TW202302626A - 用於調節ｔｇｆ－ｂ信息傳導之細胞療法組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供使用多肽來調節轉形生長因子-β (TGFβ)信息傳導（例如TGFβ受體、特異性地與TGFβ或TGFβ受體結合之抗體或其抗原結合片段）的方法。也提供包含有抗體或其片段之組成物以及使用該組成物治療涉及TGFβ活性之疾病的方法。亦揭示包含該等抗原結合劑及其片段之核酸、重組表現載體、宿主細胞、抗原結合片段及醫藥組成物。本發明亦提供用於利用TGFβ信息傳導調節劑之治療方法。

Description

用於調節TGF-B信息傳導之細胞療法組成物及方法

無。

使用靶向癌症特定抗原之經改造細胞的免疫療法已在一些癌症的治療中展現功效。然而，惡性細胞會適應生成免疫抑制微環境來保護其免受免疫辨識及消滅。腫瘤微環境中的高TGFβ含量會促進一些類型的癌細胞的維持及病情發展。腫瘤微環境對於涉及刺激免疫反應的治療方法造成重大挑戰，諸如標靶細胞療法的情況下。因此，期待有用於治療癌症之新穎治療策略。

本發明提供一種供使用於治療癌症（例如，實體瘤）之調節TGFβ信息傳導的新穎系統。本發明係部分基於發現到調節轉形生長因子β (TGF-β)的信息傳導可增進過繼性細胞療法，諸如標靶工程化嵌合抗原受體(CAR)療法。調節TGF-β信息傳導，諸如受本文所述之抗體系統（例如抗TGF-β或抗TGF-βR）、TGF-βR2之抗原結合片段或重組細胞外結構域所影響，會減輕腫瘤中的免疫抑制微環境且增強免疫療法的功效。

基於T細胞之免疫療法已成為合成生物學的新前沿；多重啟動子及基因產物設計為使這些高活性細胞轉向腫瘤微環境，其中T細胞可避開負面的調節信號且介導有效腫瘤毒殺。通過用AP1903對誘導型凋亡蛋白酶9 (caspase 9)進行藥物誘導可消除不需要的T細胞，其顯現出一種以藥理學方式啟動控制T細胞群的強力開關之方法(Di Stasi A等人，N Engl J Med. 2011; 365(18):1673-83)。因此，雖然CAR呈現出可以類似於內源性T細胞受體之方式觸發T細胞活化，但迄今為止，此技術的臨床應用的主要阻礙在於CAR+ T細胞的體內擴增有限，在輸注後細胞快速消失，且臨床活性令人失望。因此，本領域中有迫切需要找出使用可展現具特異性且具功效的抗腫瘤效果之方式來治療癌症的新穎組成物及方法而沒有不想要的影響(亦即高毒性、療效不足)。

本發明藉由提供包含有CAR及表現於免疫細胞（例如T細胞）中之TGFβ信息傳導路徑調節劑的免疫調節系統來解決此等需求。包含有該免疫調節系統之組成物及治療方法係可用於治療癌症及其他疾病及/或病狀。具體而言，本發明提供表現有裝甲化CAR之經改造免疫細胞，其可用於治療與TGFβ的調節失調相關的疾病、病症或病狀（例如癌症、實體瘤）。共同表現TGFβ調節劑之裝甲化CAR T細胞在經轉導的T細胞上展現出高度表面表現的CAR，並增進癌細胞的細胞溶解。因此，本發明提供了使用包含有調節TGF-b信息傳導之多肽的免疫調節系統（例如，經改造CAR T細胞）來增進對於癌症及病原體之免疫反應的方法及組成物。

本發明的一部分係提供包含有TGFβ信息傳導路徑調節劑之經改良CAR多肽、編碼這類多肽之核酸分子、經基因修飾以表現該經改良CAR之細胞，以及在治療癌症（例如，實體瘤癌症）之過繼性細胞療法中使用該等經修飾細胞的方法。

在一些實施例中，本發明係提供經修飾以表現TGFβ信息傳導路徑調節劑（在本文中亦稱為「TGFβ裝甲化CAR-T細胞」）之CAR-T細胞，使得在向有需要之個體投與時，該等細胞在相對於不表現TGFβ信息傳導路徑調節劑之CAR-T細胞（在本文中亦稱為「未裝甲化CAR-T細胞」）下能夠在該個體中引起免疫反應。

在一些態樣中，本發明係提供帶有抗原受體（其可為嵌合抗原受體(CAR)）之免疫反應性細胞（例如T細胞），且其包括調節TGF-b信息傳導之多肽。此等經改造的免疫反應性細胞（例如CAR-T細胞）係針對抗原且可抵抗免疫抑制及/或具有增進的免疫活化特性。

在一態樣中，本發明係提供一種基因改造T細胞群體，其包含辨識癌症相關抗原嵌合抗原受體(CAR)及TGFβ信息傳導路徑調節劑之。

在一些實施例中，該細胞群係包括辨識選自由以下組成之群之抗原的CAR：ADGRE2、CLEC12、CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、CEACAM 5、密連蛋白(Claudin) 18.2、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、葉酸受體-a、GCC (亦稱為GUCY2C)、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、x-輕鏈、KDR、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-AI、MUC1、MUC13、間皮素、NKG2D配位體、NY-ES0-1、腫瘤胚胎抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、TAG-72、TROP2、VEGF-R2及WT-1。

在一些實施例中，該細胞群包含CD19 CAR或GCC CAR。

在一些實施例中，該細胞群包含與TGFβ或TGFβ受體結合之TGFβ信息傳導路徑調節劑。

在一些實施例中，該細胞群包含了包含有選自表1之胺基酸序列的TGFβ信息傳導路徑調節劑。

在一些實施例中，該細胞群為自體的。

在一些實施例中，該細胞群為同種異體的。

在一些實施例中，該細胞群為初代細胞。在一些實施例中，該細胞群係衍生自誘導型多功能幹細胞(iPSC)。

在一些實施例中，該細胞群係使用包含有編碼CAR多肽之第一核酸及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸的載體進行基因修飾。

在一些實施例中，該細胞群係使用兩種載體進行基因修飾，第一載體包含編碼CAR多肽之核酸，而第二載體包含編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之核酸。

在一些實施例中，該細胞群係使用Crispr進行基因修飾。在一些實施例中，該細胞群係使用反轉錄病毒轉導（包括g-反轉錄病毒）、慢病毒轉導、轉位子及轉位酶(Sleeping Beauty及PiggyBac系統)、信使RNA轉移介導的基因表現、基因編輯（基因插入或基因刪除/破壞）、CRISPR-Cas9、ZFN（鋅手指核酸酶）、或TALEN（類轉錄活化因子效應蛋白核酸酶）系統。

在一些實施例中，該細胞群包含了包含有選自由以下組成之群的細胞內信息傳導域之CAR：CD3ζ-鏈、CD97、2B4、GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、DAP10、DAP12、CD28信息傳導域、或其組合及變化。

在一些實施例中，該細胞群包含了包含有跨膜域之CAR，且其跨膜域係衍生自選自由以下組成之群的跨膜域：CD3、CD8、CD28、OX40、CD27、4-1BB、DAP10、DAP12、或其組合。

在一態樣中，本發明提供一種載體，其包含編碼CAR多肽之第一核酸以及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸。

在一些實施例中，該包含有包含編碼CAR多肽之第一核酸以及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸的載體係包含一内部核糖體進入位點。

在一些實施例中，該載體進一步包含2A核糖體序列。

在一態樣中，本發明提供一種經載體修飾之免疫細胞，該載體包含編碼CAR多肽之第一核酸以及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸。

在一些實施例中，該免疫細胞為T細胞。

在一態樣中，本發明提供調節宿主中之免疫反應的方法，該方法包含向該宿主投與基因改造T細胞群，該細胞群包含有辨識癌症相關抗原之嵌合抗原受體(CAR)及TGFβ信息傳導路徑調節劑，其中調節免疫反應係包含藉宿主免疫細胞進行以下之一或多者：增進IFNγ產生；增進IL-2產生；增進抗原呈現；以及增進增生。

在一態樣中，本發明提供一種包含有基因改造T細胞群之醫藥組成物，該細胞群包含有辨識癌症相關抗原之嵌合抗原受體(CAR)及TGFβ信息傳導路徑調節劑。

在一態樣中，本發明提供一種在有需要之個體中治療或預防癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之基因改造T細胞群，該細胞群包含有辨識癌症相關抗原之嵌合抗原受體(CAR)及TGFβ信息傳導路徑調節劑。

在一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病、急性非淋巴性白血症、急性骨髓性白血病、急性前骨髓細胞白血病、急性骨髓單核球白血病、急性單核球白血病、急性紅血球性白血病、慢性白血病、慢性非淋巴性白血症、多發性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、真性紅血球增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、華氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重鏈病、實體瘤、肉瘤、惡性腫瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、索脊瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內內皮肉瘤、滑液膜瘤、間皮瘤、依文氏(Ewing's)肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管上皮癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚癌、威爾姆氏(Wilm's)腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、大腸直腸癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、及其轉移。

在一態樣中，本發明提供一種免疫調節系統，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸序列；及編碼調節TGF-b信息傳導之多肽（例如，TGFβ信息傳導調節劑）的核酸序列。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含可變重鏈(vH)。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含可變重鏈(vH)及可變輕鏈(vL)。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含IgA抗體、IgG抗體、IgE抗體、IgM抗體、雙或多特異性抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、經分離之CDR或其群組；單鏈可變片段(scFv)、多肽-Fc融合物、單域抗體(sdAb)、VH、駱駝源化抗體；掩蔽抗體、小型模組化免疫製藥(「SMIPsTM」)、單鏈、串聯雙價抗體、VHHs、抗運載蛋白(Anticalin)、奈米抗體、人源化抗體(humabody)、微型抗體、BiTE、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白、DARPIN、Avimer、DART、TCR-類似抗體、Adnectin、人類泛素(Affilin)、穿透抗體(Trans-body)；親和抗體(Affibody)、TrimerX、微型蛋白、Fynomer、Centyrin；以及KALBITOR，或其片段。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽僅包含重鏈抗體。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含選自表1之胺基酸序列。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含二聚體抗原結合劑。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b結合。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b受體結合。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b受體2 (TGF-bR2)結合。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含TGF-b受體2 (TGF-bR2)或其片段。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係包含TGF-bR2 (TGF-bR2)之細胞外結構域。

在一些實施例中，該CAR係與選自由以下組成之群的抗原結合：ADGRE2、CLEC12、CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、CEACAM 5、密連蛋白(Claudin) 18.2、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、葉酸受體-a、GCC (亦稱為GUCY2C)、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、x-輕鏈、KDR、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-AI、MUC1、MUC13、間皮素、NKG2D配位體、NY-ES0-1、腫瘤胚胎抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、TAG-72、TROP2、VEGF-R2及WT-1。

在一些實施例中，該CAR係與CD19或GCC結合。

在一些實施例中，該CAR包括選自由以下組成之群的細胞內信息傳導域：CD3ζ-鏈、CD97、2B4、GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、DAP10、DAP12、CD28信息傳導域、或其組合及變化。

如前述請求項中任一項之免疫調節系統，其中該CAR包含跨膜域且該跨膜域係衍生自選自由以下組成之群的跨膜域：CD3、CD8、CD28、OX40、CD27、4-1BB、DAP10、DAP12、或其組合。

在某些實施例中，該經修飾之CD3z多肽缺乏全部或部分的免疫受體酪胺酸基活化模體(ITAM)，其中該ITAM為ITAM1、ITAM2及ITAM3。在某些實施例中，該經修飾之CD3z多肽更缺乏全部或部分的富鹼性延伸(BRS)區，其中該等BRS區為BRS1、BRS2及BRS3。

在一態樣中，本發明提供一種包含有本文所述免疫調節系統之核酸，其中編碼嵌合抗原受體(CAR)之序列以及編碼調節TGF-b信息傳導之多肽的序列係存在於單一構築體上。

在一些實施例中，編碼嵌合抗原受體(CAR)之序列以及編碼調節TGF-b信息傳導之多肽的序列係存在於不同的構築體上。

在一態樣中，本發明提供一種包含有編碼本文所述免疫調節系統之核酸的載體。

在一些實施例中，該載體包含内部核糖體進入位點(IRES)。

在一些實施例中，該載體包含2A核糖體序列。在一些具體例中，該2A核糖體序列為P2A或T2A。

在一態樣中，本發明提供一種包含有本文所述免疫調節系統之免疫反應性細胞。

在一態樣中，本發明提供一種免疫反應性細胞，其包含：對於腫瘤相關抗原或壓力配位體具特異性之標靶劑，以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一些實施例中，該標靶劑係與選自由以下組成之群的壓力配位體專一性地結合：MIC-A、MIC-B、ULBP1-6。

在一態樣中，本發明提供一種免疫反應性細胞，其包含：嵌合抗原受體(CAR)；以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一些實施例中，該CAR及該編碼調節TGF-b信息傳導之多肽的核酸係設在相同的多核苷酸上。

於一些實施例中，該CAR及該編碼調節TGF-b信息傳導之多肽的核酸係設在分開的多核苷酸上。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係由該細胞分泌。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含可變重鏈(vH)。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含可變重鏈(vH)及可變輕鏈(vL)。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含單鏈可變片段(scFv)。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含二聚體抗原結合劑。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b結合。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含TGF-b受體2 (TGF-bR2)或其片段。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係包含TGF-bR2之細胞外結構域。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b受體結合。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之多肽係與TGF-b受體2 (TGF-bR2)結合。

在一些實施例中，該免疫反應性細胞包含由載體所表現的CAR、由經改造的mRNA所表現的CAR、或整合至宿主細胞染色體中的CAR。在一些實施例中，該編碼CAR的序列係使用核酸內切酶整合至宿主細胞染色體中。在一些實施例中，該編碼CAR的序列係使用Crispr/Cas9、Cas12a或Cas13而整合至宿主細胞染色體中。

在一些實施例中，該免疫反應性細胞係包含調節TGF-b信號傳導之重組多肽，其自載體、經改造mRNA表現或整合至宿主細胞染色體中。在一些實施例中，該編碼調節TGF-b信息傳導之多肽的序列係使用Crispr/Cas9、Cas12a或Cas13而整合至宿主細胞染色體中。

在一些實施例中，該免疫反應性細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手(NK) T細胞、γδ T細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、調節性T細胞、人類胚胎幹細胞、B細胞、巨噬細胞、以及可以從中分化出淋巴樣細胞的多能幹細胞。

於一些實施例中，該免疫反應性細胞為經改造的自體細胞。在一些實施例中，該免疫反應性細胞為經改造的同種異體細胞。

在一些實施例中，該免疫反應性細胞係包含與選自由以下組成之群的腫瘤抗原結合的CAR：ADGRE2、CLEC12、CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、CEACAM 5、密連蛋白(Claudin) 18.2、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、葉酸受體-a、GCC (亦稱為GUCY2C)、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、x-輕鏈、KDR、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-AI、MUC1、MUC13、間皮素、NKG2D配位體、NY-ES0-1、腫瘤胚胎抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、TAG-72、TROP2、VEGF-R2及WT-1。

在一些實施例中，該CAR係與CD19或GCC結合。在一些實施例中，該CAR係與GCC結合。

在一些實施例中，該CAR包括衍生自以下各者之細胞內信息傳導域：CD3ζ-鏈、CD97、2B4、GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、DAP10、DAP12、CD28信息傳導域、或其組合及變化。

在一些實施例中，該CAR包含跨膜域且該跨膜域係衍生自選自由以下組成之群的跨膜域：CD3、CD8、CD28、OX40、CD27、4-1BB、DAP10、DAP12、或其組合。

在某些實施例中，該經修飾之CD3z多肽缺乏全部或部分的免疫受體酪胺酸基活化模體(ITAM)，其中該ITAM為ITAM1、ITAM2及ITAM3。在某些實施例中，該經修飾之CD3z多肽更缺乏全部或部分的富鹼性延伸(BRS)區，其中該等BRS區為BRS1、BRS2及BRS3。

在一些實施例中，免疫反應性細胞包含嵌合共刺激受體(CCR)。在一些實施例中，該CAR包含一共刺激域。在一些實施例中，該CAR不包含細胞內信息傳導域。在一些實施例中，該CAR不包含CD3z域。

在一些實施例中，該調節TGF-b信息傳導之重組多肽係增進免疫反應性細胞之免疫反應。

在一態樣中，本發明提供一種包含了有效量之本文所述免疫調節系統的醫藥組成物。

在一態樣中，本發明提供一種包含了有效量之編碼本文所述免疫調節系統之核酸序列的醫藥組成物。

在一態樣中，本發明提供一種包含了有效量之編碼本文所述免疫調節系統之載體的醫藥組成物。

在一態樣中，本發明提供一種包含了有效量之本文所述免疫反應性細胞的醫藥組成物。

在一些實施例中，該醫藥組合物更包含醫藥學上可接受的賦形劑。

在一態樣中，本發明提供一種用於治療癌症之套組，該套組包含了包含有嵌合抗原受體(CAR)之免疫反應性細胞；以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一些實施例中，該套組包含編碼本文所述免疫調節系統之核酸或載體。

在一態樣中，本發明提供一種在個體中治療或預防癌症或其轉移之方法，該方法包含投與有效量之包含有嵌合抗原受體(CAR)之免疫反應性細胞；以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一些實施例中，本文所述之組成物係可用於治療造血性癌症。在其他實施例中，本文所述之組成物係可用於治療實體瘤癌症。

在一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病、急性非淋巴性白血症、急性骨髓性白血病、急性前骨髓細胞白血病、急性骨髓單核球白血病、急性單核球白血病、急性紅血球性白血病、慢性白血病、慢性非淋巴性白血症、多發性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、真性紅血球增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、華氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重鏈病、實體瘤、肉瘤、惡性腫瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、索脊瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內內皮肉瘤、滑液膜瘤、間皮瘤、依文氏(Ewing's)肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管上皮癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚癌、威爾姆氏(Wilm's)腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、大腸直腸癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。

在一些實施例中，該方法更包含向該個體投與第二治療劑。

在一些實施例中，該第二治療劑以全身性方式向該個體投與。

在一些實施例中，第二治療劑與CAR分開投與且核酸編碼調節TGF-b信號傳導之重組多肽

在一些實施例中，該第二治療劑係靶向PD1/PD-L1、CXCR2及/或IL-15。

在一些實施例中，該第二治療劑為PD1/PD-L1抑制劑。

在一態樣中，本發明提供一種調節免疫細胞活性之方法，該方法包含投與編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸；以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一態樣中，本發明提供一種調節嵌合抗原受體(CAR)之活性的方法，該方法包含投與編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸；以及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸。

在一態樣中，本發明提供一種降低個體中之腫瘤負荷的方法，該方法包含投與有效量之包含有本文所述核酸、載體或免疫反應性細胞的免疫調節系統。

在一些實施例中，該方法降低了腫瘤細胞的數量。在一些實施例中，該方法降低了腫瘤大小。在一些實施例中，該方法根除了該個體中的腫瘤。

在一態樣中，本發明提供一種提高對於個體中之癌細胞所做之免疫活化細胞介素生成反應的方法，其包含向個體投與包含有本文所述核酸、載體或免疫反應性細胞的免疫調節系統。

在一態樣中，本發明提供一種用於產生製造具抗原特異性之免疫反應性細胞的方法，該方法包含將編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸序列、及編碼調節TGF-b信息傳導之重組多肽的核酸，導入免疫反應性細胞中。

應理解，前述一般描述及以下詳細描述二者僅為例示性及解釋性，且不限制本發明，如所申明者。

相關申請案之交互參考

本申請案主張於2021年2月15日提交之美國臨時申請案第63/149,628號、及於2022年2月4日提交之美國臨時申請案第63/306,836號之優先權，其每一者之揭露內容於此以全文引用方式併入。 定義

為使本發明更易於理解，首先在下文定義某些術語。隨附術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書記載。

除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「方法」包括一或多種方法，及/或本文所述類型之步驟，及/或熟習此項技術者將經由閱讀本發明及類似者時，變得顯而易見。

投與 ：如本文所用，向個體「投與」組成物係指提供、施用或使該組成物與該個體接觸。投與可藉由多種途徑中之任一者實現，諸如局部、口服、皮下、肌肉內、腹膜內、靜脈內、脊髓鞘內和皮內。

過繼性細胞療法： 如本文中所可互換使用，術語「過繼性細胞療法」或「過繼性細胞轉移」或「細胞療法」或「ACT」係指細胞（例如本文所述之基因改造細胞群）轉移至有需要的患者中。該等細胞係可衍生自及繁殖有需要的患者（即自體細胞），或可自非患者供體獲得（即異體細胞）。在一些實施例中，該細胞為免疫細胞，諸如淋巴細胞，其經修飾以表現CAR及TGFβ信息傳導路徑調節劑，如本文所描述（例如，TGFβ裝甲化CAR-T細胞）。可使用各種細胞類型進行ACT，包括但不限於天然殺手(NK)細胞、T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞、γδ T細胞、調節型T細胞、誘導型多能幹細胞(iPSC)、iPSC衍生的T細胞、iPSC衍生的NK細胞、造血幹細胞(HSC)、間質幹細胞及周邊血液單核細胞。

親和力： 如本文所用，術語「親和力」係指結合部分（例如，抗原結合劑（例如，本文所描述之可變域）與標靶（例如，抗原（例如，TGFΒ或TGFBR））之間的結合相互作用特性，並且指示結合相互作用的強度。在一些實施例中，親和力之量測係以解離常數(K _D)表示。抗原結合蛋白與其標靶之結合親和力可藉由平衡方法（例如，酵素連接免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫測定(RIA)、動力學（例如，BIACORE™分析）或本領域中已知的其他方法來測定。

結合性： 如本文所用，術語「結合性」為兩個分子在多個位點彼此結合之強度總和（例如考慮到該交互作用的價數）。

動物 ：如本文所使用之術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於發育之任何階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於發育之任何階段之非人類動物。在某些實施例中，該非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥、爬蟲類、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蟲。在一些實施例中，動物可為基因轉殖動物、經基因工程改造之動物及/或純系。

自體 ：如本文所用，術語「自體」是指衍生自同一個體的任何材料，隨後將其重新引入該個體。

同種異體 ：如本文所用，「同種異體」是指衍生自與引入材料的個體為相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座上的基因不相同時，該二或多個個體被稱為彼此同種異體。來自相同物種之個體的同種異體材料在基因上的不同可能足以發生抗原交互作用。

抗體或抗原結合劑 ：如本文所用，術語「抗體」或「抗原結合劑」係指包括足以賦予特定標靶抗原的特異性結合之典型免疫球蛋白序列元件之多胜肽。熟習此項技術者將瞭解，該術語可在本文中互換使用。在一些實施例中，如本文中所使用，術語「抗體」或「抗原結合劑」亦指包括完整抗體之一部分（諸如(例如)抗體之抗原結合或可變區）的「抗體片段」或「多個抗體片段」。「抗體片段」之實例包括Fab、Fab'、F(ab’)2及Fv片段；三抗體；四抗體；直線形抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成之多特異性抗體中所包括之含CDR部分。熟習此項技術者應瞭解，術語「抗體片段」並不暗示且不限於任何特定產生模式。抗體片段可經由使用任何適當方法學製備，包括但不限於完整抗體的裂解、化學合成、重組製造等。如本領域中已知的，天然製造之完整抗體為約150 kD之四聚體試劑，包含兩個相同的重鏈多肽(各約50 kD)及兩個相同的輕鏈多肽(各約25 kD)相互結合形成所謂的「Y形」結構。各重鏈包含至少四個域(每個約110個胺基酸長)- 一個胺基端可變(V _H)域(位於Y結構之頂端)，接著是三個恒定域：C _H1、C _H2和羧基端C _H3(位於Y型主幹的底部)。短區(稱為「開關」)連接該重鏈可變區及恆定區。「鉸鏈」將C _H2及C _H3域連接至該抗體之其餘部分。此鉸鏈區中的兩個雙硫鍵將完整抗體中的兩個重鏈多肽彼此連接。各輕鏈包含兩個域 - 胺基端可變(V _L)域，之後接著一個羧基端恆定(C _L)域，彼此以另一「開關」隔開。完整抗體四聚體是由兩個重鏈-輕鏈二聚體組成，其中重鏈及輕鏈藉由單一雙硫鍵彼此連接；兩個其他雙硫鍵將該重鏈鉸鏈區彼此連接，使得該二聚體彼此連接且形成四聚體。天然生成的抗體亦經醣基化，一般在C _H2域上。天然抗體中的每個域都具有以「免疫球蛋白折疊」為特徵的結構，該折疊由兩個β摺板(例如，3-、4-或5-股摺板)，在壓縮的反向平行β桶中相互堆積而成。每個可變域包含三個高度變異環，稱為「互補決定區」(CDR1、CDR2和CDR3)和四個稍微不變的「框架」區(FR1、FR2、FR3和FR4)。當天然抗體折疊時，FR區形成β摺板，為域提供結構框架，而來自重鏈和輕鏈二者的CDR環區在三維空間中聚集在一起，因而在該Y結構的頂端創造出單一高度變異抗原結合位點。抗體多肽鏈之間的胺基酸序列比對已定義出兩種輕鏈(κ和λ)類別、數種重鏈(如μ、γ、α、ε、δ)類別，以及數種重鏈亞群(α1、α2、γ1、γ2、γ3和γ4)。抗體類別(IgA [包括IgA1、IgA2]、IgD、IgE、IgG [包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4]和IgM)是基於所使用的重鏈序列的類別而定義的。

出於本發明的目的，在某些實施例中，包括在天然抗體中發現的足夠免疫球蛋白域序列的任何多肽或多肽複合物，可被稱為及/或作為「抗體」或「抗原結合劑」，不論此種多肽是天然產生的(例如，由對某一抗原產生反應的生物體產生)，或藉由重組工程、化學合成或其他人工系統或方法學產生。在一些實施例中，抗體為單株抗體；在一些實施例中，抗體為多株抗體。在一些實施例中，抗體具有小鼠、兔子、靈長類動物或人類抗體特徵的恆定區序列。在一些實施例中，如本領域中已知的，抗體序列元件為人類化、靈長類化、嵌合化等。此外，本文使用的術語「抗體」或「抗原結合劑」將被理解為涵蓋(除非內文另有說明或澄清)在適當的實施例中，可以指任何本領域已知的或已開發的構建體或形式，用於在替代呈現中捕捉抗體結構性和功能性特徵。舉例而言，在一些實施例中，該等術語可指稱雙-或其它多-特異性(例如，酶親體等)抗體、小型模組免疫藥物(「SMIPs™」)、單鏈抗體、駱駝源化抗體及/或抗體片段。在一些實施例中，抗體可能缺乏它在天然產生時可能具有的共價修飾(例如，連接聚醣)。在一些實施例中，抗體可包含共價修飾(例如，連接聚醣、負載[例如可偵測部分、治療部分、催化部分等]、或其他側接基[例如聚乙二醇等])。

大約或約 ：如本文所使用，術語「大約」或者「約」如應用於有興趣的一或者多個數值，係指類似於所陳述參考值之數值。在某些實施例中，除非另外說明或者另外自內文顯而易見，否則術語「大約」或者「約」係指在任一方向上(大於或者小於)落於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或者更小之數值範圍內(但此數值將超出可能性值之100%的情況除外)。應理解，當使用術語「約」或「大約」來修飾所陳述之參考值時，係一起涵蓋所陳述之參考值本身以及所陳述之參考值的任一側接近所述參考值的數值。

裝甲化 CAR-T 細胞： 如本文所用，術語「裝甲化CAR細胞」或「裝甲化CAR-T細胞」係指具有躲避腫瘤免疫抑制及腫瘤誘導型CAR-T功能低下之能力的基因改造細胞。在一些實施例中，裝甲化CAR T細胞包含了辨識癌症相關抗原及TGFβ信息傳導路徑調節劑之嵌合抗原受體(CAR)。

互補決定區 (CDR) ：可變域的「CDR」為在可變區內，根據Kabat、Chothia之定義、Kabat和Chothia二者之累積、AbM、接觸及/或構型定義或任何本領域中所周知的CDR測定方法所辨識出的胺基酸殘基。抗體CDR可辨識為最初由Kabat等人定義的高度變異區。請參見，例如，Kabat等人，1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生服務處，NIH, Washington D.C。CDR的位置亦可辨識為最初由Chothia和其他人描述的結構環結構。請見如Chothia等人，Nature 342:877-883, 1989。其他的CDR辨識方法包括「AbM定義」，此為Kabat和Chothia之間的折衷，是使用Oxford Molecular的AbM抗體模擬軟體(現在名為Accelrys®)推導而來，或基於觀察到的抗原接觸的CDR之「接觸定義」，如MacCallum等人，J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996中所述。在另一方法中，在本文中稱為CDR的「構型定義」，該CDR的位置可辨識為對抗原結合做出焓貢獻的殘基。請參照如Makabe等人，Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1166, 2008。尚有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍將與至少一部分的Kabat CDR重疊，儘管根據特定殘基或殘基組的預測或實驗結果，它們可能會縮短或延長，甚至整段CDR都不會顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR係可指本領域中已知之任何方法（包括方法之組合）所定義的CDR。本文所使用之方法係可利用根據此等方法中之任一者所定義的CDR。對於含有超過一個CDR之任何所給實施例，該等CDR可根據Kabat、Chothia、延伸、AbM、接觸及/或構形定義中之任一者來定義。

抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 或ADCC是指一種細胞毒性形式，其中所分泌的Ig結合至某些細胞毒性細胞(例如，自然殺手(NK)細胞、中性顆粒細胞及巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)，使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至攜帶有抗原之標靶細胞，且隨後以細胞毒素殺死該標靶細胞。該抗體「武裝」該細胞毒性細胞，且為藉由這種機制殺死該標靶細胞所必需。介導ADCC的主要細胞為NK細胞，其僅表現FcγRIII，而單核細胞則表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的Fc表現係摘錄於Ravetch和Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)之第464頁的表3。為了評估感興趣的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，例如美國專利號 5,500,362或5,821,337中所述。用於此種測定法的可使用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)和自然殺手(NK)細胞。替代地或額外地，可在體內評估感興趣分子之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如在Clynes等人，PNAS USA 95: 652-656 (1998)中所揭示的動物模型。

抗原 ：如本文所用，術語「抗原」是指引發免疫反應的試劑；及/或當暴露或投至生物體時，與T細胞受體(例如，當由MHC分子呈現時)或抗體(例如，由B細胞產生)結合的試劑。在一些實施例中，抗原在生物體中引發體液反應(例如，包括抗原特異性抗體的產生)；替代地或額外地，在一些實施例中，抗原在生物體中引發細胞反應(例如，涉及其受體與該抗原特異性交互作用的T細胞)。本領域技術人員將理解，特定抗原可在標靶生物體(例如，小鼠、兔、靈長類動物、人類)之一或數個成員中，而非在該標靶生物體物種的所有成員中，引發免疫反應。在一些實施例中，抗原在標靶生物體物種的至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的成員中引發免疫反應。在一些實施例中，抗原結合至抗體及/或T細胞受體，且可能會或可能不會在生物體中誘發特定生理反應。在一些實施例中，例如，抗原可在體外結合至抗體及/或T細胞受體，無論此作用是否在體內發生。在一些實施例中，抗原與特定體液或細胞免疫的產物反應，包括由異源性免疫原誘發者。

相關聯 ：作為本文使用之術語，若其中一者與另一者之存在、程度及/或形式相關，則此二事件或者實體彼此「相關聯」。舉例而言，若特定實體(例如多肽)之存在、程度及/或形式與特定疾病、病症或者病況之發生率及/或易感性相關(例如在相關群體中)，則該特定實體視為與該特定疾病、病症或者病況相關聯。在一些實施例中，若二或者更多個實體直接或者間接相互作用，以使得其彼此物理上接近且保持物理上接近，則其彼此物理上「相關聯」。在一些實施例中，彼此物理上相關聯之二或者更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，彼此物理上相關聯之二或者更多個實體彼此不共價連接，但以非共價形式相關聯，例如藉助於氫鍵、凡得瓦交互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。在一些實體例中，提及「與癌細胞相關之抗原」時，術語「與...相關」係指癌細胞表面上存在有特定抗原。

結合： 應當理解，本文所用的術語「結合」通常是指二或多個實體之間的非共價結合。「直接」結合涉及實體或部分之間的物理接觸；間接結合涉及藉由與一或多個中間實體進行物理接觸的物理交互作用。二或多個實體之間的結合可在多種情況中的任一者下進行評估- 包括相互作用的實體或部分在隔絕或在更複雜系統的情況下(例如，與載體實體及/或在生物系統或細胞中以共價或其他方式結合)。如本文所使用之「K _a」係指特定結合部分與標靶形成結合部分/標靶複合物之結合速率。如本文所使用之「K _d」係指特定結合部分/標靶複合物之解離速率。如本文所使用之「K _D」係指解離常數，其得自K _d比K _a之比率(亦即K _d/K _a)，且以莫耳濃度(M)表示。K _D值可使用此項技藝中良好建立之方法(例如藉由使用表面等離子體共振)或者使用生物感測器系統(例如Biacore®系統)來測定。

載體 ：如本文所用，術語「載體」係指與組成物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。在一些例示性實施例中，載體可包括無菌液體，諸如(例如)水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如(例如)花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似物。在一些實施例中，載體為或包括一或多個固體成分。

特徵部分 ：如本文中所用，術語「特徵部分」在最廣義而言係指稱某一物質之一部份的存在(或不存在)與特定特徵、屬性或活性之存在(或不存在)相關聯。在一些實施例中，一物質的特徵部分是在該物質和相關物質中發現具有共享特定特徵、屬性或活性的部分，而非不共享特定特徵、屬性或活性者。

嵌合抗原受體： 如本文所用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指由細胞外標靶結合域（例如，衍生自抗體）、跨膜區與一或多個細胞外效應域中之一或多者所組成的經改造受體。CAR通常被導入免疫細胞中，諸如T細胞，以重新定向所要細胞表面抗原或MHC-肽複合物的專一性。此等合成受體通常含有經由單個融合分子中之可撓性連接子與一或多個信息傳導域相關的標靶結合域。該標靶結合域係用以將免疫細胞(例如T細胞)導引至病理性細胞(例如，癌細胞)表面上的特定標靶，且該等信息傳導域含有用於免疫細胞(例如T細胞)活化及增殖之分子機制。通常穿過免疫細胞(例如T細胞)膜之可撓性連接子(亦即，形成跨膜域)允許細胞膜表現出CAR的標靶結合域。CAR已成功地使免疫細胞針對在來自各種惡性病(包括淋巴瘤及實體腫瘤)的腫瘤細胞表面處表現的抗原進行重新定向(Gross等人, (1989) Transplant Proc., 21(1 Pt 1): 127-30; Jena等人, (2010) Blood, 116(7):1035-44)。CAR之胞外結合域可由衍生自使鼠類或人源化單株抗體之可變重鏈及輕鏈區融合的單鏈可變片段(scFv)構成。在一些實施例中，該胞外結合域包含單域抗體。替代性地，可使用衍生自Fab之scFv (而非衍生自例如獲自Fab庫之抗體)。在各實施例中，此scFv係與跨膜域融合且接著與胞內信息傳導域融合。

已研發出至少三代的CAR。第一代CAR包含附接至衍生自CD3ζ或Fc受體γ鏈之細胞質區之信息傳導域的標靶結合域。已顯示第一代CAR成功地將免疫細胞重新定向至選定標靶，但其未能在活體內提供長期的擴增及抗腫瘤活性。第二代及第三代CAR係聚焦於藉由將共刺激分子(諸如CD28、OX-40 (CD134)及4-1BB (CD137))包括於其內來增強經修飾T細胞存活率並增進增殖。本文所述之該等實施例係部分聚焦於進一步改善含有CAR-T之免疫療法，例如，藉由用TGFβ信息傳導路徑調節劑來裝甲化CAR-T，藉以使免疫療法在治療癌症（尤其是實體瘤癌症）時更為有效。相對於未裝甲化的CAR-T細胞，本文所提供的裝甲化CAR在面對不利的腫瘤微環境時可改善或增進CAR-T功能及存活率。

密碼子最佳化 ：如本文所用，「密碼子最佳化」的核酸序列是指已經改變，使得核酸序列的轉譯和所得蛋白質的表現，針對特定表現系統達增進之最佳化的核酸序列。「密碼子最佳化」的核酸序列係編碼與該「密碼子最佳化」核酸序列所基於的未最佳化親代序列相同的蛋白質。例如，一核酸序列可經「密碼子最佳化」，以在哺乳動物細胞(例如，CHO細胞、人類細胞、小鼠細胞等)、細菌細胞(例如，大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞中表現。

可比較 ：如本文所用，術語「可比較」是指二或多個試劑、實體、情況、條件組等，它們可能彼此不同但足夠相似，以允許在它們之間進行比較，因而可根據觀察到的差異或相似之處合理地得出結論。本領域普通技術人員將理解，在內文中，在任何特定情況下需要何種程度的一致性，才能將二或多個此類試劑、實體、情況、條件組等視為具有可比較性。

對應於 ：如本文所用，術語「對應於」通常用於指定有興趣多肽的胺基酸殘基的位置/一致性。普通技術人員將理解，為簡要起見，多肽中的殘基通常使用基於參考相關多肽的規範編號系統來命名，如此，「對應於」位置190殘基之胺基酸，舉例而言，實際上不必是特定胺基酸鏈中的第190個胺基酸，而是對應於該參考多肽中第190個殘基；本領域普通技術人員容易理解如何鑑定「相對應」的胺基酸。

衍生自： 如本文所用，片語「衍生自」或「特異於指定序列」的序列是指包含大約至少6個核苷酸或至少2個胺基酸、至少約9個核苷酸或至少3個胺基酸、至少約10-12個核苷酸或4個胺基酸、或至少約15-21個核苷酸或5-7個胺基酸對應於，即，一致於或互補於例如指定序列的連續區域。在某些實施例中，該序列包含所有指定的核苷酸或胺基酸序列。如通過本領域中已知的技術確定，該序列可與特定序列獨特的序列區域互補(在聚核甘酸序列的情況下)或一致。可衍生序列的區域包括但不限於：編碼特異性表位的區域、編碼CDR的區域、編碼框架序列的區域、編碼恆定域區域的區域、編碼可變域區域的區域，以及非轉譯及/或非轉錄區域。該衍生序列不一定是從研究中的感興趣序列生理性衍生而來，而可以任何方式產生，包括但不限於化學合成、複製、逆轉錄或轉錄，其基於該聚核甘酸所衍生的區域中的鹼基序列提供的信息。因此，它可以代表該原始聚核甘酸的同義或反義方向。此外，對應於指定序列的區域組合可以本領域中已知的方式進行修飾或組合，以符合預期用途。例如，一序列可包含二或多個連續序列，每一者包含指定序列的一部分，且被與指定序列不同但用於代表衍生自該指定序列的序列的區域中斷。關於抗體分子，「衍生自」包括與比較抗體在功能或結構上相關的抗體分子，例如，「衍生自」包括具有相似或實質上相同的序列或結構，例如具有相同或類似的CDR、框架或可變區。抗體的「衍生自」亦包括殘基，例如一或多個，例如2、3、4、5、6個或更多個殘基，其可為連續或不連續，但根據編號流程，或與比較序列的一般抗體結構或三維鄰近性(即，在CDR或框架區內)的同源性，而定義出或辨識出。術語「衍生自」不限於生理性衍生，而是包括經由任何方式產生，例如藉由使用來自比較抗體的序列信息來設計另一抗體。

測定 ：本文所述之許多方法學包括一「測定」步驟。閱讀本說明書的本領域普通技術人員將理解，此「測定」可利用本領域技術人員可獲得的多種技術之任一者，包括例如本文明確提及的特定技術進行。在一些實施例中，測定涉及生理樣本的操作。在一些實施例中，測定涉及對數據或信息的考量及/或操作，例如利用適於執行相關分析的電腦或其他處理單元。在一些實施例中，測定涉及從來源接收相關信息及/或材料。在一些實施例中，測定涉及將樣本或實體的一或多個特徵與可比較的參考物進行比較。

改造： 如本文所用，術語「經改造」描述已由人為設計或修飾及/或其存在和生產需要人為干預及/或動作的聚核甘酸、多肽或細胞。例如，旨在設計用於引發特定效果且與天然存在的相同類型細胞的效果不同的經改造細胞。在一些實施例中，經改造細胞表現本文所述的嵌合抗原受體。

效應子功能： 如本文所用，術語「效應子功能」是指可歸因於本文所述的抗原結合劑的生物活性。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合性；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；和B細胞活化)的調降。「降低或最小化」抗體效應子功能是指其較野生型或未修飾的抗體降低至少50%(或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。抗體效應子功能的測定可由本領域一般技術人員容易地確定和測量。在一些實施例中，補體結合、補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性的抗體效應子功能受到影響。在一些實施例中，效應子功能經由在恆定區中消除醣基化的突變而消除，例如「無效應子突變」。在一態樣中，該無效應子突變為CH2區域的N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields等人，J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)。此外，導致效應子功能降低或消除的額外突變包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，效應子功能可通過生產技術而降低或消除，例如在無醣基化作用的宿主細胞(例如大腸桿菌)中表現，或其中導致醣基化模式改變成在促進效應子功能方面無效或效果較差(如Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 (5):3466-3473 (2003))。

表位 ：如本文所用，術語「表位」包括被免疫球蛋白(例如，抗體或受體)結合成分全部或部分特異性辨識出的任一部分。在一些實施例中，表位由抗原中的複數個胺基酸組成。在一些實施例中，當抗原採用相關三維構型時，此類胺基酸殘基暴露於表面。在一些實施例中，當抗原採用此種構型時，胺基酸殘基在空間上彼此物理性接近或等高。在一些實施例中，當抗原採用替代構型(例如，直線化；例如，非直線形表位)時，至少一些胺基酸彼此呈物理上分隔。

賦形劑： 如本文所用，術語「賦形劑」是指可包括在醫藥組成物中的非治療劑，舉例而言，以提供或有助於所需的稠度或穩定作用。合適的藥物賦形劑包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及類似物。

表現 ：術語「表現」或「經表現」，當用於提及本文中的核酸時，其係指以下事件中的一或多者：(1)DNA模板之RNA轉錄物產生(例如，藉由轉錄作用)；(2)RNA轉錄物的加工(例如，藉由剪接、編輯、5'端帽形成及/或3'末端形成)；(3)RNA轉譯成多肽；及/或(4)多肽的轉譯後修飾。

離體 ：如本文所用，術語「離體」意謂細胞自活生物體移出且於生物體外部繁殖的過程（例如，在試管中，在生物反應器中）。

融合蛋白 ：如本文所用，術語「融合蛋白」是指由編碼兩種不同(例如，異源性)蛋白質的至少一部分的核酸序列改造而得之核酸序列編碼的蛋白質。技術人員無疑知道，為了產生融合蛋白，係將核酸序列連接而使得所產生之讀框不包含內部終止密碼子。

宿主 ：如本文所用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物（例如，小鼠、大鼠、兔、犬、貓、牛、豬、綿羊、馬、非人類之靈長類動物）或系統（例如細胞或細胞株)。在一些實施例中，宿主為將被要投與表現有CAR及/或本文所描述之TGFβ調節劑之細胞或細胞群的生物體。在一些實施例中，投與該細胞群係導致宿主中之免疫反應改善。

宿主細胞 ：如本文所用，片語「宿主細胞」是指已引入外源性DNA(重組性或其他)的細胞。例如，宿主細胞可用於藉由標準重組技術產生本文所述之經修飾CAR分子。技術人員在閱讀本揭示內容後將理解，此類術語不僅指稱特定個體細胞，並指稱此一細胞的後代。由於某些修飾可能由於突變或環境影響而在子代中發生，因此，這類子代實際上可能不與親代細胞完全一致，但仍包括在本文所用術語「宿主細胞」的範圍內。

在一些實施例中，宿主細胞係指人類細胞。在一些實施例中，宿主細胞包括適合於表現外源性DNA(例如，重組性核酸序列)的任何原核和真核細胞。例示性細胞包括原核生物和真核生物(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬等之菌株)、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、甲醇畢赤酵母(P. methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如，SF-9、SF-21、經桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合體，例如雜交瘤或四重雜交瘤。在一些實施例中，該細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，該細胞為真核細胞，並選自於以下細胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、HEK293T、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、支持細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞和衍生自前述細胞之細胞株。在一些實施例中，該細胞包含一或多種病毒基因，例如表現病毒基因的視網膜細胞(例如PER.C6™細胞)。

免疫反應 ：如本文所用，術語「免疫反應」是指免疫系統的細胞如B細胞、T細胞、樹突細胞、巨噬細胞或多形核細胞，對於刺激如抗原或疫苗之反應。免疫反應可包括參與宿主防禦反應的任何身體細胞，包括例如分泌干擾素或細胞因子的上皮細胞。免疫反應包括但不限於先天性及/或適應性免疫反應。測量免疫反應的方法為本領域中眾所周知的，包括例如測量淋巴細胞(例如B或T細胞)的增殖及/或活性、細胞因子或趨化因子的分泌、發炎、抗體產生、及類似反應。在一些實施例中，免疫反應係指在投與本文所述之裝甲化CAR-T細胞或未裝甲化CAR-T細胞之後所觀察到的免疫反應。在一些實施例中，投與本文所述裝甲化CAR-T細胞之後所觀察到的免疫反應係由以下一或多者來測定：表現CAR之細胞的增殖增加、表現CAR之細胞的IFNg生成增加、表現CAR之細胞的IL-2生成增加、宿主免疫細胞的增殖增加、宿主免疫細胞的IL-2生成增加、表現抗原之宿主細胞的抗原表現增加、表現抗原之宿主細胞的共刺激增加、內皮細胞的活化增加、或免疫細胞（例如NK細胞、T細胞、巨噬細胞）的腫瘤歸宿性增加。

體外 ：如本文所使用，術語「 活體外」係指事件在人工環境中（ 例如在試管或反應器皿中）、在細胞培養物中 等而非在多細胞生物體內發生。

體內 ：如本文所使用，術語「 活體內」係指事件發生在諸如人類及非人類動物之多細胞生物體內。在基於細胞之系統之情形下，該術語可用於指事件發生在活細胞內（相反於例如 活體外系統）。

經分離： 如本文所用，術語「經分離的」是指物質及/或實體(1)與最初生產時(無論是在自然界及/或在實驗環境中)相結合的至少一些成分分離，及/或(2)在人為干預下設計、生產、製備及/或製造。經分離的物質及/或實體可與其最初結合的其他成分之約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%分離。在一些實施例中，經分離的試劑的純度為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或超過約99%。如本文所用，如果該物質實質上不含其他成分，則該物質為「純的」。在一些實施例中，如本領域技術人員將理解的，該物質在與某些其他成分（諸如(例如)一或多種載體或賦形劑(例如，緩衝液、溶劑、水等)）組合之後，仍可視為「經分離的」或甚至「純的」；在此類實施例中，計算該物質的分離百分比或純度時不包括此類載體或賦形劑。僅作為一實例，在一些實施例中，當在以下情況下，自然界中存在之諸如多肽或聚核苷酸的生物聚合物被認為是「經分離的」：a)由於其起源或衍生來源不與一些或所有在自然狀態下伴隨它的成分結合；b)其實質上不含來自於自然界產生它的物種之相同物種的其他多肽或核酸；c)由非來自於自然界產生它的物種之細胞或其他系統表現，或與該細胞中的成分結合。因此，例如，在一些實施例中，化學合成的或在不同於天然產生它的細胞系統中合成的多肽係被認為是「經分離的」多肽。在一些實施例中，細胞可為分離自自然伴隨著細胞之分子及/或細胞組分的「經分離細胞」。替代地或額外地，在一些實施例中，已進行一或多種純化技術之多肽在達到已與：a)自然界中與其相連；及/或b)最初產生時與其相連之其他組份分離的程度時，可視為一「經分離的」細胞。

連接子： 如本文所用，術語「連接子」係指共價附接二或多個多肽或核酸以使其彼此連接之官能基（例如，化學試劑或多肽）。如本文所用，「肽連接子」係指用於將兩種蛋白質偶合在一起(例如，偶合VH及VL結構域)的一或多個胺基酸（例如，耦接VH及VL結構域）。

調節或調節劑： 如本文所用，術語「調節」或「調節劑」係指組分對相關功能正向或負向改變的能力。例示性調節包括約1%、約2%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%或約100%的改變。例如，本文提供了能夠改變或防止TGFβ受體發生信息傳導之TGFB信息傳導調節劑。熟悉本技術者應瞭解，這可藉由與活化TGFβR信息傳導之細胞介素（即TGFβ）結合、或與受體本身（例如TGFβ抗體或其片段、TGFBR抗體或其片段）結合來達成。因此，此術語涵蓋了結合TGFβ的分子與結合TGFβR的分子之兩種分子。在一實施例中，本發明之調節劑可通過TGFβRII來抵消TGFβ信息傳導。藉由「中和」時，其意指阻斷TGFβ之正常信息傳導作用，使得TGFβ的存在對TGFβRII信息傳導具有中和作用。在一些實施例中，TGFβ調節劑改善了宿主中之免疫反應。

核酸 ：如本文所用，片語「核酸」，就最廣義而言，係指其為寡核苷酸鏈或可加入寡核苷酸鏈中的任何化合物及/或物質。在一些實施例中，核酸為寡核苷酸鏈或可經由磷酸二酯連結加入寡核苷酸鏈中的化合物及/或物質。從內文可清楚地看出，在一些實施例中，「核酸」係指各個核酸殘基(例如，核苷酸及/或核苷)；在一些實施例中，「核酸」係指包含有各個核酸殘基的寡核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸」為或包含RNA；在一些實施例中，「核酸」為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種核酸類似物組成。在一些實施例中，核酸類似物與核酸的不同之處在於它不利用磷酸二酯骨架。例如，在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種本領域中已知在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵的「肽核酸」組成，視為落入本發明範疇中。替代地或額外地，在一些實施例中，核酸具有一或多個硫代磷酸酯及/或5'-N-亞磷醯胺連結而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷和去氧胞苷)組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多種核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯併-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5 丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)。在一些實施例中，與天然核酸相較，核酸包含一或多種經修飾的醣類(例如，2'-氟核醣、核醣、2'-去氧核醣、阿拉伯醣和己醣)。在一些實施例中，核酸具有編碼功能基因產物例如RNA或蛋白質的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，核酸係藉由從天然來源分離、以互補模板為基礎進行聚合之酵素合成(體內或體外)、在重組細胞或系統中繁殖、及化學合成之一或多者來製備。在一些實施例中，核酸為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多殘基長度。在一些實施例中，核酸為單股；在一些實施例中，核酸為雙股。在一些實施例中，核酸具有一核苷酸序列，其包含至少一編碼一多肽的元件，或為編碼一多肽之序列的互補物。在一些實施例中，核酸具有酵素活性。

醫藥學上可接受的載體 ：可用於本揭示的醫藥學上可接受的載體(媒劑)為常規性的。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack出版公司發行，Easton, PA，第15版(1975)中描述適用於以藥物遞送一或多種治療組成物之組成物及調配物。一般而言，載體的性質將取決於所採用的特定投藥模式。例如，腸胃外配方通常包含可注射流體，其包括醫藥學上和生理學上可接受的流體，例如水、生理食鹽水、平衡鹽類溶液、右旋糖水溶液、甘油或類似物作為媒劑。對於固體組成物而言(例如，粉末、藥片、錠劑或膠囊形式)，傳統的無毒固體載體可包括例如醫藥級的甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外，待投與的醫藥組成物可包含少量無毒性輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩衝劑及類似物，例如乙酸鈉或單月桂酸脫水山梨醣酯。

多肽 ：「多肽」，一般而言，為藉由一肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的串聯。在一些實施例中，多肽可包括至少3至5個胺基酸，每一胺基酸藉由至少一個肽鍵連接到其他胺基酸。本領域普通技術人員將理解，多肽有時包括「非天然」胺基酸或其他實體，儘管如此，它們仍能夠視情況整合到多肽鏈中。在一些實施例中，術語「多肽」用於指多肽的特定功能類別，例如抗體、嵌合性抗原受體或共刺激域多肽等。對於每一此種類別，本說明書提供及/或本領域已知該類別內已知例示性多肽的胺基酸序列的數個實例；在一些實施例中，一或多種此類已知多肽為該類別的參考多肽。在此類實施例中，術語「多肽」是指顯示出與相關參考多肽足夠的序列同源性或一致性的類別的任一成員，本領域技術人員將理解該參考多肽應包括在該類別中。在許多實施例中，代表性類別之成員亦與該參考多肽共享顯著的活性。例如，在一些實施例中，一成員多肽顯示出與參考多肽至少約30-40%的整體序列同源性或一致性，且通常大於約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，及/或包括至少一區域(即保守區域，通常包括特徵序序列元素)顯示出非常高的序列一致性，通常大於90%，甚至95%、96%、97%、98%或99%。此類保守區通常包含至少3-4個，且經常多達20個或更多個胺基酸；在一些實施例中，保守區包含至少一段至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個連續胺基酸。

應理解，本發明的抗體和抗原結合劑可具有額外的保守或非必需胺基酸取代，其對多肽功能沒有實質性影響。該特定取代是否可被容忍，即不會不利地影響所需的生物學特性(例如結合活性)，可如Bowie, J U等人，Science 247：1306-1310 (1990)或Padlan等人，FASEB J. 9：133-139 (1995)中所述決定。「保守性胺基酸取代」是其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中定義出。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。

預防 : 如本文所用，術語「預防」係指預防、避免疾病表現、延遲發作及/或降低特定疾病、病症或病況(例如癌症)之一或多種症狀的頻率及/或嚴重性。在一些實施例中，預防係以群體為基礎評估，若在對該疾病、病症或病況易感的人群中觀察到該疾病、病症或病症的一或多種症狀的發展、頻率及/或強度在統計學上顯著降低，則認為該試劑「預防」該特定疾病、病症或病況。

純的 ：如本文所用，如果試劑或實體實質上不含其他成分，則其為「純的」。例如，包含超過約90%的特定試劑或實體的製劑通常被認為是純製劑。在一些實施例中，試劑或實體為至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少為99%的純度。

重組 ：如本文所用，術語「重組」係指藉由重組方式設計、改造、製備、表現、創造或分離出的多肽(例如，如本文所述的多肽)，例如使用重組表現載體轉染宿主細胞而表現之多肽、由重組、組合式多肽庫中分離出的多肽、或藉由涉及將選定序列元件剪接成另一者之任何其他方式製備、表現、創造或分離出的多肽。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件是在自然界中發現的。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件及/或其組合是經電腦設計。在一些實施例中，一或多種此類的選定序列元件係由多個(例如，二或多個)已知序列元件的組合產生，這些已知序列元件並非天然存在於相同的多肽中。

參考物 ：術語「參考物」在本文中經常用於描述標準或對照試劑、個體、群體、樣本、序列或數值，與感興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值進行比較。在一些實施例中，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值之測試或測定，實質上同時與感興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值進行測試及/或測定。  在一些實施例中，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值是經驗參考物，視情況在有形媒介中具體化。  通常，如本領域技術人員將理解的，參考試劑、個體、群體、樣本、序列或數值，係用於在可比較的條件下測定或鑑定有興趣的試劑、個體、群體、樣本、序列或數值。

單域抗體： 如本文所用，術語「單域抗體(sdAb)」、「可變單域」或「免疫球蛋白單可變域(ISV)」、「單重鏈可變域(VH)抗體」是指與標靶抗原結合之抗體之單一可變片段。這些術語在本文中可互換使用。sdAb為具有三個互補決定區(CDR)的單一抗原結合多肽。僅具sdAb便能夠結合抗原，而不須與相對應的含CDR多肽成對。在一些情況下，單域抗體由駱駝源化HCAbs改造而成，而其重鏈可變域被稱為「VHH」。某些VHH亦可稱為奈米抗體。駱駝源化sdAb是最小的已知抗原結合抗體片段之一(請參見，例如Hamers-Casterman等人，Nature 363: 446-8 (1993)；Greenberg等人，Nature 374: 168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013))。基本VHH從N端到C端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4係分別指框架區1至4，其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。可根據本領域中可用的標準技術將駱駝源化VHH結構域人類化，且此類結構域被視為「結構域抗體」。如本文中所用，VH包括駱駝VHH結構域，且其術語VHH可用於指僅包含重鏈之人類或駱駝來源的結構域抗體。如下文所解釋，本發明各態樣的一些實施例係有關一種結合試劑，其包含單一重鏈可變域抗體/免疫球蛋白重鏈單一可變域，其可在不存在輕鏈的情況下與TGFΒ抗原結合。

個體 ：如本文所用，術語「個體」是指任何哺乳動物，包括人類。在本發明的某些實施例中，個體為成人、青少年或嬰兒。在一些實施例中，術語「個人」或「患者」被使用且可與「個體」互換。本發明亦涵蓋醫藥組成物的投與及/或子宮內治療方法的進行。例如，個體可為患有癌症(例如胃腸來源)、癌症症狀的患者(例如人類患者或動物患者)，其中至少一些細胞表現TGFβ，或為有癌症傾向的患者，其中至少一些細胞表現TGFβ。除非另有說明，本發明之術語「非人類動物」包括所有非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。

實質上 ：如本文所用，術語「實質上」是指具有感興趣的特徵或特性的全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域的普通技術人員將理解，生物和化學現象很少(若有的話)完成及/或繼續完成或達到或避免一絕對的結果。因此，術語「實質上」在本文中用於包羅許多生物及化學現象中固有之潛在缺乏的完全性。

治療劑： 如本文所用，術語「治療試劑」是指具有生物活性的試劑(例如，抗原結合劑)。該術語在本文中用於指稱化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料製成的萃取物。在一些實施例中，該治療劑可為抗癌劑或化學治療劑。如本文所用，術語「抗癌劑」或「化療劑」是指具有抑制人類腫瘤，特別是惡性(癌性)病變，例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的發展或進展的功能特性的試劑。抑制轉移或血管生成通常是抗癌劑或化學治療劑的特性。化學治療劑可為細胞毒性劑或細胞抑制劑。術語「細胞抑制劑」是指抑制或壓抑細胞生長及/或細胞增殖的試劑。

轉型 ：如本文所用，係指將外源性DNA引入宿主細胞的任一過程。可使用本領域中眾所周知的各種方法在自然或人工條件下進行轉型。轉型可依賴於將外源核酸序列插入原核或真核宿主細胞中的任何已知方法。在一些實施例中，係基於被轉型的宿主細胞而選擇特定的轉型方法學，且可包括但不限於：病毒感染、電穿孔、交配、脂質轉染。在一些實施例中，「 經轉型的」細胞被穩定轉型，因為插入的DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體的一部分而進行複製。在一些實施例中，經轉型的細胞在有限的時間段內暫時表現引入的核酸。

