DE68928946T2

DE68928946T2 - Verfahren zum aufspüren von diagnostischen oder therapeutischen mitteln durch antikörper

Info

Publication number: DE68928946T2
Application number: DE68928946T
Authority: DE
Inventors: Hans Hansen
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1989-12-11
Publication date: 1999-10-21
Anticipated expiration: 2009-12-12
Also published as: AU5673690A; EP0505357A1; KR920702819A; WO1991008770A1; KR100236375B1; DE68928946D1; ATE177321T1; JPH05501543A; EP0505357B1; AU649952B2; JP3032287B2; EP0505357A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Produkt zur Verstärkung der zielgerichteten Abgabe eines Antikörpers, das ein Antikörper-Enzym-Konjugat und ein getrenntes, lösliches Substrat-Mittel-Konjugat enthält, wobei das zielgerichtete Enzym die Umwandlung eines löslichen Substrats, das mindestens ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel trägt, zu einem Produkt katalysiert, das das Mittel umfaßt, welches sich am Zielort für eine wirksame Behandlung oder Diagnose ansammelt. Das vorstehende Produkt eignet sich zum zielgerichteten Abgeben beliebiger Typen von Mitteln an einem Ort, an dem ein Antikörper eine selektive Bindung eingehen kann, wozu die Verwendung zur Abbildung von Tumoren, infektiösen Läsionen, Fibringerinnseln, Myokardinfarkten, nicht-krebsartigen Zellen, geschädigten normalen Zellen, atherosklerotischen Plaques und autoreaktiven Lymphozytenklonen und für Therapiezwecke gehören.
Es ist bekannt, daß Antikörper oder Antikörperfragmente mit Radioisotopen, Arzneistoffen oder Toxinen konjugiert werden können, um das diagnostische oder therapeutische Prinzip zielgerichtet zur Tumor- oder Läsionsstelle zu bringen. Ein Haupthindernis bei der Anwendung derartiger Verfahren besteht in der Schwierigkeit, den Antikörper mit einer ausreichenden Menge des therapeutischen oder diagnostischen Mittels zu beladen. Eine weitere Komplikation besteht darin, daß eine Überladung des Antikörpers mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel den Körper dazu veranlassen kann, das Antikörper-Konjugat abzustoßen und zu zerstören.
Es ist bekannt, zytotoxische Arzneistoffe mit Antikörpern zu konjugieren, um ein zielgerichtetes therapeutisches Ergebnis zu erreichen. Beispielsweise ist es bekannt, daß Methotrexat (MTX) mit Antikörpern konjugiert werden kann. Dabei wurde eine gewisse selektive Zytotoxizität beobachtet. Es ist wünschenswert, die Zytotoxizität von derartigen Konjugaten zu verstärken, indem man die Beladung mit dem zytotoxischen Arzneistoff erhöht. Jedoch verringert eine Mehrfachkonjugation von einzelnen Arzneistoffmolekülen mit einem Antikörper letztlich dessen Immunoreaktivität, wobei dieser Effekt beobachtet wird, wenn eine Beladung mit mehr als etwa 10 Arzneistoffmolekülen vorgenommen wird.
Ferner wurde vorgeschlagen, den Arzneistoff mit einem polymeren Träger zu konjugieren, der wiederum mit einem Antikörper konjugiert werden kann. Dies hat den Vorteil, daß eine größere Anzahl von Arzneistoffmolekülen zur Zielstelle transportiert werden kann. über die Verwendung von Polylysin als polymerem Träger berichteten Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 3867-3870. Diese Autoren stellten fest, daß nur eine Beladung mit etwa 13 MTX pro Träger vorgenommen werden konnte und die Immunoreaktivität gering war. Ferner verursachte der hohe Amingehalt des Polymeren, weitgehend in Form von geladenen Ammoniumgruppen, eine Haftung des Konjugats an normalen Zellen und beeinträchtigte die Selektivität des zytotoxischen Effekts.
Das US-Patent 4 046 722 (Rowland) beschreibt ein Antikörper-Konjugat, bei dem eine Mehrzahl von Molekülen eines zytotoxischen Mittels kovalent an einen polymeren Träger mit einem Molekulargewicht von 5000-500 000 gebunden ist und der beladene Träger durch willkürliche Befestigung an seitenständigen Amin- oder Carboxylgruppen kovalent an einen Antikörper gebunden ist. Ghose et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. 61 (1978), S. 657-676, beschreibt weitere, mit Antikörpern verknüpfte zytotoxische Mittel, die sich für die Krebstherapie eignen. Das US-Patent 4 699 784 (Shih et al.) beschreibt die ortsspezifische Haftung eines mit Methotrexat beladenen Aminodextrans an einem Antikörper.
Die zielgerichtete, neutronenaktivierte Radiotherapie wird beispielsweise von folgenden Autoren beschrieben: Goldenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 560; Hawthorne et al., J. Med. Chem., Bd. 15 (1972), S. 449; und Goldenberg, US-Patente 4 332 647, 4 348 376, 4 361 544, 4 468 457, 4 444 744, 4 460 459, 4 460 561, 4 818 709 und 4 624 846.
Die vorerwähnten Druckschriften beschreiben unter anderem Verfahren zur Einverleibung von Bor-10 enthaltenden Addenden in Antikörper-Konjugate, wobei man beispielsweise ein Carboran (z. B. mit einem Phenyldiazoniumion verknüpft) an einen Antikörper kuppelt. Diese Verfahren eignen sich zum Einverleiben einer relativ geringen Anzahl an Bor-10-Atomen. Typischerweise werden unter Anwendung des Carboran-Phenyldiazonium-Konjugationsverfahrens zwischen 10 und 120 B-10-Atome an IgG gebunden, bevor die Immunoreaktivität und die Ausbeute an gewonnenem Produkt unannehmbar nieder wird. Es ist wünschenswert, über die Fähigkeit zu verfügen, eine große Anzahl an B-10-Atomen zielgerichtet zu einem Tumorort zu bringen, um eine wirksame Therapie vorzunehmen.
EP-A-0 302 473 betrifft ein Verfahren zur Abgabe von zytotoxischen Arzneistoffen an Tumorzellen, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Antikörper-Enzym-Konjugats, dessen Antikörper mit einem Antigen an der Oberfläche von Tumorzellen reaktiv ist, und die zusätzliche Verabreichung einer Arzneistoffvorstufe, die am Tumorort in Gegenwart des antikörpergebundenen Enzyms in einen zytotoxischen Arzneistoff umgewandelt wird, umfaßt.
WO-A-88/07378 betrifft ein therapeutisches Zweikomponentensystem, das sich zur Abgabe einer zytotoxischen Antitumorverbindung mittels einer sequentiellen parenteralen Verabreichung eignet. Bei der ersten Komponente handelt es sich um einen Antikörper-Enzym-Komplex, der zur Bindung mit einem tumorassoziierten Antigen befähigt ist, wobei das Enzym vorzugsweise nicht von Säugetieren stammt. Bei der zweiten Komponente handelt es sich um eine Arzneistoffvorstufe der Antitumorverbindung, die unter dem Einfluß des Enzyms in den zytotoxischen Arzneistoff umgewandelt werden kann.
WO-A-89/10140 beschreibt eine verbesserte Version der Verfahren zur Arzneistoffabgabe gemäß WO-A-88/07378, wobei eine Zwischenstufe mit dem Ziel durchgeführt wird, die Clearance der restlichen, nicht an den Zielort gelangten Konjugate des Enzyms (erste Komponente) aus dem Blut zu beschleunigen, z. B. indem man einen raschen Verlust an Enzymaktivität der ersten Komponente im Plasma hervorruft, ohne daß es zu einem erheblichen Verlust an Enzymaktivität an Tumororten kommt.
Somit besteht ein anhaltendes Bedürfnis nach einem Verfahren für einen zielgerichteten Antikörpertransport mit dem es möglich ist, eine ausreichende Menge eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels an einem Zielort abzuscheiden, ohne daß der zielgerichtete Antikörper mit dem Mittel überladen ist und dadurch ein Verlust an Immunoreaktivität und/oder eine Induktion einer immunogenen Reaktion hervorgerufen werden.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Produkt zur Verstärkung der Zielfähigkeiten von Antikörpern durch Amplifikation des Zielereignisses bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereitzustellen, die sich zur Diagnose und/oder Behandlung von Krebs, infektiösen Läsionen oder anderen pathologischen Läsionen, wie Myokardinfarkten, eignen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen hohen Grad der Abscheidung von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln an einer Zielstelle ohne Notwendigkeit einer hohen Beladung des Antikörpers zu erreichen.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus den folgenden Erörterungen leichter ersichtlich.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt bereitgestellt, das folgendes umfaßt:
(a) eine für die enzymatische Wirkung in einem Säugetier wirksame Menge eines Enzyms;
(b) eine für die zielgerichtete Abgabe in einem Säugetier wirksame Menge eines bispezifischen Antikörpers, der mindestens eine erste, für ein Antigen an einem Zielort spezifische Bindungsstelle und mindestens eine zweite, für das Enzym spezifische Bindungsstelle aufweist; und
(c) eine zur Abscheidung in einem Säugetier am Zielort wirksame Menge eines löslichen Substrat-Mittel-Konjugats, das ein Nichtsubstrat- Polymeres umfaßt, das kurze Verknüpfungssegmente eines Substratoligomeren trägt, die mit einer Vielzahl von Molekülen mindestens eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels kovalent verknüpft sind, so daß die Spaltung der kurzen Linkersegmente des Substratoligomeren durch das Enzym, das mindestens ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel zur Ansammlung am Zielort für eine wirksame Therapie oder Behandlung freisetzt,
wobei das Enzym bei dem Säugetier an einem Nichtzielort entlang des Verabreichungs- oder Bioverteilungswegs des Substrat-Mittel-Konjugats nicht in einer die zielgerichtete Abscheidung und die Ansammlung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels störenden Menge endogen ist,
als ein kombiniertes Präparat zur Anwendung bei einem Säugetier in der Reihenfolge: (a) nach (b) entweder zusammen oder nacheinander in der Reihenfolge (a) nach (b) und danach (c).
Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Enzym entweder
(i) eine Protease, eine Glycosidase oder eine Esterase oder
(ii) eine Dextranase oder eine Cellulase, wobei es sich beim Oligomeren um mindestens ein Dextran- oder Cellulose-Substratoligomeres handelt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt bereitgestellt, das folgendes umfaßt:
(ab) eine für die zielgerichtete Abgabe und die Enzymaktivität in einem Säugetier wirksame Menge eines kovalenten Antikörper-Enzym-Konjugats, wobei der Antikörper mindestens eine erste, für ein Antigen an einem Zielort spezifische Bindungsstelle aufweist und es sich beim Enzym um eine Dextranase oder eine Cellulase handelt;
(c) eine zur Abscheidung in einem Säugetier am Zielort wirksame Menge eines löslichen Substrat-Mittel-Konjugats, das ein Dextran oder eine Cellulose umfaßt, die kovalent an eine Mehrzahl von Molekülen mindestens eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels so gebunden sind, daß die Spaltung des Substrat-Mittel-Konjugats durch das Enzym das mindestens eine diagnostische oder therapeutische Mittel zur Ansammlung am Zielort für eine wirksame Behandlung oder Diagnose freisetzt,
wobei das Enzym bei dem Säugetier an einem Nichtzielort entlang des Verabreichungs- oder Bioverteilungswegs des Substrat-Mittel-Konjugats nicht in einer die zielgerichtete Abscheidung und die Ansammlung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels störenden Menge endogen ist,
als ein kombiniertes Präparat zur Anwendung bei einem Säugetier in der Reihenfolge: (ab) und danach (c).
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, wobei die mindestens eine erste Bindungsstelle des Antikörpers spezifisch an ein Antigen bindet, das durch einen Tumor, eine infektiöse oder parasitische Läsion, ein Fibringerinnsel, einen Myokardinfarkt, eine atherosklerotische Plaque, eine Nichtkrebszelle oder eine geschädigte normale Zelle erzeugt worden ist oder mit diesen assoziiert ist.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt gemäß dem ersten, zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, wobei es sich bei dem Mittel entweder um
(i) ein diagnostisches Mittel, das ein gamma-emittierendes oder positronenemittierendes Radioisotop umfaßt,
(ii) ein diagnostisches Mittel, das ein paramagnetisches Ion für die Verstärkung der magnetischen Resonanzabbildung umfaßt, oder
(iii) um ein therapeutisches Mittel handelt, das ein beta- oder alpha-emittierendes Radioisotop, einen Arzneistoff, ein Toxin, einen Bor- Addenden, einen Vasodilatator, ein Cytokin, einen Photosensibilisator oder einen Radiosensibilisator umfaßt.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt nach einem der vorstehenden Aspekte der Erfindung bereitgestellt, wobei die Verabreichung auf intrakavitärem, intravenösem, intraarteriellem, intrapleuralem, intrathekalem, intralymphatischem, intramuskulärem, intraläsionalem, subkutanem Wege oder durch Katheterperfusion erfolgt.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt nach einem der vorstehenden Aspekte der Erfindung bereitgestellt, wobei der Antikörper an eine Markierung, z. B. ein Radioisotop oder ein Mittel zur Verstärkung der magnetischen Resonanzabbildung, konjugiert ist oder zur Konjugation mit diesem geeignet ist, um die Clearance aus dem Kreislaufsystem und/oder die Lokalisierung am Zielort des Antikörpers zu überwachen.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt nach einem der vorstehenden Aspekte der Erfindung bereitgestellt, wobei das Substrat-Mittel-Konjugat ferner mit einer Markierung, wie einem Radioisotop oder einem Mittel zur Verstärkung der magnetischen Resonanzabbildung, konjugiert ist oder zur Konjugation mit diesen befähigt ist, um die Clearance aus dem Kreislaufsystem und/oder die Ansammlung am Zielort des Substrat-Mittel-Konjugats zu überwachen.
Gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Produkt nach einem der vorstehenden Aspekte der Erfindung zum Einsatz in Diagnose oder Therapie bereitgestellt.

