DE69722937T2

DE69722937T2 - Bor-neutronen-einfangtherapie unter verwendung von pre-targeting-methoden

Info

Publication number: DE69722937T2
Application number: DE69722937T
Authority: DE
Inventors: L. Gary GRIFFITHS; V. Serengulam Govindan
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2017-07-24
Also published as: EP0920623A4; DE69722937D1; DK0920623T3; WO1998004917A1; PT920623E; AU3732397A; CA2261791A1; JP2000516217A; ATE243319T1; AU732510B2; EP0920623B1; US5846741A; ES2201309T3; EP0920623A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen zur Durchführung von Bomeutroneneinfangtherapie (BNCT). BNCT ist ein binäres System, das zur Auslieferung ionisierter Strahlung an Tumorzellen durch Neutronenbestrahlung von an einem Tumor lokalisierten Bor-10-Atomen ausgelegt ist. In der vorliegenden Erfindung werden die Krebszellen z. B. mit einem karzinoembryonischen, antigenspezifischen monoklonalen Antikörper (MAb), der z. B. mit Streptavidin konjugiert ist, vorerfaßt. Dann wird eine z. B. mit Biotin konjugierte Bor enthaltende Verbindung verabreicht, welche an das an der Krebsstelle lokalisierte Streptavidin bindet. Das lokalisierte Bor kann dann bestrahlt werden, wobei eine Behandlung der Tumorzellen bewirkt wird.
Beschreibung von verwandtem Stand der Technik
BORNEUTRONENEINFANGTHERAPIE
Borneutroneneinfangtherapie (BNCT) basiert auf der Kernreaktion, welche stattfindet, wenn ein stabiles Isotop B-10 (das in einer natürlichen Menge von 19,8% vorhanden ist) mit thermischen Neutronen unter Erzeugung eines alpha-Teilchens und eines Li-7-Kerns bestrahlt wird. Diese Teilchen haben eine Weglänge von etwa einem Zelldurchmesser, was zu einem hohen linearen Energietransfer führt. Nur wenige der in dieser Kernreaktion mit 1,7 MeV erzeugten Kurzstrecken-alpha-Teilchen reichen aus, den Zellkern anzusteuern und ihn zu zerstören. Barth et al., Cancer, 70: 2995-3007 (1992). Da die ¹⁰B(n,α)⁷Li-Reaktion stattfindet und dabei nur dann eine signifikante biologische Wirkung erzeugt wird, wenn ein ausreichender Teilchenfluß (Anzahl) thermischer Neutronen und eine kritische Menge an B-10, die um oder in der malignen Zelle lokalisiert ist, vorhanden ist, ist die erzeugte Strahlung lokalisiert. Der Neutroneneinfangquerschnitt von B-10 übersteigt bei weitem denjenigen von in Geweben gefundenem Stickstoff und Wasserstoff, welche ebenfalls Einfangreaktionen unterliegen können (relative Anzahlen: 1 für N-14, 5,3 für H-1 und 11.560 für B-10), so daß, wenn erst einmal ein hoher Konzentrationsunterschied von B-10 zwischen normalen und malignen Zellen erreicht ist, nur die letztgenannten bei Neutronenbestrahlung beeinflußt werden. Dies ist die wissenschaftliche Grundlage für die Borneutroneneinfangtherapie. Barth et al., supra; Barth of al., Cancer Res., 50: 1061–70 (1990); Perks et al., Brit. J. Radiol., 61: 1115–26 (1988).
Kernreaktoren sind die Quelle von Neutronen für BNCT. Thermische Neutronenstrahlen mit Energien im Bereich von 0,023 eV, die in frühen Experimenten zur Behandlung von Gehirntumoren verwendet werden, wurden leicht von Geweben abgeschwächt und dringen schlecht ein. Kürzliche Fortschritte mit Neutronen von mittlerer Energie (epithermische Neutronen, 1–10.000 eV Energie) führten zu der Übereinstimmung, sie in geplanten klinischen Versuchen in den USA und Europa zu verwenden. Alam et al., J. Med. Chem., 32: 2326–30 (1989). Schnelle Neutronen mit einer wahrscheinlichen Energie von 0,75 MeV werden in der BNCT wenig eingesetzt.
Ursprüngliche Berechnungen schätzten, daß eine Borkonzentration von 35–50 μg pro g Tumor oder 10⁹ B-10-Atome pro Tumorzelle notwendig wären, eine zelltötende Kernreaktion mit Teilchenflüssen thermischer Neutronen von 10¹²–10³³ n × cm^–2 aufrechtzuerhalten. Fairchild et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 11: 831 (1985). Diese Berechnungen basierten auf gleichförmig verteiltem Bor, wie man es bei unspezifisch borierten Verbindungen sieht. Für auf Antikörpern basierenden Bor-Mitteln, wobei man von einer Sättigung aller Oberflächenantigene der Tumorzelle ausgeht, entspricht diese Menge an erforderlichem Bor etwa 1.000 Atomen pro Antikörpermolekül. Jedoch führten jüngere Monte-Carlo-Berechnungen zu der Analyse, daß für einen nicht internalisierenden Antikörper die Borbeladung so gering wie 300 Atome pro MAb-Molekül sein könnte. Kalend et al., Med. Phys., 18: 662 (1991); Zamenhof et al., J. Nat'l Cancer Inst., 84: 1290-91 (1992).
Dies wurde auf die folgende Begründung gestützt: Für Tumorzellen, die ein Kern-zu-Zell-Volumenverhältnis von 0,5 und einen effektiven Zelldurchmesser von 10 μm aufweisen, würden drei B-10-Spaltungen auf der Zelloberfläche einen Übergang von wenigstens einem schweren Teilchen in den Kern produzieren. Unter der Annahme einer Sättigung von Antigenstellen auf der Zelloberfläche wurde geschlossen, daß unter diesen Bedingungen nur 300 Atome pro Antikörpermolekül ausreichen würden, die drei Spaltreaktionen auf der Tumorzelloberfläche zu bewirken. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, welches eine 20-fach größere Anzahl an Boratomen pro MAb anheften kann als es diese früheren Methoden bewirkten.
Historisch wurde BNCT zuerst für die Behandlung von Glioblastom (einer tödlichen Form von Gehirntumor) und anderen Gehirntumoren zu einer Zeit verwendet, als tumorspezifische Substanzen fast unbekannt waren. Hatanaka et al., in BORON NEUTRON CAFTURE THERAPY FOR TUMORS, S. 349–78 (Nishimura Co., 1986). Eine der ersten verwendeten borierten Verbindungen, eine Sulfhydryl enthaltende Borsubstanz, die Natriumborocaptat oder BSH (Na₂B₁₂H₁₁SH) genannt wird, passiert die Blut-Hirn-Schranke und wird im Gehirn lokalisiert, und dies war die anatomische Grundlage für Neutroneneinfangtherapie von Gehirntumoren. Es wurden klinische Versuche durchgeführt oder sind geplant für die Behandlung von Gliomen in Japan, den USA und Europa. Barth et al., Cancer, supra. Probleme mit früheren Therapieverfahren mit anorganischem Bor waren, daß das Bor sowohl angezielte als auch nicht angezielte Bereiche erreichte. Dementsprechend wurden, wenn das Bor bestrahlt wurde, gesunde Zellen als auch Krebszellen zerstört.
Das BNCT-Konzept wurde auf andere Krebsarten erweitert, angespornt von der Entdeckung einer Anzahl tumorlokalisierender Substanzen, einschließlich auf Tumore zielender monoklonaler Antikörper. Zum Beispiel sammelten sich borierte Aminosäuren, wie p-Borphenylalanin, in Melanomzellen an. Das Potential der Verwendung borierter monoklonaler Antikörper, die gegen Zelloberflächenantigene gerichtet waren, wie CEA, wurde für die BNCT von Krebs demonstriert. Ichihashi et al., J. Invest. Dermatol., 78: 215-18 (1982); Goldenberg et al., P. N. A. S., USA, 79: 3011–14 (1982); Barth et al. Hybridoma, 5 (supp. 1): 543-5540 (1986); Ranadive et al., Nucl. Med. Biol., 20: 663–68 (1993). Jedoch versagten stark borierte Antikörper dabei, Tumore in vivo in Tiermodellen anzusteuern. Alam et al., supra; Barth et al., Bioconjugate Chem., 5: 58–66 (1994).
Ein Erfolg mit der BNCT von Krebs erfordert Verfahren zur Lokalisierung einer hohen Konzentration von Bor-10 an Tumorstellen, wobei Nicht-Zielorgane im wesentlichen borfrei bleiben. Borierte Verbindungen, die keine Antikörper sind und welche sich präferentiell in Tumoren ansammeln, jedoch nicht spezifisch, haben den Nachteil, daß die Tumor-zu-Blut- und Tumor-zu-Organ-Verhältnisse häufig geringer als ideal sind mit der Folge, daß ein Schaden an normalen Organen während einer Bestrahlung mit Neutronenstrahlen auftreten könnte.
