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TWI671403B - 控制組裝之多肽的製造方法 - Google Patents

控制組裝之多肽的製造方法 Download PDF

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TWI671403B
TWI671403B TW105116065A TW105116065A TWI671403B TW I671403 B TWI671403 B TW I671403B TW 105116065 A TW105116065 A TW 105116065A TW 105116065 A TW105116065 A TW 105116065A TW I671403 B TWI671403 B TW I671403B
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amino acid
antibody
acid residues
chain
polypeptide
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TW105116065A
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TW201631154A (zh
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井川智之
Tomoyuki Igawa
角田浩行
Hiroyuki Tsunoda
Original Assignee
中外製藥股份有限公司
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Abstract

發現藉由將形成多肽間組裝時之界面的胺基酸殘基改變為帶同種電荷之胺基酸，可抑制該組裝。依照本發明，可有效率地形成異分子。
本發明例如可適用於製作雙專一性抗體時。

Description

控制組裝之多肽的製造方法
本發明係關於利用各分子內或各分子間組裝進行控制之多肽之製造方法、各分子內或各分子間之組裝受控制之多肽、及含有該多肽為有效成分之醫藥組成物等。
抗體由於在血液中之安定性高且副作用少，作為醫藥品受到重視。其中有一種可同時認識二種抗原之雙專一性抗體。現在，正在進行臨床試驗之MDX-210係一IgG型雙專一性抗體，係將表現FcγRI之單核球等重導(retargeting)至表現HER-2/neu之癌細胞的抗體(參照非專利文獻1)。抗體製造一般多使用基因重組技術。具體而言，係自融合瘤、產生抗體之感作淋巴球等抗體產生細胞、或提示抗體基因之噬菌體庫之中選殖出編碼為抗體之蛋白質的DNA，嵌入適當載體之中，並將該等導入寄主細胞使生產的技術。使用基因重組技術之IgG型雙專一性抗體之製造，係將構成目的之二種IgG的H鏈及L鏈的基因，合計4種基因導入細胞，並藉由共表現使分泌。如該表現之中，使野生型之H鏈及L鏈之構成基因表現之情形，由於2種H鏈之共價鍵或H鏈與L鏈之非共價鍵係隨機發生，因此目的雙專一性抗體之比例變得極低。具體而言，目的雙專一性抗體在10種中僅1種，生產效率低。目標抗體之生產效 率低不僅會妨害目標抗體精製，而且使批間差等不均勻性增大，會造成生產成本上漲。
就關於雙專一性抗體之有效率生產之見解而言，有人報告藉由對IgG H鏈之CH3區域施以胺基酸取代，而使優先分泌就H鏈為異種組合之IgG(參照專利文獻1及非專利文獻2及3)。具體而言，將存在於其中之一H鏈之CH3區域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob；突起)，並將存在於另一H鏈之CH3區域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole；空隙)，以將突起配置於空隙內之方式來促進異種H鏈形成及抑制同種H鏈形成。也有人報告在H鏈可變區域(以下稱為VH)與L鏈可變區域(以下稱為VL)進行組裝之界面利用同樣的「突起」與「空隙」之見解(參照非專利文獻4)。依據Zhe等之報告，藉由將存在於VH與VL界面之胺基酸取代2種(兩鏈共4種)，異分子之形成被促進1.28倍的效率(野生型；72%、變異體；92%)。 又，一種胺基酸取代(兩鏈共2種)則與野生型為同左右之效率。但是，在VH與VL設置突起(knob)及空隙(hole)之方法不能說是能充分地促進異分子之形成。
【專利文獻1】國際公開第96/27011號
【非專利文獻1】Segal DM等著，Current Opinion in Immunology,1999年，Vol.11,p.558-562
【非專利文獻2】Ridgway JB等著，Protein Engineering,1996年，Vol.9,p.617-621
【非專利文獻3】Merchant AM等著，Nature Biotechnology,1998年，Vol.16,p.677-681
【非專利文獻4】Zhe Z等著，Protein Science,1997年，Vol.6,p.781-788
本發明係有鑑於如該狀況而生，其目的為提供控制多肽組裝之方法、組裝受控制之多肽，以及該多肽之製造方法。又，本發明其中之一的態樣之目的為，提供控制VH與VL之界面之組裝而有效率地製造雙專一性抗體之方法。又，目的為提供有效率地製造sc(Fv)2其中之一的構造構造異構物之方法。
本發明者等就供組裝控制之多肽選擇了抗體的VH及VL，並對於可控制該等VH與VL組裝之方法，努力地研究。
其結果，發現：藉由將存在於VH與VL之界面的胺基酸取代為帶有電荷的胺基酸，可抑制VH與VL之組裝，較使用上述突起與空隙的方法能較有效率的形成異分子。
令人驚訝的是依照本發明之方法，僅僅將取代存在於VH與VL之界面的各1種胺基酸(VH與VL合計2個胺基酸)，便可有效率地形成異分子。有，由抗原性之觀點，胺基酸之取代愈少愈好。依照本發明之一態樣，僅僅取代存在於VH與VL之界面的1個胺基酸，便可有效率的形成異分子。
亦即，藉由本發明者等所發現之見解，可控制VH 與VL之組裝。又，本發明不僅可應用於VH與VL之組裝之控制，也可應用於任意多肽間之組裝控制。
再者，本發明者等實際上確認了由本發明之組裝控制方法所取得之雙專一性抗體保持著機能。
如上所述，本發明者等成功地開發了可控制任意多肽間之組裝的方法，並完成本發明。
本發明係關於控制多肽組裝之方法、組裝受控制之多肽，以及該多肽之製造方法，更具體而言，係提供以下：
[1]一種多肽變異體之製造方法，係使形成多肽內界面之胺基酸殘基具有變異而控制多肽組裝，包含下列步驟：(a)將編碼為形成多肽內界面之胺基酸殘基的核酸以使多肽內之組裝受抑制之方式自原核酸改變，(b)培養寄主細胞使表現該核酸，(c)自寄主細胞培養物將該多肽回收。
[2]一種異種多聚體之製造方法，係使形成多肽間界面之胺基酸殘基具有變異而控制異種多聚體組裝，包含下列步驟：(a)將編碼為形成多肽間界面之胺基酸殘基的核酸以使多肽間之組裝受抑制之方式自原核酸改變，(b)培養寄主細胞使表現該核酸，(c)自寄主細胞培養物將該異種多聚體回收。
[3]如[1]之方法，其中，於可形成2種以上構造構造異構物之多肽之中，將編碼為形成多肽內界面之胺基酸殘基的核酸以使形成1種以上構造構造異構物之多肽之組裝受抑制之方式自原核酸改變。
[4]如[2]之方法，其中，於可形成2種以上多聚體之異種多聚體之中，將編碼為形成多肽間界面之胺基酸殘基的核酸以 使形成1種以上多聚體之多肽之組裝受抑制之方式自原核酸改變。
[5]如[1]或[2]之方法，其中，步驟(a)之改變係將原核酸改變為使形成界面之2個殘基以上的胺基酸殘基為同種電荷的方式於該界面導入胺基酸殘基之變異。
[6]如[5]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[7]如[5]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[8]如[5]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[9]如[5]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[10]如[5]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[11]如[1]或[2]之方法，其中，步驟(a)之改變係將原核酸改變為以使形成存在界面之疏水性核之胺基酸殘基成為帶有電荷之胺基酸殘基之方式在該界面導入胺基酸殘基之變異。
[12]如[11]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[13]如[11]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[14]如[11]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[15]如[11]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[16]如[11]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[17]如[1]或[2]之方法，其中，多肽之界面係由抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域形成。
[18]如[1]或[2]之方法，其中，多肽之界面係由2種以上重鏈可變區域形成。
[19]如[1]或[2]之方法，其中，多肽之界面係由抗體之重鏈不變區域及輕鏈不變區域形成。
[20]如[1]或[2]之方法，其中，多肽之界面係由2種以上重鏈不變區域形成。
[21]如[1]之方法，其中，多肽係將2個以上重鏈可變區域及2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽。
[22]如[2]之方法，其中，異種多聚體係包含2種以上重鏈可變區域及2種以上輕鏈可變區域之多重專一性抗體。
[23]如[22]之方法，其中，異種多聚體為雙專一性抗體。
[24]多肽變異體或異種多聚體，係由[1]或[2]之方法製造。
[25]一種多肽變異體，係將形成該多肽內之界面的胺基酸殘基改變，以抑制原來多肽內之組裝。
[26]一種異種多聚體，係將形成該多肽間之界面的胺基酸殘基改變，以抑制原來多肽間之組裝。
[27]如[25]之多肽變異體，其中，原多肽可形成2種以上構造構造異構物。
[28]如[26]之異種多聚體，其中，原多肽可形成2種以上多聚體。
[29]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，形成前述多肽界面之胺基酸殘基之改變係於該界面導入胺基酸殘基之變異，使形成界面2個殘基以上之胺基酸殘基成為同種電荷。
[30]如[29]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[31]如[29]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[32]如[29]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[33]如[29]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[34]如[29]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[35]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，形成前述多肽界面之胺基酸殘基之改變係於該界面導入胺基酸殘基之變異，使形成存在於界面之疏水性核的胺基酸殘基具有電荷。
[36]如[35]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[37]如[35]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[38]如[35]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[39]如[35]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[40]如[35]之多肽變異體或異種多聚體，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[41]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，多肽界面由抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域形成。
[42]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，多肽界面由2種以上重鏈可變區域形成。
[43]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，多肽界面由抗體之重鏈不變區域及輕鏈不變區域形成。
[44]如[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，其中，多肽界面由2種以上重鏈不變區域形成。
[45]如[25]之多肽變異體，其中，多肽係將2個以上重鏈可變區域及2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽。
[46]如[26]之異種多聚體，其中，異種多聚體係包含2種以上重鏈可變區域及2種以上輕鏈可變區域之多重專一性抗體。
[47]如[46]之異種多聚體，其中，異種多聚體為雙專一性抗體。
[48]一種組成物，包含[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體，及醫藥上可可容許的擔體。
[49]一種核酸，編碼為[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體。
[50]一種寄主細胞，具有[49]之核酸。
[51]一種[25]之多肽變異體或[26]之異種多聚體之製造方法，包含下列步驟：培養[50]之寄主細胞、自細胞培養物將多肽回收之步驟。
[52]一種多肽之組裝控制方法，包含將形成原來多肽內之界面之胺基酸殘基改變，以抑制多肽內之組裝。
[53]一種異種多聚體之組裝控制方法，包含將形成原來多 肽間之界面之胺基酸殘基改變，以抑制多肽間之組裝。
[54]如[52]之方法，其中，係將可形成2種以上構造構造異構物之多肽之中，改變形成多肽內界面之胺基酸殘基，以抑制形成1種以上構造構造異構物之多肽之組裝。
[55]如[53]之方法，其中，係將可形成2種以上多聚體之異種多聚體之中，改變形成多肽間界面之胺基酸殘基，以抑制形成1種以上多聚體之多肽間之組裝。
[56]如[52]或[53]之方法，其中，形成前述多肽界面之胺基酸殘基之改變係於該界面導入胺基酸殘基之變異，以使形成界面之2個殘基以上之胺基酸殘基成為帶同種電荷。
[57]如[56]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[58]如[56]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[59]如[56]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[60]如[56]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[61]如[56]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[62]如[52]或[53]之方法，其中，形成前述多肽界面之胺基酸殘基之改變係於該界面導入胺基酸殘基之變異，以使形成存在於界面疏水性核之胺基酸殘基成為具有電荷之胺基酸殘基。
[63]如[62]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為谷胺酸(E)。
[64]如[62]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為天冬醯胺酸(D)。
[65]如[62]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為離胺酸(K)。
[66]如[62]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為精胺酸(R)。
[67]如[62]之方法，其中，導入之胺基酸殘基為組胺酸(H)。
[68]如[52]或[53]之方法，其中，多肽界面由抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域形成。
[69]如[52]或[53]之方法，其中，多肽界面由2種以上之重鏈可變區域形成。
[70]如[52]或[53]之方法，其中，多肽界面由抗體之重鏈不變區域及輕鏈不變區域形成。
[71]如[52]或[53]之方法，其中，多肽界面由2種以上重鏈不變區域形成。
[72]如[52]之方法，其中，多肽係將2個以上重鏈可變區域及2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽。
[73]如[53]之方法，其中，異種多聚體係包含2種以上重鏈可變區域及2種以上輕鏈可變區域之多重專一性抗體。
[74]如[73]之方法，其中，異種多聚體為雙專一性抗體。
[75]一種抗體，包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域，以下(1)及(2)胺基酸殘基為帶同種電荷之胺基酸殘基：(1)包含於重鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中39位(谷醯胺)；(2)包含於輕鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中44位(谷醯胺)。
[76]一種抗體，包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域，以下(1)及(2)之胺基酸殘基為帶同種電荷之胺基酸殘基：(1)包含於重鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中45位(白胺酸)； (2)包含於輕鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中50位(脯胺酸)。
[77]一種抗體，包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域，以下(1)或(2)任一者為帶電荷之胺基酸殘基：(1)包含於重鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中45位(白胺酸)；(2)包含於輕鏈可變區域之胺基酸殘基，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中50位(脯胺酸)。
[78]如[75]或[76]之抗體，其中，前述帶同種電荷之胺基酸殘基係擇自包含於以下(a)或(b)任一群之胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
[79]如[77]之抗體，其中，前述帶電荷之胺基酸殘基為谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)、離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)。
[80]如[75]~[77]之中任一項之抗體，其中，多肽係將2個以上重鏈可變區域與2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽。
[81]如[75]~[77]之中任一項之抗體，其中，多肽係包含2種以上重鏈可變區域及2種以上輕鏈可變區域之多重專一性抗體。
[82]如[81]之抗體，其中，多肽為雙專一性抗體。
[83]一種組成物，包含[75]~[77]之中任一項之抗體及醫藥上可容許的擔體。
[84]一種核酸，係編碼為構成[75]~[77]任一項之抗體之多 肽。
[85]一種寄主細胞，具有[84]之核酸。
[86]一種製造如[75]~[77]之中任一項之抗體之方法，包含下列步驟：培養[85]之寄主細胞之步驟、自細胞培養物將多肽回收之步驟。
[87]一種抗體，包含2種以上重鏈CH3區域，第1重鏈CH3區域之中，擇自由以下(1)~(3)所示胺基酸殘基所構成組之中1組至3組胺基酸殘基帶同種電荷。
(1)EU編號為356位及439位之胺基酸殘基，包含於重鏈CH3區域。
(2)EU編號為357位及370位之胺基酸殘基，包含於重鏈CH3區域。
(3)EU編號為399位及409位之胺基酸殘基，包含重鏈CH3區域。
[88]如[87]之抗體，係擇自第2重鏈CH3區域之中前述(1)~(3)所示胺基酸殘基之組之胺基酸殘基組，對應於前述第1重鏈CH3區域之中帶同種電荷之前述(1)~(3)所示胺基酸殘基組之1組至3組胺基酸殘基，帶有與前述第1重鏈CH3區域之中對應之胺基酸殘基相反的電荷。
[89]如[87]之抗體，其中，前述帶同種電荷之胺基酸殘基係擇自以下(a)或(b)任一群中包含的胺基酸殘基：(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)、
[90]如[87]之抗體，其中，前述第1重鏈CH3區域與第2 重鏈CH3區域以雙硫鍵交聯。
[91]如[87]之抗體，具有2種以上重鏈不變區域。
[92]如[87]之抗體，為包含2種以上重鏈可變區域與2種以上輕鏈可變區域之多重專一性抗體。
[93]如[92]之抗體，為雙專一性抗體。
[94]一種組成物，包含[87]之抗體及醫藥上可容許的擔體。
[95]一種核酸，編碼為構成[87]之抗體之多肽。
[96]一種寄主細胞，具有[95]之核酸。
[97]一種抗體之製造方法，製造[87]之抗體，包含下列步驟：培養[96]之寄主細胞之步驟、自細胞培養物將多肽回收之步驟。
第1圖顯示將人類化SB04之Fv區域模式化之圖，(A)顯示VH與VL界面之胺基酸殘基H39及L38、(B)VH與VL界面之胺基酸殘基H45及L44。
第2圖顯示H39與L38改變之抗體中，關於H鏈L鏈組裝之評價結果。結果，所有改變抗體與野生型比較，顯示目的抗體之組裝比例上升。
線(lane)之說明
M：分子量標記
1：人類化XB12 H鏈(Q)+人類化XB12 L鏈(Q)
2：人類化XB12 H鏈(Q)+人類化SB04 L鏈(Q)
3：野生型：人類化XB12 H鏈(Q)+人類化XB12 L鏈(Q)
+人類化SB04 L鏈(Q)
4：D變異型：人類化XB12 H鏈(D)+人類化XB12 L鏈(Q)+人類化SB04 L鏈(D)
5：E變異型：人類化XB12 H鏈(E)+人類化XB12 L鏈(Q)+人類化SB04 L鏈(E)
6：R變異型：人類化XB12 H鏈(R)+人類化XB12 L鏈(Q)+人類化SB04 L鏈(R)
7：K變異型：人類化XB12 H鏈(K)+人類化XB12 L鏈(Q)+人類化SB04 L鏈(K)
第3圖顯示H39與L38之改變抗體之中，凝固活性之評價結果。結果，XB12 H鏈(H39)及SB04 L鏈(L38)改變為Glu之雙專一性抗體顯示與野生型為同等以上之凝固活性。
第4圖顯示H39與L38之改變抗體之中，FactorIXa結合活性之評價結果。結果，所有改變抗體之中顯示與野生型為同等之結合活性。
第5圖顯示H39與L38之改變抗體之中，FactorX結合活性之評價結果。結果，所有改變抗體之中，顯示與野生型為同等之結合活性。
第6圖顯示L44之改變抗體之中，H鏈與L鏈組裝之評價結果。結果，所有改變抗體之中，與野生型比較，目的抗體之組裝比例上升。
線之說明
1：野生型：人類化XB12 H鏈+人類化XB12 L鏈(P)+人類化SB04 L鏈(P)
2：D變異型：人類化XB12 H鏈+人類化XB12 L鏈(P)+人類化SB04 L鏈(D)
3：E變異型：人類化XB12 H鏈+人類化XB12 L鏈(P)+人類化SB04 L鏈(E)
4：R變異型：人類化XB12 H鏈+人類化XB12 L鏈(P)+人類化SB04 L鏈(R)
5：K變異型：人類化XB12 H鏈+人類化XB12 L鏈(P)+人類化SB04 L鏈(K)
第7圖顯示L44之改變抗體之中，凝固活性之評價結果。結果，所有改變抗體之中，顯示較野生型為高之凝固活性。
第8圖顯示L44之改變抗體之中，FactorX結合活性之評價結果。結果，所有改變抗體之中，顯示與野生型為同等之結合活性。
第9圖顯示H39、L38及L44之改變抗體之中，H鏈與L鏈組裝之評價結果。結果，所有改變抗體之中，與野生型比較，顯示目的抗體之組裝比例上升。
線之說明
1：野生型：人類化XB12 H鏈(H39：Q)+人類化XB12 L鏈(L38：Q)+人類化SB04 L鏈(L38：Q,L44：P)
2：E+D變異型：人類化XB12 H鏈(H39：E)+人類化XB12 L鏈(L38：Q)+人類化SB04 L鏈(L38：E,L44：D)
