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DE69535272T2 - Polyspezifische Immunkonjugate und Antikörper-Komposite zur zielgerichteten Erkennung des Multidrug-Resistenz Phänotyps - Google Patents

Polyspezifische Immunkonjugate und Antikörper-Komposite zur zielgerichteten Erkennung des Multidrug-Resistenz Phänotyps Download PDF

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DE69535272T2
DE69535272T2 DE69535272T DE69535272T DE69535272T2 DE 69535272 T2 DE69535272 T2 DE 69535272T2 DE 69535272 T DE69535272 T DE 69535272T DE 69535272 T DE69535272 T DE 69535272T DE 69535272 T2 DE69535272 T2 DE 69535272T2
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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue polyspezifische Immunkonjugate, welche für die Diagnose und Therapie von Krankheiten geeignet sind, die durch Zellen, die Multidrug-resistent sind, verursacht werden. Diese Erfindung betrifft insbesondere polyspezifische Immunkonjugate, welche mindestens einen Rest, der mit einem Multidrug-Transporterprotein bindet, mindestens einen Rest, der mit einem, mit einem Tumor verbundenen Antigen oder mit einem Antigen eines infektiösen Mittels bindet und ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel umfassen. Diese Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Diagnose und Therapie, welche die polyspezifischen Immunkonjugate verwenden. Diese Erfindung betrifft weiter diagnostische und therapeutische Verwendungen von Antikörper-Kompositen, die mindestens einen Rest, der mit einem Multidrug-Transporterprotein bindet und mindestens einen Rest, der mit einem, mit einem Tumor verbundenen Antigen oder einem Antigen eines infektiösen Mittels bindet, umfassen.
  • 2. Hintergrund
  • Eine der Haupteinschränkungen der Krebs-Chemotherapie ist die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen durch Krebszellen. Trotz anfänglicher Sensitivität für ein bestimmtes chemotherapeutisches Mittel, werden manche Tumore schrittweise unempfänglich für dieses bestimmte Mittel oder für verschiedene chemotherapeutische Mittel. Es wird angenommen, dass dies Phänomen der erworbenen Arzneimittelresistenz auf der Selektion und dem Wachstum von Arzneimittel resistenten mutierten Tumorzellen beruht. Siehe zum Beispiel Deuchars et al., Sem. Onocl. 16: 156 (1989).
  • Kultivierte Zelllinien und transplantierbare Tumore wurden verwendet, um den Mechanismus der erworbenen Arzneimittelresistenz in vitro zu untersuchen. Diese Studien zeigten, dass unter bestimmten Selektionsbedingungen Zellen simultane Resistenz gegen verschiedene Gruppen von Arzneimitteln erwerben können, die in Struktur, zellulärem Ziel und Wirkungsweise nicht mit dem Selektionsmittel in Beziehung stehen. Siehe zum Beispiel Bradley et al., Biochim. Biophys. Acta 948: 87 (1988); Deuchars et al., supra. Viele der durch diesen "Multidrug-Resistenz" (MDR) Phänotyp betroffenen Arzneimittel spielen in gängigen Behandlungsprotokollen eine wichtige Rolle, wie Vincristin, Actinomycin D und Adriamycin. Id.
  • Der MDR Phänotyp ist durchweg mit Überexpression eines 170 Kilodalton Membran-Glycoproteins, als "gp170" oder "P-Glycoprotein" bezeichnet, verbunden. Endicott et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 137 (1989); Kane et al., J. Bioenerg. Biomembr. 22: 593 (1990); Efferth et al., Urol. Res. 18: 309 (1990). Untersuchungen weisen darauf hin, dass das P-Glycoprotein ein Transmembranprotein ist, welches für einen ATP-abhängigen Ausstrom eines breiten Spektrums strukturell und funktionell verschiedener Arzneimittel aus Multidrug-resistenten Zellen verantwortlich ist. Riordan et al., Pharmacol. Ther. 28: 51 (1985). Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Expression von P-Glycoprotein in einer Anzahl von Neoplasmen eine Vorhersage für eine schwache Antwort auf eine Chemotherapie darstellt. Siehe zum Beispiel Pearson et al., J. Nat'l Cancer Inst. 83: 1386 (1991).
  • Aktuelle Beobachtungen weisen darauf hin, dass infektiöse Mittel den MDR Phänotyp in Zellen, die keine Krebszellen sind, induzieren können. Zum Beispiel ist eine anhaltende Behandlung einer AIDS-Virus (HIV) Infektion mit 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT) mit einer erworbenen Resistenz gegen AZT verbunden. Gollapudi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 1002 (1990); Antonelli et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1839 (1992). In vitro Untersuchungen zeigen, dass HIV-infizierte humane Zellen eine erhöhte Expression von P-Glycoprotein aufweisen und weniger AZT akkumulieren, verglichen mit nicht infizierten Kontrollzellen. Id.; Gupta et al., J. Clin. Immunol. 13: 289 (1993). Daher können die Überexpression von P-Glycoprotein und der begleitende MDR Phänotyp eine Chemotherapie mit antiviralen Arzneimitteln beeinträchtigen.
  • Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen, um den Multidrug-resistenten Phänotyp zu überwinden und so die Wirksamkeit der Chemotherapie zu verbessern. Die meisten dieser Strategien beziehen pharmakologische Mittel ein, welche die intrazelluläre Akkumulation der Krebs-Arzneimittel verstärken, indem sie den Multidrug-Transporter biochemisch inhibieren. Siehe zum Beispiel Ford et al., Pharmacol. Rev. 42: 155 (1990). Beispiele für Mittel, welche die P-Glycoprotein-Aktivität modulieren, schließen Calciumkanal Blockierer, Calmodulin Inhibitoren, antiarrythmetische Mittel, Antimalaria-Mittel, verschiedene lysoosmotropische Mittel, Steroide, Östrogenhemmer und zyklische Peptidantibiotika ein. Rittmann-Grauer et al., Cancer Res. 52: 1810 (1992).
  • Multidrug-Resistenz umkehrende Arzneimittel, die in frühen klinischen Prüfungen verwendet wurden, zeigten jedoch bedeutende Nebenwirkungen, die nicht in Beziehung zur Inhibition von P-Glycoprotein stehen, so wie Herztoxizität (Verapamil) oder Immunsuppression (Cyclosporin A), welches die Arzneimitteldosis, die verabreicht werden kann, einschränkt. Siehe zum Beispiel Ozols et al., J. Clin. Oncol. 5: 641 (1987); Dalton et al., J. Clin. Oncol. 7: 415 (1989); Cano-Gauci et al., Biochem. Pharmacol. 36: 2115 (1987); Ford et al., supra. Daher war der Erfolg bei der Umkehrung der MDR in vivo aufgrund der Toxizität vieler dieser kleinen Modulatoren eingeschränkt. Siehe zum Beispiel Rittmann-Grauer et al., supra.
  • Die Verwendung von Antikörper-Arzneimittel Konjugaten stellt einen alternativen Ansatz bereit, um den MDR Phänotyp zu überwinden. Zum Beispiel haben in vitro Studien gezeigt, dass MDR teilweise überwunden werden kann, indem das resistente Arzneimittel an einen Antitumor-Antikörper konjugiert wird, um die Aufnahme und den nachfolgenden Zelltod zu steigern. Durrant et al., Brit. J. Cancer 56: 722 (1987); Sheldon et al., Anticancer Res. 9: 637 (1989). Diesem Ansatz fehlt jedoch die Spezifität für Tumorzellen, die den MDR Phänotyp exprimieren.
  • Ein zielgerichteterer Ansatz zur Überwindung des MDR Phänotyps ist die Verwendung von Antikörpern oder Antikörper-Konjugaten, die mit P-Glycoprotein binden. Zum Beispiel kann die Verabreichung eines monoklonalen Anti-P-Glycoprotein Antikörpers und eines resistenten Arzneimittels die Überlebenszeit von Nacktmäusen, die humane Tumorzellen tragen, steigern. Pearson et al., J. Nat'l Cancer Inst. 83: 1386 (1991); Iwahashi et al., Cancer Res. 53: 5475 (1993). Siehe ebenfalls Grauer et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/02105 (1993). Zusätzlich wurde von einem Konjugat aus monoklonalem Anti-P-Glycoprotein Antikörper und Pseudomonas-Toxin gezeigt, dass es Multidrug-resistente, humane Zellen in vitro abtötet. FitzGerald et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 4288 (1987). Siehe ebenfalls Efferth et al., Med. Oncol. & Tumor Pharmacother. 9: 11 (1992) und Mechetner et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/19094 (1993).
  • Ähnlich haben Forscher bispezifische Antikörper hergestellt, die einen P-Glycoprotein Bindungsrest und einen Rest, der mit einer zytotoxischen Zelle bindet, umfassen. van Dijk et al., Int. J. Cancer 44: 738 (1989); Ring et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/08802 (1992). Die Theorie hinter diesem Ansatz ist, dass die bispezifischen Antikörper verwendet werden können, um die zytotoxischen Zellen zu Multidrug-resistenten Zellen zu leiten, die P-Glycoprotein exprimieren.
  • Studien haben jedoch gezeigt, dass P-Glycoprotein in normalen humanen Geweben, wie Leber, Niere, Nebenniere, Pankreas, Kolon und Jejunum exprimiert wird. Siehe zum Beispiel Endicott et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 137 (1989). Folglich haben Forscher gewarnt, dass "Blockierung der P-Glycoprotein Aktivität, um MDR zu umgehen, ebenfalls das normal exprimierte P-Glycoprotein betreffen wird und dies inakzeptable, toxische Nebenwirken verursachen kann." Childs et al., "The MDR Superfamily of Genes and Its Biological Implications," in IMPORTANT ADVANCES IN ONCOLOGY 1994, DeVita et al., (Hrsg.), Seiten 21–36 (J. B. Lippincott CO. 1994). Diese Warnung bezieht sich insbesondere auf therapeutische Verfahren, die Antikörper-Konjugate verwenden, die aus einem P-Glycoprotein Bindungsrest und einem zytotoxischen Mittel bestehen. Daher wird der Erfolg einer Antikörper geleiteten Behandlung von MDR Tumoren hauptsächlich auf der Fähigkeit beruhen, Arzneimittel resistente Tumorzellen mit tolerierbaren Nebenwirkungen für normale Gewebe des Patienten abzutöten. Efferth et al., Med. Oncol. & Tumor Pharmacother. 9: 11 (1992).
  • Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren zur Überwindung des MDR Phänotyps, welches aber ebenfalls die Toxizität für normales Gewebe minimiert.
  • Die Entstehung des MDR Phänotyps ist ebenfalls die bedeutendste Misserfolgsursache bei der Behandlung von Infektionskrankheiten. Davies, Science 264: 375 (1994). Insbesondere weisen pathogene Bakterien aktive Arzneimittel Ausström-Systeme mit einer sehr weiten Substratspezifität auf. Nikaido, Science 264: 382 (1994). Zum Beispiel weisen Studien darauf hin, dass ein Arzneimittel Ausström-System eine bedeutende Rolle bei der intrinsischen Resistenz von Pseudomonas aeruginosa, einem verbreiteten, opportunistischen Pathogen, spielt. Poole et al., Mol. Microbiol. 10: 529 (1993); Poole et al., J. Bacteriol. 175: 7363 (1993).
  • Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass bakterielle Arzneimittel Ausström-Systeme funktionell ähnlich zu den Säugetier MDR Ausström-Pumpen sind. Als eine Darstellung, sowohl die Bacillus subtilis als auch die Säugetier Multidrug-Transporter können mit Reserpin und Verapamil inhibiert werden. Neyfakh et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. 88: 4781 (1991). Darüber hinaus haben Forscher eine Überfamilie von ATP-abhängigen Membrantransportern erkannt, die prokaryotische Permeasen und Säugetier P-Glycoprotein einschließt. Doige et al., Ann. Rev. Microbiol. 47: 291 (1993).
  • Aktiver Arzneimittel Ausstrom als Mechanismus für die Arzneimittelresistenz ist signifikant bei nicht bakteriellen infektiösen Mitteln. Beispielsweise ist ein Plasmodium falciparum-Protein bei der Vermittlung der Resistenz gegen Chinolin enthaltende Arzneimittel, die zur Prophylaxe und Behandlung von Malaria verwendet werden, beteiligt. Id.; Bray FEMS Microbiol. Lett. 113: 1 (1993). Zusätzlich wurde Arzneimittelresistenz bei dem Pilz Aspergillus nidulans mit einem aktiven Ausstrom verbunden. De Waard et al., Pestic. Biochem. Physiol. 13: 255 (1980).
  • Historisch hat sich die pharmazeutische Industrie darauf konzentriert, Arzneimittel zu entwickeln, um spezifische Mechanismen der MDR, wie gesteigerten Abbau bestimmter Arzneimittel und Inaktivierung von Arzneimitteln durch enzymatische Modifikation spezifischer Gruppen bei infektiösen Mitteln zu überwinden. Nikaido et al., supra. Jedoch werden in der Zukunft allgemeine Mechanismen der MDR, wie aktiver Arzneimittel Ausstrom, im klinischen Umfeld, wahrscheinlich wichtiger.
  • Daher besteht ein Bedarf an Verfahren, die verwendet werden können, um die Funktion von Multidrug-Transporterproteinen, die von infektiösen Mitteln exprimiert werden, zu inhibieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Überwndung des Multidrug-resistenten Phänotyps bereitzustellen, welches einen, gegenüber den konventionellen Verfahren, besseren therapeutischen Index aufweist.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, Verfahren zur selektiven Ausrichtung diagnostischer und therapeutischer Mittel auf Multidrug-resistente Zellen bereitzustellen, während bedeutende toxische Nebenwirkungen auf normale Organe vermieden werden.
  • Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist, Antikörper-Kompositen bereitzustellen, die ein Multidrug-Tansporterprotein und ein Antigen, welches mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist, binden.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, polyspezifische Immunkonjugate bereitzustellen, die Konjugate aus Antikörper-Kompositen und diagnostischen oder therapeutischen Mitteln sind.
  • Diese und andere Ziele werden in Übereinstimmung mit einer erfindungsgemäßen Ausführungsform durch die Bereitstellung eines polyspezifischen Immunkonjugats erreicht, welches:
    • (a) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet; gebunden an
    • (b) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, wobei das Antigen mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist; und
    • (c) mindestens ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel umfasst.
  • Die Antikörperkomponenten eines solchen polyspezifischen Immunkonjugats sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus (a) einem monoklonalen Mausantikörper, (b) einem von (a) abgeleiteten humanisierten Antikörper, (c) einem humanen monoklonalen Antikörper, (d) einem subhumanen Primaten-Antikörper und (e) einem von (a), (b), (c) oder (d) abgeleiteten Antikörperfragment besteht, wobei das Antikörperfragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv und einer minimalen Erkennnungseinheit besteht. Das Multidrug-Transporterprotein eines solchen polyspezifischen Immunkonjugats ist aus der Gruppe ausgewählt, welche aus P-Glycoprotein, OtrB, Tel(L), Mmr, ActlI, TcmA, NorA, QacA, CmlA, Bcr, EmrB, EmrD, AcrE, EnvD, MexB, Smr, QacE, MvrC, MsrA, DrrA, DrrB, TlrC, Bmr, TetA und OprK besteht.
  • Wie oben festgestellt, umfasst das polyspezifische Immunkonjugat ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel. Ein geeignetes diagnostisches Mittel wird aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einer radioaktiven Markierung, einem photoaktiven Mittel oder einem Farbstoff, einer Fluoreszenz-Markierung, einer Enzym-Markierung, einer Biolumineszenz-Markierung, einer Chemolumineszenz-Markierung, kolloidalem Gold und einem paramagnetischen Ion besteht. Darüber hinaus kann eine geeignete radioaktive Markierung ein γ-Strahler oder ein Positronenstrahler sein. Vorzugsweise weisen γ-Strahler einen Gamma-Strahlen- Emissionspeak im Bereich von 50–500 KeV auf, wie ein Radioisotop, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus 99mTc, 67Ga, 123I, 125I und 131I besteht.
  • Ein geeignetes therapeutisches Mittel wird aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einem Radioisotop, einem Bor-Addend, einem Immunmodulator, einem Toxin, einem photoaktiven Mittel oder einem Farbstoff, einem chemotherapeutischen Krebsarzneimittel, einem antiviralen Arzneimittel, einem Antipilz-Arzneimittel, einem antibakteriellen Arzneimittel, einem Antiprotozoen-Arzneimittel und einem chemosensibilisierenden Mittel besteht. Darüber hinaus wird ein geeignetes therapeutisches Radioisotop aus der Gruppe ausgewählt, welche aus α-Strahlern, β-Strahlern, γ-Strahlern, Auger-Elektronen-Strahlern, Neutroneneinfangmitteln, welche α-Teilchen ausstrahlen, und Radioisotopen, die durch Elektroneneinfang zerfallen, besteht. Vorzugsweise wird das Radioisotop aus der Gruppe ausgewählt, welche aus 198Au, 32P, 125I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu und 211At besteht.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls polyspezifische Immunkonjugate, welche weiterhin eine Antikörperkomponente, die mit einem zweiten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, umfassen. Darüber hinaus können polyspezifische Immunkonjugate eine Antikörperkomponente umfassen, die mit einem zweiten Epitop eines Antigens, welches mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbunden ist oder die mit einem Epitop eines zweiten Antigens, welches mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbunden ist, bindet.
  • Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf die Verwendung eines erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugats zur Behandlung eines Säugetiers gerichtet, welches entweder einen Multidrug-resistenten Tumor, der ein mit dem Tumor verbundenes Antigen exprimiert, oder eine Multidrug-resistente Erkrankung, die durch ein infektiöses Mittel hervorgerufen wurde, aufweist.
  • Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung polyspezifische Immunkonjugate, welche weiterhin ein chemosensibilisierendes Mittel oder einen Immunmodulator umfassen.
  • Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auf den Nachweis des Ortes von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln gerichtet.
  • Bei einem solchen Nachweisverfahren wird das diagnostisches Mittel aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einer radioaktiven Markierung, einem photoaktiven Mittel oder einem Farbstoff, einer Fluoreszenz-Markierung und einem paramagnetischen Ion besteht. Darüber hinaus ist das Biotin bindende Molekül Avidivin oder Streptavidin.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers, welches eine Multidrug-resistente Erkrankung aufweist, die durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel hervorgerufen wurde.
  • Ein geeignetes therapeutisches Mittel wird aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einem Radioisotop, einem Bor-Addend, einem Toxin, einem Immunmodulator, einem photoaktiven Mittel oder einem Farbstoff, einem chemotherapeutischen Krebsarzneimittel, einem antiviralen Arzneimittel, einem Antipilz-Arzneimittel, einem antibakteriellen Arzneimittel, einem Antiprotozoen-Arzneimittel oder einem chemosensibilisierenden Mittel besteht. Wiederum ist das Biotin bindende Molekül Avidivin oder Streptavidin.
  • Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln gerichtet, wobei das Verfahren
    • (a) das Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper-Kompositen, welcher (1) mindestens eine Antikörperkomponente umfasst, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet und (2) mindestens eine Antikörperkomponente umfasst, welche mit dem ersten Epitop eines Antigens bindet, das mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbunden ist, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen durchge führt wird, welche das Binden des Antikörper-Komposits an die biologische Probe erlauben, und
    • (b) den Nachweis von allen gebundenen Antikörper-Kompositen umfasst.
