DE69230142T2

DE69230142T2 - Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern

Info

Publication number: DE69230142T2
Application number: DE69230142T
Authority: DE
Inventors: Andrew David Griffiths; Kevin Stuart Johnson; Andrew John Smith; Gregory Winter
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1991-05-15
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 2000-03-09
Anticipated expiration: 2012-05-16
Also published as: DE69230142D1; US6291650B1; US5871907A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung spezifischer Bindungspaar- (sbp-)Elemente. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die nach diesen Verfahren erzeugten biologischen Bindungsmoleküle.
Aufgrund ihrer hohen Spezifität für ein bestimmtes Antigen stellte die Entdeckung monoklonaler Antikörper (G. Kohler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975)) einen wesentlichen technischen Durchbruch dar, der sowohl wissenschaftlich als auch kommerziell wichtige Folgen hatte.
Monoklonale Antikörper werden herkömmlicherweise hergestellt, indem eine immortalisierte Säugetier-Zelllinie aufgebaut wird, die von einer einzelnen Immunglobulin produzierenden Zelle stammt, die eine Form eines biologisch funktionellen Antikörpermoleküls mit einer bestimmten Spezifität sekretiert. Weil die Antikörper sekretierende Säugetier-Zelllinie immortalisiert ist, sind die Eigenschatten des Antikörpers von Charge zu Charge reproduzierbar. Die Schlüsseleigenschaften monoklonaler Antikörper sind ihre Spezifität für ein bestimmtes Antigen und die Reproduzierbarkeit, mit der sie erzeugt werden können.
Strukturell umfasst der einfachste Antikörper (IgG) wier Polypeptidketten, zwei Schwer- (H-)Ketten und zwei Leicht-(L-)Ketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (siehe Fig. 1). Die Leichtketten liegen in zwei unterschiedlichen Formen vor, die als κ und λ bezeichnet werden. Jede Kette weist einen konstanten Bereich (C) und einen variablen Bereich (V) auf. Jede Kette ist in eine Abfolge von Domänen organisiert. Die Leichtketten weisen zwei Domänen auf, von denen eine dem C-Bereich und die andere dem V-Bereich entspricht. Die Schwerketten weisen wier Domänen, die dem V-Bereich entsprechen, und drei Domänen (1, 2 und 3) im C-Bereich auf. Der Antikörper weist zwei Arme auf (wobei jeder Arm ein Fab-Bereich ist), von denen jeder einen VL- und einen VH-Bereich aufweist, die miteinander verbunden sind. Dieses Paar von V- Bereichen (VL und VH) ist es, das sich (aufgrund von Aminosäuresequenzvariationen) von einem Antikörper zum anderen unterscheidet, und sie sind gemeinsam für die Er kennung des Antigens und das Bereitstellen einer Antigenbindungsstelle (ABS) verantwortlich. Noch detaillierter besteht jeder V-Bereich aus drei Komplementaritäts-Bestimmungsbereichen (CDR), die durch wier Rahmenbereiche (FR) getrennt sind. Die CDRs sind der variabelste Teil der variablen Bereiche, und sie erfüllen die entscheidende Antigen-Bindungsfunktion. Die CDR-Bereiche werden über ein komplexes Verfahren, das Rekombination, Mutation und Selektion umfasst, von vielen potentiellen Keimlinien- Sequenzen abgeleitet.
Es ist gezeigt worden, dass die Bindungsfunktion von Antigenen durch Fragmente eines ganzen Antikörpers erfüllt werden kann. Beispiele für bindende Fragmente sind (i) das Fab-Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domäne besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus VH- und CH1-Domäne besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus VL- und VH-Domäne eines einzigen Arms eines Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (E. S. Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Bereiche; und (vi) F(ab')&sub2;-Fragmente, wobei ein zweiwertiges Fragment zwei Fab- Fragmente umfasst, die im Hingebereich über eine Disulfidbrücke verbunden sind.
Obwohl für die beiden Domänen des Fv-Fragments durch getrennte Gene kodiert wird, hat es sich als möglich erwiesen, einen synthetischen Linker zu bilden, der es ermöglicht, sie durch Rekombinations-Verfahren in Form einer einzigen Proteinkette auszubilden (die als Einzelkette-Fv (scFv) bekannt ist; R. E. Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883 (1988)). Diese scEv- Fragmente wurden aus Genen von monoklonalen Antikörpern zusammengestellt, die zuvor isoliert worden waren.
Monoklonale Antikörper, deren Fragmente und Derivate weisen zwar enorme Vorteile auf, sind jedoch trotzdem mit einer Anzahl von Einschränkungen verbunden.
Zunächst sind die therapeutischen Anwendungen monoklonaler Antikörper, die von immortalisierte Menschen-Zelllinien produziert wurden, vielversprechend für die Behand lung einer großen Vielfalt von Erkrankungen (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Herausgegeben von E. S. Lennox. British Medical Bulletin 1984. Verleger Churchill Livingstone). Unglücklicherwiese ist es sehr schwierig, immortalisierte Antikörper produzierende menschliche Zelllinien zu erstellen, und sie ergeben niedrige Antikörper- Ausbeuten (etwa 1 ug/ml). Im Gegensatz dazu ergeben äquivalente Nagetier-Zelllinien große Mengen Antikörper (etwa 100 ug/ml). Die wiederholte Verabreichung dieser fremden Nagetier-Proteine an Menschen kann jedoch zu schädlichen Hypersensitivitätsreaktionen führen. Im Großen und Ganzen sind diese von Nagetieren stammenden monoklonalen Antikörper daher von begrenztem therapeutischem Nutzen.
Zweitens besteht ein Schlüsselaspekt beim Isolieren monoklonaler Antikörper darin, wieviele verschiedene Klone von Antikörper produzierenden Zellen mit unterschiedlichen Spezifitäten praktisch erstellt und gesampelt werden können, im Vergleich dazu, wieviele theoretisch gesampelt werden müssen, um eine Antikörper produzierende Zelle mit den gewünschten Spezifitätscharakteristika zu isolieren (C. Milstein, Royal Soc. Croonian Lecture, Proc. R. Soc. London B. 239, 1-16, (1990)). Beispielsweise wird angenommen, dass die Anzahl verschiedener Spezifitäten, die zu einem beliebigen Zeitpunkt von Lymphozyten des Mäuse-Immunsystems exprimiert wird, etwa 10&sup7; beträgt, und das ist nur ein kleiner Anteil des potentiellen Repertoires von Spezifitäten. Während des Isolierens einer typischen Antikörper produzierenden Zelle mit einer gewünschten Spezifität können die Forscher jedoch nur 10³ bis 10&sup4; einzelne Spezifitäten sampeln. Das Problem ist beim Menschen noch schlimmer, wo etwa 10¹² Lymphozytenspezifitäten vorliegen, während die Begrenzung des Samplings auf 10³ oder 10&sup4; bestehen bleibt.
Dieses Problem ist bei Labortieren durch den Einsatz von Immunisierungsschemata bis zu einem gewissen Grad erleichtert worden. So wird, wenn monoklonale Antikörper mit einer Spezifität gegen ein bestimmtes Epitop erzeugt werden sollen, ein Tier mit einem Immunogen immunisiert, das dieses Epitop exprimiert. Das Tier entwickelt dann eine Immunreaktion gegen das Immunogen, und es kommt zu einer Vermehrung von Lymphozyten, die Spezifität gegen das Epitop zeigen. Aufgrund dieser Vermehrung von Lymphozyten mit der gewünschten Spezifität wird es einfacher, sie im Samplingverfahren zu detektieren. Dieser Ansatz ist jedoch nicht in allen Fällen erfolgreich, da möglicherweise kein geeignetes Immunogen verfügbar ist. Weiters ist ein solcher Ansatz praktisch oder ethisch nicht machbar, wenn menschliche monoklonale Antikörper (beispielsweise zur therapeutischen Verabreichung, wie zuvor erörtert) hergestellt werden sollen.
In den letzten Jahren bestand ein Ansatz für die Lösung dieser Probleme teilweise in der Anwendung von DNA-Rekombinations-Verfahren zur Isolierung und Produktion von z. B. Antikörpern und Fragmenten von Antikörpern mit Antigen-Bindungsfähigkeit in Bakterien wie etwa E.coli.
Diese einfache Substitution immortalisierter Zellen mit bakteriellen Zellen als "Fabrik" vereinfacht Verfahren zur Herstellung großer Mengen an Bindungsmolekülen beträchtlich. Weiters lässt ein Rekombinations-Produktionssystem Spielraum für die Herstellung maßgeschneideter Antikörper und Fragmente davon. Beispielsweise ist es möglich, heterozygote Moleküle mit neuen Kombinationen aus Bindungs- und Effektorfunktionen, humanisierten Antikörpern (z. B. variablen Mäuse-Bereichen, kombiniert mit konstanten menschlichen Domänen oder Mäuse-Antikörper-CDRs, die auf einen menschlichen FR aufgepfropft sind) und neuen Antigen-Bindungsmolekülen zu erzeugen. Weiters weist der Einsatz von Polymerasekettenreaktion-(PCR-)Amplifizierung (R. K. Saiki et al., Science 239, 487-491 (1988)) zum Isolieren von Antikörper produzierenden Sequenzen aus Zellen (z. B. Hybridomen und B-Zellen) ein großes Potential für die Beschleunigung des zeitlichen Ablaufs auf, mit dem Spezifitäten isoliert werden können. Amplifizierte VH- und VL-Gene werden direkt in Vektoren zur Expression in Bakterien- oder Säugetierzellen kloniert (R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989), E. S. Ward et al. (1989), s. o.; J. W. Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1250-1255 (1989); L. Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5728-5732 (1989)). Lösliche Antikörperfragmente, die von Bakterien sekretiert wurden, werden dann auf Bindungsaktivitäten gescreent.
Wie das Produktionssystem, das auf immortalisierten Zellen basiert, unterliegt jedoch auch das Rekombinations-Produktionssystem den bereits erörterten Selektionsproblemen und greift daher auf Tier-Immunisierung zurück, um den Anteil an Zellen mit gewünschter Spezifität zu erhöhen. Weiters können einige dieser Techniken die Screeningprobleme verschärfen. Beispielsweise sind große getrennte H- und L-Kettensammlungen von immunisierten Mäusen hergestellt und vor dem Screenen durch statistische Kombination miteinander kombiniert worden (W. D. Huse et al., Science 246, 1275- 1281 (1989), WO 90/14443, WO 90/14424 und WO 90/14430). Es ist jedoch entscheidend, dass die in jeder Zelle enthaltene Information, nämlich die ursprüngliche Paarung einer L-Kette mit einer H-Kette, verloren geht. Dadurch geht ein Teil des Vorteils verloren, der unter Einsatz von Immunisierungsprotokollen im Tier erhalten wird. Zur Zeit weisen nur Sammlungen, die von einzelnen VH-Domänen stammen (dAbs; E. S. Ward et al. (1989), s. o.), diesen Nachteil nicht auf. Weil jedoch nicht alle Antikörper-VH-Domänen zur Antigenbindung fähig sind, müssen mehrere gescreent werden. Außerdem bleibt noch das Problem des direkten Screenings vieler verschiedener Spezifitäten in Prokaryoten zu lösen.
Daher besteht Bedarf an einem Screening-System, mit dem sich eines oder mehrere der obigen oder anderer Probleme erleichtern oder überwinden lassen. Das ideale System würde das Sampling einer sehr großen Anzahl von Spezifitäten (z. B. 10&sup6; und darüber), rasche Sortierung in jeder Klonierungsrunde und raschen Tansfer des genetischen Materials, das für das Bindungsmoleküle kodiert, aus einer Stute des Produktionsverfahrens in die nächsten Stufe ermöglichen.
Die attraktivsten Kandidaten für diese Art von Screening wären prokaryotische Organismen (weil sie rasch wachsen, relativ einfach zu manipulieren sind, und weil eine große Anzahl von Klonen erzeugt werden kann), an deren Oberfläche eine funktionelle Bindungsdomäne, z. B. ein Antikörper, ein Rezeptor, ein Enzym usw., freiliegt. Im UK-Patent GB 2.137.631B wurden Verfahren zur Coexpression der variablen H- und L-Ketten gene von Immunglobulinen in einer einzigen Wirtszeile geoffenbart. Das Protein wurde jedoch intrazellulär exprimiert und war unlöslich. Weiters erforderte das Protein umfassende Behandlung, um Antikörperfragmente mit Bindungsaktivität und dieses erzeugte Material mit nur einem Teil der Bindungsaktivität, die für Antikörperfragmente in dieser Konzentration erwartet wird, zu erzeugen. Es ist bereits gezeigt worden, dass Antikörperfragmente durch Bakterien-Membranen mit dem geeigneten Signalpeptid sekretiert werden können (A. Skerra und A. Pluckthun, Science 240, 1038-1040 (1988); M. Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988)), was eine Steigerung der Bindungsaktivität von Antikörperfragmenten zur Folge hat. Diese Verfahren erfordern das Screenen einzelner Klone auf Bindungsaktivität in der gleichen Weise wie monoklonale Mäuse-Antikörper.
Es ist jedoch nicht gezeigt worden, wie eine funktionelle Bindungsdomäne, z. B. ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Rezeptor, ein Enzym usw., an der Bakterien-Oberfläche in einer Konfiguration gehalten werden kann, die das Sampling etwa seiner Antigen-Bindungseigenschaften und die Selektion auf Klone mit gewünschten Eigenschaften ermöglicht. Größtenteils ist das darauf zurückzuführen, dass die bakterielle Oberfläche eine komplexe Struktur ist, und bei den gramnegativen Organismen gibt es eine Außenwand, welche die Lage weiter verkompliziert. Weiters ist noch nicht gezeigt worden, dass sich beispielsweise eine Antikörperdomäne korrekt faltet, wenn sie als Fusion mit einem Oberflächenprotein von Bakterien oder Bakteriophagen exprimiert wird.
Bakteriophagen sind für diese Art von Screening attraktive, mit Prokaryoten verwandte Organismen. Im Allgemeinen ist ihre Oberfläche eine relativ einfache Struktur, sie können leicht in großer Anzahl gezüchtet werden, sie sind der praktischen Handhabung zugänglich, die bei vielen potentiellen Massen-Screeningprogrammen erforderlich ist, und sie tragen gentische Informationen für ihre eigene Synthese innerhalb einer kleinen, einfachen Packung. Die Schwierigkeit besteht darin, das Problem zu lösen, wie Bakteriophagen auf diese Weise einzusetzen sind. Die Patentanmeldung Nr. WO 88/06630 der Genex Corporation schlägt vor, dass Bakteriophage λ ein geeignetes Vehikel für die Expression von Antikörpermolekülen ist, aber sie liefern keine Lehre, die es ermöglicht, die allgemeine Idee durchzuführen. Beispielsweise zeigt die WO 88/06630 nicht, dass irgendwelche Sequenzen (a) als Fusion mit Gen V exprimiert worden sind; (b) an der Oberfläche von λ exprimiert worden sind; und (c) so exprimiert worden sind, dass das Protein seine biologische Aktivität beibehält. Weiters gibt es keine Lehren dazu, wie auf geeignete Fusionen zu screenen ist. Auch wird, da die λ-Virions innerhalb der Zelle assembliert werden, das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert und seine Inaktivität vorhergesagt. Bass et al. beschrieben im Dezember 1990 das Löschen eines Teils von Gen III des filamentösen Bakteriophagen M13 und das Insertieren der Kodiersequenz für menschliches Wachstumshormon (hGH) in die N-terminale Stelle des Gens. Das von M13 freigelegte Wachstumshormon erwies sich als funktionell. (S. Bass et al., Proteins, Structure, Function and Genetics 8, 309-314 (1990)). Eine funktionelle Kopie von Gen III war außerdem immer vorhanden, wenn diese Fusion exprimiert wurde. Die Patentanmeldung WO 90/02809 der Protein Engineering Corportion schlägt das Insertieren der Kodiersequenz für Rinder-Pankreas-Trypsininhibitor (BPTI) in Gen VIII von M13 vor. Der Vorschlag erwies sich jedoch als nicht wirksam. Beispielsweise gibt es keine Demonstration der Expression von BPTI-Seuqenzen als Fusionen mit Protein VIII und Freiliegen an der Oberfläche von M13. Weiters lehrt dieses Dokument, dass es, wenn eine Fusion mit Gen III durchgeführt wird, notwendig ist, eine zweite synthetische Kopie von Gen III zu verwenden, so dass irgendein unverändertes Gen III-Protein vorhanden ist. Bei den Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung ist das nicht der Fall. Bei Ausführungsformen, wo Phagemid mit M13K07-Phagen mit Gen III-Deletion erhalten wird, ist kein unverändertes Gen III vorhanden.
Die WO 90/02809 lehrt auch, dass Phagemide, die nicht das volle Genom von M13 enthalten und Befreiung durch Coinfektion mit Helfer-Phagen erfordern, nicht für diese Zwecke geeignet sind, weil Coinfektion zu Rekombination führen könnte.
Bei allen Ausführungsformen, bei denen die vorliegende Anmelderin Phagemide verwendet hat, wurde ein Helfer-Phage eingesetzt, und die einzigen Sequenzen, die von fi lamentösen Bakteriophagen in den Phagemiden stammen, sind die Replikationsursprungs- und die Gen III-Sequenzen.
Die WO 90/02809 lehrt auch, dass für die dortigen Verfahren Informationen, wie z. B. die Nukleotidsequenz des Ausgangsmoleküls und deren dreidimensionale Struktur, erforderlich war. Die Verwendung eines bereits bestehenden Repertoires von Bindungsmolekülen zur Selektion bezüglich eines Bindungselements, wie hierin geoffenbart, beispielsweise unter Verwendung eines Immunglobulin-Genrepertoires von Tieren, wurde nicht geoffenbart. Weiters erörtern sie keinerlei Begünstigung der Vielfältigkeit ihrer Bindungsmoleküle in natürlichen Variationsblöcken, wie z. B. CDRs von Immunglobulinen, zur Begünstigung der Erzeugung verbesserter Moleküle und Verhinderung ungünstiger Variationen. Die WO 90/02809 schließt auch spezifisch die Anwendung dieses Verfahrens auf die Produktion von scFv-Molekülen aus.
In beiden oben erörterten Patenten (WO 88/06630 und WO 90/02809) ist das zur Freilegung vorgeschlagene Protein eine einzelne Polypeptidkette. Es gibt keine Offenbarung eines Verfahrens zur Freilegung eines dinieren Moleküls durch Expression eines Monomers als Fusion mit einem Capsidprotein und des anderen Proteins in freier Form.
Eine weitere im Mai 1991 veröffentlichte Offenbarung beschreibt die Insertion in Gen VIII von M13, die Kodiersequenzen für eine der beiden Ketten des Fab-Abschnitts eines Antikörpers mit Coexpression der anderen Form als Plasmid. Es wurde gezeigt, dass die beiden Ketten als funktionelles Fab-Fragment an der Oberfläche des Phagen exprimiert werden (A. S. Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366 (1991)). Es erfolgte keine Offenbarung der Stelle der Insertion in Gen VIII, und für das Assay auf pAb-Bindungsaktivität mittels ELISA wurde ein für Antikörper-L-Kette und nicht für Phagen spezifisches Reagens eingesetzt. Eine weitere, im März 1991 veröffentlichte Offenbarung beschreibt die Insertion eines Fragments des AIDS-Virus-Proteins gag in den N-terminalen Abschnitt von Gen III des Bakteriophagen fd. Die Expression des gag-Proteins wurde durch immunologische Verfahren detektiert, es wurde aber nicht gezeigt, ob das Protein in funktioneller Form exprimiert wurde oder nicht (Tsunetsugu-Yokata Y et al., Gene 99, 261-265 (1991)).
Das Problem, wie Bakteriophagen auf diese Weise einzusetzen sind, ist tatsächlich eine schwierige Frage. Das Protein muss auf solche Weise in den Phagen insertiert werden, dass die Integrität des Phagenüberzugs nicht beeinträchtigt wird, und das Protein selbst sollte seine biologische Aktivität in Bezug auf Antigenbindung funktionell beibehalten. Daher sollte sich das Protein der Wahl, wenn es ein Antikörper ist, effizient und korrekt falten und für die Antigenbindung bereitgestellt werden. Die Lösung des Problems für Antikörpermoleküle und -fragmente würde ebenfalls ein allgemeines Verfahren für jegliches Biomolekül bereitstellen, das ein Element eines spezifischen Bindungspaares ist, z. B. Rezeptormoleküle und Enzyme.
Überraschenderweise waren die Anmelder in der Lage, einen Bakteriophagen zu konstruieren, der an seiner Oberfläche ein großes, biologisch funktionelles Bindungsmolekül (z. B. Antikörperfragmente sowie Enzyme und Rezeptoren) exprimiert und freilegt und dabei intakt und infektiös bleibt. Das wird in der WO 92/01047 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Lesern des vorliegenden Dokuments wird empfohlen, bezüglich einer detaillierten Erklärung vieler der Verfahren, die bei den hierin beschriebenen Versuchen angewandt werden, die WO 92/01047 zu konsultieren. Die Anmelder haben die Struktur, die ein Virusteilchen und ein Bindungsmolekül umfasst, das an der viralen Oberfläche freiliegt, als "Packung" bezeichnet. Wenn das Bindungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperderivat oder ein Fragment, oder aber eine Domäne ist, die zu einer Immunglobulindomäne homolog ist, bezeichnen die Anmelder die Packung als "Phagenantikörper" (pAb). Außer wenn der Kontext etwas anderes verlangt, sollte der Begriff Phagenantikörper, wenn er allgemein verwendet wird, jedoch auch so interpretiert werden, dass er sich auf jede Packung bezieht, die ein Virusteilchen und ein biologisch funktionelles Bindungsmolekül umfasst, das an der viralen Oberfläche freiliegt.
pAbs haben eine Bandbreite von Anwendungen bei der Selektion von Antikörpergenen, die für Antigen-Bindungsaktivität kodieren. Beispielsweise könnten pAbs zum Klonieren und die Befreiung von Hybridomen (R. Orlandi et al., PNAS 86, 3833-3837 (1989)) und beim Screenen großer kombinatorischer Sammlungen (wie bei W. D. Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989)) verwendet werden. Insbesondere können Selektionsrunden, bei denen pAbs verwendet werden, dazu beitragen, die Antikörper mit höherer Affinität aus den letzteren Sammlungen zu befreien. Es kann vorzuziehen sein, kleine Sammlungen zu screenen, die von Antigen-selektierten Zellen stammen (P. Casali et al., Science 234, 476-479 (1986)), um die ursprünglichen VH/VL-Paare zu befreien, welche die Fv-Region eines Antikörpers umfassen. Die Verwendung von pAbs kann auch die Konstruktion vollständig synthetischer Antikörper ermöglichen. Weiters können Antikörper hergestellt werden, die einige synthetische Sequenzen, z. B. CDRs, und einige natürlich abgeleitete Sequenzen aufweisen. Beispielsweise könnten V-Gen-Repertoires in vitro hergestellt werden, indem nicht-umgeordnete V-Gene mit D- und -Segmenten kombiniert werden. Beispiele für pAbs könnten dann durch Bindung an Antigen selektiert, in vitro in den Antigen-Bindungsschleifen oder V-Domänen-Rahmenbereichen hypermutiert und weiteren Runden von Selektion und Mutagenese unterzogen werden.
Wie zuvor erörtert, verlieren getrennte H- und L-Ketten-Sammlungen ihre ursprüngliche Paarung zwischen den Ketten. Es ist schwer, eine ausreichend große Sammlung herzustellen und auf eine besonders vorteilhafte Kombination von H- und L-Ketten zu screenen.
Beispielsweise gibt es in einer Maus etwa 10&sup7; mögliche H-Ketten und 10&sup7; mögliche L- Ketten. Daher gibt es 10¹&sup4; mögliche Kombinationen von H- und L-Ketten, und um auf einen Faktor wie diese Anzahl an Kombinationen zu testen, müsste man eine Sammlung aus etwa 10&sup4; Klonen erzeugen und screenen.
Die vorliegende Erfindung bietet Ansätze, die dieses Problem erleichtern.
Gemäß einem Ansatz wird eine Sammlung erzeugt, die so groß wie praktisch möglich ist und die möglichst viele der 10¹&sup4; potentiellen Kombinationen exprimiert, Dank der Expression der H- und L-Ketten an der Oberfläche des Phagen ist es jedoch einigermaßen praktikabel, die gewünschte Kombination aus allen erzeugten Kombinationen durch Affinitätstechniken zu selektieren (eine Beschreibung der Selektionsformate erfolgt später).
Gemäß einem Ansatz (der von der Anmelderin als polykombinatorischer Ansatz bezeichnet wird) wird eine große Sammlung aus zwei kleineren Sammlungen erzeugt, um die gewünschte Kombination zu selektieren. Der Ansatz umfasst die Erzeugung von: (i) einer ersten Sammlung aus beispielsweise etwa 10&sup7; H-Ketten, die auf einem Bakteriophagen (als Fusion mit dem Protein, für welches das Gen III kodiert) freiliegen, der beispielsweise gegen Tetracyclin resistent ist; und (ii) einer zweiten Sammlung aus beispielsweise etwa 10&sup7; L-Ketten, bei denen die Kodiersequenzen für diese Leichtketten innerhalb eines Plasmidvektors vorliegen und im periplasmatischen Raum eines Wirtsbakteriums exprimiert werden. Die erste Sammlung wird dann eingesetzt, um das Bakterium zu infizieren, das die zweite Sammlung enthält, um 10¹&sup4; Kombinationen aus H- und L-Ketten an der Oberfläche des resultierenden Phagen im bakteriellen Überstand bereitzustellen.
Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass zwei getrennte Sammlungen mit beispielsweise 10&sup7; erzeugt werden, so dass 10¹&sup4; Kombinationen entstehen. Die Erzeugung einer 10&sup7;-Sammlung ist eine praktische Möglichkeit.
Die 10¹&sup4; Kombinationen werden dann Selektion unterzogen (siehe nachstehende Beschreibung der Selektionformate), wie gemäß vorliegender Anmeldung geoffenbart. Diese Selektion ergibt dann eine Population aus Phagen, die eine spezielle Kombination aus H- und L-Ketten mit der gewünschten Spezifität freilegen. Die selektierten Phagen enthalten jedoch nur DNA, die für einen Partner der gepaarten H- und L-Ketten kodiert. Das die Population enthaltende Probeneluat wird dann in zwei Abschnitte unterteilt. Ein erster Abschnitt wird beispielsweise auf Tetracyclinplatten vermehrt, um jene Bakteriophagen zu selektieren, die DNA enthalten, die für H-Ketten kodiert, die an der gewünschten Antigenbindung beteiligt sind. Ein zweiter Abschnitt wird beispielsweise auf Ampicillinplatten vermehrt, um jene Bakteriophagen zu selektieren, die Phagemid-DNA enthalten, die für L-Ketten kodiert, die an der gewünschten Antigenbindung beteiligt sind. Ein Satz von Kolonien von einzeln isolierten Klonen, z. B. von den Tetracyclinplatten, wird dann eingesetzt, um spezifische Kolonien beispielsweise von den Ampicillinplatten zu infizieren. Das ergibt Bakteriophagen, die spezifische Kombinationen der H- und L-Ketten exprimieren, die danach auf Antigenbindung untersucht werden können.
Gemäß einem anderen Ansatz (der von der Anmelderin als hierarchischer Doppelkombinationsansatz oder als Ketten-Umgruppierung bezeichnet wird) wird eine einzelne Kolonie entweder vom H- oder L-Kettenklon, der durch Vermehrung auf den antibiotischen Platten selektiert wurde, eingesetzt, um eine vollständige Sammlung von Klonen zu infizieren, die für die andere Kette (H oder L) kodieren. Die Selektion erfolgt wie oben beschrieben. Das begünstigt die Isolierung der vorteilhaftesten Kombination.
Phagemide sind oben erwähnt worden. Die Anmelder haben erkannt und gezeigt, dass Phagemide in vielen Fällen gegenüber Phagen bevorzugt werden, um Antikörper zu klonieren, weil es einfacher ist, sie einzusetzen, um umfassendere Sammlungen des Immunrepertoires zu erzeugen. Der Grund dafür ist, dass die Phagemid-DNA etwa 100- mal effizienter Bakterien transformiert als Bakteriophagen-DNA (siehe Beispiel 19 der WO 92/01047). Auch ermöglicht die Verwendung von Phagemiden, die Anzahl von Gen III-Bindungsmolekül-Fusionsproteinen zu variieren, die an der Oberfläche des Bakteriophagen freiliegen (siehe Beispiel 17 der WO 92/01047). Beispielsweise bestimmt bei einem System, das eine bakterielle Zelle umfasst, die ein Phagemid enthält, das für ein Gen III-Fusionsprotein kodiert und mit einem Helferphagen infiziert ist, die Induktion der Expression des Gen III-Fusionsproteins in unterschiedlichem Ausmaß die Anzahl der Gen III-Fusionsproteine, die im Raum vorhanden ist, der nach der Superinfek tion zwischen der inneren und der äußeren bakteriellen Membran definiert ist. Das bestimmt das Verhältnis zwischen Gen III-Fusionsprotein und nativem Gen III-Protein, die vom zusammengestellten Phagen freigelegt werden.
Die Expression eines einzelnen Fusionsproteins pro Virion kann die Selektion von Antikörperspezifitäten auf Basis der Affinität unterstützen, indem die "Aviditäts"wirkung vermieden wird, bei der ein Phage, der zwei Kopien eines Antikörpers mit niedriger Affinität exprimiert, die gleiche scheinbare Affinität aufweisen würde wie ein Phage, der eine Kopie eines Antikörpers mit höherer Affinität exprimiert. In manchen Fällen ist es jedoch wichtig, alle Gen III-Moleküle freizulegen, die durch Superinfektion von Zellen abgeleitet wurden, die Phagemide enthalten, um Fusionen zu erreichen (z. B. um Bindungsmoleküle mit geringer Affinität zu selektieren oder die Sensitivität im ELISA zu verbessern). Eine Möglichkeit, dies zu tun, besteht in der Superinfektion mit einem Bakteriophagen, der ein defektives Gen III enthält. Die Anmelder haben daher einen Phagen entwickelt und eingesetzt, dessen Gen III gelöscht ist; wie in der WO 92/01047 beschrieben.
Die Demonstration, dass eine funktionelle Antigen-Bindungsdomäne an der Phagenoberfläche freiliegen kann, hat Implikationen über die Konstruktion neuer Antikörper hinaus. Wenn beispielsweise andere Proteindomänen an der Oberfläche eines Phagen freigelegt werden können, könnten Phagenvektoren eingesetzt werden, um Gene zu klonieren und anhand der Bindungseigenschaften des freigelegten Proteins zu selektieren. Weiters könnten Varianten von Proteinen, einschließlich Epitopsammlungen, die in die Oberfläche des Proteins eingebaut sind, hergestellt und problemlos auf Bindungsaktivitäten selektiert werden. Tatsächlich könnten andere Proteinstrukturen als "neue" Antikörper dienen.
Die Technik bietet die Möglichkeit, Antikörper gemäß ersten Prinzipien zu konstruieren, wobei der Strukturrahmen genutzt wird, auf dem sich die Antigenbindungsschleifen falten. Im Allgemeinen weisen diese Schleifen eine begrenzte Anzahl an Konformationen auf, die durch alternative Schleifenkombinationen und durch diverse Seitenketten eine Vielfalt von Bindungsstellen erzeugen. Jüngere Erfolge bei der Modellierung von Antigenbindungstellen stimmen optimistisch für die de novo-Konstruktion. In jedem Fall ist eine hohe Auflösungsstruktur des Antigens erforderlich. Der Ansatz ist jedoch attraktiv, was beispielsweise die Herstellung katalytischer Antikörper betrifft, insbesondere bei kleinen Substraten. Hier können Seitenketten oder Bindungstellen für prosthetische Gruppen eingebaut werden, nicht nur, um selektiv an den Übergangszustand des Substrats zu binden, sondern auch, um direkt an der Bildung oder Aufbrechung von Bindungen teilzunehmen. Die einzige Frage ist, ob die Antikörperstruktur, die für Bindung spezialisiert ist, der beste Ausgangspunkt für den Bau von Katalysatoren ist. Echte Enzymstrukturen, wie z. B. das Triosephosphatisomerase-(TiM-)Barrel, sind möglicherweise besser geeignet. Wie Antikörper weisen auch TIM-Enzyme eine Rahmenstruktur (ein Barrel von β-Strängen und α-Helices) und Schleifen auf, um Substrat zu binden. Viele Enzyme mit einer Vielfalt katalytischer Eigenschaften basieren auf dieser Struktur, und die Schleife kann unabhängig von den Rahmen manipuliert werden, um neue katalytische und Bindungs-Eigenschaften zu konstruieren. Das Phagenselektionssystem, wie gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt, kann eingesetzt werden, um bezüglich Antigenbindungsaktivitäten zu selektieren, und die so selektierten CDR-Schleifen können entweder auf einem Antikörperrahmen oder einem TIM-Barrel-Rahmen eingesetzt werden. Schleifen, die beispielsweise auf einem TIM-Barrel-Rahmen angeordnet sind, könnten durch Mutagenese weiter modifiziert und weiterer Selektion unterzogen werden. Daher ist es nicht notwendig, in einem einzigen Schritt auf Hochaffinitätsbindungsaktivitäten zu selektieren. Die Strategie des Immunsystems, in dem sich niedrige Affinität zu hoher Affinität entwickelt, scheint realistischer und kann unter Einsatz der vorliegenden Erfindung nachgeahmt werden.
Eine Klasse von Molekülen, die bei dieser Art von Anwendung nützlich sein könnte, sind Rezeptoren. Beispielsweise könnte ein spezifischer Rezeptor an der Oberfläche des Phagen freiliegen, so dass er sich an seinen Liganden bindet. Der Rezeptor könnte dann beispielsweise durch Mutagenese in vitro modifiziert und Varianten mit höherer Bin dungsaffinität für den Liganden selektiert werden. Die Selektion kann nach einem oder mehreren der nachstehend beschriebenen Formate durchgeführt werden.
Alternativ dazu könnte der Phagenrezeptor als Basis eines raschen Screeningsystems für die Bindung von Liganden, veränderten Liganden oder potentiellen Arzneimittel-Kandidaten eingesetzt werden. Die Vorteile dieses Systems, nämlich einfaches Klonieren, zweckmäßige Expression, Standard-Reagenzien und leichte Handhabung machen die Arzneimittel-Screening-Anwendung besonders attraktiv. Im Kontext dieser Erörterung ist mit Rezeptor ein Molekül gemeint, das sich an einen spezifischen oder eine Gruppe spezifischer Liganden bindet. Der natürliche Rezeptor könnte an der Oberfläche einer Population von Zellen exprimiert werden, oder es könnte sich um die extramolekulare Domäne eines solchen Moleküls handeln (gleichgültig, ob eine solche Form natürlich vorkommt oder nicht), oder ein lösliches Molekül, das im Plasma oder innerhalb einer Zelle oder eines Organs eine natürliche Bindungsfunktion erfüllt.
Eine weitere Möglichkeit ist die Freilegung eines Enzymmoleküls oder einer aktiven Stelle eines Enzymmoleküls an der Oberfläche eines Phagen (siehe Beispiele 11, 12, 30, 31; 32 und 36 der WO 92/01047). Sobald das Phagenenzym exprimiert wurde, kann es durch Affinitätschromatographie selektiert werden, beispielsweise auf Säulen, die mit Übergangszustandsanalogen derivatisiert sind. Wenn ein Enzym mit einer anderen oder modifizierten Spezifität gewünscht wird, kann es möglich sein, ein Enzym zu mutieren, das als Fusion auf Bakteriophagen freigelegt wird, und dann auf einer Säule zu selektieren, die mit einem Analog derivatisiert ist, das so gewählt ist, dass es eine höhere Affinität für ein Enzym mit einer gewünschten modifizierten Spezifität aufweist.
Obwohl die Anmelder in der vorliegenden Anmeldung immer die Möglichkeit des Screenens auf höhere Affinitätsvarianten von pAbs erörtern, räumen sie ein, dass bei manchen Anwendungen, beispielsweise Niederaffinitätschromagraphie (S. Ohlson et al., Anal. Biochem. 169, 204-208 (1988)) wünschenswert sein kann, Varianten mit niedrigerer Affinität zu isolieren.
pAbs ermöglichen auch die Selektion von Antikörpern zwecks verbesserter Stabilität. Bei vielen Antikörpern ist festgestellt worden, dass die Ausbeute und die Stabilität verbessert werden, wenn die Antikörper bei 30ºC und nicht bei 37ºC exprimiert werden. Wenn pAbs bei 37ºC freigelegt werden, stehen nur jene, die stabil sind, für die Affinitätsselektion zur Verfügung. Wenn Antikörper in vivo für Therapie- oder Diagnosezwecke eingesetzt werden sollen, verlängert die erhöhte Stabilität die Halbwertszeit von Antikörpern im Kreislauf.
Obwohl die Stabilität für alle Antikörper und Antikörperdomänen wichtig ist, die unter Verwendung von Phagen selektiert werden, ist sie besonders wichtig für die Selektion von Fv-Fragmenten, die durch nicht-kovalente Bindung von VH- und VL-Fragmenten gebildet werden. Fv-Fragmente haben die Tendenz zur Dissoziation und weisen im Vergleich zu ganzen Antikörpern eine stark verringerte Halbwertszeit auf. Fv-Fragmente werden an der Oberfläche von Phagen durch die Assoziation einer Kette, die als Gen III- Proteinfusion exprimiert wird, mit der komplementären Kette freigelegt, die als lösliches Fragment exprimiert wird. Wenn Paare von Ketten hohe Tendenz zur Dissoziation aufweisen, ist es viel weniger wahrscheinlich, dass sie als pAbs selektiert werden. Daher wird die Population an Paaren angereichert, die stabil assoziieren. Obwohl die Dissoziation bei Fab-Fragmenten ein geringeres Problem darstellt, findet Selektion auch bei Fab-Fragmenten statt, die stabil assoziieren. pAbs ermöglichen die Selektion nach Stabilität gegen Proteaseangriff. Nur jene pAbs, die nicht durch Proteasen gespalten werden, können ihren Liganden binden, und daher werden Phagenpopulationen an jenen angereichert, die stabile Antikörperdomänen freilegen.
Die Technik zur Freilegung von Bindungsmolekülen an der Phagenoberfläche kann auch als primäres Kloniersystem eingesetzt werden. Beispielsweise kann eine cDNA- Sammlung konstruiert und in den Bakteriophagen insertiert werden, und diese Phagensammlung kann auf die Fähigkeit zur Bindung eines Liganden gescreent werden. Die Ligand/Bindungsmolekül-Kombination könnte jedes Paar von Molekülen umfassen, die die Fähigkeit besitzen, sich spezifisch aneinander zu binden, z. B. Rezeptor/Ligand, Enzym/Substrat (oder Analog), Nukleinsäure-Bindungsprotein/Nukleinsäure usw. Wenn ein Element des komplementären Paares verfügbar ist, kann das ein bevorzugter Weg sein, um einen Klon für das andere Element des Paares zu isolieren.
Es ist oft notwendig, die Diversität oder Vielfältigkeit einer Population von Genen zu erhöhen, die zur Freilegung ihrer Proteine auf Phagen kloniert wurden, oder eine einzelne Nukleotidsequenz zu mutieren. Obwohl für beide Zwecke Mutagenesetechniken in vitro oder in vivo eingesetzt werden können, wäre die Verwendung von Mutatorstämmen ein besonders geeignetes Verfahren. Ein Mutatorstamm ist ein Stamm, der einen genetischen Defekt enthält, der bewirkt, dass darin replizierte DNA in Bezug auf ihre Stamm- DNA mutiert wird. Daher wird, wenn eine Population von Genen, wie z. B. Gen III- Fusionen, in diese Stämme eingeführt wird, diese weiter diversifiziert und kann dann, falls gewünscht, zur Freilegung und Selektion in einen Nicht-Mutator-Stamm transferiert werden.