Ausführliche Erörterung

Der Stand der Technik beschreibt das direkte Befestigen von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln an einem Antikörper oder an einem Träger, der an einem Antikörper befestigt ist. Zu einigen Problemen, die mit der Konjugation eines Mittels an den Antikörper verbunden sind, gehören die Kreuzverknüpfung, der Verlust an Immunoreaktivität, die immunogene Beschaffenheit, die unzureichende Beladung des Antikörpers mit dem Mittel und die unzureichende Abscheidung des Mittels am Zielort. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Schwierigkeiten, indem sie ein Antikörper-Enzym-Konjugat und ein getrenntes Substrat-Mittel-Konjugat verwendet, was es möglich macht, den Antikörper an den Zielort zu bringen, ohne daß der Antikörper mit dem diagnostischen oder therapeutischen Mittel beladen werden muß.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur zielgerichteten Abgabe eines Produkts, das ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel umfaßt, an einen Zielort kann durchgeführt werden, indem man zunächst einem Säugetier auf parenteralem Wege eine für die zielgerichtete Abgabe und die Enzymaktivität eines Antikörper-Enzym-Konjugats wirksame Menge injiziert und ausreichend lange wartet, bis das Konjugat sich am Zielort befindet und im wesentlichen aus dem Kreislaufsystem des Säugetiers verschwunden ist. Die nächste Stufe des Verfahrens besteht darin, daß man dem Säugetier auf parenteralem Wege eine für die Abscheidung am Zielort wirksame Menge eines löslichen Substrat-Mittel-Konjugats, das durch das Enzym zu einem das Produkt enthaltenden Mittel umgewandelt werden kann, injiziert, wobei sich das Mittel am Zielort für eine wirksame Behandlung und Diagnose ansammelt. Beim Substrat-Mittel-Konjugat handelt es sich um ein Substrat für das Enzym, das mit mindestens einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel konjugiert ist.
Die Antikörper-Komponente des Antikörper-Enzym-Konjugats ist der zielende Teil und dient zur selektiven Bindung des Konjugats an mindestens ein am Zielort vorhandenes Antigen. Dadurch ergibt sich eine Lokalisierung der Enzym-Komponente des Konjugats am Zielort. Nachdem das nicht am Ziel angekommene Konjugat im wesentlichen aus dem Blutkreislauf beseitigt ist, wird das Substrat-Mittel-Konjugat injiziert. Es soll dabei auf dem Weg zum Zielort auf nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge des Antikörper-Enzym-Konjugats oder eines ähnlich wirkenden endogenen Enzyms treffen.
Wenn jedoch das Substrat-Mittel-Konjugat den Zielort erreicht, wird es durch das Enzym in ein Produkt, das das diagnostische oder therapeutische Mittel umfaßt, umgewandelt. Das Enzym kann zahlreiche Moleküle oder Untereinheiten des Substrat-Mittel-Konjugats umwandeln und dabei zahlreiche Moleküle des Produkts in einer Form freisetzen, die sich aufgrund der günstigen Verteilung zwischen der den Zielort umgebenden Flüssigkeit und dem Gewebe oder einem anderen antigenhaltigen Medium am Ort selbst ansammeln. Somit verstärkt das Enzym das Zielvermögen des Antikörpers, ohne daß das Mittel mit dem zielgerichteten Antikörper konjugiert sein muß. Das Mittel sammelt sich am Zielort an und kann dort seine diagnostische oder therapeutische Wirkung entfalten.
Sofern nichts anderes angegeben ist, umfaßt der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" auch Antikörperfragmente und ist somit mit dem Ausdruck "Antikörper/Fragment", der in der vorliegenden Erörterung in austauschbarer Weise verwendet wird, gleichwertig. Bei den Antikörpern kann es sich um vollständige Immunoglobuline beliebiger Klassen handeln, z. B. IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, oder um Hybridantikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitopspezifitäten oder um Fragmente, z. B. F(ab')&sub2;, F(ab)&sub2;, Fab', Fab und dergl., unter Einschluß von Hybridfragmenten.
Antikörper umfassen Antiserum-Präparate, vorzugsweise affinitätsgereinigte Präparate mit einer hohen Immunoreaktivität, z. B. einer Bindungskonstante von mindestens etwa 10&sup7; Liter/Mol und vorzugsweise von mindestens etwa 10&sup9; Liter/Mol, einer hohen Immunospezifität, z. B. von mindestens etwa 40%, vorzugsweise von mindestens etwa 60% und insbesondere von etwa 70-95%, und einer geringen Kreuzreaktivität mit anderen Gewebeantigenen, z. B. nicht mehr als etwa 30%, vorzugsweise nicht mehr als etwa 15% und insbesondere nicht mehr als etwa 5%. Das Antiserum kann einer Affinitätsreinigung durch herkömmliche Maßnahmen unterzogen werden, z. B. durch Bindung eines Antigens an eine chromatographische Säulenpackung, z. B. SephadexR, durch Durchleiten des Antiserums durch die Säule, wobei spezifische Antikörper zurückgehalten werden und andere Immunoglobuline und Verunreinigungen abgetrennt werden, und durch anschließende Gewinnung der gereinigten Antikörper durch Elution mit einem chaotropen Mittel, wonach sich gegebenenfalls eine weitere Reinigung anschließt.
Monoklonale Antikörper eignen sich ebenfalls zur Verwendung im vorliegenden Produkt und werden aufgrund ihrer hohen Spezifitäten bevorzugt. Sie lassen sich leicht durch nunmehr als herkömmlich angesehene Verfahren der Immunisierung von Säugetieren mit einem immunogenen Antigenpräparat, durch Fusion von immunen Lymph- oder Milzzellen mit einer unsterblichen Myelom-Zellinie und durch Isolierung von spezifischen Hybridomklonen herstellen. Weniger gebräuchliche Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind dabei nicht ausgeschlossen, z. B. Interspezies-Fusionen und gentechnische Bearbeitung von hypervariablen Regionen, da vorwiegend die Antigen-Spezifität der Antikörper ihre Eignung im vorliegenden Verfahren beeinflußt.
Antikörper-Fragmente lassen sich durch Verdauung von vollständigen Immunoglobulinen durch Pepsin oder Papain entsprechend herkömmlichen Verfahren, wie sie unter anderem im US-Patent 4 331 647 beschrieben sind, herstellen.
Bei den Zielstellen kann es sich (ohne Beschränkung hierauf) um Karzinome, infektiöse und parasitische Läsionen, Fibringerinnsel, Myokardinfarkte, atherosklerotische Plaques, geschädigte normale Zellen, Nichtkrebszellen und autoreaktive Lymphozytenklone handeln.
Es wurden zahlreiche Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch Marker binden, die durch Tumoren oder infektiöse Läsionen, einschließlich virale, bakterielle, mykotische und parasitische Infektionen, erzeugt werden oder mit diesen assoziiert sind, sowie Antigene und Produkte, die mit derartigen Mikroorganismen verbunden sind, beschrieben; vergl. z. B. Hansen et al. (US-Patent 3 927 193) und Goldenberg (US-Patente 4 331 647, 4 348 376, 4 361 544, 4 468 457, 4 444 744, 4 460 459, 4 460 561, 4 818 709 und 4 624 846.
Antifibrin-Antikörper sind aus dem Stand der Technik bekannt. Antikörper, die Myokardinfarkte aufspüren, werden beispielsweise von Haber (US-Patent 4 036 945) beschrieben. Antikörper die normale Gewebe oder Organe aufspüren, sind beispielsweise im US-Patent 4 735 210 beschrieben. Antifibrin-Antikörper sind aus dem Stand der Technik als Antikörper bekannt, die an artherosklerotische Plaques und an autoreaktive Lymphozytenklone binden.
Im allgemeinen können Antikörper gegen beliebige Antigene erzeugt werden, indem man sich zahlreicher herkömmlicher, aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren bedient. Beliebige zielgerichtete Antikörper für ein Antigen, das sich in einer ausreichenden Konzentration an einem Ort im Körper eines Säugetiers, der von diagnostischem oder therapeutischem Interesse ist, befindet, können zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Antikörper-Enzym-Konjugats eingesetzt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, daß ein bispezifischer Antikörper/Fragment im vorliegenden Produkt verwendet werden kann, wobei mindestens eine Bindungsstelle für ein Antigen an einem Zielort spezifisch ist und mindestens eine weitere Bindungsstelle für die Enzymkomponente des Antikörper-Enzym-Konjugats spezifisch ist. Ein derartiger Antikörper kann vor der Injektion an das Enzym binden, wodurch die Notwendigkeit zur kovalenten Konjugation des Enzyms an den Antikörper vermieden wird, oder er kann injiziert werden und eine Lokalisierung am Zielort erfahren, wobei das Enzym, nachdem nicht ans Ziel gelangter Antikörper im wesentlichen aus dem Kreislaufsystem des Säugetiers beseitigt worden ist, in einer Menge und durch einen Verabreichungsweg injiziert werden, die sicherstellen, daß eine ausreichende Menge des Enzyms den lokalisierten Antikörper erreicht und mit diesem eine Bindung unter in situ-Bildung des Antikörper-Enzym-Konjugats eingeht.
Bispezifische Antikörper lassen sich nach verschiedenen herkömmlichen Verfahren herstellen, z. B. durch Disulfidspaltung und Reformation von Gemischen von vollständigem IgG oder vorzugsweise von F(ab')&sub2;-Fragmenten, Fusionen von mehr als einem Klon unter Bildung von Polyomen, die Immunoglobuline mit mehr als einer Spezifität erzeugen, und durch gen technische Maßnahmen. Die bispezifischen Antikörper können an ein oder mehr Epitope am Enzym binden, sollen aber nicht an einem Ort binden, wo die Enzymaktivität beeinträchtigt wird.
Das erfindungsgemäß verwendete Enzym muß zur Transformation eines im wesentlichen löslichen Substrat-Mittel-Konjugats unter Bildung eines Produkts befähigt sein, das ein diagnostisches und/oder therapeutisches Mittel umfaßt, das sich am Zielort ansammelt. Weder das Enzym noch ein Enzym mit ähnlicher Substratspezifität sollen beim Säugetier entlang des Verabreichungs- oder Bioverteilungswegs des Substrat-Mittel-Konjugats endogen sein. Ansonsten wird das Mittel an Orten, die vom Zielort abweichen, freigesetzt, wodurch üblicherweise, jedoch nicht immer, die diagnostische oder therapeutische Wirkung des Mittels gestört oder beeinträchtigt wird.
Prinzipiell kann es sich bei dem Enzym um einen beliebigen Enzymtyp handeln, der an einen Antikörper gebunden werden kann und ein Substrat- Mittel-Konjugat unter Berücksichtigung der vorstehenden Kautelen in ein Produkt umwandeln kann. Proteasen, Glycosidasen, Esterasen und dergl. stellen insgesamt allgemeine Typen von Enzymen dar, die erfindungsgemäß unter geeigneten Umständen eingesetzt werden können. Zu spezielleren Beispielen für geeignete Enzyme gehören (ohne Beschränkung hierauf) Glucuronidase, beta-Glucosidase, beta-Lactamase, Cellulase, Dextranase, Fructase, Aminopeptidase und Lysozym.
Das Enzym wird in Funktion des Typs des gewählten Substrat-Mittel- Konjugats ausgewählt. Beispielsweise erfolgt bei Wahl von Dextran als Substrat eine Kombination mit der Verwendung von Dextranase als Enzym. In ähnlicher Weise wird Cellulase in Verbindung mit einem Cellulosesubstrat verwendet. Ein Glucuronid als Substrat-Mittel-Konjugat wird in Verbindung mit Glucuronidase als Enzym eingesetzt und dergl.
