CN101245107B - 抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用，属于分子生物学领域。抗人转铁蛋白受体人源抗体，具有序列表SEQ ID No.1所示的单链抗体(scFv)氨基酸序列。本发明的优点是：人源抗体解决了靶向抗体的免疫原性问题，使其能够在人体长期反复给药；本发明采用的从大容量抗体库中筛选基因工程抗体的方法相对于单克隆抗体制备容易，易于大规模生产，抗体分子小，能够深入组织内部，具有明显的优势。本发明采用的pET-22b(+)载体，含有较强的T7启动子，可保证靶向抗体有较高的表达水平。优化后的诱导表达条件，使抗体以可溶形式被表达，蛋白活性较高。pET-22b(+)载体3’端带有6个His(组氨酸)的标签，可方便的使用Ni-NTAagarose进行亲合层析纯化。

Description

抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用，更具体地说是抗人转铁蛋白受体人源抗体、其核苷酸序列及含有该核苷酸的载体，属于分子生物学领域。

背景技术

转铁蛋白受体(Transferrin Receptor，TfR)是一种跨膜糖蛋白，由两个相同亚基组成同源二聚体，通过与转铁蛋白的相互作用介导铁的吸收。转铁蛋白受体在脊椎动物的具核细胞中表达，尤其富含于血脑屏障、胎盘组织和代谢旺盛、需要大量铁的肿瘤细胞及一些快速分裂的细胞表面，是血脑屏障和肿瘤定向转运的重要靶标。

血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞、基底膜和神经胶质细胞组成，其显著特点是脑毛细血管内皮细胞连接紧密，除气体分子和水分子外，限制了绝大多数物质的入脑。近年来蛋白质、多肽、多聚寡核苷酸等脑治疗药物(如芋螺毒素)的研究发展迅速，其中许多大分子具有很好的疗效，但因血脑屏障的屏蔽无法进入脑中发挥作用，成为中枢神经系统疾病治疗的瓶颈。目前临床上多应用鞘内或脑室穿刺直接给药以绕过血脑屏障，或采用渗透压休克法可逆性打开血脑屏障，这些方法技术要求高，副作用大，易造成颅内感染。近年有文献报道位于脑毛细血管内皮细胞壁上的某些特异性受体能介导大分子药物的转运，如转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、血管紧张素II受体、白介素受体I等，其中转铁蛋白受体和胰岛素受体的转运能力最强。但内源性转铁蛋白在血中的含量很高，与受体的结合近于饱和，胰岛素又会引起血糖的降低，因此转铁蛋白和胰岛素自身并不适于作为转运载体。由于抗转铁蛋白受体抗体或抗胰岛素受体抗体与受体的结合位点不同于转铁蛋白或胰岛素与受体的结合位点，在转运中可避免竞争性抑制，将这些抗体作为脑转运载体与外源药物相连接，经受体介导的胞吞胞吐作用，已将多种药物转运到了脑组织中。成功报道的例子有抗转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26、128.1和抗胰岛素受体的单克隆抗体83-14等。Pardridge WM的小组将ox26-BDNF化学交联产物应用于大鼠缺血性脑梗塞的治疗，在永久性中脑动脉闭塞后，ox26-BDNF复合物5ug/rat和50ug/rat尾静脉给药，脑梗塞面积分别减少了43％和65％。这种受体介导的血脑屏障转运载体特异性强、转运效率高、安全性好，为大分子药物跨血脑屏障的研究提供了新途径。

除在血脑屏障富含转铁蛋白受体外，作为肿瘤细胞表面特异性抗原，转铁蛋白受体也受到了许多研究者的重视。他们发现肿瘤快速增殖过程中对铁需求旺盛，使转铁蛋白受体在许多肿瘤细胞中过表达。相对这些受体在正常组织中不表达或甚少表达，且在外周血中不存在的特性，将抗转铁蛋白受体抗体与碱性磷酸酶、核素等偶联，可用于肿瘤的定位诊断；与化疗药物、细胞毒素、酶解前药等连接，还可用于肿瘤的定向治疗。文献报道将转铁蛋白受体单克隆抗体与表阿霉素或卡铂偶联后，动脉插管灌注或局部注射治疗晚期恶性肿瘤(肝癌、肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌等)，取得了满意疗效。说明转铁蛋白受体抗体—药物偶联物对肿瘤有较好的靶向性，可进一步提高肿瘤的局部用药浓度，增强杀伤肿瘤细胞能力。同时转铁蛋白受体抗体—药物偶联物很少被人体正常组织细胞摄取，故可适当降低化疗药物的毒副作用。

一方面抗转铁蛋白受体抗体在血脑屏障和肿瘤靶向转运中有良好的应用前景。另一方面现有的OX26抗体为小鼠抗大鼠转铁蛋白受体抗体，其免疫原性和动物种属选择性较强，不能在人体应用；128.1是小鼠抗人转铁蛋白受体抗体，鼠源抗体作为异源蛋白在人体内应用会受到限制：如诱发鼠抗人抗体(HAMA)的生成、鼠源性Fc段不能有效发挥人源性Fc段的功能、鼠源性抗体的生物半衰期短等。即使进行人源化改造，仍会保留一定的鼠源序列，难以彻底解决抗体的免疫原性问题。且抗体人源化改造费时、费力，改造后往往亲和活性降低，特异性下降。因此直接制备特异性的人源抗体具有重要的研究意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种特异性的抗转铁蛋白受体人源抗体。

