ES2890669T3

ES2890669T3 - Terapias de combinación con anticuerpos anti-CD38

Info

Publication number: ES2890669T3
Application number: ES15839752T
Authority: ES
Inventors: Henk M Lokhorst; Tuna Mutis; Inger S Nijhof; De Donk Niels W Van
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2022-01-21
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: IL251033A0; EA201790548A1; PH12017500442B1; EP3191187A4; EA035979B1; JP6707531B2; SG11201701867SA; BR112017004614A2; PH12017500442A1; IL251033B; HK1255599A1; KR20170054442A; AU2015315396A1; EP3191187B1; NI201700027A; UA122212C2; EP3191187A2; CN108064182B; JP2017528462A; ZA201702483B

Abstract

Un anticuerpo anti-CD38, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene mieloma múltiple, en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con el anticuerpo anti-CD38 o una combinación de por lo menos un agente quimioterapéutico y el anticuerpo anti-CD38, y en donde el anticuerpo anti-CD38: i) comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR), 1 (HCDR1) , 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de las SEQ ID NO: 6, 7, y 8, respectivamente; ii) comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR), 1 (LCDR1) , 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 9, 10, y 11, respectivamente; iii) induce la destrucción de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); y iv) se administra en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias de combinación con anticuerpos anti-CD38

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a terapias de combinación con anticuerpos anti-CD38 y ácido transretinoico total.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enfermedades malignas de células B incluyen leucemia linfocítica crónica de células B, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, leucemia de células pilosas, linfoma de efusión primario y linfoma no Hodgkin relacionado con el SIDA. Las enfermedades malignas de células B comprenden más del 85% de los linfomas diagnosticados.

El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células B caracterizada por la acumulación latente de células plasmáticas secretoras en la médula ósea con un índice proliferativo bajo y una vida útil prolongada. La enfermedad en última instancia ataca los huesos y la médula ósea, dando como resultado múltiples tumores y lesiones en todo el sistema esquelético. Aproximadamente el 1% de todos los cánceres y un poco más del 10% de todas las enfermedades hematológicas malignas pueden atribuirse al MM. La incidencia de MM aumenta en la población de edad avanzada, con una edad mediana en el momento del diagnóstico de alrededor de 61 años.

La CD38 es una proteína de membrana de tipo II que tiene función en la adhesión y señalización mediadas por receptores, así como en la mediación de la movilización de calcio a través de su actividad ectoenzimática, catalizando la formación de ADP-ribosa cíclica (cADPR) a partir de NAD+ y también hidrolizando cADPR en ADP-ribosa. (ADPR). La CD38 media la secreción de citoquinas y la activación y proliferación de linfocitos (Funaro et al, J Immunology 145:2390-6, 1990; Terhorst et al, Cell 771-80, 1981; Guse et al, Nature 398:70-3, 1999), y a través de su actividad de glucohidrolasa NAD regula los niveles extracelulares de NAD+ que se han implicado en la modulación del compartimento regulador de células T (Adriouch et al, 14:1284-92, 2012; Chiarugi et al, Nature Reviews 12: 741-52, 2012).

La CD38 se expresa en células plasmáticas malignas de MM y está implicada en varias enfermedades malignas hematológicas. De Weers et. al. describe el anticuerpo anti-CD38, daratumumab y que induce la destrucción de tumores de mieloma múltiple y otros hematológicos (De Weers et. al. J Immunology 186:1840-1848, 2011).

Las terapias disponibles actualmente para el MM incluyen quimioterapia, trasplante de células madre, Thalomid® (talidomida), Revlimid® (lenalidomida), Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronato) y Zometa® (ácido zoledrónico). Los protocolos de tratamiento actuales, que incluyen una combinación de agentes quimioterapéuticos como vincristina, BCNU, melfalán, ciclofosfamida, adriamicina y prednisona o dexametasona, producen una tasa de remisión completa de sólo aproximadamente el 5%. La supervivencia mediana es de aproximadamente 36-48 meses desde el momento del diagnóstico. Los avances recientes en el uso de quimioterapia de dosis alta seguido de trasplante autólogo de células mononucleares de sangre periférica o de médula ósea han aumentado la tasa de remisión completa y la duración de la remisión, sin embargo, la supervivencia general solo se ha prolongado ligeramente y no se ha obtenido evidencia de cura. En última instancia, todos los pacientes con MM recaen, incluso bajo terapia de mantenimiento con interferón-alfa (IFN-a) solo o en combinación con esteroides. Por tanto, hay una necesidad de terapias adicionales para el tratamiento de mieloma múltiple y otras enfermedades malignas de células B.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención es un anticuerpo anti-CD38, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene mieloma múltiple, en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con el anticuerpo anti-CD38 o una combinación de por lo menos un agente quimioterapéutico y el anticuerpo anti-CD38, y en donde el anticuerpo anti-CD38:

i) comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR), 1 (HCDR1) , 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de las SEQ ID NO: 6, 7, y 8, respectivamente;

ii) comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR), 1 (LCDR1) , 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 9, 10, y 11, respectivamente;

iii) induce la destrucción de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); y

iv) se administra en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

Otra realización de la invención es una composición farmacéutica para su uso como se define en las reivindicaciones que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención, en donde la composición farmacéutica para el uso indicado comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

La divulgación proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar a un paciente con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1A muestra que el ácido transretinoico total (ATRA) mejora la expresión de CD38 en líneas celulares de mieloma múltiple (MM) de una manera dependiente de la dosis. Las líneas celulares de MM RPMI8226, UM9 y XG1 se incubaron con medio RPMI-1640 solo o con ATRA 0-25 nM durante 48 horas y luego se recogieron para determinar la expresión de CD38 mediante citometría de flujo. El gráfico muestra los resultados de un experimento representativo. El eje Y muestra el aumento de veces de la intensidad fluorescente media (MFI) de la expresión de superficie de CD38.

La Figura 1B muestra que ATRA potencia la expresión de CD38 en líneas celulares de MM de una manera dependiente del tiempo. Las líneas celulares de MM RPMI8226, UM9 y XG1 se incubaron con medio RPMI-1640 solo o con ATRA 10 nM durante 24, 48, 72 o 96 horas y luego se recogieron para determinar la expresión de CD38 mediante citometría de flujo. El gráfico muestra los resultados de un experimento representativo. El eje Y muestra el aumento de veces de la intensidad fluorescente media (MFI) de la expresión de superficie de CD38. La Figura 2 muestra que ATRA potencia la expresión de CD38 en células mononucleares de médula ósea (BM-MNC) de pacientes con MM ex vivo. Se incubaron BM-MNC de 26 pacientes con MM con medio RPMI-1640 solo o con ATRA 10 nM durante 48 horas y luego se recogieron para determinar la expresión de CD38 mediante citometría de flujo. El eje Y muestra el MFI de la expresión de superficie de CD38. Medio: medio a las 0 horas, ns: no significativo. ***p<0,001; ****p <0,0001.

La Figura 3A muestra la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) inducida por daratumumab (panel superior) y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) (panel inferior) en la línea celular de MM XG1 pretratada con o sin ATRA 10 nM durante 48 horas antes de realizar la CDC o ADCC en presencia de 10 pg/ml de daratumumab. El eje Y muestra el porcentaje (%) de CDC o ADCC. Los datos muestran la media y la SEM de por lo menos tres experimentos, los valores de p entre los grupos indicados se calcularon usando una prueba t de Student pareada. Dara: daratumumab; *p<0,05; **p<0,01.

La Figura 3B muestra la CDC (panel superior) y la ADCC (panel inferior) inducidas por daratumumab en la línea celular de MM RPMI8226 pretratada con o sin A^tRA 10 nM durante 48 horas antes de realizar la CDC o ADCC en presencia de 10 pg/ml de daratumumab. El eje Y muestra el porcentaje (%) de CDC o ADCC. Los datos muestran la media y la SEM de por lo menos tres experimentos. Los valores de p entre los grupos indicados se calcularon utilizando una prueba t de Student pareada. Dara: daratumumab; ns: no significativo.

La Figura 3C muestra la CDC (panel superior) y la ADCC (panel inferior) inducidas por daratumumab en la línea celular de MM UM9 pretratada con o sin A^tRA 10 nM durante 48 horas antes de realizar la CDC o ADCC en presencia de 10 pg/ml de daratumumab. El eje Y muestra el porcentaje (%) de CDC o ADCC. Los datos muestran la media y SEM de por lo menos tres experimentos. Los valores de p entre los grupos indicados se calcularon usando una prueba t de Student pareada. Dara: daratumumab; *p<0,05; ns: no significativo.

La Figura 4A muestra que el pretratamiento de células de MM primarias durante 48 horas con ATRA 10 nM potencia la CDC mediada por daratumumab de las células de MM primarias. Las células de MM se pretrataron durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM, como se indica en la Figura, a concentraciones de daratumumab que varían de 0 a 10 pg/ml. El gráfico muestra los resultados agrupados de 16 muestras de pacientes. ***p <0,001, ****p<0,0001. D^aR^a: daratumumab.

La Figura 4B muestra que el pretratamiento de células de MM primarias durante 48 horas con ATRA 10 nM potencia la ADCC mediada por daratumumab de las células de MM primarias. Las células de MM se pretrataron durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM, como se indica en la Figura, a concentraciones de daratumumab que variaban de 0-10 pg/ml. El gráfico muestra los resultados agrupados de 13 muestras de pacientes. *p<0,05. DARA: daratumumab.

La Figura 5A muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 1 y del paciente 2 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 pg/ml.

La Figura 5B muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 3 y del paciente 4 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 pg/ml.

La Figura 5C muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 5 y del paciente 6 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 pg/ml.

La Figura 5D muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 7 y del paciente 8 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 |jg/ml.

La Figura 5E muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 9 y del paciente 10 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 5F muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 11 y del paciente 12 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 5G muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 13 y del paciente 14 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 5H muestra los resultados de CDC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 15 y del paciente 16 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6A muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 3 y del paciente 4 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6B muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 7 y del paciente 8 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6C muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 9 y del paciente 10 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6D muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 14 y del paciente 15 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6E muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 16 y del paciente 17 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1-10 jg/ml.