Im Falle von Antikörpern hat der anerkannte Bedarf, diese mit 1.000 Boratomen pro Antikörpermolekül zu beladen, zur Gestaltung einer Vielzahl stark borierter Antikörper geführt, wobei z. B. Polylysin, Dendrimer oder Dextran als Zwischenträger von Borclustern verwendet wurden. Alam et al., supra; Barth et al., Bioconjugate Chem, supra. Obwohl in vielen Fällen gefunden wurde, daß etwas Antigenbindung in vitro erhalten blieb, fanden sich diese borierten Konjugate hauptsächlich in der Leber unter geringem Zuwachs im Tumor in in vivo Tiertumormodellen.
Daher besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen, das in der Lage ist, eine große Menge an Boratomen an Tumorstellen auszuliefern, während nicht krebsartige Stellen relativ borfrei gelassen werden.
VORANSTEUERUNG
Das Konzept der Voransteuerung für die Darstellungsanwendung in vivo wurde von Hnatowich of al., J. Nuc. Med., 28: 1294–1302 (1987) vorgeschlagen und später von einem theoretischen Gesichtspunkt aus untersucht. Van Osdol et al., J. Nucl. Med., 34: 1552–64 (1993). Von Voransteuerung wurde kürzlich beschrieben, daß sie zu sehr vielversprechenden vorklinischen Ergebnissen bei einer Yttrium-90-Radioimmuntherapie führte. Axworthy et al., J. Immunother., 16: 158 (1994). US-Patent Nr. 5,482,698 offenbart ebenfalls verschiedene Voransteuerungsverfahren.
Eine Therapie erfordert einen hohen absoluten Zuwachs des therapeutischen Mittels an der Krebsstelle sowie eine einigermaßen lange Dauer der Aufnahme und Bindung. Hohe Hintergrundniveaus an nicht-zielendem Antikörper wurden lange als ein Haupthindernis dafür angesehen, daß hohe Ziel: Hintergr and-Verhältnisse erreicht werden. Zur Überwindung dieses Hindernisses wurden verschiedene Verfahren entwickelt, wie diejenigen, die in Hansen et al., US-Patent Nr. 3,927,193, und Goldenberg, US-Patent Nr. 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,460,459, 4,460,561, 4,624,846 und 4,818,709 beschrieben sind.
Voransteuerungsverfahren, welche Biotin/Avidin-Ansätze verwenden, sind z. B. beschrieben in Hnatowich et al, J. Nucl. Med., 28: 1294, 1987; Oehr et al., J. Nucl. Med. 29: 728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29: 1951, 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30: 66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31: 1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Cancer 48: 167, 1991; Paganelli of al., Cancer Res. 51: 5960, 1991; Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12: 211, 1991; Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650, 1991; und Yuan et al., Cancer Res. 51: 3119, 1991.
Diese Verfahren umfassen die Voransteuerung einer Zielstelle, wie eines Tumors oder einer Läsion, mit einem zielenden Protein, wie einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, konjugiert an einen Teil eines Bindungspaares, wie Biotin oder Avidin, wobei das Antikörperkonjugat an der Zielstelle lokalisiert wird. Anschließend wird ein Konjugat aus einem Detektions- oder einem therapeutischen Mittel, wie einem Radioisotop, und dem komplementären Teil des Bindungspaares, wie Avidin oder Biotin, verabreicht. Die Bindungsaffinität zwischen den Teilen des Bindungspaares bewirkt, daß das zweite Konjugat an der Zielstelle lokalisiert wird, wo das erste Konjugat bereits gebunden ist.
Bei einigen dieser Verfahren wird eine Zwischenklärungs- oder Lokalisierungsstufe verwendet. In diesem Fall umfaßt das erste Konjugat einen Teil des Bindungspaares (z. B. Biotin), das Klär- und Lokalisierungsmittel kann den anderen Teil des Bindungspaares (z. B. Avidin) umfassen, und das zweite Konjugat umfaßt den gleichen Teil des Bindungspaares wie das erste (z. B. Biotin). Andere Klärmittel, wie Antikörper, wurden ebenfalls beschrieben.
Es besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen, das hohe Tumor: Nicht-Tumor-Verhältnisse der Boratome liefert und das ausreichende Mengen an Boratomen an Tumorstellen in einer effizienten Art und Weise ausliefert. Es werden auch Zusammensetzungen benötigt, die für die Verwendung in solch einem Verfahren geeignet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen bereitzustellen, das die früheren Probleme mit der Aufrechterhaltung eines hohen Tumor: Nicht-Tumor-Verhältnisses von Bor-10-Atomen überwindet, und zur effizienten Auslieferung ausreichender Mengen an Bor-10-Atomen an Tumorstellen, sowie Zusammensetzungen zur Verwendung in diesem Verfahren zu liefern.
Zur Erfüllung dieser und anderer Aufgaben der Erfindung wird gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen in einem Patienten bereitgestellt mit den Stufen, in denen man:

(A) dem Patienten eine zielende Zusammensetzung verabreicht, die ein Konjugat aus einem ersten Teil eines Bindungspaares und einem Antikörper umfaßt, wobei der Antikörper selektiv an Antigene bindet, die von den Tumorzellen produziert werden oder mit diesen einhergehen, und das Konjugat an den Tumorzellen einfinden läßt,
(B) optional dem Patienten eine Klärzusammensetzung verabreicht und die Klärzusammensetzung nicht lokalisiertes Konjugat aus der Zirkulation entfernen läßt, und
(C) dem Patienten eine borhaltige Verbindung verabreicht, die ein Konjugat mit einem komplementären Teil des Bindungspaares und Boratomen umfaßt, und die borhaltige Verbindung an den Tumorzellen lokalisieren läßt. Das Verfahren kann weiterhin die Stufe der Bestrahlung der Boratome der borhaltigen Verbindung, die an den Tumorzellen lokalisiert ist, umfassen, wobei man BNCT der Tumorzellen bewirkt.

Das Bindungspaar kann Biotin und Avidin oder Streptavidin, komplementäre Stränge von Polynukleotiden oder Enzym-Substrat-Paare umfassen. Wenn das Bindungspaar Biotin umfaßt, kann das Biotin ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon umfassen, einschließlich eines Biotinrestes, der über eine Peptidbindung an eine nicht natürliche D-Aminosäure gebunden ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die borhaltige Verbindung mit einer feststellbaren Markierung radioaktiv markiert, wobei in diesem Fall das Verfahren weiterhin die Stufe der Feststellung der feststellbaren Markierung der borhaltigen Verbindung umfaßt, wobei der Ort der Verbindung bestimmt wird. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Boratome der borhaltigen Verbindung, die an den Tumorzellen lokalisiert ist, bestrahlt, nachdem die feststellbare Markierung festgestellt wurde.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine sterile, injizierbare Zusammensetzung für die Anwendung am Menschen bereitgestellt, die eine Zusammensetzung umfaßt für die Verwendung beim Zielen von Boratomen auf Tumorzellen mit einer Biotin enthaltenden Verbindung, die ein Konjugat aus einem Teil eines Bindungspaares und Boratomen umfaßt. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Biotin enthaltende Verbindung mit einer feststellbaren Markierung radioaktiv markiert.
Der Teil des Bindungspaares kann Biotin oder Avidin oder Streptavidin, einen Einzelstrang eines Polynukleotids oder ein Enzym oder Enzymsubstrat umfassen. Wenn der Teil des Bindungspaares Biotin umfaßt, kann das Biotin ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon umfassen, das einen Biotinrest enthält, der über eine Peptidbindung an eine nicht natürliche D-Aminosäure gebunden ist.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, das für die Verwendung in einem Verfahren zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen in einem Patienten geeignet ist, wobei das Kit folgendes umfaßt:

(A) eine sterile, injizierbare Präparation einer zielenden Zusammensetzung mit einem ersten Teil eines Bindungspaares und einem Antikörper, wobei der Antikörper selektiv an Antigene bindet, die von den Tumorzellen produziert werden oder mit diesen einhergehen,
(B) optional eine Klärzusammensetzung und
(C) eine Bor enthaltende Verbindung, welche ein Konjugat umfaßt mit einem komplementären Teil des Bindungspaares und Boratomen.

Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung sind zum Teil in der folgenden Beschreibung angegeben und werden zum Teil anhand der Beschreibung deutlich oder können durch Anwendung der Erfindung erlernt werden. Die Ziele und Vorteile können anhand der Verfahren und Zusammensetzung, die speziell in den anhängenden Patentansprüchen angegeben sind, realisiert und erreicht werden.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung überwindet die vorgenannten Probleme mit durch Antikörper angesteuerter BNCT durch Entkopplung der Antikörper- und Borauslieferungsstufen, indem z. B. ein zwei- oder dreistufiges Vorerfassungsverfahren angewendet wird. Während frühere Verfahren von Antikörper angesteuerter BNCT Beladungen von etwa 1.500 Bor-10-Atomen auf einem einzelnen Antikörpermolekül umfassen, belädt die vorliegende Erfindung den zielenden Antikörper nicht mit Bor, wodurch die Probleme, die mit Hypersubstitution von MAb mit Bor einhergehen, eliminiert werden.