  • Hier wird ein geeignetes diagnostisches Mittel aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einem Radioisotop, einer Fluoreszenz-Markierung, einer Chemolumineszenz-Markierung, einer Enzym-Markierung, einer Biolumineszenz-Markierung und kolloidalem Gold besteht. Darüber hinaus kann das Antikörper-Komposit weiterhin Biotin oder ein Biotin bindendes Molekül umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiter auf ein Verfahren zum Nachweis der Lage von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln gerichtet, die eine Multidrug-resistente Erkrankung aufweisen, welche durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel hervorgerufen wurde.
  • Ein geeignetes diagnostisches Mittel wird aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einer radioaktiven Markierung, einem photoaktiven Mittel oder einem Farbstoff, einer Fluoreszenz-Markierung und einem paramagnetischen Ion besteht.
  • Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis der Lage von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mittlen gerichtet.
  • Geeignete diagnostische Mittel schließen Radioisotope, wie einen γ-Strahler oder einen Positronenstrahler und ein photoaktives Mittel oder einen Farbstoff, der durch Laser induzierte Fluoreszenz nachgewiesen wird, ein.
  • Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auf ein Antikörper-Komposit gerichtet, welches:
    • (a) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, gebunden an
    • (b) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, wobei das Antigen mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist, umfasst.
  • Geeignete Antikörperkomponenten eines Antikörper-Komposits werden aus der Gruppe ausgewählt, welche aus (a) einem monoklonalen Mausantikörper, (b) einem von (a) abgeleiteten humanisierten Antikörper, (c) einem humanen monoklonalen Antikörper, (d) einem subhumanen Primaten-Antikörper und (e) einem Antikörperfragment, welches von (a), (b), (c) oder (d) abgeleitet wurde, besteht, wobei ein Antikörperfragment aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv und einer minimalen Erkennnungseinheit besteht. Darüber hinaus wird ein geeignetes Multidrug-Transporterprotein aus der Gruppe ausgewählt, die aus P-Glycoprotein, OtrB, Tel(L), Mmr, ActlI, TcmA, NorA, QacA, CmlA, Bcr, EmrB, EmrD, AcrE, EnvD, MexB, Smr, QacE, MvrC, MsrA, DrrA, DrrB, TlrC, Bmr, TetA und OprK besteht.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Antikörper-Komposit, welches weiterhin eine Antikörperkomponente umfasst, die mit einem zweiten Epitop des Multidrug-Transporterproteins bindet. Ein Antikörper-Komposit kann außerdem eine Antikörperkomponente einschließen, die mit einem zweiten Epitop des mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbundenen Antigens oder mit einem Epitop eines zweiten Antigens, welches mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbunden ist, bindet.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG 1. Definitionen
  • In der nachfolgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Begriffen breit verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verstehen der Erfindung zu vereinfachen.
  • Ein Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, welche in eine Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wird, welche anschließend in eine Aminosäuresequenz translatiert wird, die charakteristisch für ein spezifisches Polypeptid ist.
  • Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, welche die Transkription eines Strukturgens leitet. Typischerweise liegt ein Promotor in der 5'-Region eines Gens, nahe der Transkriptions-Startstelle eines Strukturgens. Wenn der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, steigt die Transkriptionsgeschwindigkeit das Antwort auf ein induzierendes Mittel an. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsgeschwindigkeit nicht durch ein induzierendes Mittel reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
  • Ein isoliertes DNA-Molekül ist ein DNA-Fragment, welches nicht in die genomische DNA eines Organismus integriert ist. Zum Beispiel ist ein kloniertes T-Zell-Rezeptorgen ein DNA-Fragment, welches aus der genomischen DNA einer Säugetierzelle separiert wurde. Ein anderes Beispiel für ein isoliertes DNA-Molekül ist ein chemisch synthetisiertes DNA-Molekül, welches nicht in die genomische DNA eines Organismus integriert ist.
  • Ein Enhancer ist ein regulatorisches DNA-Element, welches die Wirkung der Transkription steigern kann, unabhängig von der Entfernung oder Orientierung des Enhancers relativ zur Startstelle der Transkription.
  • Komplementäre DNA (cDNA) ist ein einzelsträngiges DNA-Molekül, welches von einer mRNA-Matritze mit dem Enzym Reverse Transkriptase gebildet wird. Typischerweise wird ein Primer, welcher zu Teilen der mRNA komplementär ist, zur Initiation der reversen Transkription verwendet. Der Fachmann verwendet den Begriff "cDNA" ebenfalls, um ein doppelsträngiges DNA-Molekül zu bezeichnen, welches aus einem solchen einzelsträngigen DNA-Molekül und seinem komplementären DNA-Strang besteht.
  • Der Begriff Expression bezeichnet die Biosynthese eines Genprodukts. Zum Beispiel schließt im Fall eines Strukturgens die Expression die Transkription des Strukturgens in mRNA und die Translation der mRNA in ein oder mehrere Polypeptide ein.
  • Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, welches eine Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle aufweist. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise sowohl eine oder eine kleine Anzahl Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen, an denen fremde DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer essenziellen biologischen Funktion des Vektors eingefügt werden können, als auch ein Markergen, welches zur Verwendung bei der Identifikation und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden, geeignet ist. Markergene schließen typischerweise Gene ein, die eine Tetracyclin-Resistenz oder eine Ampicillin-Resistenz bereitstellen.
  • Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, welches ein Gen, das in einer Wirtszelle exprimiert wird, umfasst. Typischerweise steht die Genexpression unter der Kontrolle bestimmter regulatorischer Elemente, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, gewebsspezifische regulatorische Elemente und Enhancer einschließen. Solch ein Gen gilt als "operabel bzw. funktionell verbunden mit" den regulatorischen Elementen.
  • Ein rekombinanter Wirt kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, welche entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Begriff schließt ebenfalls jene prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ein, die gentechnisch verändert wurden, damit sie das klonierte Gen/die klonierten Gene im Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten.
  • Ein Tumor verbundenes bzw. assoziiertes Antigen ist ein Protein, welches normalerweise nicht exprimiert oder in sehr geringen Mengen durch einen normalen Gegenspieler exprimiert wird. Beispiele für Tumor verbundene Antigene schließen α-Fetoprotein und karzinoembryonales Antigen (CEA) ein. Dem Fachmann sind viele weitere Darstellungen von Tumor verbundenen Antigenen bekannt. Siehe zum Beispiel Urban et al., Ann. Rev. Immunol. 10: 617 (1992).
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein infektiöses Mittel sowohl Mikroben als auch Parasiten. Eine "Mikrobe" schließt Viren, Bakterien, Rickettsien, Mykoplasmen, Protozoen, Pilze und ähnliche Mikroorganismen ein. Ein "Parasit" bezeichnet infektiöse, allgemein mikroskopische oder sehr kleine vielzellige Wirbellose oder Eier oder Juvenilformen davon, welche anfällig für eine Antikörper induzierte Beseitigung oder lytische oder phagozytotische Zerstörung sind, wie Malaria-Parasiten, Spirochäten und desgleichen.
  • Ein Multidrug-Transporterprotein ist ein Membran verbundenes Protein, welches verschiedene zytotoxische Verbindungen in einer energieabhängigen Art und Weise aus einer Zelle transportiert. Beispiele für Multidrug-Transporterproteine schließen P-Glycoprotein, OtrB, Tel(L), Mmr, ActlI, TcmA, NorA, QacA, CmlA, Bcr, EmrB, EmrD, AcrE, EnvD, MexB, Smr, QacE, MvrC, MsrA, DrrA, DrrB, TlrC, Bmr, TetA, OprK und desgleichen ein.
  • Ein Antikörper-Fragment ist ein Teil eines Antikörpers, wie F(ab')2), F(ab)2, Fab', Fab und desgleichen. Unabhängig von seiner Struktur bindet ein Antikörper-Fragment mit dem gleichen Antigen, welches durch den intakten Antikörper erkannt wird.
  • Der Begriff "Antikörper-Fragment" schließt ebenfalls jedes synthetisch oder gentechisch veränderte Protein ein, welches durch das Binden an ein spezifisches Antigen, um einen Komplex zu bilden, wie ein Antikörper wirkt. Zum Beispiel schließen Antikörper-Fragmente isolierte Fragmente, welche aus der variablen Region der leichten Kette bestehen, "Fv"-Fragmente, welche aus den variablen Regionen der schweren und der leichten Ketten bestehen, rekombinante Einzelketten Polypeptid-Moleküle, in denen die leichten und schweren variablen Regionen durch einen Peptid-Linker ("sFv-Proteine") verbunden sind und minimale Erkennungseinheiten, die aus den Aminosäureresten bestehen, welche die hypervariable Region nachahmen, ein.
  • Humanisierte Antikörper sind rekombinante Proteine, in denen komplementäre Determinanten-Regionen von monoklonalen Antikörpern der Maus aus den schweren und leichten variablen Ketten des Maus-Immunglobulins in eine humane variable Domäne transferiert wurden.
  • So wie hier verwendet, schließt der Begriff Antikörperkomponente sowohl einen gesamten Antikörper als auch ein Antikörper-Fragment ein.
  • So wie hier verwendet, bezeichnet ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel ein Molekül oder Atom, welches mit einem Antikörperrest konjugiert ist, um ein Konjugat herzustellen, welches für die Diagnose oder Therapie geeignet ist. Beispiele für diagnostische oder therapeutische Mittel schließen Arzneimittel, Toxine, Immunmodulatoren, Chelatbildner, Borverbindungen, photoaktive Mittel oder Farbstoffe, Radioisotope, Fluoreszenzmittel, paramagnetische Ionen oder Moleküle und Markerrreste ein.
  • Ein Antikörper-Komposit ist eine polyspezifische Antikörper-Zusammensetzung, welche mindestens zwei, im Wesentlichen monospezifische Antikörperkomponenten umfasst, wobei mindestens eine Antikörperkomponente mit einem Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, und wobei mindestens eine Antikörperkomponente mit einem Antigen bindet, welches mit entweder einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist.
  • Ein polyspezifisches Immunkoniugat ist ein Konjugat aus einem Antikörper-Komposit mit einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel.
  • 2. Herstellung von monoklonalen Nagetier-Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Primaten-Antikörpern und humanen Antikörpern
  • Ein erfindungsgemäßes Antikörper-Komposit kann von einem monoklonalen Antikörper (MAk) eines Nagetiers abgeleitet werden. Monoklonale Nagetier-Antikörper für spezifische Antigene können durch Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Siehe zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975) und Coligan, et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, Seiten 2.5.1–2.6.7 (John Wiley & Sons, 1991) [nachfolgend "Coligan"]. In Kürze, monoklonale Antikörper können durch das Injizieren einer Zusammensetzung, die ein Antigen umfasst, in Mäuse, das Verifizieren der Anwesenheit der Antikörper-Herstellung durch das Entfernen einer Serumprobe, das Entfernen der Milz, um B-Lymphozyten zu erhalten, das Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomzellen, um Hybridome herzustellen, das Klonieren der Hybridome, das Auswählen positiver Klone, welche Antikörper gegen das Antigen herstellen, das Kultivieren der Klone, welche Antikörper gegen das Antigen herstellen und das Isolieren der Antikörper aus den Hybridomkulturen erhalten werden.
  • MAks können durch eine Vielzahl von gut etablierten Techniken aus Hybridomkulturen isoliert und aufgereinigt werden. Solche Isolationstechniken schließen Affinitäts-Chromatographie mit Protein-A-Sepharose, Größenausschluss-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie ein. Siehe zum Beispiel Coligan auf den Seiten 2.7.1–2.7.12 und den Seiten 2.9.1–2.9.3. Siehe ebenfalls Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 10, Seiten 79–104 (The Humana Press, Inc. 1992).
  • Eine große Vielzahl monoklonaler Antikörper gegen Tumor verbundene Antigene oder infektiöse Mittel wurde entwickelt. Siehe zum Beispiel Goldenberg et al., internationale Anmeldungsveröffentlichung Nr. WO 91/11465 (1991), Hansen et al., internationale Anmeldungsveröffentlichung Nr. WO 93/23062 und Goldenberg, internationale Anmeldungsveröffentlichung Nr. WO 94/04702 (1994).
  • Ferner sind solche Antikörper von kommerziellen Quellen leicht erhältlich. Zum Beispiel können monoklonale Nagetier-Antikörper, die mit Adenokarzinom verbundenem Antigen (Kat. Nr. 121730), mit humanem Choriongonadotropin (Kat. Nr. 230740), mit karzinoembryonalem Antigen (Kat. Nrs. 215920 und 215922), mit humanem Alpha-Fetoprotein (Kat. Nr. 341646) und desgleichen binden, von Calbiochem-Novabiochem Corp. (San Diego, CA) bezogen werden. Darüber hinaus können monoklonale Nagetier-Antikörper, welche mit antigenen Determinanten von infektiösen Mitteln binden, wie unter anderem Escherichia coli (HB 8178), Legionella pneumophila (CRL 1770), Schistosoma mansoni (HB 8088), Streptococcus, Gruppe A (HB 9696), Treponema palladium (HB 8134), Hepatitis B (CRL 8107), Herpes simplex (HB 8181) und AIDS-Virus (HB 9101) von American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen werden. Ferner können monoklonale Mausantikörper gegen Merozoiten und Sporozoiten von Plasmodium falciparum wie bei Goldenberg, U.S. Patent Nr. 5,332,567 (1994) beschrieben, hergestellt werden.
  • Verfahren zur Herstellung von P-Glycoprotein Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Lathan of al., Cancer Res. 45: 5064 (1985); Kartner et al., Nature 316: 820 (1985); Hamada et al., Proc. Nat'l Acad. Sci 83: 7785 (1986); Scheper et al., Int. J. Cancer 42: 389 (1988); Rittmann-Grauer et al., Cancer Res. 52: 1810 (1992); Ling et al., US Patent Nr. 4,837,306 (1989); Ring et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/08802; Grauer et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/02015 und Mechetner et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/19094. Da das P-Glycoprotein seine strukturelle Identität über verschiedene Säugetierarten hinweg beibehält (Rubin, U.S. Patent Nr. 5,005,588; Kane et al., J. Bioenergetics and Biomembranes 22: 593 (1990)), können Antikörper, die in nicht humanen Zellen gegen P-Glycoprotein erzeugt wurden, für die Diagnose und Therapie in Menschen verwendet werden. Umgekehrt sollten Antikörper, welche gegen humanes P-Glycoprotein erzeugt wurden, für tiermedizinische Verwendungen geeignet sein.
  • Bevorzugte P-Glycoprotein Antikörper binden mit der extrazellulären Domäne des P-Glycoproteins und können gegen Zellen, die den MDR Phänotyp exprimieren, wie zum Beispiel von Mechetner et al., supra und Rittmann-Grauer et al., supra, beschrieben wird, hergestellt werden. Alternativ können solche Antikörper durch Verwendung von Peptiden erhalten werden, welche ein extrazelluläres P-Glycoprotein Epitop enthalten. Siehe zum Beispiel Cianfriglia et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/25700.
  • Der Fachmann kann leicht Standardtechniken anwenden, um Antikörper gegen Multidrug-Transporterproteine von infektiösen Mitteln herzustellen. Geeignete Antigene schließen Multidrug-Transporterproteine wie Bmr, TetA, EmrB, OprK, Smr und desgleichen ein. Siehe zum Beispiel Nikaido et al., supra; Poole et al., J. Bacteriol. 175: 7363 (1993) und Childs et al., "The MDR Superfamily of Genes and Its Biological Implications," in IMPORTANT ADVANCES IN ONCOLOGY 1994, DeVita et al., (Hrsg.), Seiten 21–36 (J. B. Lippincott Co. 1994). Ein Ansatz zur Herstellung von Antikörpern gegen Multidrug-Transporterproteine von infektiösen Mitteln wird in Beispiel 6 dargestellt.
  • Ein erfindungsgemäßes Antikörper-Komposit kann ebenfalls von einem subhumanen Primaten-Antikörper abgeleitet werden. Allgemeine Techniken zur Erzeugung therapeutisch geeigneter Antikörper in Pavianen können zum Beispiel in Goldenberg et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/11465 (1991) und in Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990) gefunden werden.
  • Alternativ kann ein Antikörper-Komposit von einem "humanisierten" monoklonalen Antikörper abgeleitet werden. Humanisierte monoklonale Antikörper werden hergestellt, indem komplementäre Determinantenregionen der schweren und der leichten variablen Ketten der Maus von dem Maus-Immunglobulin in eine humane variable Domäne transferiert werden, und anschließend die humanen Reste in die Framework-Regionen der Maus-Gegenstücke substituiert werden. Die Verwendung von Antikörperkomponenten, welche von humanisierten monoklonalen Antikörpern abgeleitet wurden, vermeidet potenzielle Probleme, die mit der Immunogenität der konstanten Regionen der Maus verbunden sind. Allgemeine Techniken zum Klonieren von Maus-Immunglobulin variablen Domänen werden zum Beispiel in der Veröffentlichung von Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989) beschrieben. Techniken zur Herstellung humanisierter MAks werden zum Beispiel von Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992) und Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1993) beschrieben.
  • Als eine Alternative, kann ein erfindungsgemäßes Antikörper-Komposit von humanen Antikörperfragmenten abgleitet werden, die aus einer kombinatorischen Immunglobulin-Bibliothek isoliert wurden. Siehe zum Beispiel Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991) und Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994). Klonierungs- und Expressionsvektoren, welche für die Herstellung einer humanen Immunglobulin-Phagenbibliothek geeignet sind, können zum Beispiel von STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA) bezogen werden.
  • Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßes Antikörper-Komposit von einem humanen monoklonalen Antikörper abgeleitet werden. Solche Antikörper werden von transgenen Mäusen erhalten, die "verändert" wurden, um spezifische humane Antikörper als Antwort auf eine Antigenkonfrontation herzustellen. Bei dieser Technik werden Elemente des humanen schwere Ketten und leichte Ketten Locus in Mausstämme eingeführt, die von embryonalen Stammzelllinien abgeleitet wurden, die gerichtete Unterbrechungen der endogenen schwere Ketten und leichte Ketten Loci enthalten. Die transgenen Mäuse können humane Antikörper synthetisieren, die spezifisch für humane Antigene sind, und die Mäuse können verwendet werden, um humane Antikörper sezernierende Hybridome herzustellen. Verfahren zum Erhalt humaner Antikörper aus transgenen Mäusen werden von Green et al., Nature Genst. 7: 13 (1994), Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994) und Taylor et al., Int. Immun. 6: 579 (1994) beschrieben.
