DE69914892T2

DE69914892T2 - Positronenemissions-tomographie mit benutzung von gallium-68 chelaten

Info

Publication number: DE69914892T2
Application number: DE69914892T
Authority: DE
Inventors: L. Gary GRIFFITHS; J. William MCBRIDE
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2019-05-07
Also published as: AU3880699A; CA2331348C; AU740563B2; WO1999056792A1; EP1075287B1; CA2331348A1; JP2002513776A; EP1075287A1; DE69914892D1; ES2216510T3; ATE259663T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Positronenemissionstomographie (PET) ist eine hochauflösende, nicht-invasive Abbildungstechnik für die Visualisierung einer Erkrankung des Menschen. Bei PET werden 511 keV Gamma-Photonen, die beim Positronenannihilationszerfall produziert werden, detektiert. Beim klinischen Einsatz ist Fluor-18 (F-18) eines der am häufigsten verwendeten positronenemittierenden Nuklide. Es sind jedoch komplizierte chemische Reaktionen erforderlich, um F-18 mit spezifischen zielenden Vektoren, wie Antikörpern, Antikörperfragmenten, rekombinanten Antikörperkonstrukten und längerlebigen, von Rezeptoren angezielten Peptiden zu verknüpfen.
Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur Durchführung von PET, welches nicht auf das F-18-Isotop angewiesen ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchführung von PET durch Verabreichung eines Ga-68-Chelatkomplexes bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen und Kits zur Durchführung von PET bereitzustellen.
Gemäß dieser und anderer Aufgaben liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle mit: Verabreichen eines bispezifischen Antikörpers, welcher über eine primäre Bindungsstelle spezifisch an eine Substanz bindet, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht, und an einen anschließend verabreichten Ga-68-Chelatkomplex und Einfindenlassen des Antikörpers an der Zielstelle;
optional Verabreichen eines Klärungsmittels zur schnellen Entfernung von nicht eingefundenem, bispezifischem Antikörper aus dem Kreislauf, wobei das Klärungsmittel bezüglich der primären Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers antiidiotypisch ist, und
Verabreichen eines Ga-68-Chelatkomplexes, welcher Ga-68, das von Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂ cheliert ist, aufweist, und Einfindenlassen des Ga-68-Chelatkomplexes an der Zielstelle über spezifische Bindung durch die sekundäre Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle mit: Verabreichen eines direkt zielenden Mittels, das eine zielende Spezies umfaßt, die mit Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂, welches mit Ga-68 markiert ist, konjugiert ist.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Durchführung von Positronenemissionstomographie (PET) unter Verwendung des Radioisotops Gallium-68 (Ga-68). Ga-68 hat eine Halb wertszeit von einer Stunde und zerfällt mit 90% Positronenhäufigkeit mit wenigen damit einhergehenden Gammastrahlen. Diese physikalischen Eigenschaften machen Ga-68 besonders geeignet für PET-Anwendungen.
Ga-68 erhält man aus einem Germanium-68- (Ge-68-) Generator. Weil Ge-68 eine Halbwertszeit > 240 Tage hat, hält ein Ge-68-Generator für eine lange Zeit und produziert Ga-68 wirtschaftlich. Das Ga-68 kann von dem Generator mit jedem Chelierungsmittel für Ga-68, wie DOTA, DTPA oder EDTA, gemäß dem von Schuhmacher of al., Inf. J. Appl. Radiat. Isot., Band 32, S. 31–36 (1981) beschriebenen Verfahren eluiert werden. Der resultierende Ga-68-Chelatkomplex kann in den nachfolgend diskutierten Verfahren verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein vorab zielendes Verfahren eingesetzt, um Ga-68 an eine Zielstelle auszuliefern. Bei diesem Verfahren wird die interessierende in vivo-Stelle (d. h. Tumor, Läsion, Infektionsherd) mit einem bispezifischen Antikörper gemäß den nachfolgenden Stufen vorab angezielt:

(1) Es wird ein bispezifischer Antikörper verabreicht, welcher sich an der Zielstelle über spezifische Bindung an eine Substanz, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht, einfindet und welcher spezifisch an einen anschließend verabreichten Chelatkomplex bindet,
(2) optional wird ein Klärungsmittel verabreicht, um nicht eingefundenen Antikörper aus dem Kreislauf zu entfernen, und
(3) ein Chelatkomplex, welcher Ga-68 und Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂ enthält, wird verabreicht und findet sich an der Zielstelle über spezifische Bindung durch den bispezifischen Antikörper ein.

Der bispezifische Antikörper hat eine primäre Bindungsstelle, welche spezifisch an eine Substanz bindet, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht, und findet sich an der Zielstelle durch diese spezifische Wechselwirkung ein. Der bispezifische Antikörper hat auch eine sekundäre Bindungsstelle, welche spezifisch an den anschließend verabreichten Chelatkomplex bindet.