轉形生長因子 -β (TGFβ) ： 如本文所用，術語「TGF-β」、「TGFb」、「TGFβ」及「轉形生長因子-β」在本文中可互換使用，指具有來自人類之任何TGF-β之全長天然胺基酸序列的分子家族，包括其潛在形式以及前體與成熟TGF-β之結合或未結合複合物。本文所提及的這類TGF-β將理解為提及目前已辨識的形式中之任一者，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4及TGF-β5與其潛在形式，以及未來被辨識出的人類TGF-β種類，包括衍生自任何已知TGF-β的序列並與該序列至少約75%、較佳地至少約80%、更佳地至少約85%、又更佳地至少約90%、及甚至更佳地至少約95%同源之多肽。特定術語「TGF-β1」、「TGF-β2」及「TGF-β3」，以及「TGF-β4」及「TGF-β5」係指在文獻中所定義之TGF-β，例如Derynck等人, Nature, 同上；Seyedin等人, J. Biol. Chem., 262, 同上；及deMartin等人, 同上。術語「TGF-β」係指編碼人類TGF-β之基因。較佳的TGF-β為人類TGF-β天然序列。

將TGF-β家族的成員定義為彼等在分子的成熟部分中帶有9個半胱胺酸殘基、在成熟區與其它已知TGF-β序列共有至少65%同源性、且可競爭相同受體之成員。此外，它們似乎均編碼為較大的前體，該前體在N-末端附近共用一個高度同源區且在後來會通過加工除去的前體部分中表現出保留有三個半胱胺酸殘基。X 此外，TGF-β似乎具有四或五個胺基酸的加工位點。

轉形生長因子 -β 受體 (TGFβR) ： 如本文所用，術語「TGF-bR」或「TGF-b受體」或「TGF-β受體」或「TGFβR」係用以涵蓋TGFβR家族的全部三個子類型（即TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3）。TGFβ受體的特徵為絲胺酸/蘇胺酸激酶活性，且存在於幾種不同的同型或異型二聚同功型中。

TGFβ 信息傳導路徑調節劑或TGF β 調節劑 ： 如本文所用，在本文中可互換使用之術語「TGFβ信息傳導路徑調節劑」或「TGFβ調節劑」係指能夠調節TGFβ信息傳導路徑（例如，具有抑制、阻斷或中和作用）之分子（例如抗體或其片段），且該分子可結合TGFβ本身或其可與細胞上的TGFβ受體結合。在任一情況下，該調節劑抑制了TGFβ信息傳導路徑（例如，藉由結合細胞介素(即TGFβ)本身或藉由結合TGFβ的受體）。因此，此術語涵蓋了結合TGFβ及結合TGFβ受體的兩種類型調節劑。在本文所述之各實施例中，TGFβ信息傳導路徑調節劑係於經修飾之免疫細胞（例如CAR-T細胞）中與嵌合抗原受體一起表現。表現這類TGFβ信息傳導路徑調節劑之CAR-T細胞在本文中係稱為TGFβ裝甲化CAR-T細胞。

治療或治療 ：如本文所用，術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」的定義為將治療劑投與一個體，例如患者，或投至(例如藉由施加)從個體分離出的組織或細胞中且其之後返回至該個體。在一些實體例中，該治療劑為經護甲之CAR-T細胞（例如共同表現TGFβ調節劑之經改造CAR T細胞）。治療可為治癒、療癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、緩和、增進或影響該病症、該病症的症狀或該病症的傾向，例如癌症。儘管不希望受理論束縛，但一般相信治療可在體外或體內引起細胞的抑制、消融或殺傷，或以其他方式降低細胞(例如異常細胞)介導疾病，如本文所述的病症(例如，癌症)的能力。

本文所述之發明係以「有效量」用於治療、預防或預防性治療。本文所述之治療有效量之裝甲化CAR-T細胞（例如，共表現CAR及TGFβ信息傳導調節劑之經改造細胞）為一種可改善或降低一或多種疾病症狀或預防或治癒疾病（例如癌症）之有效量。

可變區或可變 域 ： 如本文所用，術語抗體的「可變區」或「可變域」是指抗體重鏈或輕鏈的胺基端域。重鏈和輕鏈的可變域可分別稱為「VH」和「VL」。這些域通常是抗體中變化最大的部分(相對於同一類別的其他抗體)並包含抗原結合位點。僅具重鏈的抗體具有單一重鏈可變區。

載體 ：如本文所用，術語「載體」是指能夠傳送與其連接的另一核酸的核酸分子。其中一種載體類型為「質體」，其係指環狀雙股DNA環，其中可接合額外的DNA片段。另一種載體類型為病毒載體，其中額外的DNA片段可接合至該病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合至宿主細胞的基因組中，因而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠主導與其操作性連接的基因之表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。 特定實施例之詳細描述

本發明提供使用了以調節TGFβ信息傳導之多肽裝甲化之經修飾的免疫細胞（例如CAR-T細胞）來增進對癌症之免疫反應的方法及組成物。本發明不限於本文所述之特定方法或實驗條件，因為此方法或實驗條件可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅用於描述特定實施例之目的，且非用於限制，除非指明，因為本發明之範疇將僅受所附申請專利範圍限制。 TGF-B/SMAD 信息傳導

轉形生長因子β (TGF-β)是一種多功能細胞介素，最初以其將正常纖維母細胞轉化為不依賴錨固生長的細胞的能力而命名。TGF-β信息傳導控制了控制許多關鍵的細胞功能，包括增殖、分化、存活、遷移及上皮間質轉化。其調節多種生物過程，諸如細胞外基質形成、傷口癒合、胚胎發育、骨骼發育、造血、免疫及發炎反應、以及惡性轉化。TGF-β的失調會導致病理狀況，例如出生缺陷、癌症、慢性發炎、以及自體免疫與纖維化疾病。

TGFβ主要由造血及腫瘤細胞產生，其可調節(即刺激或抑制)來自多種正常和腫瘤性組織來源的細胞的生長與分化(Spom等人, Science, 233: 532 (1986))，並且刺激各種基質元件的形成與發展。TGF-β參與許多增殖和非增殖的細胞過程，諸如細胞增殖與分化、胚胎發育、細胞外基質形成、骨發育、傷口癒合、造血、以及免疫及發炎反應。

TGFβ還擁有免疫抑制作用，包括淋巴激素活化殺手細胞(LAK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抑制、降低B細胞淋巴細胞生成與κ輕鏈表現、造血的負調控、腫瘤細胞上HLA-DR表現的下調、以及對B細胞生長因子做出反應的抗原活化B淋巴細胞增殖的抑制。許多人類腫瘤及許多腫瘤細胞株會產生TGF-β，這教示了一個讓彼等腫瘤躲避正常免疫監視的可能機制。加上觀察到某些已轉形的細胞株已失去了以自體分泌方式對於會刺激基質形成且減低腫瘤免疫監視之TGF-β作出反應的能力，此負向免疫調節作用教示了一個值得做的腫瘤性失調與增殖模型。

由於TGF-β信息傳導對於健康細胞與癌症調控都是重要的，全身性地靶向TGF-β會造成不想要的。特別就癌症而言，已知TGF-β家族的成員具有許多與腫瘤發生(包括血管生成)與轉移相關的生物學活性。TGF-β抑制許多細胞類型的增殖，包括微血管內皮細胞及平滑肌細胞。TGF-β會向下調控整合蛋白的表現(涉及內皮細胞遷移的α1β1、α2β1及αvβ3)。整合蛋白係涉及所有細胞的遷移，包括轉移性細胞。TGF-β會向下調控血管生成與轉移所需的基質金屬蛋白酶表現。TGF-β會誘導胞漿素原活化物抑制劑而抑制血管生成與轉移所需的蛋白酶級聯。TGF-β會誘導正常細胞來抑制轉形細胞。參見例如，Yingling等人, Nature Reviews, 3 (12): 1011-1022 (2004)，其揭露了TGF-β的失調涉及多種疾病（包括癌症及纖維化）的發病機制，且提出理論基礎來評估TGF-β信息傳導抑制劑作為癌症治療劑、生物標誌物/診斷劑、研發中的小分子抑制劑結構、以及應用於其研發的標靶藥物研發模型。

如本文所用，術語「TGF-β信息傳導路徑」係用於描述歸因於TGF-β及TGF-β樣配位體之下游信息傳導事件。例如，在一信息傳遞路徑中，TGF-β配位體係結合於第II型TGF-β受體並使其活化。第II型TGF-β受體吸收且形成一個具有第I型TGF-β受體之異二聚體。所得之異二聚體使第I型受體可磷酸化，其繼而使SMAD蛋白家族之成員磷酸化及活化。如本領域技術人員所熟知，信息傳導級聯觸發後最終會導致對涉及細胞生長、細胞分化、腫瘤形成、細胞凋亡及細胞恆定等之中介蛋白的表現進行控制。也設想到其他TGF-β信息傳導路徑可根據本文所述方法操作。 TGF-β 信息傳導路徑調節劑

本發明提供一種免疫調節系統，其包含TGF-β信息傳導調節劑（例如調節TGF-β信息傳導之多肽或編碼調節TGF-β信息傳導之多肽的核酸序列）。在一些實施例中，TGF-β信息傳導調節劑在與TGF-β或TGF-β受體結合時會引起細胞反應。在一些實施例中，TGF-β信息傳導調節劑係分泌自細胞。

在各實施例中，本發明提供了一起表現嵌合抗原受體與TGF-β信息傳導調節劑的經修飾免疫細胞（例如T細胞）。這類調節劑可與TGF-β本身結合或與TGF-β受體結合。表現這類調節劑之CAR-T細胞在本文中係稱為TGF-β裝甲化CAR-T細胞。 抗 -TGFβ 及抗 -TGFβR2 抗原結合分子

在一些實施例中，TGF-β信息傳導調節劑為抗原結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）。在一些實施例中，該等抗原結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）特異性地與TGF-β結合。在一些實施例中，該等抗原結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）特異性地與TGF-β受體(TGFβR)（例如TGFβR1、TGFβR2）結合。

TGF-β信息傳導調節劑（例如，抗TGFβ抗體分子或抗TGFβR抗體分子）可包含本文所述之CDR或重鏈的全部或抗原結合子群。本文所述之抗TGFβ或抗TGFβR2抗原結合劑的例示性胺基酸序列（包括可變區）係顯示於表1中。其他的抗TGFβ或抗TGFβR2抗體亦描述於美國專利第7,723,486號及第9,783,604號；美國專利申請公開案第 US20160017026A1及US20180105597、US20190119387；及國際專利申請案第WO2012093125A1、WO2011/012609、WO 2017/141208 Al；其每一者的全文據此以引用方式併入。在本文所述免疫調節系統中有用的抗原結合劑包括(但不限於)特異性地與抗原(例如TGFβR表位)結合之抗體、諸如(Fab′)2之二價片段、諸如Fab之單價片段、單鏈抗體、單鏈Fv (scFv)、單域抗體、多價單鏈抗體、雙價抗體、三價抗體等。

在一些實施例中，該免疫調節系統包含與表1中所提供序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之TGFβ信息傳導調節劑（例如，抗TGFβ或抗-TGFβR2抗原結合劑）。在一些實施例中，該免疫調節系統係包含包含有一或多個表1所述抗體或其片段之CDR序列的TGFβ信息傳導調節劑。在一些實施例中，本發明之TGF-b信息傳導調節劑係包含與表1中所提供VH序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，TGF-β信息傳導調節劑之VH為單一結構域抗體(VH)。

在一些實施例中，TGF-β信息傳導調節劑包含一前導序列。在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑為單體。在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑為二聚體。在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑為三聚體。

在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑包含連接至串聯結構域之連接子。在一些實施例中，該連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 59)。在一些實施例中，該連接子包含(GGGGS) _n(SEQ ID NO: 59)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，該連接子包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61)。

在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑包含與表1所提供之VL序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗TGF-β抗原結合劑包含一與表1所提供之VH序列一致的重鏈可變區胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明之TGF-β信息傳導調節劑包含一與表1所提供之VH序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之TGF-β信息傳導調節劑包含一與表1所提供之VH序列一致的重鏈可變區胺基酸序列。

在一些實施例中，該TGF-β信息傳導調節劑(例如，單域抗體)的VH包含一與表1所提供者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的前導序列。在一些實施例中，該VH抗TGFβ抗原結合劑(例如，單域抗體)包含表1所提供之前導序列。 表 1. 例示性抗 TGFβ及抗 TGFβR2抗原結合分子

SEQ ID NO	序列
SEQ ID NO: 1 TGFb scFv VH-VL1	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKR
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SEQ ID NO: 16	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
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SEQ ID NO: 27	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 28	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 29	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQESMYWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTRIKQGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 30	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 31	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTDQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRQPAGVSGKYVDYWGQGTLVTVSS

在一些實體例中，該抗TGFβ或抗TGFβR抗原結合劑為抗體。天然發生的哺乳動物抗體的典型結構單元為四聚體。每個四聚體由兩對多肽鏈組成，每對具有一條「輕」鏈(約25 kDa)和一條「重」鏈(約50-70 kDa)。每條鏈的胺基端部分包括主要負責抗原識別的約100至110個或更多個胺基酸的可變區。每條鏈的羧基端部分定義出主要負責效應子功能的恆定區。人類輕鏈可分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α或ε，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區由一具約12個或更多胺基酸的「J」區連接，其中重鏈亦包括一具約10個以上的胺基酸的「D」區。一般請參見 Fundamental ImmunologyCh. 7 (Paul, W.編，二編，Raven Press, N.Y. (1989))。每一輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。抗TGFβ抗體分子的較佳同種型為IgG免疫球蛋白，其可分為四種亞型，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各具有不同的γ重鏈。大多數治療性抗體為IgG1類型的人類、嵌合性或人源化抗體。在一特定實施例中，該抗TGFβ抗體分子具有IgG1同種型。

每一重鏈和輕鏈對的可變區形成抗原結合位點。因此，完整的IgG抗體具有兩個相同的結合位點。然而，雙功能或雙特異性抗體為人工雜交構建體，其具有兩個不同的重/輕鏈對，導致兩個不同的結合位點。

這些鏈都具有由三個高度變異區(亦稱為互補決定區或CDR)連接的相對保守框架區(FR)的相同一般結構。來自每對兩條鏈的CDR藉由框架區對齊，而能夠與特異性表位結合。從N端到C端，輕鏈和重鏈均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每一結構域的胺基酸係依據下列文獻之定義指定：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987及1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia等人， Nature342:878-883 (1989)。如本文所用，CDR係指重鏈(HCDR1、HCDR2、HCDR3)及輕鏈(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中之每一者。

因此，在一實施例中，該抗體分子包括以下之一或二者：

(a) 上述人類融合瘤、選定淋巴細胞或鼠類抗體中之一者的輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2及/或LCDR3）之一個、兩個、三個或抗原結合數。在實施例中，該CDR可包含如下的LCDR1至3之一或多個或全部的胺基酸序列：LCDR1或經修飾的LCDR1，其中一到七個胺基酸經保守性取代；LCDR2或經修飾的LCDR2，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；或LCDR3或經修飾的LCDR3，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；以及

(b) 上述人類融合瘤、選定淋巴細胞或鼠類抗體中之一者的重鏈CDR（HCDR1、HCDR2及/或HCDR3）之一個、兩個、三個或抗原結合數。在實施例中，CDR可包含如下的HCDR1至3中的一或多個或全部的胺基酸序列：HCDR1或經修飾的HCDR1，其中一或兩個胺基酸經保守性取代；HCDR2或經修飾的HCDR2，其中一至四個胺基酸經保守性取代；或HCDR3或經修飾的HCDR3，其中一或兩個胺基酸經保守性取代。

在一些實施例中，本發明的抗TGFβ抗體分子或抗TGFβR (例如，抗TGFβR2)抗體分子可使表現TGFβ之細胞(例如腫瘤細胞)產生抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。由於其具有結合至Fc受體的能力，具有IgG1和IgG3同種型的抗體可用於引發抗體依賴性細胞毒性能力之效應子功能。具有IgG2和IgG4同種型的抗體可用於使ADCC反應最小化，因為它們結合至Fc受體的能力低。在相關實施例中，可在抗體Fc區進行取代或醣基化組成的變化，例如藉由在經修飾的真核細胞株中生長，以增強Fc受體辨識、結合及/或介導抗TGFβ抗體所或抗TGFβR (例如，抗TGFβR2)抗體結合之細胞的細胞毒性(參見，例如，美國專利號7,317,091、5,624,821和文獻包括WO 00/42072、Shields等人， J. Biol. Chem.276:6591-6604 (2001)、Lazar等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103:4005-4010 (2006)、Satoh等人， Expert Opin Biol. Ther.6:1161-1173 (2006))。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段(例如，人源化抗體、人類抗體)可包括改變或裁剪功能(例如，效應子功能)的胺基酸取代或置換。例如，人類來源恆定區(例如，γ1恆定區、γ2恆定區)可設計為降低補體活化及/或Fc受體結合。(請參見，例如，美國專利第5,648,260號(Winter等人)、美國專利第5,624,821號(Winter等人)和美國專利第5,834,597號(Tso等人)，其全部教示係以全文引用之方式併入本文中)。較佳地，包含此類胺基酸取代或置換的人類來源恆定區胺基酸序列，與人類來源之未經改變恆定區胺基酸序列在全長上至少約95%一致，更佳地，與人類來源之未經改變恆定區胺基酸序列在全長上至少約99%一致。額外的抗TGFβ抗原結合分子係進一步描述於美國專利第 8,785,600號(Nam等人)中，其全部教示係以引用之方式併入本文中。

在又一實施例中，效應子功能亦可藉由調節抗體的醣基化模式來改變。改變是指刪除抗體中發現的一或多個醣類部分，及/或加入一或多個抗體中不存在的醣基化位點。例如，在美國專利申請公開號2003/0157108 (Presta)中描述具有增強的ADCC活性和成熟的醣類結構的抗體，該結構缺乏連接到抗體Fc區的岩藻醣。亦請參見美國專利申請公開號2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo股份有限公司)。Glycofi亦開發出能夠產生抗體特異性醣型的酵母細胞株。

額外地或替代地，可製備具有醣基類型改變的抗體，例如具有降低量的岩藻醣基殘基的低岩藻醣基化抗體、或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。此種改變的醣基化模式已被證明可增加抗體的ADCC能力。此類醣類修飾可藉由例如在具有經改變的醣基化機制的宿主細胞中表現該抗體而達成。本領域已描述具有改變的醣基化機制的細胞，且可使用作為宿主細胞，其中經改造以表現本發明的重組抗體，因而產生具有改變的醣基化的抗體。例如，EP 1,176,195 (Hang等人)中描述具有功能被破壞的FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻醣基轉移酶，使得在此類細胞株中表現的抗體展現低岩藻醣基化。PCT公開號WO 03/035835 (Presta)描述一種變異性CHO細胞株--Lec13細胞，其將岩藻醣連接至Asn(297)-連接醣類上的能力降低，亦導致在該宿主細胞中表現的抗體呈現低岩藻醣基化(亦請見Shields, R. L.等人，2002 J. Biol. Chem.277:26733-26740)。PCT公開號WO 99/54342 (Umana等人)描述經改造以表現醣蛋白修飾醣基轉移酶(例如，β(1,4)-N 乙醯胺基葡萄醣基轉移酶III (GnTIII))的細胞株，使得在該經改造細胞株中表現的抗體表現出增加的等分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加(亦請參見Umana等人，1999 Nat. Biotech.17:176-180)。

人源化抗體亦可使用CDR-嫁接方法製備。產生此類人源化抗體的技術為本領域中已知的。通常，人源化抗體是藉由獲得編碼與TGFβ結合的抗體之可變重鏈和可變輕鏈序列的核酸序列、辨識該可變重鏈和可變輕鏈序列中的互補決定區或「CDR」，並將該CDR核酸嫁接至人類框架核酸序列上而產生。(請參見，例如，美國專利號4,816,567和5,225,539)。CDR和框架殘基的位置可確定(請參見Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部，NIH出版編號91-3242，以及Chothia, C.等人， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))。

在一些實體例中，本發明之免疫調節系統包含編碼來自表1中所述抗體分子之CDR的抗TGFβ或抗TGFβR抗體分子的核酸序列。於一些實施例中，來自表1之序列係可併入用於本文所述治療方法（例如，免疫調節系統、免疫反應性細胞或包含其之治療方法）之辨識TGFβ或TGFβR的分子中。選出的人類框架為一種適合體內投藥的框架，這意味著它不具有免疫原性。例如，此種決定可經由此類抗體的體內使用和胺基酸相似性研究的先前經驗而進行。適宜框架區可選自如下人類源抗體：其在供體抗體(例如抗TGFβ抗體分子)之等效部分(例如框架區)之胺基酸序列內之框架區長度上具有至少約65%胺基酸序列一致性，且較佳地至少約70%、80%、90%或95%胺基酸序列一致性。可使用合適的胺基酸序列比對演算法，例如CLUSTAL W，使用預設參數來決定胺基酸序列一致性。(Thompson J. D.等人， Nucleic Acids Res.22:4673-4680 (1994))。

一旦辨識出待人源化的複製抗體之CDR和FR，便可辨識出編碼該CDR的胺基酸序列，並將相對應的核酸序列嫁接到選定的人類FR上。此可使用已知的引子和連接子來完成，其選擇為本領域中已知的。特定人類抗體的所有CDR可被非人類CDR的至少一部分替換，或者僅部分CDR可被非人類CDR替換。僅需要替換該人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數量。在CDR嫁接至選定的人類FR上後，所得的「人源化」可變重鏈和可變輕鏈序列係經表現，以產生與TGFβ或TGFβR結合的人源化Fv或人源化抗體。較佳地，經CDR-嫁接的(例如，人源化的)抗體係以與供體抗體的親和力相似、實質上相同或更好的親和力與TGFβ或TGFβR結合。通常，該人源化可變重鏈和輕鏈序列係表現為具有人類恆定域序列的融合蛋白，因此獲得與TGFβ結合的完整抗體。然而，可產生不包含該恆定序列的人源化Fv抗體。

人源化抗體，其中特定胺基酸已經取代、刪去或加入，亦落於本發明範圍內。特別地，人源化抗體可在框架區具有胺基酸取代，例如以增進與抗原的結合。例如，經選定、小數目的人源化免疫球蛋白鏈的接受者框架殘基，可被相對應的供體胺基酸置換。取代的位置包括與CDR相鄰的胺基酸殘基，或能夠與CDR相互作用的胺基酸殘基(請參見例如美國專利號5,585,089或5,859,205)。接受者框架可為成熟的人類抗體框架序列或共通序列。如本文所用，術語「共通序列」是指在相關家族成員中的某一區域之序列的每一位置處最常見的或由最共通的殘基設計的序列。有多種人類抗體共通序列可使用，包括人類可變區不同亞群的共通序列(請參見Kabat, E. A.,等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部，美國政府印務局(1991))。Kabat數據庫及其應用可在線上免費獲得，例如經由IgBLAST，國家生物技術信息中心，貝塞斯達，馬里蘭州(亦請見，Johnson, G.及Wu, T. T., Nucleic Acids Research29:205-206 (2001))。

在某些實施例中，該TGFβ或TGFβR抗體分子為人類抗TGFβ或抗TGFβR IgG1抗體。由於此類抗體具有與TGFβ或TGFβR分子所希望的結合，因此此類抗體中的任一者皆可容易地進行同種型轉換，以產生人類IgG4同種型，例如，同時仍具有相同的可變區(其定義該抗體的特異性和親和力，在一定程度上)。因此，當產生滿足如上文所討論的希望「結構」屬性的抗體候選物時，它們通常可提供至少某些經由同種型轉換所希望的額外「功能」屬性。 單鏈抗體

單鏈抗體缺乏其所源自之完整抗體的一些恆定域或所有恆定域。因此，其可克服一些與使用完整抗體相關之問題。例如，單鏈抗體傾向於不含有重鏈恆定區與其他生物分子之間的某些不想要的相互作用。此外，單鏈抗體顯著小於完整抗體且與完整抗體相比可具有較大滲透性，使得單鏈抗體更有效地定位且結合於標靶抗原結合位點。再者，與完整抗體相比，單鏈抗體之相對較小的尺寸使其不太可能在接受者中引發不當免疫反應。

在一些實施例中，該TGFβ信息傳導調節劑為專一性結合至TGF乙型之單鏈抗原結合分子（例如scFv）。在一些實施例中，該TGFβ信息傳導調節劑為特異性地與TGF-B受體(TGFβR) (例如TGFβR1、TGFβR2)結合之單鏈抗原結合分子(例如scFv)。

多個單鏈抗體（每個單鏈具有由第一肽連接子所共價連結的一個VH以及一個VL結構域）可藉由至少一或多個肽連接子而共價連結，以形成多價單鏈抗體，且其可以是單特異性或多特異性的。多價單鏈抗體的每一個鏈都包括可變異輕鏈片段及可變異重鏈片段，且藉由肽連接子而連結到至少另一個鏈。肽連接子是由至少15個胺基酸殘基所組成。連接子胺基酸殘基的最大數目大約為100個。

兩個單鏈抗體可經組合以形成亦稱為二價二聚物之雙價抗體。雙價抗體具有兩條鏈及兩個結合位點，且可具有單特異性或雙特異性。雙價抗體之各鏈包括與VL域連接之VH域。該等結構域係與足夠短之連接子連接以防止在相同鏈上的結構域之間配對，由此促使不同鏈上之互補域之間配對，從而再產生兩個抗原結合位點。

三個單鏈抗體可經組合以形成亦稱為三價二聚物之三價抗體。三價抗體係由VL或VH域之胺基酸末端與VL或VH域之羧基末端直接融合(亦即無任何連接子序列)而構成。三價抗體具有三個Fv頭部，其中多肽係以環狀、頭接尾的方式排列。一種可能的三價抗體構形為平面的，其中三個結合位點係以彼此成120度之角度位於一平面中。三價抗體可具有單特異性、雙特異性或三特異性。 單域抗體

單域抗體(sdAb)與傳統4-鏈抗體的不同之處在於具有單一單體抗體可變域。例如，駱駝科動物和鯊魚產生稱為僅具重鏈之抗體(HcAbs)的sdAb，其天生缺乏輕鏈。駱駝源化僅具重鏈之抗體的每一臂中的抗原結合片段，具有單一重鏈可變域(VHH)，它可以在沒有輕鏈幫助的情況下對抗原具有高親和力。駱駝源化VHH被稱為最小的功能性抗原結合片段，分子量約為15 kD。

本申請案之一態樣係提供一種特異性地結合至TGFβR (諸如人類TGFβR2)之經分離單域抗體(本文稱為「抗TGFβR sdAb」)。在一些實施例中，該抗TGFβR sdAb係調節TGFβ活性。在一些實施例中，該抗TGFβR sdAb為拮抗劑抗體。進一步提供衍生自本文所述任一抗TGFβR sdAb的抗原結合片段，以及包含有本文所述任一抗TGFβR sdAb的抗原結合蛋白。在一些實施例中，該抗TGFβR sdAb包含表1中提供的一、二及/或三個CDR序列。例示性抗TGFβR sdAb係提供於表1中。

在一些實施例中，一些或所有的CDR序列、重鏈，可用於另一抗原結合劑中，例如用於CDR嫁接、人源化或嵌合性抗體分子中。該等實施例包括一包含有足夠的CDR (例如來自上述重鏈可變區之一的所有三個CDR)之抗體分子以使其可結合TGFβ。

在一些實施例中，該等CDR(例如所有的HCDR)係嵌入人類或人類衍生的框架區中。人類框架區的實例包括人類生殖系(germline)框架序列、已親和力成熟化(體內或體外)的人類生殖系序列，或合成的人類序列，例如共通序列。在一實施例中，該重鏈框架為IgG1或IgG2框架。

在一些實施例中，本發明之TGFβ調節劑係包含表1中提供的重鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，該抗TGFβ抗原結合劑為僅具單域重鏈的抗體(例如，不包含免疫球蛋白輕鏈的抗原結合劑)。

用於體內治療或診斷用途的抗體片段可受益於增進其血清半衰期的修飾。適用於增加該抗體的體內血清半衰期的有機部分可包括一、二或更多個直線或分支片段，選自於：親水性聚合物基團(例如，直線或分支聚合物(例如，聚烷二醇如聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇及類似物)、醣類(例如葡聚醣、纖維素、多醣及類似物)、親水性胺基酸的聚合物(例如聚離胺酸、聚天冬胺酸及類似物)、聚烷類氧化物和聚乙烯吡咯烷酮)、脂肪酸基團(例如單羧酸或二羧酸)、脂肪酸酯基團、脂質基團(例如二醯基甘油基團、神經鞘脂基團(例如神經醯胺基))或磷脂基團(例如，磷脂醯乙醇胺基團)。較佳地，該有機部分結合至預定位點，在該處有機部分不會損害所得免疫共軛物的功能(例如，降低抗原結合親和力)，與未共軛抗體部分相較。該有機部分可具有約500 Da至約50,000 Da，較佳約2000、5000、10,000或20,000 Da的分子量。以有機部分修飾多肽(例如抗體)的實例和方法可見於例如美國專利號 4,179,337和5,612,460、PCT公開號WO 95/06058和WO 00/26256，以及美國專利申請公開號20030026805。 TGFβR細胞外結構域