Abgesehen von dem in situ-Verfahren zur Bildung des Antikörper-Enzym-Konjugats ist es vorteilhaft, das Enzym direkt oder über einen kurzen oder langen Linkerrest über eine oder mehrere funktionelle Gruppen am Antikörper und/oder am Enzym, z. B. über Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thiol- oder Hydroxylgruppen, kovalent an den Antikörper zu binden. Verschiedene herkömmliche Linker können verwendet werden, z. B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Bis-(hydroxysuccinimid)-ester, Carbodiimide, Maleinimid-hydroxysuccinimid-ester, Glutaraldehyd und dergl.
Ein einfaches Verfahren besteht im Mischen des Antikörpers mit dem Enzym in Gegenwart von Glutaraldehyd unter Bildung des Antikörper-Enzym- Konjugats. Die anfänglichen Schiffschen-Base-Verknüpfungen können stabi lisiert werden, z. B. durch Borhydrid-Reduktion zu sekundären Aminen. Dieses Verfahren wird herkömmlicherweise zur Herstellung beispielsweise von Peroxidase-Antikörper-Konjugaten für immunohistochemische Anwendungen oder für Immunoassays herangezogen. Ein Diisothiocyanat oder ein Carbodiimid können anstelle von Glutaraldehyd verwendet werden.
Eine selektivere Verknüpfung läßt sich unter Verwendung eines heterobifunktionellen Linkers, z. B. eines Maleinimid-Hydroxysuccinimidesters, erreichen. Die Umsetzung des letztgenannten Produkts mit einem Enzym führt zur Derivatisierung von Amingruppen am Enzym. Das Derivat kann sodann beispielsweise mit einem Antikörper-Fab-Fragment mit freien Sulfhydrylgruppen (oder mit einem größeren Fragment oder mit intaktem Immunoglobulin mit seitenständigen Sulfhydrylgruppen beispielsweise mit Traut-Reagenz) umgesetzt werden.
Es ist vorteilhaft, das Enzym mit einer Stelle am Antikörper, die von der Antigen-Bindungsstelle weit entfernt ist, zu verknüpfen. Dies kann beispielsweise durch Verknüpfung mit gespaltenen Interketten-Sulfhydrylgruppen erreicht werden, wie vorstehend erwähnt wurde. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Umsetzung eines Antikörpers, dessen Kohlenhydratteil oxidiert worden ist, mit einem Enzym, das mindestens eine freie Aminfunktion aufweist. Dies führt zu einer anfänglichen Schiffschen Base- (Imin)-Verknüpfung, die vorzugsweise durch Reduktion zu einem sekundären Amin, z. B. durch Borhydrid-Reduktion, unter Bildung des endgültigen Konjugats stabilisiert wird.
Aufgrund der Größe des Konjugats ist es normalerweise bevorzugt, einen einzigen Antikörper mit einem einzigen Enzymmolekül zu verknüpfen. Jedoch kann es vorteilhaft sein, eine Mehrzahl von Antikörper-Fragmenten, z. B. Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, an ein einzelnes Enzym zu binden, um dessen Bindungsaffinität oder -wirkungsgrad am Antigen-Ziel zu erhöhen. Alternativ kann es dann, wenn das Enzym nicht zu voluminös ist, geeignet sein, eine Mehrzahl von Enzymmolekülen mit einem einzigen Antikörper oder Antikörperfragment zu verknüpfen, um die Turnover-Zahl des Konjugats zu erhöhen und um die Geschwindigkeit der Abscheidung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels am Zielort zu steigern. Konjugate von mehr als einem Enzym und Antikörper können ebenfalls herangezogen werden, vorausgesetzt, daß sie den Zielort erreichen und keiner zu raschen Clearance unterliegen. Gemische von Konjugaten unterschiedlicher Größe oder von Konjugaten, die Aggregate enthalten, können verwendet werden, wobei auch hier die vorstehend genannten Kautelen zu berücksichtigen sind.
Das Antikörper-Enzym-Konjugat kann ferner mit einem Radioisotop oder mit einem Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzabbildung konjugiert werden oder für die Konjugation angepaßt werden, um die Clearance des Konjugats aus dem Kreislaufsystem des Säugetiers zu überwachen und sicherzustellen, daß eine ausreichende Lokalisierung am Zielort erfolgt ist, bevor das Substrat-Mittel-Konjugat verabreicht wird. Alternativ kann das Konjugat mit einer Markierung, z. B. einer radioaktiven Markierung, einer fluoreszierenden Markierung oder dergl., die einen Nachweis und eine quantitative Bestimmung in Körperflüssigkeiten, z. B. in Blut und Urin, gewährleisten, markiert werden, so daß die zielgerichtete Abgabe und/oder die Clearance gemessen und/oder indirekt ermittelt werden können.
Beliebige herkömmliche Verfahren zur radioaktiven Markierung, die sich zur Markierung von Proteinen für die in vivo-Anwendung eignen, sind allgemein für die Markierung von Antikörper-Enzym-Konjugaten und häufig auch für die Markierung von Substrat-Mittel-Konjugaten geeignet, wie aus den nachstehenden Ausführungen hervorgeht. Dies kann durch direkte Markierung, beispielsweise mit I-131 und I-123, durch Metallisierung, beispielsweise mit Tc-99 m oder Cu-Ionen, oder dergl. unter Anwendung herkömmlicher Techniken oder durch Anbringen eines chelatbildenden Mittels für ein radioaktives Metall oder ein paramagnetisches Ion erfolgen. Derartige Chelatbildner und ihre Möglichkeiten zur Befestigung an Antikörpern sind dem Fachmann geläufig und sind unter anderem beispielsweise in den vorerwähnten Goldenberg-Patenten und im Artikel von Childs et al., J. Nuc. Med., Bd. 26 (1985), S. 293, beschrieben.
Das Substrat-Mittel-Konjugat umfaßt ein Substrat, das durch ein lokalisiertes Enzym des Antikörper-Enzym-Konjugats in ein Produkt umgewandelt werden kann. Bei dem Mittel handelt es sich um ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel, dessen zielgerichtete Abgabe an einen speziellen Ort für dessen Wirksamkeit von Vorteil ist. Zu derartigen therapeutischen und diagnostischen Mitteln gehören z. B. Toxine, antibiotische oder chemotherapeutische Arzneistoffe, Radioisotope, paramagnetische Ionen, Bor-Addenden, Cytokine, Photosensibilisatoren, Radiosensibilisatoren, Vasodilatatoren und dergl.
Das Substrat-Mittel-Konjugat muß zum Zwecke der Verabreichung und zum Transport zum Zielort löslich sein. Es muß auch in der Lage sein, das Ziel zu erreichen und zu einem Produkt umgewandelt zu werden, das im Vergleich zum Konjugat einen wesentlich günstigeren Verteilungskoeffizient zur Anziehung an den entsprechenden Ort aufweist. Der hier verwendete Ausdruck "löslich" bedeutet eine Löslichkeit in der Flüssigkeit, in der es verabreicht wird und mit der es zum Zielort transportiert wird, in einem ausreichenden Maße, um den Transport einer diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Menge des Konjugats zu diesem Ort zu ermöglichen. Normalerweise erfolgt die Verabreichung in den Blutstrom durch intravenöse oder intraarterielle Infusion. Das Konjugat muß im Serum löslich sein und vorzugsweise in ausreichendem Maße hydrophil sein, daß es weitgehend von der wäßrigen Phase des Serums transportiert wird und relativ leicht durch die Wände der Blutgefäße in die Interstitialflüssigkeit diffundieren kann, und zwar in Fällen, wo dies notwendig ist.
Natürlicherweise ist im Fall einer kardiologischen Abbildung oder der Abbildung oder Therapie von atherosklerotischen Plaques oder dergl., wo der Zielort im Kreislaufsystem liegt, die hydrophile/lipophile Löslichkeit nicht ebenso wichtig wie eine Verringerung der Serumlöslichkeit unter Spaltung des Substrat-Mittel-Konjugats durch das Enzym zu einem Produkt, das sich in günstigerer Weise auf das Ziel verteilt. Gerade diese Verteilung des Mittels, die erfolgt, nachdem die Enzym-Komponente des zielgerichteten Antikörper-Enzym-Konjugats auf das Substrat-Mittel- Konjugat eingewirkt hat, so daß sich das Mittel am Zielort in erheblich größerem Maße ansammelt, als dies für das Substrat-Mittel-Konjugat in Abwesenheit des Enzyms der Fall wäre, stellt das charakteristische Merkmal für den erfindungsgemäßen Aufspürmechanismus dar. Dies wird im Rahmen von einigen allgemeinen Beispielen und einer ausführlicheren Beschreibung verschiedener Spezies besser verständlich.
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Substrat-Mittel-Konjugats beinhaltet die kovalente Bindung von mindestens einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel an ein Substrat.
Bestimmte zytotoxische Arzneistoffe, die sich für die Antikrebstherapie eignen, sind in Serum relativ unlöslich. Einige sind in unkonjugierter Form recht toxisch, wobei ihre Toxizität durch Umwandlung in Konjugate erheblich verringert wird. Die Umwandlung eines relativ schlecht löslichen Arzneistoffes in ein stärker lösliches Konjugat, z. B. ein Glucuronid, verbessert dessen Löslichkeit in der wäßrigen Phase des Serums und dessen Fähigkeit zur Passage durch venöse, arterielle oder kapillare Zellwände und zum Erreichen der Interstitialflüssigkeit, die den Tumor umgibt. Tatsächlich stellt die Umwandlung von bestimmten toxischen Substanzen, wie aromatischen oder alicyclischen Alkoholen, Thiolen, Phe nolen und Aminen, zu Glucuroniden in der Leber das körpereigene Verfahren zur Entgiftung dieser Stoffe und zu ihrer leichteren Ausscheidung im Urin dar.
Der Arzneistoff wird an Glucuronsäure unter Bildung des Glucuronids gebunden, wodurch das Konjugat löslich gemacht wird. Die Bindung oder Befestigung erfolgt üblicherweise an eine Hydroxyl-, Thiol- oder Aminfunktion des Arzneistoffes, wodurch eine Acetal-, Thioacetal- oder Aminoacetalgruppe mit dem Aldehydkohlenstoff der Glucuronsäure gebildet wird. Das Konjugat kann am Zielort durch das Enzym Glucuronidase gespalten werden, wobei dieses Enzym dann die Enzymkomponente des Antikörper- Enzym-Konjugats darstellt. Der freie Arzneistoff ist dann in der Interstitialflüssigkeit erheblich weniger gut löslich und neigt zur Abscheidung an der Zellmembran von umgebenden Zellen und übt seine zytotoxische Wirkung am Ort der Lokalisierung des Antikörper-Enzym-Konjugats aus.
Ein Verfahren zur Herstellung derartiger Glucuronide besteht darin, daß man einem Säugetier, z. B. einer Kuh, einer Ziege, einem Pferd oder einem Primaten, eine Injektion des Arzneistoffes verabreicht. Ein Teil des Arzneistoffes wird in der Leber des Tieres in Glucuronide umgewandelt. Das Arzneistoff-Glucuronid-Konjugat wird sodann im Urin ausgeschieden. Der Arzneistoff wird vorzugsweise durch langsame intravenöse Infusion über eine Leberpumpe, durch die Leberarterie oder die Pfortader verabreicht. Sodann kann man den Urin sammeln und das Glucuronid-Konjugat extrahieren, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie. Eine alternative Möglichkeit besteht in der Umsetzung von UDP-Glucuronsäure mit dem Arzneistoff und in der anschließenden Isolierung des Glucuronids aus dem Reaktionsgemisch. Die Umsetzung kann durch Enzyme, die aus dem endoplasmatischen Retikulum der Leber von Säugetieren isoliert worden sind, katalysiert werden und/oder die Umsetzung kann in Gegenwart von Extrakten oder Gewebehomogenisaten des endoplasmatischen Retikulums vorgenommen werden.
