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CN110464842B - 包含抗pcsk9抗体的制剂及其用途 - Google Patents

包含抗pcsk9抗体的制剂及其用途 Download PDF

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CN110464842B CN201810450088.5A CN201810450088A CN110464842B CN 110464842 B CN110464842 B CN 110464842B CN 201810450088 A CN201810450088 A CN 201810450088A CN 110464842 B CN110464842 B CN 110464842B
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Abstract

本发明涉及包含抗PCSK9抗体的制剂及其用途，尤其涉及包含特异性结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的抗体和/或抗体片段、缓冲剂、减粘剂和表面活性剂的药物制剂。本发明还涉及抗PCSK9抗体。此外，本发明涉及这些制剂或抗体的治疗和诊断用途。

Description

包含抗PCSK9抗体的制剂及其用途
技术领域
本发明涉及抗体制剂领域，尤其涉及包含特异性结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 型9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9)(PCSK9)的抗体(下称抗PCSK9抗体)和/或其抗体片段的药物制剂。此外，本发明涉及这些制剂的治疗和诊断用途。
背景技术
血清胆固醇水平升高是导致心血管事件的重要危险因素，目前已有多种作用机制的降低胆固醇的药物上市或在研，其中抗PCSK-9的单克隆抗体因具备良好的安全性和疗效，受到广泛的关注(赵水平等,中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版).中国循环杂志 31(10):937-953,2016)。
单克隆抗体药物因作用特异性强，不良反应小等优势已成为许多疾病领域药物的发展主流，通过减少LDLR内吞来降低LDL-C的抗PCSK-9单克隆抗体药物是目前的研究热点。抗 PCSK-9单抗具有显著的降低LDL-C的效果，且安全性良好、用药方便，是降脂治疗领域的重大突破性药物。
现在仍然存在替代PCSK9抗体的需求。具体而言，存在与PCSK9具有高亲和力、细胞株来源可靠，稳定性好并能以高效能降低LDL-C的替代PCSK9抗体的需求。还更具体的是，存在以高效能降低LDL-C并提供持久的起效持续时间(例如，持久的LDL-C水平的抑制) 的替代PCSK9抗体的需求。此类抗体将还优选具有利于开发、制造或配制的良好的物理化学特性。
目前大多数上市的单克隆抗体药物为静脉注射，但是，对于一些慢性疾病，病人希望可以在家中自行用药，因此皮下注射便成为了首选的注射方式。由于皮下注射体积一般限制在 1.0～1.5ml，因此需要抗体制剂达到高浓度(≥100mg/ml)以满足临床用药剂量要求。但是，粘度高也是高浓度抗体制剂的一大挑战。因为，高粘度制剂会给下游工艺和药物通过注射器皮下给药带来很大困难。蛋白在高浓度下往往稳定性较差，容易产生聚集体和颗粒，且蛋白构象的不稳定也会引起化学稳定性，如电荷异质性的显著变化。
另外，单克隆抗体为生物大分子，其结构非常复杂。在生产过程中，表达的抗体分子会发生各种翻译后修饰和降解反应，如N末端环化，糖基化，脱酰胺，异构化，氧化，片段化，二硫键错配等等。这些质量属性可能会对最终产品安全性和有效性产生影响，因此，控制产品质量的正确性和一致性也非常重要。
本领域中有提供低粘度、稳定、高浓度的抗PCSK-9抗体液体制剂的需要。
发明内容
PCSK9呈现为重要和有利的治疗靶标。本发明还提供了包含抗PCSK9抗体或其片段(例如本文所定义的抗PCSK9抗体)的液体抗体制剂。本发明还提供了针对PCSK9的抗体。
一、本发明的抗体制剂
一方面，本发明提供一种液体抗体制剂，其包含
(i)抗PCSK-9抗体或其片段(例如抗原结合片段)；
(ii)缓冲剂；
(iii)减粘剂；和
(iv)表面活性剂。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约50 至约200mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约100mg/mL至约200mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约100mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约125mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约150mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约175mg/mL。在另一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗PCSK9抗体或其片段的浓度为约200mg/mL。
在一个实施方案中，所述抗PCSK9抗体为任何结合PCSK9蛋白(例如人PCSK9)的抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体或者两者的组合。优选地，在一个实施方案中，所述抗PCSK9 抗体为单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗PCSK9抗体或其片段为本文中定义的抗 PCSK9抗体或其片段。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约0.01-50mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约0.1-50mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约0.2-10mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约0.5-2.5mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约1.0-2.0mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约1.5mg/ml。
在一个实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷。在一个实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的减粘剂的浓度为约10mmol/L-1000 mmol/L。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的减粘剂的浓度为约20mmol/L-500 mmol/L。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的减粘剂的浓度为约50mmol/L-300 mmol/L。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的减粘剂的浓度为约50mmol/L-200 mmol/L。
在一个实施方案中，所述减粘剂选自：糖醇(例如山梨醇)、精氨酸、精氨酸盐酸盐、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠和其组合。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇，其浓度为约1％-6％(w/v)。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇，其浓度为约1％-6％(w/v)，并且所述液体制剂不包含其它减粘剂。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇与精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的组合。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇与精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的组合，其中山梨醇的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)，其中精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的浓度为约50mmol/L～180mmol/L，优选约 70mmol/L～150mmol/L，更优选约90mmol/L。在一个实施方案中，所述减粘剂是山梨醇与精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的组合，其中山梨醇的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约 2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)，其中精氨酸或精氨酸盐的浓度为约50mmol/L～180mmol/L，优选约70mmol/L～150mmol/L，更优选约90mmol/L，并且所述液体制剂不包含其它减粘剂。
在一个实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.01-5mg/ml。在一个实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.05-1mg/ml。在一个实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约 0.1-0.5mg/ml。在一个实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.3mg/ml。
在一个实施方案中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂例如是普洛尼克(pluronics)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、或聚山梨醇酯-20等。
在一个实施方案中，本发明的液体制剂包含溶媒，优选地所述溶媒选自注射用水、注射用有机溶剂包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。
在一个实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.0～6.0。在一个实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.2-5.8。在一个实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.4-5.6。在一个实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.5。
在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0厘泊-20厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0厘泊-10厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约5.0厘泊-7.0厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约5.2厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约6.0厘泊。
在一个实施方案中，所述液体制剂为药物制剂，优选为注射剂，更优选为皮下注射剂。
在一个优选实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含
(i)约100mg/mL至约200mg/mL的抗PCSK-9抗体或其片段；
(ii)约0.2-10mg/ml组氨酸；
(iii)约1％-6％(w/v)山梨醇；和
(iv)约0.05-1mg/ml聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20；
其中所述液体制剂的pH为约5.0～6.0。
在一个更优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂还包含注射用水。
在一个优选实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含
(i)约100mg/mL至约200mg/mL的抗PCSK-9抗体或其片段；
(ii)约0.2-10mg/ml组氨酸；
(iii)约1％-6％山梨醇和约50mmol/L～180mmol/L精氨酸或精氨酸盐；和
(iv)约0.05-1mg/ml聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20；
其中所述液体制剂的pH为约5.0～6.0。
在一个更优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂还包含注射用水。