  • 3. Herstellung von Antikörperfragmenten
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Antikörperfragmenten zur Herstellung von Antikörper-Kompositen. Antikörperfragmente können durch prote olytische Hydrolyse des Antikörpers oder durch Expression der DNA, welche für das Fragment kodiert, in E. coli hergestellt werden. Antikörperfragmente können durch die Spaltung ganzer Antikörper mit Pepsin oder Papain mit gängigen Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel können Antikörperfragmente durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin hergestellt werden, um ein 5S Fragment, als F(ab')2 bezeichnet, bereitzustellen. Dieses Fragment kann weiter unter Verwendung eines reduzierenden Thiolmittels und gegebenenfalls einer Blockierungsgruppe für die Sulfhydrylgruppen, die aus der Spaltung der Disulfidbrücken entstehen, gespalten werden, um monovalente 3,5 S Fab'-Fragmente herzustellen. Alternativ stellt eine enzymatische Spaltung, die Pepsin verwendet, direkt zwei monovalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment her. Diese Verfahren werden zum Beispiel von Goldenberg, U.S. Patent Nrs. 4,036,945 und 4,331,647 und den darin enthaltenen Zitaten beschrieben. Siehe ebenfalls Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, Seite 422 (Academic Press 1967) und Coligan auf Seiten 2.8.1–2.8.10 und 2.10–2.10.4.
  • Andere Verfahren zur Spaltung von Antikörpern, wie die Trennung der schweren Ketten, um monovalente leichte-schwere Kettenfragmente zu bilden, ferner Spaltung von Fragmenten oder andere enzymatische, chemische oder genetische Techniken können ebenfalls verwendet werden, solange die Fragmente an das Antigen binden, welches durch den intakten Antikörper erkannt wird.
  • Zum Beispiel umfassen Fv-Fragmente eine Verbindung aus VH und VL Ketten. Diese Verbindung kann nicht kovalent sein, wie bei Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69: 2659 (1972) beschrieben. Alternativ können die variablen Ketten durch eine intermolekulare Disulfidbindung verbunden werden oder durch Chemikalien wie Glutaraldehyd quervernetzt werden. Siehe zum Beispiel Sandhu, supra.
  • Vorzugsweise umfassen die Fv-Fragmente VH und VL Ketten, welche durch einen Peptidlinker verbunden sind. Diese Einzelketten Antigen-Bindungsproteine (sFv) werden durch die Konstruktion eines Strukturgens hergestellt, welches DNA- Sequenzen umfasst, welche die VH und VL Domänen, die durch ein Oligonukleotid verbunden sind, kodieren. Das Strukturgen wird in einen Expressionsvektor eingefügt, welcher nachfolgend in eine Wirtszelle, wie E. coli, eingebracht wird. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine ein eine Polypeptidkette mit einem Linkerpeptid, welches die zwei V-Domänen überbrückt. Verfahren zur Herstellung von sFvs werden zum Beispiel von Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991) beschrieben. Siehe ebenfalls Bird et al., Science 242: 423–426 (1988), Ladner et al., U.S. Patent Nr. 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11: 1271–1277 (1993) und Sandhu, supra.
  • Eine andere Form eines Antikörperfragments ist ein Peptid, welches für eine einzelne Komplementaritäts-Determinanten-Region (CDR) kodiert. CDR Peptide ("minimale Erkennungseinheiten") können durch die Konstruktion von Genen erhalten werden, welche für die CDR eines Antikörpers von Interesse kodieren. Solche Gene werden zum Beispiel durch die Verwendung der Polymerase Kettenreaktion hergestellt, um die variable Region aus RNA von Antikörper herstellenden Zellen zu synthetisieren. Siehe zum Beispiel Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991).
  • 4. Herstellung von Antikörper-Kompositen
  • Antikörper-Kompositen können durch eine Vielzahl von gängigen Verfahren hergestellt werden, die von einer Verbindung durch Glutaraldehyd bis zu mehr spezifischen Verbindungen zwischen funktionellen Gruppen reichen. Die Antikörper und/oder Antikörperfagmente werden vorzugsweise kovalent direkt oder durch einen Linkerrest, durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen des Antikörpers oder Fragments, z.B. Amin-, Carboxyl-, Pheny-, Thiol- oder Hydroxylgruppen, aneinander gebunden. Verschiedene gängige Linker können zusätzlich zum Glutaraldehyd verwendet werden, z.B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, bis(Hydroxysuccinimid)ester, Carbodiimide, Maleimidhydroxysuccinimidester und desgleichen. Die optimale Länge des Linkers kann gemäß dem Typ der Zielzelle variieren. Die wirksamste Linkergröße kann durch die Verwendung von Antikörper- Kompositen mit verschiedenen Linkerlängen für die immunchemische Färbung einer Gewebeprobe eines Patienten, welche Zellen enthält, die ein Multidrug-Transporterprotein und das Ziel-Antigen exprimieren, bestimmt werden. Immunchemische Techniken werden unten beschrieben.
  • Ein einfaches Verfahren zur Herstellung von Antikörper-Kompositen ist, die Antikörper oder Fragmente in der Anwesenheit von Glutaraldehyd zu mischen, um ein Antikörper-Komposit zu bilden. Die anfänglichen Schiffsche Basen Verbindungen können z.B. durch Reduktion mit Borhydrid zu sekundären Aminen stabilisiert werden. Ein Diisothiocyanat oder Carbodiimid kann anstelle von Glutaraldehyd als ein nicht seitenspezifischer Linker verwendet werden.
  • Die einfachste Form eines Antikörper-Komposits ist ein bispezifischer Antikörper, welcher Bindungsreste für ein Multidrug-Transporterprotein und ein Antigen, welches mit einer Tumorzelle oder einem infektiösen Mittel verbunden ist, umfasst. Bispezifische Antikörper können durch eine Vielzahl von gängigen Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Disulfid-Spaltung und erneute Bildung von Gemischen aus gesamt IgG oder vorzugsweise F(ab')2-Fragmenten, durch Fusionen von mehr als einem Hybridom, um Polyome zu bilden, welche Antikörper herstellen, die mehr als eine Spezifität aufweisen und durch gentechnische Veränderung. Bispezifische Antikörper-Kompositen wurden durch oxidative Spaltung von Fab'-Fragmenten, die aus der reduktiven Spaltung von verschiedenen Antikörpern stammten, hergestellt. Dies wird vorteilhafterweise durch das Mischen zwei verschiedener F(ab')2-Fragmente, welche durch Pepsin-Spaltung von zwei verschiedenen Antikörpern hergestellt wurden, durch reduktive Spaltung, um ein Gemisch aus Fab'-Fragmenten zu bilden, gefolgt von einer oxidativen Neubildung der Disulfid-Verbindungen, um ein Gemisch aus F(ab')2-Fragmenten herzustellen, welches bispezifische Antikörper-Kompositen einschließt, welche einen Fab'-Anteil enthalten, der spezifisch für jedes der Originalepitope ist, durchgeführt. Allgemeine Techniken zur Herstellung von Antikörper-Kompositen können zum Beispiel bei Nisonhoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968) und U.S. Patent Nr. 4,331,647 gefunden werden.
  • Selektivere Verbindungen können durch die Verwendung eines heterobifunktionalen Linkers, wie Maleimidhydroxysuccinimidester erreicht werden. Die Reaktion des Esters mit einem Antikörper oder Fragment wird die Aminogruppen des Antikörpers oder Fragments derivatisieren, und das Derivat kann anschließend mit z.B. einem Antikörper-Fab-Fragment, welches freie Sulfhydrylgruppen aufweist (oder mit einem größeren Fragment oder intakten Antikörper mit Sulfhydrylgruppen, die durch z.B. Traut's Reagens daran angeheftet wurden), umgesetzt werden. Bei einem solchen Linker ist es weniger wahrscheinlich, dass er Gruppen im selben Antikörper quervernetzt, und er verbessert die Selektivität der Verbindung.
  • Es ist vorteilhaft, die Antikörper oder Fragmente an Stellen, welche entfernt von der Antigen-Bindungsstelle liegen, zu verbinden. Dies kann z.B. durch eine Verbindung an gespaltene Zwischenketten-Sulfhydrylgruppen erreicht werden, wie oben erwähnt. Ein anderes Verfahren schließt die Reaktion eines Antikörpers, welcher einen oxidierten Kohlenwasserstoffanteil aufweist, mit einem anderen Antikörper, welcher mindestens eine freie Aminfunktion aufweist, ein. Dies führt zu einer anfänglichen Schiffsche Basen-(Imin)Verbindung, die vorzugsweise durch Reduktion zu einem sekundären Amin stabilisiert wird, z.B. durch Borhydrid Reduktion, um das endgültige Komposit zu bilden. Solche stellenspezifischen Verbindungen werden für kleine Moleküle in dem U.S. Patent Nr. 4,671,958 und für größere Addenden in dem U.S. Patent Nr. 4,699,784 offenbart.
  • Im vorliegenden Zusammenhang umfasst ein bispezifischer Antikörper Bindungsreste für ein Multidrug-Transporterprotein und ein Antigen, welches mit einer Tumorzelle oder einem infektiösen Mittel verbunden ist. Zum Beispiel kann der Multidrug-Transporterprotein-Bindungsrest von einem Anti-Multidrug-Transporterprotein Mak abgeleitet werden, während ein Bindungsrest eines karzinoembryonalen Antigens (CEA) von einem Klasse III Mak abgeleitet werden kann. Verfahren zur Herstellung eines Multidrug-Transporterprotein Mak werden oben beschrieben, während Verfahren zur Herstellung von Klasse III Anti-CEA Mak von Primus et al., Cancer Research 43: 686 (1983) und von Primus et al., U.S. Patent Nr. 4,818,709 beschrieben werden.
  • Ein bispezifischer Antikörper kann zum Beispiel durch das Erhalten eines F(ab')2-Fragments von einem Anti-CEA Klasse III Mak durch die Verwendung der oben beschriebenen Techniken hergestellt werden. Die Zwischenketten Disulfidbrücken des Anti-CEA Klasse III F(ab')2-Fragments werden vorsichtig, unter Beachtung leichte-schwere Ketten Verbindungen zu vermeiden, mit Cystein reduziert, um Fab'-SH-Fragmente zu bilden. Die SH-Gruppe(n) wird (werden) mit einem Überschuss an Bismaleimid-Linker (1,1'-(Methylendi-4,1-phenylen)bismaleimid) aktiviert. Der Multidrug-Transporterprotein Mak wird zu Fab'-SH konvertiert und reagiert anschließend mit dem aktivierten Anti-CEA Klasse III Fab'-SH-Fragment, um einen bispezifischen Antikörper zu erhalten.
  • Alternativ können solche bispezifischen Antikörper durch das Fusionieren von zwei Hybridom-Zelllinien hergestellt werden, welche Anti-Multidrug-Transporterprotein Mak und Anti-CEA Klasse III Mak herstellen. Techniken zur Herstellung von Tetradomen werden zum Beispiel von Milstein et al., Nature 305: 537 (1983) und Pohl et al., Int. J. Cancer 54: 418 (1993) beschrieben.
  • Schließlich können solche bispezifischen Antikörper durch Gentechnik hergestellt werden. Zum Beispiel können Plasmide, die DNA enthalten, welche für variable Domänen eines Anti-CEA Klasse III Mak kodiert, in Hybridome eingeführt werden, die Anti-Multidrug-Transporterprotein-Antikörper sezernieren. Die entstehenden "Transfektome" stellen bispezifische Antkörper her, welche CEA und das Multidrug-Transporterprotein binden. Alternativ können chimäre Gene entwickelt werden, welche für sowohl das Anti-Multidrug-Transporterprotein als auch die Anti-CEA-Bindungsdomänen kodieren. Allgemeine Techniken zur gentechnischen Herstellung bispezifischer Antikörper werden zum Beispiel von Songsivilai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 271 (1989); Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) und Weiner et al., J. Immunol. 147: 4035 (1991) beschrieben.
  • Ein polyspezifisches Antikörper-Komposit kann durch das Hinzufügen verschiedener Antikörperkomponenten zu einem bispezifischen Antikörper-Komposit erhalten werden. Zum Beispiel kann man einen bispezifischen Antikörper mit 2-Iminothiolan reagieren lassen, um eine oder mehrere Sulfhydrylgruppen zur Verwendung bei der Verknüpfung des bispezifischen Antikörpers mit einer Antikörperkomponente, welche ein Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, welches vom Epitop verschieden ist, welches durch den bispezifischen Antikörper gebunden wird, einzufügen, wobei das Bis-Maleimid-Aktivierungs-Verfahren verwendet wird, welches oben beschrieben wurde. Diese Techniken zur Herstellung von Antikörper-Kompositen sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 4,925,648 und Goldenberg, internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/19273.
  • 5. Herstellung von polyspezifischen Immunkonjugaten
  • Polyspezifische Immunkonjugate können durch indirektes Konjugieren eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels an ein Antikörper-Komposit hergestellt werden. Allgemeine Techniken sind in Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101–1106 (1990) und Shih et al., U.S. Patent Nr. 5,057,313 beschrieben. Das allgemeine Verfahren schließt die Reaktion einer Antikörperkomponente, welche einen oxidierten Kohlenhydratanteil aufweist, mit einem Trägerpolymer ein, welches mindestens eine freie Aminfunktion aufweist und mit einer Vielzahl an Arzneimitteln, Toxinen, Chelatoren, Bor-Addends oder anderen diagnostischen oder therapeutischen Mitteln beladen ist. Diese Reaktion führt zu einer anfänglichen Schiffsche Basen (Imin) Verbindung, welche durch die Reduktion zu einem sekundären Amin stabilisiert werden kann, um das endgültige Konjugat zu bilden.
  • Das Trägerpolymer ist vorzugsweise ein Aminodextran oder ein Polypeptid aus mindestens 50 Aminosäureresten, obwohl andere, im Wesentlichen äquivalente Polymer-Träger ebenfalls verwendet werden können. Vorzugsweise ist das endgültige polyspezifische Immunkonjugat in einer wässrigen Lösung, wie Säugetierserum, zur Vereinfachung der Verabreichung und zur wirksamen Zielausrichtung bei der Verwendung in Diagnose oder Therapie löslich. Daher werden löslich machende Funktionen an dem Trägerpolymer die Serumlöslichkeit des endgültigen polyspezifischen Immunkonjugats verstärken. Löslich machende Funktionen sind ebenfalls für die Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten für den immunchemischen Nachweis, wie unten beschrieben, wichtig. Insbesondere wird ein Aminodextran bevorzugt werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines polyspezifischen Immunkonjugats mit einem Aminodextran-Träger beginnt typischerweise mit einem Dextran-Polymer, vorteilhafterweise einem Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 10.000–100.000. Man lässt das Dextran mit einem Oxidationsmittel reagieren, um eine kontrollierte Oxidation eines Teils seiner Kohlenhydratringe zu bewirken, um Aldehydgruppen zu erzeugen. Die Oxidation wird in geeigneter Weise mit glykolytischen chemischen Reagenzien, wie NaIO4, gemäß gängigen Verfahren bewirkt.
  • Man lässt das oxidierte Dextran anschließend mit einem Polyamin, vorzugsweise einem Diamin und weiter bevorzugt einem Mono- oder Polyhydroxydiamin reagieren. Geeignete Amine schließen Ethylendiamin, Propylendiamin oder andere ähnliche Polymethylendiamine, Diethylentriamin oder ähnliche Polyamine, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder andere ähnliche hydroxylierte Diamine oder Polyamine und desgleichen ein. Ein Überschuss des Amins relativ zu den Aldehydgruppen des Dextrans wird verwendet, um eine im Wesentlichen vollständige Konvertierung der Aldehydfunktionen in Schiff'sche Basengruppen zu sichern.
  • Ein Reduktionsmittel wie NaBH4, NaBH3CN oder desgleichen wird verwendet, um eine reduktive Stabilisierung der sich ergebenden Schiff'sche Basen-Zwischenprodukte zu bewirken. Das sich ergebende Addukt kann durch eine Passage durch eine gängige Größentrennungssäule gereinigt werden, um quervernetzte Dextrane zu entfernen.
  • Andere gängige Verfahren zur Derivatisierung eines Dextrans, um Aminfunktionen einzufügen, z.B. eine Reaktion mit Cyanbromid, gefolgt von der Reaktion mit einem Diamin, können ebenfalls verwendet werden.
  • Man lässt das Aminodextran anschließend mit einem Derivat des bestimmten Arzneimittels, Toxins, Chelators, paramagnetischen Ions, Bor-Addends oder einem anderen diagnostischen oder therapeutischen Mittel, mit welchem beladen werden soll, in einer aktivierten Form, vorzugsweise einem Carboxyl-aktivierten Derivat, welches mit gängigen Hilfsmitteln hergestellt wurde, z.B. der Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder einer wasserlöslichen Variante davon, reagieren, um ein Addukt als Zwischenprodukt zu bilden.
  • Alternativ können Polypeptidtoxine wie antivirales Kermesbeeren-Protein oder Ricin-A-Kette und desgleichen mit Aminodextran durch Glutaraldeyhd-Kondensation oder durch die Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen auf dem Protein mit Aminen auf dem Aminodextran verknüpft werden.
  • Chelatoren für radioaktive Metalle oder Enhancer der magnetischen Resonanz sind im Stand der Technik gut bekannt. Typisch sind Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese Chelatoren weisen typischerweise Gruppen auf der Seitenkette auf, mit denen der Chelator an den Träger angeheftet werden kann. Solche Gruppen schließen z.B. Benzylisothiocyanat ein, mit dem das DTPA oder EDTA mit der Amingruppe eines Trägers verknüpft werden kann. Alternativ können Carboxylgruppen oder Amingruppen an einem Chelator mit einem Träger durch eine Aktivierung oder vorherige Derivatisierung und anschließende Verknüpfung verknüpft werden, alles mit gut bekannten Hilfsmitteln.
  • Markierungen wie Enzyme, fluoreszente Verbindungen, Elektronentransfer-Mittel und desgleichen, können durch gängige Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, an einen Träger gebunden werden. Diese markierten Träger und die aus diesen hergestellten polyspezifischen Immunkonjugate können für einen immunchemischen Nachweis, wie unten beschrieben, verwendet werden.
  • Bor-Addends, wie Carborane, können mit gängigen Verfahren an Antikörperkomponenten angefügt werden. Zum Beispiel können Carborane mit Carboxylfunktionen an überhängenden Seitenketten hergestellt werden, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist. Das Anfügen solcher Carborane an einen Träger, z.B. Aminodextran, kann durch die Aktivierung der Carboxylgruppen der Carborane und durch die Kondensation mit Aminen an dem Träger erreicht werden, um ein Konjugat als Zwischenprodukt herzustellen. Solche Zwischenprodukt-Konjugate werden anschließend an Antikörperkomponenten angefügt, um therapeutisch verwendbare polyspezifische Immunkonjugate, wie unten beschrieben, herzustellen.
  • Ein Polypeptid-Träger kann anstelle eines Aminodextrans verwendet werden, aber der Polypeptid-Träger sollte mindestens 50 Aminosäurereste in der Kette aufweisen, vorzugsweise 100–5000 Aminosäurereste. Mindestens einige der Aminosäuren sollten Lysinreste oder Glutamat oder Aspartatreste sein. Die überhängenden Amine der Lysinreste und die überhängenden Carboxylate des Glutamins und Aspartats sind zur Anheftung eines Arzneimittels, Toxins, Chelators, Bor-Addends oder eines anderen diagnostischen oder therapeutischen Mittels geeignet. Beispiele für geeignete Polypeptid-Träger schließen Polylysin, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Copolymere davon und gemischte Polymere dieser Aminosäuren und anderer, z.B. Serine, ein, um dem sich ergebenden beladenen Träger und dem polyspezifischen Immunkonjugat die gewünschten Löslichkeitseigenschaften zu verleihen.