Ein Typ von Antitumor-Arzneistoff, der in ein derartiges Substrat umgewandelt werden kann, ist Epirubicin, ein 4'-Epimeres von Doxorubicin (Adriamycin), bei dem es sich um ein Anthracyclin-glycosid handelt und von dem gezeigt worden ist, daß es ein Substrat für humane beta-D-Glucuronidase darstellt (Arcamone, Cancer Res., Bd. 45 (1985), S. 5995). Von weiteren Analogen, die eine geringere Anzahl an polaren Gruppen aufweisen, ist zu erwarten, daß sie stärker lipophil und für einen derartigen Weg vielversprechender sind. Weitere Arzneistoffe, Toxine, Borverbindun gen oder mit aromatischen oder alicyclischen Alkohol-, Thiol- oder Amingruppen chelatbildende Mittel stellen ebenfalls Kandidaten für eine derartige Konjugatbildung dar.
Ein weiterer Typ für ein Substrat-Mittel-Konjugat ist ein Polymeres mit einer Mehrzahl von Mitteln, die in Abständen entlang des Polymergerüstes gebunden sind. Das Polymere kann so beschaffen sein, daß es ein Substrat für die Enzymkomponente des Antikörper-Enzym-Konjugats darstellt oder es kann Segmente oder Verzweigungen aufweisen, die Substrate für ein derartiges Enzym darstellen. Die Moleküle des Mittels werden an das Polymere so gebunden, daß eine Spaltung durch das Enzym das Mittel in der Weise freisetzt, daß es frei von Polymereinheiten ist oder an eine ausreichend geringe Anzahl von Einheiten gebunden ist, so daß es die erforderliche geringere Löslichkeit oder einen günstigeren Verteilungskoeffizienten für Zellen, Gewebe, Läsionskomponenten oder ähnliche Loci am Zielort, bezogen auf die diese Loci umgebende Flüssigkeit, aufweist.
Zu Beispielen für Polymere für einen derartigen Anwendungszweck gehören beispielsweise Polyole, Polysaccharide, Polypeptide und dergl. Ein Polysaccharidtyp ist Dextran, ein alpha-Glycosid, das durch das Enzym Dextranase gespalten werden kann. Das diagnostische oder therapeutische Mittel kann so funktionalisiert werden, daß es Gruppen enthält, die gegenüber den Dextranhydroxylgruppen reaktiv sind, z. B. Anhydride, Isocyanate oder Isothiocyanate und dergl. Alternativ kann Dextran auf verschiedenen Wegen einer Derivatbildung unterzogen werden, z. B. durch Umwandlung in ein Aminodextran.
Das Verfahren zur Herstellung eines Substrat-Mittel-Konjugats mit einem Aminodextran (AD)-Träger beginnt normalerweise mit einem Dextran- Polymeren, vorzugsweise mit einem Dextran mit einem Molekulargewichtsmittel (MG) von etwa 10 000-100 000, vorzugsweise etwa 10 000-40 000 und insbesondere etwa 15 000. Das Dextran wird sodann mit einem Oxidationsmittel umgesetzt, um eine kontrollierte Oxidation eines Teils seiner Kohlenhydratringe unter Erzeugung von Aldehydgruppen durchzuführen. Die Oxidation wird zweckmäßigerweise mit glycolytischen chemischen Reagenzien, z. B. mit NaIO&sub4;, gemäß herkömmlichen Verfahrensweisen vorgenommen.
Es ist zweckmäßig, die Menge des Oxidationsmittels so einzustellen, daß etwa 50-150 und vorzugsweise 100 Aldehydgruppen für ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 erzeugt werden, wobei etwa das gleiche Verhältnis von Aldehydgruppen für Dextrane mit anderen Molekulargewichten gilt. Eine größere Anzahl von Aldehydgruppen und anschließenden Amingruppen ist weniger vorteilhaft, weil sich das Polymere dann mehr wie Polylysin verhält und auch gegenüber einer Enzymspaltung beständig sein kann. Eine geringere Anzahl führt zu einer unerwünscht niedrigen Beladung mit Arzneistoff, Toxin, chelatbildendem Mittel oder Bor-Addenden, was nachteilig sein kann, insbesondere wenn die Turnover-Zahl des Enzyms nieder ist.
Das oxidierte Dextran wird sodann mit einem Polyamin, vorzugsweise einem Diamin und insbesondere einem Mono- oder Polyhydroxydiamin umgesetzt. Zu geeigneten Aminen gehören beispielsweise Ethylendiamin, Propylendiamin oder ähnliche Polymethylendiamine, Diethylentriamin oder ähnliche Polyamine, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder andere ähnliche hydroxylierte Diamine oder Polyamine und dergl. Es kann ein Überschuß des Amins in bezug auf die Aldehydgruppen eingesetzt werden, um eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Aldehydfunktionen in Schiffsche Basen (Imin)-Gruppen zu gewährleisten.
Eine reduktive Stabilisierung des erhaltenen Zwischenprodukts wird durch Umsetzung des Schiffsche Basen-Zwischenprodukts mit einem Reduktionsmittel, z. B. NaBH&sub4;, NaBH&sub3;CN oder dergl., durchgeführt. Ein Überschuß des Reduktionsmittels wird eingesetzt, um eine im wesentlichen vollständige Reduktion der Imingruppen in sekundäre Amingruppen und eine Reduktion von etwaigen nicht-umgesetzten Aldehydgruppen zu Hydroxylgruppen zu gewährleisten. Das erhaltene Addukt kann ferner durch Passage über eine herkömmliche Größenausschlußsäule zur Entfernung von vernetzten Dextranen gereinigt werden. Eine Schätzung bezüglich der Anzahl der verfügbaren primären Aminogruppen am AD kann durch Umsetzung einer abgewogenen Probe mit Trinitrobenzolsulfonsäure und Korrelation der optischen Dichte bei 420 nm mit einem Standard durchgeführt werden. Dieses Verfahren ergibt normalerweise eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der berechneten Anzahl an Aldehydgruppen zu primären Amingruppen am AD.
Alternativ kann das Dextran nach herkömmlichen Verfahren einer Derivatbildung zur Einführung von Aminfunktionen, z. B. durch Umsetzung mit Bromcyan, unter anschließender Umsetzung mit einem Diamin unterzogen werden.
Das AD ist mit einem Derivat des speziellen Arzneistoffes, Toxins, chelatbildenden Mittels oder Bor-Addenden in einer aktivierten Form, vorzugsweise einem carboxylaktivierten Derivat, das durch herkömmliche Maßnahmen, z. B. unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder einer wasserlöslichen Variante davon, hergestellt worden ist, umzusetzen.
Methotrexat (MTX) ist ein typischer Arzneistoff zur Verwendung bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Konjugaten. Es wird zur Erläuterung einer der Vorgehensweisen eingesetzt. Analoge Stufen werden für andere Arzneistoffe, Toxine, chelatbildende Mittel und Bor-Addenden herangezogen, wobei entsprechende Modifikationen, die für den Fachmann leicht ersichtlich sind, vorgenommen werden. Eine Aktivierung von MTX wird zweckmäßigerweise mit beliebigen herkömmlichen carboxylaktivierenden Reagenzien, z. B. DCC, unter fakultativer anschließender Umsetzung mit N- Hydroxysuccinimid (HOSu) unter Bildung des aktiven Esters durchgeführt. Die Umsetzung wird normalerweise in einem polaren, aprotischen Lösungsmittel, z. B. Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder dergl., vorgenommen. Weitere aktivierte Ester, z. B. p-Nitrobenzoat und dergl., können ebenfalls verwendet werden, sowie gemischte Anhydride. Die DCC/HOSu-Aktivierung ist ein milder Vorgang. Das aktivierte MTX kann in einem wäßrigen Medium mit dem AD umgesetzt werden, so daß es bevorzugt ist.
Die Verhältnisse von aktiviertem MTX zu AD sind vorzugsweise so beschaffen, daß etwa die Hälfte der Aminogruppen, die am AD verfügbar sind, unter Bildung von Amidbindungen mit den Carboxylgruppen des aktivierten MTX reagieren. Wenn somit etwa 100 Amingruppen am AD mit einem Ausgangsmolekulargewicht von etwa 40 000 verfügbar sind, so sollen bis zu etwa 50 dieser Gruppen mit aktiviertem MTX umgesetzt werden. Bei Anwendung eines Verhältnisses NTX : AD von etwa 50 : 1 werden normalerweise etwa 25-50 MTX- Moleküle eingeführt. Es ist schwierig, eine höhere Beladung zu erreichen, was auf die beginnende Fällung des Addukts aufgrund von dessen zunehmender Unlöslichkeit zurückzuführen ist.
Als ein erläuterndes Beispiel für Anpassungen, die für andere Arzneistoffe vorzunehmen sind, kann die Beladung mit 5-Fluoruracil (5-FU) durch Oxidation von 5-Fluoruridin am Kohlenhydratteil, beispielsweise unter Verwendung von Periodat, durchgeführt werden, wobei man das Zwischenprodukt mit einem Aminodextran umsetzt und das Schiffsche Basen-Addukt reduktiv stabilisiert. Cycloheximid kann durch direkte Umsetzung der Cyclohexanoncarbonylgruppe mit Aminodextran-Amingruppen unter anschließender reduktiver Stabilisierung oder durch Umsetzung seiner Seitenketten-Hydroxylgruppen mit einem Überschuß eines Diisothiocyanat-Linkers und Umsetzung des Isothiocyanat-Derivats mit Aminen am Aminodextran oder durch Umsetzung des Imidstickstoffs, beispielsweise mit einer Halogensäure oder einem Halogenester, unter anschließender Aktivierung des er haltenen Carboxylderivats, z. B. mit DCC, und Kondensation mit Aminen am Aminodextran durchgeführt werden.
Ein weiteres erläuterndes Beispiel ist das Antibiotikum Mitomycin C und dessen Analoge. Dieses Molekül weist eine Aminfunktion und eine cyclische Iminfunktion auf. Beide Gruppen können mit einer alkylierenden Aktivierungsgruppe, z. B. Succinimidyloxyiodacetat oder Sulfosuccinimidyloxy-(4-iodacetyl)-aminobenzoat (Sulfo-SIAB), umgesetzt werden, wobei das erhaltene Zwischenprodukt anschließend zur Alkylierung von Amingruppen an einem Aminodextran herangezogen wird. Alternativ lassen sich Carboxylgruppen einführen, indem man z. B. Bernsteinsäureanhydrid verwendet, wonach eine Aktivierung, beispielsweise mit DCC, vorgenommen wird und das aktivierte Zwischenprodukt auf die vorstehend geschilderte Weise gekuppelt wird.
Toxine, z. B. antivirales Kermesbeere-Protein (pokeweed antiviral protein, PAP) oder die Ricin-A-Kette und dergl., können an Aminodextrane durch Glutaraldehyd-Kondensation oder durch Umsetzung von aktivierten Carboxylgruppen am Protein mit Aminen am Aminodextran gekuppelt werden.
Neben den vorstehenden speziellen Beispielen sind zahlreiche Arzneistoffe und Toxine bekannt, die eine zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen oder auf Mikroorganismen, die beim Menschen eine Infektion oder eine Läsion hervorrufen können, ausüben. Derartige Stoffe sind in zusammenfassenden Werken über Arzneistoffe und Toxine, z. B. im Merck-Index, aufgeführt. Beliebige derartige Arzneistoffe können durch herkömmliche, bekannte Maßnahmen auf AD geladen werden, und zwar in analoger Weise zu den vorstehenden Ausführungen. Die Möglichkeit, einen Arzneistoff in Form eines erfindungsgemäßen Konjugats partiell oder vollständig zu detoxifizieren, während sich das Konjugat im Kreislauf aufhält, kann systemische Nebenwirkungen des Arzneistoffes verringern und dessen Anwendung ermöglichen, wenn eine systemische Verabreichung des nicht-konjugierten Arzneistoffes inakzeptabel ist. Beispielsweise sind MTX und Cycloheximid häufig bei systemischer Verabreichung zu toxisch. Eine Verabreichung einer größeren Anzahl von Molekülen des mit einem Substratträger konjugierten Arzneistoffes gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine Therapie bei gleichzeitiger Abmilderung der systemischen Toxizität.