本法明要解决的另一个技术问题是：提供含有该人源抗体核苷酸序列的载体。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供抗转铁蛋白受体人源抗体的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

抗人转铁蛋白受体人源抗体H67，具有序列表SEQ ID No.1所示的单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)的氨基酸序列。

MASYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALGNKYASWYQQKPGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSNSGNTA

TLTISGTQAEDEADYYCSSGDSPCRAFGGGTKLTVLGSGGSTITSYNVYYTKLSSSGSEVQLVESGGGLVQP

GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCARHSIYRCFFAVWGQGTLVTVSS。

单链抗体轻重链之间以linker相连接(序列中的下划线处)，以确保V_L和V_H连接后形成正确的三维折叠，保持其全长抗体的结合活性。该linker通常为10-55个氨基酸残基，优化地，该linker为10-30个氨基酸残基。该linker的另一个例子可以是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃。

所述抗体还可以是Fab抗体、双链抗体、三链抗体或全抗体。

现已知抗体多样性主要取决于CDRs的多样性，CDRs的多样性又以CDR3的多样性为主。随着对人类抗体胚系基因序列的深入了解，人们发现这些抗体胚系基因中有一些框架的使用频率要远高于其他框架。本发明使用的抗体库PHB-pIX-scFv就是基于此种思路设计的，其轻重链的CDR1和CDR2区分别采用固定的氨基酸序列，在轻链CDR3区设计为使用频率较高的Vκ1和Vλ3框架，重链CDR3区采用使用频率较高的VH3框架，CDR3区的设计既保留个别关键位置上的固定氨基酸残基，又充分考虑满足多样性的需要，构建的全合成噬菌体单链抗体库库容量达到1.82×10¹⁰(新型pIX噬菌体展示系统的建立及初步评价，王双；孙志伟；杜威世；张锦超；俞炜源；军事医学科学院院刊，2005，5：48)。

单链抗体(scFv)是用基因工程方法构建的一种抗体片段，由抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过一连接肽连接而成的重组蛋白，约为完整抗体分子的六分之一。

Fab抗体是由Fd(重链V_H+CH1)和完整轻链组成的抗体片段，两者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体，约为完整抗体分子的三分之一，有一个抗原结合位点。

双链抗体(diabody)由两个单链抗体组成，也称二价二聚体。双链抗体具有两条链，每条链含有一个与V_L结构域连接的V_H结构域。接头要足够短，以防止同一条链上的结构域之间配对，以促使不同链上的互补结构域配对，从而再现两个抗原结合位点。上述肽接头包括至少4个氨基酸和不多于10个的氨基酸，例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂。上述双链抗体的结构是刚性而紧密的。抗原结合位点位于该分子相对的两端。双链抗体可以如下表示：V_L-L₁-V_H-L₂-V_L-L₁-V_H，或V_L-L₁-V_H-L₂-V_H-L₁-V_L，或V_H-L₁-V_L-L₂-V_H-L₁-V_L，或V_H-L₁-V_L-L₂-V_L-L₁-V_H。

三链抗体(triabody)是指由三个单链抗体组成的三价三聚体，是通过V_L或V_H结构域的氨基端直接与V_H或V_L羧基端融合而构建的，即无任何接头序列。三体含有三个Fv头部，其多肽以环形、头尾连接的方式排列。三链抗体的一个例子为：V_L-L₁-V_H-V_L-L₁-V_H-V_L-L₁-V_H。

全抗体是指用基因工程方法构建的包括两个轻链和两个重链的完整IgG抗体分子。

编码抗人转铁蛋白受体人源抗体H67的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列。

含有编码抗人转铁蛋白受体人源抗体H67的核苷酸序列的表达载体。该表达载体能够表达靶向血脑屏障或肿瘤细胞的转运载体(即抗人转铁蛋白受体人源抗体)。转运载体能将化学药物、蛋白质、多肽、寡核苷酸、包裹药物的脂质体、纳米粒等运载入脑或肿瘤细胞。

含有编码抗人转铁蛋白受体人源抗体H67核苷酸序列的载体，该载体为原核表达载体pET-22b(+)，其5’端为T7启动子，3’端带有6个His(组氨酸)的标签。包含pET-22b-H67的大肠杆菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100080，电话010-62542758)，保藏日为2007年2月8日，保藏号为CGMCC No.1941。建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。诱导表达条件为20℃，0.5mmol/L IPTG，16小时。

抗人转铁蛋白受体人源抗体H67具有靶向转运治疗中枢神经系统疾病或肿瘤药物的用途。H67是能够靶向血脑屏障或肿瘤细胞的抗体，能将化学药物、蛋白质、多肽、寡核苷酸、包裹药物的脂质体、纳米粒等运载入脑或肿瘤细胞，具有治疗中枢神经系统疾病或肿瘤的用途。