La Figura 6F muestra los resultados de ADCC in vitro de células de MM primarias aisladas del paciente 18 pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM como se indica en la Figura a concentraciones de daratumumab que varían de 1- 10 pg/ml.

La Figura 7 muestra los niveles de expresión de CD38 en BM-MNC aisladas de pacientes con MM antes y después de la incubación de células con (barras negras) o sin (barras blancas) en presencia de ATRA 10 nM. Se usaron las mismas muestras de pacientes en los ensayos de ADCC y CDC como se muestra en las Figuras 4A, 4B, 5 y 6.

La Figura 8A muestra la reducción inducida por ATRA de la expresión de CD55, CD59 y CD46 en células RPMI8226 después de 48 horas de incubación de las células con ATRA 0-25 nM. MFI; intensidad fluorescente media. La expresión de CD55, CD59 y CD46 se evaluó usando citometría de flujo. Panel superior: MFI; panel inferior: veces de cambio de MFI en comparación con el control.

La Figura 8B muestra la reducción inducida por ATRA de la expresión de CD55, CD59 y CD46 en células UM9 después de 48 horas de incubación de células con ATRA 0-25 nM. MFI; intensidad fluorescente media. La expresión de CD55, CD59 y CD46 se evaluó mediante citometría de flujo. Panel superior: MFI; panel inferior: veces de cambio de MFI en comparación con el control.

La Figura 8C muestra la reducción inducida por ATRA de la expresión de CD55, CD59 y CD46 en células XG1 después de 48 horas de incubación de células con ATRA 0-25 nM. MFI; intensidad fluorescente media. La expresión de CD55, CD59 y CD46 se evaluó mediante citometría de flujo. Panel superior: MFI; panel inferior: veces de cambio de MFI en comparación con el control.

La Figura 9A muestra la reducción inducida por ATRA de la expresión de CD55 en células de MM primarias después de 48 horas de incubación de células con (barras grises) o sin (barras negras) en ATRA 10 nM como se indica. *p = 0,019.

La Figura 9B muestra la reducción inducida por ATRA de la expresión de CD59 en células de MM primarias después de 48 horas de incubación de células con (barras grises) o sin (barras negras) en ATRA 10 nM como se indica. **p = 0,0047.

La Figura 9C muestra el efecto de ATRA sobre la expresión de CD46 en células de MM primarias después de 48 horas de incubación de células con (barras grises) o sin (barras negras) en ATRA 10 nM como se indica, ns: no significativo.

La Figura 10A muestra la expresión de CD55 en células de MM primarias aisladas de 16 pacientes con MM después de 48 horas de incubación de células con (barras negras) o sin (barras blancas) ATRA 10 nM. Se usaron las mismas muestras de pacientes en los ensayos de CDC como se muestra en la Figura 5.

La Figura 10B muestra la expresión de CD59 en células de MM primarias aisladas de 16 pacientes con MM después de 48 horas de incubación de células con (barras negras) o sin (barras blancas) ATRA 10 nM. Se usaron las mismas muestras de pacientes en los ensayos de CDC como se muestra en la Figura 5.

La Figura 10C muestra la expresión de CD46 en células de MM primarias aisladas de 16 pacientes con MM después de 48 horas de incubación de células con (barras negras) o sin (barras blancas) ATRA 10 nM. Se usaron las mismas muestras de pacientes en los ensayos de CDC como se muestra en la Figura 5.

La Figura 11 muestra que ATRA mejora la respuesta a daratumumab en un modelo de ratón de mieloma múltiple humanizado. Se inocularon células XG1 transducidas con luciferasa a ratones Rag2-/-Yc-/- que llevaban andamiajes recubiertos con células madre mesenquimales (MSC). Los ratones se trataron con control, ATRA más PBMC empobrecidas en células T como células efectoras (PBMC-T), daratumumab más PBMC-T, o daratumumab más ATRA más PBMC-T, y se monitorizaron semanalmente mediante imagenología bioluminiscente (BLI) para el crecimiento del células XG1 transducidas. La Figura muestra la carga tumoral por grupo de tratamiento con 4 ratones por grupo y cada ratón con 4 andamiajes. Las diferencias estadísticas entre los ratones tratados con daratumumab y los ratones tratados con daratumumab más ATRA se calcularon usando la prueba U de Mann-Whitney. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; ns: no significativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

"CD38" se refiere a la proteína CD38 humana (sinónimos: ADP-ribosil ciclasa 1, cADPr hidrolasa 1, ADP-ribosa hidrolasa 1 cíclica). La ^cD38 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

"Anticuerpos", como se usa en la presente, se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos diméricos, tetraméricos o multiméricos y anticuerpos de cadena sencilla.

Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente kappa (^k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

"Fragmentos de anticuerpos" como se usa en la presente se refiere a una porción de una molécula de inmunoglobulina que retiene el sitio de unión al antígeno de la cadena pesada y/o la cadena ligera, como las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3, las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, una región variable de cadena pesada (VH) o una región variable de cadena ligera (VL). Los fragmentos de anticuerpos incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHI; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHI; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste de un dominio VH. Los dominios VH y VL pueden modificarse y enlazarse entre sí mediante un conector sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios VH/VL se emparejan intramolecularmente, o intermolecularmente en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante constructos de anticuerpos de cadena sencilla separados, para formar un sitio de unión al antígeno monovalente, como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descritos por ejemplo en las Publicaciones de Patente Internacional N° WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 y WO1992/01047. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos de longitud completa.

"Anticuerpo aislado" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a CD38). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD38 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, como ortólogos de CD38 humana, como CD38 de Macaca fascicularis (cynomolgus). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

Una región variable de anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando varios términos: Regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3) se refieren a las regiones de dominios variables de un anticuerpo que son de estructura hipervariable como lo definen Chothia y Lesk (Chothia y Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) y “Specificity Determining Residue Usage” (SDRU) (Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004). La base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y una definición estandarizadas de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre las delineaciones de CDR, HV e IMGT se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.

"Residuos de Chothia", como se usa en la presente, son los residuos de VL y VH del anticuerpo numerados de acuerdo con Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).

El "marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distintas de las definidas como sitios de unión al antígeno.

"Anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que los sitios de unión al antígeno se derivan de especies no humanas y los marcos de la región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir sustituciones en el marco de tal manera que el marco puede no ser una copia exacta de la inmunoglobulina humana o las secuencias génicas de la línea germinal expresadas.

Anticuerpos "adaptados a humanos" o anticuerpos "adaptados al marco humano (HFA)" se refieren a anticuerpos humanizados adaptados de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0118127. Los anticuerpos adaptados a humanos se humanizan seleccionando los marcos humanos aceptores basándose en las similitudes máximas de CDR y FR, compatibilidades de longitud y similitudes de secuencia de los lazos de CDR1 y CDR2 y una parte de los lazos de CDR3 de cadena ligera.

"Anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de cadena ligera y pesada en las que tanto el marco como los sitios de unión al antígeno se derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de origen humano.

Un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que se "derivan de" secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. Tales sistemas incluyen bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana presentadas en fagos y animales transgénicos no humanos como ratones que portan loci de inmunoglobulina humana como se describe en la presente. Un anticuerpo humano puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara con la línea germinal humana o secuencias de inmunoglobulina reorganizadas debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o la introducción intencionada de sustituciones en el marco o sitios de unión al antígeno. Típicamente, un anticuerpo humano es por lo menos aproximadamente un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por una línea germinal humana o un gen de inmunoglobulina reordenado. En algunos casos, un anticuerpo humano puede contener secuencias marco de consenso derivadas de análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000), o HCDR3 sintética incorporadas en bibliotecas génicas de inmunoglobulina humana presentadas en fagos, como se describe en, por ejemplo, Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462). Los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de una especie no humana no se incluyen en la definición de anticuerpo humano.

Los anticuerpos humanizados aislados pueden ser sintéticos. Los anticuerpos humanos pueden generarse usando sistemas como la presentación de fagos que incorporan CDR sintéticas y/o marcos sintéticos, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos.

"Anticuerpo recombinante" como se usa en la presente incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos (se describe más adelante a continuación), anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN, o anticuerpos que se generan in vitro usando intercambio de brazos Fab como anticuerpos biespecíficos.

"Anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión a través de su VH, VL y/o pareja de VH/VL y afinidad por un epítopo particular, o en el caso de un anticuerpo monoclonal biespecífico, una especificidad de unión dual para dos epítopos distintos.

"Epítopo" como se usa en la presente se refiere a una porción de un antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos habitualmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrófobas) de fracciones como aminoácidos o cadenas laterales de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto de aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo discontiguo, los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se acercan en un espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína.

"Variante" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia en una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.

"En combinación con" significa que pueden administrarse dos o más agentes terapéuticos a un sujeto juntos en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.

"Sinergia", "sinergismo" o "sinérgico" significan más que el efecto aditivo esperado de una combinación. "En combinación con", como se usa en la presente, significa que pueden administrarse dos o más agentes terapéuticos a un sujeto juntos en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico en donde el objeto es ralentizar (disminuir) un cambio o enfermedad fisiológica no deseada, o proporcionar un resultado clínico beneficioso o deseado durante el tratamiento, como el desarrollo, crecimiento o propagación de tumores o células tumorales. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no estaba recibiendo tratamiento. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos sujetos que ya tienen el cambio fisiológico o la enfermedad no deseadas así como aquellos sujetos propensos a tener el cambio fisiológico o la enfermedad.

"Inhibe el crecimiento" (por ejemplo, en referencia a células, como células tumorales) se refiere a una disminución medible en el crecimiento celular in vitro o in vivo cuando se pone en contacto con un agente terapéutico o una combinación de agentes terapéuticos o fármacos en comparación con el crecimiento de las mismas células cultivadas en condiciones de control apropiadas bien conocidas por los expertos en la técnica. La inhibición del crecimiento de una célula in vitro o in vivo puede ser de por lo menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 100%. La inhibición del crecimiento celular puede producirse mediante una variedad de mecanismos, por ejemplo por toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), apoptosis, necrosis o por inhibición de la proliferación celular.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de un agente terapéutico o una combinación de agentes terapéuticos para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los indicadores ejemplares de un agente terapéutico o una combinación de agentes terapéuticos eficaz que incluyen, por ejemplo, bienestar mejorado del paciente, reducción de una carga tumoral, crecimiento detenido o ralentizado de un tumor y/o ausencia de metástasis de células cancerosas a otros lugares del cuerpo.