Die Beladung des Substratträgers mit Arzneistoffen hängt ab von der Löslichkeit (Verteilungskoeffizient zwischen der einen Zielort umgebenden Flüssigkeit und den als Ziel dienenden Zellen, Geweben und anderen Strukturen, z. B. atherosklerotischen Plaques, Fibringerinnseln, Virusparti keln, Parasiten und dergl.) und vom Wirkungsgrad der Spaltung der Substratmoleküle oder der Untereinheiten durch das Enzym unter Freisetzung eines Produkts, das den Arzneistoff umfaßt, der einen ausreichend günstigen Verteilungskoeffizienten in bezug zum Ziel aufweist, daß sich die gewünschte therapeutische Wirkung ergibt. Im allgemeinen ist es wünschenswert, ein Dextran mit einem Arzneistoff in einem Verhältnis von Monosaccharid-Untereinheiten zu Arzneistoff von etwa 3 bis etwa 25 zu beladen, wobei es sich hierbei aber um bevorzugte und nicht um begrenzende Mengen handelt. Eine sehr schwere Beladung der Arzneistoffmoleküle kann die Enzymaktivität vorwiegend aufgrund einer sterischen Hinderung der Bindung des Substrat-Konjugats an das aktive Zentrum des Enzyms hemmen. Eine zu leichte Beladung kann zu einer unzureichenden Verringerung der Löslichkeit des Arzneistoffes in der Flüssigkeit als Folge der Enzymspaltung führen, da möglicherweise ein geringerer Anteil des Polysaccharid-Arzneistoff-Konjugats vom gebundenen Enzym wegdiffundiert, bevor genügend Zuckeruntereinheiten abgespalten sind, um die Löslichkeit in ausreichendem Maße zu verringern, daß der Arzneistoff (an dem möglicherweise noch einige Glycosid-Untereinheiten gebunden sind) in günstiger Weise aus der umgebenden Flüssigkeit unter Ansammlung am Zielort (z. B. an einer Tumorzellmemebran, an einer bakteriellen Zellwand, an einer artherosklerotischen Plaque oder an einem Fibringerinnsel und dergl.) abgeschieden wird. Bei Toxinen kann eine weniger starke Beladung als bei Arzneistoffen vorgenommen werden, da es sich hierbei häufig um größere Proteine handelt.
Aus dem Stand der Technik sind auch chelatbildende Mittel für radioaktive Metalle oder verstärkende Mittel für die magnetische Resonanz bekannt. Typischerweise handelt es sich um Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA). Diese Produkte weisen typischerweise Gruppen an der Seitenkette auf, mit denen das chelatbildende Mittel an einem Träger befestigt werden kann. Diese gleiche Gruppe kann zur Kupplung des chelatbildenden Mittels an Amingruppen an einem AD herangezogen werden. Alternativ können Carboxyl- oder Amingruppen an einem chelatbildenden Mittel an ein AD-Aktivierungsprodukt gekuppelt werden oder es kann eine vorherige Derivatisierung und anschließende Kupplung vorgenommen werden, wobei es sich durchweg um bekannte Verfahren handelt. Beispielsweise weist Deferoxamin, ein Chelatbildner für Ga-67, eine freie Amingruppe auf, die mit einem geeigneten Linker aktiviert werden kann, so daß eine aktivierte Carboxyl-, Isothiocyanat- oder ähnliche Gruppe enthalten ist. Anschließend kann eine Kupplung an Amingruppen an einem AD durchgeführt werden. Weitere Verfahren zur Verknüpfung von Chelatbildnern mit Aminen an einem AD sind für den Fachmann je nach der Funktionalität des chelatbildenden Mittels ersichtlich.
Bor-Addenden, z. B. Carborane, lassen sich dann, wenn sie am Substrat-Konjugat angebracht und mittels des Antikörpers zielgenau auf Läsionen ausgerichtet sind, durch thermische Neutronenbestrahlung aktivieren und in radioaktive Atome umwandeln, die durch alpha-Emission unter Erzielung von stark zytotoxischen Wirkungen kurzer Reichweite zerfallen. Eine hohe Beladung mit Bor-Addenden sowie mit die magnetische Resonanz verstärkenden Ionen ist zur Potenzierung der Wirkung von starker Bedeutung. Carborane können auf bekannte Weise an Seitenketten mit Carboxylfunktionen versehen werden. Ein Anbringen dieser Carborane an ADs durch Aktivierung der Carboxylgruppen und durch Kondensation mit Aminen an den Trägern ermöglicht die Herstellung von wertvollen Substrat-Mittel-Konjugaten.
Das Substrat-Mittel-Konjugat kann eine große Anzahl an Boratomen enthalten und wird vorzugsweise aus Reagenzien, die in bezug auf das Bor- 10-Isotop angereichert sind, hergestellt. Bor enthaltende Reagenzien, die auf etwa 96% Bor-10 angereichert sind, sind im Handel erhältlich. Ein derartiges Konjugat erweist sich bei der neutronenaktivierten Radiotherapie als sehr nützlich, da es in der Lage ist, an den Tumorort oder an den Ort einer pathologischen Läsion eine ausreichende Anzahl an Boratomen zu transportieren, so daß sich bei thermischer Neutronenbestrahlung am Zielgewebe eine therapeutische Dosis von alpha-Teilchen ergibt, selbst wenn der prozentuale Anteil einer injizierten Dosis eines Antikörper-Enzym- Konjugats, das im Zielgewebe lokalisiert ist, relativ nieder ist, z. B. 1-10%. Derartige prozentuale Lokalisierungsanteile sind für Antikörper- Zielspezies nicht unüblich.
Mit Bor beladene Substrat-Konjugate weisen eine Anzahl von Boratomen pro Substratmolekül auf, die normalerweise mindestens etwa 50 bis etwa 10 000 und vorzugsweise etwa 200 bis etwa 2000 beträgt. Es sei wiederholt, daß bei diesen Atomen vorzugsweise eine Anreicherung in bezug auf Bor-10 von etwa 96% vorliegt, obgleich es kostengünstiger sein kann, ein Konjugat mit einer größeren Anzahl an Boratomen mit dem natürlichen 20%igen Anteil am Bor-10-Isotop einzusetzen.
Das Substrat-Mittel-Konjugat kann Reste enthalten, die kein Bor enthalten oder die Bor und andere geeignete Funktionen aufweisen, z. B. ein Radionuclid, insbesondere I-123, I-125 oder I-131, oder Funktionen, wie chelatbildende Mittel, Chelate mit Metallionen, Arzneistoffe, Toxine, Chromophore, Chromogene, fluoreszierende Marker und dergl., die alle einen Beitrag zur therapeutischen Wirkung leisten können oder die eine Überwachung der Abscheidung und/oder der Clearance des Bor-Addenden ermöglichen oder die eine komplementäre therapeutische Wirkung entfalten. Das Substrat-Mittel-Konjugat kann Funktionen enthalten, deren Hauptzweck darin besteht, die Lipidlöslichkeit des erhaltenen Enzym-Spaltungsprodukts, das den Bor-Addenden enthält, zu verbessern und dessen Wasserlöslichkeit zu verringern.
Zur Herstellung derartiger Konjugate eignen sich Bor-Käfigverbindungen aufgrund ihrer relativ einfachen Handhabung und aufgrund der Tatsache, daß derartige Käfigverbindungen jeweils 5-12 Boratome zum Zielort transportieren können. Bei den gebräuchlichsten und am leichtesten erhältlichen Arten von Bor-Käfigverbindungen handelt es sich um die Carborane. Der Fachmann kennt allgemeine Abhandlungen auf diesem Gebiet, die sich mit den meisten der nachstehend erörterten Umsetzungen befassen. Nachstehend sind die besten und umfassendsten Druckschriften aufgeführt: Muetterties et al., "Polyhedral Boranes", Dekker, New York, 1968; Muetterties, Hrsg., "Boron Hydride Chemistry", Academic Press, New York, 1975; und Grimes, "Carboranes", Academic Press, New York, 1970. Diese Druckschriften enthalten umfangreiche Bibliographien über spezielle Themen innerhalb des breiten Gebiets der Synthese von organischen Derivaten mit einem Gehalt an einer Mehrzahl von Boratomen. Das US-Patent 4 824 659 (Hawthorne) enthält eine Fülle von derartigen Einzelheiten.
Eine Alternative für ein alpha-Glycosid, wie Dextran oder Aminodextran, ist ein beta-Glycosid, wie Carboxymethylcellulose (CMC), das durch ein Cellulase-Enzym gespalten werden kann. Das Anbringen von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln an CMC erfolgt in analoger Weise wie bei Dextran, da es sich bei beiden Produkten um Zuckerpolymere handelt, die sich nur bezüglich der Stereochemie der glycosidischen Bindung unterscheiden. Eine Derivatisierung des CMC zum Anbringen von funktionellen Molekülen wird vermutlich am zweckmäßigsten erreicht, indem man es mit einem Carbodiimidtyp eines Kondensationsmittels umsetzt und eine Aminfunktion am diagnostischen oder therapeutischen Mittel zur Bildung von Amidbindungen heranzieht. Alternativ ergibt eine milde Oxidation mit Gly kol-Spaltungsreagenzien, z. B. Periodat, unter Bildung von Aldehydgruppen an einer Mehrzahl von Punkten entlang der Polymerkette unter anschließender Umsetzung mit einem Diamin die Bildung von Amino-CMC, die sich zur Umsetzung mit einer Vielzahl von unterschiedlichen funktionellen Gruppen eignet. Eine Kondensation der oxidierten CMC mit Aminen und eine Borhydrid-Stabilisierung ist ebenfalls praktikabel. Weitere Maßnahmen zum Anbringen von Mitteln an der CMC ergeben sich für den Fachmann in einfacher Weise.
Eine weitere Variante des Polymersubstrats ist ein Polymeres, das durch das Enzym nicht gespalten wird, das aber kurze Linker-Segmente eines Oligomeren trägt, bei dem es sich um ein Substrat für das Enzym handelt, und das Arzneistoffe, chelatbildende Mittel, Bor-Addenden und ähnliche diagnostische oder therapeutische Mittel trägt. Als ein Beispiel kann ein Polyvinylalkohol als Träger für eine Mehrzahl von kurzen Oligosacchariden, z. B. ein kurzes Dextran oder Cellulose-Oligomere mit beispielsweise 5-50 und vorzugsweise 5-20 Glycosid-Untereinheiten, verwendet werden. Der Polyvinylalkohol kann beispielsweise mit Bromcyan unter anschließender Diamin-Kondensation aminiert werden. Das Oligosaccharid kann beispielsweise mit Periodat in milder Weise oxidiert und mit dem aminierten Polymeren unter Bildung von Schiffscher Base-Verknüpfungen kondensiert werden, die vorzugsweise durch Borhydrid-Reduktion weiter stabilisiert werden. Das erhaltene, mit Oligomerem beladene Polymere kann sodann leicht aminiert werden, wie es vorstehend für Dextran oder Cellulose-Polymere beschrieben wurde, oder es kann anderweitig auf herkömmliche Weise funktionalisiert werden, um mindestens 2 und vorzugsweise etwa 2-5 Amingruppen an jedem Oligomer-Linker anzubringen. Durchschnittlich etwa 1-3 Arzneistoffmoleküle, chelatbildende Mittel, Bor-Addenden oder andere Mittel werden sodann mit jedem der Oligomeren konjugiert.
Es ist leicht ersichtlich, daß zahlreiche weitere Varianten in Betracht kommen. Die Kondensation der leicht oxidierten Dextran-Oligomer- Linker mit dem aminierten Polymeren und dem Arzneistoff oder einem anderen Mittel kann gleichzeitig oder sequentiell unter späterer Stabilisierung durchgeführt werden. Weitere funktionelle Gruppen an den Mitteln können zur Bindung an das Oligomere herangezogen werden. Weitere funktionelle Gruppen können zur Bindung des Oligomeren an den polymeren Träger eingesetzt werden.
