстран-опосредованную трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, бомбардировка частицами, инкапсулирование полинуклеотида (ов) в липосомы, конъюгирование пептидов, дендримеры, и прямую микроинъекцию ДНК в ядро.
В другом аспекте, изобретение раскрывает клетку-хоязин, содержащую нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке. В вариантах осуществления клетка экспрессирует молекулу антитела, или ее компонент, описанные в настоящей заявке. В еще других вариантах осуществления обеспечивается способ получения молекулы антитела, например, молекулы анти-GCC антитела, описанной в настоящей заявке, например, человеческой или гуманизированной молекулы антитела, включающий поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии, таким образом экспрессируется цепь (и) иммуноглобулинов и продуцируется молекула антитела. Дополнительный вариант осуществления обеспечивает клетку-хозяина, содержащую любой из вышеописанных экспрессионных векторов, кодирующих последовательности тяжелой и легкой цепи антитела. Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, например, клетку млекопитающего, клетку насекомого, дрожжевую клетку, или прокариотическую клетку, например, Е. coli. Например, клетка млекопитающего может представлять собой культивируемую клетку или клеточную линию. Примеры клеток млекопитающих включают клеточные линии лимфоцитов (например, NSO), клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки COS. В предпочтительном варианте осуществления культивируемая клетка-хозяин представляет собой COS клетку, содержащую последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 5F9 молекула антитела. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой гибридому 5F9 (PTA-8132). Дополнительные клетки включают клетки ооцитов и клетки из трансгенного животного, например эпителиальные клетки млекопитающих. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу антитела, описанную в настоящей заявке, могут экспрессироваться в трансгенном животном, отличающемся от человека.
Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессиии, известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, доступные от Американской коллекции типовых культур (ATCC), включая, но не ограничиваясь только ими клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки NSO, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярного рака человека (например, Hep G2), и различные другие клеточные линии. Клетки, отличающиеся от клеток млекопитающих, включая, но не ограничиваясь только ими, бактериальные, дрожжевые, насекомых, и растений, также можно использовать для экспрессии рекомбинантных антител. Сайт-направленный мутагенез домена CH2 антитела для элиминирования гликозилирования может являться предпочтительным для предотвращения изменений либо в иммуногенности, фармакокинетике, и/или эффекторных функций, возникающих вследствие нечеловеческого гликозилирвоания. Методы экспрессии выбирают путем определения, в каких системах генерируется наиболее высокие уровни экспрессии и продуцируются антитела с констритутивными GCC связывающими свойствами.
Еще другой вариант осуществления обеспечивает способ получения молекулы анти-GCC антитела, например, человеческой или гуманизированной молекулы антитела, включающий поддержание клеткихозяина, содержащей нуклеиновые кислоты, описанные в настоящей заявке, например, одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, перечисленных в табл. 4 или 6, в условиях, подходящих для экспрессии иммуноглобулина, таким образом экспрессируются цепи иммуноглобулинов и продуцируется молекула антитела, например человеческая или гуманизированная молекула антитела, которая связывает GCC, или его фрагмент или вариант. Например, способ экспрессии молекул антител включает применение клеток-хозяев, где первая рекомбинатная молекула нуклеиновых кислот, кодирующая молекулу антитела, например легкую цепь человеческого или гуманизированного антитела, и вторая рекомбинатная молекула нуклеиновых кислот, кодирующая молекулу антитела, например тяжелую цепь человеческого или гуманизированного антитела, содержатся в одном экспрессионном векторе. В других вариантах осуществления они находятся в отдельных векторах. Методы дополнительно могут включать стадию выделения или восстановления антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента цепи антитела, если это является желательным.
Например, молекулу нуклеиновых кислот (то есть, одну или несколько молекул нуклеиновых кислот), кодирующую тяжелые и легкие цепи антитела человека, которые связывает GCC белок, или экспрессионную конструкцию (то есть, одну или несколько конструкций), содержащую такую(ие) молекулу (ы) нуклеиновых кислот, можно интродуцировать в подходящую клетку-хозяин для создания рекомбинантной клетки-хозяина, используя любой метод, подходящий для выбранной клетки-хозяина (например, трансформацию, трансфекцию, электропорацию, инфекцию), таким образом, что молекула(ы) нуклеиновых кислот функционально связаны с одним или несколькими элементами, контролирующими транскрипцию (например, в векторе, конструкции, созданной путем обработки в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученную рекомбинантную клетку-хозяин можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, отличаю
- 32 030827 щемся от человека, в подходящей среде, дополненной пригодными солями, факторами роста, антибиотиками, питательными добавками, и т.д.), таким образом продуцируются кодируемый(ые) полипептид(ы). Если является желательным, то кодируемый белок может быть выделен или восстановлен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Этот процесс охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного, отличающегося от человека (см., например, WO 92/03918, GenPharm International) или растении.
Кроме того, экспрессия антител согласно изобретению (или их других компонентов) из продуцирующих клеточных линий может быть усилена с помощью различных известных техник. Например, системы экспрессии глутамин синтетазы и DHFR гена являются общепринятыми подходами для усиления экспрессии в определенных условиях. Максимально экспрессируемые клеточные клоны могут быть идентифицированы с помощью общепринятых технологий, таких как клонирование при ограниченных разведениях, микрокапельная технология, или любых других методов, известных в данной области. GS система обсуждается полностью или частично в европейских патентах №№ 0216846, 0256055 и 0323997 и европейской патентной заявке № 89303964.4.
В типичной системе для рекомбинантной экспрессии модифицированного антитела, или его антигенсвязывающей части, согласно изобретению рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, интродуцируют в dhfr- CHO клетки с помощью опосредованной фосфатом кальция трансфекции. В рекомбинантном экспрессионном векторе гены тяжелой и легкой цепи антитела, каждый, функционально связан с энхансерными/промоторными регуляторными элементами (например, имеющими происхождение из SV40, CMV, аденовируса и др., такими как CMV энхансер/AdMLP промотор регуляторный элемент или SV40 энхансер/AdMLP промотор регуляторный элемент) для способствования высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет DHFR ген, который предоставляет возможность отбора CHO клеток, которые были трансфектированы вектором, используя селекцию метотрексатом/амплификацию. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для предоставления возможности экспрессии тяжелых и легких цепей антитела и интактное антитело восстанавливают из культуральной среды. Стандартные техники молекулярной биологии используются для приготовления рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфектирования клеток-хозяев, отбора трансформантов, культтииврования клеток-хозяев и восстановления антитела из культуральной среды.
Антитела согласно изобретению могут быть получены трансгенно путем создания млекопитающего или растения, которое является трансгенным относительно последовательностей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, представляющих интерес и продукции антитела в его восстанавливаемой форме. Применительно к трансгенному получению у млекопитающих антитела могут продуцироваться в и восстанавливаться из молока коз, коров, или других млекопитающих. См., например, патенты US №№ 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957.
Антитела, антигенсвязывающие фрагменты, цепи антител и их антигенсвязывающие части, описанные в настоящей заявке, также могут продуцироваться в подходящей экспрессионной системе in vitro, с помощью химического синтеза или любого другого подходящего метода.
Слитые белки и иммуноконъюгаты
Анти-GCC антитела, описанные в настоящей заявке, могут быть функционально связаны с помощью любого подходящего метода (например, химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим способом) с одним или несколькими молекулярными структурами, не являющимися антителами.
Могут быть получены слитые белки, в которых молекула анти-GCC антитела, как, описано в настоящей заявке, и компонент, не представляющий собой антитело, являются компонентами одной непрерывной полипептидной цепи. Компонент, не представляющий собой антитело, может быть расположен на N-конце, C-конце, или внутри, по отношению к антительному компоненту. Например, некоторые варианты осуществления могут быть получены путем вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательности иммуноглобулинов, в подходящий экспрессионный вектор, такой как pET вектор (например, pET-15b, Novagen), фаговый вектор (например, pCNATAB 5 E, Pharmacia), или другой вектор, например, pRIT2T Белок A слитый вектор, Pharmacia). Полученная конструкция может экспрессироваться для получения цепей антитела, которые содержат компонент, не представляющий собой антитело, (например, гистидиновую метку, E метку, или Белок A IgG связывающий домен). Слитые белки могут быть выделены или восстановлены, используя любую подходящую технику, такую как хроматография, используя подходящую аффинную матрицу (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M и др., ред., т. 2, дополн. 26, cc. 16.4.1-16.7.8 (1991)).
Изобретение обеспечивает молекулы анти-GCC антител, которые нацелены на и, в вариантах осуществления, интернализованы в клетки. Они способны доставлять терапевтические средства или обнаруживаемые агенты к или в клетки, экспрессирущие GCC, но не к или в клетки, где мишень не экспрессируется. Таким образом, изобретение также обеспечивает анти-GCC иммуноконъюгаты, содержащие молекулу анти-GCC антитела, как описано в настоящей заявке, которые конъюгированы с терапевтическим средством или обнаруживаемым агентом. В вариантах осуществления аффинность для GCC анти
- 33 030827
GCC иммуноконъюгата составляет по меньшей мере 10, 25, 50, 75, 80, 90, или 95% таковой неконъюгированного антитела. Это может быть определено с использованием GCC клеточной поверхности или выделенного GCC. В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела, например, иммуноконъюгат, имеет LD50, как определено с помощью анализа, описанного в настоящей заявке, меньше, чем 1,000, 500, 250, 100, или 50 пМ.
Молекула анти-GCC антитела может быть модифицирована для действия в качестве иммуноконъюгата с использованием техник, которые известны в данной области. См., например, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). См. также патент US № 5194594. Препараты радиоактивно меченных антител также могут быть легко приготовлены с помощью техник, которые известны в данной области. См., например, Junghans и др. в Cancer Chemotherapy и Biotherapy 655-686 (2-ое изд., Chafner и Longo, ред., Lippincott Raven (1996)). См.также патенты US №№ 4681581, 4735210, 5101,8275102990 (U.S. Re. Пат. № 35500), 5648471 и 5697902.
В некоторых вариантах осуществления, молекула антитела и компонент, не представляющий собой антитело, связаны с помощью линкера. В таких вариантах осуществления, иммуноконъюгат представлен формулой (I)
где
Ab представляет собой молекулу анти-GCC антитела, описанную в настоящей заявке;
X представляет собой компонент, который связывает Ab и Z, например остаток линкера, описанного в настоящей заявке, после ковалентного связывания с одним или обеими из Ab и Z;
Z представляет собой терапевтическое средство или метку и m находится в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 15.
Переменная m представляет количество-X-Z компонентов на молекулу антитела в иммуноконъюгате формулы (I). В различных вариантах осуществления, m находится в интервале от 1 до 15, 1-10, 1-9, 18, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 или 1-2. В некоторых вариантах осуществления m находится в интервале от 2 до 10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2- 5, 2 - 4 или 2 - 3. В других вариантах осуществления, m представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В композициях, содержащих множество иммуноконъюгатов формулы (I), m представляет собой среднее количество -X-Z компонентов на Ab, также обозначается как среднее значение насыщенности лекарственным средством. Среднее значение насыщенности лекарственным средством может находиться в интервале от 1 до приблизительно 15 -X-Z компонентов на Ab. В некоторых вариантах осуществления, если m представляет собой среднее значение насыщенности лекарственным средством, m равно приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7 или приблизительно 8. В типичных вариантах осуществления m равно от приблизительно 2 до приблизительно 8. В одном варианте осуществления m приблизительно равно 8. В другом варианте осуществления m приблизительно равно 4. В другом варианте осуществления m приблизительно равно 2.
Среднее число-X-Z компонентов на Ab может быть охарактеризовано с помощью общепринятых методов, таких как масс-спектроскопия, ELISA анализ, и ВЭЖХ. Также можно определить количественное распределение иммуноконъюгатов в отношении m. В некоторых случаях можно осуществлять разделение, очистку и характеристику гомогенности иммуноконъюгаты, где m имеет определенное значение в отличие от иммуноконъюгатов, насыщенными другими лекарственными средствами, с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой или электрофореза.
Иммуноконъюгаты формулы (I) могут существовать в виде смесей, где каждый компонент смеси имеет различное m значение. Например, иммуноконъюгат формулы (I) может существовать в виде смеси двух отдельных компонентов иммуноконъюгатов: один компонент иммуноконъюгата, где m равно 7, и другой компонент иммуноконъюгата, где m равно 8.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 1, 2, и 3 соответственно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 3, 4, и 5 соответственно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 5, 6, и 7 соответственно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 7, 8, и 9 соответственно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 9, 10 и 11 соответст- 34 030827 венно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 11, 12 и 13 соответственно.
В одном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I) существует в виде смеси трех отдельных иммуноконъюгатов, где m для трех отдельных иммуноконъюгатов равно 13, 14 и 15 соответственно.
Различные подходящие линкеры (например, гетеробифункциональные реагенты для связывания молекулы антитела с терапевтическим средством или меткой) и способы приготовления иммуноконъюгатов известны в данной области. (См., например, Chari и др., Cancer Research 52:127-131 (1992).) Линкер может быть отщепляемым, например, в физиологических условиях, например во внутриклеточных условиях, таким образом, что отщепление линкера высвобождает лекарственное средство (терапевтическое средство или метку) во внутриклеточную окружающую среду. В других вариантах осуществления линкер не является отщепляемым и лекарственное средств высвобождается, например, путем разложения антитела.
Линкер может быть связан с химически реакционно-способной группой в антительном компоненте, например, со свободной амино, имино, гидроксильной, тиольной или карбоксильной группой (например, с N- или C-концевыми, с эпсилон-аминогруппой одного или нескольких остатков лизина, свободной группой карбоновой кислоты одного или нескольких остатков глутаминовой кислоты или аспрарагиновой кислоты, или с сульфгидрильной группой одного или нескольких остатков цистеина). Сайт, с которым связывается линкер, может представлять собой природный остаток в аминокислотной последовательности антительного компонента или он может быть интродуцирован в антительный компонент, например, с помощью технологии рекомбинантных ДНК (например, путем интродукции цистеина или сайта расщепления протеазой в аминокислотную последовательность) или путем биохимии белков (например, восстановления, pH коррекции или протеолиза).
Одним из наиболее часто используемых методов ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция для связывания карбокси (или амино) группы соединения с амино (или карбокси) группами молекулы антитела. Дополнительно, бифункциональные агенты, такие как диальдегиды или сложные имидоэфиры можно использовать для связывания аминогруппы соединения с аминогруппами молекулы антитела. Также доступна для присоединения лекарственных средств к молекуле антител реакция оснований шиффа. Этот метод включает окисление перйодатом лекарственного средства, которое содержит гликольные или гидрокси группы, образуя, таким образом альдегид, который после этого подвергают реакции с молекулой антитела. Присоединение происходит путем образования основания шиффа с аминогруппами молекулы антитела. Изотиоцианаты также можно использовать в качестве связующих средств для ковалентного присоединения лекарственных средств к молекуле антитела. Другие техники известны специалистам в данной области техники и охватываются объемом настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления, промежуточное соединение, которое представляет собой предшественник линкера (X), подвергают реакции с лекарственным средством (Z) в подходящих условиях. В определенных вариантах осуществления, реакционно-способные группы используются на лекарственном средства и/или промежуточном соединении. Продукт реакции между лекарственным средством и промежуточным соединением, или дериватизированным лекарственным средством, после этого подвергают реакции с молекулой антитела в подходящих условиях.
Иммуноконъюгат может быть очищен от реагентов путем применения методологий, которые хорошо известны специалисту в данной области техники, например, колоночной хроматографии (например, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, хроматографии с гидрофобным взаимодействием), диализом, диафильтрации или осаждения. Иммуноконъюгат можно оценивать путем применения методологий, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, SDS-PAGE, масс-спектроскопии, или капиллярного электрофореза.
В некоторых вариантах осуществления, линкер отщепляют с помощью расщепляющего агента, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в лизосоме или эндосоме или ямке (на поверхности клеток). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляют с помощью внутриклеточной пептидазы или протеазного фермента, включая, но не ограничиваясь только ими, лизосомальную или эндосомальную протеазу. В некоторых вариантах осуществления, пептидильный линкер имеет по меньшей мере две аминокислоты в длину или по меньшей мере три аминокислоты в длину. Расщепляющие агенты могут включать катепсины B и D и плазмин, все из которые, как известно, гидролизируют дипетидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри целевых клеток (см., например, Dubowchik и Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Наиболее типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, присутствующими в GCC-экспрессирующих клетках. Например, можно использовать пептидильный линкер, который отщепляется с помощью тиолзависимой протеазы катепсинB, который в больших количествах экспрессируется в раковой ткани (например, Phe-Leu или Gly-Phe
- 35 030827
Leu-Gly линкер (SEQ ID NO:319)).
Другие примеры таких линкеров описаны, например, в патенте US № 6214345, включенный в настоящую заявку полностью и для всех целей. В специфическом варианте осуществления, пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой Val-Cit линкер или Phe-Lys линкер (см., например, патент US 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с помощью val-cit линкера). Одним из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического расщепления терапевтического средства является то, что агент типично аттенуируется при конъюгировании и стабильность в сыворотке конъюгатов является типично высокой.
В других вариантах осуществления расщепляемый линкер является pH-чувствительным, то есть чувствительным к гидролизу при определенных pH значениях. Типично, pH-чувствительный линкер гидролизируется в кислых условиях. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, который шидролизируется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, сложный орто-эфир, ацеталь, кеталь, или другие). (См., например, патенты US №№ 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik и Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville и др., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661.) Такие линкеры являются относительно стабильными в нейтральных условиях pH, таких как условия в крови, но нестабильны при значении ниже pH 5,5 или 5,0, приблизительном pH лизосомы. В определенных вариантах осуществления, гидрлизируемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому средству с помощью ацилгидразоновой связи (см., например, патент US № 5622929).
В еще других вариантах осуществления, линкер отщепляется в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). В данной области известны различные дисульфидные линкеры, включая, например, те, которые могут быть образованы, используя SATA Щ-сукцинимидил^ацетилтиоацетат), SPDP Щ-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB Щ-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)бутират) и SMPT Щ-сукцинимидил-оксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол), SPDB и SMPT (См., например, Thorpe и др., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak и др., В Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ред., Oxford U. Press, 1987. См. также патент US № 4880935.)
В еще других специфических вариантах осуществления, линкер представляет собой малонатный линкер (Johnson и др., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), малеимидобензоильный линкер (Lau и др., 1995, Bioorg Med Chem. 3(10): 1299-1304), или 3'-Ы-амидный аналог (Lau и др., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).
В еще других вариантах осуществления линкерная единица не отщепляется и лекарственное средство высвобождается путем разложения антитела. (См. например, публикацию US № 20050238649 включенную в качестве ссылки полностью в настоящую заявку и для всех целей).
Типично линкер является существенно нечувствительным к внеклеточной среде. Как используется в настоящей заявке, существенно нечувствительный к внеклеточной среде, в контексте линкера, обозначает, что не больше, чем приблизительно 20%, типично не больше чем приблизительно 15%, более типично не больше чем приблизительно 10%, и еще более типично не больше чем приблизительно 5%, не больше, чем приблизительно 3%, или не больше, чем приблизительно 1% линкеров, в образце иммуноконъюгата, расщепляется, если иммуноконъюгат присутствует во внеклеточной среде (например, в плазме). Определить, будет ли существенно нечувствительным к внеклеточной среде, можно, например, путем инкубирования иммуноконъюгата с плазмой в течение заранее установленного периода времени (например, 2, 4, 8, 16, или 24 ч) и затем определения количества свободного лекарственного средства, присутствующего в плазме.
В других, взаимно-неисключающих вариантах осуществления, линкер способствует клеточной интернализации. В определенных вариантах осуществления, линкер способствует клеточной интернализации, если конъюгирован с терапевтическим средством или меткой (Z). В еще других вариантах осуществления, линкер способствует клеточной интернализации, если конъюгирован как с Z компонентом, так и с молекулой анти-GCC антитела.
Различные примеры линкеров, которые можно использовать в композициях и способах согласно настоящему изобретению, описаны в WO 2004-010957, US публикация № 20060074008, US публикация № 20050238649, и US публикация № 20060024317 (каждая из которых включена в качестве ссылки полностью в настоящую заявку и для всех целей).
Примеры линкеров, которые можно использовать для связывания молекулы антитела с терапевтическим средством или меткой, включают, например, малеимидокапроил (mc); линкеры малеимидокапроил-н-аминобензилкарбамат; малеимидокапроил-пептид-аминобензилкарбамат, например, малеимидокапроил-L-фенилаланин-L-лизин-p-аминобензилкарбамат и малеимидокапроил-Е-валин-Е-цитруллин-наминобензилкарбамат (vc); N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)проприонат (также известен как Nсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат или SPP); 4-сукцинимидил-оксикарбонил-2-метил-2-(2пиридилдитио)толуол (SMPT); N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутират (SPDB); 2-иминотиолан; S-ацетилянтарный ангидрид; дисульфид бензил карбамат; карбонат; гидразоновые линкеры; №(а-малеимидоацетокси) сукцинимид сложный эфир; N-[4
- 36 030827 (н-азидосалициламидо)бутил] -3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (AMAS); N- [β-малеимидопропилокси]сукцинимид сложный эфир (BMPS); [№-е-малеимидокапроилокси]сукцинимид сложный эфир (EMCS); №[у-малеимидобутирилокси]сукцинимид сложный эфир (GMBS); сукцинимидил-4-[№ Малеимидометил]циклогексан-1-карбокси-[6-амидокапроат] (LC-SMCC); сукцинимидил 6-(3-[2пиридилдитио]пропионамидо)гексаноат (LC-SPDP); м-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимид сложный эфир (MBS); №сукцинимидил[4-йодацетил] аминобензоат (SIAB); сукцинимидил 4-[Nмалеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); N-сукцинимидил 3-[2-пиридилдитио]пропионамидо (SPDP); [№Е-малеимидокапроилокси]сульфосукцинимид сложный эфир (сульфо-EMCS); №[у-малеимидобутирилокси]сульфосукцинимид сложный эфир (сульфо-GMBS); 4-сульфосукцинимидил-6-метил-а-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат) (сульфо-LC-SMPT); сульфосукцинимидил 6-(3'-[2-пиридилдитио]пропионамидо)гексаноат (сульфо-LC-SPDP); м-малеимидобензоил-№гидроксисульфосукцинимид сложный эфир (сульфо-MBS); №сульфосукцинимидил[4-йодацетил]аминобензоат (сульфо-SIAB); сульфосукцинимидил 4-[№малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (сульфоSMCC); сульфосукцинимидил 4-[н-малеимидофенил] бутират (сульфо-SMPB); этилен гликольбис(янтарной кислоты N-гидроксисукцинимид сложный эфир) (EGS); дисукцинимидил тартрат (DST); 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (DOTA); диэтилентриамин-пентауксусная кислота (DTPA); и линкеры тиомочевины.
В некоторых вариантах осуществления линкер -X- имеет формулу -Aa-Ww-Yy- и иммуноконъюгат формулы (I) характеризуется формулой (II)
АЬ·
(II) где
Ab представляет собой молекулу анти-GCC антитела, описанную в настоящей заявке;
-A- представляет собой растяжную единицу;
a равен 0 или 1;
каждый -W- независимо представляет собой аминокислотную единицу;
w представляет собой целое число в интервале от 0 до 12;
-Y- представляет собой само-уничтожающую спейсерную единицу;
y представляет собой 0, 1, или 2;
Z представляет собой терапевтическое средство или метку и m находится в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 15.
Растяжная единица (A), если она присутствует, способна связывать Ab единицу с аминокислотной единицей (-W-), если она присутствует, со спейсерной единицей (-Y-), если она присутствует; или с терапевтическим средством или меткой (Z). Пригодные функциональные группы, которые могут присутствовать на молекуле анти-GCC антитела, либо натурально или либо вследствие химической обработки, включают, но не ограничиваясь только ими, сульфгидрил, амино, гидроксил, аномерную гидроксильную группу углевода, и карбоксил. Подходящие функиональные группы представляют собой сульфгидрил и амино. В одном примере, сульфгидрильная группа может быть получена путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей молекулы анти-GCC антитела. В другом варианте осуществления, сульфгидрильные группы могут быть получены путем взаимодействия аминогруппы лизинового компонента молекулы анти-GCC антитела с 2-иминотиоланом (реагент Траута) или другими сульфгидрильными генерирующими реагентами. В определенных вариантах осуществления, молекула анти-GCC антитела представляет собой рекомбинантное антитело и сконструировано таким образом, что несет один или несколько лизинов. В определенных других вариантах осуществления, рекомбинантная молекула антиGCC антитела сконструирована таким образом, что она несет дополнительные сульфгидрильные группы, например, дополнительные цистеины.
В одном варианте осуществления, растяжная единица образует связь с атомом серы Ab единицы. Атом серы может иметь происхождение из сульфгидрильной группы Ab. Типичные растяжные единицы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формул (IIa) и (IIIb), где Ab-, -W-, -Y-, -Z, w и y имеют значения, указанные выше, и Ra выбирают из -Q-Сщ-алкилен-, -C2-Q0алкенилен-, Ю2-С10-алкинилен-, -карбоцикло-, ^-(^^-алкилен)-, О-^^-алкенилен)-, -O-^-Qалкинилен)-, -арилен-, -^-С^-алкилен-арилен-, Ю2-С10-алкенилен-арилен, -^-Сщ-алкинилен-арилен, -ариленЮгСщ-алкилен-, -арилен-C2-C10-алкенилен-, -ариленЮ2-С10-алкинилен-, -^-Сщ-алкилен(карбоцикло)-, -^-Сщ-алкенилен^карбоцикло)-, -^-Сщ-алкинилен^карбоцикло)-, -(карбоцикло^^-С^алкилен-, -(карбоцикло^^-Сщ-алкенилен-, -(карбоцикло^^-Сщ-алкинилен, гетероцикло-, -Q-Сщалкилен-( гетероцикло)-, -^-Сщ-алкенилен^гетероцикло)-, -^-Сщ-алкинилен^гетероцикло)-, -(гетероцикло^^-С^-алкилен-, -(гетероцикло^^-Сщ-алкенилен-, -(гетероцикло^^-Сщ-алкинилен-, -(CH2CH2O)r-, или -(CH2CH2O)r-CH2-, и r представляет собой целое число в интервале от 1-10, где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, ариловые, карбоцикличные, карбоцикло, гетероцикло, и ариленовые радикалы, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно замещены. В некоторых вариантах осуществления, указанные алкильные,
- 37 030827 алкенильные, алкиниловые, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, ариловые, карбоцикличные, карбоцикло, гетероцикло, и ариленовые радикалы, либо отдельно или в виде части другой группы, замещены. В некоторых вариантах осуществления, Ra выбирают из -Q-Cw-алкилен-, - карбоцикло-, -O-(C1Cs-алкилен)-, -арилен-, -Q-C^-алкилен-арилен-, -арилен-C1-C10-алкилен-, -C1-C10-алкилен-(карбоцикло)-, -( карбоцикло^г^-алкилен-, -Q-Cg-гетероцикло-, -C1-C10-алкилен-(гетероцикло)-, -( гетероцикло)-^Cw-алкилен-, -(CH2CH2O)r-, и -(CH2CH2O)r-CH2-; и r представляет собой целое число в интервале от 1-10, где указанные алкиленовые группы замещены и оставшиеся группы необязательно замещены.
Подразумевается из всех типичных вариантов осуществления, даже если точно не указано, что от 1 до 15 компонентов лекарственных средств могут быть связаны с Ab(m=1-15).
z (///«) о II
Z (™)
Иллюстративная растяжная единица представляет собой единицу формулы (IIIa), где Ra представляет собой -(CH2)5-
Другая иллюстративная растяжная единица представляет собой единицу формулы (IIIa), где Ra представляет собой -(CH2CH2O)r-CH2- и r представляет собой 2:
Другая иллюстративная растяжная единица представляет собой единицу формулы (IIIa), где Ra представляет собой -арилен- или арилен-C1-C10-алкилен-. В некоторых вариантах осуществления арильная группа представляет собой незамещенную фенильную группу.
Еще другая иллюстративная растяжная единица представляет собой единицу формулы (IIIb), где Ra представляет собой -(CH2)5/Ай
В определенных вариантах осуществления растяжная единица связана с Ab с помощью дисульфидной связи между атомом серы Ab единица и атомом серы растяжной единицы. Типичная растяжная единица согласно этому варианту осуществления представлена в квадратных скобках формулы (IV), где Ra, Ab-, -W-, -Y-, -Z, w и y имеют значения, указанные выше.
/ [ и \
Ab—bsj-S—Ra—С Ww-Yy Z \ / т
Следует принять во внимание, что для всей заявки, S компонент в формуле ниже относится к атому серы Ab единицы, если другое не следует из контекста.
Ab—S4В еще других вариантах осуществления растяжная единица перед присоединением к Ab, содержит реакционно-способный сайт, который может образовывать связь с первичной или вторичной аминогруппой Ab. Примеры этих реакционно-способных сайтов включают, но не ограничиваясь только ими, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные сложные эфиры, 4 нитрофенильные сложные эфиры, пентафторфенильные сложные эфиры, тетрафторфенильные сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Типичные растяжные единицы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формулы (Va) и (Vb) где -Ra-, Ab-, -W-, -Y-, -Z, w и y имеют значения, указанные выше
- 38 030827
В некоторых вариантах осуществления растяжная единица содержит реакционно-способный сайт, который реагирует для модификации углеводной (-CHO) группы, которая может присутствовать на Ab. Например, углевод может быть мягко окислен с помощью реагента, такого как перйодат натрия, и полученную (-CHO) единицу окисленного углевода можно конденсировать с растяжной единицей, которая содержит функциональную группу, такую как гидразид, оксим, первичный или вторичный амин, гидразин, тиосемикарбазон, гидразин карбоксилат, и арилгидразид, такие как те, которые описаны Kaneko и др., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 133-41. Типичные растяжные единицы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формулы (VIa), (VIb), и (VIc), где -Ra-, Ab-, -W-, -Y-, -Z, w и y имеют значения, указанные выше.
(ГЛ)
(гл)
Аминокислотная единица (-W-), если присутствует, связывает растяжную единицу со спейсерной единицей, если спейсерная единица присутствует, связывает растяжную единицу с лекарственным компонентом, если спейсерная единица отсутствует, и связывает Ab с терапевтическим средством или меченым компонентом, если растяжная единица и спейсерная единица отсутствуют.
Ww- может представлять собой, например, монопептидную, дипептидную, трипептидную, тетрапептидную, пентапептидную, гексапептидную, гептапептидную, октапептидную, нонапептидную, декапептидную, ундекапептидную или додекапептидную единицу. Каждая -W- единица независимо имеет формулу, представленную ниже, в квадратных скобках, и w представляет собой целое число в интервале от 0 до 12
or
СН3 О
Rb где Rb представляет собой водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, нгидроксибензил, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, фенил, циклогексил
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная единица может быть ферментативно отщеплена с помощью одного или нескольких ферментов, включая протеазу, связанную с раком или с опухолью, для высвобождения терапевтического средства или меченый компонент (-Z), который в одном варианте осуществления протонирован in vivo при высвобождении, обеспечивая терапевтическое средство
- 39 030827 или метку (Z).
В определенных вариантах осуществления аминокислотная единица может содержать природные аминокислоты. В других вариантах осуществления, аминокислотная единица может содержать не встречающиеся в природе аминокислоты. Иллюстративные Ww единицы представлены формулами (VII)-(IX):
где Rc и Rd имеют значения, указанные ниже:
ΙΓ
Бензил (CH2)4NH2;
метил (CH2)4NH2;
изопропил (CH2)4NH2;
изопропил (CH2)3NHCONH2;
бензил (CH2)3NHCONH2;
изобутил (CH2)3NHCONH2;
emqp-бутил (CH2)3NHCONH2;
>-снгО N Н (CH2)3NHCONH2;
бензил метил;
бензил (CH2)3NHC(=NH)NH2;
ц О Rd u О
Rc О Re где Rc, Rd и Re имеют значения, указанные ниже:
(VIII)
В!
бензил Бензил (CH2)4NH2;
изопропил Бензил (CH2)4NH2; и
Η Бензил (CH2)4NH2;
где Rc, Rd, Re и Rf имеют значения, указанные ниже:
в^ В! в!
н бензил изобутил Н; и
метил изобутил метил изобутил.
Типичные аминокислотные единицы включают, но не ограничиваясь только ими, единицы формулы (VII), где Rc представляет собой бензил и Rd представляет собой -(CH2)4NH2; Rc представляет собой изопропил и Rd представляет собой -(CH2)4NH2; или Rc представляет собой изопропил и Rd представляет собой -(CH2)3NHCONH2. Другой типичной аминокислотной единицей является единица формулы (VIII), где Rc представляет собой бензил, Rd представляет собой бензил, и Re представляет собой -(CH2)4NH2.
Пригодные -Ww- единицы могут быть созданы и оптимизированы относительно их селективности для ферментативного расщепления с помощью конкретного фермента, например, протеазы, связанной с опухолью. В одном варианте осуществления, -Ww - единица представляет собой единицу, которая расщепляется катепсином B, C и D или плазминовой протеазой.
В одном варианте осуществления, -Ww- представляет собой дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Если Rb, Rc, Rd, Re или Rf не представляет собой водород, то атом углерода, к которому Rb, Rc, Rd, Re или Rf присоединены, является хиральным.
Каждый атом углерода, к которому Rb, Rc, Rd, Re или Rf, присоединены, независимо находится в (S) или (R) конфигурации.
В одном аспекте аминокислотной единицы аминокислотная единица представляет собой валинцитруллин (vc или val-cit). В другом аспекте аминокислотная единица представляет собой фенилаланинлизин (i.e., fk). В еще другом аспекте аминокислотной единицы аминокислотная единица представляет собой N-метилвалин-цитруллин. В еще другом аспекте, аминокислотная единица представляет собой 5аминовалериановую кислоту, гомофенилаланинлизин, тетраизохинолинкарбоксилат лизин, циклогексилаланин лизин, изонепекотовую кислоту лизин, бета-аланинлизин, глицин-серин-валин-глутамин и изонепекотовую кислоту.
Спейсерная единица (-Y-), если присутствует, связывает аминокислотную единицу с терапевтическим средством или меченым компонентом (-Z-), если присутствует аминокислотная единица. Альтерна
- 40 030827 тивно, спейсерная единица связывает растяжную единицу с терапевтическим средством или меченым компонентом, если аминокислотная единица отсутствует. Спейсерная единица также связывает терапевтическое средство или меченый компонент с Ab единицей, если обе аминокислотная единица и растяжная единица отсутствуют.
Спейсерные единицы бывать двух различных типов: не-саморазрушающаяся или саморазрушающаяся. Не-саморазрушающаяся спейсерная единица представляет собой единицу, в которой часть или все из спейсерной единицы остаются связанными с терапевтическим средством или меченым компонентом после расщепления, предпочтительно ферментативного, аминокислотной единицы от конъюгата антитело-лекарственное средства. Примерами не-саморазрушающейся спейсерной единицы являются, но не ограничиваясь только ими, (глицин-глицин) спейсерная единица и глицин спейсерная единица (обе представлены на схеме 1) (ниже). Если конъюгат, содержащий глицин-глицин спейсерную единицу или глицин спейсерную единицу, подвергается ферментативному расщеплению с помощью фермента (например, протеазой, связанной с опухолевой клеткой, протеазой, связанной с раковой клеткой, или протеазой, связанной с лимфоцитом), то глицин-глицин-Z компонент или глицин-Z компонент отщепляется от Ab-Aa-Ww-. В одном варианте осуществления в целевой клетке происходит независимая реакция гидролиза, расщепляющая связь глицин-Z компонента и высвобождая терапевтическое средство или метку.
Схема 1
Ab—^Аа—Ww—Gly-Gly-Z^ ферментативное расщепление ферментативное расщепление гидролиз
I
Gly—Z Gly—Gly—Z терапевтическое средство или метка терапевтическое средство или метка
В некоторых вариантах осуществления не-саморазрушающаяся спейсерная единица (-Y-) представляет собой -Gly-. В некоторых вариантах осуществления не-саморазрушающаяся спейсерная единица (-Y-) представляет собой -Gly-Gly-.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает иммуноконъюгат формулы (II), где спейсерная единица отсутствует (y=0), или его фармацевтически приемлемую соль.
Альтернативно, конъюгат, содержащий саморазрушающуюся спейсерную единицу, может высвобождать -Z. Как используется в настоящей заявке, термин саморазрушающийся спейсер относится к бифункциональному химическому компоненту, который способен ковалентно связывать вместе два расположенных на расстоянии химических компонента в стабильную трехкомпонентную молекулу. Он бу дет спонтанно отделяться от второго химического компонента, если его связь с первым компонентом расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления -Yy- представляет собой н-аминобензиловую спиртовую (PAB) единицу (см. схемы 2 и 3), чья фениленовая часть замещена с помощью Qn, где Q представляет собой -CrCs-алкил, -Q-Cs-алкенил, -Q-Cs-алкинил, ^-(^^-алкил), -O-(C2-C8-алкенил), -O-(C2-C8алкинил), -галоген, -нитро или -циано; и n представляет собой целое число в интервале от 0-4. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут быть необязательно замещены.
В некоторых вариантах осуществления -Y- представляет собой PAB группу, которая связана с -Ww с помощью амино атома азота PAB группы, и соединена непосредственно с -Z с помощью карбонатной, карбаматной или простой эфирной группы. Не желая ограничиваться любой конкретной теорией или механизмом, на схеме 2 представлен возможный механизм высвобождения терапевтического средства или метки (-Z) из PAB группы, которая присоединена непосредственно к -Z с помощью карбаматной или карбонатной группы, как описано Toki и др., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872.
Схема 2
ферментативное расщепление
Q„ δ
1,6-элиминация терапевтическое средство или метка
- 41 030827
На схеме 2, Q представляет собой -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -Q-Q-алкинил, -□-(Q-Q-алкил), -□-(Q-Q-алкенил), -□-(Q-Q-алкинил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в интервале от 0-4; и m находится в интервале от 1 до приблизительно 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут быть необязательно замещены.
Не желая ограничиваться любой конкретной теорией или механизмом, на схеме 3 представлен возможный механизм высвобождения терапевтического средства или метки (-Z) из PAB группы, которая присоединена непосредственно к -Z с помощью простой эфирной или аминовой связи, где -Z включает группу кислорода или азота, которая является частью терапевтического средства или меченого компонента.
Схема 3
1,6-элиминация
терапевтическое средство или метка
На схеме 3 Q представляет собой -Q-Q-алкил, -C^Q-алкенил, -Q-Q-алкинил, -□-(CrQ-алкил), О-^-^-алкенил), -□-(Q-Q-алкинил), -галоген, -нитро или -циано; n представляет собой целое число в интервале от 0-4 и m находится в интервале от 1 до приблизительно 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут быть необязательно замещены.
Другие примеры саморазрушающихся спейсеров включают, но не ограничиваясь только ими, ароматические соединения, которые электронно сходно с PAB группой, такие как производные 2аминоимидазол-5-метанола (Hay и др., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или парааминобензилацетали. Спейсеры могут подвергаться циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues и др., 1995, Chemistry Biology 2:223), подходяще замещенные бицикло [2.2.1] и бицикло [2.2.2] кольцевые системы (Storm и др., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry и др., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Элиминия амино-содержащих лекарственных средств, которые замещены в а-положении глицина (Kingsbury и др., 1984, J. Med. Chem. 27:1447), также является примером само-разрушающихся спейсеров.
В одном варианте осуществления спейсерная единица представляет собой разветвленную бис(гидроксиметил)-стирольную (BHMS) единицу, как представлено на схеме 4, которая может использоваться для инкорпорации и высвобождения множественных лекарственных средств.
Схема 4
ферментативное расщепление
У (2 х т) терапевтические средства или метки
На схеме 4 Q представляет собой -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -Q-Q-алкинил, -□-(CrQ-алкил), -□-(Q-Q-алкенил), -□-(Q-Q-алкинил), -галоген, -нитро или -циано; n представляет собой целое число в интервале от 0-4; o равен 0 или 1; и m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут быть необязательно замещены.
В некоторых вариантах осуществления -Z компоненты являются одинаковыми. В еще другом варианте осуществления, -Z компоненты являются разными.
В одном аспекте спейсерные единицы (-Yy-) представлены формулами (X)-(XII)
- 42 030827
где Q представляет собой -Q-Cs-алкил, -Q-Cs-алкенил, -Q-Cs-алкинил, -O-(C1-C8-алкил), -O-(C2Cg-алкенил), -O-(C2-C8-алкинил), -галоген, -нитро или -циано и m представляет собой целое число в интервале от 0-4. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, либо отдельно или в виде части другой группы, могут быть необязательно замещены.
UN—СН2-СО—(xjx i—NHCH2C(O)-NHCH2C(O)—!
? ξ (XII)
В группе выбранных вариантов осуществления конъюгаты формулы (I) и (II) представляют собой
где Aa, Ww, Yy, Z и Ab имеют значения, указанные выше.
Переменная Z в формуле (I) представляет собой терапевтическое средство или метку. Терапевтическое средство может представлять собой любое средство, способное проявлять желательный биологический эффект. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство сенсибилизирует клетку ко второй терапевтической модальности, например химиотерапевтическому средству, лучевой терапии, иммунотерапии.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство цитостатический или цитотоксический агент. Примеры включают, без ограничений, антиметаболиты (например, азатиоприн, 6меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабин, пентостатин, кладрибин, 5-фторурацил (5FU), флоксуридин (FUDR), арабинозид цитозина (цитарабин), метотрексат, триметоприм, пириметамин, пеметрексед); алкилирующие средства (например, циклофосфмид, мехлоретамин, урамустин, мелфалан, хлорамбуцил, тиотепа/хлорамбуцил, ифосфамид, кармустин, ломустин, стрептозоцин, буфульфан, дибромманнитол, цисплатин, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, сатраплатин, триплатин тетранитрат, прокарбазин, алтретамин, дакарбазин, митололомид, темозоломид); антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, варрубицин); антибиотики (например, дактиномицин, блеомицин, митрамицин, антрамицин, стрепрозотоцин, грамицидин D, митомицины (например, митомицин C), дуокармицины (например, CC-1065), калихеамицины); антимитотические средства (включая, например, майтансиноиды, ауристатины, доластатины, крипрофицины, алколоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин), таксаны (например, паклитаксел, децетаклел, или новый таксан (см., например, международную патентную публикацию № WO 01/38318, опубликованную 31 мая
- 43 030827
2001 г.)), и колхицины; ингибиторы топоизомеразы (например, иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, тенипозид, митоксантрон); и ингибиторы протеасомы (например, пептидил бороноые кислоты).