Der bispezifische Antikörper umfaßt wenigstens zwei Antikörper oder Antikörperfragmente oder eine Kombination von wenigstens einem Antikörper und wenigstens einem Antikörperfragment. Antikörper enthalten eine oder mehrere Disulfidbindungen, welche die schweren Ketten verknüpfen, sowie Disulfidbindungen, welche leichte und schwere Ketten miteinander verbinden. Die letztgenannten Disulfidbindungen sind normalerweise für disulfidreduzierende Mittel weniger zugänglich, und die Bindungen, welche schwere Ketten verknüpfen, können normalerweise selektiv gespalten werden. Die resultierenden Fragmente behalten ihre Immunspezifität und Fähigkeit, an Antigen zu binden. Es ist klar, daß eine Reduzierung von Disulfidbindungen, welche die schweren Ketten eines Immunglobulins verknüpfen, mit Vorsicht bewirkt werden muß, da die normalerweise weniger reaktiven Disulfidbindungen, welche leichte und schwere Ketten verknüpfen, möglicherweise reduziert werden, wenn die Reduktionsbedingungen zu drastisch sind oder das Reduktionsmittel für eine zu lange Zeit in Kontakt mit den Fragmenten belassen wird.
Der Begriff "monovalentes Antikörperfragment", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Fab'- und Fab-Fragmente, die man normalerweise durch Spaltung von bivalenten Fragmenten oder intaktem Immunglobulin erhält. Fab'-Antikörperfragmente werden normalerweise und bequem durch reduktive Spaltung von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt, welche selbst normalerweise durch Pepsinverdau von intaktem Immunglobulin hergestellt werden. Fab-Antikörperfragmente können durch Papainverdau von intaktem Immunglobulin unter reduzierenden Bedingungen oder durch Spaltung von F(ab)₂-Fragmenten, welche aus vorsichtigem Papainverdau von Gesamt-Ig erhalten werden, hergestellt werden. Parham et al., J. Immunol. Methods, 53: 133–173, 1982, und Boguslawski et al., J. Immunol. Methods, 120: 51–56, 1989, zeigen Papainverdau von monoklonalem Maus-IgG₁ zu F(ab)₂. Aktivierung des Papains mit Thiol, gefolgt von Entfernen des Thiols vor der Spaltung, erlaubt, daß die Spaltung von solchen Immunglobulinen, welche die Papainspaltungsstelle unterhalb von wenigstens einer Disulfidbindung haben, ohne weitere Spaltung des bivalenten Fragments stattfindet.
Es ist jedoch klar, daß monovalente Fragmente auch jedwede Fragmente umfassen, welche den hypervariablen, antigenbindenden Bereich eines Immunglobulins behalten und eine Größe haben, die ähnlich wie oder kleiner als ein Fab'-Fragment ist. Dies umfaßt genetisch hergestellte und/oder rekombinante Proteine, entweder einkettige oder mehrkettige, welche eine Antigenbindungsstelle enthalten oder in anderer Weise in vivo als zielende Vehikel in im wesentlichen der gleichen Art und Weise wie natürliche monovalente Immunglobulinfragmente funktionieren.
Es ist auch klar, daß die radioaktiv zu markierenden, monovalenten Antikörperfragmente Fragmente sein können, welche an Antigene binden, die Antigene umfassen, die von Tumoren, infektiösen Läsionen, Mikroorganismen, Parasiten, Myokardinfarkten, Arterioskleroseplaques oder normalen Organen oder Geweben produziert werden oder mit diesen einhergehen, aber nicht auf diese beschränkt sind.
Die Antikörperfragment-Chelat-Konjugate der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren hergestellt werden und nach den Verfahren in z. B. den US-Patenten 5,612,016, 5,637,288, 5,635,603 und den US-Patentanmeldungen 08/456,629, 08/779,556 und 08/456,909. Antikörperfragmente können für eine Konjugation an ein Radioisotop, d. h. Ga-68, für eine Verwendung als ein diagnostisches Abbildungsmittel, hierin für Positronenemissionstomographie, angepaßt sein. Dies kann erreicht werden, indem man ein Chelierungsmittel für ein Radiometall oder ein paramagnetisches Ion gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung, die Ga-68 cheliert, anheftet. Solche Chelierungsmittel und die Verfahren zu deren Anheftung an Antikörper sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und unter anderem z. B. in Childs et al., J. Nuc. Med., 26: 293 (1985) und in den US-Patenten 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744 und 4,624,846 von Goldenberg offenbart. Typisch sind Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA). Zum Beispiel cheliert Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂ Ga-68 und kann mit einem Antikörperfragment konjugiert werden. Diese haben typischerweise Gruppen an der Seitenkette, durch welche das Chelierungsmittel an ein Antikörperfragment angeheftet werden kann. Alternativ können Carboxyl- oder Amingruppen an einem Chelie rungsmittel aktiviert und dann nach gut bekannten Verfahren an ein Antikörperfragment gekoppelt werden.