In der vorliegenden Erfindung wird eine hohe Konzentration an Bor spezifisch an den Tumorstellen durch Voransteuerung der Tumorstellen mit einem für Tumorantigen selektiven monoklonalen Antikörper, der mit einem Teil eines Bindungspaares, wie Avidin oder Streptavidin, konjugiert ist, lokalisiert. Der verwendete Antikörper bindet selektiv an Antigene, die von Tumorzellen produziert werden oder mit diesen einhergehen. Die Verwendung eines selektiven monoklonalen Antikörpers ist inhärent spezifischer als die früher verwendeten borierten Verbindungen, welche sich bevorzugt an Tumorstellen ansammeln, jedoch nicht selektiv.
Nachdem sich das Antikörper-Avidin-Konjugat an dem Tumorstellen lokalisiert hat und nachdem optional ein Klärmittel verabreicht und nicht lokalisiertes Konjugat aus der Zirkulation entfernt wurde, wird eine Bor enthaltende Verbindung, die ein Konjugat mit dem komplementären Teil des Bindungspaares, wie Biotin, und Bor umfaßt, verabreicht. Die Affinität zwischen den Teilen des Bindungspaares führt die Bor enthaltende Verbindung, so daß sie an den Tumorstellen lokalisiert wird, wobei eine selektive Auslieferung von Boratomen an die Tumorzellen bewirkt wird.
Krebszustände, die gemäß der vorliegenden Erfindung angesteuert und behandelt werden können, umfassen Karzinome, Melanome, Sarkome, Neuroblastome, Leukämien, Lymphome, Gliome und Myelome.
Ein übliches Bindungspaar, das in Voransteuerungsverfahren verwendet wird, ist Avidin oder Streptavidin und Biotin. Avidin, das man in Eiweißen findet, hat eine sehr hohe Bindungsaffinität für Biotin, welches ein B-Komplex-Vitamin ist. Wilcheck et al., Anal. Biochem., 171: 1 (1988). Streptavidin (SAv), erhalten aus Streptomyces avidinii, ist avidinähnlich, weist aber eine geringere unspezifische Gewebebindung auf und wird daher häufig anstelle von Avidin verwendet. Sowohl Avidin als auch Streptavidin besitzen eine Tetravalenz für Biotin, weshalb sie eine Vervielfältigung erlauben, wenn die vorgenannten an Biotin binden.
Das Streptavidin-Biotin-System repräsentiert die stärkste zwischen einem Protein und einem Liganden bekannte nicht kovalente biologische Wechselwirkung (K_a = 10⁵ M^–1). Rosebrough, Nucl. Med. Biol., 20: 663–68 (1993). Dementsprechend wird es in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet. Streptavidin ist ein Tetramer mit einem Molekulargewicht von 60 kDa mit vier Biotinerkennungsstellen, während Biotin ein kleines organisches Molekül ist. Streptavidin kann an seinen Lysinresten kovalent modifiziert und an einen Antikörper gebunden werden. Biotin kann an seinem Carboxylende für eine Bindung an viele Spezies, einschließlich einem borierten Dextran, einfach umgewandelt werden. Die starke Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung führt zur Bindung der zwei Bestandteile in vivo.
Streptavidin besitzt einen pl von ~6, verglichen mit > 10 für Avidin, was die Ladung von SAv bei physiologischem pH-Wert in die Nähe des Neutralen bringt im Gegensatz zu der stark positiven Ladung von Avidin. Darüber hinaus ist Avidin in vivo und in vitro "klebrig". Rosebrough, supra. Aus diesen Gründen ist Streptavidin gegenüber Avidin zur Herstellung von Konjugaten, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bevorzugt. Jedoch können sowohl Avidin als auch Streptavidin verwendet werden, und, wie in der nachfolgenden Beschreibung verwendet, umfassen die Begriffe Avidin und Streptavidin sowohl Avidin als auch Streptavidin.
Modifizierte Formen von Avidin, wie deglycosyliertes Avidin und/oder neutralisiertes Avidin, können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie auch rekombinante Formen von Avidin oder Streptavidin.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren, bei denen eine Reduzierung der Immunogenizität von Avidin oder der zielenden Zusammensetzung durch Kopplung des immunogenen Mittels mit einem Kohlenhydratpolymer oder Polyolgruppen stattfindet. Beispiele für geeignete Kohlenhydrate oder Polyolgruppen umfassen Dextran, Polysaccharide, Polyethylenglycol (PEG) und ähnliche.
Andere Voransteuerungsverfahren, die gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind beschrieben, wobei z. B. die spezifische Hybridisierung komplementärer Polynukleotidfragmente, einschließlich DNA, RNA und synthetischer Analoge von Polynukleotiden, wie PNAs, als der Erkennungsmechanismus eines Voransteuerungssystems verwendet werden kann. In solch einem Verfahren wirkt ein Strang eines Polynukleotids als ein Teil eines Bindungspaares, und der komplementäre Strang wirkt als der komplementäre Teil des Bindungspaares. Siehe auch Bos et al., Cancer Res. 54: 3479–3486 (1994). Ein Hauptvorteil dieses Systems gegenüber Biotin/Avidin-Systemen könnte die angenommene niedrigere Immunogenizität eines relativ kurzen Stückes von DNA im Vergleich zu der 60.000 Dalton großen Avidinspezies sein.
Ein weiterer Ansatz zur Voransteuerung umfaßt die Verabreichung eines Enzyms, das mit einem Antikörper verknüpft ist, gefolgt von Verabreichung eines hochaffinen Enzyminhibitors (der für das Enzym spezifisch ist), gebunden an einen Chelat-Isotop-Komplex. Dieses Verfahren hat den Vorteil gegenüber früheren bispezifischen Verfahren, daß es beide Antigenbindungsstellen des Antikörpers erhält, und den weiteren Vorteil, daß es einen hochaffinen sekundären Zielmechanismus verwendet (K_d, Dihydrofolatreduktase : Methotrexat = 10^–10). Enzym und Enzym-Substrat-Kombinationen können ebenfalls als Bindungspaare in Voransteuerungsverfahren verwendet werden. Wie bei dem oben diskutierten DNA-Verfahren kann geringere Antigenizität beobachtet werden als in dem Avidin/Biotin-System.
Noch ein weiterer Ansatz zur Voransteuerung umfaßt die Verwendung eines doppelstrangigen Polynukleotids als einen Teil eines Bindungspaares und eines interkalierenden Mittels als den anderen Teil des Bindungspaares. Zum Beispiel kann ein doppelstrangiges Oligonukleotid an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment zum Zielen auf Tumorzellen gebunden werden. Anschließend wird eine Bor enthaltende Verbindung, welche Bor und ein geeignetes interkalierendes Mittel umfaßt, verabreicht, welche sich aufgrund von Affinität zwischen dem Oligonukleotid und dem interkalierenden Mittel an den Tumorzellen einfindet.
Obwohl die hierin angegebenen Beispiele die Verwendung von Avidin und Biotin als das Bindungspaar beschreiben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung in der für Avidin und Biotin beschriebenen Art und Weise jedes Bindungspaar verwendet werden.
Antikörper und Antikörperfragmente können zur Voransteuerung des ersten Teils des Bindungspaares auf die Tumorstellen verwendet werden. Monoklonale Antikörper sind aufgrund ihrer hohen Spezifitäten bevorzugt. Sie lassen sich einfach durch inzwischen als konventionell angesehene Verfahren der Immunisierung von Tieren mit einer immunogenen Antigenpräparation, Fusion von Immunlymph- oder -milzzellen mit einer immortalen Myelomzellinie und Isolierung spezifischer Hybridomaklone herstellen. Eher unkonventionelle Verfahren zur Herstellung monoklonalen Antikörper sind nicht ausgeschlossen, wie Interspeziesfusionen und gentechnische Manipulationen von hypervariablen Bereichen, da es in erster Linie die Antigenspezifität der Antikörper ist, welche deren Brauchbarkeit in der vorliegenden Erfindung beeinflußt. Es ist klar, daß neuere Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern ebenfalls verwendet werden können, z. B. von menschlichen monoklonalen Antikörpem, Interspezies-monoklonalen Antikörpern, chimären (z. B. Mensch/Maus) monoklonalen Antikörpern, gentechnisch hergestellten Antikörpern und ähnlichen.
Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv und ähnliche, einschließlich Hybridfragmente. Bevorzugte Fragmente sind Fab', F(ab')₂, Fab und F(ab)₂. Ebenfalls geeignet sind alle Unterfragmente, welche die hypervariable, antigenbindende Region eines Immunglobulins beibehalten und eine Größe haben, die ähnlich oder kleiner ist als ein Fab'-Fragment. Diese umfassen gentechnisch hergestellte und/oder rekombinante Proteine, entweder einzelkettig oder mehrkettig, welche eine Antigenbindungsstelle enthalten und ansonsten in vivo als Zielvehikel auf im wesentlichen die gleiche Art und Weise wie natürliche Immunglobulinfragmente funktionieren. Solche Einzelkettenbindungsmoleküle sind in dem US-Patent 4,946,778 offenbart. Fab'-Antikörperfragmente können bequem durch reduktive Spaltung von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt werden, welche selbst durch Pepsinverdau von intaktem Immunglobulin hergestellt werden. Fab-Antikörperfragmente können durch Papainverdau von intaktem Immunglobulin unter reduzierenden Bedingungen oder durch Spaltung von F(ab)₂-Fragmenten, welche aus vorsichtigem Papainverdau von ganzem Immunglobulin erhalten werden, hergestellt werden. Die Fragmente können auch durch Gentechnik produziert werden.