Zielgerichteter Gentransfer

Ein nützlicher und neuer Satz von Anwendungen nutzt das Bindungsprotein auf dem Phagen, um das Phagengenom auf eine bestimmte Zelle oder Gruppe von Zellen abzuzielen. Beispielsweise könnte ein pAb, der für ein Zelloberflächenmolekül spezifisch ist, eingesetzt werden, um sich über das Oberflächenmolekül an die Zielzelle zu binden. Der Phage könnte dann entweder durch die Wirkung des Rezeptors selbst oder als Ergebnis eines anderen Ereignisses (z. B. einer elektrischen Entladung, wie bei der Elektroporationstechnik) internalisiert werden. Das Phagengenom würde dann exprimiert werden, wenn die relevanten Kontrollsignale (für Transkription und Translation und gegebenenfalls Replikation) vorhanden wären. Das wäre besonders nützlich, wenn das Phagengenom eine Sequenz enthielte, deren Expression in der Zielzelle gewünscht würde (gemeinsam mit den geeigneten Expressionskontrollsequenzen). Eine nützliche Sequenz könnte der Rezipientenzelle Antibiotikaresistenz verleihen oder die Zelle durch die Expression ihres Produktes markieren (z. B. wenn die Sequenz ein detektierbares Genpro dukt, wie z. B. Luciferase, exprimiert, siehe M. White et al., Techniques 2(4), 194-201 (1990)), oder eine spezielle Eigenschaft auf die Zielzelle übertragen (z. B. wenn die Zielzelle eine Tumorzelle wäre und die neue Sequenz die Expression eines Tumor unterdrückenden Gens steuern würde), oder ein Antisense-Konstrukt exprimieren, das so konstruiert ist, dass es ein Gen oder einen Satz Gene in der Zielzelle abschaltet, oder ein Gen oder Gen-Produkt, das so konstruiert ist, dass es für die Zielzelle toxisch ist.
Alternativ dazu kann für die Sequenz, deren Expression in der Zielzelle gewünscht wird, auf einem Phagemid kodiert werden. Die Phagemid-DNA kann dann in einen Phagen eingebaut werden, der einen Antikörper freilegt, der für einen Zelloberflächenrezeptor spezifisch ist. Beispielsweise kann der Einbau durch Superinfektion von Bakterien erfolgen, die das Phagemid enthalten, mit einem Helfer-Phagen, dessen Genom für das Antikörperfragment kodiert, das für die Zielzelle spezifisch ist. Die Packung wird dann eingesetzt, um das Phagemid auf die Zielzelle abzuzielen.
Für diese Technik des "zielgerichteten Gentransfers" gibt es eine Reihe von Anwendungen in der Forschung und auch in der Therapie und Diagnose. Beispielsweise zielt die Gentherapie oft darauf ab, das Ersatzgen auf einen spezifischen Zelltyp abzuzielen, der in seiner Aktivität defizient ist. Das Targetting von pAbs stellt eine Möglichkeit dar, dies zu erreichen.
In der Diagnose sind Phagen, die für bestimmte Bakterien oder Gruppen von Bakterien spezifisch sind, eingesetzt worden, um Markergene, z. B. Luciferase, auf den bakteriellen Wirt abzuzielen (siehe beispielsweise S. Ulitzer und J. Kuhn, EP-A-85303913.9). Wenn der Wirtsbereich des Phagen geeignet ist, werden nur jene Bakterien, auf die getestet wird, durch den Phagen infiziert, exprimieren das Luciferasegen und werden anhand des Lichts detektiert, das sie aussenden. Dieses System wird eingesetzt, um die Gegenwart von Salmonella nachzuweisen. Ein Hauptproblem bei diesem Ansatz ist die anfängliche Isolierung eines Bakteriophagen mit dem korrekten Wirtsbereich und dann das Klonieren eines Luciferase-Genkassette in diesen Phagen, so dass er funktionell ist. Das pAb-System ermöglicht, dass die Luciferasekassette in ein gut charakterisiertes System (einen filamentösen Phagen) kloniert wird, und ermöglicht die einfache Selektion eines geeigneten Wirtsbereichs durch Modifizieren der Antikörper- (oder anderen Bindungsmolekül-) Spezifität, für die der pAb kodiert.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes konnten auch neue Selektionssysteme und Assayformate entwickeln, die von den einzigartigen Eigenschaften dieser replizierbaren genetischen Freilegungspackungen abhängen, z. B. pAbs.

TERMINOLOGIE

Ein Großteil der in diesem Abschnitt erörterten Terminologie ist im Text an entsprechender Stelle erwähnt worden.

Spezifisches Bindungspaar (sbp)

Dieser Ausdruck beschreibt ein Molekülpaar (von denen jedes ein Element eines spezifischen Bindungspaares ist), die natürlich abgeleitet oder synthetisch produziert sind. Eines des Paares von Molekülen weist einen Bereich an seiner Oberfläche oder einen Hohlraum auf, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist, so dass das Paar die Eigenschaft hat, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Typen spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat und IgG-Protein A.

Multimeres Element

Dieser Ausdruck beschreibt ein erstes Polypeptid, das mit zumindest einem zweiten Polypeptid assoziiert, wenn die Polypeptide in freier Form und/oder an der Oberfläche eines Substrats exprimiert werden. Das Substrat kann von einem Bakteriophagen bereitgestellt werden. Wenn zwei assoziierte Polypeptide vorhanden sind, ist der assoziierte Polypeptidkomplex ein Dimer, wenn es drei sind, ein Trimer usw. Das Dimer, Trimer, Multimer usw. oder das multimere Element kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares umfassen.
Beispiele für multimere Elemente sind Schwerdomänen auf Basis eines Immunglobulin- Moleküls, Leichtdomänen auf Basis eines Immunglobulin-Moleküls und T-Zellen-Rezeptor-Subeinheiten.

Replizierbare genetische Freilegungspackung ("replicable genetic display package", rgdp)

Dieser Ausdruck beschreibt ein biologisches Teilchen, das genetische Information aufweist, die das Teilchen mit der Fähigkeit zu replizieren versieht. Das Teilchen kann an seiner Oberfläche zumindest Teil eines Polypeptids freilegen. Für das Polypeptid kann durch gentische Information kodiert werden, die dem Teilchen innewohnt und/oder künstlich in das Teilchen oder einen Vorläufer davon eingepflanzt wird. Das freigelegte Polypeptid kann ein beliebiges Element eines spezifischen Bindungspaares sein, z. B. eine Schwer- oder Leichtkettendomäne, basierend auf einem Immunglobulinmolekül, ein Enzym oder ein Rezeptor usw.
Das Teilchen ist ein sekretierter Bakteriophage, wie fd oder M13.

Packung

Dieser Ausdruck beschreibt eine replizierbare genetische Freilegungspackung, in der das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaares an seiner Oberfläche freilegt. Die Packung kann ein Bakteriophage sein, der eine Antigen-Bindungdsdomäne an seiner Oberfläche freilegt. Diese Art von Packung wird als Phagen-Antikörper (pAb) bezeichnet.

Antikörper

Dieser Ausdruck beschreibt ein Immunglobulin, das entweder natürlich oder teilweise oder vollständig synthetisch erzeugt ist. Der Begriff deckt auch jedes Protein ab, das eine Bindungsdomäne aufweist, die zu einer Immunglobulin-Bindungsdomäne homolog ist. Diese Proteine können von natürlichen Quellen stammen oder teilweise oder vollständig synthetisch hergestellt werden.
Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und die Fab-, F(ab¹)&sub2;-, scFv-, Fv-, dAb- und Fd-Fragmente.

Immunglobulin-Überfamilie

Dieser Ausdruck beschreibt eine Familie von Polypeptiden, deren Elemente zumindest eine Domäne mit einer Struktur aufweisen, die mit jener einer variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulinmolekülen verwandt ist. Die Domäne enthält zwei β- Faltblätter und üblicherweise eine konserwierte Disulfidbindung (siehe A. F. Williams und A. N. Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405 (1988)).
Beispiele für Mitglieder einer Immunglobulin-Superfamilie sind CD4, von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGFR) und interzellulares Adhäsionsmolekül (ICAM). Außer, wo der Kontext anderes verlangt, umfassen Verweise auf Immunglobuline und Immunglobulin-Homologe in dieser Anmeldung Elemente der Immunglobulin- Superfamilie und Homologe davon.

Homologe

Dieser Begriff bezeichnet Polypeptide mit den gleichen oder konserwierten Resten an einer entsprechenden Position in ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur. Der Begriff umfasst auch zwei oder mehr Nukleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptide kodieren.
Beispiele für homologe Peptide sind die Immunglobulin-Isotypen.

Funktionell

In Bezug auf ein sbp-Element, das an der Oberfläche eines rgdp freigelegt ist, bedeutet dieser Begriff, dass das sbp-Element in einer gefalteten Form vorliegt, in der seine spezifische Bindungsdomäne für sein komplementäres sbp-Element die gleiche wie oder stark analog zu seiner nativen Konfiguration ist, wodurch es ähnliche Spezifität für das komplementäre sbp-Element aufweist. In dieser Hinsicht unterscheidet es sich von den Peptiden von Smith et al., s. o., die keine definitive gefaltete Konfiguration aufweisen und eine Vielzahl von Konfigurationen einnehmen können, die durch die komplementären Elemente bestimmt sind, mit denen sie in Kontakt gebracht werden können.

Genetisch diverse bzw. vielfältige (in den Ansprüchen auch als "andersartig" bezeichnete) Population

In Verbindung mit sbp-Elementen oder Polypeptid-Komponenten davon bezieht sich dieser Ausdruck nicht nur auf Diversität, die in der natürlichen Population von Zellen oder Organismen vorliegen kann, sondern auch auf Diversität, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo erzeugt werden kann.
Mutation in vitro kann beispielsweise Zufallsmutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden umfassen, die Zufallsmutationen der Sequenz aufweisen, die variiert werden soll. Für Mutagenese in vivo können beispielsweise Mutatorstämme von Wirtsmikroorganismen eingesetzt werden, um die DNA zu beherbergen (siehe Beispiel 38 der WO 92/01047). Das Wort "Population" selbst kann gebraucht werden, um eine Vielzahl von beispielsweise Polypeptidketten zu bezeichnen, die nicht genetisch divers, d. h. alle gleich sind.

Domäne

Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, der in sich selbst und unabhängig von anderen Teilen des gleichen Proteins und unabhängig von einem komplementären Bindungselement gefaltet ist.

Gefaltete Einheit

Dabei handelt es sich um eine spezifische Kombination aus einer α-Helix- und/oder β- Strang- und/oder β-Windungsstruktur. Domänen und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren zusammenbringen, die in der Primärstruktur nicht benachbart sind.

Freie Form

Dieser Ausdruck beschreibt den Zustand eines Polypeptids, das nicht von einer replizierbaren genetischen Freilegungspackung freigelegt ist.

Bedingt defektiv

Dieser Begriff beschreibt ein Gen, das unter einem Satz von Bedingungen ein bestimmtes Polypeptid nicht, unter einem anderen Satz von Bedingungen aber schon exprimiert. Ein Beispiel ist ein Gen, das eine Amber-Mutation enthält, die in nicht-suppressiven bzw. suppressiven Wirten exprimiert wird.
Alternativ dazu kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter einem Satz von Bedingungen defektiv ist, unter einem anderen Satz jedoch nicht. Ein Beispiel ist ein Gen mit einer temperatursensitiven Mutation.

Unterdrückbares Translationsstopcodon

Dieser Begriff beschreibt ein Codon, das die Translation von Nukleotidsequenzen stromab vom Codon unter einem Satz von Bedingungen zulässt, wobei die Translation jedoch unter einem anderen Satz von Bedingungen am Codon endet. Beispiele für die unterdrückbaren Translationsstopcodons sind die Amber-, Ocker- und Opal-Codons.

Mutatorstamm

Dabei handelt es sich um eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, dass darin replizierte DNA in Bezug auf ihre Stamm-DNA mutiert wird. Beispiele für Mutator-Stämme sind NR9046mutD5 und NR9046 mut T1 (siehe Beispiel 38).

Helfer-Phage

Dies ist ein Phage, der eingesetzt wird, um Zellen zu infizieren, die ein defektives Phagengenom enthalten, und der die Funktion erfüllt, den Defekt zu komplementieren. Das defektive Phagengenom kann ein Phagemid oder ein Phage mit bestimmter Funktion sein, die für entfernte Genseugenzen kodiert. Beispiele für Helfer-Phagen sind M13K07, M13K07 Gen III Nr. 3; und ein Phage, der ein Bindungsmolekül freilegt oder dafür kodiert, das mit einem Capsidprotein fusioniert ist.

Vektor

Dabei handelt es sich um ein zur Replikation in einem Wirtsorganismus fähiges DNA- Molekül, in das ein Gen insertiert wird, um ein rekombiniertes DNA-Molekül zu konstruieren

Phagenvektor

Dabei handelt es sich um einen durch Modifikation eines Phagengertoms abgeleiteten Vektor, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen, aber keinen für ein Plasmid enthält.

Phagemidvektor

Dabei handelt es sich um einen durch Modifikation eines Plasmidgenoms abgeleiteten Vektor, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen sowie den Plasmid-Replikationsursprung enthält.

Sekretiert

Dieser Ausdruck beschreibt ein rgdp oder Molekül, das mit dem Element eines auf dem rgdp freigelegten sbp assoziiert, in dem das sbp-Element und/oder das Molekül gefaltet worden sind und die Packung extern am zellularen Cytosol assembliert worden ist.

Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene

Eine Sammlung natürlich vorkommender Nukleotide, z. B. DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulin-Gene in einem Tier kodieren. Die Sequenzen werden durch die in vivo-Umordnung von beispielsweise V-, D- und J-Segmenten für H-Ketten und beispielsweise die V- und J-Segmente für L-Ketten erzeugt. Alternativ dazu können die Sequenzen aus einer Zelllinie erzeugt werden, die in vitro immunisiert wurde und in der die Umordnung als Reaktion auf die Immunisierung intrazellulär erfolgt. Das Wort "Repertoire" wird eingesetzt, um auf genetische Vielfalt hinzuweisen.

Sammlung

Eine Ansammlung von Nukleotid-, z. B. DNA-, Sequenzen innerhalb von Klonen; oder eine genetisch diverse Ansammlung von Polypeptiden oder spezifischen Bindungspaar- Elementen oder Polypeptiden oder sbp-Elementen, die auf rgdps freiliegen und zur Selektion oder zum Screening fähig sind, um ein einzelnes Polypeptid oder sbp-Elemente oder eine gemischte Population aus Polypeptiden oder sbp-Elementen bereitzustellen.

Repertoire künstlich umgeordneter Immunglobulin-Gene

Eine Ansammlung von Nukleotid-, z. B. DNA-, Sequenzen, die vollständig oder teilweise von einer anderen Quelle als den umgeordneten Immunglobulinsequenzen von einem Tier stammen. Dazu gehören beispielsweise DNA-Sequenzen, die für VH-Domänen kodieren, indem nicht-umgeordnete V-Segmente mit D- und J-Segmenten kombiniert werden, und DNA-Sequenzen, die für VL-Domänen kodieren, indem V- und J-Segmente kombiniert werden.
Ein Teil der oder die gesamten DNA-Sequenzen können durch Oligonukleotid-Synthese abgeleitet werden.

Sekretionsleaderpeptid

Dabei handelt es sich um eine Sequenz von Aminosäuren, die an das N-terminale Ende eines Polypeptids gebunden ist und die Bewegung des Polypeptids aus dem Cytosol heraus steuert.

Eluens

Dabei handelt es sich um eine Lösung, die eingesetzt wird, um die Verbindung zwischen zwei Molekülen zu trennen. Bei der Verbindung kann es sich um nicht-kovalente oder kovalente Bindung(en) handeln. Die beiden Moleküle können Elemente eines sbp sein.