Иммуноконъюгаты майтансиноидов
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой майтансиноид. Майтансиноидные соединения и способы их конъюгирования с антителами описаны, например, в Chari и др., Cancer Res., 52: 127-131 (1992); Widdison и др., J. Med. Chem. 49: 4392-4408 (2006) и патентах US №№ 5208020 и 6333410. Примеры майтансиноидов включают аналоги майтансина, имеющие модифицированное ароматическое кольцо (например, C-19-дехлор, C-20-деметокси, C-20-ацилокси), и те, которые имеют модификации в других положениях (например, C-9-CH, C-14-алкоксиметил, C-14гидроксиметил или ацилоксиметил, C-15-гидрокси/ацилокси, C-15-метокси, C-18-N-деметил, 4,5дезокси). В определенных вариантах осуществления, майтансиноид представляет собой N2-деацетил-N2 (4-меркапто-1-оксопентил)майтансин (DM3), N2 -деацетил-N2 -(3-меркапто-1 -оксопропил)майтансин (DM1), или N2 -деацетил-N2 -(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтансин (DM4).
Майтансиноидные соединения, которые содержат сульфгидрильную группу, могут быть связаны с антителами с использованием гетеробифункционального линкера, который связывается с майтансиноидным соединением с помощью тиоэфирной или дисульфидной связи. В некоторых таких вариантах осуществления, линкер связан с аминогруппой на антителе (например, концевая аминогруппа или эпсилон аминогруппа остатка лизина. В некоторых вариантах осуществления, гетеробифункциональный линкер, который используется для связывания майтансиноидного соединения с антителом, представляет собой N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)проприонат (также известен как N-сукцинимидил 4-(2пиридилдитио)пентаноат, или SPP), 4-сукцинимидил-оксикарбонил-2-метил-2-(2-пиридилдитио)-толуол (SMPT), N-сукцинимидил 4-[№малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутират (SPDB), 2иминотиолан или S-ацетилянтарный ангидрид.
В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат формулы (I) характеризуется формулой Ab-(SMCC-DM1)m (формула (I-1); Ab-(SPP-DM1)m (формула (I-2); или Ab-(SPDB-DM4)m (формула (I-3), где Ab представляет собой молекулу анти-GCC антитела, как описано в настоящей заявке, и m имеет значения и предпочтительные значения, описанные выше для формулы (I).
В некоторых вариантах осуществления переменная Ab в формуле (I-1), (I-2), или (I-3) представляет собой молекулу антитела с характерными особенностями, обобщенными в табл. 1-6. В определенных вариантах осуществления, переменная Ab представляет собой - 5F9 молекулу антитела или - Abx-229 молекулу антитела.
В некоторых вариантах осуществления, переменная m в формуле (I-1), (I-1), или (I-3) находится в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 3 до приблизительно 7, или от приблизительно 3 до приблизительно 5.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления, изобретение относится к иммуноконъюгату формулы (I-1), (I-1), или (I-3), где Ab представляет собой 5F9 молекулу антитела и m приблизительно равно 4.
Иммуноконъюгаты доластатина и ауристатина
В некоторых других вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой доластатин. В некоторых вариантах осуществления, терапевтическое средство представляет собой ауристатин, такой как ауристатин E (также известен в данной области техники как производное доластатин-10) или его производное. В некоторых вариантах осуществления, терапевтическое средство представляет
- 44 030827 собой соединение, выбранное из соединений формул (XIII)-(XXIII), или его форму фармацевтически приемлемой соли:
Ауристатиновые соединения и способы их конъюгирования с антителами описаны, например, в Doronina и др., Nature Biotech., 21: 778-784 (2003); Hamblett и др., Clin. Cancer Res., 10: 7063-7070 (2004); Carter и Senter, Cancer J., 14 154-169 (2008); патенты US №№ 7498298, 7091186, 6884869; 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444 и 4486414; опубликованные патентные заявки US №№ 20090010945, 20060074008, 20080300192, 20050009751, 20050238649, и 20030083236; и
- 45 030827 опубликованные международные патентные заявки №№ WO 04/010957 и WO 02/088172, каждая из которых включена в качестве ссылки полностью в настоящую заявку и для всех целей.
Ауристатин может представлять собой, например, сложный эфир, образованный между ауристатином E и кето-кислотой. Например, ауристатин E может реагировать с параацетил бензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с образованием AEB и AEVB, соответственно. Другие типические ауристатины включают ауристатин фенилаланин фенилендиамин (AFP; (XVIII)), монометил ауристатин E (MMAE; (XIII)), и монометил ауристатин F (MMAF; (XXI)).
Было показано, что ауристатины наносят ущерб динамике микротрубочек и ядерному и клеточному делению и имеют противораковую активность. Ауристатины для применения в настоящем изобретении связывают тубулин и могут проявлять цитотоксический или цитостатический эффект на клеточную линию, экспрессирующую GCC. Способы определения, будет ли соединение связывать тубулин, известны в данной области техники. См., например, Muller и др., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel и pp., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976; и Hamel и др., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265:28, 17141-17149. Для целей настоящего изобретения, может быть определена относительная аффинность соединения к тубулину. Некоторые предпочтительные ауристатины согласно настоящему изобретению связывают тубулин с аффинностью в интервале от 10-раз ниже (более слабая аффиность) по сравнению со связывающей аффинностью MMAE к тубулину, до 10-раз , 20-раз или даже 100-раз выше (более высокая аффинность) по сравнению со связывающей аффинностью MMAE к тубулину.
В данной области техники известны различные анализы, которые могут использоваться для определения, будет ли ауристатин или полученный иммуноконъюгат проявлять цитостатический или цитотоксический эффект на желательной клеточной линии. Например, цитотоксическая или цитостатическая аффинность иммуноконъюгата может быть измерена путем: экспозиции клеток млекопитающих, экспрессирующих целевой белок иммуноконъюгата в клеточной культуральной среде; культивирование клеток в течение периода времени от приблизительно 6 ч до приблизительно 5 дней; и измерения жизнеспособности клеток. Клеточные исследования in vitro можно использовать для оценки жизнеспособности (пролиферации), цитотоксичности, и индукции апоптоза (активация каспазы) иммуноконъюгата.
Для определения того, будет ли иммуноконъюгат проявлять цитостатический эффект, можно использовать анализ инкорпорации тимидина. Например, раковые клетки, экспрессирующие целевой антиген при плотности 5000 клеток/лунку в планшете на 96 лунок культивировали в течение периода 72 ч и экспонировали с 0,5 мкКи Щ-тимидина в течение последних 8 ч 72-часового периода.
Инкорпорацию Щ-тимидина в клетки культуры измеряли в присутствии и отсутствии иммуноконъюгата.
Для определения цитотоксичности, можно определять некроз или апоптоз (запрограммированной клеточной гибели). Некроз типично сопровождается повышенной проницаемостью плазматической мембраны; набуханием клеток и разрывом плазматической мембраны. Апоптоз типично характеризуется пузырением мембраны, конденсацией цитоплазмы, и активацией эндогенных эндонуклеаз. Определение любого их этих эффектов на раковых клетках указывает на то, что иммуноконъюгат пригодных для лечения злокачественных новообразований.
Жизнеспособность клеток может быть оценена путем определения в клетках поглощения красителя, такого как нейтральный красный, трипановый синий, или ALAMAR™ синий (см., например, Page и др., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473-476). В таким анализе, клетки инкубируют в среде, содержащей краситель, клетки промывают, и оставшийся краситель, отображающий поглощение красителя клетками, измеряют спектрофотометрически. Для измерения цитотоксичности, также можно использовать протеинсвязывающий краситель сульфродамин B (SRB) (Skehan и др., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-12).
Альтернативно, тетразолиевая соль, такая как MTT или WST, используется для количественного колориметрического анализа для выживания и пролиферации клеток млекопитающих путем определения живых, а не мертвых клеток (см., например, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
Апоптоз может быт количественно оценен путем измерения, например, фрагментации ДНК. Доступны коммерческие фотометрические методы для количественного определения in vitro фрагментации ДНК. Примеры таких анализов, включая TUNEL (который определяет инкорпорацию меченных нуклеотидов в фрагментированную ДНК) и анализы на основе ELISA, описаны в Biochemica, 1999, № 2, cc. 3437 (Roche Molecular Biochemicals).
Апоптоз также может быть определен путем измерения морфологических изменений в клетке. Например, как и при некрозе, потерю целостности цитоплазматической мембраны можно определить путем измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентного красителя, такого как, например, акридиновый оранжевый или этидий бромид). Способ для измерения количества апоптотических клеток был описан Duke и Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan и др. ред., 1992, cc. 3.17.1-3.17.16). Клетки также могут быть мечены с помощью ДНК красителя (например, акридиновый оранжевый, этидий бромид, или пропидий йодид) и в клетках наблюдается конденсация хроматина и скопление лейкоцитов вдоль внутренней ядерной мембраны. Другие морфологические изменения, которые можно оценивать для определения апоптоза, включают, например, цитоплазматическую конденсацию, повышенное пузырение мембраны, и сморщивание клеток.
- 46 030827
Присутствие апоптотических клеток может быть измерено как в прикрепленных, так и и блуждающих компартментах культур. Например, оба компартмента могу быть собраны путем удаления супернатанта, трипсинизации присоединенных клеток, объединения препаратов после центрифугирования стадии промывки (например, 10 мин при 2000 об./мин), и определения апоптоза (например, путем измерения фрагментации ДНК). (См., например, Piazza и др., 1995, Cancer Research 55: 3110-16).
Эффекты иммуноконъюгатов могут быть тестированы или подтверждены на животных моделях. Специалистам в данной области техники известны различные установленные модели злокачественных новообразований на животных, любое из которых можно использовать для оценки эффективности иммуноконъюгата. Неограничивающие примеры таких моделей описаны ниже. Кроме того, могут быть созданы небольшие животные модели для оценки эффективностей иммуноконъюгатов в условиях in vivo путем имплантирования опухолевых клеточных линий человека в подходящие иммунодефицитные штаммы грызунов, например, атимические «голые» мыши или SCID мыши.
В некоторых вариантах осуществления, переменная -Z в формуле (I) представляет собой ауристатиновый компонент формулы (X-A) или формулы (X-B).
где, независимо в каждой локализации: волнообразная линия указывает связь;
R2 представляет собой -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, или -Q-C^-алкинил;
R3 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, карбоцикл, -C1-C20алкилен (карбоцикл), -C2-C20-алкенилен(карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(карбоцикл), -арил, -Q-C^-алкилен(арил), -C2-C20-алкенилен(арил), -C2-C20-алкинилен(арил), -гетероцикл, -C1-C20-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20-алкинилен(гетероцикл);
R4 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, карбоцикл, -C1-C20алкилен (карбоцикл), -C2-C20-алкенилен(карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(карбоцикл), -арил, -C1-C20алкилен(арил), -C2-C20-алкенилен(арил), -^-С^алкинилен^рил), -гетероцикл, -C1-C20-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20-алкинилен(гетероцикл);
R5 представляет собой -H или -Q-Q-алкил;
или R4 и R5 вместе образуют карбоциклическое кольцо и имеют формулу -(CRaRb)s-, где Ra и Rb независимо представляют собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, или -карбоцикл и s представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6,
R6 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, или -Q-C^-алкинил;
R7 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, -карбоцикл, -C1-C20алкилен (карбоцикл), -C2-C20-алкенилен(карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(карбоцикл), -арил, -C1-C20алкилен(арил), -C2-C20-алкенилен(арил), -C2-C20-алкинилен(арил), гетероцикл, -Q-C^-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20-алкинилен(гетероцикл);
каждый R8 независимо представляет собой -H, -OH, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, -O-(C1-C20-алкил), -O-(C2-C20-алкенил), -O-(C1-С20-алкинил) или -карбоцикл;
R9 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, или -Q-C^-алкинил;
R19 представляет собой -арил, -гетероцикл, или -карбоцикл;
R20 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, -карбоцикл, -O-(C1-C20алкил), -O-(C2-C20-алкенил), -O-(C2-C20-алкинил), или OR18, где R18 представляет собой -H, гидроксильную защитную группу, или простую связь, где OR18 представляет собой =O;
R21 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, или -Q-C^-алкинил, -арил, -гетероцикл, или -карбоцикл;
R10 представляет собой -арил или -гетероцикл;
G представляет собой -O-, -S-, -NH-, или -NR12-, где R12 представляет собой -Q-C^-алкил, -C2-C20алкенил, -Q-C^-алкинил;
R11 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -Q-C^-алкинил, -арил, -гетероцикл, -(R13O)s-R14, или -(R13O)s-CH(R15)2;
s представляет собой целое число в интервале от 0-1000;
R13 представляет собой -Q-C^-алкилен, -Q-C^-алкенилен, или -Q-C^-алкинилен;
R14 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, или -Q-C^-алкинил;
в каждом случае R15 независимо представляет собой -H, -COOH, -(CH2)t-N(R16)2, -(CH2)t-SO3H, -(CH^-SO^Q-C^-алкил, -(CH^SO^Q-C^-алкенил, или -(CH^SO^Q-C^-алкинил;
в каждом случае R16 независимо представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -Q-C^-алкенил, -C2-C20
- 47 030827 алкинил или -(CH2)t-COOH; и t представляет собой целое число в интервале от 0 до 6; где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиникленовые, арильные, карбоцикличные и гетероцикличные радикалы, либо отдельно или в виде части другой группы, необязательно замещены.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиникленовые, арильные, карбоцикличные, и гетероцикличные радикалы замещены.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых группы R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, и R9 замещены и группы R19, R20 и R21 необязательно замещены, как описано в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых
R2 представляет собой -Q-Q-алкил;
R3, R4 и R7 независимо выбирают из -H, -Q-C^-алкила, -C^C^-алкенила, -C^C^-алкинила, моноциклического Cз-C6-карбоцикла, C1-C20-алкилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -C2-C20алкенилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -C6-C10-арила, -C1 -C20-алкилен(C6-C10-арил), -C2-C20-алкенилен(C6-C10-арил), -C2-C20-алкинилен(C6-C10арил), -гетероцикла, -C1-C20-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20алкинилен(гетероцикл); где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, карбоцикличные, арильные и гетероцикличные радикалы необязательно замещены;
R5 представляет собой -водород;
R6 представляет собой -Q-Q-алкил;
каждый R8 независимо выбирают из -OH, -O+Q-C^^km), -O+C^C^-алкенил) или -O-(C2-C20алкинил), где указанные алкильные, алкенильные, и алкинильные радикалы необязательно замещены;
R9 представляет собой -водород или -Q-Q-алкил;
R19 представляет собой необязательно замещенный фенил;
R20 представляет собой OR18; где R18 представляет собой H, гидроксильную защитную группу или простую связь, где OR18 представляет собой =O;
R21 выбирают из -H, -Q-C^-алкила, -C^C^-алкенила, -Q-C^-алкинила или -карбоцикла; где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные и карбоцикличные радикалы необязательно замещены; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых R2 представляет собой метил;
R3 представляет собой -H, -Q-Q-алкил, -C^Q-алкенил, или -Q-Q-алкинил, где указанные алкильные, алкенильные и алкинильные радикалы необязательно замещены;
R4 представляет собой -H, -Q-Q-алкил, -Q-Q-алкенил, -C^Q-алкинил, моноциклический C3-C6карбоцикл, -C6-C10-арил, -C1-C8-алкилен(C6-C10-арил), -C2-C8-алкенилен(C6-C10-арил), -Q-Q-алкинилен(C6-C10-арил), -Q-^-алкилен (моноциклический ^-^-карбоцикл), -C^^-алкенилен (моноциклический ^-^-карбоцикл), -C^^-алкинилен (моноциклический ^-^-карбоцикл); где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, арильные, и карбоцикличные радикалы либо отдельно или в виде части другой группы необязательно замещены;
R5 представляет собой H; R6 представляет собой метил;
R7 представляет собой -Q-Q-алкил, -C^Q-алкенил или -C^Q-алкинил;
каждый R8 представляет собой метокси;
R9 представляет собой -водород или -Q-Q-алкил;
R19 представляет собой фенил;
18 18
R представляет собой OR ; где R представляет собой -H, гидроксильную защитную группу, или простую связь, где OR18 представляет собой =O;
R21 представляет собой метил; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых R2 представляет собой метил; R3 представляет собой H или Q-Cs-алкил; R4 представляет собой ^^-алкил; R5 представляет собой H; R6 представляет собой метил; R7 представляет собой изопропил или втор-бутил; R8 представляет собой метокси; R9 представляет собой водород или Q-Q-алкил; R19 представляет собой фенил; R20 представляет собой OR18; где R18 представляет собой H, гидроксильную защитную группу, или простую связь, где OR18 представляет собой =O; и R21 представляет собой метил; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-A) включают те соединения, в которых R2 представляет собой метил или Ci-C.'3-алкил; R3 представляет собой H или Q-Cs-алкил; R4 представляет собой Q-Cs-алкил; R5 представляет собой H; R6 представляет собой Q-Cs-алкил; R7 представляет собой Q-Cs-алкил; R8 представляет собой Q-Cs-алкокси; R9 представляет собой водород или Q-Q-алкил;
R19 представляет собой фенил; R20 представляет собой OR18; где R18 представляет собой Н, гидроксильную защитную группу, или простую связь, где OR18 представляет собой =O и R21 представляет собой Q-Cs-алкил; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых
- 48 030827
R2 представляет собой метил;
R3, R4 и R7 независимо выбирают из -H, -Q-C^-алкила, -C^C^-алкенила, -C^C^-алкинила, моноциклического Cз-C6-карбоцикла, C1-C20-алкилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -C2-C20алкенилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -C2-C20-алкинилен(моноциклический Cз-C6-карбоцикл), -Ce-Cw-арил, -C1 -C20-алкилен(C6-C10-арил), -C2-C20-алкенилен(C6-C10-арил), -C2-C20-алкннилен(C6-C10арил), -гетероцикла, -C1-C20-алкилен(гетероцикл), -C2-C20-алкенилен(гетероцикл), или -C2-C20алкинилен(гетероцикл); где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиниленовые, карбоцикличные, арильные, и гетероцикличные радикалы либо отдельно или в виде части другой группы необязательно замещены;
R5 представляет собой -H;
R6 представляет собой метил;
каждый R8 представляет собой метокси;
R9 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -C^C^-алкенил, или -C^C^-алкинил; где указанные алкильные, алкенильные и алкинильные радикалы необязательно замещены;
R10 представляет собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероцикл;
G представляет собой -O-, -S-, -NH-, или -NR12-, где R12 представляет собой -Q-CM-алкил, -C2-C20алкенил, или -C^C^-алкинил, каждый из которых необязательно замещен;
R11 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -C^C^-алкенил, -C^C^-алкинил, -арил, -гетероцикл, -(R13O)s-R14, или -(R13O)s-CH(R15)2, где указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, арильные и гетероцикличные радикалы необязательно замещены;
s представляет собой целое число в интервале от 0-1000;
R13 представляет собой -Q-C^-алкилен, -Q-C^-алкенилен, или -C^C^-алкннилен, каждый из которых необязательно замещен;
R14 представляет собой -H, -Q-C^-алкил, -C^C^-алкенил, или -C^C^-алкинил, где указанные алкильные, алкенильные и алкинильные радикалы необязательно замещены;
в каждом случае R15 независимо представляет собой -H, -COOH, -(CH2)t-N(R16)2, -(CH2)t-SO3H, -(CH2)t-SO3-C1-C20-алкнл, -(CH2)t-SO3-C2-C20-алкенил, или -(CH2)t-SO3-C2-C20-алкннил, где указанные алкильные, алкенильные и алкинильные радикалы необязательно замещены;
в каждом случае R16 независимо представляет собой -H, -Ci-CS-алкил. -C^C^-алкенил, -C2-C20алкинил или -(CH2)t-COOH, где указанные алкильные, алкенильные и алкинильные радикалы необязательно замещены;
t представляет собой целое число в интервале от 0 до 6; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
в определенных этих вариантах осуществления R10 представляет собой необязательно замещенный фенил;
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых группы R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 и R9 замещены и группы R10 и R11 имеют значения, как описано в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых указанные алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленовые, алкениленовые, алкиникленовые, арильные, карбоцикличные и гетероцикличные радикалы замещены.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых
R2 представляет собой ^-^-алкил;
R3 представляет собой H или ^-^-алкил;
R4 представляет собой Q-Cs-алкил;
R5 представляет собой H;
R6 представляет собой ^-^-алкил;
R7 представляет собой ^^-алкил;
R8 представляет собой ^-^-алкокси;
R9 представляет собой водород или ^-^-алкил;
R10 представляет собой необязательно замещенный фенил;
G представляет собой O, S, или NH и
R11 имеют значения, указанные в настоящей заявке; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых
R2 представляет собой метил; R3 представляет собой H или C1 -Оз-алкил;
R4 представляет собой Q-Cs-алкил;
R5 представляет собой H;
R6 представляет собой метил;
R7 представляет собой изопропил или втор-бутил;
R8 представляет собой метокси;
R9 представляет собой водород или Q-Q-алкил;
- 49 030827
R10 представляет собой необязательно замещенный фенил;
G представляет собой O, S или NH и
R11 имеют значения, указанные в настоящей заявке; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых
R2 представляет собой метил;
R3 представляет собой H или Ci-Ci-алкил;
R4 представляет собой Q-Cs-алкил;
R5 представляет собой H;
R6 представляет собой метил;
R7 представляет собой изопропил или втор-бутил;
R8 представляет собой метокси;
R9 представляет собой водород или Q-Cs-алкил;
R10 представляет собой фенил,
G представляет собой O или NH и
R11 имеют значения, указанные в настоящей заявке, предпочтительно водород; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых
R2 представляет собой Q-Cs-алкил;
R3 представляет собой H или Q-Cs-алкил;
R4 представляет собой Q-Cs-алкил;
R5 представляет собой H;
R6 представляет собой Q-Cs-алкил;
R7 представляет собой Q-Cs-алкил;
R8 представляет собой ^^-алкокси;
R9 представляет собой водород или Q-Cs-алкил;
R10 представляет собой фенил и
G представляет собой O или NH и
R11 имеют значения, указанные в настоящей заявке, предпочтительно водород; или форму его фармацевтически приемлемой соли.
Ауристатины формулы (X-A) или (X-B) включают те соединения, в которых R3, R4 и R7 независимо представляют собой изопропил или втор-бутил и R5 представляет собой -H. В типичном варианте осуществления R3 и R4, каждый, представляет собой изопропил, R5 представляет собой H и R7 представляет собой втор-бутил. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-A) или (X-B) включают те соединения, в которых R2 и R6, каждый, представляет собой метил, и R9 представляет собой H. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-A) или (X-B) включают те соединения, в которых в каждом случае R8 представляет собой -OCH3. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-A) или (X-B) включают те соединения, в которых R3 и R4, каждый, представляет собой изопропил, R2 и R6, каждый, представляет собой метил, R5 представляет собой H, R7 представляет собой втор-бутил, в каждом случае R8 представляет собой -OCH3 и R9 представляет собой H. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых G представляет собой -O- или -NH-. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых R10 представляет собой арил. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых R10 представляет собой -фенил. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых G представляет собой -O- и R11 представляет собой H, метил или t-бутил. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых, если G представляет собой -NH, R11 представляет собой -(R13O)s-CH(R15)2, где R15 представляет собой -(CH2)t-N(R16)2, и R16 представляет собой -Q-Q-алкил или -(CH2)t-COOH. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
Ауристатины формулы (X-B) включают те соединения, в которых, если G представляет собой -NH, R11 представляет собой -(R13O)s-CH(R15)2, где R15 представляет собой H или -(CH2)t-SO3H. Остальные заместители имеют значения, указанные в настоящей заявке.
В предпочтительных вариантах осуществления иммуноконъюгатов формулы (II), если Z представляет собой молекулу ауристатина формулы (X-A), w представляет собой целое число в интервале от 1 до 12, предпочтительно 2-12, y представляет собой 1 или 2 и a представляет собой предпочтительно 1.
- 50 030827
В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгатов формулы (II), если Z представляет собой молекулу ауристатина формулы (X-B), а представляет собой 1 и w и y представляют собой 0.
Иллюстративные терапевтические средства (-Z) включают те, которые имеют следующие структуры:
- 51 030827
В одном аспекте гидрофильные группы, такие как, но не ограничиваясь только ими, триэтилен гликоль сложные эфиры (TEG), могут быть присоединены к молекуле ауристатина формулы (X-B) в R11. Не желая ограничиваться теорией, гидрофильные группы способствуют интернализации и не-агломерации терапевтического средства.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство не представляет собой TZT-1027. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство не представляет собой ауристатин E, доластатин 10 или ауристатин PE.
В некоторых вариантах осуществления молекула ауристатина связана с цистеиновым компонентом на молекуле антитела с помощью линкера, содержащего малеимидный компонент, например малеимидокапроильный компонент.
В некоторых вариантах осуществления молекула ауристатина соединена с молекулой антитела, используя гетеробифункциональный линкер, который связан с гидроксильной группой на молекуле ауристатина. В некоторых таких вариантах осуществления линкер содержит гидразон. В некоторых вариантах осуществления, линкер представляет собой гидразоновое соединение, образованное путем реакции малеимидокапроилгидразида и кетакарбоксиновой кислоты, например 5-бензоилувалеривановой кислоты. В предпочтительных вариантах осуществления линкер представляет собой ^)-6-(2-(6-(2,5-диоксо2,5-дигидро-Ш-пиррол-1-ил)гексаноил)гидразоно)-6-фенилгексановую кислоту.
В некоторых других вариантах осуществления молекула ауристатина связан с антителом с использованием гетеробифункционального линкера, который соединен с монометил аминогруппой на молекуле ауристатина. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит отщепляемый компонент, например, пептидный компонент, и само-разрушающаяся н-аминобензилкарбаматный спейсер. Примеры линкеров включают малеимидокапроил (mc), малеимидокапроил^-фенилаланин^-лизин-н-аминобензилкарбамат, и малеимидокапроил^-валин^-цитруллин-н-аминобензилкарбамат (vc).
В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат формулы (I) характеризуется формулой Ab-(vc-MMAF)m (формула (I-4)); Ab-(vc-MMAE)m (формула (I-5)); Ab-(mc-MMAE)m (формула (I-6)); или Ab-(mc-MMAF)m, (формула (I-7)), где Ab представляет собой молекулу анти-GCC антитела, как описано в настоящей заявке, S представляет собой атом серы антитела и m имеет значения и предпочтительные значения, описанные выше для формулы (I). В определенных вариантах осуществления m представляет собой целое число от 1 до приблизительно 5.
- 52 030827
m (1-4)
(1-6) о
(1-7)
В некоторых вариантах осуществления переменная Ab в формуле (I-4), (I-5), (I-6), или (I-7) представляет собой молекулу антитела с характерными особенностями, обобщенными в табл. 1- 6. В определенных вариантах осуществления переменная Ab представляет собой 5F9 молекулу антитела или Abx229 молекулу антитела.
В некоторых вариантах осуществления переменная m в формуле (I-4), (I-5), (I-6), или (I-7) находится в интервале от приблизительно 2 до приблизительно 10, от приблизительно 6 до приблизительно 8, или от приблизительно 4 до приблизительно 6.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к иммуноконъюгату формулы (I-4), (I-5), (I-6), или (I-7), где Ab представляет собой 5F9 молекулу антитела и m приблизительно равно 4.
Иммуноконъюгаты, описанные в настоящей заявке, могут применяться для модификации данной биологической ответной реакции. Терапевтическое средство не конструируется как ограниченное только классическими химическими терапевтическими средствами. Например, терапевтическое средство может представлять собой нуклеиновую кислоту, белок, или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Например, молекула антитела может быть конъюгирована с антисмысловой молекулой, молекулой киРНК, молекулой кшРНК или молекулой миРНК, которая может препятствовать экспрессии гена, таким образом продуцируя желательный биологический эффект.
Белки и полипептиды, которые могут быть конъюгированы с молекулами антител согласно изобретению, включают, например, токсины и их компоненты, такие как абрин, цепь A абрина, рицин, цепь A рицина, модеццин, цепь A моддецина, альфа-сакрин, эндотоксин A (из Pseudomonas aeruginosa), PE38 (усеченный эндотоксин pseudomonas), гелонин, токсин дифтерии, фрагмент A токсина дифтерии, определенные белки Aleurites fordii, определенные белки Dianthus caryophyllus (например, диантин 30 и диантин 32), определенные белки Phytolacca Americana (например, PAP, PAPII, и PAP-S), определенные белки Saponaria officinlis (например, сапонин 6), ингибитор Momordica charantia, курсин, кротин, митогиллин, рестриктоцин, феномицин, и еномицин; белки для контактирования с иммунной системой в опухоли или индукции эффекторной функции в опухоли, такие как фактор некроза опухоли, интерферон, фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов, и активатор тканевого плазминогена; и модификаторы биологической реакции, такие как, например, цитокины и лимфокины (например, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF)), и другие факторы роста.
Антитела в соответствии с изобретением также могут быть конъюгированы или слиты с поверхностными белками вирусов, присутствующих на вирусных частицах. Например, одноцепочечное анти-GCC антитело согласно настоящему изобретению может быть слито (например, с образованием слитого белка) с поверхностным вирусным белком. Альтернативно, цельное анти-GCC антитело согласно настоящему изобретению, или его фрагмент, может быть химически коннъюгирован (например, с помощью химического линкера) с поверхностным вирусным белком. Предпочтительно, вирус представляет собой вирус, который сливается с эндоцитными мембранами, например, вирус гриппа, таким образом, что вирус интернализуется вместе с анти-GCC антителом и таким образом инфицирует клетки, экспрессирующие GCC. Вирус может быть сконструирован генетически в качестве клеточного токсина. Например, вирус
- 53 030827 может экспрессировать или индуцировать экспрессию генов, которые являются токсическими для клеток, например генов, способствующих гибели клеток. Предпочтительно такие вирусы будут неспособными к вирусной репликации.
Молекула анти-GCC антитела, описанная в настоящей заявке, также может быть конъюгирована с пролекарством или активатором пролекарства. В способе уничтожения или подавления опухолевых клеток, первая молекула анти-GCC антитела согласно изобретению конъюгирована с пролекарством, которое антивируется только тогда, когда находится в непосредственной близости с активатором пролекарства. Активатор пролекарства конъюгирован со второй молекулой антитела, предпочтительно молекулой, которая связывается с неконкурирующим сайтом на GCC молекуле. Определить, будут ли два антитела связываться с конкурирующим или неконкурирующим связывающими сайтами, можно с помощью общепринятых анализов конкурентного связывания. Пары лекарство-пролекарство, пригодные для применения при практическом осуществлении настоящего изобретения, описаны в Blakely и др., ZD2767, an Improved System for Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy That Results in Tumor Regressions in Colorectal Tumor Xenografts, (1996) Cancer Research, 56: 3287-3292.
Терапевтически активные радиоактивные изотопы также можно связывать с анти-GCC антителами, или их антигенсвязывающими фрагментами, или производными. Радиоактивные изотопы можно использовать для диагностических или терапевтических показаний. Радиоактивные изотопы, которые могут быть связаны с анти-GCC антителами, включают, но не ограничиваясь только ими α-, β-, или γэмиттеры, или β- и γ- эмиттеры. См., например, S.E. Order, Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin и др. (ред.), cc. 303-316 (Academic Press 1985. Такие радиоактивные изотопы включают, но не ограничиваясь только ими, медь (64Cu), йод (131I или 125I), иттрий (90Y), лютеций (177Lu), актиний ( Ac), празеодимий, астат ( At), рений ( 6Re), висмут ( Bi или Bi), индий ( In), технеций (99mTc), фосфор (32P), родий (188Rh), сера (35S), углерод (14C), тритий (3H), хром (51Cr), хлор (36Cl), кобальт 57 58 59 75 67 ( Co или Co), железо (9Fe), селен ( Se), или галлий ( Ga). Радиоактивные изотопы, пригодные в каче90 177 225 стве терапевтических средств, включают иттрий ( Ύ), лютеций ( Lu), актиний ( Ac), празеодимий, астат ( At), рений ( Re), висмут ( Bi или Bi) и родий ( Rh). Радиоактивные изотопы, пригодные в качестве меток, например, для применения для диагностики, включают йод (131I или 125I), индий (111In), технеций (99mTc), фосфор (32P), углерод (14C) и тритий (3H), или один или несколько терапевтических изотопов, перечисленных выше.
131 90 177
Радиоиммунотерапия (RIT) с использованием антител, меченных с помощью I, Y и Lu, находится на стадии интенсивных клинических испытаний. Существуют значительные различия в физических характеристиках этих трех нуклидов и в результате этого выбор радионуклида может быть чрезвычайно важным для доставки максимальной дозы радиации в опухоль. Частицы с высокой энергией бетаизлучения 90Y могут быть хорошими для объемных опухолей, но могут и не быть необходимыми для небольших опухолей и в особенности метастаз в кости. Частицы с относительно низкой энергией бетаизлучения 131I являются идеальными, но дегалогенирование in vivo радиойодированных молекул является основным недостатком для интернализации антитела. В отличие от этого, 177Lu имеет частицы с низкой энергией бета-излучения только с диапазоном 0,2-0,3 мм и доставляет значительно меньшую дозу радиации в костный мозг по сравнению с Y. Дополнительно, вследствие более длительного физического периода полураспада (по сравнению с 90Y), время нахождения в опухоли является более высоким. Благодаря этому, более высокие активности (большие количества мКи) 177Lu меченных агентов можно вводить с относительно низкой дозой радиации на костный мозг. Представлено несколько клинических исследований применения антител, меченных 177Lu, для лечения различных злокачественных новообразований. (Mulligan T и др. Clin Cancer Res. 1: 1447-1454(1995); Meredith RF и др. J Nucl Med 37:1491-1496(1996); Alvarez RD, и др. Gynecologic Oncology 65: 94-101(1997)).
Пригодные обнаруживаемые агенты, с которыми антитело или часть антитела согласно изобретению может быть дериватизирована (или мечена), включают флуоресцентные соединения, различные ферменты, простетические группы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, флуоресцентные эмитирующие атомы металлов, например, европий (Eu), и другие антаниды, и радиоактивные материалы (описанные выше). Примеры флуоресцентных обнаруживаемых агентов включают флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонил хлорид, фикоэритрин и др. Антитело также может быть дериватизировано с обнаруживаемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, ацетилхолинэстераза, оксидаза глюкозы и др. Если антитело дериватизировано с обнаруживаемым ферментом, то его детектируют путем добавления дополнительных реагентов, которые фермент используется для продуцирования обнаруживаемого продукта реакции. Например, если присутствует обнаруживаемый агент пероксидаза хрена, то добавление перекиси водорода и диаминобензидина будет приводить к получению окрашенного продукта реакции, который можно обнаружить. Антитело также может быть дериватизировано с простетической группой (например, стрептавидин/биотин и авидин/биотин). Например, антитело может быть дериватизировано с биотином, и обнаруживаться с помощью непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.
- 54 030827
Примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала явлется люминол; и примерами биолюминесцентных материалов являются люцифераза, люциферин и экворин.
Фармацевтические композиции
В другом аспекте изобретение раскрывает композиции, например фармацевтически приемлемые композиции, которые включают молекулу анти-GCC антитела или его иммуноконъюгат, как описано в настоящей заявке, комбинированные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В воплощениях, молекула анти-GCC антитела представляет собой один из образцовых признаков, приведенных в табл. 1 и 2.
Как используется в настоящей заявке, фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любые или все растворители, дисперсионные среды, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобные, которые являются физиологически совместимыми. Носитель может быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). Фармацевтическая композиция может включать один или несколько дополнительных вспомогательных веществ, например соли, буферы, модификаторы тонуса, лиопротектанты, неионные детергенты, поверхностно-активные вещества и консерванты.
Композиции могут быть в различных формах. К ним относятся, например, жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы, (например, инъекционные и неплавкие растворы), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Некоторые типичные композиции находятся в форме инъекционных и неплавких растворов, предназначенных для парентерального введения (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно). В некоторых вариантах осуществления антитело является введенным внутривенно путем инфузии или инъекции. В других вариантах осуществления, антитело является введенным внутримышечной или подкожной инъекцией.
Фразы парентеральное введение и введенный парентерально, как используется в настоящей заявке означает способы введения другие, нежели энтеральное и местное введение, обычно путем инъекции, и включает, помимо прочего, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, расположенную под кутикулой, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и инфузию.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция является стерильной и стабильной при условиях производства и хранения. Композиция может быть сформирована в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы, микрогранулы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации антитела. Стерильные растворы для инъекции могут быть приготовлены путем инкорпорирования активного соединения (то есть, антитело или часть антитела) в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов перечисленных выше, как это требуется, с последующей стерилизацией, к примеру, путем фильтрации. Главным образом, дисперсии являются приготовленными посредством инкорпорирования активного соединения в стерильное связующее вещество, которое содержит щелочную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекции обеспеченные методы приготовления представляют собой вакуумную сушку и сушку сублимацией, которые дают в результате активный ингредиент плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может быть поддержана, к примеру, посредством использования покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Длительное поглощение инъекционных композиций может быть вызвано, в том числе, посредством включения в композицию агента, который задерживает поглощение, к примеру, соли моностеарата и желатин.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения могут быть введены посредством различных методов, известных в уровне техники, несмотря на то, что для многих терапевтических применений, метод/способ введения представляет собой внутривенную инъекцию или вливание. Как будет оценено квалифицированным специалистом в данной области техники, способ и/или метод введения будет варьироваться в зависимости от желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления, активное соединение может быть приготовлено с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, таким как состав, контролируемый высвобождение, включающий имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Биоразлагаемые, биологически совместимые полимеры могут быть использованы, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, и полимолочная кислота. Многие методы для приготовления таких составов являются запатентованными или главным образом известны квалифицированному специалисту в данной области техники. См., к примеру, Sustained и Controlled Release Drug
- 55 030827
Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В определенных вариантах осуществления, молекула анти-GCC антитела или иммуноконъюгат, описанные в настоящей заявке могут быть введены перорально, например, с инертным наполнителем или с способным к усвоению съедобным наполнителем. Соединение (и другие ингредиенты по желанию) может также быть заключено в твердую или мягкую оболочку желатиновой капсулы, спрессованной в таблетки, таблетки для медленного растворения в щечном кармане, пастилки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы, пластинки и др. Для введения антитела или фрагмента антитела согласно изобретению помимо парентерального введения может оказаться необходимым покрыть соединение или совместно ввести соединение с материалом, который предотвращает его инактивацию.
Терапевтические композиции могут быть введены с помощью медицинских устройств, известных из уровня техники. Например, фармацевтические препараты могут быть размещены внутри устройства, например, в воздухонепроницаемом или непроницаемом для жидкости контейнере, который содержит одну или больше доз. Примеры подаваемых устройств включают, без ограничения, флаконы, катетеры, иглы, капельные системы, и линии. Изобретение также обеспечивает методы размещения молекулы антитела или иммуноконъюгата, описанных в настоящей заявке в таких устройствах.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает молекулу анти-GCC антитела или иммуноконъюгата, описанных в настоящей заявке, которые комбинированы в композицию липосомы. В некоторых вариантах осуществления, липосомы являются покрытыми молекулой антитела. В некоторых таких вариантах липосомы заполнены терапевтическим средством. Поставка липосомы может учитывать поставку агента, к примеру, терапевтического средства, которое не связано с антителом. Этот подход может быть использован для доставки агента, к примеру, терапевтического средства, которое не поддается перекрестному сшиванию к молекуле антитела или агента, к примеру, терапевтического средства, которое должно быть поглощено, или которое контактирует с нецелевыми клетками, что должно быть сведено к минимуму. В конкретных воплощениях липосома является заполненной цитостатическим или цитотоксическим агентом. В некоторых конкретных воплощениях терапевтическое средство является выбранным из группы, которая состоит из майтансиноидов, ауристатинов, доластатинов, дуокармицинов, криптофицинов, таксанов, ДНК алкилирующих агентов калихимицинов, и производных вышеизложенных. В других вариантах осуществления, липосома является заполненной последовательностью нуклеиновых кислот, которая содержит молукулы РНК-интерференции, к примеру, антисмысловые молекулы, малая интерферирующая РНК, короткая шпилечная РНК или микроРНК молекулы, которые являются способными к снижению GCC экспрессии или экспрессии другого гена, к примеру, онкогена, в клетках, экспрессирующих GCC. В некоторых других воплощениях липосомы являются покрытыми или наполненными иммуноконъюгатом, который содержит молекулу анти-GCC антитела и терапевтическое средство или метку.
Схема приема лекарственного средства подобрана таким образом, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (к примеру, терапевтический ответ). К примеру, одинарный болюс может быть введен, несколько разделенных доз могут быть введены со временем или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена как указано в конкретной терапевтической ситуации. Это особенно выгодно для разработки парентеральных композиций на единицу дозирования лекарственной формы для легкости введения и равномерности дозировки. Термин единица дозирования лекарственной формы, который используется в настоящей заявке, следует понимать как физически дискретные единицы, которые подходят в качестве стандартных доз для субъектов, требующих лечения; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Технические требования для единиц дозирования лекарственной формы согласно изобретению продиктованы и непосредственно зависят от (а) исключительных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, присущих существующему уровню техники составления соединений таких как активное соединение для лечения чувствительности у людей.
В качестве образца, не ограниченный уровень для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению составляет 0,1-20 или 1-10 мг/кг. Это будет означать, что значения дозирования могут меняться в зависимости от типа и тяжести состояния, которое нужно лечить. Кроме того, должно быть понятно, что для любого субъекта конкретные схемы дозирования должны подбираться в течение продолжительного периода времени в зависимости от индивидуальных потребностей и профессиональных суждений лица, осуществляющего введение или контроль за введением композиций, и что уровни дозирования, изложенные здесь являются только образцовыми и не направлены на то, чтобы ограничить область или практическое применение заявленной композиции.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению. Под терапевтически эффективным количеством следует понимать количество, эффективное при дозировании и для необходимого периода времени для обеспечения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество модифицированного антитела или фрагмента антитела может изменятся в
- 56 030827 зависимости от факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол и вес человека и способность антитела или части антитела вызвать желаемую реакцию у человека. Терапевтически эффективным количеством также является то, в котором никакое токсическое или вредное воздействие модифицированного антитела или фрагмента антитела является превзойденным благоприятными терапевтическими воздействиями. Терапевтически эффективная доза предпочтительно ингибирует измеряемый параметр (к примеру, скорость роста опухоли) у лечащихся субъектов на по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 60% и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 80%, по отношению к субъектам, которые не подвергались лечению. Способность соединения ингибировать измеряемый параметр, к примеру, рак, может быть оценена в системе животных моделей, прогнозирующая эффективность для человеческих опухолей. Альтернативно, эти свойства композиции могут быть оценены посредством изучения способности соединения ингибировать, такого как ингибирование in vitro посредством анализов, известных для квалифицированного практика.