Es sollte angemerkt werden, daß Gemische von Antikörpern und Immunglobulinklassen verwendet werden können, wie auch Hybridantikörper. Multispezifische, einschließlich bispezifische und hybride Antikörper und Antikörperfragmente sind für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet und bestehen aus wenigstens zwei verschiedenen im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wobei wenigstens zwei dieser Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an wenigstens zwei verschiedene Antigene binden, die von den Krebszellen produziert werden oder mit diesen einhergehen, oder an wenigstens zwei verschiedene Epitope oder Moleküle einer Markersubstanz, die von den Krebszellen produziert werden oder mit diesen einhergehen. Multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente mit doppelten Spezifitäten können analog zu den Anti-Tumormarkerhybriden hergestellt werden, wie es in dem US-Patent Nr. 4,361,544 offenbart ist. Andere Techniken zur Herstellung von Hybridantikörpern sind z. B. in den US-Patenten Nr. 4,474,894 und 4,479,895 und bei Milstein et al., Immunol. Today, 5: 299 (1984) offenbart.
Bevorzugt sind Antikörper, die eine spezifische Immunreaktivität gegen eine Markersubstanz, die von den Krebszellen produziert wird oder mit diesen einhergeht, von wenigstens 60% und eine Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen oder nicht angesteuerten Substanzen von weniger als 35% aufweisen.
Wie es oben offenbart ist, sind Antikörper gegen Tumorantigene bekannt. Zum Beispiel sind Antikörper und Antikörperfragmente, welche spezifisch Marker binden, die von Tumoren produziert werden oder mit diesen einhergehen, unter anderem in Hansen et al., US-Patent Nr. 3,927,193, und Goldenberg, US-Patent Nr. 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,818,709 und 4,624,846, offenbart. Insbesondere werden Antikörper gegen ein Antigen, z. B. einen Gastrointestinaltumor, Lungentumor, Brusttumor, Prostatatumor, Eierstocktumor, Hodentumor, Gehirntumor oder lymphatischen Tumor, ein Sarkom oder ein Melanom mit Vorteil verwendet.
Die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper und Antikörperfragmente können nach einer Vielzahl von auf dem Gebiet bekannten Verfahren konjugiert werden. Viele dieser Verfahren sind in den oben angegebenen US-Patenten und -Patentanmeldungen offenbart. Siehe auch Childs et al., J. Nuc. Med., 26: 293 (1985).
Ein für die Venrwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugter Antikörper ist MN-14, ein CEA-Antikörper der zweiten Generation, der zehnmal höhere Affinität für CEA aufweist als die Version der ersten Generation, NP-4. Hansen et al., Cancer 71: 3478–85 (1993). MN-14 internalisiert langsam, was ihn für einen Voransteuerungsansatz geeignet macht.
Obwohl Antikörper bevorzugte Zielmittel sind, können auch andere Zielmittel verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Bor enthaltende Verbindung mit einem Konjugat, welches Biotin und Boratome umfaßt. Das Biotin ist vorzugsweise ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon, welches nachfolgend ausführlicher beschrieben wird. Das Biotin wird an einen Zwischenträger gebunden, welcher wiederum an etwa 1.500 Boratome gekoppelt wird. Der Zwischenträger kann z. B. Dextran sein. Andere Trägermoleküle werden dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein und umfassen Aminodextrane, Shih et al., US-Patent Nr. 5,057,313, andere Polysaccharide, natürliche und synthetische Polypeptide, wie Polylysine, Polyglutaminsäuren und Polycysteine, und synthetische Polymere, wie Polyethylenimin, Polyolefine, Polyalkohole, Polycarbonsäuren und Starburst-Dendrimere. Ein weiteres Beispiel für geeignete Träger sind Copolymere, wie solche mit der Formel (Lys)_n-(aax)_q-(Glu)_m-(aay)_p, worin n, m, p und q ganze Zahlen und aax und aay nicht spezifizierte Aminosäuren sind, welche gleich oder verschieden voneinander sein können und welche unter den natürlichen Aminosäuren und deren D-Isomeren ausgewählt sind.
In einer Ausführungsform sind von etwa 1 bis etwa 3 Biotinreste an jedes Dextranmolekül konjugiert. Um eine optimale Auslieferung von Bor-10-Atomen an Tumorstellen zu erzielen, ist es erwünscht, einen Durchschnitt von nur einem Biotinrest pro Molekül der Biotin-Dextran-Bor-Verbindung zu haben. Weil jedes Molekül von Avidin oder Streptavidin bis zu vier Moleküle Biotin binden kann, können bis zu 6.000 Boratome pro Mol Antikörper, der an den Tumorstellen vorlokalisiert ist, ausgeliefert werden. Idealerweise wird jede der vier Biotin-Bindungsstellen von Streptavidin mit einem Biotin-Dextran-(Bor)_x-Rest beladen sein.
Die Bor enthaltende Verbindung der vorliegenden Erfindung vervielfältigt die Menge an Bor, die pro Antikörpermolekül, welches in der ersten Voransteuerungsstufe verwendet wird, ausgeliefert werden kann, und dies ist ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung. Die Verwendung dieser Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt oder übertrifft die hohe Borkonzentration im Tumor, die für eine effektive BNCT erforderlich ist. Dementsprechend sind die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Zielen von Boratomen auf Tumorstellen für eine Therapie von gemeinen malignen Tumoren durch BNCT geeignet.
Obwohl die Bor enthaltende Verbindung oben als eine biotinylierte Verbindung beschrieben wird, umfaßt die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, bei denen die Bor enthaltende Verbindung ein Konjugat mit Boratomen und irgendeinem Teil eines Bindungspaares, wie einem Polynukleotid, einem Enzym oder einem Enzymsubstrat, wie es oben diskutiert wird, umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bor enthaltende Verbindung auch mit einer feststellbaren Markierung radioaktiv markiert. Dies erlaubt die Feststellung des Ortes der verabreichten Bor enthaltenden Verbindung. Geeignete Radiomarkierungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und umfassen z. B. Gammastrahlen emittierende Isotope. Die Verbindung kann nach Verfahren markiert werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann die Bor enthaltende Verbindung an ein chelatbildendes Mittel, wie z. B. DTPA, konjugiert werden, welches die Radiomarkierung oder einen Thiolliganden für eine direkte Markierung durch Tc-99m unter Anwendung bekannter Verfahren, wie solchen, die in dem US-Patent Nr. 5,514,363 beschrieben sind, cheliert. Wenn eine radioaktiv markierte, Bor enthaltende Verbindung verwendet wird, kann die radioaktive Markierung festgestellt werden, bevor das Bor bestrahlt wird, um sicherzustellen, daß die Verbindung an den Tumorzellen lokalisiert ist und daß nicht lokalisiertes Bor aus dem Kreislauf entfernt wurde. Diese Ausführungsform minimiert das Risiko einer Schädigung gesunder Zellen, wenn das Bor bestrahlt wird, weil die Bestrahlung verzögert werden kann, bis die Bor enthaltende Verbindung an Tumorzellen lokalisiert ist. Der Neutronenstrahl wird vorteilhafterweise auf Stellen mit lokalisierten Bor-10-Resten fokussiert, um die Genauigkeit des Neutroneneinfangs weiter zu verbessern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Sulfhydryl enthaltenden Borreste Natriumborocaptat oder BSH (NaB₂B₁₂H₁₁SH) zur Borierung von Dextran verwendet. Diese wurden als nicht toxisch dokumentiert. Barth, Cancer Res., supra; Haselberger of al., Cancer Res. 54: 6318–20 (1994). Diese sind vorzugsweise mit Bor-10 angereichert und enthalten z. B. bis zu 95–98% Bor-10.
Die Herstellung von Borocaptat-Dextran-Konjugat ist in dem nachfolgenden Schema 1 erläutert. Andere mit Bor-10 angereicherte Verbindungen sind ebenfalls bekannt, wie mit Bor-10 angereicherte Carborane. Beispiele dafür sind in dem US-Patent Nr. 4,824,659 beschrieben. Diese Verbindungen können gemäß der vorliegenden Erfindung z. B. durch Konjugieren der Carborane an den ausgewählten Träger verwendet werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein zweistufiger Voransteuerungsansatz verwendet. Wie bei den anderen Ausführungsformen der Erfindung, trennt dieser Ansatz die Antikörperlokalisierungsstufe von der Stufe der Hinterlegung von Bor an den Tumorstellen. Zum Beispiel werden Tumorstellen mit einem Avidin- oder Streptavidin-MAb-Konjugat vorangesteuert. Nachdem ein Zeitraum für die Tumoransteuerung vergangen ist, wird eine biotinylierte Bor enthaltende Verbindung, die kein Antikörper ist, wie die oben beschriebenen Bor enthaltenden Verbindungen, verabreicht. Diese Verbindung bindet an das an den Tumorstellen lokalisierte Avidin oder Streptavidin über den Biotinrest, wobei Boratome an die Tumorstellen ausgeliefert werden. Dieses Verfahren vermeidet Bedenken bezüglich des in vivo-Verhaltens von borierten Antikörpern, weil die Bor enthaltende Verbindung keinen Antikörper umfaßt.