Derivat

Dabei handelt es sich um eine Substanz, die von einem Polypeptid stammt, für das eine DNA innerhalb eines ausgewählten rgdp kodiert. Das Derivat-Polypeptid kann sich vom kodierten Polypeptid durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder durch die Bindung anderer Moleküle an das kodierte Polypeptid unterscheiden. Diese Änderungen können auf Nukleotid- oder Proteinebene erfolgen. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an einen Fc- Schwanz von einer anderen Quelle gebunden wird. Alternativ dazu können Markierungen, wie z. B. Enzyme, Flouresceine usw., beispielsweise an Fab- oder scFv-Fragmente gebunden werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung spezifischer Bindungspaar-(sbp)-Elemente bereitgestellt, umfassend eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Einbringen in bakterielle Wirtszellen
(i) erster Vektoren, die Nukleinsäure umfassen, die für eine genetisch andersartige Population der ersten Polypeptidkette, fusioniert an eine Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen zum Freilegen der Polypeptidketten an der Oberfläche von sekretiertem Bakteriophagen kodiert, und
(ii) zweiter Vektoren, die Nukleinsäure umfassen, die für eine genetisch andersartige Population der zweiten Polypeptidkette kodiert;
wobei die ersten Vektoren in infektiöse Bakteriophagen gepackt werden und ihr Einbringen in bakterielle Wirtszellen durch Infektion in Wirtszellen erfolgt, welche die zweiten Vektoren beherbergen, oder
die zweiten Vektoren in infektiöse Bakteriophagen gepackt werden und ihr Einbringen in bakterielle Wirtszellen durch Infektion in Wirtszellen erfolgt, welche die ersten Vektoren beherbergen; und
das Exprimieren der ersten und zweiten Polypeptidkette innerhalb der Wirtszellen, um eine Sammlung der sbp-Elemente zu bilden, die der sekretierte Bakteriophage freigelegt hat, wobei zumindest eine der Populationen aus Nukleinsäure exprimiert wird, die dann in sekretierte Bakteriophagen gepackt wird, wodurch das genetische Material jedes solchen sekretierten Bakteriophagen für eine Polypeptidkette des an seiner Oberfläche freigelegten sbp-Elements kodiert.
Gemäß einem bevorzugten Verfahren wird jede solche Polypeptidkette ausgehend von Nukleinsäure exprimiert, die fähig ist, als rgdp verpackt zu werden, wobei das Komponenten-Fusionsprodukt eingesetzt wird.
Das Verfahren kann das Einbringen von Vektoren, die zur Expression einer Population der ersten Polypeptidketten fähig sind, in Wirtsorganismen, die eine Population der zweiten Polypeptidketten in freier Form exprimieren, oder das Einbringen von Vektoren, die zur Expression einer Population der zweiten Polypeptidketten in freier Form fähig sind, in Wirtsorganismen, die eine Population der ersten Polypeptidketten exprimieren, umfassen.
Andererseits kann jede der zweiten Polypeptidketten als Fusion mit einer Komponente eines rgdp exprimiert werden, das dadurch die zweiten Polypeptidketten an der Oberfläche von rgdps freilegt. Mit anderen Worten, sowohl die erste als auch die zweite Kette kann auf rgdps durch Fusion an eine Oberflächenkomponente freigelegt werden.
Die Populationen der Polypeptidketten können abgeleitet sein von:
(i) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene eines mit komplementärem sbp- Element immunisierten Tieres;
(ii) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene eines nicht mit komplementärem sbp-Element immunisierten Tieres;
(iii) einem Repertoire eines oder mehrerer künstlich umgeordneter Immunglobulin-Gene;
(iv) einem Repertoire eines oder mehrerer Immunglobulin-Homolog-Gene; oder
(v) einem Repertoire von Sequenzen, die von einem oder mehreren Keimlinien-Immunglobulin-Genen abgeleitet sind;
(vi) einem Repertoire eines oder mehrerer Immunglobulin-Gene, das/die durch Einführung einer oder mehrerer Punktmutationen künstlich mutiert wurde(n);
(vii) einem Gemisch aus beliebigen von (i), (ii), (iii), (iv), (v) und (vi).
Der Bakteriophage kann aus den Klasse I-Phagen fd, M13, fl, Ifl, Ike, ZJ/Z, und Ff sowie den Klasse II-Phagen Xf, Pfl und Pf3 ausgewählt werden.
Nach der Kombination können rgdps so selektiert oder gescreent werden, dass ein einzelnes sbp-Element oder eine Mischpopulation aus den sbp-Elementen bereitgestellt wird, die in ihrem jeweils sekretierten Bakteriophagen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für eine Polypeptidkette davon kodiert. Die restringierte Population zumindest einer Art von Polypeptidkette, die auf diese Weise bereitgestellt wurde, kann dann in einem weiteren dualen Kombinationsverfahren für die Selektion einer einzelnen oder einer restringierten Population aus komplementären Ketten eingesetzt werden.
Nukleinsäure, die von einer restringierten rgdp-Population stammt, die für die ersten Polypeptidketten kodiert, kann in einen rekombinierten Vektor eingeführt werden, in den auch Nukleinsäure von einem genetisch andersartigen Repertoire von Nukleinsäuren eingeführt wird, die für die zweiten Polypeptidketten kodiert, oder jene Nukleinsäure, die von einer restringierten rgdp-Population stammt, die für die zweiten Polypeptidketten kodiert, kann in einen rekombinierten Vektor eingeführt werden, in den auch Nukleinsäure von einem genetisch andersartigen Repertoire von Nukleinsäuren eingeführt wird, das für die ersten Polypeptidketten kodiert.
Der rekombinierte Vektor kann durch intrazelluläre Rekombination zweier Vektoren erzeugt werden, und das kann gefördert werden, indem in die Vektoren Sequenzen eingebaut werden, an denen stellenspezifische Rekombination erfolgt, wie z. B. loxP-Sequenzen, die von Coliphagen P1 erhältlich sind. Stellenspezifische Rekombination kann dann durch Cre-Rekombinase katalysiert werden, die ebenfalls aus Coliphagen P1 erhältlich ist.
Die eingesetzte Cre-Rekombinase kann unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors exprimierbar sein.
Die Produktion eines rekombinierten Vektors kann eingesetzt werden, um Nukleinsäure zu erzeugen, die für ein Einzelketten-Fv-Bereich-Derivat eines Immunglobulins kodiert, das aus der Rekombination zwischen ersten und zweiten Vektoren resultiert.
Es kann wünschenswert sein, dass der Vektor, der Nukleinsäure umfasst, die für die erste Polypeptidkette kodiert, ein Phage oder Phagemid ist, während der Vektor, der Nukleinsäure umfasst, die für die zweite Polypeptidkette kodiert, ein Plasmid ist; oder dass der Vektor, der Nukleinsäure umfasst, die für die erste Polypeptidkette kodiert, ein Plasmid ist, während der Vektor, der Nukleinsäure umfasst, die für die zweite Polypeptidkette kodiert, ein Phage oder Phagemid ist. Dann kann die intrazelluläre Rekombination in einem bakteriellen Wirt erfolgen, der Plasmide gegenüber Phagen oder Phagemiden bevorzugt repliziert oder der Phagen oder Phagemide gegenüber Plasmiden bevorzugt repliziert. Es kann vorteilhaft sein, ein System zu verwenden, worin die bevorzugte Replikation eines Vektortyps gegenüber dem anderen bedingt erfolgt.
Das wird später unter Bezugnahme auf den PoIA-Stamm von E.coli oder einem anderen gramnegativen Bakterium erörtert.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das weiters die folgenden Schritte (A) und (B) umfasst:
(A) das Selektieren von sbp-Elementen, die für das sbp-Element-Gegenstück spezifisch sind und in ihrem jeweiligen Bakteriophagen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für eine erste Polypeptidkette davon kodiert, anhand von Affinität für sbp-Element- Gegenstücke von Interesse;
(B) das Kombinieren der ersten Polypeptidketten von spb-Elementen, die in Schritt (A) selektiert wurden, mit einer genetisch andersartigen Population zweiter Polypeptidketten von sbp-Elementen, wobei die zweiten Polypeptidketten an eine Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen fusioniert sind, der sie dadurch an der Bakteriophagenoberfläche freilegt, wobei durch das Kombinieren in diesem Schritt (B) eine Sammlung von sbp-Elementen gebildet wird, von der ein oder mehrere sbp-Elemente für das sbp-Element-Gegenstück von Interesse anhand von Affinität dafür selektierbar ist/sind.
Diese sbp-Elemente können Antikörper oder andere Mitglieder der Immunglobulin-Familie oder bindende Fragmente davon oder irgendein anderes multimeres sbp-Element sein. An anderer Stelle im vorliegenden Text sind weitere Beispiele zu finden.
Vorteile und Nutzen eines solchen Verfahrens werden an anderer Stelle in der vorliegenden Anmeldung erörtert. Diese Technik kann modifiziert werden, um Antikörper zu "humanisieren", gegebenenfalls in Kombination mit CDR-Grafting und vielleicht unter Verwendung heterozygoter Polypeptidketten. Nützliche Chimären könne eine variable Domäne, die von einem Tier-Antikörper (nicht vom Menschen) abgeleitet ist, der für das Antigen von Interesse spezifisch ist, und eine menschliche Antikörperdomäne umfassen, wie z. B. eine, die Cy1 umfasst. Bei dem Verfahren kann eine genetisch andersartige Population heterozygoter zweiter Polypeptidketten eingesetzt werden. Jede der Population aus zweiten Polypeptidketten, die in Schritt (B) kombiniert werden, kann eine Human- Kette sein, die einen aufgesetzten Komplementarität bestimmenden Bereich (CDR) von einem Tier-Antikörper (nicht vom Menschen) umfasst, der für das Antigen spezifisch ist. Wenn die ersten Polypeptidketten Immunglobulin-Leichtketten sind und die zweiten Polypeptidketten Immunglobulin-Schwerketten sind, kann es für die Selektion eines humanisierten Antikörpers mit hoher Spezifität vorteilhaft sein, dass der aufgesetzte CDR CDR3 ist.
Sets können eingesetzt werden, um ein Verfahren gemäß einem Aspekt der Erfindung durchzuführen. Ein Set kann zusätzlich zu den Hilfskomponenten, die für die Durchführung des Verfahrens erforderlich sind, folgende Komponenten umfassen:
(i) einen Vektor mit den folgenden Merkmalen:
(a) einem Replikationsursprung für einstrangigen Bakteriophagen, (b) einer Restriktionsstelle zur Insertion von Nukleinsäure, die für ein sbp-Element kodiert, oder einer Polypeptidkomponente eines solchen, (c) wobei sich die Restriktionsstelle im 5-Endbereich der reifen Kodiersequenz eines Phagen-Capsidproteins befindet, und (d) mit der Sekretionsleadersequenz stromauf von der Stelle, die eine Fusion des Capsidproteins und sbp- Polypeptids zum periplasmatischen Raum eines bakteriellen Wirts lenkt; und
(ii) einen weiteren Vektor, der einige oder alle der Merkmale (a), (b), (c) und (d) des unter (i) beschriebenen Vektors aufweist.
Ein weiteres Set kann zusätzlich zu den Hilfskomponenten, die zur Durchführung des Verfahrens erforderlich sind, folgende Komponenten aufweisen:
(i) einen ersten Vektor, der die folgenden Merkmale aufweist:
(a) eine Restriktionsstelle zur Insertion von Nukleinsäure, die für ein sbp-Element kodiert, oder einer Polypeptidkomponente eines solchen, (b) wobei sich die Restriktionsstelle im 5'-Endbereich der reifen Kodiersequenz eines Phagen-Capsidproteins befindet, und (c) mit einer Sekretionsleadersequenz stromauf von der Stelle, die eine Fusion des Capsidproteins und des sbp-Polypeptids zum periplasmatischen Raum eines bakteriellen Wirts lenkt; und
(ii) einen zweiten Vektor mit einer Restriktionsstelle zur Insertion von Nukleinsäure, die für eine zweite solche Polypeptidkette kodiert;
(iii) wobei zumindest einer der Vektoren einen Replikationsursprung für einstrangigen Bakteriophagen aufweist; und
(iv) die Vektoren Sequenzen aufweisen, an denen stellengerichtete Rekombination erfolgt.
Bei den obigen Verfahren kann das Bindungsmolekül ein Antikörper oder eine Domäne sein, die zu einem Immunglobulin homolog ist. Der Antikörper oder die Domäne kann entweder natürlich abgeleitet oder synthetisch oder eine Kombination aus beiden sein. Die Domäne kann ein Fab-, ScFv-, Fv-, dAb- oder Fd-Molekül sein. Alternativ dazu kann das Bindungsmolekül ein Enzym oder Rezeptor oder Fragment, Derivat oder Analog irgendeines solchen Enzyms oder Rezeptors sein. Alternativ dazu kann das Bindungsmolekül ein Mitglied einer Immunglobulin-Superfamilie sein, das eine strukturelle Form aufweist, die auf einem Immunglobulin-Molekül basiert.
Die vorliegende Erfindung stellt rgdps wie oben definiert und Elemente spezifischer Bindungspaare bereit, z. B. Bindungsmoleküle, wie z. B. Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Fragmente und Derivate davon, die unter Verwendung eines der oben definierten Verfahren erhältlich sind. Die Derivate können Elemente der spezifischen Bindungspaare umfassen, die an ein anderes Molekül, wie z. B. ein Enzym oder einen Fc-Schwanz, fusioniert sind.
Um die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung durchzuführen, können Sets eingesetzt werden. Die Sets umfassen die notwendigen Vektoren. Ein solcher Vektor weist typischerweise einen Replikationsursprung für einstrangigen Bakteriophagen auf und enthält entweder die sbp-Element-Nukleinsäure oder eine Restriktionsstelle für dessen Insertion in den 5'-End-Bereich der reifen Kodiersequenz eines Phagen-Capsidproteins, wobei eine Sekretionsleader-Kodiersequenz stromauf von der Stelle liegt, die eine Fusion von Capsidprotein und exogenem Polypeptid in den periplasmatischen Raum lenkt.
Die Restriktionsstellen in den Vektoren sind vorzugsweise jene von Enzymen, die nur selten in Proteinkodiersequenzen spalten.
Das Set umfasst vorzugsweise einen Phagemid-Vektor, der die obigen Eigenschaften aufweisen kann oder eine sbp-Element-Nukleinsäure enthalten kann oder eine Stelle zu deren Insertion aufweisen kann, um das kodierte Polypeptid in freier Form zu exprimieren.
Die Sets enthalten auch Hilfskomponenten, die für die Durchführung des Verfahrens erforderlich sind, wobei die Beschaffenheit solcher Komponenten natürlich vom jeweils eingesetzten Verfahren abhängt.
Nützliche Hilfskomponenten können Helfer-Phagen, PCR-Primer sowie Puffer und Enzyme verschiedener Art umfassen.
PCR-Primer und zugeordnete Reagenzien für Anwendungen, wo die sbp-Elemente Antikörper sind, können folgende Eigenschaften aufweisen:
(i) Primer mit Homologie zum 5'-Ende des Sense- oder Antisense-Strangs von Sequenzen, die für Domänen von Antikörpern kodieren; und
(ii) Primer, die Marker-Sequenzen 5' von diesen homologen Sequenzen umfassen, die Restiktionsstellen umfassen, um die Insertion in Vektoren zu ermöglichen; gemeinsam mit Sequenzen, um die Assemblierung von amplifizierten VH- und VL-Regionen zu ermöglichen, um so die Expression als Fv-, scFv- oder Fab-Fragmente zu ermöglichen.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten ist die Bereitstellung eines Zwischenprodukts eines Doppelkombinationsverfahrens, umfassend eine selektierte oder teilweise selektierte Mischpopulation aus Vektoren oder spezifischen Bindungspaar-Elementen, wie z. B. Antikörpern, die dann in einem weiteren Verfahren von Kombination und Selektion eingesetzt werden können.
Puffer und Enzyme werden typischerweise eingesetzt, um die Herstellung von Nukleotidsequenzen zu ermöglichen, die für Fv-, scFv- oder Fab-Fragmente kodieren, die gemäß den hierin beschriebenen Strategien von umgeordneten oder nicht-umgeordneten Immunglobulin-Genen abgeleitet sind.
Die Anmelder habe die filamentösen F-spezifischen Bakteriophagen als Beispiel für die Art von Phagen gewählt, die ein Vehikel für die Freilegung von Bindungsmolekülen, z. B. Antikörpern und Antikörperfragmenten und Derivaten davon, an ihrer Oberfläche darstellen und die nachfolgende Selektion und Manipulation erleichtern könnten.
Die F-spezifischen Phagen (z. B. fl, fd und M13) haben ein Fortpflanzungsverfahren entwickelt, das die Wirtszelle nicht tötet, und sie werden üblicherweise als Vehikel für rekombinierte DNA verwendet (A. Kornberg, DNA-Replikation, W. H. Freeman und Co., San Francisco, 1980). Das einstrangige DNA-Genom (etwa 6,4 Kb) von fd wird durch die bakterielle Membran ausgetrieben, wo es Capsid-Subeinheiten maskiert, um reife Virions zu erzeugen. Diese Virions haben einen Durchmesser von 6 nm, eine Länge von 1 um und enthalten jeweils etwa 2.800 Moleküle des Haupthüllproteins, für das vom viralen Gen VIII kodiert wird, und wier Moleküle des Adsorptionsmolekül-Gen III-Proteins (g3p), wobei letzteres an einem Ende des Virions angeordnet ist. Die Struktur wird von Webster et al., "The Single Stranded DNA Phages", 557-569 (1978), Cold Spring Harbor Laboratory Press, zusammengefasst. Das Gen III-Produkt ist an der Bindung des Phagen an den bakteriellen F-Pilus beteiligt.
Obwohl diese Phagen ihren Wirt während der normalen Replikation nicht töten, kann das Aufbrechen einiger ihrer Gene zum Zelltod führen (A. Kornberg (1980), s. o.). Dies schränkt ihren Einsatz etwa ein. Die Anwender haben erkannt, dass Gen III des Phagen fd eine attraktive Möglichkeit für die Insertion biologisch aktiver fremder Sequenzen ist. Es gibt jedoch auch andere in Frage kommende Stellen, einschließlich beispielsweise Gen VIII und Gen VI.
Das Protein selbst ist nur eine Neben-Komponente der Phagen-Hülle, und Aufbrechen des Gens führt nicht zum Zelltod (G. Smith, Virology 167, 156-165 (1988)). Weiters ist es möglich, einige fremde Sequenzen (ohne biologische Funktion) in verschiedene Positionen innerhalb dieses Gens zu insertieren (G. Smith, Science 228, 1315-1317 (1985); S. F. Parmley und G. P. Smith, Gene 73, 305-318 (1988); und V. F. de la Cruz et al., J. Biol. Chem. 263, 4318-4322 (1988)). Smith et al. beschreiben die Freilegung von Peptiden an der äußeren Oberfläche von Phagen, nicht jedoch die Freilegung von Proteindomänen. Peptide können einen Bereich von Strukturen annehmen, die in freier Lösung anders sein können als beispielsweise bei Bindung an Antikörper, oder wenn sie Teil eines Proteins sind (R. I. Stanfield et al., Science 248, 712-719 (1990)). Proteine haben im Allgemeinen eine gut definierte Struktur und erfüllen ihre biologische Funktion nur, wenn sie diese Struktur annehmen. Beispielsweise ist die Struktur des Antikörpers D1.3 in freier Form und bei Bindung an Antigen aufgelöst worden (T. N. Bhat et al., Nature 347, 483-485 (1990)). Die Gesamtstruktur des Proteins ist in beiden Fällen identisch, wobei es nur unwesentliche Variationen um die Bindungsstelle für das Antigen gibt. Andere Proteine zeigen deutlichere Konformationsänderungen bei der Bindung von Liganden, beispielsweise die Enzyme Hexokinase und Pyruvat-Dehydrogenase während ihres katalytischen Zyklus, aber sie behalten ihr Gesamt-Faltmuster dennoch bei. Diese Strukturintegrität ist nicht auf ganze Proteine beschränkt, sondern auch Proteindomänen weisen sie auf. Das führt zum Konzept einer gefalteten Einheit, die Teil eines Proteins, häufig einer Domäne, ist, die eine gut definierte Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur aufweist und die das gleiche Gesamtfaltmuster beibehält, gleichgültig, ob sie an einen Bindungspartner gebunden ist oder nicht. Die einzige von Smith et al. beschriebene Gensequenz, die eine ausreichende Größe aufweist, um für eine Domäne zu kodieren (mindestens etwa 50 Aminosäuren) war ein 335bp-Fragment einer β-Galaktosidase, die den Nukleotiden 861-1195 in der β-Galaktosidase-Gensequenz entspricht (S. Parmley und G. P. Smith (1988), s. o.). Diese würde für 112 Aminosäuren einer viel größeren Domäne mit 380 Aminosäuren kodieren. Daher ist, bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, keine im Wesentlichen komplette Domäne oder gefaltete Einheit auf Phagen freigelegt worden. In diesen Fällen könnten, obwohl die Infektivität des Virions be seitigt wurde, die insertierten Sequenzen an der Phagenoberfläche beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden.
Das Protein, für das Gen III kodiert, weist mehrere Domänen auf (D. Pratt et al., Virology 39, 42-53 (1969), R. A. Grant et al., J. Biol. Chem. 256, 539-546 (1981); und J. Armstrong et al., FEBS Lett. 135, 167-172 (1981)), einschließlich: (i) einer Signalsequenz, die das Protein zur Zellmembran lenkt und dann abgespalten wird; (ii) einer Domäne, die das reife Protein in der bakteriellen Zellmembran (und auch der Phagen-Hülle) verankert; und (iii) einer Domäne, die sich spezifisch an den Phagen-Rezeptor, den F-Pilus des Wirtsbakteriums, bindet. Kurze Sequenzen, die von Proteinmolekülen stammen, sind in zwei Stellen innerhalb des reifen Moleküls insertiert worden (G. Smith (1985), s. o.; S. F. Parmley und G. P. Smith (1988), s. o.), nämlich in einen Interdomänenbereich und auch zwischen den Aminosäuren 2 und 3 am N-Terminus. Die Insertionsstellen am N-Terminus waren erfolgreicher bei der Aufrechterhaltung der Strukturintegrität des Gen III-Proteins und der Freilegung der Peptide an der Oberfläche des Phagen. Unter Verwendung von Antiseren, die für die Peptide spezifisch sind, wurde gezeigt, dass die in diese Position insertierten Peptide an der Oberfläche des Phagen lagen. Diese Autoren waren unter Nutzung dieser Eigenschaft auch in der Lage, den Phagen zu reinigen. Die vom Phagen exprimierten Peptide wiesen jedoch keine eigenen messbaren biologischen Funktionen auf.
Es ist schwierig, die biologische Funktion eines Moleküls beizubehalten, wenn es in einem radikal anderen Kontext als seinem natürlichen Zustand exprimiert wird. Die Struktur des Moleküls ist hohen Anforderungen ausgesetzt. Im Gegensatz dazu ist die Beibehaltung der Fähigkeit, von spezifischen Antiseren gebunden zu werden, ein passiver Vorgang, der an die Struktur des Moleküls weit weniger rigorose Anforderungen stellt. Beispielsweise ist es weniger die Ausnahme als die Regel, dass polyklonale Antiseren vollständig denaturierte und biologisch inaktive Proteine bei Western-Blots erkennen (siehe beispielsweise E. Harlow und D. Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Larboratory Press, 1988). Daher lehrt die Insertion von Peptiden in einen Bereich, der ermöglicht, dass ihre Struktur mit Antiseren sondiert wird, nur, dass der Bereich ermöglicht, dass die insertierten Sequenzen freigelegt werden, und lehrt nicht, dass der Bereich für die Insertion großer Sequenzen mit starken strukturellen Einschränkungen für die Freilegung eines Moleküls mit einer biologischen oder Bindungs- Funktion geeignet ist. Insbesondere lehrt sie nicht, dass Domänen oder gefaltete Einheiten von Proteinen von Sequenzen freigelegt werden können, die in diesen Bereich insertiert werden.
Dieser Versuch mit Western-Blots ist eine graphische praktische Demonstration, die zeigt, dass das Beibehalten der Fähigkeit zur Bindung durch spezifische Antiseren weit weniger strenge Anforderungen an die Struktur eines Polypeptids stellt als die Faltung, um eine biologische Funktion beizubehalten.
Es sind Untersuchungen durchgeführt worden, bei denen E.coli manipuliert worden sind, um den Protein β-Adrenergin-Rezeptor als Fusion mit dem Außenmembranprotein lamB zu exprimieren. Der β-Adrenerginrezeptor wurde in einer funktionellen Form exprimiert, wie durch das Vorliegen von Bindungsaktivität ermittelt. Als jedoch eine äquivalente Antikörper-Fusion mit lamB erfolgte, war die Antikörperfusion gegenüber der Wirtszelle toxisch.
Die Anwender haben die Möglichkeit untersucht, die Gen-Kodiersequenz für biologisch aktive Antikörper-Fragmente in den Gen III-Bereich von fd zu insertieren, um ein großes Fusionsprotein zu exprimieren. Wie aus der obigen Erörterung hervorgeht, stellt dieser Ansatz lästige Anforderungen an die Funktionalität des Fusionsproteins. Die Insertion ist groß und kodiert für Antikörper-Fragmente mit zumindest 100 bis 200 Aminosäuren; die von Antikörper abgeleitete Domäne muss sich effizient und korrekt falten, um Antigen- Bindung aufzuweisen; und ein Großteil der Funktionen von Gen III muss beibehalten werden. Der Ansatz der Anmelder für die Konstruktion des Fusionsmoleküls war dazu bestimmt, das Risiko der Zerstörung dieser Funktionen zu minimieren. Bei einer Ausführungsform der Erfindung war der ursprünglich eingesetzte Vektor fd-tet (A. N. Zacher et al., Gene 9, 127-140 (1980)), eine tetracyclinresistente Version von fd-Bakteriophagen, der als Plasmid vermehrt werden kann, das dem infizierten E.coli-Wirt Tetracyclinresistenz verleiht. Die Anmelder haben aus mehreren Gründen die Wahl getroffen, nach der Signalsequenz des fd-Gen III-Proteins zu insertieren. Insbesondere haben die Anmelder die Wahl getroffen, nach Aminosäure 1 des reiten Proteins zu insertieren, um den Kontext für die Signalpeptidase-Spaltung beizubehalten. Um die Struktur und Funktion von Gen III selbst beizubehalten, wird der Großteil der ursprünglichen Aminosäuren nach den insertierten Immunglobulinsequenzen synthetisiert. Die insertierten Immunglobulinsequenzen waren so konstruiert, dass sie Reste vom Switch-Bereich umfassen, der VH- VL mit CH1-CL verbindet (A. Lesk und C. Chothia, Nature 3345, 188-190 (1988)).
Überraschenderweise waren die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes durch die Manipulation von Gen III des Bakteriophagen fd in der Lage, einen Bakteriophagen zu konstruieren, der an seiner Oberfläche große, biologisch funktionelle Antikörper-, Enzym- und Rezeptormoleküle freilegt, während er intakt und infektiös bleibt. Weiters können die Antikörper mit gewünschter Spezifität aus einem Hintergrund von Phagen, welche diese Spezifität nicht aufweisen, selektiert werden.
Die Sequenzen, die für eine Population von Antikörper-Molekülen kodieren, sowie zur Insertion in den Vektor, um die Expression von Antikörper-Bindungsfunktionen an der Phagenoberfläche zu ergeben, können aus einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden; beispielsweise von immunisierten oder nicht-immunisierten Nagetieren oder Menschen und von Organen wie Milz und Peripherblutlymphozyten. Die Kodiersequenzen werden von diesen Quellen durch Techniken abgeleitet, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind (R. Orlandi et al. (1989), s. o.; J. W. Larrick et al. (1989), s. o.; Y. L. Ciang et al., Bio Techniques 7, 360-366 (1989); E. S. Ward et al. (1989), s. o.; L. Sastry et al. (1989), s. o.).
Die von den Anmeldern gemachte Offenbarung ist wichtig und stellt einen wesentlichen Durchbruch in der Technologie dar, die mit der Produktion biologischer Bindungs moleküle, derer Fragmente und Derivate durch den Einsatz von Rekombinations-Verfahren in Zusammenhang steht.
Bei Standard-Rekombinationstechniken zur Produktion von Antikörpern wird ein Expressionsvektor, der Sequenzen enthält, die für die Antikörper-Polypeptidketten kodieren, eingesetzt, um beispielsweise E.coli zu transformieren. Die Antikörper-Polypeptide werden exprimiert und unter Einsatz von Standard-Screeningsystemen detektiert. Wenn das Screening ein Antikörper-Polypeptid mit gewünschter Spezifität detektiert, muss zum jeweiligen transformierten E.coli zurückgekehrt werden, welches das gewünschte Antikörper-Polypeptid exprimiert. Weiters muss der Vektor, der die Kodiersequenz für das gewünschte Antikörper-Polypeptid enthält, dann zur Verwendung in weiteren Verfahrensschritten aus E.coli isoliert werden.
Gemäß vorliegender Erfindung ist das gewünschte Antikörper-Polypeptid, wenn es exprimiert wird, bereits mit seiner Gen-Kodiersequenz gepackt. Das bedeutet, dass, wenn ein Antikörper-Polypeptid mit gewünschter Spezifität selektiert wird, nicht die Notwendigkeit besteht, zur ursprünglichen Kultur zurückzukehren, um diese Sequenz zu isolieren. Weiters muss bei vorherigen Verfahren bei Standard-Rekombinationstechniken jeder Antikörper exprimierende Klon einzeln gescreent werden. Die vorliegende Anmeldung sieht die Selektion von Klonen vor, die Antikörper mit gewünschten Eigenschaften exprimieren, und erfordert daher nur das Screenen von Klonen aus einem angereicherten Pool.
Weil ein rgdp (z. B. ein pAb) ein Element eines spezifischen Bindungspaares (z. B. einen Antikörper mit monoklonaler Antigen-Bindungsspezifität) an der Oberfläche einer relativ einfachen replizierbaren Struktur freilegt, die auch die genetische Information enthält, die für das Element kodiert, können rgdps, z. B. pAbs, die sich an das komplementäre Element des spezifischen Bindungspaares (z. B. Antigen) binden, sehr effizient gewonnen werden, indem entweder das komplementäre Element unter Einsatz von beispielsweise Diethylamin, hohen Salzkonzentrationen usw. wegeluiert und geeignete Bakteri en infiziert werden, oder indem die Struktur denaturiert wird und im Speziellen die Sequenzen, die für das Element kodieren, unter Einsatz von PCR amplifiziert werden. Das heißt, es besteht keine Notwendigkeit, wieder auf den ursprünglichen bakteriellen Klon zurückzugreifen, der das pAb lieferte.
Für manche Zwecke, beispielsweise Immunfällung und einige Diagnosetests, ist es vorteilhaft, polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente zu verwenden. Die vorliegende Erfindung macht es möglich, dies entweder durch Selektion eines angereicherten pAb-Pools mit gewünschten Eigenschatten oder durch Mischen einzeln isolierter Klone mit gewünschten Eigenschaften zu erreichen. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können dann, falls gewünscht, in löslicher Form exprimiert werden. Eine solche selektierte polyklonale pAb-Population kann aus Stammreservoirs von Phagen, Phagemide enthaltenden Bakterien oder Bakterien, die lösliche Fragmente exprimieren, die von der selektierten polyklonalen Population stammen, erhalten werden. So wird ein zu einem polyklonalen Antiserum äquivalentes Reagens erzeugt, das ohne Einsatz von Tieren in Kultur repliziert und routinemäßig hergestellt werden kann.

SELEKTIONSFORMATE UND AFFINITÄTSREINIGUNG

Einzelne rgdps, beispielsweise pAbs, welche die gewünschte Spezifität, beispielsweise für ein Antigen, exprimieren, können aus der komplexen Sammlung unter Einsatz der herkömmlichen Screeningtechniken isoliert werden (wie beispielsweise von E. Harlow, D. Lane (1988), s. o., E. Gherardi et al., J. Immuol. Meth. 126, 61-68 (1990), beschrieben).
Die Anmelder haben auch eine Reihe neuer Selektionstechniken entwickelt, die nur aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von rgdps praktikabel sind. Der allgemeine Entwurf einiger Screening-Verfahren wird in Fig. 15 dargestellt, wobei pAbs als eine exemplarische rgdp-Art dient.
Die zu screenende Population/Sammlung von pAbs könnte aus immunisierten oder anderen Tieren erhalten werden; oder in vitro durch Mutagenese bereits bestehender Phagen-Antikörper erzeugt werden (unter Einsatz nach dem Stand der Technik bekannter Techniken, wie z. B. Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Larboratory Press)). Diese Population kann in einem oder mehreren der Formate gescreent werden, die nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 15 beschrieben werden, um jene speziellen pAbs abzuleiten, deren Antigen-Bindungseigenschaften sich von Probe c unterscheiden.

