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CN119562970A - 双特异性抗体融合分子及其使用方法 - Google Patents

双特异性抗体融合分子及其使用方法 Download PDF

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CN119562970A
CN119562970A CN202380040726.5A CN202380040726A CN119562970A CN 119562970 A CN119562970 A CN 119562970A CN 202380040726 A CN202380040726 A CN 202380040726A CN 119562970 A CN119562970 A CN 119562970A
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索纳里·迪纳德维尔
杰里米·S·迈尔斯
埃里克·M·塔姆
莫霍辛·萨尔卡尔
金贵贤
陈淑娴
帕尔维兹·拉拾德
海雷挺·拉斐特·余弥雷芬迪
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Evolutionary Immunotherapy Co
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Abstract

本文描述了用于有效生产异多聚体抗体诸如双特异性抗体的组合物和方法。所述组合物和方法以比常规方法高的产量和效率改善了异多聚体抗体的组装。抗体任选地与细胞因子或共刺激肽或其部分融合。本文还描述了特异性结合CD3的单克隆抗体及其抗原结合片段、变体、多聚体形式或双特异性抗体。本文描述了制备抗CD3抗体及其抗原结合片段的方法，以及将所述抗CD3抗体及其抗原结合片段用于各种治疗、诊断和预防适应症的方法。

Description

双特异性抗体融合分子及其使用方法
相关申请
本申请要求于2022年7月19日提交的美国临时申请号63/368,852、于2022年4月12日提交的美国临时申请号63/330,250以及于2022年3月18日提交的美国临时申请号63/321,563的优先权和利益，每个申请的内容通过引用整体并入本文中。
序列表的并入
2023年3月20日创建的电子序列表名为“EVIM_001_001WO_SeqList_ST26.xml”，大小为883,743字节，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本文描述了用于有效生产抗体或其抗原结合片段的组合物和方法。抗体可能能够特异性地结合多于一个的靶分子或单个靶分子上的不同表位。组合物和方法改善了抗体组装和生产，与传统方法相比导致了更高的效率和产量。
背景技术
IgG类型的单克隆抗体含有两个相同的抗原结合臂和一个恒定结构域(Fc)。在它们的结合臂中具有不同特异性的抗体通常不会在自然界中出现，因此必须借助化学工程(例如化学交联等)、重组DNA和/或细胞融合技术来制作。
双特异性抗体可以同时结合两种不同的抗原。这一特性使得开发传统单克隆抗体无法实现的治疗策略成为可能。另一类多特异性分子是重组融合蛋白。由免疫调节蛋白的胞外结构域和免疫球蛋白(Ig)的恒定区(Fc)结构域组成的重组融合蛋白代表了一类日益增长的人治疗剂。
对于抗体，尤其是多特异性抗体来说，临床级材料的制造仍然具有挑战性。有很多种途径可以生产具有混合结合臂(即结合臂彼此不相同)的分子。但是这些方法的每一种都有明显的缺点。
化学交联是劳动密集型的，因为相关物质可能仍需要从同二聚体和其他不需要的副产物中纯化，从而需要另外的步骤来将不良产物与所需产物分离。此外，化学修饰步骤可改变蛋白质的完整性，从而导致稳定性差。因此，这种方法通常效率低下并可导致抗体活性丧失。
细胞融合技术(例如杂交瘤)表达两条重链和两条轻链，当两个各自表达单独抗体的细胞融合时，该两条重链和两条轻链随机组装，从而产生10种抗体组合。所需异多聚体抗体仅占由此产生的抗体的一小部分。所需异多聚体蛋白质的纯化显著降低生产产量并增加制造成本。
重组DNA技术已被用于生成各种异多聚体形式，例如不包含Fc结构域的单链Fv、双抗体等。该类抗体分子的主要缺点是缺乏Fc结构域，因此缺乏抗体触发效应功能和延长血清半衰期(例如补体活化、Fc受体结合等)的能力。因此，需要包含功能性Fc结构域的双特异性抗体。
重组DNA技术也已用于生成“旋钮入孔”双特异性抗体。该策略的一个限制是两个亲本抗体的轻链必须相同，以防止在同一细胞中表达时发生错误配对和形成不需要的和/或无活性的分子。
此外，退火和纯化过程中的限制事件之一是氧化还原效率。如氧化后完整质量物质的BioAnalyzer和MS-TOF分析表明，还原后在此步骤后氧化的异二聚体通常仅占蛋白质的70-80％。剩余20-30％的抗体是二聚体的，并且缺乏共价键(SEC-MALS)。这可以被去除但会严重影响总产量。
因此，仍然需要提高抗体生产的总产量，尤其是异二聚体抗体，诸如双特异性抗体。本文描述了可以提高双特异性抗体、异二聚体等的总产量的方法。根据本文提供的本发明的描述，本发明的这些和其他方面和优点将显而易见。
发明内容
本公开提供了包含以下结构的抗体：a.第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，b.第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)，其中i.所述VH1和VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且所述VL1和VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸与所述VH1和VH2的第39位氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者所述VH1和VH2的第100位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且所述VL1和VL2的第44位(Kabat编号)的氨基酸与所述VH1和VH2的第100位氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；ii.CH1H1和CH1H2的第147位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1或CL2的第131、179或180位(EU编号)的氨基酸之一与CH1H1和CH1H2的第147位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；iii.CH1H1和CH1H2的第185位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1和CL2的第137位(EU编号)的氨基酸与CH1H1和CH1H2的第185位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1和CL2的第137或138位(EU编号)的氨基酸之一与CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；并且iv.CH1H1和CH1H2的第145位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1和CL2的第131位(EU编号)的氨基酸与CH1H1和CH1H2的第145位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基。
在一些实施方案中，带电荷的氨基酸残基是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，天然存在的带电荷的氨基酸残基是精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
在一些实施方案中，第39、100、147、185、187或145位的H1氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带负电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带正电荷。在一些实施方案中，第39、100、147、185、187和145位的H1氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带正电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带负电荷。
在一些实施方案中，L1和L2是λ或κ轻链。在一些实施方案中，L1是λ轻链并且L2是κ轻链。在一些实施方案中，L1是κ轻链并且L2是λ轻链。
在一些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2,或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体可以为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含：i)与细胞表面抗原结合的第一抗原结合结构域，其中细胞表面抗原在T细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞或树突细胞接合体上表达；以及ii)与疾病相关抗原(DAA)结合的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，细胞表面抗原在T细胞上表达。
在一些实施方案中，在T细胞上表达的细胞表面抗原是CD3。在一些实施方案中，在T细胞上表达的细胞表面抗原是CD3ε。
在一些实施方案中，DAA是UL16结合蛋白2(ULBP2)。在一些实施方案中，DAA是UL16结合蛋白5(ULBP5)。在一些实施方案中，DAA是UL16结合蛋白6(ULBP6)。
在一些实施方案中，多肽与H1和/或H2的N端或C端融合。在一些实施方案中，多肽与H1的N端融合。在一些实施方案中，多肽与H2的N端融合。在一些实施方案中，多肽与H1的C端融合。在一些实施方案中，多肽与H2的C端融合。在一些实施方案中，多肽是CD58、IL-7或其片段。在一些实施方案中，多肽是CD58胞外结构域(CD58-ECD)。在一些实施方案中，多肽是CD58可变结构域(CD58v*)。
在一些实施方案中，多肽通过接头肽融合。在一些实施方案中，接头肽的长度为至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:52-54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包括：i)VH1和/或VH2的第87位(Kabat编号)的氨基酸为G；和ii)VL1和/或VL2的第45位(Kabat编号)的氨基酸为W。
在一些实施方案中，抗体包括：i)CH1H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；ii)CH2H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；iii)CH1H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)；或者iv)CH2H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
在一些实施方案中，CH1H3和/或CH2H3在第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，i)H1H和/或H2H在第234和235位(EU编号)具有A；ii)H1H和/或H2H在第234、235和237位(EU编号)具有A；或iii)H1H和/或H2H在第234和235位具有A且在第329位(EU编号)具有G。
在一些实施方案中，抗体包括：i)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有A；ii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有G；或iii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有S。在一些实施方案中，CH1H3和/或CH2H3在第331位(EU编号)具有S。
在一些实施方案中，抗体包括：i)CH1H2和/或CH2H2在第370位(Kabat编号)具有C；和ii)CH1H2和/或CH2H2在第375位(Kabat编号)具有C。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；iii.CH1H1的第128位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第118位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的第134位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第116位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii.CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；iv.H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；iii.CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的第131位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii.CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii.CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；且CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且iv.CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第180位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.VH2的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且VL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第137位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为R；iv.CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且v.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii.CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且iii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii.CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为E；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且iii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，a)H1和L1包括以下：i.VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii.CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii.CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i.VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii.CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii.CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv.H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在一些实施方案中，i)VH1和/或VH2的第87位(Kabat编号)的氨基酸为G；和ii)VL1和/或VL2的第45位(Kabat编号)的氨基酸为W。
在一些实施方案中，i)CH1H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；ii)CH2H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；iii)CH1H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)；或者iv)CH2H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)。在一些实施方案中，CH1H3和/或CH2H3在第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，i)H1H和/或H2H在第234和235位(EU编号)具有A；ii)H1H和/或H2H在第234、235和237位(EU编号)具有A；或iii)H1H和/或H2H在第234和235位具有A且在第329位(EU编号)具有G。
在一些实施方案中，i)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有A；ii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有G；或iii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有S。在一些实施方案中，CH1H3和/或CH2H3在第331位(EU编号)具有S。
在一些实施方案中，抗体包括：i)CH1H2和/或CH2H2在第370位(Kabat编号)具有C；和ii)CH1H2和/或CH2H2在第375位(Kabat编号)具有C。
在一些实施方案中，a)VH1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且b)VL1包含SEQID NO:22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，a)VH1包含EVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNX1YAMX2WVRX3APGKGLEWVAX4IRSKYNNYAT YYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGX5FGNX6X7YVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:440)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:440的X1为D或T，其中SEQ ID NO:440的X2为D或N，其中SEQ ID NO:440的X3为D或K，其中SEQ ID NO:440的X4为K或R，其中SEQ ID NO:440的X5为N或T，其中SEQ ID NO:440的X6为D或N，并且其中SEQID NO:440的X7为D或S；并且b)VL1包含ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQX1KPGQAP RGLIGX2TNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAL WX3SX4LWVFGGGTKLTVL(SEQID NO:441)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:441的X1为E或D的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:441的X2为D或G，其中SEQ ID NO:441的X3为D或Y，并且其中SEQ ID NO:441的X4为D、N或Q。
在一些实施方案中，a)VH2包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:428的互补决定区1(VH2CDR1)；包含氨基酸序列SEQ ID NO:430的互补决定区2(VH2CDR2)；及包含氨基酸序列SEQID NO:432的互补决定区3(VH2CDR3)；以及b)VL2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:433的互补决定区1(VL2CDR1)；包含氨基酸序列SEQ ID NO:434的互补决定区2(VL2CDR2)；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:435的互补决定区3(VL2CDR3)。
在一些实施方案中，a)VH2包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的互补决定区1(VH2CDR1)；包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的互补决定区2(VH2CDR2)；及包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的互补决定区3(VH2CDR3)；以及b)VL2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的互补决定区1(VL2CDR1)；包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的互补决定区2(VL2CDR2)；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的互补决定区3(VL2CDR3)。
在一些实施方案中，CD58包含SEQ ID NO:49-50的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
本公开提供了包含编码本文公开的任一种抗体的核酸序列的多核苷酸。本公开还提供了包含本公开的多核苷酸的载体。
本公开还提供了一种药物组合物，其包含本发明的任何一种抗体、多核苷酸或载体以及药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。
本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的本公开的任何一种药物组合物。本公开还提供了有需要的受试者的T细胞重新靶向的方法，其包括施用治疗有效量的本公开的任何一种药物组合物。本公开还提供了有需要的受试者的活化T细胞的方法，其包括施用治疗有效量的本公开的任何一种药物组合物。
在一些实施方案中，受试者具有癌症。在一些实施方案中，癌症是ULBP2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是原发性肿瘤、转移性癌症、多重耐药性癌症、进行性肿瘤或复发性癌症。在一些实施方案中，癌症为实体瘤。在一些实施方案中，癌症是尿路上皮癌、肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌或食道癌。
在一些实施方案中，方法还包括施用治疗有效量的配体或细胞因子或与所述配体和细胞因子的受体结合的不可知抗体。在一些实施方案中，配体是CD48、CD58、CD86、TNFSF9、OX40L、4-1BBL、GITL、CD70、CD80、MR1、TNFSF4、ICOSL、ICOSLG、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1G和RAET1L。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18或IL-21。
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图1A-D描绘了具有带电对突变、二硫键重新定位和旋钮入孔突变的抗体的示意图。灰色阴影区域代表第一重链多肽(H1)，其具有重链可变区(VH1)，具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)。白色阴影区域代表第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)。抗原结合结构域之间的+和-符号代表带电对突变。CH1H1和CL1结构域与CH2H1和CL2结构域之间的线表示二硫键，其中实线表示内源性二硫键，虚线表示重新定位的二硫键。CH1H3和CH2H3结构域之间的突起和凹陷代表旋钮入孔突变。带电对突变、二硫键重新定位和旋钮入孔突变提供了增加的重链和轻链异二聚化，这有利于本公开的双特异性抗体的生产和纯化。
图2A-2B是描绘了轻链配对双特异性抗体EIP0187(轻链配对C)、EIP0205(轻链配对D)、EIP0356(轻链配对O)和EIP0377(轻链配对P)与EIP0112 Crossmab对照抗体相比的生物物理特征的两张图。图2A从轻链配对双特异性抗体的蛋白A和尺寸排阻色谱串联纯化获得的尺寸排阻色谱图。图2B描绘了轻链配对双特异性抗体的差示扫描量热法分析。
图3A-3B是图2A-2B中描绘的轻链配对双特异性抗体的代表性变体的NuPAGE凝胶分析。图3A是非还原NuPAGE分析。图3B是还原NuPAGE分析，一起显示了完整的双特异性抗体以及重链和轻链的预期蛋白质质量。
图4A-4B是显示图2A-2B中描绘的轻链配对双特异性抗体与同种型和双特异性抗体对照相比的抗原结合的一系列线图。图4A是描绘通过夹心ELISA测定的轻链配对双特异性抗体变体的抗原结合的线图，其中抗体被捕获在用CD3ε包被的板上。图4B是描绘通过夹心ELISA测定的轻链配对双特异性抗体变体的抗原结合的线图，其中抗体被捕获在用重组ULBP2包被的板上。
图5A是EIP0205的质谱分析，其显示在非还原条件下PNGase F去糖基化并使用反相C4柱进行色谱分离后的完整质量。
图5B是EIP0205的质谱分析，其显示在还原条件下快速PNGase F去糖基化和使用反相C4柱进行色谱分离后重链质量降低。
图5C是EIP0205的质谱分析，其显示在还原条件下快速PNGase F去糖基化和使用反相C4柱进行色谱分离后轻链质量降低。
图5D是EIP0187的质谱分析，其显示在非还原条件下PNGase F去糖基化并使用反相C4柱进行色谱分离后的完整质量。
图5E是EIP0187的质谱分析，其显示在还原条件下快速PNGase F去糖基化和使用反相C4柱进行色谱分离后重链质量降低。
图5F是EIP0187的质谱分析，其显示在还原条件下在快速PNGase F去糖基化和使用反相C4柱进行色谱分离后轻链质量降低。
图6是描绘图2A-2B中所描绘的轻链配对双特异性抗体在肿瘤细胞和T细胞共培养测定中与双特异性对照抗体(EIP0112)相比的功能评估(细胞毒性)的线图。
图7A是通过串联纯化获得的双特异性抗体变体的色谱图。
图7B是显示完整的双特异性抗体变体的蛋白质质量的非还原NuPAGE分析。
图7C是显示双特异性抗体变体重链和轻链的蛋白质质量的还原NuPAGE分析。
图7D是描绘通过夹心ELISA测定的轻链配对双特异性抗体变体的抗原结合的线图，其中抗体被捕获在用CD3ε包被的板上。
图7E是描绘通过夹心ELISA测定的轻链配对双特异性抗体变体的抗原结合的线图，其中抗体被捕获在用抗原包被的板上。
图8A是描绘通过ELISA测定的αULBP2-αCD3双特异性抗体变体与人CD3ε的结合的线图。
图8B是描绘通过ELISA测定的αULBP2-αCD3双特异性变体与食蟹猴CD3ε的结合的线图。
图9A-9B是描绘了在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下，肿瘤细胞和JurkatNFAT荧光素酶报告细胞的共培养中的荧光素酶活性的一系列线图。图9A描绘了SiHa肿瘤细胞的共培养。
图9B描绘了HCT116肿瘤细胞的共培养。
图10A-10C是描绘了在图9A-9B的αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下三种肿瘤细胞系的T细胞介导的细胞毒性的一系列线图。图10A描绘了HCT116肿瘤细胞的细胞毒性。图10B描绘了MDA-MB-231GFP肿瘤细胞的细胞毒性。
图10C描绘了在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下SiHa肿瘤细胞的细胞毒性。
图11A-11C是描绘了在图9A-9B的αULBP2-αCD3双特异性亲和力变体的存在下，活化T细胞与SiHa肿瘤细胞共培养时分泌细胞因子的一系列线图。图11A描绘了IFNγ的分泌。
图11B描绘了IL-2的分泌。
图11C描绘了TNFα的分泌。
图12A描绘了没有CD58融合物的双特异性抗体变体。
图12B描绘了CD58与CH1H3的羧基端融合的双特异性抗体变体。
图12C描绘了CD58与CH2H3的羧基端融合的双特异性抗体变体。
图12D描绘了CD58与CH1H3的羧基端融合且CD58与CH2H3融合的羧基端的双特异性抗体变体。
图12E描绘了在VL2上氨基末端与CD58融合的双特异性抗体变体。
图12F描绘了在VH2上氨基末端与CD58融合的双特异性抗体变体。
图12G描绘了在VL1上氨基末端与CD58融合的双特异性抗体变体。
图12H描绘了在VH1上氨基末端与CD58融合的双特异性抗体变体。
图12L描绘了CD58与CL2的羧基端融合的双特异性抗体变体。
图12J描绘了CD58与CL1的羧基端融合的双特异性抗体变体。
图12K描绘了CD58与CL1和CL2的羧基端融合的双特异性抗体变体。
图13是利用轻链配对技术改造的共刺激配体或细胞因子融合双特异性变体(EIP0205、EIP0359、EIP0360、EIP0363)的串联纯化获得的色谱图。
图14描绘了共刺激配体或细胞因子融合αULBP2-αCD3双特异性变体(EIP0205、EIP0359、EIP0363)的差示扫描量热法分析。
图15A是描绘通过夹心ELISA测定共刺激配体或细胞因子融合双特异性抗体变体与用重组CD3ε包被的板的抗原结合的线图。
图15B是描绘通过夹心ELISA测定共刺激配体或细胞因子融合双特异性抗体变体与用重组ULBP2蛋白包被的板的抗原结合的线图。
图16A描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体的存在下与初始T细胞孵育7天后MDA-MB-231GFP肿瘤细胞的细胞溶解。
图16B显示了初始T细胞活化和MDA-MB-231细胞死亡的明场和荧光显微镜代表性图像
图16C描绘了在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下与初始T细胞孵育7天后ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞的细胞溶解。
图17A-17B是描绘在图16A-16C的双特异性抗体变体存在下，与MDA-MB-231GFP肿瘤细胞和ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞一起孵育24小时后，IFNγ从初始T细胞分泌的一系列线图。图17A描述了MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图17B描绘了ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图18A-18B是描绘在图16A-16C的双特异性抗体变体存在下，与MDA-MB-231GFP肿瘤细胞和ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞孵育24小时后，IL-2从初始T细胞的分泌的一系列线形图。图18A描绘了MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图18B描绘了ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图19A-19B是描绘在图16A-16C的双特异性抗体变体存在下，与MDA-MB-231GFP肿瘤细胞和ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞一起孵育24小时后，IFNγ从初始T细胞分泌的一系列线图。图19A描绘了MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图19B描绘了ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞。
图20A描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体存在下与活化T细胞孵育48小时后SiHa细胞的细胞溶解。
图20B描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体存在下与活化T细胞孵育48小时后SiHa细胞的细胞溶解。
图21A描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体存在下与活化T细胞孵育48小时后SiHa细胞的细胞溶解。
图21B描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体存在下与活化T细胞孵育48小时后SiHa细胞的细胞溶解。
图22A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IFNγ的线图。
图22B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IFNγ的线图。
图23A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IFNγ的线图。
图23B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IFNγ的线图。
图24A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IL-2的线图。
图24B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IL-2的线图。
图25A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IL-2的线图。
图25B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌IL-2的线图。
图26A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌TNFα的线图。
图26B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌TNFα的线图。
图27A是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌TNFα的线图。
图27B是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性抗体变体存在下，活化T细胞与SiHa细胞共培养48小时后分泌TNFα的线图。
图28是描绘在αULBP2-αCD3、αULBP2-αCD3-CD58双特异性αULBP2-αCD3-CD58可变结构域融合双特异性抗体变体的存在下，与PBMC孵育7天后MDA-MB-231GFP细胞的细胞溶解的线图。
图29A是描绘在双特异性抗体变体的存在下MDA-MB-231细胞的细胞溶解的线图。
图29B是描绘在双特异性抗体变体的存在下从MDA-MB-231细胞分泌IFNγ的线图。
图30是在双特异性抗体变体的存在下，MDA-MB-231-GFP细胞与初始T细胞、第3轮和第5轮耗竭的T细胞一起孵育48小时后细胞溶解的代表性显微镜图像。
图31是描绘在双特异性抗体变体的存在下将PBMC与MDA-MB-231细胞孵育72小时后存在的T细胞标志物IL2、IFNγ、CD25、CD69、GZMB、CD2、PD-1、CD38和TIM3的归一化水平的雷达图。
图32A-32D是描绘用双特异性抗体变体治疗后人源化小鼠的改善的肿瘤生长抑制、药代动力学和存活率的一系列图表。图32A是描绘在过继转移人T细胞和用双特异性抗体变体EIP0542、EIP0205和EIP0359给药后SiHa肿瘤随时间生长抑制的线图。图32B是过继转移人T细胞和用图32A的双特异性抗体变体给药后的存活曲线。图32C是描绘图32A的双特异性抗体变体的药代动力学的线图。图32D是描绘在向人源化小鼠施用10mg/kg剂量后EIP0561的药代动力学的图表。
图33A-33C是在移植后3天用双特异性抗体变体处理的来自SiHa肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析的一系列直方图。图33A是显示双特异性抗体变体增加了肿瘤细胞溶解的颗粒酶B的分析。图33B是显示双特异性抗体变体增加了T细胞活化的CD25的分析。图33C是显示双特异性抗体变体降低了T细胞耗竭的CD38的分析。
图34A-34C是模拟A06和E12与ULBP2结合的一系列结构效果图。图34A是ULBP2-NKG2D复合物的同源性模型。图34B是ULBP2和A06抗体的对接模型。图34C是ULBP2和E12抗体的对接模型。残基R106在所有图中以棒模型显示。ULBP2显示为深灰色，而NKG2D、A06和E12显示为浅灰色。
图35是描绘在共移植人T细胞并用具有各种CD3亲和力的双特异性抗体和双特异性CD58融合物给药后，CORL-105肿瘤随时间的生长抑制的线图。
图36A-36F是描绘了在双特异性CD58融合物的存在下与活化T细胞一起孵育48小时后肿瘤细胞的细胞溶解的一系列图表。图36A显示HCT116细胞的细胞溶解。图36B显示U266B1细胞的细胞溶解。图36C显示JeKo-1细胞的细胞溶解。图36D显示PSMA-low LNCAP前列腺癌细胞(LNCAP-vL)的细胞溶解。图36E显示MM1s细胞的细胞溶解。图36F显示Raji细胞的细胞溶解。
图37是描绘从具有和不具有示例性二硫键稳定化突变的示例性抗体的串联纯化所获得的色谱图的图表。
图38A-38D是描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下，MDA-MB-231GFP肿瘤细胞和ULBP2缺陷型MDA-MB-231GFP肿瘤细胞以1:10的bil与初始T细胞孵育5天后发生细胞溶解的两张图表和显微镜图像。图38A显示了与不同浓度的EIP0205孵育的肿瘤细胞。图38B显示了使用EIP0205孵育的初始T细胞活化和MDA-MB-231细胞死亡的明场和荧光显微镜代表性图像。图38C显示了使用不同浓度的EIP0359孵育的肿瘤细胞。图38D显示了使用EIP0359孵育的初始T细胞活化和MDA-MB-231细胞死亡的明场和荧光显微镜代表性图像。
图39为描绘在αULBP2-αCD3双特异性抗体变体的存在下，以1:10的比率与初始T细胞孵育5天后MDA-MB-231GFP肿瘤细胞的细胞溶解的图表。
图40A-40C是描绘了在αULBP2-αCD3双特异性变体和αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体的存在下，以10:1的E:T比率与初始T细胞孵育5天后，肿瘤细胞的细胞溶解和细胞因子分泌的一系列线图。图40A描绘了肿瘤细胞的细胞溶解。图40B描绘了活化T细胞与肿瘤细胞共培养48小时后IFNγ的分泌。图40C描绘了活化T细胞与肿瘤细胞共培养48小时后IL-2的分泌。
图41是描绘在活化T细胞的存在下在αULBP2-αCD3-CD58双特异性变体的存在下以5:1的E:T比率与活化T细胞孵育48小时后MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤的图表。
图42A-42F是描绘与对照相比，在活化T细胞的存在下和包含本公开的轻链配对的αCD3双特异性抗体变体的存在下，2天后肿瘤细胞的细胞溶解的一系列图表。图42A显示了效应细胞与靶细胞(E:T)比率为5:1的JeKo-1肿瘤细胞。图42B显示了效应细胞与靶细胞(E:T)比率为10:1的Ramos细胞。图42C显示了效应细胞与靶细胞(E:T)比率为10:1的Raji细胞。图42D显示了效应细胞与靶细胞(E:T)比率为10:1的SUDHL10细胞。图42E显示了效应细胞与靶细胞(E:T)比率为5:1的MV411细胞。图42F显示效应细胞与靶细胞(E:T)比率为5:1的OCI-AML2细胞。
图43A-43B是描绘与对照相比，在初始T细胞的存在下在7.5:1的效应细胞与靶细胞(E:T)比率下在包含轻链配对的αCD3双特异性抗体变体(具有和不具有本公开的CD58融合分子)的存在下，z3天后肿瘤细胞的溶解的一系列图表。图43A显示JeKo-1细胞的肿瘤溶解。图43B显示MV411细胞的肿瘤溶解。
图44A-44B是描绘与无抗体对照相比，在活化T细胞的存在下在αBCMA-αCD3和αBCMA-αCD3-CD58双特异性变体的存在下，在48小时孵育后肿瘤细胞的细胞溶解的一系列图表。图43A显示的效应细胞与靶细胞(E:T)比率为2:1的NCI929肿瘤细胞。图43B显示效应细胞与靶细胞(E:T)比率为1.6:1的U266B1细胞。
具体实施方式
使用常规技术生产异多聚体抗体(例如双特异性抗体)面临着诸多挑战，包括产生错误配对的抗体、产量降低和效应功能降低/消除等。此外，异多聚体抗体的制备和组装过程中经常发生聚集和沉淀。重链和轻链的错配、聚集和沉淀可大大降低所需的异多聚体抗体的产量。因此，需要本文中的组合物和方法来更有效、更高水平地生产异多聚体抗体。
本文公开了通过使用或调节以下一种或多种(包括但不限于)经济地生产异多聚体抗体(例如双特异性抗体)的组合物和有效的生产工艺/方法：轻链和重链上带相反电荷的突变对、二硫键重新定位突变或旋钮入孔突变。本文所述的本发明方法减少了重链和轻链的错配，减少了蛋白质沉淀和/或聚集的损失并且提高异多聚体抗体生产(例如双特异性抗体的生产)的总产量。
T细胞重新靶向(或T细胞重定向)双特异性抗体是一类新型治疗方法，能够将T细胞募集到肿瘤细胞并诱导肿瘤特异性(但MHC非依赖性)的T细胞效应活性活化。通常，T细胞重新靶向双特异性抗体包含靶向用于T细胞募集的T细胞受体的CD3部分的抗原结合结构域，和靶向疾病相关抗原(DAA)的抗原结合结构域。这种靶向设计促进了T细胞的募集并将其与靶肿瘤细胞紧密接触定位，导致免疫突触的形成、局部T细胞活化以及随后通过T细胞细胞毒颗粒释放的穿孔素和颗粒酶破坏靶细胞。
由于T细胞重新靶向双特异性抗体的CD3结合亲和力对于T细胞的募集至关重要，本发明还涉及生成一组与人CD3结合并与食蟹猴CD3交叉反应的抗体。与食蟹猴CD3的交叉反应性是重要特征以便促进掺入本文描述的抗CD3ε抗体的T细胞重新靶向双特异性抗体的临床前开发。此外，这些抗CD3ε抗体表现出不同的结合亲和力。双特异性抗体的CD3臂的亲和力可以显著改变双特异性抗体的功能活性。因此，具有不同亲和力的抗CD3抗体是期望的和有利的。
此外，本文公开的双特异性抗体可以具有细胞因子或共刺激分子融合肽，其作为拮抗剂来抑制或阻断有害相互作用，或作为激动剂来模拟或增强生理反应。生理反应包括但不限于T细胞活化、T细胞增殖和防止T细胞耗竭。这些特性优于传统的CD3双特异性抗体或肿瘤靶向共刺激受体激动剂，因为它们不能最佳地活化T细胞并诱导(或促进)T细胞功能障碍。因此，细胞因子和/或共刺激融合肽有利于增强双特异性抗体的治疗潜力。
总而言之，这些特征(例如轻链和重链上带相反电荷的突变对、二硫键重新定位突变、旋钮入孔突变、CD3亲和力变体、细胞因子或共刺激分子融合肽)从开发角度来看具有相当大的优势。例如，它提供T细胞的共刺激并防止T细胞耗竭，此外，双特异性T细胞重新靶向剂具有人单克隆抗体的药物样特性。此外，T细胞重新靶向双特异性抗体优于其他现有疗法(例如CAR-T疗法)，因为它提供了具有高安全性(例如缓解细胞因子释放综合征和降低导致T细胞功能障碍的强直信号水平)的现成产品以及剂量滴定和升级的可能性。
抗体组成和结构
本公开提供了包含以下结构域结构的抗体：a)第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，以及b)第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)。本公开的抗体结构示意图如图1A-1D所示。
本文中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“免疫反应”或“针对”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇发生反应，而不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(Kd>10-6)结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体。抗体可以来自重组来源和/或在转基因动物中产生。
已知抗体的基本结构单元是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。
一般来说，从人获得的抗体分子属于IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类中的任何一种，它们因分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些类别也有子类，诸如IgG1、IgG2、IgG4等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。因此，在一个实施方案中，本文公开的抗体是IgG抗体。
抗体可以通过熟知的技术来纯化，所述技术例如使用蛋白质A或蛋白质G的亲和色谱，其主要提供免疫血清的IgG部分。随后或可选地，可以将作为所寻求的免疫球蛋白的靶标的特定抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和色谱纯化免疫特异性抗体。例如，D.Wilkinson(The Scientist,The Scientist,Inc.出版,Philadelphia PA,第14卷,第8期(2000年4月17日),pp.25-28)讨论了免疫球蛋白的纯化。
本文中使用的术语“抗体片段”旨在包括但不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体及其多聚体、多特异性抗体片段和结构域抗体。可以使用常规技术将抗体片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab')2片段。可以处理所得的F(ab')2片段以还原二硫桥以产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可导致Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术合成。
技术可适用于产生对本公开的抗原蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如美国专利号4,946,778)。此外，方法可适于构建Fab表达文库(参见例如Huse等人,1989Science246:1275-1281)，以允许快速有效地鉴定对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。
如本文所用，术语“表位”是指抗原上被本文所公开的抗体和片段识别的位点。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如氨基酸)的化学活性表面基团或糖侧链组成并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。当解离常数<1微摩尔，例如<100nM，优选<10nM，更优选<1nM时，据说抗体与抗原特异性结合。
双特异性抗体为对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。本公开提供了双特异性抗体，其具有与第一抗原(例如CD3)结合的第一抗原结合区和与第二抗原(例如疾病相关抗原)结合的第二抗原结合区。
还考虑具有多于两种价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的重链异二聚化、轻链异二聚化、结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修改引入到编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修改包括例如在抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，前体条件是最终的构建体具有所需的tez(例如轻链异二聚化、重链异二聚化、抗原结合)。
根据共同的侧链特性，氨基酸可以被如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电荷)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电荷)：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
本公开还涵盖本文所述的抗体或抗原结合片段的功能变体。本文所用的术语“功能变体”包括本文所公开的氨基酸和核酸序列的修饰或化学等同物，其以基本上相同的方式执行与本文所公开的多肽或核酸分子基本上相同的功能。例如，本文公开的多肽的功能变体包括但不限于保守氨基酸取代。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，从而将一个氨基酸改变为具有相似生化特性(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。多肽的变体还包括本文公开的多肽序列的添加和缺失。此外，变体核苷酸序列包括其类似物和衍生物。本文公开的结合蛋白的变体包括与结合蛋白结合相同抗原或表位的蛋白质。
在一些实施方案中，带电荷的氨基酸残基是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，天然存在的带电荷的氨基酸残基是精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
轻链和重链置换变体
为了生成具有重链和轻链正确配对(即，轻链与重链的同源配对或异二聚化是形成原始抗体的可变结构域或抗原结合结构域所必需的)的基本上同质的双特异性抗体群，第一重链多肽(H1)相对于第二轻链多肽(L2)具有与第一轻链多肽(L1)结合的强烈偏好；并且第二重链多肽(H2)相对于第一轻链多肽(L1)具有与第二轻链多肽(L2)结合的强烈偏好。此外，第一重链多肽(H1)和第二重链多肽(H2)对异二聚化的偏好比对同二聚化(即重链异二聚化)的偏好更强。
本文提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。示例性的替代诱变位点包括表1.1-1.3和2-6中所示的带电替代对。