3：E+E變異型：人類化XB12 H鏈(H39：E)+人類化XB12 L鏈(L38：Q)+人類化SB04 L鏈(L38：E,L44：E)
4：E+R變異型：人類化XB12 H鏈(H39：E)+人類化XB12 L鏈(L38：Q)+人類化SB04 L鏈(L38：E,L44：R)
5：E+K變異型：人類化XB12 H鏈(H39：E)+人類化XB12L鏈(L38：Q)+人類化SB04 L鏈(L38：E,L44：K)
M：分子量標記
第10圖顯示H39、L38及L44之改變抗體之中，凝固活性之評價結果。結果，XB12 H鏈(H39)及SB04 L鏈(L38、L44)改變之雙專一性抗體顯示與野生型為同等以上之凝固活性。
第11圖顯示H39、L38及L44之改變抗體之中，FactorIXa結合活性之評價結果。結果，所有改變抗體之中，顯示與野生型為同等之結合活性。
第12圖顯示包含2種重鏈可變區域(VH1及VH2)及2種輕鏈可變區域(VL1及VL2)之sc(Fv)2構造之一例的示意圖。(a)構造之sc(Fv)2主要存在以(b)所示之2種型構造異構物。
第13圖顯示u2-wz4之構造異構物peak1與peak2以陽離子交換層析分離之結果。
第14圖顯示以陽離子交換層析分離之peak1與peak2之肽輿圖。
第15圖顯示u2-wz4之構造異構物peak1與peak2、分離前u2-wz4經subtilisin處理後之還原SDS-PAGE結果。所得到之譜帶構造如右所示。
第16圖顯示由於二價scFv與單鏈抗體之構造差異所產生subtilisin限定分解後之分解圖案不同。二價scFv構造之情形，會產生以虛線圍住之低分子量片段。
第17圖顯示u2-wz4之構造異構物peak1及peak2、分離 前之u2-wz4以Subtilisin進行限定分解後之凝膠過濾層析結果。箭頭顯示低分子量峰部之溶出位置。
第18圖顯示MG10-GST融合蛋白質固定化管柱精製後之u2-wz4、變異體v1、變異體v3之凝膠過濾層析結果。
第19圖顯示u2-wz4、變異體v1、變異體v3陽離子交換層析之結果。
第20圖顯示u2-wz4、u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之等電點電泳結果。
第21圖顯示u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之蛋白酶限定分解後之凝膠過濾層析分析結果。
第22圖顯示u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之TPO類似協同活性評價之結果。
第23圖顯示u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之DSC分析結果。
第24圖顯示u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之熱加速試驗之中凝膠過濾層析分析所得到之單體殘存率。
第25圖顯示u2-wz4精製peak1、u2-wz4精製peak2、變異體v1、變異體v3之熱加速試驗之中陽離子交換層析分析所得到之構造異構物含有比例。
第26圖顯示人類化雙專一性抗體(人類化A69(hA69-PFL)/人類化B26(hB26-PF)/人類化BBA(hAL-AQ))之凝固活性之評價結果。結果顯示與嵌合雙專一性抗體為同等以上之凝固活 性。
第27圖顯示改變H鏈不變區域使雙專一性抗體之形成效率提高之概念圖。改變位置編號採用EU編號(Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)。
第28圖顯示CH3界面經過改變之人類化雙專一性抗體(IgG4型)之IEX分析層析圖。
第29圖顯示CH3界面經過改變之人類化雙專一性抗體(IgG4型)以IEX分析所得到之A-Homo、BiAb、B-Homo之形成比例。
第30圖顯示由CH3界面經過改變之人類化雙專一性抗體(IgG4型)所精製之BiAb於60℃-1W之熱加速試驗後之單體殘存率。
第31圖顯示CH3界面經過改變之人類化雙專一性抗體(IgG4型)之凝固活性評價結果。結果顯示與未改變之雙專一性抗體為同等凝固活性。
第32圖顯示CH3界面經過改變之人類化雙專一性抗體(IgG1型)以A-Homo、BiAb、B-Homo之IEX分析所得到之形成比例。
【實施發明之最佳形態】
本發明係關於多肽組裝或多肽構成之異種多聚體之組裝的控制方法。
首先本發明提供一種多肽之組裝控制方法，包含將形成原來多肽內界面之胺基酸殘基改變，以抑制多肽內組 裝。
本發明之中多肽通常指長度10個胺基酸左右以上長度之肽及蛋白質。又，通常為生物由來之多肽，但不特別限定，例如也可為由人工設計之序列構成之多肽。又，也可為天然多肽、或者合成多肽、重組多肽等任一者。再者，上述多肽之片段也包含於本發明之多肽。
本發明之中多肽之組裝，換言之，可指例如2個以上多肽區域交互作用之狀態。
本發明之中「對組裝進行控制」係指控制使成為所望之組裝狀態，更具體而言，係指控制使多肽內之中不形成不希望的組裝。
本發明之中「界面」係指通常組裝(交互作用)時之組裝面，形成界面之胺基酸殘基係指通常供組裝之多肽區域中所包含的1或多數胺基酸殘基，更佳為於組裝時接近並與交互作用相關的胺基酸殘基。該交互作用具體而言，包含組裝時接近的胺基酸殘基彼此形成氫鍵、靜電交互作用、鹽橋之情形等。
本發明之中「形成界面之胺基酸殘基」更加詳述的話，係指構成界面之多肽區域之中，該多肽區域所包含的胺基酸殘基。構成界面之多肽區域若舉一例來表示，係指抗體、配體、受體、基質等之中，負責其分子內或分子間之中選擇性結合之多肽區域。具體而言，例如有抗體之中之重鏈可變區域、輕鏈可變區域等。
本發明方法之中，胺基酸殘基之「改變」具體而言，係指將原胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基、使原來之胺 基酸殘基缺失、附加新的胺基酸殘基等，較佳為指將原胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。
又，本發明之中「多肽」較佳為可形成2種以上構造構造異構物之多肽。該構造構造異構物一般而言，係指胺基酸序列相同，但是立體構造(三次構造)彼此不同的蛋白質。通常，構造構造異構物彼此之中化學或物理性質之中至少之一多會不同。
本發明較佳態樣之中，係關於自可存在2種以上構造構造異構物之中優先地(有效率地)取得所望構造構造異構物之方法。亦即，就一態樣而言，係關於將可形成2種以上構造構造異構物之多肽之中，將形成多肽內界面之胺基酸殘基加以改變，以抑制形成1種以上構造構造異構物之多肽間之組裝之方法。
例如，於多肽內之中，存在第一~第四之多肽區域並且該等任意2個區域可組裝的情形，可考慮(1)第一及第二多肽區域組裝，再者第三及第四多肽區域組裝、(2)第一及第三多肽區域組裝，再者，第二及第四多肽區域組裝、(3)第一及第四多肽區域組裝，再者，第二及第三多肽區域組裝之情形，主要可存在3種構造構造異構物。
為了優先地取得如上述狀況之中(1)的方式組裝的多肽(構造構造異構物)，例如可將存在於該等第一、三或四多肽區域之形成界面的胺基酸殘基加以改變，以抑制第一多肽區域與第三及第四多肽區域之組裝。
又，本發明之方法係關於異種多聚體之組裝控制 方法，包含將形成原來多肽間界面之胺基酸殘基加以改變，以抑制多肽間之組裝。
本發明之中「異種多聚體(heteromultimer)」係指由多數種多肽構成，且該多肽可彼此組裝之蛋白質多聚體。更詳細地說，「異種多聚體」為至少具有第一多肽及第二多肽，且其中第二多肽為與胺基酸序列之中第一多肽至少有1個胺基酸殘基不同的分子。又，雖不特別限定，較佳為，該異種多聚體至少對於2種相異配體、抗原、受體、或基質等具有結合專一性。該異種多聚體除了第一及第二多肽所形成「異種二聚體」，尚可存在其他種多肽。亦即，本發明之「異種多聚體」不限於異種二聚體，例如也包含異種三聚體、異種四聚體等。
上述方法之較佳態樣之中，為對於可形成2種以上多聚體之異種多聚體，改變形成多肽間界面之胺基酸殘基，以抑制形成1種以上多聚體之多肽間之組裝的方法。
例如，於由第一~第四多肽構成之蛋白質多聚體之中，可將該等任意2個多肽組裝之情形，主要可存在：(1)第一及第二多肽組裝，再者，第三及第四多肽組裝之多聚體、(2)第一及第三多肽組裝，再者，第二及第四多肽組裝之多聚體，或(3)第一及第四多肽組裝，再者，第二及第三多肽組裝之多聚體。
為了優先地取得如上述狀況之中(1)之方式組裝之多聚體的情形，例如，可改變該等第一、三或四多肽所包含之胺基酸殘基，以抑制第一多肽與第三及第四多肽組裝。
本發明之多肽之組裝控制方法之較佳態樣，特徵 為：例如形成多肽界面之胺基酸殘基之改變係對該界面導入胺基酸殘基之變異，以使形成界面之2個殘基以上胺基酸殘基成為帶同種電荷。
上述方法之中，可認為藉由使與界面之中組裝相關的2個以上胺基酸殘基改變成為彼此帶同種電荷，藉由電荷之斥力，而使該等胺基酸殘基彼此之組裝受到抑制。
因此，上述方法之中，被改變的胺基酸殘基較佳為，形成界面之多肽區域間之中，於組裝時彼此接近之2個以上胺基酸殘基。
組裝時接近之胺基酸殘基可藉由，例如解析多肽之立體構造，並檢查該多肽組裝時形成界面之多肽區域之胺基酸序列而發現。界面之中彼此接近之胺基酸殘基，成為本發明方法之中「改變」之較佳目標。
胺基酸之中，已知有帶電荷之胺基酸。一般而言，帶正電荷之胺基酸(正電荷胺基酸)已知有離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。帶負電荷之胺基酸(負電荷胺基酸)已知有天冬醯胺酸(D)、谷胺酸(E)等。因此，較佳為，本發明之中帶同種電荷之胺基酸係指、帶正電荷之各胺基酸，或者帶負電荷之各胺基酸。
於本發明方法之中，使變異的所有胺基酸殘基以成為帶同種電荷之方式所做改變，較佳為不一定限於該情形，例如，由於改變而導入之胺基酸殘基為多數的情形，也可於該等胺基酸殘基之中包含少數不帶電荷的胺基酸殘基。
本發明方法之中供改變之胺基酸殘基數不特別限 制，例如改變抗體可變區域之情形，為了不使與抗原之結合活性降低及為了不提高抗原性，較佳為使改變之胺基酸殘基儘可能少。本發明方法如後述實施例所示，藉由使界面之中接近的2個胺基酸殘基之中兩者或一者改變，可控制組裝。上述「少數」係指，例如1~10左右之數，較佳為1~5左右之數，更佳為1~3左右之數，最佳為1或2。
本發明之較佳態樣之中，由改變而導入之(供予改變)胺基酸殘基較佳為，全部為擇自上述正電荷胺基酸之胺基酸殘基，或全部為擇自上述負電荷胺基酸之胺基酸殘基。
又，本發明之中導入之胺基酸殘基，較佳為谷胺酸(E)、天冬醯胺(D)、離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
又，原(改變前)多肽之中，當形成界面之胺基酸殘基(X)已經帶電荷之情形，將組裝時與該胺基酸殘基接近並相對之胺基酸殘基改變成為與該胺基酸殘基(X)為相同之胺基酸殘基(或帶同種電荷之胺基酸殘基)亦為本發明較佳態樣之一。於該態樣之中，只要改變形成界面之胺基酸殘基其中之一即可。
又，本發明組裝控制方法之較佳態樣之中，其特徵為：形成多肽界面之胺基酸殘基之改變係於該界面導入胺基酸殘基之變異，以使界面所存在形成疏水性核之胺基酸殘基成為帶電荷之胺基酸殘基。
一般而言，「疏水性核(hydrophobic core)」係指疏水性胺基酸之側鏈集合於組裝之多肽內側而形成之部分。疏水性胺基酸包含例如丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、 苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、纈胺酸等。又，疏水核形成有時也與疏水性胺基酸以外之胺基酸殘基(例如酪胺酸)有關。該疏水性核與親水性胺基酸之側鏈露出於外側之親水性表面一起成為促進水溶性多肽組裝之驅動力。如果相異之2個功能區之疏水性胺基酸存在於分子表面，並且暴露於水分子中，則熵(entropy)增大並且自由能增大。因此，2個功能區為了使自由能減少並安定化，而彼此組裝，並使界面之疏水性胺基酸埋入分子內部，形成疏水核。
可認為是發生多肽組裝時，由於自形成疏水性核之疏水性胺基酸改變為帶電荷之極性胺基酸，使疏水性核之形成受到抑制，其結果，使多肽組裝受到抑制。
對於該技術領域之人士，可藉由對所望多肽進行胺基酸序列解析，而了解疏水性核是否存在及形成部位(區域)等。亦即本發明係一種組裝控制方法，其特徵為將界面之中可形成疏水性核之胺基酸殘基，改變為帶電荷之胺基酸殘基。
上述方法之中，就帶電荷之胺基酸殘基而言，較佳為例如谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)、離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
本發明之組裝控制方法，可利用為在抗體或抗體片段及具有類似抗體活性之多肽等之製造之中，優先地取得(製造)目的抗體(多肽)之方法。
本發明之中，用語「抗體」係使用為最廣的意義，只要是顯示所望之生物學活性即可，包含單株抗體、多株抗體、抗體變異體(嵌合抗體、人類化抗體、低分子化抗體(也包 含抗體片段)、多專一性抗體等)。又，本發明之中「抗體」也可為多肽或者異種多聚體之中任一者。較佳抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體，以及抗體片段等低分子化抗體。本發明之中，取得該等抗體取得(作成)時，可適當使用本發明之組裝控制方法。
本發明之中「多重專一性抗體」(本說明書，與「多種專一性抗體」表示相同含意)係指可與相異的多種抗原決定基進行專一性結合之抗體。也就是說，多重專一性抗體係對於至少2種不同的抗原決定基具有專一性之抗體，除了認識相異抗原之抗體以外，尚包含認識相同抗原上之相異抗原決定基的抗體。(例如，當抗原為異受體之情形，多重專一性抗體為認識構成異受體之相異功能區者，或者抗原為單體之情形，多重專一性抗體認識單體抗原之多數位置)。通常，如該種分子係與2個抗原結合者(雙專一性抗體：bispecific抗體；本說明書之中與「二種專一性抗體」為相同含意)，但也可對於更多種(例如3種)抗原具有專一性者。
本發明之中「抗體」包含藉由對上述抗體進一步進行胺基酸取代、缺失、加成及/或插入或嵌合化或人類化等，而使其胺基酸序列改變者。以胺基酸取代、缺失、加成及/或插入、以及人類化、嵌合化等所進行之胺基酸序列改變，可利用該技術領域之人士公知之方法進行。同樣地，本發明之中以重組抗體之方式製作抗體時所利用之抗體可變區域及不變區域，也可藉由胺基酸取代、缺失、加成及/或插入或嵌合化或人類化等來改變胺基酸序列。
本發明之中抗體可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等各種動物由來之抗體。再者，可為例如嵌合抗體，其中，較佳為人類化抗體等將胺基酸序列取代之改變抗體。又，可為使各種分子結合之抗體修飾物、抗體片段、低分子化抗體等各種抗體。
「嵌合抗體」係指將相異動物由來之序列組合而製作之抗體。例如有，由小鼠抗體之重鏈及輕鏈之可變(V)區域與人類抗體之重鏈及輕鏈之不變(C)區域構成的抗體。嵌合抗體之製作為公知的，例如，可藉由將編碼為抗體V區域之DNA與編碼為人類抗體C區域之DNA連結，並將該等嵌入表現載體並導入寄主使生產，來得到嵌合抗體。
「人類化抗體」也稱為再構成(reshaped)人類抗體，將係指人類以外之哺乳動物由來之抗體，例如小鼠抗體之互補性決定區域(CDR；complementarity determining region)移植到人類抗體之CDR者。鑑定CDR之方法為公知的(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),National Institute of Health,Bethesda,Md.；Chothia et al.,Nature(1989)342：877)。又，其一般的基因重組方法亦為公知(參照歐洲專利申請公開編號EP 125023號公報、WO 96/02576號公報)。可藉由公知方法，例如決定小鼠抗體之CDR，並取得編碼為將該CDR與人類抗體之框架區域(framework region；FR)連結之抗體的DNA，並將人類化抗體以通常表現載體使用之系來產生。如該DNA可藉由以使CDR及FR兩者之末端區域具有重疊部分之方式所製作之數個寡核苷酸作為 引子，並以PCR法合成(參照WO98/13388號公報之方法)。透過CDR而連結之人類抗體之FR，可以用使CDR形成良好之抗原結合部位的方式來選擇。視需要，也可以用使再構成人類抗體之CDR形成適當之抗原結合部位之方式，來改變抗體可變區域之中FR之胺基酸(Sato et al.,Cancer Res.(1993)53：851-6)。可改變之FR中之胺基酸殘基包含：於抗原以直接、非共價鍵來結合之部分(Amit et al.,Science(1986)233：747-53)、對CDR構造影響或作用之部分(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)及與VH-VL交互作用相關之部分(EP239400號專利公報)。
本發明之中，抗體為嵌合抗體或人類化抗體之情形，該等抗體之C區域較佳為使用人類抗體由來者。例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，L鏈可使用Cκ、Cλ。又，為了改善抗體或其產生之安定性，可將人類抗體C區域視需要加以修飾。本發明之中，嵌合抗體較佳為由人類以外之哺乳動物由來抗體之可變區域與人類抗體由來之不變區域構成。另一方面，人類化抗體較佳為由人類以外之哺乳動物由來抗體之CDR與人類抗體由來之FR及C區域構成。關於可變區域，於(3)-3.之中整理並說明。人類抗體由來之不變區域依IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE等同種型(isotype)而具有固有之胺基酸序列。本發明之中，人類化抗體所使用之不變區域，可為屬於任一同種型之抗體之不變區域。較佳為，使用人類IgG之不變區域，但不限於該等。又，利用於人類化抗體之人類抗體由來之FR亦不特別限定，可為屬於任一同種型之抗體。
本發明之中，嵌合抗體及人類化抗體之可變區域及不變區域只要是能顯示原來抗體之結合專一性，也可藉缺失、取代、插入及/或加成等加以改變。
利用人類由來序列之嵌合抗體及人類化抗體，由於在人類體內之抗原性低，被認為在治療目的等對人類投予時為有用的。
又，低分子化抗體於體內動態之性質方面，由可使用大腸菌、植物細胞等以低成本製造之觀點，作為抗體是有用的。
抗體片段為低分子化抗體之一種。又，低分子化抗體尚包含使抗體片段成為其構造一部分之抗體。本發明之中低分子化抗體只要具有對抗原之結合能力則其構造、製造法等不限定。低分子化抗體之中，尚存在有較全長抗體更高活性之抗體(Orita et al.,Blood(2005)105：562-566)。本說明書之中，「抗體片段」雖然只要是全長抗體(whole antibody、例如whole IgG等)之一部分即不特別限定，但較佳為包含重鏈可變區域(VH)或輕鏈可變區域(VL)。較佳抗體片段之例，例如有Fab、F(ab')2、Fab'、Fv等。抗體片段中之VH或VL之胺基酸序列可藉由取代、缺失、加成及/或插入加以改變。再者，只要能保持對抗原之結合能力，則VH及VL之一部可缺損。例如，於前述抗體片段之中，「Fv」為包含完全之抗原認識部位與結合部位之最小抗體片段。「Fv」為由1個VH及1個VL以非共價鍵強力結合之二聚物(VH-VL二聚物)。由各可變區域之3個互補鏈決定區域(complementarity determining region；CDR) 在VH-VL二聚物之表面形成抗原結合部位。由6個CDR在抗體賦予抗原結合部位。然而，即使1個可變區域(或為僅含有對抗原專一性之3個CDR之Fv一半)較全結合部位之親和性為低，仍認識抗原，並具有結合能力。因此，較如該Fv小之分子亦包含於本發明之中抗體片段。又，抗體片段之可變區域可嵌合化或人類化。
低分子化抗體較佳為包含VH及VL兩者。就低分子化抗體之例而言，例如有Fab、Fab'、F(ab')2及Fv等抗體片段以及可利用抗體片段所製作之scFv(單鏈Fv)(Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：5879-83；Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113,Resenburg及Moore編，Springer Verlag,New York,pp.269-315,(1994))、雙功能抗體(Diabody)(Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：6444-8；EP404097號；WO93/11161號；Johnson et al.,Method in Enzymology(1991)203：88-98；Holliger et al.,Protein Engineering(1996)9：299-305；Perisic et al.,Structure(1994)2：1217-26；John et al.,Protein Engineering(1999)12(7)：597-604；Atwell et al.,Mol.Immunol.(1996)33：1301-12)、sc(Fv)2(Hudson et al、J Immunol.Methods(1999)231：177-89；Orita et al.,Blood(2005)105：562-566)、Triabody(Journal of Immunological Methods(1999)231：177-89)，及串聯雙功能抗體(Tandem Diabody)(Cancer Research(2000)60：4336-41)等。
抗體片段可藉由將抗體以酵素，例如木瓜酵素、 胃蛋白酶等蛋白酶處理而得到(參照Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24：107-17；Brennan et al.,Science(1985)229：81)。又，可以依據該抗體片段之胺基酸序列，利用基因重組來製造。
具有將抗體片段改變之構造的低分子化抗體可利用以酵素處理或基因重組得到抗體片段而構建。或，也可構件編碼為低分子化抗體全體之基因，將該等導入於表現載體之後，以適當的寄主細胞加以表現(例如，參照Co et al.,J.Immunol.(1994)152：2968-76；Better and Horwitz,Methods Enzymol.(1989)178：476-96；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol.(1989)178：497-515；Lamoyi,Methods Enzymol.(1986)121：652-63；Rousseaux et al.,Methods Enzymol.(1986)121：663-9；Bird and Walker,Trends Biotechnol.(1991)9：132-7)。
又，上述「scFv」為將2個可變區域視需要透過連接子等而結合之單鏈多肽。scFv中包含之2個可變區域通常為1個VH及1個VL，但也可為2個VH或2個VL。一般而言，scFv多肽在VH及VL功能區之間包含連接子，藉此形成抗原結合所必須的VH及VL之配對部分。通常，為了於同分子內在VH及VL間形成配對部分，一般而言，會將連結VH及VL之連接子設為10個胺基酸以上長度之肽連接子。然而，本發明之中scFv之連接子只要不妨礙scFv形成，並不限於如該肽連接子。就scFv之總論而言，可參照Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibody』Vol.113(Rosenburg and Moore ed.,Springer Verlag,NY,pp.269-315(1994))。
又，「雙功能抗體(diabody；Db)」係指利用基因融合所構建之二價(bivalent)抗體片段(P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097號、WO93/11161號等)。雙功能抗體為由2條多肽鏈構成之二聚物，多肽鏈由各個無法將在同鏈中輕鏈可變區域(VL)及重鏈可變區域(VH)彼此結合程度之短小，例如5個殘基左右之連接子而結合。被編碼於相同多肽鏈上之VL與VH由於其之間之連接子短小，因此無法形成單鏈V區域片段而形成二聚體，使雙功能抗體具有2個抗原結合部位。此時如果將對2個相異抗原決定基(a、b)之VL及VH與VLa-VHb及VLb-VHa的組合以5個殘基左右之連接子連結者同時表現，則會以雙專一性Db之形式分泌。此時2個相異抗原決定基可指在相同抗原上之相異2位置之抗原決定基，也可指分別位於2個相異抗原之2位置的抗原決定基。
雙功能抗體由於包含2分子scFv，故包含4個可變區域，其結果，成為具有2個抗原結合部位。與未形成二聚物之scFv之情形不同，以形成雙功能抗體為目的之情形，通常連接各scFv分子內之VH及VL之間的連接子為肽連接子時，係定為5個胺基酸左右。然而，形成雙功能抗體之scFv之肽連接子，只要不妨礙scFv表現且不妨礙雙功能抗體之形成，並不限於如該連接子。
供於本發明方法之較佳多肽或異種多聚體例如有，具有抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之多肽或異種多 聚體。又，更佳為本發明較佳態樣為一組裝控制方法，其中，本發明之多肽或異種多聚體包含2種以上重鏈可變區域及2種以上輕鏈可變區域。該多肽或異種多聚體較佳為能認識2種以上抗原決定基者，例如有多重專一性抗體。