  • Die Konjugation des Zwischenprodukt-Konjugats mit der Antikörperkomponente wird durch die Oxidation des Kohlenhydratteils der Antikörperkomponente und die Reaktion der sich ergebenden Aldehyd- (und Keton-) carbonyle mit Amingruppen, die nach der Beladung mit einem Arzneimitttel, Toxin, Chelator, Bor-Addend oder einem anderen diagnostischen oder therapeutischen Mittel auf dem Träger verbleiben, bewirkt. Alternativ kann ein Zwischenprodukt-Konjugat an eine oxidierte Antikörperkomponente über Amingruppen, welche nach der Beladung mit dem diagnostischen oder therapeutischen Mittel in das Zwischenprodukt-Konjugat eingeführt wurden, angefügt werden. Oxidation wird in geeigneter Weise entweder chemisch, z.B. mit NaIO4 oder einem anderen glykolytischen Reagens oder enzymatisch, z.B. mit Neuraminidase und Galactoseoxidase bewirkt. Im Fall eines Aminodextran-Trägers werden typischerweise nicht alle der Amine des Aminodextrans zur Beladung mit einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel verwendet. Die verbleibenden Amine des Aminodextrans kondensieren mit der oxidierten Anitkörperkomponente, um Schiffsche Basen-Addukte zu bilden, welche anschließend reduzierend stabilisiert werden, in der Regel mit einem reduzierenden Borhydridmittel.
  • Analoge Verfahren werden verwendet, um andere erfindungsgemäße polyspezifische Immunkonjugate herzustellen. Beladene Polypeptid-Träger weisen vorzugsweise freie Lysinreste auf, die zur Kondensation mit dem oxidierten Kohlenhydratteil einer Antikörperkomponente verbleiben. Carboxyle am Polypeptid-Träger können, wenn nötig, durch z.B. Aktivierung mit DCC und Reaktion mit einem Überschuss an Diamin zu Aminen konvertiert werden.
  • Das endgültige polyspezifische Immunkonjugat wird unter Verwendung gängiger Techniken, wie Größentrennungs-Chromatographie mit Sephacryl S-300 gereinigt.
  • Alternativ können polyspezifische Immunkonjugate durch direktes Konjugieren einer Antikörperkomponente mit einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel hergestellt werden. Das allgemeine Verfahren ist analog zu dem indirekten Verfahren der Konjugation, außer dass ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel direkt an eine oxidierte Antikörperkomponente angefügt wird.
  • Es wird erwartet, dass andere diagnostische oder therapeutische Mittel durch die hier beschriebenen Chelatoren substituiert werden können. Der Fachmann wird in der Lage sein, Konjugationsschemata ohne übermäßiges Experimentieren zu entwickeln.
  • Zusätzlich wird der Fachmann zahlreiche mögliche Variationen der Konjugationsverfahren erkennen. Zum Beispiel kann der Kohlenhydratrest verwendet werden, um Polyethylenglykol anzufügen, um die Halbwertszeit eines intakten Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon in Blut, Lymphe oder anderen extrazellulären Flüssigkeiten zu verlängern. Außerdem ist es möglich, ein "divalentes Immunkonjugat" durch das Anfügen eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels an einen Kohlenhydratrest und an eine freie Sulfhydrylgruppe zu konstruieren. Solch eine freie Sulfhydrylgruppe kann in der Gelenkregion der Antikörperkomponente gelegen sein.
  • 6. Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten und Antikörper-Kompositen in der Diagnose
  • A. In vitro Diagnose
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten und Antikörper-Kompositen, um biologische Proben in vitro auf die Expression von P-Glycoprotein durch Tumorzellen zu screenen. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugate und Antikörper-Kompositen verwendet werden, um die Anwesenheit von P-Glycoprotein und Tumor verbundenem Antigen in Gewebeschnitten nachzuweisen, welche aus Biopsieproben hergestellt wurden. So ein immunchemischer Nachweis kann verwendet werden, um die Menge an P-Glycoprotein zu bestimmen und um die Verteilung von P-Glycoprotein in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Allgemeine immunchemische Techniken sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application", in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH, Monk (Hrsg.), Seiten 115–38 (IRL Press 1987), Volm et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 743 (1989), Coligan auf Seiten 5.8.1–5.8.8 und Ausubel et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 14.6.1 bis 14.6.13 (Wiley Interscience 1990). Siehe ebenfalls allgemein Manson (Hrsg.), METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS (The Humana Press, Inc. 1992). Außerdem werden Verfahren für den immunchemischen Nachweis von P-Glycoprotein beschrieben, zum Beispiel von Dalton et al., Blodd 73: 747 (1989) und Volm et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 743 (1989).
  • Zusätzlich umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten und Antikörper-Kompositen, um biologische Proben in vitro auf die Expression eines Multidrug-Transporterproteins durch ein infektiöses Mittel zu screenen. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugate und Antikörper-Kompositen verwendet werden, um die Anwesenheit von OprK-Protein in klinischen Isolaten nachzuweisen. Die Anwesenheit dieses bestimmten Multidrug-Transporterproteins würde darauf hinweisen, dass das Gewebe mit Multidrug-resistenten Pseudomonas aeruginosa infiziert war.
  • Außerdem können immunchemische Nachweistechniken verwendet werden, um Antikörper-Kompositen für eine nachfolgende in vivo Diagnose und Therapie in Form von Antikörper-Kompositen per se oder als polyspezifische Immunkonjugate zu optimieren. Dementsprechend kann ein immunchemischer Nachweis mit einer Reihe von Antikörper-Kompositen durchgeführt werden, um die geeignetste Kombination von Antikörperkomponenten für eine nachfolgende in vivo Diagnose und Therapie zu identifizieren. Zum Beispiel kann ein Antikörperrest, welcher das c-erb B2 Protoonkogen-Produkt bindet, geeigneter für einen bestimmten Brustkrebs sein, als ein Antikörperrest, welcher karzinoembryonales Antigen bindet. Nachdem eine geeignete Kombination von Antikörperkomponenten identifiziert wurde, kann weiteres in vitro Testen verwendet werden, um die wirksamste Linkergröße im Antikörper-Komposit abzugrenzen, wie oben diskutiert.
  • Ein immunchemischer Nachweis kann durch Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper-Komposit und einem anschließenden Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem nachweisbar markierten Molekül, welches an das Antikörper-Komposit bindet, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das nachweisbar markierte Molekül einen Antikörperrest umfassen, welcher das Antikörper-Komposit bindet. Alternativ kann das Antikörper-Komposit mit Avidin/Streptavidin (oder Biotin) konjugiert werden, und das nachweisbar markierte Molekül kann Biotin (oder Avidin/Streptavidin) umfassen. Zahlreiche Variationen dieser Basistechnik sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Alternativ kann ein Antikörper-Komposit mit einem diagnostischen Mittel konjugiert werden, um ein polyspezifisches Immunkonjugat zu bilden. Antikörper-Kompositen können mit jedem geeigneten Markerrest, zum Beispiel einem Radioisotop, einer Fluoreszenz-Markierung, einer Chemolumineszenz-Markierung, einer Enzym-Markierung, einer Biolumineszenz-Markierung oder kolloidalem Gold nachweisbar markiert werden. Verfahren zur Herstellung und zum Nachweis solcher nachweisbar markierten polyspezifischen Immunkonjugate sind dem Fachmann gut bekannt und werden unten detaillierter beschrieben.
  • Der Markerrest kann ein Radioisotop sein, welches durch Autoradiographie nachgewiesen wird. Isotope, welche insbesondere für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet sind, sind 3H, 125I, 131I, 35S und 14C.
  • Polyspezifische Immukonjugate können ebenfalls mit einer Fluoreszenz-Verbindung markiert werden. Die Anwesenheit einer Fluoreszenz markierten Antikörperkomponente wird durch Exponieren des polyspezifischen Immunkonjugats gegenüber Licht der angemessenen Wellenlänge und den Nachweis der entstehenden Fluoreszenz bestimmt. Fluoreszente Markierungsverbindungen schließen Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluoreszamin ein.
  • Alternativ können polyspezifische Immunkonjugate durch Verknüpfung einer Antikörperkomponente mit einer chemolumineszenten Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Anwesenheit des Chemolumineszenz markierten polyspezifischen Immunkonjugats wird durch den Nachweis der Anwesenheit von Lumines zenz, welche während des Ablaufs einer chemischen Reaktion auftritt, bestimmt. Beispiele für chemolumineszente Markierungsverbindungen schließen Luminol, Isoluminol, einen aromatischen Acridiniumester, ein Imidazol, ein Acridiniumsalz und ein Oxalatester ein.
  • Eine biolumineszente Verbindung kann ähnlich verwendet werden, um erfindungsgemäße polyspezifische Immunkonjugate zu markieren. Biolumineszenz ist eine Form von Chemolumineszenz, welche in biologischen Systemen gefunden wird, in denen ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der chemolumineszenten Reaktion verstärkt. Die Anwesenheit eines biolumineszenten Proteins wird durch den Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz bestimmt. Biolumineszente Verbindungen, welche für eine Markierung geeignet sind, schließen Luciferin, Luciferase und Äquorin ein.
  • Alternativ können polyspezifische Immunkonjugate durch Verbinden einer Antikörperkomponente mit einem Enzym nachweisbar markiert werden. Wenn das polyspezifische Immunkonjugate-Enzym Konjugat in der Anwesenheit des geeigneten Substrats inkubiert wird, reagiert der Enzymrest mit dem Substrat, um einen chemischen Rest herzustellen, welcher zum Beispiel mit spektrophotometrischen, fluorometrischen oder visuellen Hilfsmitteln nachgewiesen werden kann. Beispiele für Enzyme, die verwendet werden können, um polyspezifische Immunkonjugate nachweisbar zu markieren, schließen β-Galactosidase, Glucoseoxidase, Peroxidase und alkalische Phosphatase ein.
  • Der Fachmann wird andere geeignete Markierungen kennen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden können. Das Binden von Markerresten an Antikörperkomponenten kann durch Verwendung von Standardtechniken des Standes der Technik vervollständigt werden. Typische Methodik diesbezüglich wird von Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976) beschrieben. Schurs et al. Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990), Stein et al., Cancer Res. 50: 1330 (1990), supra und Stein et al., Int. J. Cancer 55: 938 (1993). Allgemein siehe ebenfalls, Coligan.
  • Zusätzlich kann die Geeignetheit und Vielseitigkeit des immunchemischen Nachweises durch die Verwendung von Antikörperkomponenten, welche mit Avidin, Streptavidin und Biotin konjugiert wurden, verstärkt werden. Siehe zum Beispiel Wilchek et al. (Hrsg.), Avidin-Biotin Technology, METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 184 (Academic Press 1990) und Bayer of al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, Manson (Hrsg.), Seiten 149–162 (The Human Press, Inc. 1992).
  • Daher können die oben beschriebenen immunchemischen Nachweisverfahren verwendet werden, um bei der Diagnose oder der Stadienbestimmung eines pathologischen Zustandes zu helfen. Diese Techniken können ebenfalls verwendet werden, um die am meisten geeignete Zusammensetzung eines Antikörper-Komposits oder eines polyspezifischen Immunkonjugats für eine nachfolgende in vivo Diagnose und Therapie festzustellen.
  • B. In vivo Diagnose
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Antikörper-Kompositen und polyspezifischen Immunkonjugaten für eine in vivo Diagnose. Das Verfahren des diagnostischen Imaging mit radioaktiv markierten MAks ist gut bekannt. Bei der Technik der Immunszinitigraphie werden zum Beispiel Antikörper mit einem Gamma-Strahlen ausstrahlenden Radioisotop markiert und in einen Patienten eingeführt. Eine Gammakamera wird verwendet, um die Lage und die Verbreitung der Gamma-Strahlen ausstrahlenden Radioisotope nachzuweisen. Siehe zum Beispiel Srivastava (Hrsg.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage, Gennaro et al. (Hrsg.), S. 624–652 (Mack Publishing Co., 1990), Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies", in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227–49, Pezzuto et al. (Hrsg.) (Chapman & Hall 1993) und Goldenberg, CA–A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994).
  • Für ein diagnostisches Imaging können Radioisotope entweder direkt oder indirekt durch Verwendung einer funktionellen Zwischenprodukt-Gruppe an ein Antikörper-Komposit gebunden werden. Geeignete funktionelle Zwischenprodukt-Gruppen schließen Chelatoren wie Ethylendiamintetraessigsäure und Diethylentriaminpentaessigsäure ein. Siehe zum Beispiel Shih et al., supra und U.S. Patent Nr. 5,057,313. Siehe ebenfalls Griffiths, U.S. Patent Nr. 5,128,119 (1992).
  • Die Strahlendosis, welche auf den Patienten abgegeben wird, wird auf einem Niveau so niedrig wie möglich durch die Wahl eines Isotops für die beste Kombination aus minimaler Halbwertszeit, minimaler Verweildauer im Körper und minimaler Menge des Isotops, welches einen Nachweis und eine genaue Messung erlaubt, gehalten. Beispiele für Radioisotope, die an ein Antikörper-Komposit gebunden werden können und die für ein diagnostisches Imaging geeignet sind, schließen γ-Strahler und Positronen-Strahler wie 99mTc, 67Ga, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 51Cr, 89Zr, 18F und 68Ga ein. Andere geeignete Radioisotope sind dem Fachmann bekannt.
  • Bevorzugte γ-Strahler weisen einen Gamma-Strahlen-Emissionspeak im Bereich von 50–500 KeV auf, hauptsächlich weil der Stand der Technik für Strahlendetektoren gegenwärtig solche Markierungen bevorzugt. Beispiele für solche γ-Strahler schließen 99mTc, 67Ga, 123I, 125I und 131I ein.
  • Antikörper-Kompositen können ebenfalls für Verwendungszwecke der in vivo Diagnose mit paramagnetischen Ionen markiert werden. Elemente, welche besonders geeignet für eine Magnetresonanztomographie sind, schließen Gd-, Mn-, Dy- und Fe-Ionen ein.
  • Ein hohes Hintergrundniveau an nicht gerichtetem Antikörper stellt ein Haupthindernis der in vivo Diagnosemethodik dar. Das Verhältnis von gerichtetem zu nicht gerichtetem radioaktiv markiertem Antikörper kann jedoch durch die Verwendung von einem nicht markierten sekundären Antikörper, welcher reinigt und die Clea rance des nicht gerichteten, zirkulierenden, radioaktiv markierten Antikörpers begünstigt, verstärkt werden. Der sekundäre Antikörper kann ein gesamtes IgG oder IgM oder ein Fragment des IgG oder IgM sein, solange wie es in der Lage ist, den radioaktiv markierten Antikörper zu binden, um einen Komplex zu bilden, welcher schneller aus der Zirkulation und den Räumen entfernt wird, welche kein Ziel sind, als der radioaktiv markierte Antikörper alleine. Im vorliegenden Zusammenhang, können geeignete sekundäre Antikörper mit entweder dem Fc-Teil oder der variablen Region eines radioaktiv markierten polyspezifischen Immunkonjugats binden. Siehe zum Beispiel Goldenberg, U.S. Patent Nr. 4,624,846, Goldenberg, internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/19273 und Sharkey et al., Int. J. Cancer. 51: 266 (1992).
  • Zum Beispiel kann die Lage von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln in einem Säugetier, welches eine Multidrug-resistente Erkrankung aufweist, die durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel verursacht wurde, durch parenterale Injektion des Säugetiers mit einem polyspezifischen Immunkonjugat bestimmt werden, welches (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, welches mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbunden ist und (3) ein diagnostisches Mittel umfasst. Nachfolgend wird dem Säugetier ein Antikörper oder Antikörperfragment injiziert, welches mit dem polyspezifischen Immunkonjugat in einer Menge bindet, welche ausreicht, um den Spiegel an zirkulierendem polyspezifischen Immunkonjugat um etwa 10–85 % innerhalb von 2 bis 72 Stunden zu senken. Das Säugetier wird anschließend mit einem Detektor gescannt, um die Stelle oder die Stellen der Aufnahme des polyspezifischen Immunkonjugats zu lokalisieren. Siehe Goldenberg, U.S. Patent Nr. 4,624,846.
  • In einem alternativen Ansatz werden die Nachweisverfahren durch den Vorteil der Bindung zwischen Avidin/Streptavidin und Biotin verbessert. Avidin, welches in Eiweiß gefunden wird, weist eine sehr hohe Bindungsaffinität für Biotin auf, wel ches ein B-Komplex Vitamin ist. Streptavidin, welches aus Streptomyces avidinii isoliert wird, ist dem Avidin ähnlich, aber weist eine niedrigere nicht spezifische Gewebebindung auf, und daher wird Streptavidin häufig anstelle von Avidin verwendet. Ein diagnostisches Basisverfahren umfasst die Verabreichung eines Antikörper-Komposits, welches mit Avidin/Streptavidin (oder Biotin) konjugiert ist, das Injizieren einer Clearing-Zusammensetzung, welche Biotin (oder Avidin/Streptavidin) umfasst und das Verabreichen eines Konjugats aus einem diagnostischen Mittel und Biotin (oder Avidin/Streptavidin). Vorzugsweise wird die Biotin- (oder Avidin-/Streptavidin-) Komponente der Clearing-Zusammensetzung mit einem Kohlenhydratrest (wie Dextran) oder einer Polyolgruppe (z.B. Polyethylenglykol) verknüpft, um die Immunogenität zu senken und wiederholte Anwendungen zu erlauben.
  • Eine Modifizierung des Basisverfahrens wird durch parenterales Injizieren eines Säugetieres mit einem Antikörper-Komposit, welches mit Avidin/Streptavidin (oder Biotin) konjugiert wurde, Injizieren einer Clearing-Zusammensetzung, welche Biotin (oder Avidin/Streptavidin) umfasst und parenterales Injizieren eines erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugats, welches weiterhin Avidin/Streptavidin (oder Biotin) umfasst, durchgeführt. Siehe Goldenberg, internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/04702.
  • In einer weiteren Variation dieses Verfahrens, kann ein verbesserter Nachweis durch das Konjugieren multipler Avidin-/Streptavidin- oder Biotinreste an ein Polymer, welches wiederum an eine Antikörperkomponente konjugiert ist, erreicht werden. Angepasst an die vorliegende Erfindung, können Antikörper-Kompositen oder polyspezifische Immunkonjugate hergestellt werden, welche multiple Avidin-/Streptavidin- oder Biotinreste enthalten. Techniken zur Herstellung und zur Verwendung von Multiavidin-/Multistreptavidin- und/oder Multibiotin-Polymerkonjugaten, um eine Verstärkung der Zielausrichtung zu erhalten, werden durch Griffiths, internationale Anmeldung Nr. PCT/US94/04295 offenbart.
  • In einer anderen Variation wird der verbesserte Nachweis durch Injizieren eines gerichteten Antikörper-Komposits, welches mit Biotin (oder Avidin/Streptavidin) konjugiert ist, durch Injizieren mindestens einer Dosis eines Avidin/Streptavidin (oder Biotin) Clearing-Mittels und durch Injizieren einer diagnostischen Zusammensetzung erreicht, welche ein Konjugat aus Biotin (oder Avidin/Streptavidin) und einem natürlich vorkommenden Metallatom chelatisierenden Protein umfasst, welches chelatisiert ist. Geeignete erfindungsgemäße Ziel ausrichtende Proteine würden Ferritin, Metallthioneine, Ferredoxine und desgleichen sein. Dieser Ansatz wird durch Goldenberg et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US94/05149 offenbart.