Das Chelierungsmittel kann an das Antikörperfragment direkt oder durch einen kurz- oder langkettigen Verknüpfungsrest, durch eine oder mehrere funktionale Gruppen an dem Antikörper, z. B. Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thiol- oder Hydroxylgruppen, gebunden werden. Es können verschiedene herkömmliche Linker verwendet werden, z. B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Carbodiimide, bis-Hydroxysuccinimidester, Maleimid-hydroxysuccinimidester, Glutaraldehyd und ähnliche, vorzugsweise ein selektiver sequentieller Linker, wie der Anhydrid-Isothiocyanat-Linker, der in dem US-Patent 4,680,338 offenbart ist.
Gemäß einer Ausführungsform umfaßt der bispezifische Antikörper monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt der bispezifische Antikörper humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente. Monoklonale Antikörper (MAb) sind üblicherweise Proteine der Maus, und sie sind nicht identisch mit humanen Antikörpern. Daher werden Antikörper von einer Maus, wenn sie in einen Patienten injiziert werden, möglicherweise aus dem Kreislauf entfernt, da sie als Fremdproteine erkannt werden. Beide Ketten des Antikörpermoleküls können in variable und konstante Bereiche unterteilt werden. In jedem Antikörper unterscheiden sich die variablen Bereiche von einem Antikörper gegenüber dem nächsten. Dies ist der Bereich, welcher das Antigen bindet. Der konstante Bereich des Antikörpers ist unter Antikörpern des gleichen Typs der gleiche. Die Grundstruktur eines Maus-MAb ähnelt derjenigen eines menschlichen Antikörpers. Es gibt jedoch zahlreiche Unterschiede zwischen den Aminosäuresequenzen der Antikörper aus den zwei Spezies. Diese Sequenzunterschiede begründen die Immunogenizität von Maus-MAbs in Menschen. Ein chimärer MAb wird durch Ligieren des cDNA-Fragmentes, welches die leichten variablen und schweren variablen Domänen der Maus codiert, an ein Fragment, welches die C-Domänen aus einem menschlichen Antikörper codiert, konstruiert. Weil die C-Domänen nicht zu einer Antigenbindung beitragen, wird der chimäre Antikörper die gleiche Antigenspezifität behalten, wie der ursprüngliche Maus-MAb, aber er wird hinsichtlich der Sequenz menschlichen Antikörpern näher sein. Chimäre MAbs enthalten jedoch nach wie vor einige Maussequenzen und können nach wie vor immunogen sein. Ein humanisierter MAb enthält nur solche Aminosäuren der Maus, die notwendig sind, um das Antigen zu erkennen. Dieses Produkt wird durch Einbauen der Aminosäuren der die Komplementarität bestimmenden Bereiche aus der Maus in ein menschliches Antikörpergerüst konstruiert.
Multispezifische, einschließlich bispezifische und hybride Antikörper und Antikörperfragmente können auch zum Detektieren von Läsionen verwendet werden und bestehen aus wenigstens zwei verschiedenen, im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wobei wenigstens zwei der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an wenigstens zwei verschiedene Antigene binden, welche von der angezielten Läsion produziert werden oder mit dieser einhergehen, oder an wenigstens zwei verschiedene Epitope oder Moleküle einer Markersubstanz, die von der angezielten Läsion produziert wird oder mit dieser einhergeht. Multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente mit doppelten Spezifitäten können analog zu den Anti-Tumor- Markerhybriden, offenbart in dem US-Patent Nr. 4,361,544, hergestellt werden. Andere Techniken zur Herstellung hybrider Antikörper sind z. B. in den US-Patenten Nr. 4,474,893 und 4,479,895 und bei Milstein et al., Immunol. Today, 5, 299 (1984) offenbart. Diese Antikörper werden dann mit einem Antikörper oder Antikörperfragment mit Chelatspezifität unter Ausbildung des zielenden Antikörpers verknüpft.
Die Antikörper gegen Tumorantigene und gegen Pathogene sind bekannt. Zum Beispiel sind Antikörper und Antikörperfragmente, welche spezifisch Marker binden, die von Tumoren oder infektiösen Läsionen, einschließlich viralen, bakteriellen, Pilz- und Parasiten-Infektionen, produziert werden oder mit diesen einhergehen und Antigene und Produkte, die mit diesen Mikroorganismen einhergehen, unter anderem in Hansen et al., US-Patent 3,927,193 und Goldenberg, US-Patente 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,818,709 und 4,624,846 offenbart. Insbesondere werden Antikörper gegen ein Antigen, z. B. einen gastrointestinalen, Lungen-, Brust-, Prostata-, Eierstock-, Hoden-, Hirn- oder Lymphtumor, ein Sarkom oder ein Melanom vorteilhafterweise verwendet.
Es wurde eine breite Vielfalt an monoklonalen Antikörpern gegen infektiöse Krankheitsstoffe entwickelt und in einem Überblick von Polin in Eur. J. Clin., Microbiol., 3(5): 387–398, 1984 zusammengefaßt, was die einfache Verfügbarkeit zeigt.