本發明之中又更佳為就多重專一性抗體而言，例如雙專一性抗體。
亦即，本發明較佳態樣係關於一種控制組裝之方法，係控制由例如2種重鏈可變區域(第一重鏈及第二重鏈)及2種輕鏈可變區域(第一輕鏈及第二輕鏈)構成之雙專一性抗體之組裝。
若對於本發明較佳態樣之「雙專一性抗體」進一步詳述，上述「第一重鏈」係指形成抗體之2個H鏈之其中之一的H鏈，第二H鏈係指與第一H鏈相異之另一H鏈。也就是說，可將2個H鏈之中任意一者作為第一H鏈，另一者作為第二H鏈。同樣地，「第一輕鏈」係指形成雙專一性抗體之2個L鏈之其中之一的L鏈，第二L鏈指與第一L鏈相異之另一L鏈，可將2個L鏈其中之任一者作為第一L鏈，另一者作為第二L鏈。通常，第一L鏈與第一H鏈由認識某抗原(或抗原決定基)之相同抗體由來，第二L鏈與第二H鏈亦由認識某抗原(或抗原決定基)之相同抗體由來。在此，將由第一H鏈‧L鏈形成之L鏈-H鏈對稱為第一對，由第二H鏈‧L鏈形成之L鏈-H鏈對稱為第二對。成為第二對由來之抗體在製作時使用之抗原(或抗原決定基)較佳為與成為第一對由來之抗體在製作時使用者不同。亦即，第一對與第二對認識之抗原可為相同， 但較佳為認識相異抗原(或抗原決定基)。於該情形，較佳為第一對及第二對之H鏈與L鏈彼此具有相異的胺基酸序列。當第一對與第二對認識相異之抗原決定基的情形，該第一對與第二對可認識完全相異之抗原，也可認識相同抗原上之相異部位(相異抗原決定基)。又，可為其中之一認識蛋白質、肽、基因、糖等抗原，另一者認識放射性物質、化學療法劑、細胞由來毒素等細胞傷害性物質等。然而，在欲考慮製作由特定H鏈與L鏈組合形成之對的抗體時，可以將其特定H鏈與L鏈作為第一對及第二對而任意地決定。
又，上述「雙專一性抗體」不一定限於由2種重鏈及2種輕鏈構成的抗體，例如也可為將2種重鏈可變區域及2種輕鏈可變區域以單鏈的形式連結構造之抗體(例如sc(Fv)2)。
本發明方法之中，編碼為變異導入前之抗體(本說明書之中，有時單獨記載為「本發明之抗體」)之H鏈或L鏈的基因可使用既知序列，又，也可用該領域人士公知之方法取得。例如，可由抗體庫取得，也可自產生單株抗體之融合瘤選殖出編碼為抗體之基因。
關於抗體庫，已經有許多公知的抗體庫，又抗體庫之製作方法亦為公知的，因此，該技術領域之人士可適當地取得抗體庫。例如，關於抗體噬菌體庫，可參照Clackson et al.,Nature 1991,352：624-8、Marks et al.,J.Mol.Biol.1991,222：581-97、Waterhouses et al.,Nucleic Acids Res.1993,21：2265-6、Griffiths et al.,EMBO J.1994,13：3245-60、Vaughan et al.,Nature Biotechnology 1996,14：309-14及日本特表平20 -504970號公報等文獻。此外，可使用製作真核細胞庫之方法(WO95/15393號小冊)或微脂體提示法等公知方法。再者，使用人類抗體庫，利用淘篩(panning)取得人類抗體之技術亦為已知的。例如，可以將人類抗體之可變區域作為單鏈抗體(scFv)，利用噬菌體提示(display)法表現於噬菌體表面，並選擇與抗原結合之噬菌體。如果對選擇的噬菌體進行基因解析，則可決定編碼為結合於抗原之人類抗體之可變區域的DNA序列。如果結合於抗原之scFv之DNA序列明瞭了，則可以依據該序列，製作適當的表現載體，並取得人類抗體。該等方法已經為周知的，可參考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
自融合瘤取得編碼為抗體之基因的方法，可藉由：基本上使用公知技術，使用所望抗原或表現所望抗原之細胞作為感作抗原，將該等依照通常之免疫方法進行免疫，將得到之免疫細胞利用通常的細胞融合法與公知的母細胞融合，利用通常的篩選法，篩選單株抗體產生細胞(融合瘤)，以得到融合瘤之mRNA利用反轉錄酶合成抗體之可變區域(V區域)之cDNA，並藉由將該等與編碼為所望抗體不變區域(C區域)之DNA連結而得到。
更具體而言，不特別限於以下例示者，但用以得到編碼為上述H鏈及L鏈之抗體基因之感作抗原，包含具有免疫原性之完全抗原及未顯示免疫原性之包含半抗原(hapten)等不完全抗原兩者。例如，可使用目的蛋白質之全長蛋白質或部分肽等。此外，多糖類、核酸、脂質等構成之物質已知可成為 抗原，但本發明抗體之抗原不特別限定。抗原之調製可依照該技術領域人士公知之方法進行，例如可依照使用桿狀病毒(Baculovirus)之方法(例如WO98/46777等)等進行。融合瘤之製作，例如可依據Milstein等人之方法(G.Kohler and C.Milstein,Methods Enzymol.1981,73：3-46)等進行。當抗原之免疫原性低的情形，可使其與白蛋白等具有免疫原性之巨大分子結合，並進行免疫即可。又，視需要抗原可藉由與其他分子結合而成為可溶性抗原。當使用如受體之膜貫通分子作為抗原之情形，可將受體之細胞外區域部分作為片段使用，或使用在細胞表面上表現膜貫通分子之細胞作為免疫原。
抗體產生細胞可藉由使用上述適當感作抗原而將動物免疫化以得到。或也可將能產生抗體之淋巴球於體外(in vitro)免疫化而製成抗體產生細胞。免疫化動物可使用各種哺乳動物，一般使用囓齒目、兔目、靈長目動物。例如有，小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒目、兔等兔目、長尾獼猴(Macaca fascicularis)、恆河猴(Macaca mulatta)、長鬃狒狒(Papio hamadryas)、黑猩猩(chimpanzee)等猴等靈長目動物。此外，亦已知有具有人類抗體基因曲目(repertoire)的基因轉殖動物，藉由使用如該動物，也可得到人類抗體(參照WO96/34096；Mendez et al.,Nat.Genet.1997,15：146-56)。取如該基因轉殖動物之使用而代之，例如將人類淋巴球於體外(in vitro)以所望抗原或表現所望抗原之細胞感作，再藉由將感作淋巴球與人類骨髓瘤細胞例如U266融合，也可得到對抗原具有結合活性之所望人類抗體(參照特公平1-59878號公報)。又，也可藉由將 具有人類抗體基因所有的曲目(repertoire)的基因轉殖動物以所望的抗原來免疫，得到所望之人類抗體(參照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)。
動物之免疫化例如可藉由：將感作抗原以磷酸緩衝鹽液(Phosphate-buffered Saline)(PBS)或生理食鹽水等適當稀釋、懸浮，再視需要與佐劑混合而後乳化，之後對動物進行腹腔內或皮下注射來進行。之後，較佳為將混合於佛洛依德不完全佐劑之感作抗原於間隔4~21日投予數次。抗體產生之確認可以慣用方法測定動物血清中之目的抗體力價來進行。
融合瘤可將自以所望抗原免疫化之動物或淋巴球所得到之抗體產生細胞，使用慣用之融合劑(例如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞融合而製作(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,1986,59-103)。視需要，將融合瘤細胞加以培養‧增殖，並利用免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸附分析(ELISA)等公知之分析法，測定由該融合瘤所產生抗體之結合專一性。之後，視需要也可將會產生經過測定目的專一性、親和性或活性之抗體之融合瘤利用極限稀釋法等方法進行次選殖(sub cloning)。
接著，將編碼為選擇之抗體的基因利用能對抗體專一性結合之探針(例如，與編碼為抗體不變區域之序列互補的寡核苷酸等)自融合瘤或抗體產生細胞(感作淋巴球等)加以選殖。又，也可自mRNA利用RT-PCR進行選殖。免疫球蛋白分類為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM5種相異的類別(class)。再者，該等類別分成幾種次型(同種型)(例如、IgG-1、IgG-2、 IgG-3、及IgG-4；IgA-1及IgA-2等)。本發明之中，抗體製造使用之H鏈及L鏈可由來自屬於該等任一類型及次型之抗體，雖不特別限定，但尤佳為IgG。
在此，編碼為H鏈及L鏈之基因也可利用遺傳工程的方法加以改變。例如，可就小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、羊抗體、駱駝抗體等抗體，適當製作經過人為改變以使對人類之異種抗原性降低之基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人類化抗體等。嵌合抗體為由人類以外之哺乳動物，例如小鼠抗體之H鏈、L鏈之可變區域與人類抗體之H鏈、L鏈之不變區域構成之抗體，可藉由將編碼為小鼠抗體之可變區域的DNA與編碼為人類抗體之不變區域的DNA連結，並將該等嵌入表現載體並導入寄主使產生來得到。人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體，可藉由將連結人類以外之哺乳動物，例如小鼠抗體之互補性決定區域(CDR；complementary determining region)之方式設計之DNA序列利用由以末端部具有重疊部分之方式製作之數個寡核苷酸以PCR法合成。可藉由將得到之DNA與編碼為人類抗體不變區域之DNA連結，接著，嵌入表現載體，將該等導入寄主並生產而得到(參照EP239400；WO96/02576)。透過CDR連結之人類抗體之FR之中，互補性決定區域形成良好抗原結合部位者被選擇。視需要，也可將再構成人類抗體之互補性決定區域之中，抗體可變區域之框架區域之胺基酸取代，以形成適當的抗原結合部位(K.Sato et al.,Cancer Res.1993,53：851-856)。
上述人類化以外，可考量例如為了改善與抗原之 結合性等抗體之生物學特性而進行改變。如該改變可利用部位專一性的突變(例如參照Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)、PCR變異、卡匣(cassette)變異等方法進行。一般而言，生物學特性經過改善之抗體變異體相對於原來抗體可變區域之胺基酸序列，有70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)之胺基酸序列相同性及/或類似性。本說明書之中，序列相同性及/或類似性係定義為：以取得序列相同性為最大值之方式視需要將序列整列化及導入缺口(gap)後，與原來之抗體殘基為相同(相同殘基)或類似(一般而言，係依據胺基酸側鏈之特性而分類為同群(group)之胺基酸殘基)之胺基酸殘基之比例。通常，天然的胺基酸殘基依據其側鏈之性質，分類成下列群：(1)疏水性：丙胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸；(2)中性親水性：天冬醯胺、谷醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸及絲胺酸；(3)酸性：天冬醯胺酸及谷胺酸；(4)鹼性：精胺酸、組胺酸及離胺酸；(5)影響鏈配向之殘基：甘胺酸及脯胺酸；及(6)芳香族性：酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。
通常，存在於H鏈及L鏈之可變區域中總共6個互補性決定區域(超可變部；CDR)會交互作用並形成抗體之抗原結合部位。其中，已知1個可變區域雖然較包含完整結合部位者親和性較低，但是會認識抗原並具有結合能力。因此，本發明之中編碼為H鏈及L鏈之抗體基因只要由該基因所編碼之多肽能維持與所望抗原結合性即可，能編碼為包含H鏈及L鏈之各抗原結合部位之片段部分即可。
依照本發明之組裝控制方法，如上所述，例如可優先地(有效率地)取得所望之雙專一性抗體。亦即，可自單體混合物有效率地形成為所望之異種多聚體之雙專一性抗體。
以下，對於具有2種重鏈可變區域(VH1及VH2)及2種輕鏈可變區域(VL1及VL2)之IgG型雙專一性抗體之情形更詳細說明，但關於其他異種多聚體也同樣地可應用本發明之方法。
欲取得可自第一重鏈可變區域(VH1)及第一輕鏈可變區域(VL1)認識其中之一之抗原決定基，並可由第二重鏈可變區域(VH2)及第二輕鏈可變區域(VL2)認識另一抗原決定基之雙專一性抗體之情形，如果使該抗體之生產之中，4種鏈各別的表現，則理論上可能產生10種抗體分子。
於該情形，如果以抑制例如：VH1與VL2、及/或VH2與VL1多肽間之組裝的方式加以控制，則可優先地取得所望之抗體分子。
舉一例來說，例如藉由將VH1多肽與VL2多肽間，及/或VH2多肽與VL1多肽間之形成界面之胺基酸殘基改成如上所述，則可抑制該等多肽間之組裝。
又，藉由利用本發明之組裝控制方法，也可抑制重鏈彼此(VH1與VH2)，或者輕鏈彼此(VL1與VL2)之組裝。
重鏈可變區域如上述，通常由3個CDR區域及FR區域構成。本發明較佳態樣之中供「改變」之胺基酸殘基，可自例如位在CDR區域或者FR區域之胺基酸殘基之中適當選擇。一般而言，CDR區域之胺基酸殘基之改變可能使對抗原之 結合能力下降。因此，本發明之中供「改變」之胺基酸殘基雖不特別限定，但較佳為自位於FR區域之胺基酸殘基中適當選擇。
如果為該技術領域之人士，關於欲以本發明方法控制組裝之所望多肽，可適當地了解，為組裝時接近FR界面之中之胺基酸殘基之種類。
又，人類或小鼠等生物之中，可利用為抗體可變區域之FR的序列，只要是該技術領域之人士，可利用公共資料庫等而適當取得。更具體而言，可利用後述實施例之工具取得FR區域之胺基酸序列資訊。
例如，關於後述實施例所示雙專一性抗體，就組裝時接近FR界面之中之胺基酸殘基之具體例而言，例如有重鏈可變區域上之39位(FR2區域)(例如序列編號：6之胺基酸序列之中之39位)的谷醯胺(Q)，及相對(接觸)之輕鏈可變區域上之38位(FR2區域)(例如序列編號：8之胺基酸序列之中之44位)的谷醯胺(Q)。再者，例如較佳為重鏈可變區域上之45位(FR2)(例如序列編號：6之胺基酸序列之中之45位)的白胺酸(L)，及相對之輕鏈可變區域上之44位(FR2)(例如序列編號：8之胺基酸序列之中之50位)的脯胺酸(P)。又，關於該等部位之編號參考Kabat等之文獻(Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。
如後述實施例所示，藉由改變該等胺基酸殘基並實施本發明之方法，可以優先地取得所望抗體。
由於該等胺基酸殘基已知在人類及小鼠之中為高 度保守性的(conservative)(J.Mol.Recognit.2003；16：113-120)，因此，實施例所示抗體以外之VH與VL之組裝，也可利用改變對應於上述胺基酸殘基之胺基酸殘基，而控制抗體可變區域之組裝。
亦即，本發明較佳態樣為提供一種抗體，為包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體(多肽(例如sc(Fv)2)或異種多聚體(例如IgG型抗體)等)，以下(1)與(2)或(3)與(4)之胺基酸殘基為帶同種電荷之胺基酸殘基：
(1)一種胺基酸殘基，包含於重鏈可變區域，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中之39位。
(2)一種胺基酸殘基，包含於輕鏈可變區域，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中之44位。
(3)一種胺基酸殘基，包含於重鏈可變區域，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中之45位。
(4)一種胺基酸殘基，包含於輕鏈可變區域，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中之50位。
又，上述序列編號：6或8之胺基酸序列係用以將本發明之中供改變之胺基酸殘基的位置更具體例示，重鏈可變區域或輕鏈可變區域不限於該等胺基酸序列情形。
上述(1)與(2)、(3)與(4)各胺基酸殘基，如後述實施例及圖1所示，在組裝之後彼此為接近的。只要是該技術領域之人士，可對於所望之重鏈可變區域或輕鏈可變區域，利用使用市售軟體之相同度模擬器等，而發現與上述(1)~(4)之胺基酸殘基對應之部位，並適當將該部位之胺基酸殘基供改變。
上述抗體之中，「具有電荷之胺基酸殘基」較佳為擇自例如以下(a)或(b)任一群所包含胺基酸殘基。
(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
再者，本發明提供一種抗體，為包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體(多肽或異種多聚體等)，以下(3)與(4)任一者為帶電荷之胺基酸殘基。以下(3)與(4)表示之胺基酸殘基之側鏈可接近並形成疏水性核。
(3)一種胺基酸殘基，包含於重鏈可變區域，相當於序列編號：6之胺基酸序列之中之45位。
(4)一種胺基酸殘基，包含於輕鏈可變區域，相當於序列編號：8之胺基酸序列之中之50位。
上述抗體之中，「帶電荷之胺基酸殘基」較佳為例如谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)、離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)。
上述(1)~(4)之胺基酸殘基通常在人類及小鼠之中分別為(1)谷醯胺(Q)、(2)谷醯胺(Q)、(3)白胺酸(L)、(4)脯胺酸(P)。因此，本發明較佳態樣之中，該等胺基酸殘基供予改變(例如取代為帶電荷胺基酸)。又，上述(1)~(4)胺基酸殘基之種類不一定限於上述胺基酸殘基，也可為與該胺基酸相當之其他胺基酸。例如，就相當於輕鏈可變區域上序列編號：8之胺基酸序列之中之44位的胺基酸而言，於人類之情形，例如可為組胺酸(H)。該技術領域之人士，藉由參照公知文獻等(例如J.Mol.Recognit.2003；16：113-120)，可就序列編號：8上任 意位置，了解相當於該位置之胺基酸殘基種類，並適當對該胺基酸殘基進行改變(例如，取代為帶電荷胺基酸)。
又，上述抗體之製造方法，及以將上述(1)~(4)胺基酸殘基加以改變為特徴之本發明之組裝控制方法亦為本發明之較佳態樣。
又，本發明之其他態樣，例如有於重鏈或輕鏈不變區域之界面導入電荷性斥力，而抑制重鏈彼此或重鏈與輕鏈之組裝的方法。於重鏈不變區域之界面接觸的胺基酸殘基，例如相對於CH3區域之中377位(356位)與470位(439位)、378位(357位)與393位(370位)、427位(399位)與440位(409位)之區域。於重鏈不變區域與輕鏈不變區域之界面接觸的胺基酸殘基，例如有與CH1區域之221位(213位)及CL區域之123位相對之區域。就抗體不變區域之編號而言，係參考Kabat等文獻(Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)，關於重鏈不變區域之EU編號表示於括弧內。
如後述實施例所示，藉由改變該等胺基酸殘基並實施本發明之方法，可控制抗體重鏈之組裝，並優先地取得所望之抗體。
亦即，本發明較佳態樣提供一種抗體，包含2種以上重鏈CH3區域之抗體及Fc區域結合蛋白質(例如、IgG型抗體、minibody(Alt M et al.FEBS Letters 1999；454：90-94)、免疫黏著素(immunoadhesin)(非專利文獻2)等)，第1重鏈之CH3區域之中，擇自以下(1)~(3)所示胺基酸殘基構成之組之1組至3 組胺基酸殘基帶同種電荷。
(1)一種胺基酸殘基，包含於重鏈CH3區域，以EU編號為356位及439位。
(2)一種胺基酸殘基，包含於重鏈CH3區域，以EU編號為357位及370位。
(3)一種胺基酸殘基，包含於重鏈CH3區域，以EU編號為399位及409位。
再者，本發明較佳態樣提供一種抗體，係與上述第1重鏈CH3區域相異之第2重鏈CH3區域之中，擇自前述(1)~(3)所示胺基酸殘基之組之胺基酸殘基之組，且對應於前述第1重鏈CH3區域之中帶同種電荷之以前述(1)~(3)所示胺基酸殘基之組的1組至3組胺基酸殘基，具有前述第1重鏈CH3區域之中對應的胺基酸殘基為相反之電荷。
上述(1)~(3)各胺基酸殘基如後述實施例及圖27所示，在組裝之後彼此接近。如為該技術領域之人士，對於所望重鏈CH3區域或重鏈不變區域，藉由使用市售軟體之相同度模擬器，可發現對應於上述(1)~(3)之胺基酸殘基之部位，並適當使該部位之胺基酸殘基供予改變。
上述抗體之中，「帶電荷之胺基酸殘基」較佳為，例如擇自以下(a)或(b)任一群包含之胺基酸殘基。
(a)谷胺酸(E)、天冬醯胺酸(D)；(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述抗體之中，「帶同種電荷」係指例如2個以上胺基酸殘基之中任一者具有包含於上述(a)或(b)任1群之胺 基酸殘基。「帶相反電荷」係指例如2個以上胺基酸殘基之中至少1個胺基酸殘基，具有上述(a)或(b)任1群所包含之胺基酸殘基的情形，其餘之胺基酸殘基具有相異群所包含之胺基酸殘基。
於較佳態樣，上述抗體之中，第1重鏈CH3區域及第2重鏈CH3區域可利用雙硫鍵加以交聯。
本發明之中，供「改變」之胺基酸殘基不限於上述抗體可變區域或抗體不變區域之胺基酸殘基。只要為該技術領域之人士，對於多肽變異體或異種多聚體，可藉由使用市售軟體之相同度模擬器等，發現形成界面之胺基酸殘基，並將該部位之胺基酸殘基供於改變，以控制組裝。
本發明方法可與公知技術組合而實施，但並非必要的。例如，以使VH1與VL1，及/或VH2與VL2之組裝促進之方式，除了本發明之「改變」以外，將存在於其中之一H鏈可變區域之胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob；突起)，並將存在於另一H鏈之相對可變區域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole；空隙)，並使突起能配置於空隙之方式來促進VH1與VL1、及/或VH2與VL2之組裝，結果可進一步抑制VH1與VL2，及/或VH2與VL1多肽間之組裝。
本發明之組裝控制方法，當優先地(有效率地)取得所望之sc(Fv)2時，可適當地實施。以下，舉一例對於具有2種重鏈可變區域(H1與H2)及2種輕鏈可變區域(L1與L2)之sc(Fv)2的情形，更詳細說明。
一般而言，sc(Fv)2係將2個重鏈可變區域(VH1 與VH2)及2個輕鏈可變區域(VL1與VL2)以連接子結合之單鏈多肽。亦即，sc(Fv)2為將4個抗體可變區域以連接子等結合成為單鏈之低分子化抗體。通常，sc(Fv)2係將2個輕鏈可變區域及2個重鏈可變區域等4個可變區域以連接子等結合而成為單鏈之抗體(Hudson et al,J Immunol.Methods 1999；231：177-189)。
該技術領域之人士可用公知之方法製作sc(Fv)2，例如可藉由將scFv以連接子連結以製作。scFv包含抗體之VH及VL。該等區域存在於單一多肽鏈中(關於scFv之總論，參照Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113(Rosenburg and Moore ed(Springer Verlag,New York)pp.269-315,1994))。
又，抗體較佳為：2個VH及2個VL以單鏈多肽之N末端側為基點，依序以VH、VL、VH、VL(〔VH〕連接子〔VL〕連接子〔VH〕連接子〔VL〕)之順序排列。
2個VH與2個VL之順序不特別限於上述配置，可以任意順序排列。例如可為如以下之配置。
〔VL〕連接子〔VH〕連接子〔VH〕連接子〔VL〕
〔VH〕連接子〔VL〕連接子〔VL〕連接子〔VH〕
〔VH〕連接子〔VH〕連接子〔VL〕連接子〔VL〕
〔VL〕連接子〔VL〕連接子〔VH〕連接子〔VH〕
〔VL〕連接子〔VH〕連接子〔VL〕連接子〔VH〕
sc(Fv)2也可包含抗體可變區域、連接子以外之胺基酸序列。
上述抗體可變區域可為可變區域全長，只要可維持對抗原之結合活性，也可為可變區域之部分序列。又，可變區域中之胺基酸序列可被取代、缺失、加成、插入等。例如，為使抗原性降低，可經過嵌合化或人類化。
將抗體可變區域結合之連接子，可使用利用遺傳工程導入之任意肽連接子或合成化合物連接子(參照例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996)所揭示之連接子等，但是，本發明之中較佳為肽連接子。連接子之長度不特別限定，視目的該技術領域之人士可適當選擇，但較佳長度為12個胺基酸以上(上限雖不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。於sc(Fv)2包含3個肽連接子之情形，可以都使用相同長度之肽連接子，也可具有相異長度之肽連接子。
例如，為肽連接子之情形，例如：Ser
Gly‧Ser
Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser)n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly)n
〔n為1以上整數〕等。但是，該技術領域之人士可視目的對肽連接子長度或序列適當選擇。
較佳sc(Fv)2之態樣例如有以下之sc(Fv)2。