Bindende Elution

Fig. 15(i) zeigt Antigen (ag), das an eine teste Oberfläche (s) gebunden ist; die feste Oberfläche (s) kann aus einer Petri-Schale, Chromatographie-Perlen, Magnetperlen und dergleichen bestehen. Die Population/Sammlung von pAbs wird dann über das ag geleitet, und jene speziellen p, die sich binden, werden nach dem Waschen zurückgehalten und gegebenenfalls mit Detektionssystem d detektiert. Ein Detektionssystem auf Basis von Anti-fd-Antiseren ist detaillierter in Beispiel 4 der WO 92/01047 beschrieben. Wenn Proben gebundener Population p unter zunehmend rauhen Bedingungen entfernt werden, nimmt die in jeder Probe vorhandene Affinität zu. Bedingungen zunehmender Stringenz können beispielsweise erzielt werden, indem die Einweichzeit verlängert oder der pH der Einweichlösung erhöht wird usw.

Kompetition

Auf Fig. 15(ii) Bezug nehmend kann Antigen ag an einen festen Träger s gebunden und vom ursprüngliche Bindungsmolekül c bis zur Sättigung gebunden werden. Wenn eine Population von mutierten pAbs (oder ein Satz nicht verwandter pAbs) dem Komplex angeboten wird, binden sich nur jene, die höhere Affinität für Antigen ag als c aufweisen. In den meisten Beispielen wird nur eine Minderheit von Population c durch Vertreter von Population p ersetzt. Wenn c ein herkömmliches Antikörper-Molekül ist, kann das gesamte gebundene Material gewonnen und gebundenes p gewonnen werden, indem geeignete Bakterien infiziert und/oder indem Standard-Techniken, wie z. B. PCR, eingesetzt werden.
Eine vorteilhafte Anwendung besteht dann, wenn ag als Rezeptor und c als entsprechender Ligand eingesetzt wird. Die gewonnene gebundene Population p steht dann strukturell mit der Rezeptor-Bindungsstelle und/oder dem Liganden in Verbindung. Es ist bekannt, dass diese Art von Spezifität sehr nützlich in der pharmazeutischen Industrie ist.
Eine weitere vorteilhafte Anwendung besteht dann, wenn ag ein Antikörper und c sein Antigen ist. Die gewonnene gebundene Population p ist dann ein Anti-Idiotyp-Antikörper, der zahlreiche Verwendungsmöglichkeiten in der Forschung und Diagnose sowie in pharmazeutischen Industriezweigen haben kann.
Gegenwärtig ist es schwierig, direkt Selektion bezüglich Anti-Idiotyp-Antikörpern durchzuführen. pAbs würden die Möglichkeit geben, dies direkt zu tun, indem pAb-Sammlungen (z. B. eine native Sammlung) an B-Zellen gebunden werden (die Antikörper an ihrer Oberfläche exprimieren), und jene Phagen zu isolieren, die gute Bindung aufweisen.
In manchen Fällen kann es sich als vorteilhaft erweisen, Population p vorzuselektieren. Beispielsweise kann p im obigen Anti-Idioptyp-Beispiel gegen einen verwandten Antikörper adsorbiert werden, der das Antigen nicht bindet.
Wenn c jedoch ein pAb ist, können entweder c oder p oder beide vorteilhaft auf beliebige Weise markiert werden, um sowohl zwischen gebundenem p und gebundenem c zu unterschieden als auch zu selektieren. Diese Kennzeichnung kann physikalisch erfolgen, beispielsweise durch Vor-Markierung von p mit Biotin; oder, was vorteilhafter ist, genetisch. Beispielsweise kann c mit einer EcoB-Restriktionsstelle markiert werden, während p mit einer EcoK-Restriktionsstelle markiert werden kann (siehe P. Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443 (1985)). Wenn gebundene p + c aus dem Antigen eluiert und zum Infizieren geeigneter Bakterien eingesetzt werden, erfolgt Restriktion (und daher kein Wachstum) von Population c (d. h. in diesem Beispiel EcoB-Restriktionsbakterien). jeder Phage, der wächst, wird an jenen Vertretern von p mit höheren Bindungsaffinitäten stark angereichert. Alternativ dazu kann die genetische Markierung erzielt werden, indem p mit neuen Sequenzen markiert wird, die eingesetzt werden können, um unter Einsatz von PCR spezifisch p aus dem Gemisch zu amplifizieren.
Da die gebundenen pAbs amplifiziert werden können, indem beispielsweise PCR oder bakterielle Infektion eingesetzt werden, ist es auch möglich, die gewünschte Spezifität zu befreien, selbst wenn nicht genügend Vertreter gebunden werden, um eine Detektion mit herkömmlichen Techniken zu ermöglichen.
Das bevorzugte Selektionsverfahren eines Phagen, der ein Proteinmolekül mit einer gewünschten Spezifität oder Affinität freilegt, ist oft jenes durch Elution aus einer Affinitätsmatrix mit einem Liganden (z. B. Beispiel 21 der WO 92/01047). Elution mit zunehmenden Liganden-Konzentrationen sollte Phagen eleiren, die B indungsmoleküle mit zunehmender Affinität freilegen. Wenn sich jedoch beispielsweise ein pAb mit hoher Affinität oder Avidität an sein Antigen (oder ein anderes Protein an seinem Bindungspartner) bindet, ist es möglicherweise nicht möglich, den pAb aus einer Affinitätmatrix mit Molekülen zu eluieren, die mit dem Antigen verwandt sind. Alternativ dazu gibt es möglicherweise kein geeignetes spezifisches Elutionsmolekül, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren einzusetzen, das nicht spezifisch - beispielsweise für den Antigen-Antikörper-Komplex - ist. Einige der nicht-spezifischen Elutionsverfahren, die im Allgemeinen eingesetzt werden, verringern die Phagen-Lebensfähigkeit, beispielsweise verkürzt sich die Phagen- Lebensfähigkeit bei pH12 im Lauf der Zeit (E. F. Rossomando und N. D. J. Zinder, J. Mol. Biol. 36, 387-399 (1968)). Es kann Wechselwirkungen beispielsweise zwischen Antikörpern und Afinitätsmatrices geben, die nicht unterbrochen werden können, ohne die Phagen-Infektivität vollständig zu beseitigen. In diesen Fällen ist ein Verfahren zum Eluieren von Phagen erforderlich, das nicht auf der Unterbrechung beispielsweise der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung basiert. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, welches das Eluieren von gebundenen pAbs unter schonenden Bedingungen (Reduktion einer Dithiogruppe mit Dithiothreitol) ermöglicht, die den die Phagen-Strukturen nicht zerstört werden (Beispiel 47 der WO 92/01047).
Dieses Elutionsverfahren ist nur ein Beispiel für einen Elutionsvorgang unter schonenden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren bestünde darin, eine Nukleotidsequenz einzuführen, die für Aminosäuren kodiert, die eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hochspezifische Protease zwischen dem insertierten fremden Gen, in diesem Fall einem Gen für ein Antikörper-Fragment, und der Sequenz des restlichen Gens III. Beispiele für solche hochspezifischen Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach der Bindung des Phagen an eine Affinitätsmatrix und Elution, um nicht spezifisch gebundenen Phagen und schwach gebundenen Phagen zu entfernen, wird der stark gebundene Phage durch Waschen der Säule mit Protease unter Bedingungen, die für Spaltung an der Spaltstelle geeignet sind, entfernt. Dadurch wird das Antikörper-Fragment vom Phagenteilchen abgespalten und der Phage eluiert. Es ist zu erwarten, dass diese Phagen infektiös sind, da die einzige Proteasestelle die spezifisch eingeführte sein sollte. Stark gebundene Phagen können dann durch Infizieren von beispielsweise E.coli TG1- Zellen gewonnen werden.
Ein alternatives Verfahren zum obigen besteht darin, die Affinitätsmatrix, die den stark gebundenen pAb beibehalten hat, zu nehmen und die DNA zu extrahieren, beispielsweise durch Kochen in SDS-Lösung. Extrahierte DNA kann dann eingesetzt werden, um E. coli-Wirtszellen direkt zu transformieren, oder alternativ dazu können die Antikörper- Kodiersequenzen amplifiziert werden, beispielsweise unter Einsatz von PCR mit geeigneten Primern, wie den hierin geoffenbarten, und dann in einen Vektor insertiert werden, zur Expression als löslicher Antikörper für weitere Untersuchung oder als pAb für weitere Selektionsrunden.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Selektion gemäß der Affinität ist jenes durch Bindung an eine Affinitätsmatrix, die geringe Ligandenmengen enthält.
Wenn aus einer Population von Phagen selektiert werden soll, die ein Proteinmolekül mit hoher Affinität für seinen Liganden freilegen, besteht eine bevorzugte Strategie darin, eine Phagen-Population an eine Affinitätsmatrix zu binden, die eine geringe Menge an Liganden enthält. Phagen, die Hochaffinitäts- und Niederaffinitäts-Proteine freilegen, konkurrieren um Bindung an den Liganden auf der Matrix. Phagen, die Protein mit hoher Affinität freilegen, werden bevorzugt gebunden, und Protein mit niedriger Affinität wird weggewaschen. Das Protein mit hoher Affinität wird dann durch Eluieren mit dem Liganden oder durch andere Verfahren gewonnen, welche die Phagen von der Affinitätsmatrix eluieren (Beispiel 35 der WO 92/01047 zeigt diesen Vorgang).
Zusammenfassend kann somit zur Gewinnung der gepackten DNA aus dem Affinitätsschritt die Packung einfach eluiert werden, sie kann in Gegenwart eines homologen sbp-Elements eluiert werden, das mit der Packung um Bindung an ein komplemehtäres sbp-Element konkurriert; sie kann durch Aufkochen entfernt werden, sie kann durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden; und Fachleute werden auch andere Verfahren kennen, z. B. das Zerstören der Bindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Element, um die gepackte DNA und sbp-Element freizusetzen. In jedem Fall besteht das Ziel darin, die DNA aus der Packung zu erhalten, so dass sie direkt oder indirekt eingesetzt werden kann, um das dadurch kodierte sbp-Element zu exprimieren.
Die Effizienz dieses Selektionsvorgangs für pAbs und die Fähigkeit, sehr große Sammlungen zu erzeugen, bedeuten, dass die Immunisierungstechniken, die entwickelt wurden, um den Anteil gescreenter Zellen, die Antikörper von Interesse produzieren, zu erhöhen, keine absolute Notwendigkeit darstellen. Die Technik ermöglicht das rasche Isolieren von Bindungsspezifitäten, beispielsweise Antigen-Bindungsspezifitäten, einschließlich jener, die mit herkömmlichen Techniken schwierig oder nicht erzielbar wären, beispielsweise katalytische oder anti-idotypische Antikörper. Nun ist es möglich, das Tier vollkommen wegzulassen, sobald eine vollständige Sammlung des Immunrepertoires konstruiert wurde.
Die Struktur des pAb-Moleküls kann bei einer Reihe anderer Anwendungen eingesetzt werden, wofür einige Beispiele die Folgenden sind:

Signal-Amplifizierung

Indem sie an sich als Moleküleinheit wirken, kombinieren rgdps, beispielsweise pAbs, die Fähigkeit zur Bindung eines spezifischen Moleküls, beispielsweise eines Antigens, mit Amplifizierung, wenn das Haupt-Hüllprotein eingesetzt wird, um eine andere Gruppe anzubinden. Diese Gruppe kann durch immunologische, chemische oder andere Mittel angebunden werden und kann beispielsweise eingesetzt werden, um den Komplex mit Detektionsreagenzien oder zytotoxischen Molekülen zur Verwendung in vivo oder in vitro zu markieren.

Physikalische Detektion

Die Größe der rgdps, z. B. pAbs, kann als Marker im Speziellen für physikalische Detektionsverfahren, wie z. B. Elektronenmikroskopie und/oder manche Biosensoren, z. B. Oberflächen-Plasmonresonanz, eingesetzt werden.

Diagnoseassays

Die rgdps, z. B. pAbs, weisen auch vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten bei Diagnoseassays auf, insbesondere, wenn Trennung unter Nutzung ihrer physikalischen Eigenschaften herbeigeführt werden kann, beispielsweise Zentrifugation, Filtration usw.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden Ausführungsformen detaillierter nur als Beispiele und nicht zur Einschränkung unter Bezugnahme auf die nachstehend beschriebenen Figuren erklärt.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt Kurven der Wahrscheinlichkeit des Isolierens eines Antikörpers mit einem bestimmten p[K]-Wert über der Größe der Sammlung.
Fig. 2 legt eine Strategie zum Klonieren von Schwerkette als g3-Fusion auf Phagen dar, wobei Leichtketten als lösliche Fragmente ausgehend von einem Phagemid exprimiert werden.
Fig. 3 zeigt eine Klonierstrategie, worin nur eines der beiden Replicons in ein filamentöses Teilchen gepackt werden kann.
Fig. 4 zeigt verschiedene mögliche Kombinationen von Schwer- und Leichtketten, Gen 3-Fusionen und Replicons in polykombinatorischen Sammlungen.
Fig. 5 zeigt eine Strategie zum Klonieren von Schwerketten als g3-Fusionen auf Phagen unter Kombination mit gereinigten Leichtketten in vitro.
Fig. 6 veranschaulicht die Nutzung stellenspezifischer Rekombination zur Konstruktion von polykombinatorischen Sammlungen.
Fig. 7 zeigt die Sequenz des in Beispiel 1 eingesetzten Templatklons. Dieser ist Aab NQ10.12.5 (Hoogenboom et al. (1991), s. o.).
Fig. 8 veranschaulicht eine Strategie zum Klonieren und Schwer- und Leichtketten als getrennte Elemente.
Fig. 9 zeigt die Sequenz von Polylinker, der in pUC19- und pCU119-Derivaten in Beispiel 1 eingesetzt wird.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 1 beschriebenen Infektionsversuche und veranschaulicht die Interferenz zwischen Phagen- und Phagemidvektoren.
Fig. 11 veranschaulicht die Wirkung von Interferenz zwischen Phagen- und Phagemidvektoren auf ein ELISA-Signal im Vergleich zu Phagen und Plasmiden.
Fig. 12 zeigt ELISA-Ergebnisse, die zeigen, dass nur, wenn korrekte Schwer- und Leichtketten-Kombination eingesetzt wird, ein funktioneller Antikörper erzeugt wird, wie in Beispiel 3 gezeigt.
Fig. 13 zeigt ein Beispiel für ein Schema zur Humanisierung eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers.
Fig. 14 zeigt die Basisstruktur der einfachsten Antikörpermoleküls IgG.
Fig. 15 zeigt schematisch Selektionstechniken, bei denen die einzigartigen Eigenschaften von pAbs genutzt werden; 15(i) zeigt ein Bindungs/Elutions-System; und 15(ii) zeigt ein Kompetitionssystem (p = pAb; ag = Antigen, an das sich pAb binden muss; c = Kompeptitorpopulation, z. B. Antikörper, pAb, Liganden; s = Substrat (z. B. Kunststoffperlen usw.); d = Detektionssystem.
Fig. 16 zeigt die Sequenz um die Klonierstelle in Gen III von fd DOG1. Restriktionsenzymstellen werden ebenso gezeigt wie die Aminosäuren, für die von Antikörper stammende Sequenzen kodieren. Diese sind am 5-Ende vom Gen III-Signalpeptid und am 3'-Ende von 3 Alaninresten (für welche die Not 1-Restriktionsstelle kodiert) und dem Rest des reiten Gen III-Proteins flankiert. Der Pfeil zeigt die Spaltstelle zum Abspalten des Signalpeptids.
Fig. 17 zeigt a) das Phagemid pHEN1 als Derivat von pUC119, wie in Beispiel 24 beschrieben; und b) die Klonierstellen im Phagemid pHEN.
Fig. 18. Die in fd-DOG1 und pHEN1 klonierten Antikörper-Konstrukte zur Freilegung an der Oberfläche von Phagen. Die Konstrukte I, II, III und IV wurden sowohl in fd-DOG1 (als ApaLI-NotI-Fragmente) als auch pHEN1 (als Sfil-NotI-Fragmente) und pHEN1 (als sfil-NotI-Fragmente) kloniert. Alle Konstrukte enthielten die variablen Schwerketten- (VH-) und Leichtketten-(VK-)Bereiche des Mäuse-Anti-phOx-Antikörpers NQ10.12.5. Die konstanten Domänen waren menschliches CK und CH1 (γ 1-Isotyp).
Fig. 19. Drei Arten der Freilegung von Antikörperfragmenten an der Oberfläche von Phagen durch Fusion an Gen III-Protein.
Hierin werden Verfahren zur Herstellung extrem vielfältiger Sammlungen von Antikörper-Schwer- und Leichtketten geoffenbart. Schwer- und Leichtketten werden auf getrennten Replicons kloniert und funktioneller Antikörper wird durch post-translationale Assemblierung von Schwer- und Leichtketten in vivo oder in vitro produziert, so dass die endgültige Anzahl an erzeugten Kombinationen die Anzahl von Schwerketten multipliziert mit der Anzahl von Leichtketten ist. Ein solches Format ist auch für Ketten-Umgruppierung, Mutagenese, Humanisierung und CDR-"Imprimierung" zweckmäßig. Diese Verfahren können auch für andere Proteine angewandt werden, bei denen sich zwei oder mehrere verschiedene Subeinheiten verbinden, um ein funktionelles Oligomer zu bilden.
Die ersten funktionellen Antikörpermoleküle, die an der Oberfläche von filamentösem Phagen zu exprimieren waren, waren Einzel-Ketten-Fvs (scFv), die so bezeichnet werden, weil variable Schwer- und Leichtketten-Domänen, normalerweise an zwei getrennten Proeinen, kovalent über ein flexibles Linkerpeptid verbunden sind. Alternative Expressionsstrategien waren ebenfalls erfolgreich. Monomere Fab-Moleküle können auf Phagen freigelegt werden, wenn eine der Ketten (Schwer- oder Leichtkette) an g3-Capsidprotein fusioniert und die komplementäre Kette als lösliches Molekül in das Periplasma exportiert wird. Für die beiden Ketten kann auf demselben oder auf unterschiedli chen Replicons kodiert werden; der entscheidende Punkt besteht darin, dass sich die beiden Antikörperketten post-translational verbinden und das Dimer über Bindung einer der Ketten an g3p in das Phagenteilchen eingebaut wird.
Neuere Klonierversuche sind mit "Phagemid"-Vektoren durchgeführt worden, die um etwa das Hundertfache höhere Transformationseffizienzen aufweisen als Phagen-DNA. Dabei handelt es sich um Plasmide, die den Intergen-Bereich von filamentösen Phagen enthalten, der ermöglicht, einstrangige Kopien der Phagemid-DNA zu produzieren und in infektiöse filamentöse Teilchen zu packen, wenn Zellen, die sie beherbergen, mit "Helfer"-Phagen infiziert werden, welche die Phagen-Komponenten in trans bereitstellen. Wenn Phagemide glll enthalten, das an ein Antikörpergen (z. B. pHEN-1) fusioniert ist, wird das resultierende Fusionsprotein auf den Phagemidteilchen freigelegt (H. R. Hoogenboom, A. D. Griffiths, K. S. Johnson, D. J. Chiswell, P. Hudson und G. Winter, "Multi-subunit Proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains", Nucleic Acis Res. 19 (15), 4133-4137 (1991)). Es gab beträchtliche Fortschritte bei der Entwicklung effizienter Strategien zum Klonieren von Antikörpergenen, ein Faktor, der sehr wichtig wird, wenn eine große Anzahl verschiedener Antikörper-Fragmente, beispielsweise Repertoires, zu bewältigen ist.
Der Kloniervektor fd-DOG-1 wurde in früheren Arbeiten mit Phagen-Antikörper-Repertoires eingesetzt, bei denen scFv-Fragmente von Milz-m-RNA von Mäusen stammten, die mit dem Hapten Oxazalon immunisiert worden waren (T. Clackson, H. R. Hoogenboom, A. D. Griffiths und G. Winter, "Making antibody fragments using phage display libraries", Nature 352, 624-628 (1991)); VH- und VL-Domänen wurden getrennt amplifiziert und dann über ein kurzes DNA-Fragment, das für das scFV-Linkerpeptid kodiert, statistisch verbunden, um eine Sammlung aus etwa 10&sup5; verschiedenen Klonen zu erzeugen. Diese wurde gegen das immunisierende Antigen gespannt, um Kombinationen aus VH und VL zu selektieren, die funktionelle Antikörper erzeugten. Mehrere Binder wurden isoliert, wobei einer insbesondere eine Affinität aufweist, die nicht weit unter jener der besten monoklonalen Antikörper lag, die durch herkömmliche Hybridom-Technologie erzeugt wurden.
Bei einer Maus gibt es jedesmal etwa 10&sup7; mögliche H-Ketten und 10&sup7; mögliche L-Ketten, was eine Gesamtzahl von 10¹² möglichen VH:VL-Kombinationen ergibt, wenn die beiden Ketten statistisch kombiniert werden (diese Zahlen sind Schätzungen und liefern einfach einen ungefähren Hinweis auf die Repertoire-Größe). Diese Zahlen zeigen, dass die obige Mäuse-Sammlung nur 1 von 10&sup7; der möglichen VH:VL-Kombinationen erfasst hat. Es ist wahrscheinlich, dass Antikörper mit guter Affinität isoliert wurden, weil die Milzzellen von einem immunisierten Spendertier stammten, bei dem B-Zellen, die zur Erkennung des Antigens fähig sind, klonal expandiert werden und große Mengen an IgmRNA produzieren. Die geringe Sammlungskomplexität bei diesem Versuch ist teilweise auf die Phagen-DNA eigene, im Vergleich zu Plasmid (oder Phagemid) niedrige Transformationseffizieriz zurückzuführen.
Marks et al. (J. D. Marks, H. R. Hoogenboom, T. P. Bonnert, J. McCafferty, A. D. Griffiths und G. Winter, "By-passing immunization: Human antibodies from V-Gene libraries displayed on phage", J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)) und PCT/GB91/01134 beschreiben die Konstruktion eines Antikörper-Reperoires von nicht-immunisierten Menschen, kloniert in Phagemid pHEN-1. Diese Sammlung, die aus 3.10&sup7; Klonen bestand, hat bisher spezifische Antikörper für zehn verschiedene Antigene ergeben. Diese Antikörper weisen die mäßigen Affinitäten auf, die von einer primären Immunreaktion erwartet werden, vas zeigt, dass verwendbare Antikörper gegen einen Bereich von strukturell diversen Antigenen tatsächlich aus einer einzigen Quelle isoliert werden können.
Neue Binder können aus Klonen erzeugt werden, die aus Phagen-Antikörper-Sammlungen isoliert wurden, indem ein als "Ketten-Umordnung" bezeichnetes Verfahren eingesetzt wird. Bei diesem Verfahren ist eine der beiden Ketten fix, die andere wird variiert. Beispielsweise wurden durch Fixieren der Schwerkette vom Mäuse-Anti-OX-Phagen- Antikörper mit höchster Affinität und gleichzeitiges Reklonieren des Repertoires von Leichtketten Sammlungen mit 4.10&sup7; konstruiert. Mehrere neue OX-Binder wurden isoliert, und die Mehrzahl davon hatte Leichtketten, die sich von den zuerst Isolierten unterschieden und wesentlich vielfältiger waren. Diese Beobachtungen spiegeln die Tatsache wieder, dass eine kleine Sammlung ausreicht, um die verfügbare Vielfalt anzuzapfen, wenn nur eine Kette variiert wird; ein nützlicher Vorgang, wenn die ursprüngliche Sammlung nicht ausreichend groß ist, um die verfügbare Vielfalt zu enthalten.
Die Größe der Sammlung ist von entscheidender Wichtigkeit. Das gilt insbesondere, wenn versucht wird, Antikörper aus einem naiven menschlichen Repertoire zu isolieren, ist aber ebenso relevant zum Isolieren der Antikörper mit höchster Affinität aus einer immunisierten Quelle.
Es ist klar, dass die Phagen-Freilegung zwar ein außergewöhnlich wirksames Werkzeug zum Klonieren und Selektieren von Antikörper-Antigenen darstellt, hier aber unter Einsatz der vorhandenen Technologie nur ein winziger Bruchteil der potentiellen Vielfalt angezapft wird. Die Transformationseffizienzien stellen die größte Einschränkung für die Sammlungsgröße dar, wobei bei Einsatz aktueller Verfahren etwa 10&sup9; die Grenze darstellt. Grobe Berechnungen weisen darauf hin, dass das einige Größenordnungen unter der Zieleffizienz liegt; eine genauere Analyse bestätigt das.
Perselson und Oster haben theoretisch die Beziehung zwischen der Größe des Immunrepertoire und der Wahrscheinlichkeit der Erzeugung eines Antikörpers untersucht, der in der Lage ist, ein bestimmtes Epitop mit mehr als einer bestimmten Schwellenaffinität K zu erkennen. Die Beziehung wird durch folgende Gleichung beschrieben:
P = e-N(p[K])
worin P = die Wahrscheinlichkeit, dass ein Epitop nicht mit einer Affinität oberhalb des Schwellenwerts K durch keinen Antikörper im Repertoire erkannt wird;
N = die Anzahl verschiedener Antikörper des Repertoires; und
p[K] = die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner Antikörper ein Zufallsepitop mit einer Affinität oberhalb des Schwellenwerts K erkennt, ist.
Bei dieser Analyse ist p[K] umgekehrt proportional zur Affinität, obwohl der Algorithmus, der diese Beziehung präzise beschreibt, nicht abgeleitet wurde. Dennoch ist offensichtlich, dass das p[K] eines Antikörpers umso niedriger ist und das Repertoire um so größer sein muss, um eine vernünftige Wahrscheinlichkeit des Isolierens des Antikörpers zu erzielen, je höher seine Affinität ist. Das andere wichtige Merkmal besteht darin, dass es sich um eine Exponentialfunktion handelt; wie in Fig. 1 gezeigt, kann eine geringfügige Änderung der Sammlungsgröße entweder eine vernachlässigbare oder eine dramatische Wirkung auf die Wahrscheinlichkeit des Isolierens eines Antikörpers mit einem bestimmten p[K] haben, je nachdem, welcher Punkt auf der Kurve durch die Sammlungsgröße gegeben ist.
Die Anmelder haben erkannt, dass die Grenzen der Transformationseffizienz (und daher die Obergrenze für die Sammlungsgröße) durch wirksame Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen überwunden werden können. Bei einer bevorzugten Konfiguration werden Schwer- und Leichtkettengene getrennt an zwei verschiedenen Replicons kloniert, von denen zumindest eines in ein filamentöses Teilchen eingebaut werden kann. Infektiöse Teilchen, die eine Kette tragen, werden in Zellen infiziert, welche die komplementäre Kette beherbergen; Infektionshäufigkeiten von > 90º/0 lassen sich leicht erzielen. Schwer- und Leichtketten können dann dadurch, dass eine oder beide Ketten mit g3p verbunden ist/sind, post-translational im Periplasma zu jener Kombination assoziieren, die an der Oberfläche des filamentösen Teilchens freiliegt. Beispielsweise wird eine Sammlung aus 10&sup7; Schwerketten als unfusonierte Population in ein Phagemid kloniert, und 10&sup7; Leichtketten werden als g3-Fusion in fd-DOG-1 kloniert. Beide Populationen werden dann durch Wachstum expandiert, so dass 10&sup7; jeder Leichtkette enthaltenden Zelle und 10&sup7; Kopien jedes Leichtketten-Phagen vorhanden sind. Indem ermöglicht wird, dass der Phage die Zellen infiziert, können 10&sup7; · 10&sup7; = 10¹&sup4; einzigartige Kombinationen geschaffen werden, weil 10&sup7; Zellen vorhanden sind, welche die gleiche Schwerkette tragen, die dann mit 10&sup7; Phagen infiziert werden können, welche die Leichtketten tragen. Wenn das für jeden verschiedenen Schwerketten-Klon wiederholt wird, sind das Ergebnis bis zu 10¹&sup4; verschiedene Schwer/Leicht-Kombinationen in unterschiedlichen Zellen. Diese Strategie ist in Fig. 2 dargelegt, welche die Schwerkette als g3-Fusionen auf Phagen kloniert und die Leichtketten als lösliche Fragmente von einem Phagemid exprimiert zeigt. Natürlich ist auch die umgekehrte Kombination, d. h. Leichtkette auf Phagen und Schwerkette auf Phagemid denkbar.
In dieser in Fig. 2 dargestellten Konfiguration "befreit" fd-DOG das Phagemid, so dass sowohl Phage als auch Phagemid in filamentöse Teilchen gepackt werden, und beide Typen weisen an ihrer Oberfläche Schwer- und Leichtketten auf, obwohl sie nur für eine davon die genetische Information besitzen. Für ein bestimmtes Antigen oder Epitop ist die große Mehrzahl der Paarungen aus Schwer- und Leichtkette nicht funktionell, weshalb die Selektion mittels Antigen den Effekt hat, dass die Komplexizität der Schwer- und Leichtketten-Populationen stark verringert wird. Nach der ersten Selektionsrunde werden die Klone neusortiert, in diesem Beispiel durch Infektion neuer Wirtszellen und Selektion auf beide Replicons. Nach mehreren Antigen-Selektionsrunden und Gewinnung der beiden Replicons können die beträchtlich reduzierten Schwer- und Leichtketten-Populationen auf dasselbe Replicon kloniert und auf herkömmliche Weise analysiert werden. Ein technisches Problem bei dieser Vorgangsweise ist die sogenannte "Interferenz" zwischen dem Replikationsursprung filamentöser Phagen, der auf verschiedenen Replicons getragen wird, aufgrund der Konkurrenz um denselben Replikationsapparat. Dieses Problem kann durch Konstruktion von "interferenz-resistenten" Mutanten von Phage und/oder Phagenursprung (S. Johnston und D. S. Ray, "Interference between M13 and oriM13 plasmids is mediated by a replication enhancer sequence near the viral strand origin", J. Mol. Biol. 177, 685-700 (1984)) oder durch Begrenzung der Kopienanzahl, z. B. durch Ersetzen des Ursprungs der doppelstrangigen Replikation am Phagemid (der sich vom Zwischengenbereich des filamentösen Phagen unterscheidet) durch beispielsweise jenen eines temperaturempfindlichen Ausreißer-Replicons abgeschwächt werden. Auf diese Weise kann die Kopienanzahl niedrig gehalten werden, um Interferenz zu minimieren, so dass der Phage gebildet werden kann, und dann zur Expression des Antikörpers die Phagemid-Kopienanzahl ansteigen gelassen werden.
Alternativ dazu braucht nur eines der beiden Replicons in ein filamentöses Teilchen gepackt werden zu können. Eine solche Strategie wird schematisch in Fig. 3 skizziert und in Beispiel 2 in die Praxis umgesetzt. Eine Leichtketten-Sammlung wird in das Plasmid pUC19 kloniert, und dann werden die Schwerketten als g3-Fusionen in fd- DOG-1 exprimiert. Es gibt in diesem Fall keine Interferenz, da die Replikationsmechanismen unterschiedlich sind. Der Hauptunterschied in der Vorgangsweise liegt darin, dass das Verfahren in diesem Fall zur Selektion der besten Schwerketten führt; die Leichtketten werden nicht kloniert. Die geeigneten Leichtketten werden später isoliert, wenn die selektierten Schwerketten zusammen mit dem Leichtketten-Repertoire auf demselben Replicon kloniert werden, und dann auf herkömmliche Weise selektiert.
Wiederum kann dieses Prinzip in eine Abfolge alternativer Formate mit unterschiedlichen Kombinationen von Vektoren, Ketten und g3-Fusionen umgesetzt werden, wie in Fig. 4 gezeigt.
Eine weitere Konfiguration besteht darin, die Schwerketten als g3-Fusionen auf Phagen zu klonieren und gereinigte Leichtketten in vitro zuzugeben, wie in Fig. 5 gezeigt. Diese Ketten werden durch Zusatz von Guanidinhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 5M teilweise denaturiert, dann wird das Denaturierungsmittel wegdialysiert, so dass sich Schwer- und Leichtketten verbinden, um funktionelle Antikörper-Kombinationsstellen an der Phagenoberfläche zu erzeugen, die dann auf Antigen selektiert werden können, und der geeignete Schwerketten-Phage wird isoliert. Falls notwendig, kann die Selektion mit frischer Leichtkette wiederholt werden. Geeignete Konzentrationen anderer Denaturierungsmittel, wie z. B. Harnstoff oder Kaliumisothiocyanat, erweisen sich ebenfalls als wirksam. Nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde, bleibt eine stark reduzierte Population von Schwerketten-Genen zurück, die dann zusammen mit dem Leichtketten-Repertoire kloniert werden können, vorzugsweise auf dem gleich Replicon. Die lösliche Kette kann durch DNA-Rekombinations-Technologie, einen oder mehrere monoklonale Antikörper oder aus Serum-Antikörper erzeugt werden. Die umgekehrte Konfiguration, d. h. Leichtkette auf Phagen in Verbindung mit löslicher Schwerkette oder Fragment von Schwerkette, ist ebenfalls möglich. Ebenfalls überlegt werden alternative Verfahren zum Verbinden von Schwer- und Leichtketten, die beispielsweise durch chemische Modifikation verbunden werden könnten.
Bisher arbeiten die beschriebenen Verfahren auf dem Prinzip, dass zeust die Komplexizität des Repertoires verringert wird, mit möglichem nachfolgendem Reklonieren einer oder beider Ketten der reduzierten Population. Alternative Verfahren, die es ermöglichen, dass beide Ketten auf dem gleichen Replicon mit hoher Effizienz kloniert werden, sind ebenfalls entwickelt worden. Diese basieren wieder auf dem Klonieren von Schwer- und Leichtkettengenen auf getrennten Replicons, aber diesmal mit dem Ziel, die Rekombination zwischen den beiden Vektoren zu fördern, so dass beide Ketten auf dem gleichen Replicon plaziert werden. In Fig. 6 wird ein Schema gezeigt, bei dem das Rekombinationssystem auf dem lox P/Cre-Rekombinasesystem des Coliphagen P1 basiert (R. H. Hoess und K. Abremski, "The Cre-lox recombination system", in "Nucleic Acids and Molecular Biology", F. Eckstein und D. M. J. Lilley (Hrsg.), Band 4, S. 99-109 (1990), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, BRD). Cre-Rekombinase katalysiert einen hochspezifischen Rekombinationsvorgang an Sequenzen, die als lox. lox P bezeichnet werden, die Rekombinationsstelle im Phagen P1 besteht aus zwei invertierten Repetitionen mit 15 bp, die durch einen nicht-symmetrischen Kern mit 8 bp getrennt sind (Fig. 6). Bei der im Detail in Fig. 6 dargestellten Konfiguration wird lösliche Leichtkette auf ein Phagemid kloniert, das eine einzelne lox P-Stelle enthält. Die Schwerketten werden als 3 g-Fusionen auf ein Plasmid kloniert. Entlang der g3-Fusion liegt das Gen für einen selektierbaren Marker und die Schwerketten/g3/Marker-Sequenz flankiert von zwei lox P-Stellen. Dieses Plasmid enthält auch die Cre-Rekombinase auf einem regulierbaren Promotor und weist zusätzlich zu jenem auf dem Helferphagen einen Ursprung doppelstrangiger Replikation auf, der mit dem auf dem Phagemid kompatibel ist, z. B. coexistieren p15A, RSF 1010 und col E1-Ursprünge in derselben Zelle. Die Phagemide werden dann in Zellen infiziert, die das Donor-Plasmid und den induzierten Rekombinase- Promotor enthalten, so dass die Rekombination zwischen den lox P-Stellen innerhalb in fizierter Zellen erfolgt. Einige dieser Rekombinationsereignisse führen dazu dass die Schwerketten/g3/Marker-Sequenzen als Block auf das Phagemid an seiner einzelnen lox P-Stelle transferiert werden. Phagemide werden dann mit einem Helferphagen, wie z. B. M13K07, befreit, und die resultierenden Phagemidteilchen entweder direkt auf Antigen selektiert oder in frische Wirtszellen infiziert und unter Selektion bezüglich der Gegenwart beider Marker gezüchtet: einer vom Phagemid selbst und der andere vom Schwerketten/g3/Marker-Block.
Der Einsatz stellenspezifischer Rekombination, um Gene auf dasselbe Replicon zu bringen, kann auf die Erzeugung einer kontinuierlichen Sequenz auf demselben Replicon ausgedehnt werden, beispielsweise um Einzelketten-Fv-Moleküle zu konstruieren. Es gibt einen einzelnen offenen Leserahmen auf der loxP-Sequenz, der in einen scFv-Linker eingebaut werden könnte, der dann ein Substrat für Cre-katalvsierte stellenspezifische Rekombination wäre. Die Anordnung solcher modifizierter scFv-Linker-Sequenzen an einem oder beiden Enden der zu fusionierenden Gene kann dann zur Erzeugung kontinuierlicher offener Leserahmen in vivo oder in vitro führen, wenn Cre-Rekombinase bereitgestellt wird.
Die Strategie kann weiter verfeinert werden, wenn die Cre-katalysierte Rekombination in einem polA-Bakterienstamm, vorzugsweise E.coli oder einem anderen gramnegativen Bakterium, erfolgt; diese Zellen weisen DNA-Polymerase I-Defizienz auf und können die Replikation von Plasmiden nicht unterstützen (S. Johnston und D. S. Ray (1984), s. o.). Sie können jedoch die Replikation von filamentösen Phagen und Plasmiden unterstützen, die Zwischengenbereiche filamentöser Phagen enthalten. Durch Selektion bezüglich des Vorhandenseins beider selektierbarer Marker in derselben pol A-Zelle werden erfolgreiche Rekombinationsereignisse angereichert, da Rekombination erfolgen muss, damit das zweite Markergen repliziert und exprimiert wird. Die resultierenden Zellen sind nun das vollständige Repertoire und können als Zellen vermehrt und mit Helferphagen infiziert werden, um Phagemide zu produzieren, welche die Gene für beide Ketten enthalten und sie an ihrer Oberfläche exprimieren.
Andere allgemeine und/oder stellenspezifische Rekombinationsmechanismen können ebenfalls eingesetzt werden; um das gleiche Ergebnis zu bewirken ("Escherichia coli and. Salmonella typhimurium" in "Cellular und Molecular Biology", S. 1034-1043, 1054-1070 (1987), F. C. Neidhart (Hrsg.), American Society for Microbiology).
Es ist klar, dass das Konzept des Einsatzes zweier oder mehrerer Replicons zur Erzeugung von Diversität nicht auf das Freilegen an der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen beschränkt ist. Beispielsweise könnten Bakterien als replizierbare genetische Freilegungspackung verwendet werden. Beispielsweise haben Fuchs et al. gezeigt, dass funktioneller Antikörper durch Fusion an peptidoglycan-assoziiertes Lipoprotein an der Oberfläche von E.coli freigelegt werden kann (P. Fuchs, F. Breitling, S. Dubel, T. Seehaus und M. Little, "Targetting of recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli: Fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein", BioTechnology 9, 1369-1373 (1991). Klauser et al. beschreiben den Transport eines heterologen Proteins an die Oberfläche von e.coli durch Fusion an Neisseria-IgA-Protease (T. Klauser, J. Phoher und T. F. Meyer, "Extracellular transport of cholera toxin B subunit unsing Neisseria IgA protease B domain: conformation-dependent outer membrane translocation", EMBO 9, 1991- 1999 (1990)). Andere Oberflächenproteine, wie z. B. Pili, ompA oder das an der Oberfläche freigelegte Lipoprotein Tra T könnten ebenfalls eingesetzt werden, und grampositive Organismen, wie z. B. Lactobacilli und Streptococci, könnten eingesetzt werden. Klonieren und Expression in eukaryotischen Organismen werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
Alternative Klonierstrategien sind möglich, wenn Zellen anstelle von Phagen eingesetzt werden. Beispielsweise können zusätzlich zur Transformation und Infektion Replicons durch Konjugation in die Zellen eingebracht werden. Darüber hinaus können ein oder mehrere Gene in das Chromosom eingebaut werden, wodurch die Einschränkung verringert wird, dass kompatible Replicons eingesetzt werden müssen.
Das polykombinatorische Konzept ist auch besonders vorteilhaft für Mutagenese-Versuche, indem es die Herstellung einer bei weitem größeren Anzahl von Mutanten-Nachkommenschaft ermöglicht.
Die Anmelder haben erkannt, dass das polykombinatorische Konzept auf andere multimere Proteine als Antikörper anwendbar ist, wie z. B. T-Zellen-Rezeptoren, CD3 und Insulin-Rezeptor. Sammlungen von Proteinen mit mehr als zwei verschiedenen und diversen Subeinheiten können beispielsweise durch mehr als einen Infektionszyklus erzeugt werden. Zellen, die eine der Subeinheiten enthalten, werden mit Phagen infiziert, der die zweite Subeinheit enthält, und die resultierende Population wird ein zweites Mal mit einem kompatiblen Phagen infiziert, der die dritte Subeinheit trägt.
In manchen Fällen ist es vorteilhaft, Zwei- oder Mehrkomponenten-Polypeptid-Domänen eines Multimers als g3-Fusionen zu exprimieren. Das hat den Vorteil, dass schwache Wechselwirkungen zwischen getrennten Ketten stabilisiert werden oder Polypeptid- Domänen, die schwach wechselwirken, oder Polypeptid-Domänen, die nur in Gegenwart von Ligand assoziieren, stabilisiert werden.
Die Anzahl der möglichen Kombinationen ist beim polykombinatorischen Ansatz nur durch die Anzahl von Klonen begrenzt, die in jedem der Repertoires vorhanden ist, und in speziellen Fällen der Verwendung von Phagen, die eine Kette bereitstellen, um Zellen zu infizieren, welche die andere enthalten, durch die Anzahl an Phagen und Zellen, die produziert werden können. Die Verwendung von ausgeklügelteren Verfahren, beispielsweise Fermentierungstechnologie, ermöglicht den Zugang zu einer noch größeren Anzahl von Kombinationen.
Die von Affymax Inc. eingereichte PCT/WO 91/17271 beschreibt die Expression von Antikörper-Schwer- und -Leichtketten, weist aber nicht darauf hin, dass die Infektion von Zellen, die ein Replicon beherbergen, mit Phagen, die ein anderes Replicon beherbergen, das Konstruieren von größeren Sammlungen ermöglicht. Sie beschreibt auch nicht das Selektionsverfahren zum Selektieren eines Antikörper-Fragments von Interesse unter Einsatz der beiden Replicons. Sie befassen sich nur mit doppelter Selektion, um die beiden Ketten gemeinsam in demselben Phagen oder Bakterium zu halten, was beim Format, das sie beschreiben, die Größe der Sammlung begrenzt, die konstruiert werden kann. Es gibt auch keinen Hinweis darauf, dass bei Schwer- und Leichtketten-Sammlungen auf getrennten Vektoren die Schwer- und Leichtketten umgeordnet werden würden, oder wie die gewünschte Kombination zu identifizieren ist.
Ein entscheidender Unterschied gegenüber vorherigen Ansätzen ist der Einsatz getrennter Quellen von Schwer- und Leichtketten und die Art, wie sie kombiniert werden, um Sammlungen mit höherer Diversität zu produzieren. Die Anmelder stellen Verfahren für die Konstruktion solcher Sammlungen bereit und lehren, wie Schwer- und Leichtketten- Sammlungen kombiniert werden können, um eine enorme Anzahl an funktionellen Kombinationen zu erzeugen, sowie Mittel, womit gewünschte Kombinationen selektiert und isoliert werden können. Der entscheidende Vorteil besteht darin, dass auf diese Art konstruierte Sammlungen um einige Größenordnungen größer sein können, als bisher möglich war. Wenn zwei Replicons eingesetzt werden, kann gibt es jegliche gepaarte Kombinationen von Phage, Phagemid und Plasmid, in allen Fällen mit den Antikörper- Ketten als lösliche Fragmente exprimiert oder mit dem Phagen-Capsid assoziiert. Zumindest einer der Vektoren kann in ein infektiöses phagenartiges Teilchen eingebaut werden, und zumindest einer der Vektoren ermöglicht die Assoziation von Antikörperkette mit dem Phagen-Capsid, beispielsweise durch Fusion an g3p. Jede der obigen Konfigurationen kann bei neuen Humanisierungs-/Mutagenese-Verfahren eingesetzt werden.
Der "Ketten-Umordnungs"-Kombinationsansatz stellt eine besonders nützliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Beispielsweise kann eine einzelne Schwerkette oder eine beschränkte Anzahl von Schwerketten von einem Antikörper genommen werden, von dem bekannt ist, dass er die gewünschte Antigen-Spezifität aufweist, oder sogar von einem Repertoire von Antikörpern von Menschen oder Tieren, die mit einem Antigen von Interesse immunisiert wurden, und eine Population solcher Ketten mit einer möglicherweise sehr großen genetisch andersartigen Population von, in diesem Fall, Leichtketten kombiniert werden, die an eine rgdp-Komponente fusioniert sind. Die Leichtketten werden ausgehend von Nukleinsäure exprimiert, die in ein rgdp gepackt werden kann. Dann erfolgt Selektion bezüglich rgdps, die jeweils Leichtkette freilegen, mit einer assoziierten Schwerkette, die einen für ein Antigen von Interesse spezifischen Antikörper bildet. Solche rgdps enthalten jeweils Nukleinsäure, die für eine Leichtkette kodiert. Leichtketten der so selektierten restringierten Population werden dann mit einer genetisch diversen Population, gegebenenfalls einer sehr großen Population, von Schwerketten kombiniert, die an eine rgdp-Komponente fusioniert sind und ausgehend von Nukleinsäure exprimiert werden, die in rgdps gepackt werden kann. Eine zweite Runde der Selektion bezüglich rgdps, die spezifische Bindungspaar-Elemente freilegen, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind, ergibt eine restringierte Population von Schwerketten, die fähig sind, mit den zuvor selektieren Leichtketten zu assoziieren, um Antikörper der gewünschten Spezifität zu bilden.
Diese Technik ermöglicht die Reduktion von Populations-Diversität auf ein leicht bewältigbares Ausmaß, während eine sehr große Anzahl von Kombinationen berücksichtigt wird. Das wird durch den Stand der Technik nicht einmal annähernd erreicht. Sie kann vorteilhaft zur Humanisierung von Antikörpern eingesetzt werden, die aus tierischer Quelle (nicht vom Menschen) isoliert/gereinigt wurden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen, wie diese Konzepte in die Praxis umgesetzt werden können. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird klar sein, dass viele Variationen dieser Themen zufriedenstellende Ergebnisse ergeben. Die folgenden Bespiele dienen der Veranschaulichung des Konzepts, und sollen dieses nicht einschränken.