Es können andere Bindungspaare als Biotin und Avidin verwendet werden, wie die oben diskutierten Polynukleotide und Enzym/Enzym-Substratpaare.
Nachdem sich die biotinylierte Borverbindung an der Tumorstelle eingefunden hat, können die Boratome nach herkömmlichen BNCT-Verfahren bestrahlt werden, wobei eine Therapie der Tumorzellen bewirkt wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet eine Zwischenstufe zwischen der Stufe der Auslieferung von Antikörperkonjugat und der Stufe der Auslieferung von Bor. In dieser Stufe wird ein Klärmittel verwendet, um die schnelle Klärung von zirkulierendem Antikörper zu bewirken und sicherzustellen, daß die Endkonzentration an Bor im Kreislauf vernachlässigbar oder nicht existent gehalten wird.
In einer Ausführungsform umfaßt das Klärmittel ein Konjugat, das Galaktose, humanes Serumalbumin (HSA) und Biotin enthält. Solch ein Klärmittel wird schnell aus der Zirkulation durch Asialoglycoprotein-Rezeptoren in der Leber entfernt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Klärmittel ein anti-idiotypischer Antikörper. Dieser Antikörper kann galaktosyliert sein, um eine schnelle Klärung zu erzielen, wie es oben beschrieben ist.
Wege der Verabreichung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen umfassen intravenöse, intraarterielle, intrapleurale, intraperitoneale, intrathecale, subkutane Verabreichung oder Verabreichung durch Perfusion.
Die zeitliche Steuerung der zwei oder drei Voransteuerungsstufen kann zur Verbesserung der Effizienz der Borauslieferung optimiert werden. Die Zeit für die maximale Aufnahme des Antikörperkonjugats, z. B. von Streptavidin-MN-14, durch einen Tumor kann bestimmt werden, indem man zuerst die optimale SAv-Dosis bestimmt und auch die Zeit der maximalen Tumoraufnahme bei dieser Dosis bestimmt. In einem Test wurde gefunden, daß die Zeit für eine maximale Tumoraufnahme zwischen 48 Stunden und 72 Stunden beträgt. Optimalerweise wird das Klärmittel, wie unmarkiertes, glycosyliertes HSA-Biotin oder anti-idiotypischer Antikörper, zu dieser Zeit verabreicht.
Bei verschiedenen Voransteuerungsverfahren wurde das Klärmittel 24 Stunden nach der Injektion eines Streptavidin-IgG-Konjugats verabreicht. Axworthy et al., WO 93/25240. Diese "frühe" zeitliche Steuerung kann den Austausch von einigen Streptavidinstellen durch endogenes Biotin vermeiden. Hnatowich et al., Nucl. Med. Commun. 15: 575-77 (1994).
Ein Klärmittel, das ein Galaktose-HSA-Biotin-Konjugat umfaßt, senkt die Menge an zirkulierendem primärem MAb-SAv-Konjugat bis herab auf etwa 5% ID/g. In anfänglichen Studien haben die gegenwärtigen Erfinder gezeigt, daß die Blutmenge an Antikörperkonjugat zum Zeitpunkt "Null" nach Verabreichung eines anti-idiotypischen Klärmittels dramatisch abfällt. Das heißt, daß zirkulierendes Konjugat nahezu unmittelbar entfernt wird. Die biotinylierte, Bor enthaltende Verbindung kann daher innerhalb von Stunden (2–4 h) nach der Klärungsstufe verabreicht werden, und sie kann unmittelbar nach der Klärungsstufe verabreicht werden, wenn ein anti-idiotypisches Klärmittel verwendet wird.
Die Erzielung niedriger Mengen an zirkulierendem Bor und insbesondere die Erzielung einer nahezu vollständigen Entfernung von zirkulierendem Bor hat den Vorteil, daß die systemische Toxizität, die man beobachtet, wenn Boratome von dem Neutronenstrahl bestrahlt werden, reduziert wird. Das heißt, weil sich wenig oder kein Bor in der Zirkulation befindet, werden nur angesteuerte Tumorzellen von der Bestrahlung von Boratomen durch den Neutronenstrahl beeinflußt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein anti-idiotypisches Klärmittel verwendet, die Bor enthaltende Verbindung wird verabreicht, und der Patient wird kurz nach Verabreichung der Bor enthaltenden Verbindung, z. B. unmittelbar nach Verabreichung der Bor enthaltenden Verbindung, einem thermischen Neutronenstrahl ausgesetzt, wobei die Boratome zu einem Zeitpunkt bestrahlt werden, wenn die Menge an Bor, das an den angesteuerten Tumorzellen lokalisiert ist, auf einem Maximum ist. In einer Variante dieser Ausführungsform ist die Bor enthaltende Verbindung mit einer feststellbaren Markierung markiert, und die feststellbare Markierung wird vor der Bestrahlung der Boratome festgestellt. Diese letztgenannte Variante erlaubt es dem Anwender, sicherzustellen, daß sich die Bor enthaltende Verbindung an dem Ort befindet, bevor das Bor bestrahlt wird, wodurch die Risiken einer Schädigung von gesunden Zellen minimiert wird.
Alternativ kann die Bor enthaltende Verbindung innerhalb von 24 Stunden nach der zweiten Stufe oder bis zu drei Tage später parenteral verabreicht werden. Je länger die Verzögerung nach der ersten Stufe ist, desto niedriger ist die Menge (und das Verhältnis) an benötigtem Klärmittel.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird kein Klärmittel verwendet, und die Bor enthaltende Verbindung wird von etwa 5 bis etwa 20 Tagen nach der Verabreichung des Antikörperkonjugats verabreicht. Diese Ausführungsform ist vorteilhaft für Patienten, die eine schnelle Blutklärung und Tumoranreicherung der zielenden Verbindungen zeigen, z. B. weil sie eine schwere Tumorbelastung aufweisen, die große Mengen an Antigen exprimiert.
Die optimale Dosierung der biotinylierten Borverbindung zur Verabreichung ist eine Funktion der Menge an Avidin oder Streptavidin, welches von der Verbindung komplexiert werden muß, sowie eine Funktion der Klärungskinetiken der Verbindungen in vivo. Wie es nachfolgend diskutiert wird, liefern Bioverteilungen von I-125-markiertem Biotin-Dextran-(Bor)_x in normalen Balb/C-Mäusen zu fünf Zeitpunkten diese Information. Das Doppelmarkierungsexperiment in tumortragenden Nacktmäusen (dritte Stufe) beschreibt die Aufnahme von boriertem Material in Tumor und andere Organe. Abhängig davon, wie lange es benötigt, bis die I-125-Markierung aus Nicht-Zielorganen entfernt wird, kann die Zeitsteuerung und Dosierung der dritten Stufe modifiziert werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat aus Antikörper und Bindungspaarteil, wie ein Antikörper-Avidin- oder Antikörper-Polynukleotid-Konjugat, panenteral üblicherweise mit einer Antikörperdosis von bis zu 1 g, z. B. innerhalb eines Dosisbereichs von etwa 50 mg bis etwa 500 mg, injiziert. Dieses kann als eine einzelne Injektion oder in aufgeteilten Dosen verabreicht werden.
Nach 1–5 Tagen, vorzugsweise weniger als zwei Tagen und sogar weniger als einem Tag, wenn das erste Mittel ein kleines und schnell ansteuerndes Molekül umfaßt, wie ein Antikörperfragment oder -unterfragment, kann eine Dosis an nicht markiertem Klärmittel parenteral verabreicht werden. Die Dosis kann z. B. das 2,5- bis 10-fache der Dosis der ersten Stufe betragen (was auch durch Messung der Menge an Antikörper aus der ersten Stufe, welcher zum Zeitpunkt der Injektion der zweiten Stufe im Blut zirkuliert, bestimmt werden kann). Das Klärmittel kann als eine einzelne Injektion oder in aufgeteilten Dosen gegeben werden, wobei eine Verabreichung des Klärmittels in zwei Dosen unter bestimmten Umständen bevorzugt ist.
Anschließend wird die Bindungspaarteil-Bor-Verbindung, wie eine biotinylierte Borverbindung, zu einem geeigneten Zeitpunkt und in geeigneter Dosierung, was bestimmt wird, wie es oben beschrieben ist, verabreicht. Zum Beispiel, wenn das Avidin-Biotin-System als das Bindungspaar verwendet wird, kann die Dosis an biotinyliertem Bor von etwa 2 mg bis etwa 2 g betragen. Die höhere Dosis stellt einen etwa vierfachen molaren Überschuß an biotinylierter Verbindung gegenüber dem injizierten Avidin-Antikörper-Konjugat dar, was eine Sättigung aller Biotinbindungsstellen an dem vorangesteuerten Avidin-Konjugat erlaubt. Die niedrigere Dosis spiegelt die Beobachtung wider, daß nur eine geringe Menge der biotinylierten Borverbindung die Tumorstellen zu erreichen braucht.