〔VH〕連接子(15個胺基酸)〔VL〕連接子(15個胺基酸)〔VH〕連接子(15個胺基酸)〔VL〕
合成化學物連接子(化學交聯劑)為肽之交聯之中通常使用的交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST))、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES))、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
將4個抗體可變區域結合時，通常需要3個連接子，可全部使用相同的連接子，也可使用相異之連接子。
又，sc(Fv)2之中，就構造構造異構物而言，例如存在單鏈雙功能抗體(diabody)型及二價(bivalent)scFv型。
sc(Fv)2以[可變區域1](連接子1)[可變區域2](連 接子2)[可變區域3](連接子3)[可變區域4]之順序排列時，本發明之中二價(bivalent)scFv型係指：具有可變區域1與可變區域2組裝且可變區域3與可變區域4組裝之狀態的構造之sc(Fv)2。本發明之中，單鏈雙功能抗體(diabody)係指：具有可變區域1與可變區域4組裝，且可變區域2與可變區域3組裝之狀態之構造的sc(Fv)2。
單鏈雙功能抗體(diabody)例如具有圖12(b)右之構造之sc(Fv)2，二價(bivalent)scFv型例如具有圖12(b)左之構造之sc(Fv)2。
sc(Fv)2究竟為單鏈雙功能抗體(diabody)型或二價(bivalent)scFv型哪一種構造可利用例如蛋白酶限定分解法來解析。如舉一例，可利用如以下之方法來解析。
將sc(Fv)2之連接子部分使用可部分且限定分解之一種枯草桿菌蛋白酶subtilisin A，進行受檢sc(Fv)2之限定分解。
為單鏈雙功能抗體(diabody)型之情形，由於VH與VL之間之交互作用，sc(Fv)2所具有之3個連接子之中，即使有哪一連接子切斷，分子量也觀察不到變化。
另一方面，為二價(bivalent)scFv型之情形，如果中央之連接子切斷，會生成一半分子量之分子種類。
因此，藉由解析反應產物，可區別二價(bivalent)scFv型與單鏈雙功能抗體(diabody)型。
反應產物可藉由例如凝膠過濾層析分析來解析。又，也可使用層析並依據峰部面積，對sc(Fv)2所包含二價 (bivalent)sc(Fv)2構造與單鏈雙功能抗體(diabody)構造之存在比例加以定量評價。
本發明之組裝控制方法於關於上述sc(Fv)2，欲優先地取得所望之型、亦即，雙功能抗體(diabody)型與二價(bivalent)scFv型之中某一者時，為較佳可利用的。
更具體而言，當sc(Fv)2具有VH1-(連接子)-VL1-(連接子)-VH2-(連接子)-VL2之構造時，使用本發明之組裝控制方法，欲優先地取得二價(bivalent)scFv型之sc(Fv)2之情形，例如只要抑制VH1與VL2，及/或VH2與VL1之組裝即可。(舉一例來說，在VH1與VL2之形成界面導入變異，使胺基酸殘基成為帶同種電荷。)
又，欲優先地取得單鏈雙功能抗體(diabody)型之sc(Fv)2時，只要抑制例如、VH1與VL1，及/或VH2與VL2之組裝即可。(舉一例來說，在VH1與VL1之形成界面導入變異，使胺基酸殘基成為帶同種電荷。)
又，sc(Fv)2為單專一性抗體(monospecific antibody)之情形亦可以同樣方式實施本發明。
又，除了該等技術以外，尚可將VH與VL之各功能區以雙硫鍵加以交聯(Clin Cancer Res.1996 Feb；2(2)：245-52)。
藉由利用本發明之組裝控制方法，例如可有效率地製作具活性之抗體或多肽。就該活性而言，例如有結合活性、中和活性、細胞傷害活性、協同活性、拮抗活性、酵素活性等。協同活性係指藉由使抗體結合於受體等抗原，在細胞內進行信號傳遞達等，而誘導某些生理活性變化之活性。生理活 性例如：增殖活性、生存活性、分化活性、複製活性、膜輸送活性、結合活性、蛋白質分解活性、磷酸化/去磷酸化活性、氧化還原活性、轉移活性、核酸分解活性、脫水活性、細胞死亡誘導活性、細胞凋零(apotosis)誘導活性等，但不限於該等。
又，利用本發明方法，可有效率地製作認識所望抗原，或與所望受體結合之抗體或多肽。
該抗原不特別限定，可為任意抗原。抗原之例例如有受體或其片段、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等，不特別限於該等。
又，就該受體之例而言，例如屬於以下受體家族之受體：造血因子受體家族、細胞素受體家族、酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、G蛋白質共軛型受體家族、GPI固著子(anchor)型受體家族、酪胺酸磷解酶型受體家族、黏著因子家族、荷爾蒙受體家族等。屬於該等受體家族之受體及關於其特徴存在有多數文獻，例如：Cooke BA.,King RJB.,van der Molen HJ.ed.New Comprehesive Biochemistry Vol.18B"Hormones and their Actions Part II"pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV.,New York,USA、Patthy L.(1990)Cell,61：13-14.、Ullrich A.,et al.(1990)Cell,61：203-212.、Massagul J.(1992)Cell,69：1067-1070.、Miyajima A.,et al.(1992)Annu.Rev.Immunol.,10：295-331.、Taga T.and Kishimoto T.(1992)FASEB J.,7：3387-3396.、Fantl WI.,et al.(1993)Annu.Rev.Biochem.,62：453-481.、Smith CA.,et al.(1994)Cell,76：959-962.、Flower DR.(1999)Biochim.Biophys.Acta,1422：207-234.、宮坂昌之審訂，細胞工程別冊手冊系列「黏著因子手冊」(1994)(秀潤社、東京、日本)等。就屬於上述受體家族之具體受體而言，例如：人類或小鼠紅血球生成素(EPO)受體、人類或小鼠顆粒球群落(colony)刺激因子(G-CSF)受體、人類或小鼠血小板生成素(TPO)受體、人類或小鼠胰島素受體、人類或小鼠Flt-3配體受體、人類或小鼠血小板由來增殖因子(PDGF)受體、人類或小鼠干擾素(IFN)-α、β受體、人類或小鼠瘦體素(leptin)受體、人類或小鼠成長荷爾蒙(GH)受體、人類或小鼠介白素(IL)-10受體、人類或小鼠類胰島素增殖因子(IGF)-I受體、人類或小鼠白血病抑制因子(LIF)受體、人類或小鼠毛狀體神經營養因子(CNTF)受體等(hEPOR：Simon,S.et al.(1990)Blood 76,31-35.；mEPOR：D'Andrea,AD.Et al.(1989)Cell 57,277-285.；hG-CSFR：Fukunaga,R.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,8702-8706.；mG-CSFR：Fukunaga,R.et al.(1990)Cell 61,341-350.；hTPOR：Vigon,I.et al.(1992)89,5640-5644.；mTPOR：Skoda,RC.Et al.(1993)12,2645-2653.；hInsR：Ullrich,A.et al.(1985)Nature 313,756-761.；hFlt-3：Small,D.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91,459-463.；hPDGFR：Gronwald,RGK.Et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,3435-3439.；hIFNα/βR：Uze,G.et al.(1990)Cell 60,225-234.及Novick,D.et al.(1994)Cell 77,391-400.)。
癌抗原為伴隨細胞惡質化而表現之抗原，也成為腫瘤專一性抗原。又，細胞癌化時在細胞表面或蛋白質分子上 出現的異常糖鏈也會成為癌抗原，特別稱為癌糖鏈抗原。癌抗原之例，例如：CA19-9、CA15-3、Serail SSEA-1(SLX)等。
MHC抗原大致區分為MHC第I類抗原及MHC第II類抗原，MHC第I類抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC第II類抗原包含HLA-DR、-DQ、-DP。
分化抗原包含CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43,CD44、CD45,CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130等。
又，本發明提供以本發明方法使組裝受控制之多肽變異體或異種多聚體。亦即本發明係關於以本發明之組裝控制方法取得之多肽或異種多聚體。
本發明之較佳態樣為提供一種多肽變異體，該多肽內形成界面之胺基酸殘基有改變，以抑制原來多肽內之組裝。
又，本發明另一態樣之中提供一種異種多聚體，該多肽間形成界面之胺基酸殘基有改變，以抑制原來多肽間之組裝。
本發明之中「原來之多肽」係指利用本發明方法 以組裝受控制之方式改變前之狀態的多肽。
本發明之上述多肽變異體之一例，例如：原多肽可形成2種構造構造異構物之變異體。又，上述異種多聚體之一例，例如：原多肽可形成2種以上多聚體之多聚體。
又，利用本發明之上述組裝控制方法而使組裝受控制之多肽變異體或異種多聚體也包含於本發明。亦即，上述組裝控制方法之較佳態樣之中，組裝受到控制之多肽或異種多聚體也是本發明較佳態樣之一。
又，本發明提供一種多肽或多種多聚體之組裝受到控制之多肽或多種多聚體之製造方法。
本發明製造方法之較佳態樣，提供一種多肽變異體之製造方法，係以多肽組裝受控制之方式使多肽內形成界面之胺基酸殘基具有變異之多肽製造方法，包含下列步驟：(a)將編碼為多肽內形成界面之胺基酸殘基的核酸自原核酸改變，使多肽內組裝受到抑制，並(b)培養寄主細胞使表現該核酸，及(c)自寄主細胞培養物將該多肽回收。
又，本發明製造方法之另一態樣，提供一種異種多聚體之製造方法，係以異種多聚體之組裝受控制之方式使多肽間形成界面之胺基酸殘基具有變異之異種多聚體之製造方法，包含下列步驟：(a)將編碼為多肽間形成界面之胺基酸殘基的核酸自原核酸改變，使多肽間之組裝受到抑制，並(b)培養寄主細胞使表現該核酸，及(c)自寄主細胞培養物將該異種多聚體回收。
又，利用本發明之上述組裝控制方法，以多肽組 裝受到抑制之方式，使編碼為多肽內(間)形成界面之胺基酸殘基之核酸自原核酸改變之步驟的方法也是本發明上述製造方法之較佳態樣之一。
本發明上述方法之中「改變核酸」係指以對應於本發明之中「改變」而導入之胺基酸殘基之方式改變核酸。更具體而言，係指：就編碼為原來(改變前)之胺基酸殘基的核酸，改變成編碼為以改變而導入之胺基酸殘基之核酸。通常意指：對原來之核酸進行如至少使1個鹼基插入、缺失或取代之基因操作或變異處理而使成為編碼為目的胺基酸殘基之密碼子。亦即，將編碼為原胺基酸殘基之密碼子取代為編碼為因改變而導入之胺基酸殘基的密碼子。如該核酸之改變，該技術領域之人士之中可使用公知技術，例如部位專一性變異誘發法、PCR變異導入法等而適當實施。
又，本發明之中核酸通常被載持(插入)於適當載體並導入寄主細胞。該載體只要可安定地保持插入之核酸即不特別限定，例如寄主使用大腸菌則選殖用載體較佳為pBluescript載體(Stratagene社製)等，可利用市售之各種載體。為了生產本發明之多肽而使用載體之情形，尤以表現載體為有用的。表現載體只要是在試驗管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內表現多肽之載體即不特別限制，例如如於試驗管內表現，較佳為pBEST載體(Promega社製)、於大腸菌則較佳為pET載體(Invitrogen社製)、於培養細胞則較佳為pME18S-FL3載體(GenBank Accession No.AB009864)、於生物個體則較佳為pME18S載體(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。本發明之 DNA插入載體可依常法，例如利用使用限制酶部位之接合酶反應來進行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
上述寄主細胞不特別限定，可視目的使用各種寄主細胞。用於表現多肽之細胞，例如：細菌細胞(例：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈黴菌、枯草菌)、真菌細胞(例：酵母、麴菌)、昆蟲細胞(例：果蠅S2、斜紋夜蛾(Spodoptera)SF9)、動物細胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色瘤(Melanoma)細胞)及植物細胞。對寄主細胞之載體導入，例如可利用磷酸鈣沉澱法、電脈衝穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、脂質體(Lipofectamine)法(GIBCO-BRL社製)、微注射法等公知之方法進行。
為了使寄主細胞之中表現之多肽分泌至微胞體之內腔、細胞周邊腔或細胞外之環境，可將適當之分泌信號嵌入目的多肽。該等信號對於目的多肽可為內因性也可為異種信號。
上述製造方法之中，多肽之回收當本發明之多肽分泌至培養基之情形，將培養基回收。當本發明之多肽產生於細胞內時，先將該細胞溶解之後將多肽回收。
自重組細胞培養物將本發明之多肽回收並精製時，可利用包含硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和層析、 羥基磷灰石層析及凝集素(lectin)層析之公知方法。
又，本發明係關於一種組成物(藥劑)，包含本發明之多肽變異體或本發明之異種多聚體及醫藥上可容許之擔體。
本發明之中，醫藥組成物係指通常用用於疾患之治療或預防或者檢查‧診斷之藥劑。
本發明之醫藥組成物，該技術領域之人士可用公知之方法加以製劑化。例如，可以如下形式非經口的使用：水或其他藥學的可容許之液體形成之無菌性溶液或懸浮液劑之注射劑。例如可與藥理學上可容許的擔體或媒體，具體而言、滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載體、防腐劑、結合劑等適當組合，並以一般認可之製藥習慣要求之單位用量形態加以混合而製劑化。該等製劑之中，有效成分量係設定為可得到指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組成物可使用如注射用蒸餾水之載體，依照通常製劑習慣加以處方。
注射用之水溶液，例如：生理食鹽水、葡萄糖或包含此外之輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。也可併用適當之溶解輔助劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液例如可併用蔴油、大豆油，溶解輔助劑例如苯甲基苯甲酸酯及/或苄醇。又，也可配合緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、無痛化劑(例如、鹽酸普卡因 (procain))、安定劑(例如、苄醇及苯酚)、抗氧化劑。調製之注射液通常充填於適當的注射液瓶。
本發明之醫藥組成物較佳為非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。例如可以靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等進行全身或局部的投予。
投予方法可依照患者之年齡、症狀來適當選擇。含有抗體或編碼為抗體之聚核苷酸之醫藥組成物投予量，可設定為例如每次體重1kg為0.0001mg至1000mg之範圍。或例如每位患者0.001~100000mg之投予量，但本發明不一定限於該等數值。投予量及投予方法由於患者之體重、年齡、症狀等而變動，但只要是該技術領域之人士可考慮該等條件並設應適當之投予量及投予方法。
又，視需要，本發明之多肽或異種多聚體可與其他之醫藥成分組合而製劑化。
又，本發明提供編碼為本發明之多肽變異體或本發明之異種多聚體的核酸。再者，載持該核酸之載體也包含於本發明。
再者，本發明提供具有上述核酸之寄主細胞。該寄主細胞不特別限定，例如：大腸菌或各種動物細胞等。寄主細胞可作為例如本發明之抗體或多肽製造或表現之生產系使用。用以多肽製造之生產系有體外(in vitro)及體內(in vivo)生產系。體外生產系例如有使用真核細胞之生產系及使用原核細胞之生產系。
可作為寄主細胞使用之真核細胞，例如：動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞，哺乳類細胞例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108：945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等；兩生類細胞例如：非洲爪蟾蜍卵母細胞(Valle et al.,Nature(1981)291：338-340)；及昆蟲細胞例如：Sf9、Sf21、Tn5。本發明抗體之表現較佳為使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、BHK細胞。動物細胞之中，以大量表現為目的時，尤佳為CHO細胞。對寄主細胞導入載體，例如可以如下方法進行：磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽離子性微脂體(liposome)DOTAP(Boehringer Mannheim製)之方法、電穿孔法、脂染(lipofection)等方法進行。
植物細胞已知有例如以菸草(Nicotiana tabacum)由來之細胞作為蛋白質生產系，可將該細胞利用癒合組織培養方法來產生本發明之抗體。就真菌細胞而言，使用酵母，例如：糖化酵母(Saccharomyces)屬之細胞((Saccharomyces cerevisiae)、(Saccharomyces pombe)等)、及黴菌，例如麴菌(Aspergillus)屬之細胞((Aspergillus niger)等)之蛋白質表現系為公知，可利用為本發明之抗體產生之寄主。
使用原核細胞之情形，有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞除了上述大腸菌(E.coli)以外，已知有使用枯草菌之生產系，可利用於本發明之抗體產生。
使用本發明之寄主細胞來產生抗體之情形，只要將以包含編碼為本發明抗體之聚核苷酸的表現載體進行形質轉換之寄主細胞加以培養，並使表現聚核苷酸即可。培養可依 照公知方法進行。例如，以動物細胞為寄主之情形、培養液可使用，例如：DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時，可併用FBS、胎牛血清(FCS)等血清補液，也可以無血清培養進行細胞培養。培養時之pH較佳為約6~8。培養通常於約30~40℃進行約15~200小時，視需要加入培養基之交換、通氣、攪拌。
另一方面，於體內(in vivo)生產多肽之系，例如：使用動物之生產系或使用植物之生產系。於該等動物或植物之中導入目的聚核苷酸，並於動物或植物之體內使多肽產生並回收。本發明之中「寄主」包含該等動物、植物。
使用動物之情形，有使用哺乳類動物、昆蟲之生產系。哺乳類動物可使用山羊、豬、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。又，使用哺乳類動物之情形，可使用基因轉殖動物。
例如，將編碼為本發明抗體之聚核苷酸與編碼為如山羊β酪蛋白之乳汁中固有產生之多肽的基因調製成融合基因。接著，將包含該融合基因之聚核苷酸片段注入山羊之胚胎，將該胚胎移殖到雌山羊。自收容胚之山羊生下的基因轉殖山羊或其子代產生之乳汁，可得到目的抗體。為了使基因轉殖山羊產生之包含抗體之乳汁量增加，也可對基因轉殖山羊投予適當的荷爾蒙(Ebert et al.,Bio/Technology(1994)12：699-702)。
又，產生本發明抗體之昆蟲，例如可使用蠶。使用蠶之情形，藉由將插入有編碼為目的抗體之聚核苷酸的桿狀病毒感染蠶，可自蠶之體液得到目的抗體(Susumu et al.,Nature (1985)315：592-4)。
再者，以植物用於本發明抗體產生之情形，可使用例如菸草。使用菸草之情形，將編碼為目的抗體之聚核苷酸插入於植物表現用載體，例如pMON 530，並將該載體導入於農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之細菌。使該細菌感染菸草，例如Nicotiana tabacum，可自該菸葉得到所望之抗體(Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24：131-8)。
以該方式所得到之抗體可自寄主細胞內或細胞外(培養基、乳汁等)單離，而精製成實質為純且均勻之抗體。抗體之分離、精製使用通常多肽精製使用之分離、精製方法即可，無任何限定。例如可適當選擇層析管柱、過濾膜、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等並組合而將抗體分離、精製。
層析例如有：親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。該等層析可利用液相層析，例如HPLC、FPLC等液相層析來進行。親和層析使用之管柱例如有：PROTEIN A管柱、PROTEIN G管柱。例如、使用PROTEIN A之管柱有Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia製)等。
視需要，可藉由於抗體精製前或精製後使適當之蛋白質修飾酵素作用，任意地加以修飾或除去部分的肽。蛋白 質修飾酵素可使用例如：胰蛋白酶、凝乳蛋白酶(Chymotrpsin)、離胺酸末端肽酶、蛋白質激酶、葡萄糖氧化酶等。
如上述，包含：培養本發明之寄主細胞，並自該細胞培養物回收多肽之步驟之本發明之多肽變異體或異種多聚體製造方法，亦為本發明較佳態樣之一。
【實施例】
以下，以實施例對本發明更具體的說明，但本發明不受限於該等實施例。
[實施例1]對抗Factor IXa(F.IXa)之非中和抗體製作
1-1.免疫及融合瘤製作
將BALB/c小鼠(雄、免疫開始時6週齡、日本Charles‧River)8頭及MRL/lpr小鼠(雄、免疫開始時6週齡、日本Charles‧River)5頭依如下方式以Factor IXaβ(Enzyme Research Laboratories,Inc.)免疫。初次免疫將以FCA(佛洛依德完全佐劑H37 Ra(Difco laboratories))乳膠化之Factor IXaβ進行40μg/head皮下投予。2週間後，將以FIA(佛洛依德不完全佐劑(Difco laboratories))乳膠化之Factor IXaβ進行40μg/head皮下投予。之後，以1週間隔進行追加免疫3~7次。對於Factor IXaβ之血清抗體價上升，以1-2所示ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)確認後，最終免疫以PBS(-)(不含鈣離子、鎂離子之磷酸緩衝液)稀釋Factor IXaβ以40μg/head進行靜脈內投予。最終免疫3日後，將小鼠脾臓細胞與小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U.1(稱為P3U1，ATCC CRL-1597)以使用 PEG1500(Roche Diagnostics)之常法進行細胞融合。將懸浮於包含10% FBS(Invitrogen)之RPMI1640培養基(Invitrogen)(以下稱為10%FBS/RPMI1640)之融合細胞接種於96井培養盤，並融合1、2、3、5日後，藉由取代為HAT選擇培養基(10%FBS/RPMI1640/2%HAT 50x concentrate(大日本製藥)/5% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))，進行融合瘤之選擇培養。使用融合後第8日或第9日採取之培養上清，以1-2所示ELISA測定對Factor IXa之結合活性，藉以選擇具有Factor IXa結合活性之融合瘤。接著，以5-3所示之方法測定對於Factor IXa酵素活性之中和活性，選擇不具有對Factor IXa之中和活性之融合瘤。融合瘤係在96井培養盤之中1個井接種1個細胞，進行2次極限稀釋而克隆化，樹立成產生抗Factor IXa抗體之融合瘤XB12。
1-2.Factor IXa ELISA