Также в рамках данного изобретения наборы включают молекулу анти-GCC антитела или иммуноконъюгат, как описано в настоящей заявке. Дополнительно включенные наборы содержат композиции липосом, включающие молекулу анти-GCC антитела или иммуноконъюгат. Набор может включать один или более других элементов, которые включают инструкцию по применению; другие агенты, например метку, терапевтическое средство или агент, полезный для хелатирования, или иные соединения, антитело к метке или терапевтическое средство, или радиозащитную композицию; устройства или другие материалы для приготовления антитела для введения фармацевтически приемлемых носителей; и устройства или другие материалы для введения субъекту. Инструкции для применения могут включать инструкции для диагностического применения молекулы анти-GCC антитела или иммуноконъюгата для обнаружения GCC, in vitro, например, в образце, например, в биопсии или клетке пациента, страдающего раком, или in vivo. Инструкции могут включать в себя руководство для терапевтического применения, включая рекомендуемые дозы и/или способы введения, например, у пациентов с раком (например, рак желудочно-кишечного происхождения, такой как, например, рак ободочной кишки, рак желудка, рак пищевода). Другие инструкции могут включать инструкции по связи антитела к хелатирующему агенту, метке или терапевтическому средству, или для очистки конъюгированных антител, например, от непрореагировавших конъюгированных компонентов. Как уже говорилось выше, набор может включать метку, например любую их меток, описанных в настоящей заявке. Как уже говорилось выше, набор может включать терапевтическое средство, например терапевтическое средство, описанное в настоящей заявке. В некоторых применениях антитела будут реагировать с другими компонентами, например хелатирующим агентом или меткой или терапевтическим средством, например радиоизотопным, например иттрием или лютецием. В некоторых случаях набор может включать один или более реакционных сосудов для проведения реакции или разделительное устройство, например хроматографическую колонку, для применения в разделении готового продукта от исходных материалов или промежуточных реакций.
Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент, такой как диагностическое или терапевтическое средство, например диагностическое или терапевтическое средство, как описанное в настоящей заявке, и/или одна или больше дополнительных молекул анти-GCC антител или иммуноконъюгатов, сформулированные по мере необходимости, в один или более раздельных фармацевтических препаратов.
Набор дополнительно содержит радиопротектант. Радиолитическая природа изотопов, например 90Иттрия (90Y) известна. Для того, чтобы предупредить этот радиолиз, радиопротектанты могут быть включены, например, в реакционный буфер, поскольку такие радиопротекторы являются безвредными, значит, что они не ингибируют или иначе не вызывают негативного влияния на реакцию введения метки, например изотопа, такого как 90Y, с антителом. Состав буфера настоящего изобретения может включать радиопротектант, такой как сыворотка альбумина человека (HSA) или аскорбат, которые минимизируют радиолиз из-за иттрия или других сильных радионуклидов. Другие радиопротектанты являются известными в области техники и могут также быть применены в составе буфера настоящего изобретения, то есть, поглотители свободных радикалов (фенол, сульфиты, глутатион, цистеин, гентизиновая кислота, никотиновая кислота, аскорбилпальмитат, HOP(:O)H2I глицерин, формальдегидсульфоксилат натрия, Na2S2O, Na2S2O3, и SO2, и т.д.).
Обеспечиваемый набор является, во-первых, пригодным для белка, меченого радиоизотопом конъюгированного с хелатом или пептида с лечебным радиоизотопом для введения пациенту. Набор включает (I) пузырек содержащий антитело конъюгированное с хелатом, (ii) пузырек, содержащий буферный состав для стабилизации и введения антитела, меченого радиоизотопом пациенту, и (iii) инструкции для осуществления процесса введения метки радиоизотопа. Набор обеспечивает выделение антитела конъюгированного с хелатом радиоизотопа или его соли для достаточного количества времени при благоприятных условиях, например, как рекомендуется в инструкциях. Производится антитело, меченое радиоизотопом, имеющее достаточную чистоту, удельную активность и специфику связывания. Антитело, меченое радиоизотопом, может быть разбавлено до соответствующей концентрации, например, в буферном составе и вводиться непосредственно пациенту или без дополнительного очищения. Антитело,
- 57 030827 конъюгированное с хелатом, может быть снабжено в лиофилизированной форме.
Применения
Молекулы анти-GCC антител, описанные в настоящей заявке, имеют in vitro и in vivo диагностические, прогностические, визуализационные, терапевтические и профилактические ценности. Например, эти молекулы антитела могут быть введены клеткам культуры, например in vitro или ex vivo, или введены в объект, например, in vivo, чтобы лечить, предотвратить и/или диагностировать различные заболевания.
Молекулы антитела, иммуноконъюгаты и химерные белки, описанные в настоящей заявке, могут быть применены, модулируя активность или функциональность GCC белка, такую как связывание лигандов (например, связывание ST или гуанилина), GCC-медиированная сигнальная трансдукция, профилактика кишечной жидкости, электролитный гомеостаз, внутриклеточное выделение кальция (поток кальция), клеточная дифференцировка, клеточная пролиферация или клеточная активация.
В одном аспекте изобретение раскрывает способ уничтожения, ингибирования или модулирования роста, или вмешательства в метаболизм GCC-экспрессированой клетки. В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ ингибирования GCC-медиированной сигнальной трансдукции или способ уничтожения клетки. Способ может быть применен с любой клеткой или тканью, которая экспрессирует GCC, такой как раковая клетка (например, клетка рака желудочно-кишечного тракта, такого как, например, клетка рака толстого кишечника, желудка или пищевода или поджелудочной железы), или метастатические поражения. Неограниченные примеры GCC-экспрессирующих клеток включают Т84 клетки аденокарциномы толстого кишечника человека, свежие или замороженные клетки опухоли толстого кишечника и клетки, включающие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую GCC или ее часть.
Способы согласно изобретению включают этапы контактирования клетки с молекулой анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгат, как, описанные в настоящей заявке, в эффективном количестве, то есть, количестве достаточном, чтобы ингибировать GCC-медиированную сигнальную трансдукцию или количестве достаточном, чтобы уничтожить клетку. Способ может быть применен на клетках в культуре, например in vitro, in vivo, ex vivo, или in situ. Например, клетки, которые экспрессируют GCC (например, клетки собранные биопсией из опухоли или метастатичного поражения; клетки из укоренившейся раковой клеточной линии; или рекомбинантные клетки), могут быть культивированы in vitro в питательной среде и этап контактирования может быть осуществлен добавлением молекулы анти-GCC антитела или иммуноконъюгата к питательной среде. В способах уничтожения клетки способ включает применение очищенной молекулы анти-GCC антитела или иммуноконъюгата, содержащего молекулу анти-GCC антитела и цитотоксический агент. Способ будет приводить в результате к уничтожению клеток, экспрессирующих GCC, включая в особенности опухолевые клетки, экспрессирующие GCC (например, опухолевые клетки толстого кишечника).
Ссылка на табл. 7 может служить как направление к выбору антител(а), чтобы применить для различных способов. Например, табл. 7 указывает, какие антитела были подтверждены для усвоения после связывания GCC. Такие антитела были бы полезны, когда связаны с цитостатическим фрагментом или фрагментом отображения клетки. Антитела, которые не усваивают, могут использоваться в диагностических целях или терапевтических методах, используя оголенное антитело, разработанное, чтобы выявить антителозависимый, опосредованный клеткой цитостатический ответ, или возможно для способов доставки липосомы.
Молекулы анти-GCC антител настоящего изобретения связаны с внеклеточными областями GCC или их частями в клетках, экспрессирующих антиген. Как результат, когда практикуются способы настоящего изобретения, чтобы уничтожить, подавить, или определить канцерогенные клетки, антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются со всеми такими клетками, а не только с клетками, которые фиксированы или клетками, у которых внеклеточные антигенные области иначе подвергаются воздействию внеклеточной среды. Соответственно, связывающие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, концентрируются в области, где клетки экспрессирующие GCC, независимо от того, эти клетки фиксируются или не фиксируются, жизнеспособны или омертвевшие. Дополнительно или альтернативно, молекулы анти-GCC антител, связываются и обобщаются с GCC на связывающих клетках экспрессирующих антиген.
Способ также может быть осуществлен на клетках присутствующих в объекте, как часть in vivo протокола. В одном варианте осуществления объект является человеческим объектом. Альтернативно, объект может быть млекопитающим, экспрессирующим GCC антиген, с которым молекула анти-GCC антитела, раскрытая здесь, перекрестно реагирует. Молекула анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгат может быть введен человеческому объекту для лечебных целей. Молекула анти-GCC антитела или иммуноконъюгат также может быть введен нечеловеческому млекопитающему, экспрессирующему GCC-подобный антиген с которым антитело перекрестно реагирует (например, примат, свинья или мышь) для ветеринарных целей или как животная модель человеческой болезни. Животные модели могут быть пригодными для оценки терапевтической эффективности антител согласно изобретению (например, тестирование дозировок и длительности курсов введения). Для in vivo вариантов осуществления
- 58 030827 этап контактирования осуществляется в объекте и включает введение молекулы анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгата объекту в условиях эффективных, чтобы разрешить и связывание молекулы антитела с внеклеточной областью GCC экспрессирущей на клетке, и лечение клетки.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ лечения рака введением молекулы анти-GCC антитела или иммуноконъюгата, включающего молекулу анти-GCC антитела и цитотоксический агент, пациенту нуждающемуся в таком лечении. Способ может быть применен для лечения любого ракового заболевания, которое включает, по меньшей мере, несколько клеток, которые экспрессируют GCC антиген. Как применяется в настоящей заявке, термин рак определяется, чтобы включить все типы раковых развитий или онкогенных процессов, метастатических процессов, метастатических тканей или злокачественных трансформированных клеток, тканей, или органов, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Термины рак и опухоль могут быть применены заменяя друг друга (например, когда применены в контексте способы лечения, лечение рака и лечение опухоли имеют одинаковое значение).
В вариантах осуществления лечение является достаточным, чтобы снизить или ингибировать рост опухоли объекта, снизить количество или размер метастатических поражений, снизить опухолевую нагрузку, снизить первичную опухолевую нагрузку, снизить инвазивность, продлить время жизни или поддержать или обеспечить качество жизни.
Примеры раковых заболеваний включают, но не ограничиваясь только ими, солидные опухоли, опухоли мягких тканей и метастатические поражения. Примеры солидных опухолей включают злокачественные новообразования, например саркомы, аденокарциномы и карциномы различных органов системы, такие как повреждающие толстый кишечник и поджелудочную железу. Аденокарциномы включают злокачественные новообразования, такие как немелкоклеточный рак легкого. Метастатические поражения вышеупомянутых раков также могут быть вылечены или предотвращены, применяя способы и композиции согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления рак, который будет лечиться, является раком желудочно-кишечного тракта (например, рак ободочной и прямой кишки, рак пищевода, или рак желудка). В некоторых вариантах осуществления рак поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления рак является раком ободочной и прямой кишки, например аденокарциномой ободочной и прямой кишки, лейомиосаркомой ободочной и прямой кишки, лимфомой ободочной и прямой кишки, меланомой ободочной и прямой кишки или нейроэндокринной опухолью ободочной и прямой кишки. В особом варианте осуществления рак является метастатическим раком ободочной кишки. В другом варианте осуществления рак является раком желудка (например, желудочная аденокарцинома, лимфома, или саркома) или его метастазами. В другом варианте осуществления рак является раком пищевода (например, плоскоклеточная карцинома или аденокарцинома пищевода).
Способ может быть пригодным в лечении соответствующего заболевания при любой стадии или субклассификации. Например, способ может быть применен, чтобы лечить ранние или поздние стадии рака ободочной кишки или рак ободочной кишки любой стадии 0, I, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC и IV.
В некоторых вариантах осуществления способ для лечения рака (например, ободочной и прямой кишки, пищевода, или рак желудка) включает введение пациенту при необходимости такого лечения, очищенной молекулы анти-GCC антитела, описанной в настоящей заявке. В других вариантах осуществления способ включает введение иммуноконъюгата содержащего молекулу анти-GCC антитела, описанную в настоящей заявке, и цитотоксический агент. В некоторых таких вариантах осуществления иммуноконъюгат характеризуется формулой (I), как описанный в настоящей заявке. В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгат характеризуется формулой (I-1), (I-1), (I-3), (I-4), (I-5), (I-6) или (I7), как описанный в настоящей заявке. В особых вариантах осуществления иммуноконъюгат характеризуется формулой (I), (I-1), (I-1), (I-3), (I-4), (I-5), (I-6) или (I-7), где переменная Ab представляет собой молекулу антитела с частями обобщенными в табл. 1-6. В определенных вариантах осуществления переменная Ab представляет собой 5F9 молекулу антитела или Abx-229 молекулу антитела. В определенных особых вариантах осуществления иммуноконъюгат характеризуется формулой (I-5) или (I-7), где переменная Ab представляет собой 5F9 молекулу антитела.
Способы введения молекул антител и иммуноконъюгатов описываются выше. Подходящие дозировки применяемых молекул будут зависеть от возраста и веса объекта и особенностей применяемого соединения.
В некоторых вариантах осуществления молекула анти-GCC антитела или иммуноконъюгат вводится в лечебные циклы. Лечебный цикл состоит из периода лечения, на протяжении которого молекула анти-GCC антитела или иммуноконъюгат вводится, как описано выше, с последующим периодом отдыха, на протяжении которого не вводится ни одна молекула анти-GCC антитела или иммуноконъюгата. Цикл лечения может быть повторен, если необходимо, чтобы достичь желаемого результата.
Анти-GCC антитела, описанные в настоящей заявке (например, очищенные молекулы анти-GCC антител или иммуноконъюгаты, содержащие молекулу анти-GCC антитела и терапевтическое средство) могут быть применены в комбинации с другими способами лечения. Например, комбинированное лечение может включать композицию настоящего изобретения, комбинированную c, и/или совместно введенную c, одним или больше дополнительными терапевтическими средствами, например одним или
- 59 030827 больше противораковыми средствами, например цитотоксическими или цитостатическими агентами, гормональным лечением, вакцинами и/или другими иммунотерапиями. В других вариантах осуществления анти-GCC антитела вводятся в комбинации с другими лечебно-терапевтическими приемами, включая хирургию, облучение, криохирургию и/или термотерапию. Такие комбинированные способы лечения могут выгодно применять более низкие дозы вводимых терапевтических средств, таким образом избегая возможных токсикаций или осложнений, связанных с различными способами монолечения.
Введение в комбинации, как применяется в настоящей заявке, означает, что два (или больше) разных видов лечения даются объекту на протяжение курса повреждения объекта заболеванием, например два или больше лечений даются после диагностирования заболевания объекта и перед излечением или устранением заболевания. В некоторых вариантах осуществления подача одного лекарства все еще происходит, когда подача второго начинается, так что есть наложение. Это иногда упоминается здесь, как одновременная или параллельная подача. В других вариантах осуществления подача одного лечения заканчивается перед началом подачи другого лечения. В некоторых вариантах осуществления любого случая лечение более эффективно через комбинированное введение. Например, второе лечение более эффективно, например, эквивалентный эффект замечен с меньшим количеством второго лечения, или уменьшение симптомов при втором лечении в большей мере, чем было замечено, если второе лечение было введено в отсутствие первого лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым лечением. В некоторых вариантах осуществления, подача такая, что уменьшение симптома, или другого параметра относящегося к заболеванию, является больше того, что наблюдалось бы с одним лечением, поданным в отсутствие другого. Эффект двух лечений может быть частично аддитивным, полностью аддитивным, или больше, чем аддитивным. Подача может быть такой, что эффект первого поданного лечения все еще определяется, когда второе подается.
В некоторых вариантах осуществления молекула анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгат применяется в комбинации с химиотерапевтическим средством. Неограниченые примеры повреждающих ДНК химиотерапевтических средств включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан, камптотецин и аналоги или их метаболиты, и доксорубицин); ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, тенипозид, и даунорубицин); агенты алкилирования (например, мелфалан, хлорамбул, бусульфан, тиотепа, ифосфамид, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, декарбазин, метотрексат, митомицин C, и циклофосфамид); ДНК интеркаляторы (например, цисплатин, оксалиплатин, и карбоплатин); ДНК интеркаляторы и свободнорадикальные генераторы такие как блеомицин; и нуклеозидные миметики (например, 5-фторурацил, капеситибин, гемцитабин, флударабин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин, и гидроксимочевина).
Химиотерапевтические средства, которые разрушают клеточную репликацию, включают паклитаксел, доцетаксел и родственные аналоги; винкристин, винбластин и родственные аналоги; талидомид, леналидомид и родственные аналоги (например, CC-5013 и CC-4047); ингибиторы протеин-тирозин киназы (например, иматиниба, мезилат и гефитиниб); ингибиторы протеасомы (например, бортезомиб); ингибиторы NF-kB, включая ингибиторы IkB киназы; антитела, которые связывают белки, сверхэкспрессирующиеся в раковых опухолях и, следовательно, снижают клеточную репликацию (например, трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб, и бевацизумаб); и другие ингибиторы белков или ферментов, известные, как повышающие, сверхэкспрессирующие или активирующие в раковых опухолях, ингибиторы которых снижают клеточную репликацию.
Выбор терапевтических средств(а) или методик лечения, которые будут комбинироваться с молекулой анти-GCC антитела или иммуноконъюгатом согласно изобретению, будут зависеть от заболевания, которое будет лечиться. Дополнительный агент(ы) или методики лечения могут включать, например, стандартные разрешенные способы лечения для лечимых симптомов. Например, когда молекула анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгат применяются, чтобы лечить рак ободочной кишки, это может быть применено в комбинации с, например, хирургией; лучевой терапией; 5-фтороурицилом (5-FU), капецитибином, леуковорином, иринотеканом, оксалиплатином, бевацизумабом, цетуксимабом, панитумумом, или их комбинациями (например, оксалиплатин/капецитибин (XELOX), 5-фторурицил/леуковорин/оксалиплатин (FOLFOX), 5-фтороурицил/леуковорин/иринотекан (FOLFIRI), FOLFOX плюс бевацизумвб, или FOLFIRI плюс бевацизумаб).
В другом аспекте изобретение раскрывает применение молекул анти-GCC антитела или иммуноконъюгата как, описанное в настоящей заявке в производстве лекарственного средства. В варианте осуществления лекарственное средство является для лечения рака, например, рака желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство содержит молекулу анти-GCC антитела имеющую части обобщенные в табл. 1-6. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство содержит 5F9 молекулу антитела или Abx-229 молекулу антитела.
Анти-GCC антитела и иммуноконъюгаты, описанные в настоящей заявке, могут быть применены, чтобы определить присутствие GCC, например, чтобы определить присутствие GCC в биологическом образце, или чтобы определить присутствие или распространение GCC в объекте. Термин определение, как используется в настоящей заявке, охватывает количественное или качественное определение. Определение GCC или GCC белка, как используется в настоящей заявке, означает определение целого GCC
- 60 030827 белка или определение части GCC белка, которая содержит эпитоп с которым молекула анти-GCC антитела связана.
Таким образом, в другом аспекте, изобретение раскрывает способ определения GCC белка, например определение GCC экспрессируемого клеткой или тканью, например, опухолевою клеткой, или опухолью, имеющей клетки, которые экспрессируют GCC. Способ включает контактный материал, например клетку или ткань, например образец опухоли с экспрессией GCC, с молекулой анти-GCC антитела, например молекулой анти-GCC антитела, описанный в настоящей заявке, при условиях которые позволяют формирование комплекса между молекулой анти-GCC антитела и GCC белком; и определение структуры комплекса между молекулой анти-GCC антитела и GCC белком, чтобы таким образом определять присутствие GCC белка, например, чтобы определять GCC экспрессирование клеткой или опухолью.
В варианте осуществления молекула анти-GCC антитела является иммуноконъюгатом, содержащим определяющиеся метки.
В определенных вариантах осуществления ткани включают нормальную и/или канцерогенную ткани, которые экспрессируют GCC на более высоких уровнях относительно других тканей, например другой ткани, такой как В клетки и/или ткани ассоциированные B клетками.
Способы определения, описанные в настоящей заявке, или in vitro или in vivo, могут быть применены, чтобы оценить объект. В варианте осуществления способ производится in vivo, и может быть применен, например, для визуализации, определения стадии, оценки или диагностирования пациента. В определенных вариантах осуществления заболевание является клеточнопролиферативным заболеванием, таким как рак или опухоль, например рак ободочной кишки.
Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает способ для определения присутствия GCC белка in vitro (например, в биологическом образце, таком как биопсия ткани, например из опухолевой ткани, из объекта) или in vivo (например, in vivo визуализация объекта). Способ включает: (i) контактирование образца с молекулой анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгата, или введение объекту молекулы анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгата; и (ii) определение образования комплекса между молекулой анти-GCC антитела и GCC белком. Образование комплекса служит признаком присутствия или уровня GCC.
В вариантах осуществления уровень комплекса определяется в образце или объекте относительно сравнительного значения, например, значения образования комплекса или уровня GCC. В варианте осуществления уровень GCC, который превышает сравнительное значение, служит признаком GCCмедиированного заболевания.
В варианте осуществления способ включает контактирование сравнительного образца, например контрольного образца (например, контрольного биологического образца, такого как плазма, ткань, биопсия) или контрольный объект) с молекулой анти-GCC антитела или ее иммуноконъюгата и сравнение уровня комплекса определенного здесь с уровнем, определенным в образце или объекте.
В определенных вариантах осуществления тестируемая клетка или ткань, полученная из особи, подозреваемой в наличии заболевания, связанного с увеличением экспрессии GCC.
В варианте осуществления уровень GCC в образце из объекта, или в объекте, сравниваются со сравнительным уровнем, например, уровень GCC в контрольном материале, например нормальная клетка из такой же тканевой области как клетка объекта или клетка, имеющая GCC на уровнях, сравнимых с таковыми нормальной клетки. Способ может содержать, например, сравнение с определяемым уровнем GCC, обеспечение диагноза, прогноза, оценки эффективности лечения, или стадии заболевания. Высокий уровень GCC в образце или объекте, по сравнению с контрольным материалом, определяет присутствие заболевания вызванного увеличением экспрессии GCC. Высокий уровень GCC в образце или объекте, по сравнению с контрольным материалом, может также определять относительную нехватку эффективности лечения, относительно неблагоприятный диагноз, или поздние стадии болезни. Уровень GCC может также быть применен, чтобы оценить или выбрать будущее лечение, например, потребность в большем или меньшем количестве агрессивного лечения, или потребность переключаться с одного режима лечения на другой.
Уровень GCC может также быть применен, чтобы выбрать или оценить пациентов. Например, в вариантах осуществления пациенты, у которых опухолевые клетки, экпрессирующие высокие количества GCC на своих поверхностях, могут рассматриваться как хорошие кандидаты для лечения конъюгированными с токсинами молекулами анти-GCC антител. В вариантах осуществления пациенты, у которых опухолевые клетки экспрессируют низкие количества GCC на своих поверхностях, не могут быть хорошими кандидатами для этого или имеют возможность быть кандидатами для комбинирования молекулы анти-GCC антитела с дополнительным способом лечения, или будут кандидатами для лечения очищенным антителом. В другом примере, доза конъюгированной с токсином молекулы анти-GCC антитела должна быть выровнена, чтобы отразить число GCC молекул экспрессированных на поверхностях опухолевых клеток. Пациенты с высокими количествами GCC молекул на поверхностях своих опухолевых клеток имеют возможность лечится более низкими дозами чем пациенты с низкими количествами молекул. Определение присутствия опухолевых клеток экспрессирующих GCC in vivo может позволить иден
- 61 030827 тифицировать ткани, в которых в первую очередь опухоль экспрессирующая GCC метастазирует. Знание о том, в каких тканях есть метастазы, может привести к направленному применению лечения опухоли.
Как обсуждалось выше, молекулы антител, описанные в настоящей заявке, позволяют оценить присутствие GCC белка в нормальных в противоположность неопластическим тканям, через которые могут быть оценены присутствие или опасность болезни, прогрессирование болезни и/или эффективность лечения. Например, может быть проверено лечение и оценена эффективность. В одном примере, GCC белки могут быть определены и/или измерены в первом образце, полученном из объекта, имеющего воспалительную болезнь и может быть начато лечение. Позднее, второй образец может быть получен из объекта и GCC белок в образце может быть определен и/или измерен. Уменьшение количества GCC белка, определенного или измеренного во втором образце, может определять эффективность лечения.
Типичные клеточно-пролиферативные заболевания, которые могут быть оценены, например, диагностированием, применяя антитело, раскрытое здесь, включают пролиферативное заболевание включая, но не ограничиваясь только им, рак ободочной кишки, рак желудка, рак пищевода.
В определенных вариантах осуществления способ, такой как описанный выше, включает определение связывания анти-GCC антитела с GCC экспрессированного на поверхности клетки или в мембраном препарате полученном из клетки экспрессирующей GCC на своей поверхности. В определенных вариантах осуществления способ включает контактирование клетки с анти-GCC антителом в условиях, допускающих связывание анти-GCC антитела с GCC, и определение, сформировался ли комплекс между антиGCC антителом и GCC на поверхности клетки. Типичным исследованием для определения связывания анти-GCC антитела с GCC, экспрессированного на поверхности клетки, является FACS исследование.
Типичные образцы способов, описанных в настоящей заявке, включают ткань или жидкий компонент организма, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкий компонент кишечника, образец кала или биопсия. В одном примере образец (например, ткань и/или жидкий компонент организма) может быть получен из особи и может быть применен подходящий иммунологический способ, чтобы определить и/или измерять экспрессию GCC белка. Подходящие иммунологические способы для определения или измерения экспрессии GCC белка включают твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологический анализ, иммуногистология, проточная цитометрия и др.
Молекулы анти-GCC антител применяются в способах, описанных в настоящей заявке, например в in vivo и in vitro определениях, например диагностических, определяющих стадию, или томографических способах, могут быть непосредственно или опосредованно мечены определяющимся веществом, чтобы облегчить определение связанного или несвязанного связывающего агента. Подходящие определяющиеся вещества включают различные биологически активные ферменты, лиганды, простерические группы, флуоресцентные материалы, люминисцентные материалы, хемилюминисцентные материалы, биолюминисцентные материалы, хромофорные материалы, электроноплотные материалы, парамагнитные (например, активное вещество ядерно-магнитного резонанса) материалы, и радиоактивные материалы. В некоторых вариантах осуществления, молекула анти-GCC антитела сцепляется с радиоактивным ионом, например, индий (111In), иод (131I или 125I), иттрий (90Y), лютеций (177Lu), актиний (225Ac), висмут (212Bi или 213Bi), сера (35S), углерод (14C), тритий (3H), родий (188Rh), технеций (99mTc), празеодимий, или фосфор (32P); или позитрон-эмитирующий радионуклид, например, углерод-11 (11C), калий-40 (40K), азот-13 (13N), кислород-15 (15O), фтор-18 (18F), и йод-121 (121I).
Типичные метки включают флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных элементов или флуорисцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцифераза, например, люцифераза светлячков и бактериальная люцифераза (U.S. Pat. No. 4,737,456), люциферин, и 2,3дигидрофталазиндионы. Другие типичные метки включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, сцепленные с ферментом, который пользуется пероксидом водорода, чтобы окислить красящее исходное вещество, такое как HRP, лактопероксидаза, или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактеориологические метки, стабильные свободные радикалы и др.
Флуорофоры и хромофоры метящие молекулы антител могут быть приготовлены из стандартных составляющих известных в области техники. Поскольку антитела и другие белки поглощают свет, имеющий длину волны до приблизительно 310 нм, флуоресцентные составляющие должны быть выбраны, чтобы иметь существенное поглощение при длине волны выше 310 нм и предпочтительно выше 400 нм. Различные подходящие флуоресцентные соединения и хромофоры являются описанными Stryer Science, 162:526 (1968) и Brand, L. и др. Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972). Антитела могут быть мечены флуоресцентными хромофорными группами обычными процессами, такими как те, что раскрыты в патентах US №№ 3940475, 4289747 и 4376110.
Одна группа флуорофоров, имеющих некоторые из желательных свойств описанных выше, представляет собой ксантеновые красители, которые включают флуоресцеины, производные от 3,6дигидрокси-9-гексенилксантгидрол и ресамины и родамины, производные от 3,6-диамино-9фенилксантгидрол и лиссаминовый родамин B. Производные родамина и флуоресцеина 9-oкарбоксифенилксантгидрола имеют 9ю-карбоксифенильную группу. Флуоресцеиновые соединения,
- 62 030827 имеющие реакционно-способные соединяющие группы, такие как амино и изотиоцианатные группы, такие как флуоресцеин изотиоцианат и флуорескамин легкодоступны. Другие группы флуоресцентных соединений представляют собой нафтиламины, имеющие аминогруппу в а или β положении.
Могут быть применены меченые молекулы антител, например, с точки зрения диагностики и/или экспериментально в некоторых из контекстов, включая (i) для изолирования предопределенного антигена стандартными методами, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация; (ii), чтобы обнаружить предопределенный антиген (например, в клеточном лизате или клеточном супернатанте), чтобы оценить избыток и образец экспрессии белка; (iii), чтобы контролировать уровни белка в ткани как часть клинической процедуры проверки, например, определить эффективность данного режима лечения.
Могут быть применены и определенные другие методы, чтобы обнаружить связывание анти-GCC антител к GCC. Такие методы включают, но не ограничены ими, анализы антиген-связывания, которые известны в уровне техники, такие как вестерн блот, радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), сандвич иммунологические анализы, иммунопреципитационные анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы белка A и иммуногистохимия (IHC - иммуногистохимия).
Комплексное образование между молекулой анти-GCC антитела и GCC может быть определено при помощи измерения или визуализации или антитела (или фрагмент антитела), связанного с GCC антигеном или несвязанной молекулы антитела. Могут быть применены обычные анализы обнаружения, например, вестерн блот, радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), сандвич иммунологические анализы, иммунопреципитационные анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы белка A, и иммуногистохимия (IHC) или радиоиммуноанализ (RIA).
Альтернатива мечению молекулы анти-GCC антитела, присутствие GCC может быть оценено в образце сравнительными иммунологическими обследованиями, используя стандарты, меченые обнаружимым веществом, и немеченую молекулу анти-GCC антитела. В этом испытании, комбинируют биологический образец, меченые стандарты и GCC связывающий агент, и определяют количество меченого стандарта, связанного с немеченым антителом. Количество GCC в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта, связанного с GCC связывающим агентом.
Также возможно непосредственно обнаружить GCC для комплексного образования молекулы антиGCC антитела без дополнительных манипуляций или маркирования или компонента (GCC или молекула антитела), например, используя технику переноса энергии флуоресценции (FET, смотри, например, Lakowicz и др., патент US № 5631169; Stavrianopoulos, и др., патент US № 4868103). Флуорофорная метка на первой молекуле 'донора' выбрана так, что после возбуждения отраженным светом соответствующей длины волны, ее испускаемая флуоресцентная энергия будет поглощена флуоресцентной меткой на второй молекуле 'акцепторе', которая в свою очередь способна флюоресцировать благодаря поглощенной энергии. Наоборот, белковая молекула 'донор' может просто использовать естественную флуоресцентную энергию остатков триптофана. Метки выбраны такие, которые испускают различные длины волны света, так, что метка 'акцепторной' молекулы может быть дифференцирована от какого она 'донора'. Так как эффективность передачи энергии между метками связана с расстоянием, отделяющим молекулы, могут быть оценены пространственные отношения между молекулами. В ситуации, в которой происходит связывание между молекулами, флуоресцентная эмиссия метки 'акцепторной' молекулы в анализе должна быть максимальной. FET случай связывания может быть удобно измерен через стандарт способа флуорометрического обнаружения, известные в уровне техники (например, используя флуорометр).
В другом примере, определение способности молекулы антитела распознавать GCC может быть достигнуто, без маркирования анализируемого компонента (GCC или молекула антитела), используя способ, такой как реальновременной Biomolecular Interaction Analysis (BIA) (см., например, Sjolander, S. и Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 и Szabo и др., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Как используется в настоящей заявке, BIA или резонанс поверхностного плазмона являются технологией для изучения биоопределенных взаимодействий в режиме реального времени, не маркируя ни одной из взаимодействующих частиц (например, BIACORE™). Изменения в массе в поверхности связывания (свидетельствующий случай связывания) приводят к изменениям показателя преломления света около поверхности (оптическое явление поверхности резонанса поверхностного плазмона (SPR), приводя к обнаружимому сигналу, который может использоваться в качестве признака реакций в реальном времени между биологическими молекулами.
В еще другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ обнаружения присутствия GCC-экспрессирующих тканей опухоли in vivo. Способ включает: (i) введение субъекту (например, пациент, имеющий рак) анти-GCC антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгирован с детектируемой меткой или маркером; (ii) подвергание субъекта средствам обнаружения упомянутой детектируемой метки или маркера на GCC-экспрессирующих тканях или клетках.
Примерами меток, полезных для диагностического отображения в соответствии с настоящим изо-
- 63 030827 центные метки, такие как флуоресцеин и родамин, ядерно-магнитнорезонансные активные метки, позитронно-активные изотопы, детектируемые при помощи детектора однофотонной эмиссионной компьютерной томографией (SPECT) или сканера позитрон-эмиссионной томографии (PET), хемилюминесценты, такие как люциферин, и энзимные маркеры, такие как пероксидаза или фосфатаза. Также могут быть применены источники излучения ближнего действия, такие как изотопы, детектируемые при помощи детекторных головок ближнего действия, такие как трансректальное зондирование. Антитело может быть мечено такими реагентами, применяя способы, известные в уровне техники. Например, см. Wensel и Meares (1983) Radioimmunoimaging и Radioimmunothempy, Elsevier, New York, для методов, касающихся радиомаркирования антител. См. также, D. Colcher и др. Meth. Enzymol. 121: 802-816 (1986).
В случае радиоактивно-меченого антитела, антитело вводится пациенту, локализуется в опухоли, имеющей антиген, с которым антитело реагирует и детектируют или создают изображение in vivo, применяя известные методы, такие как радиоядерное сканирование, применяя, например, камеру для гамма-излучения или эмиссионную томографию или компьютерную томографию. См., например, A.R. Bradwell и др., Developments in Antibody Imaging, Monoclonal Antibodies for Cancer Detection и Therapy, R.W. Baldwin и др., (eds.), pp 65-85 (Academic Press 1985). Альтернативно, могут быть применены сканер позитронного излучения трансаксиальной томографии, такие как обозначенные Pet VI, размещенные в Brookhaven National Laboratory, где радиометка испускает позитроны (например, 11C, 18F, 15O и 13N).
В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает способы определения дозы, например дозы излучения, которым подвергают различные ткани, когда субъекту, например человеку, вводится молекула анти-GCC антитела, которая конъюгирована с радиоактивным изотопом. Способ включает: (i) введение молекулы анти-GCC антитела, как описано в настоящей заявке, например, молекулы антиGCC антитела, которая мечена радиоактивным изотопом, субъекту; (ii) измерение количества радиоактивного изотопа, расположенного в различных тканях, например, опухоли или крови, в различные моменты времени, пока, некоторые или весь радиоактивный изотоп не были устранены из тела субъекта; и (iii) вычисление суммарной дозы радиации, полученной каждой анализируемой тканью. Измерения могут быть проведены в запланированные моменты времени, например день 1, 2, 3, 5, 7 и 12, после введения (день 0) радиоактивной меченой молекулы анти-GCC антитела субъекту. Концентрация радиоизотопа, существующего в данной ткани, проинтегрированная по времени и умноженная на определенную активность радиоизотопа, может использоваться, чтобы вычислить дозу, которую получает данная ткань. Фармакологическая информация, генерированная применяя молекулы анти-GCC антител, меченые одним радиоактивным изотопом, например гамма-излучатель, например 111In, может быть применена, чтобы вычислить ожидаемую дозу, которую та же самая ткань получила бы от другого радиоактивного изотопа, который не может быть легко измерен, например, бета-излучатель, например 90Y.
Последовательности анти-GCC антител
Анти-GCC антитела создавались с помощью нескольких методов, таких как более подробно обсуждаются в примерах. Вкратце, мышиные моноклональные антитела 3G1 8F1 и 10B8 создавались с помощью традиционной технологии иммунизации в стандартной мыши. Человеческие моноклональные антитела 1D2, 5F9, 5H3, 6H8, 8C2, и 10C10 создавались с использованием трансгенных мышей, которые производят полностью человеческие IgG2 антитела, используя Abgenix XENOMOUSE трансгенную технологию, и выделяют с использованием гибридомной технологии. Человеческие mAb Abx-012, mAb Abx020, mAb Abx-106, mAb Abx-198, mAb Abx-221, mAb Abx-229, mAb Abx-338 и mAb Abx-393 были созданы с помощью трансгенных мышей, которые вырабатывают полностью человеческие IgG2 антитела. Единичные антитела выделяют с помощью технологии Abgenix SLAM. Их используют для получения полностью человеческих IgG1 антител. Специфичность антитела к GCC тестировали путем ELISA и проточной цитометрии (FCM). Поднабор созданных антител отбирали для дальнейшей характеристики.
В табл. 1 ниже обобщены несколько анти-GCC антител, обозначения антител, иммуноген, используемый для создания антитела, использование антитело, источник, виды и выделенные изотипы.
Таблица 1
АЬ Иммуноген Животное Источник Виды Изотип
3G1 TOKI07-hIg C57 обычная мышь Гибридома Мышь IgGl,k
8F1 TOKI07-hIg C57 обычная мышь Гибридома Мышь IgGl,k
10В8 TOKI07-hIg С57 обычная мышь Гибридома Мышь IgGl,k
1D3 TOKI07-hIg С57 обычная мышь Гибридома Мышь IgGl,k
8Е12 TOKI07-hIg С57 обычная мышь Гибридома Мышь IgGl,k
5F9 TOKI07-hIg XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
- 64 030827
1D2 TOK107-hIg XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
5НЗ CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
6Н8 CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
8С2 CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
10С10 CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
10D3 CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
1С9 CHO-GC-C#27 cells XenoMouse Гибридома Человек IgG2,k
229 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
012 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
221 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
020 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
338 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
106 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
198 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
393 TOK107-hIg XenoMouse SLAM Человек IgGl,k
Определяли последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепи. В табл. 2 ниже представлены обобщенные данные SEQ ID NO для вариабельных участков некоторых антител. Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот для вариабельных участков каждой тяжелой и легкой цепи для мышиных и человеческих анти-GCC антител представлены в табл. 3 и 4 соответственно.
Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот для каждой из CDR тяжелой и легкой цепи для анти-GCC антител представлены в табл. 5 и 6 соответственно.
Например, в табл. 3, ряд 9 представляет собой иллюстрацию кодированной аминокислотной последовательности зрелого вариабельного участка тяжелой цепи mAb 5F9 (SEQ ID NO: 18); и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая зрелый вариабельный участок тяжелой цепи mAb 5F9 (SEQ ID NO: 17) представлена в табл. 4, ряд 9. Кодированные аминокислотные последовательности mAb 5F9 для тяжелой цепи CDR (CDR) 1 (SEQ ID NO: 106), CDR2 (SEQ ID NO: 108) и CDR3 (SEQ ID NO: 110) представлены в табл. 5, ряды 25-27, соответственно; и последовательности нуклеиновых кислот mAb 5F9 для тяжелой цепи CDR1 (SEQ ID NO: 105), CDR2 (SEQ ID NO: 107) и CDR3 (SEQ ID NO: 109) представлены в табл. 6, ряды 25-27 соответственно.
Табл. 3, ряд 10 представляет собой иллюстрацию кодированной аминокислотной последовательности зрелого вариабельного участка легкой цепи mAb 5F9 (SEQ ID NO: 20); и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая зрелый каппа вариабельный участок легкой цепи mAb 5F9 (SEQ ID NO: 19) представлена в табл. 4, ряд 10. Кодированные аминокислотные последовательности mAb 5F9 для легкой цепи CDR (CDR) 1 (SEQ ID NO: 112), CDR2 (SEQ ID NO: 114) и CDR3 (SEQ ID NO: 116) представлены в табл. 5, ряды 28-30 соответственно; и последовательности нуклеиновых кислот mAb 5F9 для легкой цепи CDR1 (SEQ ID NO: 111), CDR2 (SEQ ID NO: 113) и CDR3 (SEQ ID NO: 115) представлены в табл. 6, ряды 28-30 соответственно.
Секвенирование CDR предоставляет возможность определения избытка остатков, которые могут служить в качестве сайтов конъюгирования токсинов. Неспаренный свободный цистеин в антигенсвязывающей области может быть сайтом для конъюгирования ауристатина и лизин может быть сайтом для конъюгирования майтансина. Конъюгирование токсина с аминокислотой CDR будет повышать долю изменений связывающей аффинности антитела к GCC. Таким образом, в вариантах осуществления CDR отсутствует аминокислота, которая может быть конъюгирована с терапевтическим средством.