Se proporcionan métodos para tratar pacientes que tienen una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 con la combinación de un anticuerpo CD38 y ácido transretinoico total (ATRA). La invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que ATRA aumenta la lisis mediada por daratumumab del anticuerpo anti-CD38 por ADCC y/o CDC de células de MM primarias que expresan niveles bajos, intermedios o altos de CD38 mejorando la expresión de CD38 en células de MM. ATRA también es capaz de inducir la ADCC y/o CDC mediadas por daratumumab en muestras primarias de MM que eran resistentes a CDC y/o ADCC mediadas por daratumumab in vitro o que se obtuvieron de pacientes con mieloma múltiple muy pretratados que tenían enfermedad refractaria doble (refractaria a lenalidomida y bortezomib). ATRA aumentó la CDC mediada por daratumumab en mayor medida que ADCC, lo que puede explicarse por los descubrimientos de que ATRA también regula por disminución las proteínas inhibidoras del complemento CD55 y CD59.

ATRA (CAS 302-79-4) tiene una estructura molecular bien conocida.

Un caso de la divulgación proporcionada en la presente, que incluye las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

Un caso de la divulgación proporcionada en la presente, que incluye las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

El anticuerpo anti-CD38 de la invención puede usarse para tratar un sujeto animal que pertenezca a cualquier clasificación. Los ejemplos de tales animales incluyen mamíferos como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.

En algunas realizaciones de la invención divulgada en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas que se enumeran a continuación, el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de las células que expresan CD38 mediante CDC in vitro.

"Enfermedad maligna hematológica positiva para CD38" se refiere a una enfermedad maligna hematológica caracterizada por la presencia de células tumorales que expresan CD38, incluyendo leucemias, linfomas y mieloma. Ejemplos de tales enfermedades malignas hematológicas positivas para CD38 son leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras y linfoma no Hodgkin de células B, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda y neoplasias de células B maduras, como leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL) incluyendo FL de grado bajo, intermedio y alto, linfoma cutáneo del centro del folículo, linfoma de células B de la zona marginal (tipo MALT, tipo ganglionar y esplénico), leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), linfoma de Burkitt (BL), plasmocitoma, mieloma múltiple (MM), leucemia de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemias de células plasmáticas y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).

La CD38 se expresa en una variedad de enfermedades hematológicas malignas, incluyendo mieloma múltiple, leucemias y linfomas, como leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia linfocítica aguda de células T y B, macroglobulinemia de Waldenstrom, amiloidosis sistémica primaria, linfoma de células del manto, leucemia prolinfocítica/mielocítica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande (LGL), leucemia de células NK y leucemia de células plasmáticas. La expresión de CD38 se ha descrito en células epiteliales/endoteliales de diferente origen, incluyendo el epitelio glandular en la próstata, las células de los islotes en el páncreas, el epitelio ductal en las glándulas, incluyendo la glándula parótida, las células epiteliales bronquiales, las células en los testículos y el ovario y el epitelio tumoral en el adenocarcinoma colorrectal. Otras enfermedades, donde podría estar implicada la expresión de CD38 incluyen, por ejemplo, carcinomas broncoepiteliales del pulmón, cáncer de mama (que evoluciona a partir de la proliferación maligna del revestimiento epitelial en los conductos y lóbulos de la mama), tumores pancreáticos, que evolucionan a partir de las células p (insulinomas), tumores que evolucionan a partir del epitelio en el intestino (por ejemplo, adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas), carcinoma en la glándula prostática y seminomas en cánceres de testículo y ovario. En el sistema nervioso central, los neuroblastomas expresan CD38.

En todas las realizaciones de la invención divulgada en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es mieloma múltiple.

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es linfoma difuso de células B grandes (DLBCL).

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es un linfoma no Hodgkin.

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es leucemia linfoblástica aguda (ALL).

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es linfoma folicular (FL).

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es el linfoma de Burkitt (BL).

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es linfoma de células del manto (MCL).

En un caso de la divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de Burkitt (BL), linfoma folicular (FL) o linfoma de células del manto (MCL).

Los ejemplos de linfomas de células B no Hodgkin son granulomatosis linfomatoide, linfoma de efusión primario, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma mediastínico de células B grandes, enfermedades de la cadena pesada (incluidas enfermedad de ^y, H y a), linfomas inducidos por terapia con agentes inmunosupresores, como linfoma inducido por ciclosporina y linfoma inducido por metotrexato.

En un caso de la presente divulgación, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el trastorno que implica células que expresan CD38 es el linfoma de Hodgkin.

Otros ejemplos de trastornos que implican células que expresan CD38 incluyen enfermedades malignas derivadas de células T y NK, incluyendo neoplasias de células T y células NK maduras, incluyendo leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica granular grande de células T, leucemia de células NK agresiva, leucemia/linfoma de células T adultas, linfoma extraganglionar de células NK/T, linfoma de células T de tipo enteropatía, tipo nasal, linfoma de células T hepatoesplénico, linfoma de células T subcutáneo tipo paniculitis, linfoma blástico de células NK, micosis fungoide/síndrome de Sezary, trastornos linfoproliferativos de células T positivos para CD30 cutáneos primarios (linfoma cutáneo primario anaplásico de células grandes C-ALCL, papulosis linfomatoide, lesiones limítrofes), linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma periférico de células T no especificado y linfoma anaplásico de células grandes.

Los ejemplos de enfermedades malignas derivadas de células mieloides incluyen leucemia mieloide aguda, incluyendo la leucemia promielocítica aguda, y enfermedades mieloproliferativas crónicas, incluyendo la leucemia mieloide crónica.

Puede usarse cualquier anticuerpo anti-CD38 en los métodos como se divulga en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte in vitro de células que expresan CD38 mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Las regiones variables de los anticuerpos anti-CD38 pueden obtenerse de anticuerpos anti-CD38 existentes y clonarse como anticuerpos de longitud completa o en varios formatos y fragmentos de anticuerpos usando métodos estándar. Las regiones variables de anticuerpos ejemplares que se unen a CD38 que pueden usarse se describen en las Publicaciones de Patente Internacional N° W005/103083, WO06/125640, WO07/042309, WO08/047242, WO12/092612, WO06/099875 y WO11/154453A1.

Un anticuerpo anti-CD38 ejemplar que puede usarse es el daratumumab. El daratumumab comprende secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) mostradas en la SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente, las CDR de cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y es del subtipo IgG1/K y se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.829.693. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de daratumumab se muestra en la SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 1

MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGT

T KREPET VL ARC V K Y T EIHPEMRH V DC QS V W D AFKGAFIS KHPCNITEED Y QPLM

KLGTQT V PCNK1LLWS RIKDL AH QFT Q V QRD MFT LEDT LLG Y LADDLT WCGEEN

TSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDK

NSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSC

KNTYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI SEQ ID NO: 2

SKRNIQFSCKNIYR SEQ ID NO: 3

EKVQTLEAWVIHGG

SEQ ID NO: 4

E V QLLESGGGL V QPGGSLRLSC A V SGFTFN SFAMS W VRQAPGKGLEWV S A

is g s g g g t y y a d s v k g r e t is r d n s k n t l y l q m n s l r a e d t a v y f c a k .d k ILWFGEP VFD Y W GQGTLVT V S S

SEQ ID NO: 5

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQ

GTKVEIK

SEQ ID NO: 6

SFAMS SEQ ID NO: 7

AISGSGGGTYYADSVKG SEQ ID NO: 8

DKILWFGEPVFDY SEQ ID NO: 9

RASQSVSSYLA SEQ ID NO: 10

DASNRAT SEQ ID NO: 11

QQRSNWPPTF

SEQ ID NO: 12

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPCKGLEWVSAISGSG

GGTYYADSVKGRFTTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVF

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYT QKSL SLSPGK SEQ ID NO: 13

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFT LTIS SLEPEDFAV Y YCQQRS N WPPTFGQGT K VEIKRT V AAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Otro anticuerpo anti-CD38 ejemplar que puede usarse es mAb003 que comprende las secuencias de VH y VL de las SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente, y se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.829.693. La VH y la VL de mAb003 pueden expresarse como IgG1/K.

SEQ ID NO: 14

Q V QL V QSGAE V KKPGSS V K V SCK ASGGT FSS Y AFS W V RQAPGQGLE W MGR VIPF LGIANS AQKFQGRVTIT ADKSTST AY MDLSSLRSEDTAVYYCARDDIAALGPFDYWGQGTLVTVSSAS

SEQ ID NO: 15

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVE1K

Otro anticuerpo anti-CD38 ejemplar que puede usarse es mAb024 que comprende las secuencias de VH y VL de las SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente, descrito en la Patente de Estados Unidos N° 7.829.693. La VH y la VL de mAb024 pueden expresarse como IgG1/K.

SEQ ID NO: 16

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPH DSDARYSPSFQGQVTFSADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARHVGWGSRYWYFDLWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO: 17

El V LTQS P AT LSL SPGER AT LSCRASQS V SS Y L AW Y QQKPGQAPRLLIYD ASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK

Otro anticuerpo anti-CD38 ejemplar que puede usarse es MOR-202 (MOR-03087) que comprende las secuencias de VH y VL de las SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente, descrito en la Patente de Estados Unidos N° 8.088.896. La VH y la VL de MOR-202 pueden expresarse como IgG1/K.

SEQ ID NO: 18

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGD PSNTYYADSV KGRFTIS RDN SKNTL Y LQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 19

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPS GIPERF SGS NS GN T AT LTISGT QAE DEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ

Otro anticuerpo anti-CD38 ejemplar que puede usarse es isatuximab, que comprende las secuencias de VH y VL de las SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente, descrito en la Patente de Estados Unidos N° 8.153.765. La VH y la VL de isatuximab pueden expresarse como IgG1/K.