預期供使用於本文所述免疫調節系統的之TGF-β受體係可為任何TGF-β受體，包括來自活化素樣激酶家族(ALK)、骨塑型蛋白(BMP)家族、Nodal家族、生長及分化因子家族(GDF)、及TGF-β受體家族之受體。TGF-β受體為影響細胞中各種生長及分化途徑的絲胺酸/蘇胺酸激酶受體。在一些實施例中，TGFβ信息傳導調節劑為TGFβ受體（例如TGFβR1、TGFβR2）之經改造重組細胞外結構域(ECD)。在一些實施例中，可用於本文所述免疫調節系統之TGF-β受體為第II型TGF-β受體（例如TGF-βR2）。

在一些實施例中，該TGF-β調節劑包含表2所提供之TGFβR。在一些實施例中，該TGFβ調節劑包含與表2所提供之序列至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致之序列的序列。 表 2. 例示性 TGFβR細胞外結構域

SEQ ID NO: 32 mTGFbR2ECD (I24-K31,F57-L185)	IPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL
SEQ ID NO: 33 huTGFbR1+2 ECD v1	LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEGGGGSTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD [hTGFbR1-ECD(L34-E125)- hTGFbR2-ECD(A44-D151)]
SEQ ID NO: 34 huTGFbR1+2 ECD v2	QCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE [hTGFbR1-ECD(Q35-N107)-4GS- 4GS-hTGFbR2-ECD(L34-E125)]
SEQ ID NO: 35 mTGFbR1+2 ECD v1	LQCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNKIELPTTGPFSEKQSAGLGPVELGGGGSIPPHVPKSVNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPD [mTGFbR1-ECD(L30-L126)-4GS-mTGFbR2-ECD(I24-K31,F57-D184)]
SEQ ID NO: 36 huTGFbR1+2 ECD v2	QCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKE [mTGFbR1-ECD(Q31-N107)-4GS-mTGFbR2-ECD(I24-K31,F57-E150)]
SEQ ID NO: 37 具有IgKss的小鼠TGFbR2 ECD	METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL
SEQ ID NO: 38 具有8(G4S)連結子及帶 標記標籤之IgKss的小鼠TGFbR2 ECD二聚體	METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGS DYKDDDDK

嵌合性抗原受體

在一些態樣中，本發明提供一種包含有TGF-β信息傳導調節劑（例如調節TGF-β信息傳導之多肽或編碼調節TGF-β信息傳導之多肽的核酸序列）以及可與所關注抗原結合之嵌合抗原受體(CAR)的免疫調節系統。嵌合抗原受體(CAR)是包含有三個基本單元的雜合分子：(1)胞外抗原結合基序，(2)連接/跨膜基序，及(3)胞內T細胞信息傳導基序(Long A H, Haso W M, Orentas R J. Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigen receptor. Oncoimmunology. 2013; 2 (4):e23621)。在一些實施例中，本發明之CAR從N末端至C末端係包含一信息或前導肽、抗原結合域、跨膜及/或鉸鏈域、共刺激域及胞內結構域。在一些實施例中，CAR為「第一代CAR」，例如包括在抗原結合時僅提供CD3ζ信息的CAR。「第二代CAR」包括皆提供共刺激(例如CD28或CD137)與活化(CD3ζ)的CAR。「第三代CAR」包括皆提供多重共刺激(例如CD28或CD137)與活化(CD3)的CAR。在各實施例中，CAR係經選擇以對於抗原具有高親和力或結合性。

CAR的抗原結合模體通常在單鏈片段可變域(ScFv)、免疫球蛋白(Ig)分子的最小結合域或單域抗體之後形成(例如，WO2018/028647A1)。替代的抗原結合模體，例如受體配位體(即，IL-13已被改造為與腫瘤表現IL-13受體結合)、完整的免疫受體、基因庫衍生的胜肽、和先天免疫系統效應子分子(例如NKG2D)亦經改造。用於表現CAR之替代細胞標靶（諸如NK或γ-δ T細胞）也在開發中(Brown C E等人，Clin Cancer Res. 2012; 18(8):2199-209; Lehner M等人，PLoS One. 2012; 7 (2):e31210)。

在一些實施例中，該CAR之抗原結合域為單鏈可變片段。在一些實施例中，該CAR之抗原結合域為單域抗體。在一些實施例中，該等CAR從N端到C端包含一信息肽或前導肽、vH、CD28跨膜及鉸鏈、CD28共刺激域、及CD3ζ細胞內結構域。

CAR的連接模體可為相對穩定的結構域，例如IgG的恆定域，或被設計為延伸的彈性連接子。結構模體，例如衍生自IgG恆定域者，可用於將ScFv結合域延伸遠離T細胞膜表面。這對於結合域特別靠近腫瘤細胞表面膜的某些腫瘤標靶可能很重要(例如二唾液酸神經節苷脂GD2；Orentas等人，未發表的觀察)。迄今為止，CAR中使用的信息傳導模體始終包括CD3-ζ鏈，因為此核心模體是T細胞活化的關鍵信息。首個報導的第二代CAR具有CD28信息傳導域和CD28跨膜序列。此模體也用於包含CD137 (4-1BB)信息傳導模體的第三代CAR中(Zhao Y等人，J Immunol. 2009; 183 (9): 5563-74)。隨著新技術的出現，以與抗-CD3和抗-CD28抗體連結的微珠活化T細胞，以及來自CD28的經典「信息2」的出現，不再需要由CAR本身編碼。使用微珠活化，發現第三代載體在體外試驗中並不優於第二代載體，且它們在白血病小鼠模型中沒有明顯優於第二代載體(Haso W, Lee D W, Shah N N, Stetler-Stevenson M, Yuan C M, Pastan I H, Dimitrov D S, Morgan R A, FitzGerald D J, Barrett D M, Wayne A S, Mackall C L, Orentas R J. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia, Blood. 2013; 121 (7):1165-74; Kochenderfer J N等人，Blood. 2012; 119 (12):2709-20)。第二代CD28/CD3-ζ中的CD19特異性CAR (Lee D W等人，American Society of Hematology Annual Meeting. New Orleans, La.; Dec. 7-10, 2013)和CD137/CD3-ζ信息格式(Porter D L等人，N Engl J Med. 2011; 365 (8): 725-33)的臨床成功證明了這一點。除了CD137，其他腫瘤壞死因子受體超級家族成員如OX40也能夠在CAR轉導的T細胞中提供重要的持續信息(Yvon E等人，Clin Cancer Res. 2009; 15(18):5852-60)。同樣重要的是培養CAR T細胞群的培養條件。

CAR之特徵包括其以非MHC限制之方式，將T細胞特異性及反應性重新導向至所選目標，及利用單株抗體之抗原結合特性的能力。非MHC限制性抗原辨識使表現CAR之T細胞有能力辨識出與抗原加工無關之抗原，因此繞過腫瘤逃逸之主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR會有利地不使外源性T細胞受體(TCR)α及β鏈進行二聚化。 細胞外結構域

如本文中所描述，該CAR包含一標靶特異性結合元件，其還被稱為抗原結合域或部分。結構域之選擇取決於定義標靶細胞表面之配位體的種類及數目。例如，可選擇該抗原結合域來辨識與特定疾病狀態(例如癌症)相關之在標靶細胞上作為細胞表面標記物的配位體(例如癌症抗原)。因此，在CAR中可作為抗原結合域之配位體的細胞表面標記物之實例包括與病毒性、細菌性及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關者。

在一些實施例中，CAR之細胞外結構域包含特異性地與癌症抗原結合之抗原結合劑。在某些實施例中，CAR係與腫瘤抗原結合。可將任何腫瘤抗原（抗原肽）使用於本文所述之腫瘤相關實施例中。抗原來源包括(但不限於)癌症蛋白。抗原可表現為肽或其完整蛋白或其部分。其完整蛋白或部分可為天然或經誘變的。腫瘤抗原之非限制性實例包括碳酸酐酶IX (CA1X)、癌胚抗原(CEA)、CD8、CD7、CD 10、CD 19、CD20、CD22、CD30、CD33、CLL1、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、CD123、CD44V6、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原(例如，細胞表面抗原)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、受體酪胺酸蛋白激酶erb-B2,3,4 (erb-B2,3,4)、葉酸結合蛋白(FBP)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、葉酸受體-a、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂G3 (GD3)、鳥苷酸環化酶(Guanylyl cyclase) C (GCC)、人類表皮生長因子受體2 (ITER-2)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、介白素13受體次單元α-2 (IL- l3Rcx2)、k-輕鏈、激酶插入結構域受體(KDR)、路易斯(Lewis) Y (LeY)、Ll細胞黏附分子(L1CAM)、黑色素瘤抗原家族A、1 (MAGE-A1)、黏蛋白16 (MUC16)、黏蛋白1 (MUC1)、間皮素(MSLN)、ERBB2、MAGEA3、p53、MARTl,GPl00、蛋白酶3 (PR1)、酪胺酸酶、存活蛋白、hTERT、EphA2、NKG2D配位體、癌症-睪丸抗原NY-ES0-1、腫瘤胚胎抗原(h5T4)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTK7 ROR1、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG-72)、血管內皮生長因子R2 (VEGF-R2)、及Wilms腫瘤蛋白(WT-l)、BCMA、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、PRAME CCR4、CD5、CD3、TRBC1、TRBC2、TIM-3、整聯蛋白B7、ICAM-l、CD70、Tim3、CLEC12A及ERBB。

在某些實施例中，該CAR與CD19多肽結合。在某些實施例中，該CAR與人類CD19多肽結合。在某些實施例中，該CAR與CD19蛋白的細胞外結構域結合。在某些實施例中，該CD19 CAR包含表3所提供的序列。

在某些實施例中，該CAR與GCC多肽結合。在某些實施例中，該CAR與人類GCC多肽結合。在某些實施例中，該CAR與GCC蛋白的細胞外結構域結合。在某些實施例中，該抗GCC CAR包含表3中提供的序列。

在某些實施例中，該CAR與間皮素多肽結合。在某些實施例中，該CAR與人類間皮素多肽結合。在某些實施例中，該CAR與間皮素蛋白的細胞外結構域結合。

在某些實施例中，該CAR與病原體抗原結合，以(例如)用於治療及/或預防(例如)免疫功能低下的個體中之病原體感染或其他感染性疾病。病原體之非限制性實例包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲及可引起疾病之原生動物。

病毒之非限制性實例包括逆轉錄病毒科(例如人類免疫缺陷病毒，諸如HIV-l (也稱為HDTV-III、LAVE或HTLV-IIELAV、或HIV-III；以及其它分離株，諸如HIV-LP)；小核醣核酸病毒科(例如小兒麻痺病毒、A型肝炎病毒、腸病毒、人類柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒(echovirus))；杯狀病毒科(例如引起腸胃炎的菌株)；披衣病毒科(例如馬腦炎病毒、德國麻疹病毒)；黃病毒科(例如登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；桿狀病毒科(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；絲狀病毒科(例如伊波拉病毒)；副黏液病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒)；正黏液病毒科(例如流行性感冒病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例如漢江病毒、班加(bunga)病毒、白蛉病毒屬病毒(phlebovirus)及奈拉(Naira)病毒)；沙狀病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒、環狀病毒(orbivirus)及輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科；肝炎病毒科(B型肝炎病毒)；細小病毒科(Parvoviridae)(細小病毒)；乳多瘤病毒科(乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多數腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV) 1及2、水痘帶狀皰狀病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；及虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒)；以及未分類的病毒(例如，D型肝炎的病原體(被認為是B肝病毒的缺失性衛星)、非A非B型肝炎的病原體(第1類=內部傳播；第2類=經腸胃外傳播(即C型肝炎)；諾沃克(Norwalk)及相關病毒，以及星狀病毒)。

細菌之非限制性實例包括巴斯德桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、假單胞菌及沙門氏菌。感染性細菌之具體實例包括但不限於幽門螺桿菌、伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬(例如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M. avium)、胞內分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、戈登分枝桿菌(M. gordonae))、金黃色葡萄球菌、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、單核細胞增生性李斯特菌、化膿性鏈球菌(A組鏈球菌)、無乳鏈球菌(B組鏈球菌)、鏈球菌(草綠色組)、糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌(厭氧屬)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲桿菌屬、腸球菌屬、流感嗜血桿菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、棒狀桿菌屬、紅斑丹毒絲菌、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringers)、破傷風梭菌、產氣腸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、多殺性巴斯德桿菌(Pasturella multocida)、類桿菌屬、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌、梅毒螺旋體(Treponema pallidium)、細弱螺旋體、鉤端螺旋體、立克次氏體及伊斯若放線菌。

在某些實施例中，病原體抗原為存在於巨細胞病毒(CMV)中之病毒抗原、存在於EB病毒中之病毒抗原、存在於人類免疫缺陷病毒(HIV)中之病毒抗原、或存在於流感病毒中之病毒抗原。

在某些實施例中，該CAR的細胞外結構域包含連接子。在一些實施例中，該連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 59)。在一些實施例中，該連接子包含(GGGGS) _n(SEQ ID NO: 59)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，該連接子包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61)。

在一些實施例中，該細胞外抗原結合域係包含IgA抗體、IgG抗體、IgE抗體、IgM抗體、雙或多特異性抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、經分離之CDR或其群組；單鏈可變片段(scFv)、多肽-Fc融合物、單域抗體(sdAb)、VH、駱駝源化抗體；掩蔽抗體、小型模組化免疫製藥(「SMIPsTM」)、單鏈、串聯雙價抗體、VHHs、抗運載蛋白(Anticalin)、奈米抗體、人源化抗體(humabody)、微型抗體、BiTE、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白、DARPIN、Avimer、DART、TCR-類似抗體、Adnectin、人類泛素(Affilin)、穿透抗體(Trans-body)；親和抗體(Affibody)、TrimerX、微型蛋白、Fynomer、Centyrin；以及KALBITOR，或其片段。

在一些實施例中，該CAR之胞外抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，該CAR之胞外抗原結合域包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，為單域抗體(sdAb)， 跨膜域

如本文所述，該CAR包含一跨膜域。關於跨膜域，該CAR包含與CAR的胞外抗原結合域融合的一或多個跨膜域。該跨膜域可衍生自天然或合成來源。若來源是天然的，則該域可衍生自任何膜-結合蛋白或跨膜蛋白。

用於本文所述之CAR中之跨膜區可衍生自(亦即，包含至少以下跨膜區)T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、間皮素(mesothelin)、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，該跨膜域可為合成性，在此情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。在一些實施例中，在合成性跨膜域的每一端會發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。視情況，短寡-或多肽連接子，長度較佳在2到10個胺基酸之間，可形成跨膜域和CAR的細胞質信息傳導域之間的連結。在一些實施例中，該連接子為甘胺酸-絲胺酸雙聯體或丙胺酸三聯體連接子。

在一些實施例中，除了如前述之跨膜域之外，亦使用天然地與CAR的結構域之一結合的跨膜域。在一些實施例中，該跨膜域可藉由胺基酸取代來選擇，以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜域結合，藉此使與該受體複合物的其他成員的相互作用最小化。

在一些實施例中，本發明之CAR中之跨膜域為CD28跨膜域。在一些實施例中，該CD28跨膜域包含核酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，CD28跨膜結構域包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 42之核酸序列。在一些實施例中，該跨膜結構域包含之序列係具有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列中至少一、二或三個修飾(例如，取代)但不超過20、10或5個修飾(例如，取代)，或其序列與SEQ ID NO: 42之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致。

在CAR中，間隔子域(亦稱為鉸鏈域)可配置在細胞外結構域與跨膜域之間，或配置在細胞內結構域與跨膜域之間。間隔子域意謂任何作為連接跨膜域與細胞外結構域及/或跨膜域與細胞內結構域之寡胜肽或多胜肽。間隔子域包含至多300個胺基酸，較佳10至100個胺基酸，且最佳25至50個胺基酸。

在數個實施例中，該連接子可包括間隔子元件，當存在時，以增加連接子之大小，使得效應分子或可偵測標記與抗體或抗原結合片段之間的距離增加。例示性間隔子為一般技術人員所已知，且包括於美國專利號 7,964,566、7,498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444、及4,486,414，以及美國專利 公開號 20110212088和20110070248中所列者，其每一者皆以全文引用之方式併入本文中。

該間隔子域較佳具有促進CAR與抗原之結合及提高傳導至細胞中之信息的序列。預期促進結合之胺基酸實例包括半胱胺酸、帶電胺基酸、及潛在醣基化位點中之絲胺酸及蘇胺酸，且此等胺基酸可作為構成該間隔子域之胺基酸。

在一些實施例中，該CAR包含一鉸鏈域。在一些實施例中，該鉸鏈域包含核酸序列IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 41)。在一些實施例中，該鉸鏈域包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 41之核酸序列。在一些實施例中，該絞鏈域包含之序列係具有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列中至少一、二或三個修飾(例如，取代)但不超過20、10或5個修飾(例如，取代)，或其序列與SEQ ID NO: 41之胺基酸序列至少95-99%一致。

在一些實施例中，該鉸鏈域及跨膜域係衍生自相同分子。在其他實施例中，該鉸鏈及跨膜域係衍生自不同分子(例如，CD8融合至CD28)。在一些實施例中，該CAR包含一鉸鏈域。在一些實施例中，該鉸鏈域包含核酸序列IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 43)。在一些實施例中，該鉸鏈域包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 43之核酸序列。在一些實施例中，該絞鏈域包含之序列係具有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列中至少一、二或三個修飾(例如，取代)但不超過20、10或5個修飾(例如，取代) 。 細胞内域

CAR的細胞質域或細胞內信息傳導域負責活化已有CAR的免疫細胞的至少一種正常效應子功能。術語「效應子功能」是指細胞的特殊功能。例如，T細胞的效應子功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因子的分泌。因此，術語「細胞內信息傳導域」是指轉導效應子功能信息並指導細胞執行特定功能的蛋白質之一部分。雖然通常可以使用完整細胞內信息傳導域，但在許多情況下沒有必要使用整個鏈。就使用細胞內信息傳導域的截短部分而言，此類截短部分可用於代替完整鏈，只要它能轉導效應子功能信息即可。因此，術語「細胞內信息傳導域」意在包括足以轉導效應子功能信息的細胞內信息傳導域的任何截短部分。

用於CAR的細胞內信息傳導域的實例包括T細胞受體(TCR)和共受體的細胞質序列，其共同作用以在抗原受體接合後啟動信息轉導，以及這些序列的任何衍生物和變異體，和任何具有相同功能的合成序列。僅通過TCR產生的信息不足以完全活化T細胞，還需要次級或共刺激信息。因此，T細胞活化可視為由兩種不同類型的細胞質信息傳導序列介導的：經由TCR(初級細胞質信息傳導序列)啟動抗原依賴性初級活化者，以及以非抗原-依賴性的方式發揮作用，以提供次級或共刺激信息(次級細胞質信息傳導序列)。

初級細胞質信息傳導序列以刺激方式或抑制方式調節TCR複合物的初級活化。以刺激方式作用的初級細胞質信息傳導序列可能包含信息傳導模體，這些模體被稱為免疫受體酪胺酸基活化模體或ITAM。本文揭示的含有特別用於CAR之初級細胞質信息傳導序列的ITAM實例包括衍生自TCRζ (CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d者。特別地，ITAM之非限制性實例包括具有CD3ζ胺基酸序列編號51至164之胜肽。(NCBI RefSeq: NP.sub.--932170.1)，Fcε.RI.γ之胺基酸編號45至86。(NCBI RefSeq: NP.sub.--004097.1)，Fcε.RI.β之胺基酸編號201至244。(NCBI RefSeq: NP.sub.--000130.1)，CD3γ之胺基酸編號139至182。(NCBI RefSeq: NP.sub.--000064.1)，CD3δ之胺基酸編號128至171。(NCBI RefSeq: NP.sub.--000723.1)，CD3ε之胺基酸編號153至207。(NCBI RefSeq: NP.sub.--000724.1)，CD5之胺基酸編號402至495 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2)、0022之胺基酸編號707至847 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001762.2)、CD79a之胺基酸編號166至226 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001774.1)、CD79b之胺基酸編號182至229 (NCBI RefSeq: NP.sub.--000617.1)、及CD66d 之胺基酸編號177至252 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001806.2)、以及與這些胜肽具有相同功能的變異體。基於本文所述之NCBI RefSeq ID或GenBank之胺基酸序列資訊的胺基酸編號，係基於每一蛋白質之前驅體(包含一信息胜肽序列等)的全長來編號。在一實施例中，CAR之細胞質信息傳導分子包含一衍生自CD3ζ之細胞質信息傳導序列。

在一些實施例中，CAR之細胞內結構域可經設計以包含CD3-ζ信息傳導域本身，或與有關CAR的內文中可用的任何其他所需之細胞內信息傳導域結合。例如，CAR之細胞内域可包含一CD3ζ鏈部分及一共刺激信息傳導區。該共刺激信息傳導區係指包含共刺激分子之細胞内域的CAR之一部分。共刺激分子為抗原受體或其配位體以外之細胞表面分子，其為淋巴細胞對抗原產生有效反應所必需。此類共刺激分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及特異地與CD83結合之配位體、及類似者。特別地，此類共刺激分子之非限制性實施例包括具有下列序列之胜肽：CD2之胺基酸編號236至351 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001758.2)、CD4之胺基酸編號421至458 (NCBI RefSeq: NP.sub.--000607.1)、CD5之胺基酸編號402至495 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2)、CD8α之胺基酸編號207至235 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001759.3)、CD83之胺基酸編號196至210 (GenBank: AAA35664.1)、CD28之胺基酸編號為181至220 (NCBI RefSeq： NP.sub.-006130.1)、CD137之胺基酸編號為214至255 (4-1BB，NCBI RefSeq: NP.sub.--001552.2)、CD134之胺基酸編號241至277 (OX40，NCBI RefSeq: NP.sub.--003318.1)、及ICOS之胺基酸編號166至199 (NCBI RefSeq: NP.sub.--036224.1)、以及與這些胜肽具有相同功能的變異體。因此，雖然本發明主要使用4-1BB作為共刺激信息傳導元件範例，但其他共刺激信息傳導元件亦落於本發明的範疇中。

CAR之細胞質信息傳導部分中的細胞質信息傳導序列可隨機或以指定順序彼此連接。視情況，短寡-或多胜肽連接子，長度較佳在2到10個胺基酸之間，可形成該橋聯。在一些實施例中，該連接子為甘胺酸-絲胺酸雙聯體或丙胺酸三聯體連接子。

在一些實施例中，該細胞內結構域可設計成包含一CD28共刺激信息傳導域。在一些實施例中，該CAR之細胞內結構域包含之胺基酸序列係與RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 44)至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

在一些實施例中，該細胞內結構域係設計成包含CD3-ζ的信息傳導域和CD28的信息傳導域。

在一些實施例中，該細胞內結構域包含具有一或多個經修飾之免疫受體酪胺酸基礎活化模體(ITAM)的CD3-ζ。在一些實施例中，該細胞內結構域包含一CD3-ζ，其具有三個免疫受體酪胺酸基礎活化模體(ITAM)，其中第一個未經修飾，且第二和第三個ITAM經改變，名為「1XX」。在一些實施例中，該CAR之細胞內結構域包含之胺基酸序列係與RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 45)至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

在一些實施例中，該CAR包含之細胞內信息傳導域係包含經修飾之CD3z多肽（例如經修飾之人類CD3z多肽），該經修飾之CD3z多肽包含天然ITAM1、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3、具有兩個功能喪失突變之ITAM2變異體、及具有兩個功能喪失突變之ITAM3變異體、以及包含有CD28多肽(例如人類CD28多肽)之共刺激信息傳導區。

在另一實施例中，該細胞內結構域設計成包含CD3-ζ之信息傳導域及4-1BB之信息傳導域。在又一實施例中，該細胞內結構域係設計成包含CD3-ζ的信息傳導域和CD28和4-1BB的信息傳導域。

在一些實施例中，該細胞內結構域係設計成包含4-1BB的信息傳導域和CD3-ζ的信息傳導域。

在一些實施例中，該CAR包含之胺基酸序列係與表3中所提供之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 表 3. 例示性嵌合性抗原受體

	序列
抗CD19 CAR	MGTSLLCWMALCLLGADHADAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 49)
小鼠CD19 CAR	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT NSRRNR LLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPA RDFAAYRP RAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR (SEQ ID NO: 62)
人類CD19 CAR (含CD3-1xx)	MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 63)
V1-01 抗GCC CAR	MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 47)
V51 抗GCC CAR	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 48)
V5 抗GCC CAR	MELGLSWVFLVAILEGVQCQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDYTRDVWGQGTAVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 50)
V36 抗GCC CAR	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGGRLEWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 51)
V1 抗GCC CAR	MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 52)
V48 抗GCC CAR	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYPDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDNLRAEDTAMYYCTRDYNKDLWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 53)
V8 抗GCC CAR	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTGVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 54)
V9 抗GCC CAR	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGRGLEWVAKIRYDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 55)
V30 抗GCC CAR	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFGRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 56)
V31 抗GCC CAR	QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 57)

CAR 的功能特徵

本文中所揭示之CAR的功能部分亦明確包括在本發明範疇中。術語「功能部分」當用於指稱CAR時，係指本文中所揭露之一或多個CAR之任何部分或片段，該部分或片段保留該部分的CAR (原CAR)之生物活性。功能部分涵蓋例如CAR的彼等部分，其與原CAR保持辨識標靶細胞或偵測、治療或預防疾病之能力的程度相似、程度相同或程度較高。關於原CAR，該功能部分可包含例如約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多的原CAR。

該功能部分可包含在該部分之胺基或羧基端或兩端處之額外胺基酸，其為在原CAR之胺基酸序列中並未發現的額外胺基酸。希望的是，該額外胺基酸不干擾該功能部分的生物功能，例如，辨識標靶細胞、偵測癌症、治療或預防癌症等。更理想地，與原CAR的生物活性相較，該額外胺基酸提高該生物活性。

本發明的範圍包括本文中所揭露之CAR的功能變異體。如本文所用，術語「功能變異體」係指具有與原CAR實質上或顯著的序列一致性或相似性之CAR、多胜肽或蛋白質，該功能變異體保留由其變異之CAR的生物活性。功能變異體涵蓋例如本文所述之CAR的變異體(原CAR)，其保持與原CAR程度相似、程度相同或程度較高之辨識標靶細胞的能力。相關於原CAR，該功能變異體可與原CAR之胺基酸序列例如，至少約30%、50%、75%、80%、90%、98%或更高一致。

功能變異體可例如包含原CAR之胺基酸序列，其具有至少一保守性胺基酸取代。替代地或另外地，功能變異體可例如包含原CAR之胺基酸序列，其具有至少一非保守性胺基酸取代。在此案例中，非保守性胺基酸取代較佳地不干擾或抑制該功能性變異體之生物活性。非保守性胺基酸取代可提高該功能變異體之生物活性，使得功能變異體之生物活性較原CAR增加。

該CAR之胺基酸取代較佳為保守性胺基酸取代。保守性胺基酸取代為本領域中已知的，且包括胺基酸取代，其中具有特定物理及/或化學性質之胺基酸係交換成具有相同或類似化學或物理性質之另一胺基酸。例如，該保守性胺基酸取代可為一酸性/負電荷極性胺基酸被另一酸性/負電荷極性胺基酸(如Asp或Glu)取代、一帶有非極性側鏈之胺基酸被另一帶有非極性側鏈之胺基酸(如Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)取代、一鹼性/正電荷極性胺基酸被另一鹼性/正電荷極性胺基酸(如Lys、His、Arg等)取代、一帶有極性側鏈的不帶電胺基酸被另一帶有極性側鏈的不帶電胺基酸(如Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)取代、一帶有β分支側鏈的胺基酸被另一帶有β分支側鏈的胺基酸(如He、Thr和Val)取代、一帶有芳香側鏈的胺基酸被另一帶有芳香側鏈的胺基酸(如His、Phe、Trp和Tyr)取代等。

該CAR基本上可由本文所述之特定胺基酸序列或序列組成，使得其他成分(例如，其他胺基酸)不實質改變該功能變異體的生物活性。

該CAR (包括功能部分及功能變異體)可具有任何長度，亦即，可包含任何數量的胺基酸，條件為該CAR (或其功能部分或功能變異體)保留其生物活性，例如，特異結合至抗原之能力、偵測哺乳動物之患病細胞、或治療或預防哺乳動物之疾病等。例如，該CAR可為約50至約5000個胺基酸長度，諸如長度為50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個胺基酸。

該CAR (包括本發明之功能性部分及功能變異體)可包含合成胺基酸代替一或多種天然存在之胺基酸。此類合成胺基酸為本領域中已知的，並包括例如：胺基環己烷羧酸、正亮胺酸、-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-和反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸 β-羥基苯丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、二氫吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-芐基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二芐基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、-胺基環戊烷羧酸、α-胺基環己烷羧酸、α-胺基環庚烷羧酸、α-(2-胺基-2-降冰片烷)-羧酸、γ-二胺基丁酸、β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸和α-第三-丁基甘胺酸。

該CAR (包括功能部分及功能變異體)可經醣基化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-醯化、經由例如雙硫橋聯環化、或轉化為酸加成鹽及/或視情況二聚合化或聚合化或共軛。 取代和變異