对于本公开的双特异性抗体，使用Fab异二聚化策略是有利的，以允许属于同一臂的Fab结构域正确缔合，并最大限度地减少属于不同臂的Fab结构域的异常配对。示例性的Fab异二聚化策略包括但不限于表1.1和表1.2中所示的策略。表1.1和表1.2中所列出的抗体结构域对应于图1中所描绘的本公开的结构域。
表1.1-Fab异二聚化策略
表1.2-Fc异二聚化策略
表1.3.κ轻链和重链-恒定结构域突变对
突变类型 重链恒定结构域 轻链恒定结构域
带电对 K147D S131K
带电对 K147D T180R
带电对 K147(WT) T180E
带电对 T187D N137K/N138R
带电对 T187D N138R
带电对 T187D N138K
带电对 K147(WT) S131D
带电对 L145S S131K
所有位置信息均采用EU编号方案报告
野生型(WT)表示指定位置上的天然氨基酸
重链和轻链之间可以反转带有负电荷和正电荷残基的电荷对，其中D或E(负电荷)被K或R(正电荷)取代，同源链K或R(正电荷)被D或E(负电荷)取代。
表2.κ轻链和重链-可变结构域突变对
突变类型 重链可变结构域 轻链可变结构域
带电对 Q39K Q38D
带电对 Q39K Q38E
带电对 Q39D Q38K
带电对 Q39E Q38K
带电对 G100K G44D
旋钮入孔 Y87G L45W
所有位置信息都使用Kabat编号方案进行报告
野生型(WT)表示指定位置上的天然氨基酸
重链和轻链之间可以反转带有负电荷和正电荷残基的电荷对，其中D或E(带负电荷)被K或R(带正电荷)替代，而同源链K或R(带正电荷)被D或E(带负电荷)替代。
表3.λ轻链和重链-恒定结构域突变对
突变类型 重链恒定结构域 轻链恒定结构域
带电对 V185K S137D
带电对 V185E S137K
带电对 K147D T131R
带电对 K147D S179R
带电对 K147D S179K
带电对 K147D T131K
带电对 L145S T131K
带电对 K147(WT) T131D
带电对 K147(WT) S179E
所有位置信息均采用EU编号方案报告
重链和轻链之间可以反转带有负电荷和正电荷残基的电荷对，其中D或E(负电荷)被K或R(正电荷)取代，同源链K或R(正电荷)被D或E(负电荷)取代。
表4.λ轻链和重链-可变结构域突变对
突变类型 重链可变结构域 轻链可变结构域
带电对 Q39K Q38D
带电对 Q39K Q38E
带电对 Q39D Q38K
带电对 Q39E Q38K
带电对 G100D G44K
旋钮入孔 Y87G L45W
所有位置信息都使用Kabat编号方案进行报告
重链和轻链之间可以反转带有负电荷和正电荷残基的电荷对，其中D或E(负电荷)被K或R(正电荷)取代，同源链K或R(正电荷)被D或E(负电荷)取代。
表5.κ恒定链半胱氨酸突变对
突变类型 重链恒定结构域 轻链恒定结构域
Cys-Cys S131C S114C
Cys-Cys S136C S114C
Cys-Cys S134C F116C
Cys-Cys F170C S162C
Cys-Cys P171C S162C
所有位置信息均采用EU编号方案报告
表6.λ恒定链半胱氨酸突变对
突变类型 重链恒定结构域 轻链恒定结构域
Cys-Cys V173C T162C
Cys-Cys L128C S118C
Cys-Cys S134C T116C
所有位置信息均采用EU编号方案报告
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：i)VH1和VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，且VL1和VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸与VH1和VH2的第39位的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者VH1和VH2的第100位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且VL1和VL2的第44位(Kabat编号)的氨基酸与VH1和VH2的第100位的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；ii)CH1H1和CH1H2的147位(EU编号)的氨基酸为带电荷的或极性的氨基酸残基，且CL1或CL2的第131、179或180位(EU编号)的氨基酸之一为与CH1H1和CH1H2的第147位的氨基酸相比带相反电荷的或极性的氨基酸残基；iii)CH1H1和CH1H2的第185位(EU编号)的氨基酸为带电荷的或极性的氨基酸残基，且CL1和CL2的第137位(EU编号)的氨基酸为与CH1H1和CH1H2的第185位的氨基酸相比带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，且CL1和CL2的第137或138位(EU编号)的氨基酸之一与CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；并且iv)CH1H1和CH1H2的第145位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，且CL1和CL2的第131位(EU编号)的氨基酸与CH1H1和CH1H2的第145位的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基。
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：第39、100、147、185、187或145位的H1氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带负电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带正电荷。
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：第39、100、147、185、187和145位的H1氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带正电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带负电荷。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集A”，其包含以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第128位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第118位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集B”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第134位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第116位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集C”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集D”，其包含以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；iv)H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集E”，其包含以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集F”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第131位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集G”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集H”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；且iii)CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集I”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集J”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；且iii)CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集K”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集L”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集0340”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集M”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集N”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集O”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且iv)CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第180位(EU编号)的氨基酸为E；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)VH2的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且VL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集367”，其包含以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第137位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为R；iv)CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且v)H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集P”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；且iii)CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集404”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；iii)CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集406”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为E；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集473”，其包括以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且iii)CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；ii)CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；iii)CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且iv)H2H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
在某些实施方案中，抗体变体包含“轻链配对突变集Q”，其包含以下取代：a)H1和L1包括以下：i)VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；ii)CH1H1的第170位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；iii)CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；iv)H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且b)H2和L2包括以下：i)VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且ii)CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
可能希望就效应功能方面修饰本文公开的抗体，以便增强例如抗体在治疗疾病和病症中的效力。例如，可在Fc区引入半胱氨酸残基，从而允许在此区域形成链间二硫键。由此产生的同型二聚抗体可以具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。(参见Caron等人,J Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922.(1992))。或者，可以将抗体工程改造成具有双Fc区域，从而具有增强的补体溶解和ADCC能力。(参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230(1989))。
描述具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如Fc区的第298、333和/或334位(残基的EU编号方式)的取代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如描述于美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中，所述新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含具有一个或多个取代的Fc区，从而改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有取代，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)的那些变体。还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例。
在一些实施方案中，抗体可以在Fc区中包含降低效应功能的取代突变。在一些实施方案中，取代突变是非糖基化位点突变。在一些实施方案中，非糖基化位点突变位于氨基酸残基297处，并且氨基酸取代位于残基234、235、265和331(EU编号)处，以破坏Fc受体结合界面。在一些实施方案中，非糖基化位点突变降低了抗体的效应功能。
在一些实施方案中，i)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有A；ii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有G；或iii)CH1H3和/或CH2H3在第297位(EU编号)具有S。在一些实施方案中，CH1H3和/或CH2H3在第331位(EU编号)具有S。
在一些实施方案中，i)H1H和/或H2H在第234和235位(EU编号)具有A；或ii)H1H和/或H2H在第234、235和237位(EU编号)具有A；iii)H1H和/或H2H在第234和235位具有A且在第329位(EU编号)具有G。
在一些实施方案中，抗体可包含Fc区中的取代突变，其可改善表达滴度并增加抗体纯化后的同质性。在一些实施方案中，抗体包含变体人IgG4 Fc结构域。在一些实施方案中，i)CH1H2和/或CH2H2在第370位(Kabat编号)具有C；和ii)CH1H2和/或CH2H2在第375位(Kabat编号)具有C。
使用旋钮入孔作为生产多特异性抗体的方法是本领域熟知的。参见1998年3月24日授权并转让给Genentech的美国专利号5,731,168、2009年7月16日发布并转让给Amgen的PCT出版物号WO2009089004以及2009年7月16日发布并转让给Novo Nordisk A/S的美国专利出版物号20090182127。另请参阅Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658以及Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。
“突起”是指从第一多肽的界面突出并因此可位于相邻界面(即第二多肽的界面)的补偿腔中的至少一个氨基酸侧链，以便稳定异多聚体抗体，并且从而例如有利于异多聚体抗体的形成而不是同多聚抗体的形成。突起可存在于原始界面中，或者可以通过合成方式引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第一多肽界面的核酸被改变以编码突起。为了实现这一点，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸替换编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基大的侧链体积。应当理解，可以存在多于一个原始和相应的输入残基。被替换的原始残基数量的上限是第一多肽界面中的残基总数。
用于形成突起的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，形成突起的原始残基具有较小的侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH1H3或CH2H3结构域中形成突起的示例性氨基酸取代包括但不限于T366W取代。
“腔”是指从第二多肽的界面凹陷的至少一个氨基酸侧链，并因此容纳第一多肽的相邻界面上的相应突起。腔可以存在于原始界面中，或者可以合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码腔。为了实现这一点，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA替换编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基小的侧链体积。应当理解，可以存在多于一个原始和相应的输入残基。被替换的原始残基数量的上限是第二多肽界面中的残基总数。各种氨基残基的侧链体积如上表3所示。用于形成腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，形成腔的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。用于产生腔的CH1H3或CH2H3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于T366S、L368A、Y407A、Y407T和Y407V取代。在某些实施方案中，旋钮半抗体包含T366W取代，而孔半抗体包含T366S/L368A/Y407V取代。
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：CH1H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
在某些实施方案中，抗体变体包含以下取代：CH2H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：CH1H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH2H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)；
在某些实施方案中，抗体变体包括以下取代：CH2H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且CH1H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
T细胞表面抗原
本公开提供了一种抗体，其包含与T细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞或树突细胞接合细胞上表达的细胞表面抗原结合的第一抗原结合结构域，以及与疾病相关抗原(DAA)结合的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，细胞表面抗原在T细胞上表达。示例性的T细胞表面抗原包括但不限于CD3。在一些实施方案中，T细胞表面抗原是CD3。在一些实施方案中，T细胞表面抗原是CD3ε。
分化簇3(CD3)
在一些实施方案中，本发明部分基于抗CD3抗体。在某些实施方案中，抗CD3抗体是多特异性的(例如，双特异性的)，并且除了结合CD3或其片段之外，还结合第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，疾病相关抗原)。本发明的抗体可用于例如治疗细胞增殖性病症(例如癌症)或自身免疫性病症或延缓所述病症的进展，或用于增强患有此类病症的受试者的免疫功能。
除非另有说明，否则本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物，如灵长类动物(如人、食蟹猴)和啮齿类动物(如小鼠和大鼠))来源的任何天然的CD3，包括例如CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链。CD3是在T细胞上表达的与T细胞受体缔合的细胞表面复合物。CD3复合物是CD8+和CD4+T淋巴细胞活化所必需的。它由三条不同但高度相关的链形成：一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链，它们相互缔合形成CD3ε/γ异二聚体和CD3ε/δ异二聚体。两种CD3异二聚体与T细胞受体(TCR)和信号转导ζ链同二聚体一起形成T细胞受体复合物。
术语包括“全长”未加工的CD3(例如，未加工或未修饰的CD3ε或CD3γ)，以及细胞中加工产生的任何形式的CD3。术语还涵盖CD3的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。CD3包括例如人CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)，其长度为207个氨基酸。
在一些实施方案中，本发明提供了结合CD3的分离抗体。在一些实施方案中，本发明提供了结合CD3ε的分离抗体。在一些情况下，抗CD3ε抗体与人CD3ε多肽或食蟹猴(cyno)CD3ε多肽结合。在一些情况下，人CD3多肽或cynoCD3多肽分别是人CD3ε多肽(SEQ ID NO:419)或cyno CD3ε多肽(SEQ ID NO:420)。在一些情况下，抗CD3抗体与由人CD3ε(SEQ IDNO:419)的氨基酸残基1-26或氨基酸残基1-27组成的CD3ε(例如人CD3ε)片段内的表位结合。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶点的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替代以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。或者或另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
抗CD3ε抗体
本文提供了抗CD3ε抗体。在一些实施方案中，对“SP34”抗CD3ε抗体进行丙氨酸扫描诱变以产生本发明的亲和力调节的抗CD3ε抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗CD3ε抗体包含表7中所列的任何一个VH和VL序列。在表7中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列并且加粗的序列是根据Chothia的CDR序列。
在一些实施方案中，本公开的抗CD3抗体包含：a)重链可变区(VH)，其包含VH互补决定区1(VHCDR1)、VH互补决定区2(VHCDR2)和VH互补决定区3(VHCDR3)；以及b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区1(VLCDR1)、VL互补决定区2(VLCDR2)和VL互补决定区3(VLCDR3)。表8和9提供了本文提供的抗CD3抗体的CDR序列的示例。
表7.抗CD3可变重链和可变轻链结构域
表8.抗CD3重链CDR
表9.抗-CD3轻链CDR
在一些实施方案中，本公开提供了抗体(例如，包括抗体片段，诸如特异性结合CD3ε的单链可变片段(scFv)，其中抗体包含a)重链可变区(VH)，其包含i)包含氨基酸序列SEQID NO:29、30、31、32或33的VH互补决定区1(VHCDR1)，ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34、35或36的VH互补决定区2(VHCDR2)，iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37、38、39、40或41的VH互补决定区3(VHCDR3)；以及b)轻链可变区(VL)，其包含a i)i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL互补决定区1(VLCDR1)，ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43或44的VL互补决定区2(VLCDR2)，iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45、46、47或48的VL互补决定区3(VLCDR3)。
本发明的示例性抗CD3抗体包括CD3-A1、CD3-A2、CD3-A3、CD3-A4、CD3-A5、CD3-A6、CD3-A7、CD3-A8、CD3-A9、CD3-A10、CD3-A11、CD3-A12和CD3-A13。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A1包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A1包含含有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A2包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A2包含含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A3包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A3包含含有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A4包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A4包含含有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A5包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A5包含含有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A6包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A6包含含有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A7包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A7包含含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A8包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A8包含含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A9包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A9包含含有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A10包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQID NO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A10包含含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A11包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQID NO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A11包含含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A12包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQID NO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A12包含含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A13包含VH区，所述VH区包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQID NO:43的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗CD3抗体CD3-A13包含含有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VH区和含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL区。
双特异性抗CD3ε抗体
本文提供了双特异性抗体，其包含结合第一抗原(例如CD3ε)的第一抗原结合结构域和结合第二抗原(例如疾病相关抗原)的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，双特异性抗体具有以下结构：a)第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，以及第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域(例如结合至CD3)，所述第一抗原结合结构域包含表7中列出的VH1和VL1序列中的任一个。在表7中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列并且加粗的序列是根据Chothia的CDR序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域(例如结合至CD3ε)，所述第一抗原结合结构域包含：a)重链可变区(VH1)，其包含VH互补决定区1(VH1CDR1)、VH互补决定区2(VH1CDR2)和VH互补决定区3(VH1CDR3)；以及b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区1(VL1CDR1)、VL互补决定区2(VL1CDR2)和VL互补决定区3(VL1CDR3)。表8和9提供了本文提供的抗CD3抗体的CDR序列的示例。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括本公开的任一种抗CD3抗体。本发明的示例性抗CD3抗体包括CD3-A1、CD3-A2、CD3-A3、CD3-A4、CD3-A5、CD3-A6、CD3-A7、CD3-A8、CD3-A9、CD3-A10、CD3-A11、CD3-A12和CD3-A13。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性结合CD3ε并与任何前述抗体竞争的分离抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)。
在一些实施方案中，本发明提供了与CD3ε结合并与本文所述的抗体竞争的抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)，包括CD3-A1、CD3-A2、CD3-A3、CD3-A4、CD3-A5、CD3-A6、CD3-A7、CD3-A8、CD3-A9、CD3-A10、CD3-A11、CD3-A12和CD3-A13。
在一些实施方案中，本发明还提供了基于CDR接触区针对CD3ε抗体的抗体的CDR部分。CDR接触区是抗体中赋予抗体对抗原的特异性的区域。一般来说，CDR接触区包括CDR中的残基位置和游标区，其受到限制以维持适当的环结构，使抗体与特定抗原结合。参见，例如，Makabe等人,J.Biol.Chem.,283:1156-1166,2007。CDR接触区域的确定完全属于本领域的技术范围。
本发明的抗CD3ε抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)对人CD3ε(例如人CD3ε(例如，(SEQ ID NO:419))的结合亲和力(KD)可以是约0.001至约5000nM。
在一些实施方案中，结合亲和力约为以下的任一者：5000nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2000nM、1789nM、1583nM、1540nM、1500nM、1490nM、1064nM、1000nM、933nM、894nM、750nM、705nM、678nM、532nM、500nM、494nM、400nM、349nM、340nM、353nM、300nM、250nM、244nM、231nM、225nM、207nM、200nM、186nM、172nM、136nM、113nM、104nM、101nM、100nM、90nM、83nM、79nM、74nM、54nM、50nM、45nM、42nM、40nM、35nM、32nM、30nM、25nM、24nM、22nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
在一些实施方案中，结合亲和力小于约5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM中的任一者。
本发明的抗CD3ε抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)对食蟹猴CD3ε(例如食蟹猴CD3ε(例如，(SEQ ID NO:422))的结合亲和力(KD)可以是约0.001至约5000nM。
在一些实施方案中，结合亲和力约为以下的任一者：5000nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2000nM、1789nM、1583nM、1540nM、1500nM、1490nM、1064nM、1000nM、933nM、894nM、750nM、705nM、678nM、532nM、500nM、494nM、400nM、349nM、340nM、353nM、300nM、250nM、244nM、231nM、225nM、207nM、200nM、186nM、172nM、136nM、113nM、104nM、101nM、100nM、90nM、83nM、79nM、74nM、54nM、50nM、45nM、42nM、40nM、35nM、32nM、30nM、25nM、24nM、22nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
在一些实施方案中，结合亲和力小于约5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM中的任一者。
在一些实施方案中，本公开提供了编码任何前述分离的抗CD3ε抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了包含此类核酸的载体。在一些实施方案中，本公开提供了包含此类核酸的宿主细胞。
疾病相关抗原
本文提供了双特异性抗体，其具有结合第一抗原(例如CD3ε)的第一抗原结合结构域和结合第二抗原(例如细胞表面抗原或DAA)的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二生物分子是细胞表面抗原。在一些实施方案中，第二生物分子是疾病相关抗原。疾病相关抗原包括但不限于ACVR1、ADAM21、AGL10、ALPPL2、APCDD1、ASPRV1、BCMA、BMPR1B、CD151、CD19、CD22、CD274、CD276、CD33、CD38、CD47、CD6、CD70、CD74、CD84、CD180、CDCP1、CDH17、CDH3、CDHR2,CDHR5、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CELSR1、CLCA2、CLDN1、CLDN18、CLDN6、CNGB1、CNGB3、COL11A1、COL17A1、CRB1、CPSG4、CTAG2、CTAGE4、CXADR、CXCR4、DCBLD2、DCST1、DLL3、DLL4、DPCR1、DSG3、DSG4、DUOX2、EBI3、EFNA4、EGFR、ENTPD1、ENTPD2、EPCAM、EPHA10、EPHA6、EPHA8、EPHB3、EPS8L1、ERBB2、ERMP1、F11R、FAP、FAT1、FCER2、FCRL3、FER1L6、FGFR2、FLT3、FLVCR1、FN1、FXYD3、GABRA3、GGT2、GGT3P、GJB3、GLG1、GPC1、GPC2、GPNMB、GPC5A、GRIND2D、GUCY2C、HAVCR2、HEPHL1、HHLA1、IGSF3、IGSF9、IL2RB、IL3RA、ITGA2、ITGA6、ITGAV、ITGB4、ITGB6、LCN15、LILRB4、LNPEP、LRFN4、LRRC15、LY6D、LY75、MAL2、MET、MFI2、MICA、MICB、MMP13、MMP14、MPZL2、MS4A1、MSLN、MST1R、MTDH、MUC1、MUC13、MUC16、MUC17、NAALADL2、NCSTN、NIPAL4、NLGN1、NOTCH3、NOX1、OC90、OR10Q1、OR5l1、PAEP、PANX3、PCDH15、PDCHA9、PCDHB12、PCDHB2、PKD1L1、PODXL、POLR2J2、PROM1、PSMA、PTK7、PVR、PVRL1、PVRL4、RAET1E、RAET1G、RAET1L、ROR1、ROR2、SDC1、SDC4、SDK2、SHISA8、SIGLEC7、SIT1、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLC11A2、SLC12A2、SLC15A1、SLC1A5、SLC22A25、SLC2A9、SLC34A2、SLC38A2、SLC39A4、SLC6A14、SLC7A11、SLC7A3、SLC7A5、SYT8、TAS2R5、TMEM132A、TMPRSS3、TMPRSS4、TMX1、TNFRSF17、TNFRSF21、TNFRSF9、TNFRSF11、TNFRSF15、TNFRSF4、TNFRSF9、TNMD、TP53l11、TPBG、TRPC5、TRPV2、TSPAN10、TSPAN8、UGT2A1,UGT3A2、ULBP1、ULBP2、ULBP3、UMODL1、UPK1B、VANGL1、VANGL2、VASN、VMP1、VSIG4、VTCN1、WNT16、YIF1B和ZNRF4。
示例性疾病相关抗原包括但不限于表22中所示的抗原。
表22.示例性疾病相关抗原
多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的抗体(例如，单克隆抗体)。在一些实施方案中，本文提供的抗CD3 CD3ε抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合CD3的两个不同表位(例如，CD3ε或CD3γ)。在某些实施方案中，一种结合特异性针对CD3(例如，CD3ε或CD3γ)并且另一种结合特异性针对任何其他抗原(例如，第二生物分子，例如，细胞表面抗原，例如，疾病相关抗原)。因此，双特异性抗CD3抗体可以具有对CD3和第二生物分子的结合特异性，所述第二生物分子诸如表22中所列并在美国公开号2010/0111856和PCT公开号WO2016204966 A1中描述的第二生物分子(例如，疾病相关抗原)，所述专利均通过引用整体并入本文中。
在一些情况下，细胞表面抗原(例如疾病相关抗原)可在靶细胞(例如肿瘤细胞)上以低拷贝数表达。例如，在一些情况下，细胞表面抗原以每个靶细胞少于35,000个拷贝表达或存在。在一些实施方案中，低拷贝数细胞表面抗原存在于每个靶细胞100至35,000个拷贝之间；每个靶细胞100至30,000个拷贝之间；每个靶细胞100至25,000个拷贝之间；每个靶细胞100至20,000个拷贝之间；每个靶细胞100至15,000个拷贝之间；每个靶细胞100至10,000个拷贝之间；每个靶细胞100至5,000个拷贝之间；每个靶细胞100至2,000个拷贝之间；每个靶细胞100至1,000个拷贝之间；或每个靶细胞100至500个拷贝之间。可以例如使用标准刮擦卡图来确定细胞表面抗原的拷贝数。
UL16结合蛋白
示例性的UL16结合蛋白包括但不限于ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1E(ULBP4)、RAET1G(ULBP5)和RAET1L(ULBP6)。ULBP1-6的调节缺陷与从自身免疫到癌症范围内的疾病相关。
UL16结合蛋白2(ULBP2)是一种主要组织相容性复合体(MHC)I类相关分子，其与自然杀伤(NK)细胞上的NKG2D受体结合以触发多种细胞因子和趋化因子的释放，进而有助于NK细胞的募集和活化。编码的蛋白质经过进一步加工生成成熟蛋白质，该成熟蛋白质或者通过糖基磷脂酰肌醇部分锚定在膜上，或者被分泌出来。许多恶性细胞分泌编码蛋白质以逃避NK细胞的免疫监视。ULBP2在多种实体瘤适应症中广泛且差异表达。特别是，黑素瘤和乳腺癌中的ULBP2表达与不良预后和晚期疾病有关。
衰老是一种应激诱导的细胞状态，它通过诱导衰老相关分泌表型(SASP)来防止细胞增殖和促进免疫介导的受损细胞清除，从而限制肿瘤发生(Rodier,F.等人PersistentDNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokinesecretion.Nat.Cell Biol.11,973-979(2009))。衰老也与年龄相关的组织病理有关，其中SASP阳性细胞的积累可诱导组织炎症，导致组织功能障碍，在老年患者中表现为关节炎、自身免疫、糖尿病、纤维化和伤口愈合延迟(Childs,B.G.等人Senescent cells:an emergingtarget for diseases of ageing.Nat.Rev.Drug Discov.16,718-735(2017))。SASP阳性细胞表达一系列复杂的分泌蛋白和细胞表面蛋白，包括免疫活化细胞因子、组织重塑基质金属蛋白酶和细胞表面蛋白，这些蛋白包括MHCI样NKG2D配体，通过NKG2D共刺激受体介导NK和T细胞效应物的识别和活化。这些蛋白质一起促进衰老细胞的消除。然而，与年龄相关的免疫细胞活性下降和其他因素会如癌症化疗加速组织中SASP阳性细胞的诱导，并限制免疫系统对衰老细胞的清除(Jackola,D.R.,Ruger,J.K.&Miller,R.A.Age-associatedchanges in human T cell phenotype and function.Aging Clin.Exp.Res.6,25-34(1994)；Demaria,M.等人Cellular Senescence Promotes Adverse Effects ofChemotherapy and Cancer Relapse.Cancer Discov.7,165-176(2017))。消除SASP阳性细胞的治疗策略提供了补充衰老免疫监视和减轻许多与年龄相关的疾病的潜在病因和化疗的持久副作用的机会。此外，清除衰老细胞不仅可以减少与年龄相关的疾病，而且这些抗衰老药物还具有延长寿命的潜力(Baker,D.J.等人Naturally occurring p16Ink4a-positive cells shorten healthy lifespan.Nature 530,184-189(2016)；Baker,D.J.等人Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associateddisorders.Nature 479,232-236(2011))。ULBP2是一种MHCI样配体，已成为与应激诱导的SASP阳性成纤维细胞和癌细胞相关的细胞表面蛋白(Sagiv,A.等人NKG2D ligandsmediate immunosurveillance of senescent cells.Aging 8,328-344(2016)；Ruscetti,M.等人NK cell-mediated cytotoxicity contributes to tumor control by acytostatic drug combination.Science 362,1416-1422(2018)；D.P.等人Targetable mechanisms driving immunoevasion of persistent senescent cellslink chemotherapy-resistant cancer to aging.JCI Insight 5,e124716,124716(2019))。除了根除癌细胞之外，ULBP2或ULBP2/5/6靶向药物还具有从组织中消除SASP阳性细胞的潜力以及具有改善组织功能的潜力，从而可以预防与年龄相关的疾病并延长寿命。
ULBP2涵盖ULBP2的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。ULBP2包括例如人ULBP2蛋白(UniProt ID：Q9BZM5)，其长度为246个氨基酸。
在一个方面，本发明提供了与ULBP2结合的分离抗体。在一些情况下，抗ULBP2抗体与人ULBP2多肽或其部分结合。在一些实施方案中，人ULBP2多肽包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
ULBP5(RAET1G)涵盖ULBP5的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。ULBP5包括例如人ULBP5蛋白(UniProt ID：Q6H3X3)，其长度为334个氨基酸。
在一个方面，本发明提供了与ULBP5(RAET1G)结合的分离抗体。在一些情况下，抗ULBP5抗体与人ULBP5多肽或其部分结合。在一些实施方案中，人ULBP5多肽包含SEQ ID NO:422的氨基酸序列。
ULBP6(RAET1L)涵盖ULBP6的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。ULBP6包括例如人ULBP6蛋白(UniProt ID:Q5VY80)，其长度为246个氨基酸。
在一个方面，本发明提供了与ULBP6(RAET1L)结合的分离抗体。在一些情况下，抗ULBP6抗体与人ULBP6多肽或其部分结合。在一些实施方案中，人ULBP6多肽包含SEQ ID NO:423的氨基酸序列。
抗ULBP2/5/6抗体
本文提供了与抗ULBP2/5/6结合的抗体。在一些实施方案中，可对“E12”抗ULBP2/5/6抗体进行丙氨酸扫描诱变，以产生亲和力调节的抗ULBP2/5/6抗体。本文还提供了与抗ULBP2结合的抗体。在一些实施方案中，可以对“A06”抗ULBP2抗体进行丙氨酸扫描诱变以产生亲和力调节的抗ULBP2抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗ULBP2/5/6抗体包含表10中所列的任一个VH和VL序列。在表10中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列并且加粗的序列是根据Chothia的CDR序列。
在一些实施方案中，本公开的抗ULBP2抗体包含：a)重链可变区(VH)，其包含VH互补决定区1(VHCDR1)、VH互补决定区2(VHCDR2)和VH互补决定区3(VHCDR3)；以及b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区1(VLCDR1)、VL互补决定区2(VLCDR2)和VL互补决定区3(VLCDR3)。表11和12提供了本文提供的抗ULBP2抗体的示例性CDR序列。
表10.抗ULBP2/5/6可变重链和可变轻链结构域
表11.抗ULBP2/5/6重链CDR
表12.抗ULBP2/5/6轻链CDR
在一些实施方案中，本公开提供了抗体(例如，包括抗体片段，诸如特异性结合ULBP2的单链可变片段(scFv)，其中抗体包含a)重链可变区(VH)，其包含i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或6的VH互补决定区1(VHCDR1)，ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8的VH互补决定区2(VHCDR2)，iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH互补决定区3(VHCDR3)；以及b)轻链可变区(VL)，其包含i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的VL互补决定区1(VLCDR1)，ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VL互补决定区2(VLCDR2)，iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的VL互补决定区3(VLCDR3)。