SEQ ID NO: 20

Q V QL V QSGAEV AKPGTS VKLSCK ASG YTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGT

IYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGD

YYGSNSLDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 21

DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYS

ASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGG

GTKLEIK

Otros anticuerpos anti-CD38 ejemplares que pueden usarse en los métodos de la divulgación incluyen los descritos en la Publicación de Patente Internacional N° WO05/103083, Publicación de Patente Internacional N° WO06/125640, Publicación de Patente Internacional N° WO07/042309, Publicación de Patente Internacional N° WO08/047242 o la Publicación de Patente Internacional N° WO14/178820.

Los anticuerpos anti-CD38 usados en los métodos divulgados en la presente, inluyendo las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, también pueden seleccionarse de novo de una biblioteca de presentación de fagos, donde el fago se modifica para expresar inmunoglobulinas humanas o porciones de las mismas como Fabs, anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o regiones variables de anticuerpos no emparejadas o emparejadas (Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84, 2001; Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996; Sheets et al., PITAS (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom y Winter, J Mol Biol 227:381, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222:581, 1991). Los dominios variables de unión a CD38 pueden aislarse, por ejemplo, de bibliotecas de presentación de fagos que expresan regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos como proteínas de fusión con la proteína de la cubierta del bacteriófago pIX como se describe en Shi et al (2010). J. Mol. Biol. 397:385-96 y la Publicación Internacional de PCT N° WO09/085462). Las bibliotecas de anticuerpos pueden cribarse para determinar la unión al dominio extracelular de CD38 humana, los clones positivos obtenidos caracterizarse adicionalmente, los Fab aislarse de los lisados de clones y posteriormente clonarse como anticuerpos de longitud completa. Tales métodos de presentación de fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Ver, por ejemplo: Patente de Estados Unidos N° 5.223.409, Patente de Estados Unidos N° 5.403.484, y Patente de Estados Unidos N° 5.571.698, Patente de Estados Unidos N° 5.427.908, Patente de Estados Unidos N° 5.580.717, Patente de Estados Unidos N° 5.969.108, Patente de Estados Unidos N° 6.172.197, Patente de Estados Unidos N° 5.885.793, Patente de Estados Unidos N° 6.521.404, Patente de Estados Unidos N° 6.544.731, Patente de Estados Unidos N° 6.555.313, Patente de Estados Unidos N° 6.582.915 y Patente de Estados Unidos N° 6.593.081.

La porción Fc del anticuerpo puede mediar en funciones efectoras de anticuerpos como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Tales funciones pueden estar mediadas por la unión de un dominio o dominios efectores de Fc a un receptor de Fc en una célula inmunitaria con actividad fagocítica o lítica o mediante la unión de un dominio o dominios efectores de Fc a componentes del sistema del complemento. Normalmente, el efecto o efectos mediados por las células de unión a Fc o los componentes del complemento dan como resultado la inhibición y/o el agotamiento de las células objetivo, por ejemplo, las células que expresan CD38. Los isotipos IgG humanos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 muestran una capacidad diferencial para las funciones efectoras. La ADCC puede estar mediada por IgG1 e IgG3, la ADCP puede estar mediada por IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la CDC puede estar mediada por IgG1 e IgG3.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 es de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 es de isotipo IgG1 o IgG3.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte in vitro de células que expresan CD38 por ADCC.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte in vitro de células que expresan CD38 por CDC.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 por ADCC y CDC in vitro.

"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" es un mecanismo para inducir la muerte celular que depende de la interacción de las células objetivo recubiertas de anticuerpos con las células efectoras que poseen actividad lítica, como la células asesinas naturales, monocitos, macrófagos y neutrófilos a través de receptores Fc gamma (F^cyR) expresados en células efectoras. Por ejemplo, las células NK expresan FcYRIIIa, mientras que los monocitos expresan F^cyRI, F^cyRII y FcYRIIIa. La muerte de la célula objetivo recubierta de anticuerpo, como las células que expresan CD38, se produce como resultado de la actividad de la célula efectora a través de la secreción de proteínas y proteasas formadoras de poros de la membrana. Para evaluar la actividad de ADCC de un anticuerpo anti-CD38 in vitro, el anticuerpo puede añadirse a células que expresan CD38 en combinación con células efectoras inmunes, que pueden activarse por los complejos antígeno-anticuerpo dando como resultado la citólisis de la célula objetivo. La citólisis generalmente se detecta mediante la liberación de un marcador (por ejemplo, sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Por ejemplo, para el ensayo pueden usarse células primarias de BM-MNC aisladas de un paciente con una enfermedad maligna de células B, como MM. En un ensayo ejemplar, las BM-MNC pueden tratarse con un anticuerpo anti-CD38 durante 1 hora a una concentración de 0,3-10 pg/ml, y la supervivencia de células de MM CD138+ primarias puede determinarse mediante citometría de flujo usando técnicas descritas en van der Veer et al., Haematologica 96:284-290, 2001 o en van der Veer et al., Blood Cancer J 1(10):e41, 2011. El porcentaje de la lisis de células de MM puede determinarse con respecto a un control de isotipo como se describe en la presente. Los anticuerpos anti-CD38 de la invención pueden inducir la ADCC en aproximadamente un 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de control.

"Citotoxicidad dependiente del complemento", o "CDC", se refiere a un mecanismo para inducir la muerte celular en el que un dominio efector de Fc de un anticuerpo unido al objetivo se une y activa el componente del complemento C1q, que a su vez activa la cascada del complemento lo que lleva a la muerte de la célula objetivo. La activación del complemento también puede dar como resultado el depósito de componentes del complemento en la superficie de la célula objetivo que facilitan la ADCC al unirse a los receptores del complemento (por ejemplo, CR3) en los leucocitos. En un ensayo ejemplar, las células BM-MNC primarias aisladas de un paciente con una enfermedad maligna de células B pueden tratarse con un anticuerpo anti-CD38 y un complemento derivado de suero humano agrupado al 10% durante 1 hora a una concentración de 0,3-10 pq/ml, y la supervivencia de células de MM CD138+ primarias puede determinarse mediante citometría de flujo usando técnicas descritas en van der Veer et al., Haematologica 96:284-290, 2011; van der Veer et al., Blood Cancer J 1(10):e41, 2011. El porcentaje de lisis de células de MM puede determinarse con respecto a un control de isotipo como se describe en la presente. Los anticuerpos anti-CD38 de la invención pueden inducir la CDC en aproximadamente un 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.

La capacidad de los anticuerpos monoclonales para inducir la ADCC puede potenciarse modificando su componente oligosacárido. Las IgG1 o IgG3 humanas están N-glicosiladas en Asn297 con la mayoría de los glicanos en las formas biantenarias G0, G0F, G1, G1F, G2 o G2F bien conocidas. Los anticuerpos producidos por células de CHO no modificadas típicamente tienen un contenido de fucosa de glicano de aproximadamente por lo menos el 85%. La eliminación de la fucosa del núcleo de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc potencia la ADCC de los anticuerpos mediante la unión mejorada de FcYRIIIa sin alterar la unión al antígeno o la actividad de CDC. Tales anticuerpos pueden lograrse usando diferentes métodos que se ha informado que llevan a la expresión de anticuerpos defucosilados relativamente altos que portan el tipo de complejo biantenario de oligosacáridos Fc, como el control de la osmolalidad del cultivo (Konno et al. Cytotechnology 64:249-65, 2012), aplicación de una línea de CHO variante Lec13 como línea celular huésped (Shields et al., J Biol Chem 277:26733-40, 2002), aplicación de una línea de CHO variante EB66 como línea celular huésped (Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Publicación electrónica antes de la impresión; PMID: 20562582), aplicación de una línea celular de hibridoma de rata YB2/0 como línea celular huésped (Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003), introducción de ARN interferente pequeño específicamente contra el gen de a 1,6-fucosiltrasferasa (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng88:901-908, 2004), o coexpresión de p-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III y a-manosidasa II de Golgi o un inhibidor de alfa-manosidasa I potente, kifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008). La ADCC provocada por los anticuerpos anti-CD38 de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, también puede potenciarse mediante ciertas sustituciones en el anticuerpo Fc. Las sustituciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones en las posiciones de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 (numeración de residuos de acuerdo con el índice EU) como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.737.056. La CDC provocada por los anticuerpos anti-CD38 de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, también puede potenciarse mediante ciertas sustituciones en el anticuerpo Fc. Las sustituciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones en las posiciones de aminoácidos 423, 268, 267 y/o 113 (numeración de residuos de acuerdo con el índice EU) como se describe en Moore et al., Mabs 2:181-189, 2010.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, los anticuerpos anti-CD38 comprenden una sustitución en el anticuerpo Fc.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, los anticuerpos anti-CD38 comprenden una sustitución en el anticuerpo Fc en las posiciones de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 y/o 430 (numeración de residuos de acuerdo con el índice EU).

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, los anticuerpos anti-CD38 comprenden una sustitución en el anticuerpo Fc en la posición de aminoácidos 113, 267, 268 y/o 423 (numeración de residuos de acuerdo con el índice EU).

Otra realización de la invención, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 compite por unirse a CD38 con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 5 (daratumumab).

Otra realización de la invención, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total. (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde el anticuerpo anti-CD38 compite por unirse a CD38 con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 5 (daratumumab).