在一些實施例中，其涵蓋了本文提供的抗體之胺基酸序列變異體。例如，可能希望增進抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。抗體的胺基酸序列變異體可藉由引入適當的修飾至編碼該抗體的核酸序列中、或藉由胜肽合成而製備。此類修飾包括，例如，抗體胺基酸序列內殘基的刪去及/或插入及/或取代。可進行刪去、插入和取代的任何組合，以完成最終構建體，條件為該最終構建體具有希望的特徵，例如抗原結合。 a)取代、插入和刪除變異

在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。進行取代突變的有興趣位點包括HVR和FR。以下進一步描述胺基酸側鏈類別。可將胺基酸取代引入至有興趣的抗體中，並將產物進行希望之活性篩選，例如抗原結合度維持/增進、免疫原性降低、或ADCC或CDC增進。

胺基酸可根據共同側鏈特性來分組：

(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)鹼性：His、Lys、Arg；

(5)影響鏈位向之殘基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代係為將這些類別之一的成員交換為另一類別。

取代變異體之一種類型涉及取代親本抗體(例如，人源化或人抗體)的一或多個高度變異區殘基。通常，經選擇用於進一步研究的所得變異體，相較於親本抗體，在某些生物學特性(例如增加的親和力、降低的免疫原性)方面將具有修飾(例如，增進)，及/或將實質上保留該親本抗體的某些生物學特性。例示性取代變異體為親和力成熟的抗體，其可方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，如本文所述者。簡而言之，一或多個HVR殘基發生突變，而該變異抗體展示在噬菌體上，並針對特定的生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

可在HVR中進行改變(例如，取代)，以例如增進抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」中進行，即由在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變的密碼子編碼的殘基(請參見，例如，Chowdhury,  Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))，及/或SDR (a-CDR)，其中所得變異體VH或VL的結合親和力係經測試。藉由構建及自二級庫中重新篩選而達成親和力成熟，已描述於如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’ Brien等人編，Human Press, Totowa, NJ (2001))。在親和力成熟的一些實施例中，在選定用於成熟化的可變基因中引入多樣性，藉由多種方法之任一者達成(例如，易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸-定向突變)。之後創建二級庫。之後篩選該庫，以辨識出具有希望親和力的任何抗體變異體。另一種引入多樣性的方法涉及HVR-導向法，其中數個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)被隨機化。參與抗原結合的HVR殘基可被特異性辨識出，例如，使用丙胺酸掃描突變或模擬。尤其是CDR-H3和CDR-L3經常成為標靶。

在一些實施例中，取代、插入或刪去可發生在一或多個HVR內，只要此類改變實質上不降低抗體結合抗原的能力。例如，可在HVR內進行實質上不會降低結合親和力的保守性改變(例如，本文提供的保守性取代)。此類改變可能在HVR「熱點」或CDR之外。在上文提供的變異體VHH序列的一些實施例中，每一HVR未經改變或含有不超過一、二或三個胺基酸取代。

一種用於辨識抗體中目標用於突變的殘基或區域的可用方法被稱為「丙胺酸掃描突變」，描述於Cunningham和Wells (1989) Science, 244: 1081-1085。在此方法中，目標殘基之一殘基或殘基組(例如帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被辨識出，並被中性或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代，以決定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。其他取代可引入至顯示出對初始取代的功能敏感性的胺基酸位置處。替代地或額外地，抗原-抗體複合物的晶體結構係用於辨識抗體和抗原之間的接觸位點。此類接觸殘基和相鄰殘基可被靶向或消除，而作為取代的候選物。可篩選變異體以確定其是否含有所希望的特性。

胺基酸序列的插入包括胺基及/或羧基端融合，長度範圍從一個殘基到含有一百個或更多個殘基的多肽，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N-端甲硫胺醯殘基的抗體。該抗體分子的其他插入型變異體包括抗體的N-或C-端融合至一酵素(例如，針對ADEPT)或一增加該抗體之血清半衰期的多肽。 b)醣基化變異體

在一些實施例中，本文提供的抗體經改變以增加或減少抗體被醣基化的程度。向抗體加入或刪除醣基化位點可方便地藉由改變胺基酸序列，藉此創造或移除一或多個醣基化位點而達成。

在抗體包含一Fc區時，與其相連的碳水化合物可被改變。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支、雙觸角寡醣，其藉由N-橋聯連結至Fc區之CH2域的Asn297。請參見例如，Wright等人 TIBTECH 15: 26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯葡醣胺(GlcNAc)、半乳醣和唾液酸，以及在雙觸角寡醣結構的「主幹」中連接至GlcNAc的岩藻醣。在一些實施例中，本申請案的抗體可進行寡醣修飾，以創造具有某些增進特性的抗體變異體。

在一些實施例中，係提供具有醣類結構的抗體變異體，該醣類結構缺乏(直接或間接)連接到Fc區的岩藻醣。例如，此類抗體中岩藻醣的含量可為1至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻醣的量是藉由計算Asn297醣鏈內的岩藻醣平均含量而決定的，相對於與Asn 297相連的所有醣結構(例如，複合、雜合和高度甘露醣結構)的總和，以MALDI-TOF質譜法測量，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區約位置297的天冬醯胺殘基(Fc區殘基的EU編號)；然而，由於抗體的微小序列差異，Asn297也可能位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，即介於位置294和300之間。此類岩藻醣基化變異體可具有增進的ADCC功能。請參見，例如，美國專利公開號US 2003/0157108 (Presta、L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo股份有限公司)。與「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺失」抗體變異體相關的文獻實例包括：US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體的細胞株實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化的Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986)；US專利申請案號US 2003/0157108 A1，Presta, L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人)，以及敲除細胞株，例如α-1、6-岩藻醣基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(請參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng., 94 (4):680-688 (2006)；以及WO2003/085107)。

抗體變異體更提供二等分的寡醣，例如，其中連接到抗體Fc區的雙觸角寡醣被GlcNAc二等分。此類抗體變異體可能具有降低的岩藻醣基化及/或增進的ADCC功能。此類抗體變異體的實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利號6,602,684 (Umana等人)；以及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供在連接到Fc區的寡醣中具有至少一個半乳醣殘基的抗體變異體。此類抗體變異體可具有增進的CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；以及WO 1999/22764 (Raju, S.)。

CAR (包括其功能部分和功能變異體)可藉由本領域中已知的方法獲得。CAR可經由任何製備多肽或蛋白質的合適方法製備。自始合成多肽和蛋白質的合適方法係描述於參考文獻中，諸如Chan等人，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, Reid, R.編，Marcel Dekker, Inc., 2000；Epitope Mapping, Westwood等人編，Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001；以及美國專利號 5,449,752。此外，多肽和蛋白質可使用本文所述的核酸使用標準重組方法重組產生。請參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, N Y, 1994。此外，一些CAR (包括其功能部分和功能變異體)可從來源，例如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物(例如大鼠、人類)等中分離及/或純化出。分離和純化的方法為本領域中已知的。或者，本文所述的CAR (包括其功能部分和功能變異體)可由工廠工業合成。在此態樣中，CAR可為合成性、重組性、經分離及/或經純化。 可偵測標記物與標籤

CAR、表現CAR的T細胞、單株抗體、其抗原結合片段，特異於本文揭示的一或多種抗原，亦可與標籤蛋白一起表現(例如，共表現)。在一些實施例中，弗林蛋白酶識別位點和下游2A核糖體序列，係設計用於該標籤序列及CAR序列同時雙順反子表現。在一些實施例中，該2A序列包含核酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，弗林蛋白酶和P2A序列包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 58之核酸序列。在一些實施例中，該P2A標籤包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列或具有與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致的序列。

特異於本文揭示的一或多種抗原之CAR、表現CAR的T細胞、單株抗體、其抗原結合片段，亦可與可偵測標記物共軛；例如，能夠藉由ELISA、分光光度法、流式細胞術、顯微術或診斷成像技術(例如電腦斷層掃描(CT)、電腦軸向斷層掃描(CAT)掃描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)、磁共振斷層掃描(MTR)、超音波、光纖檢查和腹腔鏡檢查)偵測的可偵測標記物。可偵測標記物的具體、非限制性實例包括螢光基團、化學發光劑、酵素聯結、放射性同位素和重金屬或化合物(例如用於以MRI偵測的超順磁性氧化鐵奈米晶體)。例如，可使用的可偵測標記物包括螢光化合物，包括螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白、鑭系元素磷光體、及類似物。亦可使用生物發光標記物，例如螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)。特異於本文揭示的一或多種抗原之CAR、表現CAR的T細胞、抗體、其抗原結合片段，亦可與用於偵測的酵素共軛，例如辣根過氧化酶、β-半乳醣苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄醣氧化酶、及類似物。當CAR、表現CAR的T細胞、抗體、其抗原結合片段，與可偵測的酵素共軛時，可藉由加入額外的試劑進行偵測，該酵素使用該額外試劑產生可辨別的反應產物。例如，當辣根過氧化酶試劑存在時，加入過氧化氫和二胺基聯苯胺會產生有色反應產物，該產物可目視偵測。CAR、表現CAR的T細胞、抗體、其抗原結合片段，亦可與生物素共軛，並經由抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)結合的間接測量來偵測。應當注意的是，抗生物素蛋白本身可與酵素或螢光標記共軛。

CAR、表現CAR的T細胞、抗體、其抗原結合片段，可與順磁性劑例如釓共軛。順磁性試劑如超順磁性氧化鐵亦可作為標記物。抗體亦可與鑭系元素(例如銪和鏑)和錳共軛。抗體或抗原結合片段亦可標記有可被二級報告子所辨識的預定多肽表位(例如白胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合位點、金屬結合域、表位標籤)。

CAR、表現CAR的T細胞、抗體、其抗原結合片段，亦可與經放射性標記的胺基酸共軛。放射性標記可用於診斷和治療目的。例如，放射性標記可用於藉由X射線、發射光譜或其他診斷技術偵測本文揭示的一或多種抗原及表現抗原的細胞。此外，該放射性標記可在治療上作為毒素，以治療個體的腫瘤，例如治療神經母細胞瘤。多肽之標籤的實例包括但不限於以下放射性同位素或放射性核苷酸： ³H、 ¹⁴C、 ¹⁵N、 ³⁵S、 ⁹⁰Y、 ⁹⁹Tc、 ¹¹¹In、 ¹²⁵I、 ¹³¹I。

偵測此類可偵測標記物的方法為本領域技術人員眾所周知的。因此，例如，放射性標記可使用照相底片或閃爍計數器偵測，螢光標記物可使用光偵測器偵測發出的光線而偵測。酵素性標記物通常藉由提供酵素與受質，並偵測酵素對受質作用產生的反應產物，且藉由簡單地觀察有色標記物而偵測該顯色標記物。 免疫反應性細胞及宿主細胞

本申請案之一態樣係提供一種經改造免疫效應細胞（例如，免疫反應性細胞）。如本文所用，「免疫反應性細胞」係指在免疫反應或是祖細胞或其子代中起作用之細胞。在一些實施例中，該免疫反應性細胞包含本文所述之免疫調節系統（例如，包括有對於腫瘤相關抗原或壓力配位體具特異性之標靶劑的細胞；以及編碼調節TGF-β信息傳導之多肽的核酸序列）。在一些實施例中，該免疫反應性細胞包含本文所述之免疫調節系統（例如，編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及編碼調節TGF-β信息傳導之多肽的核酸序列）。

在一些實施例中，該免疫效應細胞為T細胞、NK細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、造血幹細胞、多潛能幹細胞或胚胎幹細胞。在一些實施例中，該免疫反應性細胞為T細胞。

出於本文之目的，該T細胞可為任何T細胞，諸如經培養T細胞，例如初代T細胞，或來自經培養T細胞株，例如Jurkat、SupTl等的T細胞，或自哺乳動物獲得之T細胞。若自哺乳動物獲得，則該T細胞可自多種來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T細胞亦可經富集或純化。該T細胞可為人類細胞。該T細胞可為分離自人類之T細胞。該T細胞可為任何類型之T細胞且可為任何發育階段，包括但不限於：CD4+/CD8+雙陽性T細胞、CD4+輔助T細胞(例如Th1及Th2細胞)、CD8+ T細胞(例如，細胞毒殺T細胞)、腫瘤浸潤細胞、記憶T細胞、記憶幹細胞(即Tscm)、原始T細胞及類似細胞。該T細胞可為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。

於一實施例中，如本文所述的CAR可用於合適的非T細胞中。此類細胞為具有免疫效應功能者，例如由多潛能幹細胞產生之NK細胞及T-類似細胞。

一實施例進一步提供包含本文所述的任何重組表現載體的宿主細胞。如本文所用，術語「宿主細胞」是指可含有本發明的重組表現載體的任一類型細胞。該宿主細胞可為真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，或可為原核細胞，例如細菌或原生動物。該宿主細胞可為培養細胞或初代細胞，即直接從生物體例如人類分離出。該宿主細胞可為附著細胞或懸浮細胞(即懸浮生長的細胞)。合適的宿主細胞為本領域中已知的，包括(例如) DH5α 大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等等。為了擴增或複製該重組表現載體目的，該宿主細胞可為原核細胞，例如DH5a細胞。為了產生重組CAR之目的，該宿主細胞可為哺乳動物細胞。該宿主細胞可為人類細胞。當宿主細胞可為任何細胞類型、可衍生自任何類型的組織且可處於任何發育階段時，該宿主細胞可為周邊血液淋巴細胞(PBL)或周邊血液單核細胞(PBMC)。該宿主細胞可為T細胞。

一實施例亦提供包含至少一種本文所述之宿主細胞的細胞群。該細胞群可為異質群，其包含含有所述的任何重組表現載體的宿主細胞，以及至少一種其他細胞(例如不包含任何該重組表現載體的宿主細胞(如T細胞))、或T細胞以外的細胞，例如B細胞、巨噬細胞、中性顆粒細胞、紅血球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等。或者，該細胞群可為實質上同質之群體，其中該群體主要包含含有該重組表現載體(例如基本上由其組成)的宿主細胞。該群體亦可為細胞的複製群體，其中該群體的所有細胞皆為包含一重組表現載體的單一宿主細胞的複製株，而使得該群體的所有細胞都包含該重組表現載體。在本發明之一實施例中，該細胞群為包含宿主細胞的複製株群，該宿主細胞包含如本文所述的重組表現載體。

CAR (包括其功能部分及其變異體)、核酸、重組表現載體、宿主細胞(包括其群體)及抗體(包括其抗原結合部分)，可經分離及/或純化。例如，經純化(或經分離)的宿主細胞製備物，係為其中宿主細胞比其體內自然環境中的細胞更純。此類宿主細胞可例如藉由標準純化技術製造。在一些實施例中，宿主細胞之製備物經純化，使得宿主細胞含量為該製備物之總細胞含量的至少約50%，例如至少約70%。例如，該純度可為至少約50%、可大於約60%、約70%或約80%、或可為約100%。 核酸及表現載體

本發明之一實施例進一步提供一種核酸，該核酸包含編碼本文所述的任何CAR、抗體或其抗原結合部分(包括其功能部分和功能變異體)的核苷酸序列。本發明的核酸可包含編碼本文所述的前導序列、抗原結合域、跨膜域及/或細胞內T細胞信號傳導域之任一者的核苷酸序列。

在一些實施例中，該核苷酸序列可經密碼子修飾。不受特定理論的束縛，一般相信該核苷酸序列的密碼子最佳化可增加mRNA轉錄物的轉譯效率。該核苷酸序列的密碼子最佳化可能涉及以天然密碼子取代另一個編碼相同胺基酸的密碼子，但可藉由細胞內更容易獲得的tRNA轉譯，因而提高轉譯效率。該核苷酸序列的最佳化亦可降低會干擾轉譯的二級mRNA結構，因而提高轉譯效率。

在本發明之一實施例中，該核酸可包含編碼本發明CAR之抗原結合域的密碼子-經修飾之核苷酸序列。在本發明之另一實施例中，該核酸可包含編碼本發明CAR之任一者(包括功能部分及其功能變異體)之密碼子-經修飾之核苷酸序列。

表現載體包括質體、逆轉錄病毒、黏接質體、YAC、EBV衍生的附加體、及類似物。一種方便的載體為編碼功能完整人類CH或CL免疫球蛋白序列的載體，其具有經改造的適當限制性位點，以便可以輕鬆插入和表現任何VH或VL序列。在此種載體中，剪接通常發生在插入J區的剪接供體位點和人類C區之前的剪接受體位點之間，也發生在人類CH外顯子內的剪接區。合適的表現載體可包含許多組件，例如複製起點、可選擇標記基因、一或多種表現控制元件，例如轉錄控制元件(例如啟動子、增強子或終止子)、及/或一或多個轉譯信號、一信號序列或前導序列、及類似物。聚腺苷酸化和轉錄終止發生在該編碼區下游的天然染色體位點。所得嵌合性抗體可與任何強啟動子連接。可使用的合適載體實例包括適用於哺乳動物宿主並以病毒複製系統為基礎者，例如猿猴病毒40(SV40)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK突變異體(BKV)，或小鼠和人類巨細胞病毒(CMV)，以及莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、天然Ig啟動子等。多種合適的載體為本領域中已知的，包括維持在單副本或多副本、或整合到宿主細胞染色體中的載體，例如，經由LTR，或經改造而具有多個整合位點的人工染色體(Lindenbaum等人， Nucleic Acids Res.32:e172 (2004)、Kennard等人， Biotechnol. Bioeng. Online May 20, 2009)。合適載體的額外實例在後面章節中列出。

因此，本發明提供一或多種包含有一核酸的表現載體，且該核酸係編碼抗體、抗體之抗原結合片段(例如，人類、人源化、嵌合抗體或前述任何抗原結合片段)、抗體鏈(例如，重鏈、輕鏈)或與TGFβ或TGFβR結合之抗體鏈的抗原結合部分。在一些實施例中，本發明提供一或多種包含有TGFβR之核酸細胞外結構域的表現載體。

在真核宿主細胞中的表現是有用的，因為此類細胞比原核細胞更有可能組裝和分泌出正確折疊的和具有免疫學活性的抗體。然而，任何所得由於不正確折疊而失活之抗體，可根據已知方法重新恢復活性(Kim及Baldwin、“Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding”, Ann. Rev. Biochem.51、第459-89頁(1982))。宿主細胞可能會產生完整抗體的一部分，例如輕鏈二聚體或重鏈二聚體，其亦為本發明的抗體類似物。

本發明亦提供一種核酸，其包含與編碼本文所述CAR構築體之核酸至少約70%或更高，如約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致之核苷酸序列。

在一實施例中，可將核酸加入重組表現載體中。在此方面，一實施例提供包含該核酸任一者的重組表現載體。出於本文目的，術語「重組表現載體」是指基因經修飾的寡核苷酸或聚核苷酸構建體，當該構建體包含編碼該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽的核苷酸序列時，其允許宿主細胞表現該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽，且該載體在足以在細胞內表現該mRNA、蛋白質、多肽或胜肽的條件下與該細胞接觸。這些載體並非以一個整體天然發生。

然而，該載體之一部分可為天然發生。重組表現載體可包含任一類型的核苷酸，包括但不限於DNA和RNA，其可為單鏈或雙鏈、合成或部分來自天然來源，且可包含天然的、非天然的或經改變的核苷酸。該重組表現載體可包含天然發生或非天然發生的核苷酸間聯結，或兩種類型的聯結兼具。較佳地，非天然發生或經改變的核苷酸或核苷酸間聯結並不阻礙載體的轉錄或複製。

在一實施例中，該重組表現載體可為任何合適的重組表現載體，且可用於轉型或轉染任何合適的宿主細胞。合適的載體包括設計用於繁殖和擴增或用於表現、或兩者兼有的載體，例如質體和病毒。該載體可選自於由下組成之組：pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, CA)、pET系列(Novagen, Madison, WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。

亦可使用噬菌體載體，例如λ、λZapII (Stratagene)、EMBL4和λNMI 149。植物表現載體的實例包括pBIO1、pBI101.2、pBHO1.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。動物表現載體的實例包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo (Clontech)。重組表現載體可為病毒載體，例如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。慢病毒載體是衍生自慢病毒基因組的至少一部分的載體，尤其包括自失活慢病毒載體，如提供於Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)。可用於臨床的慢病毒載體的其他實例包括，例如但不限於，來自Oxford BioMedica plc 的LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen的LENTIMAX™載體系統、及類似技術。非臨床類型的慢病毒載體亦可獲得，且為本領域技術人員已知。

許多轉染技術為本領域中已知的(請參見，例如Graham等人，Virology, 52: 456-467 (1973)；如前述之Sambrook等人；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986)；以及Chu等人，Gene, 13: 97 (1981))。

轉染方法包括磷酸鈣共沉澱(請參見例如如前述之Graham等人)、直接微量注射到培養細胞中(請參見例如Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980))、電穿孔(請參見例如，Shigekawa等人，BioTechniques, 6: 742-751 (1988))、微脂體介導的基因轉移(請參見例如，Mannino等人，BioTechniques, 6: 682-690 (1988))、脂質介導的轉導(請參見例如，Feigner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987))、和使用高速微彈的核酸遞送(請參見例如，Klein等人，Nature, 327: 70-73 (1987))。

在一實施例中，重組表現載體可使用(例如)如前述之Sambrook等人及如前述之Ausubel等人所描述之標準重組DNA技術製備。可製備環狀或直線表現載體的構建體，以包含在原核或真核宿主細胞中發揮作用的複製系統。複製系統可衍生自例如ColE1、2μ質體、λ、SV40、牛乳突狀瘤病毒、及類似病毒。

重組表現載體可包含調控序列，例如轉錄和轉譯起始和終止密碼子，其特異於待引入該載體的宿主細胞類型(例如細菌、真菌、植物或動物)，若合適的話，並考慮該載體是基於DNA還是基於RNA。該重組表現載體可包含限制性位點，以幫助選殖。

重組表現載體可包括一或多種標記基因，其允許篩選出經轉型或經轉染的宿主細胞。標記基因包括殺生物劑抗性，例如對抗生素、重金屬等的抗性，在營養缺陷型宿主中的互補，以提供原養型及類似物。適用於本發明表現載體的標記基因包括，例如，新黴素/G418抗性基因、潮黴素抗性基因、組胺醇抗性基因、四環素抗性基因、和胺芐青黴素抗性基因。

該重組表現載體可包含天然或非天然啟動子，其可操作地連接至編碼該CAR (包括功能部分及其功能變異體)的核苷酸序列、或與編碼該CAR的核苷酸序列互補或雜合的核苷酸序列。啟動子的選擇，例如強、弱、可誘導、組織特異性和發育特異性，係落於技術人員的一般技能範圍內。類似地，核苷酸序列與啟動子的組合也落於技術人員的一般技能範圍內。該啟動子可為非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子、或在鼠幹細胞病毒之長末端重複序列中發現的啟動子。

重組表現載體可設計為用於暫時表現、穩定表現或兩者皆是。此外，重組表現載體可製備為用於組成型表現或誘導型表現。

此外，重組表現載體可製備為包括一自殺基因。如本文所用，術語「自殺基因」是指導致表現該自殺基因的細胞死亡的基因。自殺基因可為賦予表現基因的細胞對試劑(例如藥物)的敏感性，並在細胞與試劑接觸或暴露於試劑時導致細胞死亡的基因。自殺基因為本領域中已知的(請參見，例如，Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004)，包括例如單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺基酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基還原酶。 治療方法

本發明係有關於包含向個體投與抗TGFβ、抗-TGFβR抗原結合分子、或TGFβR之細胞外結構域的治療方法。在一些實施例中，本文所揭露之CAR及抗原結合分子係可用於治療或預防哺乳動物疾病的方法中。在此方面，一實施例係提供一種治療或預防哺乳動物癌症的方法，包含向哺乳動物投與有效治療或預防哺乳動物癌症之量的CAR、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群、抗體及/或其抗原結合部分，及/或醫藥組成物。

在一些實施例中，CAR係表現在供體細胞上，且這些細胞分泌出抗TGFβ、抗-TGFβR抗原結合分子、或TGFβR之細胞外結構域。在一些實施例中，用於T細胞療法之供體T細胞係得自患者(例如，用於自體T細胞療法)。在其他實施例中，用於T細胞療法之供體T細胞得自非患者之個體(例如，同種異體T細胞療法)。CAR+ T細胞可以治療有效量投與。舉例而言，治療有效量之T細胞可為至少約10 ⁴個細胞、至少約10 ⁵個細胞、至少約10 ⁶個細胞、至少約10 ⁷個細胞、至少約10 ⁸個細胞、至少約10 ⁹個細胞、或至少約10 ¹⁰個細胞。

在一些實施例中，T細胞之治療有效量為約10 ⁴個細胞、約10 ⁵個細胞、約10 ⁶個細胞、約10 ⁷個細胞或約10 ⁸個細胞。在一些實施例中，CAR T細胞之治療有效量為約2 X 10 ⁶個細胞/kg、約3 X 10 ⁶個細胞/kg、約4 X 10 ⁶個細胞/kg、約5 X 10 ⁶個細胞/kg、約6 X 10 ⁶個細胞/kg、約7 X 10 ⁶個細胞/kg、約8 X 10 ⁶個細胞/kg、約9 X 10 ⁶個細胞/kg、約1 X 10 ⁷個細胞/kg、約2 X 10 ⁷個細胞/kg、約3 X 10 ⁷個細胞/kg、約4 X 10 ⁷個細胞/kg、約5 X 10 ⁷個細胞/kg、約6 X 10 ⁷個細胞/kg、約7 X 10 ⁷個細胞/kg、約8 X 10 ⁷個細胞/kg、或約9 X 10 ⁷個細胞/kg。在一些實施例中，CAR陽性的活T細胞之治療有效量介於約1 X 10 ⁶至約2 X 10 ⁶個CAR陽性的活T細胞每公斤體重之間，直至最大劑量約1 x 10 ⁸個CAR陽性的活T細胞。

在一些實施例中，CAR陽性的活T細胞之治療有效量在約0.25 X 10 ⁶至2 X 10 ⁶之間。 在一些實施例中，CAR陽性的活T細胞之治療有效量為0.25 x 10 ⁶、0.3 x 10 ⁶、0.4 x 10 ⁶、約0.5 x 10 ⁶、約0.6 x 10 ⁶、約0.7 x 10 ⁶、約0.8 x 10 ⁶、約0.9 x 10 ⁶、約1.0 x 10 ⁶、約1.1 x 10 ⁶、約1.2 x 10 ⁶、約1.3 x 10 ⁶、約1.4 x 10 ⁶、約1.5 x 10 ⁶、約1.6 x 10 ⁶、約1.7 x 10 ⁶、約1.8 x 10 ⁶、約1.9 x 10 ⁶、或約2.0 x 10 ⁶個CAR陽性的活T細胞。

在一些實施例中，CAR陽性的活T細胞之治療有效量在約0.4 x 10 ⁸至約2 x 10 ⁸個CAR陽性存活T細胞之間。在一些實施例中，CAR陽性的活T細胞之治療有效量為約0.4 x 10 ⁸、約0.5 x 10 ⁸、約0.6 x 10 ⁸、約0.7 x 10 ⁸、約0.8 x 10 ⁸、約0.9 x 10 ⁸、約1.0 x 10 ⁸、約1.1 x 10 ⁸、約1.2 x 10 ⁸、約1.3 x 10 ⁸、約1.4 x 10 ⁸、約1.5 x 10 ⁸、約1.6 x 10 ⁸、約1.7 x 10 ⁸、約1.8 x 10 ⁸、約1.9 x 10 ⁸、或約2.0 x 10 ⁸個CAR陽性的活T細胞。

一實施例進一步包含在投與本文所揭示之CAR之前，使哺乳動物進行淋巴耗盡。淋巴耗盡的實例包括但不限於：非清髓性淋巴細胞清除化療、清髓性淋巴細胞清除化療、全身輻射照射等。

就其中投與宿主細胞或細胞群的方法目的而言，細胞可為與該哺乳動物同種異體或自體的細胞。在一些實施例中，該等細胞為哺乳動物自體的。在一些實施例中，該等細胞係與哺乳動物異源。如本文所用，同種異體是指衍生自與引入材料的個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座上的基因不相同時，該二或多個個體被稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自同一物種個體的同種異體材料可能在基因上完全不同，而有抗原性相互作用。如本文所用，「自體」是指衍生自同一個體的任何材料，之後將其重新引入該個體。

本文所提及之哺乳動物可為任何哺乳動物。如本文所用，術語「哺乳動物」是指任何哺乳動物，包括但不限於：囓齒目哺乳動物，例如小鼠和倉鼠，以及兔形目哺乳動物，例如兔。哺乳動物可來自食肉目，包括貓科動物(貓)和犬科動物(狗)。哺乳動物可來自偶蹄目，包括牛(母牛)和豬(豬)，或來自偶蹄目，包括馬(馬)。哺乳動物可為靈長類、四足猴(Ceboids)或原猴(Simoids)(猴子)或類人猿目(人類和猿)。在一些實施例中，該哺乳動物為人類。

關於所述方法，該癌症可為任何癌症，包括急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱肉瘤)、骨癌、腦癌(例如，神經管母細胞瘤)、乳癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸部癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌，或中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、纖維肉瘤、胃腸道類癌瘤、頭頸癌(如頭頸鱗狀細胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、白血病、液體腫瘤、肝癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、間皮瘤、肥大細胞瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)和勃氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌和腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、實體瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌和輸尿管癌之任一者。