Ein Acrylat-Polymeres kann verwendet werden, wobei Aminodextran-Oligomere daran durch Amidverknüpfungen, die durch Carbodiimid-Aktivierung der Acrylat-Carboxylgruppen gebildet worden sind, gebunden sind. Es kann ein Polypeptid verwendet werden, wobei die Oligomer-Linker an Carboxyl- oder Aminresten am Träger angebracht sind. Anstelle eines Oligosaccharid- Linkers kann ein kurzer Polyester- oder Oligopeptid-Linker zusammen mit einer Esterase und einem Peptidase-Enzym, das den Linker spaltet, verwendet werden. Der Fachmann ist dazu in der Lage, weitere Varianten aufzufinden, die unter den breiten Umfang der Erfindung fallen und die durch herkömmliche Syntheseverfahren hergestellt werden können.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, ein Träger-Polymeres, das die Arzneistoffe, chelatbildenden Mittel, Bor-Addenden oder andere Mittel trägt und das vom Ziel stark angezogen wird, in unmodifizierter Form zu verwenden, das dann aber durch Konjugation mit solubilisierenden Substratmolekülen modifiziert wird, die anschließend durch das zielgerichtete Enzym abgespalten werden. Ein Beispiel für diese Untergruppe eines Substrat-Mittel-Konjugats ist ein Polylysin, an das eine Mehrzahl von radioaktiven Metall- oder paramagnetischen Metall-Chelatbildnern, Carboranen oder MTX-Molekülen gebunden sind. Dieses Träger-Konjuat wird sodann mit einer Mehrzahl von kurzen Dextran-Oligomeren, z. B. durch Bildung einer Schiffschen Base mit leicht oxidiertem Dextran und Borhydrid- Stabilisierung, in einem Verhältnis kondensiert, das die Löslichkeit (Verringerung der "Klebrigkeit") des Polylysins erhöht und es im Serum leicht transportierbar und leicht durch die Kapillarwände diffundierbar macht (wobei es anschließend mit Radioisotop- oder paramagnetischen Ionen beladen wird, wenn die chelatbildenden Mittel am Träger angebracht werden). Am Zielort, z. B. einem Tumor, streift ein lokalisiertes Antitumor- Antikörper-Dextranase-Konjugat den Dextranüberzug vom Polylysin in ausreichendem Maße ab, um es erneut "klebrig" zu machen, wonach es an den Tumorzellen haftet. Das gebundene Polylysin, das mit dem diagnostischen oder therapeutischen Mittel beladen ist, wirkt sodann auf die Tumorzelle ein, um eine Abbildung oder eine zytotoxische Therapie zu ermöglichen. Ein stark aminiertes Aminodextran kann die Funktion eines Polylysins ausüben und kann mit kurzen oligomeren Substrat-Linkern gemäß der vorstehenden Erörterung substituiert sein. Es ist gegenüber Zellmembranen und anderen Geweben auf ähnliche Weise "klebrig" wie Polylysin. Andere Polypeptide oder stark aminierte Polymere können in analoger Weise als Träger für eine Substratbeschichtung und für die Solubilisierung dienen. Tatsächlich ist eine Aminierung für die Funktion des beladenen Trägers nicht wesentlich, da jede beliebige Funktionalität, die eine günstige Vertei lung von einem Konjugat eines Trägers und einem oder mehreren diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln bewirkt, durch solubilisierende Substrat-Oligomere oder auch durch kleine Substratmoleküle maskiert werden kann, so daß das erhaltene, stärker lösliche Konjugat bereitwillig im Serum oder einer anderen Flüssigkeit für die Verabreichung zirkuliert und in der Flüssigkeit, die den Zielort umgibt, weniger gut löslich wird, nachdem die Beschichtungsmoleküle durch Einwirkung des lokalisierten Enzyms des Antikörper-Enzym-Konjugats abgespalten worden sind.
Die Verhältnisse von beladenem Träger-Polymeren zu "beschichtenden" solubilisierenden Substratgruppen oder Oligomeren hängen von der Art des Zielortes und den Eigenschaften der Komponenten ab. Wenn ein Polylysin oder ein funktionelles Äquivalent davon als Träger verwendet werden, wird die Beschichtung mit Oligodextran vorteilhafterweise in einem Dextran : Polylysin-Gewichtsverhältnis von etwa 1 : 10 bis etwa 100 : 1, vorzugsweise von etwa 1 : 1 bis etwa 10 : 1 und insbesondere von etwa 3 : 1 bis etwa 7 : 1 durchgeführt. Ein Beispiel ist ein Polylysin mit einem Molekulargewicht von etwa 1500 Dalton, das mit etwa 3 bis 7 Dextran-Oligomeren mit einem Molekulargewicht von jeweils etwa 15 000 Dalton beschichtet ist.
Es ist ersichtlich, daß die Clearance des Antikörper-Enzym-Konjugats und/oder des Substrat-Enzym-Konjugats nach einer für die Lokalisierung oder Abscheidung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels ausreichenden Zeitspanne beschleunigt werden kann, indem man einen zweiten Antikörper verwendet, um das Konjugat zu komplexieren und dessen Aufnahmegeschwindigkeit durch Makrophagen oder das retikuloendotheliale System zu erhöhen, wie es beispielsweise im US-Patent 4 624 846 (Goldenberg) beschrieben ist. Die optimale Zeitspanne für die Clearance durch einen derartigen zweiten Antikörper läßt sich mit Hilfe einer Markierung an beiden Konjugaten bestimmen, so daß das Ausmaß der Lokalisierung des Antikörper- Enzym-Konjugats am Zielort und/oder das Ausmaß der Abscheidung des Mittels am Zielort sowie die biologische Verteilung von nicht-zielgerichteten Konjugaten überwacht werden kann.
Die Reagenzien werden zweckmäßigerweise als doppelte injizierbare Präparate zur therapeutischen und diagnostischen Anwendung beim Menschen bereitgestellt. Das erste injizierbare Präparat enthält eine wirksame Menge eines Antikörpers oder Antikörperfragments in Konjugation mit einem Enzym in einem pharmazeutisch verträglichen Injektionsträger, vorzugsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem physiologischen pH-Wert und einer physiologischen Konzentration. Das zweite injizierbare Präparat enthält eine wirksame Menge eines löslichen Substrats, das mit mindestens einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel konjugiert ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Injektionsträger, der im allgemeinen dem Träger, der für das erste Präparat verwendet wird, ähnlich ist. Die Injektionspräparate sind vorzugsweise steril, insbesondere wenn sie für die Anwendung beim Menschen vorgesehen sind.
Die Reagenzien können auch in zweckmäßiger Weise in Form eines therapeutischen oder diagnostischen Kits zum zielgerichteten Transport des Antikörpers zu einem Zielort bereitgestellt werden, wobei man zwei geeignete Behälter verwendet. Der erste Behälter weist eine wirksame Menge eines Antikörpers oder Antikörperfragments, die kovalent an ein Enzym gebunden sind, auf. Der zweite Behälter weist eine wirksame Menge eines löslichen Substrats auf, das mit mindestens einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel konjugiert ist. Die Reagenzien lassen sich zur Erzielung einer längeren Lagerbeständigkeit lyophilisieren oder in Form von Lösungen, die gegebenenfalls herkömmliche Konservierungsmittel, Stabilisatoren und dergl. enthalten, bereitstellen. Weitere fakultative Komponenten von derartigen Kits sind normalerweise Behälter von Puffern, Markierungsmitteln, Radioisotopen, paramagnetischen Verbindungen, zweiten Antikörpern für eine verstärkte Clearance und herkömmliche Spritzen, Säulen, Fläschchen und dergl.
Das erfindungsgemäße Produkt wird normalerweise durch parenterale Injektion verabreicht. Bei den verschiedenen Typen von parenteralen Injektionen kann es sich (ohne Beschränkung hierauf) um eine intrakavitäre (z. B. intraperitoneale), intravenöse, intraarterielle, intrapleurale, intrathekale, intramuskuläre, intralymphatische und regional intraarterielle, intraläsionale, subkutane Injektion, um eine Katheterperfusion und dergl. handeln.
Zur Abbildung und/oder Therapie von Karzinomen wird normalerweise eine intravenöse, intraarterielle oder intrapleurale Verabreichung für Lungen-, Brust- und leukämische Tumoren herangezogen. Eine intraperitoneale Verabreichung ist für Ovarialtumoren vorteilhaft. Eine intrathekale Verabreichung ist für Gehirntumoren und Leukämie vorteilhaft. Eine subkutane Verabreichung ist für die Hodgkin-Krankheit, Lymphome und Brustkarzinome vorteilhaft. Eine Katheterperfusion eignet sich für metastatische Lungen-, Brust- oder Keimzellenkarzinome der Leber. Eine intraläsionale Verabreichung eignet sich für Lungen- und Brustläsionen.
Die vorstehenden Ausführungen erläutern die allgemeinen Verfahren zur Verabreichung der Antikörper-Enzym-Konjugate und der Konjugate aus Substrat und therapeutischem oder diagnostischem Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung. Es ist ersichtlich, daß die Verabreichungsarten für die beiden verschiedenen Konjugate möglicherweise nicht gleich sind, da sich im allgemeinen die Clearancewege und die Bioverteilungen der Konjugate voneinander unterscheiden. Beispielsweise kann eine intraperitoneale Verabreichung eines Antikörper-Enzym-Konjugats zur Abbildung eines Ovarialtumors vorteilhaft sein, während eine intravenöse Verabreichung eines Radioisotop-Substrat-Konjugats für eine Abbildung erwünscht sein kann, da dies eine bessere Kontrolle der Abscheidungsgeschwindigkeit und eine leichte Überwachung der Clearance-Geschwindigkeit ergibt.
Das Antikörper-Enzym-Konjugat wird im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung in PBS, vorzugsweise in Form einer sterilen Lösung, verabreicht, insbesondere wenn es für die Anwendung beim Menschen vorgesehen ist. Vorteilhafterweise werden Dosiseinheiten von etwa 50 ug bis etwa 5 mg des Antikörper-Enzym-Konjugats verabreicht, entweder in einer einzigen Dosis oder in unterteilten Dosen, obgleich auch in besonderen Fällen kleinere oder größere Dosen indiziert sein können. Es kann erforderlich sein, die Dosierung zu verringern und/oder Antikörper von anderen Spezies und/oder hypoallergene Antikörper, z. B. Fragmente oder hybride Human- oder Primaten-Antikörper, zu verwenden, um die Empfindlichkeit des Patienten zu verringern, insbesondere für therapeutische Zwecke und insbesondere wenn wiederholte Verabreichungen im Verlauf einer Therapie oder für zusätzliche diagnostische Maßnahmen erforderlich sind. Ein Hinweis für die Notwendigkeit von derartigen vorsorglichen Maßnahmen besteht in einer erhöhten Human-anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Bildung, die durch einen Immunoassay bestimmt werden kann.
Üblicherweise dauert es 2 bis 14 Tage und vorzugsweise 5 bis 14 Tage, bis sich ein IgG-Antikörper am Zielort lokalisiert und im wesentlichen aus dem Kreislaufsystem des Säugetiers beseitigt ist, bevor die Verabreichung des Substrat-Mittel-Konjugats erfolgt. Die entsprechenden Lokalisierungs- und Clearance-Zeiten für F(ab)&sub2;- und F(ab')&sub2;-Antikörperfragmente betragen etwa 2 bis 7 Tage und vorzugsweise 4 bis 7 Tage sowie 1 bis 3 Tage und vorzugsweise 3 Tage für Fab- und Fab'-Antikörperfragmente. Andere Antikörper können einen unterschiedlichen Zeitrahmen bis zur Lokalisierung am Zielort benötigen. Der vorstehende Zeitrahmen kann durch das Vorliegen des konjugierten Enzyms beeinflußt werden. Auch hier ist darauf hinzuweisen, daß eine Markierung des Antikörper-Enzym-Konjugats eine Überwachung der Lokalisierung und der Clearance ermöglicht.
IgG wird normalerweise in der Leber und in geringerem Umfang im Verdauungssystem verstoffwechselt. F(ab)&sub2; und F(ab')&sub2; werden normalerweise vorwiegend in der Leber verstoffwechselt, können aber auch in der Leber und im Verdauungssystem verstoffwechselt werden. Fab und Fab' werden normalerweise vorwiegend in der Leber verstoffwechselt, können aber auch in der Leber und im Verdauungssystem verstoffwechselt werden.
Normalerweise ist es erforderlich, daß mindestens etwa 0,0001% der injizierten Dosis des Antikörper-Enzym-Konjugats am Zielort lokalisiert ist, bevor die Verabreichung des Substrat-Mittel-Konjugats erfolgt. Sofern ein höherer Zielwirkungsgrad für dieses Konjugat erreicht wird, kann dieser prozentuale Anteil höher sein, so daß eine geringere Dosis verabreicht werden kann.