Los anticuerpos pueden evaluarse para determinar su competencia con daratumumab que tiene la VH de la SEQ ID NO: 4 y la VL de la SEQ ID NO: 5 para la unión a CD38 usando métodos in vitro bien conocidos. En un método ejemplar, las células de CHO que expresan CD38 de manera recombinante pueden incubarse con daratumumab no marcado durante 15 min a 4° C, seguido de incubación con un exceso de anticuerpo de prueba marcado fluorescentemente durante 45 min a 4° C. Después de lavar en PBS/BSA, la fluorescencia puede medirse mediante citometría de flujo usando métodos estándar. En otro método ejemplar, la porción extracelular de CD38 humana puede recubrirse sobre la superficie de una placa ELISA. Puede añadirse un exceso de daratumumab no marcado durante aproximadamente 15 minutos y posteriormente pueden añadirse anticuerpos de prueba biotinilados. Después de los lavados en PBS/Tween, la unión de los anticuerpos biotinilados de prueba puede detectarse usando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y la señal detectarse usando métodos estándar. Es evidente que en los ensayos de competición, el daratumumab puede estar marcado y el anticuerpo de prueba no marcado. El anticuerpo de prueba compite con daratumumab cuando daratumumab inhibe la unión del anticuerpo de prueba, o el anticuerpo de prueba inhibe la unión de daratumumab en un 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. El epítopo del anticuerpo de prueba puede definirse adicionalmente, por ejemplo, mediante mapeo de péptidos o ensayos de protección de hidrógeno/deuterio usando métodos conocidos.

Otra realización de la invención divulgada en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un anticuerpo anti-CD38, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello el anticuerpo anti-CD38 que se une a la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1) en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

Otra realización de la invención divulgada en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, es un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 que se une a la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1) en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El anticuerpo "se une a la región SKRNIQFSCKNIYR (Se Q ID NO: 2) y la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3)" cuando el anticuerpo se une por lo menos a un residuo de aminoácido dentro de cada región. El anticuerpo puede unirse, por ejemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de aminoácidos dentro de cada región de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. El anticuerpo también puede unirse opcionalmente a uno o más residuos fuera de las regiones de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. La unión puede evaluarse mediante métodos conocidos como estudios de mutagénesis o resolviendo la estructura cristalina de CD38 en un complejo con el anticuerpo. En algunas realizaciones divulgadas en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el epítopo del anticuerpo comprende por lo menos un aminoácido en la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y por lo menos un aminoácido en la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID ⁿO: 1). En algunas realizaciones divulgadas en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el epítopo del anticuerpo comprende por lo menos dos aminoácidos en la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y por lo menos dos aminoácidos en la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID ⁿO: 1). En algunas realizaciones divulgadas en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el epítopo del anticuerpo comprende por lo menos tres aminoácidos en la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y por lo menos tres aminoácidos en la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones divulgadas en la presente, incluyendo en las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 se une a un epítopo que comprende por lo menos KRN en la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y que comprende por lo menos VQLT (SEQ ID NO: 22) en la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 se une a un epítopo que comprende por lo menos KRN en la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y que comprende por lo menos VQLT (SEQ ID NO: 22) en la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1).

Un anticuerpo ejemplar que se une a la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1) o mínimamente a los residuos KRN y VQLT (SEQ ID NO: 22) como se ha mostrado anteriormente es daratumumab que tiene ciertas secuencias VH, VL y CDR como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos que se unen a la región SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO: 2) y la región EKVQTLEAWVIHGG (SEQ ID NO: 3) de CD38 humana (SEQ ID NO: 1) pueden generarse, por ejemplo, inmunizando ratones con péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 2 y 3 usando métodos estándar y como se describe en la presente. Los anticuerpos pueden evaluarse adicionalmente, por ejemplo, ensayando la competencia entre daratumumab y un anticuerpo de prueba para la unión a CD38 como se ha descrito anteriormente.

En los métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 puede unirse a CD38 humana con un intervalo de afinidades (K^d). En una realización de acuerdo con la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 se une a CD38 con alta afinidad, por ejemplo, con una K^digual o menor de aproximadamente 10-7 M, como aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 x 10-8 M, 1x10-9 M, aproximadamente 1x10-10 M, aproximadamente 1x10-11 M, aproximadamente 1x10-12 M, aproximadamente 1x10-13 M, aproximadamente 1x10-14 M, aproximadamente 1x10-15 M o cualquier intervalo o valor en los mismos, como se determina mediante resonancia de plasmones de superficie o el método Kinexa, como se pone en práctica por los expertos en la técnica. Una afinidad ejemplar es igual o menor de 1x10-88 M. Otra afinidad ejemplar es igual o menor de 1x10-9 M.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 tiene una estructura de glicano biantenario con un contenido de fucosa de aproximadamente entre el 0% y aproximadamente el 15%, por ejemplo el 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0%.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 tiene una estructura de glicano biantenario con un contenido de fucosa de aproximadamente el 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2 %, 1% o 0%.

Las sustituciones en el Fc y el contenido reducido de fucosa pueden potenciar la actividad de ADCC del anticuerpo anti-CD38.

"Contenido de fucosa" se refiere a la cantidad de monosacárido de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa relacionadas con todas las glicoestructuras. Las glicoestructuras pueden caracterizarse y cuantificarse mediante múltiples métodos, por ejemplo: 1) usando MALDI-TOF de una muestra tratada con N-glicosidasa F (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y oligo- y con alto contenido de manosa) como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2008/077546; 2) por liberación enzimática de los glicanos Asn297 con derivatización posterior y detección/cuantificación por HPLC (UPLC) con detección de fluorescencia y/o HPLC -MS (UPLC -MS); 3) análisis de proteínas intactas del mAb nativo o reducido, con o sin tratamiento de los glicanos Asn297 con Endo S u otra enzima que escinde entre el primer y el segundo monosacáridos de GlcNAc, dejando la fucosa unida al primer GlcNAc; 4) digestión del mAb a péptidos constituyentes mediante digestión enzimática (por ejemplo, tripsina o endopeptidasa Lys-C), y posterior separación, detección y cuantificación por HPLC-MS (UPLC-MS); o 5) separación de los oligosacáridos del mAb de la proteína del mAb por desglicosilación enzimática específica con PNGasa F en Asn 297. Los oligosacáridos liberados pueden marcarse con un fluoróforo, separarse e identificarse mediante diversas técnicas complementarias que permiten una caracterización fina de las estructuras de glicanos mediante espectrometría de masas por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) por comparación de las masas experimentales con las masas teóricas, determinación del grado de sialilación mediante HPLC de intercambio iónico (GlycoSep C), separación y cuantificación de las formas de oligosacáridos de acuerdo con los criterios de hidrofilicidad mediante HPLC de fase normal (GlycoSep N), y separación y cuantificación de los oligosacáridos mediante fluorescencia inducida por láser-electroforesis capilar de altor rendimiento (HPCE-LIF).

"Fucosa baja" o "bajo contenido de fucosa", como se usa en la solicitud, se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de aproximadamente el 0%-15%.

"Fucosa normal" o "contenido de fucosa normal" como se usa en la presente se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de aproximadamente más del 50% o, típicamente aproximadamente más del 60%, 70%, 80% o más del 85%.

El anticuerpo de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de la SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.

El anticuerpo de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, también comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente.

El anticuerpo de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, comprende por lo tanto las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (hCd R) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente y las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 4 y la región variable de la cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 5.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 13.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 14 y la región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 15.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 16 y la región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 17.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 18 y la región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 19.

En algunos métodos descritos en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 20 y la región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 21.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de la SEQ ID NO: 13.

Los anticuerpos que son sustancialmente idénticos al anticuerpo que comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 13 pueden usarse en los métodos divulgados en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación. El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo que se están comparando son idénticas o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo que no afectan adversamente a las propiedades de los anticuerpos. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante una alineación por pares usando la configuración predeterminada del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secuencias de proteínas de los anticuerpos de la presente invención pueden usarse como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patentes para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Los programas ejemplares usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), o el paquete GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) usando la configuración predeterminada. Las sustituciones ejemplares que pueden realizarse en los anticuerpos anti-CD38 de la invención son, por ejemplo, sustituciones conservadoras con un aminoácido que tiene características estereoquímicas, hidrófobas o de carga similares. También pueden realizarse sustituciones conservadoras para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo la estabilidad o la afinidad, o para mejorar las funciones efectoras del anticuerpo. Pueden realizarse, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 sustituciones de aminoácidos, en la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-CD38. Además, cualquier residuo nativo en la cadena pesada o ligera también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de exploración de alanina (MacLennan et al, Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998; Sasaki et al, Adv Biophys 35:1-24, 1998). Los expertos en la técnica pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas en el momento en que se deseen tales sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis por PCR (Patente de Estados Unidos N° 4.683.195). Pueden generarse bibliotecas de variantes usando métodos bien conocidos, por ejemplo, usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) y cribando las bibliotecas en busca de variantes con las propiedades deseadas. Las variantes generadas pueden probarse para determinar su unión a CD38, su capacidad para inducir ADCC, ADCP o apoptosis in vitro usando métodos descritos en la presente.

En algunas realizaciones, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el anticuerpo anti-CD38 es un anticuerpo biespecífico. Las regiones VL y/o VH de los anticuerpos anti-CD38 existentes o las regiones VL y VH identificadas de novo como se ha descrito anteriormente pueden modificarse en anticuerpos biespecíficos de longitud completa. Tales anticuerpos biespecíficos pueden elaborarse modulando las interacciones de CH3 entre las dos cadenas pesadas de anticuerpos monoespecíficos para formar anticuerpos biespecíficos usando tecnologías como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 7.695.936; Publicación de Patente Internacional N° WO04/111233; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0015133; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2007/0287170; Publicación de Patente Internacional N° WO2008/119353; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0182127; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0286374; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0123532; Publicación de Patente Internacional N° WO2011/131746; Publicación de Patente Internacional N° WO2011/143545; o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2012/0149876. Estructuras biespecíficas adicionales en las que pueden incorporarse las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, inmunoglobulinas de dominio variable dual (Publicación de Patente Internacional N° WO2009/134776), o estructuras que incluyen varios dominios de dimerización para conectar los dos brazos de anticuerpos con diferente especificidad, como dominios de dimerización de colágeno o cremallera de leucina (Publicación de Patente Internacional N° WO2012/022811, Patente de Estados Unidos N° 5.932.448; Patente de Estados Unidos N° 6.833.441).

Otro caso de la divulgación es un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde la enfermedad maligna hematológica es mieloma múltiple (MM), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de Burkitt (BL), linfoma folicular (FL) o linfoma de células del manto (MCL).