將以被覆緩衝液(100mM碳酸氫鈉，pH 9.6,0.02%疊氮化鈉)稀釋為1μg/mL之Factor IXaβ，以100μL/well分注於Nunc-免疫盤(Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))，於4℃溫育一晚。以包含Tween(R) 20之PBS(-)清洗3次後，以稀釋緩衝液(50mM Tris-HCl,pH8.1,1%牛血漿白蛋白(bovine serum albumin),1mM MgCl2,0.15M NaCl,0.05% Tween(R) 20,0.02%疊氮化鈉)，使盤於室溫靜置2小時以進行封阻(blocking)。除去緩衝液後，於盤中將添加100μL/well以稀釋緩衝液稀釋之小鼠抗血清或融合瘤之培養上清，於室溫溫育1小時。將盤子進行3次清洗後，添加 以稀釋緩衝液稀釋為1/2000之鹼性磷解酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(Zymed Laboratories)100μL/well，於室溫溫育1小時。將盤子清洗6次後，添加呈色基質Blue-PhosTM磷酸基質(Kirkegaad & Perry Laboratories)100μL/well，於室溫溫育20分鐘。添加Blue-PhosTM Stop Solution(Kirkegaad & Perry Laboratories)100μL/well後，以微平盤讀取儀(Microplate Reader)Model 3550(Bio-Rad Laboratories)測定595nm之吸光度。
1-3.Factor IXa中和活性測定
將磷脂質(Sigma-Aldrich)以注射用蒸餾水溶解，施以超音波處理，以調製400μg/mL之磷脂質溶液。將包含0.1%牛血清白蛋白之Tris緩衝生理食鹽液(以下稱TBSB)40μL與30ng/mL Factor IXaβ(Enzyme Research Laboratories)10μL及400μg/mL磷脂質溶液5μL及包含100mM CaCl2、20mM MgCl2之TBSB 5μL與融合瘤培養上清10μL在96井盤中混合，並於室溫溫育1小時。於該混合溶液添加50μg/mL Factor X(Enzyme Research Laboratories)20μL及3U/mL Factor VIIIa(Amrican diagnostica)10μL，於室溫反應30分鐘。藉由在該等之中添加10μL之0.5M EDTA使反應停止。於該反應溶液之中添加50μL之S-2222溶液(Chromogenix)，於室溫溫育30分鐘後，以微平盤讀取儀(Microplate Reader)Model 3550(Bio-Rad Laboratories,Inc.)測定在測定波長405nm、對照波長655nm之吸光度。
[實施例2]對抗Factor X(F.X)之非中和抗體之製作
2-1.免疫及融合瘤製作
將BALB/c小鼠(雄、免疫開始時6週齡、日本Charles‧ River)8頭及MRL/lpr小鼠(雄、免疫開始時6週齡、日本Charles‧River)5頭以Factor X(Enzyme Research Laboratories)依如下方式免疫。初次免疫以皮下投予以FCA乳膠化之Factor X40μg/head。2週後皮下投予以FIA乳膠化之Factor X 20或40μg/head。以後，每隔1週間隔進行追加免疫，合計進行3~6次。以2-2所示ELISA確認對抗Factor X之血清抗體價上升後，最終免疫以靜脈內投予稀釋於PBS(-)之Factor X 20或40μg/head。最終免疫3日後，將小鼠脾臓細胞與小鼠骨髓瘤細胞P3U1依照使用PEG1500之常法進行細胞融合。將懸浮於10%FBS/RPMI1640培養基之融合細胞接種於96井培養平盤，並藉由融合1、2、3、5日後取代為HAT選擇培養基，進行融合瘤之選擇培養。使用融合後第8日採取之培養上清，依照2-2所示ELISA，測定對於Factor X之結合活性。選擇具有Factor X結合活性之融合瘤，以2-3所示方法測定對Factor Xa之酵素活性的中和活性。將對於Factor Xa不具中和活性之融合瘤利用極限稀釋2次加以選殖，建立產生抗Factor X抗體之融合瘤SB04。
2-2.Factor X ELISA
將以被覆緩衝液稀釋成1μg/mL之Factor X以100μL/well分注於Nunc-免疫盤後，於4℃溫育一晚。以含Tween(R) 20之PBS(-)清洗3次後，以稀釋緩衝液將平盤於室溫進行2小時封阻(blocking)。除去緩衝液後，於盤中添加以稀釋緩衝液稀釋之小鼠抗血清或融合瘤之培養上清，於室溫溫育1小時。將盤清洗3次後，添加以稀釋緩衝液稀釋成1/2000之鹼性磷解酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)，於室溫溫育1小時。將盤清洗6 次後，添加呈色基質Blue-PhosTM磷酸基質(Kirkegaad & Perry Laboratories)100μL/well，於室溫溫育20分鐘。添加Blue-PhosTM停止溶液(Kirkegaad & Perry Laboratories)100μL/well後，以微平盤讀取儀(Microplate Reader)Model 3550(Bio-Rad Laboratories)測定595nm之吸光度。
2-3.Factor Xa中和活性測定
將包含以TBSB稀釋成1/5之融合瘤培養上清10μL與40μL之250pg/mL Factor Xa(Enzyme Research Laboratories)之TBCP(2.78mM CaCl2、22.2μM磷脂質(磷脂醯膽鹼：磷脂醯絲胺酸=75：25、Sigma-Aldrich)之TBSB混合，並於室溫溫育1小時。於混合溶液之中添加包含20μg/mL凝血原(Prothrombin)(Enzyme Research Laboratories)及100ng/mL活性化凝固第V因子(Factor Va(Haematologic Technologies))之TBCP 50μL，並於室溫反應10分鐘。添加0.5M EDTA10μL以使反應停止。於該反應溶液之中添加1mM S-2238溶液(Chromogenix)50μL，於室溫溫育30分鐘後，以微平盤讀取儀(Microplate Reader)Model 3550(Bio-Rad Laboratories)測定405nm之吸光度。
[實施例3]嵌合雙專一性抗體表現載體之構建
3-1. 自融合瘤調製編碼為抗體可變區域之DNA片段
由產生抗F.IXa抗體之融合瘤XB12或者產生抗F.X抗體之融合瘤SB04，使用QIAGEN(R) RNeasy(R) Mini套組(QIAGEN)依照說明書記載之方法萃取總RNA。將總RNA溶解於40μL之滅菌水。以經過精製之RNA1~2μg為模板，使用 SuperScript cDNA合成系統(Invitrogen)依照說明書記載之方法，以RT-PCR法合成單鏈cDNA。
3-2. 抗體H鏈可變區域以PCR之放大及序列解析
就小鼠抗體H鏈可變區域(VH)cDNA之放大用引子而言，準備Krebber等報告(J.Immunol.Methods 1997；201：35-55)之HB引子混合物及HF引子混合物。使用各0.5μL之100μM HB引子混合物及100μM HF引子混合物，調製反應液25μL(3-1之中調製之cDNA溶液2.5μl、KOD plus緩衝液(東洋紡織)、0.2mM dNTPs,1.5mM MgCl2,0.75單位DNA聚合酶KOD plus(東洋紡織))。PCR使用熱循環器GeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)，對應於cDNA片段放大之效率性，以條件A(98℃加熱3分鐘後，以98℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行32回合)或條件B(94℃加熱3分鐘後，以94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行5回合，再者以94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行30回合)任一條件進行。PCR後，反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl溶出。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator循環定序套組(Applied Biosystems)，以DNA定序儀ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)，依照所附說明書記載之方法來決定。本方法所決定之序列群以解析軟體GENETYX-SV/RC Version 6.1(Genetyx)進行比較解析，並選擇具有相異序列者。
3-3.選殖用抗體可變區域DNA片段之調製
為了將選殖用限制酶Sfi I切斷部位附加於抗體可變區域放大片段之兩末端，進行以下操作。
為了將Sfi I切斷部位加成VH片段(Sfi I-VH)放大，準備引子HB之(Gly4Ser)2-連接子序列改變為具有Sfi I切斷部位之所示序列者(引子VH-5’末端)。使用各0.5μl之10μM序列專一性引子VH-5’末端及10μM引子scfor(J.Immunol.Methods 1997；201：35-55)，調製反應液20μL(3-2調製之精製VH cDNA放大片段溶液1μl,KOD plus緩衝液(東洋紡織)、0.2mM dNTPs,1.5mM MgCl2,0.5單位DNA聚合酶KOD plus(東洋紡織))。PCR使用熱循環器GeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)，依照片段放大之效率性，以條件A(98℃加熱3分鐘後，以98℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行32回合)或條件B(94℃加熱3分鐘後，以94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行5回合，再者以94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行30回合)任一條件進行。PCR後，將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)依照所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μL溶出。
為了將小鼠抗體L鏈可變區域(VL)cDNA片段放大，首先準備Krebber等人之報告(J.Immunol.Methods 1997；201：35-55)記載之各0.5μL100μM LB引子混合物及100μM LF引子混合物，以調製反應液25μL(3-1所調製c-DNA溶液2.5μL, KOD plus緩衝液(東洋紡織)、0.2mM dNTPs,1.5mM MgCl2,0.75單位DNA聚合酶KOD plus(東洋紡織))。PCR使用熱循環器GeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)，依照片段放大之效率性，以如下條件進行：94℃加熱3分鐘後，以94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行5回合，再以94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行30回合。PCR後，反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段以QIAqucick Gel Extractio套組(QIAGEN)依照所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μL溶出。該片段為在C末端上加成有引子LF由來之(Gly4Ser)3-連接子序列之狀態。為於該片段之C末端加成Sfi I切斷部位，準備將引子LF之(Gly4Ser)3-連接子序列改變為具有Sfi I切斷部位所示序列者(引子VL-3’末端)。為了將Sfi I切斷部位加成VL片段(Sfi I-VL)放大，使用各0.5μL之10μM VL-3’末端引子混合物及10μM scback引子，調製反應液20μL(精製VL cDNA放大片段溶液1μL,KOD plus緩衝液(東洋紡織)、0.2mM dNTPs,1.5mM MgCl2,0.5單元DNA聚合酶KOD plus(東洋紡織))。PCR使用熱循環器GeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)，以如下條件進行：94℃加熱3分鐘後，以94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行5回合，再以94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒構成之反應作為1回合，進行30回合。。PCR後，反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明 書記載之方法精製，並以滅菌水30μL溶出。
精製Sfi I-VH及Sfi I-VL片段以Sfi I(Takarabio)依所附說明書記載之方法調製反應液，於50℃進行一晚消化。之後，將反應液使用QIAquick PCR Purification套組(QIAGEN)依所附說明書記載之方法精製，並以該套組所附之緩衝液EB 30μL溶出。
3-4.人類IgG4-小鼠嵌合雙專一性IgG抗體表現用質體
產生目的雙專一性IgG抗體時，為了形成各H鏈之異分子，參考IgG1之突起進入空隙(knobs-into-holes)技術(非專利文獻3)，製作對IgG4之CH3部分之胺基酸取代體。a型(IgG4γa)為Y349C、T366W取代體，b型(IgG4γb)為E356C、T366S、L368A、Y407V之取代體。再者，在兩取代體之鉸鏈區域亦導入取代(-ppcpScp-->-ppcpPcp-)。依照本技術，雖大部分得到異質體，但是L鏈不限於此，不必要抗體分子之生成可能會影響之後活性測定。因此，本方法為了使分別表現具有各專一性之抗體分子單臂(稱為HL分子)之細胞內，有效率地製作目的型雙專一性IgG抗體，就對應於各HL分子之表現載體而言，係使用以相異藥劑所誘導者。
就抗體分子單臂(簡便上稱為右臂HL分子)之表現用，製作在四環黴素誘導型載體pcDNA4(Invitrogen)上嵌入有H鏈至L鏈各區域，也就是說在動物細胞用信號序列(IL3ss)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1984；81：1075)之下游嵌入有適當之小鼠抗體可變區域(VH至VL)及人類IgG4γa不變區 域(序列編號：9)至κ不變區域(序列編號：10)者(pcDNA4-g4H至pcDNA4-g4L)。首先，將pcDNA4以存在於其多重選殖部位之限制酶切斷部位Eco RV及Not I(Takarabio)消化。將具有適當抗體可變區域之嵌合雙專一性抗體右臂H鏈至L鏈表現單元(各約1.6kb至約1.0kb)以Xho I(Takarabio)消化之後，以QIAquick PCR Purification套組(QIAGEN)依所附說明書記載之方法精製，並使用DNA聚合酶KOD(東洋紡織)依所附說明書記載之反應液組成使於72℃反應10分鐘，使末端平滑化。將該平滑化末端片段以QIAquick PCR Purification套組(QIAGEN)依所附說明書記載之方法精製，並以Not I(Takarabio)消化。該Not I-鈍端片段(各約1.6kb至1.0kb)及以該Eco RV-Not I消化之pcDNA4使用Ligation High(東洋紡織)依所附說明書記載之方法進行連結反應。以該反應液將大腸菌DH5α株(Competent high DH5α(東洋紡織))形質轉換。所得到之安皮西林耐性選殖體使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)而單離各質體DNA。
就另一單臂(簡便上稱為左臂HL分子)，依前述方法製作在蛻皮激素類似體誘導型載體pIND(Invitrogen)中嵌入H鏈至L鏈各該區域，也就是說在動物細胞用信號序列(IL3ss)(EMBO.J.1987；6：2939)之下游嵌入有適當之小鼠抗體可變區域(VH至VL)及人類IgG4γb不變區域(序列編號：11)至κ不變區域者(pIND-g4H至pIND-g4L)，並單離各質體DNA。
3-5.雙專一性抗體表現載體構建
將3-4調製之四環黴素誘導型表現質體(pcDNA4-g4H至 pcDNA4-g4L)以Sfi I消化，並將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將除去原有抗體可變區域部分(VH至VL)之片段(約5kb)以QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)依照所附說明書記載方法精製，並以滅菌水30μL溶出。將該片段與各自對應之於3-3調製之Sfi I消化抗F.IXa抗體XB12由來Sfi I-VH至Sfi I-VL片段以Quick Ligation套組(New England Biolabs)依所附說明書記載之方法進行連結反應。以該反應液對大腸菌DH5α株(Competent high DH5α(東洋紡織))形質轉換。又，自3-4調製之Sfi I消化蛻皮激素類似體誘導型表現質體(pIND-g4H至pIND-g4L)，以與上述同樣手法將除去抗體可變區域部分(VH至VL)之片段及各對應之3-3所調製之Sfi I消化抗F.X抗體SB04由來Sfi I-VH至Sfi I-VL片段以同樣手法嵌入。
各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator循環定序套組(Applied Biosystems)，以DNA定序儀ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)依所附說明書記載之方法決定。本方法所決定之序列群以解析軟體GENETYX-SV/RC Version 6.1(Genetyx)解析。
由該目的選殖體，使用QIAprep Spin Miniprep套組(QIAGEN)將各質體DNA單離，並溶解於100μL滅菌水。抗F.IXa抗體嵌合H鏈表現載體、抗F.IXa抗體嵌合L鏈表現載體、抗F.X抗體嵌合H鏈表現載體及抗F.X抗體嵌合L鏈表現載體各命名為pcDNA4-g4 XB12H、pcDNA4-g4 XB12L、pIND-g4 SB04H及pIND-g4 SB04L。
[實施例4]嵌合雙專一性抗體之製作
4-1. DNA溶液之調製
抗體右臂HL分子表現用載體(pcDNA4-g4 XB12H及pcDNA4-g4 XB12L)以四環黴素進行表現誘導。為了於不存在四環黴素之狀況下完全地抑制表現，要求編碼為Tet抑制子之質體pcDNA6/TR(Invitrogen)。又，抗體左臂HL分子表現用載體(pIND-g4 SB04H及pIND-g4 SB04L)以昆蟲荷爾蒙蛻皮激素類似體(ponasterone A)進行表現誘導。此時，要求編碼為與ponasterone A反應並進行誘導之蛻皮激素受體及視黃醇X受體之質體pVgRXR(Invitrogen)。因此，調製用以對動物細胞轉染之共計6種質體DNA混合液。為調製細胞培養液10mL，使用pcDNA4-g4 XB12H、pcDNA4-g4 XB12L、pIND-g4 SB04H及pIND-g4 SB04L各3μg、pcDNA6/TR及pVgRXR各18μg。
4-2. 動物細胞之轉染
將人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%FCS(MOREGATE)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5×105個/mL之細胞密度接種於黏著細胞用培養皿(直徑10cm,CORNING)各皿10mL，放置於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養一晝夜。將4-1調製之質體DNA混合液加入轉染試藥、Lipofectamine 2000(Invitrogen)75.8μL與Opti-MEM I培養基(Invitrogen)2708μL之混合液，於室溫靜置20分鐘後投入各井之細胞，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)培養4~5小時。
4-3. 雙專一性IgG抗體之表現誘導
將自前項方式經過轉染之細胞培養液中吸走培養基，投入含1μg/mL四環黴素(和光純藥工業)之10mL CHO-S-SFM-II (Invitrogen)培養基，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養1日，進行抗體右臂HL分子之第一次表現誘導。之後，將培養基吸引除去，再以10mL CHO-S-SFM-II培養基清洗後，投入含5μM之ponasterone A(Invitrogen)之10mL CHO-S-SFM-II培養基，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養3日，進行抗體左臂HL分子之第二次表現誘導，使雙專一性IgG抗體分泌至培養基中。將培養上清回收後，以離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)將細胞除去，再通過0.22μm濾膜MILLEX(R)-GV(Millipore)滅菌。該樣本於4℃保存至使用為止。
4-4.抗體精製
於實施例4-3之方法所得到之10mL之培養上清中添加100μL rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，於4℃進行4小時以上倒轉混合。將該溶液移到0.22μm之過濾杯Ultrafree(R)-MC(Millipore)，以含0.01% Tween(R) 20之TBS 500μL做3次清洗後，將rProtein A SepharoseTM樹脂懸浮於含100μL 0.01% Tween(R) 20之10mM HCl,pH2.0，並靜置2分鐘之後，使抗體溶出。立即加入5μL之1M Tris-HCl,pH8.0使中和。
4-5.人類IgG濃度之定量
將山羊抗人類IgG(Biosource International)以被覆緩衝液調製成1μg/mL，並固定化於Nunc-免疫盤(Nunc)。以稀釋緩衝液(D.B.)進行封阻處理後，添加使用D.B.適當稀釋之培養上清樣本。又，用以計算抗體濃度之標準，係同樣地添加自2000ng/mL起以3倍以D.B.系列稀釋11階段之人類IgG4(人類型化 抗TF抗體、參照WO 99/51743)。3次清洗後，使山羊抗人類IgG、鹼性磷解酶(Biosource International)反應。5次清洗後，以Sigma 104(R)磷解酶基質(Sigma-Aldrich)作為基質使呈色，以吸光度讀取儀Model 3550(Bio-Rad Laboratories)，測定參照波長655nm及405nm之吸光度。使用Microplate Manager III(Bio-Rad Laboretories)軟體，由標準校正曲線計算培養上清中之人類IgG濃度。
[實施例5]血漿凝固分析
對明瞭是否為對血友病A血液凝固能力有效之雙專一性抗體，探討該抗體對於使用Factor VIII缺乏血漿之活性化部分血栓形成素時間(APTT)之影響。將各種濃度之抗體溶液50μL、Factor VIII缺乏血漿(Biomerieux)50μL及APTT試藥(Dade Behring)50μL之混合液於37℃加溫3分鐘。凝固反應藉由將20mM CaCl2(Dade Behring)50μL加人該混合液而開始。測定自連接CR-A(Amelung)之KC10A(Amelung)至到達凝固之時間。
使用Factor VIII缺乏血漿之凝固時間定為0%、正常血漿之凝固時間定為100%時製作之校正曲線，自添加雙專一性抗體時之凝固時間計算雙專一性抗體之Factor VIII類似活性(%)。
[實施例6]雙專一性抗體之人類化
就血液凝固時間之縮短效果最高之抗FactorIXa抗體XB12及抗FactorX抗體SB04，以如下方式實施人類化。
6-1.人類抗體之相同性檢索
以被一般公開之Kabat資料庫(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)及IMGT資料庫(http：//imgt.cines.fr/)取得人類抗體胺基酸序列資料，並使用構建之資料庫分成小鼠XB12-H鏈可變區域、小鼠XB12-L鏈可變區域、小鼠SB04-H鏈可變區域、小鼠SB04-L鏈可變區進行相同性檢索。其結果，由於確認與以下所示人類抗體序列具有高相同性，故使用於人類化抗體之框架區域(以下稱FR)。
(1)XB12-H鏈可變區域：KABATID-020619(Kabat資料庫)
(Mariette等，Arthritis Rheum.1993；36：1315-1324)
(2)XB12-L鏈可變區域：EMBL Accession No.X61642(IMGT資料庫)
(Mark等，J Mol Biol.1991；222：581-597.)