Daraus folgt, daß es sich bei einer wirksamen Menge eines Antikörper-Enzym-Konjugats um eine Menge handelt, die für einen zielgerichteten Transport des Konjugats zum Antigen am Zielort ausreicht, wobei eine Menge des Enzyms gebunden wird, die ausreicht, um eine ausreichende Menge des löslichen Substrat-Mittel-Konjugats in ein Produkt umzuwandeln, so daß sich eine Ansammlung einer diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Menge des Mittels am Zielort ergibt.
Das Konjugat aus Substrat und therapeutischem oder diagnostischem Mittel wird im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung in PBS verabreicht. Auch hier handelt es sich um eine sterile Lösung, wenn eine Anwendung beim Menschen vorgesehen ist. Das Substrat-Mittel-Konjugat wird verabreicht, nachdem eine ausreichende Zeitspanne abgelaufen ist, daß sich das Antikörper-Enzym-Konjugat am Zielort lokalisiert und im wesentlichen aus dem Kreislaufsystem des Säugetiers beseitigt ist.
Konjugate eines mit einem Bor-Addenden beladenen Trägers für eine thermische Neutronen-Aktivierungstherapie werden normalerweise auf ähnliche Weise eingesetzt. Es ist vorteilhaft, abzuwarten, bis das nicht an das Ziel gelangte Substrat-Mittel-Konjugat beseitigt ist, bevor die Neutronenstrahlung vorgenommen wird. Eine derartige Clearance kann durch Verwendung eines zweiten Antikörpers beschleunigt werden, wie es beispielsweise aus dem US-Patent 4 624 846 bekannt ist.
Bei einer wirksamen Menge eines Substrat-Mittel-Konjugats handelt es sich um eine ausreichende Menge, um eine wirksame Menge des Mittels am Zielort abzugeben und um die Menge eines Substrats, die durch das Enzym unter Bildung des Produkts, das zu einer Anreicherung am Zielort tendiert, umgewandelt werden kann. Eine wirksame Menge eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels ist die Menge, die zur Behandlung oder zur Diagnose des Zielorts ausreicht.
Bei der Durchführung einer szintigraphischen Abbildung enthält das Substrat-Mittel-Konjugat eine radioaktiv markierte Spezies, die an ein Substrat gebunden ist. Hierbei kann es sich um ein Chelat eines radioaktiven Metalls oder um eine direkt iodierte oder metallisierte Verbindung handeln. Zu geeigneten gamma-emittierenden Isotopen gehören I-131, I-123, Tc-99m, In-111 und Ga-67. Beim Antikörper handelt es sich um einen Antikörper, der an ein Antigen am Zielort bindet. Beim Enzym handelt es sich um ein Enzym, das das Substrat-Mittel-Konjugat in ein Produkt umwandelt, das sich am Zielort in einer Menge anreichert, die zur Abbildung ausreicht. Nachdem das Isotop in ausreichender Menge am Zielort abgeschieden ist, wird ein Abtastvorgang entweder mit einer herkömmlichen planaren und/oder einer SPECT-gamma-Kamera oder unter Verwendung einer gamma-Handsonde, die extern oder intern eingesetzt wird, durchgeführt, um den Tumor, den Ort der mikrobiologischen Infektion, des Myokardinfakts, der artherosklerotischen Plaque oder einen anderen Zielort zu lokalisieren. Das Szintigramm wird normalerweise mit einer gamma-Abbildungskamera mit einem oder mehreren Fenstern zum Nachweis von Energien im Bereich von 50- 500 keV aufgenommen. Die Verwendung von Radioisotopen mit energiereichen beta- oder Positronen-Emissionen bringt die Verwendung von Abbildungskameras mit den geeigneten Detektoren mit sich, die alle dem Stand der Technik entsprechen.
Beispielsweise kann ein Polylysin-Oligomeres mit einer Mehrzahl von Aminomethyl-DTPA-Chelatbildnern unter Verwendung eines Succinimidyl-p- isothiocyanatobenzoat-Linkers (US-Patent 4 680 338) konjugiert werden, wobei die erhaltene Verbindung sodann mit einer Mehrzahl von schwach oxidierten Dextran-Oligomeren umgesetzt wird, die dann mit Borhydrid stabilisiert werden. Ein Patient, beispielsweise ein Krebspatient, erhält eine Injektion eines Konjugats eines Antitumor-Antikörpers und eines Dextranase-Enzyms, wonach 7 Tage gewartet wird, um eine Lokalisierung des Konjugats und eine Clearance des nicht an das Ziel gelangten Konjugats zu erreichen. Das Substrat-Chelatbildner-Konjugat wird sodann mit Indium- 111-Ionen beladen, in PBS steril filtriert und dem Patienten injiziert. Eine Ansammlung der Markierung ist nach etwa 3 Stunden ersichtlich. Die Clearance der Hintergrundmarkierung ist nach etwa 12-24 Stunden im we sentlichen vollständig. Zu diesem Zeitpunkt wird die Abbildung durchgeführt.
Eine magnetische Resonanzabbildung (MRI) wird nach einem analogen Verfahren zur szintigraphischen Abbildung durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Abbildungsmittel anstelle von Radioisotopen eine MRI-Verstärkungsspezies enthalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß die magnetische Resonanzerscheinung auf einem von der Szintigraphie abweichenden Prinzip beruht. Normalerweise steht das erzeugte Signal in Korrelation zu den Relaxationszeiten der magnetischen Momente von Protonen in den Kernen der Wasserstoffatome von Wassermolekülen im abzubildenden Bereich. Das die magnetische Resonanzabbildung verstärkende Mittel bewirkt eine Erhöhung der Relaxationsgeschwindigkeit, wodurch der Kontrast zwischen Wassermolekülen in dem Bereich, wo sich das Abbildungsmittel ansammelt, und Wassermolekülen an anderen Stellen im Körper verstärkt wird. Jedoch besteht die Wirkung des Mittels in einer Erhöhung sowohl von T&sub1; als auch von T&sub2;, wobei der erstgenannte Wert einen höheren Kontrast ergibt, während der letztgenannte Wert zu einem geringeren Kontrast führt. Demgemäß ist die Erscheinung konzentrationsabhängig. Normalerweise gibt es eine optimale Konzentration einer paramagnetischen Spezies für eine maximale Wirksamkeit. Diese optimale Konzentration hängt ab vom speziellen verwendeten Mittel, dem Abbildungsort, der Abbildungsart, z. B. Spin-Echo, Sättigung- Erholung, Inversion-Erholung und verschiedene andere stark T&sub1;-abhängige oder T&sub2;-abhängige Abbildungstechniken, und der Zusammensetzung des Mediums, in dem das Mittel gelöst oder suspendiert ist. Diese Faktoren und ihre relative Bedeutung sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise Pykett, Scientific American, Bd. 246 (1982), S. 78; und Runge et al., Am. J. Radiol., Bd. 141 (1987), S. 1209.
Zu Beispielen, die sich für eine Verstärkung der MRI-Abbildung eignen, gehören paramagnetische Gd(III)-, Eu(III)-, Dy(III)-, Pr(III)-, Pa(IV)-, Mn(II)-, Cr(III)-, Co (III)-, Fe (III)-, Cu(II)-, Ni(II)-, Ti(III)- und V(IV)-Ionen oder Radikale, z. B. Nitroxide. Diese werden mit einem Substrat konjugiert, das paramagnetische Ionen-Chelatbildner für die Ionen oder Linker für die Radikal-Addenden trägt. Das Verstärkungsmittel für die MR-Abbildung muß in ausreichenden Mengen vorliegen, um einen Nachweis durch eine externe Kamera zu ermöglichen, wobei magnetische Feldstärken angewandt werden, die vernünftigerweise erreichbar und mit der Sicherheit für den Patienten und der Instrumentenkonstruktion vereinbar sind. Die Anforderungen für derartige Mittel sind aus dem Stand der Technik für die Mittel bekannt, die auf Wassermoleküle im Medium einwirken; vergl. beispielsweise Pykett, a. a. O., und Runge et al., a. a. O.
Für die magnetische Resonanzabbildung (MRI) kann ein ähnliches Verfahren wie für die Szintigraphie herangezogen werden. Da es beim vorstehenden Beispiel erwünscht ist, eine große Anzahl von paramagnetischen Ionen im Hinblick auf einen hohen Kontrast der MRI-Verstärkung zu einem Zielort zu transportieren, wird das Polylysin mit einer größeren Menge an Chelatbildnern beladen und mehr Antikörper-Enzym-Konjugat und Substrat- Chelat-Konjugat werden verabreicht, um eine höhere Konzentration an paramagnetischen Ionen am Zielort abzuscheiden.
Die therapeutische Anwendung des erfindungsgemäßen Produkts kann durch Konjugation einer therapeutisch wirksamen Menge eines Radioisotops, wie Y-90 oder I-131 (die je nach der injizierten Menge sowohl zur Lokalisierung als auch zur Therapie eingesetzt werden können) oder eines Arzneistoffes, wie Adriamycin bei Krebs oder Gentamycin bei Infektionen, einer immunomodulatorischen Substanz, wie Poly-IC, oder eines biologischen Toxins, wie Kermesbeere-Mitogen, mit dem Substrat und durch Abscheidung einer therapeutisch wirksamen Menge des Mittels am Zielort erreicht werden. Die therapeutische Anwendung des erfindungsgemäßen Produkts kann auch durch Konjugation von einem oder mehreren Bor-10-Addenden mit dem Substrat erreicht werden, wobei nach Abscheidung von Bor-10 am Zielort, z. B. einem Tumor, eine externe thermische Neutronenbestrahlung des Tumors durchgeführt wird, um die neoplastischen Zellen zu zerstören. Das Bor-10-Konjugat kann mit einem Radioisotopen-Chelat markiert sein, um sicherzustellen, daß eine ausreichende Menge an Bor-Addenden am Zielort lokalisiert ist und daß im wesentlichen das gesamte nicht an das Ziel gelangte Bor-10 das Kreislaufsystem vor der Neutronenbestrahlung verlassen hat.
Die Dosierungseinheiten des Substrat-Mittel-Konjugats hängen von zahlreichen Faktoren ab, wobei jeder dieser Faktoren in relativ unkomplizierter Weise bestimmt werden kann, so daß eine optimale Dosimetrie vorgenommen werden kann. Bei der anfänglichen dosimetrischen Bewertung ist es hilfreich, ein radioaktiv markiertes Substrat-Mittel-Konjugat zu verwenden (wenn es sich beim Mittel nicht selbst um ein radioaktives Isotop handelt), um den Grad und die Geschwindigkeit zur Abscheidung des Mittels am Zielort und die Geschwindigkeit der Clearance und der Bioverteilung des nicht an das Ziel gelangten Konjugats zu bestimmen. Auch eine Verwendung eines markierten Antikörper-Enzym-Konjugats zur Bestimmung der Menge des am Zielort lokalisierten Enzyms unterstützt die dosimetrische Analyse.
Es kann erforderlich sein, Versuche für die Dosimetrie vorzunehmen, wobei man im allgemeinen zunächst ein Tiermodell (sofern verfügbar) heranzieht und sodann eine Reihe von Patientenuntersuchungen durchführt, um die Dosis des Substrat-Mittel-Konjugats in Funktion der Zugänglichkeit des Ortes, des Verabreichungsweges, der Turnover-Zahl des Enzyms, der am Ort erwünschten Dosis des Mittels und der Geschwindigkeit der Clearance des nicht an das Ziel gelangten Konjugats zu optimieren. Entsprechendes ist zu erwarten, und Techniken für die Optimierung liegen im Fachwissen des Arztes.
Es wird angenommen, daß der Fachmann ohne weitere Entwicklungsarbeiten unter Berücksichtigung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Umfang anwenden kann. Die folgenden bevorzugten speziellen Ausführungsformen dienen daher lediglich der Erläuterung und stellen keinerlei Beschränkung der übrigen Offenbarung dar. In den folgenden Beispielen werden sämtliche Temperaturen unkorrigiert in Grad Celsius angegeben. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Teil- und Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Herstellung eines Methotrexat/Aminodextran-Konjugats