Die Ausführungsformen der Erfindung können durch Beispiele, welche Gesichtspunkte der Erfindung im Detail zeigen, weiter erläutert werden. Diese Beispiele erläutern spezielle Elemente der Erfindung und sollen ihren Schutzumfang nicht beschränken.
1. HERSTELLUNG VON REAGENZIEN
Herstellung und Analyse von Streptavidin-MN-14-Ab-Konjugat:
Ein mit Thiolatgruppe versehendes MN-14-IgG wird mit einem mit Maleimido-Gruppe verbundenen Streptavidin umgesetzt. Eine typische optimierte Konjugation umfaßt die Verwendung eines fünffachen molaren Überschusses an handelsüblich erhältlichem Sulfo-SMCC-Verknüpfer (Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat) zur Streptavidin-Derivatisierung, eines fünffachen molaren Überschusses an 2-Iminothiolan zum Anbringen von Thiolgruppen an MN-14 und eines molaren Verhältnisses an Proteinen von etwa 1 : 1 bei einem pH-Wert von 6,4 für die Kopplung. Präparative HPLC-Reinigungen auf einer Sphenogel-TSK-G 3000-SWG-Säule (Tosohaas, Montgomeryville, PA) unter Verwendung von 0,2 M phosphatgepufterter Kochsalzlösung bei einem pN-Wert von 6,8 trennen das 1 : 1-Konjugat von nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien und Aggregat.
Analyse des Streptavidin-IgG-Konjugats auf SDS-PAGE zeigte ein Molekulargewicht von etwa 210 kDa. Biotin-Bindungstests, die unter Verwendung eines In-111-markierten Biotin-(ITC-Bz-DTPA-) Derivats durchgeführt wurden, zeigten eine Aufnahme von vier Äquivalenten an Biotin-DTPA durch ein Äquivalent Streptavidin-IgG-Konjugat, wodurch sowohl die Konjugatreinheit als auch der Erhalt aller der vier Biotin-Bindungsdomänen in dem Konjugat nachgewiesen wurden.
Kompetitive Bindungsstudien in vitro unter Verwendung von ELISA-Tests haben gezeigt, daß die Bindungsaffinität für das Antigen (CEA) sehr ähnlich zu derenigen von nicht modifiziertem MN-14 war.
In vivo Ansteuerungsexperimente in Tumore aufweisenden GW39-Nacktmäusen unter Verwendung von mit I–125 markiertem SAv-MN14-IgG und mit I–125 markiertem, nicht modifiziertem MN14-IgG zeigten ähnliche Ansteuerungs- und Klärungsmuster, wie sie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt sind.
Tabelle 1 Bioverteilungen von I-131-MN14 (A) und I-125-[SAv-MN14] (B) in Tumor tragenden GW39-Nacktmäusen (% ID/g, n = 5)
Das MN14-Streptavidin-Konjugat, welches nach dem oben beschriebenen Vertahren hergestellt und gereinigt wurde, ist ein bevorzugtes Konjugat für die Verwendung in der ersten Voransteuerungsstufe der vorliegenden Erfindung.
Herstellung von Galaktosyl-HSA-Biotin-Klärmittel:
HSA wird unter Verwendung von handelsüblich erhältlichem Sulfosuccinimidobiotin in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,5-8,0 biotinyliert. Cyanomethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galaktopyranosid wird mit 10% v/v 0,1 M Natriumethoxid in Methanol unter Erzeugung des aminreaktiven Galaktosylthioimidat-Derivats umgesetzt. Stowell et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37: 225-81 (1980). Das biotinylierte HSA, gepuffert bei einem pH-Wert von 7,5–9,0, wird mit verschiedenen Mengen des Thioimidats in molarem Überschuß inkubiert, und der glycosylierte Antikörper wird durch Größenausschlußchromatographie gereinigt.
Das Ausmaß der Glycosylierung wird indirekt durch Bestimmung der verfügbaren Aminogruppen an HSA vor und nach der Glycosylierung gemessen. Dies umfaßt die Umsetzung mit Fluorescamin und die Bestimmung der Fluoreszenzintensität in einem Fluorometer. Stocks et al., Analyt. Biochem., 154: 232-34 (1984).
Die Mengen an Biotinylierung und Galaktosylierung von humanem Serumalbumin, die benötigt werden, um zirkulierendes SAv-MN14 zu komplexieren, ohne am Tumor lokalisiertes Konjugat zu komplexieren, und es schnell aus der Zirkulation zu entfernen, können durch Herstellung verschiedener Konjugate, die sich bezüglich der Substitutionsverhältnisse an Galaktose und Biotin unterscheiden, und Vergleichen der Entfernung optimiert werden.
Dieses Galaktose-HSA-Konjugat ist als ein Klärmittel in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet.
Herstellung einer Biotin-Dextran-Bor-Verbindung:
1. Herstellung eines Sulfhydrylboran-Dextran-Konjugats (Verbindung 3 in Schema 1):
70.000 MW Dextran wird mit Borocaptat unter Anwendung eines veröffentlichten zweistufigen Verfahrens boriert. Holmberg et al., Bioconjugate Chem, 4: 570–73 (1993). Dieses einfache Verfahren umfaßt die Allylierung der Hydroxylgruppen des Dextrans, gefolgt von einer Addition von Borocaptat vom frei-radikalischen Typ. Von diesem Verfahren hat man herausgefunden, daß es 100–125 Borkäfige oder 1.200–1.500 Boratome pro Dextrankette inkorporiert. Das nach diesem Verfahren erhaltene Produkt ist wasserlöslich. Gemäß Holmberg et al., supra, wurden 70% der Hydroxylgruppen allyliert, und eine Effizienz von 50% bei der Borierung von Allyldextran lieferte das Konjugat mit einem Borgehalt von 150 μg Bor/mg und einem Schwefelgehalt von 1,5–4%. Dies entspricht 100–120 Borkäfigen oder 1.200–1.500 Boratomen pro Dextrankette.
Im einzelnen wurde Dextran (2 g, 70 kDa) in wäßriger Lösung mit 29 mmol Allylbromid in der Gegenwart von 12,5 mmol Natriumhydroxid für 2 Stunden bei 60°C allyliert. Nach diesem Zeitraum wurde das Reaktionsgemisch angesäuert, wiederholt aus Aceton präzipitiert, mehrere Male mit Ethanol gewaschen und schließlich dialysiert. Das Zwischenprodukt wurde dann mit 40 mmol Natriumhydroxid basisch gemacht und mit 2,8 g 6-Bromhexansäure bei 70–80°C für 5 Stunden umgesetzt. Die Lösung wurde gekühlt, angesäuert und durch Dialyse gereinigt.
Das doppelt derivatisierte Dextran wird durch Umsetzung von Dextranallylgruppen mit Natriumborocaptat ("BSH" oder NaB₂B₁₂H₁₁SH; Dinatrium-undecahydromercaptoclosododecacarbonat; Boron Biologicals, Raleigh, NC) boriert. Kurz gesagt wurde Allyldextran (20 mg) mit 30 mg Natrium borocaptat und 20 mg Ammoniumpersulfat in 2 ml Wasser für 3 Stunden bei 50°C umgesetzt. Das Zwischenprodukt wird durch PD-10-Säulenchromatographie und wiederholte Dialyse gegen Wasser gereinigt.
Der Borgehalt des Sulfhydrylboran-Dextran-Konjugats wird unter Verwendung von ICP-Atomemissionsspektroskopie sowie anhand des Schwefelgehalts bestimmt. Schwefelanalyse zeigte das Vorhandensein von 124,3 Borkäfigen, wogegen Mikroanalyse des Borgehaltes eine Anzahl von 137 Borkäfigen (1.644 Boratomen) pro Mol Dextran lieferte. Borbestimmungen an nicht biologischen Proben können von kommerziellen Einrichtungen durchgeführt werden (Galbraith Laboratories).
Das mit Carbonsäure derivatisierte borierte Dextran-70 (12,5 mg) wurde mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (12,5 mg) und einem 50-fachen Überschuß an Ethylendiamin bei einem pH-Wert von 5,3 für 4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Überschüssige Reaktanten wurden von dem polymeren Zwischenprodukt durch wiederholte Filtration durch eine Centricon-30-Membran entfernt, und an dem gereinigten Zwischenprodukt wurde ein Pufferaustausch zu 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,7 durchgeführt. Dieses Material wurde mit einem 15-fachen molaren Überschuß an Sulfosuccinimido-Biotin für 1 Stunde umgesetzt und schließlich unter Verwendung einer Centricon-30-Membran gereinigt. Ein HABA-Test zeigte, daß das biotinylierte, borierte Dextran-70 etwa 2 Biotinreste pro Polymereinheit enthielt.
Obwohl in diesem Beispeil Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 kDa verwendet wurde, können in vivo Pharmakokinetiken des borierten Dextrans die Verwendung von Dextran mit entweder höherem oder niedrigerem Molekulargewicht geeignet machen.