Zusätzliche Beispiele für gegen infektiöse Organismen erzeugte MAbs, welche in der Literatur beschrieben wurden, werden aufgeführt.
MAbs gegen das gp120-Glycoprotein-Antigen von humanem Immunschwächevirus 1 (HIV-1) sind bekannt. Siehe z. B. Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8055–8058, 1990. Andere MAbs gegen virale Antigene und viral induzierte Antigene sind ebenfalls bekannt.
MAbs gegen Malariaparasiten können gegen die Sporozoit-, Merozoit-, Schizont- und Gametocyt-Stadien gerichtet sein. Mehrere Gruppen haben MAbs gegen T. gondii entwickelt, dem Protozoenparasiten, der in Toxoplasmose involviert ist (Kasper et al., J. Immunol. 129: 1694–1699, 1982; Id., 130. 2407–2412, 1983) und gegen schistosomale Oberflächenantigene (Simpson et al., Parasitology, 83: 163–177, 1981; Smith et al., Parasitology, 84: 83–91, 1982; Gryzch et al., J. Immunol., 129: 2739–2743, 1982; Zodda et al., J. Immunol. 129: 2326–2328, 1982; Dissous et al., J. Immunol., 129: 2232–2234, 1982).
Trypanosoma cruzi ist der verursachende Stoff von Chagas-Krankheit und wird durch blutsaugende Reduviid-Insekten übertragen. Es wurde ein MAb erzeugt, der spezifisch die Differenzierung einer Form des Parasiten in eine andere (Epimastigoten- zu Trypomastigoten-Stadium) in vitro hemmt und welcher mit einem Zelloberflächenglycoprotein reagiert, jedoch fehlt dieses Antigen den Säuger- (Blutbahn-) Formen des Parasiten (Sher et al., Nature, 300: 639–640, 1982).
Es wurden geeignete MAbs gegen die meisten der Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Protozoen, andere Parasiten), die für die meisten Infektionen im Menschen verantwortlich sind, entwickelt und können zu Zwecken der in vitro-Diagnostik verwendet werden. Diese Antikörper und neuere MAbs, die durch herkömmliche Verfahren erzeugt werden können, sind für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Die zielenden Spezies können ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment sein und sie können humanisiert sein, wie es oben diskutiert wird.
Antikörper, die spezifisch Gallium- und Indiumchelate binden, sind bekannt, wie auch Verfahren zum Einbau der Antikörper oder chelatbindenden Fragmente davon in bispezifische zielende Konjugate. Siehe z. B. US-Patente 5,256,395 und 5,274,076 und Schuhmacher et al., Cancer Research, 55: 115–123 (1995).
Gemäß der Erfindung kann ein optionales Mittel verabreicht werden, um nicht-lokalisierte bispezifische Antikörper, welche von dem Ziel zurück in Nicht-Zielbereiche oder in das Kreislaufsystem abgelöst werden oder wandern, zu entfernen. Das verabreichte Klärungsmittel kann jedes bekannte Klärungsmittel sein.
In einer Ausführungsform wird ein Antikörper verabreicht, welcher für den anfänglich verabreichten bispezifischen Antikörper spezifisch ist und den nicht-lokalisierten, anfänglich verabreichten Antikörper entfernt. Der zweite Antikörper kann Gesamt-IgG oder -IgM oder ein Fragment von IgG oder IgM sein, solange er in der Lage ist, den bispezifischen Antikörper unter Ausbildung eines Komplexes, welcher aus dem Kreislauf und den Nicht-Zielräumen schneller entfernt wird als der bispezifische Antikörper selbst, zu binden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Klärungsmittel verabreicht, das einen Rest umfaßt, welcher die primäre Bindungsstelle der primären zielenden Spezies (des bispezifischen Antikörpers) bindet. Das heißt, daß das Klärungsmittel den Bereich der primären zielenden Spezies (des bispezifischen Antikörpers) bindet, welcher an die Zielstelle bindet. Dieser Typ von Klärungsmittel kann jedes Molekül enthalten, welches ein spezifisch bindendes Komplement zu der primären Bindungsstelle der primären zielenden Spezies (des bispezifischen Antikörpers) ist. Die Klärungsmittel können eine Spezies sein, die nicht Antikörper ist, welche an die primäre Bindungsstelle des zielenden Antikörpers bindet. Es kann ein Klärungsmittel, das kein Antikörper ist, verwendet werden, welches an die primäre Bindungsstelle der primären zielenden Spezies (des bispezifischen Antikörpers) bindet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Klärungsmittel zu der primären Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers (der Stelle, welche an eine Substanz bindet, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht) antiidiotypisch, wie ein antiidiotypischer Antikörper. Siehe z. B. US-Patentanmeldungen 08/486,166 und 08/731,107, deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß das Klärungsmittel nicht-lokalisierten bispezifischen Antikörper aus dem Kreislauf entfernt, ohne bispezifischen Antikörper, der sich bereits an der Zielstelle eingefunden hat, in konkurrierender Weise zu entfernen. Wenn das Klärungsmittel ein Antikörper ist, kann es humanisiert sein, wie es oben unter Bezugnahme auf den bispezifischen Antikörper diskutiert wird.