在某些實施例中，該癌症是胃腸癌。在一些實施例中，該癌症是胃癌。在一些實施例中，該癌症是大腸直腸癌。在一些實施例中，該癌症是大腸癌。在一些實施例中，該癌症的TGFβ表現異常或TGFβ信息傳導異常。

如本文所用，術語「治療」和「預防」以及其衍生詞不一定意味著100%或完全治療或預防。相反地，存在不同程度的治療或預防，本領域普通技術人員認為其具有潛在益處或治療效果。在此方面，該方法可提供任何量或任何位準的哺乳動物癌症的治療或預防。

此外，由該方法提供的治療或預防可包括治療或預防一或多種待治療或預防的疾病(例如癌症)的病況或症狀。此外，出於本文目的，「預防」可包括延遲疾病或其症狀或病況的發作。

測試CAR辨識標靶細胞的能力和抗原特異性的方法為本領域中已知的。例如，Clay等人，J. Immunol, 163: 507-513 (1999)，揭示測量細胞因子(例如干擾素-γ、顆粒細胞/單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤因子a (TNF-α)或介白素2 (IL-2))釋放的方法。此外，CAR功能可藉由量測細胞之細胞毒性來評估，如Zhao等人， J. Immunol， 174：4415-4423 (2005)中所述。

另一實施例提供本發明的CAR、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分及/或藥物組合物之用途，用於治療或預防哺乳動物之增殖性疾病，例如癌症。該癌症可為本文所述的任何癌症。

任何投與方法均可用於所揭示的治療劑，包括局部和全身投與。例如可使用局部、口服、血管內(例如靜脈內)、肌肉內、腹膜內、鼻內、皮內、鞘內和皮下投與。特定的投與方式和給藥方案將由主治臨床醫生選擇，考慮到病例的細節(例如個體、疾病、所涉及的疾病狀態以及治療是否為預防性)。在投與大於一種試劑或組成物的情況下，可使用一或多種投與途徑；例如，化療劑可口服投與，而抗體或抗原結合片段或共軛物或組成物可靜脈投與。投與方法包括注射，其中CAR、CAR T細胞、共軛物、抗體、抗原結合片段或組成物，係於無毒的醫藥學上可接受的載體中提供，例如水、生理食鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、5%人類血清白蛋白、非揮發性油、油酸乙酯或微脂體。在一些實施例中，可使用所揭示的化合物之局部投藥，例如藉由將抗體或抗原結合片段施加至已移除腫瘤的組織區域，或懷疑傾向於發展腫瘤的區域。在一些實施例中，包括治療有效量的抗體或抗原結合片段的醫藥製劑的持續性腫瘤內(或腫瘤附近)釋放可能有助益。在其他實例中，共軛物作為滴眼劑局部施加至角膜，或經玻璃體內施加至眼睛。

所揭示的治療劑可配製成適合精確劑量單獨投藥的單位劑型。此外，所揭示的治療劑可以單劑量或多劑量方案投藥。多劑量方案為其中主要治療過程可為大於一個單獨的劑量，例如1至10個劑量，之後根據需要在隨後的時間間隔投與其他劑量，以維持或加強該組成物的作用。治療可涉及在幾天至幾個月甚至幾年的時間內，每天或每天多次投與化合物。因此，該投藥方案也將，至少部分地，基於待治療對象的特定需要而決定，並將取決於投藥醫師的判斷。

抗體或共軛物之典型劑量範圍可介於約0.01至約30 mg/kg，如約0.1至約10 mg/kg。

在特定實例中，投與該個體一治療性組成物，其包括共軛物、抗體、組成物、CAR、CAR T細胞或額外試劑之一或多者，在每日多次投藥時程下，例如至少連續兩天、連續10天等，例如數週、數月或數年。在一實例中，向該個體投與共軛物、抗體、組成物或額外試劑一段時間，至少30天如至少2個月、至少4個月、至少6個月、至少12個月、至少24個月、或至少36個月。

在一些實施例中，所揭示的方法包括向該個體提供手術、放射療法及/或化學治療，與所揭示之抗體、抗原結合片段、共軛物、CAR或表現CAR的T細胞之組合(例如，依次、實質上同時或同時)。此類試劑及治療之方法及治療劑量為熟習此項技術者已知的，且可由熟練臨床醫師決定。額外試劑之製備及投與時程可根據製造商之指示或由熟練之執業人員依經驗決定。此類化學療法之製備與投藥時程亦描述於Chemotherapy Service, (1992), M. C. Perry編，Williams & Wilkins, Baltimore, Md。

在一些實施例中，該組合療法可包括向個體投與治療有效量之額外癌症抑制劑。可與該組合療法一起使用之額外治療劑的非限制性實例包括微管結合劑、DNA嵌合劑或交聯子、DNA合成抑制劑、DNA及RNA轉錄抑制劑、抗體、酵素、酵素抑制劑、基因調節劑及血管生成抑制劑。這些試劑(其以治療有效量投與)及治療可單獨或組合使用。例如，任何適合之抗癌或抗血管生成劑係可與本文所揭露之CAR、CAR-T細胞、抗體、抗原結合片段或共軛物組合投與。此類試劑之方法及治療劑量為熟習此項技術者已知的，且可由熟練臨床醫師決定。

其他化學治療劑包括但不限於：烷化劑，例如氮芥(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯甲鹼(chlormethine)、環磷醯胺、異環磷醯胺和美法崙(melphalan))、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)和鏈脲佐菌素(streptozocin))、鉑化合物(例如，卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)和BBR3464)、白消安(busulfan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氯乙胺(mechlorethamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、噻替帕(thiotepa)和烏拉莫司汀(uramustine)；抗代謝物，例如葉酸(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)和雷替曲塞(raltitrexed))、嘌呤(例如克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)和硫鳥嘌呤(tioguanine))、嘧啶(例如卡培他濱(capecitabine))、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和吉西他濱(gemcitabine)；植物生物鹼，例如鬼臼屬(例如，依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(etoposide))、紫杉烷(例如，多西紫杉醇(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel))、長春花(例如，長春鹼(paclitaxel)、長春新鹼(paclitaxel)、長春地辛(vindesine)和長春瑞濱(vindesine))；細胞毒性/抗腫瘤抗生素，例如蒽環家族抗生素(例如柔紅黴素(vindesine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和伐柔比星(valrubicin))、博來黴素(bleomycin)、利福平(rifampicin)、羥基脲和絲裂黴素；拓撲異構酶抑制劑，例如拓撲替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)；單克隆抗體，例如阿崙單抗(alemtuzumab)、貝伐單抗(alemtuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉姆單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)和曲妥珠單抗(trastuzumab)；光敏劑，例如胺基乙醯丙酸、胺基乙醯丙酸甲酯、泊芬鈉(porfimer sodium)和維替泊芬(verteporfin)；和其他藥物，如阿利維A酸(alitretinoin)、阿曲他明(altretamine)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、三氧化二砷、天冬醯胺酶、阿西替尼(axitinib)、貝沙羅汀(bexarotene)、貝伐單抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortezomib)、塞來昔布(celecoxib)、地尼白介素(denileukin diftitox)、厄洛替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、吉非替尼(gefitinib)、羥基甲醯胺、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、噴司他丁(pentostatin)、馬索普考(masoprocol)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、他莫昔芬(tamoxifen)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、威羅非尼(vemurafinib)、凡德他尼(vandetanib vandetanib)和維甲酸(tretinoin)。此類試劑的選擇和治療劑量是本領域技術人員已知的，並可由熟練的臨床醫生決定。

該組合療法可提供協同作用且證明協同作用，亦即，當活性成分一起使用所導致之效果大於分開使用該等化合物的效果總和時，所達到的作用。當活性成分如下述時，可達到協同效應：(1)共同配製且在組合單位劑型中同時投與或遞送時；(2)作為單獨的配方交替或平行遞送時；或(3)藉由一些其他方案。當以交替方式遞送時，可在依序投與或依序遞送化合物時達到協同效應，例如藉由在不同注射器中進行不同注射。一般而言，在交替方式中，各活性成分之有效劑量係依序投與，而在組合療法中，兩種或多於兩種活性成分之有效劑量則一起投與。

在各實施例中，該包含有本文所述TGFβ信息傳導調節劑之免疫調節系統可包括在進一步包括了向個體投與至少一種額外試劑的治療過程中。在各實施例中，與包含有如本文所述TGFβ信息傳導調節劑之免疫調節系統組合投與的額外試劑可為化學療法試劑。在各實施例中，與如本文所述之抗原結合劑組合投與之額外試劑，可為抑制發炎之試劑。

在一些實施例中，該TGFβ信息傳導調節劑為單域抗體或對於人類TGFβ具專一性之可分泌scFv。在一些實施例中，該TGFβ信息傳導調節劑為單域抗體或對於人類TGFβR具專一性之可分泌scFv。在一些實施例中，該TGFβ信息傳導調節劑係可與治療劑(例如化療劑及放射性原子)共軛(例如連接)，用以結合癌細胞、遞送該治療劑至癌細胞，並殺傷表現人類TGFβ之癌細胞。在一些實施例中，TGFβ信息傳導調節劑係與治療劑連接。在一些實施例中，治療劑為化療劑、細胞激素、放射性原子、siRNA或毒素。在一些實施例中，該治療劑為化療劑。在一些實施例中，該試劑為放射性原子。

在一些實施例中，該方法可與用於TGFβ信息傳導異常病症之其他療法結合進行。舉例而言，該組成物可在化學療法之前或之後同時向個體投與。在一些實施例中，該組成物可在採用過繼性細胞療法的同時、之前或之後向個體投與。

在各實施例中，與該包含有本文所述TGFβ信息傳導調節劑之免疫調節系統組合投與之額外試劑係可與該TGFβ信息傳導調節劑在相同時間、同一天或同星期投與。在各實施例中，與本文所述TGFβ信息傳導調節劑組合投與之額外試劑係可以單一調配物形式與該免疫調節系統一起投與。在某些實施例中，係以與如本文所述TGFβ信息傳導調節劑之投與在時間上分開之方式投與額外試劑，例如，在投與該TGFβ信息傳導調節劑之前或之後的一或多個小時、之前或之後的一或多天、之前或之後的一或多週、之前或之後的一或多月。在各實施例中，一或多種額外試劑之投與頻率可與如本文所述TGFβ信息傳導調節劑之投與頻率相同、相似或不同。

在一些實施例中，該等組成物係可與一或多種額外治療劑一同配製，例如在個體中治療或預防TGFβ相關病症(例如癌症或自體免疫病症)之額外療法。用於在個體中治療TGFβ相關病症之額外試劑將視待治療之特定病症而不同，但可包括(但不限於)利妥昔單抗(rituximab)、環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、強的松(prednisone)、奧斯發醯胺(osfamide)、卡鉑(carboplatin)、依托泊苷(etoposide)、地塞米松(dexamethasone)、阿糖胞苷(cytarabine)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺或氟達拉濱(fludarabine)。 組成物

本文提供用於基因療法、免疫療法及/或細胞療法的組成物，其包括一或多種揭示之CAR或表現CAR之T細胞、抗體、抗原結合片段、共軛物、CAR或表現CAR的T細胞(其特異性結合至本文揭示的一或多種抗原)，於一載體(例如藥學上可接受的載體)中。該組成物可以用於向個體投與之單位劑型來製備。投與量和時間由主治臨床醫師酌情判斷，以達到預期結果。該組成物可配製為用於全身（如靜脈內）或局部（如腫瘤內）投與。在一實例中，所揭示之CAR或表現CAR之T細胞、抗體、抗原結合片段、共軛物係經配製，以用於非經腸胃投與，如靜脈內投與。包括如本文所述之CAR或表現CAR之T細胞、共軛物、抗體或抗原結合片段之組成物，可用於如治療及偵測腫瘤，例如且不限於，神經母細胞瘤。在一些實例中，該組成物可用於治療或偵測癌症。包括如本文所述之CAR或表現CAR之T細胞、共軛物、抗體或抗原結合片段之組成物，亦用於例如偵測病理性血管生成。

用於投與之組成物可包括溶於醫藥學上可接受的載體(例如水性載體)中的CAR或表現CAR之T細胞、共軛物、抗體或抗原結合片段之溶液。可使用各種水性載體，例如，緩衝生理食鹽水及其類似物。這些溶液是無菌的，通常不含不希望的物質。這些組成物可藉由習知且熟知之滅菌技術來滅菌。該組成物可根據需要包含醫藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，例如pH調節劑和緩衝劑、毒性調節劑、佐劑及類似物，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及類似物。在此等調配物中之CAR或表現CAR之T細胞、抗體或抗原結合片段或共軛物的濃度可廣泛地變化，且將主要根據所選擇的特定投與方式和個體的需要來選擇，主要基於流體體積、黏度、體重及類似因素。製備用於基因療法、免疫療法及/或細胞療法的此類劑型的實際方法，對於本領域技術人員而言是已知的或將是顯而易見的。

用於靜脈內投與的典型組成物包括約0.01至約30 mg/kg的抗體或抗原結合片段或共軛物每個體每日（或CAR、或表現CAR的T細胞、或包括抗體或抗原結合片段的共軛物的相對應劑量）。用於製備可投與組成物之實際方法將為熟習此項技術者所已知或顯而易見，且更詳細描述於文獻如Remington's Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)。

經控制釋放腸胃外配方可製成植入物、油劑注射液或顆粒系統。有關蛋白質遞送系統的廣泛概述，可參見Banga， A. J.， Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995)。顆粒系統包括微球體、微顆粒、微膠囊、奈米膠囊、奈米球及奈米顆粒。微膠囊含有治療性蛋白質，如細胞毒素或藥物，作為中心核心。在微球體中，該治療劑分散在整個顆粒中。小於約1 μm之顆粒、微球體及微膠囊通常分別稱為奈米顆粒、奈米球體及奈米膠囊。微血管具有約5 μm的直徑，因此只有奈米顆粒可靜脈內投與。微粒一般直徑約100 μm，以皮下或肌肉注射方式投與。請參見例如Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter編，Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.，第219-342頁(1994)；及Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus編，Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y.，第315-339頁(1992)。

聚合物可用於本文揭示之CAR或表現CAR之T細胞、抗體、或抗原結合片段、或共軛物組成物之離子控制釋放。用於經控制藥物遞送的各種可降解和不可降解之聚合物基質為本領域中已知的(Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993)。舉例而言，嵌段共聚物polaxamer 407，在低溫下以黏稠但流動的液體形式存在，但在體溫下形成半固體凝膠。它已被證明是重組介白素-2和脲酶的配製和持續遞送的有效載體(Johnston等人, Pharm. Res. 9:425-434, 1992；及Pec等人，J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990)。或者，羥基磷灰石已被使用作為蛋白質控制釋放的微載體(Ijntema等人， Int. J. Pharm. 112：215-224， 1994)。在又一態樣中，脂質體係用於脂質包裹藥物的控制釋放以及藥物靶向(Betageri等人, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa. (1993))。已知用於控制治療性蛋白質之遞送的多種額外系統(參見美國專利號5,055,303; 5,188,837; 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 4,957,735; 5,019,369; 5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206; 5,271,961; 5,254,342和5,534,496)。 套組

在一態樣中，亦提供使用本文所揭示之CAR的套組。例如，用於治療個體之腫瘤，或製造表現本文所揭示之一或多種CAR的CAR T細胞的套組。該套組通常將包括如本文所揭示之抗體、抗原結合片段、共軛物、核酸分子、CAR或表現CAR之T細胞。大於一種之如本文所揭示之抗體、抗原結合片段、共軛物、核酸分子、CAR或表現CAR之T細胞可包括在該套組中。

該套組可包括一容器及在該容器上或與其相連的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料形成，如玻璃或塑膠。該容器通常容置一組成物，其包含所揭示之抗體、抗原結合片段、共軛物、核酸分子、CAR或表現CAR之T細胞之一或多者。在數個實施例中，該容器可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈注射溶液袋，或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。標籤或包裝插頁說明該組成物用於治療特定病況。

標籤或包裝插頁通常將進一步包括所揭示之抗體、抗原結合片段、共軛物、核酸分子、CAR或表現CAR之T細胞的使用說明，例如，用於治療或預防腫瘤或製造CAR T細胞的方法中。包裝插頁通常包括常規包含在治療產品的商業包裝中的說明，這些說明包含有關使用此類治療產品的適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警告的信息。該說明書材料可為書面，以電子形式（例如電腦硬碟或光碟）或視覺形式（例如影片檔案）。該套組亦可包括額外組件，以幫助套組設計之特定應用。因此，例如，該套組可額外地含有偵測標記物(例如用於酵素標記的酵素受質、用於偵測螢光標記物的過濾組、合適的二級標記物(例如二級抗體)及類似物)之裝置。該套組可額外包括緩衝液及常規用於實施特定方法的其他試劑。此套組與合適內容物為熟習此項技術者所熟知的。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語和片語與本領域普通技術人員通常理解的含義相同。儘管在本發明的實施或測試中可使用與本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但現在描述較佳的方法和材料。本文提及的所有文獻均以引用方式併入本文中。

標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉型(例如，電穿孔、脂質轉染)。酵素反應和純化技術可根據製造商的說明書或如本領域中通常完成者或如本文所述進行。前述技術和程序一般可根據本領域已知的常規方法進行，並如在本說明書整篇引用和討論的各種一般性和更具體的參考文獻中所描述的。請參見例如Sambrook等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的經由引用方式併入本文中。

本文提及的所有文獻、專利申請案、專利案和其他參考文獻均以全文引用方式併入本文中。本發明將藉由參考以下實例而更臻清楚。 實例

這些實例的提出是為了幫助理解本發明，但並非旨在，也不應解釋為以任何方式限制其範圍。實例不包括對本領域普通技術人員已知的常規方法(分子選殖技術等)的詳細描述。 實例 1. 共表現嵌合抗原受體 (CAR) 及 TGF-B 信息傳導調節劑之 TGF-B 免疫反應性細胞

此實例係說明在人類T細胞中使用免疫調節系統來共表現TGF-β信息傳導調節劑及CAR。將編碼TGF-B信息傳導調節劑(例如，抗TGFβ及抗TGFβR2)及抗人類CD19 CAR (SJ25C1胞外抗原結合域)之免疫調節構築體包裹供逆轉錄病毒遞送。使Phoenix A逆轉錄病毒包裝細胞株(Phoenix A Retroviral Packaging Cell Line, ATCC)在DMEM 20% FBS與Pen/Strep (青黴素/鏈黴素)中生長到50-70%聚滿。根據製造商實驗方案，使用編碼TGF-B信息傳導調節劑及CAR構築體之各個質體、輔助質體gag-pol以及pVSVG及轉導試劑Fugene HD (Promega)來製備DNA複合物。在轉染20-48小時之後，收取病毒上清液、等分並冷凍供進一步使用。

使用密度梯度由Leukopaks分離出人類PBMC並冷凍直到進一步使用。由先前冷凍之PBMC以磁性選擇分離出人類T細胞（T細胞分離套組; Stemcell）。將純化出的人類T細胞在含有2ng/ml人類IL-2 (Miltenyi)與T細胞Transact珠粒(Miltenyi)之完全Optimizer培養基（Optimizer基礎培養基(ThermoFisher #A10221-01) + 26ml OptiMizer增補劑(ThermoFisher #A10484-02) + 20ml ICSR (CTS免疫細胞SR), ThermoFisher #A25961-01) + 10ml of 200mM L-麩胺酸, (Gibco 25030-081) + PenStrep, (Gibco 15140-122)）中培養2天。

將T細胞轉移到塗覆有retronectin (重組人纖維蛋白)之盤(Takara; 40ug/ml retronectin)中與適合的病毒量進行旋轉轉導。以流式細胞儀在不同時間點來確認及量化轉導程度。簡言之，細胞係於4’C下在FACS緩衝液中與250ng hCD19-hFc蛋白(RnD Systems)或內部生產的hGCC-Fc蛋白一起培養1小時。在用FACS緩衝液洗滌之後，於室溫下使細胞再懸浮於抗人類FC之二抗(Biolegend)中20分鐘。在一些實驗中添加了抗CD4、CD8或其他表面標記物之抗體。使用可固定型存活細胞染料(fixable viability dye, Thermofisher)將死細胞排除在分析之外。在流式細胞儀(FACS Fortessa, BD Biosciences)分析之前，將細胞固定在PBS 2% FCS, 4%甲醛中。轉導效率係以對CAR染色呈陽性之活細胞百分比來顯示。流式細胞儀結果顯示，87.6%淋巴細胞、76.1%單一細胞群、78.3%活CD3+細胞及75.8%細胞之細胞群有表現CAR（圖1A-1D）。轉導效率係以對CAR染色呈陽性之活細胞百分比來顯示（圖1E）。 實例 2. 使用 TGF-β 調節型人類 CAR-T 細胞進行活體外殺傷

此實例係說明以共表現TGF-β信息傳導調節劑之人類CAR-T細胞進行活體外殺傷。裝甲化人類CAR-T細胞之活體外殺傷作用係與未裝甲化CAR-T細胞相當。

根據製造商實驗方案將Raji (ATCC CD19陽性)或Raji CD19ko (人類CD19陰性)用增殖染料efluor 450 (Thermofisher)染色並種在96孔孔盤內至少2小時，之後添加實例1所述之TGF-β調節型CAR-T細胞。以效應子：標靶為0:1、0.3:1、1:1、3:1、9:1之比例與僅添加T細胞來添加CAR-T細胞，並在37°C下培養過夜。次日，使用抗人類CD107a (LAMP-1) (Biolegend)、TCR α/β (Biolegend)之螢光染料共軛抗體以及人類CD4抗體(Biolegend)來進行FACS染色。根據製造商實驗方案，在4°C下將細胞與抗體一起培養30分鐘，用PBS洗滌，且用可固定型存活細胞染料(Thermofisher)染色。將細胞用1x Annexin V結合緩衝液(Biolegend)洗滌並用Annexin V FITC染色。將細胞固定在cytofix (BD Biosciences)中，之後在FACS Fortessa (BD Biosciences)上收取。TGF-β調節型CD19 CAR-T細胞對CD19陽性Raji細胞展現出標靶特異性體外殺傷作用（圖2A），但對CD19陰性對照組細胞(Raji CD19ko)則沒有（圖2B）。 實例 3. 由免疫反應性細胞分泌之 TGF-β 調節劑

此實例展現了TGF-β調節型CAR-T細胞分泌出共表現之TGF-β調節劑（例如，與TGF-β結合之抗TGF-β以及與TGFβR2結合之抗TGFβR2）。

來自TGF-β調節型CAR-T細胞之上清液係以ELISA分析以偵測抗TGF-β及抗TGFβR2抗體。在4°C下將Maxisorp 96孔孔盤以100 µl塗覆緩衝液之重組人類抗TGF-β (4; RnD System µg/ml)或hTGFβR2-Fc (0.1 mg/ml; RnD System)進行塗覆過夜。將孔盤以1x洗滌緩衝液洗滌，且在室溫下用試劑稀釋劑阻斷1小時。添加CAR-T上清液、重組TGFβR2-flag、或重組TGF-β-flag抗體且在室溫下培養2小時。

在另一次洗滌步驟之後，添加共軛有HRP之flag標籤抗體且在室溫下培養30分鐘。將孔盤洗滌且添加TMB受質10至20分鐘。使用終止(Stop)試劑終止反應且使用Pherasta讀盤儀以450 nm讀取孔盤。與以TGF-b scFv VL-VH使用抗flag標籤HRP抗體來偵測結合子相比，以ELISA使用塗覆之TGF-b偵測到高含量的TGF-b scFv VH-VL1及TGF-b scFv VH-VL2（圖3A）。以ELISA使用塗覆之TGFbR2-Fc偵測到高含量來自人類CAR-T的TGFbR2 scFv VH-VL、TGFbR2 scFv VL-VH及hTGFbR2 VH1，但無法偵測到mTGFbR2 VH1（圖3B）。TGF-β結合子及TGFβR2結合子係由TGF-β調節型CAR-T細胞分泌並結合至其同源抗原。 實例 4. 人類 CAR-T 細胞分泌抗 TGF-β / TGFβR2 之中和抗體

此實例係說明在TGF-β調節型CAR-T上清液中存在之抗TGF-β /TGFβR2的中和抗體。

使用SBE-Luc報告細胞（在Smad結合元件(SBE) (BPS Biosciences)的控制下表現螢火蟲螢光之HEK293細胞）進行CAR-T細胞上清液中之TGF-β阻斷結合子的功能性評估，其係設計來監測TGF-β/SMAD信息傳導的活性。TGF-β蛋白結合到其在細胞表面上的同源受體，引發信息傳導級聯而導致SMAD2與SMAD3的磷酸化與活化，接著與SMAD4形成複合體。該SMAD複合體移位至細胞核且與該SMAD結合元件(SBE)結合，導致TGF-β/SMAD反應型基因的轉錄與表現。阻斷結合子的存在係以其在SBE-Luc報告細胞中抑制TGF-β誘導型螢光酶表現的能力來偵測。評估抑制TGF-β誘導型報告活性之效力的例示性分析法係進行如下。

以每孔100 μl新配培養基（含有1x Penn/Strep之X-VIVO15）中有1x10 ⁵個細胞之濃度將SBE-Luc細胞播種到塗覆有Poly-D離胺酸之96孔孔盤內，且在37°C及5% CO ₂下培養4小時。來自CAR-T細胞之上清液或其稀釋液係與等體積的TGF-β (4 ng/ml in X-VIVO15)混合並在室溫下培養15分鐘，使TGF-β與CAR-T上清液中所含之TGF-b複合。以二重複方式將100 μl之混合物添加至SBE-Luc報告細胞中，且在37°C及5% CO ₂下培養過夜。TGF-β的最終濃度為1 ng/ml。在存在1 ng/ml TGF-β下，每個實驗包括了TGF-β抗體（1D11 (BioXcell)或TGF-β結合子或TGFβR2 結合子）之逐步稀釋的滴定曲線。

次日，移出100 μl的培養上清液，並添加100 μl之含有Luciferin-D的檢測試劑(ONE-Step™螢光酶檢測系統)。使細胞再懸浮並轉移到白色檢測盤以使用Pherastar讀盤儀測量螢光。螢光酶活性係以CPM記錄。使用MS Excel或Graphpad prism來分析數據。使用Graphpad prism之Sigmoidal劑量-反應(可變斜率)來進行非線性回歸擬合。計算IC50值。

使用下列方程式來計算抑制活性(%)： 抑制(%) = (1- CPM的樣本/經TGF-β (1ng/ml)處理之樣本的最大CPM) X 100

結果顯示來自分泌構築體TGF-β scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)與TGF-β scFv VH-VL2(SEQ ID NO: 2)之CAR-T細胞的上清液抑制了TGF-β信息傳導（圖4）。設計了另外的構築體並使用螢光酶報告分析來篩選抗TGF-β或TGFβR2之多聚結合子的分泌（圖5及圖6）。將分泌抗TGF-β與TGFβR2之多聚抗體的TGF-β調節型CAR-T細胞進行辨識。無論連接子為何，人類CAR-T細胞會分泌多聚TGF-b結合子並抑制TGF-b信息傳導。如下圖所示，分析了四種不同的連接子。使用抗GCC CAR-T細胞時觀察到近似的結果（數據未示出）。 實例 5. 分泌抗 TGF-β 或 TGFβR2 之多聚結合子的 TGF-B 調節型 CAR-T 細胞

此實例係說明分泌抗TGF-β或TGFβR2之多聚結合子的小鼠CAR-T細胞的篩選及辨識。為了產生小鼠CAR-T細胞，使Platinum-E逆轉錄病毒包裝細胞株在DMEM 20% FBS與Pen/Strep中生長到50-70%聚滿。根據製造商實驗方案，使用編碼CAR構築體及TGFB調節劑（例如，抗TGF-b scFv單體、抗TGF-b scFv二聚體）之免疫調節系統質體、包裝構築體、及轉導試劑Fugene HD來製備DNA複合物。在轉染20-48小時之後，收取病毒上清液、等分並冷凍供進一步使用。將溶液混合並在室溫下培養10分鐘，且每個10 cm ²細胞盤添加850 µl的複合物。分別從Balb/c或C57BL/6小鼠脾臟使用T細胞分離套組以磁性選擇分離出小鼠T細胞。將純化出的小鼠T細胞與小鼠T細胞活化珠粒（1:1比例）在RPMI 10%熱失活FCS、Pen/Strep與小鼠IL-2 (30 U/ml)中培養2天。在轉染48小時之後收集病毒並通過0.4 µm針筒過濾器過濾。將T細胞轉移至塗覆有retronectin（根據製造商實驗方案塗覆40 µg/ml retronectin）的盤中與適合的病毒量進行旋轉轉導。以流式細胞儀在不同時間點來確認及量化轉導程度。

在4°C下將細胞與250 ng hCD19-hFc蛋白在FACS緩衝液中一起培養1小時。在用FACS緩衝液洗滌之後，在室溫下使細胞再懸浮於抗人類FC之二抗中20分鐘。在一些實驗中，添加了抗CD4、CD8或其他表面標記物之抗體。使用可固定型存活細胞染料將死細胞排除在分析之外。在流式細胞儀(FACS Fortessa)分析之前，將細胞固定在PBS 2% FCS, 4%甲醛中。轉導效率係以對CAR染色呈陽性之活細胞百分比來顯示。