本发明选择的检测标签可以是E.tag标签(Amersham pharmacia公司)，其核苷酸序列是ACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACC(SEQ ID No.3)。

抗体与芋螺毒素SO3之间以linker相连接，以确保两者连接后形成正确的三维折叠，保持各自的生物学活性。该linker的一个例子可以是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃。

本发明利用人转铁蛋白从人源全合成噬菌体单链抗体库PHB-pIX-scFv中筛选抗人转铁蛋白受体人源抗体H67，将抗体基因插入原核表达载体pET-22b(+)中，在大肠杆菌中进行了可溶表达。单链抗体经纯化后尾静脉注射小鼠，于脑组织中检测到了抗体的存在。单链抗体与不能透过血脑屏障的芋螺毒素SO3在大肠杆菌中融合表达后尾静脉注射小鼠，试验显示小鼠的疼痛域值明显提高，说明SO3在抗体的转运下通过血脑屏障，并在中枢神经系统中发挥了镇痛作用。此外该单链抗体与人宫颈癌Hela细胞和人肝细胞癌Hep G2细胞的ELISA试验也显示，抗体可与肿瘤细胞特异性结合。上述抗体可用作将化学药物、蛋白质、多肽、寡核苷酸、包裹药物的脂质体、纳米粒等运载入脑或肿瘤细胞的转运载体。

本发明所述的抗体可以通过如下步骤生产或鉴定：

1.设计适当的引物，从富含转铁蛋白受体的组织细胞中提取RNA，通过RT-PCR扩增人转铁蛋白受体的胞外区基因。获得的基因测序正确后插入有关载体表达。或者通过制备转铁蛋白-Sepharose 4B亲和层析柱的方法，从富含转铁蛋白受体的组织细胞裂解液中亲和层析纯化蛋白。肽指纹图谱分析验证所得蛋白。

2.将以上两种途径获得的转铁蛋白受体包被免疫管，对人源PHB-pIX-scFv噬菌体抗体库进行筛选，对获得的阳性克隆测序。

3.以测序后的阳性噬菌体单链抗体基因或其序列为模板，采用PCR或人工合成单链抗体基因的方法获得带有相应酶切位点的单链抗体基因，并在其3’端插入特定检测标签，克隆入相应表达载体中诱导表达，该表达载体可以是pET-22b(+)载体。纯化抗体并测定亲和力常数。用不同细胞系的人肿瘤细胞包被酶联板，ELISA试验检测抗体与肿瘤细胞的结合活性。抗体对脑的体内靶向活性可通过如下试验证实：将纯化的抗体尾静脉注射小鼠，一定时间后取鼠脑剥离脑毛细血管，将脑实质匀浆后用抗标签的抗体进行Western Blot分析，以检测单链抗体在脑实质中的存在。

4.利用PCR的方法将上述单链抗体V_H和V_L之间的linker缩短到5-10个氨基酸，插入相应载体中表达双链抗体或是直接去除V_H和V_L之间的linker，插入载体表达三链抗体。以上表达载体可以是pET-22b(+)载体。利用PCR的方法扩增抗体重链的Fd段，与V_L一起分别插入Fab表达载体中表达，该表达载体可以是pComb3载体。将抗体重链的Fd段和V_L分别插入全抗体表达载体上，即可表达全抗体IgG，该表达载体可以是pAC-L-Fc载体。将以上表达产物纯化后采用(3)中的方法检测抗体与肿瘤细胞的结合活性。剥离脑毛细血管，检测抗体在脑实质中的存在。

5.为了验证上述抗体是否能介导大分子物质入脑，表达抗体与芋螺毒素SO3的融合蛋白。纯化融合蛋白后将其尾静脉注射小鼠，热板法实验检测融合蛋白对小鼠的镇痛作用，以此判断抗体对SO3的靶向转运作用。

本发明的优点是：人源抗体与之前的鼠源抗体和人源化抗体相比，解决了靶向抗体的免疫原性问题，使其在人体能够长期反复给药，有良好的应用前景。本发明采用的从大容量抗体库中筛选基因工程抗体的方法相对于单克隆抗体制备容易，易于大规模生产，抗体分子小，能够深入组织内部，具有明显的优势。本发明采用的pET-22b(+)载体，含有较强的T7启动子，可保证靶向抗体有较高的表达水平。20℃，0.5mmol/L IPTG，16小时的诱导表达条件使目的蛋白主要以易形成正确折叠的可溶形式表达，蛋白活性较高。pET-22b(+)载体3’端带有6个His(组氨酸)的标签，可方便的使用Ni-NTA agarose进行亲合层析纯化。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，本发明的实施方式并不限于此，凡是根据本发明公开的内容或原理，实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为用基因工程方法表达的人转铁蛋白受体胞外区蛋白的肽质量检测图谱。

图2为从胎盘中纯化的人转铁蛋白受体蛋白的肽质量检测图谱。

图3为ELISA试验检测噬菌体抗体与转铁蛋白受体结合活性的图。

图4为pET-22b-H67重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达的SDS-PAGE图：1.蛋白分子量Marker；2.pET-22b/BL21(DE3)重组菌表达上清；3.pET-22b-H67/BL21(DE3)重组菌表达上清。