Otro caso de la divulgación es un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es mieloma múltiple (MM), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de Burkitt (BL), linfoma folicular (FL) o linfoma de células del manto (MCL).

Otra realización de la invención es un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es el mieloma múltiple (MM).

Otra realización de la invención es un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anticuerpo anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde la enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es mieloma múltiple (MM).

La invención también proporciona un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello el anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con el anticuerpo anti-CD38.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello el anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con el anticuerpo anti-CD38.

La divulgación también proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterápico.

La divulgación también proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico.

La divulgación también proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia a tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico.

La divulgación también proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico, en donde el por lo menos un agente quimioterapéutico es lenalidomida, bortezomib, melfalán, dexametasona o talidomida.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico, en donde el por lo menos un agente quimioterapéutico es lenalidomida, bortezomib, melfalán, dexametasona, talidomida, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina (doxorrubicina), vincristina o prednisona.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico, en donde el por lo menos un agente quimioterapéutico es lenalidomida y/o bortezomib.

Pueden usarse varios métodos cualitativos y/o cuantitativos para determinar si un sujeto es resistente, ha desarrollado o es susceptible de desarrollar una resistencia al tratamiento con un anticuerpo anti-CD38 u otro agente terapéutico. Los síntomas que pueden estar asociados con la resistencia incluyen, por ejemplo, una disminución o estancamiento del bienestar del paciente, un aumento en el tamaño de un tumor, aumento en el número de células cancerosas, disminución detenida o ralentizada en el crecimiento de un tumor o células tumorales o tumorales, y/o la propagación de células cancerosas en el cuerpo desde una localización a otros órganos, tejidos o células. El restablecimiento o empeoramiento de varios síntomas asociados con el tumor también puede ser una indicación de que un sujeto ha desarrollado o es susceptible de desarrollar resistencia a un anticuerpo anti-CD38 u otro agente terapéutico. Los síntomas asociados con el cáncer pueden variar de acuerdo con el tipo de cáncer. Por ejemplo, los síntomas asociados con las enfermedades malignas de células B pueden incluir ganglios linfáticos inflamados en el cuello, la ingle o las axilas, fiebre, sudores nocturnos, tos, dolor en el pecho, pérdida de peso inexplicable, hinchazón o dolor abdominal o sensación de saciedad. La remisión en los linfomas malignos se estandariza usando los criterios de Cheson (Cheson et al., J Clin Oncology 25:579-586, 2007), cuyas pautas pueden usarse para determinar si un sujeto ha desarrollado una resistencia a un anticuerpo anti-CD38 u otro agente terapéutico.

En algunas realizaciones de la invención descrita en la presente, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es homocigoto para fenilalanina en la posición 158 de CD16 (genotipo FcYRIIIa-158F/F) o heterocigoto para valina y fenilalanina en la posición 158 de CD16 (genotipo FcYRIIIa-158F/V). CD16 también se conoce como el receptor IlIa de Fc gamma (FcYRIIIa) o la isoforma del receptor III-A de la región Fc de inmunoglobulina gamma de baja afinidad. Se ha demostrado que el polimorfismo de valina/fenilalanina (V/F) en la posición 158 del residuo de proteína FcYRIIIa afecta a la afinidad de FcYRIIIa por la IgG humana. El receptor con polimorfismos FcYRIIIa-158F/F o FcYRIIIa-158F/V demuestra un acoplamiento de Fc reducido y, por lo tanto, una ADCC reducida en comparación con FcYRIIIa-158V/V. La falta o baja cantidad de fucosa en oligosacáridos N enlazados humanos mejora la capacidad de los anticuerpos para inducir la ADCC debido a la unión mejorada de los anticuerpos a FcYRIIIa (CD16) humana (Shields et al, J Biol Chem 277:26733-40, 2002). Los pacientes pueden analizarse para determinar su polimorfismo FcYRIIIa usando métodos rutinarios.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el sujeto es homocigoto para la fenilalanina en la posición 158 de CD16 o heterocigoto para valina y fenilalanina en la posición 158 de CD16.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-CD38, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello un anti-CD38 en combinación con ácido transretinoico total (ATRA), en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la muerte de células que expresan CD38 in vitro por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), en donde el sujeto es homocigoto para fenilalanina en la posición 158 de CD16 o heterocigoto para valina y fenilalanina en la posición 158 de CD16.

Administración/Composiciones farmacéuticas

El anticuerpo anti-CD38 de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, puede proporcionarse en composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden el anticuerpo anti-CD38 y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el anticuerpo anti-CD38. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de material particulado. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas como agentes de ajuste y tamponadores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las moléculas o anticuerpos de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente hasta por lo menos aproximadamente el 1% hasta tanto como el 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, que incluyen otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina de suero humano, se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición Troy, D.B. ed., Lipincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing págs. 691-1092, ver especialmente las págs. 958-989.

El modo de administración del anticuerpo anti-CD38 de la invención puede ser cualquier vía adecuada como administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar, transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal) u otros medios apreciados por el experto en la técnica, bien conocidos en la técnica.

El anticuerpo anti-CD38 de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, puede administrarse a un paciente por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parental mediante infusión inyección de bolo intravenosa (i.v.), por vía intramuscular, subcutánea o intraperitoneal. La infusión i.v. puede administrarse durante, por ejemplo, 15, 30, 60, 90, 120, 180 o 240 minutos, o desde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas.

La dosis administrada a un paciente que tiene una enfermedad maligna hematológica positiva para CD38 es suficiente para aliviar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando ("cantidad terapéuticamente eficaz") y puede ser a veces de 0,005 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg/kg, o de aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente168 mg/kg o de aproximadamente 24 mg/kg, o por ejemplo, de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg, pero puede ser incluso más alta, por ejemplo de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg.

También puede administrarse una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área superficial del paciente, por ejemplo, 500, 400, 300, 250, 200 o 100 mg/m2. Habitualmente, pueden administrarse entre 1 y 8 dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar una enfermedad maligna de células B positiva para CD38, pero pueden administrarse 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más dosis.

La administración del anticuerpo anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles cursos repetidos de tratamiento, al igual que la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD38 en los métodos de la invención puede administrarse a 8 mg/kg o a 16 mg/kg a intervalos semanales durante 8 semanas, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada dos semanas durante 16 semanas adicionales, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada cuatro semanas mediante infusión intravenosa.

Los anticuerpos anti-CD38 de la invención pueden administrarse, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, mediante terapia de mantenimiento, como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de 6 meses o más.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, pueden proporcionarse como una dosificación diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en por lo menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, o alternativamente, por lo menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, usando dosis individuales o divididas de cada 24, 12, 8, 6, 4, o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.

Los anticuerpos anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, también pueden administrarse de manera profiláctica para reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar la aparición de la presencia de un evento en la progresión del cáncer y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión. Esto puede ser especialmente útil en pacientes en los que es difícil localizar un tumor que se sabe que está presente debido a otros factores biológicos.

El anticuerpo anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación puede liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un posrtador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución bien conocidas.

El anticuerpo anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación puede administrarse en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

El ATRA puede proporcionarse a una dosificación de 45 mg/m2/día PO o 25 mg/m2/día PO.

El anticuerpo anti-CD38 de la invención y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación puede administrarse en combinación con ácido transretinoico total (ATRA) y un tercer agente terapéutico.

En algunas realizaciones de la invención, y en algunas realizaciones de todas y cada una de las realizaciones numeradas enumeradas a continuación, el tercer agente terapéutico puede ser melfalán, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, como carboplatino, talidomida o un análogo de talidomida, lenalidomida o CC4047, un inhibidor de proteasomas, como bortezomidina o vinca alcaloide, como vincristina una antraciclina, como la doxorrubicina.

Aunque se ha descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la divulgación se divulgarán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1. Métodos generales

Anticuerpos y reactivos

Se usó un mAb humano contra un antígeno inocuo (VIH-1 gp120) como control de isotipo como se ha descrito anteriormente (van der Veers et al., Haematologica 96:284-290, 2011; van der Veers et al., Blood Cancer J 1 :e41, 2011). El ácido transretinoico total (ATRA) se adquirió de Sigma-Aldrich y se diluyó en DMSO.

Ensayos de ADCC basados en imagenología por bioluminiscencia (BLI) usando líneas celulares de MM transducidas con luciferasa (LUC)

Las líneas celulares de MM transducidas con LUC se cocultivaron con células efectoras (PBMC recién aisladas de donantes sanos) en una proporción de efector a objetivo de 1:25 en placas blancas opacas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) en presencia de daratumumab (0,001, 0,01, 0,1 y 1,0 pg/ml) durante cuatro horas. Luego, se determinó la supervivencia de las células LUC+-MM mediante BLI, 10 minutos después de la adición del sustrato luciferina (125 pg/ml; Promega). La lisis de las células de MM se determinó usando la siguiente fórmula: % de lisis = 1-(señal de ^bLⁱmedia en presencia de células efectoras y daratumumab/señal de BLI media en presencia de células efectoras y anticuerpo de control) x100%.

Ensayos de CDC basados en BLI usando líneas celulares de MM transducidas con LUC

Se añadió daratumumab (0, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0 y 3,0 pg/ml) a líneas celulares de MM en medio suplementado con suero humano agrupado (10%; Sanquin) o suero humano inactivado por calor. Después de una incubación de 1 hora a 37° C, se determinó la lisis celular por BLI, 10 minutos después de la adición de luciferina (125 pg/ml), y se calculó usando la siguiente fórmula: % de lisis = 1-(señal de BLI media en presencia de suero humano nativo/señal de BLI media en presencia de suero inactivado por calor) x 100%.