- 65 030827
Таблица 2. Обобщенные сведения SEQ ID NO для вариабельных участков моноклональных антител
П1ЛЬ IgG цепь NA SEQ ID АА SEQ ID
3G1 Тяжелая цепь 1 2
Легкая цепь 3 4
8Е12 Тяжелая цепь 5 6
Легкая цепь 7 8
8F1 Тяжелая цепь 9 10
Легкая цепь И 12
1D3 Тяжелая цепь 13 14
Легкая цепь 15 16
5F9 Тяжелая цепь 17 18
Легкая цепь 19 20
5НЗ Тяжелая цепь 21 22
Легкая цепь 23 24
6Н8 Тяжелая цепь 25 26
Легкая цепь 27 28
8С2 Тяжелая цепь 29 30
Легкая цепь 31 32
10С10 Тяжелая цепь 33 34
Легкая цепь 35 36
10D3 Тяжелая цепь 286 287
Легкая цепь 288 289
АЬх-012 Тяжелая цепь 238 239
Легкая цепь 240 241
АЬх-020 Тяжелая цепь 37 38
Легкая цепь 39 40
АЬх-106 Тяжелая цепь 242 243
Легкая цепь 244 245
АЬх-198 Тяжелая цепь 41 42
Легкую цепь 43 44
АЬх-221 Тяжелую цепь 246 247
Легкую цепь 248 249
АЬх-229 Тяжелую цепь 45 46
Легкую цепь 47 48
АЬх-338 Тяжелую цепь 49 50
Легкую цепь 51 52
АЬх-393 Тяжелую цепь 53 54
Легкую цепь 55 56
- 66 030827
Таблица 3. Аминокислотная последовательность вариабельного участка mAb
mAb IgG цепь SEQ ID NO: Аминокислотная последовательность
1 3G1 Тяжелая цепь 2 QVOLKESGPGLVAPSOSLSITCTVSGFSLSRNAISWVRQP PGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALKSRLSIRKENSKSOVF LKMNSLOTEDTARYFCARSGYDGFDYWGOGTLVTVSA
2 3G1 Легкая цепь 4 OIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVNYMHWYOOK SGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITSME AEDAATYYCOOWSGNPYTFGGGTKLEIK
3 8Е12 Тяжелая цепь 6 OVOLKOSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVK ORPGOGLEWIGKIGPRSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSS TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWDAYWGQGTLVTVS
4 8Е12 Легкая цепь 8 DVVMTOTPLSLSVTIGQPASISCKSSOSLLYSNGKTYLN WLOORPGOAPKHLMYOVSKLDPGIPDRFSGSGSETDFTL KISRVEAEDLGVYYCLOGTYYPYTFGGGTKLEIK
5 8F1 Тяжелая цепь 10 OVOLOOPGAELVKPGASVOMSCKASGYIFTGYWMYWV KORPGOGLEWIGRIHP SD SNTNYNOKFKGK ATLT VDKS S STAYMQLSSLTSEDSAVYYCTHALAYWGQGTLVTVS
6 8F1 Легкая цепь 12 DVVLTOTPLTLSITIGOPASISCKSSOSLLYSNGKTYLSWL LORPGOSPKRLIYLVSOLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKIS RVEAEDLCiVYYC VOGTHLFTFCiSGTKLEiK
7 1D3 Тяжелая цепь 14 QVQLKQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYINWV KQRPGQGLEWIGKIGPRSGSTYYNEKFKGKATLTADKSS STAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWDAYWGQGTLVTVSA
8 1D3 Легкая цепь 16 DVVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLN WLQQRPGQAPKHLMYQVSKLDPGIPDRFSGSGSETDFTL KISRVEAEDLGVYYCLQGTYYPYTFGGGTKLEIK
9 5F9 Тяжелая цепь 18 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIR QPPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQF ALKLS S VT AADT А V YYC ARERGYT YGNFDHWGQGTL V TVSS
10 5F9 Легкая цепь 20 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQK PGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQS EDFAVYYCQQYKTWPRTFGQGTNVEIK
11 5H3 Тяжелая цепь 22 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDCYMSWIR QSPGKGLEWVSYITTSGNTIYYADSVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGWFYGMDVWGQGT TVTVSS
12 5H3 Легкая цепь 24 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHNDGKTYLY WYLQKPGQPPQLLIYEVSNRF SGVPDRF SS SGSXTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCMQSIQLPRTFGQGTKVEIK
13 6H8 Тяжелая цепь 26 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR QAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARGRS S S YFD YWGQGTL VTVSS
14 6H8 Легкая цепь 28 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSW LQQRPGQPPRLLIYKTSNRF SGVPDRF SGSGAGTDFTLKI SRVGAEDVGVYYCMQATQFPTFGQGTRLEIK
15 8C2 Тяжелая цепь 30 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVR QAPGKGLEWVGAIWYDGSNKYYAASVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDT AVFYC ARGRS S S YFD YWGQGTL V TVSS
- 67 030827
16 8С2 Легкая цепь 32 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSW LQQRPGQPPRLLIYKT SNRF SGVPDRF SGSGAGTDFTLKI SRVGAEDVGVYYCMQATQFPTFGQGTRLEIK
17 10С1 0 Тяжелая цепь 34 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR QAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDT AVYYC ARGRS S S YFD YWGQGTL VTVSS
18 10C1 0 Легкая цепь 36 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASFSCRSSQSLVHSDGNTYLS WLQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCMQATQFPTFGQGTRLEIK
35 10D3 Тяжелая цепь 287 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIR QPPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSR VTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARERGYTYG NFDHWGQGTL VTVSS
36 10D3 Легкая цепь 289 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGAS SRATGTPDRF SGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYFCQQYERSFTFGPGTKVD
19 Abx012 Тяжелая цепь 239 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWIRQ PAGKGLEWIGRIYISGRTSYNPSLKSRVTVSVDTSKNQFS LKLS SVTAADT A VYYCARDRLTGYFD YWGQGTL VTVS S
20 Abx012 Легкая цепь 241 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYGASSRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQYGSSLTFGGGTKVEIK
21 Abx020 Тяжелая цепь 38 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIR QAPGKGLEWISYITSSGSTIYYSASVKGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDF SGWFGVHFDYWGQGT L VTVSS
- 68 030827
22 Abx020 Легкая цепь 40 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYW YLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPNRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCMQSIQLTWTFGQGTKVEIK
23 Abx106 Тяжелая цепь 243 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWIRQ PAGKGLEWIGRIYISGRTSYNPSLKSRVTVSVDTSKNQFS LKLS S VT AADT A VY YC ARDRLTGYFD YWGQGTL VT VS S
24 Abx106 Легкая цепь 245 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQYGSSPMCSFGQGTKLEIK
25 Abx198 Тяжелая цепь 42 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLDWVSDISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMHSLSAEDTAIYYCAKRRWQGYFDLWGRGTLV TVSS
26 Abx198 Легкая цепь 44 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRARQRVDSRYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGAS SRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIK
27 Abx221 Тяжелая цепь 247 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMNWVR QAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRDFWSGPFDYWGQGT LVTVSS
28 Abx221 Легкая цепь 249 EIVMTPSSATLSVSPGERATLSCRASQSVSRSLAWYQQK PGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS ED VAVYYCQQ YNNWMC SFGQGTKLEIK
29 Abx229 Тяжелая цепь 46 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMNWVR QAPGKGLEWVSGISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRDEWSGPFDYWGQGT LVTVSS
30 Abx229 Легкая цепь 48 EIVMTPSSATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQK PGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDF AVYYCHQ YSNWMC SFGQGTKLEIK
31 Abx338 Тяжелая цепь 50 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSYYWSWIRQP AGKGLEWIGRIYISGRTTFNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK LS S VTAADT AVYFC ARDRYYGYLDYWGQGTLVTVS S
32 Abx338 Легкая цепь 52 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYD AS SRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQYGSSPSTFGQGTRLEIK
33 Abx393 Тяжелая цепь 54 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRHYYWSWIRQ PPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNLSLKSRVTISRDTSKNQVS LKLSSVTAADTAVYYCAAGMGFD YWGQGTL VTVSS
34 Abx393 Легкая цепь 56 DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQAIRNDLGWYQLKP GKAPKRLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DSATYYCLQHNSFPPTFGQGTKVEIK
- 69 030827
Таблица 4. Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка mAb
mAb IgG цепь SEQ ID NO: Последовательность нуклеиновых кислот
3G1 Тяжелая цепь 1 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTG GCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTC TCTGGGTTCTCATTAAGCAGAAATGCTATAAGCTGG GTTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTT GGAGTAATATGGACTGGTGGAGGCACAAATTATAAT TCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCCGCAAAGAG AACTCCAAGAGTCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTACAAACTGAAGACACAGCCAGGTACTTCTGTGCC AGAAGTGGTTACGACGGGTTTGATTACTGGGGCCAA GGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
2 3G1 Легкая цепь 3 CAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTG CATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTG CCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGC AGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATG ACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCAC AATCACCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTA TTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTACACGTT CGGAGGGGGGACCAAACTGGAAATAAAA
3 8Е12 Тяжелая цепь 5 CAGGTCCAGTTGAAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTG AAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCT TCTGGCTACACCTTCACTGACTACTATATAAACTGGG TGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTG GAAAGATTGGTCCTCGAAGTGGTAATACTTACTACA ATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCA GACAAATCGTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTG CAAGATGGGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGG TCACTGTCTCT
4 8Е12 Легкая цепь 7 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTGTCTTTGTCGG TTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTC AAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAGACATA TTTGAATTGGTTACAACAGAGGCCTGGCCAGGCTCC AAAGCACCTAATGTATCAGGTGTCCAAACTGGACCC TGGCATCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGA AACAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGC TGAAGATTTGGGAGTTTATTACTGCTTGCAAGGTAC ATATTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCT GGAAATAAAG
5 8F1 Тяжелая цепь 9 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTG AAGCCTGGGGCTTCAGTGCAGATGTCCTGTAAGGCT TCTGGCTATATTTTCACCGGCTACTGGATGTACTGGG TGAAGCAGAGGCCTGGCCAAGGCCTTGAGTGGATTG GAAGGATTCATCCTTCTGATAGTAATACTAACTACA ATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAG ACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCA GCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTAC CCATGCCCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGT CACTGTCTCT
- 70 030827
6 8F1 Легкая цепь И GATGTTGTGTTGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGA TTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTC AAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTA TTTGAGTTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCC AAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTCAACTGGACTCT GGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGA ACAGATTTTACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCT GAGGATTTGGGAGTGTATTACTGCGTGCAAGGTACA CATTTATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAA АТАААА
7 1D3 Тяжелая цепь 13 CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTG AAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCT TCTGGCTACACCTTCACAGACTACTATATAAACTGG GTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATT GGAAAGATTGGTCCTAGAAGTGGTAGTACTTACTAC AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGC AGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAG CAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGT GCAAGATGGGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTG GTCACTGTCTCTGCA
8 1D3 Легкая цепь 15 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTGTCTTTGTCGG TTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTC AAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAGACATA TTTGAATTGGTTACAACAGAGGCCTGGCCAGGCTCC AAAGCACCTAATGTATCAGGTGTCCAAACTGGACCC TGGCATCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGA AACAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGC TGAAGATTTGGGAGTTTATTACTGCTTGCAAGGTAC ATATTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCT GGAAATAAAA
9 5F9 Тяжелая цепь 17 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCT TTGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGAT CCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTG GGGAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGACAAC CCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCGCCCTGAAGCTGAGTTCT GTGACCGCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCG AGAGAACGTGGATACACCTATGGTAACTTTGACCAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
10 5F9 Легкая цепь 19 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCT GTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGG GCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTAGCCTGGTAT CAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATC TATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGAATCCCAGCC AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACT CTCACCATCGGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCA GTTTATTACTGTCAGCAGTATAAAACCTGGCCTCGG ACGTTCGGCCAAGGGACCAACGTGGAAATCAAA
11 5НЗ Тяжелая цепь 21 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTC AAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATTCACCTTCAGTGACTGCTACATGAGCTGG ATCCGCCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTT TCATACATTACTACTAGTGGTAATACCATTTACTACG CAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGG ACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTG CGAGAGACTGGGGATGGTTCTACGGTATGGACGTCT GGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
- 71 030827
12 5НЗ Легкая цепь 23 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCG TCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGT CTAGTCAGAGCCTCCTGCATAATGATGGAAAGACCT ATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTC CACAACTCCTGATCTATGAAGTTTCCAACCGGTTCTC TGGAGTGCCAGATAGGTTCAGTAGCAGCGGGTCNNG GACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGC TGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTAT ACAGCTTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGT GGAAATCAAA
13 6Н8 Тяжелая цепь 25 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTC CAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCG TCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG GCAGCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGGGAGGAGCAGCTCGTACTTTGACTATTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
14 6Н8 Легкая цепь 27 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCACCTG TCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTC TAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATGGAAACACCTA CTTGAGTTGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCC AAGACTCCTAATTTATAAGACTTCTAACCGCTTCTCT GGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGGCAGG GACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGGAGC TGAGGATGTCGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTAC GCAATTTCCAACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGA GATTAAA
- 72 030827
15 8С2 Тяжелая цепь 29 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggTCCCT GAGACTCTCCTGTGTAGCGTCTGGATTCACCTTCAGT AGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGGCTGGAGTGGGTGGGAGCTATATGGTATGAT GGAAGTAATAAATACTATGCAGCCTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGAC ACGGCTGTATTTTACTGTGCGAGAGGGAGGAGCAGC TCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCA
16 8С2 Легкая цепь 31 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCACCTG TCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTC TAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATGGAAACACCTA CTTGAGTTGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCC AAGACTCCTAATTTATAAGACTTCTAACCGCTTCTCT GGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGGCAGG GACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGGAGC TGAGGATGTCGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTAC GCAATTTCCAACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGA GATTAAA
17 10С10 Тяжелая цепь 33 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTC CAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCG TCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG GCAGCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGGGAGGAGCAGCTCGTACTTTGACTATTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
18 10С10 Легкая цепь 35 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCACCTG TCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCTTCTCCTGCAGGTC TAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATGGAAACACGTA CTTGAGTTGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCC AAGACTCCTAATTTATAAGATTTCTAACCGGTTCTCT GGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGGCAGG GACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAAGC TGAGGATGTCGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTAC ACAATTTCCAACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGA GATTAAA
35 10D3 Тяжелая цепь 286 CAGGTGCA GCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTC GGAGACCCTGTCCC TCACCTGCGCTGTCTTTGGTGGGTCCTTCAGTGGTTA CTACTGGAGCTGG ATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATT GGGGAAATCAATCA TCGTGGAAACACCAACGACAACCCGTCCCTCAAGAG TCGAGTCACCATAT CAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCGCCCTGAAGC TGAGTTCTGTGACC GCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGAA CGTGGATACACCTA TGGTAACTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGT CACCGTCTCCTCA
- 73 030827
36 10D3 Легкая цепь 288 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT TAGCAGCAGGTACT TAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCACCCCAGACAGG TTCAGTGGCAGTGG GTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATT TTGCAGTGTATTTCTGTCAGCAGTATGAAAGGTCATT CACTTTCGGCCCT GGGACCAAAGTGGAT
19 Abx012 Тяжелая цепь 238 CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGC CTCCATCAGTCATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCA GCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGCGTAT СТАТАТСА GTGGGAGGACCAGCTACAACCCCTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCGTGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGT TCTCCCTG AAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTG TATTACTGTGCGAGAGATCGGCTAACTGGGTACTTT GACTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
20 АЬх012 Легкая цепь 240 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCA GAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCA GAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGG TGCATCCA GCAGGGCCGCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCA GACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATG GTAGCTCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGG AGATCAA АС
21 АЬх020 Тяжелая цепь 37 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTC AAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGG ATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATT TCATACATTACTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACT CAGCCTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGG ACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTG CGAGAGATTTCAGTGGCTGGTTCGGAGTCCACTTTG ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCT CG
- 74 030827
22 Abx020 Легкая цепь 39 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCG TCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGTAAGTC TAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTGATGGAAAGACCTA TTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCC ACAGCTCCTGATCTATGAAGTTTCCAACCGGTTCTCT GGAGTGCCAAATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGG GACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGC TGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTAT ACAACTTACGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGT GGAAATCAAA
23 Abx106 Тяжелая цепь 242 CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGC CTCCATCAGTCATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCA GCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGCGTAT СТАТАТСА GTGGGAGGACCAGCTACAACCCCTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCGTGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGT TCTCCCTG AAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTG TATTACTGTGCGAGAGATCGGCTAACTGGGTACTTT GACTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC
24 АЬх106 Легкая цепь 244 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCA GAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCA GAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGG ТАСАТССА GCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCA GACTGGAG CCTGAAGACTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTAT GGTAGCTCACCCATGTGCAGTTTTGGCCAGGGGACC AAGCTGGA GATCAAACG
25 АЬх198 Тяжелая цепь 41 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA CAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGACTGGGTC TCAGATATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGCAC AGCCTGAGCGCCGAGGACACGGCCATATATTACTGT GCGAAACGGCGGTGGCAGGGGTACTTCGATCTCTGG GGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
- 75 030827
26 Abx198 Легкая цепь 43 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGGCAGCGTGTTGACAGCAGGTACTTAGCCTGGT ACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAG ACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA CTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTG CAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGC TCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
27 Abx221 Тяжелая цепь 246 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA CAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATT CACCTTTAGCCGCTATGCCATGAACTGGGTCCGCCA GGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTAT TAGTGGTA GTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGG GCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA CGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGC CGTATATTACTGTGCGAAAGATCGCGATTTTTGGAG TGGTCCATT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCAGC
28 Abx221 Легкая цепь 248 GAAATAGTGATGACGCCGTCTTCAGCCACCCTGTCT GTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGG GCCAGTCA GAGTGTTAGTAGAAGCTTAGCCTGGTACCAGCAGAA ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGGTGC АТССАССА GGGCCACTGGGATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCC TGCAGTCT GAAGATGTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAAT AACTGGATGTGCAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTG GAGATCAA ACG
29 Abx229 Тяжелая цепь 45 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA CAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATTCACCTTTAGCCGCTATGCCATGAACTGGG TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCT CAGGTATTAGTGGGAGTGGTGGTAGGACATACTACG CAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAG ACAATTCCAAGAACACACTATATCTGCAAATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTG CGAAAGATCGCGATTTTTGGAGTGGTCCATTTGACT ACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
- 76 030827
30 Abx229 Легкая цепь 47 GAAATAGTGATGACGCCGTCTTCAGCCACCCTGTCT GTGTCTCCAGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGG GCCAGTCAGAGTGTTAGTAGAAACTTAGCCTGGTAC CAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATC TATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCC AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAATTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCA GTTTATTACTGTCACCAGTATAGTAACTGGATGTGCA GTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
31 Abx338 Тяжелая цепь 49 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGGCTCCATCAGAAGTTACTACTGGAGCTGGA TCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG GACGTATTTATATCAGTGGGAGGACCACCTTCAACC CCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTGGACA CGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTG TGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGA GAGATAGATATTATGGCTACCTTGACTACTGGGGCC AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
32 Abx338 Легкая цепь 51 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCAGAGTGTTAGCCGCAGTTACTTAGCCTGGT ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAG ACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA CTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTG CAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGTTCACCGA GCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
33 АЬх393 Тяжелая цепь 53 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGCGGCTCCATCCGTCATTACTACTGGAGCTGGA TCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG GGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACC TCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAAGAGACA CGTCCAAGAATCAGGTCTCCCTG AAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTG TATTATTGTGCGGCGGGTATGGGCTTTGACTACTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
34 АЬх393 Легкая цепь 55 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTG CATCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGG CAAGTCAGGCCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATC AGCTGAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCT ATTCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAA GGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTC TCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTCTGCAA CTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTTCCCTCCGAC GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
- 77 030827
Таблица 5. Аминокислотная последовательность CDR
mAb IgG цепь SEQID NO: Аминокислотная последовательность
1 3G1 VH CDR1 58 RNAIS
2 3G1 VH CDR2 60 VIWTGGGTNYNSALKS
3 3G1 VH CDR3 62 SGYDGFDY
4 3G1 VL CDR1 64 SASSSVNYMH
5 3G1 VL CDR2 66 DTSKLAS
6 3G1 VL CDR3 68 QQWSGNPYT
7 8Е12 VH CDR1 70 DYYIN
8 8Е12 VH CDR2 72 KIGPRSGNTYYNEKFKG
9 8Е12 VH CDR3 74 WDAY
10 8Е12 VL CDR1 76 KSSQSLLYSNGKTYLN
- 78 030827
11 8Е12 VL CDR2 78 QVSKLDP
12 8Е12 VL CDR3 80 LQGTYYPYT
13 8F1 VH CDR1 82 GYWMY
14 8F1 VH CDR2 84 RIHPSDSNTNYNQKFKG
15 8F1 VH CDR3 86 ALAY
16 8F1 VL CDR1 88 KSSQSLLYSNGKTYLS
17 8F1 VL CDR2 90 LVSQLDS
18 8F1 VL CDR3 92 VQGTHLFT
19 1D3 VH CDR1 94 DYYIN
20 1D3 VH CDR2 96 KIGPRSGSTYYNEKFKG
21 1D3 VH CDR3 98 WDAY
22 1D3 VL CDR1 100 KSSQSLLYSNGKTYL
23 1D3 VL CDR2 102 QVSKLDP
24 1D3 VL CDR3 104 LQGTYYPYT
25 5F9 VH CDR1 106 GYYWS
26 5F9 VH CDR2 108 EINHRGNTNDNPSLKS
27 5F9 VH CDR3 110 ERGYTYGNFDH
28 5F9 VL CDR1 112 RASQSVSRNLA
29 5F9 VL CDR2 114 GASTRAT
30 5F9 VL CDR3 116 QQYKTWPRT
31 5H3 VH CDR1 118 DCYMS
32 5H3 VH CDR2 120 YITTSGNTIYYAD SVKG
33 5H3 VH CDR3 122 DWGWFYGMDV
34 5H3 VL CDR1 124 KSSQSLLHNDGKTYLY
- 79 030827
35 5НЗ VL CDR2 126 EVSNRFS
36 5НЗ VL CDR3 128 MQSIQLPRT
37 6Н8 VH CDR1 130 SYGMH
38 6Н8 VH CDR2 132 AIWYDGSNKYYADSVKG
39 6Н8 VH CDR3 134 GRSSSYFDY
40 6Н8 VL CDR1 136 RSSQSLVHSDGNTYLS
41 6Н8 VL CDR2 138 KTSNRFS
42 6Н8 VL CDR3 140 MQATQFPT
43 8С2 VH CDR1 142 SYGMH
44 8С2 VH CDR2 144 AIWYDGSNKYYAASVKG
45 8С2 VH CDR3 146 GRSSSYFDY
46 8С2 VL CDR1 148 RSSQSLVHSDGNTYLS
- 80 030827
47 8С2 VL CDR2 150 KTSNRFS
48 8С2 VL CDR3 152 MQATQFPT
49 10С10 VH CDR1 154 SYGMH
50 10C10 VH CDR2 156 AIWYDGSNKYYADSVKG
51 10C10 VH CDR3 158 GRSSSYFDY
52 10C10 VL CDR1 160 RSSQSLVHSDGNTYLS
53 10C10 VL CDR2 162 KISNRFS
54 10C10 VL CDR3 164 MQATQFPT
103 10D3 VH CDR1 291 GYYWS
104 10D3 VH CDR2 293 EINHRGNTNDNPSLKS
105 10D3 VH CDR3 295 ERGYTYGNFDH
106 10D3 VL CDR1 297 RASQSVSSRYLA
107 10D3 VL CDR2 299 GASSRAT
108 10D3 VL CDR3 301 QQYERSFT
55 Abx-012 VH CDR1 251 HYYWS
56 Abx-012 VH CDR2 253 RIYISGRTSYNPSLKS
57 Abx-012 VH CDR3 255 DRLTGYFDY
58 Abx-012 VL CDR1 257 RASQSVSSSYLA
59 Abx-012 VL CDR2 259 GASSRAA
60 Abx-012 VL CDR3 261 QQYGSSLT
61 Abx-020 VH CDR1 166 DYYMS
62 Abx-020 VH CDR2 168 YITSSGSTIYYSASVKG
63 Abx-020 VH CDR3 170 DFSGWFGVHFDY
64 Abx-020 VL CDR1 172 KSSQSLLHSDGKTYLY
- 81 030827
65 Abx-020 VL CDR2 174 EVSNRFS
66 Abx-020 VL CDR3 176 MQSIQLTWT
67 Abx-0106 VH CDR1 263 HYYWS
68 Abx-106 VH CDR2 265 RIYISGRTSYNPSLKS
69 Abx-106 VH CDR3 267 DRLTGYFDY
70 Abx-106 VL CDR1 269 RASQSVSSSYLA
71 Abx-106 VL CDR2 271 GTSSRAT
72 Abx-106 VL CDR3 273 QQYGSSPMCS
73 Abx-198 VH CDR1 178 SYAMS
74 Abx-198 VH CDR2 180 DISGSGGSTYYADSVKG
75 Abx-198 VH CDR3 182 RRWQGYFDL
76 Abx-198 VL CDR1 184 RARQRVDSRYLA
- 82 030827
77 Abx-198 VL CDR2 186 GASSRAT
78 Abx-198 VL CDR3 188 QQYGSSPLT
79 Abx-221 VH CDR1 275 RYAMN
80 Abx-221 VH CDR2 277 GISGSGGSTYYADSVKG
81 Abx-221 VH CDR3 279 DRDFWSGPFDY
82 Abx-221 VL CDR1 281 RASQSVSRSLA
83 Abx-221 VL CDR2 283 GASTRAT
84 Abx-221 VL CDR3 285 QQYNNWMCS
85 Abx-229 VH CDR1 190 RYAMN
86 Abx-229 VH CDR2 192 GISGSGGRTYYADSVKG
87 Abx-229 VH CDR3 194 DRDFWSGPFDY
88 Abx-229 VL CDR1 196 RASQSVSRNLA
89 Abx-229 VL CDR2 198 GASTRAT
90 Abx-229 VL CDR3 200 HQYSNWMCS
91 Abx-338 VH CDR1 202 SYYWS
92 Abx-338 VH CDR2 204 RIYISGRTTFNPSLKS
93 Abx-338 VH CDR3 206 DRYYGYLDY
94 Abx-338 VL CDR1 208 RASQSVSRSYLA
95 Abx-338 VL CDR2 210 DASSRAT
96 Abx-338 VL CDR3 212 QQYGSSPST
97 Abx-393 VH CDR1 214 HYYWS
98 Abx-393 VH CDR2 216 YIYYSGSTNYNLSLKS
99 Abx-393 VH CDR3 218 GMGFDY
100 Abx-393 VL CDR1 220 RASQAIRNDLG
- 83 030827
101 АЬх-393 VL CDR2 222 SASSLQS
102 АЬх-393 VL CDR3 224 LQHNSFPPT
109 консенсу сная VH CDR1 302 x-x/Y-x/Y-M/W-S/N
110 консенсу сная VH CDR2 303 x-I-x-x-SG-[x или HeT]-x-T/I-[y/T/S]-x-x-L/V-Ks/G
111 консенсу сная VH CDR3 304 [4-6x]-G-[2-3x]-D-Y
112 консенсу сная VL CDR1 305 R/K-A/S-SQS-V/L-S/L-[5-9x]
113 консенсу сная VL CDR2 306 x-x-S-x-R-x-x
114 консенсу сная VL CDR3 307 Q/H/M-Q-Y/S-[5-7x]
Таблица 6. Последовательность нуклеиновых кислот CDR
niAb IgG цепь SEQID NO: Последовательность нуклеиновых кислот
1 3G1 VH CDR1 57 AGAAATGCTATAAGC
2 3G1 VH CDR2 59 GTAATATGGACTGGTGGAGGCACAAATTAT AATTCAGCTCTCAAATCC
- 84 030827
3 3G1 VH CDR3 61 AGTGGTTACGACGGGTTTGATTAC
4 3G1 VL CDR1 63 AGTGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCAC
5 3G1 VL CDR2 65 GACACATCCAAACTGGCTTCT
6 3G1 VL CDR3 67 CAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTACACG
7 8Е12 VH CDR1 69 GACTACTATATAAAC
8 8Е12 VH CDR2 71 AAGATTGGTCCTCGAAGTGGTAATACTTACT ACAATGAGAAGTTCAAGGGC
9 8Е12 VH CDR3 73 TGGGATGCTTAC
10 8Е12 VL CDR1 75 AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATG GAAAGACATATTTGAAT
11 8Е12 VL CDR2 77 CAGGTGTCCAAACTGGACCCT
12 8Е12 VL CDR3 79 TTGCAAGGTACATATTATCCGTACACG
13 8F1 VH CDR1 81 GGCTACTGGATGTAC
14 8F1 VH CDR2 83 AGGATTCATCCTTCTGATAGTAATACTAACT
ACAATCAAAAGTTCAAGGGC
- 85 030827
15 8F1 VH CDR3 85 GCCCTTGCTTAC
16 8F1 VL CDR1 87 AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATG GAAAAACCTATTTGAGT
17 8F1 VL CDR2 89 CTGGTGTCTCAACTGGACTCT
18 8F1 VL CDR3 91 GTGCAAGGTACACATTTATTCACG
19 1D3 VH CDR1 93 GACTACTATATAAAC
20 1D3 VH CDR2 95 AAGATTGGTCCTAGAAGTGGTAGTACTTACT ACAATGAGAAGTTCAAGGGC
21 1D3 VH CDR3 97 TGGGATGCTTAC
22 1D3 VL CDR1 99 AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATG GAAAGACATATTTGAAT
23 1D3 VL CDR2 101 CAGGTGTCCAAACTGGACCCT
24 1D3 VL CDR3 103 TTGCAAGGTACATATTATCCGTACACG
25 5F9 VH CDR1 105 GGTTACTACTGGAGC
26 5F9 VH CDR2 107 GAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGAC AACCCGTCCCTCAAG
- 86 030827
27 5F9 VH CDR3 109 GAACGTGGATACACCTATGGTAACTTTGACC AC
28 5F9 VL CDR1 111 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTA GCC
29 5F9 VL CDR2 113 GGTGCATCCACCAGGGCCACT
30 5F9 VL CDR3 115 CAGCAGTATAAAACCTGGCCTCGGACG
31 5НЗ VH CDR1 117 GACTGCTACATGAGC
32 5НЗ VH CDR2 119 TACATTACTACTAGTGGTAATACCATTTACT ACGCAGACTCTGTGAAGGGC
33 5НЗ VH CDR3 121 GACTGGGGATGGTTCTACGGTATGGACGTC
34 5НЗ VL CDR1 123 AAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAATGATG GAAAGACCTATTTG
35 5НЗ VL CDR2 125 GAAGTTTCCAACCGGTTCTCT
36 5НЗ VL CDR3 127 ATGCAAAGTATACAGCTTCCTCGGACG
37 6Н8 VH CDR1 129 AGCTATGGCATGCAC
38 6Н8 VH CDR2 131 GCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT ATGCAGACTCCGTGAAGGGC
- 87 030827
39 6Н8 VH CDR3 133 GGGAGGAGCAGCTCGTACTTTGACTAT
40 6Н8 VL CDR1 135 AGGTCTAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATG GAAACACCTACTTGAGT
41 6Н8 VL CDR2 137 AAGACTTCTAACCGCTTCTCT
42 6Н8 VL CDR3 139 ATGCAAGCTACGCAATTTCCAACC
43 8С2 VH CDR1 141 AGCTATGGCATGCAC
44 8С2 VH CDR2 143 GCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT ATGCAGCCTCCGTGAAGGGC
45 8С2 VH CDR3 145 GGGAGGAGCAGCTCGTATTTTGACTAC
46 8С2 VL CDR1 147 AGGTCTAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATG GAAACACCTACTTGAGT
47 8С2 VL CDR2 149 AAGACTTCTAACCGCTTCTCT
48 8С2 VL CDR3 151 ATGCAAGCTACGCAATTTCCA
49 10С10 VH CDR1 153 AGCTATGGCATGCAC
50 10C10 VH CDR2 155 GCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT ATGCAGACTCCGTGAAGGGC
- 88 030827
51 ЮСЫ VH CDR3 157 GGGAGGAGCAGCTCGTACTTTGACTAT
52 10C10 VL CDR1 159 AGGTCTAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATG GAAACACGTACTTGAGT
53 10C10 VL CDR2 161 AAGATTTCTAACCGGTTCTCT
54 10C10 VL CDR3 163 ATGCAAGCTACACAATTTCCAACC
103 10D3 VH CDR1 290 GGTTACTACTGGAGC
104 10D3 VH CDR2 292 GAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGAC AACCCGTCCCTCAAG
105 10D3 VH CDR3 294 GAACGTGGATACACCTATGGTAACTTTGACC AC
106 10D3 VL CDR1 296 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGGTAC TTAGCCT
107 10D3 VL CDR2 298 GGTGCATCCAGCAGGGCCACTG
108 10D3 VL CDR3 300 CAGCAGTATGAAAGGTCATTCACTT
55 Abx-012 VH CDR1 250 CATTACTACTGGAGC
56 Abx-012 VH CDR2 252 CGTATCTATATCAGTGGGAGGACCAGCTACA ACCCCTCCCTCAAGAGT
57 Abx-012 VH CDR3 254 GATCGGCTAACTGGGTACTTTGACTAC
- 89 030827
58 Abx-012 VL CDR1 256 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCC
59 Abx-012 VL CDR2 258 GGTGCATCCAGCAGGGCCGCT
60 Abx-012 VL CDR3 260 CAGCAGTATGGTAGCTCCCTCACT
61 Abx-020 VH CDR1 165 GACTACTACATGAGC
62 Abx-020 VH CDR2 167 TACATTACTAGTAGTGGTAGTACCATATACT ACTCAGCCTCTGTGAAGGGC
63 Abx-020 VH CDR3 169 GATTTCAGTGGCTGGTTCGGAGTCCACTTTG ACTAC
64 Abx-020 VL CDR1 171 AAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTGATG GAAAGACCTATTTGTAT
65 Abx-020 VL CDR2 173 GAAGTTTCCAACCGGTTCTCT
66 Abx-020 VL CDR3 175 ATGCAAAGTATACAACTTACGTGGACG
67 Abx-106 VH CDR1 262 CATTACTACTGGAGC
68 Abx-106 VH CDR2 264 CGTATCTATATCAGTGGGAGGACCAGCTACA ACCCCTCCCTCAAGAGT
69 Abx-106 VH CDR3 266 GATCGGCTAACTGGGTACTTTGACTAC
- 90 030827
70 Abx-106 VL CDR1 268 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCC
71 Abx-106 VL CDR2 270 GGTACATCCAGCAGGGCCACT
72 Abx-106 VL CDR3 272 CAGCAGTATGGTAGCTCACCCATGTGCAGT
73 Abx-198 VH CDR1 177 AGCTATGCCATGAGC
74 Abx-198 VH CDR2 179 GATATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACT ACGCAGACTCCGTGAAGGGC
75 Abx-198 VH CDR3 181 CGGCGGTGGCAGGGGTACTTCGATCTC
76 Abx-198 VL CDR1 183 AGGGCCAGGCAGCGTGTTGACAGCAGGTAC TTAGCC
77 Abx-198 VL CDR2 185 GGTGCATCCAGCAGGGCCACT
78 Abx-198 VL CDR3 187 CAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACT
79 Abx-221 VH CDR1 274 CGCTATGCCATGAAC
80 Abx-221 VH CDR2 276 GGTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACT ACGCAGACTCCGTGAAGGGC
81 Abx-221 VH CDR3 278 GATCGCGATTTTTGGAGTGGTCCATTTGACT AC
- 91 030827
82 АЬх-221 VL CDR1 280 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGTAGAAGCTTA GCC
83 АЬх-221 VL CDR2 282 GGTGCATCCACCAGGGCCACT
84 АЬх-221 VL CDR3 284 CAGCAGTATAATAACTGGATGTGCAGT
85 АЬх-229 VH CDR1 189 CGCTATGCCATGAAC
86 АЬх-229 VH CDR2 191 GGTATTAGTGGGAGTGGTGGTAGGACATAC TACGCAGACTCCGTGAAGGGC
87 АЬх-229 VH CDR3 193 GATCGCGATTTTTGGAGTGGTCCATTTGACT АС
88 АЬх-229 VL CDR1 195 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGTAGAAACTTA GCC
89 АЬх-229 VL CDR2 197 GGTGCATCCACCAGGGCCACT
90 АЬх-229 VL CDR3 199 CACCAGTATAGTAACTGGATGTGCAGT
91 АЬх-338 VH CDR1 201 AGTTACTACTGGAGC
92 АЬх-338 VH CDR2 203 CGTATTTATATCAGTGGGAGGACCACCTTCA ACCCCTCCCTCAAGAGT
93 АЬх-338 VH CDR3 205 GATAGATATTATGGCTACCTTGACTAC
94 АЬх-338 VL CDR1 207 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCAGTTACT TAGCC
95 АЬх-338 VL CDR2 209 GATGCATCCAGCAGGGCCACT
96 АЬх-338 VL CDR3 211 CAGCAGTATGGTAGTTCACCGAGCACC
97 АЬх-393 VH CDR1 213 CATTACTACTGGAGC
98 АЬх-393 VH CDR2 215 TATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACA ACCTCTCCCTCAAGAGT
99 АЬх-393 VH CDR3 217 GGTATGGGCTTTGACTAC
100 АЬх-393 VL CDR1 219 CGGGCAAGTCAGGCCATTAGAAATGATTTA GGC
101 АЬх-393 VL CDR2 221 TCTGCATCCAGTTTGCAAAGT
102 АЬх-393 VL CDR3 223 CTACAGCATAATAGTTTCCCTCCGACG
Экспрессионные векторы создавали, как описано выше, которые содержат кодирующие последовательности для обеих тяжелой и легкой цепи каждого из mAb 5F9 и Abx-229.
Изобретение иллюстрируется со ссылкой на последующие примеры, которые не должны рассматриваться как дальнейшее ограничение.
- 92 030827
Примеры
ПРИМЕР 1. Создание анти-GCC антител и исследование
Синтез белка GCC для иммунизации и скрининга был выполнен следующим образом. Антиген GCC приготавливали при помощи субклонирования части гена GCC, кодирующего последовательность, содержащую следующую последовательность GCC (сигнальная последовательность и внеклеточный домен), в экспрессирующем векторе.
MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVR GRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMY LDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTE TEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAV AEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLF GHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTY DTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKL (SEQ ID N0:229)
Экспрессирующий вектор (pLKTOK107) обеспечил C-терминальную область IgG1Fc для слияния с последовательностью GCC. Этот вектор содержал экзон с шарниром IgG1, CH2 и CH3 домены, мутировавшие до исключения неспаренного цистеин из фрагмента CH1 в экзоне. Затем указанная IgG1Fc область мутировала в лизин 235 и глицин 237 до аланинов. Конструкция рекомбинантно экспрессировала в человеческие эмбриональные клетки почек (HEK293), трансфицированные геном для SV40 Т-антигена в качестве секретируемой последовательности GCC (аминокислотные остатки 24-430 SEQ ID NO:228) слитой с человеческой C-терминальной областью IgG1Fc. Белок, названный TOK107-hIg (альтерн. наименование hGCC-ECD/hIgG1Fc, SEQ ID NO:317), очищали при помощи хроматографии протеина A и эксклюзионной хроматографии.
Антиген GCC также приготавливали при помощи субклонирования вышеупомянутого слитого белка в экспрессирующем векторе, таком как pLKTOK111, который подходит для слияния мышиной трансмембранной области IgG2a на C-конце. Когда эта конструкция рекомбинантно экспрессирует в клетках CHO, внеклеточный домен GCC обнаруживают на поверхности клетки. Высокий уровень экспрессии на поверхности клетки слитого белка GCC-Ig (SEQ ID NO:318) достигается тогда, когда вектор pLKTOK111 со-трансфицируется с pLKTOK123, который содержит мышиный CD79a (MB 1) и CD79b (B29). Клон #27 из этой трансфекции (CHO-GCC#27) применяли в качестве иммуногена. В качестве иммуногена также применяли клетки HT-29-GCC#2.
Для скрининга супернатантов гибридом и очищенных mAbs при помощи ELISA, нуклеиновую кислоту, кодирующую слитую конструкцию GCC, клонировали в экспрессирующем векторе pCMV1 (компания Sigma). Метки очистки: FLAG-метка (на N-конце) и His-метка (на C-конце) клонировали в конструкцию равным образом. Конструкция слитого белка была трансфицирована в клетки 293, экспрессирована, и слитый белок очищали на колонке Anti-FLAG® для аффинной хроматографии на M2-агарозе (компания Sigma).
Реагенты и клеточные линии
Клетки HEK293, CHO и человеческие клетки рака толстой кишки T84 были получены из ATCC (Американской коллекции типовых культур) и поддерживались в соответствии с протоколами ATCC.
Мыши:
Самки мыши C57BL/6, возрастом 4-6 недель, были приобретены у компании Taconic Farms, Inc (Джермантаун, штат Нью-Йорк), с целью создания мышиных гибридом. Ксеномыши, продуцирующие человеческие антитела IgG2, возрастом до 4-6 недель, выведенные для внутреннего использования, были приобретены у компании Abgenix, Inc (Фримонт, штат Калифорния), с целью создания человеческих гибридом. Все животные были приобретены и содержались в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по содержанию и использованию животных компании Millennium Pharmaceuticals, Inc.
Клеточные линии:
Клеточные линии, которые использовались для функционального анализа, представляли собой клеточные пары клеток, трансфицированных GCC, и вектор контроля клеток HEK293 или HT29. Клетки HT29 были трансфицированы первичным полноразмерным GCC под контролем промотора EF-1a или пустого вектора (pLKTOK4) и селектированы в G418. Было подтверждено, что для GCC в указанных клетках присущ cGMP-ответ, в случае контактирования с пептидом ST (1-18 или 5-18). Клетки HEK293 были трансфицированы первичным полноразмерным GCC под контролем промотора CMV или пустого вектора (pN8mycSV40) и селектированы в бластицидин. В указанных клетках GCC имеет myc метку. Клоны, селектированные для более высокого уровня экспрессии GCC, представляли собой 293-GCC#2, HT29-GCC#2 и HT29-GCC#5. Также в качестве иммуногенов применяли HT29-GCC#2, с целью создания молекул анти-GCC антител. Дополнительными клетками GCC-экспрессии являются клетки CT26. С целью создания клеточных линий CT26, экспрессирующих GCC, использовали вектор pTOK58D. Первичный GCC клонировали в участок, обычно используемый для клонирования тяжелой цепи и люциферазу клонировали в участок, обычно используемый для клонирования легкой цепи. После трансфекции в клетки CT26, была подтверждена независимая экспрессия как GCC, так и люциферазы. Поверхностная
- 93 030827 экспрессия GCC была подтверждена при помощи проточной цитометрией, посредством применения антитела 5F9. Клон #32 был отобран для дальнейших исследований.