(3)SB04-H鏈可變區域：KABATID-025255(Kabat資料庫)
(Demaison等，Immunogetetics 1995；42：342-352)
(4)SB04-L鏈可變區域：EMBL Accession No.AB064111(IMGT資料庫)
(未公開資料)
製作在(1)-(4)之人類抗體FR中移植有各小鼠抗體之互補性抗原決定區域(以下稱CDR)的人類化抗體。
又，使用NCBI所一般公開之相同性檢索網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，檢索與(1)-(4)人類抗體之相同性高之人類抗體分泌信號序列。使用檢索得到以下所示分泌信號序列。
(1)XB12-H鏈可變區域：GenBank Accession No.AF062120
(2)XB12-L鏈可變區域：GenBank Accession No.M74019
(3)SB04-H鏈可變區域：GenBank Accession No.BC019337
(4)SB04-L鏈可變區域：GenBank Accession No.AY204756
6-2.人類化抗體基因表現載體之構建
於編碼為自分泌信號序列至抗體可變區域之胺基酸序列之鹼基序列之中，交互地製作12條3’末端約20base左右黏合之50base左右之合成寡DNA。再者製作：黏合於抗體可變區域基因之5’末端並具有XhoI切斷序列之引子，與黏合於抗體可變區域基因之3’末端且具有SfiI切斷序列之引子。
將調製成2.5μM之合成寡DNA以各1μL混合，加入1x TaKaRa Ex Taq緩衝液、0.4mM dNTPs、0.5單元TaKaRa Ex Taq(皆為寶酒造)，調製反應液48μL。於94℃保溫5分鐘後，將由94℃ 2分鐘、55℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘構成之反應進行2回合，實施各合成寡DNA之組合及伸長反應。其次，添加黏合於抗體基因之5’末端及3’末端之引子(各10μM)1μL，進行由94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘構成之反應35回合，於72℃反應5分鐘，將抗體可變區域基因放大。PCR後，將反應液全量供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl溶出。將該片段使用pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)依所附說明書記載之方法進行選殖。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator循環定序套組(Applied Biosystems)，以DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)依所附說明書記載之方法來定序。
將確認為正確人類化抗體可變區域基因序列之質體以EcoRI及SfiI消化之後，將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之DNA片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，依所附說明書記載之方法精製，以滅菌水30μl溶出。又，將實施例3-3製作之四環黴素誘導型表現質體(pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L)及蛻皮激素類似體誘導型表現質體(pIND-g4H、pIND-g4L)以EcoRI及SfiI消化後，將含抗體不變區域之片段(約5kb)使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，依所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl溶出。將以EcoRI及SfiI消化之人類化XB12抗體基因片段(H鏈可變區域或L鏈可變區域)及以EcoRI及SfiI消化之四環黴素誘導型表現質體(pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L)，以Rapid DNA Ligation套組(Roche Diagnostics)依所附說明書記載之方法進行連結反應。又，將以EcoRI及SfiI消化之人類化SB04抗體基因片段(H鏈可變區域或L鏈可變區域)及以EcoRI及SfiI消化之蛻皮激素類似體誘導型表現質體(pIND-g4H、pIND-g4L)使用Rapid DNA Ligation套組(Roche Diagnostics)依所附說明書記載之方法進行連結反應。使用各反應液之一部分進行大腸菌DH5α株(東洋紡織)之形質轉換。
又，為了以非雙專一性抗體之通常人類化抗體之形式表現，以如下方式製作表現載體。將在雞β肌動蛋白(actin)促進子之pCAGGS(Niwa et al.1991 Gene,108：193-199.)中插入有野生型抗體不變區域之質體(pCAG-g4H、pCAG-gκ)以 XhoI及SfiI消化，製作插入有將上述雙專一性抗體表現載體以XhoI及SfiI消化而回收之人類化XB12抗體基因片段(H鏈可變區域或L鏈可變區域)或人類化SB04抗體基因片段(H鏈可變區域或L鏈可變區域)之表現質體。DNA連結反應使用Rapid DNA Ligation套組(Roche Diagnostics)，進行大腸菌DH5α株(東洋紡織)之形質轉換。
6-3.人類化雙專一性抗體之調製
使用4種人類化雙專一性抗體表現載體及pcDNA6/TR、pVgRXR，以實施例4-2、4-3所示方法進行對HEK293H之基因導入及表現誘導。再者，以實施例4-5、4-6所示方法進行抗體精製及抗體濃度之定量。
6-4.人類化抗體之調製
為了使非雙專一性抗體之通常人類化抗體表現，使用實施例6-3製作之人類化H鏈抗體表現載體及人類化L鏈抗體表現載體依實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入。基因導入後添加10mL之CHO-S-SFM-II培養基(Invitrogen)及除去並清洗後，再添加10mL之CHO-S-SFM-II，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養3日，使人類化抗體分泌。
6-5.人類化雙專一性抗體之活性評價及抗體序列之改變
為了評價所調製之人類化雙專一性抗體及嵌合雙專一性抗體(XB12/SB04)之血漿凝固能力，依照實施例5之方法，使用F.VIII缺乏血漿探討抗體對APTT之影響。對於血液凝固能力低之人類化雙專一性抗體，以活性上升為目標來改變人類抗 體FR之胺基酸。又，對於擔心熱安定性低等之XB12抗體VH之CDR3的半胱胺酸殘基也改變為丙胺酸殘基。具體而言，使用QuikChange點突變套組(Stratagene)依所附說明書記載之方法在人類化抗體可變區域導入變異。藉由反複進行FR序列之胺基酸改變及血液凝固能力之評價，取得與XB12/SB04具有同等活性之人類化雙專一性抗體(人類化XB12抗體(VH：hXB12f-A,VL：hXBVL)/人類化SB04抗體(VH：hSB04e,VL：hSBVL-F3f)。各抗體可變區域序列以如下序列編號表示。
(1)人類化XB12抗體VH(hXB12f-A)序列編號：1(鹼基序列)、序列編號：2(胺基酸序列)
(2)人類化XB12抗體VL(hXBVL)序列編號：3(鹼基序列)、序列編號：4(胺基酸序列)
(3)人類化SB04抗體VH(hSB04e)序列編號：5(鹼基序列)、序列編號：6(胺基酸序列)
(4)人類化SB04抗體VL(hSBVL-F3f)序列編號：7(鹼基序列)、序列編號：8(胺基酸序列)
[實施例7]人類化抗體之模式化(modeling)
為了確認人類化SB04抗體之VH與VL之界面之胺基酸殘基，使用MOE軟體(Chemical Computing Group Inc.)，以相同度模擬器製作抗體Fv區域模型。VH與VL之界面中，H39及L38之胺基酸都是谷醯胺(Gln)，確認兩殘基之側鏈形成氫鍵(圖1(A))。又，H45與L44之胺基酸各為白胺酸(Leu)及脯胺酸(Pro)，確認兩殘基之側鏈非常近，且形成疏水性核(圖1(B))。該等2位置之胺基酸殘基已有報告在人類抗體之中為高 保守性的(Vargas-Madrazo E et al.J.Mol.Recognit.2003,16：113-120)。H39、L38、H45、L44等抗體之編號參考Kabat等人之文獻(Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)。
[實施例8]H39、L38之胺基酸經過改變之人類化抗體之製作及評價
8-1.H39及L38經過改變之抗體表現載體之構建
以抑制人類化XB12之H鏈與人類化SB04之L鏈之組裝的方式，依據實施例7之見解取代人類化XB12 H鏈之H39之谷醯胺與人類化SB04 L鏈之L38之谷醯胺。具體而言，以抑制谷醯胺側鏈氫鍵而產生電荷斥力之方式，將兩胺基酸(H39、L38)取代為側鏈帶正電荷之離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)、側鏈帶負電荷之谷胺酸(Glu)或天冬醯胺酸(Asp)。人類化抗體基因之取代使用QuikChange點突變套組(Stratagene)依所附說明書記載之方法導入變異。胺基酸被取代之各人類化抗體基因片段插入於實施例6-2使用之雙專一性抗體表現載體或通常之抗體表現載體。
8-2.組裝控制評價用抗體之調製及組裝控制評價
為了評價H鏈與L鏈之組裝控制，將製作之人類化XB12 H鏈(H39改變)、人類化SB04 L鏈(L38改變)、野生型人類化XB12 L鏈等3種抗體使用表現載體，以實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使培養上清中分泌抗體。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
將精製抗體200ng於樣本緩衝液(TEFCO)中進行 還原處理，注入14% SDS-PAGE mini凝膠(TEFCO)，進行電泳。電泳後，浸泡於含10%甲醇之7%乙酸溶液30分鐘進行固定處理，並於SYPRO(R)Ruby蛋白凝膠染色液(BIO-RAD)浸泡一晝夜進行染色。其次，於含10%甲醇之7%乙酸溶液浸泡1小時進行脫色處理，使用螢光偵測裝置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)進行影像解析，取得影像。使用所得到之影像，以ImageQuant ver4.2(Amersham Biosciences)計算H鏈及L鏈譜帶之螢光強度。
結果如圖2所示。使用算出之螢光強度強度值，將目的XB12-L鏈之比例(%)以「XB12-L鏈/L鏈總量(XB12-L鏈+SB04-L鏈)x 100」算出。確認了：人類化XB12 H鏈(H39)及人類化SB04 L鏈(L38)之胺基酸為野生型谷醯胺(Gln)之情形為50%，相對於此，取代H39及L38之情形之中，人類化XB12 L鏈比例上升，取代為谷胺酸(Glu)之之情形，為82%，上升了1.6倍。
8-3.凝固活性評價用之雙專一性抗體之調製與凝固活性評價
為評價凝固活性，使用製作之人類化XB12 H鏈(H39改變)及人類化SB04 L鏈(L38改變)雙專一性抗體表現載體及野生型人類化XB12 L鏈及人類化SB04 H鏈雙專一性抗體表現載體、pcDNA6/TR、pVgRXR，以實施例4-2、4-3所示方法進行對HEK293H之基因導入及表現誘導。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
凝固活性之評價以實施例5所示方法實施。結果如圖3所 示。於組裝控制評價之中比例上升到達82%之谷胺酸(Glu：E)改變抗體之中，與野生型比較，確認呈現同等以上凝固活性。
8-4.結合活性評價用抗體之調製
為評價與FactorIXa及FactorX之結合活性，將人類化XB12H鏈(H39改變)及野生型人類化XB12 L鏈抗體表現載體或野生型人類化SB04 H鏈及人類化SB04 L鏈(L38改變)抗體使用表現載體，以實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使抗體分泌於培養上清中。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
對於FactorIXa及FactorX之結合活性之評價以實施例1-2、2-2所示方法實施。結果如圖4、圖5所示。確認了即使取代H39及L38之胺基酸，結合活性也沒有變化。
由以上結果，暗示藉由改變XB12 H鏈之H39及SB04 L鏈之L38，可於不使對抗原之結合活性、代替FactoVIII之凝固活性等生物活性降低的狀態，使目的雙專一性抗體之比例上升。僅在多肽中一位置導入胺基酸變異，便使機能不降低而控制組裝之例，包含突起與空隙之方法也沒有報導至此程度，可稱為首度的見解。
[實施例9]L44之胺基酸經過改變之人類化抗體之製作及評價
9-1.L44經過改變之抗體表現載體之構建
以抑制人類化XB12之H鏈與人類化SB04之L鏈組裝之方式，依據實施例7之見解將人類化SB04 L鏈之L44之脯胺酸取代為側鏈帶電荷之胺基酸。具體而言，將於VH與VL界 面存在疏水性核之脯胺酸取代為側鏈帶正電荷之離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)、側鏈帶負電荷之谷胺酸(Glu)或天冬醯胺酸(Asp)。人類化抗體基因之取代使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，依所附說明書記載之方法導入變異。胺基酸被取代之各人類化抗體基因片段被插入實施例6-2使用之雙專一性抗體表現載體或通常之抗體表現載體。
9-2.組裝控制評價用抗體之調製及組裝控制評價
為評價H鏈與L鏈之組裝控制，使用製作之人類化SB04 L鏈(L44改變)、野生型人類化XB12 H鏈、野生型人類化XB12 L鏈等3種抗體表現載體，以實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使抗體分泌於培養上清中。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
將精製抗體200ng於樣本緩衝液(TEFCO)中進行還原處理，注入14% SDS-PAGE mini凝膠(TEFCO)，進行電泳。電泳後，浸泡於含10%甲醇之7%乙酸溶液30分鐘進行固定處理，並於SYPRO(R)Ruby蛋白凝膠染色液(BIO-RAD)浸泡一晝夜進行染色。其次，於含10%甲醇之7%乙酸溶液浸泡1小時進行脫色處理，使用螢光偵測裝置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)進行影像解析，取得影像。使用所得到之影像，以ImageQuant ver4.2(Amersham Biosciences)計算H鏈及L鏈譜帶之螢光強度。
結果如圖6所示。使用計算之螢光強度強度值，以「XB12-L鏈/L鏈總量(XB12-L鏈+SB04-L鏈)x 100」計算目的之XB12-L鏈之比例(%)。確認：人類化SB04 L鏈(L44)之 胺基酸為野生型脯胺酸(Pro)之情形為47%，相對於此，取代L44之情形，人類化XB12 L鏈之比例上升，為86-90%，上升了1.8-1.9倍。
9-3.凝固活性評價用之雙專一性抗體之調製及凝固活性評價
為評價凝固活性，使用製作之人類化SB04 L鏈(L44改變)雙專一性抗體表現載體及野生型之人類化XB12 H鏈、人類化XB12 L鏈及人類化SB04 H鏈雙專一性抗體表現載體、pcDNA6/TR、pVgRXR，以實施例4-2、4-3所示方法進行對HEK293H之基因導入及表現誘導。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
凝固活性之評價以實施例5所示方法實施。結果如圖7所示。確認：組裝控制評價中比例上升之所有改變抗體之中，呈現較野生型之凝固活性為高的凝固活性。
9-4.結合活性評價用抗體之調製
為評價對FactorX之結合活性，使用野生型人類化SB04 H鏈及人類化SB04 L鏈(L44改變)抗體表現載體，以實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使抗體分泌於培養上清中。再者，以實施例4-6所示方法實施培養上清中之抗體濃度之定量。
對FactorX之結合活性之評價使用培養上清以實施例2-2所示方法實施。結果如圖8所示。確認即使取代L44之胺基酸，結合活性也沒有變化。
由以上結果，暗示藉由將SB04 L鏈之L44一位置 之胺基酸改變，可於不降低對抗原之結合活性、代替FactoVIII之凝固活性等生物活性，而使目的雙專一性抗體之比例上升。僅在多肽中一位置導入胺基酸變異，便能使機能不低下而控制組裝之例，包含突起與空隙之方法也沒有報導至此程度，可稱為首見的。
[實施例10]H39、L38之胺基酸及L44之胺基酸經過改變之人類化抗體之製作與評價
10-1.H39、L38之胺基酸及L44經過改變之抗體表現載體之構建
以抑制人類化XB12之H鏈與人類化SB04之L鏈組裝之方式，依據實施例8及9之見解將人類化XB12 H鏈之H39及人類化SB04 L鏈之L38及L44取代為側鏈帶電荷之胺基酸。具體而言，將人類化XB12 H鏈之H39及人類化SB04 L鏈之L38兩胺基酸取代為實施例8之中最有效果之谷胺酸(Glu)，並將存在於人類化SB04 L鏈之L44之脯胺酸取代為側鏈帶正電荷之離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)、側鏈帶負電荷之谷胺酸(Glu)或天冬醯胺酸(Asp)。人類化抗體基因之取代使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，依所附說明書記載之方法導入變異。胺基酸被取代之各人類化抗體基因片段被插入實施例6-2使用之雙專一性抗體表現載體或通常之抗體表現載體。
10-2.組裝控制評價用抗體之調製及組裝控制評價
為評價H鏈與L鏈之組裝控制，使用變異型人類化SB04 L鏈、變異型人類化XB12 H鏈、野生型人類化XB12 L鏈3種 抗體表現載體，以實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使抗體分泌於培養上清中。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
將精製抗體200ng於樣本緩衝液(TEFCO)中進行還原處理，注入14% SDS-PAGE mini凝膠(TEFCO)，進行電泳。電泳後，浸泡於含10%甲醇之7%乙酸溶液30分鐘進行固定處理，並於SYPRO(R)Ruby蛋白凝膠染色液(BIO-RAD)浸泡一晝夜進行染色。其次，於含10%甲醇之7%乙酸溶液浸泡1小時進行脫色處理，使用螢光偵測裝置FluorImagerSI(Amersham Biosciences)進行影像解析，取得影像。使用所得到之影像，以ImageQuant ver4.2(Amersham Biosciences)計算H鏈及L鏈譜帶之螢光強度。
結果如圖9所示。使用算出之螢光強度強度值，將目的XB12-L鏈之比例(%)以「XB12-L鏈/L鏈總量(XB12-L鏈+SB04-L鏈)x 100」算出。確認了：人類化XB12 H鏈(H39)及人類化SB04 L鏈(L38)之兩胺基酸改變為谷胺酸(Glu)、人類化SB04 L鏈(L44)為野生型之脯胺酸(Pro)之情形為82%，人類化XB12 H鏈(H39)及人類化SB04 L鏈(L38)之兩胺基酸改變谷胺酸(Glu)且取代L44之情形，人類化XB12 L鏈之比例上升至94-96%。該比例之提高，比實施例9之中單獨取代L44之86-90%為高。
10-3.凝固活性評價用之雙專一性抗體之調製及凝固活性評價
為評價凝固活性，使用製作之變異型人類化XB12 H鏈、 人類化XB12 L鏈及人類化SB04 H鏈雙專一性抗體表現載體與野生型人類化XB12 H鏈、人類化XB12 L鏈及人類化SB04 H鏈雙專一性抗體表現載體、pcDNA6/TR、pVgRXR，以實施例4-2、4-3所示方法進行對HEK293H之基因導入及表現誘導。再者，以實施例4-5、4-6所示方法實施抗體精製及抗體濃度之定量。
凝固活性之評價依實施例5所示方法實施。結果如圖10所示。組裝控制評價中比例上升之所有改變抗體之中，確認與野生型之凝固活性呈現同等之凝固活性。
10-4.結合活性評價用抗體之調製
為評價對FactorX之結合活性，使用野生型人類化SB04 H鏈及變異型人類化SB04 L鏈抗體表現載體，依實施例4-2所示方法對HEK293H進行基因導入，使抗體分泌於培養上清中。再者，以實施例4-6所示方法實施培養上清中之抗體濃度之定量。
對FactorX之結合活性之評價使用培養上清以實施例2-2所示方法實施。結果如圖11所示。確認了即使取代L38及L44兩胺基酸，結合活性也沒有變化。
由以上結果，暗示藉由改變XB12 H鏈之H39及SB04 L鏈之L38,L44之胺基酸，可不使對抗原之結合活性、代替FactoVIII之凝固活性等生物活性降低，而使目的雙專一性抗體之比例上升。確認雙專一性抗體之比例由於增加界面之胺基酸改變之數目而上升。
[實施例11]hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之構造構造異 構物分離、構造決定
11-1. 人類化抗人類Mpl抗體hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之製作
人類化抗Mpl抗體hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2(以下u2-wz4)之製作方法表示於WO2005/56604。該基因係使用編碼為連接子序列(GlyGlyGlyGlySer)x3之鹼基序列，使帶有由VH-連接子序列-VL-連接子序列-VH-連接子序列-VL構成之鹼基序列(參照序列編號：12；WO2005/56604之序列編號：286)的方式以PCR法製作。確認基因之鹼基序列後，將DNA片段選殖於表現載體pCXND3並構建表現載體，藉由對CHO-DG44細胞進行基因導入，製作安定表現細胞株。具體而言，將表現載體(20μg)與懸浮於PBS之CHO-DG44細胞(1×107細胞/mL)0.75mL混合者於冰上冷卻10分鐘，移到小玻璃管後，使用Gene Pulser Xcell(BioRad)施以1.5kV、25μFD電容之脈衝。於室溫經過10分鐘之回復期間後，將經過電穿孔處理之細胞加入含500μg/mL Geneticin(Invitrogen)之CHO-S-SFMII培養基(Invitrogen)並選擇，建立u2-wz4產生CHO細胞株。