本发明的示例性抗ULBP2抗体包括ULBP2-01、ULBP2-02、E12、A06。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体ULBP2-01具有VH区，其包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体ULBP2-01具有包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体ULBP2-02具有VH区，其包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体ULBP2-02具有包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体E12具有VH区，其包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体E12具有包含SEQ ID NO:425所示氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:424所示氨基酸序列的VL区。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体A06具有VH区，其包含含有SEQ ID NO:428的氨基酸序列的VHCDR1、含有SEQ ID NO:430的氨基酸序列的VHCDR2和含有SEQ ID NO:432的氨基酸序列的VHCDR3；以及VL区，其包含含有SEQ ID NO:433的氨基酸序列的VLCDR1、含有SEQ ID NO:434的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:435的氨基酸序列的VLCDR3。
在一些实施方案中，抗ULBP2抗体A06具有包含SEQ ID NO:427所示氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO:426所示氨基酸序列的VL区。
双特异性抗ULBP2/5/6抗体
本文提供了双特异性抗体，其包含结合第一抗原(例如，细胞表面抗原，CD3ε)的第一抗原结合结构域和结合第二抗原(例如，ULBP2/5/6)的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，双特异性抗体具有以下结构：a)第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，以及第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第二抗原结合结构域(例如结合至ULBP2/5/6)，所述第一抗原结合结构域包含表10中列出的VH2和VL2序列中的任一个。在表10中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列并且加粗的序列是根据Chothia的CDR序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第二抗原结合结构域(例如结合至ULBP2)，所述第二抗原结合结构域包含：a)重链可变区(VH2)，其包含VH互补决定区1(VH2CDR1)、VH互补决定区2(VH2CDR2)和VH2互补决定区3(VH2CDR3)；以及b)轻链可变区(VL2)，其包含VL互补决定区1(VL2CDR1)、VL互补决定区2(VL2CDR2)和VL互补决定区3(VL2CDR3)。表11和12提供了本文提供的抗ULBP2抗体的示例性CDR序列。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括本公开的任一种ULBP2/5/6抗体。本发明的示例性抗ULBP2/5/6抗体包括ULBP2-01、ULBP2-02和E12。在一些实施方案中，双特异性抗体包括本公开的任一种抗ULBP2抗体。本发明的示例性抗ULBP2抗体包括A06。
在一些实施方案中，本公开提供了特异性结合ULPB2/5/6并与任何前述抗体竞争的分离抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)。
在一些实施方案中，本发明提供了与ULBP2/5/6结合并与本文所述的抗体(包括ULBP2-01、ULBP2-02、A06和E12)竞争的抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)。
在一些实施方案中，本发明还基于CDR接触区提供了针对ULBP2/5/6抗体的抗体的CDR部分。CDR接触区是抗体中赋予抗体对抗原的特异性的区域。一般来说，CDR接触区包括CDR中的残基位置和游标区，其受到限制以维持适当的环结构，使抗体与特定抗原结合。参见，例如，Makabe等人,J.Biol.Chem.,283:1156-1166,2007。CDR接触区域的确定完全属于本领域的技术范围。
本文所述的ULBP2/5/6抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)对ULBP2/5/6(例如人ULBP2(例如，(SEQ ID NO:421)、ULBP5(SEQ ID NO:422)、ULBP6(SEQ ID NO:423))的结合亲和力(KD)可以是约0.001至约5000nM。
在一些实施方案中，结合亲和力约为以下的任一者：5000nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2000nM、1789nM、1583nM、1540nM、1500nM、1490nM、1064nM、1000nM、933nM、894nM、750nM、705nM、678nM、532nM、500nM、494nM、400nM、349nM、340nM、353nM、300nM、250nM、244nM、231nM、225nM、207nM、200nM、186nM、172nM、136nM、113nM、104nM、101nM、100nM、90nM、83nM、79nM、74nM、54nM、50nM、45nM、42nM、40nM、35nM、32nM、30nM、25nM、24nM、22nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
在一些实施方案中，结合亲和力小于约5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM中的任一者。
在一些实施方案中，本公开提供了编码任何前述分离的抗ULBP2/5/6抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了包含此类核酸的载体。在一些实施方案中，本公开提供了包含此类核酸的宿主细胞。
与CD3Ε和ULBP2/5/6结合的示例性双特异性抗体
本文提供了双特异性抗体，其包含结合第一抗原(例如，CD3ε)的第一抗原结合结构域和结合第二抗原(例如，ULBP2/5/6)的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，双特异性抗体具有以下结构：a)第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，以及第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域(例如结合至CD3ε)，其包含：a)重链可变区(VH1)，其包含VH互补决定区1(VH1CDR1)、VH互补决定区2(VH1CDR2)和VH互补决定区3(VH1CDR3)；和b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区1(VL1CDR1)、VL互补决定区2(VL1CDR2)和VL互补决定区3(VL1CDR3)；以及第二抗原结合结构域(例如结合至ULBP2/5/6)，其包含：a)重链可变区(VH2)，其包含VH互补决定区1(VH2CDR1)、VH互补决定区2(VH2CDR2)和VH2互补决定区3(VH2CDR3)；和b)轻链可变区(VL2)，其包含VL互补决定区1(VL2CDR1)、VL互补决定区2(VL2CDR2)和VL互补决定区3(VL2CDR3)。表8和9提供了本文提供的抗CD3ε抗体的CDR序列的示例。表11和12提供了本文提供的抗ULBP2/5/6抗体的CDR序列的示例。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一抗原结合结构域(例如结合至CD3ε)，其包含表7中列出的VH1和VL1序列中的任一个，以及第二抗原结合结构域(例如结合至ULBP2/5/6)，其包含表10中列出的VH2和VL2序列中的任一个。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)；以及第二重链多肽(H2)以及第二轻链多肽(L2)，其包含表13和表14中所列的任一个序列。斜体序列是重链可变区和轻链可变区。加下划线序列是根据Kabat的CDR，而粗体序列是根据Chothia的CDR。
在一些实施方案中，本文提供的本公开的双特异性抗体包含与表13和表14中列出的序列的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一的H1。
在一些实施方案中，本文提供的本公开的双特异性抗体包含与表13和表14中列出的序列的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一的L1。
在一些实施方案中，本文提供的本公开的双特异性抗体包含与表13和表14中列出的序列的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一的H2。
在一些实施方案中，本文提供的本公开的双特异性抗体包含与表13和表14中列出的序列的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一的L2。
在一些实施方案中，H1氨基酸序列根据SEQ ID NO:439编号。在一些实施方案中，L1氨基酸序列根据SEQ ID NO:438编号。在一些实施方案中，H2氨基酸序列根据SEQ ID NO:437编号。在一些实施方案中，L2氨基酸序列根据SEQ ID NO:436编号。
表13.结合CD3ε和ULBP2/5/6的示例性双特异性抗体
本发明的示例性的CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包括EIP0174、EIP0175、EIP0187、EIP0205、EIP0206、EIP0207、EIP0208、EIP0294、EIP0295、EIP0306、EIP0307、EIP0318、EIP0340、EIP0342、EIP0354、EIP0356、EIP0367、EIP0377、EIP0404、EIP0406、EIP0473和EIP0598。
双特异性抗体EIP0174、EIP0175、EIP0187、EIP0205、EIP0206、EIP0207、EIP0208、EIP0294、EIP0295、EIP0306、EIP0307、EIP0318、EIP0340、EIP0342、EIP0354、EIP0356、EIP0367、EIP0377、EIP0404、EIP0406、EIP0473和EIP0598包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；及VL1，其包含具有SEQ ID NO:42氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45氨基酸序列的VL1CDR3。
双特异性抗体EIP0174、EIP0175、EIP0187、EIP0205、EIP0206、EIP0207、EIP0208、EIP0294、EIP0295、EIP0306、EIP0307、EIP0318、EIP0340、EIP0342、EIP0354、EIP0356、EIP0367、EIP0377、EIP0404、EIP0406、EIP0473和EIP0598包含结合ULBP2/5/6的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含VH2，所述VH2包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH2CDR1；具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH2CDR2；和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH2CDR3；以及VL2，所述VL2包含具有SEQ ID NO:10氨基酸序列的VL2CDR1；具有SEQ ID NO:11氨基酸序列的VL2CDR2；和具有SEQ ID NO:12氨基酸序列的VL2CDR3。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0174在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第128位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第118位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3中第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3中第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列及SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0174在H2和L2中包含下述氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0174包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0174包含含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的L1，含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的H2，和含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0175在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0175在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第134位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第116位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0175包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0175包含含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0187在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0187在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0187包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0187包含含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0205在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；
CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0205在H2和L2中包含下述氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0205包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0205包含含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0206在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H中的220位(EU编号)的氨基酸为S，CL1中的第214位的氨基酸为S；
H1H中的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且
当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0206在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第134位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第116位(EU编号)的氨基酸为C；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0206包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0206包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0207在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0207在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第131位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0207包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0207包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0208在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0208在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0208包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0208包含含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0294在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；且CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；H1H中第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且
当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0294在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0294包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0294包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0295在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0295在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0295包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0295包含含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0306在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K，并且CL1的179位(EU编号)的氨基酸为E；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；H1H中的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；
CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据在SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0306在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0306包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0306包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0307在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0307在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0307包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0307包含含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0318在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H中第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3中第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3中第368位(EU编号)的氨基酸为A。
CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0318在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0318包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0318包含含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0340在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0340在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0340包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0340包含含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0342在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0342在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0342包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0342包含含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0354在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列进行编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0354在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0354包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0354包含含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0356在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第180位(EU编号)的氨基酸为E；H1H中的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3中第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3中第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列及SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0356在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0356包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0356包含含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0367在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；H1H中第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ的H1氨基酸序列NO:439和SEQ的L1氨基酸序列NO:438编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0367在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第137位(EU编号)的氨基酸为K，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0367包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0367包含含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0377在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S；且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且
当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0377在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0377包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0377包含含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0404在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0404在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0404包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0404包含含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0406在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1第38位(Kabat编号)的氨基酸为E；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ的H1氨基酸序列NO:439和SEQ的L1氨基酸序列NO:438编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特异性互补决定区外，双特异性抗体EIP0406在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL2第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0406包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0406包含含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0473在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为D，且CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；H1H中第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列和SEQ NO:438的L1氨基酸序列编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0473在H2和L2中包含以下氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C，且CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H2H第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQNO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0473包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0473包含含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的L2。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0598在H1和L1中包含下述氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第170位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3中第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3中第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列及SEQ NO:438的L1氨基酸序列进行编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
除了上述的特定互补决定区外，双特异性抗体EIP0598在H2和L2中包含下述氨基酸取代：VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D，且VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D，且CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；H2H的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH2H3的第354位(EU编号)的氨基酸为C；CH2H3的第366位(EU编号)的氨基酸为W；并且当根据SEQ NO:437的H2氨基酸序列和SEQ NO:436的L2氨基酸序列编号时，CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0598包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2，含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1，和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0598包含含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的H1，含有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的L2。
上表13中所示的任一个双特异性抗体可以通过用表7-9中所示的任一个抗CD3ε结合区取代任一个抗CD3ε抗原结合区来进一步修饰。例如，双特异性抗体“EIP0205”的抗CD3ε抗原结合区可以用表7-9中所示的任一个抗CD3ε结合区取代，以产生本发明的双特异性抗体。示例性抗体如表14所示。加下划线序列是根据Kabat的CDR序列，粗体序列是根据Chothia的CDR序列。
表14.与CD3ε和ULBP2/5/6结合的示例性双特异性抗体
在一些实施方案中，本发明的示例性的CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包括EIP0527、EIP0624、EIP0486、EIP0626、EIP0483、EIP0623、EIP0621、EIP0625、EIP0622、EIP0525。
双特异性抗体EIP0527、EIP0624、EIP0486、EIP0626、EIP0483、EIP0623、EIP0621、EIP0625、EIP0622和EIP0525在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ的H1氨基酸序列NO:439和SEQ的L1氨基酸序列NO:438编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
双特异性抗体EIP0527、EIP0624、EIP0486、EIP0626、EIP0483、EIP0623、EIP0621、EIP0625、EIP0622和EIP0525具有结合ULBP2/5/6的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含VH2，所述VH2包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH2CDR1、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH2CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH2CDR3；以及VL2，所述VL2包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL2CDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL2CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL2CDR3。
双特异性抗体EIP0527、EIP0624、EIP0486、EIP0626、EIP0483、EIP0623、EIP0621、EIP0625、EIP0622和EIP0525包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2；和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
双特异性抗体EIP0527、EIP0624、EIP0486、EIP0626、EIP0483、EIP0623、EIP0621、EIP0625、EIP0622和EIP0525具有包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的H2；和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的L2。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0527还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0527包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0527包含具有SEQ ID NO:146的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:145的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0624还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0624包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0624包含具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0486还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0486包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0486包含具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0626还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0626包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0626包含具有SEQ ID NO:158的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0483还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0483包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0483包含具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0623还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0623包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0623包含具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0621还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0621包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0621包含具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0625还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0625包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0625包含具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0622还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0622包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0622包含具有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:177的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0525还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0525包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0525包含具有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:181的氨基酸序列的L1。
在一些实施方案中，本发明的示例性的CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包括EIP0630、EIP0540、EIP0628、EIP0542、EIP0627、EIP0515、EIP0477、EIP0541、EIP0513、EIP0629。
双特异性抗体EIP0630、EIP0540、EIP0628、EIP0542、EIP0627、EIP0515、EIP0477、EIP0541、EIP0513和EIP0629在H1和L1中具有以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；CH1H1的第170位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，且CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，且CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235、237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3中第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3中第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3中第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ NO:439的H1氨基酸序列及SEQ NO:438的L1氨基酸序列进行编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
双特异性抗体EIP0630、EIP0540、EIP0628、EIP0542、EIP0627、EIP0515、EIP0477、EIP0541、EIP0513和EIP0629具有结合ULBP2/5/6的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含VH2，所述VH2具有具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH2CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH2CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH2CDR3；以及VL2，所述VL2具有具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL2CDR1；具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL2CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL2CDR3。
双特异性抗体EIP0630、EIP0540、EIP0628、EIP0542、EIP0627、EIP0515、EIP0477、EIP0541、EIP0513和EIP0629具有：具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2；和具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的VL2。
双特异性抗体EIP0630、EIP0540、EIP0628、EIP0542、EIP0627、EIP0515、EIP0477、EIP0541、EIP0513和EIP0629具有：具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的H2；和具有SEQ IDNO:139的氨基酸序列的L2。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0630还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0630包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0630包含具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:185的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0540还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0540包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0540包含具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:189的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0628还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0628包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0628包含具有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:193的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0542还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0542包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0542包含具有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0627还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0627包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0627包含具有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0515还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0515包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0515包含具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0477还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0477包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0477包含具有SEQ ID NO:210的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0541还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0541包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0541包含具有SEQ ID NO:214的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:213的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0513还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0513包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0513包含具有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:217的氨基酸序列的L1。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0629还包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0629包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0629包含具有SEQ ID NO:222的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:221的氨基酸序列的L1。
在一些实施方案中，本发明的示例性CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包括EIP0820。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820在H1和L1中包含以下氨基酸取代：VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K，且VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K，CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C，CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；H1H的第220位(EU编号)的氨基酸为S，CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；H1H中的第234、235和237位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第349位(EU编号)的氨基酸为C；CH1H3的第366位(EU编号)的氨基酸为S；CH1H3的第368位(EU编号)的氨基酸为A；CH1H3的第407位(EU编号)的氨基酸为V；并且当根据SEQ的H1氨基酸序列NO:439和SEQ的L1氨基酸序列NO:438编号时，CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820具有结合ULBP2/5/6的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含VH2，所述VH2包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH2CDR1；具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH2CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH2CDR3；以及VL2，所述VL2包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL2CDR1；具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL2CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL2CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH2；和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820包含含有SEQ ID NO:629的氨基酸序列的VH2；和含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VL2。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820包含含有SEQ ID NO:621的氨基酸序列的H2；和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的L2。