Клеточная линия рака толстой кишки T84 эндогенно экспрессирует GCC. Taqman-анализ GCC в широкой панели клеточных линий выявил, что T84 было единственной клеточной линией, которая экспрессирует мРНК для GCC. Окрашивание GCC селективными GCC моноклонального антитела на дебрисе клеток T84 показало существенную экспрессию белка GCC.
Подсчет уровней рецептора GCC с помощью меченого лиганда (ST-токсин) дал основание предположить, что клетки 293-GCC#2 экспрессировали больше GCC, чем клетки T84, в то время как HT29GCC#2 или #5 экспрессировали наименьшее количество молекул GCC на клетку.
Клеточная линия Цельноклеточный анализ связывания (рецептор /клетка)
HT-29-GCC#2/#5 100,000 эндогенные GCC Т84 300,000
293-GCC 600,000
Создание мышиных моноклональных антител при помощи иммунизации белка: Человеческий внеклеточный домен GCC /человеческий слитый белок Ig (TOK107-hIg, 50 мкг) суспендировали в физиологическом растворе, забуференном фосфатом Дульбекко (ФСБ; компания GIBCO, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), и эмульгировали с равным по объему полным адъювантом Фрейнда (компания Sigma Chemical Co., Сант-Льюис, штат Миссури). Мыши C57BL/6 были иммунизированы инъекцией эмульсии по трем подкожным участкам и одному внутрибрюшинному (в.б.) участку. По истечении двух недель после начальной иммунизации, мышей подвергали повторной иммунизации в.б. с использованием 25 мкг TOK107-hIg в неполном адъюванте Фрейнда. По истечении одной недели, из хвостовой вены отбирали небольшое количество крови, и связывающую активность сыворотку против TOK107-Ig титровали посредством ELISA. Мышей отбирали для слияния, когда их титр превышал 1:24,300 посредством ELISA или 1:500 посредством FACS. Селектированные мыши были повторно стимулированы посредством инъекции 25 мкг TOK107-hIg в ФСБ. По истечении четырех дней, одна мышь была подвергнута эвтаназии, после чего была приготовлена суспензия клеток селезенки, и промыта с помощью ФСБ для слияния с клетками P3. По истечении одного месяца, были приготовлены клетки селезенки из другой мыши для слияния с клетками P3. Слившиеся клетки были протестированы на предмет производства антител, которые специфически связываются с GCC, посредством ELISA для связывания TOK107-hIg, по сравнению с не-GCC антигеном или с областью Fc IgG, и посредством FACS для связывания с клетками T84, или с клетками Caco-2, или с клетками клона #2 HT-29, по сравнению с вектором контроля, и по сравнению с не экспрессирующими -GCC клетками MCF-7. Изотип определяли посредством применения изотипирующего набора моноклонального мышиного антитела ISOSTRIP® (компания Roche Diagnostics, Мангейм, Германия). Указанные схемы иммунизации и слияния гибридом производили молекулы мышиных анти-GCC антител 1D3, 8E12, 3G1 и 10B8.
Создание человеческих моноклональных антител
Созданные методами генетической инженерии мыши XENOMOUSE (компания Abgenix, Фримонт, штат Калифорния) (возраст 8-10 недель) были иммунизированы с целью производства человеческих моноклональных антител. Смотри Mendez и др. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Применяли несколько схем иммунизации. В одной схеме сто микрограмм человеческого внеклеточного домена GC-C/человеческого слитого белка Ig (TOK107-hIg) суспендировали в физиологическом растворе, забуференном фосфатом Дульбекко (ФСБ; компания GIBCO, ГрандАйленд, штат Нью-Йорк), и эмульгировали равным по объему полным адъювантом Фрейнда (компания Sigma Chemical Co., Сант-Льюис, штат Миссури). XENOMOUSE™ были иммунизированы инъекцией эмульсии по трем подкожным участкам, в основе хвоста и в одном внутрибрюшинном (в. б.) участке. По истечении четырнадцати дней после начальной иммунизации, мышей подвергали повторной иммунизации с использованием 50 мкг TOK107-hIg в неполном адъюванте Фрейнда. Тестирование сыворотки показало недостаточный титр, по этой причине, после нескольких недель отдыха, мышей подвергли второй повторной иммунизации с использованием 50 мкг человеческих TOK107-hIg. По истечении двух недель, у хвостовой вены отбирали небольшое количество крови, и титровали активность сыворотки против TOK107-Ig посредством ELISA, и активность сыворотки против клеток HT29-GCC#2 посредством FACS. Мышей отбирали для слияния, когда их титр превышал 1:24,300 посредством ELISA, или 1:500 посредством FACS. По истечении почти трех месяцев после указанной повторной иммунизации, мышей стимулировали с помощью 107 клеток HT-29#2, и на следующий день стимулировали 50 мкг TOK107-hIg, обоими в неполном адъюванте Фрейнда. Мышь, иммунизированная по указанной схеме, вырабатывала 5F9 и молекулы человеческих анти-GCC антител 1D2.
По истечении четырех дней мыши были подвергнуты эвтаназии, после чего были приготовлены суспензии клеток селезенки, и промыты ФСБ для целей слияния. Слившиеся клетки были протестированы на предмет производства антител, которые специфически связываются с GCC, посредством ELISA,
- 94 030827 для связывания TOK107-hIg, по сравнению с не-GCC антигеном, или с областью Fc IgG, и посредством FACS для связыцвания с клетками T84, или клетками клона #2 HT-29, по сравнению с вектором контроля, и по сравнению с клетками MCF-7, не экспрессирующими GCC. Изотип определяли посредством применения ELISA или FACS, с применением специфических вторичных антител IgG или IgM. Мышь, иммунизированная по указанной схеме, вырабатывала молекулы человеческих анти-GCC антител 5F9 и 1D2.
В другой схеме, клетки CHO-GCC#27 (5х106) содержащие вектор pkTOK111, и экспрессирующие внеклеточный домен GCC на их поверхностях, применяли в качестве иммуногена дважды, с двумя неделями между BIP иммунизациями (основа хвоста + внутрибрюшинная). После осуществления выборки крови, с целью идентифицирования реактивности анти-GCC против TOK107-hIg посредством ELISA, мыши были повторно стимулированы с использованием клеток GCC #2 HT-29 (либо три недели, либо более чем два месяца от предыдущей стимуляции). По истечении четырех дней после последней повторной иммунизации, была собрана соответствующая селезенка для слияния клеток. Указанные слившиеся клетки были протестированы на предмет производства антител, которые специфически связываются с GCC, посредством ELISA, для связывания TOK107-hIg, по сравнению с не-GCC антигеном, или с областью Fc IgG, посредством FACS, для связывания с клетками клона #2 HT-29, по сравнению с вектором контроля, клетками T84 или не экспрессирующими GCC клетками MCF-7. Изотип определяли посредством применения ELISA. Указанные схемы иммунизации и слияния гибридом производили молекулы человеческих анти-GCC антител 5H3, 6H8, 8C2, 10C10, 10D3 и 1C9.
Гибридомы, которые производят человеческое моноклональное антитело: клетки селезенки были посчитаны и смешаны с клетками SP 2/0 миеломы (№ ATCC CRL8-006, Роквилл, штат Мэриленд), которые являются неспособными к секретированию как тяжелой, так и легкой цепи иммуноглобулина при соотношении миеломы селезенки: 2:1. Клетки были слиты с применением полиэтиленгликоля 1450 (ATCC) в 12-ти 96-луночных планшетах с культурами ткани в среде HAT-селекции в соответствии со стандартными процедурами. В промежутке между 10-м и 21-м днем после слияния, колонии гибридом стали видимыми и супернатанты культур были собраны и затем подвержены скринингу посредством ELISA и FACS.
Создание антитела на основе SLAM-технологии:
Моноклональные антитела были также выделены при помощи SLAM-технологии Абгеникса (Babcook и другие PNAS 93:7843-7848 (1996)). Начальная стадия в указанном методе состоит в иммунизации мышей XENOMOUSE, которых иммунизируют антигеном GCC в соответствии со схемой, которая находится среди схем, описанных ниже. Затем стадия SLAM (Selected Lymphocyte Antibody Method - метод селектированных лимфоцитных антител) включает первичную идентификацию в пределах большой популяции лимфоцитов единственного лимфоцита, который вырабатывает антитело с желательной специфичностью или функцией, и затем сохранение генетической информации от этого лимфоцита, которая кодирует специфичность антитела. Вариабельная область такого лимфоцита (первоначально продуцирующая антитело IgG2 или IgG4) амплифицирована и перенесена вектору, имеющему изотип IgG1.
Схемы иммунизации антител SLAM (например, Abx-229,-012,-221,-020,-338,-106,-198 или-393) включают применение TOK-hIg или TOK-hIg, конъюгируемые с гемоцианином лимфы улитки. Иммунизации проводились либо посредством инъекции в подушечку стопы, либо посредством комбинации инъекции в основание хвоста и внутрибрюшинной инъекции. Первичная иммунизация с применением 10 мкг иммуногена включала либо золотой адъювант TITERMAX®, либо полный адъювант Фрейнда. Было проведено шесть - восемь повторных иммунизаций с применением 5 мкг иммуногена, посредством использования либо квасцов, золотого адъюванта TITERMAX®, либо неполного адъюванта Фрейнда. Если золотой адъювант TITERMAX был начальным адъювантом, то квасцы применялись в качестве адъюванта для повторной иммунизации, и при этом повторные иммунизации были проведены с интервалом в 3 4 дня. Если при первичной иммунизации и повторных иммунизациях применяли полный, а затем неполный адъювант Фрейнда соответственно, то интервалы между повторными иммунизациями составляли приблизительно двухнедельные интервалы. Тестирования сывороток титров от четвертой до шестой повторной иммунизации иногда сопровождались дополнительными повторными иммунизациями. В заключительной повторной иммунизации за четыре дня до отбора применяли иммуноген в ФСБ.
Анализ моноклонального антитела посредством ELISA. Закрепленные 96-луночные планшеты EIA с высоким содержанием белка (компании Costar/Corning, Inc. Корнинг, штат Нью-Йорк) были обогащены 50 мкл/лунку 2 мкг/мл раствора (0,1 мкг/лунку) TOK107-hIg и инкубировали на протяжении ночи при температуре 4°C. Излишек раствора отсасывали с помощью аспиратора и планшеты промывали ФСБ/0,05% Tween-20 (три раза), затем блокировали 1%-м альбумином бычьей сыворотки (БСА, фракция V, компания Sigma Chemical Co., штат Миссури) на протяжении 1 ч при комнатной температуре (КТ), для того чтобы ингибировать неспецифическое связывание. Раствор БСА был удален, затем добавляли 50 мкл/лунку супернатанта гибридомы из каждой лунки планшета. Планшеты были затем инкубированы на протяжении 45 мин При температуре 37°C и промыты три раза с помощью ФСБ/0,05% Tween-20. В каждую лунку добавляли пероксидазу хрена (HRP)-конъюгируемую козиным, антимышиным или анти- 95 030827 человеческим антителом IgG F(ab)2 (H&L) (Jackson Research Laboratories, Inc., Вест Гров, штат Пенсильвания), разбавленную 1:4000 в 1%-й БСА/ФСБ, и затем планшеты инкубировали на протяжении 45 мин при температуре 37°C. После промывания добавляли 50 мкл/лунку раствора ABTS (компания Zymed, Южный Сан-Франциско, штат Калифорния). Интенсивность зеленого цвета положительных лунок в 405 нМ оценивали на ридере микротитровального планшета Vmax (компания Molecular Devices Corp., Саннивейл, штат Калифорния). Все гибридомы из лунок, которые дали положительный ответ, были затем добавлены в 24-луночные планшеты с культурами, субклонированными методом серийного разведения, и проанализированные посредством ELISA и FACS. Три лучших субклона добавляли далее.
Анализ моноклонального антитела посредством проточной цитометрии
Скрининг проточной цитометрии (FACS) был осуществлен по всем планшетам с супернатантами, параллельно со скринингом в соответствии с методом ELISA. Клетки клона #2 HT-29 или нетрансфицированные клетки HT-29 выращивали в колбах T225 (компания Costar/Corning, Inc, Корнинг, штат НьюЙорк) в DMEM (модифицированная по способу Дюльбекко среда Игла) (GIBCO), с добавлением 10%-й фетальной бычьей сыворотки (GIBCO). Клетки были отделены от поверхности колбы, с использованием версена (GIBCO), собраны и промыты дважды с использованием DMEM, затем их один раз промывали 1%-м раствором БСА/ФСБ. Клетки повторно суспендировали в 1% БСА/ФСБ и 2х106 клеток добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов с V-образным дном (Costar) и центрифугировали на протяжении 5 мин при скорости 2500 оборотов в минуту (промывной раствор). Промывной раствор удаляли и добавляли 50 мкл/лунку супернатанта из каждой лунки планшета. Применяли приспособление для заклеивания планшетов (компании Linbro/MP Biomedicals, LLC, Солон, штат Огайо) и планшеты затем осторожно перемешивали на вортексе, для того чтобы ресуспендировать и перемешать клетки с супернатантами, и инкубировали при температуре 4°C (на льду) на протяжении 30 мин. Планшеты затем промывали холодной 1%-й БСА/ФСБ (три раза) и в каждую лунку добавляли на протяжении 30 мин при температуре 4°C (на льду в темном) по 50 мкл/лунку FITC-конъюгируемое ослиное антимышиное антитело IgG F(Ab)2 (H&L) или FITC-конъюгируемое козье античеловеческое антитело IgG F(Ab)2 (H&L) (Jackson), разбавленные в соотношении 1:50. Планшеты снова промывали три раза в холодной 1% БСА/ФСБ и фиксировали в холодном 1%-м параформальдегиде (Sigma)/ФСБ. Клетки переносили в блок пробирок (Costar) и анализировали на проточном питометре FACScalibur (компания Becton Dickenson, Сан-Хосе, штат Калифорния). Любые гибридомы из лунок, которые показали положительное изменение, были затем добавлены в 24-луночные планшеты с культурами, субклонированными методом серийного разведения.
Анализ интернализации
Интернализация молекул анти-GCC антител была протестирована как в GCC-экспрессирующих клетках, так и в клетках векторного контроля посредством применения иммунофлюоресцентной микроскопии. Клетки выращивали на покровных стеклах и помещали на лед на 10 мин до инкубации с 10 мкг/мл антител в холодной культуральной среде на протяжении 20 мин на льду. Для интернализации содержащую антитело среду заменяли свежей культуральной средой и происходило изменение клеток при повышении температуры до 37°C на протяжении 2-3 ч, или они оставлялись на льду. После промывания в ФСБ и короткой фиксации в 4%-м параформальдегиде при комнатной температуре, клетки были пермеабилизированны на протяжении 15 мин в 0/5% TRITON Х-100. Локализацию анализируемого антитела определяли посредством применения флуоресцентно маркированного анти-IgG антитела при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Молекулы антител локализованы на поверхности GCC-экспрессирующих клеток, когда они располагались на льду. После инкубации при температуре 37°C, 5F9 продемонстриовали пунктирное окрашивание в пределах мембраны клетки, указывающее на интернализацию. В случае с клетками вектора никакой интернализации не было обнаружено.
Заключение о свойствах молекул анти-GCC антител. Большинство антител, полученных таким образом, было протестировано посредством многих исследований, описанных выше. Табл. 7 подытоживает свойства in vivo для каждого. (T84= Клетки человеческой опухоли толстой кишки, MCF7= клетки человеческой опухоли молочной железы, WB=вестерн-блоттинг, ГР^ммунопреципитация, IHC=иммуногистохимня; в интернализации были использованы клетки T84, по сравнению с клетками MCF-7).
- 96 030827
Таблица 7. Свойства молекул анти-GCC антител
ELISA FACS
АЬ TOK1 07-hIg TOK8 2-hIg HT29#2 HT29 T84 MCF7 WB IP IHC Интерна лизация
8F1 + +/- + +/- + +/- + +
3G1 + - + - + - - + + +
10В8 + - + - + - - + +
5НЗ + - + - + - - + + +
6Н8 + - + - + - - + +
8С2 + + + - - + + +
10С10 - - + - + - - +
10D3 + - + - + - + +
1D2 + - + - + - - +
4А12 + - + - + - - +
5F9 + - + - + - + + + +
1С9 + - + - + - - +
Abx-012 + + - + + +
Abx-015 + - + +
Abx-020 + + - + +
Abx-106 + + + -
Abx-198 + + + +
Abx-221 + + + +
тид-вызванный перенос ионов кальция в GCC-экспрессирующие клетки. Анализ cGMP был произведен в клетках HT29-GCC#18 в присутствии 50 нМ ST в присутствии или отсутствии молекул анти-GCC антител. Наблюдалось дозо-зависимое ингибирование переноса ионов кальция при применении 5F9. Другие антитела, 5H3 и Abx-338 также ингибировали перенос ионов кальция, вызывамый ST.
Оценка относительной афинности молекул анти-GCC антител
Относительные афинности (EC50; концентрация антитела для половины максимального связывания) некоторых молекул анти-GCC антител оценивали на основании измерений ELISA, в зависимости от TOK107-hIg, и на основании измерений FACS с применением GCC-экспрессирующими клетками. Следующая таблица демонстрирует некоторые результаты.
- 97 030827
Измерение афинности молекул анти-GCC антител.
Для измерения афинности анти-GCC антител 5F9 при температуре 22°C применяли систему BIACORE™ T100 (компания GE Healthcare, Piscataway, штат Нью-Джерси).
Стадия 1:
Моноклональное антитело 5F9 (Преп. A) разбавляли до 20 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, значение pH равнялось 4.0 и стандартный образец моноклонального антитела 5F9 (Преп. B) разбавляли до 10 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, значение pH равнялось. Каждое моноклональное антитело было ковалентно иммобилизовано с несколькими чипами CM4 BIACORE, посредством применения стандартного присоединения аминогруппы. Для каждого приготовленного чипа CM4, Преп. A 5F9 иммобилизовали по двум проточным ячейкам в пределах 75-100 EO, в то время как Преп. В 5F9 иммобилизовали по одной проточной ячейке в пределах 70-80 EO. Оставшуюся четвертую проточную ячейку каждого чипа CM4 использовали в качестве стандартного образца проточной ячейки.
Стадия 2: Концентрацию исходного раствора GCC-ECD-Fc (TOK107-hIg) определяли посредством применения методов, которые подробно описаны Pace и др. в Protein Science, 4:2411 (1995), and Pace and Grimsley in Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9 (2003).
Стадия 3:
Для каждого подготовленного чипа CM4, описанного в стадии 1, вводили GCC-ECD-Fc в течение 2 мин в диапазоне концентраций 202-1.6 нМ (2 серийных разведения), за которым следовало 7 мин диссоциации. Образцы были рандомизованным образом введены в трех повторностях с несколькими циклами введения буферов, рассеянные для двойного сравнивания со стандартным образцом. Чтобы получить более существенные данные скорости диссоциации, было проведено три дополнительных инъекции 101 нМ GCC- ECD-Fc и три дополнительные буферные инъекции, с временем инъекции, составляющим 2 мин и временем диссоциации, составляющим 4 ч. Применялась скорость потока, составляющая 100 мкл/мин для всех экспериментов и все поверхности были регенерированы с применением 20 с ипульса 10 мМ глицин-HCl (значение pH 2.0). Все образцы были приготовлены в подвижном буфере, который представлял собой Hepes-забуференный физиологический раствор, добавляли 0,005% полисорбата 20, значение pH 7.4 (HBS-P) с 100 мкг/мл БСА.
Стадия 4:
Все данные сенсорограммы (график поверхностного плазмонного резонанса в зависимости от времени) были обработаны с применением программного обеспечения Scrubber 2.0 (компания BioLogic Software, Кемпбелл, Австралия) и в целом соответствуют как 1:1 модели взаимодействия, включая термин для постоянной массопереноса 1<м, когда используются программное обеспечение CLAMP™ (Myszka и Morton Trends Biochem. Sci. 23:149-150 (1998)).
Модель 1:1 обеспечивает очень хорошее соответствие данным, пока уровни иммобилизации моноклонального антитела сохранялись достаточно низкими так, чтобы Rmax, полученный из анализа в целом данных сенсорграммы, составлял, по меньшей мере, ниже 12 EO для каждой поверхности. В большинстве случаев одна из двух поверхностей Преп. A 5F9 обладала значением Rmax, которое было слишком низким (ниже 2 EO) для достоверности кинетических измерений. Тем не менее, данные от двух проточных ячеек GCC-ECD-Fc, связывающихся с Преп. A 5F9 от того же самого чипа CM4, были одновременно соответствующими, если это было возможным. Когда поверхности моноклональных антител были приготовлены в результате более высокого Rmax(> 12 EO), то сенсорграммы ясно показывали сложные кинетики и, таким образом, модель 1:1 слабо соответствовала данным. Это не удивительно вследствие того, что GCC-ECD-Fc является бивалентной конструкцией и более высокая поверхностная плотность иммобилизованного моноклонального антитела, скорее всего, повышает вероятность того, что GCC-ECD-Fc сильно связывается с поверхностью. Репликации, полученные в этом исследовании, включают только те данные, которые соответствуют как 1:1 модели взаимодействия. Полученные KD и константы скорости всех репликаций для Преп. A 5F9 и Преп. B стандартного моноклонального антитела перечислены в табл. 9 и 10 соответственно.
Таблица 9. GCC-Fc, связывающееся с иммобилизованным моноклональным антителом 5F9 Преп. A
Репликация Rmax (ЕО) ка (M'V1) kd (s'1) Κο(πΜ)
А И Е06Х 105 1.19 X 10'5 112
В 8 Е20Х 105 1.10 X 10'5 91.7
С 5 Е07Х 105 2.15 X 10'5 201
D 9 1.22 ХЮ5 1.11 X 10'5 91.0
Е 6,4 9.64 X 104 1.77 X ΙΟ'5 184
Ср. (95% Подтв. Инт.) ЕЮ (0.13) ХЮ5 1.46 (0.59) ΧΙΟ'5 136 (65)
- 98 030827
Таблица 10. GCC-Fc, связывающееся с иммобилизованным моноклональным антителом 5F9 Преп. B
Репликация Rmax (ЕО) ка (M'V1) kd (s'1) Kd (πΜ)
F 9 9.68 X 104 7.64 X ΙΟ'6 78.9
G 8 1.20 X 105 1.24 X 10'5 103
Н 7 9.09 X 104 9.57 X ΙΟ'6 105
I 12 1.21 X 105 1.54 X 10'5 127
Ср. (95% Подтв. Инт.) 1.07 (0.25) ХЮ5 1.13 (0.54) X 10'5 103 (31)
Конъюгация токсинов с антителами
Майтансины.
Мышиные античеловеческие (МАЧ)-IgG-DM1 и анти-GCC-DM1 были получены в соответствии с одностадийным процессом получения цитостатических конъюгатов майтансиноидов, как описано в патенте США №6 441163.
Если кратко, то майтансиноиды конъюгировали с антителами посредством применения опубликованных процедуры. DM1 конъюгировали с антителами посредством применения гетеробифункционального кросслинкера SMCC (сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат; Chari и др. Cancer Research 52: 127-131 (1992). DM4 конъюгировали с антителами посредством применения гетеробифункционального кросслинкера SPDB (Widdison и др. J. Med. Chem. 49:4392-4408 (2006)). Конъюгированное антитело отделяли от не вступивших в реакцию и побочных продуктов реакции с помощью гельфильтрационной хроматографии, посредством применения колонки SEPHADEX™ G-25.
Ауристатины.
Конъюгация ауристатинов может быть выполнена посредством применения опубликованных процедур (например, Doronina и др., Nature Biotech., 21: 778-784 (2003)). В основном, ауристатины связываются с цистеинами цепей антитела. Связывание с цистеинами достигается, в первую очередь, посредством сокращения дисульфидных связей в молекуле антитела. Задачей управления процессом сокращения является ограничение сокращения некоторых, но не обязательно всех, междуцепочечных дисульфидных связей. Следовательно, ауристатины являются способными связаться со свободными цистеинами. Подавление реакции конъюгации сопровождается удалением побочных продуктов реакции и заменой буфера, для приведения к желательному составу.
Если кратко, то молекула анти-GCC антитела при 7,6 мг/мл является предварительно уравновешенной при температуре 37°C, и затем добавляют 15% объема 500 мМ бората натрия, значение pH 8.0, для того чтобы поднять значение pH до 7.5-8.0. Раствор также содержит 1 мМ DTPA. Антитело частично редуцируют, при помощи добавления 2.6 экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) на моль молекулы анти-GCC антитела и взбалтывают при температуре 37°C. После 28 мин раствор редуцированной молекулы анти-GCC антитела помещают на лед, затем незамедлительно обрабатывают 4,8-4,9 мол. экв. (в отношении молекулы анти-GCC антитела) линкер-лекарственное средство (например, mc-vc-MMAF или mc-vc-MMAE или mc-MMAF) в качестве 20,5 мМ раствора в ДМСО. Дополнительный ДМСО вводят для того, чтобы довести смесь до 10% ДМСО по объему. Реакционную смесь размешивают на льду в течение ~90 мин перед обработкой 5-кратным молярным избытком N-ацетил цистеина (относительно mc-vcMMAF). Конъюгат отделяют посредством фильтрования тангенциальным потоком, вначале получают концентрацию ~10 мг/мл, затем диафильтруют с применением ~10 диаобъемов ФСБ. Полученные конъюгированные лекарственными средствами антитела имеют среднее наполнение лекарственным средством, составляющее приблизительно четыре единицы линкер-лекарственное средство на антитело. Для удобства в следующих примерах и приложенных фигурах ауристатиновые иммуноконъюгаты упоминаются в следующем формате аббревиатур, независимо от наполнения лекарственного средства: Ab-vcMMAF относится к молекуле анти-GCC антитела, конъюгируемого с mc-vc-MMAF; Ab-vc-MMAE относится к молекула анти-GCC антитела, конъюгируемого с mc-vc-MMAE; и Ab-mc-MMAF относится к молекула анти-GCC антитела, конъюгируемого с mc-MMAF. Иммуноконъюгаты, содержащие определенные молекулы анти-GCC антител, упоминаются в том же формате, например, 5F9-vc-MMAF, 5F9-vcMMAE, и 5F9-mc-MMAF.
Для приготовления конъюгата лекарственного средства с антителами со средним наполнением лекарственного средства, составляющим приблизительно две единицы линкер-лекарственное средство на антитело, меняют протокол (выше), уменьшая количество TCEP на 50%. Количество линкера лекарственного средства также уменьшают на 50%. Соответствующий конъюгат лекарственного средства и антитела упоминают как Ab-vc-MMAF(2).
- 99 030827
Приготовление 5F9 vcMMAE
Применямый метод является похожим с общим методом, установленным выше, моноклональное антитело 5F9 конъюгировали с производным ауристатина, который обозначен как MMAE (Формула (XIII), посредством применения линкера vc (Val-Cit), описанным в настоящей заявке, для того чтобы получить иммуноконъюгат, который обозначен как 5F9 vcMMAE. Конъюгацию vc линкера с MMAE (компания Seattle Genetics, Inc, Ботелл, штат Вашингтон) проводили, как описано ранее (см., например, US 2006/0074008).
Если кратко, то раствор 17,8 мг/мл моноклонального антитела 5F9 в 100 мМ ацетата при значении pH 5.8 был доведен до значения pH 8 с помощью 0,3 М двухосновного фосфатома натрия, в результате чего получили концентрацию моноклонального антитела, которая составляла 11,3 мг/мл. Затем добавляли DTPA для установления окончательной концентрации реакционной смеси, которая составляла 1 мМ. Моноклональное антитело было затем частично редуцировано, при помощи добавления 2,28 молярного эквивалента TCEP (относительно молей моноклонального антитела) и затем смесь встряхивали при температуре 37°C на протяжении 1,5 ч. Частично редуцированный раствор моноклонального антитела затем охлаждали до температуры 4°C и к нему добавляли 4,4 мол. экв. vcMMAE (относительно молей антитела) в качестве 20,3 мМ раствора в ДМСО. Смесь размешивали на протяжении 30 мин при температуре 22°C, затем на протяжении 15 дополнительных мин после добавления 5 мол. экв. N-ацетилцистеина (относительно молей vcMMAE). Избыток подавленного vcMMAE и других компонентов реакции был удален посредством ультрафильтрации/диафильтрации иммуноконъюгата с применением 10 диаобъемов ФСБ, при значении pH 7.4. Полученный иммуноконъюгат обозначали как 5F9 vcMMAE, который имеет следующую формулу:
где Ab представляет собой моноклональное антитело 5F9 и m равно от 1 до 8. Средняя нагрузка лекарственного средства (m) составляла приблизительно 3,6.
Анализ цитотоксичности.
Чтобы установить способность каждого антитела к связыванию, интернализировать и уничтожать экспрессирующие клетки-мишени, был выполнен анализ цитотоксичности. В указанном исследовании клетки были инкубированы с различными концентрациями неконъюгированного первичного анти-GCC антитела и фиксированной нетоксичной концентрацией DM1-конъюгированного античеловеческого вторичного антитела Fc (косвенная цитотоксичность), или с различными концентрациями токсина, конъюгированного анти-GCC моноклональным антителом (непосредственная цитотоксичность). Жизнеспособность клеток устанавливали при помощи анализа WST после инкубации на протяжении 4 дней. Относительная активность человеческого анти-GCC антитела на клетках 293-GCC#2 показана в табл. 8, ее определяли посредством применения DM1, конъюгированного моноклональным мышиным античеловеческим антителом IgG (МАЧ-IgG очищали от клона HP607 (CRL1753, ATCC). 5F9 и 229 являются наиболее активными анти-GCC моноклональными антителами, ЛД50 которых составляет 26 и 78 пМ. Хотя здесь и не показано, ошибка в основном находится в пределах 20% указанных средних чисел, как установлено диапазоном повторов или стандартным отклонением, которое составляет >2 повторов.
- 100 030827
Таблица 11. Результаты анализа цитотоксичности для анти-GCC антител на клетках 293-GCC#2
Связывание с поверхностью клетки.
Связывание неконъюгированного 5F9 или 5F9, конъюгированного с ауристатинами, оценивали в непрямом иммунофлюоресцентном исследовании посредством применения проточной цитометрии. 1 х106 клеток/лунку добавляли в 96-луночный планшет V-образным дном и инкубировали на льду на протяжении 1 ч с серийными растворениями антитела до 1- 0,001 мкг/мл. Клетки промывали дважды 3%-й ФБС в ледяном ФСБ и инкубировали с 1:200 мышиным античеловеческим PE IgG (Southern Biotech 204309) на протяжении 1 ч на льду. Клетки промывали снова и анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре BD FACS Canto II. Данные проанализированы посредством применения программного обеспечения FACS Canto II и определяли среднее значение интенсивности флюоресценции.
Картирование антигенных детерминант.
Множественные стратегии были предприняты для того, чтобы идентифицировать антигенные де терминанты.
Набор пептидов,
Были получены 20-мерные пептиды с перекрытием, составляющим 15 а. с, охватывающие внеклеточный домен (ВКД) в трансмембранной области GCC (а.с. 1-440). Пептиды синтезировали и обеспечивали в качестве набора, иммобилизованные на предметных стеклах. Наборы гибридизировали с каждым из анти-GCC антител, для того чтобы определить, являются ли линейные пептиды способными к связыванию. Abx-198 связываются с пептидами 55 и 56, в то время как антитела 3G1, 8F1 и 10B8 связываются с пептидами 55, 56 и 57.
Последовательность,^VDLFNDQYLEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEQ ш N0:225) заполнена этими пептидами. Область наложения среди пептидов представляет собой LEDNVTAPDY (SEQ Ш N0:314) АЬх-012, Abx-338 и Abx-106 связывает пептиды 71 и 72.
Последовательность fahafrnltfegydgpvtlddwgdv (SEQ id N0:226) и последовательность RNLTFEGYDGPVTJi,q (SEQ ID N0:315) перекрывает два пептида.
Поверхность клетки, связывающаяся с укороченными мутантами GCC.
Были получены укороченные мутанты GCC ECD (зрелый пептид FL и 8 укороченных (Δ1-32, Δ1-49, Δ1-94, Δ1-128, Δ1-177, Δ1-226, Δ1-279, Δ1-229 и Δ1-379) в качестве FLAG-меченных конструкций (pFLAG-CMV-3), представляющих приблизительно 50 а.с. делеционных инкрементов. Конструкции экспрессировались в 293 клетках, за чем следовала иммунопреципитация молекулы анти-GCC антитела и вестерн-блоттинг антигенной детерминанты FLAG в лизатах 293 клеток, трансфицированных мутантами GCC ECD. Антитело 5F9 связывает клетки с Δ1-32 мутациями, но не клетки с Δ1-49 мутациями. Связывание 5F9 к GCC было потеряно, когда белок укорачивался до пределов 33-50 а.с, предлагая, что эта область вовлечена в распознавание 5F9 ее связывания антигенной детерминанте на GCC. Тем не менее,
- 101 030827 поскольку крысиные и мышиные последовательности GCC идентичны человеческому GCC в указанной области и 5F9 не связывает мышиные или крысиные GCC, то антитело 5F9, вероятно, связывает конформационную антигенную детерминанту, образованную присутствием аминокислот 33-50 из человеческого GCC.
Пример 2. Выбор токсин-линкера/исследование ADC
В стратегии конъюгата лекарственного средства и антитела (ADC) при конъюгации очень активных токсинов с антителами цитотоксичность токсина может быть направлена к опухолям, нацеленным на мишень способом, доставляя токсин к антигену, который экспрессирует клетки опухоли, не затрагивая антиген-отрицательные клетки в нормальных тканях, таким образом уменьшая общую токсичность. Ауристатин (аналог доластатина 10) и токсины класса майтансинов были определены как ADC с анти-GCC моноклональнвм антителом. Указанные токсины все являются ингибиторами полимеризации микроканальца, действующие как антимитотики. Исследования, в которых клетки контактировали со свободными токсинами, показали, что цитотоксичность свободных токсинов не отличается в отношении клеток, которые экспрессируют GCC, и в отношении клеток контроля без GCC. Указанные свободные токсины были активными по сравнению с 293-вектором, клетками 293-GCC#2, в ПГ29-векторе по сравнению с клетками HT29-GCC#5, как показано в табл. 9.
Таблица 12. Цитотоксичность свободных токсинов
ММАЕ MMAF DM1 DM4
Клеточная линия ЛД50 ЕД ЛД50 ЕД ЛД50 ЕД ЛД50 ЕД
293-вектор 0,07 6 3,37 2,34 2,83 2,00 0,79 0,79
личаются и затрагивают устойчивость линкера. Устойчивость линкера затрагивает терапевтическое окно, воздействуя на высвобождение лекарственного средства в кровь или в ткани, не являющиеся мишенями, в противовес высвобождения лекарственного средства в опухоли. Идеальный линкер ADC обладает высокой устойчивостью, находясь в крови, но при этом эффективным высвобождением в клетках-мишенях.
Ауристатины
Оценивали три пары ауристатин-линкер. Для того, чтобы в первую очередь оценить указанные конъюгаты in vivo, и затем определить, линкер-токсин в большом масштабе в исследованиях in vitro, 5F9 конъюгировали с vcMMAE, vcMMAF и mcMMAF (20 мкг на конъюгат).
Ауристатины представляют собой синтетические токсины, относящиеся к природным продуктам доластатина 10. MMAE и MMAF едва различаются, где MMAF обладает группой карбоновой кислоты в положении R2, что уменьшает клеточную проницаемость и активность в качестве свободного токсина. MMAE представляет собой Pgp носитель нагнетания лекарственным средством, в противовес MMAF.
Ауристатины конъюгируют с междуцепочечными цистеинами посредством процесс частичного редуцирования антитела, реакции с производным препарата малеимидо, которая подавляется излишком цистеина, концентрированием и заменой буфера в ФСБ. Ауристатины могут быть прикреплены к сенситивному дипептидному линкеру катепсин B, который расщеплен в результате клеточного поглощения, или к нерасщепляющемуся линкеру.
В vc-МоноМетилАуристатин линкере валинцитрулин дипептидное соединение прикреплено к лекарственному средству посредством группы н-аминобензилкарбамата (ПАБ) и к антителу посредством группы конъюгации малеидимидо капроила. Вследствие интернализации, дипептидный линкер расщеплен посредством катепсина B лизосомальной протеазы, группа ПАБ саморазрушается и свободный токсин высвобождается. Этот линкер был разработан, чтобы поддержать устойчивость сыворотки, в то время когда максимизуется внутриклеточное высвобождение лекарственного средства, опосредованное катепсинрм B.
Ауристатины могут также быть связаны с антителами посредством нерасщепляющихся линкеров, таких как MMAF, непосредственно прикрепленных к группе конъюгации малеимидо, с непептидазным сенситивным линкером. MC, конъюгированные ADC, также эффективны в уничтожении клетокмишеней.
Механизм высвобождения лекарственного средства для нерасщепляющегося ауристатиновых конъюгатов, как думают, является следствием общей деградации антитела в лизосомах. В результате исследования LC/MS было сообщено, что конъюгаты Ab-mcMMAF высвобождают токсин в форме единственного цистеин-аддукта.
- 102 030827
Связывание конъюгатов лекарственного средства и антител
Все конъюгаты антитела 5F9 и лекарственного средства одинаково хорошо связаны с клетками 293GCC#2. Табл. 10 показывает средние значения интенсивности флюоресценции конъюгатов 5F9 при увеличивающихся концентрациях клеток 293-GCC#2. Другие исследования определили, что конъюгат 5F9SPDB-DM4 связывает клетки 293-GCC#2 в зависимости от концентрации, в то время как антитело 209SPDB-DM4 не связывает.
Таблица 13. Диаграмма анализа СИФ связывания конъюгатов 5F9 и 5F9 в клетках 293 GCC #2
мкг/мл конъюгата 5F9 или 5F9
0,001 0,004 0,016 0,063 0,25 1
5F9 500 937 2465 6615 7816 8026
vcMMAE 445 696 1787 4854 7296 7416
vcMMAF 440 707 1502 4830 7563 7779
mcMMAF 483 776 2106 5353 7398 7585
Конъюгаты 5F9-ауристатин токсина были протестированы в прямом исследовании цитотоксичности множества клеток, которые были трансфицированы GCC нуклеиновой кислотой, и отобраны для экспрессии GCC. Обзор уровня поверхностной экспрессии GCC показал, что клетки 293 GCC#2 экспрессируют большое количество GCC; HP29#2 и клетки CT 26 #2.5 экспрессируют GCC от среднего до низкого уровней; клетки CT 26 #2.5 экспрессируют GCC на высоком уровне; и HT 29 GCC #5 и HT 29 GCC #18 экспрессируют небольшое количество GCC. Табл. 11 показывает компиляцию многократных исследований, подводя итоги данных цитотоксичности для трех ауристатиновых конъюгатов в клетках, экспрессирующих мишени, или в клетках дикого типа или в клетках векторного контроля. Повышенное уничтожение мишеней наблюдается во всех случаях 5F9-конъюгированных токсинов на клетках 293 GCC #2, с сильно увеличенным окном, когда применяют MMAF, в противовес MMAE. Обе расщепляющиеся и нерасщепляющиеся формы MMAF также были активными. В качестве негативного контроля конъюгат лекарственного средства и антител были также созданы с антителом sc209, которое является человеческим моноклональным антителом IgG1, индуцированным по сравнению с несвязанной мишенью, с отсутствием реагентности к GCC. Прямой анализ цитотоксичности с 209 ADC по сравнению с 5F9 vcMMAF ADC показал повышенное уничтожение клеток-мишеней в моделях клеток 293 и в моделях клеток HT29. Сравнение активности 5F9-конъюгированного токсина по клеточным линиям показывает, что уровень цитотоксичности имеет некоторую корреляцию с количеством GCC, который экспрессируется клетками. Указанные данные предполагают, что, по меньшей мере, некоторые клеточные линии, экспрессирующие большинство GCC, были более восприимчивыми к цитостатической активности конъюгата, чем клетки, экспрессирующие более низкое количество GCC. См. пример 1 для соответствующего количества GCC на клетку. Другим фактором, который влияет на различие уровней цитотоксичности, может быть различие в интернализации или внутриклеточный процессинг конъюгатов, который может варьироться в зависимости от клеточный линий дикого типа.
- 103 030827
Таблица 14. Цитотоксичность анти-GCC ауристатиновых ADC
ЛД 50 (нМ) конъюгатов 5F9 ЛД50 (нМ) конъюгатов 209
Клеточная линия vcMMAE vcMMAF mcMMAF
293 Вектор 128 > 10 > 10
293 GCC # 2 0,37 0,001 0,002
293 Вектор 1,8 >10 >10
293 GCC # 2 0,13 0.005 0.007
293 Вектор >10 >10
293 GCC # 2 0,0004 >10
НТ 29 WT 84 > 10 > 10
НТ 29 GCC #2 24,1 0,127 3,1
СТ 26 WT >500 > 10 > 10
СТ 26 GCC #2.5 >500 > 10 > 10
СТ 26 GCC #32 267 0,004 0,064
НТ 29 вектор 520,6 > 10,000 > 10,000
НТ 29 GCC #5 653,5 563,2 > 10,000
НТ 29GCC#18 554,6 > 10,000 > 10,000
НТ29 0,93 >10 >10
НТ29 GCC#5 0,59 0,32 >10
НТ29 >10 >10
НТ29 GCC#5 0,035
Если указанное провести in vitro с равной эффективностью между mc и vcMMAF, то более высокий предполагаемый уровень MTD для mcMMAF подтвердит большее терапевтическое окно для этого конъюгата.
Майтансины
5F9-майтансин ADC показал активное повышенное уничтожение мишеней в клетках 293-GCC#2 (табл. 12). Интересно, что оба конъюгата 5F9-майтансин показывают повышенное уничтожение мишеней в моделе 293, однако никакого повышенного уничтожения мишеней не наблюдалось в модели HT29, в связи с чем возникает вопрос о полезности указанной модели для оценки майтансин конъюгатов in vitro. Опять-таки, причины указанного различия не полностью объяснимы, но могут быть приписаны различной плотности рецептора и/или различию в интернализации процессинга конъюгатов в пределах клетки. В качестве негативного контроля, был также создан конъюгат лекарственного средства и антитела с антителом sc209, которое является человеческим моноклональным антителом IgG1, направленным к несвязанной мишени, с отсутствием реагентности к GCC. Прямой анализ цитотоксичности с 209 ADC по сравнению с 5F9 ADC показал повышенное уничтожение клеток-мишеней в модели клеток 293 со всеми конъюгатами 5F9. В модели клеток HT29, конъюгаты 5F9-DMx и конъюгаты 209-DMx одинаково хорошо уничтожают, показывая ненацеленный специфический механизм уничтожения в указанных клетках.