Ensayos de ADCC y CDC ex vivo basados en citometría de flujo en BM-MNC

Las BM-MNC recién aisladas, que contenían un 2-57% de células plasmáticas malignas como se determina por citometría de flujo, se usaron inmediatamente en experimentos ex vivo. Para los experimentos de ADCC, las BM-MNC, que contenían las células plasmáticas malignas, así como las propias células efectoras del paciente, se incubaron en RPMI suero bovino fetal al 10% con daratumumab (0,01-10 pg/ml) en 96 pocillos de fondo plano placas en incubadoras completamente humidificadas a 37° C, mezcla de 5% de CO2 y aire durante 48 h. La viabilidad de la muestra en la incubación fue superior al 98%, según se evaluó usando ToPro-3 (Invitrogen/Molecular Probes). Para los ensayos de CDC, las BM-MNC se trataron con daratumumab (0.3-10 pg/ml) y complemento durante 1 hora antes del análisis por citometría de flujo. Se usó suero humano agrupado (10%) como fuente de complemento. La supervivencia de las células de MM CD138+ en las BM-MNC se determinó mediante citometría de flujo como se ha descrito anteriormente (van der Veers et al., Haematologica 96:284-290, 201 1; van der Veers et al., Blood Cancer J 1:e41, 201 1). Las células de MM supervivientes se enumeraron mediante análisis de citometría de flujo de plataforma única de células CD138+ (con CD138-PE (Beckman Coulter, Miami, FL, USA) en presencia de fluoroesferas Flow-Count (Beckman Coulter) para determinar el número absoluto de células. El porcentaje de lisis de células de MM en las diferentes condiciones tratadas se determinó con respecto a la supervivencia de MM de los pocillos tratados con el anticuerpo de control (IgG1-bl2 como anticuerpo de control de IgG1 para daratumumab) usando la siguiente fórmula: % de células de lisis = 1-(número absoluto de células CD138+ supervivientes en los pocillos tratados/número absoluto de células CD138+ supervivientes en pocillos de control) x 100%.

Inmunofenotipificación por citometría de flujo

La expresión de varias proteínas de la superficie celular se determinó mediante análisis de citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales conjugados con FITC, PE, Per-CP o APC. Se adquirieron anti-CD38, antic D138 y anti-CD56 de Beckman Coulter; anti-CD3, anti-CD16, anti-CD55, anti-CD59 de BD Biosciences; y anti-CD46 de Biolegend. La citometría de flujo se realizó usando un dispositivo FACS-Calibur (Becton Dickinson); los datos se analizaron usando el software CellQuest.

Estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism (Graphpad Software Inc, versión 5). Las comparaciones entre variables se realizaron usando la prueba t de Student pareada de dos colas. Las correlaciones entre variables se realizaron usando el coeficiente de correlación de rango de Spearman, los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Ejemplo 2. ATRA aumenta la expresión de CD38 en líneas celulares de MM y en células de MM primarias Un aumento en los niveles de expresión de CD38 puede potenciar la eficacia de daratumumab para destruir células de MM a través de ADCC o CDC. La interacción de ATRA con los receptores de ácido retinoico nucleares da como resultado una expresión alterada de genes objetivo que incluyen la inducción de la expresión de CD38 (Malavasi F. J Leukoc Biol 90:217-219, 2011; Drach et al., Cancer Res 54:1746-1752, 1994). Por lo tanto, se estudió el efecto de ATRA sobre las líneas celulares de MM RPMI8226, UM9 y XG1. Las células de MM se incubaron con medio RPMI-1640 solo o con ATRA variando de 0-25 nM durante 48 horas (Figura 1A) o se incubaron con ATRA 10 nM durante 24, 48, 72 o 96 horas (Figura 1B) y luego se recogieron para determinar la expresión de CD38 mediante citometría de flujo usando un dispositivo FACS-Calibur (Becton Dickinson) y un anticuerpo anti-CD38 (Beckman Coulter). Los datos se analizaron usando el software CellQuest.

Un mínimo de ATRA 10 nM fue suficiente para inducir un aumento de 1,9-4,4 veces en la expresión de CD38 en las líneas celulares de MM RPMI8226, UM9 y XG1. Las dosis más altas de ATRA no mejoraron más la expresión de CD38 (Figura 1A). La potenciación máxima de la expresión de CD38 se produjo a las 48 horas (Figura 1B). Por lo tanto, se usó ATRA 10 nM durante 48 horas en todos los experimentos posteriores.

También se estudió la exposición a ATRA ex vivo (10 nM, 48 horas) de células de MM primarias de 26 pacientes. En estos experimentos, las BM-MNC de 26 pacientes con MM se incubaron con medio RPMI-1640 solo o con ATRA 10 nM durante 48 horas, se incubaron a 4° C durante 20 min con anticuerpo CD38 conjugado con FITC (Beckman Coulter) y luego se recogieron para determinar la expresión de CD38 mediante citometría de flujo. Los análisis de citometría de flujo se realizaron usando un dispositivo FACS-Calibur (Becton Dickinson); los datos se analizaron usando el software CellQuest.

ATRA indujo la expresión de CD38 (aumento mediano de 1,7 veces, intervalo 1,0-26,5 veces) (Figura 2). También hubo una regulación por incremento significativa de los niveles de expresión de CD138 (aumento mediano: 2,0 veces), que es característico de la diferenciación de células de MM. Por el contrario, no se observaron cambios significativos en la expresión de otros antígenos de células plasmáticas, como HLA A/B/C o CD56 en respuesta a ATRA.

Ejemplo 3. La regulación por incremento de CD38 mediada por ATRA potencia tanto la ADCC como la CDC mediada por daratumumab contra las células de MM

Se probó el posible efecto de la regulación por incremento inducida por ATRA de la expresión de CD38 sobre la A ^dC^cy la CDC inducidas por daratumumab en la líneas celulares de MM XG-1, RPMl8226 y UM9 y en células de MM primarias.

Para las líneas celulares de MM, la CDC y la ADCC se evaluaron usando ensayos de ADCC y CDC basados en imagenología por bioluminiscencia (BLI) como se ha descrito anteriormente. Para las células de MM primarias, la CDC y la ADCC se evaluaron usando ensayos de ADCC y CDC ex vivo basados en citometría de flujo en BM-MNC como se ha descrito anteriormente. En los ensayos, las células se pretrataron con ATRA 10 nM o control de solvente durante 48 horas, seguido de incubación con o sin daratumumab en presencia de PBMC como células efectoras para la evaluación de ADCC o en presencia de suero humano como fuente de complemento para análisis de CDC. El control de isotipo se añadió a 10 pg/ml, y se usó suero inactivado por calor al 10% como control para CDC.

La Figura 3A, la Figura 3B y la Figura 3C muestran los resultados de la CDC y la ADCC inducida por daratumumab en las líneas celulares XG1, RPMI8226 y UM9, respectivamente.

ATRA 10 nM solo no indujo lisis de células de MM. El pretratamiento de líneas celulares de MM con ATRA 10 nM aumentó significativamente la CDC mediada por daratumumab en células XG-1 (Figura 3A) y la ADCC en células XG-1 (Figura 3A) y UM9 (Figura 3C), en comparación con el control de solvente (Figura 3A). En las células RPMI8226 no hubo una mejora significativa en la A^dC^cy la CDC mediadas por daratumumab. Estas diferencias en la capacidad de respuesta a ATRA pueden explicarse en parte por el hecho de que ATRA mejoró la expresión de CD382,9 veces en XG-1 y 4,4 veces en UM9, mientras que la regulación por incremento fue de solo de 1,9 veces en las células RPMI8226 (Figura 1A y 1B).

Ejemplo 4. La regulación por incremento mediada por ATRA de CD38 potencia tanto la ADCC como la CDC mediadas por daratumumab contra las células de MM primarias.

Se evaluaron células de MM primarias para explorar más a fondo el efecto de la inducción de la expresión de CD38 mediada por ATRA sobre la sensibilidad a daratumumab.

La Figura 4A y la Figura 4B muestran los resultados de la CDC y la ADCC inducidas por daratumumab, respectivamente, en células de MM primarias pretratadas durante 48 horas con o sin ATRA 10 nM. Los gráficos en la Figura 4A y la Figura 4B representan resultados agrupados de 16 o 13 muestras de pacientes, respectivamente.

En las células de MM primarias, el pretratamiento con ATRA durante 48 horas dio como resultado un aumento significativo en su susceptibilidad a la CDC mediada por daratumumab en 13 de 16 pacientes (datos no mostrados) y la ADCC en 8 de 11 pacientes (datos no mostrados). Los resultados agrupados de estos pacientes muestran que ATRA mejoró la mediana de la CDC mediada por 10 pg/ml de daratumumab del 16,1% al 43,9% (P < 0,0001) (Figura 4A), y mejoró la mediana de la ADCC mediada por 10 pg/ml de daratumumab del 25,1% al 39,5% (P = 0,0315) por ATRA (Figura 4B).

La Figura 5 muestra los resultados de la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias de cada paciente. La Figura 5A muestra la CDC inducida por daratumumab en las células de MM primarias del paciente 1 y el paciente 2. La Figura 5B muestra la CDC inducida por daratumumab en las células de MM primarias del paciente 3 y el paciente 4. La Figura 5C muestra la CDC inducida por daratumumab en las células de M^mprimarias del paciente 5 y paciente 6. La Figura 5D muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 7 y paciente 8. La Figura 5E muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 9 y paciente 10. La Figura 5F muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 11 y del paciente 12. La Figura 5G muestra la CDC inducida por daratumumab en células de Mm primarias del paciente 13 y del paciente 14. La Figura 5H muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 15 y paciente 16. ATRA indujo la CDC mediada por daratumumab en células de MM primarias que no respondían a daratumumab solo in vitro (por ejemplo, pacientes 1, 4, 8, 12, 13, 15 y 16). Estas células de MM primarias se aislaron de pacientes con enfermedad refractaria o doble refractaria como se indica en la Tabla 1. En algunas muestras de células de MM primarias de pacientes, ATRA no tuvo ningún efecto adicional en la potenciación de la CDC mediada por daratumumab (por ejemplo, ver pacientes 6, 7 y 14).