除了上文所示的VH2、VL2、H2、L2序列和氨基酸取代之外，双特异性抗体EIP0820包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含VH1，所述VH1包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH1CDR1；具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH1CDR2；和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH1CDR3；以及VL1，所述VL1包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL1CDR1；具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL1CDR2；和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL1CDR3。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL1。在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0820包含具有SEQ ID NO:622的氨基酸序列的H1和具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的L1。
在一些实施方案中，本公开的示例性CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的446位(EU编号)和/或447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，其中示例性双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中第446位(EU编号)的氨基酸为G。在一些实施方案中，其中示例性双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中双特异性抗体还包含CH1H3和/或CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，其中示例性双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸，第447位(EU编号)的氨基酸为K。
在一些实施方案中，本公开的示例性CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH1H3和CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH1H3的第446位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸。
在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中第446位(EU编号)的氨基酸为G。在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH1H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中第446位(EU编号)的氨基酸为G。在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中第446位(EU编号)的氨基酸为G。在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH1H3和CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸，其中CH1H3和CH2H3的第446位(EU编号)的氨基酸为G。
在一些实施方案中，本公开的示例性CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第第447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH1H3或CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH1H3和CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸。在一些实施方案中，双特异性抗体包含CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸。
在一些实施方案中，其中CD3εx ULBP2/5/6双特异性抗体包含CH1H3和/或CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸，第447位(EU编号)的氨基酸为K。在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH1H3的第447位(EU编号)的氨基酸，第447位(EU编号)的氨基酸为K。在一些实施方案中，其中双特异性抗体包含CH2H3的第447位(EU编号)的氨基酸，第447位(EU编号)的氨基酸为K。
融合肽
本文提供了具有融合肽的抗体(例如单特异性抗体或双特异性抗体)，该融合肽与第一重链多肽或第二重链多肽的N端或C端融合。
对于初始T细胞反应至关重要的是T细胞通过其T细胞受体检测外来和突变蛋白质的能力。这种反应通常被称为T细胞活化信号1，当T细胞受体与在特定蛋白质复合物(称为主要组织相容性复合物I(MHCI))中展示外来或突变蛋白质片段或抗原的细胞接合时发生。T细胞受体的活化本身对T细胞具有活化作用和自我调节作用。TCR与MHCI复合物的强结合导致TCR的慢性活化。这种形式的信号与对自身抗原有反应的T细胞有关。当T细胞经历这种形式的活化时，它们就会被编程为失活。具有较弱但足以活化的TCR的T细胞会经历急性信号传导，并有可能保持活性并分化为记忆T细胞。这正成为T细胞疗法设计中的重要考虑因素。
T细胞细胞因子活化，通常称为信号3，在T细胞从不分裂到快速细胞分裂状态或从一种表型状态到另一种表型状态的转变中是重要的。T细胞细胞因子受体与由免疫细胞和非免疫细胞产生的细胞因子结合，并且根据细胞因子和接收细胞因子信号时T细胞的状态，可诱导细胞增殖、可维持活力或可诱导T细胞分化为适合于感染后持续活化或失活的特化细胞状态。
一个实例是初始细胞通过细胞因子经历的转变，所述细胞因子可以诱导初始T细胞增殖并促进T细胞分化为记忆T细胞。示例性细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
共刺激受体活化，称为信号2，提供了特定环境的细胞间T活化强化。当T细胞通过在APC上发现的T细胞共刺激受体CD28与CD80和CD86配体与活化的抗原呈递细胞相互作用时，最公认的共刺激形式发生。这些相互作用可以“启动”具有对病原体或癌症蛋白作出反应的T细胞受体的特定T细胞。
较少了解的是在感染和恶性肿瘤部位诱导的共刺激。这包括通过CD2和NKG2D受体起作用的共刺激，这些受体对病毒感染后在免疫细胞和上皮细胞中诱导的配体如CD58和UL16结合蛋白(例如ULBP2/5/6)有响应。这些信号不仅强化了T细胞的活化，而且确认了T细胞的致死效应活动是以单细胞精度为目标的。虽然已经发现了许多共刺激受体，但每种受体的特定环境的重要性以及多种共刺激受体同时信号传导的影响仍然很大程度上未知，这一领域可以极大地促进我们对T细胞生物学的理解并为新型肿瘤靶向T细胞治疗开发创造可能性。
共刺激配体包括但不限于CD48、CD58、CD86、TNFSF9、OX40L、4-1BBL、GITL、CD70、CD80、MR1、TNFSF4、ICOSL或ICOSLG。
CD58优于其他共刺激配体，因为它是肿瘤部位可用的主要共刺激途径，因为肿瘤浸润T淋巴细胞通常会失去其他共刺激受体(如CD28)的表达，或者由于肿瘤细胞的免疫原性低，肿瘤细胞不能充分活化T细胞，因此限制了可诱导共刺激受体(如41BB)的潜力。
如前所述，本公开的抗CD3ε抗体诱导不同水平的T细胞受体活化，这导致T细胞活力和细胞因子产生的改变。因此，共刺激配体CD58与抗CD3ε双特异性抗体的融合提供了整合的共刺激T细胞活化而实现了最佳的T细胞活化。
在一些实施方案中，双特异性抗体具有与第一重链多肽(H1)的N端融合的肽。在一些实施方案中，双特异性抗体具有与第一重链多肽(H1)的C端融合的肽。在一些实施方案中，双特异性抗体具有与第二重链多肽(H2)的N端融合的多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体具有与第二重链多肽(H2)的C端融合的多肽。示例性肽包括但不限于IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其部分。示例性肽包括但不限于CD48、CD58、CD86、TNFSF9、OX40L、4-1BBL、GITL、CD70、CD80、MR1、TNFSF4、ICOSL、ICOSLG或其部分。与双特异性抗体融合的示例性肽序列包括但不限于表15.1中列出的肽序列。
表15.1.示例性融合肽序列
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含表15.2中的任一个CD58序列的CD58融合肽。在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含SEQ ID NO:624-628中任一个的CD58融合肽。
在一些实施方案中，多肽直接与双特异性抗体融合。在一些实施方案中，多肽通过接头间接融合。在一些实施方案中，与肽融合的双特异性抗体包含接头序列。示例性的接头序列包括但不限于表16.1中所列的序列。
表16.1示例性接头序列
结构域 氨基酸序列 SEQ ID NO:
接头1 GGGGS SEQ ID NO:52
接头2 GGGGSGGGGS SEQ ID NO:53
接头3 GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:54
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-1(SEQ ID NO:52)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58融合肽(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，本发明的CD3 xULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-1(SEQ ID NO:52)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58v*融合肽(SEQ ID NO:50)。在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-1(SEQ ID NO:52)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的IL-7融合肽(SEQ ID NO:51)。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-2(SEQ ID NO:53)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58融合肽(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，本发明的CD3 xULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-2(SEQ ID NO:53)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58v*融合肽(SEQ ID NO:50)。在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-2(SEQ ID NO:53)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的IL-7融合肽(SEQ ID NO:51)。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-3(SEQ ID NO:54)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58融合肽(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，本发明的CD3 xULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-3(SEQ ID NO:54)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的CD58v*融合肽(SEQ ID NO:50)。在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有使用接头-3(SEQ ID NO:54)间接融合在第一重链多肽(H1)的C端的IL-7融合肽(SEQ ID NO:51)。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含表16.2中的任一个接头序列的铰链序列。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含SEQ IDNO:530-552中任一个的接头序列。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含表16.3中的任一个接头序列的铰链序列。
在一些实施方案中，本发明的CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体具有包含SEQ IDNO:553-606中任一个的接头序列。
具有CD58、CD58v*和IL-7融合的示例性CD3 x ULBP2/5/6双特异性抗体如表17和表18所示。
表17.示例性双特异性融合分子
表18.具有C端融合肽的CD3ε和ULBP2/5/6结合的示例性双特异性抗体
表19.与CD3ε和第二抗原结合的示例性双特异性抗体
(斜体-可变区，斜体和下划线-Kabat CDR定义，斜体和粗体-Chothia CDR定义，下划线-CD58融合物，下划线-半胱氨酸突变)
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0373包含含有SEQ ID NO:450的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:451的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:452的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:453的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0535包含含有SEQ ID NO:454的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:455的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:456的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:457的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0506包含含有SEQ ID NO:458的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:459的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:460的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0534包含含有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:463的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:464的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:465的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0702包含含有SEQ ID NO:466的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:467的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:468的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:469的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0703包含含有SEQ ID NO:470的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:471的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:472的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:473的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0765包含含有SEQ ID NO:474的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:475的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:476的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:477的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0766包含含有SEQ ID NO:478的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:479的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:480的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:481的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0990包含含有SEQ ID NO:482的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:483的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:484的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:485的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0991包含含有SEQ ID NO:486的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:487的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:488的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:489的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0991包含含有SEQ ID NO:486的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:487的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:488的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:489的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0992包含含有SEQ ID NO:490的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:491的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:492的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:493的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0993包含含有SEQ ID NO:494的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:495的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:496的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:497的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0869包含含有SEQ ID NO:498的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:499的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:500的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:501的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0870包含含有SEQ ID NO:502的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:503的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:504的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:505的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0871包含含有SEQ ID NO:506的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:507的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:508的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:509的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0872包含含有SEQ ID NO:510的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:511的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:512的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:513的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0546包含含有SEQ ID NO:514的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:515的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:516的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:517的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0607包含含有SEQ ID NO:518的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:519的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:520的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:521的氨基酸序列的H1。
在一些实施方案中，双特异性抗体EIP0614包含含有SEQ ID NO:522的氨基酸序列的L2，含有SEQ ID NO:523的氨基酸序列的H2，含有SEQ ID NO:524的氨基酸序列的L1，和含有SEQ ID NO:525的氨基酸序列的H1。
表20.本公开的双特异性抗体
表21.本公开的示例性双特异性抗体
生产方法
本领域内已知的各种方法可用于生产针对给定靶标的多克隆或单克隆抗体，所述给定靶标例如ULBP2/5/6、疾病相关抗原或其他靶标，或针对其衍生物、片段、类似物同源物或直系同源物。(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，通过引用并入本文)。
抗体通过熟知的技术来纯化，所述技术例如使用蛋白质A或蛋白质G的亲和色谱，其主要提供免疫血清的IgG部分。随后或可选地，可以将作为所寻求的免疫球蛋白的靶标的特定抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和色谱纯化免疫特异性抗体。例如，D.Wilkinson(The Scientist,The Scientist,Inc.出版,Philadelphia PA,第14卷,第8期(2000年4月17日),pp.25-28)讨论了免疫球蛋白的纯化。
在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。例如，通过使用本文提供的实施例中所述的程序来生成单克隆抗体。也可以通过例如用在其表面高水平表达给定靶标的细胞转染子组合来免疫BALB/c小鼠来产生抗体。然后筛选由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤对所选靶标的反应性。
单克隆抗体可例如使用杂交瘤方法诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)中所述的方法来制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物进行免疫，以诱发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。
免疫剂将通常包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。一般来说，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,AcademicPress,(1986)pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质可阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是那些能够有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定地高水平表达抗体并且对培养基诸如HAT培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可从例如加利福尼亚州的圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心和弗吉尼亚州的马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生单克隆抗体。(参见Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63))。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的存在。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此类技术和测定是本领域已知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力可以通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体鉴定鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体。
鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长。(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103)。用于此目的的合适的培养基包括例如杜氏改良伊格尔培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可作为哺乳动物的腹水在体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法从培养基或腹水中分离或纯化。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567中所述的方法制备。编码本发明单克隆抗体的DNA可以容易地用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。DNA也可被修饰，例如通过取代人重链和轻链恒定结构域的编码序列而替代同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接到免疫球蛋白编码序列上。此类非免疫球蛋白多肽可取代本发明抗体的恒定结构域，或可取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
本发明的单克隆抗体包括人源化抗体或人抗体。这些抗体适合施用于人，且不会引起人对所施用的免疫球蛋白的免疫反应。抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其主要由人免疫球蛋白的序列组成，并且包含最少的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化是例如按照Winter等人(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行的。(也参见美国专利号5,225,539)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应非人残基替代。人源化抗体还包括例如在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。一般来说，人源化抗体包括至少一个、通常两个可变结构域的基本上所有，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。
完全人抗体是这样的抗体分子，其中轻链和重链的整个序列(包括CDR)都来自人基因。此类抗体在本文中被称为“人抗体”或“完全人抗体”。单克隆抗体可以通过使用三源杂交技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人,1983Immunol Today 4:72)以及产生单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985，在MONOCLONALANTIBODIES ANDCANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96中)来制备。可以使用单克隆抗体，也可以使用人杂交瘤来生产(参见Cote等人,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或在体外用爱泼斯坦巴尔病毒转化人B细胞(参见Cole等人,1985，在：MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY,lan R.Liss,Inc.,pp.77-96中)。
此外，人抗体还可使用另外的技术(包括噬菌体展示文库)来生产。(参见Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)来制备。经攻击后，观察到人抗体的产生，其在所有方面都与人中观察到的非常相似，包括基因重排、组装和抗体库。这种方法描述于例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016以及Marks等人，Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368,812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14,826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)中。
还可使用转基因非人动物来另外产生人抗体，其经过修饰以产生完全人抗体，而不是响应抗原攻击的的内源性抗体。(参见PCT公开WO94/02602)。非人宿主中编码重链和轻链免疫球蛋白的内源性基因已丧失能力，而编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座被插入到宿主的基因组中。例如，使用含有所需的人DNA片段的酵母人工染色体来整合人基因。然后通过杂交繁育含有少于修饰的完全互补的中间转基因动物，获得提供所有所需修饰的动物作为子代。这种非人动物的一个实例是如PCT公开文本WO 96/33735和WO 96/34096中所公开的称为XenomouseTM的小鼠。这种动物产生分泌完全人的免疫球蛋白的B细胞。抗体可以在用所关注的免疫原免疫动物后直接从动物获得，例如作为多克隆抗体的制剂，或者从源自动物的永生化B细胞获得，诸如产生单克隆抗体的杂交瘤。此外，可以回收并表达编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因以直接获得抗体，或者可以进一步修饰以获得抗体类似物，例如单链Fv(scFv)分子。
美国专利号5,939,598公开了一种生产缺乏内源性免疫球蛋白重链表达的非人宿主(例如小鼠)的方法的实例。它可以通过一种方法获得，该方法包括从胚胎干细胞中至少一个内源性重链基因座中删除J区段基因，以防止该基因座的重排并防止重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物的形成，该删除是通过含有编码选择标记的基因的靶向载体实现的；并且从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞含有编码选择标记的基因。
美国专利号5,916,771公开了一种生产目标抗体(例如人抗体)的方法。此方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养物的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一个哺乳动物宿主细胞中，并将这两个细胞融合形成杂交细胞。杂交细胞表达包含重链和轻链的抗体。
对此方法的进一步改进中，PCT公开WO 99/53049中公开了鉴定免疫原上临床相关表位的方法，以及选择与相关表位以高亲和力特异性结合的抗体的相关方法。
抗体可以通过含有编码上述单链抗体的DNA区段的载体来表达。
这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助DNA、基因枪、导管等。载体包括诸如WO 93/64701中描述的化学缀合物，其具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如，聚赖氨酸)、病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)，诸如PCT/US 95/02140(WO95/22618)中描述的融合蛋白，其是含有靶部分(例如，针对靶细胞的特异性抗体)和核酸结合部分(例如，鱼精蛋白)、质粒、噬菌体等的融合蛋白。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。
优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘载体诸如正痘或禽痘载体、疱疹病毒载体诸如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体(参见Geller,A.I.等人,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,等人,于DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover编(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)中；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA 87:1149(1990)，腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人,Science,259:988(1993)；Davidson等人,Nat.Genet 3:219(1993)；Yang等人,J.Virol.69:2004(1995)以及腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.等人,Nat.Genet.8:148(1994)。
痘病毒载体将基因引入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体对于将核酸引入神经细胞是优选的。腺病毒载体的表达时间(约2个月)比腺相关病毒(约4个月)短，而腺相关病毒又比HSV载体短。选择的特定载体将取决于靶细胞和待治疗的疾患。引入可通过标准技术例如感染、转染、转导或转化进行。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、(Ca)2(PO4)3沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞显微注射和病毒载体。
载体可用于靶向基本上任何所需的靶细胞。例如，可采用立体定位注射将载体(例如腺病毒、HSV)引导至所需位置。此外，还可以使用微泵输注系统(例如SynchroMed输注系统)通过脑室内(icv)输注来输送粒子。基于体积流(称为对流)的方法，也已证明能有效地将大分子递送至大脑的扩展区域，并且可用于将载体递送至靶细胞。(参见Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994)；Morrison等人,Am.J.Physiol.266:292-305(1994))。可以使用的其他方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射、以及口服或其他已知施用途径。
双特异性抗体为对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在这种情况下，结合特异性之一是针对第一靶标，诸如CD3ε或其任何片段。第二结合靶标是疾病相关抗原，例如ULBP2/5/6或其任何片段。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和色谱步骤完成。类似的程序公开在1993年5月13日出版的WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。
本发明的双特异性和/或单价抗体可使用多种本领域公认的技术中的任一种来制备，包括2011年8月16日提交的共同待决申请WO 2012/023053中公开的技术，所述专利通过引用整体并入本文。WO 2012/023053中描述的方法产生了结构与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。这种类型的分子由两个拷贝的独特重链多肽即与恒定κ结构域融合的第一轻链可变区和与恒定λ结构域融合的第二轻链可变区组成。每个结合位点表现出不同的抗原特异性，重链和轻链均对此有贡献。轻链可变区可以属于λ或κ家族，并且优选分别与λ和κ恒定结构域融合。为了避免产生非天然的多肽连接，这是优选的。然而，也可以通过将κ轻链可变结构域与恒定λ结构域融合以获得第一特异性，并将λ轻链可变结构域与恒定κ结构域融合以获得第二特异性，来获得本发明的双特异性抗体。WO 2012/023053中描述的双特异性抗体被称为IgGκλ抗体或“κλ体”，是一种新的完全人双特异性IgG形式。这种κλ体形式可以实现双特异性抗体的亲和纯化，所述双特异性抗体与标准IgG分子没有区别，其特性与标准单克隆抗体没有区别，因此与以前的形式相比更具优势。
该方法的一个重要步骤是鉴定具有不同抗原特异性但共享相同重链可变结构域的两个抗体Fv区(各由可变轻链和可变重链结构域组成)。已描述了多种产生单克隆抗体及其片段的方法。(参见，例如Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，通过引用并入本文)。完全人抗体是这样的抗体分子，其中轻链和重链的序列(包括CDR 1和2)都来自人基因。CDR3区可以是人来源的，也可以通过合成方式设计。此类抗体在本文中被称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人,1983Immunol Today 4:72)以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985，在MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96中)来制备。可利用人单克隆抗体，并且可通过使用人杂交瘤(参见Cote等人,1983.ProcNatl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过在体外用爱泼斯-坦巴尔病毒转化人B细胞(参见Cole等人,1985于:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96中)来生产。
单克隆抗体例如通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体对动物进行免疫而产生。或者，用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染的细胞对动物进行免疫，使得靶抗原得到表达并与转染细胞的表面缔合。生产异种非人动物的多种技术是本领域所熟知的。例如，参见美国专利号6,075,181和6,150,584，其通过引用整体并入本文中。
或者，通过筛选包含用于结合靶抗原的抗体或抗原结合结构域序列的文库来获得抗体。例如，在噬菌体中制备此文库，作为与噬菌体外壳蛋白的蛋白质或肽融合体，所述噬菌体外壳蛋白在组装的噬菌体颗粒的表面上表达，并且编码包含在噬菌体颗粒内的DNA序列(即，“噬菌体展示文库”)。或者，可在酵母中制备文库，作为与酵母细胞表面s的细胞壁蛋白融合的蛋白质或肽以及酵母细胞内所含的编码DNA序列(即“酵母展示文库”)。
然后筛选由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤对靶抗原的反应性。单克隆抗体可例如使用杂交瘤方法诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)中所述的方法来制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物进行免疫，以诱发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。
虽然并非完全不可能，但偶然鉴定出具有相同重链可变结构域但针对不同抗原的不同抗体的可能性极小。事实上，在大多数情况下，重链对抗原结合表面的贡献很大，并且序列也是最易变化的。具体来说，重链上的CDR3在序列、长度和结构上是最具多样性的CDR。因此，针对不同抗原的两种抗体几乎总是携带不同的重链可变结构域。
共同待决申请WO 2012/023053中公开的方法克服了这一限制，并通过使用抗体文库极大地促进了具有相同重链可变结构域的抗体的分离，其中重链可变结构域对于所有文库成员都是相同的，因此多样性被限制在轻链可变结构域。此类文库在例如共同待决的申请WO 2010/135558和WO 2011/084255中进行了描述，每个申请均通过引用整体并入本文。然而，由于轻链可变结构域与重链可变结构域联合表达，因此两个结构域均可促进抗原结合。为了进一步促进该过程，可以并行使用含有相同重链可变结构域和多种λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库来体外选择针对不同抗原的抗体。这种方法能够识别两种具有共同重链但一种携带λ轻链可变结构域而另一种携带κ轻链可变结构域的抗体，这些抗体可用作生成本发明的完整免疫球蛋白形式的双特异性抗体的构建块。本发明的双特异性抗体可以是不同的同种型，并且可以修饰它们的Fc部分以改变与不同Fc受体的结合特性，并以此方式修饰抗体的效应功能及其药代动力学特性。已描述了多种修饰Fc部分的方法并且这些方法适用于本发明的抗体。(参见例如Strohl,WRCurr Opin Biotechnol 2009(6):685-91；美国专利号6,528,624；2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可用于产生缺少Fc部分的F(ab')2形式的双特异性抗体和抗体混合物。
将共同的重链和两条不同的轻链共表达到单个细胞中，以允许组装本发明的双特异性抗体。如果所有多肽都以相同的水平表达并同样好地组装形成免疫球蛋白分子，那么单特异性(相同轻链)和双特异性(两种不同的轻链)的比率应该是50％。然而，可能的是不同的轻链以不同的水平表达和/或不以相同的效率组装。因此，采用调节不同多肽的相对表达的方法来补偿它们固有的表达特征或与共同重链组装的不同倾向。这种调节可以通过启动子强度、使用具有不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或可以在转录或翻译水平起作用以及作用于mRNA稳定性的其他类型的调节元件来实现。不同强度的不同启动子可以包括CMV(立即早期巨细胞病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α亚基启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。来自哺乳动物和病毒的不同IRES也被描述。(参见例如Hellen CU和Sarnow P.Genes Dev 2001 15:1593-612)。这些IRES的长度和核糖体募集效率可有很大差异。此外，可能通过引入多个拷贝的IRES来进一步调整活性(Stephen等人2000Proc Natl Acad Sci USA 97:1536-1541)。表达的调节也可以通过细胞的多次连续转染以增加表达一种或另一种轻链的单个基因的拷贝数并因此改变它们的相对表达来实现。本文提供的实例证明，控制不同链的相对表达对于最大化双特异性抗体的组装和总产量至关重要。
重链和两条轻链的共表达在细胞培养上清液中产生三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化后者才能获得感兴趣的分子。本文所述方法通过使用与κ或λ轻链恒定结构域特异性相互作用的亲和色谱介质(例如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和基质(BAC BV,Holland))极大地促进了此纯化程序。这种多步骤亲和色谱纯化方法是高效的且普遍适用于本发明的抗体。这与必须针对源自四瘤细胞或表达抗体混合物的其他细胞系的每种双特异性抗体开发和优化的特定纯化方法形成了鲜明的对比。事实上，如果混合物中不同抗体的生化特性相似，则使用标准色谱技术(诸如离子交换色谱)进行分离可能具有挑战性或者根本不可能。
其他合适的纯化方法包括在2012年10月19日提交的共同待决申请PCT/IB2012/003028中公开的方法，该申请公布为WO2013/088259，其内容通过引用整体并入本文。
在产生双特异性抗体的其他实施方案中，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，包括至少部分铰链区、CH2区和CH3区。优选地，至少一个融合物中存在包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。有关产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人，Methods in Enzymology，121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可以工程改造一对抗体分子之间的界面，以最大化从重组细胞培养中回收的异二聚体的百分比。优选的界面包括抗体恒定结构域CH3区的至少一部分。在此方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿“腔”。这提供了一种提高异二聚体相对于其他不需要的最终产物诸如同二聚体的产量的机制。
文献中已经描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以利用化学键连来制备双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化的剂。
还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链生产了双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原形成单体，然后重新氧化形成抗体异二聚体。此方法也可用于生产抗体同二聚体。Hollinger等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中描述的“双抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了替代机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短以至于不能在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。
考虑具有多于两种价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991).