Beispiel 1: Befreiung von Phagemid mit Phage fd-DOG-1

In diesem Beispiel wird das Konzept der Verwendung eines Phagen zum "Befreien" eines Phagemids (Fig. 2) unter Verwendung eines heterozygoten Modell-Antikörpers getestet.
Eine Kette wird in pUC19, pUC119 oder pHEN-1 als lösliches periplasmatisches Protein exprimiert und die entsprechende Kette auf fd-DOG-1 als g3-Fusion kloniert. Beide Ketten stammen von einem in pUC19 klonierten Modell-Fab-Fragment, in dem die Leicht- und Schwerketten-V-Bereich-Domänen vom Mäuse-anti-phOx-(2-Phenyl-5-oxazalon-) Antikörper NQ10.12.5 an Menschen-C- bzw. -C 1-Domänen fusioniert wurden. Die C- terminalen Cysteinreste, die normalerweise eine kovalente Bindung zwischen den Leicht- und den Schwerketten bilden, sind in diesem Konstrukt aus beiden konstanten Domänen gelöscht worden, und dieses Merkmal wird in nachfolgenden Konstrukten beibehalten. Die Sequenz des Templatklons wird in Fig. 7 gezeigt.
Die Strategie zum Klonieren von Schwer- und Leichtketten als getrennte Elemente wird in Fig. 8 veranschaulicht, kurz gesagt wurden die Ketten getrennt mit Primern PCR-amplifiziert, die geeignete Restriktionsstellen an den Enden der Fragmente enthalten. Diese Fragmente wurden dann in beiden Konfigurationen, d. h. Schwerkette auf Phage, Leichtkette auf Phagemid und umgekehrt, in pHEN-1 und fd-DOG-1 kloniert. Die Schwerketten-Sfi I-Not I-Fragmente wurden auch in pUC19- ung pUC119-Derivate kloniert, bei denen der Polylinker zwischen den Eco RI- und Hind III-Stellen durch die in Fig. 9 gezeigte Sequenz ersetzt worden war, die komptaible Sfi I- und Not I-Stellen enthält. Diese Klone werden als pUC19/pUC119-Sfi-Not-polymyc bezeichnet. Die pHEN-1-Klone wurden in E.coli Stamm HB2151 transformiert, der ein männlicher, lacl und ein Nicht-Suppressor ist, was bewirkt, dass das Amber-Codon in pHEN-1 als Stopcodon gelesen wird, wodurch eine lösliche Kette erzeugt wird, die in das Periplasma exportiert wird. Der Rest der Konstrukte wurde in E.coli TG1 transformiert.
Diese Zellen werden dann mit fd-DOG-1-Phage "befreit", der die Partnerkette als g3-Fusion trägt, und die resultierende Phagen/Phagemid-Population wird bezüglich phOx-Bindung mittels ELISA untersucht.
In diesem Beispiel beschreiben die Abschnitte a) bis g) die Herstellung von Plasmid, Phagemid und Phagen-Klonen; die Abschnitte i) und j) zeigen den Effekt der Verwendung von Phagen zur Befreiung von Phagemid oder Plasmid, und jene Auswirkungen, die das auf die Antikörper-Expression hat.

c) PCR-Amplifizierung von Schwer- und Leichtketten

Plasmid pUC1 9 Fab NQ10.12.5DNA wurde als Templat für die PCR-Amplifizierung eingesetzt. Es wurden 4 getrennte PCR-Reaktionen mit den folgenden paarweisen Kombinationen von Primern durchgeführt (Tabelle 1):
Schwerketten-fd-DOG-1-Phage: VHIBACKAPA & FABNOTFOH
Schwerketten-pHEN-1-Phagemid: VHIBACKSFI & FABNOTFOH
Leichtketten-fd-DOG-1-Phage: MVKBAAPA & FABNOTFOK
Leichtketten-pHEN-1-Phagemid: MVKBASFI &- FABNOTFOK
PCR-Reaktionen enthielten 10mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, jeweils 1,25 mM dNTP, 2,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 Wo Gelatine, 0,1 Einheiten/ul Taq-Polymerase (Cetus/Perkin Elmer), jeweils 1 mM Primer und 1 ng Templat-DNA. PCR wurde in einem Techne PHC- 2-Thermocycler (Techne, Duxford, Cambridge, UK) durchgeführt, wobei 25 Zyklen für 1 min bei 94ºC, 1 min bei 50ºC und 2 min bei 72ºC eingesetzt wurden.

b) Spaltung der PCR-Fragmente

Die resultierenden Produkte wurden mit Phenol : Chloroform = 1 : 1 extrahiert, dann mit Ethanol gefällt, wie in Sambrook et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis (1990), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York.) beschrieben, und pelletierte DNA erneut in 35 ul Wasser gelöst. Restriktionsspaltungen wurden normalerweise in 100 bis 200 ul Volumen mit 0,3 - 0,4 Einheiten Enzym pro ul durchgeführt (das zugefügte Enzymvolumen war ein solches, dass es 1/20 des Gesamt- Reaktionsvolumens nicht überstieg), wobei von Hersteller empfohlene Bedingungen und der vom Hersteller gelieferte Puffer eingesetzt wurden. Spaltung mit 0,4 Einheiten pro ul an Not I-Enzym (New England BioLabs) wurde in 150 ul Volumen gemäß den An weisungen des Herstellers und in Puffer, der vom Hersteller bereitgestellt wurde, für 3 h bei 37ºC durchgeführt. Die Produkte wurden mit Phenol : Chloroform extrahiert, nochmals mit Ethanol gefällt und entweder mit Apa LI oder Sfi I gespalten. Abgesehen von der Apa LI-Spaltung des VHCH1-Apa LI-Not I-Fragments (siehe unten) wurde die Spaltung unter Verwendung von 0,4 Einheiten pro ul Enzym in insgesamt 150 ul nach den Anweisungen des Herstellers (New England BioLabs) und im vom Hersteller bereitgestellten Puffer durchgeführt. Apa LI-Spaltungen wurden für 3 h bei 37ºC, Sfi I-Spaltungen für 3 h bei 50ºC durchgeführt.
Die Apa LI-Spaltung des VHCH 1 Apa LI-Not I-Fragments musste aufgrund des Vorhandenseins einer internen Apa LI-Stelle partiell sein. Das wurde durch Spaltung mit 0,04 Einheiten/ul an Apa LI für 1 h erreicht, und die Fragmente voller Länge aus einem Agarosegel isoliert (siehe unten).

c) Reinigung von DNA-Fragmenten

Reaktionsprodukte wurden mit Ethanol gefällt, um ihr Volumen zu verringern, dann auf einem präparativen 2%-igen niederschmelzenden Agarose/TAE-(Tris-Acetat EDTA-)Gel laufen gelassen, die etwa 700 bp-Banden ausgespalten und die DNA-Fragmente unter Einsatz eines Geneclean-Sets nach den Anweisungen des Herstellers (Bio 101, La Jolla, CA, USA) gereinigt. DNA-Fragmente wurden in TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA) resuspendiert und an vorbereiteten Vektor ligiert (Abschnitte d und e).

d) Herstellung von Vektor-DNA

10 ug mit Caesiumchlorid gereinigtes fd-DOG-1 wurden mit Apa LI und Not 1 wie oben gespalten. 10 ul mit Caesiumchlorid gereinigte pUC19 Sfi/Not-, pUC119 Sfi/Not- und pHEN-1-DNAs wurden mit Sfi I und Not I gespalten, wobei die gleichen Bedingungen wie oben unter b) beschrieben eingesetzt wurden. Nach der Spaltung und Ethanol-Fällung wurde Vektor-DNA mit 1 Einheit Calf Intestinal Alkaline Phosphatase in 50 ul jenes Puffers, der vom Hersteller (Boehringer Manheim UK Ltd., Beil Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) empfohlen und als 10x Stammlösung bereitgestellt wird, für 30 min bei 37 ºC versetzt, und dann wurde eine weitere Einheit Enzym zugegeben und die Inkubation wiederholt. 40 ul Wasser, 10 ul 10x STE (10x STE ist 100 mM Tris-HCl, pH (8,0), 1M NaCl, 10 mM EDTA) und 5 ul 10% SDS wurden dann zugegeben und das Gemisch 20 min lang bei 68ºC inkubiert, um die Phosphatase zu inaktiwieren. Das Gemisch wurde dann kurz eisgekühlt und zweimal mit Phenol : Chloroform = 1 : 1 extrahiert und dann mit Ethanol gefällt, wie von Sambrook et al. (1989, s. o.) beschrieben.

e) Ligationen

Die folgenden Ligationen wurden durchgeführt:
pUC19 Sfi I-Not I +VHCH1 Sfi I-Not I
pUC119 Sfi I-Not I +VHCH1 Sfi I-Not I
pHEN Sfi I-Not I +VHCH1 Sfi I-Not I
pHEN Sfi I-Not I +VLCL Sfi I-Not I
fd-DOG Apa LI-Not I +VHCH1 Apa LI-Not I (partielles Apa LI)
fd-DOG Apa LI-Not I + VLCL Apa LI-Not I
Es wurden jeweils die folgende Ligationsreaktion durchgeführt:
* 10 · NEB-Ligationspuffer 1 ul
* Wasser 6 ul
* Gespaltener Vektor (30 ng/ul) 2 ul
* Gespaltenes PCR-Fragment (20-50 ng/ul) 1 ul
2. Schleudern für einige Sekunden in der Mikrozentrifuge; dann Zugabe von:
* T4-DNA-Ligase (400 Einheiten/ul, NEB) 1 ul
3. Stehenlassen für 2 h bei 25ºC oder über Nacht bei 16ºC.
4. Transformation in E.coli (siehe unten).
Anmerkung: 10 · NEB-Ligationspuffer ist 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8, 0,1 M MgCl&sub2;, 0,2 M DTT, 10 mM rATP und 500 ug/ml BSA.

f) Elektroproation in TG1 oder HB2151

1. Eine Phiole elektroporationskompetente Bakterien auf Eis auftauen. Für die lösliche Expression von Antikörper-Fragmenten aus pHEN1 wird der Nicht-Suppressor-Stamm HB2151 eingesetzt. Für andere wird TG1 eingesetzt.
2. Übertragung von 50 ul Zellen in einer vorgekühlte 0,2 cm-Küvette (Biorad), Zugabe von 2 ul Ligationsgemisch, zu Boden Rütteln und Absetzenlassen auf Eis für 1 min.
3. Einstellung des Gene Pulsers (Biorad), so dass er 25 uF, 2,5 kV abgibt, wobei der Impulsregler auf 200 Ω eingestellt wird.
4. Abtrocknen der Küvette mit einem Tuch und Einbringen in die Elektroporationskammer.
5. Einmaliges Pulsen (sollte einen Impuls mit einer Zeitkonstanten von 4,5 bis 5 ms ergeben).
6. Sofortige Zugabe von 1 ml SOC (frisch) zur Küvette und Resuspendieren der Zellen.
7. Übertragung in Einweg-Kulturröhrchen und Rütteln für 1 h bei 37ºC.
8. Plattieren der Fraktionen auf 2YT Agar-Platten, die für pHEN- und pUC-Replicons 100 ug/ml Ampicillin, 1% Glucose enthalten, oder auf fd-DOG 2YT-Agarplatten, die 15 ug/ml Tetracyclin enthalten.
Anmerkung 1: SOB ist 20 g Baktotrypton, 5 g Hefeextrakt und 0,5 g NaCl in 1 l.
SOC ist SOB mit 5 ml 20% Glucose, 1 ml 1 M MgCl&sub2; und 1 ml 1M MgSO&sub4; pro 100 ml.
2YT ist 20 g Baktotrypton, 10 g Hefe-Extrakt und 5 g NaCl in 1 l.
Anmerkung 2: Um die Transformationseffizienzen zu erhöhen, kann die DNA im Ligationsgemisch durch Extrahieren mit Phenol, Phenol-Chloroform und Ether, Ethanol-Fällung und Resuspendieren in Wasser gereinigt werden. Alternativ dazu können die Proben unter Einsatz von Geneclean (Bio 101) gereinigt werden. Der Wirkungsgrad steigt um das 10- bis 100-fache, wenn dieser Reinigungsschritt durchgeführt wird.
Die gewünschten Klone wurden mittels PCR gescreent, wobei die Primer eingesetzt wurden, um die Fragmente zu klonieren und ihre Identität durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt wurde. Infektiöse Teilchen wurden dann aus diesen Klonen hergestellt (siehe unten).