- 104 030827
Таблица 15. Цитотоксичность анти-GCC майтансина ADC
ЛД50 (нМ)
Клеточная 5F9-SMCC- 209-SMCC- 5F9-SPDB- 209-SPDB-
ЛИНИЯ DM1 DM1 DM4 DM4
293 вектор 25,3 10,4
293 GCC&2 <0,004 <0,004
293 вектор 32 И 13 7,4
293 GCC&2 <0,000004 6,7 <0,000004 4,8
НТ29 22,4 7,7
НТ29 GCC#5 20,8 9,1
НТ29 22 12 4,8 2,1
НТ29 GCC#5 30 22 5,8 4,2
Пример 3. Оценка in vitro
Модели опухоли:
Цитотоксичность 5F9 ADC in vitro была оценена на моделях ксенотрансплантантных мышей. Предварительная работа in vitro была проделана с клеточными линиями HT29-GCC#5 и #18. Клеточная линия 293-GCC#2 также была протестирована in vitro на рост и разработана как серийно трансплантируемая троакарная модель.
Чтобы разрешить вопрос относительно того, является ли уровень экспрессии GCC в ксенотрансплантантной модели соответствующим уровню экспрессии GCC у пациентов с метастатическим раком толстой кишки, уровни экспрессии GCC сравнивали с исследованиями ИГХ ксенотрансплантантной ткани, человеческих первичных опухолей толстой кишки и метастаз. Выборку свежих замороженных клеточных линий и тканей использовали для подсчета GCC посредством rIHC с мышиным моноклональным антителом к GCC 3G1. Для подсчета ИГХ, был осуществлена бальная оценка, посредством применения полуколичественной 0-3 системы бальной оценки. Если в модели опухоли уровни GCC < клинических уровней GCC, то моделирование вероятно будет подходить или переоценивать дефекты, необходимые для клинического исследования. Если в модели опухоли уровни GCC> клинических уровней GCC, то моделирование может недооценить дефекты, необходимые для клинического исследования.
Когда присутствовала некоторая вариабельность в экспрессировании GCC в метастатических образцах, то экспрессия клетками HT29-GCC#5 и #18 находилась в диапазоне многих из метастатических образцов. Посредством ИГХ, окрашивание GCC на клетках HT29-GCC#5 и #18 было равным или ниже чем на метастатических клетках. Указанные данные предполагают, чтобы наши модели опухоли экспрессируют GCC на уровнях, сопоставимых с уровнями, выявленными в клинических образцах metCRC.
Табл. 16 представляет подсчет флюоресценции для различных тканей, собранных на протяжении 192 часов временной точки со средними значениями для трех представленных животных. 5F9 предпочтительно накапливается в опухолях HT29-GCC#5 по сравнению с опухолями HT29-вектора, в то время как 209 не показал значительного накопления. Этот результат дает обоснование того, что конъюгаты лекарственного средства и антитела 5F9, как могли ожидать, накапливается в GCC, экспрессирующих опухоли. Во всех других исследованных тканях имелись небольшие различия в уровнях накопления 5F9 по сравнению с моноклональным антителом 209.
In vitro распределение меченых 5F9 в HT29-GCC#5 и HT29-векторе мышей, имеющих опухоль
Радиографическое исследование мышей, имеющих опухоль, было выполнено с целью оценить направленную доставку препарата к опухоли и in vitro биораспределение анти-GCC антитела 5F9 и негативный контроль антитела sc209 (человеческое моноклональное антитело IgG1, направляемого к несвязанной поверхности клеток-мишеней). Антитела были мечены 1nIn, посредством использования DTPA как бифункционального хелатора. In vitro поведение, включая направленную доставку препарата к опухоли и биораспределение в нормальных тканях в динамике по времени, было исследовано с мышиной моделью двойной опухоли как с GCC(-), так и с GCC(+) опухолями. Были получены изображения in vitro (ОФЕКТ/КТ), и при этом применяли подсчет радиоактивности ткани, чтобы обеспечить пространственное разрешение.
Подкожные опухоли выращивали в голых мышей, с HT29-векторными опухолями справа и HT29GCC#5 опухоли слева. Антитела дозировали при 0,3 мКи = 15 мкг на животное. Было три животных на группу, и группы собирали на 1, 24, 48, 72, 120 и 192 ч.
Исследование тканей животных в группе 192 ч показало, что как 5F9, так и 209 накопили до подобной степени в большинстве нормальных тканей (например, кровь, сердце, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, мускулы и кожа), и в опухолях контроля HT29-вектора. Ab 209 накапливается в чуть
- 105 030827 более высоком уровне, чем 5F9 в печени, и 5F9 накапливается в чуть более высоком уровне, чем 209 в легких, селезенке и почках. В опухолях HT29-GCC#5, 5F9 предпочтительно накапливается на уровне, более чем два раза выше, чем указанные уровни 209. Этот результат показал обоснование, что конъюгаты антитела и 5F9 лекарственного средства, как могли ожидать, накапливаются в GCC, которые экспрессируют опухоли.
Чтобы понять кинетику накопления антитела в опухолях, данные опухоли для каждого антитела были получены для все временных точек на протяжении исследования. Единственной тканью, которая показала накопление, является антитело 5F9 в GCC, которые экспрессируют опухоли. Уровень радиоактивности во всех других тканях оставался относительно небольшим, с небольшим различием между уровнями 5F9 и уровнями 209. 5F9 предпочтительно накапливается в опухолях HT29-GCC#5, в то время как 209 не показал накопления. Этот результат продемонстрировал обснование того, что конъюгаты антитела 5F9 и лекарственного средства, как могли ожидать, накапливаются в GCC, которые экспрессируют опухоли.
Таблица 16. Накопление 111In-меченного специфического моноклонального антитела GCC, но не контрольного моноклонального антитела в опухолях, которые экспрессируют GCC
Средний % ИК 5F9 Средний % ИК кнтр IgG
1ч 2,816+/-0,133 2,494+/-0,167
24ч 3,057+/-0,107 3,010+/-0,630
72ч 4,485+/-1,029 3,564+/-0,152
120ч 5,162+/-1,012 3,412+/-0,048
192ч 6,550+/-1,015 2,782+/-0,085
Накопление меченого 5F9 в GCC, экспрессирующего опухоли, на протяжении 7 дней было поддержано один раз в неделю в соответствии со схемой дозирования.
Экспериментальное исследование эффективности в опухолях HT29-GCC#5 s.c.
Исследование были проведено для того, чтобы определить эффективные конъюгаты и режимы дозирования у мышей, имеющих опухоли HT29-GCC#5. Мышей дозировали единственными или многократными дозами. Указанные исследования определили, что существовала токсичность при слишком частом дозировании при более высоких уровнях конъюгата токсина (например, 150 мкг/кг 5F9vcMMAF на один раз в три дня х 5 применений). Другое исследование определило, что один раз в 14 дней х 5 применений был слишком редким в указанной модели, чтобы позволить конъюгатам токсина показать существенную эффективность по сравнению с контролем. Дополнительно, исследование фармакодинамики с конъюгатами майтансиноид-антитело в указанной модели продемонстрировало зависимое от дозы фосфогистонное накопление только с токсином DM4, но не с токсином DM1. Другое исследование в указанной модели показало некоторое ингибирование роста опухоли посредством неспецифического конъюгата 209-токсин. Указанные результаты указали, что необходимо дать оценку другим моделям in vitro.
Исследования фармакокинетики/фармакодинамики с 5F9 ADC на мышах, имеющих опухоли 293-GCC#2
Альтернативная модель опухоли использовала клетки 293-GCC#2. Было выполнено исследование фармакодинамики для 5F9 ADC у мышей, имеющих опухоли 293-GCC#2, Мышей дозировали единственными дозами 5F9vcMMAF при 75 или 150 мкг/кг, и затем брали сыворотку во временные точки с 1 ч до 4 дней для анализа фармакодинамики фосфогистонного H3, для того чтобы протестировать антимитотическое действие токсина на клетки опухоли. Фосфо-гистон H3 обнаруживался антителом (компания Upstate Biotechnology, сейчас Millipore, Биллерика, штат Массачусетс) окрашивая покрытые парафином участки опухолей. Данные в табл. 17 показывают, что каждый из ADC вызвал существенное увеличение pH3 позитивных клеток популяции в опухолях, что указывает на то, что каждые из них, как при дозе токсина 75, так и при дозе токсина 150 мкг/кг в состоянии достигать опухолей и имеют желательный антимитотический эффект на клетки опухоли.
- 106 030827
Таблица 17. Фармакодинамичесский ответ, как установлено посредством блокировки клеток в митозе (% pH3 положительные клетки опухоли) после единственной в.в. дозы 5F9 ADC
Средний % клеток опухоли положительного рНЗ ЕД
Контроль растворителем 2,556801 2,37707
5F9-vcMMAE 75 мкг/кг 1ч 4,525187 0,178882
4ч 2,551616 1,688255
8ч 4,243988 0,352938
24ч 9,8199 4,82057
48ч 8,692061 4,756786
96ч 8,628345 1,065456
5F9-vcMMAE 150 мкг/кг 1ч 3,334943 1,351667
4ч 2,78543 1,690216
8ч 4,575611 1,130484
24ч 13,78776 3,343155
48ч 14,26067 5,448921
96ч 14,67942 1,827724
- 107 030827
5F9-vcMMAF 75 мкг/кг 1ч 4,235245 0,617585
4ч 4,18364 0,846752
8ч 4,930098 0,54746
24ч 20,22484 2,453935
48ч 9,920771 3,788795
96ч 10,38187 1,896461
5F9-vcMMAF 150 мкг/кг 1ч 3,465674 1,341187
4ч 4,416646 0,807636
8ч 8,594385 4,005021
24ч 21,53718 7,25212
48ч 15,15814 4,28407
96ч 11,12288 2,150476
5F9-mcMMAF 75 мкг/кг 1ч 5,365582 1,14198
4ч 4,044478 0,992449
8ч 8,228597 3,098222
24ч 14,10734 1,611093
48ч 19,37223 8,146504
96ч 7,749388 1,180759
5F9-mcMMAF 150 мкг/кг 1ч 3,212482 0,509604
4ч 4,722554 1,577531
8ч 9,105349 5,963128
24ч 27,51416 10,96057
48ч 13,34043 3,414961
96ч 15,60917 3,386154
В подобных исследованиях устанавливали уровни фосфогистона в 293-GCC#2 мышей, имеющих опухоль, обработанных 5F9vcMMAF, 5F9-SPDB-DM4 и 5F9-SMCC-DM1. Мышей дозировали единственными дозами при 150 мкг/кг, и сыворотку брали во временных точках от 1 ч до 21 дня для анализа фармакокинетики как всех антител, так и конъюгированных токсином антител. Процент фосфогистона H3 положительных клеток в опухолях 293-GCC#2 увеличился в ответ на все три ADC: 5F9vcMMAF, 5F9SMCC-DM1 и 5F9-SPDB-DM4. Максимальные уровни фосфогистона H3 были в 3-5 раз больше базовых показателей, с пиками на 24 ч после инъекции.
Исследование эффективности с 5F9vcMMAF и 5F9-DMx в опухолях 293-GCC#2 s.c.
5F9-SPDB-DM4, 5F9-SMCC-DM1 и 5F9vcMMAF были протестированы на эффективность в 293GCC#2 модели опухоли в двух дозах (75 мкг/кг и 150 мкг/кг токсина), на один раз в 14 дней х 5 применений. Специфически, это исследование включало контроль растворителем, Sc209-DM1 (150 мкг/кг DM1 экв), Sc209-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв), Sc209-vcMMAF (150 мкг/кг MMAF экв), 5F9-DM1 (150 мкг/кг DM1 экв), 5F9-DM1 (75 мкг/кг DM1 экв), 5F9-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв), 5F9-DM4 (75 мкг/кг DM4 экв), 5F9-vcMMAF (150 мкг/кг MMAF экв), и 5F9-vcMMAF (75 мкг/кг MMAF экв). Использовали самок мы
- 108 030827 шей Taconic, имеющих клетки 293-GCC#2 (10 мышей на группу).
Фиг. 1 изображает рост опухоли в 293-GCC#2 у мышей, имеющих ТКИН, обработанных 5F9vcMMAF,-DM1, H-DM4 по схеме один раз в 14 дней. Зависимая от дозы эффективность наблюдалась с 5F9-SPDB-DM4 в модели 293-GCC#2, в то время как контроль 209-SPDB-DM4 не имел никакого эффекта. 5F9-SMCC-DM1 был также эффективен, однако меньше чем 5F9-SPDB-DM4 при 150 мкг/кг. 5F9vcMMAF (75 мкг/кг и 150 мкг/ кг) было самым эффективным, однако 209vcMMAF также имело некоторую активность. Поэтому при указанных дозах и схемах, 5F9-SPDB-DM4 был наиболее эффективным дифференциал по сравнению с его контрольным конъюгатом.
Исследование эффективности с 5F9vcMMAF и 5F9-DMx в опухолях 293-GCC#2 s.c.
5F9-SPDB-DM4 и 5F9-SMCC-DM1 были протестированы на эффективность в модели опухоли 293GCC#2 в двух дозах (75 мкг/кг и 150 мкг/кг токсина) при дозе 1 раз в 7 дней х 5 применений. Специфически, это исследование включало контроль растворителем, один 5F9 (15 мг/кг), DM1 (300 мкг/кг), DM4 (300 мкг/кг), Sc209-DM1 (150 мкг/кг DM1 экв.), Sc209-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв.), Sc209-vcMMAF (150 мкг/кг MMAF экв.), 5F9-DM1 (150 мкг/кг DM1 экв.), 5F9-DM1 (75 мкг/кг DM1 экв.), 5F9-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв.), и 5F9-DM4 (75 мкг/кг DM4 экв.). Использовали самок мышей Taconic, имеющих клетки 293-GCC#2 (10 мышей на группу).
Исследование эффективности с ауристатиовымин конъюгатами в опухолях 293 GCC#2
Мышей с опухолью 293 GCC#2, имеющих ТКИН, обрабатывали конъюгатами 5F9 с vc MMAE, vcMMAF или mcMMAF в трех дозах по сравнению с конъюгатами 209 указанных токсинов или со свободными токсинами, или контролем растворителем. Дозы вводили в.в. 1 раз в 7 дней х 4 применения. Опухоли отбирали в дни: 3, 7, 10, 13и17. Опухоли мышей обрабатывали контрольными реагентами, демонстрировавшими непрерывное увеличение в объеме. Опухоли обрабатывали конъюгатами 5F9 и ауристатина, которые показали дозо- и время-зависимое ингибирование указанного рост опухолей. Табл. 18 предоставляет подведение результатов (ИРО= ингибирование роста опухоли, О/К=обработка/контроль, ЗРО= задержка роста опухоли, ПО/ЧО=полный ответ/частичный ответ; p значение=величины, имеющие статистическое значение, НБ=не существенно).
Таблица 18. Анализ Ауристатин ADC в 293 GCC#2 мышей, имеющих опухоль.
Г руппы ИРО ОК ЗРО по/чо P значение
209-vcMMAE 300 мкг/ кг 24,5 0,76 0,9 0 0,38>0,05 NS
209-vcMMAF 150 мкг/ кг 29,4 0,71 1,4 0 0,27>0,05 NS
209-шсММАЕ 150 мкг/ кг 36,5 0,63 1,4 0 0,15>0,05 NS
Free ММАЕ 300 мкг/ кг 35,6 0,64 2 0 0,18>0,05 NS
Free mcMMAF 150 мкг/ кг -3,4 1,03 -1,3 0 0,73>0,05 NS
5F9-vcMMAE 300 мкг/ кг 96,9 0,03 9/10 PR <0,001
5F9-vcMMAE 150 мкг/ кг 83,5 0,17 2/10 PR <0,01
5F9-vcMMAF 150 мкг/ кг 97 0,03 9/10 PR <0,001
5F9-mcMMAF 150 мкг/ кг 97 0,03 9/10 PR <0,001
5F9-vcMMAE 75 мкг/ кг 54,5 0,45 4,4 0,01<p<0,05
5F9-vcMMAF 75 мкг/ кг 88,5 0,12 6/10 PR <0,001
5F9-mcMMAF 75 мкг/ кг 87,5 0,13 7/10 PR =0,001
5F9-vcMMAF 37.5 м кг/ кг 65,2 0,35 7,1 =0,01
5F9-mcMMAF 37.5 мкг/ кг 63,6 0,36 5,8 =0,01
Все три из указанных ADC были эффективны в моделях 293 GCC#2 по схеме применения 1 раз в 7 дней. 5F9-vcMMAF и 5F9-mcMMAF являются более активными чем 5F9-vcMMAE, который коррелирует in vitro с PDOM (pHisH3) и in vivo данными цитотоксичности.
Исследование эффективности с 5F9vcMMAF и 5F9-DMx в опухолях T84 s.c.
5F9-SPDB-DM4 и 5F9-SMCC-DM1 были протестированы на эффективность в модели опухоли T84 в двух дозах (75 и 150 мкг/кг токсина) при 1 раз в 7 дней х 5 применений. Специфически, это исследование включало контроль растворителем, одно 5F9 (15 мг/кг), DM1 (300 мкг кг), DM4 (300 мкг кг), Sc209DM1 (150 мкг/кг DM1 экв.), Sc209-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв.), Sc209-vcMMAF (150 мкг/кг MMAF экв.), 5F9-DM1 (150 мкг/кг DM1 экв.), 5F9-DM1 (75 мкг/кг DM1 экв.), 5F9-DM4 (150 мкг/кг DM4 экв.), и 5F9DM4 (75 мкг/кг DM4 экв.). Использовали самок мышей Taconic, имеющих клетки T84 (10 мышей на группу).
Иммуногистохимия
Обнаружение и измерение относительного количества GCC в тканях, таких как биопсии и ксенотрансплантанты может быть выполнено иммуногистохимией. Замороженные части ткани фиксировали
- 109 030827 в 1:1 растворе ацетона и метанола на протяжении 20 мин при комнатной температуре. Предметные стекла промывали в 1 х ФСБ на протяжении 5 мин. Предметные стекла обрабатывали с помощью автоматического красящего устройства, такого как Ventana Discovery XT (компания Ventana Medical Systems, Тусон, штат Аризона), используя указанный изготовителями буфер реакции. Анти-GCC антитела растворяли до 5 мкг/мл в 5%-й сыворотке козы. Для человеческого анти-GCC антитела, например, 5F9, обнаруживаемым вторичным антителом является 1:500 раствор козьего античеловеческого биотинилированного антитела в протеиновом блоке Dako (компания Dako, Carpinteria, штат Калифорния). После автокрасящего процесса и реакции антитела, предметные стекла удаляют из автокрасящего устройства, промывают в реакционном буфере, дегидрированном посредством стандартных серий до ксилола, и ополаскивая покровные стекла в среде препарата на основе ксилоле.
Исследование эффективности ADC в первичной модели опухоли
Модели первичной колоректальной карциномы и рак желудка разрабатывались как подкожные опухоли у мышей. 5F9-vcMMAE и 5F9-mcMMAF ADC тестировали в PHTX-11c у мышей, имеющих первичную опухоль. Дозы вводили в.в. при 1 разу в 7 дней х 4 применения. Конъюгаты токсинов с 209, вводили для контроля.
Антиопухолевая активность ADC в модели первичной опухоли
Проводили два подобных исследования для того, чтобы определить in vitro антиопухолевую активность 5F9-vcMMAE, и для того, чтобы сравнить антиопухолевую активность 5F9-vcMMAE со свободным токсином MMAE и неимунным vcMMAE конъюгатом токсина и антитела (209-vcMMAE) в PHTX9c первичной человеческой опухоли толстой кишки у ксенотрансплантантных мышей при различных дозах и схемах применения, и для того, чтобы определить повторный рост кинетики после обработки. Самкам мышей, имеющих CB-17 ТКИН (возраст восемь недель), были инокулированы подкожно (ПК) в пах с фрагментами опухоли PHTX-9c (2 мм х 2 мм). Рост опухоли монитор или дважды в неделю, посредством применения штангенциркуля с нониусом, и вычисляли средний объем опухоли, посредством применения формулы (0,5 х [длина х ширина2]). Когда средний объем опухоли достигал приблизительно 150 мм3 (Исследование A) или 160 мм3 (Исследование B), животные были рандомизированы в группы обработки (n = 10/группу для Исследования A и n = 9/группу для Исследования B).
Мышей обрабатывали (Исследование A) один раз в неделю (QW), со схемой применения (3 дозы) с 0,938, 1,875, 3,75, или 7,5 мкг/кг 5F9-vcMMAE внутривенно (в.в.) на протяжении 20 дней, или контроля, который включал растворитель (0,9% физиологического раствора), 0,075 или 0,15 мкг/кг MMAE в.в. при схеме применения QW, или 1,875 или 3,75 мкг/кг 209-vcMMAE в.в. при QW, в схеме применения на протяжении 20 дней. Во втором исследовании (Исследование B), мышей обрабатывали с 0,938, 1,875, 3,75, 7,5 или 10,0 мкг/кг 5F9-vcMMAE в.в. при схеме применения QW (3 дозы) или 3,75 мкг/кг в.в. при схеме применения дважды в неделю (BIW) (6 доз) или вводили контроль, включающий растворитель, 7,5 или 10 мкг/кг 209-vcMMAE, или 0,135 или 0,18 мкг/кг MMAE вводили в.в. при схеме применения QW на протяжении 20 дней. Дозы вводили в дни 1, 8, и 15 для схемы применения QW, и в дни 1, 4, 8, 11, 15 и 18 для схемы применения BIW. Дозу свободного MMAE устанавливали так, чтобы она соответствовала количеству MMAE в дозах иммуноконъюгат в соответствии со следующим объяснением: эквивалентная доза MMAE составляет 1,8% дозы MLN0264. Эквивалентная доза линкера + MMAE составляет 4% дозы 5F9-vcMMAE. Указанные вычисления основаны на в среднем 3,9 молекул MMAE на антитело и средней молекулярной массе свободного антитела, составляющей 150 кД. Фактическая молекулярная масса антитела немного изменится вследствие степени гликозилирования.
Объем опухоли и масса тела измерялись дважды в неделю, и измерения продолжали вне периода обработки для того, чтобы установить повторный рост кинетики, что подтверждается задержкой роста опухоли (ЗРО). Измерения объема опухоли продолжали, пока объем опухоли не достигал 10% массы тела у одной мыши в пределах группы обработки, во время чего наблюдения за группой прекращали. Процент ингибирования роста опухоли (ИРО) ([средний объем опухоли группы контроля - средний объем опухоли обрабатываемой группы]/средний объем опухоли группы контроля; соотношение О/К) определяли на 20 день. Соотношения О/К по группе обработки сравнивали с соотношениями О/К группы контроля, с применением двустороннего t-тест Велша. Поскольку действие всей группы прекращают, когда хотя бы одна опухоль достигает предела размера (приблизительно 1000 мм3), то ЗРО не может быть вычислен для групп, где средний повторный рост был медленным.
Различия в тенденциях роста опухоли в динамике по времени между парами групп обработки оценивали посредством применения линейных смешанных эффектов регрессионных моделей. Указанные модели учитывают тот факт, что каждое животное оценивалось во множественных моментах времени. Отдельная модель подходила для каждого сравнения, и области под кривой (ОПК) для каждой группы обработки были вычислены посредством применения ожидаемых значений от модели. Затем вычисляли уменьшение процента в ОПК (дОПК) в отношении контрольной группы. Статистически значимое P значение (<0,05) предполагает, что тенденции в динамике по времени для двух групп обработки были различны. Результаты подытожены в табл. 19 и 20, ниже.
Антиопухолевая активность наблюдалась во всех группах, обработанных 5F9-vcMMAE в обоих ис
- 110 030827 следованиях, и эффект, как показано, был зависим от дозы. Результаты двух исследований были сопоставимы. У мышей, обработанных 5F9-vcMMAE при 0,938 мг/кг, в.в. при схеме применения QW, ИРО составляло 20,7-21,4%, p значение составляло <0.05 по сравнению с группой контроля растворителем. В обрабатываемой группе 1,875 мг/кг вводили в.в., при схеме применения QW, ИРО составлял 41,3-44,7%, p значение составляло <0.001. В обрабатываемой группе 3,75 мг/кг вводили в.в, при схеме применения QW, ИРО составляло 65,3-65,7% (p<0.001) по сравнению с группой контроля растворителем. 5F9vcMMAE вводили при 7,5 мг/кг, в.в., QW, что приводило к ИРО 84,1-84,3% (p<0.001) и 10 мг/кг, в.в., QW (только Исследование B) приводило к ИРО 91,2% (p<0.001). Когда 3,75 мг/кг вводили в.в., при схеме применения BIW (S), то наблюдалось существенное ингибирование с ИРО 84,9% (p<0.001).
Умеренная антиопухолевая активность наблюдалась при более высоких дозах 209-vcMMAE, от 7,5 и 10,0 мг/кг с ИРО 35,7-45,4% и соответственно (p <0.001), но низкие дозы 209-vcMMAE (1,875 и 3,75 мг/кг) не показали ингибирования (p>0.05). Высокая антиопухолевая активность, наблюдаемая с 209vcMMAE, происходит вероятно из-за неспецифический активности части MMAE иммуноконъюгата. Введение свободного токсина MMAE привело к смешанным результатам: 0,075, 0,135 и 0,15 мг/кг, в.в., QW, приводило к отсутствию ингибирования роста опухоли (p> 0.05), при этом введение 0,18 мкг/кг, в.в. QW приводило к ИРО 50,4% (p<0.001).
Максимальная наибольшая потеря массы тела, наблюдаемая во время периода обработки, составляла 2,3% на 7 день в свободном токсине 0,18 мг/кг MMAE группы Исследования B и 0,938 мг/кг 5F9vcMMAE группы в том же исследовании. Это указывает на то, что лекарственное средство является хорошо переносимым.
Измерения объема опухоли продолжали вне периода обработки, пока объем опухоли не достигал 10% массы тела у одной мыши в пределах группы обработки, и затем действие группы обработки прекращали. В указанных исследованиях повторный рост опухоли, как оказалось, был зависим от дозы.
Таблица 19. Результаты исследования A лечения первичной человеческой опухоли толстой кишки ксенотрансплантантами у мышей, имеющих ТКИН
Обработка Доза(мг/кг) Способ введения/ частота ИРО Изменение BW (средний максималь ный процент) ЗРО (дней) /(или дней до первой опухоли >1000 мм3)
Растворитель 0 В.В. QW х 3 дозы N/A -0,2 0
209-vcMMAE 1,875 В.В. QW х 3 дозы -2.0 (р>0.05) 8,3 0,6
209-vcMMAE 3,75 В.В. QW х 3 дозы 4.5 (р>0.05) 6,9 0,4
MMAE 0,075 В.В. QW х 3 дозы 5.0 (р>0.05) 8,3 1,0
MMAE 0,15 В.В. QW х 3 дозы 11.1 (р>0.05) 10,8 2,0
5F9-vcMMAE 0,938 В.В. QW х 3 дозы 21.4(р>0.05) 9,0 з,з
5F9-vcMMAE 1,875 В.В. QW х 3 дозы 44.7 (о>0.001) 10,6 8,2
5F9-vcMMAE 3,75 В.В. QW х 3 дозы 65.3 (р>0.001) 9,0 17,8
5F9-vcMMAE 7,5 В.В. QW х 3 дозы 84.1 (р>0.001) 7,5 (>58 дней первой опухоли )
- 111 030827
Таблица 20. Результаты исследования B лечения первичной человеческой опухоли толстой кишки ксенотрансплантантами у мышей, имеющих ТКИН
Обработка Доза (мг/кг) Способ введения/ частота ИРО Изменение BW (средний максимальн ый процент) ЗРО (дней) /(или дней до первой опухоли >1000 мм3)
Растворитель 0 В.В. QW х 3 дозы N/A -1,8 0
209-vcMMAE 7,5 В.В. QW X 3 дозы 35.7 (р>0.001) 4,2 4,2
209-vcMMAE 10,0 В.В. QW х 3 дозы 45.4 (р>0.001) 2,6 11,3
ММАЕ 0,135 В.В. QW х 3 дозы 2.2 (р>0.05) 9,3 0,2
ММАЕ 0,18 В.В. QW х 3 дозы gS о о -2,3 8,6
5F9-vcMMAE 0,938 В.В. QW х 3 дозы 20.7 (р>0.001) -2,3 3,8
5F9-vcMMAE 1,875 В.В. QW х 3 дозы 41.3 (р>0.001) 5,6 6,6
5F9-vcMMAE 3,75 В.В. QW х 3 дозы 65.7 (р>0.001) -2,2 16
5F9-vcMMAE 3,75 В.В. BIW х 6 дозы 84.9 (р>0.001) -1,8 31,9
5F9-vcMMAE 7,5 В.В. QW х 3 дозы 84.3 (р>0.001) 6,5 (>47 дней первой опухоли)
5F9-vcMMAE 10,0 В.В. QW х 3 дозы 91.2 (р>0.001) 7,2 (>56 дней первой опухоли)
Экспериментальное исследование эффективности с оголенным 5F9 анти-hGCC антителом в CT26 hGCC/luc #32 дисссеминированной модели (белые мыши)
Эта модель тестирует способность оголенных антител к связыванию с GCC-экспрессирующими клетки опухоли в кровотоке и предотвращать образование новых опухолей. Самки белых мыши инокулировали в.в. клетками CT26 hGCC/luc #32 в 1х105/мышь и 5х105/мышь. Растворитель 0,9% NaCl и неспецифические антитело (оголенное 209) вводили контрольной группе для сравнения с введением оголенного 5F9. Оба антитела были созданы методами генной инженерии (в векторе pLKTOK58) таким образом, чтобы обладать изотипом IgG1, в результате их области Fc могли выявлять антитело-зависимый клеткой опосредованный цитостатический ответ после связывания с антигенами поверхности клетки (то есть, GCC для 5F9 и несвязанная мишень для 209). Введение доз начинали за один день до в.в. инокуляции, со схемой применения один раз/неделя в.в. х4 (1 раз в 7 дней х 4). Рост опухоли монитор или системой визуализации Xenogen два раза в неделю. Также два раза в неделю проверяли массу тела и выживание. Данные о весе легкого и изображения, включающие изображения ЯМР, были обеспечены в конце указанного исследования.
Как показано на фиг. 2, обе группы 5F9 (40 мг/кг и 10мг/кг; 1х105/мышь), показывают эффективность (в день 34р± О/К (обработка/контроль) 0,04-0,05). О/К для группы 5F9 0,18-0,14 в день 34 p.i по сравнению с группой 209. О/К для группы 209 40 мг/кг составляет 0,64 по сравнению с группой 0,9% NaCl (нормальный физиологический раствор). Никакого преимущества не было замечено с группы 5F9 при 5х105.
Вес легкого в каждой группы в конце указанного исследования показан на фиг. 3. Т тест: растворитель в сравнении с 209 при 40мг/кг P=0.4; растворитель в сравнении с 5F9 при 40мг/кг P<0.05; растворитель в сравнении с 5F9 при 10мг/кг P<0.01. Визуальный осмотр легких подтвердил меньше узлов опухоли в группах, обработанных 5F9, чем в группах, обработанных растворителем, или 209. In vitro ЯМР мышей показал массивную эксфильтрацию опухоли легкого к окружающим тканям и смещение сердца у мышей, обработанных растворителем. У мыши, обработанной 40 мг/кг 5F9 было видно нормальное изображение легкого без свидетельства опухоли.
Кривая выживания показана на фиг. 4. Существенное повышение выживания наблюдали в группах, обработанных 5F9 (1х105), и не было никакого различия между 10 и 40 мг/кг в группе 5F9.
Пример 4. Создание клеточной линии, продуцирующей антитело
Для создания стабильного клона клеточной линии CHO, экспрессирующего 5F9 с продуктивностью >600 мг/л, создавали экспрессионные векторы для 5F9 путем субклонирования вариабельного участка
- 112 030827 легкой цепи (SEQ ID NO:19) и вариабельного участка тяжелой цепи (SEQ ID NO:17) в pLKTOK58 экспрессионном векторе, содержащем WT IgG1 Fc человека и ген резистентности к неомицину. Экспрессия 5F9 вариабельного участка -IgG1 слитого продукта находилась под контролем EF-1a промотора.
Клонирование и секвенирование вариабельных участков анти-GCC моноклонального антитела человека 5F9
Общую РНК выделяли (Qiagen's RNeasy kit) из субклона 8.2 гибридомы человека 46.5F9. Эта гибридома несет стандартный опубликованный Каппа константный участок легкой цепи (№ доступа GenBank AW383625, или BM918539) и стандартный опубликованный IgG2 константный участок тяжелой цепи (№ доступа GenBank BX640623, или AJ294731). 5' готовую к прогону, поли-G концевую кДНК синтезировали с помощью традиционных методов (Nature Methods 2, 629-630 (2005)). Вариабельный участок легкой цепи подвергали ПЦР амплификации из кДНК путем 5' прогона, используя поли-C якорь олиго в комбинации с обратным праймером, специфическим для Каппа константного участка. Вариабельный участок тяжелой цепи амплифицировали с обратным праймером, специфическим для IgG2 константного участка во множественной комбинации с прямыми праймерами, специфическими к известным лидерным последовательностям тяжелой цепи. ПЦР продукты были TOPO® клонированы (Invitrogen™, Life Technologies, Inc.) и секвенированы с M13F и M13R праймерами.
Конструирование экспрессионных векторов млекопитающих, несущих анти-GCC моноклональное антитело человека 5F9
Экспрессионные векторы млекопитающих, несущие вариабельных участки тяжелых и легких цепей 5F9 конструировали для создания продуцирующих CHO клеточных линий. Для нативного конструкта, вариабельные участки легких и тяжелых цепей 5F9 сублонировали в pLKTOK58D (US патентная заявка № 20040033561). Этот вектор несет два селективных маркера млекопитающих: резистетности к неомиицну и DHFR/метотрексату (для амплификации). Вектор предоставляет возможность ко-экспрессии обеих легких и тяжелых цепей их тандема EFlalpha промоторов, каждый расположен против хода транскрипции векторных лидерных-Каппа константных и лидерных-IgG1 (Fc дикого типа) константных участков. Для субклонирования, вариабельные участки легких и тяжелых цепей ПЦР амплифицировали из подтвержденных секвенированием TOPO клонов с гено-специфическими праймерами, содержащими уникальные сайты рестрикции для направленного клонирования в соединения соответствующих лидерных-Каппа и лидерных-IgG1 участков вектора. Последовательности прамеров указаны ниже (специфические последовательности вариабельного участка 5F9 выделены жирным шрифтом):
Лидерные-вариабельные праймеры легкой цепи нативного 5F9 прямой Notl yataasaatGCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACA
GC7AG4GG7G7UCAC7UCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTG-3’ (SEQ Ш NO: 234) обратный BsiWI
- GCC4CCG7ACGTTTGATTTCCACGTTGGTCCCTTGGCCGAACGTC-3’ (SEQ Ш
N0:235 )
Лидерные-вариабельные праймеры тяжелой цепи нативного 5F9 прямой EcoRI ’ ccgGAATTCCTC ACC ATGGGATGGAGCTGTATC ATCCTCTTCTTGGTAGC AAC AGCT
ACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGAC-3’ (SEQ Ш
N0:236) обратный Blpl
5-GGAGGCTGAGCTGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTGGTC-3’ (SEQ Ш
NO: 237)
Клоны подтверждали путем секвенирования двухцепочечной ДНК как легкой, так и тяжелой цепи.
Использовали два метода трансфекции для интродукции конструктов в CHO клетки: традиционный MPI процесс и процесс Crucell. Трансфекции CHO клеток инициировали с нативным 5F9 конструктом, используя традиционный MPI процесс. Использовали линеаризированные и нелинеаризироанные ДНК, либо с электропорацией или трансфекцией липофектамином 2000 CD. Создавали около 30 стабильных пулов путем селекции в G418, не нуклеоизидной среде и 5 нМ метотрексатом. На основе FMAT анализа уровня продукции антител, для клонирования выбирали три стабильных пула. Пул с наиболее высокой продукцией секретировал антитело в концентрации 12,2 мкг/мл. Эти три пула замораживали.
Crucell STAR элементы можно оценивать для получения 5F9 экспрессионных векторов, содержащих STAR элемент.
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи 5F9/hIgG1 представляет собой:
- 113 030827
GAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCC
ACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT
CACCTGCGCTGTCTTTGGTGGGTCTTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAG
GGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGACAACCCGTCCC
TCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCGCCCTGAAGCTGAGTTC
TGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGAACGTGGATACACCTATGGTAAC
TTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG
TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT
CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG
CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA
TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG
TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA
TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT
CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA
GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG
AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAATAATAGGGATAACAGGGTAATACTAGAG (SEQ ID N0:230)
Белковая последовательность тяжелой цепи 5F9/hIgG1 представляет собой;
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLE
WIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARERGYTYGNFDHWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID N0:231)
Нуклеотидная последовательность легкой цепи 5F9/hKappa представляет собой:
GCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGT
CCACTCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC
ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTG
GCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGAATCCCAGCCAGGTT
CAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCGGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTT
GCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAAAACCTGGCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAACGTGG
AAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG
TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC
AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTAGTCTAGA (SEQ ID N0:232)
Белковая последовательность легкой цепи 5F9/hKappa представляет собой:
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLI
YGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQGTNVEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
AD YEKHK VY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:233)
- 114 030827
Нуклеиновокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи для 5F9, перечисленные ниже, вставляли в pTOK58D вектор: atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgt ctccagg ggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagaaacttagcctggtatcagcagaaacctggccagg ctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggaatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggaca gagttcactctcaccatcggcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataaaacctggcctcg gacgttcggccaagggaccaacgtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatg agcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcag cagcaccctgaccctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagct cgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID N0:308) atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagct acaggtgtccactcccaggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctgtccctcacctg cgctgtctttggtgggtctttcagtggttactactggagctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattg gggaaatcaatcatcgtggaaacaccaacgacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaag aaccagttcgccctgaagctgagttctgtgaccgccgcggacacggctgtttattactgtgcgagagaacgtggatacac ctatggtaactttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtcagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcc ccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactcta ctccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagccca gcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaa ctcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcac atgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatg ccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactgg ctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacct gcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg gaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggta aataa (SEQ ID N0:309)
Последовательности, кодирующие последовательности тяжелых и легких цепей Abx-229 ниже вставляли в pTOK58D вектор:
- 115 030827 atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctatt ttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctc ctgtgcagcctctggattcacctttagccgctatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggg tctcaggtattagtgggagtggtggtaggacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaat tccaagaacacactatatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagatcgcga tttttggagtggtccatttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtcagctcagcctccaccaagggcccatcgg tcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttcccc gaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagg actctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcaca agcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgc ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaa agccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcc tgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactac aagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggca gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtaaataa (SEQ ID N0:310) atgaggctccctgctcagcttctc ttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaatagtgatgacgccgtcttcagccaccctgtctgtgtctcc aggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagtagaaacttagcctggtaccagcagaaacctggcc aggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctggg acagaattcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcaccagtatagtaactggat gLgcagLLLLggccaggggaccaagCLggagatcaaacgtacggLggCLgcaccaLCLgLCLLcaLCLLCCcgccaLCLg atgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcct cagcagcaccctgaccctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctga gctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID N0:311)
Несмотря на то, что изобретение представлено и описано со ссылкой на обеспеченные его варианты осуществления, для специалистов в данной области техники будет понятным, что различные изменения по форме и деталями могут быть проведены в данной заявке без отклонения от объема изобретения, охватываемого пунктами приложенной формулы изобретения.
- 116 030827
Перечень последовательностей <110> MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC.