图5为Western Blot检测脑组织中的抗转铁蛋白受体单链抗体的图：1.阳性对照(纯化的H67-E.tag)；2.脑毛细血管；3.脑实质；4.阴性对照(未注射H67-E.tag的脑实质)。

图6为pET-22b/H67-SO3重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达的SDS-PAGE图：1.蛋白分子量Marker；2.pET-22b/BL21(DE3)重组菌表达上清；3.4.pET-22b-H67-SO3/BL21(DE3)重组菌表达上清。

图7为热板法检测H67-SO3、H67、SO3、生理盐水以尾静脉及脑室给药时对小鼠中枢神经系统镇痛作用的图：1.H67-SO3融合蛋白(尾静脉：5ug/g小鼠，脑室：700ng/只小鼠)；2.SO3(尾静脉：0.4ug/g小鼠，脑室：60ng/只小鼠)；3.H67(尾静脉：5ug/g小鼠，脑室：700ng/只小鼠)；4.生理盐水(尾静脉：5ug/g小鼠，脑室：700ng/只小鼠)。

具体实施方式

下文列出的实施例是为帮助对发明的理解，并不应被理解为用来在任何方面限制本发明的范围。实施例不包括对常规方法的描述，如那些构建载体和质粒的方法，将基因插入载体或将质粒导入宿主细胞的方法、噬菌体抗体库的呈现、辅助噬菌体的制备、IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳方法、培养基配制等。这些方法对本领域的普通技术人员是众所周知的，并在许多出版物中都有描述，包括J萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔。2002，《分子克隆实验指南(第三版)》。

实施例1：基因工程方法表达人转铁蛋白受体胞外区蛋白

一.TfR胞外区基因的克隆

许多肿瘤细胞表面富含转铁蛋白受体，用TRIzol试剂(Invitrogen公司，照说明书操作)从人宫颈癌HeLa细胞(中国科学院上海细胞库)中提取总RNA。根据人TfR的基因序列设计引物，FW为：5′-GAATTCATGTTATATTGGGATGACCTG-3′(SEQ IDNo.4)；RV为：5′-CCGCTCGATTTAGTGATGGTGATGGTGATGAAACTC ATTGTCAATGTC-3′(SEQID No.5)，RT-PCR扩增人转铁蛋白受体的胞外区基因。

反转录基因的反应体系为：10μL RNA中加入5.0μL RV(10mmol/L)，混匀后于70℃静置5min，冰浴，加入以下成分：5μL M-MLV RT 5×buffer、2.5μL dNTP(10mmol/L)、1.0μL RNasin 30U/μL、1.0μL M-MLV 200U/μL及0.5μL DEPC水，总体积为25μL。混匀后于42℃静置1h。

PCR反应体系为：5μL反转录产物、各2.0μL FW和RV(均为10mmol/L)、2.0μL dNTP(2mmol/L)、Taq plus DNA聚合酶反应10×buffer 2.0μL、0.2μL Taqplus DNA聚合酶(5U/uL)及6.8μL H₂O，总体积为20μL。

反应条件为：95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，共30个循环，再于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析可见一1.9kb的条带。PCR产物回收后连接到pGEM-T载体上测序。

二.TfR胞外区基因的表达及纯化、复性

测序正确后，用限制性内切酶EcoR I和Xho I从pGEM-T载体(Promega公司)上切下目的基因片段，将之与经相同酶切的pPROEX^TMHTa载体(GibcoBRL公司)连接，以连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)(华美生物公司)。1mmol/L IPTG  20℃诱导表达重组菌过夜，SDS-PAGE电泳可见一70kd的表达条带。检测到目的蛋白表达后，放大体积表达重组菌，超声破碎后，以5000r/min离心10min，收集上清，再以12000r/min离心30min，取沉淀分别用1mL/L Triton X-100及2mol/L盐酸胍(溶解在PBS缓冲液中)进行悬浮、洗涤并离心。沉淀用6mol/L盐酸胍溶解后，于4℃放置过夜。取出，以12000r/min离心30min，将上清加入到用6mol/L盐酸胍平衡的Ni-NTA agarose(Amersham pharmacia公司)亲合层析柱中纯化。通过线性梯度将盐酸胍的浓度降到零，使表达的包涵体蛋白在柱上复性。最后用含0.5mol/L咪唑的PBS将目的蛋白洗下。

三.转铁蛋白受体的鉴定

将纯化得到的转铁蛋白受体超滤脱咪唑后SDS-PAGE电泳，将电泳后的凝胶置于明亮灯光白色背景上用修剪过的Eppendorf吸头(直径约1.5mm)戳取出蛋白质点，放入预先加好50μL脱色液(25mmol/L NH₄HCO₃，50％乙氰)的0.25mL离心管。室温放置30分钟，吸去脱色液，更换1-2次脱色液直到胶块无色透明。抽真空离心干燥30分钟左右，至白色颗粒状。加入2μL溶于20mmol/L碳酸氢铵的胰蛋白酶(浓度为10ng/uL)，4℃吸胀1小时，吸去多余的酶液，将管子倒置，37℃空气浴10-12小时。加入8μL 5％三氟乙酸，37℃温育1小时，将液体吸净，转移至一干净的离心管中，再加入8μL 2.5％三氟乙酸/50％乙氰，30℃温育1小时，吸出液体与前一次合并。抽真空离心干燥肽段提取液进行肽质量图谱的分析。将所得的肽质量图谱数据进行分析，确认该蛋白为转铁蛋白受体。图1是用以上方法获得的人转铁蛋白受体胞外区蛋白的肽质量检测图谱。