La Figura 6 muestra los resultados de la ADCC inducida por daratumumab en células de MM primarias de cada paciente. La Figura 6A muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 3 y el paciente 4. La Figura 6B muestra la CDC inducida por daratumumab en las células de M^mprimarias del paciente 7 y el paciente 8. La Figura 6C muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 9 y el paciente 10. La Figura 6D muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 14 y el paciente 15. La Figura 6E muestra la CDC inducida por daratumumab en células de MM primarias del paciente 16 y el paciente 17. La Figura 6F muestra la CDC inducida por daratumumab en células de Mm primarias del paciente 18. La ATRA indujo la ADCC mediada por daratumumab en la mayoría de las células de MM primarias probadas. Estas células de MM primarias se aislaron de pacientes con enfermedad refractaria o doble refractaria como se indica en la Tabla 1.

También se evaluó la expresión superficial de CD38 en todas estas células de MM primarias probadas en BM-MNC incubadas con medio ^rP^mI-1640 solo o con ATRA 10 nM durante 48 horas (Figura 7).

En general, los resultados sugieren que ATRA es una estrategia atractiva para mejorar la expresión de CD38 y la actividad de daratumumab en líneas celulares de MM y en células de MM primarias, incluyendo las células de MM que son refractarias a la CDC y/o la ADCC mediadas por daratumumab.

La Tabla 1 muestra las características de referencias de las BM-MNC de los 19 pacientes con MM evaluados. En la tabla, *la enfermedad refractaria a lenalidomida y/o bortezomib se define como enfermedad progresiva con la terapia con lenalidomida y bortezomib, sin respuesta (menos que una respuesta parcial) a la terapia con lenalidomida y bortezomib, o enfermedad progresiva en el plazo de 60 días de la interrupción de un régimen que contenga lenalidomida y bortezomib, de acuerdo con los Criterios Internacionales de Respuesta Uniforme para el Mieloma Múltiple.

Tabla 1

Paciente

1 2 3 4 5 6 Parámetro:

Edad (años) 71 43 71 64 64 53 Sexo M M F M M F Tipo de cadena pesada monoclonal IgG - - IgD - IgG Tipo de cadena ligera K K L K L L Terapia anterior

Líneas de terapia anteriores (número) 10 4 4 6 3 0 Trasplante de células madre sí sí sí sí sí no Antologas sí sí sí sí sí no Alogénicas no no no no no no Tratamiento con lenalidomida anterior. sí sí sí sí sí no estado refractario de lenalidomida* sí sí sí sí sí no Tratamiento con bortezomib anterior sí sí sí sí sí no estado refractario de bortezomib* sí sí sí sí sí no Expresión de CD38 en células MM (MFI) 1258 1346 764 1275 2642 1134 Expresión de CD46 en células MM (MFI) 1165 264 866 1346 661 1124 Expresión de CD55 en células MM (MFI) 610 119 552 227 1 594 Expresión de CD59 en células MM (MFI) 235 62 228 108 7 90 Paciente

7 8 9 10 11 12 Parámetro:

Edad (años) 55 64 75 63 56 59 Sexo F M M F M M Tipo de cadena pesada monoclonal IgA - - IgA IgA -Tipo de cadena ligera L K L K K K Terapia anterior

Líneas de terapia anteriores (número) 2 2 5 6 2 4 Trasplante de células madre sí sí no sí sí sí Autólogas sí sí no sí sí sí Alogénicas no no no no no no Tratamiento con lenalídomida anterior. no sí sí sí sí sí estado refractario de lenalídomida* no sí sí sí no sí Tratamiento con bortezomib anterior si sí sí sí no sí estado refractario de bortezomib* sí no sí sí no no Expresión de CD38 en células MM (MFI) 1999 578 1252 1310 843 64 Expresión de CD46 en células MM (MFI) 2288 4870 1700 196 368 264 Expresión de CD55 en células MM (MFI) 655 528 813 4 362 60 Expresión de CD59 en células MM (MFI) 92 151 241 7 74 47

Paciente

¹³14 15 16 17 18 Parámetro:

Edad (años) 71 72 67 64 63 53 Sexo F M M M M M Tipo de cadena pesada monoclonal - - IgG - IgG IgA Tipo de cadena ligera L K K K L K Terapia anterior

Líneas de terapia anteriores (número) 4 5 2 3 4 2 Trasplante de células madre sí no no sí sí sí Autólogas sí no no sí sí sí Alogénicas no no no no no no Tratamiento con Icnalidomida anterior, SI si SI si no SI

estado refractario de lenalidomida* sí sí sí sí no sí

Tratamiento con bortezomib anterior sí sí sí sí sí sí

estado refractario de bortezomib* sí sí no sí no sí

Expresión de CD38 en células MM (MFI) 173 241 78 1000 667 11

Expresión de CD46 en células MM (MFI) 300 492 362 491 538 557

Expresión de CD55 en células MM (MFI) 379 1275 59 176 231 519

Expresión de CD59 en células MM (MFI) 188 75 9 107 70 52

BM-MNCs; células mononucleares de ni ósea. MM; mieloma múltiple.

M; masculino. F; femenino. K; kappa.

Ejemplo 5. ATRA regula por disminución la expresión de CD55 y CD59 en células de MM primarias

Los experimentos realizados revelaron que el pretratamiento de las células de MM con ATRA hizo que estas células fueran más susceptibles a la ADCC y la CDC mediadas por daratumumab. La mejora en la CDC fue más pronunciada que la mejora en la ADCC. Se evaluó la base molecular de la observación.

Se evaluó el efecto de ATRA sobre las células efectoras. ATRA no tuvo ningún efecto o tuvo un efecto mínimo sobre la capacidad de las PBMC de donantes sanos para inducir la ADCC en las líneas celulares de MM humanas L363-CD38, LME-1, RPMI8226 y UM9 (datos no mostrados). Por el contrario, ATRA redujo los niveles de expresión de las proteínas inhibidoras del complemento CD55, CD59 y CD46 en líneas celulares de MM y células de ^mM primarias. En las células RPMI8226 (Figura 8A), L363 (Figura 8B) y XG-1 (Figura 8C), ATRA redujo los niveles de expresión de CD55, CD59 y CD46. En células de MM primarias derivadas de 16 pacientes, ATRA redujo significativamente la expresión de CD55 (reducción media 21,3%, P = 0,019) (Figura 9A) y CD59 (reducción media 37,5%, P = 0,0047) (Figura 9B), mientras que ATRA no afectó significativamente a los niveles de expresión de CD46 (datos no mostrados). Los niveles de expresión de CD46, CD55 y CD59 de las muestras de los 16 pacientes evaluados se muestran en las Figuras 10A (CD55), Figura 10B (CD59) y Figura 10C (CD46). En los experimentos, las células se cultivaron a 37° C con medio RPMI-1640 con o sin ^aTR^a10 nM 10 nM durante 48 h. Luego, las células se incubaron a 4° C durante 20 min con el panel de anticuerpos conjugados apropiado. Los análisis por citometría de flujo se realizaron usando un dispositivo FACS-Calibur (Becton Dickinson); los datos se analizaron usando el software CellQuest.

Ejemplo 6. Eficacia in vivo de la combinación de ATRA y daratumumab contra tumores de MM que crecen en un microambiente humanizado.

Se recubrieron andamiajes híbridos que consistían de tres partículas de fosfato de calcio bifásico de 2-3 mm in vitro con células estromales mesenquimales humanas (MSC; 2x105 células/andamiaje). Después de una semana de cultivo in vitro en un medio osteogénico, se implantaron andamiajes humanizados por vía subcutánea en ratones RAG2'/_ Y cf como se ha descrito anteriormente (Groen et al, Blood. 19;120:e9-e16, 2012; de Haart et al., Clin.Cancer Res. 19:5591-5601, 2013).

Ocho semanas después de la implantación, los ratones recibieron una dosis de irradiación subletal (3 Gy, 200 kV, 4 mA) y se inyectaron células XG1 transducidas con luciferasa directamente en el andamiaje (1x106 células/andamiaje). Tres semanas después de la inoculación, cuando hubo un crecimiento tumoral visible en los andamiajes por imagenología bioluminiscente (BLI), se trataron a diferentes grupos de ratones con 1) vehículo, 2) ATRA más PBMC empobrecidas de células T como células efectoras (PBMC-T), 3) daratumumab más PBMC-T, y 4) daratumumab más ATRA más PBMC-T. Se administró daratumumab (8 mg/kg) por vía intraperitoneal los días 23, 30 y 37; las PBMC-T (8x106 células/ratón) se administraron por vía intravenosa los días 24, 31 y 38; y el ATRA (10 mg/kg) se administró mediante inyección intraperitoneal los días 21-24, 28-31 y 35-38. Las PBMC-T se prepararon mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque de capas leucocitarias y el empobrecimiento posterior de las células T mediante perlas CD3 usando la tecnología EasySep™ (STEMCELL Technologies). El crecimiento del tumor se monitorizó mediante mediciones de BLI semanales como se ha descrito anteriormente (Groen et al., Blood. 19;120: e9-e16, 2012). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de obtener el permiso del comité ético local para la experimentación con animales y cumplieron con el Acta de Experimentación con Animales Holandesas. Las diferencias estadísticas entre los diferentes grupos de tratamiento

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD38, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene mieloma múltiple, en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con el anticuerpo anti-CD38 o una combinación de por lo menos un agente quimioterapéutico y el anticuerpo anti-CD38, y en donde el anticuerpo anti-CD38:

iv) se administra en combinación con ácido transretinoico total (ATRA).

2. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la destrucción de las células que expresan CD38 mediante CDC in vitro.

3. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-CD38 induce la destrucción de las células que expresan CD38 mediante ADCC in vitro.

4. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el por lo menos un agente quimioterapéutico es lenalidomida, bortezomib, melfalán, dexametasona o talidomida.

5. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el por lo menos un agente quimioterapéutico es lenalidomida o bortezomib.

6. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

7. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 es del isotipo IgG1.

8. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 comprende la región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 4 y la región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 5.

9. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de la SEQ ID NO: 13.

10. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 13.

11. El anticuerpo para el uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo anti-CD38 y el ATRA se administran:

(i) juntos en una mezcla;

(ii) concurrentemente como agentes individuales; o

(iii) secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.

12. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el portador farmacéuticamente aceptable es un diluyente, un adyuvante, un excipiente, o un vehículo.