AMGEN BRITISH COLUMBIA <120> МОЛЕКУЛЫ АНТИ-GCC АНТИТЕЛА И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ <130> M2051-7027WO <140>
<141>
<150> 61/254,474 <151> 2009-10-23 <160> 319 <170> Patentin версия 3.5 <210> 1 <211> 348 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 1
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctctgggtt ctcattaagc agaaatgcta taagctgggt tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggactg gtggaggcac aaattataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatccgc aaagagaact ccaagagtca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctacaaac tgaagacaca gccaggtact tctgtgccag aagtggttac 300
gacgggtttg attactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 2 <211> 116 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 2
Gin Vai Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin
1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Asn
20 25 30
- 117 030827
Ala He Ser 35 Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
40 45
Gly Vai He Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser He Arg Lys Glu Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai
100 105 110
Thr Vai Ser Ala
115 <210> 3 <211> 318 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 3
cagattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcaccagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtggtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaaactgg aaataaaa 318
<210> 4 <211> 106 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 4
Gin lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly
- 118 030827
1 5 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp He Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Thr Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105
<210> 5 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 5
caggtccagt tgaagcagtc tggagctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggaaag attggtcctc gaagtggtaa tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcgtccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatgggat 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctct 336
<210> 6 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
- 119 030827
<400> 6 Gin Vai Gin 1 Leu Lys 5 Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai 10 Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Vai Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Туг He Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Lys lie Gly Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser
100 105 110
<210> 7 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 7
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaag cacctaatgt atcaggtgtc caaactggac 180
cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc 240
agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac atattatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaag 336
<210> 8 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 120 030827 полипептид
<400> 8 Asp Val Val 1 Met Thr 5 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser 10 Val Thr lie 15 Gly
Gln Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly He Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 9 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 9 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgcagatg 60
tcctgtaagg cttctggcta tattttcacc ggctactgga tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggccaag gccttgagtg gattggaagg attcatcctt ctgatagtaa tactaactac 180
aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac ccatgccctt 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctct 336
<210> 10 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 121 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 10
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gin Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr lie Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Arg He His Pro Ser Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr His Ala Leu Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
<210> 11 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 11
gatgttgtgt tgacccagac tccactcact ttgtcgatta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgagttgg 120
ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tcaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtg tattactgcg tgcaaggtac acatttattc 300
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333
<210> 12 <211> 111 <212> белок
- 122 030827 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 12
Asp 1 Vai Vai Leu Thr Gin Thr Pro 5 Leu Thr Leu 10 Ser lie Thr He 15 Gly
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Vai Ser Gin Leu Asp Ser Gly Vai Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Vai Gin Gly
85 90 95
Thr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 13 <211> 339 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 13 caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggaaag attggtccta gaagtggtag tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatgggat 300
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgca 339
<210> 14
- 123 030827 <211> 113 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 14
Gin Vai oln beu bys Gin aer Gly Ala gIu Leu val Lys нго Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr He Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Lys lie Gly Pro Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala <210> 15 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 15
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaag cacctaatgt atcaggtgtc caaactggac 180
cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc 240
- 124 030827 agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac atattatccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 16 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 16
Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Vai Thr lie 15 Gly
1 5 10
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala
35 40 45
Pro Lys His Leu Met Tyr Gin Vai Ser Lys Leu Asp Pro Gly He Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 17 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 17
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctttggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caacgacaac 180
- 125 030827
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttcgccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agaacgtgga 300
tacacctatg gtaactttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 18 <211> 119 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 18
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser 15 Glu
1 5 10
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Glu lie Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Vai Thr He Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ala Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 19 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 19
- 126 030827
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agaaacttag cctggtatca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg aatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcggcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataaaacct ggcctcggac gttcggccaa 300
gggaccaacg tggaaatcaa a 321
<210> 20 <211> 107 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 20
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Gly Ser Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Val Glu He Lys
100 105 <210> 21 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 127 030827 <400> 21
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactgctaca tgagctggat ccgccagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attactacta gtggtaatac catttactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagactgg 300
ggatggttct acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 22 <211> 119 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 22
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Cys
20 25 30
Tyr Met Ser Trp He Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai
35 40 45
Ser Tyr lie Thr Thr Ser Gly Asn Thr He Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Gly Trp Phe Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 23 <211> 336
- 128 030827 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>
<221> модифицированное_основание <222> (216)..(217)
<223> а, с, , t, g, неизвестны или другие
<400> 23
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg cataatgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacaa ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtagcagc gggtcnngga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttcct 300
cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 24 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (73) . . (73) <223> Любая аминокислота <400> 24
Asp 1 lie Val Met Thr 5 Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Asn
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
- 129 030827
Asp 65 Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser 70 Xaa Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys He 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ser
85 90 95
Не Gin Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu He Lys
100 105 110
<210> 25 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
<400> 25
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt actttgacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 3 54
<210> 26 <211> 118 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 26
Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala
Gly Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40
Ala Ala 50 He Trp Tyr Asp Gly 55 Ser
Gly Gly 10 Vai Vai Gin Pro Gly 15 Arg
Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai
Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Vai
- 130 030827
Lys 65 Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 80
70 75
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 27 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 27
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagacttc taaccgcttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg gagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac gcaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 28 <211> 111 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 28
Asp He Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Pro Vai Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser
20 25 30
- 131 030827
Asp Gly Asn 35 Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro
40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Vai Gly Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Thr Gin Phe Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 29 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 29
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagcctccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat tttactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 30 <211> 118 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 30
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
25 30
- 132 030827
Gly Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai
40 45
Gly Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Ala Ser Vai
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 31 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 31
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagacttc taaccgcttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg gagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac gcaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 32 <211> 111 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 32
- 133 030827
Asp 1 lie Val Met Thr 5 Gln Thr Pro Leu Ser 10 Ser Pro Val Thr Leu Gly 15
Gln Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Gly Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 33 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggagg 300
agcagctcgt actttgacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 3 54
<210> 34 <211> 118 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
- 134 030827 <400> 34
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 15 Arg
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 35 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 35
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
ttctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacacgta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaatttcca 300
accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333
<210> 36 <211> 111
- 135 030827 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 36 Gin Thr Pro Leu Ser Ser 10 Pro Vai Thr Leu 15 Gly
Asp 1 He Vai Met Thr 5
Gin Pro Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys He Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 30 95
Thr Gin Phe Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 37
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatttcatac attactagta gtggtagtac catatactac 180
tcagcctctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
etgeaaatga acagcctgag agccgaggac aeggeegtgt attactgtgc gagagatttc 300
agtggctggt tcggagtcca ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
teg 363
- 136 030827 <210> 38 <211> 121 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 38
Gin Val Gin Leu 1 Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Ser Tyr lie Thr Ser Ser Gly Ser Thr He Tyr Tyr Ser Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Ser Gly Trp Phe Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 39
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgta agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
- 137 030827
tctggagtgc caaataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acaacttacg 300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 40 <211> 112 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 40
Asp 1 lie Val Met Thr 5 Gin Thr Pro Leu Ser 10 Leu Ser Val Thr Pro 15 Gly
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ser
85 90 95
He Gin Leu Thr Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 41 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 41 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
- 138 030827
ccagggaagg ggctggactg ggtctcagat attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgc acagcctgag cgccgaggac acggccatat attactgtgc gaaacggcgg 300
tggcaggggt acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 42 <211> 118 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 42
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Asp lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met His Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Arg Trp Gin Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 43 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 139 030827 полинуклеотид <400> 43
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccaggca gcgtgttgac agcaggtact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 44 <211> 108 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 44
Glu 1 He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Arg Gin Arg Vai Asp Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys
100 105
<210> 45 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 140 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 45
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cgctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggga gtggtggtag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactatat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgc 300
gatttttgga gtggtccatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 46 <211> 120 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 46
Glu Vai 1 Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai
35 40 45
Ser Gly lie Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser
115 120
- 141 030827 <210> 47 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 47
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agaaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcaccag tatagtaact ggatgtgcag ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 48 <211> 107 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 48
Glu 1 lie Vai Met Thr 5 Pro Ser Ser Ala Thr 10 Leu Ser Vai Ser Pro Gly 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Ser Asn Trp Met Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
- 142 030827
100 105 <210> 49 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaga agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattggacgt atttatatca gtgggaggac caccttcaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agatagatat 300
tatggctacc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 50 <211> 117 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 50
Gin 1 Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 5 Pro Gly 10 Leu Vai Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser He Arg Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Arg He Tyr He Ser Gly Arg Thr Thr Phe Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Vai Thr He Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
- 143 030827
Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 51 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 51
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc cgcagttact tagcctggta ccaacagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccgag caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 52 <211> 108 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 52
Glu 1 Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
- 144 030827
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys
100 105
<210> 53 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 53
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggcgg ctccatccgt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180
ctctccctca agagtcgagt caccatatca agagacacgt ccaagaatca ggtctccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcggc gggtatgggc 300
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342
<210> 54 <211> 114 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 54
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 10 Lys Pro Ser Glu 15
1 5
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Arg His Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Leu Ser Leu Lys
50 55 60
- 145 030827
Ser 65 Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val Ser Leu 80
70 75
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser <210> 55 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 55
gacatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggccattaga aatgatttag gctggtatca gctgaaaccg 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctattct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaggattctg caacttatta ctgtctacag cataatagtt tccctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 56 <211> 107 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 56
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser He Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ala He Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu He
- 146 030827
40 45
Tyr Ser 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr He 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Ser Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Leu Gin 90 His Asn Ser Phe Pro 95 Pro
Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 He Lys
<210> 57 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 57 agaaatgcta taagc
<210> 58 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 58
Arg Asn Ala Не Ser
5 <210> 59 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 59 gtaatatgga ctggtggagg cacaaattat aattcagctc tcaaatcc 48
- 147 030827 <210> 60 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 60
Val Не Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
10 15 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> agtggttacg acgggtttga ttac <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400>
Ser Gly Туг Asp Gly Phe Asp Tyr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> agtgccagct caagtgtaaa ttacatgcac <210> 64 <211> 10 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 148 030827 <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 64
Ser Ala Ser Ser Ser Vai Asn Tyr Met His
10 <210> 65 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 65 gacacatcca aactggcttc t <210> 66 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 66
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
5 <210> 67 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> 67 cagcagtgga gtggtaaccc gtacacg Синтетический 27
<210> 68 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид <400> 68
- 149 030827
Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность < 22 0 >
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> gactactata taaac <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400>
Asp Туг Туг lie Asn <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400>
aagattggtc ctcgaagtgg taatacttac tacaatgaga agttcaaggg c <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400>
Lys lie Gly Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5
Gly
- 150 030827 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> tgggatgctt ас <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400>
Trp Asp Ala Туг <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400>
<210> 76 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 76
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
10 15 <210> 77 <211> 21
- 151 030827 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид Синтетический
<400> 77
caggtgtcca aactggaccc t 21
<210> 78
<211> 7
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 78
Gin Vai Ser Lys Leu Asp Pro
1 5
<210> 79
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид Синтетический
<400> 79
ttgcaaggta catattatcc gtacacg 27
<210> 80
<211> 9
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 80
Leu Gin Gly Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 81
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 152 030827 олигонуклеотид <400> 81 ggctactgga tgtac 15 <210> 82 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 82
Gly Туг Trp Met Туг
5 <210> 83 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 83 aggattcatc cttctgatag taatactaac tacaatcaaa agttcaaggg c 51 <210> 84 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 84
Arg lie His Pro Ser Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys
10 15
Gly <210> 85 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 153 030827 <400> 85 gcccttgctt ас 12 <210> 86 <211> 4 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 86
Ala Leu Ala Туг <210> 87 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 87 aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaaaacct atttgagt 48 <210> 88 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 88
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Ser
10 15 <210> 89 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 89 ctggtgtctc aactggactc t 21
- 154 030827 <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400>
Leu Val Ser Gin Leu Asp Ser 1 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> gtgcaaggta cacatttatt cacg <210>
<211>
<212>
<213>
белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400>
Val Gin Gly Thr His Leu Phe Thr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> gactactata taaac <210> 94 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 155 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 94
Asp Туг Туг lie Asn
5 <210> 95 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 95 aagattggtc ctagaagtgg tagtacttac tacaatgaga agttcaaggg c 51 <210> 96 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 96
Lys Не Gly Pro Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
10 15
Gly <210> 97 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 97 tgggatgctt ас 12 <210> 98 <211> 4 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 156 030827 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 98
Trp Asp Ala Туг <210> 99 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 99 aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaagacat atttgaat 48 <210> 100 <211> 15 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 100
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu
10 15 <210> 101 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 101 caggtgtcca aactggaccc t 21 <210> 102 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 102
Gin Val Ser Lys Leu Asp Pro
- 157 030827 <210> 103 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 103 ttgcaaggta catattatcc gtacacg 27
<210> <211> <212> <213> 104 9 белок Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: пептид Синтетический
<400> 104 Leu Gin Gly Thr Tyr Tyr Pro Туг Thr 1 5
<210> 105
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 105
ggttactact ggagc 15
<210> 106
<211> 5
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 106
Gly Туг Туг Trp Ser
5 <210> 107 <211> 45
- 158 030827 <212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
107 <400>
gaaatcaatc atcgtggaaa caccaacgac aacccgtccc tcaag <210>
<211>
<212>
<213>
108 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
108 <400>
Glu lie Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro 1
Ser Leu Lys Ser <210>
<211>
<212>
<213>
109
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
109 <400> gaacgtggat acacctatgg taactttgac cac <210>
<211>
<212>
<213>
110 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
110 <400>
Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His 1 <210> <211> <212> <213>
111
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности:
Синтетический
- 159 030827 олигонуклеотид <400> 111 agggccagtc agagtgttag cagaaactta gcc <210>
<211>
<212>
<213>
112 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
112 <400>
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Leu Ala 1 <210>
<211>
<212>
<213>
113
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
113 <400> ggtgcatcca ccagggccac t <210>
<211>
<212>
<213>
114 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
114 <400>
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr <210>
<211>
<212>
<213>
115
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
115 <400>
cagcagtata aaacctggcc tcggacg
- 160 030827 <210> 116 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 116
Gin Gin Туг Lys Thr Trp Pro Arg Thr
5 <210> 117 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 117 gactgctaca tgagc <210> 118 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 118
Asp Cys Туг Met Ser
5 <210> 119 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 119 tacattacta ctagtggtaa taccatttac tacgcagact ctgtgaaggg c 51 <210> 120 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 161 030827 <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
120 <400>
Tyr lie Thr Thr Ser Gly Asn Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1
Gly <210>
<211>
<212>
<213>
121
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
121 <400>
gactggggat ggttctacgg tatggacgtc <210>
<211>
<212>
<213>
122 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
122 <400>
Asp Trp Gly Trp Phe Tyr Gly Met Asp Vai 1 <210>
<211>
<212>
<213>
123
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
123 <400>
aagtctagtc agagcctcct gcataatgat ggaaagacct atttg <210> 124 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 162 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности.· Синтетический пептид <400> 124
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Asn Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
10 15 <210> 125 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 125 gaagtttcca accggttctc t 21 <210> 126 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 126
Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser
5 <210> 127 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 127 atgcaaagta tacagcttcc tcggacg
<210> 128 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 128
- 163 030827
Met Gin Ser lie Gin Leu Pro Arg Thr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
129
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
129 <400> agctatggca tgcac <210>
<211>
<212>
<213>
130 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
130 <400>
Ser Tyr Gly Met His <210>
<211>
<212>
<213>
131
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400>
gctatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
131
132 белок
Искусственная последовательность
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
132 <400>
Ala lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5
Gly
- 164 030827 <210> 133 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 133 gggaggagca gctcgtactt tgactat 27 <210> 134 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 134
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
5 <210> 135 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 135 aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacct acttgagt 48 <210> 136 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 136
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
10 15 <210> 137 <211> 21
- 165 030827 <212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
137 <400> aagacttcta accgcttctc t <210>
<211>
<212>
<213>
138 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
138 <400>
Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser <210>
<211>
<212>
<213>
139
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
139 <400> atgcaagcta cgcaatttcc aacc <210>
<211>
<212>
<213>
140 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
140 <400>
Met Gin Ala Thr Gin Phe Pro Thr <210>
<211>
<212>
<213>
141
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности:
Синтетический
- 166 030827 олигонуклеотид <400> 141 agctatggca tgcac 15 <210> 142 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 142
Ser Туг Gly Met His
5 <210> 143 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 143 gctatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagcct ccgtgaaggg c 51 <210> 144 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 144
Ala lie Trp Туг Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Ala Ser Vai Lys
10 15
Gly <210> 145 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 167 030827 <400> 145 gggaggagca gctcgtattt tgactac 27 <210> 146 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 146
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
5 <210> 147 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 147 aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacct acttgagt 48 <210> 148 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 148
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
10 15 <210> 149 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 149 aagacttcta accgcttctc t 21
- 168 030827 <210>
<211>
<212>
<213>
150 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
150 <400>
Lys Thr Ser Asn Arg Phe Ser <210>
<211>
<212>
<213>
151
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
151 <400> atgcaagcta cgcaatttcc а <210>
<211>
<212>
<213>
152 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
152 <400>
Met Gin Ala Thr Gin Phe Pro Thr <210>
<211>
<212>
<213>
153
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
153 <400> agctatggca tgcac <210>
<211>
<212>
<213>
154 белок
Искусственная последовательность
- 169 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 154
Ser Туг Gly Met His
5 <210> 155 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 155 rrr« 1- а <- я F· гтгтЕ a t- rra f- гтгтд а гт <- a a h a a a t- а г» t-а Έ rrr«a гта γ·Ί- г* гттЕ гта а гтгтгт г· Ш 3 w — -<210> 156 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 156
Ala lie Trp Туг Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys
10 15
Gly <210> 157 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 157 gggaggagca gctcgtactt tgactat 27 <210> 158 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 170 030827 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 158
Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
5 <210> 159 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 159 aggtctagtc aaagcctcgt acacagtgat ggaaacacgt acttgagt 48 <210> 160 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 160
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
10 15 <210> 161 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 161 aagatttcta accggttctc t 21 <210> 162 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 162
Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser
- 171 030827
1 5
<210> 163
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид Синтетический
<400> 163
atgcaagcta cacaatttcc аасс 24
<210> 164
<211> 8
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 164
Met Gin Ala Thr Gin Phe Pro Thr
1 5
<210> 165 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 165 gactactaca tgagc 15
<210> 166 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид <400> 166
Asp Туг Туг Met Ser
5 <210> 167 <211> 51
- 172 030827 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 167 tacattacta gtagtggtag taccatatac tactcagcct ctgtgaaggg c 51 <210> 168 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 168
Туг Не Thr Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ser Ala Ser Vai Lys
10 15
Gly <210> 169 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 169 gatttcagtg gctggttcgg agtccacttt gactac 36 <210> 170 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 170
Asp Phe Ser Gly Trp Phe Gly Vai His Phe Asp Tyr
10 <210> 171 <211> 48 <212> ДНК
- 173 030827 <213>
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
171 <400>
aagtctagtc agagcctcct gcatagtgat ggaaagacct atttgtat <210>
<211>
<212>
<213>
172 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
172 <400>
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
173
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
173 <400> gaagtttcca accggttctc t <210>
<211>
<212>
<213>
174 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
174 <400>
Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser <210> <211> <212> <213>
175
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
- 174 030827 <400> 175 atgcaaagta tacaacttac gtggacg 27 <210> 176 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 176
Met Gin Ser lie Gin Leu Thr Trp Thr
5 <210> 177 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 177 agctatgcca tgagc <210> 178 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 178
Ser Туг Ala Met Ser
5 <210> 179 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 179 gatattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51
- 175 030827 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
180 белок
Искусственная последовательность
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
180 <400>
Asp lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1
Gly<210>
<211>
<212>
<213>
181
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
181 <400> cggcggtggc aggggtactt cgatctc <210>
<211>
<212>
<213>
182 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
182 <400>
Arg Arg Trp Gin Gly Tyr Phe Asp Leu <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
183 <400>
agggccaggc agcgtgttga cagcaggtac ttagcc <210> 184
- 176 030827 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 184
Arg Ala Arg Gin Arg Vai Asp Ser Arg Туг Leu Ala
10 <210> 185 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 185 ggtgcatcca gcagggccac t <210> 186 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 186
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
5 <210> 187 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 187 cagcagtatg gtagctcacc gctcact 27 <210> 188 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 177 030827 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 188
Gin Gin Туг Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 189 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 189 cgctatgcca tgaac <210> 190 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 190
Arg Туг Ala Met Asn
5 <210> 191 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 191 ggtattagtg ggagtggtgg taggacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 192 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 192
Gly lie Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
- 178 030827
10 15
Gly <210> 193 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 193 gatcgcgatt tttggagtgg tccatttgac tac 33 <210> 194 <211> 11 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 194
Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr
10 <210> 195 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 195 agggccagtc agagtgttag tagaaactta gcc <210> 196 <211> 11 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 196
Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Arg Asn Leu Ala
10
- 179 030827 <210> 197 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> 197 ggtgcatcca ccagggccac t Синтетический 21
<210> 198 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: пептид Синтетический
<400> 198 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 199 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид Синтетический
<400> 199 caccagtata gtaactggat gtgcagt 27
<210> 200 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид <400> 200
His Gin Tyr Ser Asn Trp Met Cys Ser
5 <210> 201 <211> 15 <212> ДНК
- 180 030827 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 201 agttactact ggagc 15 <210> 202 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 202
Ser Туг Туг Trp Ser
5 <210> 203 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 203 cgtatttata tcagtgggag gaccaccttc aacccctccc tcaagagt 48 <210> 204 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 204
Arg lie Туг Не Ser Gly Arg Thr Thr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser
10 15 <210> 205 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 181 030827 <400> 205 gatagatatt atggctacct tgactac 27 <210> 206 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 206
Asp Arg Туг Туг Gly Туг Leu Asp Туг
5 <210> 207 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 207 agggccagtc agagtgttag ccgcagttac ttagcc <210> 208 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 208
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
10 <210> 209 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 209 gatgcatcca gcagggccac t 21
- 182 030827 <210> 210 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 210
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
5 <210> 211 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 211 cagcagtatg gtagttcacc gagcacc <210> 212 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 212
Gin Gin Туг Gly Ser Ser Pro Ser Thr
5 <210> 213 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 213 cattactact ggagc 15 <210> 214 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность
- 183 030827 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 214
His Туг Туг Trp Ser
1 5
У/· <211> <212> <213> О 1 с £* X -Э 48 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 215
tatatctatt acagtgggag caccaactac aacctctccc tcaagagt 48 <210> 216 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 216
Туг lie Туг Туг Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Leu Ser Leu Lys Ser
10 15 <210> 217 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 217 ggtatgggct ttgactac 18 <210> 218 <211> 6 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 218
- 184 030827
Gly Met Gly Phe Asp Tyr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
219
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
219 <400> cgggcaagtc aggccattag aaatgattta ggc <210>
<211>
<212>
<213>
220 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
220 <400>
Arg Ala Ser Gin Ala lie Arg Asn Asp Leu Gly <210>
<211>
<212>
<213>
221
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
221 <400> tctgcatcca gtttgcaaag t <210>
<211>
<212>
<213>
222 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
222 <400>
Ser Ala Ser Ser Leu Gin Ser
5 <210> 223
- 185 030827 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 223 ctacagcata atagtttccc tccgacg 27 <210> 224 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 224
Leu Gin His Asn Ser Phe Pro Pro Thr
5 <210> 225 <211> 30 <212> белок <213> Homo sapiens <400> 225
He Leu Vai Asp Leu Phe Asn Asp Gin Tyr Leu Glu Asp Asn Vai Thr
1 5 10 15
Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Vai Leu Vai Leu Thr Leu Ser
20 25 30
<210> 226 <211> 25 <212> белок <213> Homo sapien
<400> 226
Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro
1 5 10 15
Vai Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Vai
25 <210> 227 <211> 3222 <212> ДНК <213> Homo sapiens
- 186 030827
<400> 227
atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360
gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480
atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540
cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600
gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660
ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720
aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780
gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840
tttgaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900
cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960
tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020
gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080
gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140
cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200
gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260
cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320
ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380
tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440
accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500
cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560
aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagttgct tcagattgac 1620
tattacaacc tgaccaagtt ctacggcaca gtgaaacttg ataccatgat cttcggggtg 1680
atagaatact gtgagagagg atccctccgg gaagttttaa atgacacaat ttcctaccct 1740
- 187 030827
gatggcacat tcatggattg ggagtttaag atctctgtct tgtatgacat tgctaaggga 1800
atgtcatatc tgcactccag taagacagaa gtccatggtc gtctgaaatc taccaactgc 1860
gtagtggaca gtagaatggt ggtgaagatc actgattttg gctgcaattc cattttacct 1920
ccaaaaaagg acctgtggac agctccagag cacctccgcc aagccaacat ctctcagaaa 1980
ggagatgtgt acagctatgg gatcatcgca caggagatca tcctgcggaa agaaaccttc 2040
tacactttga gctgtcggga ccggaatgag aagattttca gagtggaaaa ttccaatgga 2100
atgaaaccct tccgcccaga tttattcttg gaaacagcag aggaaaaaga gctagaagtg 2160
tacctacttg taaaaaactg ttgggaggaa gatccagaaa agagaccaga tttcaaaaaa 2220
attgagacta cacttgccaa gatatttgga ctttttcatg accaaaaaaa tgaaagctat 2280
atggatacct tgatccgacg tctacagcta tattctcgaa acctggaaca tctggtagag 2340
gaaaggacac agctgtacaa ggcagagagg gacagggctg acagacttaa ctttatgttg 2400
cttccaaggc tagtggtaaa gtctctgaag gagaaaggct ttgtggagcc ggaactatat 2460
gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc 2520
acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt 2580
gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt 2640
ttgcctaaga gaaatggcaa tcggcatgca atagacattg ccaagatggc cttggaaatc 2700
ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaat atggattcgc 2760
attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat gcctcgttat 2820
tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg 2880
agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt 2940
tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg 3000
actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag 3060
cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca 3120
gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tctggaatac 3180
ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa 3222
<210> 228 <211> 1073 <212> белок <213> Homo sapiens <400> 228
Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gin 15 10 15
- 188 030827
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gin Vai 25 Ser Gin Asn Cys 30 His Asn
20
Gly Ser Tyr Glu He Ser Vai Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Vai Asn Glu Gly Leu Glu He
50 55 60
Vai Arg Gly Arg Leu Gin Asn Ala Gly Leu Asn Vai Thr Vai Asn Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu He His Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys He Ser Asn Ala
100 105 110
Gin Arg Met Gly Cys Vai Leu He Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met He Ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Vai Asn Phe Trp Lys
165 170 175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Vai
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Leu Glu Ala Ser Vai Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Vai
210 215 220
Vai Leu Arg Gin Asp Lys Glu Phe Gin Asp He Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn Vai lie He Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
- 189 030827
245 250 255
Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp He Val He He Leu
260 265 270
Val Asp Leu Phe Asn Asp Gin Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp
305 310 315 320
Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Gly He Leu Leu Phe Gly His Met Leu
325 330 335
Lys He Phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn He Thr Thr Pro Lys Phe Ala
340 345 350
His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp He Thr Gly Arg Gly Pro Gin He Leu
420 425 430
Met lie Ala Val Phe Thr Leu Thr Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Leu
435 440 445
Val Ala Leu Leu Met Leu Arg Lys Tyr Arg Lys Asp Tyr Glu Leu Arg
450 455 460
Gin Lys Lys Trp Ser His He Pro Pro Glu Asn He Phe Pro Leu Glu
465 470 475 480
- 190 030827
Thr Asn Glu Thr Asn His Vai Ser Leu Lys lie Asp Asp 490 Asp Lys 495 Arg
485
Arg Asp Thr He Gin Arg Leu Arg Gin Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg
500 505 510
Vai He Leu Lys Asp Leu Lys His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys
515 520 525
Gin Lys He Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gin He Asp Tyr Tyr Asn Leu
530 535 540
Thr Lys Phe Tyr Gly Thr Vai Lys Leu Asp Thr Met He Phe Gly Vai
545 550 555 560
He Glu Tyr Cys Glu Arg Gly Ser Leu Arg Glu Vai Leu Asn Asp Thr
565 570 575
lie Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys He Ser
580 585 590
Vai Leu Tyr Asp He Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys
595 600 605
Thr Glu Vai His Gly Arg Leu Lys Ser Thr Asn Cys Vai Vai Asp Ser
610 615 620
Arg Met Vai Vai Lys He Thr Asp Phe Gly Cys Asn Ser lie Leu Pro
625 630 635 640
Pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gin Ala Asn
645 650 655
He Ser Gin Lys Gly Asp Vai Tyr Ser Tyr Gly He He Ala Gin Glu
660 665 670
He He Leu Arg Lys Glu Thr Phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp Arg
675 680 685
Asn Glu Lys He Phe Arg Vai Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe
690 695 700
Arg Pro Asp Leu Phe Leu Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Vai
705 710 715 720
- 191 030827
Туг Leu Leu Vai Lys Asn Cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg 735 Pro
725 730
Asp Phe Lys Lys He Glu Thr Thr Leu Ala Lys He Phe Gly Leu Phe
740 745 750
His Asp Gin Lys Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu He Arg Arg Leu
755 760 765
Gin Leu Tyr Ser Arg Asn Leu Glu His Leu Vai Glu Glu Arg Thr Gin
770 775 780
Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu
785 790 795 800
Leu Pro Arg Leu Vai Vai Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Vai Glu
805 810 815
Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Vai Thr He Tyr Phe Ser Asp He Vai Gly
820 825 830
Phe Thr Thr lie Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu Vai Vai Asp Met
835 840 845
Leu Asn Asp He Tyr Lys Ser Phe Asp His He Vai Asp His His Asp
850 855 860
Vai Tyr Lys Vai Glu Thr He Gly Asp Ala Tyr Met Vai Ala Ser Gly
865 870 875 880
Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn Arg His Ala He Asp He Ala Lys Met
885 890 895
Ala Leu Glu He Leu Ser Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu
900 905 910
Pro Gly Leu Pro He Trp He Arg He Gly Vai His Ser Gly Pro Cys
915 920 925
Ala Ala Gly Vai Vai Gly He Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly
930 935 940
Asp Thr Vai Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu
945 950 955 960
- 192 030827
Arg lie His Val Ser Gly Ser Thr He Ala lie Leu Lys Arg Thr Glu
965 970 975
Cys Gln Phe Leu Tyr Glu Val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg
980 985 990
Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gln Lys Phe
995 1000 1005
Asn Leu 1010 Pro Thr Pro Pro Thr 1015 Val Glu Asn Gln Gln 1020 Arg Leu Gln
Ala Glu Phe Ser Asp Met He Ala Asn Ser Leu Gln Lys Arg Gln
1025 1030 1035
Ala Ala Gly He Arg Ser Gln Lys Pro Arg Arg Val Ala Ser Tyr
1040 1045 1050
Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu Gln Leu Asn Thr Thr Asp Lys
1055 1060 1065
Glu Ser Thr Tyr Phe
1070 <210> 229 <211> 420 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 229
Met 1 Lys Thr Leu Leu 5 Leu Asp Leu Ala Leu Trp Ser 10 Leu Leu Phe Gln 15
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu He Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu He
50 55 60
- 193 030827
Val Arg Gly Arg Leu Gin Asn Ala Gly Leu Asn 75 Val Thr Val Asn Ala 80
65 70
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu He His Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys He Ser Asn Ala
100 105 110
Gin Arg Met Gly Cys Val Leu He Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met He Ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys
165 170 175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val
210 215 220
Val Leu Arg Gin Asp Lys Glu Phe Gin Asp He Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn Val lie He Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
245 250 255
Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala Val Ala Glu Asp He Val He He Leu
260 265 270
Val Asp Leu Phe Asn Asp Gin Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
- 194 030827
Leu 305 Leu Asn Ser Ser Phe 310 Ser Arg Asn Leu Ser 315 Pro Thr Lys Arg Asp 320
Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Gly lie Leu Leu Phe Gly His Met Leu
325 330 335
Lys He Phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn He Thr Thr Pro Lys Phe Ala
340 345 350
His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu
420 <210> 230 <211> 1444 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 230
gaattcctca ccatgggatg gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac agctacaggt 60
gtccactccc aggtgcagct acagcagtgg ggcgcaggac tgttgaagcc ttcggagacc 120
ctgtccctca cctgcgctgt ctttggtggg tctttcagtg gttactactg gagctggatc 180
cgccagcccc cagggaaggg gctggagtgg attggggaaa tcaatcatcg tggaaacacc 240
aacgacaacc cgtccctcaa gagtcgagtc accatatcag tagacacgtc caagaaccag 300
ttcgccctga agctgagttc tgtgaccgcc gcggacacgg ctgtttatta ctgtgcgaga 360
gaacgtggat acacctatgg taactttgac cactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 420
agctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
- 195 030827
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataat agggataaca gggtaatact 1440
agag 1444 <210> 231 <211> 468 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 231
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 lie He Leu Phe Leu 10 Vai Ala Thr Ala Thr 15 Gly
Vai His Ser Gin 20 Vai Gin Leu Gin Gin 25 Trp Gly Ala Gly Leu 30 Leu Lys
Pro Ser Glu 35 Thr Leu Ser Leu Thr 40 Cys Ala Vai Phe Gly 45 Gly Ser Phe
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu
- 196 030827
55 60
Glu 65 Trp Ile Gly Glu Ile 70 Asn His Arg Gly Asn Thr Asn 75 Asp Asn Pro 80
Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin
85 90 95
Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp
115 120 125
Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr
165 170 175
Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr
195 200 205
Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser
275 280 285
- 197 030827
His Glu 290 Asp Pro Glu Val Lys 295 Phe Asn Trp Tyr Val 300 Asp Gly Val Glu
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
325 33 0 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
4 05 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465 <210> 232 <211> 722 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 232 gcggccgcct caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60
- 198 030827
gtgtccactc cgaaatagtg atgacgcagt ctccagccac cctgtctgtg tctccagggg 120
aaagagccac cctctcctgc agggccagtc agagtgttag cagaaactta gcctggtatc 180
agcagaaacc tggccaggct cccaggctcc tcatctatgg tgcatccacc agggccactg 240
gaatcccagc caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga gttcactctc accatcggca 300
gcctgcagtc tgaagatttt gcagtttatt actgtcagca gtataaaacc tggcctcgga 360
cgttcggcca agggaccaac gtggaaatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca 420
tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga 480
ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg 540
gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca 600
gcaccctgac cctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca 660
cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttagtcta 720
да 722 <210> 233 <211> 233 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 233
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 He He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
10 15
Val His Ser Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val
35 40 45
Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg
50 55 60
Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Gly Ser
85 90 95
- 199 030827
Leu Gin Ser Glu 100 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 105 Gin Gin Tyr Lys 110 Thr
Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Val Glu He Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 234 <211> 112 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический primer <400> 234 ataagaatgc ggccgcctca ccatgggatg gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac 60 agctacaggt gtccactccg aaatagtgat gacgcagtct ccagccaccc tg 112 <210> 235 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 200 030827 primer <400> 235 gccaccgtac gtttgatttc cacgttggtc ccttggccga acgtc 45 <210> 236 <211> 103 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический primer <400> 236 ccggaattcc tcaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60 ggtgtccact cccaggtgca gctacagcag tggggcgcag gac 103 <210> 237 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический primer <400> 237 ggaggctgag ctgacggtga ccagggttcc ctggccccag tggtc 45 <210> 238 <211> 352 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 238
caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgc ctccatcagt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggaatg gattgggcgt atctatatca gtgggaggac cagctacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccgtgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatcggcta 300
actgggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag 352
<210> 239 <211> 117
- 201 030827 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 239
Gin 1 Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15
5 10
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Ala Ser He Ser His Tyr
20 25 30
Туг Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Arg lie Tyr He Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Vai Thr Vai Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala
о c: Э 0 Q C
Q —? w/
Arg Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 240 <211> 322 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 240
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccgc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctccctcac tttcggcgga 300
- 202 030827 gggaccaagg tggagatcaa ас 322 <210> 241 <211> 107 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 241
Glu 1 Не Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly He Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105
<210> 242 <211> 353 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 242
caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgc ctccatcagt cattactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggaatg gattgggcgt atctatatca gtgggaggac cagctacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccgtgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
- 203 030827 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatcggcta 300 actgggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc age 353 <210> 243 <211> 117 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 243
Gin 1 Vai Gin Leu Gin Glu Ser 5 Gly Pro Gly Leu Vai 10 Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Ala Ser He Ser His Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Arg lie Tyr He Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Vai Thr Vai Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Vai Thr Vai Ser Ser
115 <210> 244 <211> 329 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 244 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
- 204 030827
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagact ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtgcagtttt 300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaacg 329
<210> 245 <211> 109 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 245 Gin Ser Pro Gly Thr Leu 10 Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu 1 Ile Vai Leu Thr 5
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 246
<211> 362
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 205 030827 <400> 246
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cgctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgc 300
gatttttgga gtggtccatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
gc 362
<210> 247 <211> 120 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 247
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 248
- 206 030827 <211> 323 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 248
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgta gggccagtca gagtgttagt agaagcttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctacggt gcatccacca gggccactgg gatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagatgttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggatgtgcag ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acg 323
<210> 249 <211> 107 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 249 Met Thr Pro Ser Ser Ala Thr Leu Ser Vai Ser Pro 15 Gly
Glu 1 lie Vai
5 10
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Arg Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Met Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105
- 207 030827 <210>
<211>
<212>
<213>
250
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400> cattactact ggagc
250 <210> 251 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 251
His Туг Туг Trp Ser
5 <210> 252 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 252 cgtatctata tcagtgggag gaccagctac aacccctccc tcaagagt 48 <210> 253 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 253
Arg Не Туг Не Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
10 15 <210> 254 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 208 030827
<220> <223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <400> 254 gatcggctaa ctgggtactt tgactac Синтетический 27
<210> <211> <212> <213> 255 9 белок Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: пептид Синтетический
<400> 255 Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 256 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 256 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36
<210> 257
<211> 12
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 257
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 258 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 209 030827 <400> 258 ggtgcatcca gcagggccgc t <210>
<211>
<212>
<213>
259 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
259 <400>
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala 1 <210>
<211>
<212>
<213>
260
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
260 <400> cagcagtatg gtagctccct cact <210>
<211>
<212>
<213>
261 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
261 <400>
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Leu Thr 1 <210>
<211>
<212>
<213>
262
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
262 <400> cattactact ggagc <210> 263
- 210 030827 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 263
Wi а Тли* Тхл-и Т-игл Соу
5 <210> 264 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 264 cgtatctata tcagtgggag gaccagctac aacccctccc tcaagagt 48 <210> 265 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 265
Arg Не Туг Не Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
10 15 <210> 266 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 266 gatcggctaa ctgggtactt tgactac 27 <210> 267 <2H> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 211 030827
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 267 Asp Arg Leu Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 268 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид Синтетический
<400> 268 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36
<210> 269 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: пептид Синтетический
<400> 269 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 270
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 270
ggtacatcca gcagggccac t 21
<210> 271
<211> 7
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид <400> 271
Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr
- 212 030827 <210> <211> <212> <213>
272
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
272 <400> cagcagtatg gtagctcacc catgtgcagt <210>
<211>
<212>
<213>
273 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
273 <400>
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser 1 <210>
<211>
<212>
<213>
274
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
274 <400> cgctatgcca tgaac <210> <211>
<212>
<213>
275 белок
Искусственная последовательность <220>
Описание Искусственной последовательное™: пептид ьинтегическии
275 <400>
Arg Туг Ala Met Asn
5 <210> 276 <211> 51
- 213 030827 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 276 ggtattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 277 <211> 17 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 277
Gly Не Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
10 15
Gly <210> 278 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 278 gatcgcgatt tttggagtgg tccatttgac tac 33 <210> 279 <211> 11 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 279
Asp Arg Asp Phe Trp Ser Gly Pro Phe Asp Tyr
10 <210> 280 <211> 33 <212> ДНК
- 214 030827 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 280 agggccagtc agagtgttag tagaagctta gcc 33
<210> <211> <212> <213> 281 11 белок Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: пептид Синтетический
<400> 281 Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Arg Ser Leu Ala 15 10
<210> 282
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 282
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 283 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 283
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 284
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
- 215 030827 <400> 284 cagcagtata ataactggat gtgcagt 27 <210> 285 <211> 9 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 285
Gin Gin Туг Asn Asn Trp Met Cys Ser
5 <210> 286 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 286
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctttggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caacgacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttcgccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agaacgtgga 300
tacacctatg gtaactttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 287 <211> 119 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 287
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
- 216 030827
Tyr Trp Ser 35 Trp He Arg Gin Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp He
Gly Glu lie Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ala Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 288 <211> 315 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 288
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaggtact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcacccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta tttctgtcag cagtatgaaa ggtcattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggat 315
<210> 289 <211> 105 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 289
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
- 217 030827
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Arg
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Glu Arg Ser Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp
100 105
<210> 290 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 290 ggttactact ggagc 15 <210> 291 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 291
Gly Туг Туг Trp Ser
5 <210> 292 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 218 030827 <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
292 <400>
gaaatcaatc atcgtggaaa caccaacgac aacccgtccc tcaag <210>
<211>
<212>
<213>
293 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
293 <400>
Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 <210>
<211>
<212>
<213>
294
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический
294 <400>
gaacgtggat acacctatgg taactttgac cac <210>
<211>
<212>
<213>
295 белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
295 <400>
Glu Arg Gly Туг Thr Туг Gly Asn Phe Asp His 1 <210>
<211>
<212>
<213>
296
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <400>
296
- 219 030827 agggccagtc agagtgttag cagcaggtac ttagcct <210> 297 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 297
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg Tyr Leu Ala
10 <210> 298 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 298 ggtgcatcca gcagggccac tg <210> 299 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 299
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
5 <210> 300 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 300 cagcagtatg aaaggtcatt cactt 25 <210> 301 <211> 8
- 220 030827 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 301
Gin Gin Туг Glu Arg Ser Phe Thr
5 <210> 302 <211> 5 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> Любая аминокислота <220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Met или Тгр <220>
<221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> Ser или Asn <400> 302
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
5 <210> 303 <211> 15 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223> Любая аминокислота <220>
<221> MOD RES
- 221 030827 <222> (3)..(4) <223> Любая аминокислота <220>
<221> MOD_RES <222> (7) . . (7) <223> Любая аминокислота или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (8) .. (8) <223> Любая аминокислота <220>
<221> MOD_RES <222> (9) . .(9) <223> Thr или Не <220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Туг, Thr, или Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(12) <223> Любая аминокислота <220>
<221> MOD_RES <222> (13) . . (13) <223> Leu или Val <220>
<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser или Gly <400> 303
Хаа Не Хаа Хаа Ser Gly Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Lys Хаа 15 10 15 <210> 304 <211> 12 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> MOD_RES <222> (1) . . (6) <223> Любая аминокислота и этот участок может охватывать 4-6 остатков <220>
- 222 030827 <221> MOD_RES <222> (8)..(10) <223> Любая аминокислота и этот участок может охватывать 2-3 остатка <400> 304
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Gly Хаа Хаа Хаа Asp Туг
10 <210> 305 <211> 16 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223> Arg или Lys <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ala или Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Vai или Leu <220>
<221> MOD_RES <222> (7) . . (7) <223> Ser или Leu <220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(16) <223> Любая аминокислота и этот участок может охватывать 5-9 остатков <400> 305
Хаа Хаа Ser Gin Ser Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа 15 10 15 <210> 306 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность
- 223 030827
<220> <221> MOD RES
<222> <223> (1) · . (2) Любая аминокислота
<220>
<221> MOD RES
<222> (4) . . (4)
<223> Любая аминокислота
<220>
<221> MOD RES
<222> (6) . . (7)
<223> Любая аминокислота
<400> 306
Хаа Хаа Ser Хаа Arg Хаа Хаа
5 <210> 307 <211> 10 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Gin, His, или Met <220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Туг или Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (4) . .(10) <223> Любая аминокислота и этот участок может охватывать 5-7 остатков <400> 307
Хаа Gin Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
10 <210> 308 <211> 702 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
- 224 030827 <400> 308
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgaa 60
atagtgatga cgcagtctcc agccaccctg tctgtgtctc caggggaaag agccaccctc 120
tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcaga aacttagcct ggtatcagca gaaacctggc 180
caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccaccaggg ccactggaat cccagccagg 240
ttcagtggca gtgggtctgg gacagagttc actctcacca tcggcagcct gcagtctgaa 300
gattttgcag tttattactg tcagcagtat aaaacctggc ctcggacgtt cggccaaggg 360
accaacgtgg aaatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 54 0
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgaccctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702
<210> 309 <211> 1407 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 309
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60
gtgcagctac agcagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120
tgcgctgtct ttggtgggtc tttcagtggt tactactgga gctggatccg ccagccccca 180
gggaaggggc tggagtggat tggggaaatc aatcatcgtg gaaacaccaa cgacaacccg 240
tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt cgccctgaag 300
ctgagttctg tgaccgccgc ggacacggct gtttattact gtgcgagaga acgtggatac 360
acctatggta actttgacca ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtcag ctcagcctcc 420
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720
- 225 030827
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380
agcctctccc tgtctccggg taaataa 1407
<210> 310 <211> 1410 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 310
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagccgc tatgccatga actgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcaggtatt agtgggagtg gtggtaggac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actatatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcgcgat 360
ttttggagtg gtccatttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt cagctcagcc 420
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
- 226 030827
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 1410
<210> 311 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид
<400> 311 atgaggctcc ctgctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60
gaaatagtga tgacgccgtc ttcagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agaaacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcaccag tatagtaact ggatgtgcag ttttggccag 360
gggaccaagc tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
- 227 030827 <210> 312 <211> 4 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223 > Leu или Val <220>
<221> MOD_RES <222> (4) . . (4) <223> Ser или Gly <400> 312
Ser Хаа Lys Хаа <210> 313 <211> 7 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Lys или Arg <220>
<221> MOD_RES <222> (2) . . (2) <223> Ala или Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val или Leu <220>
<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser или Leu <400> 313
Хаа Хаа Ser Gln Ser Хаа Хаа
- 228 030827 <210> 314 <211> 10 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 314
Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr
10 <210> 315 <211> 15 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 315
Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp
10 15 <210> 316 <211> 18 <212> белок <213> Escherichia coli <400> 316
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly
10 15
Cys Tyr <210> 317 <211> 638 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 317
Ser Gin Val Ser Gin Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu lie Ser Val
10 15
- 229 030827
Leu Met Met Gly Asn 20 Ser Ala Phe Ala 25 Glu Pro Leu Lys Asn 30 Leu Glu
Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu He Val Arg Gly Arg Leu Gin Asn
35 40 45
Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Leu He His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Arg Lys He Ser Asn Ala Gin Arg Met Gly Cys Val Leu
85 90 95
lie Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Ser Tyr Pro Met He Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys
115 120 125
Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu
130 135 140
Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr
165 170 175
Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr
180 185 190
Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gin Asp Lys Glu
195 200 205
Phe Gin Asp He Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val He He
210 215 220
Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Asp He Val He He Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gin
245 250 255
- 230 030827
Tyr Leu Glu Asp Asn Vai Thr Ala Pro Asp 265 Tyr Met Lys Asn 270 Vai Leu
260
Vai Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser
275 280 285
Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn
290 295 300
Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr
325 330 335
Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Vai Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Vai
340 345 350
Asp Ser Thr Met Vai Leu Leu Tyr Thr Ser Vai Asp Thr Lys Lys Tyr
355 360 365
Lys Vai Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Vai Asn Lys Thr Tyr Pro Vai
370 375 380
Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp
385 390 395 400
Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gin Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
405 410 415
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Vai Phe
420 425 430
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai
450 455 460
Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr
465 470 475 480
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai
485 490 495
- 231 030827
Leu Thr Val Leu 500 His Gin Asp Trp Leu 505 Asn Gly Lys Glu Tyr 510 Lys Cys
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser
515 520 525
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro
530 535 540
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
545 550 555 560
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
565 570 575
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
580 585 590
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
595 600 605
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
610 615 620
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630 635
<210> 318 <211> 707 <212> белок <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 318
Ser 1 Gin Val Ser Gin 5 Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu He 10 Ser 15 Val
Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu
20 25 30
Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu He Val Arg Gly Arg Leu Gin Asn
35 40 45
- 232 030827
Ala Gly Leu Asn Val Thr Val 55 Asn Ala Thr Phe Met 60 Tyr Ser Asp Gly
50
Leu He His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Arg Lys He Ser Asn Ala Gin Arg Met Gly Cys Val Leu
85 90 95
lie Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Ser Tyr Pro Met He Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys
115 120 125
Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu
130 135 140
Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr
165 170 175
Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr
180 185 190
Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gin Asp Lys Glu
195 200 205
Phe Gin Asp He Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val He He
210 215 220
Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Asp He Val He He Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gin
245 250 255
Tyr Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu
260 265 270
Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser
275 280 285
- 233 030827
Arg Asn Leu 290 Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn
295 300
Gly lie Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys He Phe Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
Glu Asn He Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr
325 330 335
Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Vai Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Vai
340 345 350
Asp Ser Thr Met Vai Leu Leu Tyr Thr Ser Vai Asp Thr Lys Lys Tyr
355 360 365
Lys Vai Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Vai Asn Lys Thr Tyr Pro Vai
370 375 380
Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp
385 390 395 400
He Thr Gly Arg Gly Pro Gin Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
405 410 415
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Vai Phe
420 425 430
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai
450 455 460
Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr
465 470 475 480
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai
485 490 495
Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
500 505 510
Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser
- 234 030827
515 520 525
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro
530 535 540
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
545 550 555 560
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
565 570 575
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
580 585 590
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
595 600 605
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
610 615 620
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu Asp Leu
625 630 635 640
Asp Asp Val Cys Ala Glu Ala Gin Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp
645 650 655
Thr Thr He Thr lie Phe He Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr
660 665 670
Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys Val Lys Trp He Phe Ser Ser Val
675 680 685
Val Glu Leu Lys Gin Thr He Ser Pro Asp Tyr Arg Asn Met He Gly
690 695 700
Gin Gly Ala
705 <210> 319 <211> 4 <212> белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 319
Gly Phe Leu Gly

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Молекула антитела к гуанилилциклазе C (GCC), которая содержит три определяющие комплементарность области (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) тяжелой цепи, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 106 (HCDR1), SEQ ID NO: 108 (HCDR2) и SEQ ID NO: 110 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) легкой цепи, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 112 (LCDR1), SEQ ID NO: 114 (LCDR2) и SEQ ID NO: 116 (LCDR3).