g) Herstellung von infektiösen fd-DOG-Phagenteilchen

1. Einimpfen der Bakterienkolonie, die fdDOG enthält, in 2YT Brühe, die 15 ug/ml Tetracyclin enthält. Vermehrung bei 37ºC, Rütteln für 20 bis 24 h. Die Ausbeute an Phagenteilchen sollte etwa 10¹&sup0; TU (Transduzierungseinheiten - siehe unten) pro ml Überstand betragen.
2. Schleudern bei 8.000 U/min für 10 min lang (oder 4.000 U/min für 20 min).
3. Zugabe von 1/5 Volumen PEG/NaCl (20% PEG 6000, 2,5M NaCl) zum Überstand, Stehenlassen für 1 h bei 4ºC. Schleudern bei 8.000 U/min für 15 min (oder 4.000 U/min für 30 min).
4. Resuspensieren des Pellets in einen kleinen Volumen Wasser und Übertragung in Eppendorf-Röhrchen.
5. Abzentrifugieren jeglicher verbleibender Zellen (5 min in Micro-Zentrifuge).
6. Entfernung des Überstands und kurzes erneutes Schleudern des Pellets.
7. Abblasen jeglichen verbleibenden PEGs.
8. Resuspendieren des Pellets in Wasser (1/100 des ursprünglichen Kultur-Volumens) und erneutes Schleudern für 2 min in Mikro-Zentrifuge, um verbleibende Bakterien und aggultinierten Phagen zu entfernen. Filtration durch 0,45 um-Sterilfilter (Minisart NML; Sartorius).
9. Lagerung des Filtrats bei 4ºC. Die Konzentration des Phagen sollte etwa 10¹ TU ml&supmin;¹ betragen.

h) Infektionsversuche

Frühere Versuche, bei denen fd-DOG-Phagen eingesetzt wurden, um pHEN-1 zu infizieren, weisen darauf hin, dass es Interferenz zwischen den beiden Vektoren gibt, weil beide einen Zwischengenbereich von filamentösen Phagen enthalten, was zu Konkurrenz um denselben Replikationsapparat führt. Die nachstehenden Versuche bestätigen das.
TG1-Zellen, die entweder untransformiert sind oder heterozygotes pUC19-, pUC119-, pUC19-NQ10.12.5-VHCH1 und heterozytoges pUC119-NQ10.12.5-VHCH1 beherbergen, wurden bis zur mid-10 g-Phase bei 37ºC in 2YT Medium gezüchtet, ohne Antibiotikum für TG1 oder mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose für die Rekombinationen. Die Kulturen wurden dann so verdünnt, dass sie etwa 108 Zellen/ml enthielten, unter der Annäherung, dass wenn die OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,0 ist, 5,10&sup8; Kolonie bildende Einheiten (cfu)/ml enthalten sind, und fd-DOG-Phagen in 3,100 Tetracyclin-Resistenz-Transducing Units (TU, auf TG1 getestet) pro ml zugegeben. Nach 30-minütigem Inkubieren bei 37ºC wurden Verdünnungen auf 2YT Agar plattiert, das 15 ug/ml Tetracyclin und 1% Glucose enthielt, und bei 37ºC über Nacht inkubiert, was die Anzahl der erfolgreichen Infektionsereignisse (= Anzahl der tetr-Kolonien) lieferte. Das Ergebnis wird graphisch in Fig. 10 gezeigt. Es gibt nur eine geringe Differenz im Titer, wenn fd-DOG-Phagen TG1- Zellen oder TG1-Zellen infizieren, die pUC19 enthalten - der Titer ist gleich der Anzahl der zugesetzten Zellen (da Phagen bei diesem Versuch im Überschuss vorlagen). Wenn die Wirtszelle jedoch pUC119 (oder einen auf pUC119 basierenden Vektor) enthält, wird die Anzahl gesunder tetr-Kolonien (2 bis 3 mm Durchmesser) um etwa das 100-fache verringert, und es gibt nun zahlreiche winzige Kolonien (0,3 biw 0,5 mm Durchmesser). Diese kleinen Kolonien vermehren sich in flüssiger Kultur mit Tetracyclin nicht, und da die Anzahl an kleinen und großen Kolonien gleich der Anzahl an zugeführten Zellen ist, wird angenommen, dass es sich um Infektionsereignisse handelt, bei denen der Phage nicht gebildet wurde.
Das Vorhandensein einer Antikörper-Schwerkette in pUC19 Oder pUC119 hat kaum Auswirkungen auf die Ausbeute an tetr-Kolonien nach der Infektion mit fd-DOG. Ähnliche Interferenz wird beobachtet, wenn fd-DOG durch M13 ersetzt und die Anzahl erfolgreicher Infektionsereignisse anhand der Plaque-Anzahl bestimmt wird (Fig. 10). Die Fähigkeit zur Gewinnung von funktionellem Antikörper an der Oberfläche von Phagen wurde dann getestet - siehe die nachstehenden Abschnitte i und j.

i) Befreiung von Fab-Phagen

Es wurden die folgenden Befreiungen durchgeführt; alle Ketten sind NQ10.12.5-Chimären:
pUC19-Schwerkette X fd-DOG-Leichtkette
pUC119-Schwerkette X fd-DOG-Leichtkette
pHEN-Schwerkette X fd-DOG-Leichtkette
pHEN-Leichtkette X fd-DOG-Schwerkette
pHEN-Leichtkette X fd-DOG-Leichtkette
pHEN-Schwerkette X fd-DOG-Schwerkette
Wirtszellen (HB2151 für pHEN-1, TG1 für pUC), die Plasmid/Phagemid mit einer der beiden Fab-Ketten enthielten, wurden über Nacht bei 37ºC in 2YT gezüchtet, das 100 pg/ml Ampicillin und 1% Glucose enthielt (2YTAG). Glucose wird eingesetzt, um den lac-Promotor zu unterdrücken und dadurch die Expression des Antikörpergens zu verrin gern. Die stationären Kulturen wurden 1 : 100 in 10 ml frischem 2YTAG in einem 50 ml- Polypropylen-Röhrchen (Falcon) verdünnt und bei 37º bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 vermehrt, bevor konzentrierter fd-DOG-Phage, der entweder die Schwer- oder Leichtkettengene als g3-Fusionen enthielt, bis zu einer Endkonzentration von 1.10&sup9; TU/ml zugesetzt wurde. Diese Kulturen wurden dann bei 37ºC ohne Rütteln für 30 min und dann unter raschem Rütteln für weitere 30 min inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 4.000 · g 20 min lang bei 4ºC pelletiert, die Röhren ausgeleert und die Zellen in 10 ml frischem 2YT resuspendiert, das 100 ug/ml Tetracyclin enthielt (keine Glucose → Induktion) und unter heftigem Rütteln über Nacht bei 37ºC gezüchtet.
Am nächsten Tag wurden Zellen durch Zentrifugiren bei 4.000 · g für 20 min bei 4ºC pelletiert und der Überstand mittels ELISA auf das Vorhandensein von funktionellem Antikörper untersucht.

j) ELISA

1. Beschichtung einer Platte (Falcon 3912) mit 100 ul phOX-BSA (14 : 1 Substitution) pro Napf mit 10 ug/ml in PBS; Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur.
2. Dreimaliges Spülen der Näpfe mit PBS und Blockieren mit 200 ul 2% Marvel/PBS pro Napf für 2 h bei 37ºC.
3. Dreimaliges Spülen der Näpfe mit PBS, dann Zugabe von 25 ul 10% Marvel/PBS zu allen Näpfen.
4. Zugabe von 100 ul Kulturüberstand zu den entsprechenden Näpfen; Vermischung, Stehenlassen für 2 h bei Raumtemperatur.
5. Auswaschen der Näpfe mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS; Zugabe von 100 ul Schaf-Anti-M13-Antiserum, verdünnt 1 : 1000 in 2 % Marvel/PBS in jeden Napf; Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 h.
6. Dreimaliges Auswaschen der Näpfe mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS; Zupipettieren von 100 ul einer 1 : 5000-Verdünnung von Anti-Schaf-IgG-Antikörper (an Peroxidase konjugiert, Sigma); Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 h.
7. Verwerfen des zweiten Antikörpers und dreimaliges Waschen der Näpfe mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS.
8. Zugabe einer 10 mg ABTS- (2,2'-Azino-bis-(3-ethylenbenzthiazolin-6-sulfonsäure)-diammoniumsalz-) Tablette zu 20 ml 50 mM Citratpuffer, pH 4,5. (50 mM Citratpuffer, pH 4,5, wird hergestellt, indem gleiche Volumina an 50 mM Trinatriumcitrat und 50 mM Citronensäure vermischt werden).
9. Zugabe von 20 ul 30%-iges Wasserstoffperoxid zur obigen Lösung unmittelbar vor dem Ablasssen.
10. Zugabe von 100 ul der obigen Lösung zu jedem Napf; Stehenlassen bei Raumtemperatur für 30 min.
11. Quenchen durch Zugabe von 50 ul 3,2 mg/ml Natriumfluorid; Ablesung bei 405 nm.

Anmerkung 1: "Marvel" ist getrocknetes Milchpulver. PBS ist 5,84 g NaCl, 4,72 g Na&sub2;HPO&sub4; und 2,64 NaH&sub2;PO&sub4;.2H&sub2;O, pH 7,2, in 1 Liter.

Das Ergebnis wird in Fig. 11 gezeigt, wozu erkennen ist, dass die Frage, ob das zugehörige Replicon ein Plasmid oder ein Phagemid ist, wesentliche Auswirkungen auf die Menge an Antikörper hat, die durch fd-DOG befreit wird, das die komplementäre Kette trägt. Das Signal, das von Zellen erzeugt wird, welche die Schwerkette auf pUC19 tragen, ist etwa zehnmal so stark wie jenes von Zellen, welch diese Kette auf pUC119 tragen, wenn mit fd-DOG befreit wird, das die Leichtkette trägt. pHEN liefert ein ähnliches Ergebnis wie pUC119, wenn die Schwerkette in pHEN exprimiert wird und die Leichtkette auf fd-DOG, und umgekehrt. Obwohl es schwach ist, ist das Signal spezifisch, da kein Antikörper erzeugt wird, wenn der hereinkommende Phage die gleiche Kette wie jener auf pHEN trägt. Klarerweise funktioniert auch die Verwendung von Phagen, der eine Kette trägt, zur Befreiung von Phagemid, das die komplementäre Kette trägt, aber das System würde von der Manipulation von Phagen- oder Phagemid-Replicons zur Erleichterung der Interferenz profitieren. Eine Alternative besteht darin, einen Plasmidvektor in Verbindung mit Phagen zu verwenden, was zur Selektion nur einer der beiden Ketten führt. Eine solche Strategie wird in Beispiel 2 eingesetzt.

Beispiel 2: Polykombinatorische Sammlungen

In diesem Beispiel wird ein menschliches VH-Repertoire in fd-DOG kloniert, das die menschliche CH1-Domäne von lgGl (Cγ1-Domäne) trägt. Das Repertoire von Leichtketten wird in pUC19-Sfi/Not/polymyc-Plasmid in Form von Sfi/Not-Fragmenten und getrennt in pHEN-Phagemid kloniert, das an einem Ende von einer Sfi-Stelle und am anderen von Asc- und Not-Stellen flankiert ist.
Fd-DOG-Schwerketten-Phagen werden eingesetzt, um die pUC19-Leichtketten zu "befreien", und der resultierende Phage auf Antigen selektiert. Die Schwerketten-Population wird auf diese Weise verringert, dann mit Primern PCR-amplifiziert, die Acs I- und Not I- Stellen enthalten, und diese Fragmente entlang der unselektierten Leichtketten in pHEN- Phagemid kloniert. Die Gene für beide Ketten befinden sich nun auf dem gleichen Replicon und können nach der Befreiung mit Helferphagen gleichzeitig selektiert werden.
Die bei diesem Beispiel eingesetzten VH-Domänen stammen von IgM, werden aber als IgG1 fd- (d. h. VHCH1-) Fragmente ohne das C-terminale Cystein kloniert.
Die nachstehenden Abschnitte a und b beschreiben die Konstruktion eines fd-DOG-Derivats, das eine menschliche Cγ1-Domäne enthält, aus der die natürliche Apa LI-Stelle gelöscht worden ist. Die Abschnitte e bis g befassen sich mit der Herstellung der Schwer- und Leichtketten-Repertoires. Abschnitt f beschreibt, wie diese Repertoires eingesetzt werden können, um spezifische Antikörperfragmente zu isolieren.

a) Konstruktion von ΔApa LI-Version von CH1

Hier wird die Konstruktion einer ΔApa LI-Version von CH1 beschrieben. Die Konstruktion ist etwas kompliziert, da der primäre Zweck die Konstruktion eines neuen Phagemid-Kloniervektors war, und das Entfernen der Apa LI-Stelle in CH1 nur einen Schritt im Verfahren darstellte. Das neue Phagemid, das die ΔApa LI-Version von CH1 enthält, wurde als Templat im nächsten Abschnitt eingesetzt.
Die natürlich vorkommende Apa LI-Stelle in der menschlichen Cγ1-Domäne wurde mittels "PCR-Mutagenese" gelöscht, wobei teilweise komplementäre Oligonukleotide eingesetzt wurden, die um die Apa LI-Stelle überlappen und diese Sequenz von GTGCAC auf GTGGAC ändern. Es wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt und die beiden Fragmente in einer zweiten PCR-Spleißung durch Überlappungsextension verbunden.
Zwei PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 angesetzt, wobei RJHXHOBACK in Verbindung mit APAOUTFOR und APAOUTBACK in Verbindung mit HUGICYSASCHOT- FOR eingesetzt wurde (Tabelle 1). Das Templat war pUC19 Fab D1.3; dieses Anti-Lysozym-Fab hat die gleiche menschliche IgG CH&sub1;-Domäne wie pUC19 Fab NQ10.12.5, das in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die PCR-Bedingungen waren wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Annelierungstemperatur 55ºC betrug und die Extension bei 72ºC für 1 min erfolgte. Die resultierenden Fragmente wurden zur Assemblierung wie folgt gereinigt:
1. Um kleine Fragmente für Assemblierungs-PCR zu isolieren, werden die PCR-Gemische in einem Röhrchen gesammelt und auf einem 2% LGT- (Nieder-Gelierungstemperatur-) Agarosegel mit TBE-Puffer Elektrophorese unterzogen.
2. Diese Fragmente werden unter Einsatz von SPIN-X-Säulen (Costar) gereinigt.
3. Die Gelscheibe wird in eine SPIN-X-Säulen-Patrone geladen und in Trockeneis 10 bis 15 min lang tiefgefroren.
4. Auftauen der Röhrchen und Wiederholung des Gefrierschritts (fakultativ).
5. Schleudern in einer Mikro-Zentrifuge für 15 bis 30 min (bei etwa 13.000 U/min).
6. Fällung des Filtrats durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, und 2,5 Volumina Ethanol.
7. Abschrecken auf Trockeneis für 15 min. Schleudern für 10 min bei 4ºC mit 13.000 U/min.
8. Waschen des Pellets in 1 ml 70% Ethanol und Trocknung im Vakuum.
9. Verdünnung des gereinigten Linkers in 5 ul Wasser oder TE pro ursprüngliche 50 ul PCR und Messung der Konzentration auf Gel.
Diese Fragmente werden dann durch PCR verbunden. Eine 50 ul-PCR-Reaktion wird wie zuvor angesetzt, wobei diese jeweils 5 ul Fragment, aber keine Primer enthielt. Die Reaktion wird 5 min lang auf 95ºC gehalten, dann siebenmal einem Zyklus aus 1 min bei 94ºC, 1 min bei 68ºC und 1 min bei 72ºC unterzogen. RJHXHOBACK- und HUGICYSASCNOTFOR-Flankierungsoligonukleotide werden dann unter das Öl zugegeben und die Reaktion weitere zehnmal unter den gleichen Bedingungen einem Zyklus unterzogen, wobei die gleichen Bedingungen eingesetzt wurden, um jene Moleküle zu amplifizieren, die korrekt assembliert wurden. Das Reaktionsprodukt wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, dann mit Xho I und Asc I gespalten und gel-gereinigt (jeweils unter Standard-Bedingungen).
Ein zweites Fragment, das den gesamten gIII-Leader plus Polylinker von fd-DOG enthielt, wurde ebenfalls amplifiziert. Fd-DOG DNA wurde mit den Primern G3LASCGTG- BACK und fdseq amplifiziert, mit Asc I und Not I gespalten und gel-gereinigt (jeweils wie in Beispiel 1 beschrieben).
Eine Dreikomponenten-Ligation wurde mit äquimolaren Mengen an Xho I-Not I-gespaltener pHEn-DNA, Xho I-Asc I-gespaltenem Cγ-Fragment und Asc I-Not I-gespaltenem gIII-Leader + Polylinkerfragment angesetzt. Das resultierende Gemisch wurde in TG1 transformiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und Klone mit der Struktur: pHEN-pelB Leader/Sfi I/Nco I/Xho I-Cyl-Asc I/gIII-Leader-Apa LI-Not I/gIII mittels alkalischen Lyse- Minipreps und Restriktionsenzymanalyse identifiziert (Sambrook et al. (1989), s. o.). Die Integrität wurde durch DNA-Sequenzierung (Sambrook et al. (1989), s. o.) verifiziert und ein repräsentativer Klon als pJIM Cγ1gIIIL bezeichnet, der die Cγ1-Domäne trägt, aus der die interne Apa LI-Stelle entfernt wurde.

b) Insertion der CH1-Domäne in fdDOG

Die ΔApa LI-Version von CH1 wurde nun als Templat zur Konstruktion eines fd-DOG- Derivats eingesetzt, das die CH1-Domäne enthält, der die Apa LI-Stelle fehlt. In diesem Konstrukt wurde der C-terminale Cysteinrest, der normalerweise eine Disulfidbindung mit der Leichtkette bildet, mittels PCR mit dem FABNOTFOH-Primer in Serin übergeführt. Dieser Vektor eignet sich nun zum Klonieren des Repertoires von VH-Domänen als Apa LI-Sal I-Fragmente.
50 ng pJIM Cγ1gIIIL-Templat-DNA wurde unter Einsatz der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen in einer 50 ul-Reaktion mit den Primern FDGAM1BAAPA und FABNOT FOH, die Apa LI- und Not I-Stellen einführen, PCR-amplifiziert; der FABNOTFOH-Primer entfernt auch das C-terminale Cystein. Das PCR-Fragment mit etwa 300 bp wurde dann unter Einsatz der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen mit Apa LI und Not I bearbeitet und gespalten. Das Apa LI-Not I-Fragment wurde dann in das Präparat von Apa LI- und Not I-gespaltener fd-DOG-DNA kloniert, die für die in Beispiel 1 beschriebenen Versuche hergestellt wurde, und unter Einsatz der gleichen Verfahren ligiert und in TG1 transformiert.
Die Sequenz des Vektors wurde durch DNA-Sequenzierung (J. Sambrook et al. (1989), s. o.) einstrangiger DNA verfiziert, die aus filamentösen Teilchen isoliert worden war (J. Sambrook et al. (1989), s. o.), die auf herkömmliche Weise (Beispiel 1) unter Einsatz des Primers fdseq präpariert worden waren (Tabelle 1). Der Vektor wurde dann CsCl-gereinigt (J. Sambrook et al. (1989), s.o.) und mit Apa LI und Sal I gespalten. Beide Enzyme stammten von New England BioLabs, und aufeinanderfolgende Spaltungen unter Einsatz von 0,4 Einheiten Enzym/ul wurden bei 37ºC in den Vom Hersteller bereitgestellten Puffern durchgeführt (siehe Beispiel 1).

c) Herstellung von cDNA-Templat

500 ml Blut, das etwa 10&sup8; B-Lymphozyten enthielt, wurde von 2 gesunden Freiwilligen erhalten. Die weißen Blutkörperchen wurden auf Ficoll abgetrennt, und RNA wurde unter Einsatz eines modifizierten Verfahrens hergestellt (G. Cathala, J. Savouret, B. Mendez, B. L. Wesr, M. Karin, J. A. Martial und J. D. Baxter, "A method for isolation of intact, transcriptionally active ribonucleic acid", DNA 2, 329 (1983)). Drei Erststrang-cDNA- Synthesen wurden wie von Marks et al. (1991, s. o.) beschrieben aus RNA hergestellt, die 2,5 · 10&sup7; B-Zellen entsprach, wobei ein IgM-Konstantregion-Primer für die Schwerketten und ein κ- oder λ-Konstantregion-Primer für Leichtketten eingesetzt wurde (Tabelle 1).

d) PCR von Schwerketten

Es wurden zwei Präparate PCR-amplifizierter VH-Gene angefertigt. Bei beiden Präparaten wurde ein äquimolares Gemisch der HUJHFOR-Primer (Tabelle 1) eingesetzt; bei einem der Präparate wurden 6 getrennte PCR-Amplifizierungen mit jenem der HUVH- BACK-Primer einzeln durchgeführt (Tabelle 1), und im anderen wurde eine einzelne PCR-Reaktion mit einem äquimolaren Gemisch aller 6 HUVHBACK-Primer durchgeführt. Für alle sieben PCRs wurden 50 ul-Reaktiongemische hergestellt, die 5 ul des Überstands aus der cDNA-Synthese enthielten, wobei der HUIGMFOR-Primer, 20 umol Gesamtkonzentration an BACK-Primern, 20 umol Gesamtkonzentration der FORWARD- Primer, 250 uM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM Tris.HCl (pH 8,8), 2,0 mM MgCl&sub2;, 100 mg/ml BSA und 1 ul (1 Einheit) Venti DNA-Polymerase (New England Biolabs) eingesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch vurde mit Mineralöl (Paraffinöl) überschichtet und 30 Amplifizierungszyklen unterzogen, wobei ein Techne PHC-2 Thermocycler eingesetzt wurde. Der Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 57 ºC für 1 min (Annelierung) und 72ºC für 1 min (Extension). Die Produkte wurden auf einem 1,5% Agarosegel gereinigt, mittels Geneclean (Bio-101) aus dem Gel isoliert und in 25 ul H&sub2;O resuspendiert. Die sieben Produkte wurden dann gepoolt und "Durchzugs"-("pullthrough"-)PCR-Reaktionen durchgeführt, um Apa LI- und Sal I-Restriktionsstellen vorzusehen.
Die Durchzugsreaktionen wurden mit den Primern HUVHBAAPA (äquimolares Gemisch aller 6 Primer) und HUJHFORSAL (äquimolares Gemisch aller 4 Primer) angesetzt. 50 ml-Reaktionen, die 5 ul der gepoolten PCR-Produkte aus dem vorherigen Schritt enthielten, wurden unter Einsatz der gleichen Bedingungen wie für die primäre PCR amplifiziert, mit der Ausnahme, dass 25 Amplifizierungszyklen eingesetzt wurden. Die resultierenden Fragmente wurden mit Apa LI und Sal I gespalten, gelgereinigt, und die Fragemnte in Apa Li- und Sal I-gespaltenes fd-DOG CH1 ligiert, wie zuvor beschrieben. Die Ligationsgemische wurden vor der Elektroporation in Tg1-Zellen (Beispiel 1) mit Phenol-Chloroform extrahiert. Aliquote der transformierten Zellen wurden auf 2YT Agar plattiert, das mit 15 mg/ml Tetracyclin ergänzt war, und über Nacht bei 37ºC gezüchtet.

e) PCR von Leichtketten

κ- und λ-Kettengene wurden getrennt unter Verwendung eines äquimolaren Gemisches der geeigneten Familie auf Basis von BACK- und FORWARD-Primern amplifiziert (Tabelle 1). κ-Kettengene wurden ausgehend von der cDNA-Synthese unter Einsatz von HUCKFOR-Primer amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 6 HUVKBACK-Primer 1a-6a in Verbindung mit dem HUCKFORSER-Primer eingesetzt wurde. λ-Kettengene wurden ausgehend von der cDNA-Synthese unter Einsatz des HUCLFOR-Primers amplifiziert, und unter Verwendung eines äquimolaren Gemischs der 7 HULBACK-Primer 1-6 in Verbindung mit dem HUCLFORSER-Primer amplifiziert. In jedem Fall wurden 50 ul Reaktionsgemische hergestellt, die 5 ul des Überstands aus der entsprechenden cDNA-Synthese, 20 umol Gesamtkonzentration der BACK-Primer, 20 pmol Gesamtkonzentration der FORWARD-Primer, 250 uM dNTPs 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM Tris.HCl (pH 8,8), 2,0 mM MgCl&sub2;, 100 mg/ml BSA und 1 ul (1 Einheit) Vent-DNA- Polymerase (New England Biolabs) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineralöl (Paraffinöl) überschichtet und 30 Amplifizierungszyklen unter Verwendung eines Techne-Thermocyclers unterzogen. Der Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 57ºC für 1 min (Annelierung) und 72ºC für 2,5 min (Extension). Die Produkte wurden auf einem 2% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel mittels Geneclean (Bio-101) isoliert und in 25 ul H&sub2;O resuspendiert.
Nun wurden an jeder der beiden Leichtketten-Zubereitungen zwei verschiedene Durchzugsreaktionen durchgeführt. κ-Ketten-Gene wurden in zwei Reaktionen amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 6 HUVBASFI-Primer in Verbindung mit entweder HUCKFORSERASCNOT oder HUCKFORSERNOT eingesetzt wurde. λ-Ketten-Gene wurden ebenfalls in zwei Reaktionen amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 7 HUVLBASFI-Primer in Verbindung mit entweder HUCLFORSERASCNOT oder HUCLFORSERNOT eingesetzt wurde. Durchzugsreaktionen wurden wie für die obigen primären Leichtketten-PCRs durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 25 Amplifizierungszyklen eingesetzt wurden. Alle 4 PCR-Produkte wurden mit Nco I und Not I gespalten, wobei die gleichen Bedingungen wie zuvor eingesetzt wurden (Beispiel 1 und oben). Jene κ- und λ-Ketten-Gene, die mit den SERASCNOT-Forwärtsprimern amplifiziert worden waren, wurden in Nco I-Not I-gespaltenes pUC19 Sfi/Nco/Not/polymyc insertiert. Beide Repertoires wurden nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben in TG1 elektroporiert: die Ligationsgemische wurden durch Phenol-Extraktion gereinigt und mit Ethanol gefällt. Die ligierte DNA wurde in 10 ul Waser resuspendiert, und 2,5 ul Proben wurden in 50 ul E.coli TG1 elektroporiert. Zellen wurden in 1 ml SOC 1 h lang vermehrt und dann auf 2YT Agar mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose (2YTAG) in 243 · 243 mm Platten (Nunc) plattiert. Kolonien wurden von den Platten in 10 ml 2YTAG und 15 % Glycerol geschabt, um sie bei -70ºC als Ausgangssammlungen zu lagern.

f) Selektion von Antikörper-Fragmenten

Das Endergebnis der Abschnitte a) bis e) ist die Konstruktion von zwei Leichtketten- Sammlungen und einer Schwerketten-Sammlung. Die Leichtketten-Sammlungen (VLCL) wurden als Nco I-Not I-Fragmente in sowohl pHEN-1 als auch in pUC19 Sfi-Not polymyc kloniert. Die VH-Gene wurden als Apa LI-Sal I-Fragmente in fd-DOG kloniert, das eine menschliche CH1-Domäne (CγI) enthielt, aus der die natürliche Apa LI-Stelle gelöscht worden war (fd-DOG G1CH1).
Das Verfahren wird nun schematisch in Fig. 13 dargestellt. Die pUC19-Schwerketten- Sammlung wird mit der Schwerketten-fd-DOG-Sammlung infiziert, und fd-Phagen produziert, die an ihrer Oberfläche Schwer- und Leichtketten-Kombinationen aufweisen. Diese Phagen werden auf Antigen selektiert (wobei Reinfektionsrunden der Leichtketten-Sammlung und Reselektion eine Option darstellen), und die selektierten Schwerketten-Gene aus dem Phagen-Genom amplifiziert, wobei PCR mit Primer G3LASCGTG- BACK und fdseq eingesetzt wurde.
Der G3LASCGTGBACK-Primer anneliert an fd-DNA stromauf vom Start der natürlichen g3-Signalsequenz und führt eine einzelne Asc I-Stelle und eine Ribosom-Bindungsstelle (RBS) ein. Fdseq anneliert am 5'-Ende des strukturellen Teils von g3 (d. h. stromab von der Signalsequenz-Spaltstelle), stromab von der Not I-Stelle, die Cγ1-Domäne flankierend. Die PCR-Fragmente enthalten daher: Asc I-RBS-g3-Leader-VCHI-Not I. Wenn diese Fragmente als Asc I-Not I-Fragmente in die pHEN-1-Leichtketten-Sammlung kloniert werden, wird die Schwerkette an g3 von pHEN-1 fusioniert, und die Not I-Stelle wird von der myc-Markierung und einem Amber-Codon flankiert.
Phagemid-Teilchen, die von diesen Rekombinationen in einem sup E-Stamm produziert werden, enthalten nicht nur Schwer- und Leichtketten an ihrer Oberfläche, sie enthalten auch die Gene, die sowohl für Schwer- als auch Leichtkette kodieren. Die ein- oder mehrmalige Selektion auf Antigen führt dann zum Isolieren funktioneller Schwer- und Leichtketten-Kombinationen. Diese Klone können dann als lösliche Fragmente auf Antigen-Bindung gescreent werden, wenn die Phagemide in einen Nicht-Suppressor-Stamm wie H82151 transferiert werden. Ein effizientes Seletionsverfahren wäre in diesem Beispiel besonders vorteilhaft.