  • Polyspezifische Immunkonjugate, welche eine radioaktive Markierung umfassen, können ebenfalls verwendet werden, um Multidrug-resistente (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierte Zellen oder MDR infektiöse Mittel im Ablauf von intraoperativen und endoskopischen Untersuchungen unter Verwendung einer kleinen Strahlennachweissonde nachzuweisen. Siehe Goldenberg, U.S. Patent Nr. 4,932,412. Als eine Darstellung des Basisansatzes wird ein Chirurgie- oder Endoskopiepatient mit einem polyspezifischen Immunkonjugat parenteral injiziert, welches (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, welches mit einem Tumor oder infektiösem Mittel verbunden ist und (3) ein Radioisotop umfasst. Nachfolgend wird das chirurgisch exponierte oder endoskopisch zugänglich gemachte Innere der Körperhöhle des Patienten aus nächster Nähe mit einer Strahlennachweissonde gescannt, um die Stellen der Anreicherung des polyspezifischen Immunkonjugats nachzuweisen.
  • In einer Variation dieses Verfahrens wird ein photoaktives Mittel oder ein Farbstoff, wie Dihämatoporphyrinether (Photofrin II), systematisch injiziert, und die Stellen der Anreicherung des Mittels oder Farbstoffes werden durch Laser induzierte Fluoreszenz und endoskopisches Imaging nachgewiesen. Siehe Goldenberg, internationale Anmeldung Nr. PCT/US93/04098. Der Stand der Technik offenbart Imagingtechniken, die bestimmte Farbstoffe verwenden, welche durch Läsionen wie Tumore angereichert werden und welche wiederum durch eine spezifische Lichtfrequenz aktiviert werden. Diese Verfahren werden zum Beispiel von Dougherty et al., Cancer Res. 38: 2628 (1978); Dougherty, Photochem. Photobiol. 45: 879 (1987); Doiron et al. (Hrsg.), PORPHYRIN LOCALIZATION AND TREATMENT OF TUMORS (Alan Liss, 1984) und van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1986) beschrieben.
  • Bei einer Basistechnik wird ein Patient mit einem polyspezifischen Immunkonjugat parenteral injiziert, welches (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, welches mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist und (3) ein photoaktives Mittel oder einen Farbstoff umfasst. Stellen der Anreicherung werden durch Verwendung einer Lichtquelle, welche durch ein Endoskop oder während eines chirurgischen Verfahrens bereitgestellt wird, nachgewiesen.
  • Der Nachweis von polyspezifischem Immunkonjugat während einer intraoperativen oder endoskopischen Untersuchung kann durch die Verwendung eines sekundären Antikörpers oder von Avidin-/Streptavidin-/Biotin-Clearing-Mitteln, wie oben beschrieben, verstärkt werden.
  • Bei diesen endoskopischen Techniken können die Nachweishilfsmittel durch eine Öffnung wie den Mund, die Nase, das Ohr, den Anus, die Vagina oder einen Schnitt in eine Körperhöhle eingeführt werden. So wie hier verwendet, wird der Begriff "Endoskop" allgemein verwendet, um jedes Messgerät zu bezeichnen, welches in eine Körperhöhle eingeführt wird, z.B. ein anal eingeführtes Endoskop, ein oral eingeführtes Bronchoskop, ein urethral eingeführtes Zytoskop, ein abdominal eingeführtes Laparoskop oder desgleichen. Bestimmte von diesen können sehr von einem weiteren Fortschritt bei der Miniaturisierung von Komponenten profitieren, und ihre Nützlichkeit, die erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen, wird als eine Funktion der Entwicklung von geeigneten mikrominiaturisierten Komponenten für diesen Gerätetyp verstärkt werden. Hochminiaturisierte Sonden, welche intravaskulär eingeführt werden können, z.B. über Katheter oder desgleichen, sind ebenfalls für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen zur Lokalisierung von MDR Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln geeignet.
  • 7. Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten und Antikörper-Kompositen in der Therapie
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Antikörper-Kompositen und polyspezifischen Immunkonjugaten in der Immuntherapie. Ein Ziel der Immuntherapie ist es, zytotoxische Dosen an Radioaktivität, eines Toxins oder eines Arzneimittels zu Zielzellen zu bringen, während das Exponieren von Nicht-Zielgeweben minimiert wird. Von den erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugaten und Antikörper-Kompositen wird erwartet, dass sie eine größere Bindungsspezifität aufweisen als Multidrug-Transporterprotein MAks, da die polyspezifischen Immunkonjugate und Antikörper-Kompositen Reste umfassen, die an mindestens ein Multidrug-Transporterprotein-Epitop und ein Antigen, welches entweder mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist, binden.
  • Zum Beispiel kann ein therapeutisches polyspezifisches Immunkonjugat ein α-Strahlen ausstrahlendes Radioisotop, ein β-Strahlen ausstrahlendes Radioisotop, ein γ-Strahlen ausstrahlendes Radioisotop, einen Auger Elektronenstrahler, ein Neutroneneinfangmittel, welches α-Teilchen ausstrahlt oder ein Radioisotop, welches durch Elektroneneinfang zerfällt, umfassen. Geeignete Radioisotope schließen 198Au, 32P, 125I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 211At und desgleichen ein.
  • Wie oben diskutiert, kann ein Radioisotop direkt oder indirekt über ein chelatierendes Mittel an ein Antikörper-Komposit angeheftet werden. Zum Beispiel kann 67Cu, welches aufgrund seiner 61,5 Stunden Halbwertszeit und seinem reichlichen Angebot an Beta-Teilchen und Gamma-Strahlen als eines der vielversprechenderen Radioisotope für eine Radioimmuntherapie erachtet wird, an ein Antikörper- Komposit durch die Verwendung des chelatierenden Mittels p-Bromacetamidbenzyltetraethylamintetraessigsäure (TETA) konjugiert werden. Chase, supra. Alternativ kann 90Y, welches ein energiereiches Beta-Teilchen ausstrahlt, mit einem Antikörper-Komposit unter Verwendung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) verknüpft werden. Außerdem wird ein Verfahren zur direkten radioaktiven Markierung des Antikörper-Komposits mit 131I von Stein et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 703 (1991) beschrieben.
  • Alternativ können Bor-Addends, wie Carborane, an Antikörper-Kompositen angeheftet werden. Carborane können mit Carboxylfunktionen an den überhängenden Seitenketten hergestellt werden, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist. Die Anheftung der Carborane an einen Träger, wie Aminodextran, kann durch die Aktivierung der Carboxylgruppen der Carborane und durch die Kondensation mit Aminen auf dem Träger erreicht werden. Das Zwischenprodukt-Konjugat wird anschließend mit dem Antikörper-Komposit konjugiert. Nach Verabreichung des polyspezifischen Immunkonjugats wird ein Bor-Addend durch thermale Neutronenbestrahlung aktiviert und in radioaktive Atome konvertiert, welche unter α-Strahlung zerfallen, um hoch toxische Wirkungen im Nahbereich herzustellen.
  • Zusätzlich können therapeutisch geeignete polyspezifische Immunkonjugate hergestellt werden, in denen ein Antikörper-Komposit an ein Toxin oder ein chemotherapeutisches Arzneimittel konjugiert ist. Darstellend für Toxine, welche bei der Herstellung solcher Konjugate geeignet eingesetzt werden, sind Ricin, Abrin, humane Ribonuklease, antivirales Kermesbeeren-Protein, Gelonin, Diphtherintoxin und Pseudomonas-Endotoxin. Siehe zum Beispiel Pastan et al., Cell 47: 641 (1986) und Goldenberg, CA–A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994). Andere geeignete Toxine sind dem Fachmann bekannt.
  • Für die Herstellung von polyspezifischen Immunkonjugaten geeignete chemotherapeutische Krebsarzneimittel, schließen Stickstoffsenfgas, Alkylsulfonate, Nitroseharnstoffe, Triazine, Folsäure Analoge, Pyrimidin Analoge, Purin Analoge, Antibiotika, Epipodophyllotoxine, Platin Koordinationskomplexe, Hormone und des gleichen ein. Chemotherapeutische Arzneimittel, welche für die Behandlung von infektiösen Mitteln geeignet sind, schließen antivirale Arzneimittel (wie AZT, 2',3'-Dideoxyinosin und 2',3'-Dideoxycytidin), Antimalaria-Arzneimittel (wie Chloroquin und seine Verwandten, Diaminopyrimidine, Mefloquin), antibakterielle Mittel, Antipilz-Mittel, Antiprotozoen-Mittel und desgleichen ein. Geeignete chemotherapeutische Mittel werden in REMINGTON'S PHARAMCEUTICAL SCIENCES, 18. Aufl., (Mack Publishing Co. 1990) und in GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7. Aufl., (MacMillan, Publishing Co. 1985) beschrieben. Andere geeignete chemotherapeutische Mittel, wie experimentelle Arzneimittel, sind dem Fachmann bekannt.
  • Zusätzlich können therapeutisch geeignete polyspezifische Immunkonjugate durch das Konjugieren photoaktiver Mittel oder Farbstoffe mit einem Antikörper-Kompositen erhalten werden. Fluoreszente und andere Chromogene oder Farbstoffe, wie gegenüber sichtbarem Licht sensitive Porphyrine, wurden verwendet, um Läsionen durch Leiten des geeigneten Lichts zu der Läsion nachzuweisen und zu behandeln (oben zitiert). In der Therapie wurde dies als Photoradiation, Phototherapie oder photodynamische Therapie bezeichnet (Jori et al. (Hrsg.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1986)). Außerdem wurden monoklonale Antikörper mit photoaktivierten Farbstoffen zur Erreichung einer Phototherapie verknüpft (Mew et al., J. Immunol. 130: 1473 (1983); idem., Cancer Res. 45: 4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8744 (1986); idem., Photochem. Photobiol. 46: 83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288: 471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9: 422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67: 2529 (1991). Diese früheren Studien schließen jedoch nicht die Verwendung von endoskopischen Therapieanwendungen, insbesondere mit der Verwendung von Antikörperfragmenten oder Subfragmenten ein. Daher umfasst die vorliegende Erfindung die therapeutische Verwendung von polyspezifischen Immunkonjugaten, welche photoaktive Mittel oder Farbstoffe umfassen. Die allgemeine Methodik wird oben in Bezug auf die Verwendung solcher polyspezifischen Immunkonjugate in der Diagnose beschrieben.
  • Außerdem können therapeutisch geeignete polyspezifische Immunkonjugate hergestellt werden, in welchen ein Antikörper-Komposit mit einer Verbindung konjugiert wird, welche eine Multidrug-Resistenz umkehrt. Solche "chemosensibilisierenden Mittel" schließen Verapamil und seine Analoge, Calmodulin Antagonisten, Anthracyclin und Vinca-Alkaloid Analoge und desgleichen ein. Siehe zum Beispiel Endicott et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 137 (1989), Ford et al., Pharmacol. Rev. 42: 155 (1990) und Calabresi et al., PPO Updates 8: 1 (1994). Siehe ebenfalls Sarkadi et al., FASEB J. 8: 766 (1994), welcher Verfahren zur Identifizierung hydrophober Peptidderivate bereitstellt, welche eine Multidrug-Resistenz umkehren. Diese polyspezifischen Immunkonjugate können vor oder während der Verabreichung von geeigneten chemotherapeutischen Arzneimitteln verabreicht werden.
  • Als eine Alternative können nicht konjugierte chemosensibilisierende Mittel mit polyspezifischen Immunkonjugaten verabreicht werden, welche ein Toxin oder ein chemotherapeutisches Arzneimittel umfassen. Typische Arten der Verabreichung und der Dosierungen der chemosensibilisierenden Mittel werden zum Beispiel von Presant et al., Am. J. Clin. Oncol. 9: 355 (1986), Cairo et al., Cancer Res. 49: 1063 (1989), Miller et al., J. Clin. Oncol. 9: 37 (1991) und Calabresi et al., supra, Rubin, U.S. Patent Nr. 5,005,588 und Levy, U.S. Patent Nr. 5,258,372 beschrieben.
  • Zusätzlich können therapeutische polyspezifische Immunkonjugate einen Immunmodulatorrest umfassen. So wie hier verwendet, schließt der Begriff "Immunmodulator" Cytokine, Stammzellen-Wachstumsfaktoren, Tumor-Nekrosefaktoren (TNF) und hämatopoietische Faktoren, wie Interleukine (z.B. Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6 und IL-10), koloniestimulierende Faktoren (z.B. Granulozytenkoloniestimulierender Faktor (G-CSF) und Granulozyten-Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (GM-CSF)), Interferone (z.B. Interferon-α, -β und -γ), den als "S1 Faktor" bezeichneten Stammzellen-Wachstumsfaktor, Erythropoietin und Thrombopoietin ein. Beispiele für geeignete Immunmodulatorreste schließen IL-2, IL-6, IL-10, Interferon-', TNF-α und desgleichen ein.
  • Solche polyspezifischen Immunkonjugate stellen ein Hilfsmittel bereit, einen Immunmodulator zu einer Zielzelle zu bringen und sind besonders geeignet gegen Tumorzellen und Säugetierzellen, welche, wie HIV-infizierte Zellen, ein Antigen eines infektiösen Mittels auf der Zelloberfläche exprimieren. Die zytotoxischen Wirkungen von Immunmodulatoren sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Klegerman et al., "Lymphokines and Monokines," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pessuto et al. (Hrsg.), Seiten 53–70 (Chapman & Hall 1993). Als eine Darstellung, Typ I Interferone und Interferon-γ induzieren durch die Aktivierung von 2',5'-Oligoadenylatsynthetase und Proteinkinase einen antiviralen Zustand in verschiedenen Zellen. Außerdem können Interferone die Zellproliferation hemmen, indem sie eine verstärkte Expression von Klasse I Histokompatibilitätsantigenen auf der Oberfläche von verschiedenen Zellen induzieren und so die Geschwindigkeit des Abbaus von Zellen durch zytotoxische T-Lymphozyten verstärken. Darüber hinaus wird von Tumor-Nekrosefaktoren wie TNF-α geglaubt, dass sie zytotoxische Wirkungen durch das Induzieren einer DNA-Fragmentation herstellen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Zwei-, Drei- oder Vier-Schritt Zielausrichtungsstrategien, um die Antikörper-Therapie zu verstärken. Allgemeine Techniken schließen die Verwendung von Antikörperkomponenten, welche mit Avidin, Streptavidin oder Biotin konjugiert sind und die Verwendung von sekundären Antikörpern, welche mit dem primären Immunkonjugat binden, wie oben diskutiert, ein. Siehe zum Beispiel Goodwin et al., Eur. J. Nucl. Med. 9: 209 (1984), Goldenberg et al., J. Nucl. Med. 28: 1604 (1987), Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28: 1294 (1987), Paganelli et al., Cancer Res. 51: 5960 (1991), Goldenberg, internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/19273, Sharkey et al., Int. J. Cancer 51: 266 (1992) und Goldenberg, internationale Anmeldung Nr. WO 94/04702. Siehe ebenfalls Griffiths, internationale Anmeldung Nr. PCT/US94/04295, welche ein Verfahren zur Verwendung von Multiavidin- und/oder Multibiotin-Polymerkonjugaten beschreibt, und Goldenberg et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US94/05149, welche verbesserte Verfahren zur Therapie mit chelatierbaren radioaktiven Metallen offenbart.
  • Zum Beispiel kann ein Säugetier, welches eine Multidrug-resistente Erkrankung aufweist, welche durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel verursacht wurde, durch parenterales Injizieren des Säugetiers mit einem polyspezifischen Immunkonjugat behandelt werden, welches (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, welches mit dem Tumor oder infektiösen Mittel verbunden ist und (3) ein therapeutisches Mittel umfasst. Nachfolgend wird das Säugetier mit einem Antikörper oder Antikörperfragment injiziert, welcher/welches mit dem polyspezifischen Immunkonjugat in einer Menge bindet, welche ausreicht, den Spiegel an zirkulierendem polyspezifischen Immunkonjugat um etwa 10–85 % innerhalb von 2 bis 72 Stunden zu senken.
  • Ein alternativer Ansatz zur Verstärkung des therapeutischen Index umfasst, wie oben diskutiert, die Verabreichung eines Antikörper-Komposits, welches mit Avidin/Streptavidin (oder Biotin) konjugiert ist, das Injizieren einer Clearing-Zusammensetzung, welche Biotin (oder Avidin/Streptavidin) umfasst und das Verabreichen eines Konjugats aus einem therapeutischen Mittel und Avidin/Streptavidin (oder Biotin).
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren der Therapie, welches nicht konjugierte Antikörper-Kompositen verwendet. Forscher haben gefunden, dass P-Glycoprotein-Antikörper die Arzneimittelsensitivität in kultivierten Multidrugresistenten Zellen und in Multidrug-resistenten heterologen Transplantaten von Humantumoren in Nacktmäusen wiederherstellen können. Grauer et al., Europäische Patentanmeldung Nr. EP-0 569 141, Rittmann-Grauer et al., Cancer Res. 52: 1810 (1992), Pearson et al., J. Nat'l Cancer Inst. 83: 1386 (1991) und Iwahashi et al., Cancer Res. 53: 5475 (1993). P-Glycoprotein-Antikörper können ebenfalls das Wachstum von Multidrug-resistenten humanen heterologen Transplantaten in Nacktmäusen hemmen. Grauer et al., europäische Patentanmeldung Nr. EP-0 569 141. Demgemäß stellen die erfindungsgemäßen mehr spezifischen Antikörper-Kompositen ein verbessertes Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers bereit, welches eine Multidrug-resistente Erkrankung, die durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel verursacht wurde, aufweist, in welcher die Multidrug-resistenten Zellen P-Glycoprotein überexprimieren. Außerdem können die erfindungsgemäßen Antikörper-Kompositen verwendet werden, um den aktiven Arzneimittel Ausstrom bei infektiösen Mitteln zu hemmen und so die Sensitivität gegenüber einer Chemotherapie wiederherstellen.
  • Antikörper-Kompositen können alleine oder in Konjugation mit den gängigen, oben beschriebenen, chemotherapeutischen Mitteln verabreicht werden. Formen der chemotherapeutischen Verabreichung und geeignete Dosierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Aufl., (Mack Publishing Co. 1990) und GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7. Aufl. (MacMillan Publishing Co. 1985).
  • Im Allgemeinen wird die Dosis der verabreichten polyspezifischen Immunkonjugate und Antikörper-Kompositen abhängig von Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand und der bisherigen medizinischen Geschichte des Patienten variieren. Typischerweise ist es wünschenswert, dem Empfänger eine Dosis an polyspezifischem Immunkonjugat oder Antikörper-Komposit bereitzustellen, welche im Bereich von ungefähr 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Mittels/Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosis ebenfalls verabreicht werden kann, wenn die Umstände es erfordern.