在一个实施方案中，本发明的包含抗PCSK9抗体的液体制剂在约-80℃至约45℃，例如 -80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约42℃或约45℃的条件下储存至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11 个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，至少36个月，或更长时间后，用SEC-HPLC 法检测，抗PCSK-9抗体或其片段的纯度下降不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、2％、 1％、0.5％或0.1％。
在一个实施方案中，本发明的包含抗PCSK9抗体的液体制剂在约-80℃至约45℃，例如 -80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约42℃或约45℃的条件下储存至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11 个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，至少36个月，或更长时间后，用非还原型CE-SDS法检测，抗PCSK-9抗体或其片段的纯度下降不超过10％，例如不超过5％、4％、 3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在一个实施方案中，本发明的包含抗PCSK9抗体的液体制剂在约-80℃至约45℃，例如 -80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约42℃或约45℃的条件下储存至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11 个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，至少36个月，或更长时间后，用CEX-HPLC 法检测，抗PCSK-9抗体或其片段的电荷异质性变化不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、 2％、1％、0.5％或0.1％。
本发明的制剂具有高的抗体浓度，同时其具有适合给药尤其皮下给药的低粘度，具有高的物理和化学稳定性，存放时不易产生聚集体和颗粒并且较不易发生电荷异质性变化。这些优点对于生产完全、有效、高一致性的临床药品是十分有益的。
本发明人惊奇地发现山梨醇可作为抗PCSK9抗体的液体制剂的减粘剂，在无需加入其它减粘剂的情况下，即可获得低粘度、高浓度抗PCSK-9抗体或其片段液体制剂，并且所述液体制剂具有高的稳定性。另外，本发明人惊奇地发现山梨醇和精氨酸的组合作为减粘剂能够更好地降低抗PCSK9抗体的液体制剂的粘度，并且使得能够使高浓度抗PCSK-9抗体或其片段液体制剂具有更低的便于皮下注射的粘度，并且所述PCSK-9抗体液体制剂具有提高的稳定性(见实施例10-12)。
因此，另一方面，本发明提供了糖醇用作包含抗PCSK9抗体的液体制剂的减粘剂的用途。
在一个实施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗体的液体制剂中的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)。在一个实施方案中，所述糖醇优选为山梨醇。
另一方面，本发明提供了糖醇作为减粘剂在制备包含抗PCSK9抗体的液体制剂中的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了糖醇作为仅有的减粘剂在制备包含抗PCSK9抗体的液体制剂中的用途。
在一个实施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗体的液体制剂中的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)。在一个实施方案中，所述糖醇优选为山梨醇。
另一方面，本发明提供了糖醇和精氨酸(或精氨酸盐，优选精氨酸盐酸盐)的组合用作包含抗PCSK9抗体的液体制剂的减粘剂的用途。
在一个实施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗体的液体制剂中的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)，精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的浓度为约 50mmol/L～180mmol/L，优选约70mmol/L～150mmol/L，更优选约90mmol/L。在一个实施方案中，所述糖醇优选为山梨醇。
另一方面，本发明提供了糖醇和精氨酸(或精氨酸盐，优选精氨酸盐酸盐)的组合作为减粘剂在制备包含抗PCSK9抗体的液体制剂中的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了糖醇和精氨酸(或精氨酸盐，优选精氨酸盐酸盐)的组合作为仅有的减粘剂在制备包含抗PCSK9抗体的液体制剂中的用途。
在一个实施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗体的液体制剂中的浓度为约1％-6％(w/v)，优选约2％-4％(w/v)，更优选约3％(w/v)，精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)的浓度为约 50mmol/L～180mmol/L，优选约70mmol/L～150mmol/L，更优选约90mmol/L。在一个实施方案中，所述糖醇优选为山梨醇。
另一方面，本发明提供了由上面所述液体制剂冻干而获得的固体制剂。可在使用前，将该固体制剂重构于适当的溶媒中，形成本发明的液体制剂。
另一方面，本发明提供根据本发明的液体制剂的制备方法，其包括以下步骤：
a.提供抗PCSK-9抗体或其片段；
b.加入缓冲剂和减粘剂；
c.加入表面活性剂；
d.任选地无菌过滤，得到本发明的液体制剂。
在一个实施方案中，步骤a.中的抗PCSK-9抗体或其片段是经过分离纯化的抗PCSK9抗体。
在一个实施方案中，步骤a.中的抗PCSK-9抗体或其片段以溶液优选水溶液形式提供。
在一个实施方案中，在步骤b.之前使用超滤离心管(截流分子量例如为约30KD)离心浓缩抗PCSK-9抗体或其片段。
在一个实施方案中，步骤b.的缓冲剂和减粘剂以溶液优选水溶液形式提供。
在一个实施方案中，在步骤b.后，超滤离心浓缩并再用缓冲剂和减粘剂溶液优选水溶液稀释，如此反复，直到置换完全。
在一个实施方案中，在步骤c.前，调整PCSK-9抗体或其片段的浓度。
所述抗PCSK-9抗体或其片段、缓冲剂、减粘剂和表面活性剂如文中所述，其用量和/或浓度如对本发明液体制剂所述或可由其适当地确定。
在一个实施方案中，本发明的液体制剂的制备方法包括以下步骤：
i.提供分离纯化的抗PCSK9抗体，并任选地将其加入到截流分子量为约30KD的超滤离心管中，离心浓缩；
ii.加入缓冲剂和减粘剂溶液优选水溶液(优选地，缓冲剂和减粘剂的种类、浓度和溶液的pH如上面和定义部分对本发明的液体制剂所定义，更优选地缓冲剂为组氨酸，减粘剂为精氨酸和/或山梨醇)稀释后继续浓缩，如此反复，直至置换完全；
iii.调整置换后的蛋白质的浓度到对本发明的液体制剂所定义的浓度；
iv.加入表面活性剂或其溶液优选水溶液，使表面活性剂的终浓度至对本发明的液体制剂中所定义的浓度；
v.任选地步骤iv的溶液无菌过滤；和
vi.任选地分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得成品。
在实施方案中，抗PCSK9抗体是本文所定义的抗PCSK9抗体。
二、本发明的抗PCSK9抗体
在一些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段(优选人PCSK9蛋白质)的抗PCSK9抗体或抗体片段(优选抗原结合片段)。
在本发明的一个方面中，本文提供抗PCSK9抗体，以及其片段(例如抗原结合片段)。在一些实施方案中，抗PCSK9抗体抑制或阻断PCSK9活性。在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体具有以下一个或多个特性：
(1)结合PCSK9(优选地人PCSK9蛋白质)，优选地，具有的平衡解离常数(KD)≤大约1μM，≤大约100nM，≤大约10nM，≤大约1nM，≤大约0.1nM，≤大约0.01nM，或≤大约0.001nM(例如10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)；
(2)阻断PCSK9(例如人PCSK9)与LDLR(例如人LDLR)结合；
(3)增加LDLR的恢复能力，和/或抑制PCSK9诱导的LDL-C摄入降低，从而使得细胞(例如肝细胞)增加对LDL-C的摄取，优选地，抗体浓度在大约10、15、20、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM以上，例如大约在10-100nM之间、 15-70nM之间等，优选地所述抗体增加细胞对LDLC摄取的能力比对照抗体高至少2倍，优选地，对照抗体是IgG或本领域已知的抗体，例如Alirocumab、Evolocumab或Lodelcizumab；
(4)有效阻止了细胞的LDLR内化；
(5)(剂量依赖地)降低血清中LDL-C水平和/或总胆固醇(TC)水平；
(6)在较长时间内显著降低血清中LDL-C水平，例如有效天数在15、16、17、18、19、20或21天以上。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含
(i)表II所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含：
(i)SEQ ID NO:24所示的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中
(a)所述VH包含
(i)表II所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；和/或
(b)所述VL包含：
(i)SEQ ID NO:24所示的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在优选的实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，VL包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，本发明抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含
(a)如SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，和/或
(b)如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR。
在优选的实施方案中，本发明抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含
(a)如SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，和
(b)如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和 /或轻链可变区(VL)，其中
(i)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQID NO:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与选自SEQ ID NO:1、7、8、9、10、11、12、13和20的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR2包含选自SEQ ID NO:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与选自SEQ ID NO:2、14、15、16、17和21的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR3包含选自SEQ ID NO:3、18、19和22的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与选自SEQ ID NO:3、18、19和22的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；
和/或
(ii)其中所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1 包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:4 的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与 SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换) 的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者 LCDR3包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含
(i)表I所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合；或
(ii)(i)的HCDR组合的变体，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、 4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)；
和/或
(ii)所述VL包含
(i)分别包含如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列或分别由所述氨基酸序列组成的 LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合；或者
(ii)(i)的LCDR组合的变体，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、 4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)。
在优选的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区 (VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2 和HCDR3，所述VL包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合如下表(表 I)所示：
表I：本发明抗体或其抗原结合片段中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和 LCDR3的示例性组合
Figure BDA0001658222300000071
在优选的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含如表I所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和/ 或轻链可变区VL，其中，
(a)重链可变区VH
(i)包含与选自SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在 CDR区中；
和/或
(b)轻链可变区VL
(i)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在优选的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的重链可变区VH和轻链可变区VL的组合如下表(表II)所示：
表II：本发明抗体或其抗原结合片段中重链可变区VH和轻链可变区VL的示例性组合
Figure BDA0001658222300000081
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中 (a)重链
(i)包含与选自SEQ ID NO:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；
和/或
(b)轻链
(i)包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10 个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。
在优选的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述抗体或其抗原结合片段所包含的重链和轻链的组合如下表(表III)所示：
表III：本发明抗体或其抗原结合片段中重链和轻链的示例性组合
Figure BDA0001658222300000091
在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗PCSK9抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段(优选的抗原结合片段)，其中所述抗体结合PCSK9的片段内的表位。在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体结合包含人PCSK9氨基酸序列SEQ ID NO：53的氨基酸片段内的表位。
在一些实施方案中，本发明抗PCSK9抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表IV所示：
表IV
Figure BDA0001658222300000092
Figure BDA0001658222300000101
在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。当抗体包含Fc区时，可以改变附着于其的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗疾病的有效性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。关于Fc变体的实例参见美国专利号7,332,581，美国专利号6,737,056，美国专利号6,737,056； WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)，美国专利号6,194,551、 WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)，美国专利号7,371,826， Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和 WO 94/29351。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。可以如，例如美国专利号7,521,541中所述地生成半胱氨酸改造的抗体。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)显示与表C所列的任一抗体对PCSK9(例如人PCSK9，优选具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列)相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(ii)抑制(例如，竞争性抑制)表C所列的任一抗体与PCSK9(例如人PCSK9，优选具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列)的结合；
(iii)与表C所示的任一抗体结合相同或重叠的表位；
(iv)与表C所示的任一抗体竞争结合PCSK9(例如人PCSK9，优选具有如SEQ ID NO:53 所示的氨基酸序列)；
(v)具有表C所列的任一抗体分子的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4 形式的抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体是人源化的。在一些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体是人抗体。在一些实施方案中，至少部分的本文所述的抗PCSK9抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体还涵盖其抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH，F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
在一些实施方案中，本发明的抗PCSK9抗体是人源化抗体。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13:1619-1633)。Almagro&Fransson区分理性办法和经验办法。理性办法的特征在于生成少数工程化抗体变体并评估其结合或任何其它感兴趣的特性。如果设计的变体不产生预期的结果，那么启动新一轮的设计和结合评估。理性办法包括CDR嫁接、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人字符串内容优化 (Human StringContent Optimization)。相比之下，经验办法基于生成大的人源化变体库并使用富集技术或高通量筛选选出最佳克隆。因而，经验办法依赖于能够对大量抗体变体进行搜索的可靠的选择和/或筛选系统。体外展示技术，如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求并且是技术人员公知的。经验办法包括FR库、导向选择(Guided selection)、框架改组 (Framework-shuffling)和Humaneering。
在一些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5： 368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。
在一些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体是嵌合抗体。
可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature348： 552-554；Clackso等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222： 581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in MolecularBiology248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人， J.Mol.Biol340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)： 12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)中描述。
在一些实施方案中，本发明还涵盖与其它物质，如可检测标记(如荧光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质和化学发光部分)、细胞毒性剂或免疫抑制剂缀合的抗PCSK9单克隆抗体(“缀合物或免疫缀合物”)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的，参见例如WO05/103081。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性或多特异性的。多特异性单抗可以对一种靶多肽的不同表位是特异性的或可以含有对超过一种靶多肽特异性的抗原结合域。参见例如，Tutt等(1991)J.Immunol.147:60-69。抗PCSK9单抗可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。例如抗体或其片段可以功能性与一或多种其它分子，如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价联合或以其它方式)以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合人PCSK9蛋白，例如如SEQ ID NO:53所示的人PCSK9蛋白。
三、本发明抗体或其制剂的治疗方法和用途
另一方面，本发明涉及在受试者中抑制PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9 抗体。本发明还涉及本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体制备用于在受试者中抑制PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的药物的用途。
在另一方面中，本发明涉及降低受试者的胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，胆固醇是LDL-胆固醇，优选地血清胆固醇。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗 PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。在一些实施方案中，本发明涉及降低受试者的血清LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体制备用于在受试者中降低受试者的胆固醇水平(在一个实施方案中是LDL-胆固醇水平或血清LDL-胆固醇水平)的药物的用途。
在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的与升高的LDL-胆固醇水平相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。本发明还涉及本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体制备用于在受试者中治疗受试者的与升高的LDL-胆固醇水平相关的病症的药物的用途。
在一方面中，本发明涉及预防或治疗胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。本发明还涉及本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体制备用于治疗胆固醇相关疾病的药物中的用途。胆固醇相关疾病的示例性和非限制性实例提供在后文中。在一些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症(hypercholesterolemia)或高脂血症。在一些实施方案中，本发明涉及治疗高胆固醇血症和/或高脂血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体。在一些实施方案中，本发明还涉及本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体制备用于治疗高胆固醇血症和/或高脂血症的药物的用途。
在一方面中，本发明涉及预防或治疗可以通过消除、抑制或降低PCSK9活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在一些实施方案中，可以通过使用他汀类物质 (statins)治疗或预防的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗PCSK9制剂或本发明的抗 PCSK9抗体来治疗或预防。在一些实施方案中，可以受益于防止胆固醇合成或提高LDLR表达的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体来治疗。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的另外的治疗剂。在一个实施方案中，本发明还涉及包含本文所述的抗体制剂或抗体以及另外的治疗剂的组合产品。在一个实施方案中，另外的治疗剂提升LDLR蛋白的水平。在另一个实施方案中，另外的治疗剂降低LDL-胆固醇的水平。在另一个实施方案中，另外的治疗剂包含他汀类物质。在另一个实施方案中，另外的治疗剂为他汀类物质。在一些实施方案中，他汀类物质选自：阿托伐他汀(atorvastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，美伐他汀(mevastatin)，匹伐他汀(pitavastatin)，普伐他汀(pravastatin)，罗舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀 (simvastatin)，及其任意组合。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和/或心血管疾病。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于降低复发的心血管事件的风险的方法。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于提高受试者的HDL-胆固醇水平。在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选地人。
上述组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。
为了预防或治疗疾病，本发明的制剂或抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述制剂或抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。所述抗体的示例性的剂量范围包括3-30mg/kg。
在其他方面，本发明提供任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗上文提及的相关疾病或病症。
在某些实施方案中，本发明的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体可防治性地施用以预防或缓和高胆固醇血症、高脂血症、心血管疾病和/或任何胆固醇相关疾病的发作。在某些实施方案中，可施用本发明的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体以治疗现有高胆固醇血症和/或高脂血症和/或心血管疾病和/或任何胆固醇相关疾病。在一些实施方案中，本发明的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗PCSK9抗体会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
四、其它
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗PCSK9抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一个实施方案中，本发明提供制备抗PCSK9抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗PCSK9抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
在一方面中，本发明涉及检测样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的任何抗PCSK9抗体制剂或本发明的抗体接触；和(b)检测抗PCSK9抗体或其片段和 PCSK9蛋白间的复合物的形成。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体是被可检测地标记的。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有制剂或抗PCSK9抗体或其片段、方法和用途。
附图说明：
图1.显示了不同浓度的各个抗PCSK9抗体阻断PCSK9与LDLR结合的能力。
图2.显示了不同浓度的各个抗PCSK9抗体增加HepG2细胞恢复LDLR的能力。
图3.显示了不同浓度的各个抗PCSK9抗体降低细胞LDLR内化的能力。
图4A显示了本发明示例性抗体的重链的FR和CDR的序列信息，图4B显示了本发明示例性抗体的轻链的FR和CDR的序列信息。
图5A显示了显示了本发明示例性抗体的重链可变区的序列信息，图5B显示了本发明示例性抗体的轻链可变区的序列信息。
图6显示了大鼠皮下或静脉给予抗PCSK-9抗体或Evolocumab后血清中LDL-C相对于给药前水平(D1给药前，基线)的％变化率(平均)vs时间作图的图谱。
图7显示了大鼠皮下或静脉给予抗PCSK-9抗体或Evolocumab后血清中％HDL-C相对于给药前水平(D1给药前，基线)的％变化率(平均)vs时间作图的图谱。
图8显示了给予食蟹猴抗PCSK-9抗体或Evolocumab后血清LDL-C相对于给药前水平 (D1给药前，基线)的％变化率(平均)vs时间作图的图谱。
图9显示了给予食蟹猴抗PCSK-9抗体或Evolocumab后血清HDL-C相对于给药前水平(D1给药前，基线)的％变化率(平均)vs时间作图的图谱。
图10显示了给予食蟹猴抗PCSK-9抗体或Evolocumab后血清TC相对于给药前水平(D1 给药前，基线)的％变化率(平均)vs时间作图的图谱。
定义
本发明中所使用的术语具有如下所列定义。如果在文中没有给出定义，则本发明中所使用的术语具有本领域所通常理解的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或更多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
除非另外说明，术语“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(Proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)”、“PCSK9”或“NARC-1”当用于本文中时是指任何天然PCSK9，优选地来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9。该术语涵盖“全长”未加工的PCSK9以及由细胞内加工产生的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语还包括天然存在的PCSK9的变体，例如，剪接变体或等位变体。
术语“PCSK9活性”或PCSK9的“生物学活性”当用于本文中时包括PCSK9的任何生物学作用。在一些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在一些实施方案中，PCSK9的生物学活性是PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的能力。在一些实施方案中，PCSK9结合并催化涉及LDLR的反应。在一些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低或减少LDLR的利用度的能力。在一些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9提高受试者的LDL的量的能力。在一些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括 PCSK9降低受试者的可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在一些实施方案中，PCSK9 的生物学活性包括PCSK9降低可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在一些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括由PCSK9信号传导所致的任何生物学活性。
术语“抗PCSK9抗体”、“抗PCSK9”、“PCSK9抗体”或“结合PCSK9的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合PCSK9蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向PCSK9中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体与不相关的、非 PCSK9蛋白结合的程度低于所述抗体与PCSK9结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定 (RIA)测量的。在一些实施方案中，抗PCSK9的抗体的平衡解离常数(KD)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10- 13M)。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，PCSK9)中与抗体分子特异性相互作用的部分。
与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。
与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、 70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983， Methods in Enzymology 9：242-253)。
抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、 60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制 50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体 CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR 环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformationsfor the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of MolecularBiology,273, 927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从 Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest， 5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有CDR的)、去免疫的、或人的抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、由Fab表达库产生的片段、Fd、 Fv、二硫化物连接的Fv(dsFv)、单链抗体(例如scFv)、双抗体或四抗体(Holliger P.等 (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14),6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的Ig结构域。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗胆固醇相关疾病中有效的任何物质，包括细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂等等。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“组合产品”是指一种剂量单位形式的固定组合或非固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以独立地在同一时间或在时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伴侣展示协作，例如，协同效应时。术语“固定组合”是指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如他汀类药物)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，例如他汀类药物) 作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供了患者体内两种化合物的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的胆固醇相关疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“胆固醇相关疾病”包括以下中的任一种或多种：高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征(metabolic syndrome)、糖尿病、冠状动脉心脏病(coronary heartdisease)、卒中 (stroke)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease)和一般性的异常脂血症(dyslipidemia)(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的VLDL和/或低的HDL)。可以使用抗PCSK9抗体(单独地或与一种或多种其他药物组合地)治疗的原发性和继发性异常脂血症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病 (diabetes mellitus)、家族性混合性高脂血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familialhypertriglyceridemia)、家族性高胆固醇血症 (familial hypercholesterolemias)，包括杂合性高胆固醇血症 (heterozygous hypercholesterolemia)、纯合性高胆固醇血症(homozygous hypercholesterolemia)、家族性缺陷性载脂蛋白 (familial defectiveapoplipoprotein)B-100；多基因性高胆固醇血症 (polygenic hypercholesterolemia)；残粒移去障碍病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺失 (hepatic lipasedeficiency)；继发于以下任何的异常脂血症：饮食不慎(dietary indiscretion)、甲状腺机能障碍(hypothyroidism)、药物(包括雌激素和孕酮疗法、β阻断剂和噻嗪类利尿剂(thiazide diuretics))；肾病综合征(nephrotic syndrome)、慢性肾衰竭(chronic renalfailure)、库欣综合征(Cushing′s syndrome)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliarycirrhosis)、糖原沉积病(glycogen storage diseases)、肝细胞瘤(hepatoma)、胆汁淤积(cholestasis)、肢端肥大症 (acromegaly)、胰岛素瘤(insulinoma)、单纯性生长素缺乏症(isolated growth hormone deficiency) 和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-inducedhypertriglyceridemia)。
术语“高胆固醇血症”当用于本文中时是指其中胆固醇水平升高到一定水平以上的病症。在一些实施方案中，LDL-胆固醇水平升高到一定水平以上。在一些实施方案中，血清LDL- 胆固醇水平升高到一定水平以上。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
术语“有效量”指本发明的制剂、抗体或片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。本发明的制剂、抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中制剂、抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
如文中所用，术语“制剂”意指适合于向动物优选哺乳动物(包括人)施用的包含至少一种活性成分和至少一种非活性成分的组合物。“液体制剂”是指液体形式的制剂。本发明的液体制剂包含(i)抗PCSK-9抗体或其片段；(ii)缓冲剂；(iii)减粘剂；(iv)表面活性剂；和 (v)溶媒。本发明的制剂的组成可如上面液体制剂实施方案中所示。本发明的液体制剂优选为注射剂，更优选为皮下注射剂。
如文中所用，“缓冲剂”是指pH缓冲剂。优选地，所述缓冲剂能够使本发明的液体制剂的pH保持在约5.0～6.0，优选约5.2-5.8，更优选约5.4-5.6，最优选约5.5。缓冲剂在液体制剂中的浓度为例如约0.01-50mg/m、约0.1-50mg/ml、约0.2-10mg/ml、约0.5-2.5mg/ml、约1.0-2.0mg/ml或约1.5mg/ml。优选地，缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷。
如文中所用，“减粘剂”是指能够降低抗PCSK-9抗体液体制剂的粘度的物质。减粘剂在液体制剂中的浓度为例如约10mmol/L-1000mmol/L、约20mmol/L-500mmol/L、约50mmol/L-300mmol/L或约50mmol/L-200mmol/L。优选地，减粘剂选自：糖醇、精氨酸、精氨酸盐酸盐、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠和其组合。更优选地，减粘剂是山梨醇，或者减粘剂是山梨醇与精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐) 的组合。优选地，山梨醇在液体制剂中的浓度为约1％-6％(w/v)；精氨酸或精氨酸盐(优选精氨酸盐酸盐)在液体制剂中的浓度为约50mmol/L～180mmol/L，优选约70mmol/L～150mmol/L，更优选约90mmol/L。
如文中所述，“表面活性剂”是指加入少量后，能使溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。表面活性剂在液体制剂中的浓度为例如约0.01-5mg/ml，约0.05-1mg/ml或约0.1-0.5 mg/ml，更优选为约0.3mg/ml。优选地，表面活性剂是非离子型表面活性剂，例如普洛尼克 (pluronics)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40或聚山梨醇酯-20等。
如文中所用，术语“溶媒”是指用于溶解或悬浮活性成分和非活性成分以形成液体制剂的液体。可用于本发明的溶媒包括但不限于注射用水、注射用有机溶剂包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。
如文中所用，术语“糖醇”糖醇是单糖经催化氢化等还原反应而得到的相应多元醇。糖醇包括但不限于山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇等。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
如文中所用，“w/v”是指“重量/体积”，例如“1％w/v”即为1g/100ml＝0.01g/ml＝10 mg/ml。
具体实施方施
以下结合实施例进一步说明本发明，下列实施例不应被理解为对本发明的限制。
缩写的含义：
SEC-HPLC：体积排阻高效液相色谱
CE-SDS：十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳
CZE：毛细管区带电泳
实施例1.抗PCSK9的抗体筛选确定母抗体
抗原生物素标记
按照厂商的说明,采用Pierce公司的琥珀酰亚胺基磺酸基生物素标记工具包对PCSK9抗原(SEQ ID NO.53)进行生物素标记。FITC标记山羊抗人免疫球蛋白F(ab’)kappa链抗体 (LC-FITC)购自(Southern Biotech)、聚乙烯抗生物素蛋白(SA-PE)购自(Sigma)、链霉亲和素-633(SA-633)购自(Molec ular Probes)。链霉微珠和细胞免疫磁珠分离柱购自Miltenyi LS。
初步筛选
8个合成基于酵母的抗体展示(yeast-based antibody presentation)文库(来自Adimab)按照现有的方法(Xu等人,2013；WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568)进行扩增，每个库多样性达到1×109。简言之，前两轮的筛选使用Miltenyi公司的MACS系统进行磁性激活细胞分选进行。首先，将每个文库的酵母细胞(～1×1010细胞/文库)分别在FACS洗涤缓冲液中(磷酸盐缓冲液，含有0.1％牛血清蛋白)室温孵化15分钟，缓冲液中含有如上所述制备的100nM生物素标记的PCSK9抗原。使用50ml预冷的FACS洗涤缓冲液洗一次，再用40ml相同洗涤缓冲液重悬细胞，并加入500μl链霉素微珠于4℃孵化15分钟。1000rpm离心5min弃去上清后用5ml FACS洗涤缓冲液重悬细胞，将细胞溶液加到Miltenyi LS柱中。加样完成后，FACS洗涤缓冲液洗柱3次，每次3ml。从磁性区域取下Miltenyi LS柱，用5ml 生长培养基洗脱，收集洗脱的酵母细胞并在37℃过夜生长。
使用流式细胞仪进行下一轮的分选：将经过MACS系统筛选获得的大约1×108的酵母细胞用FACS缓冲液洗三次，于含有低浓度生物素(100-1nM)标记的PCSK9抗原或者PCSK9-Fc 融合抗原中室温下培养。弃去培养液，细胞用FACS洗涤缓冲液洗两次之后，将细胞与LC-FITC (1：100稀释)混合并与SA-633(1:500稀释)或EA-PE(1:50稀释)试剂混合，4℃下培养15分钟。用预冷的FACS洗涤缓冲液洗脱两次，并重悬于0.4ml缓冲液中，将细胞转移到带滤器的分离管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分选细胞。
接下来再通过几轮筛选以获得竞争性配体并清除非特异性结合物(例如CHO细胞的膜蛋白)。经过最后几轮的分选之后，将收集的酵母细胞涂平板，在37℃培养过夜，挑选出靶标单克隆。利用sanger法对所获得抗体的可变区进行测序。共获得大约310个可变区序列独特的抗体并逐一进行鉴定。
通过酵母表达并使用Protein A亲和层析的方法纯化获得了这些抗PCSK9抗体蛋白。
抗体生产纯化
将通过筛选获得的表达抗PCSK9抗体的酵母细胞在30℃下震荡诱导48小时以表达抗 PCSK9的抗体。诱导结束之后，1300rpm离心10min去除酵母细胞，收获上清液。使用Protein A对上清液中的抗PCSK9抗体进行纯化，pH2.0醋酸溶液洗脱，收获抗PCSK9抗体。使用木瓜蛋白酶消化并用KappaSelect(GE生命医疗集团)进行纯化获得相应的Fab片段。
根据本领域常规方法，从上述表达抗PCSK9抗体的酵母细胞获得编码抗PCSK9抗体的基因DNA，并根据常规方法将该基因DNA克隆到新的表达载体(pCDNA3.1)。
将含有目标抗体基因的上述表达载体与转染试剂Lipofectamine TM2000(购自Invitrogen) 按照生产产商提供的方案瞬时转染培养的人肾胚细胞293细胞，弃去培养基并用新鲜的培养基把细胞稀释到4X106/ml。在37℃，5％CO2的条件下培养细胞7天，每48小时流加新鲜培养基。7天后，13000rpm离心20min。取上清液，用Protein A纯化上清液，使抗体的纯度＞ 95％。
ForteBio KD测定(生物膜层干涉法)
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器上。再将传感器放入100nM的PCSK9抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
MSD-SET动力学检测
平衡亲和力的检测如前所述(Estep等人2013)。在含有0.1％的无IgG BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBSF)中，加入终浓度为10-100pM的如前所述获得的生物素标记的PCSK9抗原(b-PCSK9)，对如上获得的抗PCSK9Fab或mAb经过3到5倍连续稀释，获得浓度为5-100nM 的Fab或mAb溶液。将抗体(稀释于20nM磷酸盐缓冲盐水中)4℃过夜或室温30分钟包被在MSD-ECL板上。加入3％BSA，700rpm室温封闭30分钟，之后用清洗缓冲液(PBSF+0.05％吐温20)洗3遍。将样品加入板中置于摇床中700rpm室温孵育150秒后清洗1遍。加入250ng/mlsulfotag标记的链霉抗生物素(稀释于PBSF中)，室温孵育3分钟。缓冲液清洗3遍后使用MSD Sector Imager 2400设备读取来确定结合在板上的抗原。未结合的抗原百分比通过滴定抗体方法得到，结果发现抗PCSK9Fab或mAb与抗原的结合符合代谢动力学的二次方程。
Octet Red384结合表位鉴定
结合表位鉴定使用了标准的三明治式的交互阻断分析法。将靶点特异性对照IgG固定于 AHQ传感器上，并且用不相干的人IgG1抗体封闭传感器上空Fc结合位点。将传感器放于100 nM的目标抗原PCSK9溶液中120s，再放入到第二种如上所制备的100nM抗PCSK9的抗体或配体溶液中。读取数据，并将数据通过ForteBio数据分析软件7.0(来自ForteBio)处理。抗原结合抗体后还能被第二种抗体或配体结合暗示有一个未结合表位(非竞争性的)，没有结合则表示表位阻断(竞争性的或配体阻断)。
通过以上的筛选和鉴定工作，我们获得了一些能够阻断PCSK9和LDLR结合且和人鼠 PCSK9都结合的抗体。为了获得更高亲和力的抗PCSK9抗体，我们通过以下方法对抗体ADI-02396进行了优化。
实施例2抗PCSK9抗体的亲和力优化
VHmut筛选
该方法是通过常规的错配PCR的方法向抗体重链区域引入突变。PCR过程中，通过使用 1uM高突变的碱基类似物dPTP和8-oxo-dGTP，从而将碱基错配概率提高至约0.01bp。
获得的错配PCR的产物通过同源重组的方法构建入含有重链恒定区的载体中。通过这种方法，在包括PCSK9抗原滴度、未标记抗原竞争以及使用母抗体竞争的筛选压力下，我们获得了库容量为1x107的次级库。通过FACS方法进行了3轮成功筛选。
CDRH1/CDRH2筛选
把VHmut方法获得的子代抗体的CDRH3基因构建入1x108多样性的CDRH1/CDRH2基因库中，并对其进行了3轮筛选。第一轮使用MACS方法，而第二、三轮使用FACS方法，对抗体抗原结合物进行亲和力加压，筛选出最高亲和力的抗体。
第一轮优化：第一步工作是使这个具有人鼠交叉活性、配体竞争性抗PCSK9抗体ADI-02396(命名为“母”抗体)的亲和力提高。简而言之，就是向母抗体中引入突变(利用“错配PCR”的方法)，建立次级基于酵母的抗体展示(yeast-based antibody presentation)库。最终生成了大约1×107大小的次级库用于后面更高亲和力抗体的富集。筛选压力包括PCSK9抗原滴度、未标记抗原竞争以及使用母抗体竞争。FACS技术也用于筛选目标群体(具体操作方法参见Chao等人Nature Protocols,2006)。经过2-3轮的富集，将获得的酵母涂平板从而可以获得单克隆。经过这一工作后，总共得到了3个亲和力改进的后代，ADI-09111、ADI-09112和 ADI-09113。通过ForteBio Octet测定，这三个抗体的KD范围是1-10nM。两个子代抗体 ADI-09112和ADI-09113被用于第二轮的亲和力优化。
第二轮的亲和力优化：第二步工作是提高两个人鼠交叉活性、配体竞争性的抗PCSK9单抗ADI-09112和ADI-09113(命名为“母”抗体)的亲和力。简而言之，就是为每一个母抗体再建立次级基于酵母的抗体展示(yeast-based antibody presentation)库。将母抗体的CDR-H3和轻链(LC)与现有酵母文库中的基因的CDR-H1和CDR-H2相结合(命名为：“H1/H2”优化)。这最终生成了大约1×108大小的5个库用于后面更高亲和力抗体的富集。筛选方法同第一轮筛选。经过2-3轮的富集，将酵母菌涂在平板上获得单克隆。经过这一工作后，得到了亲和改进的后代抗体，其中ADI-10085、ADI-10086和ADI-10087是ADI-09912的CDR-H1及CDR-H2 区域的变异体，ADI-10088、ADI-10089和ADI-10090是ADI-09113的VH区域变异体。所述抗体的相关序列信息参见表A-C。这些抗体对人PCSK9的亲和力提高了10倍，通过ForteBio 法和MSD-SET测定表明其KD范围在4-17pM～200pM之间(表1，表2)。有部分抗体的亲和力比对照抗体高10倍左右。其他抗体功能鉴定可以进一步缩小抗体数量，以便于临床前的开发。
本申请涉及的各个抗PCSK-9抗体的序列信息及编号如下表A-C所示：
表A.本申请示例性抗体的各个CDR序列编号
Figure BDA0001658222300000211
Figure BDA0001658222300000221
表B.本申请示例性抗体的重链可变区和轻链可变区的各框架区序列编号
Figure BDA0001658222300000222
表C.本申请示例性抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链序列的序列编号
Figure BDA0001658222300000223
表1:ForteBio法测定抗体KD值
Figure BDA0001658222300000224
表2:MSD-SET动力学测定抗体KD值
Figure BDA0001658222300000231
实施例3.抗PCSK-9抗体抑制PCSK-9与LDLR结合实验
用PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)稀释如实施例1所述的PCSK9蛋白(生物素标记的PCSK9 蛋白)至400nmol/L作为工作液。分别用PBS溶液稀释如实施例2所获得的抗PCSK9抗体 (ADI-10085、ADI-10086、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089和ADI-10090)至浓度依次为1000nmol/L、100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L，按照同样的方法制备对照抗体(Alirocumab、Evolocumab、Bococizumab和Lodelcizumab)各个浓度的溶液。将PCSK9 工作液与梯度稀释的各个抗PCSK9抗体样品或者对照样品等体积混合。用PBS溶液重悬过表达人LDLR的CHO细胞(CHO-LDLR)并计数，将其细胞浓度用PBS溶液调整至4×106个/ml，接种于96孔U型细胞培养板中每孔加入50μl的细胞培养液，加入50μl PCSK9与抗PCSK9 抗体的混合液，每孔中细胞数为2.0×105个，200g室温离心5分钟，弃上清。用PBS溶液按 1:200比例稀释抗-His-FITC(R&D Systems)终浓度至2.5μg/ml，加入96孔板中，100μl每孔，冰浴30分钟。200g室温离心5分钟，轻轻弃上清液，每孔中加入150μl PBS溶液，200 g室温离心5分钟，轻轻弃上清液，重复3次。在每个实验孔中加入80μl/孔的PBS溶液，移液器吹打数下重悬细胞。用流式细胞仪检测细胞荧光信号值。
实验所检测到的荧光信号，请参见下述表3。
表3:荧光信号值
Figure BDA0001658222300000232
Figure BDA0001658222300000241
将表3原始数据用GraphPad Prism6软件进行分析作图得到图1。
实验结果表明，抗PCSK9抗体与对照抗体相比具有相当的阻断PCSK9与LDLR结合的能力。
实施例4细胞LDL-c摄取分析实验
从液氮保存罐中取出HepG2细胞冻存管，37℃快速水浴融化，将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml室温生长培养基(90％DMEM+10％FBS，其中DMEM和FBS均购自 Gibco公司)，1000r/分钟，室温离心5分钟后，用新鲜生长培养基重悬沉淀细胞，转入培养瓶中在37℃，5％CO2条件下培养。取对数生长期的HepG2细胞，PBS溶液清洗两次后，加入 1ml的0.25％的胰蛋白酶(购自Gibco)消化3分钟，加入6ml的生长培养基重悬细胞终止反应。用生长培养基将HepG2细胞调整至0.8×106个/ml，接种于黑色底部透明的聚-D-赖氨酸涂层96孔细胞培养板(购自Nunc)中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱中孵育6～7小时。弃生长培养基，替换为分析培养基(DMEM+5％FBS)，100μl/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。分别将抗体样品(ADI-10085、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089)用分析培养基稀释至66.7nmol/L。再以66.7nmol/L的样品为起始浓度，进行4倍梯度稀释，阳性对照抗体(Alirocumab、Evolocumab和Lodelcizumab)和阴性对照(LDL、PCSK9+LDL和IgG) 进行相同操作。将获得的各浓度梯度样品分别各取60μl与60μl的66.7nmol/L的PCSK9进行等体积混合，从而获得各个混合液。空白对照为120μl的分析培养基。吸弃96孔板内液体，每孔加入50μl上述混合液和空白对照样品，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时。取出培养板，每孔加入50μl，用分析培养基稀释的6μg/ml的BODIPY标记的LDL溶液(购自 life technologies)，将培养板置于37℃，5％CO2条件下培养4小时。弃去培养基，每孔加入100μl PBS溶液洗涤培养板后弃去。洗涤两次，每孔再加入100μl PBS溶液。用Spectra Max I3酶标仪，读取荧光值。
所获得的荧光值原始数据在下表4中列出，并用GraphPad Prism6软件对表4中所公开的数据进行分析作图，从而得到图2。从实验结果可知，与未加抗PCSK9抗体的荧光值相比，抗PCSK9抗体(ADI-10085、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089)作用HepG2细胞的情况下荧光值增强约两倍。这些数据证明本申请所公开的各个抗PCSK9抗体在HepG2细胞中可以增加LDLR的恢复能力，抑制了PCSK9诱导的LDL-c摄入降低，从而使得HepG2细胞增加对LDL-c的摄取，并且在16.8nM和66.7nM的梯度，其效果均优于阳性对照抗体。
表4:荧光信号值
Figure BDA0001658222300000242
Figure BDA0001658222300000251
实施例5.细胞LDLR内化分析实验
PCSK9能与LDLR直接结合促使LDLR内化，进入肝细胞后运至溶酶体降解，从而减少细胞表面表达的LDLR，增加血清中LDL-c的水平。抗PCSK9抗体阻断PCSK9与LDLR的结合，从而降低PCSK9消耗LDLR的能力，本实验通过使CHO-LDLR细胞与抗PCSK9抗体及PCSK9蛋白溶液共同孵育，采用上述流式细胞仪检测LDLR的荧光值，比较抗PCSK9抗体与阳性对照抗体(Evolocumab)荧光值，来判断抗PCSK9抗体对细胞LDLR内化的生物活性。
使用RPMI 1640细胞培养基(Gibco)将实施例1所述PCSK9蛋白配置为浓度50μg/ml，将60μl，1000nm的抗PCSK9抗体(ADI-10085和ADI-10087)与PCSK9(50μg/ml)溶液混合，均匀后孵育30分钟，对阳性抗体对照进行相同处理。取CHO细胞和CHO-LDLR细胞分别离心，500g室温离心3分钟，用PBS溶液重悬细胞并调整细胞密度至2×106个/ml，加入 96孔U型板中，100μl/孔，将上述混合的样品100μl/孔加入至培养板中，一式四份，吹打均匀，4℃孵育4小时。之后用200μl的PBS溶液洗3次，500g室温离心3分钟。取5μl抗-LDLR-PE (北京义翘公司，货号20131-R301-P)加入100μl PBS溶液中稀释，然后每孔100μl加入 96孔U型板中，避光孵育30分钟。再用200μl的PBS溶液洗3次，500g离心3分钟，用细胞培养基重悬所得到的细胞，并采用流式细胞仪检测CHO-LDLR细胞表面标记PE荧光的 LDLR蛋白的荧光信号，实验结果请参见表5。将表5原始数据用GraphPad Prism6软件进行分析作图获得图3。
根据表5的结果可见，本申请获得的抗体有效阻止了细胞的LDLR内化。
表5:荧光信号值
Figure BDA0001658222300000252
实施例6抗PCSK9抗体对健康SD大鼠的降血脂作用
将受试抗体(抗PCSK9抗体ADI-10087)按照本领域常规方法施用给SPF级SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，其中雌性大鼠体重约254～294g，约9～12周龄；雄性大鼠体重约369～420g，约9～12周龄。各组均为单次给药，给药方案详见表6。
表6:剂量设计与给药
Figure BDA0001658222300000253
Figure BDA0001658222300000261
各组动物按以下时间点根据常规方法颈静脉采血：给药前0h(D1)，给药后72h(D4)、 168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)。收集至无抗凝剂的试管中，冰上放置凝结后2～8℃，5000rpm/min离心10分钟，收集血清，用Hitachi-7060型自动生化分析仪进行LDL-C和HDL-C的测定。根据血脂分析数据，计算各时间点LDL-C和 HDL-C相对给药前(基线)变化率(％LDL-C和％HDL-C)。根据实验结果发现，大鼠单次皮下给予3～30mg/kg本申请的抗PCSK9抗体后，能够剂量依赖地降低血清LDL-C和HDL-C 水平(图6和图7)。例如分别在给药后3天、7天、14天、21天较基线水平有显著降低。此外，申请人同时发现当大鼠单次皮下给予10mg/kg Evolocumab后，血清LDL-C和HDL-C 水平并无显著降低。
对于本发明的其它抗体，也可以应用同样的方法进行上述测定。
实施例7抗PCSK9抗体对健康食蟹猴的降血脂作用
将受试抗体(抗PCSK9抗体ADI-10087)按照本领域常规方法施用给食蟹猴(广东春盛生物科技发展有限公司)，其中雌性动物体重约2-4kg，年龄约3-5岁，雄性动物体重约3-5kg，年龄约3-5岁。给药方案请参见表7，其中组1～5为单次给药，组6为每周1次给药，共4次给药。
表7:剂量设计与给药
Figure BDA0001658222300000262
针对组1～5，在以下时间点按照常规方法从动物的给药肢体的对侧前肢或后肢皮下静脉或腹股沟股动脉/腹股沟静脉采血：给药前0h及给药后24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)、1008h(D43)、 1176h(D50)及1344h(D57)。关于组6，在以下时间点按照上述方法采血：首次给药前0h 及给药后24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、168h(D8，第2次给药前)、336h(D15，第3次给药前)取血。末次给药于给药前0h，给药开始后24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、 168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)、1008h(D43)、 1176h(D50)及1344h(D57)采血。
收集全血至含促凝剂和分离胶的试管中，冰上放置凝结后2～8℃离心，5000rpm/min，离心10min，收集血清。全部血样采集完成后，进行总胆固醇(TC)、LDL-C、HDL-C的测定。根据血脂分析数据，计算各时间点LDL-C和HDL-C相对于给药前(基线)变化率(％LDL-C和％HDL-C)。根据实验结果发现：食蟹猴单次皮下给予3、10、30mg/kg本申请的抗PCSK9 抗体(ADI-10087)后，血清LDL-C(图8)和TC(图10)水平均显著降低，并呈现出较为明显的量效关系，在给药后3～28天较基线水平有显著降低。表明，本申请公开的抗体可以有效用于降低与LDL-C和TC相关的状况和/或病症，例如用于降低血脂。
抗PCSK9抗体给药后对食蟹猴血清HDL-C水平总体上无明显影响(图9)。
然而本申请人惊奇地发现，食蟹猴单次皮下分别给予10mg/kg本申请的抗PCSK9抗体和 Evolocumab后，发现Evolocumab给药后LDL-C呈现较基线水平显著降低的时间段仅为14 天，短于同剂量本申请抗体给药后的21天，即本申请的抗PCSK9抗体显著降低LDL-C的时间长于Evolocumab。
对于本发明的其它抗体，也可以应用同样的方法进行上述测定。
实施例8：本发明的抗PCSK9抗体液体制剂(制剂A)的制备
根据处方A配制浓度为150mg/ml的抗PCSK9液体制剂
处方A
Figure BDA0001658222300000271
将从实施例2获得的抗PCSK9抗体(ADI-10087)加入到超滤离心管中(截流分子量30KD)，离心浓缩后加入无聚山梨酯80和抗PCSK9抗体的处方A水溶液(1.5g/L组氨酸，90mmol/L精氨酸，3％山梨醇，pH 5.5)稀释后继续浓缩，如此反复，直至置换完全。将置换后的蛋白调整到150mg/ml后加入1/100体积的聚山梨酯80水溶液(30g/L)，使聚山梨酯 80的终浓度为0.3g/L。将此半成品无菌过滤后分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得成品。
实施例9：本发明的抗PCSK9抗体液体制剂的对比例(制剂B)的制备
对比例：根据处方B配制浓度为150mg/ml的抗PCSK9液体制剂
处方B
Figure BDA0001658222300000272
将从实施例2获得的抗PCSK9抗体(ADI-10087)加入到超滤离心管中(截流分子量30KD)，离心浓缩后加入无聚山梨酯80和抗PCSK9抗体的处方B水溶液(1.5g/L组氨酸，180mmol/L精氨酸，pH 5.5)稀释后继续浓缩，如此反复，直至置换完全。将置换后的蛋白调整到150mg/ml后加入1/100体积的聚山梨酯80水溶液(30g/L)，使聚山梨酯80的终浓度为0.3g/L。将此半成品无菌过滤后分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得成品。
实施例10：抗PCSK9抗体液体制剂的粘度测定
采用锥板粘度计(Brookfield，CAP1000+/2000+，详情见 http://www.sinoinstrument.com/product_details-4-83-401-60.html)在室温20～25℃下进行粘度测定。选择转子和速度(转子：cp-40；转速：25rpm)。将转子连接到连接螺母上，调节位置，加入样品。按下Run按键，进行样品粘度测定。根据上面实验测得制剂A的粘度为5.2厘泊，制剂B的粘度为6.0厘泊。令人惊奇的是，制剂A的粘度明显小于制剂B的粘度，表明精氨酸和山梨醇的组合更有利于降低高浓度抗体制剂的粘度。
实施例11：抗PCSK9抗体液体制剂的蛋白纯度变化
为了考查制剂A和制剂B的稳定性，进行了加速稳定性实验。将分装至西林瓶中并加塞轧盖后的制剂A和制剂B成品置于在40℃±2℃/60％RH±5％RH条件下进行加速稳定性考察，考察时间持续2个月。期间通过下述的SEC-HPLC法、非还原型CE-SDS法测定蛋白纯度的变化。
SEC-HPLC法：
将样品浓度稀释至2mg/ml，用亲水硅胶体积排阻色谱柱TSKG 3000SWxl，蛋白进样量 100μg，流动相为20mmol/L Na2HPO4·12H2O、150mmol/L NaCl、200mmol/L精氨酸，pH6.8，流速0.5ml/分钟，检测波长280nm，柱温25℃，用面积归一化法计算。
CE-SDS法：
取样品约100μg，加pH7.0样品缓冲液使总体积为95ul，还原样品加5μlβ-巯基乙醇，非还原样品加5μl 250mmol/L NEM，混合后70℃加热10分钟，进行检测。
在SEC-HPLC法中，基于SEC主峰下降百分比，测得蛋白纯度变化，制剂A的蛋白纯度在1个月时下降2.6％，在2个月时下降3.7％。而制剂B的蛋白纯度在1个月时下降4.1％，在2个月时下降7.0％。基于非还原CE-SDS下降百分比，测得蛋白纯度变化，制剂A的蛋白纯度在2周时下降0.4％，在1个月时下降2.0％。而制剂B的蛋白纯度在2周时下降2.5％，在1个月时下降7.3％。可见，制剂A的纯度变化速率显著慢于制剂B。相对于制剂B，制剂 A具有更高的稳定性。
实施例12：抗PCSK9抗体液体制剂的电荷异质性测定
在不同时间点，从实施例11中进行加速稳定性实验的制剂A和制剂B取样，进行电荷异质性检测。采用Beckman Uncoated Capillary毛细管，Beckman PA800plus毛细管电泳仪，取样电压为0.5psi，取样时间10.0s，分离电压30kV，分析时间30min。用面积归一化法计算酸性组分、碱性组分与主峰的峰面积占总峰面积的百分比。制剂A在2周时CZE主峰下降0％，在1个月时下降2.9％。而制剂B在2周时CZE主峰下降2.0％，在1个月时下降7.6％。
可以看到制剂A的电荷异质性变化速率显著慢于制剂B，可见精氨酸和山梨醇的组合使得制剂更少发生电荷异质性变化。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
序 列 表
<110> 信达生物制药（苏州）有限公司
<120> 抗PCSK9抗体及其用途
<130> PF 180008CNI
<160> 53
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 1
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 2
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR3
<400> 3
Ala Arg Glu Gly Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区CDR1
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区CDR2
<400> 5
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区CDR3
<400> 6
Gln Gln Arg Arg Asn Trp Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 7
Gly Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 8
Gly Ser Ile Val Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 9
Gly Ser Ile Arg Ser Ser Ala Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 10
Gly Ser Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 11
Gly Ser Ile Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 12
Gly Ser Ile Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Thr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<400> 13
Gly Ser Ile Trp Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 14
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Phe Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 15
Ser Ala Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 16
Ser Ile Asn Tyr Lys Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<400> 17
Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR3
<400> 18
Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR3
<400> 19
Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X1选自V和I
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> X2选自S、V、R、G、W
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X3选自S或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X4选自S或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X5选自G、A、S或T
<400> 20
Gly Ser X1 X2 Ser X3 X4 Tyr Tyr Trp X5
1 5 10
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> X1选自I或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X2选自Y和N
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> X3选自S、K和R
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> X4选自S和F
<400> 21
Ser X1 X2 Tyr X3 Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro X4 Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> X1选自G和N
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> X2选自D和G
<400> 22
Ala Arg Glu X1 Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe
1 5 10 15
X2 Pro
<210> 23
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-02396的重链可变区
<400> 23
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-09111的重链可变区
<400> 25
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-09112的重链可变区
<400> 26
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Phe
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-09113的重链可变区
<400> 27
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10085的重链可变区
<400> 28
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Val Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Lys Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10086的重链可变区
<400> 29
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Ala Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10087的重链可变区
<400> 30
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 31
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10088的重链可变区
<400> 31
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 32
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10089的重链可变区
<400> 32
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10090的重链可变区
<400> 33
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Trp Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 34
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-02396的重链
<400> 34
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 35
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 35
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> 人工序列
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<400> 36
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
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Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
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130 135 140
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420 425 430
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435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 39
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10085重链
<400> 39
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Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 40
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10086重链
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Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
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115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
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Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 41
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10087重链
<400> 41
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
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Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
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180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
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245 250 255
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Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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420 425 430
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Ser Pro Gly
450
<210> 42
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10088重链
<400> 42
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165 170 175
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195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 43
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10089重链
<400> 43
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
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85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
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130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 44
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADI-10090重链
<400> 44
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Trp Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区FR1
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
20 25
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区FR2
<400> 46
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区FR3
<400> 47
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区FR4
<400> 48
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区FR1
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区FR2
<400> 50
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区FR3
<400> 51
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区FR4
<400> 52
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 692
<212> PRT
<220>
<223> PCSK9抗原的氨基酸序列
<400> 53
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln
690

Claims (33)

1.一种液体抗体制剂，其包含
(i)抗PCSK-9抗体或其抗原结合片段，所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中
所述VH包含互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，且HCDR3由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成；
所述VL包含互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；LCDR2由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；LCDR3由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成；
(ii)缓冲剂；
(iii)减粘剂；和
(iv)表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的液体抗体制剂，其中该抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中，
所述重链可变区VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成；
所述轻链可变区VL包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成。
3.根据权利要求1所述的液体抗体制剂，其中该抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由其组成；
所述轻链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由其组成。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为50至200mg/mL，所述缓冲剂的浓度为0.01-50mg/ml,和所述减粘剂的浓度为10mmol/L-1000mmol/L。
5.根据权利要求4所述的液体抗体制剂，其特征在于所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为100mg/mL至200mg/mL，所述缓冲剂的浓度为0.1-50mg/ml,和所述减粘剂的浓度为20mmol/L-500mmol/L。
6.根据权利要求4所述的液体抗体制剂，其特征在于所述缓冲剂选自组氨酸、谷氨酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和三羟甲基氨基甲烷。
7.根据权利要求6所述的液体抗体制剂，其特征在于所述缓冲剂为组氨酸。
8.根据权利要求4所述的液体抗体制剂，其特征在于所述减粘剂选自糖醇、精氨酸、精氨酸盐酸盐、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠和其组合。
9.根据权利要求5-7中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于所述减粘剂选自糖醇、精氨酸、精氨酸盐酸盐、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠和其组合。
10.根据权利要求9所述的液体抗体制剂，其特征在于所述糖醇是山梨醇。
11.根据权利要求10所述的液体抗体制剂，其特征在于所述减粘剂是浓度为1％-6％(w/v)的山梨醇。
12.根据权利要求10所述的液体抗体制剂，其特征在于所述减粘剂是山梨醇与精氨酸或精氨酸盐的组合。
13.根据权利要求12所述的液体抗体制剂，其中所述精氨酸盐为精氨酸盐酸盐。
14.根据权利要求12所述的液体抗体制剂，其特征在于所述山梨醇的浓度为1％-6％(w/v)；所述精氨酸或精氨酸盐的浓度为50mmol/L～180mmol/L。
15.根据权利要求14所述的液体抗体制剂，其特征在于所述山梨醇的浓度为2％-4％(w/v)，所述精氨酸或精氨酸盐的浓度为70mmol/L～150mmol/L。
16.根据权利要求15所述的液体抗体制剂，其特征在于所述山梨醇的浓度为3％(w/v)；所述精氨酸或精氨酸盐的浓度为90mmol/L。
17.根据权利要求1-3、5-8和10-16中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于所述表面活性剂的浓度为0.01-5mg/ml。
18.根据权利要求17所述的液体抗体制剂，其特征在于所述表面活性剂的浓度为0.05-1mg/ml。
19.根据权利要求1-3、5-8、10-16和18中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
20.根据权利要求19所述的液体抗体制剂，其特征在于所述表面活性剂选自普洛尼克、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、或聚山梨醇酯-20。
21.根据权利要求1-3、5-8、10-16、18和20中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于所述液体制剂的pH值为5.0～6.0。
22.根据权利要求21所述的液体抗体制剂，其特征在于所述液体制剂的pH值为5.2-5.8。
23.根据权利要求21所述的液体抗体制剂，其特征在于所述液体制剂在25℃的粘度为1.0厘泊-20厘泊。
24.根据权利要求23所述的液体抗体制剂，其特征在于所述液体制剂在25℃的粘度为1.0厘泊-10厘泊。
25.根据权利要求4所述的液体抗体制剂，其特征在于
(i)所述抗PCSK-9抗体或其抗原结合片段的浓度为100mg/mL至200mg/mL；
(ii)所述缓冲剂为组氨酸，其浓度为0.2-10mg/ml；
(iii)所述减粘剂为山梨醇，其浓度为1％-6％(w/v)；和
(iv)所述的表面活性剂是聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20，其浓度为0.05-1mg/ml；
其中所述液体制剂的pH为5.0～6.0。
26.根据权利要求4所述的液体抗体制剂，其特征在于
(i)所述抗PCSK-9抗体或其抗原结合片段的浓度为100mg/mL至200mg/mL；
(ii)所述缓冲剂为组氨酸，其浓度为0.2-10mg/ml；
(iii)所述减粘剂为山梨醇与精氨酸或精氨酸盐的组合，所述山梨醇的浓度为1％-6％(w/v)，所述精氨酸或精氨酸盐的浓度为50mmol/L～180mmol/L；和
(iv)所述的表面活性剂是聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20，其浓度为0.05-1mg/ml；
其中所述液体制剂的pH为5.0～6.0。
27.根据权利要求1-3、5-8、10-16、18、20、22-26中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体制剂为药物制剂。
28.根据权利要求27所述的液体抗体制剂，特征在于所述药物制剂为注射剂。
29.根据权利要求28所述的液体抗体制剂，特征在于所述注射剂为皮下注射剂。
30.根据权利要求1-3、5-8、10-16、18、20、22-26和28-29中任一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗PCSK9抗体为单克隆抗体。
31.一种固体制剂，其由权利要求1-30中任何一项所述的液体抗体制剂冻干而获得。
32.权利要求1-30中任何一项所述的液体抗体制剂制备用于在受试者中降低受试者的胆固醇水平的药物的用途。
33.权利要求1-30中任何一项所述的液体抗体制剂制备用于治疗胆固醇相关疾病的药物中的用途，其中所述胆固醇相关疾病选自高胆固醇血症和高脂血症。
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