Beispiel 3: Lösliche kombinatorische Sammlungen

In diesem Beispiel wird entweder die Leichtkette oder das fd-Fragment der Schwerkette (d. h. VHCH1) auf Phagen-Teilchen exprimiert und die komplementäre Kette als lösliches Fragment bereitgestellt. Das Gemisch wird teilweise denaturiert, so dass sich die Ketten trennen, die Domänen aber nicht entfalten. Das Denaturat wird dann langsam durch Dialyse entfernt, wodurch das Aneinanderpacken von Leicht- und Schwerketten ermöglicht wird, so dass sie auf Antigen selektiert werden können. Die Auswirkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Population einer der beiden Ketten (welche auch immer an den Phagen gebunden ist) stark verringert wird und dann durch herkömmliche Techniken gemeinsam mit dem Repertoire von Partnerketten kloniert werden kann.
Dieser Ansatz ist theoretisch haltbar: 1.10¹¹ TU Phagen liefern etwa 10¹² Schwerketten, wenn 2 bis 3 Moleküle Schwerkette pro Phage angenommen werden, und dann erge ben Assays auf TU eine 10-fache Unterschätzung der absolute Anzahl von Phagen. 1 ug einer 25 Kd-Leichtkette bedeutet 2,4.10¹³ Moleküle - ein 10-facher Molüberschuss.
Klarerweise sind viele Variationen dieses Themas möglich, sobald gezeigt wurde, dass das Prinzip dahinter korrekt ist. Beispielsweise könnten die Positionen von Schwer- und Leichtketten umgekehrt werden, und die Ketten selbst könnten aus mehreren verschiedenen Quellen stammen. Beispielsweise könnten menschliche fd-Schwerketten auf Phagen mit Leichtketten aus einem löslichen Leichtketten-Repertoire gemischt werden, das in E.coli exprimiert wurde. Alternativ dazu könnten die Leichtketten aus menschlichem Serum gereinigt werden.
Das folgende Beispiel zeigt nicht nur, dass das Prinzip gültig ist, sondern auch, dass das Verfahren überraschend effizient ist.

a) Herstellung von Schwerketten-Phagen

VHCH1 NQ10.12.5 in fd-DOG war das in Beispiel 1 konstruierte. VHCH1-Anti-TNF in fd-DOG wurde als negativer Vergleich eingesetzt. Dieser Klon wurde aus einem monoklonalen Mäuse-Anti-Tumornekrosefaktor-Antikörper konstruiert. Das VH-Gen dieses Antikörpers wurde PCR-amplifiziert und im Rahmen mittels PCR an die menschliche CH1-Domäne (CγI) gebunden, aus der die natürliche Apa LI-Stelle gelöscht worden war (siehe Beispiel 2) und als Apa LI-Not I-Fragmente in fd-DOG kloniert. Diese Phagen wurden vermehrt und aufkonzentriert wie in Beispiel 1 beschrieben.

b) Herstellung von löslicher Schwer- und Leichtkette NQ10.12.5

Diese wurden aus dem monoklonalen parentalen Mäuse-Antikörper NQ10.12.5 präpariert. Kulturüberstand wurde auf Protein A-Sepharose gereinigt und mittels Amicon Ultrafiltration auf 20 mg/ml aufkonzentriert. Dies wurde dann mit dem gleichen Volumen an 1 M Tris, pH 8,0, verdünnt und 1/10 Volumen 1 M 2-Mercaptoethanol zugegeben; diese Menge an Mercaptoethanol reicht aus, um die Interketten- aber nicht die Intraketten-Disulfidbindungen zu reduzieren. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die freien Thiolgruppen durch Zugabe von 1/10 Volumen 1,5 M Iodacetamid und Inkubation auf Eis für 1 h alkyliert.
Die getrennten Ketten wurden durch Gel-Filtration auf einer Zorbax Biosieves GF250 TSK-Säule (DuPont) gereinigt, die an eine HPLC (Gilson) angeschlossen war. 250 ul Aliquote des reduzierten Gemischs wurden unter den folgenden Bedingungen in 5 M Guanidin-HCl/20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, laufen gelassen:
Strömungsrate = 0,5 ml/min. Fraktionsvolumen = 0,25 ml; Chart-Geschwindigkeit = 10 mm/min. Detektorbereich = 2,0 (280 nm); Druck = bis zu 1.000 psi; Laufzeit = 30 min.
Peakfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, und jene Fraktionen mit reiner Schwer- und Leichtkette in Mischversuchen eingesetzt.

c) Rekombination von Ketten

Die folgenden Gemische wurden angesetzt:
NQ10.12.5-Schwerkettenphage + lösliche NQ10.12.5-Schwerkette
NQ10.12.5-Schwerkettenphage + lösliche NQ10.12.5-Leichtkette
NQ10.12.5-Schwerkettenphage allein
Anti-TNF-Schwerkettenphage + lösliche NQ10.12.5-Schwerkette
Anti-TNF-Schwerkettenphage + Lösliche NQ10.12.5-Leichtkette
Anti-TNF-Schwerkettenphage allein
In jedem Fall wurden 1.10¹¹ TU Phagen mit 25 ug, 10 ug, 5 ug oder 1 ug gereinigter löslicher Leichtkette vermischt und auf 5 M Guanidin HCl/20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, in 900 ul Endvolumen eingestellt. Diese Proben wurden dann in ein Pierce Microdialyzer System 500 eingebracht, mit Visking-Röhren (Nr. 2, Medicell Ltd., London N1 1LX, England) dicht verschlossen. Proben wurden gegen 3x 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 bei 4ºC 38 h lang dialysiert und in ELISA eingesetzt.
Die obige Behandlung (insbesondere der 5M Guanidin-HCl-Schritt) scheint wenige oder keine Auswirkungen auf die Struktur des Phagenteilchens zu haben, zumindest, was die Infektivität betrifft, da es keinen Abfall der TUs der Probe im Verlauf des Versuchs gibt.

d) ELISA, der die Funktionalität neugefalteter Antikörper zeigt

Die Effizienz der Neufaltung wurde mittels ELISA gegen phOX-BSA untersucht, was korrekt neugefaltete Antikörper detektiert. Dieser ELISA wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die wesentliche Beobachtung ist die, dass funktioneller Antikörper tatsächlich gewonnen wird, wenn Schwerketten-NQ10.12.5-Phagen mit gereinigter NQ10.12.5-Leichtkette gemischt werden. Tatsächlich gibt es kaum Unterschiede im Signal, das über den Bereich von Leichtketten-Konzentrationen bis hinunter zu 1 ug erhalten wird, selbst wenn diese Phagen verdünnt werden; aus Gründen der Klarheit werden in Fig. 12 nur die 1 ug-Ergebnisse gezeigt. Daraus ist klar ersichtlich, dass die Stimulation absolut spezifisch ist: Stimulation ist nur zu erkennen, wenn Schwerketten-Anti-OX-Phagen mit Anti-OX-Leichtketten vermischt werden - keine Stimulation ist zu erkennen, wenn Schwerketten-Anti-OX-Phagen allein vorliegen oder wenn Schwerketten-Anti-OX-Phagen mit löslicher Anti-OX-Schwerkette vermischt werden. Auch ist keine Stimulation zu erkennen, wenn Anti-TNF-Schwerketten-Phagen allein eingesetzt werden oder mit Anti-Ox-Schwer- oder -Leichtkette vermischt wurden. Nur wenn die korrekte Schwer- und Leichtketten-Kombination eingesetzt wird, wird ein funktioneller Antikörper produziert.
Dieser Versuch zeigt, dass das Verfahren überraschend gut funktioniert. Die Leichtketten könnten auch aus anderen Quellen stammen, beispielsweise von einer in E.coli konstruierten Sammlung oder von Serum-Antikörper. Das Verfahren funktioniert auch, wenn Schwer- und Leichtketten relativ zu obigen umgekehrt werden, d. h. Leichtketten auf Phagen und lösliche Schwerketten.

Beispiel 4: Humanisierung von Nagetier-Antikörpern unter Einsatz polykombinatorischer Sammlungen und CDR-Imprimierung

CDR3 der Schwerkette erweist sich im Allgemeinen als der variabelste aller CDRs, sowohl was die Länge, als auch, was die Sequenz betrifft, und kann entscheidende Kontakte mit Antigen herstellen (G. Winter und C. Milstein, "Vian-made Antobides", Nature 349, 293-299 (1991)). Das stellt eine wichtige Überlegung beim Humanisieren dar, das durch CDR-Grafting oder Ketten-Umordnung erfolgen kann (PCT/GB91/0134). Die Anmelder haben erkannt, dass es vorteilhaft sein kann, den polykombinatorischen Ansatz auf die Humanisierung durch einen Ketten-Umordnungs-Ansatz anzuwenden, wobei die VHCDR3-Sequenz der Nagetier-Antikörper auf die menschlichen VH-Segmente imprimiert wird.
In diesem Beispiel wurde ein monoklonaler Mäuse-Anti-HIV-gp120-Antikörper humanisiert. Die VH-Domäne dieses Mäuse-Antikörpers wurde an die menschliche Cγ1-Domäne fusioniert und in pUC19Sfi/Not/polymyc kloniert.
Ein Repertoire von als g3-Fusionen in fd-DOG klonierten naiven Leichtketten wurden dann in jene Zellen infiziert, welche die heterozygote Schwerkette trugen, und Phagen auf Antigen selektiert. Diese Phagen weisen sowohl Schwer- als auch Leichtketten an ihrer Oberfläche auf, obwohl das Phagengenom nur für die Leichtkette kodiert; das stellt kein Problem dar, da die einzige Schwerkette die bereitgestellte ist.
Auf diese Weise selektierte Leichtketten wurden dann mit einer Sammlung naiver menschlicher VH-Domänen gepaart, auf solche Weise PCR-amplifiziert, dass der CDR3 der menschlichen Antikörper durch jenen der ursprünglichen Mäuse-Schwerkette ersetzt wurde.
Abschnitt a) beschäftigt sich mit der Konstruktion eines heterozytogen Fab-Fragments, in dem die Mäuse-F58-VH- und -VL-Domänen an menschliche CH1- und CK-Sequenzen fusioniert sind. Dieser Klon diente zu einer frühen Charakterisierung des Antikörpers und als Templat für die nachfolgende PCR-Amplifizierung der Schwerkette, die dann als ein Pstl-Not I-Fragment in pUC19-Sfi-Not-polymyc kloniert wurde (Abschnitt b). Abschnitt c) beschreibt die Konstruktion eines menschlichen Leichtketten-Repertoires in fd- DOG, das dann in Zellen infiziert wurde, welche die heterozygote Schwerkette auf pUC19 enthalten (Abschnitt d): Die resultierenden Phagen wurden gegen das Peptid gepannt (Abschnitt e), Und die selektierten Leichtketten PCR-amplifiziert und als Asc I-Not I-Fragmente entlang der heterozytogen Schwerkette kloniert (Abschnitt f) und einem ELISA-Assay bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung von Antigen unterzogen (Abschnitt g). Selektierte Leichtketten wurden in pUC rekloniert (Abschnitt h) und naive menschliche VH-Domänen mit einem mutagenen Primer amplifiziert, wodurch die Domänen mit der F58-CDR3-Sequenz imprimiert wurden, und die resultierenden Fragmente in Phagen kloniert (Abschnitt i). Dieses Repertoire von imprimierten Schwerketten-Phagen wurde dann eingesetzt, um Zellen zu infizieren, welche die selektierten Leichtketten auf pUC tragen, und die resultierenden Phagen auf Antigen gespannt. Schließlich würden die selektierten Schwer- und Leichtketten gemeinsam auf dem gleichen Replicon kloniert und auf Bindung an Antigen getestet (Abschnitt j).

c) Klonieren von heterozygoter F58-Schwerkette

i) cDNA-Synthese und primäre PCR

5 ml kultivierter Hybridomzellen (etwa 2 · 10&sup6; Zellen) wurden mit PBS gewaschen, pelletiert, in 200 ul 0,1% Diethylpyrocarbonat in Wasser resuspendiert und sofort 5 min lang aufgekocht. Nach dem Zentrifugieren wurden 68 ul des Überstands nach dem Aufkochen einem 28 ul-Reaktionsgemisch zugegeben, was ein 96 ul-Reaktionsgemisch ergab, das 140 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,1, bei 42ºC), 8 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 500 uM Desoxythymidintriphosphat, 500 uM Desoxyadenintriphosphat und 500 uM Desoxyguanintriphosphat als Nukleotidtriphosphate (500 uM dNTPS), 160 Einheiten menschlichen Plazenta-RNAse-Inhibitor und 10 umol Vorwärtsprimer enthielt. 4 ul (100 Einheiten) reverse Transkriptase von Vogel-Myeloblastosevirus (AMV) wurden zugesetzt, die Reaktion bei 42ºC 1 h lang inkubiert, für 3 min auf 100ºC erhitzt, auf Eis abge schreckt und 5 min Lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann sofort für die PCR eingesetzt.
Getrennte PCR-Amplifikationen wurden für die Schwer- und die Leichtketten durchgeführt. Es wurden 50 ul-Reaktionsgemische hergestellt, die 5 ul des Überstands aus der cDNA-Synthese, 250 uM dNTPs, 50 mM KCl, 100 mM Tris, enthielten. HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 175 ug/ml BSA, jeweils 20 umol der entsprechenden Gemische aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (T. Clackson et al. (1991), s. o.) und 1 ul (5 Einheiten) Thermus aquaticus-(Taq-)DNA-Polymerase (Cetus, Emervville, CA, USA) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Paraffinöl überschichtet und 30 Amplifizierungszyklen unterzogen, wobei ein Techne-PHC-2-Thermocycler eingesetzt wurde. Der Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 55ºC für 1 min (Annelierung) und 72ºC für 1 min (Extension). Das Produkt wurde analysiert, indem 5 ul auf einem 2%-Agarosegel laufen gelassen wurden. Der Rest wurde zweimal mit Ether, einmal mit Phenol/Chloroform, extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 50 ul H&sub2;O resuspendiert.

ii) Klonieren und Sequenzieren von amplifizierter VH- und Vk-DNA

Die amplifizierte VH-DNA wurde mit Pstl und BstEII gespalten, auf einem 2%-igen niedrigschmelzenden Agarosegel gereinigt und in M13VHPCR1 ligiert, das mit Pstl und BstEII gespalten worden war (R. Orlandi, D. H. Gussow, P. T. Jones und G. Winter, "Cloning immunoglublin variable domains for expression by the polymerase chain reaction", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(10), 3833-7 (1989)). Die amplifizierte VK-DNA wurde mit PvuII und Bgl II gespalten und in M13VKPCR1 ligiert, das mit Pvu II und Bcl I gespalten worden war. Die Ligationsgemische wurden eingesetzt, um kompetente TG1-Zellen zu transformieren. Zwei Klone von getrennten Amplifizierungen wurden jeweils bezüglich VH- und Vk-Kette sequenziert, wobei das Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren eingesetzt wurde.

iii) Erzeugung eines Fab-Konstruktes zur Expression in E.coli

Ein heterozygotes Fab, das die variablen F58-Domänen und die menschlichen IgG1 CH1- und Ck-Domänen enthielt, wurde konstruiert, indem die F58-V-Domänen in einen Vektor ligiert wurden, der die konstanten Domänen enthielt. M13VHPCR1, welches die F58-VH enthielt, wurde mit Pstl und BstEII gespalten. Das resultierende F58VH-Fragment wurde dann auf 1,5% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel mit Geneclean isoliert und in pJM-1 FabD1.3 ligiert, das mit Pstl und BstEII gespalten worden war (dieser Klon hat die gleichen konstanten Domänen und Restriktionsstellen wie das in Beispiel 1 beschriebene FabNQ10.12.5 - genauer gesagt wurde FabNQ10.12.5 unter Einsatz der konstanten Domänen pJM-1 FabD1.3 konstruiert). Das Ligationsgemisch wurde eingesetzt, um kompetente E.coli N4830-1-Zellen zu Transformieren (M. E. Gottesman, S. Adhya und A. Das, J. Mol. Biol. 140, 57-75 (1980)), und Klone, die F58-VH enthielten, durch Restriktionsanalyse von RF-DNA identifiziert. Die F58-Vk wurde durch PCR mit den Primern Vk2BACK und Vk3FOR2 amplifiziert (T. Clackson et al. (1991), s. o.), wobei M13VKPCR eingesetzt wurde, welches F58-Vk als Templat enthielt. Das PCR-Produkt wurde mit Sacl und Xhol gespalten, auf 1,5% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel mit Geneclean isoliert und in pJM-1 Fab-Vektor ligiert, der F58-VH, gespalten mit Sacl und Xhol, enthielt. Das Ligationsgemisch wurde eingesetzt, um komplete E.coli N4830-1- Zellen zu transformieren, und Klone, welche die F58-Vk enthielten, durch Restriktionsanalyse von RF-DNA identifiziert.

b) PCR und Klonieren von heterozygoter F58-Schwerkette

Die heterozygote F58-Schwerkette wurde aus F58 Fab-Klon-DNA PCR-amplifiziert, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren eingesetzt und die Primer VH1 BACKCSFI- 15 und HUCH1FORASCHOT eingesetzt wurden (Tabelle 1). Das resultierende Fragment mit etwa 700 bp wurde mit Pst I und Not I gespalten und in Pst I- und Not I-gespaltenes pUC19Sfi/Not/polymyc-Plasmid kloniert, wobei Standardverfahren eingesetzt wurden (J. Sambrook et al. (1989), s. o., und Beispiel 1).

c) Konstruktion des Leichtketten-Repertoires

Das Leichtketten-Repertoire wurde unter Einsatz der gleichen Materialien und Bedingungen konstruiert, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Durchzug unter Einsatz folgender Primer durchgeführt wurde:
λ-Ketten: HUVLBAAPA (äquimolares Gemisch aus 1-6) & HUCLFORSERNOT
κ-Ketten: HUVKBAAPA (äquimolares Gemisch aus 1-6) & HUCKFORSERNOT
PCR-Produkte wurden unter Einsatz des Standardformats mit Apa LI und Not I gespalten und in Apa LI- und Not I-gespaltenes fd-DOG kloniert, wie in den Beispielen 1 & 2 beschrieben. Phagen wurden aus den Sammlungsklonen hergestellt, wie in den Beispielen 1 & 2 beschrieben, und eingesetzt, um Schwerkette enthaltendene Zellen zu infizieren (siehe unten).

d) Produktion von umgruppierten Fab-Phagen

Zellen, welche die heterozygote F58-Schwerkette enthielten, wurden über Nacht bei 37 ºC in 2YTAG gezüchtet und 500 ul zu 50 ml frischem, auf 37ºC vorgewärmtem 2YTAmp-Medium in einem Spitzkolben zugegeben. Die Zellen wurden unter Rütteln bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 0,5 gezüchtet, bevor ingesamt 10¹¹ Phagen aus dem Leichtkettenrepertoire zugegeben wurden. Die Kultur wurde 45 min lang ohne Rütteln bei 37ºC stehen gelassen, dann heftig weitere 45 min bei 37ºC gerüttelt, bevor Tetracyclin in 15 ug/ml zugegeben und über Nacht gerüttelt wurde.
Die Phagen wurden durch PEG-Fällung des Kulturüberstands geerntet, wie zuvor beschrieben (Beispiele 1 und 2) und für Selektionsversuche eingesetzt.

e) Panning von gemischten Fab-Phagen

Dies erfolgte auf Maxisorb-Platten, wie zuvor beschrieben (J. Marks et al. (1991), s. o.), mit der Ausnahme, dass die Röhrchen mit env gp 120 V3-Schleifenpeptid von HIV-1-iso liertem IIIB, gelöst mit 10 ug/ml in Wasser, beschichtet wurden. Dieses Peptid wurde aus dem AIDS-Programm (Quellenverweis: ADP737) erhalten und hat die Sequenz:
CTRPNNNTRRSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCN
Die aus den Röhrchen eluierten Phagen wurden eingesetzt, um frische Zellen, welche die heterozygote F58-Schwerkette enthielten, zu reinfizieren, und das Panning/Reinfektionsverfahren weitere dreimal wiederholt.

f) Reklonierung selektierter Leichtketten

Selektierte Leichtketten wurden aus fd-DOG Leichtketten-DNA PCR-amplifiziert, wobei die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren und die Primer G3LASCGTGBACK und HUCLFORSERNOT oder HUCKFORSERNOT eingesetzt wurden. Der G3LASCGTGBACK-Primer anneliert stromauf vom Translationsstart des gIII-Signals in fd und führt eine Asc I-Stelle und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) ein. Diese Fragmente wurden mit Asc I und Not I gespalten und in Asc I- und Not I-gespaltenes pUC19F58-Plasmid kloniert (wie in Fig. 13 gezeigt), um ein Cistron zu erzeugen, wodurch die Herstellung von löslichem Fab ermöglicht wurde. Dieses wurde mittels ELISA auf Peptidbindung analysiert und gebundener Antikörper dank des myc-Marker-Peptids am Ende der Leichtkette detektiert.

g) ELISA

Dieser wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt
1. Einimpfen von 100 ul 2xTY, 100 mg/ml Ampicillin, 1% Glucose in 96-Napf-Platten ("Cell wells", Nuclon) und Vermehrung unter Rütteln (300 U/min) über Nacht bei 37ºC.
2. Verwendung einer 96-Napf-Transfer-Vorrichtung, um kleine Inocula aus dieser Platte auf eine zweite 96-Napf-Platte zu übertragen, die 200 ml frisches 2xTY, 100 mg/ml Ampicillin, 0,1% Glucose pro Napf enthält. Vermehrung bei 37ºC, Rütteln, bis die OD600nm etwa 0,9 beträgt (etwa 3 h). Einfüllen von 25 ul 60% Glycerin pro Napf und Lagerung bei -70ºC.
3. Zugabe von 25 ul 2xTY, 100 mg/ml Ampicillin, 9 mM IPTG (Endkonzentration 1 mM IPTG); Fortsetzung des Rüttelns bei 30ºC für weitere 16 bis 24 h.
4. Schleudern bei 4.000 U/min für 10 min lang Verwendung von 100 ul Überstand für ELISA.
5. Beschichtung der Platte (Falcon 3912) mit 50 ul Peptid mit 10 ug/ml in Wasser pro Napf; Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur.
6. Spülen der Näpfe 3x mit PBS und mit 200 ul pro Napfan 1% BSA/PBS, Blockieren für 1 h bei 37ºC.
7. Spülen der Näpfe 3x mit PBS, anschließendes Einfüllen von 25 ul 6% BSA/PBS in jeden Napf.
8. Zusatz von 100 ul Kulturüberstand, der lösliche Fab enthält, zu den entsprechenden Näpfen; Vermischung, Stehenlassen bei Raumtemperatur für 1,5 h.
9. Verwerfen der Testlösung und dreimaliges Auswaschen der Näpfe mit PBS, 0,05 % Tween 20, und dreimal mit PBS.
10. Verwerfen von 9E10-Antikörper und dreimaliges Auswaschen der Näpfe mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS. Einpipettieren von 100 ul (1 : 500-Verdünnung) Anti-Mäuse-Antikörper (peroxidase-konjugierte Anti-Mäuse-Immunglobuline, Dakopats/ICN, oder peroxidase-konjugierten Anti-Mäuse-IgG, Fc-spezifisch, Sigma A-2554). Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 h.
11. Verwerfen des zweiten Antikörpers und dreimaliges Auswaschen der Näpfe mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS.
12. Zugabe einer 10 mg ABTS-(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)diammoniumsalz-) Tablette zu 20 ml 50 mM Citratpuffer, pH 4,5. (50 mM Citratpuffer, pH 4,5, wird hergestellt, indem gleiche Volumina an 50 mM Trinatriumcitrat und 50 mM Citronensäure vermischt werden).
13. Zugabe von 2 ul 30% Wasserstoffperoxid zur obigen Lösung unmittelbar vor dem Ablassen.
14. Zugabe von 100 ul der obigen Lösung zu jedem Napf. Stehenlassen für 20 bis 30 min bei Raumtemperatur.
15. Quenchen durch Zugabe von 50 ul 3,2 mg/ml Natriumfluorid. Ablesung bei 405 nm.
Anmerkung 1: Alternativ dazu Einimpfen der Klone von der Transformationsplatte in 100 l 2xTY, 100 mg/ml Ampicillin, 0,1 % Glucose in 96-Napf-Platten ("Zellnäpfe", Nuclon) und Vermehrung unter Rütten (300 U/min) bei 37ºC; Rütteln bis die OD600nm etwa 0,9 beträgt (etwa 6 h). Fortfahren mit Schritt 3.
Anmerkung 2: Dieses Verfahren basiert auf jenem von D. DeBellis und I. Schwartz, Nucl. Acids Res. 18, 1311 (1990), und basiert auf den geringen Glucosemengen, die im Ausgangsmedium vorhanden sind, das metabolisiert wird, wenn der Inducer (IPTG) zugesetzt wird.
Anmerkung 3: "Marvel" ist getrocknetes Milchpulver. PBS ist 5,84 g NaCl, 4,72 g Na&sub2;HPO&sub4; und 2,64 g NaH&sub2;PO&sub4;.2H&sub2;O, pH 7,2, in 1 l. BSA ist Rinderserumalbumin.

h) Subklonieren selektierter Leichtketten

Leichtketten wurden ausgehend von DNA selektierter Klone PCR-amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 7 HUVLBASFI-Primer in Verbindung mit HUCLFORSERASCNOT oder ein äquimolares Gemisch der 6 HUVKBASFI-Primer in Verbindung mit HUGKFORSERASCNOT eingesetzt wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben. PCR-Fragmente wurden mit Sfi I und Not I gespalten und in Sfi I- und Not I-gespaltenes pUC19Sfi/Not/polymyc kloniert, dann in TG1 transformiert.
Das oben beschriebene Panning-/Infektions-Verfahren wird im wesentlichen nochmal wiederholt, wobei diesmal die Positionen der Schwer- und Leichtketten umgekehrt werden.

i) CDR-Imprimierung von VH

VH-Domänen wurden ausgehend von dem in Beispiel 2 beschriebenen, gepoolten, primären PCR-Material amplifiziert. 6 Getrennte Durchzugsreaktionen wurden mit dem mutagenen F58GRAFTJH4SAL-Primer und jedem der HUVHBAAPA-Primer 1-6 einzeln durchgeführt. Die Bedingungen für den Durchzug waren die gleichen wie in Beispiel 2(d), mit der Ausnahme, dass die Annelierungstemperatur auf 45ºC gesenkt wurde.
Die resultierenden VH-Fragmente wurden gepoolt und unter Einsatz von Standard-Bedingungen mit Apa LI und Sal I gespalten und unter Einsatz von Standard-Vorschriften in Apa LI- und Xho I-gespaltenes fd-DOG-G1CH1 kloniert (Sal 1 und Xho I erzeugen kompatible CTAG-Überhänge). Phagen wurden aus dieser Sammlung wie oben beschrieben erhalten, wobei diesmal der Schwerketten-Phage eingesetzt wurde, um Zellen zu infizieren, welche die in pUC19Sfi/Not/polymyc exprimierten selektierten Leichtketten trugen.

j) Screenen der fertigen Schwer/Leicht-Kombinationen

Das Endergebnis dieses Verfahrens ist ein Pool selektierter Schwerketten und ein Pool selektierter Leichtketten. Diese werden nun statistisch kombiniert. Schwerketten-Klone werden nun unter Einsatz eines äquimolaren Gemisches aller 6 HUVHBACKSFI-Primer in Verbindung mit HUCH1FORASCNOT PCR-amplifiziert, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren eingesetzt wird. Diese Fragmente werden mit Sfi I und Asc I gespalten und unter Einsatz von Standard-Verfahren gelgereinigt (Beispiel 1), dann an äquimolare Mengen Asc I- und Not I-gespaltene Leichtketten, wie im obigen Schritt f) hergestellt, und an Not I-gespaltenen pUC19Sfi/Not/polymc-Vektor, ebenfalls zuvor hergestellt, ligiert. Alternativ dazu ersetzten diese Sfi I-Asc I-Fragmente die F58-Schwerkette in den am Ende von Fig. 13 (A) gezeigten Konstrukten. Diese Konstrukte wurden dann in TG1 transformiert und mittels ELISA, wie oben beschrieben, bezüglich Peptid-Bindungsaktivität analysiert.
Die Endprodukte sind vollständig menschliche Fab-Fragmente mit der gleichen oder ähnlichen Antigen-Spezifität wie der Ausgangs-Nagetier-Antikörper.