实施例2：从胎盘中纯化人转铁蛋白受体

一.样品制备

人新鲜胎盘(湿重500g)去除脐带和膜后，切成小块，PBS清洗后，在1L的PBS中匀浆。10,000g离心20min，收集沉淀。用PBS重悬后，继续匀浆，离心。重复3次，以除去内源性的转铁蛋白。将沉淀溶解于800mL PBS(含2％Triton X-100，1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟))中，搅拌1h，然后超声破碎40分钟，以释放膜蛋白。10,000g离心30min，收集上清，用于亲和层析。以上操作均在4℃进行。

二.转铁蛋白受体-Sepharose 4B亲和层析柱的制备

按照说明书，将人转铁蛋白以5mg蛋白/mL湿胶的比例连接到溴化氰活化的Sepharose 4B(Sigma公司)上。用0.1mol/L碳酸氢氨(含有1.0g/L柠檬酸铁铵)平衡，使转铁蛋白充分结合Fe³⁺。此时柱材料由不含铁时的白色变为富含铁的鲑肉粉红色。再用PBS(含0.5％Triton X-100)平衡，洗去富余的柠檬酸铁铵。

三.纯化

以1mL/min的流速将样品上柱后，用以下溶液进行顺序平衡(每种溶液至少用5个柱体积)：①PBS，0.2％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸)；②50mmol/L柠檬酸钠pH 4.9，100mmol/L NaCl，2g/L CHAPS，1mmol/L去铁胺；③50mmol/L HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)pH 7.5，100mmol/L NaCl，2g/L CHAPS。用50mmol/L HEPES pH 7.5，100mmol/LNaCl，2g/L CHAPS，2mol/L KCl洗脱，使转铁蛋白受体与转铁蛋白分离。

将以上步骤纯化得到的转铁蛋白受体超滤脱盐后SDS-PAGE电泳，在90kd处可见两条蛋白条带出现。这两条均为转铁蛋白受体，只是由于微观修饰的不均一性而造成分子量的差别。将纯化产物进行肽指纹图谱的分析，确认为转铁蛋白受体。图2是该纯化蛋白的肽质量检测图谱。

实施例3：抗转铁蛋白受体单链抗体的筛选

一.噬菌体抗体库的筛选

分别以从胎盘中提取的转铁蛋白受体和表达的转铁蛋白受体胞外区蛋白各10μg包被免疫管于4℃过夜，2g/L BSA 37℃封闭2h后，加入1mL人源PHB-pIX-scFv噬菌体抗体库溶液(库容10¹⁰cfu/L)(孙志伟博士惠赠。新型pIX噬菌体展示系统的建立及初步评价。王双；孙志伟；杜威世；张锦超；俞炜源；军事医学科学院院刊，2005，5：48)，于37℃孵育2h。用PBS(含1mL/L Tween20)洗20次，每次5min。然后加入1mL 0.2mol/L Gly-HCl(pH2.2)，室温振荡10min后，用1mol/L Tris将pH中和到7.0左右。将中和后的溶液转移到有9mL OD₆₀₀＝0.5的大肠杆菌XL1-Blue(华美生物公司)的试管中，同时于免疫管中加入1mL OD₆₀₀＝0.5的大肠杆菌XL1-Blue。两管同时于37℃静置20min后，于30℃以150r/min振摇培养1h。取少许大肠杆菌XL1-Blue涂平板计算克隆数；其余全部用于铺板，于37℃培养过夜。次日，将平板上的菌落刮下，取1％接种于100mL 2×YT培养基中。待生长至OD₆₀₀＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07(Amresco公司)至终浓度为4×10⁹pfu/mL，于30℃振摇(150r/min)培养过夜。经PEG沉淀后，用于第2轮的筛选。第3轮筛选时，用5μg TfR包被免疫管，以PBST洗20次后，加入1.5mol/L硫氰酸铵振荡洗10min，以洗去亲和力较低的抗体，其余操作同前。

二.噬菌体单克隆抗体的制备

挑取单个菌落接种于2mL 2×YT(含50mg/L氯霉素及10mg/L四环素)培养基中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07(Amresco公司)，再于37℃静置20min。于30℃振摇(150r/min)培养1h后，加入卡那霉素至终浓度为50mg/L，于30℃培养过夜。次日，离心收集上清，即为噬菌体单克隆抗体，于4℃保存备用。

三.噬菌体ELISA

以从胎盘中提取的转铁蛋白受体2μg包被酶联板于4℃过夜，2g/L BSA 37℃封闭2h；甩去封闭液，加入预先用1％BSA及0.1％Tween 20处理过的单克隆抗体，37℃温育2h；PBS洗3min×3次，加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(Amresco公司)(1∶5000稀释)，37℃温育1h；PBS洗3min×3次，滴加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(中山生物公司)(1∶4000稀释)，37℃温育1h；PBS洗3min×3次，底物OPD显色，待充分显色后用1mol/L H₂SO₄终止显色，在492nm波长读取吸收值。对获得的阳性克隆测序后进行序列分析。图3是ELISA试验检测噬菌体抗体与转铁蛋白受体结合活性的图。