Das Klärungsmittel kann auch mit Zuckerresten, wie Galactose, modifiziert sein, um die Klärung zu verstärken. Konjugieren des Klärungsmittels mit einem Zuckerrest, wie Galactose, dient dazu, das Klärungsmittel an den hepatischen Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, wobei das Klärungsmittel und Komplexe aus Klärungsmittel und primären zielenden Spezies von Leberhepatozy ten schnell erkannt werden. Die Verwendung von galactosylierten Klärungsmitteln stellt daher eine nahezu vollständige hepatozytische Erkennung und Sequestration innerhalb von Minuten nach einer Injektion, im allgemeinen im wesentlichen in einem einzelnen Durchgang durch die Leber, sicher.
Der Grad der Modifikation des Klärungsmittels mit Zuckerresten bestimmt die Blutklärungsrate. Das geeignete Maß an Modifikation des Klärungsmittels ist für eine wirksame Klärung mit Klärungsmitteln für eine Verwendung mit dieser Erfindung wichtig. Die Anzahl an Zuckerresten pro Molekül des Klärungsmittels kann für jedes spezielle Klärungsmittel durch Routineverfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, empirisch bestimmt werden. Es ist üblich, das Maß an Glycosylierung als Prozentsatz an Lysinresten, die durch Hinzufügung von Zuckern modifiziert sind, auszudrücken. Für antiidiotypische Antikörperklärungsmittel wurde herausgefunden, daß ein Modifizieren von etwa 22% der Lysinreste keine signifikant beschleunigte Entfernung von nicht-lokalisiertem primärem zielendem Konjugat liefert, wobei eine Modifizierung von etwa 48% der Lysinreste eine Entfernung erheblich beschleunigt, und ein Modifizieren von etwa 76% oder mehr der Lysinreste führt zu einer nahezu vollständigen Entfernung aus dem Kreislauf in einem einzigen Durchgang durch die Leber. Dies wird im allgemeinen auch für Antikörperfragmente zutreffen, obwohl die Prozentsätze etwas variieren können. Das Ausmaß an Glycosylierung zum Erzielen von im wesentlichen vollständiger Entfernung in einem Durchgang ist einfach zu bestimmen.
Der Chelatkomplex umfaßt Ga-68 und ein Chelierungsmittel für Ga-68. Zum Beispiel können Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und andere bekannte Chelierungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ga-68 wird von diesen Chelierungsmitteln leicht cheliert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Chelatkomplex Ga-68 und ein Di-DTPA-Derivat, welches Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂ ist.
Wie es oben diskutiert wird, kann Ga-68 von dem Generator mit einem Chelierungsmittel eluiert werden. Dieses chelierte Ga-68 kann als der Chelatkomplex gemäß diesem Verfahren verwendet werden. Weil der Ga-68-Chelatkomplex relativ klein ist, wird nicht-lokalisierter Komplex schnell durch die Nieren entfernt werden.
Es kann vorteilhaft sein, eine Markierung mit trägerfreiem Ga-68 aus dem Generator unter Zugabe von kalten In⁺³-Ionen oder kalten Ga⁺³-Ionen, z. B. als ein lösliches Salz, wie das Chlorid, zur Sättigung des Chelierungsmittel folgen zu lassen. Mit bestimmten Anti-Chelat-Antikörpern ist eine Bindung an das Chelat verbessert, wenn es mit Metallionen gesättigt ist.
Die Zielstelle ist eine spezifische Stelle, an welche das Ga-68-Chelat auszuliefern ist, wie eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen, ein Gewebe, ein Organ, ein Tumor oder eine Läsion.
Verabreichungswege für die Zusammensetzung umfassen intravenös, intraarteriell, intrapleural, intraperitoneal, intrathecal, subkutan oder durch Perfusion. Die bevorzugten Verabreichungswege sind intravenös und intraarteriell. In einer Ausführungsform wird die Zusammensetzung als eine physiologische Lösung des unmittelbar zielenden Mittels verabreicht, welches ein Konjugat aus einer zielenden Spezies und Chelierungsmittel, welches mit Ga-68 cheliert ist, enthält. In einer zweiten Ausführungsform wird eine physiologische Lösung des bispezifischen Antikörpers vorzugs weise intravenös oder intraarteriell verabreicht. Ein Klärungsmittel in einer physiologischen Lösung kann dann verabreicht werden, gefolgt von Verabreichung eines Chelatkomplexes von Ga-68, vorzugsweise von mit Ga-68 markiertem Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂.