人類化抗體hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2由於未加成Flag標記(tag)，故自培養上清之精製利用認識之抗原決定基MG10(人類Mpl胺基酸序列之Gln213至Ala231)及GST融合蛋白質進行。MG10與GST融合蛋白質之精製係使用谷胱甘肽Sepharose 4B(Amersham Biosciences社製)，依照製造商的使用說明進行精製。再者，將精製之MG10與GST融合蛋白質依照製造商的使用說明，固定於HiTrap NHS-活化HP(Amersham Biosciences社製)，製作親和管柱。使人類化抗體hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2表現CHO細胞之培養上清流過MG10-GST融合蛋白質固定化管柱，使人類化抗體hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2吸附，並以100mM甘胺酸-HCl(pH 3.5)、0.01% Tween80溶出。將溶出畫分立即以1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，使用HiLoad 16/60 Superdex200pg(Amersham Biosciences社製)進行凝膠過濾層析，進行單體之精製。凝膠過濾層析之緩衝液使用20mM檸檬酸緩衝液(pH 7.5)、300mM NaCl、0.01% Tween 80。
2-2. hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之構造構造異構物之分離、精製
由於hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2為具有VH1-連接子-VL2-連接子-VH3-連接子-VL4之序列之sc(Fv)2，藉由與VB22B sc(Fv)2同樣地進行Fv(VH、VL間為非共價鍵之分子)之組合，可認為存在VH1與VL2、VH3與VL4各形成Fv之二價scFv型，與VH1與VL4、VH2與VL3各形成Fv之單鏈雙功能抗體型2種構造構造異構物(圖12)。
對hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之構造構造異構物之分離加以探討，結果暗示使用陽離子交換層析BioAssist S(TOSOH)，以下述溶離條件可將hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之各種成分分離。
移動相A：20mM磷酸鈉，pH 7.5
移動相B：20mM磷酸鈉，500mM NaCl,pH 7.5
流速：0.8ml/min
梯度：B 0%→B 35%(30min)
以上述條件，hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2被分離為2個峰部。得到圖13所示之層析圖，自滯留時間短之峰部依序命名為peak1、peak2。
對peak1及peak2，使用Q-TOF型質量分析計(Q Tof Ultima,Micro Mass)進行分子量之測定。Q-TOF以灌流(infusion)將試料溶液導入，將所得到之多價離子圖譜(+)利用附屬軟體(MassLynx)進行影像強化處理(Deconvolution)，結果得到peak1之分子量53768Da、peak2之分子量為53769Da。由此可知peak1與peak2具有相同之分子量。
對peak1及peak2進行肽輿圖分析(mapping)。還原變性、羧基甲基化後，使用胰蛋白酶分解成肽片段，以逆相層析(YMC-Pack-ODS)得到肽輿圖。比較peak1與peak2之肽輿圖，由於圖14所示peak1與peak2之輿圖之圖案相同，因此可得知胺基酸一次構造為相同。
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2未有糖鏈加成且peak1與peak2以TOF-MASS測定之分子量相同、peak1與peak2之輿圖圖案相同，因此，可得知peak1與peak2為具有彼此相異立體構造之構造異構物(conformational isomer)。
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2由於為具有VH1-連接子-VL2-連接子-VH3-連接子-VL4序列之sc(Fv)2，如圖12所示，構造藉由Fv(VH、VL間為非共價鍵之分子)之組合，存在有VH1與VL2、VH3與VL4各形成Fv之二價scFv型，及VH1與VL4、VH2與VL3各形成Fv之單鏈雙功能抗體型2種構造異構物，peak1及peak2可認為是二價scFv型與單鏈雙功能抗體 型之中某一構造。
就鑑定2種構造異構物之分析法而言，發現了蛋白酶限定分解法。sc(Fv)2之連接子部分由於為比較自由之構造，因此被認為對蛋白酶之耐性低，使用一種蛋白酶subtilisin A，以如下條件使peak1及peak2及hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2(peak1：peak2~1：4)反應。
20mM檸檬酸鈉，150mM NaCl,pH 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1或peak2：0.15mg/mL
Subtilisin A：10μg/mL
37℃,30min
反應後，使用Phastgel Homogeneous 12.5%，進行還原SDS-PAGE。其結果如圖15所示，hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk、peak1、peak2皆顯示同樣的譜帶圖案。可得知：將hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之3位置之連接子部分切斷而得到各片段之專一性譜帶，因此藉由使用上述反應條件，可將hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2之連接子部分部分且限定的分解。
於二價scFv型與單鏈雙功能抗體型之構造中，當發生3個之中一個連接子位置切斷之情形，如圖16所示，於未變性狀態，於VH與VL之間為非共價鍵結合之單鏈雙功能抗體型構造之中，即使3個中某一連接子切斷，也看不出分子量之變化，但於二價scFv型之中，如果中央之連接子切斷，會產生一半分子量之分子種類。因此，以上述反應條件部分的將連接子切斷，以hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2團塊(bulk)、peak1、peak2以TSK SuperSW2000(TOSOH)進行凝膠過濾層析 分析。凝膠過濾層析以如下條件進行。
移動相：DPBS(-)pH7.4
流速：0.2ml/min
其結果如圖17所示，peak2之中確認完全沒有低分子量之峰部，相對於此，peak1之中確認有低分子量(約一半分子量)之峰部。peak1與peak2之混合物hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2團塊確認有相當於peak1存在比例之量之低分子量峰部。因此，由本結果鑑定：peak1為二價scFv型，peak2為單鏈雙功能抗體型。
[實施例12]VH/VL界面變異型sc(Fv)2之製作、構造異構物分析及鑑定
12-1. VH/VL界面變異型sc(Fv)2之製作
將利用改變VH/VL界面之組裝控制應用於低分子化抗體sc(Fv)2，為了確認是否能控制sc(Fv)2構造異構物形成，以如下方法製作VH/VL界面變異型sc(Fv)2。
將u2-wz4之形成VH/VL界面之胺基酸VH之39位(參照序列編號：13之胺基酸序列之中39位；WO2005/56604之序列編號：289)之Gln與VL之38位(參照序列編號：14之胺基酸序列之中43位；WO2005/56604之序列編號：289)的Gln以如下方式改變。首先，製作VH1之39位之Gln(基因密碼子CAG)改為Glu(基因密碼子GAG)、VL2之38位之Gln(基因密碼子CAG)改為Glu(基因密碼子GAG)、VH3之39位之Gln(基因密碼子CAG)改為Lys(基因密碼子AAG)、VL4之38位之Gln(基因密碼子CAG)改為Lys(基因密碼子AAG)之基因 hVB22B u2-wz4(v1)sc(Fv)2(以下v1、鹼基序列以序列編號：15，以該鹼基序列所編碼之胺基酸序列以序列編號：16表示)。再者，製作：VH1之39位之Gln(基因密碼子CAG)改為Glu(基因密碼子GAG)、VL2之38位之Gln(基因密碼子CAG)改為Lys(基因密碼子AAG)、VH3之39位之Gln(基因密碼子CAG)改為Lys(基因密碼子AAG)、VL4之38位之Gln(基因密碼子CAG)改為Glu(基因密碼子GAG)之基因hVB22B u2-wz4(v3)sc(Fv)2(以下，v3、鹼基序列以序列編號：17、該鹼基序列所編碼之胺基酸序列以序列編號：18表示)。基因之改變使用QuikChange點突變套組(STRATAGENE社製)依照製造商之使用說明，導入點突變。確認各基因之鹼基序列後，將DNA片段選殖於表現載體pCXND3並構建表現載體，藉由於CHO-DG44細胞導入基因，製作安定表現細胞株。以實施例11所示方法建立v1產生CHO細胞株及v3產生CHO細胞株。
變異體v1、v3以實施例11所示方法，使用MG10-GST融合蛋白質固定化管柱進行單體分子精製。由圖18所示凝膠過濾層析之結果可得知，變異體v1、v3在培養上清中二聚物以上之凝集體少，單體比例與改變前之u2-wz4之59%比較，v1為89%、v3為77%，是上升的。推測變異體v1、v3藉由VH/VL界面胺基酸之改變，由於電荷斥力而抑制不當的組裝，而促進較佳組裝。由以上，本組裝控制成功地有效率地表現單體分子。
12-2. VH/VL界面變異型sc(Fv)2之構造異構物分析及鑑定
對所得到之VH/VL界面變異體v1、v3及未變異體u2-wz4之構造異構物存在比以陽離子交換層析及等電點電泳分析。又，以蛋白酶限定分解法實施構造鑑定。
陽離子交換層析依以下實施。
管柱：TSK-gel Bioassist S，4.6mmψ×50mm(TOSOH社製)
流速：0.8mL/min
偵測波長：220nm
溶出條件：
溶出液A：20mmol/L磷酸緩衝液(pH 7.0)
溶出液B：20mmol/L磷酸緩衝液/500mmol/L NaCl(pH 7.0)
梯度：
等電點電泳依以下實施。將PhastGel乾燥IEF凝膠(Amersham Biosciences社製)用以下凝膠膨潤液膨潤30分鐘以上。將試料加入先膨潤之凝膠，以PhastSystem依如下電泳條件電泳。電泳後，於20% TCA溶液浸泡30分鐘後，以miliQ水清洗5分鐘×3次以上，並依照試料之蛋白質濃度進行 Coomassie染色或銀染色。Coomassie染色之染色液使用含0.1% CuSO4(w/v)之0.02% CBB進行染色，並以含10%乙酸之30%甲醇脫色。銀染色使用銀染色套組，使用蛋白質(Amersham Biosciences社製)，以套組所附之標準使用方法進行染色。
<凝膠膨潤液>
<電泳程式>
以蛋白酶限定分解法進行之構造鑑定依如下條件實施。使用subtilisin A，以如下條件使u2-wz4精製peak1與u2-wz4精製peak2及變異體v1與變異體v3反應。
20mM檸檬酸鈉，150mM NaCl,pH 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1或peak2：0.15mg/mL
Subtilisin A：10μg/mL
37℃,30min
將所得到之反應液利用凝膠過濾層析以如下條件分析。
管柱：TSKgel Super2000sw(TOSOH)
溶出液：50mM磷酸鈉，300mM KCl,pH 7.0
流速：0.2ml/min
偵測：220nm
由圖19及圖20所示陽離子交換層析與等電點電泳之構造異構物分析結果，可得知：u2-wz4以24%二價scFv型、76%單鏈雙功能抗體型之兩構造異構物混合物的方式表現，相對於此，變異體v1為100%單鏈雙功能抗體型之構造異構物的方式表現，變異體v3為100%二價scFv型之構造異構物之方式表現。又如圖21所示，由蛋白酶限定分解之結果也顯示：變異體v3可觀察到與u2-wz4精製peak1同樣低分子之峰部，變異體v1可觀察到與u2-wz4精製peak2同樣低分子之峰部。因此，變異體v1以單鏈雙功能抗體型構造異構物之方式表現，變異體v3以二價scFv型構造異構物之方式表現。
[實施例13]VH/VL界面變異型sc(Fv)2之活性評價及安定性評價
13-1. VH/VL界面變異型sc(Fv)2之生物活性評價
抗人類Mpl抗體VB22B sc(Fv)2在文獻(Blood 2005；105：562-566)之中報告呈現TPO類似協同活性。因此，對使用顯示TPO依存性增殖之BaF3-human Mpl或BaF3-monkey Mpl分離之構造異構物之TPO類似協同活性進行評價。
將各細胞以含1%胎牛血清(Invitrogen)之RPMI1640(Invitrogen)清洗2次後，懸浮於含10%胎牛血清之RPMI1640，使成為4 x 105cells/mL，並以60μL/well分注 於96井盤。分配rhTPO(R&D)或構造異構物樣本之濃度，在各井加入40μL，於37℃、5% CO2條件下進行24小時培養。以10μL/well加入WST-8試藥(細胞計數試劑SF、Nacalai Tesque)，之後緊接著使用Benchmark Plus測定450nm之吸光度(對照655nm)，培養2小時後，再度測定450nm之吸光度(對照655nm)。由於WST-8試藥對應於活細胞數顯現450nm之呈色反應，故以2小時之吸光度變化為指標來評價TPO類似協同活性。
使用經過精製之VB22B sc(Fv)2之構造異構物，評價BaF3-human Mpl、BaF3-monkey Mpl之中TPO類似協同活性，結果各如圖17所示。比較peak1與peak2之構造異構物之協同活性，可得知peak2顯著呈現較高的活性。此暗示：抗Mpl抗體sc(Fv)2為發揮TPO類似協同活性，必需採取單鏈雙功能抗體之構造。
依照實施例1所示方法，進行VH/VL界面變異體v1及v3之協同活性之評價。協同活性在構造異構物間差異很大，如圖12所示，單鏈雙功能抗體構造之peak2顯示非常高之協同活性，相對於此，二價scFv構造之peak1之活性極低。如圖22所示，變異體v1與peak2顯示同等活性，變異體v3與peak1顯示大致同等之活性。由以上，確認了：生物活性之中亦為變異體v1形成單鏈雙功能抗體構造、變異體v3形成二價scFv構造。
13-2. VH/VL界面變異型sc(Fv)2之安定性評價
就u2-wz4精製peak1及u2-wz4精製peak2及變異體v1 與變異體v3之安定性評價而言，使用微差掃描型熱量測定(Differential Scanning Calorimetry)依如下條件測定變性中間溫度(Tm值)。
DSC：N-DSCII(Applied Thermodynamics社製)
溶液條件：20mM檸檬酸鈉，300mM NaCl,pH 7.0
蛋白質濃度：0.1mg/mL
掃描速度：1℃/分
各DSC測定之結果如圖23所示。可得知：u2-wz4精製peak2與變異體v1之Tm值與未變異體大致同等，安定性為同等。u2-wz4精製peak1與變異體v3顯示，變異體v3安定性稍低。使用knobs-into-hole技術之方法進行之界面控制之中，有人報告：例如IgG之CH3功能區之異組裝之中，未改變CH3功能區之Tm值為80.4℃，相對於此，改變CH3功能區之Tm值為69.4℃，Tm值大幅降低且安定性降低(Acta Pharmacol Sin.2005 26(6)：649-58)。相對於此，確認了本發明可不降低安定性而控制組裝。
接著，就u2-wz4精製peak1與u2-wz4精製peak2及VH/VL界面變異體變異體v1與變異體v3之安定性評價而言，以如下條件實施以熱加速試驗進行之安定性評價。
<熱加速條件>
溶液條件：20mM檸檬酸鈉，pH 6.0
蛋白質濃度：0.25mg/mL
加速條件：40℃-6day,12day
熱加速樣本以凝膠過濾層析及陽離子交換層析依 如下條件分析。
如圖24所示，以凝膠過濾層析分析之結果，確認：u2-wz4精製peak2與變異體v1之單體殘存率大致同等，對組裝化之安定性大致同等。又，u2-wz4精製peak1與變異體v3之單體殘存率也大致同等，可得知兩構造異構物之中對組裝化之安定性大致同等。
如圖25所示，陽離子交換層析分析之結果可得知：未變異體之精製peak1由於異構化反應而異構化為peak2，未變異體精製peak2由於異構化反應而異構化為peak1，相對於此，VH/VL界面變異體v1與v3在熱加速後也不發生異構化反應。藉由應用VH/VL界面之改變，除了能100%之狀態僅表現2種構造異構物之一之構造異構物，而且所得到之各構造異構物不發生異構化反應可安定保存。
本實施例之中，發現：藉由使用應用於v1及v3之VH/VL界面改變，可使2種構造異構物之中僅其中之一構造異構物以100%存在之狀態表現。就為了得到目的構造之單鏈抗體之VH/VL界面控制而言，已知有使用突起進入空隙(knobs-into-hole)技術來控制雙專一性抗體(Bispecific diabody)之(Protein Sci.1997 Apr；6(4)：781-8,Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation.,Zhu Z,Presta LG,Zapata G,Carter P.)。該方法據報告係藉由改變在VH/VL界面之合計4位置之胺基酸而使目的異二聚物構造之形成率上升至72%~92%。相對於此，本發明藉由改變4位置胺基酸，成功地在不使熱安定性及構造異構物之安定性降低之下，取得100 %比例之目的構造。
[實施例14]具混合L鏈之雙專一性抗體之人類化
關於血液凝固時間之縮短效果最高之抗FactorIXa抗體A69-VH、抗FactorX抗體B26-VH、混合L鏈(BBA)之組合構成之雙專一性抗體(特願2005-112514)，以如下方式實施人類化。
14-1.人類抗體之相同性檢索
以被一般公開之Kabat資料庫(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)及IMGT資料庫(http：//imgt.cines.fr/)取得人類抗體胺基酸序列資料，並使用構建之資料庫分成小鼠A69-H鏈可變區域(胺基酸序列：序列編號：57)、小鼠B26-H鏈可變區域(胺基酸序列：序列編號：58)、小鼠BBA-L鏈可變區域(胺基酸序列：序列編號：59)進行相同性檢索。其結果由於確認與以下所示人類抗體序列具高度相同性，故使用於人類化抗體之框架區域(以下稱FR)。
(1)A69-H鏈可變區域：KABATID-000064(Kabat Database)
(Kipps等，J Clin Invest.1991；87：2087-2096)
(2)B26-H鏈可變區域：EMBL Accession No.AB063872(IMGT Database)
(Unpublished data)
(3)BBA-L鏈可變區域：KABATID-024300(Kabat Database)
(Welschof等，J Immunol Method.1995；179：203-214)
製作在(1)-(3)之人類抗體FR中移植有各小鼠抗體之互補性抗原決定區域(以下、CDR)的人類化抗體。
又，使用NCBI所一般公開之相同性檢索網站 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，檢索與(1)-(3)人類抗體之相同性高之人類抗體分泌信號序列。使用檢索所得到之以下所示分泌信號序列。
(1)A69-H鏈可變區域：GenBank Accession No.AF062257
(2)B26-H鏈可變區域：GenBank Accession No.AAC18248
(3)BBA-L鏈可變區域：GenBank Accession No.AAA59100
14-2.人類化抗體基因表現載體之構建
於編碼為自分泌信號序列至抗體可變區域之胺基酸序列之鹼基序列之中，製作12條交互地3’末端約20base左右黏合之50base左右之合成寡DNA。再者製作黏合於抗體可變區域基因之5’末端並具有XhoI切斷序列之引子，與黏合於抗體可變區域基因之3’末端且具有SfiI切斷序列並編碼為內子(intron)序列之5’末端序列之引子。
將調製成2.5μM之合成寡DNA以各1μL混合，加入1x TaKaRa Ex Taq緩衝液、0.4mM dNTPs、0.5單元TaKaRa Ex Taq(皆為寶酒造)，調製反應液48μL。於94℃保溫5分鐘後，將由94℃ 2分鐘、55℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘構成之反應進行2回合，實施各合成寡DNA之組合及伸長反應。其次，添加黏合於抗體基因之5’末端及3’末端之引子(各10μM)1μL，進行由94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘構成之反應35回合，於72℃反應5分鐘，將抗體可變區域基因放大。將反應液全量供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之放大片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl 溶出。將該片段使用pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)依所附說明書記載之方法進行選殖。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator循環定序套組(Applied Biosystems)，以DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer(Applied Biosystems)依所附說明書記載之方法來定序。