实施例4：抗转铁蛋白受体单链抗体的表达及活性鉴定

一.单链抗体基因的获得

1.PCR方法从噬菌体抗体中扩增单链抗体基因

以上游引物FW’5’-ACGCGTCGACTAATGGCCAGCTACGAACTG-3’(SEQ ID No.6)和下游引物RV’5’-TTGCGGCCGCACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACCAAGCTTGCTCGACACGGTCACCAG-3’(SEQ ID No.13)为引物，以2号阳性单克隆噬菌体抗体所提取的质粒为模板，扩增抗体基因，并将该抗体命名为H67。上游引物中加入Sal I位点，下游引物中加入Not I位点及E.tag标签。

PCR反应体系为：模板1μL、上下游引物各3μL(均为10mmol/L)、5μL dNTP(2mmol/L)、Pfu DNA聚合酶反应10×buffer 10μL、2μL Pfu DNA聚合酶(5U/mL)及76μL H₂O，总体积为100μL。

反应条件为：95℃ 3min，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 2min，30个循环，再于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析可见800bp大小条带。

2.人工合成单链抗体基因

按照序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列分段合成单链抗体基因。共分18段合成，其中片段1-17每段合成长度60bp，片段18长度67bp。每段基因首尾各有20bp的序列相互重叠搭桥，以利于PCR过程中片段的延伸。以下是合成的18段序列：

NO1  atggccagct acgaactgac ccagccgccg agcgtgtcgg tggcgccggg tcagaccgcg

NO2  tggcgccggg tcagaccgcg cgtatcacct gctcgggcga tgcgctgggc aataaatacg

NO3  tgcgctgggc aataaatacg cgagctggta tcagcagaaa ccgggtcagg caccggtgct

NO4  ccgggtcagg caccggtgct ggtgatttac gaagattcta aacgcecgtc tggcatcccg

NO5  aacgcccgtc tggcatcccg gaacgcttta gcggctcgaa ttcgggcaac accgcgaccc

NO6  ttcgggcaac accgcgaccc tgaccattag cggcacccag gcggaggatg aggcggacta

NO7  gcggaggatg aggcggacta ttactgctcg tcgggtgata gtccgtgtcg ggcgtttggc

NO8  gtccgtgtcg ggcgtttggc ggtggcacca aactgaccgt gctgggcagc ggcggctcga

NO9  gctgggcagc ggcggctcga ccataacttc gtataatgta tactatacga agttatcgag

NO10 tactatacga agttatcgag ctcgggcagc gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt

NO11 tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg agctgcgcag

NO12 cctgcgtctg agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt

NO13 agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg

NO14 gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat gcggatagcg

NO15 cacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa

NO16 tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat

NO17 acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtcattct atttatcggt

NO18 acgtcattct atttatcggt gttttttcgc tgtctggggt cagggcactc tggtgaccgt

     gtcgagc

设计了4对引物，其中FW’、P2用于片段F1的扩增，P3、P4用于片段F2的扩增，P5、P6用于片段F3的扩增，P7、RV’用于片段F4的扩增。

FW’5’ACGCGTCGACTAATGGCCAGCTACGAACTG 3’(SEQ ID No.6)

与片段1的5’端序列相同，含有Sal I位点及启始密码子。

P2：5’TAGTCCGCCTCATCCTCCGCC 3’(SEQ ID No.7)

与片段6的3’端序列互补。

P3：5’AACGCCCGTCTGGCATCCCGG 3’(SEQ ID No.8)

与片段5的5’端序列相同。

P4：5’ACCGCCACCGCTTTCCACCAA 3’(SEQ ID No.9)

与片段10的3’端序列互补。

P5：5’GCTGGGCAGCGGCGGCTCGAC 3’(SEQ ID No.10)

与片段9的5’端序列相同

P6：5’CGCTATCCGCATAGTAGGTGC 3’(SEQ ID No.11)

与片段14的3’端序列互补。

P7：5’AGCTACGCGATGAGCTGGGTG 3’(SEQ ID No.12)

与片段13的5’端序列相同

RV’5’TTGCGGCCGCACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACCAAGCTTGCTCGACACG

       GTCACCAG 3’(SEQ ID No.13)

与片段18的3’端序列互补，含有Not I位点及E.tag标签，无终止密码子。

①片段F1、F2、F3、F4的扩增

以片段NO1……NO6为模板，FW’、P2为引物扩增片段F1；NO5……NO10为模板，P3、P4为引物扩增片段F2；NO9……NO14为模板，P5、P6为引物扩增片段F3；片段NO13……NO18为模板，P7、RV’为引物扩增片段F4。反应条件：每个模板浓度0.02mol/L，引物浓度50pmol/L。94℃30s，58℃30s，72℃30s，10个循环，94℃30s，68℃30s，72℃30s，20个循环。