2. Carboxyalkylierung von Sulfhydrylboran-Dextran-Konjugat:
Zur Umsetzung mit einem aminhaltigen Biotinanalogon wird das Dextrankonjugat zuerst mit 6-Bromhexansäure derivatisiert, um die notwendigen Carbonsäuregruppen einzuführen. Carboxyalkylierung und die oben beschriebene Allylierungsreaktion sind beide der gleiche Typ von Akylierungsreaktion. Diese zwei Reaktionen können in einem Vorgang kombiniert werden, indem man zuerst Dextran unter basischen Bedingungen mit Allylbromid und anschließend mit Hexansäure umsetzt. Ein ähnlicher Tandem-Vorgang wurde für die Konjugation von Mitomycin mit einem Antikörper unter Verwendung von Dextran als Zwischenträger beschrieben. Noguchi et al., Bioconj. Chem., 3: 132–37 (1992).
Die Reihenfolge der Alkylierung ist so ausgestaltet, daß sie die Menge an eingeführten Carbonsäuregruppen beschränkt, so daß in der nächsten Stufe ein Biotin-Dextran-Verhältnis von etwa 1 erreicht wird. Das Ausmaß an Carboxyalkylierung wird durch Titration mit Natriummethoxid bestimmt. Eine geringfügige Verminderung der Anzahl an Boratomen, die infolge dieser "Doppelderivatisierung" eingebracht werden, sollte aufgrund der großen Anzahl an Boratomen, die nach diesem Verfahren aufgeladen werden können, und aufgrund der vierfachen Vervielfältigung der Boransammlung pro Mol des SAv-IgG-Konjugats, das an den Tumorstellen lokalisiert ist, nicht zu besorgniserregend sein.
3. Biotinylierung von Sulfhydrylboran-Dextran (Schema 1):
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein speziell ausgestaltetes aminhaltiges Biotin-Analogon (Verbindung 7 von Schema 1). Diese Verbindung hat einen Abstandshalterarm zwischen dem Biotinrest und dem Amin-Terminus und eine N-Methyl-Substitution an der Biotin-Peptidbindung. Alternativ kann ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon verwendet werden, das ein Biotin enthält, welches über eine Peptidbindung mit einer nicht natürlichen D-Aminosäure verbunden ist und weiterhin in einer Aminogruppe für die Konjugation an carboxylsubstituiertes Dextran-Borocaptat endet. Diese Eigenschaften der spezifischen Biotin-Peptidbindung verhindern oder minimieren eine Erkennung durch Serumbiotinidasen, und die Verbindungen sind daher stabiler. Evangelatos et al., Analyt. Biochem., 196: 385-89 (1991).
Das aminhaltige Biotinylierungsmittel wird mit carboxyliertem Sulfhydrylboran-Dextran unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodümids ("EDC") und N-Hydroxysulfosuccinimid bei einem pN-Wert von etwa 6 bei Raumtemperatur kondensiert. Die Struktur des erforderlichen Endprodukts ist als Verbindung 4 in Schema 1 gezeigt.
Das Ausmaß der Amidbildung kann durch Variieren des molaren Überschusses an verwendetem Amin gesteuert werden. Noguchi et al., supra. Diese Manipulation kann dazu verwendet werden, die Menge an eingebrachtem Biotin mit dem Ziel zu steuern, durchschnittlich etwa einen Biotinrest pro Dextrankette einzuführen. Endgültige molare Substitutionsverhältnisse erhält man aus Bestimmungen von Biotin-Dextran- und Bor-Dextran-Verhältnissen und aus der Bindung an bekannte Konzentrationen an Streptavidin.
II. TIEREXPERIMENTE
Für Tierexperimente wird ein Nacktmausmodell mit LS174T-Zell-Tumorheterotransplantat verwendet. Tom et al., In-Vitro, 12: 180–91 (1976). Tumorzellen werden in Zellkultur gezüchtet vor einer subkutanen oder intramuskulären Injektion von 5 × 10⁶ Zellen in Nacktmäuse. Tumore benötigen 10–14 Tage, um auf eine geeignete Größe (50–100 mg) zu wachsen, und zu diesem Zeitpunkt sind die Tiere für eine Verwendung bereit.
Es werden 10 μCi/Maus radioiodiertes Antikörper-Konjugat oder biotinyliertes Sulfhydrylboran verwendet. Es werden Gruppen von fünf Mäusen zur Bestimmung der Bioverteilungen zu jedem Zeitpunkt in pharmakokinetischen Studien verwendet, einschließlich der ersten zwei Stufen der Voransteuerung, der Verabreichung des Streptavidin MAb-Konjugats und der Klärungsstufe.
Für die Bioverteilungen unter Verwendung von Tieren, die aufeinanderfolgend in allen der drei Stufen, einschließlich der dritten Stufe der Borauslieferung, verwendet werden, werden bis zu zehn Mäuse pro Zeitpunkt untersucht. Unter diesen werden einige (3 bis 5) ausschließlich für die Bestimmung von Bor-Bioverteilungen verwendet. Diesen codierten Mäusen wird nur kaltes SAv-MN14 und Biotin-Dextran-(Bor)_x gegeben, jedoch mit identischen Protein- und Dextrandosen, aber andererseits werden sie identischen experimentellen Bedingungen ausgesetzt, wie die Nacktmäuse, die mit radioiodierten Verbindungen untersucht werden.
Die Proteindosis des Reagenzes der ersten Stufe (I-131-MN14-SAv), die zur Sättigung von Tumorzellen benötigt wird, und die Zeit der maximalen Tumoransammlung des Konjugats bei dieser Dosis wird durch Verabreichung von 10, 50, 100 und 250 μg des Konjugats (unter Verwendung von zusätzlichem nicht markiertem Konjugat, falls erforderlich) an vier Gruppen der Tumore aufweisenden Mäuse und Bestimmung der Bioverteilungen nach 1, 2, 3 und 5 Tagen für jede Gruppe von fünf Mäusen bestimmt.
Die Immunreaktivität von I-131-markiertem SAv-MN14 wird durch Komplexierung mit einem 80-fachen Überschuß an Antigen CEA (Scripps Clinic, La Jolla, CA) und Untersuchen der Verschiebung der HPLC-Retention in die Nähe des Leervolumens der Säule untersucht. Routinemäßige kompetitive Bindungstests in vitro können ebenfalls mit den SAv-MN14-Präparationen durchgeführt werden.
Die Klärung des zirkulierenden SAv-MN14-Konjugats wird unter Verwendung des oben beschriebenen Biotin-HSA-Galaktosekonjugats untersucht. Dies wird durch Verabreichen von I-125-markiertem zweitem MAb an drei Gruppen von Mäusen (5/Gruppe}, die bereits I-131-SAv/MN14 zum Zeitpunkt der maximalen Tumoraufnahme tragen, durchgeführt. Die Bioverteilungen beider Markierungen werden 2, 4 und 24 Stunden nach der Injektion des zweiten MAb bestimmt.
Tom of al., In-vitro, supra, beschreibt ein Verfahren zur Radioiodierung mit I-131- und I-125-Isotopen unter Verwendung eines Chloramin-T-Verfahrens. Eine typische Radioiodierung ist die folgende: 0,5 M Natriumphosphat, pH 7,4 (50 μl), Antikörper (51 μg/0,85 mCi Iodid) und Chloramin T (4,25 μg) werden dem Reaktionsgefäß, welches radioaktives Iodid enthält, hinzugegeben. Nach etwa einer Stunde wird Natriummetabisulfit (8,5 μg in 50 μl Wasser) hinzugefügt, und das markierte Produkt wird durch Hindurchleiten durch eine PD-10-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die Ausbeute an Radioaktivität beträgt etwa 70%. Dieses Verfahren kann für die Radioiodierung von Streptavidin-MAb-Konjugaten wegen der oxidativen Instabilität von Streptavidin aufgrund von Tryptophan-Resten in dessen Biotinbindungsdomäne jedoch nicht mit Vorteil eingesetzt werden.
Das folgende Verfahren ist bevorzugt: [I-125]-N-Succinimidyl-4-iodobenzoat (1,7 mCi, NEN DuPont) wird in einem Luftstrom für 40 Minuten zur Entfernung des organischen Lösungsmittels getrocknet und mit 200 μg Streptavidin-MAb in 500 μl 0,5 M Boratpuffer bei einem pH-Wert von 9,5 behandelt. Man läßt die Reaktion für eine Stunde bei Raumtemperatur ablaufen, woraufhin die Reaktion durch die Zugabe von 1 M Glycin bei einem pN-Wert von 8,5 abgeschreckt wird, und man läßt das Reaktionsgemisch für eine weitere Stunde stehen. Das radioiodierte SA-MAb-Produkt wird auf einer PD-10-Säule, die in 1% HSA in PBS bei einem pN-Wert von 7,0 äquilibriert wurde, gereinigt. Man erzielt eine radiochemische Ausbeute von etwa 55%.
Es werden ähnliche Bestimmungen zur Untersuchung der Klärung mit anderen Reinigungsmitteln, wie einem anti-idiotypischen Antikörper, durchgeführt.