流式細胞儀結果顯示出未裝甲化T細胞、TGF-β單體、TGF-β二具體及未轉導細胞的相對比例。在轉導後第2天所收集之來自小鼠CAR-T細胞的上清液係經調查其在SBE-Luc TGF-b報告分析之TGF-b信息傳導抑制作用（如實例4所述之方法）。根據螢光酶報告活性，來自分泌TGF-b scFv單體與二聚體之小鼠CAR-T細胞的上清液抑制了TGF-b信息傳導。將分泌抗TGF-β與TGFβR2之多聚抗體的小鼠CAR-T細胞進行辨識。

在轉導2天後收集上清液並冷凍在-80’C直到使用於ELISA。如實例3所述進行ELISA。使用人類重組TGFbR2-Fc蛋白以抓取抗人類TGFbR2之結合子，並使用小鼠重組TGFbR2-Fc蛋白來調查TGFbR2 結合子與小鼠TGFbR2之結合。使用抗flag HRP抗體與個別的受質來檢測結合作用。如圖7所示，所分泌之結合子hTGFbR2-VH2與hTGFbR2-VH3之單體與二聚體以及TGFbR2 scFv VH-VL之單體與二聚體係與人類TGFbR2結合。所測上清液中沒有任何一個結合子會與小鼠TGFbR2結合，確認了對於人類TGFBR2的特異性。 實例 6. 分泌 TGF-β 信息傳導調節劑之 CAR-T 細胞的活體內抗腫瘤效力

此實例係說明分泌抗TGF-β mAb之CAR-T細胞的活體內抗腫瘤效力。小鼠裝甲化CAR-T細胞（共表現抗人類CD19 CAR與TGFb信息傳導調節劑）比未裝甲化CART細胞更抑制了同基因的EMT6-hCD19腫瘤生長。另外，裝甲化CAR-T細胞降低了肝臟與肺臟的轉移。生成過度表現做為CAR-T標靶抗原之人類CD19及螢火蟲螢光酶的EMT6乳癌細胞株。EMT6細胞係以帶有編碼受控於EF1a啟動子之人類CD19之質體且具嘌呤黴素抗性的病毒進行轉導。使用嘌呤黴素正向選擇EMT6-hCD19細胞並進一步以FACS分選純化。EMT6-hCD19細胞係以帶有編碼受控於EF1a啟動子之螢火蟲螢光酶之質體且具新黴素抗性(Amsbio)的病毒以5 x 10 ⁷IFU/mL進行轉導；MOI = 10，於聚凝胺存在下。使用G418 (500 µg/ml)正向選擇EMT6-hCD19-Fluc細胞。

以0.2 x 10 ⁶個活EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞接種6-16週齡雌性Balb/c小鼠(Jackson Labs)之乳腺脂肪墊(原位)內。植入6天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³)的治療組中並用環磷醯胺(CPA; 200mg/kg i.p.)治療。次日，將來自同基因型CD45.1 Balb/c小鼠的500,000個小鼠CAR-T細胞注入尾靜脈。第1組接受未轉導的T細胞，第2組接受CAR-T細胞，而第3組接受分泌抗TGF-β scFv VH-VL1的CAR-T細胞。每週測量體重兩次以監測毒性。

每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236（圖8）。犧牲掉任何腫瘤超過2000 mm ³或有潰瘍性腫瘤的小鼠。與注射未轉導的T細胞之對照小鼠相比，以腫瘤大小的減少來評估抗腫瘤功效。完全反應者係被定義為沒有任何可檢測到的腫瘤之小鼠。

相對於未裝甲化CAR-T或未轉導的CAR-T，分泌TGF-β結合子之CAR-T細胞顯示出高度的抗腫瘤功效。藉由注射luciferin且以IVIS成像，對肝臟及肺臟進行表現螢火蟲螢光酶之腫瘤細胞進行成像。將D-Luciferin溶液(D-Luciferin, Potassium Salt Vivo Glo tm Luciferin)製備為15 mg/ml且以150 mg/kg使用。以分泌TGF-β結合子之CAR-T細胞處理的小鼠係能夠降低肝臟及肺臟的轉移（圖8A-8E）。

分泌出抗TGF-β(TGF-b scFv VH-VL1)之抑制性抗體的抗人類CD19之小鼠CAR-T細胞比未裝甲化CART細胞更抑制了同基因的EMT6-hCD19腫瘤生長並降低了肝臟與肺臟的轉移。先前已滴定分析CAR-T細胞的數量以得到對於未裝甲化CAR-T的次優效果，以識別出裝甲化CAR-T細胞的改良活性。 實例 7. 分泌 TGFbR2 細胞外結構域 (ECD) 之裝甲化小鼠 CAR-T 細胞抑制了 TGFb 信息傳導

比較了來自分泌不同TGF-β配位體結合衰減蛋白（TGF-β scFv VH-VL1至TGFbR2 ECD單體、同質二聚體(圖9A)及異質二聚體(圖9B)之裝甲化小鼠CAR-T的上清液與未裝甲化CAR-T的上清液來進行SBE-Luc TGF-β報告分析。SBE-Luc TGF-β報告分析顯示出來自分泌TGFβR2細胞外結構域(ECD)二聚體之裝甲化小鼠CAR-T抗人類CD19的上清液有很好的抑制效果（但分泌單體的則無），並顯示出分泌TGF-β scFv VH-VL1二聚體的也有相當抑制效果。在轉導2天後收集上清液。評估包括有TGFβR2 ECD及TGFβR1 ECD之TGFβR2 ECD異質二聚體抑制作用。辨識出抑制TGF-b信息傳導之TGFβR2 ECD異質二聚體係比TGF-β scFV VH-VL1更為有效。例示性TGFβR2 ECD序列係顯示於表4中。 表 4. 例示性 TGFβR2 ECD 序列

TGFbR2 ECD單體

METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL (SEQ ID NO: 37)

TGFbR2 ECD二聚體

METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL (SEQ ID NO: 39)

mTGFbR2ECD單體2 IPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL (SEQ ID NO: 32)

huTGFbR1+2 ECD二聚體1

LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEGGGGSTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (SEQ ID NO: 33)

huTGFbR1+2 ECD二聚體2

QCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE (SEQ ID NO: 34)

mTGFbR1+2 ECD二聚體1

LQCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNKIELPTTGPFSEKQSAGLGPVELGGGGSIPPHVPKSVNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPD (SEQ ID NO: 35)

huTGFbR2 ECD單體1

LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVE (SEQ ID NO: 40)

huTGFbR2 ECD單體2

QCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKE (SEQ ID NO: 36)

實例 8. 分泌 TGF-β 信息傳導調節劑之裝甲化 CAR-T 細胞的抗腫瘤功效

此實例係說明分泌抗TGFβ mAb或TGFβ R2-ECD之CAR-T細胞在活體內的相對抗腫瘤功效。

與未裝甲化CAR-T細胞相比，分泌TGFβR2 ECD1+2二聚體之小鼠CAR-T顯示出在活體內有改善的抗腫瘤作用。以0.2x10 ⁶個活EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞接種6-16週齡雌性Balb/c小鼠(Jackson Labs)之乳腺脂肪墊(原位)內。植入6天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³；每組n=8)的治療組中並用環磷醯胺(CPA; 200mg/kg i.p.)治療。次日，將來自同基因型CD45.1 Balb/c小鼠的2百萬個小鼠CAR-T細胞注入尾靜脈。第1組接受未轉導的對照T細胞，第2組接受未裝甲化CAR-T細胞，而第3組接受分泌TGFbR1+2 ECD二聚體的CAR-T細胞，而第4組接受全身性抗TGF-β抗體(殖株1D11.16.8; 10mg/kg; 每週3次注射; i.v.)。每週測量體重兩次以監測毒性。每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236。遵循協會的動物健康協議，犧牲掉任何腫瘤超過2000 mm ³或有潰瘍性腫瘤的小鼠。與注射未轉導的T細胞之對照小鼠相比，以腫瘤大小的減少來評估抗腫瘤功效。完全反應者係被定義為沒有任何可檢測到的腫瘤之小鼠。

分泌TGF-β 配位體結合衰減蛋白(mTGFbR2 ECD1+2二聚體1)之抗人類CD19的小鼠CAR-T比未裝甲化CAR-T細胞更抑制了同基因的EMT6-hCD19腫瘤生長，與接受未裝甲化CAR-T或未轉導的T細胞、或以全身性抗TGF-β抗體處理(1D11, 10mg/kg, 每週3x i.v.)之沒有完全反應的對照組小鼠相比下，其誘導了3個完全反應。（圖10）。 實例 9. 分泌 TGF-β 信息傳導調節劑之裝甲化 CAR-T 細胞於同基因的腫瘤模型 (MC38-hCD19) 中的抗腫瘤功效

此實例係說明分泌抗TGFβ mAb或TGFβ R2-ECD之CAR-T細胞在活體內的相對抗腫瘤功效。以抗TGF-b mAb (TGF-b scFv VH-VL1)裝甲化之小鼠CAR-T細胞在不同的同基因腫瘤模型(MC38-hCD19)中有改善作用。

生成過度表現做為CAR-T標靶抗原之人類CD19及螢火蟲螢光酶的MC38大腸癌細胞株並用來進行成像。簡言之，MC38細胞係以帶有編碼受控於EF1a啟動子之人類CD19之質體且具嘌呤黴素抗性(CD19_FL_WT_pLVX-EF1a-IRES-Puro)的病毒進行轉導。使用嘌呤黴素正向選擇MC38-hCD19細胞。MC38-hCD19細胞係以帶有編碼受控於EF1a啟動子之螢火蟲螢光酶之質體且具新黴素抗性(Amsbio, 目錄號LVP435-PBS, 以5x10^7 IFU/mL; MOI = 10)的病毒在聚凝胺的存在下進行轉導。使用G418 (geneticin)正向選擇MC38-hCD19-Fluc細胞。

以0.2x10 ⁶個活MC38-hCD19-Fluc腫瘤細胞皮下接種6-16週齡雌性C57BL/6小鼠(Jackson Labs)。植入7天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³；每組n=8)的治療組中並用環磷醯胺(CPA; 200mg/kg i.p.)治療。次日，將來自同基因型CD45.1 C57BL/6小鼠的100,000個小鼠CAR-T細胞（或以未轉導的T細胞作為陰性對照）注入尾靜脈。第1組接受未轉導的T細胞。第2組接受未裝甲化CAR-T細胞。第3組接受分泌抗TGF-β的CAR-T細胞(TGF-b scFv VH-VL1)。每週測量體重兩次以監測毒性。每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236。遵循協會的動物健康協議，犧牲掉任何腫瘤超過2000 mm ³或有潰瘍性腫瘤的小鼠。與注射未轉導的T細胞之對照小鼠相比，以腫瘤大小的減少來評估抗腫瘤功效。完全反應者係被定義為沒有任何可檢測到的腫瘤之小鼠。

與未裝甲化CAR-T相比，分泌抗TGF-β (TGF-b scFv VH-VL1)之抑制性結合子的CAR-T細胞顯示出卓越的功效，與接受等量未裝甲化CAR-T或未轉導的T細胞之沒有完全反應的對照組小鼠相比下，其在8隻經治療小鼠中誘導了7個完全反應。(圖11)。 實例 10. 分泌 TGF-β 信息傳導調節劑之 CAR-T 細胞增進了宿主免疫反應的活化

此實例係展現了顯示出會使宿主免疫反應受到分泌抗TGF-β之結合子的CAR-T細胞而增進活化的RNA序列。

以0.2x10 ⁶個活EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞接種6-16週齡雌性Balb/c小鼠(Jackson Labs)之乳腺脂肪墊(原位)內。植入6天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³；每組n=8)的治療組中並用環磷醯胺(CPA; 200mg/kg i.p.)治療。次日，將來自同基因型CD45.1 Balb/c小鼠的2百萬個小鼠CAR-T細胞注入尾靜脈。第1組接受未轉導的對照T細胞，第2組接受未裝甲化CAR-T細胞，而第3組接受分泌抗TGF-βscFv VH-VL1的CAR-T細胞。第4組接受全身性抗TGF-β抗體(殖株1D11.16.8; BioXcell; 10mg/kg; 每週3次注射; i.v.)，而第5組接受同種型對照抗體(殖株MOPC21; BioXcell; 10mg/kg; 每週3次注射; i.v.)。每週測量體重兩次以監測毒性。每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236。

在第12天將小鼠安樂死並收取腫瘤，速凍並保持在-80’C。萃取RNA及且隨後進行RNA定序電腦分析，如圖12所示。

與來自其他組的小鼠相比，來自接受分泌TGF-βscFv VH-VL1之CAR-T之小鼠的腫瘤的腫瘤浸潤性T細胞(CD3d+, CD3e+, CD3g+)計分顯著增加，尤其是CD8+ T細胞(CD8a+)及細胞毒殺T細胞(GzmB+)（圖13）。

ssGSEA富集計分顯示出來自接受分泌TGF-βcFv VH-VL1之CAR-T的小鼠腫瘤中的T細胞特徵及IFNg特徵增加，表示CAR-T細胞的浸潤增加及/或內源性免疫系統的活化增加。於來自接受分泌TGF-βscFv VH-VL1之CAR-T的小鼠腫瘤中之經活化內皮細胞、共刺激及抗原呈現的特徵增加，清楚顯示出內源性免疫系統的活化。因此，以阻斷抗體(或其他結合子)來裝甲化CAR-T細胞抑制了TGF-β路徑抗腫瘤功效，至少部份地改善內源性免疫反應。（圖14）。 實例 11. 來自以未裝甲化 CAR-T 細胞治療之 EMT6-hCD19 小鼠的腫瘤樣本 FACS 分析

以0.2x10 ⁶個活EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞接種6-16週齡雌性Balb/c小鼠(Jackson Labs)之乳腺脂肪墊(原位)內。植入6天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³；每組n=8)的治療組中並用環磷醯胺(CPA; 200mg/kg i.p.)治療。次日，將來自同基因型CD45.1 Balb/c小鼠的2百萬個小鼠CAR-T細胞注入尾靜脈。第1組接受未轉導的對照T細胞，第2組接受未裝甲化CAR-T細胞，第3組接受分泌抗TGF-b scFv VH-VL1單體的CAR-T細胞。每週測量體重兩次以監測毒性。每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236。

在第7天將小鼠安樂死並收取腫瘤，秤重且進行FACS分析。簡言之，將腫瘤切成小片並根據製造商的說明使用小鼠腫瘤離解套組(Mouse Tumor Dissociation Kits, Miltenyi)消化。使樣本再懸浮於PBS 2% FCS中，過濾且種到96孔孔盤中進行FACS染色。阻斷Fc受體(TruStain FcX (抗小鼠CD16/32)抗體; Biolegend)且在4’C下使用rhuCD19 (RnD Systems)標記CAR 1小時，之後使用抗人類IgG Fc抗體標記hCD19-Fc，表面標記物包括TCRa/b、CD8a、CD4、CD25、CD62L、CD11b、Gr1、CD11c、CD45.1及CD45，使用可固定型存活細胞染料(ebioscience)對活細胞染色，且包括GzmB、Ki67及FoxP3之胞內抗原係使用eBioscience Foxp3 /轉錄因子染色緩衝液組(Thermofisher)進行染色。將樣本過濾且在BD Fortessa流式細胞儀上收取。

如圖15所示，與接受注射未轉導的細胞或未裝甲化CAR-T之對照組相比，FACS染色顯示出來自接受分泌TGF-β scFv VH-VL之CAR-T的小鼠的樣本中之hCD19+腫瘤細胞減少，且T細胞浸潤（每毫克腫瘤組織）增加。圈選CD45.1+及CD45.1- T細胞顯示內源性T細胞浸潤(CD45.1-)係特別增加。來自這些樣本的轉移CAR-T細胞(CD45.1+)之CAR表現較高，且CD8+ T細胞顯示CD25的表現較高，表示活化增加。來自宿主細胞(CD45.1-)的CD8+ T細胞之GzmB表現較高，表示細胞毒性較高。總而言之，這些FACS數據表示以抗TGF-β之結合子裝甲化CAR-T細胞增進了CAR-T細胞及內源性免疫反應的作用。 實例 12. 異種移植模型顯示以抗 TGF-β 或抗 TGFβR2 阻斷抗體裝甲化之人類 GCC-CAR-T 細胞的作用改善

以2x10 ⁶個活GSU腫瘤細胞皮下接種6-16週齡雌性NSG小鼠(Jackson Labs)。植入7天後，腫瘤大小達到約50 mm ³且將小鼠隨機分組到有近似平均腫瘤大小(平均約50 mm ³；每組n=6)的治療組中。次日，將500,000或100,000個人類GCC CAR-T細胞注入尾靜脈。第1組接受未轉導的對照T細胞，第2組接受未裝甲化CAR-T細胞，第3組接受分泌抗TGF-b scFv VH-VL1單體的CAR-T細胞，第4組接受分泌抗TGFβR2 VH3單體的CAR T細胞，而第5組接受分泌抗TGFβR2 VHH二聚體的CAR T細胞。每週測量體重兩次以監測毒性。每週測量腫瘤大小兩次並使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm ³) = 長度 x 寬度 x 高度 x 0.5236。以抗TGF-β或抗TGFβR2阻斷抗體裝甲化之GCC-CAR-T細胞在轉移500,000個細胞時係顯示出比未裝甲化對照CAR-T更快的反應，且在轉移100,000個CAR-T細胞時的抗腫瘤功效即有改善。（圖16）。

TGFβ調節劑的腫瘤及血漿濃度係使用抗Flag免疫捕捉LC/MS測定法來測定。如圖17A-17D所示，以裝甲化CAR-T細胞處理之小鼠的血液循環中有少量TGF-β抗體或抗TGFbR2抗體分泌。使用EDTA管從以指定量的裝甲化或未裝甲化抗GCC CAR-T細胞處理之小鼠收集血漿。

如圖20A-20C所示，裝甲化CAR-T細胞在GCC陽性GSU、HT55及MDA-MB-231-FP4 Luc異種移植模型中也展現出抗腫瘤活性。

使用脾內注射HT55腫瘤細胞且隨後靜脈注射CAR-T細胞來評估肝臟轉移。與同種型對照組相比，裝甲化CAR-T細胞減緩了向肝臟的轉移（圖21A-21C）。 實例 13. GCC 陽性腫瘤中之重複抗原刺激

將未裝甲化或裝甲化（共表現抗GCC CAR及TGFβ調節劑(例如，TGFβR2-VHH)）之100,000個抗GCC CAR-T細胞與200,000個HT29-GCC或HT29親代(GCC陰性)在TGF-β (1ng/ml或10ng/ml)存在或不存在下以二重複方式共培養。每3-4天在相同條件下將每孔一半的CAR-T細胞轉移到新的腫瘤細胞盤（在TGF-β 1ng/ml或10ng/ml存在或不存在下）。收集上清液且冷凍供之後評估。評估細胞的細胞計數及FACS染色分析。

根據製造商實驗方案，使用CellTiterGlo (Promega)評估腫瘤細胞。使用Pherastar讀盤儀分析孔盤。使用以下公式評估殺傷百分比： 殺傷% = (1 – (測試孔訊號/對照孔訊號)) * 100

對照孔係含有與未轉導的T細胞（來自相同供體做CAR-T細胞使用）共培養之腫瘤細胞。FACS染色係使用抗人類CD4、CD8、CD25及耗盡標記物PD-1、TIM-3、Lag-3及TIGIT抗體(Biolegend)之螢光染料共軛抗體每週進行一次。使用可固定型存活細胞染料efluor 506 (Thermofisher; 根據製造商實驗方案)來排除死細胞。表現CAR的細胞係於4’C下與GCC-hFc一起培養1小時，用PBS 2% FCS洗滌且用二級小鼠抗人類IgG抗體（30分鐘，4’C）進行偵測。

在與標靶細胞再刺激幾輪（模擬慢性抗原活化）後，TGF-β誘導對CAR-T細胞功能的抑制。只有分泌TGFβ調節劑（例如，TGFβR2 VHH二聚體）的CAR-T細胞受到保護，免受TGF-β（1 ng/ml或10 ng/ml）刺激的抑制作用（圖18A-18C）。對CAR-T殺傷的抑制效果係與抑制耗盡標記物Lag3的增殖與誘導相關。 實例 14. 在間皮素陽性腫瘤中之重複抗原刺激

將大約100,000個iPSC衍生之抗-Msln CAR-T細胞（共表現抗Msln的CAR與TGFβ調節劑(例如，TGFβR2-VH或dnTGFbR2)）或對照抗GFP的VH (Msln-對照VH)與40,000個過度表現人類Msln之MiaPaca-2腫瘤細胞在TGF-β (R&D Systems, 10ng/ml)存在或不存在下以二重複方式共培養。TGFβR2-VH係由CAR-T細胞分泌，而dnTGFbR2係與CAR-T細胞膜結合。每3-4天在相同條件下將每孔一半的CAR-T細胞轉移到新的腫瘤細胞盤（在TGF-β 10 ng/ml存在或不存在下）。收集上清液且冷凍供之後評估。在指定時間點以流式細胞儀評估計數CAR-T細胞且進行FACS表現型分型（ 圖 22A）。

根據製造商實驗方案，使用CellTiterGlo (Promega)評估腫瘤細胞的存活率。使用Pherastar讀盤儀分析孔盤。使用以下公式評估殺傷百分比：

對照孔僅含有腫瘤細胞但不含效應子(即CAR-T)細胞。細胞毒性百分比係顯示於 圖 22B中。

使用Sytox Red染料（Thermofisher，根據製造商實驗方案）排除死細胞以進行細胞計數，在Fortessa流式細胞儀(BD Biosciences)上使用HTS單元收取等體積的細胞懸浮液。圈選活細胞、單一細胞及大小來計數活CAR-T細胞。將結果進行外推以獲得每孔的細胞數。

觀察到在與標靶細胞幾輪再刺激進行（模擬慢性抗原活化）後，TGF-β誘導對CAR-T細胞功能（即殺傷）的抑制。只有分泌TGFβ調節劑（例如，分泌TGFβR2 VH二聚體或表現膜結合dnTGFbR2）的CAR-T細胞受到保護，免受TGF-β（10 ng/ml）的抑制作用，但對照VH則沒有。 序列表

下表5係提供本文所揭示之序列與描述。 表 5. 序列表

描述/SEQ ID NO	序列
SEQ ID NO: 1 TGFb scFv VH-VL1	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKR
SEQ ID NO: 2 TGFb scFv VH-VL2	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKR
SEQ ID NO: 3 TGFb scFv VL-VH	ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 4 TGFbR2 scFv VH-VL	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 5 TGFbR2 scFv VL-VH	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 6     mTGFbR2 VH1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYGMGWVRQAPGKGLEWVSWIEKTGNKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKARHIKVRSRDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 7	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYGMGWVRQAPGKGLEWVSWIEKTGNKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKA GRHIKVRSRDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8 hTGFbR2 VH1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 9 TGFbR2 VHH二聚體	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 12	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 13	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 14	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 15	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 16	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSggggsggggsEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 17 TGFb-scFv VH-VL1 G4S二聚體	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKggggsQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 18 TGFb-scFv VH-VL1 2xG4S二聚體	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKggggsggggsQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 19 TGFb-scFv VH-VL1微型抗體+鉸鏈	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 20 TGFb-scFv VH-VL1微型抗體+二聚體	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 21 TGFb-scFv VH-VL1微型抗體	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 22	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 23	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKggggsQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 24	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKggggsggggsQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 25	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 26	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKGGSEPKSsDKTHTCPPCgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 27	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 28	QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKgggssgggsgGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGggggsggsQLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 29    TGFbR2 VH2	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQESMYWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTRIKQGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 30  TGFbR2 hVH2	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 31 TGFbR2 VH3	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTDQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRQPAGVSGKYVDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 32 mTGFbR2ECD (I24-K31,F57-L185)	IPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL
SEQ ID NO: 33 huTGFbR1+2 ECD v1	LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEGGGGSTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD [hTGFbR1-ECD(L34-E125)- hTGFbR2-ECD(A44-D151)]
SEQ ID NO: 34 huTGFbR1+2 ECD v2	QCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE [hTGFbR1-ECD(Q35-N107)-4GS- 4GS-hTGFbR2-ECD(L34-E125)]
SEQ ID NO: 35 mTGFbR1+2 ECD v1	LQCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNKIELPTTGPFSEKQSAGLGPVELGGGGSIPPHVPKSVNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPD [mTGFbR1-ECD(L30-L126)-4GS-mTGFbR2-ECD(I24-K31,F57-D184)]
SEQ ID NO: 36 huTGFbR1+2 ECD v2	QCFCHLCTKDNFTCETDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGAVTTTYCCNQDHCNGGGGSAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKE [mTGFbR1-ECD(Q31-N107)-4GS-mTGFbR2-ECD(I24-K31,F57-E150)]
SEQ ID NO: 37 具有IgKss的小鼠TGFbR2 ECD	METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL
SEQ ID NO: 38 具有8(G4S)連結子及帶標記標籤之IgKss的小鼠TGFbR2 ECD二聚體	METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGS DYKDDDDK
SEQ ID NO: 39 TGFbR2 ECD二聚體	METDTLLLWVLLLWVPGSTGIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVPKSDVEMEAQKDASIHLSCNRTIHPLKHFNSDVMASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPKLTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPDL
SEQ ID NO: 40 huTGFbR2 ECD單體1	LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVE
SEQ ID NO: 41 CD28鉸鏈域	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
SEQ ID NO: 42 CD28跨膜域	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO: 43 CD28鉸鏈/跨膜域	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO: 44 CD28單域	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 45 CD3z-1XX突變信號傳導域	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 46 合併的CAR跨膜及細胞內結構域	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 47 V1-01 抗GCC CAR	MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 48 V51 抗GCC CAR	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 49 抗CD19 scFv	MGTSLLCWMALCLLGADHADAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPG KGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDY LDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHW YQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAE DAATYYCQQWNINPLTF GAGTKLELKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVL WVGGVLACYSLLVTVAFI IFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR SRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
V5 抗GCC CAR  SEQ ID NO: 50	MELGLSWVFLVAILEGVQCQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDYTRDVWGQGTAVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO:)
V36 抗GCC CAR  SEQ ID NO: 51	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGGRLEWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCTRDYNKDYWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: )
V1 抗GCC CAR SEQ ID NO: 52	MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISHYYWSWFRQPAGKGLEWIGRIYPSGSTSYNPSLKSRVAMSVDTPKNQFSLNLSSVTAADTAVYYCARDRSTGWSEWNSDLWGRGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: )
V48 抗GCC CAR SEQ ID NO: 53	MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGKGLEWVAKIRHDGGEKYYPDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDNLRAEDTAMYYCTRDYNKDLWGQGTLVTVSSRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (SEQ ID NO: )
V8 抗GCC CAR SEQ ID NO: 54	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTGVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (
V9 抗GCC CAR SEQ ID NO: 55	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMTWVRQAPGRGLEWVAKIRYDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (
V30 抗GCC CAR SEQ ID NO: 56	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFGRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (
V31 抗GCC CAR SEQ ID NO: 57	QVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGREWVAKIKYDGSEKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCATDFTRDVWGQGTTVTVSS RAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (
SEQ ID NO: 58 P2A	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO: 59 G4S連接子	GGGGS
SEQ ID NO: 60 2x G4S連接子	GGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 61	GGGGSGGGGSGGGGS
小鼠CD19 CAR    SEQ ID NO: 62	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT NSRRNR LLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPA RDFAAYRP RAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
人類CD19 CAR (含CD3-1xx) SEQ ID NO: 63	MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR

等效方案及範疇

熟悉本技藝者將認識到或者能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施例之許多等效方案。本發明之範疇並不意欲受限於以上描述，而實際上係如隨附申請專利範圍中所記載。

已描述本發明的至少一實施例的幾個態樣，應當理解，各種改變、修飾和增進對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。此類變更、修飾和增進旨在成為本揭示的一部分，且旨在落入本發明的精神和範圍內。因此，前面的描述和附圖僅作為示範，本發明由後附的申請專利範圍詳細描述。

在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等序數術語來修飾申請專利範圍要件本身，並不意味著某一申請專利範圍要件相對於另一個申請專利範圍要件的任何優先、先行或順序，或方法執行的時間順序，而僅作為標示，以將具有特定名稱的一個申請專利範圍要件與具有相同名稱(但使用該序數術語)的另一個要件區分開來，以區分各申請專利範圍要件。

如本文在說明書和申請專利範圍中使用的冠詞「一(a)」和「一(an)」，除非明確指出相反，否則應理解為包括複數參考物。除非另有說明，否則若該群組之一個、多個或所有成員存在於、使用於或以其他方式相關於一特定產物或方法，則在一或多個群組成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述被視為已滿足，除非上下文相反或以其他方式明顯指出。本發明包括其中該群組中恰好有一個成員存在於、使用於或以其他方式相關於特定的產品或過程的實施例。本發明亦包括其中大於一個或整個群組成員存在於、使用於或以其他方式相關於特定的產品或過程的實施例。此外，應當理解，本發明涵蓋所有變化、組合和排列，其中來自所列申請專利範圍的一或多個限制、要件、子句、描述性術語等，係引入另一從屬申請專利範圍中相同的基本申請專利範圍(或相關的任何其他申請專利範圍)中，除非另有說明或除非本領域普通技術人員可明顯看出矛盾或不一致。在要件以列表形式呈現的情況下(例如，以馬庫什組(Markush group)或類似格式)，應當理解，亦揭示該要件的每個子群，且可從該群組中移除任一要件。應當理解，一般而言，本發明或本發明態樣被稱為包含特定要件、特徵等的情況下，本發明的某些實施例或本發明的各態樣由或基本上由此類要件、特徵等組成。為了簡單起見，在本文中這些實施例並未在每種情況下以如此多的詞語具體闡述。亦應當理解，本發明的任何實施例或態樣都可明確地從申請專利範圍中排除，而不論特定的排除是否在說明書中有陳述。用於描述本發明的背景並提供關於其實施的額外細節所引用的文獻、網站和其他參考資料均以引用方式併入本文中。