示例性的双特异性抗体可以结合两个不同的表位，其中至少一个源自本发明的蛋白质抗原。或者，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合白细胞上的触发分子的臂组合，诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以便将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂导向表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一种所关注的双特异性抗体结合本文描述的蛋白质抗原并进一步结合组织因子(TF)。
异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体由两种共价连接的抗体组成。例如，已提出将这种抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(参见美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。预期可以使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的方法)在体外制备抗体。例如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺盐以及例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。
可能需要就效应功能而言修饰本发明的抗体，以便增强例如抗体在治疗癌症和/或与异常ULBP2/5/6表达和/或活性相关的其他疾病和病症中的效力。例如，可在Fc区引入半胱氨酸残基，从而允许在此区域形成链间二硫键。由此产生的同型二聚抗体可具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤力和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人,J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992))。或者，可以对抗体进行工程改造，使其具有双Fc区，从而可以具有增强的补体溶解和ADCC能力。(参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230(1989))。
本发明还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)缀合的抗体。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹毒素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。多种放射性核素可用于生产放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体和细胞毒剂的缀合物是使用多种双功能蛋白质偶联剂制备的，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中描述的方法制备。碳-14标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
本领域的普通技术人员将认识到，可以将多种可能的部分与本发明的所得抗体偶联。(参见，例如，“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology andImmunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr(编辑),Carger Press,New York,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。
只要抗体和另一部分保留各自的活性，偶联可以通过结合两个分子的任何化学反应来实现。这种键连可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。然而，优选的结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或外部桥接分子的掺入来实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子(诸如本发明的抗体)与其他分子偶联。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物，如硫酯、碳二酰亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表并非旨在详尽列出本领域已知的各类偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例。(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；以及Vitetta等人,Science 238:1098(1987)。
文献中描述了优选的接头。(参见，例如，Ramakrishnan,S.等人，Cancer Res.44：201-208(1984)中描述了MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用)。还参见美国专利号5,030,719，其描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤化乙酰肼衍生物的使用。特别优选的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(PierceChem.Co.,Cat#21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)与EDC缀合的磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.,Cat.#24510)。
上述接头含有具有不同属性的成分，从而导致缀合物具有不同的物理化学性质。例如，烷基羧酸的磺基-NHS酯比芳族羧酸的磺基-NHS酯更稳定。含有NHS-酯的接头比磺基-NHS酯的溶解性更低。此外，接头SMPT含有空间位阻二硫键，可以形成稳定性增加的缀合物。二硫键通常不如其他键稳定，因为二硫键在体外会被裂解，导致可用的缀合物较少。磺基-NHS尤其可以增强碳二亚胺偶联物的稳定性。碳二亚胺偶联剂(诸如EDC)与磺基NHS缀合使用时，形成的酯比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解。
本文公开的抗体也可配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知方法制备，例如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA,77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。美国专利号5,013,556公开了具有增加的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成。脂质体通过具有确定孔径的过滤器挤出，得到具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab'片段可以如Martin等人,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述通过二硫键互换反应与脂质体缀合。
使用方法
本发明的任何抗CD3ε抗体(例如，结合CD3ε的本发明的双特异性抗CD3抗体，和第二种生物分子，例如疾病相关抗原)可用于治疗方法中。
在一个方面，提供了用作药物的抗CD3抗体(例如双特异性抗CD3和ULBP2抗体)。在进一步的方面，提供了用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症，例如食道癌或腺癌)或自身免疫性病症(例如关节炎)或延缓所述病症的进展的抗CD3抗体。在一些方面，提供了用于治疗或延缓衰老相关疾病的抗CD3抗体。
在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的抗CD3ε抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体的方法中的抗CD3ε抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗CD3ε抗体。在一个此类实施方案中，该方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体的免疫功能的抗CD3ε抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于增强患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体的免疫功能的方法中的抗CD3ε抗体，包括向个体施用有效量的抗CD3ε抗体以活化效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)，扩增(增加)效应细胞群，减少靶细胞(例如，表达由本发明的抗CD3ε抗体识别的第二生物分子的细胞，诸如本发明的双特异性抗CD3ε和ULBP2/5/6抗体)群和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了抗-抗-CD3ε抗体(例如双特异性抗-抗-CD3ε和ULBP2/5/6抗体)在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗细胞增殖性病症(例如癌症，例如食道癌或腺癌)或自身免疫性病症(例如关节炎)。在进一步的实施方案中，药物用于治疗细胞增殖性病症或自身免疫性病症的方法，包括向患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，该方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，药物用于活化效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群、减少靶细胞(例如表达由本发明的抗CD3抗体识别的第二生物分子的细胞，诸如本发明的双特异性TDB抗体)群和/或杀死个体中的靶细胞(例如靶肿瘤细胞)。在进一步的实施方案中，药物用于增强患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体的免疫功能的方法，包括向个体施用有效量的药物以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)，扩增(增加)效应细胞群，减少靶细胞(例如，表达由本发明的抗CD3抗体识别的第二生物分子的细胞，例如本发明的双特异性抗CD3和ULBP2抗体)群，和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了治疗细胞增殖性病症(例如癌症，例如食道癌或腺癌)或自身免疫性病症(例如关节炎)的方法。在一个实施方案中，方法包括向患有这种细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体施用有效量的抗抗CD3ε抗体(例如双特异性抗CD3ε和ULBP2/5/6抗体)。在一个此类实施方案中，该方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。在另一方面，本发明提供了增强患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体患有细胞增殖性病症或自身免疫性病症的个体的免疫功能的方法。在一个实施方案中，方法包括向个体施用有效量的抗CD3ε抗体以活化效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)，扩大(增加)效应细胞群，减少靶细胞(例如，表达由本发明的抗CD3ε抗体识别的第二生物分子的细胞，例如本发明的双特异性抗CD3ε和ULBP2/5/6抗体)群体，和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。在一个实施方案中，“个体”是人。
在另一方面，本发明提供了通过施用有效量的本发明的抗CD3ε抗体(例如双特异性抗CD3ε和ULBP2/5/6抗体)治疗尿路上皮癌、食道癌、胃癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌或腺癌(例如，结直肠腺癌、胃腺癌或胰腺腺癌)的方法，所述腺癌可以是转移性腺癌(例如，转移性结直肠腺癌、转移性胃腺癌或转移性胰腺腺癌)。
在其他实施方案中，双特异性抗CD3ε抗体与一种或多种另外的治疗剂共同施用(同时，作为单一或多种组合物(例如，制剂))。在其他实施方案中，双特异性抗CD3ε抗体在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在其他实施方案中，双特异性抗CD3ε抗体在一种或多种另外的治疗剂之后施用。示例性另外的治疗剂包括但不限于CDK4/6抑制剂(例如帕博西尼)、抗PD1抗体(例如纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗)、FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-氟尿嘧啶和亚叶酸钙联合使用)、卡培他滨5-氟尿嘧啶(5-FU)、CapeOx(XELOX；卡培他滨与奥沙利铂联合使用)、亚叶酸钙(亚叶酸)、贝伐单抗西妥昔单抗帕尼单抗瑞戈非尼伊立替康(CPT-11；)和FLOX(5-氟尿嘧啶与奥沙利铂联合使用)。
在另一方面，本发明提供了一种治疗血液癌症诸如B细胞癌(例如成熟B细胞淋巴瘤)的方法，通过施用有效量的本发明的抗CD3ε抗体，诸如本发明的双特异性TDB抗体，诸如抗B细胞靶向的TDB，诸如具有抗CD3ε臂和抗CD20臂的CD20-TDB。在实施方案的另一方面，成熟B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在该实施方案的另一方面，NHL选自包含以下的组：生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(CL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(ZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(W)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、脾淋巴瘤/白血病(未分类)、脾弥漫红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血变异型、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病、a重链疾病、γ重链病、μ重链病、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、[骨外浆细胞瘤、黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结节边缘区淋巴瘤、儿童结节边缘区淋巴瘤、儿童滤泡性淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统DLBCL、原发性皮肤DLBCL(腿型)、老年人EBV阳性DLBCL、与慢性炎症相关的DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤：B细胞淋巴瘤，无法分类，其特征介于弥漫大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间，以及B细胞淋巴瘤，无法分类，其特征介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤之间。在本发明的优选实施方案中，方法包括治疗癌症，所述癌症包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)或伯基特淋巴瘤(BL)。
在另一方面，本发明提供了包含本文提供的例如用于任何上述治疗方法的任何抗CD3ε抗体的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗-CD3ε抗体和药学上可接受的载剂。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗CD3ε抗体和例如如本文所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的抗体在治疗中可单独使用或与其他剂组合。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射治疗的剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂或其他剂，诸如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(TarcevaTM)、血小板源性生长因子抑制剂(例如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、干扰素、细胞因子、除本发明的抗CD3抗体以外的抗体，诸如与以下一个或多个靶标结合的抗体：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA VEGF或VEGF受体、TRAIL/Apo2、PD-1(例如纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗(Cemiplimab))、PD-L1(阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗)、PD-L2或其他生物活性或有机化学剂。在一些实施方案中，本发明提供了其中另外的治疗剂是糖皮质激素的方法。在一个实施方案中，糖皮质激素是地塞米松。
上述这种联合疗法涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或单独的制剂中)和单独施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在另外的一种或多种治疗剂的施用之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗CD3ε抗体的施用和另外的治疗剂的施用在彼此的在约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一天、两天、三天、四天、五天或六天内发生。本发明的抗CD3ε抗体(例如，与CD3ε和第二生物分子(例如，疾病相关抗原)结合的本发明的双特异性抗CD3ε抗体)还可与放射疗法联合使用。
本发明的抗体(和/或任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要进行局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，抗体通过皮下施用来施用。在一些实施方案中，通过皮下注射施用的抗CD3ε抗体在患者中表现出比通过静脉内注射施用的相同抗CD3ε抗体更低的毒性反应。可以通过任何合适的途径，例如通过注射(诸如静脉内或皮下注射)来给药，这部分地取决于施用是短暂或长期的。本文考虑包括但不限于在各种时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注的各种给药方案。
本发明的抗体将以与良好的医学实践一致的方式被配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括受治疗的具体病症、受治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的起因、剂的递送部位、施用方法、施用时程以及从业医生已知的其他因素。抗体不需要但是可以任选地与一种或多种目前用于预防或治疗讨论的病症的剂一起配制。此类其他的剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、病症或治疗的类型和上面讨论的其他因素。通常以相同的剂量和用如本文所述的施用途径，或约1％至99％的本文所述的剂量，或以任何剂量和通过经经验/临床确定为合适的任何途径来使用这些。
对于疾病的预防或治疗，本发明的任何抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重性和进展、是否施用抗体或免疫缀合物用于预防和治疗目的、先前的治疗、患者的临床史和对抗体的反应以及参与医生的判断。同时或通过一系列治疗将抗体适当地施用于患者。
作为一般建议，施用给人的抗CD3ε抗体(例如双特异性抗CD3ε和ULBP2/5/6抗体)的治疗有效量将在约0.01至约100mg/kg患者体重的范围内，无论是一次或多次施用。在一些实施方案中，所使用的抗体例如每日施用约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg或约0.01至约1mg/kg。在一个实施方案中，在21天的周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量向人施用本文所述的抗CD3ε抗体。剂量可以作为单剂量或多剂量(例如，2或3个剂量)施用，例如输注。对于几天或更长时间内的重复施用(这取决于条件)，将通常维持治疗直到疾病症状发生所需的抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如以使患者接受约2至约20个或例如约六个剂量的抗CD3ε抗体)。可以施用初始较高的负载剂量，然后是一个或多个较低的剂量。通过常规技术和测定容易监测这种治疗的进程。
在一些实施方案中，该方法可以还包括另外的疗法。另外的疗法可以是放射疗法、手术、化学疗法、基因疗法、DMA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法形式。在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗的副作用的发生和/或严重程度的剂，诸如止吐剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ放射。在一些实施方案中，另外的疗法可以是单独施用一种或多种上述治疗剂。
应当理解，根据本发明的治疗实体的施用将与合适的载剂、赋形剂和掺入制剂中的其他剂一起施用，以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的制剂可以在所有药物化学家已知的处方集中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版,MackPublishing Company,Easton,PA(1975))，特别是其中Blaug,Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。任何上述混合物均可适用于本发明的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分不被制剂灭活，并且该制剂在生理上与施用途径相容且可耐受。还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:the need forpreclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oraldrug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000),Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm SciTechnol 52:238-311(1998)以及其中对于包含与药物化学家熟知的制剂、辅料和载剂相关的附加信息的引用。
本发明的治疗制剂(包括本发明的抗体)用于治疗或缓解与癌症相关的症状，所述癌症诸如(非限制性地举例来说)白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌和支气管癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌和肾盂癌、口腔和咽癌、子宫体癌和/或黑素瘤。本发明还提供了治疗或缓解与癌症相关的症状的方法。治疗方案通过使用标准方法鉴定受试者例如患有癌症(或有患上癌症的风险)的人患者来进行。
治疗的有效性是结合任何已知的诊断或治疗特定免疫相关病症的方法来确定的。免疫相关病症的一种或多种症状的缓解表明抗体赋予了临床益处。
筛选具有所需特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域已知的其他免疫介导技术。
针对靶标诸如CD3ε、ULBP2/5/6或其组合(或其片段)的抗体可用于本领域中已知的与这些靶标的定位和/或定量有关的方法中，例如用于测量适当生理样品中这些靶标的水平、用于诊断方法、用于对蛋白质成像等。在给定的实施方案中，含有抗体衍生的抗原结合结构域的特异性任何这些靶标的抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物被用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
本发明的抗体可用于使用标准技术诸如免疫亲和法、色谱法或免疫沉淀法分离特定靶标。本发明的抗体(或其片段)可用于诊断性地监测组织中的蛋白质水平作为临床测试程序的一部分，例如用于确定给定治疗方案的功效。通过将抗体与可检测物质偶联(即物理连接)可以方便地进行检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体(包括多克隆、单克隆、人源化和完全人抗体)可用作治疗剂。此类剂通常用于治疗或预防与受试者中给定靶标的异常表达或活化相关的疾病或病理。将抗体制剂(优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂)施用于受试者，并且通常会因其与靶标的结合而产生效果。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标的信号传导功能。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标与其天然结合的内源性配体的结合。
本发明抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目的所需的量。如上所述，这可能是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下干扰靶标的功能。需要施用的量还取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还取决于施用的抗体从施用该抗体的其他受试者的自由体积中消耗的速率。非限制性实例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围可以是约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率可以在例如每天两次到每周一次的范围内。
本发明的抗体或其片段可以以药物组合物的形式施用，用于治疗多种疾病和病症。制备此类组合物的原理和考虑因素以及选择组分的指导提供于例如Remington:TheScience And Practice Of Pharmacy，第19版(Alfonso R.Gennaro等人编辑)MackPub.Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,第4卷),1991,M.Dekker,New York。
当使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白结合结构域的最小抑制片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可以通过化学合成和/或重组DNA技术生产。(参见，例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。制剂还可以包含一种以上的活性化合物，这是所治疗的特定适应症所必需的，优选具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性化合物。可选地或另外地，组合物可包含增强其功能的剂，例如细胞毒剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以对于预期目的有效的量适当地组合存在。
活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳剂中。
待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这易于通过经由无菌过滤膜过滤来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间段较短。
根据本发明的抗体可用作检测样品中给定靶标(或其蛋白质片段)的存在的剂。在一些实施方案中，抗体含有可检测标签。抗体是多克隆的，或更优选单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。对于探针或抗体而言，术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体上而对探针或抗体进行直接标记，以及通过与另一种直接标记的试剂反应而对探针或抗体进行间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素对DNA探针进行末端标记以便可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物液体，以及受试者体内存在的组织、细胞和液体。因此，术语“生物样品”的使用包括血液以及血液的一部分或成分，包括血清、血浆或淋巴。也就是说，本发明的检测方法可用于体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，检测分析物mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测分析物基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。进行免疫测定的程序在例如“ELISA:Theory and Practice:Methods in Molecular Biology”,第42卷，J.R.Crowther(编辑)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；以及“Practice andTheory ofEnzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985中有所描述。此外，检测分析物蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白质抗体引入受试者。例如，抗体可以用放射性标志物标记，可以通过标准成像技术检测其在受试者体内的存在和位置。
药物组合物
本发明的抗体(本文也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可以掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载剂在Remington’sPharmaceutical Sciences的最新版本中有所描述，该书是本领域的标准参考文本，其通过引用并入本文中。此类载剂或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物诸如固定油。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，预期将其用于组合物中。补充性有效化合物也可并入组合物中。
本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠来调节pH值。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是易于注射的液体。在制备和储存的条件下它必须稳定并且必须针对诸如细菌和真菌的微生物污染作用而防腐。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。例如，通过使用例如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物作用。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化钠。可以通过在组合物中包含例如单硬脂酸铝和明胶的延长吸收的剂实现可注射组合物的延长吸收。
无菌注射液可通过将所需量的活性化合物连同根据需要上述一种成分或成分组合掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和上文列举的所需要的其他成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是将先前经过无菌过滤的溶液进行真空干燥和冷冻干燥，从而得到包含活性成分和任何其他所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以封装在明胶胶囊中或压成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。还可以使用流体载剂制备口服组合物以用作漱口水，其中将流体载剂中的化合物口服以及漱口并吐出或吞咽。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有下列任何成分或类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖，崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