Die vorliegende Erfindung erreicht eine wirksame Auslieferung von Ga-68 an die Zielstelle in einer kurzen Zeit mit einem hohen Ziel : Nicht-Ziel-Verhältnis von Ga-68. Im allgemeinen wird das Chelat auch für mehrere Tage an der Zielstelle gehalten. Diese effiziente und spezifische Auslieferung von Ga-68 an die Zielstelle ermöglicht eine effektive Abbildung unter Verwendung von PET.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein direkt zielendes Mittel, welches Ga-68 umfaßt. Das Mittel umfaßt eine zielende Spezies, die mit einem chelierenden Mittel konjugiert ist, welches Ga-68 cheliert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das chelierende Mittel, welches Ga-68 cheliert, Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂. Dieses Mittel kann durch Eluieren von Ga-68 von dem Generator mit einem Konjugat, welches ein Chelierungsmittel für Ga-68 und eine zielende Spezies umfaßt, hergestellt werden.
Die zielende Spezies kann ein Antikörper, ein Antikörperfragment oder eine kleinere Spezies, z. B. genetisch hergestellte und/oder rekombinante Proteine, sein und bindet eine Substanz, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht.
Ein unmittelbar zielendes Mittel kann dazu verwendet werden, Ga-68 in einer einzigen Stufe an eine Zielstelle auszuliefern. Gemäß diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel, das ein Konjugat aus einer zielenden Spezies, einem Chelierungsmittel für Ga-68 und Ga-68 umfaßt, einem Patienten verabreicht und sich an der Zielstelle einfinden gelassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Chelierungsmittel für Ga-68 das Di-DTPA-Derivat Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂. Wenn ein Antikörperfragment oder eine kleinere zielende Spezies verwendet wird, wird ein nicht-lokalisiertes Mittel schnell durch die Nieren entfernt und es wird kein Klärungsmittel benötigt, bevor PET durchgeführt werden kann. Alternativ, wenn eine größere zielende Spezies verwendet wird, kann ein Klärungsmittel verwendet werden. Dieses Klärungsmittel kann jedes bekannte Klärungsmittel sein, einschließlich eines antiidiotypischen Klärungsmittels, welches an die Bindungsstelle der zielenden Spezies bindet, wie solche, die zuvor diskutiert wurden.
Wie das oben diskutierte vorab zielende Verfahren erreicht dieses direkt zielende Verfahren eine schnelle und effiziente Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle. Mit den hohen Ziel : Nicht-Ziel-Verhältnissen von Ga-68, die durch diese Verfahren erreicht werden, werden anschließende PET-Abbildungen genau und zuverlässig sein.
Beispiele
Beispiel 1 – Herstellung des Ga-68-Chelats: Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂
Das Peptid wurde durch auf N-α-Fmoc basierender Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung einer 3 × 30 cm Glassäule, die mit einer groben Glasfritte und einem Dreiwegehahn am Boden ausgestattet war, aufgebaut. Das Harz wurde unter Verwendung einer Stickstoffspülung durch den Dreiwegehahn aufwärts durch die Glasfritte in die Harzsuspension gemischt. Das Reakti onsgefäß wurde durch Umlegen des Dreiwegehahns in die Ausschußstellung und Anlegen von Stickstoffdruck von der Oberseite der Säule, um die Lösungsmittel durch die Fritte herauszuzwingen, geleert. Die Aloc-Schutzentfernung wurde nach bekannten Verfahren durchgeführt.
Ein Fmoc-Rink-Amidharz wurde zur Herstellung des Peptids Ac-Phe-Lys-(Aloc)-Tyr(But)-Lys(Aloc)-Rink durch stufenweise Kopplung von 2,5 Äquivalenten von jeweils N^α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH, N^α-Fmoc-Tyr(But)-OH, N^α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH, N^α-Fmoc-Phe-OH, gefolgt von Acetyl-Abdeckung mit 14 Äquivalenten Acetanhydrid, verwendet. Jeder Kopplungszyklus bestand aus dem folgenden: (1) das Harz wurde mit 40 ml 25% Piperidin in DMF für 15 Minuten behandelt, (2) mit Portionen von 40 ml N-Methylpyrrolidinon (NMP) (zweimal), Isopropanol (IPA), NMP, IPA, NMP (viermal) gewaschen.
Die Aloc-Seitenkettenschutzgruppen wurden von dem Peptid Ac-Phe-Lys(Aloc)-Tyr(But)-Lys(Aloc)-Rink durch Mischen von 0,41 g des Harzes mit 8 ml einer Lösung, die 0,12 g Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium (0), 10 ml DCM und 1 ml Essigsäure enthielt, entfernt. Anschließend wurden 1,2 ml Tributylzinn hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur Vortex-gemischt. Das Harz wurde dann gewaschen mit Portionen von 8 ml DCM (zweimal), 2 DIEA in NMP (zweimal), NMP, IPA, NMP, IPA, NMP (viermal), um das von Aloc-Schutzgruppen befreite Peptid: Ac-Phe-Lys(Aloc)-Tyr(But)-Lys(Aloc)-Rink herzustellen.