本文所含之圖式，其由以下各圖組成，僅用於說明目的而非限制。

圖 1A-1E係展示在免疫反應性細胞（例如，經轉導T細胞）中之CAR及TGF-β信息傳導調節劑之例示性表現。 圖 1A係說明淋巴細胞群， 圖 1B係說明單一細胞群， 圖 1C係繪示活CD3+細胞群，而 圖 1D係顯示評估在表現TGF-β之裝甲化人類CAR-T細胞中之CAR表現的例示性流式細胞儀分析結果。 圖 1E係繪示長條圖顯示使用僅以CD19 CAR轉導之未裝甲化細胞，及經以TGFb scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)、TGFb scFv VH-VL2 (SEQ ID NO: 2)、TGFb scFv VL-VH (SEQ ID NO: 3)、TGFbR2 scFv VH-VL (SEQ ID NO: 4)、TGFbR2 scFv VL-VH (SEQ ID NO: 5)、mTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 6)及hTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 8)裝甲化之CD19 CAR-T細胞，或未經轉導的細胞，以CAR染色陽性之活細胞%呈現之轉導效率。

圖 2A-2B之曲線圖係展現共表現CD19 CAR及TGF-β信息傳導調節劑之免疫反應性細胞對於CD19+ Raji細胞(FIG. 2A)及CD19ko Raji細胞(FIG. 2B)的例示性活體內殺傷分析結果，其使用的效應子係相對於以下各者之標靶：僅以CD19 CAR轉導之未裝甲化細胞，及經以TGFb scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)、TGFb scFv VH-VL2 (SEQ ID NO: 2)、TGFb scFv VL-VH (SEQ ID NO: 3)、TGFbR2 scFv VH-VL (SEQ ID NO: 4)、TGFbR2 scFv VL-VH (SEQ ID NO: 5)、mTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 6)及hTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 8)裝甲化之CD19 CAR-T細胞，或未經轉導的細胞。

圖 3A係繪示長條圖繪示例示性ELISA結果展現人類CAR-T細胞分泌的TGF-β結合子的分泌，而 圖 3B係繪示長條圖繪示例示性ELISA結果展現人類CAR-T細胞分泌的TGFβR2結合子，以及其與同源抗原結合的能力。

圖 4係繪示長條圖繪示例示性螢光酶分析結果評估TGF-β信息傳導受到會分泌構築體TGFb scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)、TGFb scFv VH-VL2 (SEQ ID NO: 2)、TGFb scFv VL-VH (SEQ ID NO: 3)、TGFbR2 scFv VH-VL (SEQ ID NO: 4)、TGFbR2 scFv VL-VH (SEQ ID NO: 5)、mTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 6)及hTGFbR2 VH1 (SEQ ID NO: 8)之CAR-T細胞之上清液的抑制情況。

圖 5A顯示了長條圖繪示例示性螢光酶分析結果，其評估TGF-β信息傳導受到會分泌TGFb-scFv VH-VL1 G4S二聚體(SEQ ID NO: 17)、TGFb-scFv VH-VL1 2xG4S二聚體(SEQ ID NO: 18)、TGFb-scFv VH-VL1微型抗體(SEQ ID NO: 21)、TGFb-scFv VH-VL1微型抗體+鉸鏈(SEQ ID NO: 19)之CAR-T細胞之上清液的抑制。 圖 5B係顯示例示性TGF-β調節劑之示意圖，其經設計使用螢光酶報告分析來篩選針對TGF-β之多聚結合子的分泌。 圖 5C係顯示包含有VHH結合域之例示性TGF-β調節劑示意圖。

圖 6A顯示了長條圖繪示例示性螢光酶分析結果，其評估在與僅表現CAR之未裝甲化細胞相比下，共表現單聚TGFb scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)及二聚TGFb-scFv VH-VL1 G4S二聚體(SEQ ID NO: 17)結合子之裝甲化CAR T細胞的相對阻斷活性。 圖 6B顯示了長條圖繪示例示性螢光酶分析結果，用以評估TGFβR2 VHH及scFv單體及二聚體構築體的相對阻斷活性。未裝甲化之CAR-T細胞、mTGFbR2 VH2單體、mTGFbR2 VH2 G4S二聚體、mTGFbR2 VH2 G4S三聚體、hTGFbR2 VH2單體、hTGFbR2 VH2 G4S二聚體、hTGFbR2 VH3單體、hTGFbR2 VH3 G4S二聚體、hTGFbR2 scFv VH-VL單體、hTGFbR2 scFv VH-VL G4S二聚體。

圖 7A 及圖 7B係繪示長條圖繪示例示性ELISA結果展現例示性TGFb調節劑會與人類TGFbR2 (圖7A)結合但不與小鼠TGFbR2 (圖7B)結合。未裝甲化之CAR-T細胞、mTGFbR2 VH2單體、mTGFbR2 VH2 G4S二聚體、mTGFbR2 VH2 G4S三聚體、hTGFbR2 VH2單體、hTGFbR2 VH2 G4S二聚體、hTGFbR2 VH3單體、hTGFbR2 VH3 G4S二聚體、hTGFbR2 scFv VH-VL單體、hTGFbR2 scFv VH-VL G4S二聚體。

圖 8A係顯示一例示性注射時間表評估如實例6中所述之EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞之腫瘤生長。 圖 8B係顯示在相對於未裝甲化CAR-T或未經轉導之CAR-T細胞下，接受會分泌TGF-β結合子之CAR-T細胞的小鼠中之例示性腫瘤體積隨時間的變化。 圖 8C係展現在相對於未裝甲化或未經轉導之CAR-T細胞下，用會分泌TGF-β結合子之CAR-T細胞治療的小鼠中之例示性肝轉移。 圖 8D係展現在相對於未裝甲化或未經轉導之CAR-T細胞下，用會分泌TGF-β結合子之CAR-T細胞治療的小鼠中之例示性肺轉移。 圖 8E係展現在肝及肺組織中表現螢光酶之腫瘤細胞的例示性影像結果。

圖 9A 及圖 9B係繪示長條圖繪示比較了來自分泌不同TGF-b配位體結合衰減蛋白（TGF-b scFv VH-VL1至TGFbR2 ECD單體、同質二聚體(圖9A)及異質二聚體(圖9B)）之裝甲化小鼠CAR-T細胞與來自未裝甲化CAR-T細胞之上清液的例示性SBE-Luc TGF-b報告分析結果。

圖 10A係顯示一例示性注射時間表評估EMT6-hCD19-Fluc腫瘤細胞之腫瘤生長。 圖 10B係顯示在接受未經轉導之T細胞或未裝甲化CAR-T細胞（未共表現TGFβ信息傳導調節劑之CAR-T細胞）的小鼠中之例示性腫瘤體積隨時間的變化。 圖 10C係顯示在接受共表現TGFbR1+2ECD二聚體之裝甲化CAR-T細胞或未裝甲化CAR-T細胞（未共表現TGFβ信息傳導調節劑之CAR-T細胞）之小鼠中的隨時間的例示性腫瘤體積。 圖 10D係顯示在接受全身性抗TGFb抗體(1D11)或未裝甲化CAR-T細胞（未共表現TGFβ信息傳導調節劑之CAR-T細胞）的小鼠中之例示性腫瘤體積隨時間的變化。

圖 11係繪示在發展自表現CD19之MC38細胞的小鼠中之例示性腫瘤體積隨時間的變化曲線圖。小鼠係接受未經轉導之T細胞、未裝甲化抗CD19 CAR-T細胞、或會分泌抗TGF-b (TGF-b scFv VH-VL1)之抑制性結合子的CAR-T細胞。

圖 12係繪示曲線圖顯示例示性RNA序列分析，其展現出宿主免疫反應受到會分泌抗TGF-b (TGF-b scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1))之結合子的CAR-T細胞而增進活化。

圖 13係顯示對於接受會分泌TGF-b scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)之CAR-T細胞的小鼠腫瘤中之腫瘤浸潤T細胞(CD3d+, CD3e+, CD3g+)、CD8+ T細胞(CD8a+)及細胞毒性T細胞(GzmB+)之例示性生物標記物分數。

圖 14係顯示例示性單樣本基因組富集分析(GSEA)，富集分數展現出接受分泌TGF-b scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)之CAR-T細胞的小鼠腫瘤中的T細胞特徵及IFNg特徵增加。

圖 15係顯示在接受未經轉導之對照T細胞、未裝甲化CD19 CAR-T細胞、或分泌抗TGF-b scFv VH-VL1 (SEQ ID NO: 1)單體之CAR-T細胞的小鼠中之包括TCRa/b、CD8a、CD4、CD25、CD62L、CD11b、Gr1、CD11c、CD45.1及CD45的例示性表面標記物分析。

圖 16A及 圖 16B之曲線圖係繪示GSU異體移植模型之例示性活體內分析，其展現出經以抗TGF-b或抗TGFbR2阻斷抗體裝甲化之人類GCC-CAR-T細胞的功能改善。

圖 17A-17D係展現出共表現TGF-b scFv VH-VL1及TGFbR2 VHH之抗GCC CAR-T細胞所分泌的TGFb調節劑之腫瘤及/或血漿濃度，其係使用抗Flag免疫捕捉LC/MS測定法來測定。

圖 18A-18C之曲線圖係繪示在不存有TGFb (圖18A)及存有TGFb (圖18B)的情況下使用未裝甲化GCC CAR-T細胞、抗TGFbR2 VHH單體裝甲化之抗GCC CAR-T細胞、及抗TGFbR2 VHH二聚體裝甲化之抗GCC CAR-T細胞的HT29-GCC陽性細胞中之例示性活體外殺傷分析結果。 圖 18C係顯示在TGFb存在及不存在下之CAR T細胞增殖情況。

圖 19係描繪展現出重複抗原刺激後細胞上之PD-1/Lag3表現的例示性流式細胞儀分析結果。

圖 20A-20C係繪示使用裝甲化及未裝甲化CAR-T細胞以及表現顯性抑制TGFbR2 (dnTGFbR2)之CAR-T細胞進行處理之GCC表現細胞GSU (圖20A)、HT55 (圖20B)、及MDA-MB-231-FP4 Luc (圖20C)的異體移植模型。

圖 21A-21C係顯示使用裝甲化抗GCC CAR T細胞進行處理之HT55肝臟轉移模型的例示性結果。

圖 22A係顯示在指定時間點以流式細胞儀計數CAR-T細胞且進行FACS表現型分型。 圖 22B係顯示抗Msln CAR-T細胞中之細胞毒性百分比，該細胞係共表現與TGFβ調節劑(例如TGFβR2-VH或dnTGFbR2)一起抗Msln的CAR，或者該CAR與對照VH一起抗GFP (Msln-對照VH)。


          <![CDATA[<110> 日商武田藥品工業股份有限公司 (TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED)]]>
          <![CDATA[<120> 用於調節TGF-B信息傳導之細胞療法組成物及方法]]>
          <![CDATA[<130> MIL-013WO1]]>
          <![CDATA[<140> TW 111105490]]>
          <![CDATA[<141> 2022-02-15]]>
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          <![CDATA[<170> PatentIn版本3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 246]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
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          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
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          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
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          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
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          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
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          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly 
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          145                 150                 155                 160 
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          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro 
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          Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 
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          Glu Ile Lys Arg 
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          <![CDATA[<400> 3]]>
          Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu 
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          Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val 
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          Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val 
                      180                 185                 190         
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                  195                 200                 205             
          Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Leu 
              210                 215                 220                 
          Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
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          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
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          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
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          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
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          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
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          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
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          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 
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          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
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                      100                 105                 110         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Gln Val Gln Glu 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 
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          Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr Phe Ser Trp Gly Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Phe Tyr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg Gly Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Ser 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 122]]>
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          <![CDATA[<400> 6]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Ser Trp Ile Glu Lys Thr Gly Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Ala Arg His Ile Lys Val Arg Ser Arg Asp Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 7]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Trp Ile Glu Lys Thr Gly Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Ala Gly Arg His Ile Lys Val Arg Ser Arg Asp Phe Asp Tyr 
                      100                 105                 110         
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120             
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          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
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          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 
                  115                 120                 125             
          Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
                  195                 200                 205             
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
              210                 215                 220                 
          Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                          245                 
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          <![CDATA[<400> 10]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Gly Thr Glu Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Glu Phe Val Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
              210                 215                 220                 
          Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                          245                 250                 
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          <![CDATA[<400> 11]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 
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          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
              210                 215                 220                 
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
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          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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                      20                  25                  30          
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          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Glu Pro Lys 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
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          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
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                      100                 105                 110         
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          Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  355                 360                 365             
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          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
                  195                 200                 205             
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          Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 
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          Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu Gln Met 
                  275                 280                 285             
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          Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 
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          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 
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                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 
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          Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
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          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
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          Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 
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          <![CDATA[<400> 17]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 
                          245                 250                 255     
          Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys 
                      260                 265                 270         
          Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn Val Ile Ser Trp Val Arg 
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile 
              290                 295                 300                 
          Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu 
                      340                 345                 350         
          Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
              370                 375                 380                 
          Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu 
                          405                 410                 415     
          Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                      420                 425                 430         
          Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
              450                 455                 460                 
          Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 
                          485                 490                 495 
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 500]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
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          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 
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          Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Met 
                          325                 330                 335     
          Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                      340                 345                 350         
          Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                  355                 360                 365             
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
              370                 375                 380                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
                          405                 410                 415     
          Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 
              450                 455                 460                 
          Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 
          465                 470                 475                 480 
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                          485                 490                 495     
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                      500 
          <![CDATA[<210> 19]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 
                          245                 250                 255     
          His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
              370                 375             
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 631]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 
                          245                 250                 255     
          His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              370                 375                 380                 
          Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 
                          405                 410                 415     
          Ser Asn Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 
                      420                 425                 430         
          Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln 
                  435                 440                 445             
          Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr 
              450                 455                 460                 
          Thr Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp 
                          485                 490                 495     
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                      500                 505                 510         
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr 
                  515                 520                 525             
          Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 
              530                 535                 540                 
          Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 
                          565                 570                 575     
          Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
                      580                 585                 590         
          Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 
                  595                 600                 605             
          Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln 
              610                 615                 620                 
          Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 
          625                 630     
          <![CDATA[<210> 21]]>
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          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                  275                 280                 285             
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              290                 295                 300                 
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
          305                 310                 315                 320 
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360     
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 614]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 
                      180                 185                 190         
          Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
                          325                 330                 335     
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  355                 360                 365             
          Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 
                          405                 410                 415     
          Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg 
                      420                 425                 430         
          Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr 
                  435                 440                 445             
          Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
              450                 455                 460                 
          Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          485                 490                 495     
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Val Leu Thr Gln 
                      500                 505                 510         
          Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 
                  515                 520                 525             
          Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln 
              530                 535                 540                 
          Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 
                          565                 570                 575     
          Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 
                      580                 585                 590         
          Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly 
                  595                 600                 605             
          Thr Arg Leu Glu Ile Lys 
              610                 
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 491]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly 
                          245                 250                 255     
          Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 
                      260                 265                 270         
          Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg 
                  275                 280                 285             
          Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly 
              290                 295                 300                 
          Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile 
                      340                 345                 350         
          Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 
                          405                 410                 415     
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                      420                 425                 430         
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
                  435                 440                 445             
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
              450                 455                 460                 
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                          485                 490     
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          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr Phe Ser 
                  275                 280                 285             
          Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys 
                          325                 330                 335     
          Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Pro Arg 
                      340                 345                 350         
          Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 
                  355                 360                 365             
          Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 
                      420                 425                 430         
          Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 
                  435                 440                 445             
          Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 
              450                 455                 460                 
          Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                          485                 490                 495     
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 376]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln 
                      260                 265                 270         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
                      340                 345                 350         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  355                 360                 365             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
              370                 375     
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 627]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln 
                      260                 265                 270         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
                      340                 345                 350         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  355                 360                 365             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                          405                 410                 415     
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                      420                 425                 430         
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
              450                 455                 460                 
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                          485                 490                 495     
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      500                 505                 510         
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
                  515                 520                 525             
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
              530                 535                 540                 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                      580                 585                 590         
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
                  595                 600                 605             
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
              610                 615                 620                 
          Glu Ile Lys 
          625         
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 359]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro 
                          245                 250                 255     
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 
                      260                 265                 270         
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
              290                 295                 300                 
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                          325                 330                 335     
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                  355                 
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 610]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          Gln Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro 
                          245                 250                 255     
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 
                      260                 265                 270         
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
              290                 295                 300                 
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                          325                 330                 335     
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln 
                  355                 360                 365             
          Leu Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr 
              370                 375                 380                 
          Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Ser Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
                          405                 410                 415     
          Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
              450                 455                 460                 
          Pro Arg Gly Pro Thr Met Ile Arg Gly Val Ile Asp Ser Trp Gly Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                          485                 490                 495     
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 
                      500                 505                 510         
          Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 
                  515                 520                 525             
          Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 
              530                 535                 540                 
          Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 
                          565                 570                 575     
          Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 
                      580                 585                 590         
          Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 
                  595                 600                 605             
          Ile Lys 
              610 
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 120]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gln Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Ser Gly Thr Arg Ile Lys Gln Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 124]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 122]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Asp 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Arg Gln Pro Ala Gly Val Ser Gly Lys Tyr Val Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 162]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 小家鼠屬(Mus sp.)]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile His Pro Leu Lys 
                      20                  25                  30          
          His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys 
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp 
              50                  55                  60                  
          Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly 
                      100                 105                 110         
          Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys 
                  115                 120                 125             
          Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu 
              130                 135                 140                 
          Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu 
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 234]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val 
                      20                  25                  30          
          Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp 
                  35                  40                  45              
          Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Gly Gly Gly Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser 
              130                 135                 140                 
          Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys 
                          165                 170                 175     
          His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe 
                  195                 200                 205             
          Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe 
              210                 215                 220                 
          Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 
          225                 230                 
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 186]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val Thr 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val Ile 
                      20                  25                  30          
          His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp Arg 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 
              130                 135                 140                 
          Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 
                      180                 185     
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 238]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val 
                      20                  25                  30          
          Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp 
                  35                  40                  45              
          Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ala Val Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Pro Phe Ser Glu Lys Gln Ser Ala Gly Leu Gly Pro Val Glu 
                          85                  90                  95      
          Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro His 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu 
                      180                 185                 190         
          Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala 
                  195                 200                 205             
          Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp 
              210                 215                 220                 
          Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp 
          225                 230                 235             
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          <![CDATA[<211> 160]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Glu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val Ile 
                      20                  25                  30          
          His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp Arg 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ala Val Thr Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His 
              130                 135                 140                 
          Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210> 37]]>
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met 
                      20                  25                  30          
          Glu Ala Gln Lys Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          His Pro Leu Lys His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys 
                      100                 105                 110         
          Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr 
                          165                 170                 175     
          Thr Ser Ser Pro Asp Leu 
                      180         
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 397]]>
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met 
                      20                  25                  30          
          Glu Ala Gln Lys Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          His Pro Leu Lys His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys 
                      100                 105                 110         
          Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr 
                          165                 170                 175     
          Thr Ser Ser Pro Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      180                 185                 190         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro 
              210                 215                 220                 
          Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile His Pro Leu Lys His Phe 
                          245                 250                 255     
          Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro 
                      260                 265                 270         
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
                  275                 280                 285             
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro 
              290                 295                 300                 
          His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg 
                      340                 345                 350         
          Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn 
                  355                 360                 365             
          Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu 
              370                 375                 380                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 
          385                 390                 395         
          <![CDATA[<210> 39]]>
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met 
                      20                  25                  30          
          Glu Ala Gln Lys Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          His Pro Leu Lys His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys 
                      100                 105                 110         
          Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr 
                          165                 170                 175     
          Thr Ser Ser Pro Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      180                 185                 190         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro 
              210                 215                 220                 
          Pro His Val Pro Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Ile His Leu Ser Cys Asn Arg Thr Ile His Pro Leu Lys His Phe 
                          245                 250                 255     
          Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro 
                      260                 265                 270         
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
                  275                 280                 285             
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro 
              290                 295                 300                 
          His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg 
                      340                 345                 350         
          Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn 
                  355                 360                 365             
          Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu 
              370                 375                 380                 
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 92]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 40]]>
          Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val 
                      20                  25                  30          
          Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp 
                  35                  40                  45              
          Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu 
                          85                  90          
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 39]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="未知描述:CD28鉸鏈域序列"]]>
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 
          1               5                   10                  15      
          Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 
                  35                  
          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<211> 27]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="未知描述:CD28跨膜域序列"]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<211> 66]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 
          1               5                   10                  15      
          Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 
              50                  55                  60                  
          Trp Val 
          65      
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 41]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="未知描述:CD28信息域序列"]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 
          1               5                   10                  15      
          Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 
                  35                  40      
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 219]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 
          1               5                   10                  15      
          Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 
              50                  55                  60                  
          Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 
                          165                 170                 175     
          Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 
                      180                 185                 190         
          His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe 
                  195                 200                 205             
          Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
              210                 215                 
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 359]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile 
                  35                  40                  45              
          Ser His Tyr Tyr Trp Ser Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Ser Arg Val Ala Met Ser Val Asp Thr Pro Lys Asn Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Thr Gly Trp Ser Glu Trp Asn Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile 
          145                 150                 155                 160 
          His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro 
                          165                 170                 175     
          Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 
                  275                 280                 285             
          Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 
                          325                 330                 335     
          Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His 
                      340                 345                 350         
          Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                  355                 
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 48]]>
          Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Tyr Asn Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 
                  195                 200                 205             
          His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 
              210                 215                 220                 
          Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 
                      260                 265                 270         
          Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln 
              290                 295                 300                 
          Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr 
                          325                 330                 335     
          Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 
                      340                 345                 350         
          Arg 
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<211> 526]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 49]]>
          Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Asp His Ala Asp Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 
                      20                  25                  30          
          Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp 
                  115                 120                 125             
          Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met 
                          165                 170                 175     
          Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 
                  195                 200                 205             
          Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser 
              210                 215                 220                 
          Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 
                      260                 265                 270         
          Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 
                  275                 280                 285             
          Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Phe Trp Val Leu Trp Val Gly Gly Val 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 
                          325                 330                 335     
          Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met 
                      340                 345                 350         
          Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 
                  355                 360                 365             
          Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro 
              370                 375                 380                 
          Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val 
                          405                 410                 415     
          Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 
                      420                 425                 430         
          Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 
              450                 455                 460                 
          Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 
          465                 470                 475                 480 
          Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 
                          485                 490                 495     
          Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 
                      500                 505                 510         
          Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                  515                 520                 525     
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 50]]>
          Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Tyr Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 
                          245                 250                 255     
          Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Pro Pro Arg 
                  355         
          <![CDATA[<210> 51]]>
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 51]]>
          Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gly Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Tyr Asn Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 
                          245                 250                 255     
          Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Pro Pro Arg 
                  355         
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 52]]>
          Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile 
                  35                  40                  45              
          Ser His Tyr Tyr Trp Ser Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Lys Ser Arg Val Ala Met Ser Val Asp Thr Pro Lys Asn Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Ser Leu Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Thr Gly Trp Ser Glu Trp Asn Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 
                      180                 185                 190         
          Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 
                  195                 200                 205             
          Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 
              210                 215                 220                 
          Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 
                      260                 265                 270         
          Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 
              290                 295                 300                 
          Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 
                          325                 330                 335     
          His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe 
                      340                 345                 350         
          Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                  355                 360             
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
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          Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Tyr Asn Lys Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 
                          245                 250                 255     
          Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Pro Pro Arg 
                  355         
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 338]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asp Phe Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 
              290                 295                 300                 
          Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 
                          325                 330                 335     
          Pro Arg 
          <![CDATA[<210> 55]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Ile Arg Tyr Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asp Phe Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 
              290                 295                 300                 
          Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 
                          325                 330                 335     
          Pro Arg 
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          <![CDATA[<211> 338]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 56]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asp Phe Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 
              290                 295                 300                 
          Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 
                          325                 330                 335     
          Pro Arg 
          <![CDATA[<210> 57]]>
          <![CDATA[<211> 338]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 57]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asp Phe Thr Arg Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 
              290                 295                 300                 
          Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 
                          325                 330                 335     
          Pro Arg 
          <![CDATA[<210> 58]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 58]]>
          Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Asn Pro Gly Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210> 59]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 59]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 60]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 60]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 61]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成肽"]]>
          <![CDATA[<400> 61]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 62]]>
          <![CDATA[<211> 481]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 62]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala 
                  35                  40                  45              
          Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Gly Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 
                      100                 105                 110         
          Val Tyr Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr 
                  115                 120                 125             
          Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val 
                          165                 170                 175     
          Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp 
                      180                 185                 190         
          Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Tyr Leu Asp Asn Glu Arg Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu 
                  275                 280                 285             
          Lys His Leu Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys 
                      340                 345                 350         
          Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 
                  355                 360                 365             
          Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp 
              370                 375                 380                 
          Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                          405                 410                 415     
          Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln 
                      420                 425                 430         
          Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu 
                  435                 440                 445             
          Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 
              450                 455                 460                 
          Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Arg 
          <![CDATA[<210> 63]]>
          <![CDATA[<211> 485]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 63]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 
                      20                  25                  30          
          Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 
                  35                  40                  45              
          Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 
                      100                 105                 110         
          Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp 
                  115                 120                 125             
          Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln 
                      180                 185                 190         
          Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr 
                  195                 200                 205             
          Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 
              210                 215                 220                 
          Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val 
                  275                 280                 285             
          Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys 
              290                 295                 300                 
          Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 
                          325                 330                 335     
          Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 
                      340                 345                 350         
          Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 
              370                 375                 380                 
          Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 
                          405                 410                 415     
          Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe 
                      420                 425                 430         
          Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly 
                  435                 440                 445             
          Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln 
              450                 455                 460                 
          Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Leu Pro Pro Arg 
                          485 
          <![CDATA[<210> 64]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述:合成多肽"]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(50)]]>
          <![CDATA[<223> /附註="此序列可涵蓋1-10 'Gly Gly Gly Gly Ser'重複單元"]]>
          <![CDATA[<400> 64]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser 
              50  
          <![CDATA[<210> 65]]>
          <![CDATA[<211> 40]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 來源]]>
          <![CDATA[<223> /附註="人工序列描述: 合成多肽"]]>
          <![CDATA[<400> 65]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  35                  40  
          

Claims (20)

1. 一種基因改造T細胞群體，其包含辨識癌症相關抗原之嵌合抗原受體(CAR)及TGFβ信息傳導路徑調節劑。
2. 如請求項1所述之細胞群，其中該CAR係辨識選自由以下組成之群的抗原：ADGRE2、CLEC12、CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、CEACAM 5、密連蛋白(Claudin) 18.2、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、葉酸受體-a、GCC (亦稱為GUCY2C)、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、x-輕鏈、KDR、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-AI、MUC1、MUC13、間皮素、NKG2D配位體、NY-ES0-1、腫瘤胚胎抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、TAG-72、TROP2、VEGF-R2及WT-1。
3. 如請求項1或2之細胞群，其中該TGFβ信息傳導路徑調節劑係與TGFβ或TGFβ受體結合。
4. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該TGFβ信息傳導路徑調節劑包含選自表1之胺基酸序列。
5. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該CAR為CD19 CAR或GCC CAR。
6. 如請求項1所述之細胞群，其中該等細胞為自體的。
7. 如請求項1所述之細胞群，其中該等細胞為同種異體的。
8. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該細胞係使用包含有編碼CAR多肽之第一核酸及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸的載體進行基因修飾。
9. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該細胞係使用兩種載體進行基因修飾，第一載體包含編碼CAR多肽之核酸，而第二載體包含編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之核酸。
10. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該CAR包含選自由以下組成之群的細胞內信息傳導域：CD3ζ鏈、CD97、2B4 GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、DAP10、DAP12、CD28信息傳導域、或其組合及變化形。
11. 如前述請求項中任一項之細胞群，其中該CAR包含衍生自選自由以下組成之群的跨膜結構域：CD3、CD8、CD28、OX40、CD27、4-1BB、DAP10、DAP12、或其組合。
12. 一種載體，其包含編碼CAR多肽之第一核酸以及編碼TGFβ信息傳導路徑調節劑之第二核酸。
13. 如請求項12之載體，其進一步包含一内部核糖體進入位點。
14. 如請求項12之載體，其進一步包含2A自裂解位點。
15. 一種經如請求項12至14中任一項之載體修飾的免疫細胞。
16. 如請求項15之免疫細胞，其中該細胞為T細胞。
17. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1之免疫細胞群。
18. 一種調節宿主中之免疫反應的方法，該方法包含向該宿主投與如請求項1之細胞群，其中調節免疫反應係包含藉宿主免疫細胞進行以下之一或多者：增進IFNγ產生；增進IL-2產生；增進抗原呈現；以及增進增生。
19. 一種治療或預防有需要之個體的癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1之細胞群。
20. 如請求項19之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病、急性非淋巴性白血症、急性骨髓性白血病、急性前骨髓細胞白血病、急性骨髓單核球白血病、急性單核球白血病、急性紅血球性白血病、慢性白血病、慢性非淋巴性白血症、多發性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、真性紅血球增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、華氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重鏈病、實體瘤、肉瘤、惡性腫瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、索脊瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內內皮肉瘤、滑液膜瘤、間皮瘤、依文氏(Ewing's)肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管上皮癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚癌、威爾姆氏(Wilm's)腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、大腸直腸癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、及其轉移。

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