对于通过吸入施用，化合物以气雾剂喷雾的形式从含有合适推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的压力容器或分配器或雾化器中递送。
全身施用也可通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，活性化合物被配制成本领域中普遍已知的软膏、油膏、凝胶剂或乳膏。
化合物还可制成栓剂形式(例如，使用常规栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂用于直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物与可防止化合物从体内快速消除的载剂一起制备，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可购自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.。脂质体悬浮液(包括针对感染细胞的脂质体，其含有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所描述的。
为施用方便和剂量均匀，配制剂量单位形式的口服或肠胃外组合物是特别有利的。本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的与期望药物载剂结合的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由下述规定并且直接取决于下述：活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和合成此类用于治疗个体的活性化合物的领域的固有限制。
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明将在下列实施例中进一步描述，但这些实施例并不限制权利要求中所述的本发明的范围。
定义
除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书，或如本领域通常完成的或如本文所述的那样进行。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法进行，如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。例如参见Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和药物与制药化学所使用的命名法以及本文所描述的分析化学、合成有机化学和药物与制药化学的实验室程序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术被用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
除非另外指出，否则如根据本公开所用的以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与之发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇发生反应，而不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(Kd>10-6)结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab'和F(ab')2片段、scFvs和Fab表达文库。
已知抗体的基本结构单元是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。一般来说，从人获得的抗体分子属于IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类中的任何一种，它们因分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些类别也有子类，诸如IgG1、IgG2、IgG4等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
本文使用的术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”是指仅含有一种抗体分子种类的抗体分子群，该抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体来说，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中都是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，所述抗原表位的特征在于对其具有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合区”或“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链V区内的三个高度差异的区段称为“高变区”，位于称为“框架区”或“FR”的更保守侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白的高变区之间和相邻处天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此排列，形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。本领域已知多种用于编号抗体的氨基酸序列和鉴定互补决定区的方法。例如，Kabat编号系统(参见Kabat,E.A.等人,Sequencesof Protein of immunological interest,第五版,US Department of Health and HumanServices,US Government Printing Office(1991))或IMGT编号系统(参见国际ImMunoGeneTics)。可在线获取：http://www.imgt.org/)。IMGT编号系统在本领域中被常规使用和被视为可靠且准确的系统，用于确定编码序列中的氨基酸位置、等位基因比对以及轻松比较所有脊椎动物物种的免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TR)中的序列。IMGT数据的准确性和一致性基于IMGT-ONTOLOGY，这是第一个也是迄今为止唯一的免疫遗传学和免疫信息学本体论(参见Lefranc.M.P.等人,Biomolecules,2014Dec；4(4),1102-1139)。IMGT工具和数据库根据由大型序列库构建的IMGT参考目录运行。在IMGT系统中，IGV-结构域和IG C-结构域会在适当的情况下考虑外显子界定来界定。因此，IMGT数据库中更多序列的可用性，IMGT外显子编号系统可以并且被本领域技术人员可靠地用于确定编码序列中的氨基酸位置和等位基因的比对。此外，IMGT独特编号与其他编号(即Kabat)之间的对应关系可在IMGT科学图表中找到(参见Lefranc.M.P.等人,Biomolecules,2014Dec；4(4),1102-1139)。
术语“高变区”或“可变区”是指抗体中通常负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，当按照Kabat编号系统编号时，VL中约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)残基，以及VH中约31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)残基；Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当根据Chothia编号系统编号时，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及VH中的26-32(HI)、52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”VCDR的那些残基(例如，当根据IMGT编号系统编号时，VL中的残基27-38(LI)、56-65(L2)和105-120(L3)，以及VH中的27-38(HI)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc,M.P.等人,Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)，Ruiz,M.等人,Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。任选地，当根据AHo；Honneger,A.和Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))编号时，抗体在以下一个或多个位点具有对称插入：VL中的第28、36(LI)、63、74-75(L2)和123(L3)位以及VH中的第28、36(HI)、63、74-75(H2)和123(H3)位。
本文中使用的术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如氨基酸)的化学活性表面基团或糖侧链组成并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。例如，可以产生针对多肽的N端或C端肽的抗体。当解离常数<1μM，例如<100nM，优选<10nM，更优选<1nM时，抗体与抗原特异性结合。
如本文所用的术语“免疫结合”和“免疫结合特性”是指在免疫球蛋白分子和对免疫球蛋白有特异性的抗原之间发生的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)来表示，其中Kd越小表示亲和力越大。所选多肽的免疫学结合特性可使用本领域熟知的方法进行量化。其中一种方法是测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同样影响速率的几何参数。因此，通过计算浓度和实际的缔合与解离速率，可以确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。(参见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率能够抵消所有与亲和力无关的参数，并且等于解离常数Kd。(参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数(Kd)为≤1μM、例如≤100nM、优选≤10nM、且更优选≤1nM时，本发明的抗体特异性地结合其靶标，如通过本领域技术人员已知的测定法例如放射性配体结合测定法或类似测定法测量的。
本文所用术语“分离的多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源或其某种组合的多核苷酸，由于其来源，“分离的多核苷酸”(1)不与自然界中存在的“分离的多核苷酸”的全部或部分多核苷酸相关联，(2)可操作地与在自然界中不相连的多核苷酸相连，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。根据本发明的多核苷酸包括编码本文所述的重链免疫球蛋白分子的核酸分子和编码本文所述的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的“分离蛋白质”意指cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白质或它们的某种组合，根据其来源或衍生来源，“分离蛋白质”(1)与自然界中发现的蛋白质无关，(2)不含来自同一来源的其他蛋白质，例如不含海洋蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。
术语“多肽”在本文中用作通用术语，指天然蛋白质、多肽序列的片段或类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的物质。根据本发明的多肽包含本文描述的重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子(诸如κ轻链免疫球蛋白分子)的组合形成的抗体分子，反之亦然，以及其片段和类似物。
本文使用的术语“天然存在的”应用于物体时是指物体可以在自然界中找到的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列可以从自然界的来源中分离出来，并且没有在实验室中被人有意修饰或者是天然存在的。
“可操作地连接”是指组件的位置处于允许它们以预期的方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
本文所用的术语“控制序列”是指影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体不同而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对于表达和加工而言必需的所有组分，并且还可以包括其存在对例如前导序列和融合配偶体序列有利的另外的组分。本文所指的术语“多核苷酸”是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合硼，或者是核糖核苷酸或者是脱氧核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编,Sinauer Associates,Sunderland Mass.(1991))，其通过引用方式并入本文。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、s-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。根据标准用法和惯例，在本文所用的多肽符号中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基端方向。
当应用于多肽时，术语“基本同一性”是指两个肽序列在进行最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行比对时，共享至少80％的序列同一性、优选至少90％的序列同一性、更优选至少95％的序列同一性并且最优选至少99％的序列同一性。
优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论的，本发明涵盖抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化，前提是氨基酸序列的变化保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％，最优选99％。特别地，保守的氨基酸替代是预期的。保守替代是发生在侧链相关的氨基酸家族内的替代。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸有赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸有丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他氨基酸家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其属于脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其属于含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其属于脂肪族家族；以及(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其属于芳香族家族。例如，可以合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸、或用结构相关的氨基酸进行类似的氨基酸替换，不会对所得分子的结合或性质产生重大影响，特别是替换不涉及框架位点内的氨基酸的情况。通过测定多肽衍生物的比活性，可以容易地确定氨基酸变化是否产生功能肽。本文详细描述了测定法。本领域普通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基和羧基端出现在功能结构域的边界附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构和功能结构域。优选地，使用计算机比较方法来鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253:164(1991)。因此，前述实施例证明本领域技术人员能够识别可用于定义根据本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸取代是是这样的取代，所述取代：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，或(4)赋予或改变其他物理化学或功能特性。类似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白质。例如，可以在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不实质上改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏亲本序列特征的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编,W.H.Freemanand Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；以及Thornton等人,Nature354:105(1991)。
本文中使用的术语“标记”或“标记的”是指掺入可检测的标志物，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸或附着到可以通过标记的亲和素检测的生物素部分的多肽(例如，含有可以通过光学或量热方法检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)。在某些情况下，标签或标志物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、由二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标签通过不同长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间位阻。本文使用的术语“药剂或药物”是指当适当地施用于患者时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。
本文中的其他化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.,Ed.,McGraw-Hill,San Francisco(1985))所示。
本文使用的“基本上纯的”是指目标物质是存在的主要物质(即，以摩尔为基础，它比组合物中的任何其他单个物质都更丰富)，并且优选地基本上纯化的部分是其中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔为基础)的组合物。
一般而言，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的所有大分子物质的约大于80％，更优选地大于约85％、90％、95％和99％。最优选地，将目标物质纯化到基本上同质的(通过常规检测方法无法检测到组合物中的污染物物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。
术语患者包括人和兽医受试者。
实施例
实施例1：实施例2-8的材料和方法
蛋白质
食蟹猴ULBP2的氨基酸26-216(NCBI参考序列：XP_005552169.1)与hIgG1 Fc融合并在Expi293 HEK细胞中表达。人ULBP2-Fc、ULBP2-His、ULBP5-His、ULBP6-His和NKG2D-Fc购自R&D Systems。生物素标记的人CD3ε/δ和食蟹猴CD3ε/δ也购自Acro Biosystems。
生物层干涉测量法
生物层干涉测量法(BLI)在Octet RED384(Sartorius)上进行。将ULBP2抗体在动力学缓冲液(PBS+0.02％ Tween20、0.1％ BSA、0.05％叠氮化钠)中稀释至5μg/mL，然后加载到AHC生物传感器(Sartorius)中120秒。为了缔合，将传感器转移到含有以下浓度(250、125、62.5和31.25nM)的ULBP2、ULBP5和ULBP6的孔中300秒。随后，在600秒内测量解离。通过使用Octet分析软件将数据拟合到1:1结合模型来确定动力学和亲和常数。
表面等离子体共振
在Biacore 8K+(Cytiva)上进行表面等离子体共振(SPR)。使用传感器芯片SA(Cytiva)捕获生物素标记的蛋白质。将抗体在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4)中稀释至适当浓度，并以30μL/min的流速注入每个通道进行多循环动力学/亲和力分析。缔合接触时间和解离时间分别为60-120秒和120-420秒。通过以30μL/min的流速注射10mM甘氨酸(pH 1.5)持续60秒来再生芯片表面。通过使用Biacore insight评估软件将数据拟合到1:1结合模型来确定动力学和亲和常数。
NKG2D竞争ELISA
Maxisorp板(Nunc)用PBS中的5μg/mL ULBP2-His包被。在用含有5％ BSA的PBS封闭1小时后，将孔与10nM生物素标记的NKG2D-Fc和浓度增加的A06或E12抗体(0.0003、0.0011、0.0046、0.0183、0.0732、0.29、1.17、4.69、18.8、75、300nM)再孵育1小时。然后洗涤孔并将其与链霉亲和素辣根过氧化物酶缀合物再孵育1小时。添加化学发光底物(ThermoFisher)并使用EnSight读数器(Perkin Elmer)测量发光。
使用与Dynabeads缀合的生物制剂体外重复刺激T细胞
根据制造商的说明，使用EasySep人T细胞CD3+分离试剂盒(STEMCELL)通过负选择从健康PBMC中分离T细胞，并将其重悬在加有10％ FBS的RPMI 1640GlutaMAX培养基中。对于每一轮刺激，将分离的T细胞(1×106个细胞/ml)与缀合于Dynabeads(Thermofisher)的10nM蛋白质在37℃下孵育2至3天。在每轮刺激结束时，通过使用磁分离去除Dynabeads对细胞进行传代，然后每2至3天用新的细胞培养基和新鲜的Dynabeads进行培养。每轮结束时也收集细胞进行细胞计数，并通过流式染色确定表面和细胞内的标志物表达。
T细胞分离和活化
使用StemCell T细胞分离试剂盒从健康PBMC供体中分离T细胞。OpTmizer培养基中补充有2％人AB血清、1X青霉素/链霉素、4mM glutaMAX、2mM谷氨酰胺。将细胞以5x105个细胞/mL在补充OpTmizer培养基中在37℃和5％ CO2下孵育，然后用CD3和CD28抗体包被的Dynabeads处理48小时。除去Dynabeads后，将T细胞与IL-7(2.5ng/ml)和IL-15(2.5ng/ml)在补充OpTmizer培养基中另外孵育6天。每48小时用新鲜解冻的细胞因子(IL7和IL15)更换补充的培养基。在过继转移当天，使用血细胞计数器测量T细胞数量和活力。
用人T细胞共移植的肿瘤研究
将500万个CORL-105-GFP-luc细胞和100万个活化T细胞皮下植入皮下植入NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ,Jackson Laboratory)的侧腹。从第0天开始，每两周以4mg/kg给予抗体，持续3周。使用电子卡尺监测肿瘤生长，并根据公式计算体积：π/6x(长度x宽度2)。
EIP0561在食蟹猴中的药代动力学
三只食蟹猴分别接受以下剂量群组的EIP0561静脉内输注：0.25、1.0和4.0mg/kg。在输注后0.03、0.5、2、8、24、48、72和168小时使用含有抗凝剂K2EDTA的试管采集血液样品，并在4℃下以2500rpm离心10分钟。然后将血浆分成等份并储存在≤60℃的温度下。
使用夹心ELISA测定食蟹猴血浆中的EIP0561水平。将封闭缓冲液(PBS中的3％BSA)中的生物素缀合的ULBP2(4.5μg/mL)与链霉亲和素包被的板(每孔100μL)在4℃下孵育16小时。将血浆样品在冰上解冻，并在4℃下以21,000x g离心5分钟。在封闭缓冲液中制备每个时间点的样品系列稀释液，而对于标准曲线，在封闭缓冲液加2％正常食蟹猴血清中制备EIP0561的四倍系列稀释液，一式两份。将ELISA板在4℃下孵育过夜。用PBST洗涤测定板三次，然后向每孔中添加小鼠-α-人IgG-HRP(克隆G18-145)检测抗体(在封闭缓冲液中1:500稀释)，并将板在室温下孵育1小时。洗涤后，将化学发光过氧化物酶底物添加到微孔板中，室温下孵育5分钟，然后在EnSight板读数器上测量发光。
将每个样品中EIP0561的血浆浓度(Cp)作为时间的函数图作图。使用R版本4.2.1(2022-06-23ucrt)中的IQnca软件包(IntiQuan版本：1.3.0，合规模式关闭)进行非房室分析。除另有说明外，否则使用IQnca默认配置，指定和包括以下：NCA模型由配置文件类型：“单剂量”和施用类型：“静脉内推注”定义，因为未提供静脉内输注时间。在这些条件下，任何缺失的用于AUC计算的给药前估算都会根据制造商的标准进行反向外推。(https://iqnca.intiquan.com/)。AUC计算方法是线性梯形法与线性插值法。λZ(λz)方法最适合λz、对数回归，并且需要最少三个点。λz计算中未使用加权。
酵母表面展示
编码以下的质粒DNA：(1)人ULBP2(26-216)、具有R106L取代的人ULBP2、含有单个丙氨酸取代的人ULBP2(26-216)的丙氨酸变体或食蟹猴ULBP2(26-216)、(2)V5表位标签和(3)Aga2蛋白，全部都在半乳糖诱导启动子下转化到感受态EBY-100酵母(ATCC)中，并铺板到不含色氨酸的CM葡萄糖培养基中，在30℃下生长2-4天。然后将单菌落转化体转移到含有CM葡萄糖培养基(不含色氨酸)的2mL深孔板中，并在30℃下摇动培养过夜。将细胞沉淀并转移到不含色氨酸的CM半乳糖培养基中，并在20℃下过夜培养以诱导ULBP2的表达和表面展示。
为了表位作图，将48种ULBP2丙氨酸变体与生物素标记的A06和E12(1nM)以及小鼠抗V5抗体在室温下孵育1小时。然后使用含有0.1％ BSA和0.01％ Tween的PBS洗涤细胞，并将其与链霉亲和素-PE缀合物和小鼠抗V5抗体(Alexa488山羊抗鼠IgG抗体(ThermoFisher))和Alexa FluorTM647链霉亲和素(ThermoFisher)一起在冰上孵育30分钟。使用BD FACSymphony A3流式细胞仪(BD Biosciences)洗涤并分析细胞。
分子建模和结构生物信息学
使用BioLuminate,LLC,New York,NY,2021中的“构建同源性模型”工具产生抗原人ULBP2结构。为此，使用了人ULBP2序列(SEQ ID NO:421)。与ULBP6(PDB ID：4S0U)复合的人NKG2D的晶体结构被用作构建人ULBP2结构的模板。通过使用OPLS_2005力场执行约束最小化，使用Bioluminate中的“蛋白质制备工作流程”对生成的模型进行细化。人ULBP2和ULBP6(SEQ ID：423)共享96％序列同一性。
人ULBP2-NKG2D复合物的结构是使用与ULBP6(PDB ID：4S0U)复合的人NKG2D的晶体结构建模的。为此，使用Pymol(PyMOL分子图形系统，版本2.0LLC)将人ULBP2的预测结构与ULBP6-NKG2D复合物(PBD ID：4S0U)中的ULBP6进行比对。现在，从复合物中去除ULBP6的结构，并将人ULBP2与NKG2D作为复合物提取。
E12和A06的抗体结构是使用BioLuminate,LLC,New York,NY,2021中的“抗体结构预测”工具产生的。为了建模E12抗体，人激动剂抗体KMTR2(PDB ID：3X3F)的结构用于构建E12的重链和轻链。同样，为了建模A06抗体，使用了Fab4AB007(PDB ID:5MVZ)的结构。通过使用OPLS_2005力场执行约束最小化，使用Bioluminate中的“蛋白质制备工作流程”对生成的模型进行细化。
实施例2：人源化ULBP2抗体的表征
人源化ULBP2抗体
使用表面等离子体共振(SPR)测定了人源化ULBP2抗体A06和E12与人和食蟹猴ULBP2的结合动力学，其动力学常数汇总在下表23中。
表23：抗体与人和食蟹猴ULBP2结合的缔合、解离和平衡常数
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD n(M)
E12 人ULBP2 9.57E+05 2.11E-04 0.22
食蟹猴ULBP2 3.41E+06 1.82E-03 0.534
A06 人ULBP2 1.32E+06 2.14E-04 0.162
食蟹猴ULBP2 无结合 无结合 无结合
使用生物层干涉测量法(BLI)测定了人源化ULBP2抗体A06和E12与人ULBP2、ULBP5和ULBP6的结合动力学，其解离常数汇总在下表24中。
表24：抗体与人ULBP2、ULBP5和ULBP6结合的平衡解离常数
A06的特征性特征是缺乏与ULBP5、ULBP6和食蟹猴ULBP2的结合，它们都在第106位共享共同的氨基酸亮氨酸。相比之下，在ULBP2的第106位发现了精氨酸。在下表25中，A06显示与展示ULBP2的酵母结合，但不与展示ULBP2 R106L或食蟹猴ULBP2的酵母结合。相比之下，E12与酵母上展示的所有三种蛋白质结合。这些数据表明R106是A06表位的关键残基。
表25.ULBP2抗体与ULBP2展示酵母结合的平均荧光强度(MFI)。
未染色对照的MFI为385。
与NKG2D竞争
对ULBP2抗体与NKG2D竞争结合ULBP2的能力进行了评估。如表26所示，A06抑制NKG2D-Fc(10nM)与板结合ULBP2的结合，IC50为2.26nM，而E12没有影响。
表26-ULBP2抗体对NKG2D结合ULBP2的半数最大抑制浓度
抗体 IC50(nM)-NKG2D与ULBP2结合
A06 2.26
E12 无抑制
利用酵母展示的ULBP2丙氨酸扫描
以下列表的ULBP2表面残基被突变为丙氨酸，以检测A06和E12抗体结合(表27)。
表27：用于丙氨酸取代的ULBP2表面残基
生成了48个ULBP2的单独丙氨酸取代突变体，并展示在酵母表面，并与A06和E12抗体一起孵育，然后在流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo v10软件，通过落入散点图的3个定义区域的细胞百分比观察A06和E12与每个ULBP2突变体的结合：门1-对应于抗体与野生型ULBP2的结合，门2-代表与ULBP2的中等结合，门3-代表与ULBP2的弱结合或无结合。表28和表29分别显示了A06和E12的每个ULBP2突变体落入3个不同门的细胞频率。
表28：A06(1nM)与ULBP2突变体结合的总细胞频率
表29：E12(1nM)与ULBP2突变体结合的总细胞频率
A06和E12与ULBP2结合的结构建模
利用NKG2D/ULBP6复合物(PDB:4S0U)的X射线晶体学结构创建了NKG2D与ULBP2复合物的同源模型。随后，使用Bioluminate(Schrodinger)中的蛋白质-蛋白质对接模块将A06和E12抗体的片段可变区(Fv)单独对接在ULBP2表面。在对接过程中，A06/E12被标记为抗体并且非CDR区域被掩蔽，使得非CDR区域的吸引势被消除。对于附加限制，通过A06和E12的丙氨酸扫描确定的ULBP2位置具有吸引电位。对于E12，位点根据具有最大H键相互作用、CDR结合和不与NKG2D重叠进行排序。类似地，对A06位点进行筛选最大H键相互作用、CDR结合以及与NKG2D的重叠。图34A-34C显示了A06-ULBP2和E12-ULBP2排序最高的位点。
A06和E12的表位分析
使用预测的A06-ULBP2和E12-ULBP2复合物，E12和A06的表位得到进一步细化和扩展，超出了使用丙氨酸扫描观察到的范围。ULBP2与A06以及ULBP2与E12相互作用的残基分别列于表30和表31中。
表30.ULBP2与A06抗体的分子相互作用
#HB：氢键数；表面互补性：行中第1组和第2组残基之间的表面互补性(参考：2)；第1组埋藏的SASA：第1组残基的溶剂可及表面积中因与第2组残基的相互作用而被埋藏的部分；第2组埋藏的SASA：第2组残基的溶剂可及表面积中因与第1组残基的相互作用而被埋藏的部分。
表31.ULBP2与E12抗体的分子相互作用
#HB：氢键数；表面互补性：行中第1组和第2组残基之间的表面互补性(参考：2)；第1组埋藏的SASA：第1组残基的溶剂可及表面积中因与第2组残基的相互作用而被埋藏的部分；第2组埋藏的SASA：第2组残基的溶剂可及表面积中因与第1组残基的相互作用而被埋藏的部分。
实施例3：具有重链和轻链异二聚化的双特异性抗体的设计和表达
双特异性抗体的分子建模和结构指导设计
双特异性IgG样抗体形式设计的挑战在于(i)有效的重链异二聚化和(ii)有效的轻链异二聚化，以实现具有良好特异性的正确同源配对。因此，双特异性或多特异性抗体被设计为包括(i)旋钮入孔突变以促进有效的重链异二聚化和(ii)带电配对(VH1和VL1界面和/或VH2和VL2界面之间，以及CH1H1和CL1界面和/或CH2H1和CL2界面之间)和二硫键稳定突变(CH1H1和CL1界面之间和/或CH2H1和CL2界面之间)，它们共同促进重链和轻链的正确同源配对。重链和轻链的正确配对有利于有效的大规模抗体生产和纯化。
所有分子建模工作均采用Schrodinger的Bioluminate建模套件和Pymol分子图形系统完成。曲妥珠单抗(PDB ID:1N8Z)的高分辨率晶体结构被用作抗体的疾病相关抗原(DAA)结合部分的VH2-CH2H1/VL2-CL2κ抗原结合片段(Fab)的同源性建模的骨架模板，而帕妥珠单抗(PDB ID:4LLU)的高分辨率晶体结构被用作抗体的CD3结合部分的VH1-CH1H1/VL1-CL1λ(Fab)的同源性建模的骨架模板。