    2. Молекула антитела к GCC по п.1, которая дополнительно содержит каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи антитела человека.
    3. Молекула антитела к GCC по п.1 или 2, отличающаяся тем, что молекула анти-GCC антитела представляет собой IgG1 антитело.
    4. Молекула антитела к GCC по любому из пп.1-3, содержащая вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
    5. Молекула антитела к GCC по любому из пп.1-4, где молекула антитела к GCC конъюгирована с
    - 235 030827 цитотоксическим или цитостатическим агентом, обнаруживаемой меткой или радиоактивной меткой.
    6. Молекула антитела к GCC по п.5, где радиоактивная метка содержит а-эмиттер, β-эмиттер или позитрон-эмитирующий радионуклид.
    7. Молекула антитела к GCC по п.6, где а-эмиттер представляет собой 213Bi или 225Ac и β-эмиттер представляет собой 90Y или 177Lu.
    8. Иммуноконъюгат, имеющий структуру формулы (I)
    АЬ—нх—Z ] V >т Ш или его фармацевтически приемлемая соль, где
    Ab представляет собой молекулу антитела к GCC по любому из пп.1-4;
    X представляет собой линкерную часть, которая связывает Ab и Z;
    Z представляет собой терапевтическое средство или метку;
    m представляет собой количество -X-Z компонентов на молекулу антитела к GCC в иммуноконъюгате формулы (I) и m представляет собой целое число от 1 до 15.
    9. Иммуноконъюгат по п.8, где:
    (а) линкер -X- имеет структуру с формулой -Aa-Ww-Yy- и иммуноконъюгат имеет структуру с формулой (II) или её фармацевтически приемлемой солью, где
    -A- представляет собой удлиняющее звено;
    a равен 0 или 1;
    каждый -W- независимо представляет собой аминокислотное звено; w представляет собой целое число в интервале от 0 до 12;
    -Y- представляет собой самоуничтожающееся спейсерное звено; y представляет собой 0, 1 или 2;
    Z представляет собой терапевтическое средство или метку и m представляет собой целое число от 1 до 15; или (b) иммуноконъюгат имеет формулу (I-4) АЬл *s н о < н
    Sih
    Н2мАэ .
    (1-4) или его фармацевтически приемлемая соль, где m представляет собой целое число от 1 (c) иммуноконъюгат имеет формулу (I-5)
    Ab^s о н о к н <S'NH
    H2N^O (1-5) или его фармацевтически приемлемая соль, где m представляет собой целое число от 1 (d) иммуноконъюгат имеет формулу (1-7) до 8; или до 8; или
    АЬ.
    до 8.
    т (1-7) или его фармацевтически приемлемая соль, где m представляет собой целое число от 1
    10. Иммуноконъюгат по п.8 или 9, где m равно от 1 до 3 или от 3 до 5.
    11. Иммуноконъюгат по любому из пп.8-10, где Z является радиоактивной меткой.
    12. Молекула антитела к GCC по п.11, где радиоактивная метка содержит а-эмиттер, β-эмиттер или позитрон-эмитирующий радионуклид.
    13. Молекула антитела к GCC по п.12, где а-эмиттер представляет собой 213Bi или 225Ac и β-эмиттер представляет собой 90Y или 177Lu.
    14. Иммуноконъюгат по любому из пп.8-10, где Z представляет собой цитостатический или цитотоксический агент.
    - 236 030827
    15. Иммуноконъюгат по п.14, где цитостатический или цитотоксический агент выбирают из антиметаболита; алкилирующего агента; антрациклина; антибиотика; антимитотического агента; ингибитора топоизомеразы и ингибитора протеасомы.
    16. Иммуноконъюгат по п.15, где антиметаболит выбирают из азатиоприна, 6-меркаптопурина, 6тиогуанина, флударабина, пентостатина, кладрибина, 5-фторурацила (5FU), флоксуридина (FUDR), арабинозида цитозина (цитарабина), метотрексата, триметоприма, пириметамина и пеметрекседа; алкилирующий агент выбирают из циклофосфамида, мехлоретамина, урамустина, мелфалана, хлорамбуцила, тиотепа/хлорамбуцила, ифосфамида, кармустина, ломустина, стрептозоцина, буфульфана, дибромманнитола, цисплатина, карбоплатина, недаплатина, оксалиплатина, сатраплатина, триплатина тетранитрата, прокарбазина, алтретамина, дакарбазина, митозоломида и темозоломида; антрациклин выбирают из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина или валрубицина; антибиотик выбирают из дактиномицина, блеомицина, митрамицина, антрамицина, стрепрозотоцина, грамицидина D, митомицинов, дуокармицинов и калихеамицинов; антимитотический агент выбран из майтансиноидов, ауристатинов, доластатинов, крипрофицинов, алколоидов барвинка, таксанов и колхицинов; ингибитор топоизомеразы выбирают из иринотекана, топотекана, амсакрина, этопозида, тенипозида и митоксантрона и ингибитор протеасомы представляет собой пептидил бороновую кислоту.
    17. Иммуноконъюгат по п.16, где митомицин представляет собой митомицин C; дуокармицин представляет собой CC-1065; алкалоид барвинка выбирают из винкристина, винбластина, виндезина и винорелбина; таксан представляет собой паклитаксел или доцетаксел.
    18. Иммуноконъюгат по любому из пп.8-10, где Z представляет собой обнаруживаемую метку, майтансиноид или майтансин, доластатин или ауристатин.
    19. Иммуноконъюгат по п.18, где майтансиноид или майтансин представляет собой Ы2-деацетил-
    Ы2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансин (DM1), Ы2'-деацетил-Н2'-(4-меркапто-4-метил-1оксопентил)майтансин (DM4) и ауристатин представляет собой монометил ауристатин E (MMAE) или монометил ауристатин F (MMAF).
    20. Применение молекулы антитела по любому из пп.1-7 для лечения нарушения у субъекта, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    21. Применение комбинации молекулы антитела по любому из пп.1-7 с одним или более дополнительными химиотерапевтическими средствами для лечения нарушения у субъекта, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    22. Применение молекулы антитела по любому из пп.1-7 для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочнокишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    23. Применение комбинации молекулы антитела по любому из пп.1-7 с одним или более дополнительными химиотерапевтическими средствами для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    24. Применение иммуноконъюгата по любому из пп.8-19 для лечения нарушения у субъекта, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    25. Применение комбинации иммуноконъюгата по любому из пп.8-19 с одним или более дополнительными химиотерапевтическими средствами для лечения нарушения у субъекта, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    26. Применение иммуноконъюгата по любому из пп.8-19 для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочнокишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    27. Применение комбинации иммуноконъюгата по любому из пп.8-19 с одним или более дополнительными химиотерапевтическими средствами для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    28. Применение по п.21 или 25, где одно или более дополнительных химиотерапевтических средств
    - 237 030827 содержат 5-фтороурацил (5-FU), капецитабин, лейковорин, иринотекан, оксалиплатин, бевацизумаб, цетуксимаб, панитумум или их комбинацию.
    29. Применение по п.23 или 27, где одно или более дополнительных химиотерапевтических средств содержат 5-фтороурацил (5-FU), капецитабин, лейковорин, иринотекан, оксалиплатин, бевацизумаб, цетуксимаб, панитумум или их комбинацию.
    30. Применение по п.28, где комбинация дополнительных химиотерапевтических средств представляет собой оксалиплатин/капецитабин (XELOX), 5-FU/лейковорин/оксалиплатин (FOLFOX), 5FU/лейковорин/иринотекан (FOLFIRI), FOLFOX плюс бевацизумаб или FOLFIRI плюс бевацизумаб.
    31. Применение по п.29, где комбинация дополнительных химиотерапевтических средств представляет собой оксалиплатин/капецитабин (XELOX), 5-FU/лейковорин/оксалиплатин (FOLFOX), 5FU/лейковорин/иринотекан (FOLFIRI), FOLFOX плюс бевацизумаб или FOLFIRI плюс бевацизумаб.
    32. Применение по п.21 или 25, где одно или более дополнительных химиотерапевтических средств включают повреждающее ДНК средство; ингибитор топоизомеразы I; ингибитор топоизомеразы II; алкилирующий агент; ДНК-интеркалятор; генератор свободных радикалов; нуклеозидный миметик или средство, нарушающее клеточную репликацию.
    33. Применение по п.23 или 27, где одно или более дополнительных химиотерапевтических средств содержат повреждающее ДНК средство, ингибитор топоизомеразы I, ингибитор топоизомеразы II, алкилирующий агент, ДНК-интеркалятор, генератор свободных радикалов, нуклеозидный миметик или средство, нарушающее клеточную репликацию.
    34. Применение по п.32, где ингибитор топоизомеразы I выбирают из иринотекана, топотекана, камптотецина и их аналогов или метаболитов и доксорубицина; ингибитор топоизомеразы II выбирают из этопозида, тенипозида и даунорубицина; алкилирующий агент выбирают из мелфалана, хлорамбуцила, бусульфана, тиотепы, ифосфамида, кармустина, ломустина, семустина, стрептозоцина, декарбазина, метотрексата, митомицина C и циклофосфамида; ДНК-интеркалятор выбирают из цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина; генератор свободных радикалов представляет собой блеомицин; нуклеозидный миметик выбирают из 5-фторурацила, капецитабина, гемцитабина, флударабина, цитарабина, меркаптопурина, тиогуанина, пентостатина и гидроксимочевины, и средство, которое нарушает клеточную репликацию, выбирают из паклитаксела, доцетаксела, родственных аналогов паклитаксела или доцетаксела, винкристина, винбластина, родственных аналогов винкристина или винбластина, талидомида, леналидомида, родственных аналогов талидомида или леналидомида, ингибиторов протеин-тирозинкиназы, ингибиторов протеасомы, ингибиторов NF-kB и IkB киназы, антител, которые связывают белки, сверхэкспрессирующиеся в раковых опухолях, и таким образом снижают клеточную репликацию и других ингибиторов белков или ферментов, известных как имеющих повышенное содержание, сверхэкспрессированных или активированных в раковых опухолях, ингибирование которых снижает клеточную репликацию.
    35. Применение по п.33, где ингибитор топоизомеразы I выбирают из иринотекана, топотекана, камптотецина и их аналогов или метаболитов и доксорубицина; ингибитор топоизомеразы II выбирают из этопозида, тенипозида, и даунорубицина; алкилирующий агент выбирают из мелфалана, хлорамбуцила, бусульфана, тиотепы, ифосфамида, кармустина, ломустина, семустина, стрептозоцина, декарбазина, метотрексата, митомицина C и циклофосфамида; ДНК-интеркалятор выбирают из цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина; генератор свободных радикалов представляет собой блеомицин; нуклеозидный миметик выбирают из 5-фторурацила, капецитабина, гемцитабина, флударабина, цитарабина, меркаптопурина, тиогуанина, пентостатина и гидроксимочевины, и средство, которое нарушает клеточную репликацию, выбирают из паклитаксела, доцетаксела, родственных аналогов паклитаксела или доцетаксела, винкристина, винбластина, родственных аналогов винкристина или винбластина, талидомида, леналидомида, родственных аналогов талидомида или леналидомида, ингибиторов протеинтирозин киназы, ингибиторов протеасомы, ингибиторов NF-kB и IkB киназы, антител, которые связывают белки, сверхэкспрессирующиеся в раковых опухолях, и таким образом снижают клеточную репликацию и других ингибиторов белков или ферментов, известных как имеющих повышенное содержание, сверхэкспрессированных или активированных в раковых опухолях, ингибирование которых снижает клеточную репликацию.
    36. Применение по п.34, где родственный аналог талидомида или леналидомида представляет собой CC-5013 или CC-4047; ингибитор протеин-тирозинкиназы представляет собой иматиниб мезилат или гефитиниб; ингибитор протеасомы представляет собой бортезомиб; и антитело, которое связывает белки, сверхэкспрессирующиеся в раковых опухолях, и таким образом снижает клеточную репликацию, выбирают из трастузумаба, ритуксимаба, цетуксимаба и бевацизумаба.
    37. Применение по п.35, где родственный аналог талидомида или леналидомида представляет собой CC-5013 или CC-4047; ингибитор протеинтирозинкиназы представляет собой иматиниб мезилат или гефитиниб; ингибитор протеасомы представляет собой бортезомиб; и антитело, которое связывает белки, сверхэкспрессирующиеся в раковых опухолях, и таким образом снижает клеточную репликацию, выбирают из трастузумаба, ритуксимаба, цетуксимаба и бевацизумаба.
    - 238 030827
    38. Способ лечения нарушения у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества молекулы антитела по любому из пп.1-7 субъекту, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечной системы или ее метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    39. Способ лечения нарушения у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества иммуноконъюгата по любому из пп.8-19 субъекту, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    40. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения у субъекта, содержащая молекулу антитела по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    41. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения у субъекта, содержащая иммуноконъюгат по любому из пп.8-19 и фармацевтически приемлемый носитель, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    42. Фармацевтическая композиция по п.40 или 41, содержащая несколько иммуноконъюгатов, имеющих структуру формулы (I), где m представляет собой среднее число -X-Z компонентов на молекулу антитела к GCC.
    43. Фармацевтическая композиция по п.42, где m означает целое число 4.
    44. Изолированная нуклеиновая кислота, которая кодирует молекулу антитела по любому из пп.1-7 или вариабельный участок молекулы антитела по любому из пп.1-7.
    45. Изолированная нуклеиновая кислота по п.44, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 и/или SEQ ID NO: 19.
    46. Изолированная клетка, экспрессирующая молекулу антитела или вариабельный участок молекулы антитела, где клетка включает изолированную нуклеиновую кислоту по п.44 или 45.
    47. Способ получения молекулы антитела по любому из пп.1-7, который включает культивирование клетки по п.46 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы антитела.
    48. Вектор экспрессии, который включает изолированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или оба вариабельных участков легкой цепи и тяжелой цепи молекулы антитела по любому из пп.1-7.
    49. Способ обнаружения молекулы GCC в образце, включающий контактирование образца с молекулой антитела по любому из пп.1-7 и определение наличия связывания молекулы антитела с молекулой GCC в образце.
    50. Контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по любому из пп.40-43.
    51. Набор, содержащий молекулу антитела по любому из пп.1-7 и инструкции по применению молекулы антитела при лечении нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы и рака легких.
    52. Набор, содержащий молекулу антитела по любому из пп.1-7 и инструкции по применению молекулы антитела для обнаружения молекулы GCC в образце.
    53. Набор, содержащий иммуноконъюгат по любому из пп.8-19 и инструкции по применению иммуноконъюгата при лечении нарушения, где нарушение представляет собой рак, выбранный из рака желудочно-кишечного тракта или его метастатического поражения, первичного или метастатического колоректального рака, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы или рака легких.
    54. Набор, содержащий иммуноконъюгат по любому из пп.8-19 и инструкции по применению иммуноконъюгата для обнаружения молекулы GCC в образце.
    - 239 030827
    Эффективность 5F9-vcMMAF, 5F9-DM1, 5F9-DM4 у 293-GCC несущих SCID мышей, используя схему q14d (CPGC-06-EF04)
    Носитель ·..... 209-vcMMAF (150 мкг/кг MMAF экв)
    209-DM1 (150 мкг/кг ЦМ1экв) ····*··“ Sc209DM4 (150 МКг/кг ОМ4экв) --*— 5F9-VCMMAF (150 мкг/кг ММАРэкв) ......· - 5F9-DM1 (150 мкг/кг DM 1 экв)
    5F9-DM4(150 мкг/кг ОМДэкв) ----5F9-VCMMAF (75 мкг/кг ММАБэкв) ---5F9-DM1 (75 мкг/кг DM1 экв) —о—5F9-DM4 (75 мкг/кг 0М4экв)
    Фиг. 1
    Фиг. 2
    Среднее
    Фиг. 3
    1.2’ 1 I 0.8- 0.6- 0.4 0.2-
    Носитель ] 2091 μγ/κι
    Группы
    Т тест: носитель отн. 209 40 мг/кг носитель отн. 5F9 40 мг/кг носитель отн. 5F910 мг/кг ϋ Носитель
    Ώ|20§]40 мг'кг □ 5F9 40 мг/кг □ 5F9 10 «г/кг □ Нормальные мыши мыши
    Фиг. 4 о
EA201270365A 2009-10-23 2010-10-22 Анти-gcc антитело и его применения EA030827B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25447409P 2009-10-23 2009-10-23
PCT/US2010/053686 WO2011050242A1 (en) 2009-10-23 2010-10-22 Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270365A1 EA201270365A1 (ru) 2012-09-28
EA030827B1 true EA030827B1 (ru) 2018-10-31

Family

ID=43900696

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792376A EA201792376A3 (ru) 2009-10-23 2010-10-22 Молекулы анти-gcc антитела и соответствующие композиции и способы
EA201270365A EA030827B1 (ru) 2009-10-23 2010-10-22 Анти-gcc антитело и его применения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792376A EA201792376A3 (ru) 2009-10-23 2010-10-22 Молекулы анти-gcc антитела и соответствующие композиции и способы

Country Status (32)

Country Link
US (3) US8785600B2 (ru)
EP (2) EP2490720B1 (ru)
JP (2) JP5925684B2 (ru)
KR (2) KR20170123723A (ru)
CN (3) CN102573908B (ru)
AR (1) AR078751A1 (ru)
AU (1) AU2010310545C1 (ru)
BR (1) BR112012007523A2 (ru)
CA (2) CA2774032C (ru)
CL (1) CL2012000806A1 (ru)
CR (1) CR20120124A (ru)
DO (1) DOP2012000066A (ru)
EA (2) EA201792376A3 (ru)
EC (1) ECSP12011761A (ru)
ES (1) ES2788457T3 (ru)
GE (2) GEP20196956B (ru)
IL (3) IL218763A (ru)
IN (1) IN2012DN02604A (ru)
MA (1) MA33601B1 (ru)
MX (3) MX366890B (ru)
MY (1) MY173390A (ru)
NZ (2) NZ598791A (ru)
PE (1) PE20121542A1 (ru)
PH (2) PH12012500665B1 (ru)
PL (1) PL2490720T3 (ru)
SA (1) SA110310795B1 (ru)
SG (3) SG179567A1 (ru)
TN (1) TN2012000122A1 (ru)
TW (2) TWI483736B (ru)
UA (1) UA108991C2 (ru)
WO (1) WO2011050242A1 (ru)
ZA (1) ZA201201944B (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7981420B2 (en) 2000-12-22 2011-07-19 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foederung Der Wissenschaften E.V. Therapeutic use of antibodies directed against repulsive guidance molecule (RGM)
CA2624562A1 (en) 2005-09-30 2007-04-12 Abbott Gmbh & Co. Kg Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (rgm) protein family and functional fragments thereof, and their use
EP2033971A1 (de) * 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
TWI483736B (zh) 2009-10-23 2015-05-11 Millennium Pharm Inc 抗－ｇｃｃ抗體分子及其相關之組合物及方法
AU2010329955A1 (en) * 2009-12-08 2012-05-24 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the RGM A protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
KR101844479B1 (ko) 2011-11-17 2018-04-03 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
IL316441A (en) 2012-01-27 2024-12-01 Abbvie Inc Composition and method for diagnosing and treating diseases associated with axonal degeneration of nerve cells
KR102046435B1 (ko) 2012-04-27 2019-11-19 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 항-gcc 항체 분자 및 gcc-표적화 치료법에 대한 감수성을 평가하기 위한 그 용도
KR102427777B1 (ko) 2012-06-26 2022-08-01 델 마 파마슈티컬스 디안하이드로갈락티톨, 디아세틸디안하이드로갈락티톨, 디브로모둘시톨, 또는 그의 유사체 또는 유도체를 이용하여 유전학적 다형성이 있는 환자에 있어서 티로신-키나아제-억제제 내성 악성종양, ahi1 조절곤란 또는 돌연변이를 치료하는 방법
KR20150122730A (ko) * 2013-02-28 2015-11-02 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 암의 치료에서 항-gcc 항체-약물 콘주게이트 및 dna 손상 제제의 투여
MY183572A (en) * 2013-03-15 2021-02-26 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
JP2016519684A (ja) 2013-04-08 2016-07-07 デニス エム ブラウン 準最適に投与された薬物療法の有効性を改善するための及び／又は副作用を低減するための方法および組成物
JP2015209384A (ja) * 2014-04-24 2015-11-24 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 医薬製剤
UY37111A (es) * 2016-02-05 2017-08-31 Ole Peter Veiby Conjugados de anticuerpo y fármaco dirigidos contra gcc
EP3436059B1 (en) 2016-04-01 2022-01-12 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
US10654934B2 (en) 2016-04-01 2020-05-19 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي
KR101928079B1 (ko) 2016-12-12 2018-12-11 한화케미칼 주식회사 디시클로펜타디엔계 수지의 제조 방법 및 디시클로펜타디엔계 수지
CN108452318B (zh) * 2017-02-17 2023-05-26 浙江特瑞思药业股份有限公司 靶向cd20的抗体偶联药物及其制备方法和用途
CN108452319A (zh) * 2017-02-20 2018-08-28 浙江特瑞思药业股份有限公司 靶向cd20的抗体偶联药物制剂
AU2019236307A1 (en) * 2018-03-16 2020-10-22 Thomas Jefferson University Anti-GUCY2C chimeric antigen receptor compositions and methods
TWI803637B (zh) * 2018-05-23 2023-06-01 美商輝瑞大藥廠 特異性針對gucy2c之抗體及其用途
US12240915B2 (en) 2018-08-30 2025-03-04 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
JP7604396B2 (ja) 2019-05-10 2024-12-23 武田薬品工業株式会社 抗体薬物複合体
WO2021076559A1 (en) * 2019-10-14 2021-04-22 The Scripps Research Institute Human broadly neutralizing antibodies against the membrane-proximal external region of hiv env for vaccine design and intervention
WO2022098372A1 (en) * 2020-11-07 2022-05-12 Thomas Jefferson University Anti-gucy2c vaccines and vaccination
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
WO2021205325A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Pfizer Inc. Anti-gucy2c antibodies and uses thereof
US12043654B2 (en) * 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) * 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202302626A (zh) 2021-02-15 2023-01-16 日商武田藥品工業股份有限公司 用於調節ｔｇｆ－ｂ信息傳導之細胞療法組成物及方法
KR102760955B1 (ko) * 2021-04-07 2025-02-03 주식회사 엘지화학 Gucy2c 결합 폴리펩타이드 및 그의 용도
CN115521379B (zh) * 2021-07-16 2023-12-22 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 Pd-1抗体及其用途
WO2024067762A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibody and chimeric antigen receptors targeting gcc and methods of use thereof
WO2024109877A1 (en) * 2022-11-23 2024-05-30 Full-Life Technologies Hk Limited Antibody specifically binding to gcc
CN116535514B (zh) * 2023-06-15 2024-02-02 上海斯丹赛生物技术有限公司 抗鸟苷酸环化酶c抗体及其在癌症治疗中的应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030099656A1 (en) * 2001-01-26 2003-05-29 Patti Joseph M. Monoclonal antibodies to the ClfA protein and method of use in treating or preventing infections
US20030147809A1 (en) * 2001-12-28 2003-08-07 Jean Gudas Antibodies against the MUC18 antigen
US20030165496A1 (en) * 2000-12-06 2003-09-04 Elan Pharmaceuticals, Inc. Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20040081651A1 (en) * 2001-04-13 2004-04-29 Michael Karpusas Antibodies to vla-1
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands
US20060024297A1 (en) * 2003-08-12 2006-02-02 Dyax Corp. Tie complex binding proteins
US20060246071A1 (en) * 2004-12-21 2006-11-02 Larry Green Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US20080124345A1 (en) * 2005-12-30 2008-05-29 Mike Rothe Antibodies directed to HER-3 and uses thereof
US20090005257A1 (en) * 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
US20090041717A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor

Family Cites Families (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US35500A (en) 1862-06-10 Improvement in dampers
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4289747A (en) 1978-12-26 1981-09-15 E-Y Laboratories, Inc. Immunological determination using lectin
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8800077D0 (en) 1988-01-05 1988-02-10 Ciba Geigy Ag Novel chimeric antibodies
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
FI102355B1 (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
EP0486622B1 (en) 1989-08-09 1998-11-04 Rhomed, Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
US5237051A (en) 1990-12-06 1993-08-17 Vanderbilt University Purified enterotoxin receptor protein
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
CA2087413A1 (en) 1992-01-17 1993-07-18 Joseph R. Lakowicz Fluorescent energy transfer immunoassay
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
EP0592677B1 (en) 1992-02-18 2001-11-07 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha Beta-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
PT656946E (pt) 1992-08-21 2001-12-28 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
ATE259648T1 (de) 1993-10-26 2004-03-15 Univ Jefferson Verbindungen die kolorektale krebszellen spezifisch binden und verfahren für ihre herstellung
US5518888A (en) 1993-10-26 1996-05-21 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
US7097839B1 (en) * 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
US5879656A (en) 1993-10-26 1999-03-09 Thomas Jefferson University Methods of treating metastatic colorectal cancer with ST receptor binding compounds
US5601990A (en) 1994-09-13 1997-02-11 Thomas Jefferson University Methods of diagnosing colorectal tumors and metastasis thereof
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US6455251B1 (en) 1994-09-13 2002-09-24 Thomas Jefferson University Methods of and kits and compositions for diagnosing colorectal tumors and metastasis thereof
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
WO1997023243A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
WO1997042506A1 (en) 1996-05-03 1997-11-13 Thomas Jefferson University Methods of and kits and compositions for diagnosing colorectal tumors and metastasis thereof
EP0951475B1 (en) 1996-05-03 2003-07-16 Thomas Jefferson University Metastatic colorectal cancer vaccine
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US6340463B1 (en) 1996-08-14 2002-01-22 Vanderbilt University Identification of antigenic peptide sequences
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
GB9700154D0 (en) 1997-01-07 1997-02-26 Primapharma Ltd Peptides
CA2282504A1 (en) 1997-02-25 1998-08-27 Jun-Ping Xu Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
US6120995A (en) 1997-08-07 2000-09-19 Thomas Jefferson University Compositions that specifically bind to colorectal cancer cells and methods of using the same
US6197582B1 (en) 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6696550B2 (en) 1998-07-23 2004-02-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
EP1144452B1 (en) 1998-11-03 2006-01-11 Centocor, Inc. Modified antibodies and antibody fragments with increased duration of activity
US8092514B1 (en) 1998-11-16 2012-01-10 Boston Scientific Scimed, Inc. Stretchable anti-buckling coiled-sheet stent
ES2278463T3 (es) 1998-12-08 2007-08-01 Biovation Limited Metodo para reducir la inmunogenicidad de proteinas.
US6132922A (en) 1999-01-06 2000-10-17 Advanced Color Technology, Inc. Liquid developer for electrophotographic printing apparatus
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
CA2369292C (en) 1999-04-09 2010-09-21 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of modulating the activity of functional immune molecules
AU5870800A (en) * 1999-06-09 2000-12-28 Ljl Biosystems, Inc. Cell-signaling assays
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
PT1242401E (pt) 1999-11-24 2007-03-30 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo taxanos e o seu uso terapêutico
FR2805994A1 (fr) 2000-03-10 2001-09-14 Agronomique Inst Nat Rech Methode de detection de la guanylyl cyclase-c et son utilisation pour le diagnostic des tumeurs colorectales metastatiques
JP5122713B2 (ja) * 2000-03-27 2013-01-16 トーマス ジェファーソン ユニバーシティ 癌細胞を同定およびターゲティングするための組成物および方法
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
CA2441970C (en) 2001-03-29 2013-01-22 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Guanylate cyclase receptor agonists for the treatment of tissue inflammation and carcinogenesis
US20040152868A1 (en) 2001-03-30 2004-08-05 Larsen Bjarne Due Compositions and methods for modulating guanylyl cyclase signaling receptor (gc-c) activity and for treating meniere's disease
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
PT1419179E (pt) 2001-08-10 2010-03-16 Univ Aberdeen Domínios de ligação de antigenes
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20030186302A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-02 Yixin Wang Colorectal cancer diagnostics
ES2544527T3 (es) 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
US7371727B2 (en) 2003-01-28 2008-05-13 Microbia, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US7304036B2 (en) 2003-01-28 2007-12-04 Microbia, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2004071436A2 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Thomas Jefferson University The use of gcc ligands
US7628986B2 (en) * 2003-06-27 2009-12-08 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
BR122018071968B8 (pt) 2003-11-06 2021-07-27 Seattle Genetics Inc conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
US7662936B2 (en) 2004-04-07 2010-02-16 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
ES2451496T3 (es) 2004-06-25 2014-03-27 Thomas Jefferson University Ligandos de guanilato ciclasa C
JP2008519863A (ja) 2004-11-12 2008-06-12 シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2010093928A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ros expression in human cancer
WO2007113648A2 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
US7767206B2 (en) 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
CA3089569C (en) 2007-06-04 2023-12-05 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, cancer and other disorders
DK2188306T3 (en) 2007-08-10 2016-08-22 Janssen Biotech Inc IMMUNOGLOBULIN CLUTCH FRAGMENTS AS DISEASE INDICATORS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION AND BINDING OF SUCH
US7968687B2 (en) 2007-10-19 2011-06-28 Seattle Genetics, Inc. CD19 binding agents and uses thereof
CN101925612A (zh) 2007-11-27 2010-12-22 维文蒂阿生物技术公司 针对癌相关的nfkbib变体的表位的抗体及其用途
KR101651796B1 (ko) 2007-11-30 2016-08-26 제넨테크, 인크. Ｖｅｇｆ 다형성 및 항―혈관신생 요법
CA2760050A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Thomas Jefferson University Guanylyl cyclase c qrt-pcr
JP2011523662A (ja) 2008-06-04 2011-08-18 シナジー ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 胃腸障害、炎症、癌、およびその他の障害の治療のために有用なグアニル酸シクラーゼのアゴニスト
WO2010009319A2 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal, inflammation, cancer and other disorders
WO2010065293A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Antibodies for guanylyl cyclase receptors
CN102333887B (zh) 2009-02-25 2014-04-02 戴格努生命科学公司 用于检测gi癌转移的方法
US8598188B2 (en) 2009-03-12 2013-12-03 Kinki University Method for predicting therapeutic efficacy of chemotherapy on non-small-cell lung cancer
WO2010147684A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Thomas Jefferson University Compositions for and methods of activating guanylyl cyclase c
WO2011066048A1 (en) 2009-10-22 2011-06-03 Thomas Jefferson University Cell-based anti-cancer compositions and methods of making and using the same
TWI483736B (zh) 2009-10-23 2015-05-11 Millennium Pharm Inc 抗－ｇｃｃ抗體分子及其相關之組合物及方法
EP2808344A1 (en) 2010-06-01 2014-12-03 Monash University Antibodies directed to the receptor tyrosine kinase c-Met
BR112013001879A2 (pt) 2010-08-13 2019-09-03 Hoffmann La Roche "método para aprefeiçoar o efeito de tratamento em um paciente que sofre de câncer gástrico, método in vitro, kit, uso de um olignucleotídeo ou polipetídio e uso de bevacizumabe"
WO2013016662A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Diagnosis and treatment of parkinson's disease
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
KR102046435B1 (ko) 2012-04-27 2019-11-19 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 항-gcc 항체 분자 및 gcc-표적화 치료법에 대한 감수성을 평가하기 위한 그 용도
KR20150122730A (ko) 2013-02-28 2015-11-02 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 암의 치료에서 항-gcc 항체-약물 콘주게이트 및 dna 손상 제제의 투여
JP2017503763A (ja) 2013-12-03 2017-02-02 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｇｃｃ発現細胞を撮像するための化合物及び組成物
UY37111A (es) 2016-02-05 2017-08-31 Ole Peter Veiby Conjugados de anticuerpo y fármaco dirigidos contra gcc
EP3436059B1 (en) 2016-04-01 2022-01-12 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20030165496A1 (en) * 2000-12-06 2003-09-04 Elan Pharmaceuticals, Inc. Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20030099656A1 (en) * 2001-01-26 2003-05-29 Patti Joseph M. Monoclonal antibodies to the ClfA protein and method of use in treating or preventing infections
US20040081651A1 (en) * 2001-04-13 2004-04-29 Michael Karpusas Antibodies to vla-1
US20030147809A1 (en) * 2001-12-28 2003-08-07 Jean Gudas Antibodies against the MUC18 antigen
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands
US20090005257A1 (en) * 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
US20060024297A1 (en) * 2003-08-12 2006-02-02 Dyax Corp. Tie complex binding proteins
US20060246071A1 (en) * 2004-12-21 2006-11-02 Larry Green Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US20080124345A1 (en) * 2005-12-30 2008-05-29 Mike Rothe Antibodies directed to HER-3 and uses thereof
US20090041717A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor

Also Published As

Publication number Publication date
GEP20166504B (en) 2016-06-27
NZ623607A (en) 2016-07-29
TW201132352A (en) 2011-10-01
IL260285B (en) 2019-08-29
JP2016028603A (ja) 2016-03-03
CL2012000806A1 (es) 2012-08-03
US20140322233A1 (en) 2014-10-30
PL2490720T3 (pl) 2020-08-24
CA3031851C (en) 2020-07-07
EP2490720B1 (en) 2020-02-12
JP5925684B2 (ja) 2016-05-25
AU2010310545C1 (en) 2015-04-30
CA3031851A1 (en) 2011-04-28
AR078751A1 (es) 2011-11-30
CA2774032A1 (en) 2011-04-28
MY173390A (en) 2020-01-22
UA108991C2 (uk) 2015-07-10
AU2010310545A1 (en) 2012-05-17
EP3520816A2 (en) 2019-08-07
JP2013507968A (ja) 2013-03-07
EA201270365A1 (ru) 2012-09-28
CN102573908A (zh) 2012-07-11
US10941211B2 (en) 2021-03-09
CN102573908B (zh) 2014-12-17
NZ598791A (en) 2014-05-30
SG10202011656XA (en) 2020-12-30
WO2011050242A1 (en) 2011-04-28
TWI583394B (zh) 2017-05-21
KR20120128120A (ko) 2012-11-26
US20180355062A1 (en) 2018-12-13
TN2012000122A1 (en) 2013-09-19
MX2019008956A (es) 2019-09-13
EP2490720A4 (en) 2013-06-05
CN110054692A (zh) 2019-07-26
IL218763A0 (en) 2012-06-28
KR20170123723A (ko) 2017-11-08
EP3520816B1 (en) 2022-08-31
SG179567A1 (en) 2012-05-30
PE20121542A1 (es) 2012-12-06
US8785600B2 (en) 2014-07-22
EP2490720A1 (en) 2012-08-29
MX2012003198A (es) 2012-06-12
PH12012500665B1 (en) 2019-10-30
US20110110936A1 (en) 2011-05-12
IN2012DN02604A (ru) 2015-09-04
IL218763A (en) 2016-10-31
SA110310795B1 (ar) 2014-07-14
TWI483736B (zh) 2015-05-11
AU2010310545A8 (en) 2012-10-11
SG10201407757XA (en) 2015-01-29
DOP2012000066A (es) 2013-04-15
EA201792376A2 (ru) 2018-03-30
IL247842B (en) 2018-06-28
KR101834890B1 (ko) 2018-04-20
EA201792376A3 (ru) 2018-08-31
CA2774032C (en) 2019-03-26
IL260285A (en) 2018-07-31
GEP20196956B (en) 2019-03-25
MX366890B (es) 2019-07-30
TW201524517A (zh) 2015-07-01
CN104447996A (zh) 2015-03-25
AU2010310545B2 (en) 2014-11-06
PH12019500438A1 (en) 2020-07-20
ZA201201944B (en) 2013-05-29
ES2788457T3 (es) 2020-10-21
MA33601B1 (fr) 2012-09-01
ECSP12011761A (es) 2012-05-30
CR20120124A (es) 2012-07-04
BR112012007523A2 (pt) 2017-06-20
PH12012500665A1 (en) 2012-10-29
EP3520816A3 (en) 2019-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101834890B1 (ko) 항­ｇｃｃ 항체 분자와 관련 조성물 및 방법
US12233155B2 (en) Polynucleotides encoding antibodies which bind the EC3 domain of cadherin-6 (CDH6) and possess internalization ability
JP6629837B2 (ja) 抗ｐｔｋ７抗体−薬物コンジュゲート
CN101939336B (zh) Axl抗体
KR102046435B1 (ko) 항-gcc 항체 분자 및 gcc-표적화 치료법에 대한 감수성을 평가하기 위한 그 용도
KR20200060471A (ko) Cd39/cd73 축을 통한 t 세포 활성의 복원
WO2005058967A2 (en) Novel anti-insulin/igf-i hybrid receptor or anti-insulin/igf-i hybrid receptor and igf-ir antibodies and uses thereof
KR20170140424A (ko) 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체
CN113382750A (zh) Cdcp1靶向疗法
KR20210107731A (ko) Pmel17에 대한 항체 및 이의 접합체
US20240390512A1 (en) Methods of treating chemotherapy-resistant cancer with an antibody-drug conjugate
KR20150122730A (ko) 암의 치료에서 항-gcc 항체-약물 콘주게이트 및 dna 손상 제제의 투여
KR20160072268A (ko) 항-efna4 항체-약물 접합체
RU2831785C2 (ru) Антитела к рмel17 и конъюгаты на их основе

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment