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JP6557664B2 - 一価の血液脳関門シャトルモジュール - Google Patents

一価の血液脳関門シャトルモジュール Download PDF

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Description

本発明は、血液脳関門レセプター（ＢＢＢＲ）に特異的に結合する１つの結合特異性を有し、この結合特異性に関して一価である血液脳関門シャトルモジュール、ならびに、この構築物を血液脳関門シャトルとして、及び、神経疾患の処置に使用する方法に関する。
低い脳への浸透性を有する神経疾患薬、例えば、大型のバイオ医薬又は小分子剤等の脳への浸透は、神経血管系単位（ＮＶＵ）における他の細胞コンポーネントと共に、広範で、不浸透性の血液脳関門（ＢＢＢ）により、厳密に制限されている。この障害を克服するための多くの戦略が試されてきた。その１つが、脳毛細管内皮に発現している内在性レセプター（血液脳関門レセプター）により媒介されるトランスサイトーシス経路を使用するものである。脳へのバイオ医薬のレセプター媒介性送達を可能にするリコンビナントタンパク質、例えば、モノクローナル抗体又はペプチドが、これらのレセプターに対して設計されてきた。しかしながら、脳内皮細胞（ＢＥＣ）への誤った局在化と、ＢＥＣにおける特定の細胞小器官（特に、バイオ医薬の分解をもたらす小器官）への蓄積の程度とを最小化し、かつ、脳の取込みを最大化する戦略は、未探索のままである。
モノクローナル抗体及び他のバイオ医薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）における病理の処置に大きな治療的可能性を有する。しかしながら、これらバイオ医薬の脳への経路は、ＢＢＢにより妨げられる。以前の研究では、血流に注入された内の非常に小さな割合（約０．１％）のＩｇＧしか、ＣＮＳ区画内に浸透することができないことが例証されている（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164）（非特許文献１）。このことは、ＣＮＳ内の抗体が低濃度であるため、どのような薬理学的作用も間違いなく制約するであろう。
したがって、ＢＢＢを通過させて、脳内に効率的に薬剤を輸送する神経疾患薬の送達システムについての必要性が存在する。
国際公開公報第２０１４／０３３０７４号（特許文献１）には、血液脳関門シャトルが報告されている。
マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体及びその可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Ｌ５９６Ｖ及びＬ５９８Ｉ）が、Boado, R.J., et al.（Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258）（非特許文献２）により報告されている。
国際公開公報第２０１４／０３３０７４号
Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164 Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258
本発明の一態様は、脳エフェクター実体と、リンカーと、血液脳関門レセプターに結合する１つの一価の結合実体とを含む血液脳関門シャトルモジュールであって、ここで、リンカーが、エフェクター実体を、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体に連結しており、ここで、一価の結合実体が、抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３（配列番号０１及び配列番号０２）又は変異型抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３ｖ（配列番号０１及び配列番号０３）の可変ドメインを含まない、血液脳関門シャトルモジュールである。
抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３は、下記アミノ酸配列：
EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS
（配列番号０１）
を有する重鎖可変ドメインを有する。
抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３は、下記アミノ酸配列：
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK
（配列番号０２）
を有する軽鎖可変ドメインを有する。
変異型抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３ｖは、抗体８Ｄ３と同じ重鎖可変ドメインと、下記アミノ酸配列：
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK
（配列番号０３）
を有する、突然変異Ｌ１０４Ｖ及びＬ１０６Ｉを含む軽鎖可変ドメインとを有する。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、ポリペプチドである。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、血液脳関門レセプターリガンド、全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、及びＶＨＨからなる群より選択される分子を含む。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される。一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプターである。
一実施態様では、一価の結合実体は、ヒトトランスフェリンレセプター及びカニクイザルトランスフェリンレセプターに特異的に結合する。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、トランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦａｂ、特に、配列番号０４、０５、又は０６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープに特異的に結合するｓｃＦａｂを含む。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、トランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦｖ、特に、配列番号０４、０５又は０６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプター中のエピトープを認識するｓｃＦｖを含む。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、脳エフェクター実体は、神経疾患薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞毒、脳ターゲットに対する抗体、脳ターゲットに対するモノクローナル抗体、脳ターゲットに対するペプチドからなる群より選択される。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、脳ターゲットは、β−セクレターゼ１、Ａβ（Ａベータ）、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、ｔａｕ、リン酸化ｔａｕ、リン酸化ｔａｕ（ｐＳ４２２）、アポリポタンパク質Ｅ４、アルファシヌクレイン、アルファシヌクレインのオリゴマーフラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６からなる群より選択される。
血液脳関門シャトルモジュールの特定の実施態様では、脳エフェクター実体は、ポリペプチドである。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、ポリペプチドであり、該一価の結合実体は、直接脳エフェクター実体のＣ末端にコンジュゲートしているか、又は、リンカーを介して脳エフェクター実体のＣ末端にコンジュゲートしているかのいずれかである。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、脳エフェクター実体は、脳ターゲットに対する全長抗体を含む。一実施態様では、全長抗体は、ＩｇＧである。
血液脳関門シャトルモジュールの好ましい一実施態様では、血液脳関門シャトルは、脳エフェクター実体として全長ＩｇＧ抗体と、リンカーと、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体として１つのｓｃＦａｂとを含み、ここで、ｓｃＦａｂは、リンカーを介して、ＩｇＧ抗体の一方の重鎖のＦｃ領域のＣ末端にコンジュゲートしている。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体における第１重鎖は、第１二量体化モジュールを含み、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体における第２重鎖は、第２二量体化モジュールを含み、該２つの重鎖のヘテロ二量体化が可能である。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体における第１重鎖の第１二量体化モジュールは、ノブを含み、脳ターゲットに対する血液脳関門シャトルの抗体における第２重鎖の第２二量体化モジュールは、ノブ−ｉｎｔｏ−ホール戦略に基づくホールを含む。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも２５個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、３０〜５０個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号０７）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号０８）である。
下記３つの実施態様は、脳エフェクター実体が、全長抗体でない、特に、全長ＩｇＧでないという条件で、脳エフェクター実体がポリペプチドである、血液脳関門シャトルモジュールを対象にしている。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、血液脳関門レセプターに結合するＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体及び１つのｓｃＦａｂ（第１リンカーを含む）を含み、ここで、ｓｃＦａｂは、第２リンカーによりＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＣ末端に連結している。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、血液脳関門シャトルは、脳エフェクター実体と、リンカーと、血液脳関門レセプターに結合するＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメイン、第２リンカー、及び１つのｓｃＦａｂとを含み、ここで、脳エフェクター実体は、第１リンカーにより、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＮ末端にコンジュゲートしており、ｓｃＦａｂは、第２リンカーにより、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端にコンジュゲートしている。
血液脳関門シャトルモジュールの一実施態様では、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体は、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ実体である。
本発明の更なる態様は、本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールをコードする（単離された）核酸、血液脳関門シャトルモジュールをコードする（単離された）核酸を含むホスト細胞、及び血液脳関門シャトルモジュールを含む医薬製剤である。
本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールは、医薬として使用する場合があり、特に、神経疾患、例えば、アルツハイマー病等の処置に使用する場合がある。
本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門を通過させて、脳エフェクター実体を輸送することができる。
特定の実施態様では、本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールにおけるＩｇＧ抗体の重鎖は、そのＦｃ領域のＣ末端において、血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体としてのｓｃＦａｂにコンジュゲートしており、下記構造：
− ＩｇＧ重鎖と、
− ＩｇＧ重鎖におけるＦｃ領域のＣ末端をｓｃＦａｂにおけるＶＬドメインのＮ末端にコンジュゲートしているリンカーと、
− ｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及びＣ−カッパ軽鎖ドメインと、
− ｓｃＦａｂにおけるＣ−カッパ軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦａｂにおけるＶＨドメインのＮ末端にコンジュゲートしているリンカーと、
ｓｃＦａｂ抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及びＩｇＧ ＣＨ１重鎖ドメインと、
を有する。
本明細書に報告されている一態様は、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体と、リンカーと、血液脳関門レセプターに特異的に結合する１つのｓｃＦａｂとを含み、ここで、ｓｃＦａｂが、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＣ末端にリンカーによりコンジュゲートしており、ここで、ｓｃＦａｂが、抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３（配列番号０１及び配列番号０２）又は変異型抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３ｖ（配列番号０１及び配列番号０３）の可変ドメインを含まない、血液脳関門を通過させて脳エフェクター実体を輸送する融合ポリペプチドである。
本明細書に報告されている一態様は、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体と、リンカーと、血液脳関門レセプターに特異的に結合する１つのｓｃＦｖとを含み、ここで、ｓｃＦｖが、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＣ末端にリンカーによりコンジュゲートしており、ここで、ｓｃＦｖが、抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３（配列番号０１及び配列番号０２）又は変異型抗トランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３ｖ（配列番号０１及び配列番号０３）の可変ドメインを含まない、血液脳関門を通過させて脳エフェクター実体を輸送する融合ポリペプチドである。
一実施態様では、融合ポリペプチドは、脳エフェクター実体をＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＮ末端にコンジュゲートしている、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＮ末端におけるリンカーを更に含む。
融合ポリペプチドの一実施態様では、脳エフェクター実体は、神経疾患薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞毒、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２からなる群より選択される、脳ターゲットに対する抗体フラグメント又はペプチドからなる群より選択される。
融合ポリペプチドの一実施態様では、血液脳関門レセプターに特異的に結合するｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、トランスフェリンレセプターに特異的に結合する。一実施態様では、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、配列番号０４、０５、又は０６のアミノ酸配列内に含まれる、トランスフェリンレセプターのエピトープに特異的に結合する。
融合ポリペプチドの実施態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、２０〜５０個のアミノ酸長を有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号０７）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号０８）を有する。
融合ポリペプチドの一実施態様では、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体は、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ実体である。
本発明の更なる態様は、本明細書に報告されている融合ポリペプチドをコードする単離された核酸及び本明細書に報告されている融合ポリペプチドをコードする核酸を含むホスト細胞である。
本明細書に報告されている一態様は、本明細書に報告されている融合ポリペプチドと、本明細書に報告されている融合ポリペプチドのＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＮ末端にリンカーを介してコンジュゲートしている脳エフェクター実体とを含む、コンジュゲートである。
コンジュゲートの一実施態様では、脳エフェクター実体は、神経栄養因子であり、神経栄養因子をＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体のＮ末端にコンジュゲートしているリンカーは、ペプチドリンカーである。
本発明の更なる態様は、本明細書に報告されているコンジュゲートと、薬学的担体とを含む医薬製剤、本明細書に報告されているコンジュゲートの使用、特に、神経変性障害、特にアルツハイマー病を処置するためのコンジュゲートの使用である。
血液脳関門レセプターに特異的に結合する一価の結合実体は、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかで、抗体における軽鎖又は重鎖の任意の末端にコンジュゲートすることができる。一実施態様では、一価の結合実体は、重鎖のＣ末端にコンジュゲートしている。
抗体における重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫを有する、完全なＣ末端である場合がある。重鎖のＣ末端は、１又は２つのＣ末端アミノ酸残基が除去されている、短縮されたＣ末端である場合がある。一実施態様では、重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧを有する短縮されたＣ末端である。
一価の結合実体は、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかで、各抗体鎖にコンジュゲートすることができる。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号０９）を有する。
一価の結合実体は、抗体ｓｃＦｖフラグメントである場合がある。一実施態様では、一価の結合実体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、軽鎖可変ドメイン−軽鎖定常ドメイン−ペプチドリンカー−重鎖可変ドメイン−重鎖定常ドメイン１を含むｓｃＦｖである。
一実施態様では、一価の結合実体は、（Ｇ４Ｓ）６ペプチドリンカー（配列番号１０）を有する、抗トランスフェリンレセプター抗体のｓｃＦｖフラグメントである。
一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される。一実施態様では、血液脳関門レセプターは、ヒトの血液脳関門レセプターである。一実施態様では、血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプターであり、抗体は、トランスフェリンレセプターのトランスフェリンへの結合を阻害しない。一実施態様では、血液脳関門レセプターは、ヒトのトランスフェリンレセプターである。
一実施態様では、一価の結合実体を脳エフェクター実体にコンジュゲートしているペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、１８〜２５個のアミノ酸長を有する。
一実施態様では、脳エフェクター実体は、全長抗体である。一実施態様では、脳エフェクター実体は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ４の全長抗体である。
一実施態様では、一価の結合実体は、抗血液脳関門レセプター抗体又はその血液脳関門レセプター結合フラグメントである。一実施態様では、抗血液脳関門レセプター抗体又はそのフラグメントは、血液脳関門レセプターの１つ以上のそのネイティブなリガンドへの結合を損なわない。別の実施態様では、抗血液脳関門レセプター抗体は、ヒトトランスフェリンレセプターのヒトトランスフェリンへの結合を阻害しないような方法で、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する。
一実施態様では、血液脳関門シャトルモジュールは、エフェクターにサイレントである。
一実施態様では、脳エフェクター実体は、Ｆｃ領域を含む全長抗体であり、ここで、Ｆｃ領域がヒトのサブクラスＩｇＧ１のものである場合には、Ｆｃ領域が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ(ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング)を含み、又は、Ｆｃ領域がヒトのサブクラスＩｇＧ４のものである場合には、Ｆｃ領域が、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ(ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング)を含む。
図１は本発明の実施例のアッセイ法のスキームを示す概略図である。
Ｉ．定義
本明細書における目的で、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されているヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、又は、同フレームワークは、アミノ酸配列の変化を含有してもよい。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。一部の実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して同一の配列である。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間における非共有的相互作用の総計強度を意味する。特に断りない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対メンバー（例えば、抗体と抗原）間における１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を意味する。分子ＸとそのパートナーＹとの親和性は、一般的には、解離定数（Ｋｄ）により表現することができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含めて、当技術分野において公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例となり、かつ、例示的な実施態様は、以下に記載されている。
「親和性成熟」抗体は、このような変異を有さない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において、１つ以上の変異を有する抗体を意味する。このような変異は、抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味に使用され、種々の抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ；直線抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むがこれらに限定されない。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定のソース又は種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残り部分が、異なるソース又は種に由来する抗体を意味する。
抗体の「クラス」は、その重鎖により保有されている定常ドメイン又は定常領域の種類を意味する。５つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分割することができる。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する、それらの生物学的活性を意味する。同Ｆｃ領域は、抗体クラスにより変化する。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な用量及び期間において、有用な量を意味する。
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異型のＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に広がっている。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、又は、存在しなくてもよい。本明細書において特に断りない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されており、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的には、ＶＨ（又はＶＬ）における下記配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で表される。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造と実質的に同じ構造を有するか、又は、本明細書に定義されているＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味するのに、本明細書において互換的に使用される。
「ホスト細胞」、「ホスト細胞株」、及び「ホスト細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を意味し、このような細胞の子孫を含む。ホスト細胞は、「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」を含む。トランスフォーメーションされた細胞は、初代のトランスフォーメーションされた細胞と、継代回数に関わらずそれ由来の子孫とを含む。子孫は、核酸含量において、親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。元のトランスフォーメーションされた細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫は、本明細書に含まれる。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に出現するアミノ酸残基を表現するフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、サブグループの可変ドメイン配列からである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3におけるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは、前記Kabat et al.,におけるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは、前記Kabat et al.,におけるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を意味する。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。その中で、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部又は実質的に全部が、非ヒト抗体のそれらに対応し、ＦＲの全部又は実質的に全部が、ヒト抗体のそれらに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を意味する。
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は、抗原接触残基（「抗原コンタクト」）を含有する、抗体の可変ドメインの各領域を意味する。一般的には、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。
本明細書において、ＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において生じる超可変ループ（Chothia、C. and Lesk、A.M. 、J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917）と、
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）において生じるＣＤＲ（Kabat、E.A. et al. 、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991) 、NIH Publication 91-3242）と、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）において生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）と、
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせとを
含む。
特に断りない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、前記Kobat et al.,に従ってナンバリングされる。
「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。
「単離された抗体」は、その本来の環境の成分から分離されているものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定された場合、９５％又は９９％より高い純度に精製される。抗体純度を評価するためのレビュー方法については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
「単離された核酸」は、その本来の環境の成分から分離されている核酸分子を意味する。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有されるが、この核酸分子が、染色体外又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、自然発生的に生じる変異を含有し、又は、モノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性ある変異型抗体を除いて、同一であり、及び／又は、同じエピトープに結合する。このような変異体は、一般的には、少量しか存在しない。種々の決定因子（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定因子を対象にする。このため、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に基づいて使用されるモノクローナル抗体は、各種の技術により調製することができる。同技術は、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない。モノクローナル抗体を調製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイティブな抗体」は、さまざまな構造を有する、天然の免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続けて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続けて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の内の１つに割り当てることができる。
「添付文書」という用語は、治療剤製品の商業的な梱包に習慣的に含まれる説明書を意味するのに使用され、適用症、用途、用量、投与、組み合わせ治療、禁忌、及び／又はこのような治療剤製品の使用に関する警告についての情報を含有する。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮せずに、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセント同一性を達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアライメントは、当業者の範囲内にある種々の方法で、例えば、公衆に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。同パラメータは、比較される配列の全長に対する最大アライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む。ただし、本明細書の目的で、％ アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALING-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.,により作製され、ソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559にユーザ文書としてファイルされており、同ソースコードは、著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公衆に利用可能であり、又は、ソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むＵＮＩＸオペレイティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定されており、変更できない。
ALIGN-2がアミノ酸配列比較に利用される状況において、所定のアミノ酸配列Ｂに対する、同配列Ｂと共に、又は、同配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａの％ アミノ酸配列同一性（％ アミノ酸配列同一性は、所定のアミノ酸配列Ｂに対する、同配列Ｂと共に、又は、同配列Ｂに対する、特定の％ アミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａとして代替的に表現することができる）は、下記のように算出される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムALIGN-2により、Ａ及びＢのそのプラグラムアライメントにおいて、同一マッチとしてスコアされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さは、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくなく、Ｂに対するＡの％ アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％ アミノ酸配列同一性と等しくないであろうことを理解されたい。特に断りない限り、本明細書において使用される全ての％ アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されているように得られる。
「医薬製剤」という用語は、有効であるようにそれに含有される活性成分の生物学的活性を可能にするような形態にあり、この製剤が投与されるであろう対象に許容できない毒性を有する更なる成分を含有しない調製物を意味する。
「薬学的に許容し得る担体」は、活性成分以外の医薬製剤中の成分を意味し、対象に対して毒性を有さない。薬学的に許容し得る担体は、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「処置」（及びその文法上のバリエーション、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の本来の経過を変化させる試みにおける臨床的介在を意味し、予防又は臨床病理の経過中のいずれかにおいて行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を予防すること、兆候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患の進展速度の低下、疾患状態の改善又は寛解及び緩和又は改善された予後を含むがこれらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾患の進行を遅延させ、又は、疾患の進展を遅れさせるのに使用される。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に抗体を結合させるのに関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的には、４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む各ドメインを有する類似構造を有する（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。１つのＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合がある。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補なＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリをスクリーニングするための抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を伝播可能な核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構築物としてのベクターと、それが導入されるホスト細胞のゲノム内に組み込まれるベクターとを含む。特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現に向けさせることができる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
「血液脳関門（ＢＢＢ）」という用語は、周辺環境と脳及び脊髄との間の生理学的な関門を意味し、脳の毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションにより形成され、尿素（６０ダルトン）等の非常に小さな分子であっても、脳への分子の輸送を制限するタイトな関門を生じさせる。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、ＣＮＳ内の連続する毛細血管関門であり、本明細書においてまとめて、血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢは、血液ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。この場合、同関門は、毛細血管内皮細胞よりむしろ上衣細胞に含まれる。
「中枢神経系（ＣＮＳ）」という用語は、身体機能をコントロールする神経組織の複雑系を意味し、脳及び脊髄を含む。
「血液脳関門レセプター（ＢＢＢＲ）」という用語は、ＢＢＢを通過させて分子を輸送可能であるか、又は、外来的に投与された分子を輸送するのに使用される、脳の内皮細胞上に発現している細胞外膜結合レセプタータンパク質を意味する。ＢＢＢＲの例は、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含むがこれらに限定されない低密度リポタンパク質レセプター、ならびにヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含むがこれらに限定されない。例示的なＢＢＢＲは、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）である。
「脳エフェクター実体」という用語は、ＢＢＢを通過させて脳に輸送される分子を意味する。同エフェクター実体は、典型的には、脳に輸送されるのが望ましい特徴的な治療活性を有する。エフェクター実体は、神経疾患薬、細胞毒、例えば、脳ターゲットに対するポリペプチド及び抗体、特に、モノクローナル抗体又はそのフラグメント等を含む。
「一価の結合実体」という用語は、ＢＢＢＲに対して一価の結合方式で、特異的に結合可能な分子を意味する。本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュール及び／又はコンジュゲートは、一単位の一価の結合実体の存在により特徴付けられる。すなわち、本発明の血液脳関門シャトルモジュール及び／又はコンジュゲートは、一単位の一価の結合実体を正確に含む。一価の結合実体は、ポリペプチド、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖフラグメントを含む抗体フラグメント、一本鎖抗体分子、例えば、一本鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖを含むがこれらに限定されない。一価の結合実体は、例えば、ファージディスプレイ又は免疫化等の当技術分野における技術の状況を使用して操作された足場タンパク質の場合がある。一価の結合実体は、ポリペプチドの場合もある。特定の実施態様では、一価の結合実体は、血液脳関門レセプターに対する、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメイン及び一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）を含む。ｓｃＦａｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端にリンカーにより連結している。特定の実施態様では、ｓｃＦａｂは、トランスフェリンレセプターを対象にする。
「一価の結合方式」という用語は、一価の結合実体とＢＢＢＲとの間の相互作用が、１つの単独のエピトープにより行われる、ＢＢＢＲに対する特異的な結合を意味する。一価の結合方式は、単独のエピトープ相互作用点のために、ＢＢＢＲの任意の二量体化／多量体化を防止する。一価の結合方式は、ＢＢＢＲの細胞内局在が変化するのを防止する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合を可能にする、任意のポリペプチド決定因子を意味する。特定の実施態様では、エピトープ決定因子は、分子の化学的に活性な表面分類、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルを含み、特定の実施態様では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有する場合がある。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
「トランスフェリンレセプター」（ＴｆＲ）は、２つのジスルフィド結合しているサブユニット（それぞれ、約９０，０００Ｄａの見かけの分子量）から構成されており、脊椎動物における鉄の取込みに関与する、（約１８０，０００Ｄａの分子量を有する）膜貫通糖タンパク質である。一実施態様では、本明細書におけるＴｆＲは、Schneider et al.（Nature 311 (1984) 675 - 678）に報告されているアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。
「神経疾患」という用語は、ＣＮＳに影響を及ぼす、及び／又は、ＣＮＳ中に病因を有する疾患又は障害を意味する。例示的なＣＮＳ疾患又は障害は、神経疾患、アミロイド症、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症を含むがこれらに限定されない。本出願の目的で、ＣＮＳは、眼を含むと理解されたい。眼は、通常、血液網膜関門により、身体の残り部分から隔離される。神経疾患の具体的な例は、神経変性疾患（レビー小体病、ポスト急性灰白髄炎症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳委縮症、パーキンソン病、多系統委縮症、線条体黒質変性症、タウオパシー（アルツハイマー病及び核上性麻痺を含むがこれらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ症候群、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含むがこれらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、ならびに神経系ヘテロ変性障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケイン症候群、ホラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含むがこれらに限定されない）、痴呆（ピック病及び脊髄小脳失調を含むがこれらに限定されない）、ガン（例えば、体内の別の箇所のガンから生じる脳への転移を含む、ＣＮＳ及び／又は脳のガン）を含むがこれらに限定されない。
「神経疾患薬」という用語は、１つ以上の神経疾患を処置する薬剤又は治療剤を意味する。神経疾患薬は、小分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１つ以上のＣＮＳターゲットの天然リガンド、１つ以上のＣＮＳターゲットの天然リガンドの改変変異、アプタマー、干渉性核酸（すなわち、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子又は前述のいずれかの活性フラグメントを含むこれらに限定されない。例示的な神経疾患薬が、本明細書に記載されており、ＣＮＳ抗原又はターゲット分子、例えば、これらに限定されるわけではないが、アミロイド前駆体タンパク質又はその一部、アミロイドベータ、ベータ−セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、ｔａｕ、アルファ−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、グリオーマもしくは他のＣＮＳガンマーカー、ならびに神経栄養因子自体であるか、又は、それらを特異的に認識及び／もしくはそれらに作用する（すなわち、阻害、活性化又は検出する）かのいずれかである、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、干渉性核酸、及び小分子ならびに前述のいずれかの活性フラグメントを含むがこれらに限定されない。神経疾患薬及びそれらが処置するのに使用する場合がある対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳傷害（神経新生）、繊維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、抗上皮成長因子レセプター脳ガン、（ＥＧＦＲ）−抗体、グリア細胞株由来の神経因子パーキンソン病、（ＧＤＮＦ）、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）筋萎縮性側索硬化症、鬱病、脳におけるリソソーム酵素のリソソーム蓄積障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリンー１精神分裂病、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）ＨＥＲ２陽性癌からの脳転移である。
「イメージング剤」の用語は、直接又は間接的に、その存在及び／又は位置の検出を可能にする、１つ以上の特性を有する化合物を意味する。このようなイメージング剤の例は、検出を可能にするラベルされた実体を包含するタンパク質及び小分子化合物を含む。
「ＣＮＳ抗原」及び「脳ターゲット」という用語は、脳を含むＣＮＳにおいて発現している抗原及び／又は分子を意味し、抗体又は小分子でターゲッティングする場合がある。このような抗原及び／又は分子の例は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６を含むがこれらに限定されない。一実施態様では、抗原は、ＢＡＣＥ１である。
「特異的に結合する」という用語は、抗原に選択的又は優先的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、一般的には、標準的なアッセイ法、例えば、Scatchard分析又は表面プラズモン共鳴技術（例えば、BIACORE（登録商標）を使用）を使用して決定される。
本明細書で使用する場合、「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体」という用語は、免疫グロブリンＣＨ２又はＣＨ３ドメイン由来のタンパク質実体を意味する。「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体」は、二量体を形成する２つの「ＣＨ２−ＣＨ３」ポリペプチドを含む。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭである場合がある。一実施態様では、ＩｇＧの免疫グロブリン由来のＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体は、本明細書において、「ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧ実体」と呼ばれる。この用語は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのネイティブな配列と、変異型ＣＨ２−ＣＨ３ドメインとを含む。一実施態様では、「ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体」は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にかけて広がる、ヒト重鎖ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧドメインから得られる。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、又は、存在しなくてもよい。本明細書において特に断りない限り、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されており、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
「コンジュゲート」は、ラベル、神経疾患薬、又は細胞毒を含むがこれらに限定されない、１つ以上の異種分子にコンジュゲートしている、本発明の融合タンパク質である。
「リンカー」という用語は、本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュール及び／又は融合ポリペプチド及び／又はコンジュゲートの種々の実体を共有結合する化学的リンカー又は一本鎖ペプチドリンカーを意味する。リンカーは、例えば、脳エフェクター実体を一価の結合実体に結合している。例えば、一価の結合実体が、血液脳関門レセプターに対する、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇ実体及びｓｃＦａｂを含む場合、リンカーは、ｓｃＦａｂをＣＨ３−ＣＨ２ Ｉｇ実体のＣ末端にコンジュゲートする。脳エフェクター実体を一価の結合実体にコンジュゲートしているリンカー（第１リンカー）及びｓｃＦａｂをＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に結合しているリンカー（第２リンカー）は、同じである場合があるか、又は、異なる場合がある。
ペプチド結合により結合する１〜１２個のアミノ酸残基から構成される一本鎖ペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施態様では、このアミノ酸は、１２個の天然のアミノ酸から選択される。特定の他の実施態様では、このアミノ酸の１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリシンから選択される。他の実施態様では、リンカーは、化学的リンカーである。特定の実施態様では、リンカーは、少なくとも２５個のアミノ酸残基の長さを有する、好ましい一実施態様では、３２〜５０個のアミノ酸残基の長さを有する、アミノ酸配列の一本鎖ペプチドリンカーである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎリンカーである。ここで、Ｇ＝グリシンであり、Ｓ＝セリンであり、（ｘ＝３、ｎ＝８、９、又は１０）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７、又は８）であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝６又は７であり、好ましい一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝７である。一実施態様では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号０８）である。一実施態様では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号０７）である。
コンジュゲーションは、各種の化学的リンカーを使用して行うことができる。例えば、一価の結合実体又は融合ポリペプチド及び脳エフェクター実体は、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロパノアート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン ２，６−ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロンベンゼン）を使用してコンジュゲートすることができる。リンカーは、脳への送達に基づいて、エフェクター実体の放出を容易にする「開裂性リンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
共有コンジュゲーションは、直接できるか、あるいはリンカーを介してできる。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ポリペプチド融合物の構築による（すなわち、ＢＢＢＲに対する一価の結合実体及びエフェクター実体をコードし、１つのポリペプチド（鎖）として発現される、２つの遺伝子の遺伝的融合による）。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ＢＢＢＲに対する一価の結合実体の２つの部分の内の一方における反応性基と脳エフェクター実体における対応する基又はアクセプターとの間における共有結合の形成による。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、適切な条件下において、コンジュゲートする他の分子に対する共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含むようにコンジュゲートする２つの分子の内の一方の改変（すなわち、遺伝的改変）による。１つの非限定的な例として、所望の反応性基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）は、例えば、ＢＢＢＲ抗体に対する一価の結合実体内に導入することができ、ジスルフィド結合は、神経剤と形成することができる。核酸をタンパク質に共有コンジュゲーションする方法も、当技術分野において公知である（すなわち、光架橋、例えば、Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95を参照のこと）。コンジュゲーションは、各種のリンカーを使用しても行うことができる。例えば、一価の結合実体及びエフェクター実体は、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロパノアート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン ２，６−ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロンベンゼン）を使用してコンジュゲートすることができる。ペプチド結合により結合する１〜１２個のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカーも使用することができる。特定のこのような実施態様では、アミノ酸残基は、１２個の天然のアミノ酸から選択される。特定の他のこのような実施態様では、アミノ酸残基の１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリシンから選択される。リンカーは、脳への送達に基づいて、エフェクター実体の放出を容易にする「開裂性リンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールが血液脳関門を通過して脳内に脳エフェクター実体を送達するのに使用することができるという発見にいくらか基づいている。特定の実施態様では、血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門レセプター、例えば、トランスフェリンレセプターに特異的に結合する一価の結合実体を含む。本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールは、例えば、神経疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病とパーキンソン病との併存疾患の診断又は処置に有用である。
Ａ．例示的な抗血液脳関門レセプター抗体
血液脳関門レセプターに特異的に結合する一価の結合実体は、その結合性及びトランスサイトーシス特性：
− 一価の結合実体としてのＢＢＢＲ発現細胞の効率的な細胞結合、
− 一価の結合実体としての効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏトランスサイトーシス、
− ヒト−カニクイザル交差反応性（例えば、BIAcore及びＦＡＣＳ実験）
に関して特徴付ける場合がある。
トランスサイトーシススクリーニングを、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３系アッセイ法において行った。このアッセイ法を、パルスチェイス方式で行った。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３脳内皮細胞を、一価の結合実体と共に１時間インキュベーションし、その後洗浄し、下記パラメータを、洗浄後０時間及び４時間で測定した。
ｉ）ローディング期中に細胞内に取り込まれた一価の結合実体の量
ｉｉ）ローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の基底量
ｉｉｉ）ローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の頂端量
ｉｖ）ローディング及び洗浄後０時間及び４時間での（細胞溶解による）細胞中の一価の結合実体の量
ｖ）ローディング及び洗浄後０時間及び４時間での一価の結合実体の総量
本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュール中の一価の結合実体として適切であるために、一価の結合実体は、ｉ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞により取り込まれ（エンドサイトーシス）、ｉｉ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の外側に輸送され（エキソサイトーシス）、ｉｉｉ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞内で安定（分解のためにエンドソームに輸送されないか、又は、低い輸送）していなければならない。
このため、一実施態様では、一価の結合実体は、ｉ）１時間のローディング期中のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への（実質的な）取込み、ｉｉ）洗浄後４時間内でのローディング期間及び洗浄工程後の頂端及び／又は基底区画内への放出、及びｉｉｉ）低い（細胞内）分解速度により、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３系アッセイ法において特徴付けられる。
一実施態様では、ローディングは、約２．６７μg/mL 一価の結合実体の濃度において１時間である。
本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールの一価の結合実体として適切であるために、一価の結合実体は、上記されているｈＣＭＥＣ／Ｄ３系アッセイ法において、下記閾値：
ｉ）４００pg以上のローディング期中に細胞内に取り込まれた一価の結合実体の量、
ｉｉ）１００pg以上のローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の基底量、及び
ｉｉｉ）１５０pg以上のローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の頂端量
を示さなければならない。
マウス抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体１２８．１（可変領域配列については、国際公開公報第９３／１０８１９号ならびに配列番号１１及び１２を参照のこと）を、参照として採用する場合がある。この場合には、本明細書に報告されている血液脳関門シャトルモジュールの一価の結合実体として適切であるために、一価の結合実体は、上記されているｈＣＭＥＣ／Ｄ３系アッセイ法において、下記閾値：
ｉ）抗体１２８．１のローディングの２０％以上の、ローディング期中に細胞内に取り込まれた一価の結合実体の量、
ｉｉ）抗体１２８．１の基底量の１５％以上の、ローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の基底量、及び
ｉｉｉ）抗体１２８．１の頂端量の１５％以上の、ローディング及び洗浄後４時間での一価の結合実体の頂端量
を示さなければならない。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３系アッセイ法を、下記のように行った（これは、本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様である。）。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３のための培地及びサプリメント（国際公開公報第２００６／０５６８７９号及びWeksler, B.B., et al., FASEB J. 19 (2005) 1872-1874を参照のこと）を、Lonzaから得ることができる。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（２６〜２９回継代）を、２．５％ ＦＢＳ、添加した成長因子の１／４を含有し、添加したヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、及びアスコルビン酸で完全に補われたＥＢＭ２培地中で、コラーゲンコートしたカバーガラス（顕微鏡）又はフラスコにおいてコンフルエントに培養する／培養することができる。
全てのトランスサイトーシスアッセイ法について、高密度孔（１×１０８個／cm2）のＰＥＴ膜フィルタインサート（孔径０．４μm、直径１２mm）を、１２ウェル細胞培養プレートに使用し／使用する場合がある。培地容量を、頂端及び基底チャンバについて、それぞれ４００μL及び１６００μLとなるように計算する。フィルタインサートの頂端チャンバを、ラットの尾のコラーゲンＩ（７．５μg/cm2）、続けて、フィブロネクチン（５μg/mL）でコートし／コートする場合がある。各インキュベーションを、ＲＴで１時間継続する。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ＥＢＭ２培地中で１０〜１２日間、コンフルエントな単層（約２×１０５個/cm2）に増殖させ／増殖させる場合がある。空のフィルタを、アッセイ法前に、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで、１時間又は一晩（ｏ／ｎ）ブロキングし／ブロッキングする場合があり、ついで、アッセイ法前に、ＥＢＭ２中で少なくとも１時間較正する。
アッセイ法（アッセイ法のスキームについては、図１を参照のこと）を、本明細書に記載されているのとは別の方法で再構成された血清フリーＥＢＭ２培地中で行った。アッセイ法当日に、細胞を、６０分間血清不足にして、該当する血液脳関門レセプターの天然のリガンドを枯渇させる。細胞を含む又は含まない（ただし、完全な培地中で一晩ブロッキング）フィルタインサートを、該当するモノクローナル抗体（一価の結合実体）と頂端で、３７℃において１時間インキュベーションした。単層を、頂端（４００μL）及び基底（１６００μL）においてそれぞれ、血清フリー培地中での室温（ＲＴ）で、３回３〜５分間洗浄した。予め温めた培地を、頂端チャンバに加え、フィルタを、予め温めた培地 １６００μLを含有する、新たな１２ウェルプレート（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで一晩ブロッキング）に移した。この時点で、細胞を含むか又は含まないフィルタを、特異的な抗体（一価の結合実体）の取込みを決定するために、ＲＩＰＡバッファー ５００μL中で溶解させた。残ったフィルタを、３７℃又は４℃でインキュベーションした。サンプルを、種々の時点で収集して、抗体（一価の結合実体）の頂端及び／又は基底での放出を決定した。サンプル中の抗体含量を、高感度のＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して定量することができる（実施例１０を参照のこと）。各時点について、データを２つの空のフィルタ及び３つのフィルタ細胞培養物から生成するものとする。
６９個の抗トランスフェリンレセプター抗体についての結果を、以下の表に示す。抗体１２８．１を参照として使用した。


抗体２９９は、７０５pgのトランスサイトーシスローディングを示す。その４時間後、１７０pg（＝ローディングの２４％）を、基底区画中に見出すことができる。２９４pg（＝ローディングの４２％）を、頂端区画中に見出すことができる。
抗体４９４は、３５１０pgのトランスサイトーシスローディングを示す。その４時間後、７４８pg（＝ローディングの２１％）を、基底区画中に見出すことができる。１５０３pg（＝ローディングの４３％）を、頂端区画中に見出すことができる。
上記概説されている評価基準を満たす抗体は、本発明の実施態様である。
このため、本明細書に報告されている一態様は、下記を含む、抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
（１）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（４）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（６）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（７）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（８）配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（９）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１０）配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１１）配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１２）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１３）配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１４）配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１５）配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１６）配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１７）配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１８）配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（１９）配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２０）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２１）配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２２）配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２３）配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２４）配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２５）配列番号６１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２６）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２７）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２８）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（２９）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３０）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３１）配列番号７３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３２）配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３３）配列番号７７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３４）配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３５）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号８２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３６）配列番号８３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３７）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３８）配列番号８７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（３９）配列番号８９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（４０）配列番号９１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（４１）配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（４２）配列番号９５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、又は
（４３）配列番号９７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン
本明細書に報告されている好ましい一態様は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
本明細書に報告されている好ましい一態様は、配列番号９１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
各アミノ酸配列は、下記表に示されている。

本明細書に報告されている一態様は、下記を含む、ヒト化抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
（１）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（４）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（６）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（７）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（８）配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（９）配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１０）配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１１）配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１２）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１３）配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１４）配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１５）配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１６）配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１７）配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１８）配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（１９）配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２０）配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２１）配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２２）配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２３）配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２４）配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２５）配列番号６１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２６）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号６４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２７）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２８）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（２９）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３０）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３１）配列番号７３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３２）配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３３）配列番号７７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号７８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３４）配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３５）配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号８２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３６）配列番号８３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３７）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３８）配列番号８７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（３９）配列番号８９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（４０）配列番号９１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、
（４１）配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（４２）配列番号９５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン、又は
（４３）配列番号９７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメイン及び配列番号９８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメイン
本明細書に報告されている好ましい一態様は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメインと、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメインとを含む、ヒト化抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
本明細書に報告されている一態様は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含むヒト化抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体である。一実施態様では、この抗体は、（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを更に含む。
本明細書に報告されている一態様は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含むヒト化抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体である。一実施態様では、この抗体は、（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを更に含む。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む、抗トランスフェリンレセプター抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、本抗体は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、本抗体は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。更なる実施態様では、本抗体は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２とを含む。更なる実施態様では、本抗体は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、本抗体は、（ａ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む抗体を提供する。
本明細書に報告されている好ましい一態様は、配列番号９１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン由来のヒト化重鎖可変ドメインと、配列番号９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン由来のヒト化軽鎖可変ドメインとを含む、ヒト化抗トランスフェリンレセプター抗体又はそのトランスフェリンレセプター結合フラグメントである。
本明細書に報告されている一態様は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含む、ヒト化抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体である。一実施態様では、本抗体は、（ｄ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを更に含む。
本明細書に報告されている一態様は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含む、ヒト化抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体である。一実施態様では、本抗体は、（ｄ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを更に含む。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲを含む、抗トランスフェリンレセプター抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、本抗体は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、本抗体は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。更なる実施態様では、本抗体は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２とを含む。更なる実施態様では、本抗体は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、本抗体は、（ａ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｂ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｃ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号１２２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む抗体を提供する。
本明細書に報告されている一態様は、脳エフェクター実体として全長ＩｇＧ抗体と、リンカーと、トランスフェリンレセプターに結合する一価の結合実体として１つのｓｃＦａｂをと含み、ｓｃＦａｂが、ＩｇＧ抗体における一方の重鎖のＦｃ領域のＣ末端にリンカーを介してコンジュゲートしている、トランスフェリンシャトルモジュールである。
本明細書に報告されている一態様は、脳エフェクター実体として全長ＩｇＧ抗体と、リンカーと、トランスフェリンレセプターに結合する一価の結合実体として１つのｓｃＦｖと含み、ｓｃＦｖが、ＩｇＧ抗体における一方の重鎖のＦｃ領域のＣ末端にリンカーを介してコンジュゲートしている、トランスフェリンシャトルモジュールである。
好ましい一実施態様では、一価の結合実体は、配列番号１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、及び１１５又は配列番号１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、及び１２２のＨＶＲを含む。
更なる態様では、上記実施態様のいずれかに基づく抗トランスフェリンレセプター抗体は、単独又は組み合わせにおいて、以下のセクション１〜６に記載されている特徴のいずれかを包含する場合がある。
１．抗体親和性
一実施態様では、Ｋｄを、放射線ラベルされた抗原結合アッセイ法（ＲＩＡ）により測定する。一実施態様では、ＲＩＡを、対象となる抗体のＦａｂ版とその抗原とにより行う。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を、用量設定系列のラベルしていない抗原の存在下において、Ｆａｂを最少濃度の（１２５Ｉ）ラベル抗原により平衡化し、ついで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体コートプレートで捕捉することにより測定する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。アッセイ法のための条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、５０mM 炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μg/mL 捕捉性抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）により一晩コートし、その後、ＰＢＳ中の２％（w/v） ウシ血清アルブミンにより、室温（約２３℃）で２〜５時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）において、１００pM又は２６pM ［１２５Ｉ］抗原を、対象となるＦａｂの連続希釈と混合する（例えば、Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と一致）。ついで、対象となるＦａｂを、一晩インキュベーションする。ただし、このインキュベーションは、平衡が達成されるのを確保するために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温でのインキュべーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移す。ついで、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中の０．１％ ポリソルベート２０（TWEEN-20（登録商標））で、８回洗浄する。このプレートを乾燥させた時点で、１５０μL／ウェル シンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard)を加え、プレートを、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンタ（Packard）において、１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を提供する各Ｆａｂ濃度を、競合的結合アッセイに使用するために選択する。
別の実施態様に従って、Ｋｄを、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイ法を使用して測定する。例えば、BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000（BIAcore, Inc., Piscataway、NJ）を使用するアッセイ法を、固定化抗原ＣＭ５チップにより、約１０応答単位（ＲＵ）において２５℃で行う。一実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（CM5, BIACORE, Inc.）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により、供給元の説明書に従って活性化する。抗原を、１０mM 酢酸ナトリウム ｐＨ４．８で５μg/mL（約０．２μM）に希釈し、その後、５μL/分の流速で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）の連結したタンパク質を達成する。抗原の注入後、１M エタノールアミンを注入して、反応しなかった基をブロックする。反応速度測定について、２倍の連続希釈のＦａｂ（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５％ ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５μL/分の流速で２５℃において注入する。シンプルな一対一のラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標） Evolution Software version 3.2）を使用し、会合及び解離のセンサーグラムを同時に当て嵌めることにより、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平行解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。ｏｎ速度が、上記表面プラズモン共鳴アッセイ法により１０６M-1s-1を超える場合、同ｏｎ速度を、攪拌キュベットを備える分光計、例えば、ストップフローを備えた分光計（Aviv Instruments）又は8000-series SLM-AMINCO（商標）分光計（ThermoSpectronic）において測定する場合は、増大する濃度の抗原の存在下において、ＰＢＳ ｐＨ７．２中の２０nM 抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光放出強度（励起＝２９５nm；放出＝３４０nm、バンドパス１６nm）における増大又は減少を測定する蛍光クエンチ技術を使用することにより決定することができる。
２．抗体フラグメント
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメントならびに以下に記載されている他のフラグメントを含むがこれらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについて、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントのレビューについて、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、延長したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２の検討については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
ディアボディは、二価又は二重特異性の場合がある、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開公報第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリボディ及びテトラボディも、Hudson, P.J. et al., Nat. Med.9 (20039 129-134)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。
抗体フラグメントは、種々の技術により調製することができる。同技術は、本明細書に記載されている、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化及びリコンビナントホスト細胞（例えば、E. coli又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない。
３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。更なる例において、キメラ抗体は、「クラススイッチ」抗体である。同抗体において、クラス又はサブクラスは、親抗体のクラス又はサブクラスから変化している。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する抗原性を減少させるが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持するようにヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、同ドメインにおいて、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）は、非ヒト抗体由来であり、ＦＲ（又はその一部）は、ヒト抗体配列由来である。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。一部の実施態様では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が得られる抗体）由来の対応する残基により置換されている。
ヒト化抗体及びそれを調製する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633においてレビューされており、例えば、（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフト化について記載されている）Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34；（「表面再生」について記載されている）Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498；（「ＦＲシャッフリング」について記載されている）Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60；ならびに（ＦＲシャッフリングに対する「ガイドセレクション」アプローチについて記載されている）Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260に更に記載されている。
ヒト化に使用する場合があるヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体の定常配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞的に成熟）フレームワーク領域又はヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；ＦＲライブラリのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照のこと）を含むがこれらに限定されない。
４．ライブラリ由来の抗体
本発明の抗体は、所望の１つ以上の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングにより単離する場合がある。例えば、各種の方法は、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合性を有する抗体について、このようなライブラリをスクリーニングすることについては、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37にレビューされており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に更に記載されている。
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、別々にクローニングされ、ファージライブラリ中にランダムに組み換えられる。例えば、同ライブラリは、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されている抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントのいずれかとして、抗体フラグメントを提示する。免疫化ソースからのライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリは、（例えば、ヒトから）クローニングして、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載されている免疫化を何ら必要とすることなく、広い範囲の非自己及び自己抗原にも対する単一ソースの抗体を提供することができる。最終的に、ナイーブなライブラリが、非再編Ｖ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、非常に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再編を達成することによっても、合成的に調製することができる。ヒト抗体ファージライブラリを記載している特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号を含む。
５．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２種類の部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の１つは、トランスフェリンレセプターに対するものであり、他のものは、任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体は、トランスフェリンレセプターを発現している細胞に対して、細胞毒を局在化させるのにも使用する場合がある。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製する場合がある。
二重特異性抗体を調製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対のリコンビナント共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983)537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）及び「ノブ−ｉｎ−ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）を含むがこれらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を調製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋させること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan, M. et al., Science229 (1985) 81-83）；二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパー（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを調製するための「ディアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；及び例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991)60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによっても調製する場合がある。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性の抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。
本明細書における抗体又はフラグメントは、トランスフェリンレセプターと、別の種々の抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
本明細書における抗体又はフラグメントは、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５４号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、及び同第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体も含む。
本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様では、抗トランスフェリンレセプター抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の第１軽鎖及び第１重鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の第２軽鎖及び第２重鎖であって、第２軽鎖及び第２重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられている第２軽鎖及び第２重鎖とを含み、ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二価の二重特異性抗体である。
ａ）に基づく抗体は、ｂ）に基づいて報告されている改変を含有せず、ａ）に基づく重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
ｂ）に基づく抗体において、軽鎖内では、可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶにより置き換えられており、重鎖内では、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬにより置き換えられている。
一実施態様では、
ｉ） ａ）に基づく第１軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）は、正に荷電したアミノ酸により置換されており、ここで、ａ）に基づく第１重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）は、負に荷電したアミノ酸により置換されているか、
あるいは、
ｉｉ） ｂ）に基づく第２軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）は、正に荷電したアミノ酸により置換されており、ここで、ｂ）に基づく第２重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）は、負に荷電したアミノ酸により置換されている。
好ましい一実施態様では、
ｉ） ａ）に基づく第１軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ここで、ａ）に基づく第１重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）により独立して置換されているか、
あるいは、
ｉｉ） ｂ）に基づく第２軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）により独立して（好ましい一実施態様では、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており、ここで、ｂ）に基づく第２重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）により独立して置換されている。
一実施態様では、第２重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位のアミノ酸は、Ｋにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
一実施態様では、第２軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位のアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
好ましい一実施態様では、第１軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位のアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第１重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位のアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
一実施態様では、第２軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位のアミノ酸は、Ｋにより置換されており、ここで、第２重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位のアミノ酸は、Ｅにより置換されており、第１軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第１重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅにより置換されており、第２軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位のアミノ酸は、Ｋにより置換されており、第２重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位のアミノ酸は、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の第１軽鎖及び第１重鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の第２軽鎖及び第２重鎖であって、第２軽鎖及び第２重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、ここで、第２軽鎖及び第２重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２軽鎖及び第２重鎖とを含み、ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二価の二重特異性抗体である。
ａ）に基づく抗体は、ｂ）に基づいて報告されている改変を含有せず、ａ）に基づく重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
ｂ）に基づく抗体において、軽鎖内では、可変軽鎖ドメインＶＬは、前記抗体の可変重鎖ドメインＨＶにより置き換えられており、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており、重鎖内では、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬにより置き換えられており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の第１軽鎖及び第１重鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の第２軽鎖及び第２重鎖であって、第２軽鎖及び第２重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２軽鎖及び第２重鎖とを含み、ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二価の二重特異性抗体である。
ａ）に基づく抗体は、ｂ）に基づいて報告されている改変を含有せず、ａ）に基づく重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
ｂ）に基づく抗体において、軽鎖内では、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており、重鎖内では、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）１〜４個の更なる抗原に特異的に結合する（すなわち、第２及び／又は第３及び／又は第４及び／又は第５抗原、好ましくは、１つの更なる抗原、すなわち、第２抗原に特異的に結合する）１、２、３、又は４本の一本鎖Ｆａｂフラグメントとを含み、ここで、前記ｂ）に基づく一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記ａ）に基づく全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端において融合しており、ここで、第１抗原又は更なる抗原の１つが、ヒトトランスフェリンレセプターである、多重特異性抗体である。
一実施態様では、第２抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における重鎖又は軽鎖のＣ末端において融合している。
一実施態様では、第２抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における重鎖のＣ末端において融合している。
一実施態様では、第２抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における軽鎖のＣ末端において融合している。
一実施態様では、第２抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における重鎖又は軽鎖それぞれのＣ末端において融合している。
一実施態様では、第２抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における各重鎖のＣ末端において融合している。
一実施態様では、第２抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における各軽鎖のＣ末端において融合している。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ） ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）から成る第１ポリペプチドであって、前記第１ポリペプチドが、そのＶＨドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における２つの重鎖の一方のＣ末端に融合している第１ポリペプチドと、
ｃ） ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなる第２ポリペプチドであって、前記第２ポリペプチドが、ＶＬドメインのＮ末端により、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体における２つの重鎖の他方のＣ末端に融合している第２ポリペプチドとを含み、ここで、第１ポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と第２ポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが共に、第２抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成しており、ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、三価の二重特異性抗体である。
一実施態様では、ｂ）に基づくポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ｃ）に基づくポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とは、下記位置間のジスルフィド結合の導入による鎖内ジスルフィド架橋を介して連結され、安定化している。
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位に対する軽鎖可変ドメインの１００位、又は
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位に対する軽鎖可変ドメインの４３位、又は
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位に対する軽鎖可変ドメインの１００位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに常に従ったナンバリング）
安定化のための非天然のジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59；Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。一実施態様では、ｂ）及びｃ）に基づくポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位との間である。一実施態様では、ｂ）及びｃ）に基づくポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位との間である（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス常に従ったナンバリング）。一実施態様では、一本鎖Ｆａｂフラグメントにおける可変ドメインＶＨとＶＬとの間の前記任意のジスルフィド安定化を含まない、三価の二重特異性抗体が好ましい。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する全長抗体の第１軽鎖及び第１重鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する全長抗体の第２（改変）軽鎖及び第２（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第２（改変）軽鎖及び第２（改変）重鎖と、
ｃ）１つ又は２つの更なる抗原（すなわち、第３及び／又は第４抗原）に特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）における軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している１〜４つの抗原結合ペプチドとを含み、ここで、第１抗原もしくは第２抗原又は更なる抗原の１つが、ヒトトランスフェリンレセプターである、三重特異性又は四重特異性抗体である。
ａ）に基づく抗体は、ｂ）に基づいて報告されている改変を含有せず、ａ）に基づく重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）に基づいて、１つ又は２つの更なる抗原に特異的に結合する、１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントからなる群より選択される。
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメントである。
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦａｂフラグメントである。
一実施態様では、抗原結合ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）における重鎖のＣ末端に融合している。
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）に基づいて、１つの更なる抗原に特異的に結合する、１つ又は２つの抗原結合ペプチドを含む。
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）に基づいて、第３抗原に特異的に結合する、２つの同一の抗原結合ペプチドを含む。好ましい一実施態様では、このような２つの同一の抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドリンカーを介して、ａ）及びｂ）における重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、２つの同一抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
一実施態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）に基づいて、第３及び第４抗原に特異的に結合する、２つの抗原結合ペプチドを含む。一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドコネクタを介して、ａ）及びｂ）における重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、前記２つの抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントのいずれかである。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する（２つのＦａｂフラグメントを含む）抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の２つの更なるＦａｂフラグメントであって、前記更なるＦａｂフラグメントが両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）における重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合しているＦａｂフラグメントとを含み、
ここで、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われており、
ｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメント又はｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
あるいは、
ｉｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
ならびに、
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
あるいは、
ｉｉｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
ならびに、
ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
あるいは、
ｉｖ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、
あるいは、
ｖ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、
ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二重特異性の四価抗体である。
一実施態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）における重鎖のＣ末端又はａ）における重鎖のＮ末端のいずれかに融合している。
一実施態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）における重鎖のＣ末端のいずれかに融合している。
一実施態様では、前記更なるＦａｂフラグメントは両方とも、ペプチドコネクタを介して、ａ）における重鎖のＮ末端いずれかに融合している。
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又は、ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ） ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ） ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられており、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
一実施態様では、Ｆａｂフラグメントにおいて、下記改変が行われている。
ｉ） ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、第１ＶＨ−ＣＨ１ドメイン対を含む第１抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第１抗体の第２ＶＨ−ＣＨ１ドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第１抗体の（改変）重鎖と、
ｂ） ａ）における前記第１抗体の２つの軽鎖と、
ｃ）第２抗原に特異的に結合し、第１ＶＨ−ＣＬドメイン対を含む第２抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第２抗体の第２ＶＨ−ＣＬドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第２抗体の（改変）重鎖と、
ｄ） ｃ）における前記第２抗体の２つの（改変）軽鎖であって、それぞれが、ＣＬ−ＣＨ１ドメイン対を含む（改変）軽鎖とを含み、
第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二重特異性の四価抗体である。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合する第１全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する第２全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のＮ末端が、軽鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して結合している第２全長抗体の重鎖及び軽鎖とを含み、
第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二重特異性抗体である。
ａ）に基づく抗体は、ｂ）に基づいて報告されている改変を含有せず、重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
本明細書に報告されている一態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）ＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインを含む第２抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントであって、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して、互いに結合しているＦｖフラグメントとを含み、
ここで、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれかのみが、ペプチドリンカーを介して、第１抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合しており、
ここで、第１抗原又は第２抗原が、ヒトトランスフェリンレセプターである、二重特異性抗体である。
二重特異性抗体において、ａ）に基づく重鎖及び軽鎖は、独立した鎖である。
一実施態様では、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第１抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合していない。
本明細書に報告されている全ての態様において、第１軽鎖は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第１重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
全ての態様の一実施態様では、本明細書に報告されている抗体は、多重特異性抗体であり、同多重特異性抗体は、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドのヘテロ多量体化を必要とし、ここで、同抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター及び第２の非ヒトトランスフェリンレセプター抗原に特異的に結合する。
ヘテロ二量体化を支援するために、ＣＨ３改変のための複数アプローチは、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、同第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５等、同第２０１２／０５８７６８号、同第２０１３／１５７９５４号、同第２０１３／０９６２９１号に記載されている。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、当技術分野に公知のアプローチにおいて、第１重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２重鎖のＣＨ３ドメインは両方とも、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖が、同じ構造の別の重鎖と、もはやホモ二量体化できない（例えば、ＣＨ３操作第１重鎖は、別のＣＨ３操作第１重鎖と、もはやホモ二量体化できず、ＣＨ３操作第２重鎖は、別のＣＨ３操作第２重鎖と、もはやホモ二量体化できない。）ように、補完的な方法において操作されている。これにより、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、ＣＨ３ドメインを含む別の重鎖とヘテロ二量体化される。同別の重鎖は、補完的な方法で操作される。本発明のこの実施態様について、第１重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換による補完的な方法で操作される。これにより、第１重鎖及び第２重鎖は、ヘテロ二量体化される。一方、第１重鎖及び第２重鎖は、（例えば、立体的な理由のために）もはやホモ二量体化できない。
当技術分野において公知の重鎖ヘテロ二量体化を支援するための種々のアプローチが、上記で引用され、上記に含まれており、本発明に基づく多重特異性抗体に使用される種々の代替手段として考慮される。同多重特異性抗体は、本発明について上記されている特定のアミノ酸置換との組み合わせで、第１抗原に特異的に結合する第１抗体由来の「非架橋Ｆａｂ領域」と、第２抗原に特異的に結合する第２抗体由来の「架橋Ｆａｂ領域」とを含み、
本明細書に報告されている多重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」技術により変異させることができる。同技術は、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681に、複数の例を伴って、より詳細に記載されている。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を向上させるように変異される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインはそれぞれ、「ノブ」の場合があり、一方、他のものは、「ホール」の場合がある。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体を更に安定化させ（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を向上させる。
好ましい一実施態様では、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内へのＹ３４９Ｃの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内へのＥ３５６Ｃの突然変異又はＳ３５４Ｃの突然変異を導入することにより、ＣＨ３ドメイン間の更なる鎖内ジスルフィド架橋も使用する場合がある（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。このため、別の好ましい実施態様では、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異とを含む。または、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異とを含む（一方のＣＨ３ドメイン中の更なるＹ３４９Ｃの突然変異と他方のＣＨ３ドメイン中の更なるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの突然変異とが、鎖内ジスルフィド架橋を形成する）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されている他のノブ−ｉｎ−ホール技術も、代替的に又は追加的に使用する場合がある。一実施態様では、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
一実施態様では、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異とを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
一実施態様では、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異とを含む。または、本明細書に報告されている多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの突然変異と、２つのＣＨ３ドメインの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異とを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中のＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅの突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの突然変異とを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術」とは別に、多重特異性抗体における重鎖のＣＨ３ドメインをヘテロ二量体化させるために改変するための他の技術は、当技術分野において公知である。これらの技術は、特に、国際公開公報第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、同第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５号、同第２０１２／０５８７６８号、同第２０１３／１５７９５４号、及び同第２０１３／０９６２９１号に記載されているものが、本明細書において、本明細書に報告されている多重特異性抗体との組み合わせでの「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術」に対する代替手段として考慮される。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。このアプローチは、第１及び第２重鎖両方間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に、反対の電荷を有する電荷したアミノ酸の導入に基づいている。
したがって、この実施態様は、抗体の三次構造において、第１重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２重鎖のＣＨ３ドメインが、各抗体ＣＨ３ドメイン間に位置している界面を形成しており、ここで、第１重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２重鎖のＣＨ３ドメインそれぞれの各アミノ酸配列が、抗体の三次構造における前記界面内に位置している１組のセットを含み、ここで、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面に位置している１組のアミノ酸から、第１アミノ酸が、正に荷電したアミノ酸により置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面に位置している１組のアミノ酸から、第２アミノ酸が、負に荷電したアミノ酸により置換されている、本明細書に報告されている多重特異性抗体に関する。この実施態様に基づく多重特異性抗体は、本明細書において、「ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体」とも呼ばれる（ここで、「＋／−」の略称は、各ＣＨ３ドメインに導入された、反対に荷電したアミノ酸を意味する。）。
本明細書に報告されている前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、及びＨから選択され、負に荷電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
本明細書に報告されている前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負に荷電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
本明細書に報告されている前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、正に荷電したアミノ酸はＫであり、負に荷電したアミノ酸はＥである。
本明細書に報告されている前記ＣＨ３（＋／−）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｒは、Ｄにより置換されており、位のアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、３５７位のアミノ酸Ｅは、Ｋにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｋにより置換されており、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｋにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。更に、少なくとも１つの下記置換が、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中に含まれる。３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｅにより置換されており、３４９位のアミノ酸Ｙは、Ｄにより置換されており、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。一実施態様では、３６８位のアミノ酸Ｌは、Ｅにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙにより置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａにより置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。別の実施態様では、前述の置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４１１位（元はＴ）、３９９位（元はＤ）、４００位（元はＳ）、４０５位（元はＦ）、３９０位（元はＮ）、及び３９２位（元はＫ）のアミノ酸の少なくとも１つが置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。好ましい置換は、
− Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、及びＷから選択されるアミノ酸による、４１１位のアミノ酸Ｔの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）、
− Ｒ、Ｗ、Ｙ、及びＫから選択されるアミノ酸による、３９９位のアミノ酸Ｄの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）、
− Ｅ、Ｄ、Ｒ、及びＫから選択されるアミノ酸による、４００位のアミノ酸Ｓの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）、
− Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、及びＷから選択されるアミノ酸による、４０５位のアミノ酸Ｆの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）、
− Ｒ、Ｋ、及びＤから選択されるアミノ酸による、３９０位のアミノ酸Ｎの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）、ならびに
− Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ、及びＥから選択されるアミノ酸による、３９２位のアミノ酸Ｋの置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）
である。
（国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に基づいて操作された）本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸Ｌは、Ｙにより置換されており、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｖにより置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ａにより置換されており、４０９位のアミノ酸Ｋは、Ｆにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。前記最後に前述した実施態様では、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、４１１位のアミノ酸Ｔは、Ｅにより置換されており、３９９位のアミノ酸Ｄは、Ｒにより置換されており、４００位のアミノ酸Ｓは、Ｒにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の一実施態様では、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変は、３６８位及び／又は４０９位に導入される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。国際公開公報第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」技術に基づくアミノ酸改変に関する。本明細書に報告されている前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｗにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ａにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている前記ＣＨ３（ＫｉＨ）操作多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸Ｔは、Ｙにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸Ｙは、Ｔにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
ＩｇＧ２アイソタイプである、本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋ又はＮは、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄ、３５６位のアミノ酸ＥもしくはＤ、又は３５７位のアミノ酸Ｅは、正に荷電したアミノ酸（好ましい一実施態様では、Ｋ又はＲ、好ましい一実施態様では、Ｋにより、好ましい一実施態様では、３９９位又は３５６位のアミノ酸は、Ｋにより置換されている。）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。更なる一実施態様では、前述の置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｋ又はＲは、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。更なる一実施態様では、前述の置換に加えて、又は、同置換に代えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４３９位のアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位のアミノ酸Ｋは、負に荷電したアミノ酸により（好ましい一実施態様では、Ｅ又はＤにより、好ましい一実施態様では、Ｄにより）互いに独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。本明細書に報告されている前記多重特異性抗体の一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２５３位のアミノ酸Ｋは、Ｅにより置換されており、２８２位のアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、３２２位のアミノ酸Ｋは、Ｄにより置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２３９位のアミノ酸Ｄは、Ｋにより置換されており、２４０位のアミノ酸Ｅは、Ｋにより置換されており、２９２位のアミノ酸Ｋは、Ｄにより置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている多重特異性抗体の一実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体における第１重鎖及び第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するのに使用される。
全ての態様の一実施態様及び本明細書に報告されている実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。本発明の好ましい一実施態様では、多重特性抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様では、抗体は、二価又は三価の抗体である。一実施態様では、抗体は、二価の抗体である。
本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、ヒトのサブクラスＩｇＧ１又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトのサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、ヒトのサブクラスＩｇＧ２のものであることを特徴とする。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、ヒトのサブクラスＩｇＧ３のものであることを特徴とする。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、ヒトのサブクラスＩｇＧ４又は更なる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトのサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、ヒトのサブクラスＩｇＧ１又はヒトのサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトのサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを有するヒトのサブクラスＩｇＧ１のものであることを特徴とする（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトのサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。本明細書に報告されている全ての態様の更なる一実施態様では、多重特異性抗体は、前記多重特異性抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを有するヒトのサブクラスＩｇＧ４のものであることを特徴とする（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）。
本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様では、本明細書において特定されているＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、更なるＣ末端グリシン−リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。本明細書に報告されている全ての態様の一実施態様では、本明細書において特定されているＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。
６．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合ある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列内に適切な改変を導入することにより、又は、ペプチド合成により調製する場合がある。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は、同配列内への挿入、及び／又は、同配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終的な構築物に達するのに行うことができる。ただし、最終的な構築物は、所望の特徴、例えば、抗原結合を有するという条件である。
ａ）置換、挿入、及び欠失の変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「保存的置換」の見出しで表１に示されている。より実質的な変化は、「例示的な置換」の見出しで表１に提供され、アミノ酸側鎖の分類を参照して、更に以下に記載されているように提供される。アミノ酸置換は、対象となる抗体内に導入する場合があり、生成物は、所望の活性、例えば、保持／活性化された抗原結合性、低下した免疫原性、又は改善したＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングする場合がある。
アミノ酸は、共通する側鎖の特性に従ってグループ化する場合がある。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスに交換することを必要とするであろう。
ある種の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究に選択される得られた変異体は、親抗体に対する特定の生物学的特性（例えば、向上した親和性、低下した免疫原性）における改変（例えば、改善）を有し、及び／又は、親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、同抗体は、例えば、ファージディスプレイ系親和性成熟技術、例えば、本明細書に記載されているものを使用して、都合良く生成する場合がある。簡潔に、１つ以上のＨＶＲ残基が成熟され、変異型抗体は、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変異（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ中にする場合がある。このような変異は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞変異法中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）、及び／又は、抗原と接触する残基にする場合がある。得られた変異ＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築及び二次ライブラリから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の一部の実施態様では、多様性が、各種の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかにより、成熟について選択される可変遺伝子内に導入される。ついで、二次ライブラリが調製される。ついで、このライブラリが、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するのにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、ＨＶＲ指定アプローチを含む。そのアプローチにおいて、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化される。抗原結合性に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発を使用して、又は、モデリングして、特異的に特定する場合がある。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合、ターゲッティングされる。
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、このような変異が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内に起こすことができる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変異（例えば、本明細書に提供されている保存的置換）が、ＨＶＲ中にする場合がある。このような変異は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側でもよい。上記提供されている変異型ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは、変異していないか、又は、２つ以上、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異誘発のためにターゲティングする場合がある抗体の残基又は領域を特定するのに有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されている、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、ターゲット残基の残基又は基（例えば、電荷した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ）が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを決定する。更なる置換は、最初の置換に対する機能的感受性を証明するアミノ酸位置に導入する場合がある。代替的に又は追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との間の接触点を特定する。このような接触残基及び隣接する残基は、置換のための候補としてターゲッティングする場合があり、又は、除去する場合がある。変異体は、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定するのにスクリーニングする場合がある。
アミノ酸配列挿入は、長さが１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲で、アミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、ならびに、１つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を長くする、（例えば、ＡＤＥＰＴのための）酵素又はポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端に対する融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体は、抗体がグリコシル化されている度合いを向上又は低下させるように変異させる。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を変異させることにより、都合良く達成する場合がある。これにより、１つ以上のグリコシル化部位が形成又は除去される。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した炭水化物は変更する場合がある。哺乳類細胞により産生されるネイティブな抗体は、典型的には、二分岐したオリゴ糖を含む。同オリゴ糖は、一般的には、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により付着する（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖は、二分岐したオリゴ糖構造の「幹」において、ＧｌｃＮＡｃに付着した、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸ならびにフコースを含むことができる。一部の実施態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、特定の改善した特性を有する抗体変異体を形成するためにする場合がある。
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコース量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％の場合がある。フコース量は、例えば、国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定された、Ａｓｎ２９７に付着した全ての糖構造（例えば、複雑なハイブリッドの高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の２９７位付近に位置するアスパラギン残基を意味する（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）。ただし、抗体中の小さな配列変異のために、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流又は下流約±３個のアミノ、すなわち、２９４〜３００位に位置する場合もある。このようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有する場合がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する公報の例は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622を含む。脱フコシル化抗体を産生可能な細胞株の例は、タンパク質フコシル化を欠いたＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号を参照のこと）を含む。
二分割オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。例えば、同変異体において、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃにより二分割されている。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有する場合がある。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許出願第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有する場合がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書に提供されている抗体のＦｃ領域内に導入する場合があり、これにより、Ｆｃ領域変異体を生成する場合がある。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。
特定の実施態様では、本発明は、全てのエフェクター機能の一部を有するが全ては有さない抗体変異体を考慮する。同変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の半減期が重要である用途の望ましい候補となる。更なる特定のエフェクター機能（例えば、相補性及びＡＤＣＣ）は必須でないか、又は、有害である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞毒アッセイ法は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／欠損を確認するのに行うことができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイ法は、抗体がＦｃγＲ結合性を欠いている（このため、おそらくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確保するのに行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみ）を発現しているが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492における第４６４頁の表３中に概説されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法の非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと)；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用する場合がある（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞毒アッセイ法（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒アッセイ法（Promega, Madison, WI）を参照のこと)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に又は追加的に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているもの等の動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイすることができる。Ｃｑ１結合アッセイ法も、抗体がＣ１ｑと結合できないため、ＣＤＣ活性を欠いているのを確認するのに行うことができる。例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補完的な活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ法を行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合性及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照のこと）。
低下したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ以上の置換を有するものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上の置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
改善又は減少したＦｃＲに対する結合性を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位における置換を有するＦｃ領域を含む（ＥＵナンバリングでの残基）。
一部の実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、変異は、変化した（すなわち、改善又は減少のいずれかの）Ｃ１ｑ結合性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすＦｃ領域中になされる。
延長した半減期及び、胎児への母方のＩｇＧ輸送を担う（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児型Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する改善した結合性を有する抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合性を改善する、１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６）。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を形成するのが望ましい場合がある。該抗体において、抗体の１つ以上の残基は、システイン残基により置換されている。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセッシブル部位に位置する。システインによりそれらの残基を置換することにより、反応性チオール基は、抗体のアクセッシブル部位に位置することで、抗体を他の部分、例えば、薬剤部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートして、本明細書に更に記載されているように、免疫コンジュゲートを形成するのに使用する場合がある。特定の実施態様では、任意の１つ以上の下記残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）は、システインにより置換する場合がある。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成する場合がある。
ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗体は、当技術分野において公知であり、容易に利用できる、更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変する場合がある。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むがこれに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造中での利点を有する場合がある。このポリマーは、任意の分子量のものである場合があり、分岐鎖又は非分岐鎖である場合がある。抗体に付着するポリマー数は変化させる場合があり、２つ以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じか又は異なる分子である場合がある。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能を含むがこれらに限定されない考慮に基づいて、抗体誘導体が規定条件下での治療に使用されるであろうかどうか等を決定する場合がある。
別の実施態様では、抗体と、放射線への曝露により選択的に加熱する場合がある非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長のものでよく、通常の細胞に有害でない波長を含むがこれに限定されず、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分近くの細胞が殺傷される温度に加熱する。
Ｂ．リコンビナント法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているリコンビナント法及び組成物を使用して産生する場合がある。一実施態様では、本明細書に記載されている抗トランスフェリンレセプター抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする場合がある。更なる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含むホスト細胞が提供される。１つのこのような実施態様では、ホスト細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、（１）又は（２）によりトランスフォーメーションされている）。一実施態様では、ホスト細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗トランスフェリンレセプター抗体を調製する方法が提供される。ここで、同方法は、抗体の発現に適した条件下において、本明細書に提供されている抗体をコードする核酸を含むホスト細胞を培養することと、場合により、ホスト細胞（又はホスト細胞培養培地）から、抗体を回収することとを含む。
抗トランスフェリンレセプター抗体のリコンビナント産生のために、例えば、上記されている抗体をコードする核酸が単離され、ホスト細胞中で更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター内に挿入される。このような核酸は、容易に単離する場合があり、（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）従来の手法を使用してシークエンシングする場合がある。
抗体コードベクターのクローニング又は発現に適したホスト細胞は、本明細書に記載されている原核生物又は真核生物の細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃレセプター機能を必要としない場合、抗体は、細菌中で産生する場合がある。細菌中での抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと（E. coli中での抗体フラグメントの発現が記載されている、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、細菌細胞のペーストから、可溶性画分中に単離する場合があり、更に精製する場合がある。
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす糸状菌及び酵母株を含む、真菌又は酵母が、抗体コードベクター用のクローニング又は発現ホストに適している。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適したホスト細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物の例は、植物及び昆虫細胞を含む。数多くのバキュロウイルス株が特定されており、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクション用の昆虫細胞に関して使用する場合がある。
植物細胞培養物も、ホストとして利用する場合がある。例えば、（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照のこと。
脊椎動物細胞も、ホストとして使用する場合がある。例えば、懸濁液中で増殖させるのに適合した哺乳類の細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳類ホスト細胞株の他の例は、ＳＶ４０によりトランスフォーメーションされるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されている２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類ホスト細胞株は、ＤＨＦＲ− ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）ならびにメラノーマ細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０を含む。抗体産生に適した特定の哺乳類ホスト細胞株のレビューについては、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
Ｃ．アッセイ法
本明細書に提供されている抗トランスフェリンレセプター抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイ法により、その物理的／化学的特定及び／又は生物学的活性を特定し、スクリーニングし、又は、特徴付ける場合がある。
１．結合アッセイ法
一態様では、本発明の抗体を、その抗原結合活性について、例えば、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、アルファＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、抗体、又は逆相アレイ等により試験する。
例示的なＥＬＩＳＡ又はアルファＬＩＳＡアッセイ法において、溶液（細胞上清、細胞又は組織ライゼート、体液等）中のトランスフェリンレセプターは、捕捉抗体により結合される。同捕捉抗体は、トランスフェリンレセプター又は特定のコンフォーメーションにおけるトランスフェリンレセプター上の第１エピトープに特異的に結合する。検出実体に連結した検出抗体は、トランスフェリンレセプターの第２エピトープ又はコンフォーメーションに特異的に結合する。この読出しは、検出実体（化学発光、蛍光、エネルギー移動誘導発光等）に基づいている。
抗体アレイの場合には、抗体を、ガラス又はニトロセルロースチップ上にスポットする。このスライドをブロッキングし、トランスフェリンレセプター含有溶液によりインキュベーションし、結合していない抗体を除去するために洗浄する。結合した抗体を、蛍光ラベルした対応する二次抗体により検出する。蛍光シグナルを、蛍光スライドスキャナにより測定する。同様に、逆相アレイのために、リコンビナントトランスフェリンレセプター、細胞上清、細胞又は組織ライゼート、体液等を、ガラス又はニトロセルロースチップ上にスポットする。このスライドをブロッキングし、個々のアレイを、トランスフェリンレセプター上の特定のエピトープに対する抗体とインキュベーションする。結合していない抗体を洗浄し、結合した抗体を、蛍光ラベルした対応する二次抗体により検出する。蛍光シグナルを、蛍光スライドスキャナにより測定する（Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331）。
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書に提供されている抗トランスフェリンレセプター抗体はいずれも、生体サンプル中のヒトトランスフェリンレセプターの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する場合、「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生体サンプルは、細胞又は組織、例えば、脳組織を含む。
一実施態様では、診断又は検出方法に使用するための抗トランスフェリンレセプター抗体が提供される。更なる態様では、生体サンプル中のトランスフェリンレセプターの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、同方法は、トランスフェリンレセプター抗体のトランスフェリンレセプターへの結合が可能な条件下において、生体サンプルを本明細書に記載されている抗トランスフェリンレセプター抗体と接触させることと、抗トランスフェリンレセプター抗体とトランスフェリンレセプターとの間の複合体が形成されたかどうかを検出することとを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ法の場合がある。一実施態様では、例えば、トランスフェリンレセプターが患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗トランスフェリンレセプター抗体は、抗トランスフェリンレセプター抗体による治療に適格な対象を選択するのに使用される。
本発明の抗体を使用して診断する場合がある例示的な障害は、Ｉ型脳鉄蓄積（ＮＢＩＡ１）、純粋自立神経失調症、ダウ症候群、ゲーリック病、及び重篤なレビー小体病、例えば、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病レビー小体亜型（ＬＢＶＡＤ）、特定の形態のゴーシェ病、及びパーキンソン病痴呆（ＰＤＤ）を伴う神経変性を含む。
特定の実施態様では、ラベルされた抗トランスフェリンレセプター抗体が提供される。ラベルは、直接検出されるラベル又は部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性ラベル）ならびに、酵素又はリガンド等の部分を含むがこれらに限定されない。酵素又はリガンド等の部分は、例えば、酵素反応又は分子相互作用により、間接的に検出される。例示的なラベルは、放射線同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、蛍光体、例えば、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、過酸化水素を利用して、染料前駆体を酸化する酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと組み合わせた、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカル等を含むがこれらに限定されない。
Ｅ．医薬製剤
本明細書に記載されている抗トランスフェリンレセプター抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を、１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の状態で調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980）)。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むがこれらに限定されない。本明細書において、例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質薬分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８等に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含む。後者の製剤は、ヒスチジン−アセテートバッファーを含む。
本明細書における製剤は、処置される特定の適応症に必要な場合、２つ以上の活性成分、好ましくは、互いに有害に影響しない補完的な活性を有するものも含有する場合がある。このような活性成分は、意図した目的に効果的な量での組み合わせにおいて適切に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、又は、界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセルそれぞれに、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）の状態又はマイクロエマルジョンで封入する場合がある。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
持続放出型製剤が調製される場合がある。持続放出型製剤の適切な例は、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含む。同マトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの状態である。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的には、無菌である。無菌は、例えば、ろ過滅菌膜によるろ過により容易に達成する場合がある。
ＩＩＩ．製品
本発明の別の態様では、上記された障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、容器上又は該容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成する場合がある。容器は、組成物自体、又は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物との組み合わせで、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有するバイアルでもよい。）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を処置するのに使用されることを示す。更に、本製品は、（ａ）本製品に含有される組成物を含む第１容器であって、同組成物が本発明の抗体を含む第１容器と、（ｂ）本製品に含有される組成物を含む第２容器であって、同組成物が更なる細胞毒又はその他の方法での治療剤を含む第２容器とを含む。本発明のこの実施態様における製品は、組成物が特定の症状を処置するのに使用する場合があることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に又は追加的に、本製品は、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）容器を更に含む。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザ視点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
上記製品のいずれかが、抗トランスフェリンレセプター抗体に代えて、又は、同抗体に加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含むことができることが理解される。
ＶＩ．実施例
下記は、本発明の方法及び組成物の例示である。種々の他の実施態様を実施でき、上記提供される一般記載を提供すると理解される。
材料及び方法
リコンビナントＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の説明書に従って使用した。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH（Regensburg, Germany）での化学合成により調製した。合成した遺伝子フラグメントを、増殖／増幅用のE. coliプラスミド内にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確かめた。あるいは、短い合成ＤＮＡフラグメントを、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより、又は、ＰＣＲによりアッセンブリした。各オリゴヌクレオチドを、metabion GmbH（Planegg-Martinsried, Germany）により調製した。
試薬
特に断りない限り、全ての市販の化学薬品、抗体、及びキットを、製造者者のプロトコールに従って提供されたまま使用した。
実施例１
ウサギ及びマウスの免疫化
マウスの免疫化
ＮＭＲＩマウスを、ヒト又はカニクイザルの全長ＴｆＲをコードするプラスミド発現ベクターを使用し、１００μg ベクターＤＮＡの皮内適用と、続けて、エレクトロポレーションした（０．１ms中に１０００V/cmの２方形波、間隔０．１２５ｓ、続けて、１０ms中に２８７．５V/cmの４方形波、間隔０．１２５ｓ）とにより遺伝学的に免疫化。０、１４、２８、４２、５６、７０、及び８４日目に、６又は７回のいずれかの連続的な免疫化を、マウスに受けさせた。４回目及び６回目の免疫化を、カニクイザルＴｆＲをコードするベクターにより行った。ヒトＴｆＲをコードするベクターを、他の全ての免疫化に使用した。血液を、３６、７８、及び９２日目に採取し、血清を調製した。同血清を、ＥＬＩＳＡによる力価決定に使用した（以下を参照のこと）。最も高い力価を有する動物を、９６日目に、１０６個のヒトＴＦ−１細胞又は５０μg リコンビナントのヘリカルドメイン（Ｌｅｕ１２２で始まり、Ａｓｎ６０８で終わり、ヒトＦｃ領域に対するＮ末端融合物としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現しており、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製され、ヒトＴｆＲの細胞外ドメイン）を欠いたヒト可溶性ＴｆＲのいずれかの静脈内注入によりブースティングするのに選択した。モノクローナル抗体を、安定してトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の表面上に発現している、ヒト及びカニクイザルのトランスフェリンレセプターに結合するその能力に基づいて、ハイブリドーマ技術により単離した（実施例４を参照のこと）。
ウサギの免疫化
ニュージーランドホワイトウサギ又はヒト化抗体レパートリを発現しているトランスジェニックウサギを、ヒト又はカニクイザルの全長ＴｆＲをコードするプラスミド発現ベクターを使用し、４００μg ベクターＤＮＡの皮内適用と、続けて、エレクトロポレーション（１０ms中に７５０V/cmの５方形波、間隔１ｓ）とにより遺伝学的に免疫化した。０、１４、２８、５６、８４、及び１１２日目に、６回の連続的な免疫化を、ウサギに受けさせた。４回目及び６回目の免疫化を、カニクイザルＴｆＲをコードするベクターにより行った。ヒトＴｆＲをコードするベクターを、他の全ての免疫化に使用した。血液（推定合計血液量の１０％）を、３５、６３、９１、及び１１９日目に採取し、血清を調製した。同血清を、ＥＬＩＳＡにより力価決定に使用した（以下を参照のこと）。末梢単核球を単離し、Ｂ細胞クローニング法における抗原特異的Ｂ細胞のソースとして使用した（実施例２を参照のこと）。
血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ）
ヒトリコンビナント可溶性ＴｆＲ（R&D Systems Cat. No. 2474-TR）を、９６ウェルのNUNC Maxisorbプレートに、ＰＢＳ中の３μg/mL、１００μL/ウェルで固定し、続けて、同プレートを、ＰＢＳ中の２％ ＣｒｏｔｅｉｎＣ、２００μL/ウェルでブロッキングし、ＰＢＳ中０．５％ ＣｒｏｔｅｉｎＣ、１００μL/ウェルで、二重での抗血清の連続希釈を加え、（１）全てのマウス血清について、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000）、（２）全てのウサギ血清について、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000）、（３）トランスジェニックウサギの血清のみについて、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000）、（４）トランスジェニックウサギからの血清のみについて、ビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ抗体（Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5 000）及びストレプトアビジン−ＨＲＰにより検出し、０．５％ ＣｒｏｔｅｉｎＣ、１００μL/ウェルで希釈した。全ての工程について、プレートを、３７℃で１時間インキュベーションした。全ての工程間において、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。シグナルを、BM Blue POD Substrate soluble（Roche）を１００μL/ウェルで加えることにより発生させ、１M ＨＣｌを１００μL/ウェルで加えることにより停止させた。吸光度を、参照としての６９０nmに対して、４５０nmで読み出した。力価を、最大半量シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
実施例２
ウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核球（ＯＰＢＭＣ）の単離
要約すると、血液サンプルを、６匹の動物（２匹の野生型（ｗｔ）ウサギ及び４匹のトランスジェニック（ｔｇ）ウサギ）から採取した。これらのウサギを、２通りの免疫化キャンペーン：２匹のｗｔウサギ及び２匹のｔｇウサギを含む第１キャンペーン及び２匹のｔｇウサギを含む２匹のｔｇウサギから得た（実施例「ウサギの免疫化」も参照のこと）。ＥＤＴＡ含有全血を、lympholyte mammal（Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada）を使用し、製造者の仕様書に従って、密度遠心分離前に１×ＰＢＳ（PAA, Pasching, Austria）で２倍希釈した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳで２回洗浄した。
ＥＬ−４ Ｂ５培地
ＲＰＭＩ１６４０（Pan Biotech, Aidenbach, Germany）に、１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT, USA）、２mM グルタミン、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA, Pasching, Austria）、２mM ピルビン酸ナトリウム、１０mM ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）、及び０．０５mM β−メルカプトエタノール（Gibco, Paisley, Scotland）を添加した。
細胞の枯渇
第１免疫化キャンペーン：ＣＨＯ細胞のコンフルエントな単層で覆った、無菌の６ウェルプレート（細胞培養グレード）を、非特異的付着によるマクロファージ／単球及び非特異的に結合するリンパ球を枯渇させるのに使用した。
第２免疫化キャンペーン：ＣＨＯ細胞で覆ったウェルを使用する枯渇工程を省略した。ハムスタートランスフェリンレセプター抗体に交差反応性である抗体産生Ｂ細胞が枯渇するであろうことを排除できなかったためである。したがって、ブランクである無菌の６ウェルプレート（細胞培養グレード）を、ハムスター交差反応性（及び、おそらくマウス交差反応性）の表面抗体を産生する可能性のあるＢリンパ球が、ワークフローにおける次の工程に達するのが可能なように、非特異的付着によるマクロファージ及び単球を枯渇させるのに使用した。
各免疫化キャンペーンについて、各ウェルを、最大４mL 培地と、免疫化したウサギからの６×１０６個以下のＰＢＭＣとを満たし、インキュベーター中において３７℃で１時間結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パニング工程に使用した。
ヒトトランスフェリンレセプターでのＢ細胞濃縮
ヒトトランスフェリンレセプター陽性ＣＨＯ細胞の単層で覆った６ウェルの組織培養プレートを、４mL 培地当たりに６×１０６個以下のＰＢＬで播種し、インキュベーター中において３７℃で１時間結合させた。付着しなかった細胞を、１×ＰＢＳで１〜２回、ウェルを注意深く洗浄することにより除去した。残りの付着した細胞を、トリプシンにより、インキュベーター中において３７℃で１０分間引き剥がした。トリプシン処理を、ＥＬ−４ Ｂ５培地により停止させた。細胞を、免疫蛍光染色まで、氷上で維持した。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（AbD Serotec, Dusseldorf, Germany）を、単一細胞ソーティングに使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベーションさせ、暗所において４℃で４５分間インキュベーションした。染色後、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最終的に、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ分析に直ちに供した。ヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を、ＦＡＣＳ分析前に５μg/mLの濃度で加えて、死んだ細胞と生きた細胞との間を識別した。
コンピュータを備えたBecton Dickinson FACSAria及びFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences, USA）を、単一細胞ソーティングに使用した。
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養を、Zubler et al. (1985)に記載されている方法と同様の方法により準備した。簡潔に、単一ソーティングしたウサギＢ細胞を、２００μL/ウェル Pansorbin Cells（1:100000）（Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland）、５％ ウサギ胸腺細胞上清（charge TSN-M13 (10242), MicroCoat, Bernried, Germany）、及びガンマ線照射マウスＥＬ−４−Ｂ５胸腺細胞（２．５×１０４個／ウェル）を含有するＥＬ−４ Ｂ５培地を含む９６ウェルプレート中で、インキュベーター中において、５％ ＣＯ２の雰囲気下での３７℃において７日間培養した。Ｂ細胞培養上清を、スクリーニングのために除去し、残った細胞を、直ちに収集し、ＲＬＴバッファー（Qiagen, Hilden, Germany） １００μL中において、−８０℃で凍結させた。
実施例３
一価の抗ＴｆＲ ＩｇＧの選択及び産生のためのファージディスプレイ
ファージディスプレイによる選択
ヒト及びカニクイザルのＴｆＲに結合する抗体の生成を、標準的なプロトコールを使用するファージディスプレイにより行った（Silacci et al, Proteomics, 5 (2005) 2340-2350）。ｈＴｆＲ−Ｆｃ（ＫｉＨ）−Ａｖｉ（ＫｉＨ＝ノブ−ｉｎｔｏ−ホール、Ａｖｉ＝Ａｖｉタグ）抗原についての合成遺伝子を、Ｃ末端Ａｖｉタグ（配列番号９９）を有するヒトのホールＦｃ領域のＮ末端ヒンジにｈＴｆＲ ＥＣＤを結合することによりクローニングし、哺乳類発現ベクター内にライゲーションした。全ての哺乳類発現ベクターは、転写及び翻訳の開始のためのＭＰＳＶプロモータを有する。ここで、転写は、ＯＲＦの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列により終了する。加えて、このベクターは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株中での自律複製用のＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含有する。正しいＯＲＦを、シークエンシングにより確認した。このベクターを、空のノブ−Ｆｃ領域とＢｉｒＡタンパク質とを共発現させ、１mM ビオチンを培養培地に加えることによる、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ懸濁細胞中での発現に使用した。得られたビオチン化タンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続けて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ｃｙＴｆＲ−Ｆｃ（ＫｉＨ）−Ａｖｉ抗原をそれぞれ生成した（配列番号１００）。
使用したライブラリは、ＶＨ１、３、４、及び５ファミリーのヒトフレームワークと、Ｖ−カッパ１、−２、及び−３ならびにＶ−ラムダ３を使用した完全な合成ライブラリとした。ランダム化アミノ酸は、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲＬ３中であった。ライブラリプールを、全ての種々の軽鎖ライブラリと共に各重鎖ＶＨを使用して生成した。選択を、下記手順に従って、溶液中で行った。１．各ライブラリの約１０１２個のファージミド粒子を、１００nM ビオチン化ＴｆＲ−ａｖｉ−ｈｉｓに、総量 １mLで０．５時間結合させる。２．ビオチン化ＴｆＲ−ａｖｉ−ｈｉｓ及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジンコートした磁性ビーズの添加により、１０分間捕捉する。３．５〜１０回のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０ １mL及び５〜１０回のＰＢＳ １mLを使用してビーズを洗浄する。４．ファージ粒子を、１００mM ＴＥＡ（トリエチルアミン） １mLの添加により１０分間溶出し、１M トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４ ５００μLを加えることにより中和する。５．指数的に増殖するE. coli TG1細菌をヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染で再感染させ、その後、後の選択ラウンドに使用するファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。選択を、一定又は低下する（１０−７M〜２×１０−９M）抗原濃度の何れかを使用して、３〜５ラウンドにわたって行った。ラウンド２において、抗原／ファージ複合体の捕捉を、ストレプトアビジンビーズに代えて、ニュートラビジンプレートを使用して行った。リコンビナント可溶性抗体に対して生成したバインダーは、多くの場合、細胞上において弱い結合しか示さなかったため、リコンビナント抗原での第２又は第３ラウンドの濃縮後に、ネイティブな抗原を提示する細胞を使用して、２つの更なる選択工程を導入した。ここで、２つの細胞株ＴＦ−１及びＮＣＩ−Ｈ４６０を使用した（両方ともATCCから入手）。簡潔に、１×１０６個の細胞を、レセプター媒介性内部移行を避けるために、約１０１２個のファージ粒子と、氷上で１時間インキュベーションした。洗浄を、ＰＢＳＴバッファー（１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）を使用して、５〜１０回の遠心分離工程により行った。全細胞を、ファージレスキュー用のＴＧ１細菌を感染させるのに使用した。
特異的なバインダーを、下記のようにＥＬＩＳＡにより特定した。ウェル当たりに、１０nM ビオチン化ＴｆＲ−ａｖｉ−ｈｉｓ １００μLを、ニュートラビジンプレートにコートした。Ｆａｂ含有細菌上清を加え、結合したＦａｂを、抗ＦＬＡＧ／ＨＲＰ二次抗体を使用することにより、そのＦＬＡＧ−タグを介して検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、可溶性Ｆａｂフラグメントとして、９６ウェルフォーマット中で細菌的に発現させた。上清を、ProteOn XPR36（BioRad）を使用するＳＰＲ分析により、反応速度スクリーニング実験に供した。最も高い親和性定数を有するＦａｂ発現クローンを特定し、対応するファージミドをシークエンシングした。
Ｆａｂ抗体の精製
Ｔｏｐ１０細胞を、全ての細胞ＥＬＩＳＡ陽性クローンのファージミドプラスミドにより、個々にトランスフェクションした。これら細胞を、培地中で増殖させ、Ｆａｂ抗体の生成を誘導した。Ｆａｂ抗体を、ペリプラズム調製により単離し、ＩＭＡＣを使用して精製した。
ＦＡＣＳ分析
精製したＦａｂ抗体を、ＴＦ−１細胞を種々の濃度で加えた。細胞に結合したＦａｂ抗体を、蛍光ラベルした抗Ｆａｂ抗体を使用して検出し、ＦＡＣＳにより測定した。ＥＣ５０値を算出した。
選択したクローンの生成及び特徴決定
ＩｇＧフォーマットへの変換
６〜２０分の複雑な半減期（ｔ１／２）又は１０nM〜５００nMの細胞におけるＥＣ５０を有し、ＦＡＣＳ又は細胞ＥＬＩＳＡのいずれかにおける明確な細胞結合シグナルと、ｈＴｆＲ−ＦＣ（ＫｉＨ）−Ａｖｉ及びｃｙＴｆＲ−Ｆｃ（ＫｉＨ）−Ａｖｉ抗原の両方に対する交差反応性結合性とを有する選択クローンを、ＩｇＧフォーマットに変換するために選択した。
したがって、ＶＬドメインを、ＰＣＲにより増幅し、上記されているように、哺乳類発現ベクター内のＣＬドメインのすぐ上流にクローニングした。更に、ＶＨドメインを、ＰＣＲにより増幅し、ＣＨ−Ｆｃドメインのすぐ上流にクローニングした。両発現ベクターの配列を決定した。
ＩｇＧ抗体の産生
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ懸濁細胞を、ＬＣ及びＨＣコードプラスミドの両方によりトランスフェクションし、７日間培養した。上清を、ろ過滅菌によりきれいにした。ＩｇＧ濃度を、プロテインＡクロマトグラフィーにより決定した。
ＴａｇＬｉｔｅ技術を使用したＥＣ５０の決定
膜貫通ドメインを含むｈＴｆＲ又はｃｙＴｆＲそれぞれのＥＣＤ遺伝子を、哺乳類発現ベクター内のＳＮＡＰタグに対して下流にライゲーションした。このベクターを使用して、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ懸濁細胞をトランスフェクションし、ＴｆＲとＣ末端ＳＮＡＰタグとの融合物（配列番号１０１、配列番号１０２）を提示させた。ＳＮＡＰタグを、SNAP-Lumi4Tb（Cisbio）により特異的にラベルした。ラベリング効率を、６１５nmでのテルビウムの放出を測定することにより決定した。ラベルした細胞を、−８０℃で保存した。
抗ヒトＦｃ−ｄ２ ＩｇＧ抗体の存在下において、ラベルした細胞を、種々の希釈において、ＩｇＧ上清と共にインキュベーションし、ＦＲＥＴシグナル（ドナー染料Lumi4Tb：６１５nM及びアクセプター染料ｄ２：６６５nMの放出）を、４時間後に測定した。ＥＣ５０値を算出し、２５個のＩｇＧを得た。これらのＩｇＧは、ｈＴｆＲ及びｃｙＴｆＲの両方に結合した。
ＦＡＣＳによる細胞結合性の決定
全長ｈＴｆＲ又はｃｙＴｆＲそれぞれの遺伝子を、哺乳類発現ベクター内にクローニングした。このベクターを、ＣＨＯ ＥＢＮＡ懸濁細胞のトランスフェクションに使用した。ＩｇＧ上清を、ＴｆＲ提示細胞に直接加えた。ＰＢＳＴで洗浄した後、抗原−抗体複合体を、抗ｈｕＦｃ ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体コンジュゲートを使用して検出し、続けて、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジンにより発色させた。機能性ディスプレイを、市販の抗ＴｆＲ抗体を使用して確かめた。２５個全てのＴａｇＬｉｔｅ陽性クローンは、強力な結合シグナルを示した。
一価のＩｇＧ様分子の生成及び精製
ＶＨドメインを、ヒトノブＩｇＧ１ ＨＣをコードする哺乳類発現ベクター内にクローニングした。同ＨＣは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を有する。このベクターを、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ懸濁細胞中で発現させ、ＬＣ（上記されているベクター）と、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｈ４３５Ｒ、及びＹ４３６Ｆの突然変異を有する空のホールＦｃドメインとを共発現させるのに使用した。得られたタンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、単量体タンパク質は、９５％未満であり、同タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。
実施例４
細胞ＥＬＩＳＡによるヒト及びカニクイザルＴｆＲ結合抗体の特定
ウサギＢ細胞又はマウスハイブリドーマの上清を、抗体を認識するヒト及びカニクイザルＴｆＲについてスクリーニングするために、安定してトランスフェクションされているＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用する細胞ＥＬＩＳＡを利用した。安定したトランスフォーマントを、ヒト又はカニクイザルＴｆＲと、ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼのための発現カセットを含有する発現プラスミドによりＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションすることにより得た。トランスフェクション後、細胞を、５００μg/mL Ｇ４１８（Life Technologies）を含有する増殖培地中で希釈した。クローンを増殖させた後、細胞を剥がし、ＭＥＭ−７５（Abcam）又は１３Ｅ４（Life Technologies）及び、ヒトもしくはカニクイザルＴｆＲのためのＰＥラベル二次抗体で染色した。高度に蛍光した細胞を、９６ウェルプレートのウェル内で、単一細胞としてソーティングした（FACS Aria）。７日の増殖後、再度、クローンを、ＴｆＲ発現について確認した。最も発現しているクローンを、細胞ＥＬＩＳＡ実験のために選択した。
簡潔に、３８４ウェルプレートのウェル当たりに、１５，０００個の細胞を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２において１８時間インキュベーションした。上清を、自動洗浄器（BIOTEK）を使用して除去した。抗体含有上清 ３０μL、続けて、増殖培地 ２４μLを、各ウェルに加えた。２時間のインキュベーション後に、ウェルを空にし、ＰＢＳ中の０．０５％ グルタルアルデヒド ３０μLを、ＲＴにおいて４５分間加えた。ＰＢＳ／０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）による３回の洗浄後、ブロッキングバッファー中に１：５０００で希釈した、抗ウサギＨＲＰ又は抗マウスＨＲＰ（Southern Biotech） ３０μLを加えた。プレートを、ＲＴで１時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＳＴで６回洗浄し、シグナルを、ウェエ当たりに、ＴＭＢ ３０μLを使用して生成し、吸光度を、４５０nmにおいて測定した。
実施例５
抗ＴｆＲ抗体のクローニング及び発現
リコンビナントＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の説明書に従って使用した。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH（Regensburg、Germany）における化学合成により調製した。合成した遺伝子フラグメントを、増殖／増幅用のE. coliプラスミド中にクローニングした。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確かめた。あるいは、短い合成ＤＮＡフラグメントを、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより、又は、ＰＣＲによりアッセンブリした。各オリゴヌクレオチドを、metabion GmbH（Planegg-Martinsried, Germany）により調製した。
ＶドメインのＰＣＲ増幅
トータルＲＮＡを、NucleoSpin 8/96 RNAキット（Macherey&Nagel; 740709.4, 740698）を使用し、製造者のプロトコールに従って、（ＲＬＴバッファー−Qiagen - Cat. No 79216に再懸濁させた）Ｂ細胞ライゼートから調製した。ＲＮＡを、ＲＮＡｓｅフリー水 ６０μLにより溶出した。ＲＮＡ ６μLを使用し、製造者の説明書に従って、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen 18080-400）及びオリゴ−ｄＴ−プライマーを使用するリバーストランスクリプターゼ反応によりｃＤＮＡを生成した。全ての工程を、Hamilton ML Starシステムにおいて行った。ｃＤＮＡ ４μLを使用して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、最終容量 ５０μLにおいて、野生型ウサギＢ細胞の重鎖についてのプライマーであるrbHC.up及びrbHC.do、軽鎖についてのプライマーであるrbLC.up及びrbLC.doと、トランスジェニックウサギＢ細胞の軽鎖についてのBcPCR_FHLC_leader.fw及びBcPCR_huCkappa.revを使用する、AccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）により増幅させた（以下の表を参照のこと）。全てのフォワードプライマーは、（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）シグナルペプチドに特異的であった。一方、リバースプライマーは、（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）定常領域に特異的であった。RbVH＋RbVLについてのＰＣＲ条件は、下記の通りとした。９４℃で５分の高温開始；９４℃で２０秒 ３５サイクル、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒、及び６８℃で７分での最後の伸長。HuVLについてのＰＣＲ条件は、下記の通りとした。９４℃５分の高温開始；９４℃で２０秒 ４０サイクル、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒、及び６８℃で７分での最後の伸長。
ＰＣＲ溶液 ５０μLの内の８μLを、48 E-ゲル ２％（Invitrogen G8008-02）にロードした。陽性のＰＣＲ反応を、NucleoSpin Extract IIキット（Macherey&Nagel; 740609250）を使用し、製造者のプロトコールに従って洗浄し、溶出バッファー ５０μL中に溶出した。全ての洗浄工程を、Hamilton ML Starletシステムで行った。
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現
ウサギモノクローナル二価抗体のリコンビナント発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）により、発現ベクター内にｃＤＮＡとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモータと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含有した。同発現カセットに加えて、プラスミドは、E. coli中でのプラスミド増幅のための、ｐＵＣ１８由来の複製起点と、アンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子とを含有した。基礎プラスミドの３つの変異体を使用した。１つのプラスミドは、ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含有する。一方、２つの更なるプラスミドは、ＶＬ領域を受け入れるウサギ又はヒトカッパＬＣ定常領域を含有する。
カッパ又はガンマ定常領域とＶＬ／ＶＨインサートとをコードする直線化発現プラスミドを、オーバーラッププライマーを使用するＰＣＲにより増幅させた。
精製したＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションして、一本鎖オーバーハングを生成した。この反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
次の工程において、プラスミド及びインサートを組み合わせ、ｒｅｃＡと共にインキュベーションして、部位特異的組換えを誘導した。組換えたプラスミドを、E. coli内にトランスフォーメーションした。翌日、増殖したコロニーを選択し、プラスミド調製、切断解析、及びＤＮＡシークエンシングにより、正しく組み換えられたプラスミドについて試験した。
抗体発現について、単離したＨＣ及びＬＣプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞内に一過性トランスフェクションした。上清を、１週間後収集した。
ウサギモノクローナル一価抗体の発現用のベクター生成
モノクローナル一価抗体として選択した候補のリコンビナント発現のために、全てのＶＨ鎖のウサギ定常領域を、ＣＨ３セグメント中にノブ突然変異を封入するヒト定常領域に変換した。ウサギ野生型Ｂ細胞由来のＶＬ鎖のために、ウサギＣカッパ定常領域を、ヒトに変換した。選択した候補のｃＤＮＡ ４μLを使用して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域を、最終容量 ５０μLにおいて、シグナルペプチドに特異的なフォワードプライマーと、（３’端における）（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）ヒト定常領域に相同なオーバーラップ配列（２０bp）を有するＣＤＲ３−Ｊ領域に特異的なリバースプライマーとを使用する、AccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）により増幅させた。ＶＨ及びＶＬ鎖の増幅のためのＰＣＲ条件は、下記の通りとした。９４℃で５分の高温開始；９４℃で２０秒 ３５サイクル、６８℃で２０秒、６８℃で４５秒、及び６８℃で７分での最後の伸長。
Ｈ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法（RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）により、発現ベクター内にｃＤＮＡとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモータと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含有した。同発現カセットに加えて、プラスミドは、E. coli中でのプラスミド増幅のための、ｐＵＣ１８由来の複製起点と、アンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子とを含有した。基礎プラスミドの２つの変異体を使用した。１つのプラスミドは、新たに増幅したＶＨ領域を受け入れるように設計されたヒトＩｇＧ定常領域を含有する。第２プラスミドは、ＶＬ領域を受け入れるヒトカッパＬＣ定常領域を含有する。
カッパ又はガンマ定常領域とＶＬ／ＶＨインサートとをコードする直線化発現プラスミドを、オーバーラッププライマーを使用するＰＣＲにより増幅させた。
精製したＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションして、一本鎖オーバーハングを生成した。この反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
次の工程において、プラスミド及びインサートを組み合わせ、ｒｅｃＡと共にインキュベーションして、部位特異的組換えを誘導した。組換えたプラスミドを、E. coli内にトランスフォーメーションした。翌日、増殖したコロニーを選択し、プラスミド調製、切断解析、及びＤＮＡシークエンシングにより、正しく組み換えられたプラスミドについて試験した。
実施例６
一価の抗ＴｆＲ抗体の一過性発現
抗体を、Ｆ１７培地（Invitrogen Corp.）中で培養した、一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３由来）中で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成した。トランスフェクションのために、「293-Free」トランスフェクション試薬（Novagen）を使用した。上記されている抗体及び抗体ベースの改変分子を、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションを、製造者の説明書において特定されたように行った。リコンビナントタンパク質含有細胞の培養上清を、トランスフェクション後３〜７日で収集した。上清を、精製まで低温（例えば、−８０℃）において保存した。
例えば、ＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンのリコンビナント発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に提供されている。
実施例７
高スループットでの片腕トランスフェリンレセプター抗体の精製
９６ディープウェルプレート中の片腕抗体を含有する洗浄上清 ５０mLを、MabSelectSuReカラム ２００μLにロードした。ｐＨ７．４でのＰＢＳによる洗浄工程後に、タンパク質を、Tecan/Atollシステムを使用して、２．５mM ＨＣｌで溶出して、溶出液 ０．５mLを得た。溶出液を、２M トリス ｐＨ８により中和した。精製したタンパク質を、Nanodrop分光計を使用して定量し、変性及び還元条件下におけるＣＥ−ＳＤＳ及び分析的ＳＥＣにより分析した。高純度（９５％超）のタンパク質を得るために、大部分の抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて更に精製して、半抗体（ｈａｌｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ノブ−ノブ抗体、及びより高度の凝集体から分離しなければならない。次に、サンプル ５００μLを、１４０mM ＮａＣｌ ｐＨ６．０を含有する２０mM ヒスチジン中で、Dionex UltiMate 3000を使用するSuperdex200 10/300GLに注入した。この方法は、１日当たりに２５〜３０個のサンプルを画分することができるため、片腕フォーマットでの大量のスクリーニングヒットを洗練することができる。画分をプールし、上記されたように再度分析した。
実施例８
トランスサイトーシスアッセイ法のためのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞培養
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３のための培地及びサプリメント（Weksler, B. B. et al., FASEB J. 19 (2005), 1872-1874）を、Lonzaから得た。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（２６〜２９回の継代）を、２．５％ ＦＢＳ、添加した成長因子の１／４を含有し、添加したヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、及びアスコルビン酸で完全に補完されたＥＢＭ２培地中で、コラーゲンコートしたカバーガラス（顕微鏡）又はフラスコにおいて、コンフルエントに培養した。
全てのトランスサイトーシスアッセイ法について、高密度の孔（１×１０８個の孔/cm2）のＰＥＴ膜フィルタインサート（０．４μm、直径１２ｍｍ）を、１２ウェルの細胞培養プレートにおいて使用した。最適な培地容量を、頂端及び基底チャンバそれぞれについて、４００μL及び１６００μLと算出した。フィルタインサートの頂端チャンバを、ラットの尾のコラーゲンＩ（７．５μg/cm2）、続けて、フィブロネクチン（５μg/cm2）でコートした。各インキュベーションを、ＲＴで１時間継続した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ＥＭＢ２培地中で、コンフルエントな単層（約２×１０５個／cm2）に、１０〜１２日間増殖させた。
実施例９
一価抗体のトランスサイトーシスアッセイ法
アッセイ法全体を、実施例１に記載されているのと別の方法で再構成した血清フリーＥＢＭ２培地中で行った。細胞を含むフィルタインサートを、一価抗体（濃度：２．６７μg/mL）と共に、頂端において、３７℃で１時間インキュベーションした。続けて、頂端及び基底全体の培地を収集した。これらの値から、傍細胞フラックスを算出した。単層を、血清フリー培地中で、頂端（４００μL）及び基底（１６００μL）において、ＲＴで３回×３〜５分間それぞれ洗浄した。全ての洗浄液を収集して、結合していない抗体の除去効率をモニターした。予め温めた培地を、頂端チャンバに加え、フィルタを、（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで一晩ブロッキングした）予め温めた培地 １６００μLを含有する、新たな１２ウェルプレートに移した。この時点で、特異的抗体取込みを決定するために、フィルタ上の細胞を、ＲＩＰＡバッファー ５００μL中で溶解させた。残ったフィルタを、３７℃でインキュベーションし、サンプルを、種々の時点で収集して、抗体の頂端及び／又は基底での放出を決定した。サンプル中の抗体含量を、非常に高感度のＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して定量した（実施例３を参照のこと）。各時点において、データを、３つのフィルタ細胞培養物から生成した。
実施例１０
トランスサイトーシスアッセイ法後の高感度ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
手順全体を、洗浄工程用の自動洗浄機を使用してＲＴで行った。３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中の１μg/mL Ｆｃγ−特異的な抗ヒト／マウスＩｇＧにより、３０μL/ウェルで２時間コートし、続けて、ヒト及びマウスＩｇＧアッセイ法それぞれのために、１％ ＢＳＡ又は１％ ＣｒｏｔｅｉｎＣを含有するブロッキングバッファーであるＰＢＳ中で、１時間インキュベーションした。トランスサイトーシスアッセイ法からの段階希釈したサンプルと、トランスサイトーシスアッセイ法に使用される標準的な濃度の抗体とを、プレートに加え、２時間インキュベーションした。４回の洗浄後、ブロッキングバッファー中の５０ng/mL 抗ヒト／マウス−Ｆ（ａｂ）２−ビオチンを、３０μL/ウェルで加え、更に２時間インキュベーションした。６回洗浄した後、５０ng/mL（ｈｕＩｇＧアッセイ法）又は１００ng/mL（ｍＩｇＧアッセイ法） ポリ−ＨＲＰ４０−ストレプトアビジン（Fitzgerald；１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中）を、３０μL/ウェルで加え、３０分間インキュベーションした。４回の洗浄後、免疫複合体を、ＢＭ化学発光基質（Roche）を３０μL/ウェルで加えることにより検出した。発光シグナルを、発光プレートリーダを使用して測定し、濃度を、適合する検量線を使用して算出した。アッセイ法の感度を、１０pg/mL〜１０ng/mLの範囲とした。
実施例１１
トランスフェクションされたｈＴｆＲ変異体を有するＣＨＯ細胞の細胞ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング
ヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴｆＲ）上のエピトープ領域を決定可能にするために、ヒトとマウスとのＴｆＲ間かなりの相同性（７７％同一性）にも関わらず、両オルソログ間の良好な交差反応性を示す、細胞外部分に対する抗体が公知でないという論理的根拠に従って、突然変異を、表面露出アミノ酸のクラスターが整列させたマウスＴｆＲ配列中とは異なるアミノ酸を有する位置において、ｈＴｆＲ配列内に導入した。対応する突然変異を有するプラスミドのクローニングは前に記載されている。ヒトＴｆＲバインダーのそれらのエピトープへの結合性をマッピングするために、ＣＨＯ細胞を、記載されているプラスミドにより、一過性にトランスフェクションした。抗体結合性を、細胞ＥＬＩＳＡで測定した。簡潔に、通常の増殖培地（ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ）中での実験の前日に、９６ウェルプレートのウェル当たりに、１０４個の細胞を播種した。別の日に、培地を、OPTI-MEM血清低減培地（Gibco）に変更し、OPTI-MEM １２００μL、１２μg プラスミドＤＮＡ、及びXtremeGENEトランスフェクション試薬（Roche） １２μLの混合物 １０μLを、プレインキュベーションの３０分後に、ウェルに加えた。細胞を、３７℃／７．５％ ＣＯ２で２日間インキュベーションした。ついで、培地を除去し、ＴｆＲ抗体を、１nM〜１００nMの濃度で増殖培地中に加え、続けて、４℃で２時間インキュベーションした。その後、抗体溶液を、ＰＢＳ中の０．０５％ グルタルアルデヒドにより置き換えた。細胞を、ＲＴで１５分間固定し、ついで、ＰＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦｃ二次抗体（BioRad；ＥＬＩＳＡブロッキング試薬（Roche）中に1:2000）と共に、ＲＴで１．５時間インキュベーションし、シグナルを、ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェル当たりに ＴＭＢ ５０μLを使用して生成し、吸光度を、４５０nmで測定した。
実施例１２
ヒトＴｆＲ−抗体相互作用についての表面プラズモン共鳴系結合アッセイ法
結合性実験を、抗ヒトＦａｂ抗体（GE Healthcare, cat.no 28-9583-25）で予め処理したＣ１センサーチップ（GE Healthcare, cat.no. BR1005-35）を備える、BIAcore B 4000（GE Healthcare）において、標準的なアミノカップリング化学法を使用して、供給元のマニュアに従って行った。
反応速度測定のために、サンプル抗体を、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中で、２５℃において、接触時間６０秒及び流速１０μL/分を適用して固定した。リコンビナントＨｉｓ６タグ付きヒトトランスフェリンレセプター（R&D systems, cat.no 2474-TR-050）を、濃度を増大させて加え、シグナルを経時的にモニターした。流速３０μL/分での１５０秒の会合時間及び６００秒の解離時間の平均期間を記録した。データを、１：１結合モデル（ラングミュア等温線）を使用して当て嵌めた。

Claims (11)

  1. 脳エフェクター実体と、場合により、リンカーと、血液脳関門レセプターに結合する正確に１つの一価の結合実体とを含む血液脳関門シャトルモジュールであって、ここで、存在する場合、前記リンカーは、前記エフェクター実体を、前記血液脳関門レセプターに結合する前記一価の結合実体に連結しており、前記血液脳関門レセプターは、トランスフェリンレセプターであり、ここで、前記血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、
    （ｉ）（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
    又は、
    （ｉｉ）（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
    を含む、
    血液脳関門シャトルモジュール。
  2. 前記血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、及びＶＨＨからなる群より選択される分子を含む、請求項１に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  3. 前記一価の結合実体は、ヒトトランスフェリンレセプター及びカニクイザルトランスフェリンレセプターに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  4. 前記血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、トランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦａｂを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  5. 前記血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、トランスフェリンレセプターに対する１つのｓｃＦｖを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  6. 前記脳エフェクター実体は、神経疾患薬、神経栄養因子、成長因子、酵素、細胞毒、脳ターゲットに対する抗体、脳ターゲットに対するモノクローナル抗体、脳ターゲットに対するペプチドからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  7. 前記脳ターゲットは、β−セクレターゼ１、Ａβ（Ａベータ）、上皮成長因子、上皮成長因子レセプター２、ｔａｕ、リン酸化ｔａｕ、リン酸化ｔａｕ（ｐＳ４２２）、アポリポタンパク質Ｅ４、アルファシヌクレイン、アルファシヌクレインのオリゴマーフラグメント、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、デスレセプター６、アミロイド前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、及びカスパーゼ６からなる群より選択される、請求項６に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  8. 前記血液脳関門レセプターに結合する一価の結合実体は、直接脳エフェクター実体のＣ末端にコンジュゲートしているか、又はリンカーを介して脳エフェクター実体のＣ末端にコンジュゲートしているかのいずれかである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  9. 前記脳エフェクター実体は、脳ターゲットに対する全長抗体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュールを含む、医薬製剤。
  11. 血液脳関門を通過させて脳エフェクター実体を輸送するのに使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルモジュール。
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Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
RU2013141078A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
RU2016115866A (ru) 2013-10-11 2017-11-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифические антитела с обменянными доменами и одинаковыми вариабельными доменами легкой цепи
JP6721590B2 (ja) 2014-12-03 2020-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
IL310251A (en) 2015-05-04 2024-03-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, compositions comprising same and uses thereof
CN120665195A (zh) 2015-06-24 2025-09-19 豪夫迈·罗氏有限公司 具有定制亲和力的抗转铁蛋白受体抗体
EP3315606B1 (en) 2015-06-24 2025-11-26 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-human transferrin receptor antibody permeating blood-brain barrier
CN107849150B (zh) 2015-06-24 2021-12-14 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016333512B2 (en) * 2015-10-02 2022-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human CD20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
WO2017055392A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP7239320B2 (ja) * 2015-10-02 2023-03-14 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 多重特異性抗体
EP3150637A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
AR106199A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de células t
WO2017055385A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20170096485A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3150636A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017055395A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
JP6937746B2 (ja) * 2015-10-02 2021-09-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｄ１９×ｃｄ３ｔ細胞活性化抗原結合分子
BR112018000835A2 (pt) * 2015-10-02 2018-09-11 Hoffmann La Roche molécula, um ou mais polinucleotídeos, um ou mais vetores, célula, método de produção da molécula, composição, uso da molécula, método de tratamento de uma doença e método para induzir a lise de uma célula-alvo
WO2017055393A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055318A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
EP3400246B1 (en) 2016-01-08 2020-10-21 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
EP3432927A4 (en) * 2016-03-24 2019-11-20 Gensun Biopharma Inc. TRIPLE-SPECIFIC INHIBITORS FOR CANCER TREATMENT
JP6956741B2 (ja) 2016-12-26 2021-11-02 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
EP3561058B1 (en) 2016-12-26 2025-07-23 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein including bdnf
NZ756763A (en) 2017-02-17 2023-04-28 Denali Therapeutics Inc Engineered transferrin receptor binding polypeptides
RU2750721C2 (ru) 2017-03-10 2021-07-01 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения мультиспецифических антител
CN108864283B (zh) * 2017-05-12 2021-10-29 中国药科大学 一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用
JP7280238B2 (ja) * 2017-07-17 2023-05-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインに対する抗原結合領域及びその使用方法
HRP20231118T1 (hr) * 2017-08-10 2023-12-22 Denali Therapeutics Inc. Sintetizirani polipeptidi koji vežu transferinske receptore
EP3904389A1 (en) 2017-10-02 2021-11-03 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
KR20200118151A (ko) 2018-02-07 2020-10-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료 단백질 전달을 위한 방법 및 조성물
ES2929416T3 (es) 2018-06-21 2022-11-29 Novo Nordisk As Nuevos compuestos para el tratamiento de la obesidad
WO2020180882A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Nkarta, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
JP2023520821A (ja) * 2020-04-08 2023-05-19 アリアダ セラピューティクス，インコーポレイテッド 血液脳関門送達のための組成物および方法
KR20230024984A (ko) * 2020-06-12 2023-02-21 엔카르타, 인크. Cd70-지시 암 면역요법용 유전적으로 변형된 자연 살해 세포
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
WO2022081900A1 (en) * 2020-10-15 2022-04-21 Bioincept, Llc Systems, compositions and methods of determining viability of embryos using the same
MX2023008971A (es) * 2021-01-29 2023-08-15 Amgen Inc Materiales y metodos para el seguimiento del cancer mediante la administracion de un anticuerpo anti-mcl1.
JP2024522194A (ja) * 2021-06-10 2024-06-11 ザ テキサス エイ・アンド・エム ユニヴァーシティ システム ダウン症候群に伴う加速された老化の治療
WO2023277627A1 (ko) * 2021-07-02 2023-01-05 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
AU2022340568A1 (en) 2021-09-01 2024-03-28 Biogen Ma Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof
JP2025503523A (ja) * 2021-12-31 2025-02-04 イムニューラン・インコーポレーテッド 脳血管障壁透過性融合タンパク質及びその用途
KR102575322B1 (ko) * 2021-12-31 2023-09-08 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
CN119562966A (zh) 2022-05-13 2025-03-04 生物技术公司 靶向hiv的rna组合物
KR20250058783A (ko) 2022-07-29 2025-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스페린 수용체 1로 재표적화된 바이러스 입자
CA3257739A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NON-HUMAN ANIMALS CONTAINING A MODIFIED TRANSFERRIN RECEPTOR LOCUS
WO2024141955A1 (en) 2022-12-28 2024-07-04 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
CN120603851A (zh) 2023-01-30 2025-09-05 伊萨尔生物科学有限责任公司 用于治疗神经退行性疾病的人抗trem2抗体
WO2024206161A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Denali Therapeutics Inc. Abeta-targeting proteins and methods of use
WO2025027576A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2025027579A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2025054419A1 (en) * 2023-09-08 2025-03-13 California Institute Of Technology Compositions for transport of therapeutic cargos using antibody binders targeting ca-iv
WO2025166073A1 (en) * 2024-01-31 2025-08-07 Alector Llc Compositions comprising anti-sortilin antibodies and uses thereof
WO2025172924A1 (en) * 2024-02-15 2025-08-21 Janssen Biotech, Inc. Anti-transferrin receptor compositions and methods thereof
WO2025208010A1 (en) * 2024-03-29 2025-10-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies targeting human basal cell adhesion molecule
CN118027210B (zh) * 2024-03-29 2025-01-28 深圳泽安生物医药有限公司 靶向CD79b和CD3的双特异性抗体及其用途
WO2025228542A1 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Genmab B.V. Method for co-expression of a plurality of antibodies
EP4644413A1 (en) 2024-05-03 2025-11-05 Genmab B.V. Binding agents having altered fc-mediated effector functions

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2123307A1 (en) * 1991-11-26 1993-06-10 Phillip M. Friden Process for the preparation of transferrin receptor specific antibody-neuro-pharmaceutical or diagnostic agent conjugates
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
MX353234B (es) 1999-01-15 2018-01-08 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con función efectora alterada.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK1176195T3 (da) 1999-04-09 2013-06-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
WO2003085118A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RU2303461C9 (ru) * 2002-08-06 2007-12-27 Глаксо Груп Лимитед Антитела против миелин-ассоциированного гликопротеина (mag)
ATE473011T1 (de) * 2002-08-30 2010-07-15 Biorexis Pharmaceutical Corp Modifizierte transferrin-fusionsproteine mit doppelten transferrin-amino- oder carboxy- terminalen domänen
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
RS20100366A (sr) 2002-12-16 2011-04-30 Genentech, Inc. Varijante imunoglobulina i njihova upotreba
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CN1788017B (zh) * 2003-02-10 2013-04-24 to-BBB控股股份有限公司 炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk COMPOSITION OF CONDENSED PROTEINS
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
HUE042914T2 (hu) 2003-11-05 2019-07-29 Roche Glycart Ag CD20 antitestek fokozott fc receptorkötõ affinitással és effektorfunkcióval
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
ZA200702427B (en) * 2004-09-17 2008-12-31 Domantis Ltd Compositions monovalent for CD40L binding and methods of use
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006056879A1 (en) 2004-11-29 2006-06-01 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Human blood brain barrier model
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
US8142781B2 (en) * 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
CN101370526B (zh) * 2005-11-28 2013-10-09 根马布股份公司 重组单价抗体及其制备方法
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
AU2007256639A1 (en) * 2006-06-07 2007-12-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
US8497246B2 (en) 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101245107B (zh) * 2007-02-14 2010-10-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US20100098693A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-22 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of organophosphatases
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
CA2757669A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-1/anti-c-met antibodies
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
AU2010245011B2 (en) 2009-04-27 2015-09-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CA2761233A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2011066374A2 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antagonists of il-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
FR2953841B1 (fr) * 2009-12-16 2011-12-30 Centre Nat Rech Scient Anticorps diriges contre le recepteur de la transferrine et leurs utilisations pour l'immunotherapie des tumeurs qui dependent du fer
JP5856073B2 (ja) 2009-12-29 2016-02-09 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
WO2012075037A1 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
MX359070B (es) * 2010-12-01 2018-09-13 Alderbio Holdings Llc Composiciones anti-ngf y uso de las mismas.
WO2012087835A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Boston Biomedical Research Institute Compositions and methods for enhancing protein folding
WO2012088247A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
TR201815420T4 (tr) 2011-03-29 2018-11-21 Roche Glycart Ag Antikor fc varyantları.
AU2012244816B2 (en) * 2011-04-20 2015-12-10 Roche Glycart Ag Method and constructs for the pH dependent passage of the blood-brain-barrier
JP5980202B2 (ja) 2011-05-09 2016-08-31 株式会社ペルセウスプロテオミクス トランスフェリン受容体を特異的に認識できる抗体
US9499608B2 (en) * 2011-06-08 2016-11-22 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against West Nile virus with improved CNS penetration
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
ES2740749T3 (es) 2012-04-20 2020-02-06 Merus Nv Métodos y medios para la producción de moléculas heterodiméricas similares a Ig
KR102036262B1 (ko) 2012-08-29 2019-10-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 혈액 뇌 장벽 셔틀
HRP20240107T1 (hr) 2013-05-20 2024-04-12 F. Hoffmann - La Roche Ag Protutijela na transferinski receptor i postupci uporabe

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