使用BioLuminate残基扫描工具评估了带电对或旋钮入孔突变的单个突变集对Fab稳定性和每个互补位各自亲和力的影响。使用PyMol分子图形系统通过结构引导设计鉴定二硫键重新定位的残基对，并通过同源性建模或Bioluminate Cys-Cys工程工具进行验证。表1-6显示了示例性的带电对和二硫键重新定位突变。抗体设计的示意图如图1A-D所示。抗体的这种结构设计提供了改进的特异性和完整的同源配对，这有利于功能性抗体的表达和纯化。
抗体表达与纯化
实验测试了所有单独优先突变组在瞬时Expi293细胞中的表达。在pDT5载体(ATUM,Newark CA)中合成对应于抗体重链和轻链的DNA序列。根据制造商的方案将质粒DNA(1μg/ml)转染到Expi293细胞(ThermoFisher)中。细胞在37℃、含8％ CO2的旋转(125rpm)烧瓶中生长。转染后五天，通过离心(3000xg)30分钟从细胞中收获条件培养基，并使用0.2μm过滤器过滤。然后使用AKTA Avant色谱系统(Cytiva)和使用HiTrap Protein A和HiLoadSuperdex 200柱(Cytiva)的串联纯化方法纯化抗体。将抗体在纯化后和分析前在4℃储存于pH 7.22的PBS中。
生物物理特征
使用配备有1260Infinity II Bioinert HPLC系统的AdvanceBio 1.9μm SEC柱(Agilent)进行分析尺寸排阻色谱法(aSEC)，以测定聚集体和其他较高和低分子量的质量物质。使用1xPBS(pH7.2)以0.3mL/min的流速对抗体样品进行10分钟的线性梯度电泳，在280nm处监测紫外(UV)吸光度。通过紫外吸光度和峰面积积分对洗脱的蛋白质进行定量。BEH SEC蛋白质标准混合物(Waters)用作标准物。使用AdvanceBio HIC(4.6x100 mm)进行疏水相互作用色谱(HIC)。将抗体样品与缓冲液A(0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中的1.8M硫酸铵)以1:1混合，并使用流动相A和B(0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2))以线性梯度运行20分钟，流速为0.4mL/min，在280nm处监测紫外吸光度。使用纳米DSC量热仪(TA Instrument)通过差示扫描量热法(DSC)测定抗体的热稳定性。
对于DSC，样品在1xPBS中以1mg/mL浓度制备，装入样品池并以1℃/min的增量从25℃扫描至95℃。使用NanoAnalyzer程序分析数据，从每次单独的扫描中减去PBS缓冲液背景。为了进行总蛋白质纯度分析，根据制造商的说明使用了NuPAGE预制凝胶系统(Invitrogen)。具体来说，使用4-12％ NuPAGE Novex Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和NuPAGE MES(还原凝胶，含NuPAGE抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。分别将一半样品与NuPAGE样品还原剂组合或保持未还原，然后在70℃下加热10分钟。随后，将5-20μL应用于4-12％ NuPAGE Bis-Tris NUPAGE(Invitrogen)(对于非还原NUPAGE使用MOPS缓冲液，且对于还原NUPAGE使用含有NuPAGE抗氧化剂运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液)，并用考马斯亮蓝染色。
从初步筛选中，选择一组具有良好生物物理特性的突变进行组合，并改造成重链和轻链序列，然后以双特异性人IgG1形式进行进一步测试。对包含至少一个二硫键重新定位突变对(在DAA Fab臂或CD3 Fab臂中)、VH1/VL1或VH2/VL2序列中的一组电荷配对突变以及CH1H1/CL1或CH2H1/CL2序列中的至少一组电荷配对突变的不同突变组的选定排列进行表达、纯化，并在完整的IgG1双特异性形式中进行实验测试和表征。图2A显示了使用AKTA系统通过串联蛋白A-尺寸排阻柱纯化获得的代表性双特异性变体(EIP0187、EIP0205、EIP0356和EIP0377)的制备尺寸排阻色谱图。使用差示扫描量热法(DSC)评估轻链配对突变的热稳定性。如图2B所示，与EIP0112(CrossMab)相比，没有观察到EIP0187、EIP0205、EIP0356和EIP0377的Fab区熔化(第二转变)显著差异，所述EIP0112(CrossMab)是使用基准轻链配对技术CrossMab的双特异性抗体，由Schaefer等人描述[PNAS2011,108(27)11187-11192]。大多数突变组合导致双特异性蛋白表达显著下降，因此不再考虑。通过aSEC和NuPAGE凝胶电泳(完整和还原)分析表达良好的双特异性蛋白的完整性和纯度(图3)。总之，这表明双特异性抗体具有高热稳定性、高蛋白质完整性以及轻链和重链成分高效准确的组装。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
在aSEC和NuPAGE凝胶电泳上不含任何不期望的质量(HMMS或LMMS)的双特异性变体被推进用于通过夹心ELISA进一步分析与其相应抗原的结合。将Maxisorp板(Nunc)在4℃下用碳酸氢盐缓冲液(pH 9.2)或PBS(pH 7.22)中的1μg/ml浓度的蛋白质包被16小时。所有后续步骤均在室温下进行。然后用封闭缓冲液(PBS，pH 7.2，1％BSA)封闭板1小时。然后使用PBS pH 7.2、0.1％ Tween洗涤板。将双特异性抗体以1比3的稀释度在封闭缓冲液中稀释，稀释度从100nM开始，并与封闭孔一起孵育1小时。然后洗涤平板，并以1∶500的稀释度与抗人HRP缀合物一起孵育。最后一次洗涤后，根据制造商(SeraCare)的说明添加发光底物。使用Ensight板读数器(Perkin Elmer)测量发光度。为了进行比较，使用经过治疗验证的双特异性平台测试了纯化的基准双特异性抗体。双特异性抗体具有功能性，能够同时接合疾病相关抗原(即ULBP2)和CD3抗原(图4A-4B)。
质谱法
所选择的具有所需生物物理特性的双特异性变体通过质谱法进一步表征，以确定完整抗体的质量以及重链和轻链的减少质量，并评估轻链与相应重链组装的特异性。
纯化的融合蛋白和抗体链的完整质量通过Xevo G2-XS QTof四极杆飞行时间质谱法与配备Protein BEH C4(1.7μm)色谱柱的Acquity UHPLC系统(Waters)联用进行确认。按照供应商的方案，首先使用快速PNGase F酶(New England Biolabs)在还原和非还原条件下对抗体样品去糖基化。将反应混合物在含有0.1％甲酸的50％乙腈中稀释至1:10，然后将其中的2μL注入LC-MS。蛋白质的总离子色谱图和m/z数据是用10至70mL HPLC级乙腈在12分钟内梯度洗脱获得的。使用Protein Metrics的BYOS软件从总离子色谱图中去卷积蛋白质样品的质量。
图5A显示了一个代表性双特异性变体EIP0205的去卷积完整质量。观察到相应重链质量(图5B)和轻链质量(图5C)的预期大小。没有观察到与轻链与非同源重链的错配相对应的种类或质量。两条重链和两条轻链的相对强度比为1:1表明双特异性抗体是完全完整的，具有接近100％的同源配对。某些未能实现完全同源配对的双特异性抗体，错误配对的LC和HC的完整质量可以很容易地从图5D所示的去卷积离子色谱图中观察到，作为“错误配对的质量种类”。还原的重链和轻链的去卷积质量如图5E-5F所示。
总之，生物物理和抗原结合结果表明，补偿电荷配对突变(在VH1和VL1界面和/或VH2和VL2界面、CH1H1和CL1界面和/或CH2H1和CL2界面内设计)和二硫键稳定突变(在CH1H1和CL1界面和/或CH2H1和CL2界面内设计)产生具有正确构象和高热稳定性的完整双特异性抗体。
实施例4：具有促进重链和轻链异二聚化的突变的ULBP2-CD3双特异性抗体的表征
利用上述方法，构建了具有十六个不同突变集(A-P)的ULBP2-CD3双特异性抗体(例如EIP0174、EIP0175、EIP0187、EIP0205、EIP0206、EIP0207、EIP0208、EIP0294、EIP0295、EIP0306、EIP0307、EIP0318、EIP0342、EIP0344、EIP0356、EIP0377、EIP0598)。每种双特异性抗体具有与ULBP2结合的相同CDR(源自“E12”抗体)和与CD3结合的相同CDR(源自“SP34”抗体)，但在以下方面有所不同：(i)旋钮入孔突变以促进有效的重链异二聚化和(ii)带电配对(VH1和VL1界面和/或VH2和VL2界面，以及CH1H1和CL1界面和/或CH2H1和CL2界面)和二硫键稳定突变(CH1H1和CL1界面和/或CH2H1和CL2界面之间)，它们共同促进重链和轻链的正确同源配对。
对带电突变集(A-P)的表达滴度、通过分析尺寸排阻色谱法测定的POI百分比、通过夹心ELISA测定的与ULBP2和CD3的结合、通过质谱法测定的功能性T细胞活性和同源轻链配对进行评估。
表32.ULBP2-CD3双特异性抗体的表征
*UMS—未知的质量物质
T细胞介导细胞毒性测定
使用StemCell T细胞分离试剂盒从健康人PBMC供体中分离T细胞，并重悬在补充有10％ FBS、1X青霉素/链霉素的RPMI中。为了活化T细胞，将用αCD3和αCD28抗体包被的Dynabeads以每百万细胞25μL珠子的比率添加到T细胞中，并在37℃、5％ CO2下孵育48小时。除去Dynabeads后，将T细胞与IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)在补充的培养基中另外孵育7天。每48小时用新鲜解冻的细胞因子(IL7和IL15)更换补充的培养基。将人肿瘤细胞以每孔10,000个细胞接种于96孔组织培养板(Perkin Elmer)中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。第二天，在存在或不存在抗体的情况下将初始或活化的人T细胞(50-100,000)或PBMC(250-300,000)添加到肿瘤细胞中，并孵育长达3-7天。使用荧光板读数器(Ensight，Perkin Elmer)可视化绿色荧光蛋白工程化的MDA-MB-231和HCT116(Genecopoeia)细胞的细胞溶解。使用LDH-Glo细胞毒性测定(Promega)测量CORL105和SiHa细胞的细胞溶解。
然后使用具有不同E:T比率的T细胞或PBMC和肿瘤细胞共培养细胞毒性测定测试具有完全同源配对的双特异性变体的功能性细胞溶解活性。所有测试的变体在具有不同程度(从低到高)靶密度的不同肿瘤细胞模型中显示剂量依赖性细胞溶解活性，图6。总体而言，生物物理和功能表征结果表明，双特异性变体EIP0187、EIP0205、EIP0356、EIP0377和EIP0598提供了具有高特异性和热稳定性的全功能生物活性双特异性抗体。
实施例5：具有促进重链和轻链异二聚化的突变的αULBP2-αBCMA和αULBP2-αEGFR双特异性抗体的表征
此外，来自EIP0187、EIP0205、EIP0356、EIP0377和EIP0598的突变集被用于使用其他经治疗验证的抗体来工程改造非对称双特异性抗体，所述抗体针对不同的疾病相关抗原靶标，诸如分别在PCT申请WO1996040210和美国申请US20140105915中描述的EGFR(西妥昔单抗)和BCMA(贝兰他单抗)，每个申请通过引用并入本文。对纯化的双特异性抗体进行了靶标结合测试，通过质谱法彻底表征了其特异性和正确的LC和HC配对，并在重新靶向的T细胞细胞毒性测定中进行功能评估。图7A-7E和表33中汇总的生物物理和功能表征数据表明，用不同的靶臂工程改造的双特异性变体实现了100％特异性和与完全功能不对称双特异性抗体的完全同源LC/HC配对。这表明这些新的突变集组合(补偿电荷配对和二硫键稳定突变)可普遍应用于工程改造不对称双特异性或多特异性抗体。
表33：利用轻链配对突变集D的双特异性抗体的特征。
实施例6：抗CD3抗体的亲和力调节
CD3亲和力变异抗体的动力学结合分析
使用表面等离子体共振(SPR)确定了含有CD3变体的ULBP2xCD3双特异性CD58融合物与人和食蟹猴CD3ε/δ异二聚体的结合动力学，其动力学常数汇总在表34中。
表34.与人和食蟹猴CD3ε/δ异二聚体结合的缔合、解离和平衡常数
描述了源自SP34克隆的杂交瘤抗体识别人和食蟹猴CD3ε(Yoshino,N.,Ami,Y.,Terao,K.,Tashiro,F.&Honda,M.Upgrading of flow cytometric analysis forabsolute counts,cytokines and other antigenic molecules of cynomolgus monkeys(Macaca fascicularis)by using anti-human cross-reactive antibodies.Exp Anim49,97-110(2000)；Conrad,M.L.,Davis,W.C.&Koop,B.F.TCR and CD3 antibody cross-reactivity in 44species.Cytometry A 71,925-933(2007))。人源化SP34抗体在专利WO2007042261A2(Micromet)中进行了描述，并使用分子建模软件(Schrodinger)创建了同源模型。为了了解CD3结合的结构要求，对人源化SP34抗体的所有六个CDR进行了丙氨酸扫描，以确定对人CD3ε结合很重要的位置。简而言之，将人源化SP34抗体的突变体(其中单个CDR位置被丙氨酸取代)在酵母表面上展示为scFv，并使用流式细胞术评估重组人CD3ε的结合。
使用了几种策略来鉴定对CD3ε具有一系列亲和力的SP34突变体。在一种策略中，从上面描述的丙氨酸扫描分析中选择出观察到CD3亲和力降低的丙氨酸突变体。在第二种策略中，使用分子建模对CD3亲和力降低的丙氨酸突变体进行研究，以便用可选氨基酸代替丙氨酸取代，从而更好地调节亲和力降低的程度。在第三种策略中，在选定的位置用天冬氨酸取代丙氨酸，因为已经描述了某些CDR位置上的带电荷的氨基酸可以降低抗体聚集的倾向(Dudgeon,K.等人，General strategy for the generation of human antibodyvariabledomains with increased aggregation resistance.Proc Natl Acad Sci U SA 109,10879-10884(2012))。CD3亲和力降低的SP34突变体的列表如表35所示。
表35.具有在可变重链和可变轻链结构域中具有CDR突变的SP34的双特异性抗体
*人和食蟹猴CD3结合以及SiHa和HCT116细胞系的NFAT活化的突变体以粗体表示。
使用轻链配对集D，用SP34亲和力突变体和ULBP2抗体E12产生双特异性抗体，并通过ELISA评估与人和食蟹猴CD3ε的单价结合(图8A-8B)。三种双特异性SP34突变体EIP0527、EIP0540和EIP542保留了与具有无突变的SP34臂的双特异性(EIP0205)相似的强亲和力。所测试的双特异性SP34突变体EIP0477、EIP0483、EIP0486、EIP0491、EIP0513、EIP0515和EIP0541中的大多数具有中等亲和力(EC50＝10-50nM)，并且观察到一个突变体EIP0525具有弱亲和力(EC50>100nM)。此外，当针对食蟹猴CD3ε进行评估时，双特异性SP34突变体的总体结合和亲和力等级没有变化，表明突变没有改变人与食蟹猴蛋白之间的交叉反应性和/或结合。
活化T细胞核因子(NFAT)荧光素酶报告基因测定
在表达高水平(SiHa)和低水平(HCT116)ULBP2的两种癌细胞系的存在下，使用NFAT荧光素酶报告Jurkat细胞系评估双特异性SP34亲和力突变体的NFAT活化。T细胞抗原受体(TCR)/CD3复合物在T细胞中的接合导致细胞内信号传导事件和活化T细胞核因子(NFAT)通路的转录活化。将人肿瘤细胞以每孔40,000个细胞接种于96孔组织培养板(Perkin Elmer)中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。随后，在存在或不存在双特异性抗体的情况下，将100,000个NFAT荧光素酶报告Jurkat细胞(Signosis)添加到肿瘤细胞中，并在37℃下孵育5小时。在添加Bio-Glo试剂(Promega)后，使用发光板读数器(Ensight,PerkinElmer)测量发光。
通过荧光素酶测量的NFAT活化程度(图9A-9B)揭示了双特异性SP34突变体中比CD3ε结合ELISA所显示的更宽的活性范围。尽管通过ELISA观察到EIP0477和EIP0541具有中等亲和力(分别为14.93和36.34nM EC50)，但NFAT荧光素酶报告基因测定显示，这两个突变体在高ULBP2细胞系SiHa中的NFAT反应显著降低(图9A)，而在低ULBP2细胞系HCT116中几乎没有活性至没有活性(图9B)。相比之下，其他SP34突变体EIP0483、EIP0486、EIP0515和EIP0542显示出预期的中等NFAT反应，但突变体之间的差异范围比ELISA观察到的更广。
使用NFAT Jurkat报告基因和SiHa细胞系观察到CD3变体之间的最大值范围(表35)。因此，该测定用于将CD3变体分类为以下CD3活性类别：最强，EC50<50pM；强，EC50＝50-150pM；中等，EC50＝150-300pM；弱，EC50＝301-1000pM；非常弱，EC50>1000pM。
评估了双特异性SP34亲和力突变体在活化T细胞存在下诱导具有不同ULBP2表达水平的癌细胞系(SiHa>MDA-MB-231>HCT116)细胞溶解的能力。与NFAT荧光素酶报告基因测定一致，在三种细胞系中观察到双特异性SP34突变体的细胞溶解活性大范围降低(图10A-10C)。突变体中细胞溶解活性的等级顺序与之前观察到的NFAT活化的顺序一致。对于每个单独的双特异性抗体，细胞溶解活性也与肿瘤细胞上的ULBP2水平直接相关。例如，在3种细胞系中EIP0483的EC50为：SiHa，1.11nM；MDA-MB-23，2.93nM；和HCT116，71.21nM。
T细胞分泌细胞因子
还测量了SiHa细胞毒性测定中T细胞分泌的细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)。将人肿瘤细胞以每孔10,000个细胞接种于96孔组织培养板(Perkin Elmer)中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。在存在或不存在抗体的情况下，将初始或活化的人T细胞(50-100,000个)或PBMC(250-300,000个)添加到肿瘤细胞中，并再孵育24-48小时。然后将条件培养基转移到单独的96孔板中，并离心(1000x g)5分钟以沉淀细胞。取出条件培养基的等分试样，使用干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒(Biolegend)进行细胞因子测量。
三种SP34亲和力突变体(EIP0486、EIP0540和EIP0542)诱导的IFNγ释放水平与双特异性SP34野生型(EIP0205)相似，而其余突变体产生的细胞因子非常少(图11A-11C)。相同的三种SP34亲和力突变体也诱导IL-2，尽管水平与双特异性SP34野生型不同。总体而言，尽管EIP0542在所有测试的双特异性抗体中产生了最高水平，但TNFα水平仍然非常低。
实施例7-具有融合肽的αULBP2-CD3双特异性抗体的产生及生物物理表征
人CD58与人CD2(PDB 1QA9)复合的晶体结构证实了界面通过CD58的氨基末端或IgV样结构域(CD58v)发生，其是细胞外区域的两个结构域之一(另一个CD58结构域是IgC2样结构域；https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01204)和CD2的氨基末端结构域(SungH,Ferlay J,Siegel RL,Laversanne M,Soerjomataram I,Jemal A,Bray F.GlobalCancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and MortalityWorldwide for 36Cancers in 185Countries.CA Cancer J Clin.2021年5月；71(3):209-249.doi:10.3322/caac.21660.Epub2021年2月4日.PMID:33538338；Wang,J.等人Structure of aHeterophilic Adhesion Complex between the Human CD2 and CD58(LFA-3)Counterreceptors.Cell 97,791-803(1999))。鉴于CD58的氨基末端位于CD2结合界面的远端，CD58或CD58v可以作为双特异性抗体的所有四条抗体链的氨基和羧基端融合物发挥作用，从而允许多种可能的形式(图12A-12K)。氨基和羧基端IL-7融合物(WO2020236655A1和WO2005063820A2)也可以遵循与CD58类似的形式。
通过使用甘氨酸丝氨酸接头将CD58(UNIPROTKB：P19256，氨基酸：29-216)、CD58v(氨基酸：29-122)、IL7(UNIPROTKB：P13232，氨基酸：26-177)的全长胞外结构域与由ULBP2抗体E12和CD3抗体SP34(EIP0205)组成的双特异性抗体的孔重链的羧基端融合，产生双特异性融合物。由ULBP2抗体E12和SP34亲和力突变体组成的双特异性抗体与CD58在孔重链的羧基端融合，形成一系列双特异性CD58融合物。表17列出了双特异性CD58融合物及其同源双特异性抗体。
图13显示了双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)和双特异性融合物：αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)、αULBP2-αCD3-CD58v(EIP0360)和αULBP2-αCD3-IL7(EIP0363)从蛋白质A洗脱后的尺寸排阻色谱图。
鉴于所有四种抗体的表达培养体积相等，计算出的曲线下面积(AUC)代表抗体产量，因此与双特异性αULBP2-αCD3相比，与CD58和CD58v和IL-7的融合对表达无损害。尽管所有三种双特异性融合的目标峰(POI)右侧的肩部证明了出现了较低分子量的物质，但POI的整体形状与单克隆抗体一致，并且适合药物开发。
采用差示扫描量热法(DSC)确定添加CD58和IL-7是否会改变双特异性抗体的转变温度。如图14所示，使用旋钮入孔(KIH)技术生产的抗体有两个主要转变。CH1H3或CH2H3中的工程KIH突变导致熔化温度降低，其现在与CH2结构域重叠(70℃)，而第二个转变代表Fab区域的熔化(75℃)。在双特异性抗体的C端添加CD58或IL-7对降低CH1H2或CH2H2或CH1H3或CH2H3的转变温度仅有1℃的很小影响，而Fab没有改变。最后，如通过夹心ELISA所评估，CD58、CD58v和IL-7与双特异性抗体孔重链羧基端的融合不改变αULBP2-αCD3双特异性抗体与ULBP2或CD3的结合(图15A-15B)。
实施例8-具有融合肽的双特异性抗体的体外功能表征
在与MDA-MB-231GFP/荧光素酶细胞共培养的初始T细胞的细胞毒性测定中，将双特异性融合αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)的活性与双特异性αULBP2-αCD3双特异性(EIP0205)的活性进行了比较。孵育7天后，使用荧光成像确定活的GFP标记肿瘤细胞的百分比。如图16A所示，αULBP2-αCD3-CD58表现出比αULBP2-αCD3高的细胞溶解活性，如EC50(低3倍浓度)和最大细胞死亡率(增加9％)所示。在625pM的浓度下MDA-MB-231GFP细胞中αULBP2-αCD3和αULBP2-αCD3-CD58之间的荧光信号差异，如荧光细胞图像所示(图16B)。αULBP2-αCD3和αULBP2-αCD3-CD58的活性均依赖于靶标表达，因为ULBP2缺陷型MDA-MB-231细胞(通过CRISPR-Cas9靶向失活ULBP2基因产生)对细胞溶解具有很大的抗性(图16C)。此外，使用对照-αCD3双特异性(EIP0546)对亲本和ULBP2缺陷型MDA-MB-231细胞均未观察到细胞毒性。
24小时后，在双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)和双特异性融合物αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)的存在下，还测量了与MDA-MB-231GFP/荧光素酶细胞共培养的初始T细胞培养基中T细胞细胞因子IFNγ、IL-2和TNFα的释放。与αULBP2-αCD3双特异性抗体相比，观察到αULBP2-αCD3-CD58的IFNγ水平增加了79％(图17A)，观察到IL-2增加了104％(图18A)，并且观察到TNF增加了89％(图19A)，如在整个剂量范围内通过曲线下面积(AUC)测量的。与缺乏细胞毒性一致，MDA-MB-231细胞上缺乏ULBP2导致所有三种细胞因子的水平均不可测量(图17B、18B和19B)。对照-αCD3双特异性(EIP0546)未从亲本和ULBP2缺陷型MDA-MB-231细胞中诱导细胞因子。
使用与SiHa细胞和活化T细胞的共培养测定来评估双特异性SP34亲和力突变体及其同源CD58融合物的细胞毒性(图20和21)和细胞因子释放(图22-27)。当CD58与具有较低CD3亲和力的双特异性抗体融合时，通过测量EC50和最大细胞死亡观察到细胞毒性的显著改善。一般来说，与双特异性抗体相比，双特异性CD58融合物的细胞溶解活性的提高与双特异性抗体的CD3亲和力呈负相关。例如，最低CD3亲和力双特异性抗体EIP0477仅在最高抗体浓度下诱导最少的细胞死亡，其中EC50未确定(图20和21)，而等效双特异性CD58融合物(EIP0560)诱导98％的细胞死亡，其中EC50为0.15nM。相反，对于高CD3亲和力双特异性EIP0486，CD58的融合物(EIP0562)适度提高了细胞毒性，使EC50浓度降低了3倍(图20)。对于双特异性CD58融合物及其同源双特异性抗体，在IFNg释放(图22和23)、IL2(图24和25)和TNFα(图26和27)方面也观察到了类似的趋势。再次，与双特异性抗体相比，双特异性CD58融合获得的细胞因子释放与双特异性的CD3亲和力呈负相关。通过产生一系列具有不同CD3亲和力的双特异性CD58融合物，可以调节治疗窗，如通过细胞毒性和细胞因子释放的平衡所定义的，以适应在分布和绝对受体数量上具有不同表达模式的多种肿瘤抗原。
与双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)相比，与CD58v的双特异性融合αULBP2-αCD3-CD58v(EIP0360)显示出与αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)类似的细胞溶解活性改善，如使用人PBMC对MDA-MB-231GFP细胞进行细胞溶解所确定的(图28)。
双特异性融合物ULBP2-CD3-CD58(EIP0141)的增强活性取决于CD58与双特异性ULBP2-CD3双特异性之间的物理连接。如图29A和B所示，结合等摩尔量的CD58-Fc蛋白和双特异性αULBP-αCD3(EIP0121)没有产生与整合的双特异性融合(EIP0141)等量的细胞溶解或IFNγ释放。
为了进一步了解CD58共刺激的影响，在使用不同耗竭状态的CD8T细胞的细胞毒性测定中评估了双特异性融合物αULBP2-αCD3-CD58(EIP0141)和双特异性αULBP2-αCD3(EIP0112)。为了实现这一点，首先对初始的CD8 T细胞进行增加轮次的刺激，每轮刺激由与抗CD3和抗CD28抗体偶联的Dynabeads的2天孵育组成。如活肿瘤细胞的荧光成像所示，αULBP2-αCD3-CD58即使在第五轮T细胞耗竭的情况下也能够诱导肿瘤细胞的细胞溶解，而ULBP2-CD3的活性在第3轮早期T细胞耗竭的情况下达到峰值(图30)。对照-αCD3双特异性(EIP0209)不诱导初始T细胞或耗竭T细胞的细胞溶解。
接下来，评估了在双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)和双特异性融合物αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)的存在下，人PBMC与MDA-MB-231细胞共培养的CD8 T细胞中T细胞活化和耗竭的细胞内和细胞表面标志物。在孵育72小时后，使用流式细胞术测量以下T细胞标志物：细胞内IL2、细胞内IFNγ、CD25、CD69、颗粒酶B(GRZMB)、CD2、PD-1、CD38和TIM3。针对ULBP2-CD3双特异性对每个标志物的MFI进行标准化，并以雷达图表示(图31)。与αULBP2-αCD3相比，αULBP2-αCD3-CD8产生了独特的表型，这与通过IFNγ、CD25和GZMB水平的升高观察到更高的T细胞活化一致。此外，当用αULBP2-αCD3-CD58双特异性融合物处理时，T细胞似乎耗竭较少，这由CD38减少而与ULBP2-αCD3相比TIM3没有增加所证明。作为阴性对照，对照-CD3(EIP0209)不与MDA-MB-231细胞上的任何已知靶蛋白结合，不诱导任何标志物的表达。这与CD3双特异性抗体的机制一致，该机制需要靶标的存在来活化T细胞。
CD3亲和力变异抗体诱导的T细胞增殖
使用T细胞刺激测定观察了双特异性抗体与双特异性CD58融合物在不同CD3亲和力下诱导的CD8+T细胞增殖的差异。将新鲜分离的初始T细胞反复暴露于Dynabeads偶联的双特异性抗体和双特异性CD58融合物中，进行连续48-72小时的刺激。表36显示了每轮刺激后的CD8 T细胞计数。如表36所示，没有一种双特异性抗体诱导显著的T细胞增殖超过第2轮，而所有双特异性CD58融合物持续刺激增殖直到第7轮。
表36.T细胞刺激测定中的CD8+T细胞计数
用共移植的人T细胞进行肿瘤研究
在小鼠异种移植研究中评估了具有不同CD3亲和力的双特异性CD58融合物的活性，其中将人T细胞和CORL-105肿瘤细胞同时共移植到NSG小鼠侧腹中。然后以4mg/kg每两周一次给小鼠静脉内给药双特异性CD58融合物(EIP0359、EIP0562、EIP0568、EIP0561和EIP0564)、双特异性(EIP0205)和非靶向对照(EIP0607)，持续3周(图35A)。三种双特异性CD58融合物EIP0568、EIP0561和EIP0564的施用阻止了肿瘤的生长。两种双特异性CD58融合物EIP0359和EIP0562在控制肿瘤生长方面的能力中等，而非靶向对照在所有双特异性CD58融合物中抑制肿瘤生长的效果最差。然而，缺乏CD58融合物的双特异性抗体似乎对所有测试分子的肿瘤生长几乎没有影响。
CD58的融合物利用多种肿瘤靶向抗体改善T细胞的定向杀伤
如图36A-36C所示，使用经治疗验证的抗体西妥昔单抗(EGFR)、贝兰他单抗(BCMA)、地宁单抗(CD19)和奥贝利单抗(CD19)将CD58融合至不对称CD3双特异性抗体被证明导致肿瘤细胞细胞毒性的改善。在图36A中，在EIP0373(西妥昔单抗xCD3-01)、EIP0535(西妥昔单抗xCD3-01xCD58)、EIP0546(对照xCD3-01)和EIP0607(对照xCD3-A5xCD58)的存在下，将HCT116结肠癌细胞与活化的T细胞共培养。在图36B中，在EIP0506(贝兰他单抗xCD3-01)、EIP0524(贝兰他单抗xCD3-01xCD58)和EIP0546(对照xCD3-01)的存在下，将U266B1多发性骨髓瘤细胞与活化的T细胞共培养。在图36C中，在EIP0870(地宁单抗xCD3-A6xCD58)、EIP0872(奥贝利单抗xCD3-A5xCD58)和EIP0607(对照xCD3-A5xCD58)的存在下，将JeKo-1套淋巴瘤细胞与活化的T细胞共培养。
在所有3种细胞系中，与缺乏CD58融合物的双特异性抗体相比，双特异性CD58融合物表现出更好的肿瘤细胞细胞毒性。正如预期的那样，非靶向对照双特异性和双特异性CD58融合物未显示任何活性。
如图36D-36F所示，当CD58添加到预先存在的CD3双特异性抗体中时，其模块化还可以导致肿瘤细胞毒性的改善。TNB-383B(BCMA)、TNB-486(CD19)和TNB-585是处于不同临床开发阶段的CD3双特异性抗体。在图36D中，使用PSMA编码慢病毒转导PSMA阴性LNCAP前列腺癌细胞(通过CRISPR-Cas9失活PSMA基因产生)以产生PSMA低LNCAP细胞系。此细胞系在EIP0993(TNB-585xCD8)、EIP0992(TNB-585)和EIP0607(对照xCD3-A5xCD58)的存在下与活化的T细胞共培养。在图36E中，在EIP0765(TNB-383B)、EIP0766(TNB-383BxCD58)、EIP0546(对照xCD3-01)和EIP0607(对照xCD3-A5xCD58)的存在下，将MM1S多发性骨髓瘤细胞与活化的T细胞共培养。在图36F中，在EIP0990(TNB-486)、EIP0991(TNB-486xCD58)和EIP0607(对照xCD3-A5xCD58)的存在下，将Raji淋巴瘤细胞与活化的T细胞共培养。
在所有三个模型中，与双特异性抗体本身相比，CD58与临床CD3双特异性的融合物导致细胞毒性的显著改善。双特异性CD58融合的优越性在靶抗原水平较低的细胞模型中最为显著。正如预期的，非靶向双特异性和非靶向双特异性CD58融合物没有显示任何活性。
工程改造的二硫键改善表达并增加抗体的均质性
如图37所示，通过在TNB-383B序列(公开号US20210403587A1)的CH2区中的Y370和S375(Kabat编号)进行半胱氨酸取代而工程改造的二硫键可以提高表达滴度并且增强蛋白A纯化后抗体的均质性，如通过尺寸排阻色谱所观察到的。
表37.本公开的另外的抗体
实施例9：具有融合肽的双特异性抗体的体内表征
扩增T细胞用于体内研究