  • Die Verabreichung von polyspezifischen Immunkonjugaten oder Antikörper-Kompositen an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal, über Perfusion durch einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsionale Injektion erfolgen. Wenn poly spezifische Immunkonjugate oder Antikörper-Kompositen durch Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch einzelne oder multiple Boli erfolgen.
  • Polyspezifische Immunkonjugate, welche einen Bor-Addend beladenen Träger zur thermischen Neutronen-Aktivierungs-Therapie aufweisen, werden gewöhnlich in ähnlichen Weisen erfolgen. Es wird vorteilhaft sein, zu warten, bis sich das ungerichtete polyspezifische Immunkonjugat klärt, bevor die Neutronenbestrahlung durchgeführt wird. Die Clearance kann durch die Verwendung eines Antikörpers, welcher an das polyspezifische Immunkonjugat bindet, beschleunigt werden. Siehe U.S. Patent Nr. 4,624,846 für eine Beschreibung dieses allgemeinen Prinzips.
  • Die erfindungsgemäßen polyspezifischen Immunkonjugate und Antikörper-Kompositen können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen herzustellen, wobei polyspezifische Immunkonjugate oder Antikörper-Kompositen in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vereinigt werden. Eine Zusammensetzung wird "pharmazeutisch verträglicher Träger" genannt, wenn seine Verabreichung durch einen empfangenen Patienten toleriert werden kann. Sterile Phosphat gepufferte Salzlösung ist ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Andere geeignete Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Aufl. (1990).
  • Zum Zweck der Therapie werden dem Patienten ein polyspezifisches Immunkonjugat (oder ein Antikörper-Komposit) und ein pharmazeutisch verträglicher Träger in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine Vereinigung aus einem polyspezifischen Immunkonjugat (oder Antikörper-Komposit) und einem pharmazeutisch verträglichen Träger wird in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht genannt, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit zu einer nachweisbaren Änderung der Physiologie des empfangenen Patienten führt. Im vorliegenden Zusammenhang ist ein Mittel physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit zur Hemmung des Wachstums von Zielzellen oder zur Steigerung der Empfänglichkeit der Zielzellen für ein chemotherapeutisches Mittel führt.
  • Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können angewandt werden, um die Dauer der Aktivität eines polyspezifischen Immunkonjugats oder Antikörper-Komposits bei einer therapeutischen Anwendung zu kontrollieren. Präparate zur kontrollierten Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren hergestellt werden, um das polyspezifische Immunkonjugat oder das Antikörper-Komposit komplex zu binden oder zu adsorbieren. Zum Beispiel schließen biokompatible Polymere Matrizes aus Poly(Ethylen-co-vinylacetat) und Matrizes aus einem Polyanhydrid Copolymer aus einem Stearinsäure-Dimer und Sebacinsäure ein. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Die Geschwindigkeit der Freisetzung eines polyspezifischen Immunkonjugats (oder Antikörper-Komposits) von einer solchen Matrix, hängt vom Molekulargewicht des polyspezifischen Immunkonjugats (oder Antikörper-Komposits), der Menge des polyspezifischen Immunkonjugats (oder Antikörper-Komposits) innerhalb der Matrix und von der Größe der verteilten Teilchen ab. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Andere feste Dosierungsformen werden in REMINGTON'S PHARAMCEUTICAL SCIENCES, 18 Aufl. (1990) beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren der Behandlung, in dem Immunmodulatoren verabreicht werden, um strahlungsinduzierter oder Arzneimittel induzierter Toxizität für gewöhnliche Zellen und insbesondere hämatopoietische Zellen vorzubeugen, sie abzuschwächen oder umzukehren. Eine zusätzliche Immunmodulator-Therapie erlaubt die Verabreichung höherer Dosierungen zytotoxischer Mittel aufgrund der gesteigerten Toleranz des empfangenen Säugetiers. Außerdem kann eine zusätzliche Immunmodulator-Therapie einer dosierungseinschränkenden Knochenmarkstoxizität vorbeugen, sie lindern oder umkehren. Beispiele für geeignete Immunmodulatoren für eine zusätzliche Therapie schließen G-CSF, GM-CSF, Thrombopoietin, IL-1, IL-3 und desgleichen ein. Das Verfahren zur zusätzlichen Immunmodulator-Therapie wird von Goldenberg, U.S. Patent Nr. 5,120,525 offenbart.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass eine Antikörperkomponente nur ein Beispiel für einen Rest ist, welcher verwendet werden kann, um eine Ausrichtung auf bestimmte Zellen zu erhalten. Andere geeignete Reste zur Ausrichtung schließen Proteine, Peptide, Polypeptide, Glycoproteine, Lipoproteine und desgleichen, welche keine Antikörper sind, ein, z.B. Wachstumsfaktoren, Enzyme, Rezeptorproteine, Immunmodulatoren und Hormone. Sarkadi et al., The FASEB Journal 8: 766 (1994) stellt zum Beispiel Verfahren zur Identifizierung hydrophober Peptide bereit, welche mit P-Glycoprotein interagieren. Als eine Darstellung, ein polyspezifisches Konjugat, welches für die Diagnose und/oder Behandlung bestimmter Multidrug-resistenter Brustkrebse geeignet ist, würde ein hydrophobes Peptid, welches mit P-Glycoprotein bindet, einen epidermalen Wachstumsfaktorrest, welcher mit dem c-erb B2 Protoonkogen-Produkt bindet und ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung, somit allgemein beschrieben, wird durch den Verwreis auf die folgenden Beispiele einfacher verstanden werden, welche als Darstellung bereitgestellt werden und nicht beabsichtigen, die vorliegende Erfindung zu beschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung von Antikörperkomponenten:
  • Maus-P-Glycoprotein MAk und Anti-CEA MAk
  • 1. Herstellung von monoklonalen Antikörpern
  • Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-P-Glycoprotein Maus-Antikörpern sind, wie oben diskutiert, dem Fachmann gut bekannt. Ein Ansatz ist, Mäuse mit Zellen oder zellulären Membranen zu immunisieren, welche einen Überschuss an P-Glycoprotein enthalten. Zellen, welche P-Glycoprotein überexprimieren, können durch Selektieren und Anreichern von Zellen, welche den MDR Phänotyp exprimieren, aus humanen kontinuierlichen Zelllinien erhalten werden. Siehe zum Beispiel Gottesman, "Drug-Resistant Mutants: Selection and Dominance Analysis," in METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 151, Colowick et al. (Hrsg.), Seiten 113–121 (Academic Press 1987) und Clynes et al., Cytotechnolo-gy 12: 231 (1993).
  • Ein allgemeines Verfahren zur Verwendung von MDR Zellen, um monoklonale Anti-P-Glycoprotein-Antikörper herzustellen, wird zum Beispiel von Rittmann-Grauer et al., Cancer Res. 52: 1810 (1992) beschrieben. In Kürze, sechs Wochen alte, weibliche BLAB/c Mäuse werden intraperitoneal (i.p.) mit 5 × 106 MDR Zellen injiziert, die von der Oberfläche von Gewebekulturflaschen geschabt wurden. Drei Wochen später erhalten die Mäuse eine zweite i.p. Injektion von 5 × 106 MDR Zellen. Vier Tage vor der Fusion erhalten die Mäuse eine letzte intravenöse Beladung von 5 × 106 MDR Zellen. Milzzellen von den immunisierten Mäusen werden mit Maus-Myelomzellen, SP2/0-Ag 14, gemäß dem Verfahren von Gerhard, "Fusion of Cells in Suspension and Outgrowth of Hybrids in Conditioned Medium," in MONOCLONAL ANTIBODIES, Kennet et al. (Hrsg.), Seiten 370–371 (Plenum Publishing Corp. 1981) fusioniert.
  • Anti-P-Glycoprotein Hybridomkulturen werden anfänglich unter Verwendung eines indirekten ELISA mit einem Meerrettichperoxidase Konjugat aus Ziegen Anti-Maus Immunglobulin gescreent. Monolayer der MDR Zellen und die Arzneimittel sensitive Elternzelllinie werden in 96-Vertiefungsmikrotiterplatten kultiviert. Die Zellen werden mit 0,01 % Glutaraldehyd für 45 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, das Fixativ wird entfernt, die Zellen werden dreimal mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und die Mikrotitervertiefungen werden mit 10 % bovinem Serumalbumin für mindestens 45 Minuten blockiert. Fünfzig Mikroliter der Hybridom-Überstände werden zu den Mikrotitervertiefungen hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten werden anschließend mit PBS gewaschen und mit 50 μl Peroxidase konjugiertem Ziegen Anti-Maus Immunglobulin, welches 1:1000 in PBS mit 10 % Pferdeserum verdünnt wurde, inkubiert. Fünf Waschschritten mit PBS folgend, werden die positiven Klone durch das Hinzufügen von 100 μl einer Lösung identifiziert, welche 1 mg/ml O-Phenylendiamin, 0,1 % Wasserstoffperoxid, 50 mM Zitrat und 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 5,0) enthält. Die Reaktion wird durch das Hinzufügen von 50 μl 4 N Schwefelsäure abgebrochen, und die Platten werden bei 490 nm gelesen.
  • Klone, die verglichen mit Arzneimittel sensitiven Zellen ein fünffaches oder größeres ELISA-Signal für die MDR Zellen erzeugen, werden expandiert. Hybridomzellen, die Anti-P-Glycoprotein-Antikörper herstellen, werden in BALB/c Mäuse zur Herstellung von Ascites injiziert, gemäß dem Verfahren von Hoogenraad et al., J. Immunol. Methods 61: 317 (1983). Anti-P-Glycoprotein-Antikörper werden aus der Ascites-Flüssigkeit durch Verwendung einer Protein-A-Chromatographie aufgereinigt. Siehe zum Beispiel Langone et al., J. Immunol. Methods 51: 3 (1982).
  • Die Herstellung von hochspezifischen Anti-CEA MAk wurde von Hansen et al., Cancer 71: 3478 (1993) beschrieben. In Kürze, eine weibliche 20 Gramm BALB/c Maus wurde subkutan mit 7,5 μg teilweise gereinigtem CEA in vollständigem Freund'schen Adjuvans immunisiert. Am Tag 3 wurde die Maus mit 7,5 μg CEA in unvollständigem Freund'schen Adjuvans geboostet, und anschließend wurde die Maus an den Tagen 6 und 9 intravenös mit 7,5 μg CEA in Salzlösung geboostet. Am Tag 278 wurde der Maus 65 μg CEA intravenös in Salzlösung und am Tag 404 90 μg CEA in Salzlösung gegeben. Am Tag 407 wurde die Maus getötet, eine Zellsuspension der Milz wurde hergestellt, die Milzzellen wurden mit Maus Myelomzellen, SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL 1581) unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert, und die Zellen wurden in einem Medium, welches 8-Azaguanin enthielt, kultiviert. Hybridom-Überstände wurden unter Verwendung eines 125I-CEA-Radioimmunassays (Roche; Nutley, NJ) auf CEA-reaktive Antikörper gescreent. Positive Klone wurden erneut kloniert.
  • 2. Die Herstellung von Antikörperfragmenten
  • Wie oben beschrieben, stellt die Proteolyse ein Verfahren zur Herstellung von Antikörperfragmenten bereit. Diese Technik ist dem Fachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Coligan et al., supra, auf S. 2.8.1–2.8.10. Siehe ebenfalls Stanworth of al. "Immunochemical Analysis of Human and Rabbit Immunoglobulins and Their Subunits," in HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Vol. 1, Weir (Hrsg.), Seiten 12.1–12.46 (Blackwell Scientific 1986) und Parham, "Preparation and Purification of Active Fragments from Mouse Monoclonal Antibodies," Id., auf Seiten 14.1–14.23.
  • Beispielsweise kann präaktiviertes Papain verwendet werden, um wie folgt F(ab)2-Fragmente aus IgG1 oder Fab-Fragmente aus IgG2a und IgG2b herzustellen. Papain wird durch Inkubieren von 2 mg/ml Papain (2 × rekristallisierte Suspension, Sigma #P3125) und 0,05 M Cystein (free-base, kristallin; Sigma #C7755) für 30 Minuten in einem 37°C Wasserbad aktiviert. Um das Cystein zu entfernen, wird das Papain/Cystein Gemisch auf eine PD-10 Säule (Pharmacia #G-25) gegeben, welche mit 20 ml Acetat/EDTA-Puffer (0,1 M Acetat mit 3 mM EDTA, pH-Wert 5,5) äquilibriert wurde. Die Fraktionen werden durch die Messung der Absorption bei 280 nm analysiert, und die zwei oder drei Fraktionen, die Protein enthalten, werden vereinigt. Die Konzentration des präaktivierten Papain wird durch die Verwendung der Formel: (Absorption bei 280 nm)/2,5 = mg präaktiviertes Papain/ml bestimmt.
  • Um Antikörper für eine Spaltung herzustellen, werden 10 mg Antikörper in 2 bis 5 ml PBS gegen Acetat/EDTA-Puffer dialysiert. Fünfhundert Mikrogramm des präaktivierten Papain werden zu der dialysierten Antikörperlösung hinzugefügt, und das Gemisch wird gevortext. Nach einer 6- bis 12-stündigen Inkubation in einem 37°C Wasserbad wird das Papain durch Hinzufügen von kristallinem Iodacetamid (Sigma #I6125) bis zu einer Endkonzentration von 0,03 M inaktiviert. Das Gemisch wird anschließend gegen 1 Liter PBS (pH-Wert 8,0) bei 4°C für 6–12 Stunden dialysiert.
  • Um ungespaltene Antikörper und Fc-Fragmente zu entfernen, wird das Gemisch auf eine Protein A-Sepharose Säule gegeben, welche mit PBS (pH-Wert 8,0) äquilibriert wurde. Ungebundene Fraktionen werden in 2 ml Aliquots gesammelt und vereinigt. Nach Konzentrieren der vereinigten Fraktionen auf ein Gesamtvolumen von 5 ml oder weniger, wird das Protein durch eine Größenausschluss-Chromatographie fraktioniert, und die Ergebnisse werden mit einer SDS-PAGE analysiert.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung eines Antikörper-Komposits:
  • Anti-P-Glycoprotein/Anti-CEA bispezifischer Antikörper
  • Ein bispezifisches F(ab')2 Antikörper-Komposit wird aus einem Fab'-Fragment eines monoklonalen Anti-P-Glycoprotein-Antikörpers und aus einem Fab'-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, welcher für CEA spezifisch ist, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Siehe ebenfalls Goldenberg, internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/19273. In Kürze, die Zwischenketten Disulfidbrücken werden sorgfältig mit Cystein, unter Beachtung, eine leichte-schwere Kettenspaltung zu vermeiden, reduziert, um Fab'-SH-Fragmente zu bilden. Die SH-Gruppe(n) von einem Antikörperfragment wird (werden) mit einem Überschuss an Bis-Maleimid-Linker (1,1'-(Methylendi-1,4-phenylen)bismaleimid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) aktiviert. Das zweite Antikörperfragment wird ebenfalls in Fab'-SH konvertiert und anschließend mit dem aktivierten ersten Antikörperfragment umgesetzt, um ein bispezifisches Antikörper-Komposit zu erhalten.
  • BEISPIEL 3
  • Herstellung von polyspezifischem Immunkonjugat
  • Ein polyspezifisches Immunkonjugat kann durch das Binden eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels an das bispezifische Antikörper-Komposit, welches in Beispiel 2 beschrieben wurde, hergestellt werden. Beispielsweise kann das Anti-P-Glycoprotein/Anti-CEA-Komposit mit Doxorubicin über Dextran konjugiert werden, unter Verwendung des Verfahrens von Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1989). In Kürze, Aminodextran wird durch Lösen eines Gramms Dextran (Mol.-Gew. 18 kD; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) in 70 ml Wasser hergestellt. Das Dextran wird durch Hinzufügen von 0,5 Gramm Natriummetaperiodat und Rühren der Lösung bei Raumtemperatur über Nacht teilweise oxidiert, um Polyaldehyddextran zu bilden. Nach dem Konzentrieren des Gemisches mit einer Amicon Zelle (YM10 Membran; MWCO = 10.000), wird das Polyaldehyddextran durch eine Sephadex G-25 Chromatographie gereinigt und lyophilisiert, um ungefähr 900 Gramm eines weißen Pulvers zu ergeben. Polyaldehyddextran wird anschließend mit zwei Äquivalenten 1,3-Diamino-2-hydroxypropan in der wässrigen Phase für 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die sich ergebende Schiffsche Base wird durch Hinzufügen von Natriumborhydrid (0,311 mmol pro 2,15 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan) zu dem Gemisch stabilisiert. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für sechs Stunden inkubiert. Das Aminodextran wird unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule gereinigt.
  • Doxorubicin (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) wird durch das Hinzufügen von einem Milliliter wasserfreiem DMF zu 0,1 mmol Doxorubicin in einem getrockneten Reacti-Vial aktiviert, gefolgt von einer Lösung aus N-Hydroxysuccinimid (23 mg, 0,2 mmol; Sigma) in 750 μl wasserfreiem DMF und einer Lösung aus 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (41,5 mg, 0,2 mmol; Sigma) in 750 μl wasserfreiem DMF. Das Reaktionsgemisch wird in Dunkelheit bei Raumtemperatur für 16 Stunden unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Der Niederschlag wird anschließend zentrifugiert, und die Lösung wird in einer verschlossenen Flasche bei –20°C aufbewahrt.
  • Das Doxorubicin-Dextran Zwischenprodukt Konjugat wird durch das Lösen von Aminodextran (18 kD; 10 mg) in zwei Millilitern PBS (pH-Wert 7,2) und dem schrittweise Hinzufügen von 0,7 ml der oben beschriebenen N-Hydroxysuccinimid aktivierten Doxorubicin-Lösung hergestellt. Demgemäß sind 50 Mol Doxorubicin pro Mol Aminodextran anwesend. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für fünf Stunden gerührt, und nach der Entfernung allen Niederschlags wird das Konjugat unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule gereinigt. Das Doxorubicin- Dextran Konjugat ist typischerweise durch ein Doxorubicin/Dextran Verhältnis von 14 charakterisiert.
  • Alternativ wird Doxorubicin-Dextran Konjugat durch die Reaktion von Doxorubicin mit 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid hergestellt, wie von Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988) beschrieben. Siehe ebenfalls Shih et al., Cancer Research 51: 4192–4198 (1991).
  • Das bispezifische Antikörperkonjugat (25 mg) in 5 ml PBS (pH-Wert 5,5) wird in Dunkelheit durch die Behandlung mit Natriummetaperiodat (800 μl einer 21,5 mg/ml Lösung) bei Raumtemperatur für 60 Minuten oxidiert. Das Reaktionsgemisch wird anschließend mit Ethylenglykol (50 μl) behandelt, um die nicht reagierten Periodate abzubauen, und das oxidierte Antikörperfragment wird unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule, welche mit 0,05 M HEPES (pH-Wert 7,4) äquilibriert wurde, gereinigt. Nachfolgend konzentriert man das oxidierte Fragment auf 5 mg/ml in 0,05 M HEPES (pH-Wert 7,4) und lässt es mit dem Doxorubicin-Dextran Konjugat (22 mg) reagieren. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Schiffsche Base durch NaBH3CN reduziert. Der konjugierte Antikörper wird unter Verwendung einer Sepharose CL-6B Säule gereinigt.