Die DTPA wurde nach dem folgenden Verfahren aktiviert: (4,0 g) wurden in 30 ml 1 M Tetrabutylammoniumhydroxid in Methanol gelöst. Das flüchtige Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der ölige Rückstand wurde dann mit 100 ml DMF verdünnt, und die flüchtigen Lösungsmittel wurden unter Hochvakuum im Rotationsverdampfer entfernt. Die DMF-Verdampfung wurde zwei weitere Male wiederholt, und dann wurde das zurückbleibende Öl in 25 ml DMF gelöst und mit 3,9 g HBTU gemischt.
Die aktivierte DTPA-Lösung (6 ml) wurde mit dem schutzgruppenbefreiten Harz Ac-Phe-Lys-Tyr(But)-Lys-Rink für 24 Stunden bei Raumtemperatur Vortex-gemischt. Das Harz wurde dann gewaschen mit Portionen von 8 ml NMP (zweimal), IPA, NMP, IPA, NMP (viermal) und DCM (zweimal).
Das Peptid wurde von dem Harz abgespalten mit 8 ml eines Spaltungscocktails, bestehend aus 35 ml TFA, 15 ml DCM, 1 ml Anisol, 1 ml Ethandithiol und 1 ml TIPS. Die Harzsuspension wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden Vortex-gemischt, und die Spaltungslösung wurde durch Filtration gesammelt. Das Harz wurde mit weiteren 4 ml des frischen Spaltungscocktails gewaschen, und die Filtrate wurden vereinigt. Das Filtrat wurde dann in 30 ml Diethylether gegossen, und das präzipitierte Rohpeptid wurde durch Zentrifugation gesammelt. Das rohe Präzipitat wurde mit drei 30 ml-Portionen Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das rohe Peptid wurde dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Die Fraktionen wurden durch HPLC (RT, 5,7 Min.) analysiert. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert, um das Produkt (21,0 mg, 14%) als einen weißen amorphen Feststoff zu liefern.
Beispiel 2 – PET-Abbildung von Kleinzellenlungenkrebs mit Vorabzielung
Ein Patient, bei dem Kleinzellenlungenkrebs diagnostiziert war, wird mit einem bispezifischen Antikörperkonjugat, bestehend aus einem Fab'-Fragment von einem monoklonalen Anti-Kleinzellenlungenkrebs-Antikörper und einem Fab'-Fragment von einem monoklonalen Anti-DTPA-Antikörper injiziert. Am nächsten Tag wird ein 0,5 molarer Überschuß an Ga-68-Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂, markiert mit einer Abbildungsdosis von Ga-68 und dann mit InCl₃ gesättigt, intravenös infundiert. Nach 2 Stunden, 4 Stunden und 6 Stunden werden PET-Abtastungen vorgenommen. Man beobachtet gut aufgelöste Abbildungen von Tumor in mehreren Lappen der rechten Lunge, einschließlich kleiner Tumore, sogar nach 2 Stunden.
Beispiel 3 – PET-Abbildungen von Kolorektalkrebs mit direktem Zielen
Eine Lösung eines Konjugates von einem monoklonalen Anti-CEA-Antikörper-Fab'-Fragment, verknüpft durch eine n-Hexylkette an dem Antikörpergelenkbereich mit dem Phenolrest des Tyrosins von Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH₂, wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung dazu verwendet, eine wirksame Abbildungsdosis von Ga-68 von einem Generator zu eluieren und zu chelieren. Das Konjugat wird dann intravenös in einen Patienten infundiert, bei dem ein Karzinom des querverlaufenden Dickdarms diagnostiziert ist. Nach 2 Stunden, 4 Stunden und 6 Stunden werden PET-Abtastungen vorgenommen. Man beobachtet gut aufgelöste Abbildungen des Tumors, sogar nach 2 Stunden.
Die vorangegangenen Beispiele können mit ähnlichem Erfolg unter Ersetzen der generisch oder spezifisch beschriebenen Reaktanden und/oder Verfahrensbedingungen dieser Erfindung für solche erläuternde Spezies, wie sie oben beispielhaft angegeben sind, wiederholt werden.

Claims

Verfahren zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle in einem Säuger mit: (a) Verabreichen eines bispezifischen Antikörpers, welcher in der Lage ist, über eine primäre Bindungsstelle spezifisch an eine Substanz zu binden, die von der Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht, und welcher in der Lage ist, über eine sekundäre Bindungsstelle spezifisch an einen anschließend verabreichten Ga-68-Chelatkomplex zu binden; (b) Einfindenlassen des Antikörpers an der Zielstelle; (c) optional Verabreichen eines Klärungsmittels zur schnellen Entfernung von nicht eingefundenem, bispezifischem Antikörper aus dem Kreislauf; und (d) Verabreichen eines Ga-68-Chelatkomplexes, welcher Ga-68, das an Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂ cheliert ist, aufweist, und Einfindenlassen des Ga-68-Chelatkomplexes an der Zielstelle über spezifische Bindung durch die sekundäre Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers.