Beispiel 5

Freilegen von Einzelketten Fv- und Fab-Fragmenten, abgeleitet vom Anti-Oxazolon- Antikörper NQ10.12.5 auf Bakteriophagen fd unter Einsatz von pHEN1 und fdCAT2

Eine. Bandbreite von Konstrukten (siehe Fig. 18) wurde aus einem Klon (im Wesentlichen Konstrukt III in pUC19) hergestellt, der für die Expression eines löslichen Fab-Fragments (Better et al. (1988), s. o.) vom Mäuse-Anti-phOx-(2-Phenyl-5-oxazolon-)Antikörper NQ10.12.5. in Bakterien bestimmt war (G. M. Griffiths et al., Nature 312, 271-275, (1984)). In Konstrukt II stammen die V-Bereiche von NQ10.12.5 und sind an menschliche konstante Ck- und CH1- (1 Isotyp) Domänen gebunden. Die C-terminalen Cysteinreste, die normalerweise eine kovalente Bindung zwischen leichten und schweren Antikörperketten bilden, sind aus beiden konstanten Domänen gelöscht worden. Um Schwer- und Leichtkettengene zusammen als Fab-Fragmente (Konstrukt II) oder als getrennte Ketten (Konstrukte III und IV) für Phagen-Freilegung zu klonieren, wurde DNA aus Konstrukt II durch PCR amplifiziert, um eine NotI-Restriktionsstelle am 3'-Ende und am 5'-Ende entweder eine ApaLI-Stelle (zum Klonieren in fd-CAT2) oder eine Sfil-Stelle (zum Klonieren in pHEN1) einzuführen. Die Primer FABNOTFOK mit VH1BACKAPA (oder VH1BACKSFI15) wurden zur PCR-Amplifizierung von Genen eingesetzt, die für Fab-Fragmente kodieren (Konstrukt II), die Primer FABNOTFOH mit VH1BACKAPA (oder VH1BACKSFI15) für Schwerketten (Konstrukt III) und die Primer FABNOTFOK und MVKBAAPA (oder MVKBASFI) für Leichtketten (Konstrukt IV).
Die Einzelketten-Fv-Version von NQ10.12.5 (Konstrukt I) weist die variablen Schwerketten- (VH-) und Leichtketten- (Vk-) Domänen, verbunden über einen flexiblen Linker (Gly&sub4;Ser)&sub3; (J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883 (1988)) auf und wurde aus Konstrukt II durch "Spleißen mittels Überlappungsextension" wie in Beispiel 14 der WO 92/01047 konstruiert. Die assemblierten Gene wurden mit den Primern VK3F2NOT und VH1BACKAPA (oder VH1BACLSFI15) reamplifiziert, um die Restriktionsstellen für Klonierung in fd-CAT2 (ApaLI-NotI) oder pHEN1 (Sfil-NotI) anzubinden.

Restriktionsstellen sind unterstrichen

Befreiung von Phagen- und Phagemidteilchen

Die Konstrukte I-IV (Fig. 18) wurden sowohl in td-CAT2 als auch pHEN1 eingebracht. Phage fd-CAT2 (und fd-CAT2-I, -II, -III oder -IV) wurde aus dem Überstand von infizierten E.coli TG1 nach Rütteln bei 37ºC über Nacht in 2 xTY-Medium mit 12,5 ug/ml Te tracyclin aufgenommen und direkt für ELISA eingesetzt. Phagemid pHEN1 (und pHEN1- I und -II) in E.coli TG1 (supE) wurde über Nacht in 2 ml 2xTY-Medium, 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose gezüchtet (ohne Glucose verhindert die Expression von g3p die spätere Superinfektion durch Helferphagen). 10 ul der über Nacht gebildeten Kultur wurden eingesetzt, um 2 ml 2xTY-Medium, 100 ug/ml Ampicillin, 1% Glucose einzuimpfen, und bei 37ºC 1 h lang gerüttelt. Die Zellen wurden gewaschen und in 2xTY, 100 ug/ml Ampicillin, resuspendiert und Phagemidteilchen durch Zugabe von 2 ul (10&sup8; pfu) VCSM13-Helferphagen (Stratagene) befreit. Nach Wachstum für 1 h wurden 4 ul Kanamycin (25 mg/ml) zugegeben und die Kultur über Nacht gezüchtet. Die Phagemidteilchen wurden durch Fällung mit Polyethylenglykol für den ELISA 10-fach aufkonzentriert.

ELISA

Detektion von Phagenbindung an 2-Phenyl-5-oxazolon (phOx) wurde wie in Beispiel 9 durchgeführt. 96-Napf-Platten wurden mit 10 ug/ml phOx-BSA oder 10 ug/ml BSA in PBS über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet und mit PBSS blockiert, das 2% Magermilchpulver enthielt. Phage(mid)-Überstand (50 ml), vermischt mit 50 ul PBS, das 4 Magermilchpulver enthielt, wurde den Näpfen zugegeben und einem Assay unterzogen. Um die Bindung von löslichen scFv- oder Fab-Fragmenten, sekretiert aus pHENI, zu detektieren, wurde die von Munro und Pelham (1986), s. o., beschriebene c-myc- Peptidmarkierung unter Einsatz des monoklonalen anti-myc-9E10 (G. I. Evan et al., Mol. Cell Biol. 5, 3610-3616 (1985)) detektiert, gefolgt von Detektion mit peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Mäuse-Immunglobulin. Andere Details sind die gleichen wie in Beispiel 9.
Die Konstrukte in fdDOG1 und pHEN1 legen Antikörper-Fragmente der Oberfläche von filamentösen Phagen frei. Der Phagenvektor fd-DOG1 (Fig. 16) basiert auf dem Vektor fd-tet (A. N. Zacher et al., Gene 9, 127-140 (1980)) und weist Restriktionsstellen (ApaLI und NotI) zur Klonierung von Antikörpergenen (oder anderen Protein-Genen) für die Expression als Fusionen am N-Termius des Phagen-Hüllproteins g3p auf. Transkription der Antikörper-g3p-Fusionen in fed-DOG1 wird vom Gen III-Promotor gesteuert und das Fusionsprotein durch den g3p-Leader in das Periplasma abgezielt. Durch ELISA wurde gezeigt, dass sich Fab und scFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Freilegung in fd- DOG1 kloniert wurden, an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden. Es wurde angenommen, dass Phagen sich binden, wenn die A405 der Probe im ELISA zumindest um das Zehnfache größer war als der Hintergrund.
Der Phagemidvektor pHENI (Fig. 17) basiert auf pUC119 und enthält Restriktionsstellen (Sfil und NotI) zum Klonieren der Fusionsproteine. Hier wird die Transkription von Antikörper-g3p-Fusionen durch den induzierbaren lacZ-Promotor gesteuert und das Fusionsprotein durch den pelB-Leader in das Periplasma zielgerichtet. Phagemid wurde mit VSM13-Helferphagen in 2xTY-Medium befreit, das keine Glucose oder IPTG enthielt: unter diesen Bedingungen gibt es ausreichende Expression von Antikörper-g3p. Durch ELISA wurde gezeigt, dass sich Fab- und svFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Freilegung in pHEN1 kloniert worden waren, an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden (Tabelle 2), wobei das gleiche Kriterium wie oben eingesetzt wurde.
Eine alternative Methodik zur Herstellung von Sammlungen von Fab-Fragmenten, die an der Oberfläche von Phagen exprimiert werden, wäre folgende:
1. Herstellung einer Sammlung von Phagen, die Schwerketten (VHCH)-Gene exprimieren, aus Inserts im Phagengenom.
2. Herstellung einer Sammlung aus Leichtketten-Genen in einem Plasmidexpressionsvektor in E.coli, vorzugsweise einem Phagemid, und Isolieren der ausgehend von dieser Sammlung exprimierten löslichen Leichtketten.
3. Binden der löslichen Protein-Leichtketten aus der Sammlung an die Schwerketten- Sammlung, die auf Phagen freiliegt.
4. Selektieren von Phagen mit den gewünschten Eigenschaften von Affinität und Spezifität.
Diese kodieren für die Schwerketten-(VHCH-)Gene.
5. Isolieren der Leichtketten-Gene, die für Leichtketten kodieren, die in Kombination mit den selektierten Schwerketten geeignete Antigen-Bindungsstellen bilden, vorzugsweise unter Einsatz von Superinfektion von Bakterien, welche die Leichtkette exprimierendes Phagemid enthalten, mit Phagen, der die selektierte Schwerkette exprimiert, und dann Assay auf Antigen-Bindung.

Beispiel 6

Befreiung von Phagemid, das für eine Gen III-Proteinfusion mit Antikörper-Schwer- oder -Leichtketten kodiert, durch Phagen, die für die komplementäre Antikörper-Kette kodieren, die auf Phagen freiliegt, und Einsatz dieser Technik um doppelkombinatorische Sammlungen zu erzeugen

Bei statistischen kombinatorischen Sammlungen gibt es eine Einschränkung für die potentielle Vielfalt freigelegter Fab-Fragmete aufgrund der Transformationseffizienz bakterieller Zellen. Hier wird eine Strategie beschrieben (doppelkombinatorische Sammlungen), um dieses Problem zu überwinden, wobei potentiell die Anzahl an erfassten Phagen um einen Faktor von 10&sup7; vergrößert wird.
Zum Zusammenstellen von Schwer- und Leichtketten, die ausgehend von verschiedenen Vektoren exprimiert werden, wurde Phagemid (pHEN1-III oder -IV) in E.coli HBV- 2151 (einem Nicht-Supressorstamm) vermehrt, um die Produktion löslicher Ketten zu ermöglichen, und wie oben befreit, mit der Ausnahme, dass Helferphagen, die Partnerketten als Fusionen an g3p exprimieren (10&sup9; TU fd-DOG1-IV bzw. -III) und 2 ul Tetracyclin (12,5 mg/ml) anstelle von Kanamycin eingesetzt wurden.
Getrennte Vektoren zum Kodieren für Fab-Schwer- und -Leichtketten Für die Schwer- und Leichtketten von Fab-Fragmenten kann gemeinsam im gleichen Vektor oder in verschiedenen Vektoren kodiert werden. Um das zu zeigen, wurde die Schwerkette (Konstrukt III) in pHEN1 (um lösliche Fragmente bereitzustellen) und die Leichtkette (Konstrukt IV) in fd-DOG1 kloniert (um die Fusion mit g3p zu erzeugen). Das in E.coli HB2151 gezüchtete Phagemid pHEN1-11 (Nicht-Supressor) wurde mit fd- DOG1-IV Phage befreit und gezeigt, dass sich Phage(mid) an phOx:BSA, nicht aber an BSA bindet (Tabelle 2). Dies zeigt, dass lösliche Leichtkette korrekt mit Schwerkette assoziiert, die an g3p verankert ist, da weder Schwerkette noch Leichtkette allein Antigen bindet (Tabelle 2).
Ähnliche Versuche wurden im umgekehrten Versuch (mit Phagemid pHEN-1-IV und fd- CAT2-III-Phagen) erzielt, bei dem Schwerkette als lösliches Molekül erzeugt wurde und die Leichtkette an g3p verankert war (Tabelle 2). Somit wird ein Fab-Fragment durch Fusion von entweder Schwer- oder Leichtkette an g3p an der Oberfläche von Phagen assembliert, mit der Maßgabe, dass die andere Kette unter Einsatz des gleichen oder eines anderen Vektors sekretiert wird (Fig. 19).
Die resultierende Phagen-Population ist ein Gemisch aus Phagen und befreitem Phagemid. Das Verhältnis zwischen den beiden Arten von Teilchen wurden durch Infizieren von 10 g-Phasen-E.coli TG1 und Plattieren auf TYE-Platten mit entweder 15 ug/ml Tetracyclin (um bezüglich fd-DOG1 zu selektieren) oder 100 ug/ml Ampicillin (um bezüglich pHEN1 zu selektieren) bewertet. Der Titer von fd-DOG1-Phage betrug 5 · 10¹¹ TU/ml, und der Titer von pHEN1 2 · 10¹&sup0; TU/ml, was auf ein Packungsverhältnis von 25 Phagen pro Phagemid hinweist.
Hier wird eine alternative Strategie demonstriert, die die Freilegung der heterodimeren Antikörper-Fab-Fragmente an der Oberfläche von Phagen umfasst. Eine der Ketten wird an g3p fusioniert, und die andere wird in löslicher Form in den periplasmatischen Raum von E.coli sekretiert, wo es nicht-kovalent mit der g3p-Fusion assoziiert und sich spezi fisch an Antigen bindet. Entweder die Leicht- oder die Schwerkette kann an das g3p fusioniert werden: sie werden auf dem Phagen als Fab-Fragmente freigelegt und binden Antigen (Fig. 19). Beschrieben werden sowohl Phagen- als auch Phagemidvektoren für die Oberflächen-Freilegung. Phagemid- sind Phagenvektoren vermutlich überlegen, was die Erzeugung großer Phagen-Freilegungssammlungen betrifft. Besonders im Hinblick auf ihrer höheren Transfektionseffizienzen (zwei bis drei Größenordnungen höher), was die Konstruktion größerer Sammlungen ermöglicht. Der Phagemidvektor pHEN1 ermöglicht auch die Expression löslicher Fab-Fragmente in Nicht-Supressor-E.coli.
Ebenfalls gezeigt wird hier, dass Schwer- und Leichtketten, für die auf demselben Vektor (Konstrukt 11) oder auf unterschiedlichen Vektoren (Konstrukte III und IV) kodiert wird, als Fab-Fragmente freigelegt werden können. Das bietet zwei unterschiedliche Möglichkeiten, statistische Kombinationssammlungen für die Freilegung herzustellen. Sammlungen von Schwer- und Leichtkettengenen, durch PCR amplifiziert, können statistisch durch ein "PCR-Assemblierungs"-Verfahren (Beispiel 14 der WO 92/101047), basierend auf dem "Spleißen durch Überlappungsextension" verbunden, in Phage(mid)-Freilegungsvektoren kloniert und als Teil des gleichen Transkripts (Konstrukt II) wie oben ausgehend von demselben Promotor oder aber von verschiedenen Promotoren als getrennte Transkripte exprimiert werden. Hier kodiert der Phage(mid)-Vektor für beide Ketten und legt sie frei. Bei einer kombinatorischen Sammlung aus 10&sup7; Schwerketten und 10&sup7; Leichtketten ist die potentielle Diversität freigelegter Fab-Fragmente (10¹&sup4;) durch die Transfektionseffizienz baktierieller Zellen durch den Vektor begrenzzt (bestenfalls etwa 10&sup9; Klone pro ug gespaltenem und ligiertem Plasmid) (W. J. Dower et al., Nucl. Acids. Res. 16, 6127-6145 (1988)). So erzeugte Sammlungen sind zu dem von W. D. Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989), beschriebenen Verfahren für statistische kombinatorische Sammlungen analog, weisen aber das wichtige zusätzliche Merkmal auf, dass die Freilegung an der Oberfläche von Phagen ein wirksames Verfahren zum Selektieren von Antikörper-Spezifitäten aus der großen Anzahl an erzeugten Klonen darstellt.
Alternativ dazu könnten Sammlungen aus Schwer- und Leichtketten in verschiedene Vektoren zur Expression in der gleichen Zelle kloniert werden, wobei ein Phagenvektor für die g3p-Fusion und ein Phagemid für die lösliche Kette kodiert. Der Phage wirkt als Helfer, und die infizierten Bakterien produzieren sowohl gepackten Phagen als auch Phagemid. Jeder Phage oder jedes Phagemid legt beide Ketten frei, kodiert aber nur für eine Kette und somit nur für die genetische Information für die Hälfte der Antigen-Bindungsstelle. Die Gene für beide Antikörperketten können jedoch durch Plattieren auf dem selektiven Medium getrennt gewonnen werden, was auf ein Mittel hinweist, anhand dessen zueinander komplementäre Paare von Antigen bindenden Schwer- und Leichtketten-Kombinationen aus statistischen kombinatorischen Sammlungen selektiert werden können. Beispielsweise könnte ein Leichtketten-Repertoire auf fd-Phagen eingesetzt werden, um Zellen zu infizieren, die eine Sammlung löslicher Schwerketten auf dem Phagemid beherbergen. Die affinitätsgereinigte Phagemidsammlung könnte dann eingesetzt werden, um E.coli zu infizieren, mit der affinitätsgereinigten Phagensämmlung befreit werden und die neue kombinatorische Sammlung einer weiteren Selektionsrunde unterzogen werden. Somit werden Antikörper-Schwer- und -Leichtketten-Gene nach jeder Reinigungsrunde umgeordnet. Schließlich können nach mehreren Runden infizierte Bakterien plattiert und einzeln auf Antigen bindenden Phagaen gescreent werden. Solche "doppel"-kombinatorischen Sammlungen sind potentiell vielfältiger als jene, für die auf einem einzigen Vektor kodiert wird. Durch das Kombinieren getrennter Sammlungen auf 10&sup7; Leichtkettenphage(mide)n, ist die Diversität der freigelegten Fab- Fragmente (potentiell 10¹&sup4;) nur durch die Anzahl an Bakterien (10¹² pro Liter) begrenzt. Einfacher gesagt, die Verwendung zweier Vektoren sollte auch die Konstruktion "hierarchischer" Sammlungen erleichtern, bei denen ein fixierte Schwer- oder Leichtkette mit einer Sammlung oder Partnern gepaart ist, was ein Mittel zur "Feinabstimmung" von Antikörper-Affinität und -Spezifität darstellt.

TABELLE 1: ZUR VERWENDUNG FÜR PCR MENSCHLICHER IMMUNGLOBLUIN-GENE EINGESETZTE OLIGONUKLEOTID-PRIMER

Alle Primer sind in Richtung 5' zu 3' angeschrieben A) Allgemeine Fab-Primer
Restriktionsstellen sind unterstrichen B) PRIMER ZUM MANIPULIEREN MENSCHLICHER CH1-DOMÄNE C) PRIMER ZUR SYNTHESE DES ERSTEN dDNA-STRANGS Menschlicher IgM-Konstantregion-Primer C) SCHWERKETTEN-POL PRIMER Mensliche VH-Rückwärtsprimer Menschliche JH-Vorwärtsprimer VH RÜCKWÄRTSDRIMER MIT APA LI-STELLEN. JHSAL-PRIMER D) LEICHTKETTEN-PCL-PRIMER λRÜCKWÄRTSPRIMER MIT SFI-STELLEN κ-RÜCKWÄRTSPRIMER MIT SFI-STELLEN VORWÄRTSPRIMER Menschliche Vκ-Rückwärtsprimer Menschliche λ-Rückwärtsprimer E) PCL/CDR-GRAFTINGPRIMER λ-RÜCKWÄRTSPRIMER MIT APA LI-STELLEN κ-RÜCKWÄRTSPRIMER MIT APA LI-STELLEN MENSCHLICHE VH-RÜCKWÄRTSPRIMER Tabelle 2
Überlick über phOx-BSA-ELISA-Ergebnisse von Phagen- und Phagemidkonstruktionen
* Phagen wurden als "bindend" betrachtet, wenn die OD&sub4;&sub0;&sub5; der Probe im ELISA zumindest um das 10-fache höher war als der Hintergrund.
&spplus; E.coli TG1 wurde zur Vermehrung der Phagen eingesetzt, sofern nicht die Verwendung von E.coli HB2151 spezifisch angegeben ist;
# Information von der genetischen Struktur und entsprechend den Bindungsdaten abgeleitet;
§ Ergebnis experimentell durch Western-Blot bestätigt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung spezifischer Bindungspaar-(spb-)Elemente, umfassend eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

das Einbringen in bakterielle Wirtszellen

(i) erster Vektoren, die Nukleinsäure umfassen, die für eine genetisch andersartige Population der ersten Polypeptidkette, fusioniert an eine Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen zum Freilegen der Polypeptidketten an der Oberfläche von sekretiertem Bakteriophagen kodiert, und

(ii) zweiter Vektoren, die Nukleinsäure umfassen, die für eine genetisch andersartige Population der zweiten Polypeptidkette kodiert;

wobei die ersten Vektoren in infektiöse Bakteriophagen gepackt werden und ihr Einbringen in bakterielle Wirtszellen durch Infektion in Wirtszellen erfolgt, welche die zweiteh Vektoren beherbergen, oder

die zweiten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen gepackt werden und ihr Einbringen in bakterielle Wirtszellen durch Infektion in Wirtszellen erfolgt, welche die ersten Vektoren beherbergen; und

das Exprimieren der ersten und zweiten Polypeptidkette innerhalb der Wirtszellen, um eine Sammlung der sbp-Elemente zu bilden, die der sekretierte Bakteriophage freigelegt hat, wobei zumindest eine der Populationen aus Nukleinsäure exprimiert wird, die dann in sekretierten Bakteriophagen gepackt wird, wodurch das genetische Material jedes solchen sekretierten Bakteriophagen für eine Polypeptidkette des an seiner Oberfläche freigelegten sbp-Elements kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eine der Populationen ausgehend von einem Phagenvektor exprimiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin zumindest eine der Populationen ausgehend von einem Phagemidvektor exprimiert wird, wobei das Verfahren die Verwen dung eines Helfer-Phagen oder eines ergänzende Phagengene exprimierenden Plasmids umfaßt, um das Packen des Phagemidgenoms zu unterstützen.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Polypeptidkette ausgehend von Nukleinsäure exprimiert wird, die dann in sekretierten Bakteriophagen gepackt wird, wodurch für beide der Polypeptidketten kodierende Nukleinsäure in jeweiligen sekretierten Bakteriophagen gepackt wird.

5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches das Einbringen von Vektoren, die zum Exprimieren einer Population der ersten Polypeptidketten fähig sind, in Wirtsorganismen umfaßt, die eine Population der zweiten Polypeptidketten in freier Form exprimieren, oder das Einbringen von Vektoren, die zum Exprimieren einer Population der zweiten Polypeptidketten in freier Form fähig sind, in Wirtsorganismen, die eine Population der ersten Polypeptidketten exprimieren.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die zweiten Polypeptidketten jeweils als Fusion mit einer Komponente eines Bakteriophagen exprimiert werden, der dadurch die zweiten Polypeptidketten an der Oberfläche von sekretiertem Bakteriophagen freilegt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, welches das Herbeiführen oder Ermöglichen von Rekombination zwischen den ersten und zweiten Vektoren innerhalb der Wirtszellen umfaßt, was rekombinante Vektoren ergibt, von denen jeder Nukleinsäure umfaßt, die für eine solche erste Polypeptidkette und eine solche zweite Polypeptidkette kodiert und dann in sekretierten Bakteriophagen gepackt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Rekombination durch den Einschluß von Sequenzen in die ersten und zweiten Vektoren gefördert wird, an denen stellenspezifische Rekombination erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Sequenzen, an denen stellenspezifische Rekombination erfolgt, loxP-Sequenzen sind, und stellenspezifische Rekombination durch Cre-Rekombinase katalysiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors exprimiert wird.

11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin sämtliche Populationen der Polypeptidketten abgeleitet sind von:

(i) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene eines mit komplementärem sbp-Element immunisierten Tieres;

(ii) dem Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene eines nicht mit komplementärem sbp-Element immunisierten Tieres;

(iii) einem Repertoire eines oder mehrerer künstlich umgeordneter Immunglobulin-Gene;

(iv) einem Repertoire eines oder mehrerer Immunglobulinhomolog-Gene; oder

(v) einem Repertoire von Sequenzen, die von einem oder mehreren Keimlinien- Immunglobulin-Genen abgeleitet sind;

(vi) einem Repertoire eines oder mehrerer Immunglobulin-Gene, das/die durch Einführung einer oder mehrerer Punktmutationen künstlich mutiert wurde(n).

(vii) einem Gemisch aus beliebigen von (i), (ii), (iii), (iv), (v) und (vi).

12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das sbp-Element eine Domäne umfaßt, die eine Immunglobulindomäne oder homolog zu einer solchen ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die resultierenden rekombinanten Vektoren jeweils Nukleinsäure umfassen, die für ein scFv-Molekül kodiert.

14. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Bakteriophage ein filamentöser Phage ist.

Verfahren nach Anspruch 14, worin der Phage aus den Klasse I-Phagen fd, M13, f1, If1, Ike, ZJ/Z, Ff und den Klasse II-Phagen Xf, Pf1 und Pf3 ausgewählt ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die ersten Polypeptidketten als Fusionen mit dem Gen II-Capsid-Protein des Phagen fd oder dessen Gegenstück bei einem anderen filamentösen Phagen exprimiert werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die ersten Polypeptidketten jeweils in den Nterminalen Bereich des reifen Capsidproteins stromab von einem Sekretionsleaderpeptid insertiert werden.

18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Wirt E.coli ist.

19. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Nukleinsäure, die für eine erste oder eine zweite Polypeptidkette kodiert, stromab über ein unterdrückbares Translationsstopcodon an ein virales Capsidprotein gebunden ist.

20. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die durch die Expression gebildeten sekretierten Bakteriophagen selektiert oder gescreent werden, um ein individuelles sbp-Element oder eine Mischpopulation aus den sbp-Elementen bereitzustellen, die in ihrem jeweils sekretierten Bakteriophagen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für eine Polypeptidkette davon kodiert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Bakteriophagen durch Affinität für ein Element selektiert werden, das zum sbp-Element komplementär ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, welches das Gewinnen von jeglichem an das komplementäre sbp-Element gebundenen Bakteriophagen durch Waschen mit einem Eluens umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin das Eluens ein Molekül enthält, das mit dem Bakteriophagen um die Bindung an das komplementäre sbp-Element konkurriert.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin der Bakteriophage auf das komplementäre sbp-Element in Gegenwart eines Moleküls angewandt wird, das mit der Packung um Bindung an das komplementäre sbp-Element konkurriert.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, worin Nukleinsäure, die von einem selektierten oder gescreenten Bakteriophagen abgeleitet ist, verwendet wird, um das sbp-Element oder ein Fragment oder Derivat davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus zu exprimieren.

26. Verfahren nach Anspruch 20, worin Nukleinsäure einem oder mehreren Bakteriophagen entnommen und verwendet wird, um ein individuelles sbp-Element oder eine Mischpopulation aus sbp-Elementen oder Polypeptidkomponenten davon oder dafür kodierende Nukleinsäure zu erhalten.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die entnommene Nukleinsäure für die ersten Polypeptidketten kodiert und in einen rekombinanten Vektor (II) eingeführt wird, in den auch Nukleinsäure von einem genetisch andersartigen Nukleinsäurerepertoire, das für die zweiten Polypeptidketten kodiert, eingebracht wird, oder worin die entnommene Nukleinsäure für die zweiten Polypeptidketten kodiert und in einen rekombinanten Vektor (II) eingebracht wird, in den auch Nukleinsäure von einem genetisch andersartigen Nukleinsäurerepertoire eingebracht wird, das für die ersten Polypeptidketten kodiert.

28. Verfahren nach Anspruch 27, welches den Schritt des Herbeiführens oder Ermöglichens der Produktion des rekombinanten Vektors (II) durch intrazelluläre Rekombination zwischen einem Vektor, der für erste Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure enthält, und einem Vektor, der für eine zweite Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure enthält, umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die intrazelluläre Rekombination durch den Einschluß von Sequenzen in die Vektoren gefördert wird, bei denen stellenspezifische Rekombination erfolgt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin der resultierende rekombinante Vektor (II) Nukleinsäure umfaßt, die für ein Einzelketten-Fv-Bereich-Derivat eines Immunglobulins kodiert, das aus der Rekombination zwischen ersten und zweiten Vektoren resultiert.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, worin die Sequenzen, an denen stellenspezifische Rekombination erfolgt, loxP-Sequenzen sind, die von Coliphagen P1 erhältlich sind, und die stellenspezifische Rekombination durch Cre-Recombinase katalysiert wird, die ebenfalls von Coliphagen P1 erhältlich ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die verwendete Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors exprimierbar ist.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, worin der Vektor, der für die erste Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure umfaßt, ein Phage oder Phagemid ist und der Vektor, der für die zweite Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure umfaßt, ein Plasmid ist, oder der Vektor, der für die erste Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure umfaßt, ein Plasmid ist, und der Vektor, der für die zweite Polypeptidkette kodierende Nukleinsäure umfaßt, ein Phage oder Phagemid ist, und die intrazelluläre Rekombination in einem bakteriellen Wirt erfolgt, der Plasmide gegenüber Phagen oder Phagemi den bevorzugt repliziert, oder der Phagen oder Phagemide gegenüber Plasmiden bevorzugt repliziert.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin der bakterielle Wirt ein PolA-Stamm von E.coli oder eines anderen gramnegativen Bakteriums ist.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, das weiters die folgenden Schritte (A) und (B) umfaßt:

(A) das Selektieren von sbp-Elementen, die für das sbp-Element-Gegenstück spezifisch sind und in ihrem jeweiligen Bakteriophagen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für eine erste Polypeptidkette davon kodiert, anhand von Affinität für sbp-Element- Gegenstücke von Interesse;

(B) das Kombinieren der ersten Polypeptidketten von spb-Elementen, die in Schritt (A) selektiert wurden, mit einer genetisch andersartigen Population zweiteKPolypeptidketten von sbp-Elementen, wobei die zweiten Polypeptidketten an eine Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen fusioniert sind, der sie dadurch an der Bakteriophagenoberfläche freilegt, wobei durch das Kombinieren in diesem Schritt

(B) eine Sammlung von sbp-Elementen gebildet wird, von der ein oder mehrere sbp-Elemente für das sbp-Element-Gegenstück von Interesse anhand von Affinität dafür selektierbar ist/sind.

36. Verfahren nach Anspruch 35, worin die sbp-Elemente Antikörper oder andere Elemente der Immunglobulinfamilie oder Bindungsfragmente davon sind.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die sbp-Elemente scFv-Moleküle sind.

38. Verfahren nach Anspruch 36, worin jede der in Schritt (B) kombinierten zweiten Ketten eine variable Domäne umfaßt, die von einem für das Antigen von Interesse spezifischen Nicht-Mensch-Tier-Antikörper abgeleitet ist.

39. Verfahren nach Anspruch 38, worin die zweiten Polypeptidketten heterozygot sind und eine menschliche Antikörper-Domäne umfassen.

40. Verfahren nach Anspruch 39, worin die menschliche Antikörper-Domäne CγI umfaßt.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 40, die einen zusätzlichen Schritt (C) umfaßt, worin humanisierte Antikörper für das Antigen anhand von Affinität dafür selektiert werden.