  • BEISPIEL 4
  • Herstellung eines polyspezifischen Immunkonjugats, welches ein Radioisotop umfasst
  • Es kann ein polyspezifisches Immunkonjugat hergestellt werden, in dem ein Radioisotop an einen oder mehrere Antikörperkomponenten über einen Chelator gebunden ist. Als eine Darstellung, das Antikörper-Komposit aus Beispiel 2 kann entweder mit Aminobenzyldiethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder mit einem Derivat von DTPA, welches den lange-Kettenlinker, -CSNH(CH2)10NH2 (LC-DTPA) enthält, konjugiert werden. In Kürze, das Antikörper-Komposit (2,5 mg in ungefähr einem Milliliter 50 mM Acetat gepufferter 0,9 % Salzlösung [ABS; pH-Wert 5,3]) wird in Dunkelheit durch die Behandlung mit Natriummetaperiodat (210 μl einer 5,68 mg/ml Lösung) bei 0°C für eine Stunde oxidiert. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylenglykol (20 μl) behandelt, um die nicht reagierten Periodate abzubauen, und das oxidierte Antikörperfragment wird unter Verwendung einer Sephadex G-50/80 Säule (Pharmacia; Piscataway, NJ), welche in PBS (pH-Wert 6,1) äquilibriert wurde, gereinigt. Man lässt das oxidierte Fragment anschließend mit überschüssigem DTPA oder LC-DTPA reagieren. Nach 40 Stunden bei Raumtemperatur wird die Schiffsche Base durch NaBH3CN reduziert. Das konjugierte Antikörper-Komposit wird anschließend unter Verwendung einer zentrifugierten Größenausschlusssäule (Sephadex G-50/80), welche in 0,1 M Acetat (pH-Wert 6,5) äquilibriert wurde, gereinigt. Die Konzentrationen der Antikörperkonjugate werden durch die Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt.
  • Das Verhältnis von Chelatormolekülen pro Antikörper-Kompositmolekül wird durch einen Metall-Bindungsassay bestimmt. Der Assay wird durch das Mischen eines Aliquots des Antikörperkonjugats mit 0,1 M Ammoniumacetat (pH-Wert 7) und 2 M Triethanolamin und durch das Inkubieren des Gemisches bei Raumtemperatur mit einem bekannten Überschuss an Kobaltacetat, welchem 57Kobaltacetat als Spike zugesetzt wurde, durchgeführt. Nach 30 Minuten wird EDTA (pH-Wert 7) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugefügt. Nach einer weiteren 10-minütigen Inkubation, wird das Gemisch mit einer sofortigen Dünnschicht-Chromatographie (ITLC für engl.: instant thin layer chromatography), unter Verwendung von 10 mM EDTA zum Entwickeln analysiert. Die Fraktion, in der Radioaktivität an einen Antikörper gebunden ist, wird durch Zählen von Abschnitten der ITLC-Streifen auf einem Gamma-Zähler bestimmt. Typischerweise werden die Ergebnisse zeigen, dass dort ungefähr 6 Moleküle DTPA pro Antikörperkomponente und ungefähr 5 Moleküle LC-DTPA pro Antikörperkomponente vorliegen.
  • Antikörperkonjugate werden wie folgt mit 90Yttrium markiert. In Kürze, kommerziell verfügbares 90Yttriumchlorid (DuPont NEN; 17,68 μl; 5,64 mCi) wird mit 35,4 μl 0,5 M Acetat (pH-Wert 6,0) gepuffert. Die Lösung wird für 5–10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend zur radioaktiven Markierung verwendet.
  • 90Yttrium markiertes Antikörper-Komposit-DTPA wird durch Mischen von 90Yttriumacetat (128,7 μCi) mit Antikörper-Komposit-DTPA (30 μg; 8,3 μl), Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde und Verdünnen mit 90 μl 0,1 M Acetat (pH-Wert 6,5) hergestellt. 90Yttrium markiertes Antikörper-Komposit-LC-DTPA wird durch Mischen von 90Yttriumacetat (109,5 μCi) mit Antikörper-Komposit-LC-DTPA (30 μg; 7,6 μl), Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde und Verdünnen mit 90 μl 0,1 M Acetat (pH-Wert 6,5) hergestellt.
  • Das Ausmaß der 90Yttrium Aufnahme kann analysiert werden, indem das Markierungsgemisch mit 10 mM EDTA für zehn Minuten inkubiert wird, gefolgt von einer ITLC Untersuchung unter Verwendung von 10 mM EDTA zum Entwickeln. In diesem Assay wandert ungebundenes 90Yttrium mit der Lösungsmittelfront, während Antikörper gebundenes 90Yttrium am Ausgangspunkt verbleibt. Die Anwesenheit von irgendeinem kolloidalen 90Yttrium wird durch ITLC (zusammen mit humanem Serumalbumin aufgetragen) unter Verwendung einer Wasser:Ethanol:Ammoniak (5:2:1) Lösung zum Entwickeln analysiert. In diesem System repräsentiert die Fraktion der Radioaktivität am Ausgangspunkt das kolloidale 90Yttrium. Zusätzlich können alle Markierungsgemische mit einer Radio-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie analysiert werden. Typischerweise werden 90 bis 95 % des 90Yttrium in das sich ergebene polyspezifische Immunkonjugat aufgenommen.
  • BEISPIEL 5
  • Behandlung von Dickdarmkrebs mit 90Yttrium markiertem polyspezifischem Immunkonjugat und G-CSF
  • Ein Patient weist einen Bluttiter für karzinoembryonales Antigen (CEA) von 55 ng/ml aufgrund einer peritonealen Streuung eines Dickdarmkrebses auf, welcher zwei Jahre zuvor operativ entfernt wurde und sich als Dukes' C Läsion herausstellte. Da eine frühere Chemotherapie mit Fluoruracil nicht erfolgreich war, wurde der Patient zur Experimentaltherapie vorgestellt. Dem Patienten wird durch intraperitoneale Injektion eine 35 mCi Dosis des 90Yttrium markierten polyspezifi schen Immunkonjugats, hergestellt in Beispiel 4, verabreicht. Zwei Tage später wird eine intravenöse Infusion von 5 μg/kg G-CSF (wie NEUPOLEN [Amgen, Inc.; Thousand Oaks, CA]) eingerichtet, und die hämatologischen Werte des Patienten werden danach überwacht. Es wird kein signifikanter Abfall der weißen Blutkörperchenzahlen festgestellt, was daher eine Wiederholung der Radioimmuntherapie drei Wochen später erlaubt, wiederum gefolgt von einer G-CSF Therapie. Eine dritte Behandlung wird zwei Monate später verabreicht, und ein radiologischer Nachweis einer teilweisen Tumor- und Ascitesreduktion wird vier Wochen später festgestellt. Somit ist der Patient in der Lage, höhere und häufigere Dosierungen des Radioimmuntherapie-Mittels zu tolerieren.
  • BEISPIEL 6
  • Herstellung eines auf Multidrug-resistente Pseudomonas aeruginosa gerichteten Antikörper-Komposits
  • Der Fachmann kann Standardverfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Multidrug-Transporterprotein eines infektiösen Mittels verwenden. Als eine Darstellung, ein bispezifischer Antikörper kann konstruiert werden, welcher auf Multidrug-resistente Pseudomonas aeruginosa gerichtet ist. Antikörperkomponenten, welche an OprK binden, einem Multidrug-Transporterprotein von Pseudomonas aeruginosa, können erhalten werden, indem OprK-Protein verwendet wird, welches von Bakterienzellen überexprimiert wird. Zum Beispiel kann das OprK-Gen synthetisiert werden, indem sich gegenseitig primende, lange Oligonukleotide verwendet werden, welche auf der Nukleotidsequenz basieren, welche in Poole et al., J. Bacteriol. 175: 7373 (1993) offenbart wird. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, S. 8.2.8 bis 8.2.13 (Wiley Interscience 1990). Siehe ebenfalls Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987). Außerdem stellen gängige Techniken, welche die Polymerase Kettenreaktion verwenden, die Möglichkeit bereit, Gene zu synthetisieren, die bis zu 1,8 Kilobasen lang sind. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993).
  • Das OprK-Gen wird anschließend in einen prokaryotischen Expressionsvektor kloniert, welcher nachfolgend unter Verwendung von Standardtechniken in kompetente E. coli Zellen gebracht wird. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra auf Seiten 16.1.1–16.7.8. Das OprK-Protein wird aus den Wirtszellen unter Verwendung von Standardtechniken isoliert. (Id.)
  • Alternativ kann das OprK-Protein aus Pseudomonas aeruginosae isoliert werden, welche auf den Multidrug-resistenten Phänotyp selektiert wurden, wie von Poole et al., supra beschrieben.
  • Isoliertes OprK-Protein wird verwendet, um Anti-OprK MAk, wie oben beschrieben, zu erzeugen. Siehe ebenfalls Mole et al., "Production of Monoclonal Antibodies Against Fusion Proteins Produced in Escherichia coli," in DNA CLONING, VOLUME III: A PRACTICAL APPROACH, Glover (Hrsg.), Seiten 113–139 (IRL Press 1987) und Dean "Preparation and Testing of Monoclonal Antibodies to Recombinant Proteins," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOLUME 10: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS, Manson (Hrsg.) Seiten 43–63 (The Humana Press, Inc. 1992).
  • Anti-OprK Mkb oder ein Fragment davon stellen daher eine Antikörperkomponente eines bispezifischen Antikörpers bereit. Die zweite Antikörperkomponente, welche mit einem anderen Antigen bindet, welches mit der äußeren Oberfläche von Pseudomonas aeruginosa verbunden ist, kann unter Verwendung der allgemeinen oben beschriebenen Techniken erhalten werden. Alternativ können geeignete monoklonale Antikörper von American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen werden, wie Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharid (ATCC CRL Nrn. 8753, 8754, 8795, 8796 und 8797), Lipoprotein H2 der äußeren Hülle von Pseudomonas aeruginosa (ATCC CRL 1783), Pseudomonas aeruginosa Typ a Flagellen (ATCC HB 9130) und Pseudomonas aeruginosa Typ b Flagellen (ATCC HB 9129).
  • Ein Antikörper-Komposit, welches einen Rest, der OprK bindet und einen Rest, der ein Antigen der äußeren Oberfläche von P. aeruginosa bindet, umfasst, kann unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
  • BEISPIEL 7
  • Herstellung und Verwendung eines auf Multidrug-resistente Pseudomonas aeruginosa gerichteten 111Indium markierten polyspeziffschen Immunkonjugats
  • Antikörper-Komposit-Chelator Konjugate werden wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt. Die Konjugate werden mit 111Indium wie folgt markiert. In Kürze, 111Indiumchlorid wird bei pH-Wert 5,5 mit Ammoniumacetat gepuffert, so dass die Endkonzentration des Acetats ungefähr 0,2 M beträgt. 111Indiumacetat wird zu einer Lösung des Antikörper-Komposit-Chelator Konjugats in 0,1 M Acetat (pH-Wert 6,5) hinzugefügt, und das Gemisch wird für ungefähr eine Stunde inkubiert. Typischerweise enthalten die Reaktionsgemische entweder 10 μg Antikörper-Komposit-DTPA und 73 μCi 111Indium oder 10 μg Antikörper-Komposit-LC-DTPA und 126,7 μCi 111ndium. Das Ausmaß der 111Indium Aufnahme wird unter Verwendung einer ITLC, wie oben beschrieben, analysiert.
  • Ein Patient mit Granulozytopenie weist eine Pseudomonas aeruginosa Lungenentzündung auf, welche nicht länger auf Carbenicillin Behandlung anspricht. Vier Millicurie 111Indium markiertes polyspezifisches Immunkonjugat werden intravenös injiziert, und nach einer Wartezeit von mindestens 24 Stunden wird der Patient mit einer Gammakamera gescannt. Punkte erhöhter Radioaktivität erscheinen als Knoten in den unteren Lungenlappen und weisen auf die Anwesenheit von Lungeninfiltraten mit Multidrug-resistenten Pseudomonas aeruginosa hin. Es wird ein Therapieablauf entworfen, in dem ein Aminoglykosid und Carbenicillin mit nicht radioaktivem polyspezifischen Immunkonjugat verabreicht werden, welches einen OprK-Bindungsrest, einen Rest, welcher an ein Antigen der äußeren Oberfläche von Pseudomonas aeruginosa bindet und ein chemosensibilisierendes Mittel umfasst.
  • BEISPIEL 8
  • Herstellung eines auf Multidrug-resistente Pseudomonas aeruginosa gerichteten 99mTc markierten polyspezifischen Immunkonjugats
  • Ein Antikörper-Komposit, welches OprK und E87 Antigen, ein Antigen der äußeren Oberfläche von Pseudomonas aeruginosa, bindet, wird hergestellt. Allgemeine Techniken zur Herstellung des Antikörper-Komposits werden in Beispiel 6 beschrieben, und die Herstellung von monoklonalen Anti-E87 Antikörpern wird von Sawada et al., U.S. Patent Nr. 5,089,262 beschrieben.
  • Das Antikörper-Komposit wird mit 99mTc unter Verwendung von Verfahren markiert, die dem Fachmann gut bekannt sind. Siehe zum Beispiel Crockford et al., U.S. Patent Nr. 4,424,200, Paik et al., U.S. Patent Nr. 4,652,440, Baidoo et al., Cancer Research (Suppl.) 50: 799s (1990), Griffiths et al., Cancer Research 51: 4594 (1991), Pak et al., U.S. Patent Nr. 5,053,493, Griffiths et al., U.S. Patent Nr. 5,128,119, Lever et al., U.S. Patent Nr. 5,095,111 und Dean et al., U.S. Patent. Nr. 5,180,816.
  • Als eine Darstellung, 99mTc markiertes polyspezifisches Immunkonjugat kann wie von Hansen et al., U.S. Patent Nr. 5,328,679 beschrieben, erhalten werden. In Kürze, eine Lösung aus 0,075 M SnCl2 (Lösung I) wird durch Lösen von 3350 mg SnCl·2H2O in einem Milliliter 6 N HCl und Verdünnen der sich ergebenden Lösung mit sterilem H2O, welches mit Argon durchströmt wurde, hergestellt. Eine Lösung von 0,1 M NaK-Tartrat in 0,05 M NaAc (pH-Wert 5,5) [Lösung II] wird mit sterilem H2O, welches mit Argon durchströmt wurde, hergestellt. Ein Volumen von Lösung I wird mit 26 Volumina von Lösung II gemischt, und die sich ergebende Lösung III wird filtersterilisiert und mit Argon durchströmt.
  • Eine Antikörper-Komposit Lösung wird mit 20 mM Cystein reduziert, und überschüssiges Cystein wird durch Gelfiltration entfernt. Das reduzierte Antikörper-Komposit (2 mg/ml) wird bei pH-Wert 4,5 in 0,05 M NaOAc-Puffer stabilisiert, wel cher 0,15 M Salzlösung enthält. Die sich ergebende Lösung IV wird filtersterilisiert und mit Argon durchströmt. Lösung IV wird mit einer geeigneten Menge Lösung III gemischt, um eine Endkonzentration von 123 μg Sn pro mg reduziertem Antikörper-Komposit zu erhalten. Die sich ergebende Lösung V wird auf einen pH-Wert von 4,5 bis 4,8 eingestellt.
  • Eine sterile Lösung aus Natriumpertechnetat (10 mCi) in Salzlösung wird zu einem Aliquot der Lösung V hinzugefügt, welche 1,25 mg Antikörper-Komposit und stabile Zinnionen enthält, und das Gemisch wird vorsichtig bewegt. Die Markierung ist innerhalb von 5 Minuten quantitativ. Die sich ergebende Lösung aus 99mTc markiertem polyspezifischen Immunkonjugat ist zur sofortigen Injektion bereit.
  • Das 99mTc markierte polyspezifische Immunkonjugat wird einem Patienten verabreicht, und die Stellen der Infektion, welche durch Multidrug-resistente Pseudomonas aeruginosa verursacht wurden, werden unter Verwendung einer Einzelphotonen Emissions-Computertomographie lokalisiert.
  • Obwohl das Vorangegangene sich auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen bezieht, wird es verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Es wird dem Fachmann einfallen, dass verschiedene Modifikationen an den offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können und dass solche Modifikationen als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegend erachtet werden, welcher durch die folgenden Ansprüche definiert wird.
  • Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen stellen ein Beispiel auf dem Niveau des Fachmanns dar, den die Erfindung betrifft.

Claims (28)

  1. Polyspezifisches Immunkonjugat, umfassend: (a) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, gebunden an (b) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, wobei das Antigen mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist, und (c) mindestens ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel.
  2. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Antikörperkomponente, die mit einem zweiten Epitop des Multidrug-Transporterproteins, verbunden mit den Antikörperkomponenten (a) und (b), bindet.
  3. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, weiter umfassend eine Antikörperkomponente, die mit einem zweiten Epitop des mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbundenen Antigens, oder mit einem Epitop eines zweiten mit dem Tumor oder dem infektiösen Mittel verbundenen Antigens, verbunden mit den Antikörperkomponenten nach Anspruch 1 oder 2, bindet.
  4. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jede Antikörperkomponente unabhängig: (a) ein monoklonaler Mausantikörper, (b) ein von (a) abgeleiteter humanisierter Antikörper, (c) ein humaner monoklonaler Antikörper, (d) ein subhumaner Primaten-Antikörper, oder (e) ein Antikörperfragment, wie F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv und minimale Erkennungseinheit, abgeleitet von (a), (b), (c) oder (d), ist.
  5. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Multidrug-Transporterprotein P-Glycoprotein, otrB, Tel(L), Mmr, ActlI, TcmA, NorA, QacA, CmlA, Bcr, EmrB, EmrD, AcrE, EnvD, MexB, Smr, QacE, MvrC, MsrA, DrrA, DrrB, TlrC, Bmr, TetA oder OprK ist.
  6. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches ein diagnostisches Mittel, wie eine radioaktive Markierung, wie einen γ-Strahler oder einen Positronenstrahler, ein photoaktives Mittel oder einen Farbstoff, eine Fluoreszenz-Markierung, eine Enzym-Markierung, eine Biolumineszenz-Markierung, ein Chemilumineszenz-Markierung, kolloidales Gold oder ein paramagnetisches Ion enthält.
  7. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 6, wobei das diagnostische Mittel ein γ-Strahler mit einer Gammastrahlen-Emissionspeak im Bereich von 50 bis 500 keV ist, wie 99mTc, 67Ga, 123I, 125I oder 131I.
  8. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches ein therapeutisches Mittel, wie ein Radioisotop, beispielsweise einen α-Strahler, einen β-Strahler, einen γ-Strahler, einen Auger-Elektronen-Strahler, ein Neutroneneinfangmittel, welches α-Teilchen emittiert oder ein Radioisotop, welches durch Elektroneneinfang zerfällt, ein Bor-Addend, einen Immunmodulator, ein Toxin, ein photoaktives Mittel oder einen Farbstoff, ein chemotherapeutisches Krebsarzneimittel, ein antivirales Arzneimitel, ein Antipilz-Arzneimittel, ein antibakterielles Arzneimittel, ein Antiprotozoen-Arzneimittel oder ein chemosensibilisierendes Mittel enthält.