②片段F_1-2和F_3-4的扩增

F1、F2、F3、F4纯化后各取1ul稀释20倍。以F1、F2的稀释产物各2ul为模板，FW’、P4为引物，扩增片段F_1-2；F3、F4的稀释产物各2ul为模板，P5、RV’为引物，扩增片段F_3-4。反应条件：94℃ 30s，72℃ 40s，7个循环。添加引物各1ul，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 40s，28个循环。

③scFv全长基因的获得

PCR产物F_1-2和F_3-4纯化后各取1ul稀释20倍为模板，FW’、RV’为首尾引物，扩增scFv全长基因。反应条件：94℃ 30s，72℃ 40s，7个循环。添加引物各1ul，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 40s，28个循环。

二.表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

用Sal I及Not I双酶切PCR产物和pET-22b(+)载体(Novagen公司)，电泳纯化、回收抗体基因和线性化的载体，T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养16小时后，挑取单克隆进行酶切鉴定并测序。测序正确后，将重组质粒pET-22b-H67转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含Amp+的LB培养基中生长过夜，然后以2％的接种量转接于500mL含有Amp+的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导16小时。离心收集菌体进行SDS-PAGE分析，可见33kd的目的蛋白条带。图4是pET-22b-H67重组质粒在大肠杆菌中可溶表达的SDS-PAGE图。

三.表达产物的纯化

收集的菌体重悬于50mL PBS中，置于冰上超声破碎。12 000r/min离心30分钟，取上清加入咪唑至终浓度为50mmol/L。用Ni-NTA agarose亲和柱对上清进行纯化。纯化的抗体超滤去除咪唑后，测定蛋白浓度。

四.抗体亲和力的测定

具体操作按照《抗体工程》(董志伟，王琰主编)一书中第280页进行，测得抗体H67的亲和力常数为Ka＝4.8×10^-7moL/L。

实施例5：抗转铁蛋白受体双链抗体的表达

一.Diabody基因的获取

以单链抗体基因为模板，利用PCR的方法获得diabody基因。合成的两个中间引物分别为：RV-linker：5’-GCT TTC CAC CAA TTG CAC TTC CGA GCC GCC GCT GCCCAG CAC-3’(SEQ ID No.14)以及FW-linker：5’-GAA GTG CAA TTG GTG GAA AGC-3’(SEQ ID No.15)。V_L和V_H之间的linker可以为4-10个氨基酸，其核苷酸序列可以是AGCGGCGGCTCG。

扩增两小片段基因的反应体系为：pET-22b-H67质粒1μL、FW’(实施例4)和RV-linker，FW-linker和RV’(实施例4)引物各4.0μL(均为10mmol/L)、dNTP(2mmol/L)2.0μL、Pfu DNA聚合酶10×buffer 2.0μL、Pfu DNA聚合酶(5U/mL)0.2μL及H₂O 6.8μL，总体积为20μL。

反应条件为：95℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min；共30个循环；于72℃再延伸10min。分别回收PCR产物，以两个片段基因为模板，以FW’和RV’为引物扩增全长基因。全长区基因的反应体系同前，反应条件为：95℃ 5min，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 2min，30个循环，再于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析可见800bp大小条带。

二.表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

用Sal I及Not I双酶切PCR产物和pET-22b(+)载体，电泳纯化、回收抗体基因和线性化的载体，T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养16小时后，挑取单克隆进行酶切鉴定并测序。测序正确后，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含Amp+的LB培养基中生长过夜，然后以2％的接种量转接于500mL含有Amp+的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导16小时。离心收集菌体进行SDS-PAGE分析，可见33kd的目的蛋白条带。

三.表达产物的纯化

收集的菌体重悬于50mL PBS中，置于冰上超声破碎。12 000r/min离心30分钟，取上清并加入咪唑至终浓度为50mmol/L。用Ni-NTA agarose亲和柱进行纯化。

实施例6：单链抗体(scFv)的活性鉴定

一.ELISA试验检测表达抗体与肿瘤细胞的结合活性

将人宫颈癌Hela细胞、人肝细胞癌HepG2细胞(中国科学院上海细胞库)分别稀释到5×10⁴细胞/ml，每孔接种100μL至96孔细胞培养板，37℃培养24h；弃去上清，PBS洗3min×3次，加入4℃预冷的甲醇∶丙酮固定10min；弃去固定液，PBS洗3min×3次，每孔加入100uL阻断液(10mL PBS，100uL 30％H₂O₂)，室温30min，去除内源性过氧化氢酶活性；弃去阻断液，PBS洗3min×3次，滴加2％BSA 37℃封闭2h；甩去封闭液，加入纯化后的H67，37℃温育2h；PBS漂洗，由于抗体表达时在C端插入了E.tag标签，检测时加入抗E.tag抗体(Amershampharmacia公司)(1∶5000稀释)，37℃温育1h；PBS漂洗，滴加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(中山生物公司)(1∶5000稀释)，37℃温育1h；PBS漂洗，底物OPD显色，待充分显色后用1mol/L H₂SO₄终止显色，测定OD₄₉₂。ELISA试验显示H67可与Hela细胞和HepG2细胞特异结合。