(a) Aktivierung von Methotrexat

In ein trockenes Reaktionsgefäß (Reacti-vial) werden 45,4 mg Methotrexat (0,1 mMol, Sigma) in 1 ml wasserfreiem DMF mittels einer Spritze gegeben. Eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid (23 mg, 0,2 mMol, Sigma) in 7590 ul wasserfreiem DMF und eine Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (41,5 mg, 0,2 mMol, Sigma) in 750 ul wasserfreiem DMF werden anschließend zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Der weiße Niederschlag wird abzentrifugiert. Die klare Lösung wird bei -20ºC in einer verschlossenen Flasche gelagert.

(b) Umsetzung mit Aminodextran

Aminodextran (10 mg, 2,5 · 10&sup4; Mol) wird in 2 ml PBS vom pH-Wert 7,2 gelöst. Aktiviertes MTX (125 · 10&sup4; mMol) wird allmählich zugegeben. Die Lösung wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und über eine SephadexR G-25-Säule gereinigt. Das Hohlraumvolumen wird gesammelt und ferner gegen Reaktionspuffer dialysiert. Nach Lyophilisation erhält man 2,1 mg Produkt (21% Ausbeute). Für den Einbau von Methotrexat wird aufgrund der Absorption bei 370 nm ein Methotrexat/Dextran-Wert von 38 bestimmt.

Beispiel 2

Herstellung eines Chelatbildner-Polylysin/Dextran-Konjugats

Polylysin (MG 15 000) wird mit einer Menge des Succinimidyl-p- isothiocyanatobenzoat-Derivats von Aminomethyl-DTPA (ein Succinimidylbenzoat mit einer Thioharnstoffbindung an das DTPA) umgesetzt, die ausreicht, um durchschnittlich 5 DTPA-Reste am Polylysin zu befestigen. Das erhaltene Produkt wird mit Dextran-Oligomerem (MG 1500), das leicht mit Periodat in dem Maße, daß etwa zwei Aldehydgruppen pro Dextran entstehen, oxidiert worden ist, in einer Menge umgesetzt, die ausreicht, um das Polylysin-DTPA mit etwa 3-5 Dextraneinheiten zu beladen. Anschließend wird das Produkt mit Borhydrid stabilisiert, um die Schiffschen Hase-Bindungen und die restlichen Aldehydgruppen zu reduzieren.

Beispiel 3

Herstellung eines Epirubicin-Glucuronid-Konjugats

Epirubicin wird intravenös über einen Zeitraum von mehreren Wochen einem Pferd injiziert. Der Urin wird gesammelt. Epirubicin-Glucuronid wird durch Ionenaustauschchromatographie des Urins isoliert und anschließend durch weitere Säulenchromatographie und/oder HPLC gereinigt.

Beispiel 4

Herstellung eines Antikörper-Enzym-Konjugats

(A) Ein im wesentlichen monokonjugiertes Enzym-Antikörper-Präparat wird durch milde Oxidation des Kohlenhydratteils eines anti-CEA-IgG mit Periodat und durch anschließendes Kontaktieren des oxidierten IgG mit verdünnter Dextranase-Lösung (aus Penicillium sp., Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) unter Bildung eines Antikörper-Enzym-Konjugats hergestellt, das dann durch Borhydrid auf übliche Weise stabilisiert wird. Das Konjugat kann mit I-131 nach herkömmlichen Verfahren radioaktiv markiert werden.
(B) Auf ähnliche Weise wie im vorstehenden Abschnitt A wird ein anti-Leukämie-IgG an Glucuronidase (aus Rinderleber, Worthington) konjugiert.

Beispiel 5

Therapie von Lungenkrebs

Ein Patient mit einem kleinzelligen Karzinom der rechten Lunge erhält eine intravenöse Infusion mit einer sterilen, pyrogenfreien Lösung mit einem Gehalt an 5 mg des anti-CEA-IgG/Dextranase-Konjugats in PBS, das gemäß Beispiel 4 (A) hergestellt und mit I-131 markiert worden ist. Nah 5 Tagen ergibt sich eine ausgeprägte Lokalisation des Konjugats in der Lunge, während es aus dem Kreislauf des Patienten im wesentlichen beseitigt worden ist, wie sich durch tägliches szintigraphisches Abtasten ergibt.
Eine sterile, pyrogenfreie PBS-Lösung des MTX/Aminodextran-Konjugats, das gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, mit einem Gehalt an 50 mg des Konjugats wird an jedem der nächsten 4 Tage intravenös infundiert. Ein anschließender Radioimmunonachweis mit I-123-anti-CEA-Fab zeigt eine signifikante Tumorverringerung.

Beispiel 6

Therapie eines Lymphoms

Ein an einem Lymphom leidender Patient erhält eine intravenöse Infusion einer sterilen, pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 5 mg des gemäß Beispiel 4 (B) hergestellten anti-Lymphom-IgG-Glucuronidase- Konjugats, das mit I-131 markiert ist. Nach 6 Tagen ergibt sich eine ausgeprägte Lokalisierung am Zielort, wobei das Konjugat im wesentlichen aus dem Kreislaufsystem beseitigt worden ist, wie sich durch gamma-Abtasten ergibt.
Anschließend erhält der Patient eine intravenöse Infusion einer sterilen, pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 10 mg des gemäß Beispiel 3 hergestellten Epirubicin-Glucuronids, und zwar an jedem der folgenden 4 Tage. Ein anschließender Radioimmunonachweis zeigt eine signifikante Verringerung des Lymphoms.

Beispiel 7

Tumor-Radioimmunonachweis

Ein Patient mit Kolonkrebs erhält eine intravenöse Infusion mit einer sterilen, pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 5 mg des gemäß Beispiel 4 (A) hergestellten anti-CEA-IgG-Dextranase-Konjugats. Nach 7 Tagen erhält der Patient eine intravenöse Infusion einer sterilen pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 18,5 · 10&sup7; Bq (5 mCi) des In- 111-markierten Polylysin-DTPA/Dextran-Konjugats, das gemäß Beispiel 2 hergestellt und mit In-111 beladen worden war. Nach 24 Stunden ergibt sich eine Ansammlung des Radioisotops am Tumorort, die für eine szintigraphische Abbildung ausreicht.

Beispiel 8

MRI-Abbildung von Krebs

Ein Patient mit einem Tumor am Colon ascendens erhält eine intravenöse Infusion mit einer sterilen, pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 5 mg des gemäß Beispiel 4 (A) hergestellten anti-CEA-IgG-Dextranase-Konjugats. Nach 7 Tagen erhält der Patient eine intravenöse Infusion einer sterilen, pyrogenfreien PBS-Lösung mit einem Gehalt an 500 mg des gemäß Beispiel 2 hergestellten, mit Gd(III) beladenen Polylysin- DTPA/Dextran-Konjugats. Nach weiteren 2 Tagen wird eine MRI-Abbildung durchgeführt, die eine Abbildung des Tumors ergibt, die sich in angemessener Weise vom umgebenden Gewebe unterscheidet.
Die vorstehenden Beispiele lassen sich mit ähnlichem Erfolg wiederholen, indem man die allgemein oder speziell beschriebenen Reaktanten und/oder Ausführungsbedingungen der Erfindung anstelle der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Parameter heranzieht.

Claims

1. Produkt, umfassend

(a) eine für die enzymatische Wirkung in einem Säugetier wirksame Menge eines Enzyms,

(b) eine für das Aufspüren in einem Säugetier wirksame Menge eines bispezifischen Antikörpers, der mindestens eine erste für ein Antigen am Aufspürort spezifische Bindungsstelle und mindestens eine zweite, für das Enzym spezifische Bindungsstelle hat; und

(c) eine für das Deponieren in einem Säugetier am Aufspürort wirksame Menge einer löslichen Substratmittelverbindung, die ein Nichtsubstrat- Polymer einschließt, das kurze erbindungssegmente eines Substratoligomers trägt, welche mit einer Vielzahl von Molekülen mindestens eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels kovalent verbunden sind, so daß die Spaltung der kurzen Verbindungssegmente des Substratoligomers durch das Enzym das diagnostische oder therapeutische Mittel für die Ansammlung am Aufspürort zur wirksamen Behandlung oder Diagnose freisetzt,

wobei das Enzym bei dem Säugetier an einem anderen als dem Aufspürort entlang des Verabreichungs- oder Bioverteilungsweges der Substratmittelverbindung nicht in einer mit dem Aufspüren und der Ansammlung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels interferierenden Menge endogen ist,

als kombiniertes Präparat für die Anwendung bei einem Säugetier in folgender Reihenfolge: (a) und (b) entweder zusammen oder nacheinander in der Reihenfolge (a) nach (b) und danach (c).

2. Produkt nach Anspruch 1, wobei das Enzym entweder

i) eine Protease, Glykosidase oder Esterase oder

ii) eine Dextranase oder Zellulase ist und das Oligomer mindestens ein Dextran- oder Zellulosesubstratoligomer ist.

3. Produkt, umfassend (ab) eine für das Aufspüren und die Enzymwirkung bei einem Säugetier wirksame Menge einer kovalenten Verbindung eines Antikörper-Enzyms, in welcher der Antikörper mindestens eine für ein Antigen am Aufspürort spezifische Bindungsstelle hat und das Enzym eine Dextranase oder Zellulase ist;

(c) eine für das Deponieren in einem Säugetier an einem Aufspürort wirksame Menge einer löslichen Substratmittelverbindung, die ein Dextran oder eine Zellulose einschließt, das oder die mit einer Vielzahl von Molekülen mindestens eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels kovalent verbunden ist, so daß die Spaltung dieser Substratmittelverbindung durch das Enzym mindestens ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel für die Ansammlung am Aufspürort zur wirksamen Behandlung oder Diagnose freisetzt,

als kombiniertes Präparat für die Anwendung bei einem Säugetier in der Reihenfolge: (ab) und danach (c).

4. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die mindestens eine erste Bindungsstelle des Antikörpers sich spezifisch an ein Antigen bindet, das durch einen Tumor, eine infektiöse oder parasitäre Läsion, einen Fibringerinnsel, einen Myokardinfarkt, eine atherosklerotische Plaque, eine nicht karzinomatöse oder eine beschädigte normale Zelle produziert wird oder in Verbindung steht.

5. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Mittel entweder

(i) ein diagnostisches Mittel ist, das ein Gamma- oder Positron-strahlung emittierendes Radioisotop einschließt,

(ii) ein diagnostisches Mittel ist, das ein paramagnetisches Ion für die magnetische Resonanzbildverstärkung einschließt, oder

(iii) ein therapeutisches Mittel ist, das ein Beta- oder Alphastrahlung emittierendes Radioisotop, ein Arzneimittel, ein Toxin, ein Boraddend, einen Vasodilatatoren, ein Zytokin, einen Photo- oder Radiosensibilisatoren einschließt.

6. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Verabreichungsweg intrakavitär, intravenös, intraarteriell, intrapleural, intrathekal, intralymphatisch, intramuskulär, intraläsionell, subkutan oder in Form einer Katheterperfusion sein kann.

7. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Antikörper mit einem Marker, wie einem Radioisotop oder einem Mittel zur magnetischen Resonanzbildverstärkung verbunden oder für eine solche Verbindung adaptiert ist zur Überwachung entweder der Entfernung des Antikörpers aus dem Kreislaufsystem oder dessen Lokalisierung am Aufspürort, oder beider von diesen Vorgängen.

8. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Substratmittelverbindung weiter mit einem Marker, wie einem Radioisotop oder einem Mittel zur magnetischen Resonanzbildverstärkung verbunden oder für eine solche Verbindung adaptiert ist zur Überwachung entweder der Entfernung der Substratmittelverbindung aus dem Kreislaufsystem oder deren Ansammlung am Aufspürort, oder beider von diesen Vorgängen.

9. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Anwendung in der Diagnose oder Therapie.