將確認為正確人類化抗體可變區域基因序列之H鏈可變區域片段插入質體以XhoI及SfiI消化，將L鏈可變區域片段插入質體以EcoRI消化後，將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之DNA片段以QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)依所附說明書記載之方法精製，並以滅菌水30μl溶出。之後，製作如下方式之動物細胞用表現載體。為了使H鏈優先地表現成異組合IgG4，參考IgG1之knobs-into-hole技術(非專利文獻3)使用對IgG4之CH3部分之胺基酸取代體。再者為促進H鏈之二聚物形成，於鉸鏈也導入胺基酸取代(-ppcpScp-→-ppcpPcp-)。在具有雞β肌動蛋白促進子之pCAGGS(Niwa et al.1991 Gene,108：193-199.)中插入有取代為Y349C、T366W之不變區域基因的表現載體之中，插入人類化A69 H鏈可變區域抗體基因片段，製作人類化A69H鏈表現載體。又，在pCAGGS中嵌入有取代為E356C、T366S、L368A、Y407V之不變區域基因的表現載體中，插入人類化B26 H鏈可變區域抗體基因片段，製作人類化B26H鏈表現載體。又，將在pCAGGS插入有野生型抗體L鏈不變區域之質體(pCAG-gκDNA)以EcoRI消化，製作插入有人類化BBA L鏈可變區域抗體基因片段之表現載體。連結反應使用Rapid DNA Ligation套組(Roche Diagnostics)，並將大腸菌DH5α株(東洋紡織)進行形質轉換。
14-3.人類化雙專一性抗體之調製
人類化雙專一性抗體之表現使用實施例4-2記載之方法或以下方法進行。將人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%FCS(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6×105個/mL之細胞密度各接種10mL至黏著細胞用培養皿(直徑10cm,CORNING)之各皿，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養一晝夜後，吸去培養基，添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基。將14-2調製之質體DNA混合液(合計13.8μg)與1μg/mL聚乙烯亞胺(Polyethylenimine)(Polysciences Inc.)20.7μL與CHO-S-SFMII培養基690μL混合，於室溫10分鐘靜置後投入各皿之細胞，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養4~5小時。之後，添加6.9mL之CHO-S-SFM-II培養基，於CO2培養箱內培養3日。將培養上清回收後，離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)除去細胞，再通過0.22μm濾膜MILLEX(R)-GV(Millipore)以滅菌。該樣本保存於4℃至使用為止。
接著，以實施例4-4所示方法進行抗體精製及實施例4-5所示方法或以下所示方法實施抗體濃度之定量。使用BIAcore3000(BIACORE)，將ProteinA固定於感應器晶片CM5(BIACORE)。具體而言，依照製造商使用說明，在活性化之感應器晶片使以10mM乙酸鈉水溶液(pH 4.0,BIACORE)稀釋為50μg/mL之ProteinA溶液以5μL/分反應30分鐘，之後 實施封阻操作，而製作ProteinA固定化感應器晶片。使用該感應器晶片，使用BIAcore Q測定培養上清及精製品之濃度。感應器晶片之固定及濃度測定使用HBS-EP緩衝液(BIACORE)。又，濃度測定時之標準品使用以HBS-EP緩衝液自2000ng/mL分6階段以2倍系列稀釋之人類IgG4(人類型化抗TF抗體，參照WO 99/51743)。
14-4.人類化雙專一性抗體之活性評價及抗體序列之改變
為了評價所調製之人類化雙專一性抗體及嵌合雙專一性抗體(A69/B26/BBA)之血漿凝固能力，依照實施例5之方法，使用F.VIII缺乏血漿探討抗體對APTT之影響。對於血液凝固能力低的人類化雙專一性抗體，以活性上升為目標來改變人類抗體FR之胺基酸。又，表現分泌時會表現人類化A69/人類化BBA抗體、人類化B26/人類化BBA抗體、人類化A69/人類化B26/人類化BBA雙專一性抗體3種抗體，但為將該3種抗體分離，僅精製雙專一性抗體，進行使人類化A69 H鏈可變區域等電點下降，使人類化B26 H鏈可變區域等電點上升之胺基酸改變。具體而言，使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，以所附說明書記載之方法於人類化抗體可變區域導入變異。將確認為目的人類化抗體可變區域基因序列之H鏈可變區域片段插入質體以XhoI及SfiI消化、L鏈可變區域片段插入質體以EcoRI消化後，將反應液供1%瓊脂凝膠電泳。將目的大小(約400bp)之DNA片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明書記載之方法精製、以滅菌水30μl溶 出。之後，以實施例14-2所示方法，製作動物細胞用表現載體。以實施例14-3所示方法調製人類化雙專一性抗體，以實施例5所示方法評價血液凝固活性。
反複FR序列之胺基酸改變及血液凝固能力之評價，取得與嵌合雙專一性抗體(A69/B26/BBA)具同等活性之人類化雙專一性抗體(人類化A69(hA69-PFL)/人類化B26(hB26-PF)/人類化BBA(hAL-AQ))(圖26)。各抗體可變區域序列如以下序列編號所示。
(1)人類化A69抗體VH(hA69-PFL)序列編號：19(鹼基序列)、序列編號：20(胺基酸序列)
(2)人類化B26抗體VH(hB26-PF)序列編號：21(鹼基序列)、序列編號：22(胺基酸序列)
(3)人類化BBA抗體VL(hAL-AQ)序列編號：23(鹼基序列)、序列編號：24(胺基酸序列)
[實施例15]為提高雙專一性抗體之形成效率向上之不變區域之胺基酸改變位置選定
以改變存在於不變區域CH3界面之胺基酸，利用電荷斥力而提高異二聚物雙專一性抗體之形成效率為目標，進行探討。首先，利用CH3區域之結晶構造(Protein Data bank、PDB code 1OQX)，尋討CH3同二聚物形成時形成靜電交互作用之配對胺基酸。其結果發現：於CH3同二聚物形成時之界面中，H鏈356號與439號、357號與370號、399號與409號3個對(編號為EU編號(Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH))各具正電荷及負電荷且有靜電 交互作用，並選擇為改變位置。改變方法考慮藉由對成為配對之正電荷與負電荷胺基酸之電荷加以取代改變，來促進異二聚物之形成。本控制原理如圖27所示。又，吾人也嘗試同時在CH3界面導入雙硫鍵之改變。改變之胺基酸位置整理如表1。
[實施例16]人類化雙專一性抗體之不變區域CH3界面之胺基酸改變
為了將實施例15所選定之H鏈不變區域CH3界面之胺基酸改變，進行如下操作。將以人類IgG1及人類IgG4之H鏈不變區域基因為模板而編碼為H鏈不變區域之N末端側之2個胺基酸(Ala-Ser)的鹼基序列與設計為成為NheI認識序列(GCTAGC)之5’末端引子在3’末端黏合，並使用設計為帶有NotI認識部位之引子將各H鏈不變區域以PCR放大，製作將pBluescriptKS+載體(東洋紡織)以NheI,NotI(皆為寶酒造)消化之載體連結之pBCH(含IgG1不變區域基因)及pBCH4(含IgG4不變區域基因)。使用與人類化A69抗體及人類化B26抗體之H鏈可變區域之5’末端鹼基序列為互補且具有可札克序列(CCACC)及EcoRI認識序列之引子與具有NheI認識序列之3’末端鹼基序列使用引子進行PCR，將所得到之PCR產物以EcoRI及NheI(皆為寶酒造)消化並插入pBCH或pBCH4並與可變區域及不變區域連結。接著，為了改變存在於H鏈不變區域之CH3界面之胺基酸，使用QuikChange點突變套組(Stratagene)，以所附說明書記載之方法在H鏈不變區域導入變異。將確認為目的H鏈不變區域基因序列之H鏈基因片段插入質體以EcoRI及NotI(皆為寶酒造)消化後，反應液供1%瓊脂 凝膠電泳。將目的大小(約1400bp)之H鏈基因片段使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)，以所附說明書記載之方法精製，以滅菌水30μl溶出。之後，插入以EcoRI及NotI消化之pCAGGS，並製作表現質體。關於人類化雙專一性抗體之調製，依照實施例14-3所示方法進行。改變之胺基酸位置整理如表1。表1中之改變位置編號採用EU編號(Kabat EA et al.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH)。改變位置編號前之字母為改變前之胺基酸之單字母代號，改變位置編號後之字母為改變後胺基酸之單字母代號。
上述表中，KiH表示使用非專利文獻3之突起進入空隙(Knobs-into-holes)技術之變異體。
[實施例17]CH3界面改變之雙專一性抗體(IgG4型)之形成效率及安定性之評價
關於IgG4型之野生型、KiH、s1、s2、s3、w1、w2、 w3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2，以陽離子交換層析(IEX)進行分析，評價雙專一性抗體(以下稱BiAb)形成效率。陽離子交換層析分析條件如下，計算人類化A69抗體之同二聚物A-Homo、人類化A69抗體與人類化B26抗體之異二聚物BiAb、人類化B26抗體之同二聚物B-Homo之峰部面積比。
管柱：ProPac WCX-10,4×250mm,(Dionex)
移動相：A：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,pH 6.25
B：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,500mmol/L NaCl,pH 6.25
流速：1.0mL/min
梯度：10%B(5min)→(40min)→60%B→(5min)→100%B(5min)
偵測：220nm
關於野生型、KiH、s2、s3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2，藉由在上述IEX分析時分取BiAb峰部，進行BiAb精製。將BiAb畫分以Amicon Ultra,MWCO 10000(Millipore)濃縮後，以20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH 6.0於冷處進行一晚透析，之後回收，將BiAb濃度統一為0.1mg/mL，各分注2管小玻璃瓶，作為起始及60℃-1週，進行60℃-1週之安定性試驗。以凝膠過濾層析(SEC)進行分析，計算單體峰部殘存率(60℃-1週樣本之單體峰部面積/起始樣本之單體峰部面積×100)。凝膠過濾層析分析條件如下。
管柱：Super3000(TOSOH)
移動相：50mM磷酸鈉，300mM KCl,pH 7.0
流速：0.2ml/min
偵測：220nm
IgG4型之野生型、s1、s2、s3、w1之IEX層析圖如圖28，野生型、KiH、s1、s2、s3、w1、w2、w3、s1C、s2C、s3C、w3C、w3C2之A-Homo,BiAb,B-Homo之形成比例如圖29所示。又，60℃-1週後之單體殘存率如圖30所示。
本實施例之中發現之CH3界面變異體如圖28、圖29所示，與野生型比較，目的BiAb形成效率皆大幅提高。由於CH3位於不變區域，自天然胺基酸加以改變之情形，由抗原性之觀點，希望改變位置較少。KiH施以合計6位置之改變：用以導入突起與空隙共兩H鏈計4位置之改變，雙硫鍵導入2位置改變。故可如圖29所示，得到高BiAb形成效率。但是，由圖30所示安定性試驗之結果，熱安定性與野生型比較，儘管導入了雙硫鍵，仍然大幅下降。為了將抗體開發成醫療用醫藥品，需要安定製劑，故希望熱安定性較高。
另一方面，本實施例之中發現之CH3界面變異體，與野生型比較，目的BiAb形成效率皆成功地大幅提高。該等變異體之中，例如、s2、s3、w1、w2、w3、s1C藉由較KiH(6位置改變)的改變少，為合計2位置或者4位置之改變，可得到90%以上之高BiAb形成效率，可認為抗原性之風險較小。又，由圖30所示安定性試驗之結果，變異體之中，例如，s2、s3、w3、w3C、w3C2具有90%以上之高BiAb形成效率且具有較KiH為高之熱安定性(單體殘存率高)，且 s3、s2c、s3C、w3C、w3C2具有較野生型更高之熱安定性，對開發安定之醫藥品製劑為有用的。
本實施例之中發現：藉由將CH3界面之中H鏈356號、357號、370號、399號、409號、439號之胺基酸改變而導入因電荷而生之分子斥力，可使目的BiAb形成效率大幅提高。又，藉由該等之單獨、組合及雙硫鍵之導入，可以較KiH為少之改變使BiAb形成效率大幅提高，且比KiH之安定性高，且較野生型為高熱安定性且BiAb形成效率大幅地提高。
[實施例18]CH3界面經過改變之雙專一性抗體之凝固活性評價
使用實施例16之中精製之CH3界面經過改變之IgG4型雙專一性抗體(s1、s2、s3、w1、w2、w3)，依照實施例5所示方法進行凝固活性之評價。由於即使將圖31所示不變區域CH3界面之胺基酸改變，凝固活性也沒有變化，因此表示CH3界面之胺基酸改變不會影響與抗原之反應有關之可變區域之構造。
[實施例19]CH3界面經過改變之雙專一性抗體(IgG1型)之形成效率評價
關於IgG1型之野生型、KiH、w1、w2、w3，以陽離子交換層析(IEX)進行分析，評價BiAb形成效率。陽離子交換層析分析條件如下，計算人類化A69抗體之同二聚物A-Homo、人類化A69抗體與人類化B26抗體之異二聚物BiAb、人類化B26抗體之同二聚物B-Homo之峰部面積比。
管柱：ProPac WCX-10,4×250mm,(Dionex)
移動相：A：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,pH 6.25
B：10mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,500mmol/L NaCl,pH 6.25
流速：1.0mL/min
梯度：10%B(5min)→(40min)→60%B→(5min)→100%B(5min)
偵測：220nm
IgG1型之野生型、KiH、w1、w2、w3之A-Homo、BiAb、B-Homo之形成比例如圖32所示。與IgG4型同樣地，與野生型比較，目的BiAb形成效率皆大幅地上升。與IgG4型同樣地，藉由比KiH為少之4位置改變，得到90%以上之高BiAb形成效率，可認為抗原性之風險性較小。本實施例之中發現：將CH3界面之中H鏈356號、357號、370號、399號、409號、439號胺基酸改變之方法不僅是抗體不變區域之次型為IgG4，也適用於IgG1，可用在所有IgG抗體。
【產業上之可利用性】
於本發明之方法之中，由於胺基酸取代數為少數即可，能不使原多肽之構造‧機能(活性)變化而控制組裝，有用性非常高。又，對抗原性之影響也小。
藉由使用本發明之方法，可有效率地得到實際保持活性之雙專一性抗體。
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Claims (10)

  1. 一種多肽變異體之製造方法，係使存在於VH與VL內之界面的胺基酸殘基具有變異而控制多肽組裝，包括(a)於形成2種以上構造異構物之多肽之中，改變存在於VH與VL內之界面的胺基酸殘基的編碼核酸，其係以使不希望之形成1種以上構造異構物之多肽內部組裝受到抑制之方式改變原核酸，(b)培養寄主細胞使該核酸表現，(c)自寄主細胞培養物中回收該多肽，其中該多肽係將2個以上重鏈可變區域及2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽，又其中該步驟(a)之改變係將原核酸置換，使形成界面之2個殘基以上的胺基酸殘基改變為同種之正電荷的方式，其於該界面導入一胺基酸殘基之變異，形成該界面之2個殘基以上之胺基酸殘基為由於重鏈及輕鏈FR2區域上之胺基酸殘基的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組，於此，該胺基酸殘基的群組為由以下(i)與(ii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組：(i)重鏈可變區域上之Kabat編號為39之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為38之胺基酸殘基；(ii)重鏈可變區域上之Kabat編號為45之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為44之胺基酸殘基，其中該導入之胺基酸殘基為選擇自由離胺酸(K)、精胺酸(R)與組胺酸(H)所組成之群組。
  2. 一種異種多聚體(heteromultimer)之製造方法，係使形成多肽間界面之胺基酸殘基具有變異而控制異種多聚體之組裝，包括：(a)於形成2種以上多聚體之異種多聚體之中改變形成多肽間界面之胺基酸殘基的編碼核酸，其係以使不希望之形成1種以上多聚體之多肽間之組裝受抑制之方式改變原核酸，(b)培養寄主細胞使該核酸使表現，(c)自寄主細胞培養物中回收該異種多聚體，其中，該異種多聚體係包含2種以上重鏈可變區域之多重專一性抗體，又其中該步驟(a)之改變係將原核酸置換，使形成界面之2個殘基以上的胺基酸殘基改變為同種之正電荷的方式，其於該界面導入一胺基酸殘基之變異，形成該界面之2個殘基以上之胺基酸殘基為由下述之(1)~(3)所選擇之至少一組之胺基酸殘基的群組：(1)於重鏈及輕鏈FR2區域上之胺基酸殘基的群組，為由以下(i)與(ii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組：(i)重鏈可變區域上之Kabat編號為39之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為38之胺基酸殘基；(ii)重鏈可變區域上之Kabat編號為45之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為44之胺基酸殘基；以及(2)包含於來自人類IgG-型之重鏈CH3領域中之胺基酸殘基的群組，由以下(i)~(iii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基組：(i)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為356及439之胺基酸殘基；(ii)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為357及370之胺基酸殘基；(iii)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為399及409之胺基酸殘基：(3)重鏈CH1區域上之Kabat編號為221之胺基酸殘基與輕鏈CL區域上之Kabat編號為123之胺基酸殘基，其中該導入之胺基酸殘基為選擇自由離胺酸(K)、精胺酸(R)與組胺酸(H)所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之異種多聚體之製造方法，其中該異種多聚體為一雙專一性抗體。
  4. 一種多肽變異體，係改變形成該多肽內界面之胺基酸殘基，以抑制可形成2種以上構造異構物之原來多肽內之不希望之形成1種以上構造異構物之原來多肽內的組裝，其中該多肽係將2個以上重鏈可變區域及2個以上輕鏈可變區域以連接子結合之單鏈多肽，又其中形成該多肽內之界面之胺基酸殘基的改變，為形成界面之2個殘基以上的胺基酸殘基以同種之正電荷之方式將於該界面中之胺基酸殘基置換，形成該界面之2個殘基以上之胺基酸殘基為由於重鏈及輕鏈FR2區域上之胺基酸殘基的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組，於此，該胺基酸殘基的群組為由以下(i)與(ii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組：(i)重鏈可變區域上之Kabat編號為39之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為38之胺基酸殘基；(ii)重鏈可變區域上之Kabat編號為45之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為44之胺基酸殘基，其中該導入之胺基酸殘基為選擇自由離胺酸(K)、精胺酸(R)與組胺酸(H)所組成之群組。
  5. 一種異種多聚體，係改變形成該多肽間界面之胺基酸殘基，以抑制可形成2種以上多聚體之原來多肽間之不希望之形成1種以上多聚體之原來多肽的組裝，其中該異種多聚體係包含2種以上重鏈可變區域之多重專一性抗體，又其中形成該多肽間之界面之胺基酸殘基的改變，為形成界面之2個殘基以上的胺基酸殘基以同種之正電荷之方式將於該界面中之胺基酸殘基置換，形成該界面之2個殘基以上之胺基酸殘基為由顯示於下述之(1)~(3)中之胺基酸殘基之組所選擇之至少一組之胺基酸的組：(1)於重鏈及與輕鏈FR2區域上之胺基酸殘基的群組，為由以下(i)與(ii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基的群組：(i)重鏈可變區域上之Kabat編號為39之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為38之胺基酸殘基；(ii)重鏈可變區域上之Kabat編號為45之胺基酸殘基與輕鏈可變區上之Kabat編號為44之胺基酸殘基；以及(2)包含於來自人類IgG-型之重鏈CH3領域中之胺基酸殘基的群組，由以下(i)~(iii)的群組所選擇之至少1組的胺基酸殘基組：(i)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為356及439之胺基酸殘基；(ii)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為357及370之胺基酸殘基；(iii)包含於重鏈CH3區域之胺基酸殘基，EU編號為399及409之胺基酸殘基：(3)重鏈CH1區域上之Kabat編號為221之胺基酸殘基與輕鏈CL區域上之Kabat編號為123之胺基酸殘基，其中該導入之胺基酸殘基為選擇自由離胺酸(K)、精胺酸(R)與組胺酸(H)所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之異種多聚體，其中該異種多聚體為一雙專一性抗體。
  7. 一種組成物，包含申請專利範圍第4項之多肽變異體或申請專利範圍第5項之異種多聚體，及醫藥上可容許的載體。
  8. 一種核酸，編碼為申請專利範圍第4項之多肽變異體或申請專利範圍第5項之異種多聚體。
  9. 一種寄主細胞，具有申請專利範圍第8項之核酸。
  10. 一種如申請專利範圍第4項之多肽變異體或申請專利範圍第5項之異種多聚體之製造方法，包括：培養申請專利範圍第9項之寄主細胞、自細胞培養物將多肽回收。
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