使用StemCell T细胞分离试剂盒从健康PBMC供体中分离T细胞。OpTmizer培养基中补充有2％人AB血清、1X青霉素/链霉素、4mM GlutaMAX、2mM谷氨酰胺。将细胞在37℃和5％ CO2下以5×105个细胞/mL的浓度在补充了OpTmizer培养基中孵育，然后将T细胞用αCD3和αCD28抗体包被的Dynabeads以每百万个细胞25μL Dynabeads的比率处理48小时。除去Dynabeads后，将T细胞与IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)在补充OpTmizer培养基中另外孵育6天。每48小时用新鲜解冻的细胞因子(IL7和IL15)更换补充的培养基。在过继转移或共移植的当天，收获T细胞并使用血细胞计数器来确定细胞数量和活力。将T细胞悬浮在冷PBS中并在冰上保存不超过30分钟直至注射。
利用过继性人T细胞转移的肿瘤研究
SiHa肿瘤细胞最初在含有10％胎牛血清(FBS)培养基的DMEM中从冷冻原液中培养，并在经处理的细胞培养瓶中在37℃和5％CO2下孵育。然后，根据培养瓶中的细胞密度，每2-3天分裂一次细胞。在植入当天，使用TrypLE Select从烧瓶中分离细胞，并用PBS洗涤两次。将以1:1的比率重悬在PBS和Matrigel中的500万个SiHa细胞皮下植入NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ,Jackson Laboratory)的侧腹，每个治疗组群包含8-10只小鼠。使用电子卡尺监测肿瘤生长，并根据公式计算肿瘤体积：0.52×(长度×宽度2)。当肿瘤达到100mm3的平均大小时，将小鼠随机分为以下治疗组，其中每组具有相似的平均肿瘤体积，每组在初次植入后第21天通过尾静脉输注接受对照-αCD3(EIP0546)、αULBP2-αCD3(EIP0205)和αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)(剂量水平为4mg/kg)。第二天(第22天)，所有小鼠都输注了500万个活化的人T细胞。然后每周两次对小鼠给药双特异性抗体和对照，持续3周。第44天进行了第二次500万个人T细胞输注，第二天(第45天)，小鼠接受了最后一剂抗体。
在植入宫颈癌细胞系SiHa并随后过继转移活化的人T细胞的NSG小鼠中评估了双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)和双特异性融合αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)(图32A-32C)。与对照抗体对照-αCD3(EIP0546)相比，αULBP2-αCD3(EIP0205)和αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)均从治疗开始(第21天)到第45天抑制了肿瘤生长。随后，αULBP2-αCD3治疗组的肿瘤迅速扩大，达到与对照组相似的大小(900mm3)，而在αULBP2-αCD3-CD58治疗组中，肿瘤仍然很小，在研究结束时仅达到350mm3。
肿瘤与人T细胞共移植的药效动力学研究
进行了药效动力学学研究，其中将SiHa细胞与活化的人T细胞共移植到NSG小鼠中，并在同一天用双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)或双特异性融合αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)进行治疗。将800万个SiHa细胞和160万个活化的人T细胞皮下植入9只NSG小鼠的侧腹。然后将小鼠分成3组，并在共移植后立即通过尾静脉输注以4mg/kg的剂量用以下剂治疗：对照-αCD3(EIP0546)、αULBP2-αCD3(EIP0205)和αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)。三天后，在肿瘤解离前，收获来自相同治疗组的所有肿瘤并汇集。然后使用人CD45珠(Miltenyi)对单细胞悬浮液进行磁性富集，然后使用一组荧光标记的抗体进行流式细胞术分析，这些抗体结合与活化、效应活性和耗竭的T细胞表型变化相关的标志物。
如图33A-33C所示，与双特异性αULBP2-αCD3(EIP0205)相比，双特异性融合αULBP2-αCD3-CD58(EIP0359)诱导了更高水平的颗粒酶B(图33A)和CD25(图33B)，同时维持CD8 T细胞中的基线CD38(图33C)水平。对于这3种标志物，aULBP2-αCD3和αULBP2-αCD3-CD58之间观察到的差异与之前在体外观察到的差异相似(图31)。
EIP0561在食蟹猴中的药代动力学
给九只食蟹猴静脉内输注三个剂量水平(0.25、1.0和4.0mg/kg)的EIP0561，每个剂量三只动物。在0.03 0.5、2、8、24、48、72和168小时采集血液样品，并使用夹心ELISA测定血浆中的EIP0561浓度(表37)。还测定了毒代动力学参数并列于表38中。
表37.通过夹心ELISA测定每只动物随时间变化的EIP0561浓度。
表38.毒代动力学参数。下面列出了每个参数的缩写和说明。
AUCLST(ug/L*h)，从给药时间到最后一次观察时间的曲线下面积；C0(ug/L)，第一个时间点的浓度；CMAX(ug/L)，最大浓度出现在TMAX时；CLST(ug/L)，最后一个时间点的浓度；LAMZHLD(天)，终末半衰期(天)；CLO(L/h)，基于CLST的全身清除率；VSSO(L)，基于CLST的估计的稳态分布体积；VZO(L)，基于CLST的与终末期相关的分布体积。
其他实施方案
虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改均在以下权利要求的范围内。

Claims (81)

1.一种抗体，其包含以下结构：
a.第一重链多肽(H1)，其包含可变区(VH1)和恒定区(CH1)，所述恒定区(CH1)具有恒定区1结构域(CH1H1)、铰链区(H1H)、恒定区2结构域(CH1H2)和恒定区3结构域(CH1H3)；以及第一轻链多肽(L1)，其包含可变区(VL1)和恒定区(CL1)，
b.第二重链多肽(H2)，其包含可变区(VH2)和恒定区(CH2)，所述恒定区(CH2)具有恒定区1结构域(CH2H1)、铰链区(H2H)、恒定区2结构域(CH2H2)和恒定区3结构域(CH2H3)；以及第二轻链多肽(L2)，其包含可变区(VL2)和恒定区(CL2)，
其中
i.VH1和VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且VL1和VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸与VH1和VH2的第39位的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者VH1和VH2的第100位(Kabat编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且VL1和VL2的第44位(Kabat编号)的氨基酸与VH1和VH2的第100位(Kabat编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；
ii.CH1H1和CH1H2的第147位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1或CL2的第131、179或180位(EU编号)的氨基酸之一与CH1H1和CH1H2的第147位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；
iii.CH1H1和CH1H2的第185位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1和CL2的第137位(EU编号)的氨基酸与CH1H1和CH1H2的第185位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；或者CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1和CL2的第137或138位(EU编号)的氨基酸之一与CH1H1和CH1H2的第187位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基；并且
iv.CH1H1和CH1H2的第145位(EU编号)的氨基酸是带电荷的或极性的氨基酸残基，并且CL1或CL2的第131位(EU编号)的氨基酸与CH1H1和CH1H2的第145位(EU编号)的氨基酸相比是带相反电荷的或极性的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的抗体，其中带电荷的氨基酸残基是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述天然存在的带电荷的氨基酸残基是精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
4.如权利要求1所述的抗体，其中第39、100、147、185、187或145位的H1氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带负电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带正电荷。
5.如权利要求1所述的抗体，其中第39、100、147、185、187和145位的H1氨基酸带负电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L1氨基酸带正电荷；并且第39、100、147、185、187或145位的H2氨基酸带正电荷，而第38、44、131、179、180、137或138位的L2氨基酸带负电荷。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中L1和L2是λ或κ轻链。
7.如权利要求6所述的抗体，其中L1是λ轻链，且L2是κ轻链；或L1是κ轻链，且L2是λ轻链。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有IgG1、IgG2或IgG4同种型。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
10.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
11.如权利要求10所述的抗体，其中所述双特异性抗体包含
i)与细胞表面抗原结合的第一抗原结合结构域，其中所述细胞表面抗原在T细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞或树突细胞接合体上表达；以及
ii)与疾病相关抗原(DAA)结合的第二抗原结合结构域。
12.如权利要求11所述的抗体，其中所述细胞表面抗原在T细胞上表达。
13.如权利要求12所述的抗体，其中在T细胞上表达的所述细胞表面抗原是CD3。
14.如权利要求11所述的抗体，其中所述DAA是UL16结合蛋白2(ULBP2)或由基因RAET1G(UL16结合蛋白5；ULBP5)编码或由基因RAET1L(UL16结合蛋白6；ULBP6)编码。
15.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中多肽与H1和/或H2的N端或C端融合。
16.如权利要求15所述的抗体，其中所述多肽是CD58、IL-17或其片段。
17.如权利要求15所述的抗体，其中所述多肽通过接头肽融合。
18.如权利要求17所述的抗体，其中所述接头肽的长度为至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸残基。
19.如权利要求17所述的抗体，其中所述接头肽包含SEQ ID NO:52-54的氨基酸序列。
20.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中：
i)所述VH1和/或VH2的第87位(Kabat编号)的氨基酸为G；并且
ii)所述VL1和/或VL2的第45位(Kabat编号)的氨基酸为W。
21.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中：
i)所述CH1H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH2H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；
ii)所述CH2H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH1H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；
iii)所述CH1H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH2H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)；或
iv)所述CH2H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH1H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
22.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其还包含所述CH1H3和/或所述CH2H3的第446位(EU编号)和/或第447位(EU编号)的氨基酸；任选地其中第446位(EU编号)的氨基酸为G；并且任选地其中第447位(EU编号)的氨基酸为K。
23.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中：
i)所述H1H和/或所述H2H在第234和235位(EU编号)具有A；
i)所述H1H和/或所述H2H在第234、235和237位(EU编号)具有A；或
iii)所述H1H和/或所述H2H在第234和235位具有A，且在第329位(EU编号)具有G。
24.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中
i)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有A；
ii)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有G；或
iii)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有S。
25.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述CH1H3和/或所述CH2H3在第331位(EU编号)具有S。
26.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中
i)所述CH1H2和/或所述CH2H2在第370位(Kabat编号)具有C；并且
i)所述CH1H2和/或所述CH2H2在第375位(Kabat编号)具有C。
27.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；
iii.所述CH1H1的第128位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL1的第118位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
28.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第134位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第116位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
29.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
30.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；
iii.所述CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；
iv.所述H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
31.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；
iii.所述CH1H1的第173位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL1的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H1H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL1的第214位(EU编号)的氨基酸为S；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R。
32.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第131位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
33.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
34.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E，所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iii.所述CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
35.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
36.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iii.所述CL1的第179位(EU编号)的氨基酸为E；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
37.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
38.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
39.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
40.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
41.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；并且
ii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
42.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iv.所述CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL1的第180位(EU编号)的氨基酸为E；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述VH2的第170位(EU编号)的氨基酸为C且所述VL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
43.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为D；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第137位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为R；
iv.所述CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
v.H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
44.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iii.所述CH1H1的第145位(EU编号)的氨基酸为S；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第170位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
45.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH2H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第180位(EU编号)的氨基酸为R；
iii.所述CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
46.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为E；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为K且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为D；并且
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为E且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第136位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第114位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
47.如权利要求1所述的抗体，其中
a)所述H1和所述L1包括以下：
i.所述VH1的第39位(Kabat编号)的氨基酸为K且所述VL1的第38位(Kabat编号)的氨基酸为D；
ii.所述CH1H1的第147位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL1的第131位(EU编号)的氨基酸为K；并且
iii.所述CH1H1的第185位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL1的第137位(EU编号)的氨基酸为K；并且
b)所述H2和所述L2包括以下：
i.所述VH2的第39位(Kabat编号)的氨基酸为D且所述VL2的第38位(Kabat编号)的氨基酸为K；
ii.所述CH2H1的第187位(EU编号)的氨基酸为D且所述CL2的第138位(EU编号)的氨基酸为K；
iii.所述CH2H1的第171位(EU编号)的氨基酸为C且所述CL2的第162位(EU编号)的氨基酸为C；并且
iv.所述H2H中的第220位(EU编号)的氨基酸为S且所述CL2的第214位(EU编号)的氨基酸为S。
48.如权利要求27-47中任一项所述的抗体，其中：
i)所述VH1和/或VH2的第87位(Kabat编号)的氨基酸为G；并且
ii)所述VL1和/或VL2的第45位(Kabat编号)的氨基酸为W。
49.如权利要求27-48中任一项所述的抗体，其中：
i)所述CH1H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH2H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；
ii)所述CH2H3在第349位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH1H3在第354位具有C且在第366位具有W(EU编号)；
iii)所述CH1H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH2H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)；或
iv)所述CH2H3在第354位具有C、在第366位具有S、在第368位具有A且在第407位具有V(EU编号)；并且所述CH1H3在第349位具有C且在第366位具有W(EU编号)。
50.如权利要求27-49中任一项所述的抗体，其还包含所述CH1H3和/或所述CH2H3的第446位(EU编号)和/或第447位(EU编号)的氨基酸；任选地其中第446位(EU编号)的氨基酸为G；并且任选地其中第447位(EU编号)的氨基酸为K。
51.如权利要求27-50中任一项所述的抗体，其中：
i)所述H1H和/或所述H2H在第234和235位(EU编号)具有A；
i)所述H1H和/或所述H2H在第234、235和237位(EU编号)具有A；或
iii)所述H1H和/或所述H2H在第234和235位具有A，且在第329位(EU编号)具有G。
52.如权利要求27-51中任一项所述的抗体，其中：
i)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有A；
ii)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有G；或
iii)所述CH1H3和/或所述CH2H3在第297位(EU编号)具有S。
53.如权利要求27-52中任一项所述的抗体，其中所述CH1H3和/或所述CH2H3在第331位(EU编号)具有S。
54.如权利要求27-51中任一项所述的抗体，其中：
i)所述CH1H2和/或所述CH2H2在第370位(Kabat编号)具有C；并且
ii)所述CH1H2和/或所述CH2H2在第375位(Kabat编号)具有C。
55.如权利要求27-54中任一项所述的抗体，其中：
a)所述VH1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且
b)所述VL1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
56.如权利要求1-55中任一项所述的抗体，其中：
a)所述VH1包含EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNX1YAMX2WVRX3APGK GLEWVAX4IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNL KTEDTAVYYCVRHGX5FGNX6X7YVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQID NO:440)的氨基酸序列，
其中SEQ ID NO:440的X1为D或T，
其中SEQ ID NO:440的X2为D或N，
其中SEQ ID NO:440的X3为D或K，
其中SEQ ID NO:440的X4为K或R，
其中SEQ ID NO:440的X5为D或T，
其中SEQ ID NO:440的X6为D或N，并且
其中SEQ ID NO:440的X7为D或S；并且
b)所述VL1包含ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQX1KPGQAP RGLIGX2TNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAL WX3SX4LWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:441)的氨基酸序列，
其中SEQ ID NO:441的X1为E或D，
其中SEQ ID NO:441的X2为D或G，
其中SEQ ID NO:441的X3为D或Y，并且
其中SEQ ID NO:441的X4为D、N或Q。
57.如权利要求1-56中任一项所述的抗体，其中：
a)所述VH2包括：
包含SEQ ID NO:428的氨基酸序列的互补决定区1(VH2CDR1)；
包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的互补决定区2(VH2CDR2)；以及
包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的互补决定区3(VH2CDR3)；以及
b)所述VL2包括：
包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的互补决定区1(VL2CDR1)；
包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的互补决定区2(VL2CDR2)；以及
包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的互补决定区3(VL2CDR3)。
58.如权利要求1-56中任一项所述的抗体，其中：
a)所述VH2包括：
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的互补决定区1(VH2CDR1)；
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的互补决定区2(VH2CDR2)；以及
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的互补决定区3(VH2CDR3)；以及
b)所述VL2包括：
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的互补决定区1(VL2CDR1)；
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的互补决定区2(VL2CDR2)；以及
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的互补决定区3(VL2CDR3)。
59.如权利要求16-58中任一项所述的抗体，其中所述CD58包含SEQ ID NO:49-50的氨基酸序列。
60.如权利要求16-58中任一项所述的抗体，其中所述IL-7包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
61.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-58中任一项所述的抗体的核酸序列。
62.一种载体，其包含权利要求61所述的多核苷酸。
63.一种药物组合物，其包含权利要求1-60中任一项所述的抗体、权利要求61所述的多核苷酸或权利要求62所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
64.如权利要求63所述的药物组合物，其中所述药物组合物被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。
65.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求63所述的药物组合物。
66.一种治疗有需要的受试者的T细胞重新靶向的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求63所述的药物组合物。
67.一种治疗有需要的受试者的T细胞活化的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求63所述的药物组合物。
68.如权利要求66-67中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是ULBP2阳性癌症。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤、转移性癌症、多重耐药性癌症、进行性肿瘤或复发性癌症。
71.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
72.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌或食道癌。
73.如权利要求65-72中任一项所述的方法，其还包括施用治疗有效量的配体或细胞因子。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述配体是CD48、CD58、CD86、TNFSF9、OX40L、4-1BBL、GITL、CD70、CD80、MR1、TNFSF4、ICOSL、ICOSLG、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1G(ULBP5)和RAET1L(ULBP6)或细胞因子IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18或IL-21，或与这些配体和细胞因子的受体结合的激动性抗体。
75.如权利要求65-74中任一项所述的方法，其中所述方法还防止T细胞耗竭。
76.一种扩增T细胞群的方法，其包括将T细胞群与权利要求63所述的药物组合物接触。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述T细胞群的接触发生在体外、体内、离体或它们的组合中。
78.如权利要求76-77中任一项所述的方法，其中在相同条件下，所述多个T细胞的扩增是不含所述药物组合物的多个T细胞的扩增的约2至约50倍。
79.一种扩增T细胞群的方法，其包括将所述T细胞群与权利要求15-26中任一项所述的抗体接触。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述T细胞群的接触发生在体外、体内、离体或它们的组合中。
81.如权利要求79-80中任一项所述的方法，其中在相同条件下，所述多个T细胞的扩增是用不具有融合到所述H1和/或H2的N端或C端的多肽的抗体的多个T细胞扩增的约2至约50倍。
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