Verfahren zur Positronen-Emissionstomografie in einem Säuger, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: (a) Verabreichen eines bispezifischen Antikörpers oder Antikörperfragmentes, das in der Lage ist, über eine primäre Bindungsstelle spezifisch an eine Substanz zu binden, die von einer Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht, und welcher in der Lage ist, über eine sekundäre Bindungsstelle spezifisch an einen anschließend verabreichten Ga-68-Chelatkomplex zu binden; (b) Einfindenlassen des Antikörpers an der Zielstelle; (c) optional Verabreichen eines Klärungsmittels zur schnellen Entfernung von nicht eingefundenem, bispezifischem Antikörper oder Antikörperfragment aus dem Kreislauf; (d) Verabreichen eines Ga-68-Chelatkomplexes, welcher Ga-68, das an Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂ cheliert ist, aufweist, und Einfindenlassen des Ga-68-Chelatkomplexes an der Zielstelle über spezifische Bindung durch die sekundäre Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers oder Antikörperfragmentes; und (e) Detektieren von Stellen mit Zunahme an Ga-68-Chelat.
Kit zum Chelieren von Ga-68, welches in getrennten Behältern folgendes umfaßt: einen bispezifischen Antikörper, der in der Lage ist, über eine primäre Bindungsstelle spezifisch an eine Substanz zu binden, die von einer Zielstelle in einem Säuger produziert wird oder mit dieser einhergeht, und welcher in der Lage ist, über eine zweite Bindungsstelle spezifisch an einen Ga-68-Chelatkomplex zu binden; optional ein Klärungsmittel, das in der Lage ist, den bispezifischen Anti körper zu binden; und mit Ga-68 markiertes Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂, welches in der Lage ist, spezifisch an die sekundäre Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers zu binden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 oder Kit nach Anspruch 3, wobei der bispezifische Antikörper einen monoklonalen Antikörper, ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers, einen humanisierten Antikörper oder ein Fragment eines humanisierten Antikörpers umfaßt.
Verfahren oder Kit nach einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei das Klärungsmittel bezüglich der primären Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers antiidiotypisch ist.
Verfahren zur Positronen-Emissionstomographie in einem Säuger, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: (a) Verabreichen eines Antikörperfragment-Ga-68-Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂-Konjugates, in welchem das Antikörperfragment in der Lage ist, spezifisch an eine Substanz zu binden, die von einer Zielstelle produziert wird oder mit dieser einhergeht; (b) Einfindenlassen des Chelat-Konjugates an der Zielstelle; und (c) Detektieren von Stellen mit Zunahme des Konjugates.
Verfahren zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle in einem Säuger, bei dem man ein direkt zielendes Mittel verabreicht, das eine zielende Spezies umfaßt, die mit Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂, welches mit Ga-68 markiert ist, konjugiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer zielenden Spezies, die mit einem Chelator konjugiert ist, der Ga-68 cheliert, bei dem man Ga-68 aus einem Ga-68-Generator mit einem Konjugat aus einer zielenden Spezies und Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂ eluiert.
Zusammensetzung zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle in einem Säuger, die ein direkt zielendes Mittel, welches ein Konjugat aus einer zielenden Spezies aufweist, die mit Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂, welches mit Ga-68 markiert ist, cheliert ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Ga-68-Chelatkomplex, der Ga-68 mit Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂ cheliert aufweist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Krankheit in einem Säuger.
Antikörper, der in der Lage ist, einen Ga-68-Chelatkomplex gemäß Anspruch 10 zu binden, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Krankheit in einem Säuger, wobei der Antikörper in der Lage ist, an eine Substanz zu binden, die von einer Zielstelle in dem Säuger produziert wird oder mit dieser einhergeht.
Verwendung eines bispezifischen Antikörpers, welcher in der Lage ist, über eine primäre Bindungsstelle spezifisch an eine Substanz zu binden, die von einer Zielstelle in einem Säuger produziert wird oder mit dieser einhergeht, und welcher in der Lage ist, über eine sekundäre Bindungsstelle spezifisch an einen Ga-68-Chelatkomplex zu binden, optional eines Klärungsmittels, das in der Lage ist, den bispezifischen Antikörper zu binden und von mit Ga-68 markiertem Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂, welches in der Lage ist, von der sekundären Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers spezifisch gebunden zu werden, in einem Verfahren zur Auslieferung von Ga-68 an eine Zielstelle in einem Säuger, bei dem man den bispezifischen Antikörper an der Zielstelle einfinden läßt, das Klärungsmittel nicht eingefundenen, bispezifischen Antikörper aus dem Kreislauf entfernen läßt und den mit Ga-68 markierten Ac-Phe-Lys(DTPA)-Tyr-Lys-(DTPA)-NH₂-Komplex an der Zielstelle über spezifische Bindung durch die sekundäre Bindungsstelle des bispezifischen Antikörpers einfinden läßt.