  9. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 8, wobei das therapeutische Mittel ein Radioisotop ist, welches 198Au, 32P, 125I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu oder 211At ist.
  10. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das therapeutische Mittel ein chemosensibilisierendes Mittel ist oder weiter einschließt.
  11. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das therapeutische Mittel ein chemotherapeutisches Krebsarzneimittel, ein antibakterielles Arzneimittel, ein antivirales Arzneimittel, ein Antipilz-Arzneimittel oder ein Antiprotozoen-Arzneimittel ist oder weiter einschließt.
  12. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11, weiter umfassend einen Immunmodulator, wobei der Immunmodulator ein Cytokin, wie Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, ein Stammzellen-Wachstumsfaktor oder ein haematopoietischer Faktor, wie Thrombopoietin, ist.
  13. Polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Verwendung in der Behandlung eines Säugers mit entweder einem Multidrugresistenten Tumor, welcher ein mit einem Tumor verbundenes Antigen exprimiert, oder einer Multidrug-resistenten Krankheit, welche durch ein infektiöses Mittel verursacht ist.
  14. Polyspezifisches Immunkonjugat nach Anspruch 12, wobei der Immunmodulator zur Verabreichung vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der Antikörperkomponenten und des/der therapeutischen Mittels) angepasst ist.
  15. Diagnostische oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend das polyspezifische Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei: (a) mindestens eine der Antikörperkomponenten mit einem Biotin-bindenden Molekül oder mit Biotin konjugiert ist, und (b) das diagnostische oder therapeutische Mittel mit bzw. an Biotin oder mit einem Biotin-bindenden Molekül konjugiert ist, zusammen mit einer Clearing-Zusammensetzung, umfassend Biotin bzw. ein Biotin-bindendes Molekül.
  16. Diagnostische oder therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Biotin-bindende Molekül Avidin oder Streptavidin ist.
  17. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 15 zum Nachwies der Ortes von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln in einem Säuger mit einer Multidrug-resistenten Krankheit, welche durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel verursacht ist.
  18. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das diagnostische Mittel eine radioaktive Markierung, ein photoaktives Mittel oder ein Farbstoff, eine Fluoreszenz-Markierung oder ein paramagnetisches Ion ist.
  19. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 zur Behandlung eines Säugers mit einer Multidrug-resistenten Krankheit, welche durch einen Tumor oder ein infektiöses Mittel verursacht ist.
  20. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln ex vivo, wobei das Verfahren (a) das Inkontaktbringen einer biologischen Probe eines Säugers, welcher im Verdacht steht, MDR Tumorzellen, MDR HIV-infizierte Zellen oder MDR infektiöse Mittel zu enthalten, mit einem Antikörper-Komposit, welcher (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, gebunden an (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines mit dem Tumor oder infektiösen Mittel verbundenen Antigens bindet, umfasst, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen durchgeführt wird, welche das Binden des Antikörper-Komposits an die biologische Probe erlauben, und (b) das Nachweisen von allen gebundenen Antikörper-Kompositen, umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, welches ein diagnostisches polyspezifisches Immunkonjugat, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 15 bis 18 definiert, verwendet.
  22. Verwendung eines Antikörper-Komposits, welches (1) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, gebunden an (2) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines mit einer Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzelle, MDR-HIV infizierten Zelle oder MDR infektiösen Mittels verbundenen Antigens bindet, umfasst, in der Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Nachweis der Gegenwart von Multidrug-resistenten (MDR) Tumorzellen, MDR HIV-infizierten Zellen oder MDR infektiösen Mitteln in einem Säuger.
  23. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein diagnostisches polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, zusammen mit einem Antikörper oder Antikörperfragment, welches mit dem polyspezifischen Immunkonjugat in einer Menge bindet, die ausreicht, den Spiegel von zirkulierendem polyspezifischen Immunkonjugat um etwa 10 bis 85% innerhalb von 2 bis 72 Stunden zu senken.
  24. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein therapeutisches polyspezifisches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 14, zusammen mit einem Antikörper oder Antikörperfragment, welches mit dem polyspezifischen Immunkonjugat in einer Menge bindet, die ausreicht, den Spiegel an zirkulierendem polyspezifischen Immunkonjugat um etwa 10 bis 85% innerhalb von 2 bis 72 Stunden zu senken.
  25. Antikörper-Komposit, umfassend (a) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Multidrug-Transporterproteins bindet, gebunden an (b) mindestens eine Antikörperkomponente, welche mit einem ersten Epitop eines Antigens bindet, wobei das Antigen mit einem Tumor oder einem infektiösen Mittel verbunden ist.
  26. Antikörper-Komposit nach Anspruch 25, wobei jede Antikörperkomponente wie in Anspruch 4 definiert ist.
  27. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antikörper-Komposit nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, zusammen mit einem therapeutischen Mittel wie einem chemotherapeutischen Krebsarzneimittel, einem antiviralen Arzneimittel, einem Antipilz-Arzneimittel, einem antibakteriellen Arzneimittel, oder einem Antiprotozoen-Arzneimittel.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, weiter umfassend einen Immunmodulator, wobei der Immunmodulator ein Cytokin, wie Granulozytenkoloniestimulierender Faktor, ein Stammzellen-Wachstumsfaktor oder ein haematopoietischer Faktor, wie Thrombopoietin, ist.
DE69535272T 1994-08-05 1995-08-01 Polyspezifische Immunkonjugate und Antikörper-Komposite zur zielgerichteten Erkennung des Multidrug-Resistenz Phänotyps Expired - Lifetime DE69535272T2 (de)

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US (5) US5686578A (de)
EP (1) EP0778849B1 (de)
JP (1) JP4255512B2 (de)
AT (1) ATE342923T1 (de)
AU (1) AU3202195A (de)
CA (1) CA2195556C (de)
DE (1) DE69535272T2 (de)
IL (1) IL114830A (de)
WO (1) WO1996004313A1 (de)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US20010055581A1 (en) 1994-03-18 2001-12-27 Lawrence Tamarkin Composition and method for delivery of biologically-active factors
US7354587B1 (en) 1994-07-06 2008-04-08 Immunomedics, Inc. Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines
US5686578A (en) * 1994-08-05 1997-11-11 Immunomedics, Inc. Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype
US6369135B1 (en) * 1995-08-15 2002-04-09 Georgia Tech Research Corporation Water-borne alkyd coatings by miniemulsion polymerization
CA2240834C (en) * 1995-12-22 2013-12-03 Immunomedics, Inc. Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines
US6247995B1 (en) 1996-02-06 2001-06-19 Bruce Bryan Bioluminescent novelty items
WO2000002050A1 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 Department Of Radiation Oncology, University Of Washington Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
US20010023288A1 (en) 1999-07-07 2001-09-20 Wilbur D. Scott Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
US6416960B1 (en) * 1996-08-08 2002-07-09 Prolume, Ltd. Detection and visualization of neoplastic tissues and other tissues
NZ335453A (en) 1996-12-12 2001-07-27 Prolume Ltd Microelectronic device with microlocations including photodetector for detecting bioluminescence
US6451980B1 (en) * 1997-02-26 2002-09-17 Ban-An Khaw Signal enhancement of bispecific antibody-polymer probe for immunoassay use
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6407218B1 (en) * 1997-11-10 2002-06-18 Cytimmune Sciences, Inc. Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs
US7229841B2 (en) 2001-04-30 2007-06-12 Cytimmune Sciences, Inc. Colloidal metal compositions and methods
DE69833876T2 (de) * 1997-11-10 2007-05-24 Cytimmune Sciences, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für die gezielte abgabe von faktoren
AU757357B2 (en) * 1997-11-10 2003-02-20 Cytimmune Sciences, Inc. Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs
US6071490A (en) * 1998-05-07 2000-06-06 Immunomedics, Inc. Position emission tomography using gallium-68 chelates
DE69914892T2 (de) * 1998-05-07 2004-12-30 Immunomedics, Inc. Positronenemissions-tomographie mit benutzung von gallium-68 chelaten
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7052872B1 (en) 1999-06-22 2006-05-30 Immunomedics, Inc. Bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7833528B2 (en) 1998-06-22 2010-11-16 Immunomedics, Inc. Use of multispecific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7405320B2 (en) 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
ATE460946T1 (de) * 1998-06-22 2010-04-15 Immunomedics Inc Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie
WO2000014537A2 (en) * 1998-09-04 2000-03-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugate for diagnosis of multidrug resistance
MY133346A (en) * 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
US7829064B2 (en) * 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
US8119101B2 (en) 1999-05-10 2012-02-21 The Ohio State University Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
US8383081B2 (en) * 1999-05-10 2013-02-26 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
AU5905400A (en) * 1999-07-14 2001-02-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for delivery and retention of active agents to lymph nodes
EP1229934B1 (de) 1999-10-01 2014-03-05 Immunogen, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von krebs mittels immunkonjugaten und chemotherapeutischen agenzien
GB9923858D0 (en) * 1999-10-09 1999-12-08 Neutec Pharma Plc Antimicrobial compositions
NO314537B1 (no) * 1999-12-06 2003-04-07 Anticancer Therapeutic Inv Sa Reseptorbindende konjugater
US6258526B1 (en) * 2000-01-19 2001-07-10 M.D.R. Test Ltd Ex-vivo test kit for testing the effectiveness of reversers of multidrug resistance
US7494646B2 (en) * 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
CA2478543A1 (en) * 2001-10-26 2003-04-26 The Uab Research Foundation Multidrug multiligand conjugates for targeted drug delivery
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US20040018495A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Xing-Xiang Li Microparticle based signal amplification for the detection of analytes
US20060024289A1 (en) * 2002-10-02 2006-02-02 Ruggles Sandra W Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
US7651689B2 (en) * 2002-11-15 2010-01-26 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods of applying ionization radiation for therapy of infections
US8420086B2 (en) 2002-12-13 2013-04-16 Immunomedics, Inc. Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases
GB0305702D0 (en) * 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
WO2005065121A2 (en) * 2003-12-02 2005-07-21 Cytimmune Sciences, Inc. Methods and compositions for the production of monoclonal antibodies
US7901680B2 (en) 2005-10-19 2011-03-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) vaccines for cancer therapy
US9481878B2 (en) 2004-02-13 2016-11-01 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8435539B2 (en) 2004-02-13 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US9550838B2 (en) 2004-02-13 2017-01-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
US8551480B2 (en) 2004-02-13 2013-10-08 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US8883160B2 (en) * 2004-02-13 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
US8562988B2 (en) 2005-10-19 2013-10-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Strategies for improved cancer vaccines
EP1733056B1 (de) 2004-03-31 2013-05-22 The General Hospital Corporation Verfahren zur bestimmung des ansprechens eines tumors auf behandlungen mit dem epidermalen wachstumsfaktor-rezeptor als target
ES2374560T3 (es) 2004-04-12 2012-02-17 Catalyst Biosciences, Inc. Escisión de vegf y receptor de vegf mediante mt-sp1 de tipo silvestre y mutante.
US7754233B2 (en) * 2004-09-03 2010-07-13 Ethicon, Inc. Method of preventing post-operative surgical adhesion
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US8349332B2 (en) 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
US8067006B2 (en) 2005-04-06 2011-11-29 Immunomedics, Inc. Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites
US7527784B2 (en) * 2005-08-31 2009-05-05 Bioderm Research Water washable hair removal (depilatory) compositions
CN101534865A (zh) * 2005-10-19 2009-09-16 Ibc药品公司 生物活性装配体的制备方法及其用途
EP2674440B1 (de) 2005-12-16 2019-07-03 IBC Pharmaceuticals, Inc. Polyvalente bioaktive anordnungen auf immunglobulinbasis
DK2046951T5 (da) 2006-07-05 2012-01-23 Catalyst Biosciences Inc Proteasesreeningsmetoder og proteaser identificeret dermed
EP2121030A4 (de) * 2007-01-17 2013-06-19 Immunomedics Inc Polymerträger von therapeutischen mitteln und erkennungsreste für gezielte behandlung von krankheitsstellen auf antikörperbasis
PL2644205T3 (pl) * 2007-04-12 2018-11-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Ukierunkowane ABCB5 w leczeniu nowotworu
EP2200932A4 (de) * 2007-09-21 2014-09-10 Cytimmune Sciences Inc Nanotherapeutische kolloidale metallzusammensetzungen und verfahren
US20110014118A1 (en) * 2007-09-21 2011-01-20 Lawrence Tamarkin Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods
WO2009062151A1 (en) 2007-11-08 2009-05-14 Cytimmune Sciences, Inc. Compositions and methods for generating antibodies
US11542328B2 (en) 2008-11-14 2023-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
EP3978928A1 (de) 2008-11-14 2022-04-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Therapeutische und diagnostische verfahren im zusammenhang mit krebsstammzellen
WO2011032022A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Improved pseudomonas exotoxin a with reduced immunogenicity
AU2011203890B2 (en) * 2010-01-11 2013-05-30 Center For Molecular Medicine And Immunology Enhanced cytotoxicity of anti-CD74 and anti-HLA-DR antibodies with interferon-gamma
ES2625406T3 (es) 2010-03-25 2017-07-19 Oregon Health & Science University Glicoproteínas de CMV y vectores recombinantes
SI2691530T1 (en) 2011-06-10 2018-08-31 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CA2789539A1 (en) 2011-09-12 2013-03-12 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
US9757458B2 (en) 2011-12-05 2017-09-12 Immunomedics, Inc. Crosslinking of CD22 by epratuzumab triggers BCR signaling and caspase-dependent apoptosis in hematopoietic cancer cells
US9192664B2 (en) 2011-12-05 2015-11-24 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-CD22 antibodies for inducing trogocytosis
US9745631B2 (en) 2011-12-20 2017-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer
US10138479B2 (en) 2012-05-24 2018-11-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeting the glutamine to pyruvate pathway for treatment of oncogenic Kras-associated cancer
EP2679596B1 (de) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 Env-proteinvariante
WO2014014518A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating, preventing and predicting risk of developing breast cancer
KR102356017B1 (ko) 2012-12-13 2022-01-27 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 개선된 효능 및 감소된 독성을 위한 항체 및 sn-38의 면역컨쥬게이트의 투약
US9492566B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US10137196B2 (en) 2012-12-13 2018-11-27 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US10206918B2 (en) 2012-12-13 2019-02-19 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers
ES2819573T3 (es) 2012-12-13 2021-04-16 Immunomedics Inc Método para producir inmunoconjugados de anticuerpo-SN-38 con un enlazador CL2A
US9931417B2 (en) 2012-12-13 2018-04-03 Immunomedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
US10744129B2 (en) 2012-12-13 2020-08-18 Immunomedics, Inc. Therapy of small-cell lung cancer (SCLC) with a topoisomerase-I inhibiting antibody-drug conjugate (ADC) targeting Trop-2
US20240139324A1 (en) 2012-12-13 2024-05-02 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and sn-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US10413539B2 (en) 2012-12-13 2019-09-17 Immunomedics, Inc. Therapy for metastatic urothelial cancer with the antibody-drug conjugate, sacituzumab govitecan (IMMU-132)
US11253606B2 (en) 2013-07-23 2022-02-22 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10130590B2 (en) 2013-10-01 2018-11-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancer with atovaquone-related compounds
EP2873423B1 (de) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere
WO2015149006A2 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating ncoa4-mediated autophagic targeting of ferritin
RU2016148616A (ru) * 2014-06-11 2018-07-18 Дженентек, Инк. Анти-lgr5 антитела и их применение
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3286224A4 (de) 2015-04-22 2018-11-14 Immunomedics, Inc. Isolierung, detektion, diagnose und/oder charakterisierung von zirkulierenden trop-2-positiven krebszellen
US10195175B2 (en) 2015-06-25 2019-02-05 Immunomedics, Inc. Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
CA3011372A1 (en) 2016-02-10 2017-08-17 Immunomedics, Inc. Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers
CN109310385A (zh) 2016-04-27 2019-02-05 免疫医疗公司 抗trop-2-sn-38抗体药物缀合物用于检查点抑制剂复发/难治的肿瘤的疗法的功效
WO2018183041A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Immunomedics, Inc. Treatment of trop-2 expressing triple negative breast cancer with sacituzumab govitecan and a rad51 inhibitor
EP3606964A4 (de) 2017-04-03 2020-12-09 Immunomedics, Inc. Subkutane verabreichung von antikörper-arzneimittelkonjugaten zur krebstherapie
US20230241240A1 (en) * 2020-06-14 2023-08-03 Shimon Slavin Multifunctional immunotherapeutic monoclonal antibody complexes and conjugates
WO2023088295A1 (zh) * 2021-11-17 2023-05-25 江苏先声药业有限公司 一种多特异性抗体及其药物用途
US12146511B2 (en) * 2023-01-23 2024-11-19 Electronics For Imaging, Inc. Controlling multiple eversion-based actuators

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5064821A (en) * 1982-11-18 1991-11-12 Trustees Of Tufts College Method and compositions for overcoming tetracycline resistance within living cells
JPS59169489A (ja) 1983-03-15 1984-09-25 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒト培養株化細胞
JPH0618778B2 (ja) 1985-10-04 1994-03-16 中外製薬株式会社 白血球減少症治療剤
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
CA1329119C (en) 1988-03-29 1994-05-03 Milton David Goldenberg Cytotoxic therapy
US5332567A (en) * 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5005588A (en) * 1989-10-13 1991-04-09 David Rubin Method for increasing tumor sensitivity to chemotherapy
ZA914625B (en) * 1990-06-22 1993-02-24 Lilly Co Eli In vivo targeting with bifunctional antibodies
AU8727291A (en) * 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
US5773280A (en) * 1992-03-20 1998-06-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Monoclonal antibody to a human MDR1 multidrug resistance gene product, and uses
AU2400692A (en) * 1991-07-19 1993-02-23 Hybritech Incorporated Trifunctional compounds having specificity for multi-drug resistant cells
EP0569141A3 (de) * 1992-04-14 1994-10-26 Hybritech Inc Methode zur Hemmung des Wachstums von multidrugresistenten Tumoren durch Antikörper.
CA2093866A1 (en) * 1992-04-14 1993-10-15 Lana S. Grauer Methods of inhibiting the growth of multidrug resistant tumors
IT1257893B (it) * 1992-06-17 1996-02-16 Ist Superiore Sanita Anticorpi monoclonali che riconoscono un epitopo della p-glicoproteina umana.
US5686578A (en) * 1994-08-05 1997-11-11 Immunomedics, Inc. Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996004313A1 (en) 1996-02-15
DE69535272D1 (de) 2006-11-30
US6468530B1 (en) 2002-10-22
US20020187141A1 (en) 2002-12-12
ATE342923T1 (de) 2006-11-15
CA2195556A1 (en) 1996-02-15
AU3202195A (en) 1996-03-04
IL114830A0 (en) 1995-12-08
US5686578A (en) 1997-11-11
JPH10506881A (ja) 1998-07-07
IL114830A (en) 2002-02-10
CA2195556C (en) 2006-07-18
US7067128B2 (en) 2006-06-27
US5698178A (en) 1997-12-16
JP4255512B2 (ja) 2009-04-15
EP0778849A1 (de) 1997-06-18
EP0778849A4 (de) 1999-07-28
EP0778849B1 (de) 2006-10-18
US20040071692A1 (en) 2004-04-15

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