二.抗体对脑的靶向作用研究

scFv H67以2.0ug/g小鼠的剂量尾静脉注射小鼠。1小时后，尾静脉注入0.9％生理盐水配制的戊巴比妥纳(35ug/g小鼠)，使其麻醉。将主动脉阻断，颈静脉剪断，从左心室注入冰预冷的PBS 20mL。取脑组织(2mL PBS/0.5g脑组织)，用玻璃匀浆器匀浆，取出一部分用于电泳分析，其余加入终浓度为26％的葡聚糖。充分混匀后，4℃ 5400g，离心15分钟。沉淀为脑毛细血管，上清为脑组织。用裂解缓冲液(PBS，1％TritonX-100，0.1％SDS)裂解。取样50uL，加入50uL 2×上样缓冲液，开水中煮15分钟。13000r/min离心1min，取上清用于蛋白电泳。转膜(恒流，1mA/cm²PVDF膜)并用5％的脱脂奶粉封闭后，用抗E.tag的抗体(1∶1000稀释)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶3000稀释)为二抗，Western blot检测目的蛋白，ECL显色。图5是Western Blot检测脑组织中的抗转铁蛋白受体单链抗体的图。结果显示尾静脉注射H67后，抗E.tag抗体在脑血管和脑实质中分别检测到了H67的存在，未注射抗体组抗E.tag抗体检测阴性。

实施例7：单链抗体H67与芋螺毒素SO3融合蛋白的表达及其对小鼠中枢镇痛活性的研究

芋螺毒素(conotoxins，CTX)是来源于海洋芋螺(Conus)毒液的一类活性多肽，可用于某些神经系统疾病的治疗。SO3是我们从南海线纹芋螺(Conus striatus)中发现的一种新的CTX(Lu Baisong，Yu Fang，Zhao Dong，Huang Peitang，HuangCuifen.Conopeptides from Conus Striatus and Conus Textile by cDNA cloning.peptides，1999，20(1)：1139；—芋螺毒素SO3对大鼠慢性神经痛镇痛作用及对血清L6浓度影响。解放军药学学报。冯泽国，王红，周晓巍，颜光涛，刘凤云，周宏，黄培堂。2006，22(4)：261)，含25个氨基酸残基，与MVIIA同属ω-CTX，两者有7个氨基酸残基的差异。SO3作为一种无成瘾性的中枢神经系统阵痛剂有很好的应用前景，但由于SO3是一种小肽，其自身无法通过血脑屏障，限制了SO3的用药范围。

一.重组质粒pET-22b-H67-SO3的构建

重组质粒pET-22b-H67和pTIG-Trx-scFv(鼠源)-SO3(本实验室制备。蒋世卫，周晓巍，颜冰等。大鼠转铁蛋白受体单链抗体和芋螺毒素SO3的融合蛋白在大肠杆菌中的表达。生物技术通讯，2005，16(1)：16-18)用限制性内切酶Hind III、Not I双酶切，分别回收纯化pET-22b-H67和SO3，将两者4℃连接过夜后构建重组质粒pET-22b-H67-SO3，转化大肠杆菌DH5α。将菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序。

二.融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含Amp+的LB培养基中生长过夜，然后以2％的接种量转接于500mL含Amp⁺的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导16小时。图6是pET-22b-H67-SO3重组质粒在大肠杆菌中可溶表达的SDS-PAGE图。离心收集菌体重悬于50mL PBS中，置于冰上超声破碎。12 000r/min离心30分钟，取上清，加入咪唑至终浓度为50mmol/L。用Ni-NTA agarose亲和柱进行纯化。纯化的抗体超滤去除咪唑后，测定蛋白浓度。

三.融合蛋白对小鼠中枢镇痛活性的研究

H67抗体具有脑靶向性，SO3具有中枢镇痛作用，且只能在中枢神经系统才能发挥作用。因此当融合蛋白发挥了镇痛作用时，可说明SO3在抗体的转运下通过了血脑屏障。将纯化、定量后的H67-SO3、H67、SO3、生理盐水以尾静脉及脑室两种注射方法给药。1小时后，用热板法检测SO3的镇痛作用，记录小鼠初次舔舐后足的时间。热板法的方法是：雌性小鼠，体重20g左右，随机分组，每组10只。用大烧杯做热板，置于55.0±0.5℃水浴中。以小鼠后足接触热板到舔后足为止的时间定为痛域。选择反应敏感而稳定的小鼠用于实验，比较给药前后痛域的变化，痛域超过60秒的按60秒计。表1为H67-SO3、H67、SO3、生理盐水以尾静脉及脑室给药时的剂量。图7是热板法检测H67-SO3、H67、SO3、生理盐水以尾静脉及脑室给药时对小鼠中枢神经系统镇痛作用的图。

表1  H67-SO3、H67、SO3、生理盐水尾静脉、脑室给药剂量

                         序列表

Claims (3)

1.抗人转铁蛋白受体人源单链抗体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.编码抗人转铁蛋白受体人源抗体的多核苷酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述多核苷酸的载体，其特征在于：所述载体为原核表达载体，该载体包含于保藏号为CGMCC No.1941的菌株中。

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