Für Tierexperimente, welche die dritte Stufe umfassen, nämlich die Borauslieferungsstufe, wird das Klärmittel der zweiten Stufe nicht radioaktiv markiert. Stattdessen wird das Klärungsmuster des ersten Antikörpers unter Verwendung von dessen eigener Markierung aufgezeichnet. Für die Analyse der dritten Stufe wird der Verbleib von I-125-Markierung, die an Antikörper gebunden ist, und von I-131, welches nun an Borkäfige gebunden ist, in in vivo pharmakokinetischen Experimenten untersucht.
Es gibt eine Anzahl von Beispielen für die Iodierung von borierten Verbindungen unter Verwendung verschiedener Verfahren. Vanadanajan of al., Bioconj. Chem., 2: 102-110 (1991). Das Material wird an PD-10-Wegwerfsäulen gereinigt, und die Reinheit wird an einer analytischen Biosep-SEC-S4000-Gnößenausschlußsäule (Phenomenex, Torrance, CA), welche für eine Analyse von Dextranen (Wasser als mobile Phase) geeignet ist, untersucht. Es wird sowohl eine Radioaktivitätsals auch eine Brechungsindexdetektion eingesetzt. Wenn die Untersuchung der Reinheit ergibt, daß sie geringer als 90% ist, wird eine Eliminierung möglicher kleinerer Radioiodverunreinigungen durch einen Centricon 30-Mikrokonzentnator (Amicon, Danvers, MA) erreicht.
Quantitative Borbestimmungen werden durchgeführt, um die biotinylierte Dextran-Bor-Verbindung zu charakterisieren und eine Borakkumulation in vivo in einem Tumor zu verschiedenen Zeiten nach einer Verabreichung der Borverbindung in Tierexperimenten zu bestimmen. Eine Borbestimmung wird an Tiergewebe unter Verwendung des Prompt-γ-Verfahrens durchgeführt, welches für eine Bestimmung von Sub-ppm-Mengen an Bor sensitiv ist. Fainchild et al., Cancer Res., 50: 4860-4865 (1990).
Effizienz eines dreistufigen Vonansteuerungsverfahrens:
Das oben beschriebene SAv-MN14-Konjugat wurde für in vivo Bioverteilungsbestimmungen in Nacktmäusen, die Heterotransplantate von menschlichem Lungenkarzinom tragen, verwendet. Die zweite Stufe, welche die Klärung von zirkulierendem Konjugat umfaßt, wurde entweder unter Verwendung eines galaktosylierten anti-idiotypischen zweiten Antikörpers oder eines Galaktose-HSA-Biotin-Komplexes durchgeführt. Für die dritte Stufe wurde eine In-111-markierte Biotinverbindung, die das oben beschriebene, gegen Biotinidase beständige strukturelle Merkmal enthielt, verwendet. Es wurden ausgezeichnete Tumor-zu-Nicht-Tumor-Verhältnisse für In-111-Bioverteilungen erreicht, wie in Tabelle 2 zu sehen ist. Tabelle 2 spiegelt die Tatsache wider, daß fast das gesamte Konjugat durch Verwendung des Klärmittels der zweiten Stufe aus der Zirkulation entfernt wunde.
Tabelle 2
Bioverteilungen von In-111-markierter Biotinverbindung in GW39-tragenden Nacktmäusen (% ID/g, n = 3) nach Vonansteuerung mit SAv-MN14, Klärung von zirkulierendem Konjugat mit einem Galaktose-HSA-Biotin-Klärmittel und der Verabreichung der Biotinverbindung der dritten Stufe. Die Entfernung des Mittels der ersten Stufe aus der Zirkulation wird durch nicht komplexienbares Konjugat im Blut nachgewiesen. Niedrige Mengen in normalen Organen spiegeln die Abwesenheit von Biotion-Erkennungsstellen des Konjugats wider.
Eine Verbindung der dritten Stufe, welche einen Dextran-Borocaptat-Rest enthält, wie es oben beschrieben ist, erreicht ähnliche Tumor: Nicht-Tumor-Verhältnisse wie solche, die von dieser nicht borierten Verbindung erreicht werden.
III. VERFAHREN ZUM ZIELEN VON BORATOMEN AUF TUMORZELLEN
Das folgende Beispiel erläutert ein zweistufiges Voransteuerungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Die zwei Stufen sind die folgenden:

Stufe 1: Das oben beschriebene SAv-MN14-Konjugat wird einem Krebspatienten verabreicht und an Tumorstellen lokalisieren gelassen.
Stufe 2: Die oben beschriebene biotinylierte Dextran-Borocaptat-Verbindung wird verabreicht und findet sich aufgrund der Affinität zwischen den Biotinresten an der Verbindung und den Streptavidinresten, die sich in Stufe an der Tumorstelle angesammelt haben, ein.

Wenn das Bor an der Tumorstelle lokalisiert ist, kann es gemäß herkömmlicher BNCT-Verfahren bestrahlt werden, um eine Therapie der Tumorzellen zu bewirken.
Das folgende Beispiel erläutert ein dreistufiges Voransteuerungsvertahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Die drei Stufen sind die folgenden:

Stufe 1: Das oben beschriebene SAv-MN14-Konjugat wird einem Krebspatienten verabreicht und an Tumorstellen lokalisieren gelassen.
Stufe 2: Zirkulierendes Konjugat wird unter Verwendung der oben beschriebenen Galaktose-HSA-Biotin-Verbindung entfernt. Biotin-SAv-Komplexierung führt zu einer schnellen Entfernung des mit Galaktose verbundenen Komplexes (Gal-HSA-Biotin-SAv-MN14) aus der Zirkulation durch Asialoglycoprotein-Rezeptoren in der Leber. Ong of al., Cancer Res., 51: 619–26 (1991).
Alternativ kann ein galaktosylierter anti-idiotypischer Antikörper als das Klärmittel verwendet werden.
Stufe 3: Die oben beschriebene biotinylierte Dextran-Borocaptat-Verbindung wird verabreicht und findet sich aufgrund der Affinität zwischen den Biotin-Resten an der Verbindung und den Streptavidinresten, die sich in Stufe 1 an der Tumorstelle angesammelt haben, an den Tumorstellen ein.

Sobald das Bor an der Tumorstelle lokalisiert ist, kann es gemäß herkömmlicher BNCT-Verfahren bestrahlt werden.
Das folgende Beispiel erläutert ein bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren umfaßt folgendes:

1. Verabreichung des oben beschriebenen SAv-MN14-Konjugats an einen Krebspatienten und Lokalisierenlassen des Konjugats an Tumorstellen.
2. Verabreichung eines Klärmittels, wie des oben beschriebenen Galaktose-HSA-Biotin-Komplexes oder eines anti-idiotypischen Antikörpers, zur Entfernung von nicht lokalisiertem Konjugat aus der Zirkulation.
3. Verabreichung einer biotinylierten Dextran-Borocaptat-Verbindung, die mit einer feststellbaren Markierung markiert ist, und Lokalisierenlassen dieser Verbindung an den Tumorstellen aufgrund der Affinität zwischen den Biotinresten an der Verbindung und den Streptavidinresten, die sich in der ersten Stufe an der Tumorstelle angesammelt haben.
4. Feststellen der feststellbaren Markierung an der biotinylierten Dextran-Borocaptat-Verbindung, um sicherzustellen, daß die borhaltige Verbindung an Tumorzellen lokalisiert ist und daß nicht lokalisierte borhaltige Verbindung aus der Zirkulation entfernt wurde.
5. Bestrahlen der Boratome, die an der Tumorstelle lokalisiert sind, wobei BNCT der Tumorzellen bewirkt wird.

Claims

Kit zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen in einem Patienten, welches in getrennten Behältern folgendes umfaßt: (a) eine sterile, injizierbare Präparation einer Zielzusammensetzung mit (i) einem ersten Teil eines spezifischen Bindungspaares und (ii) einem Antikörper oder einem ein Antigen bindenden Antikörperfragment, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment selektiv an ein Antigen bindet, welches von den Tumorzellen produziert wird oder mit diesen einhergeht und an den Tumorzellen vorhanden ist, und (b) eine Borverbindung, welche ein Konjugat umfaßt mit (i) einem komplementären Teil des spezifischen Bindungspaares und (ii) Boratomen.
Kit nach Anspruch 1, welches weiterhin in einem getrennten Behälter eine Klärzusammensetzung enthält.
Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teile des spezifischen Bindungspaares aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem einzelstrangigen Oligonucleotid, einem doppelstrangigen Oligonucleotid, einem Interkalierungsmittel, einem Enzym, einem Enzymsubstrat, Avidin, Streptavidin und Biotin besteht.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Biotin als ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon bereitgestellt wird, welches einen Biotinrest aufweist, der über eine Peptidbindung an eine nicht natürliche D-Aminosäure gebunden ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antikörperfragment ein monoklonaler Klasse III Anti-CEA-Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Klärzusammensetzung eines oder mehrere ausgewählt unter einem galaktosylierten Konjugat von humanem Serumalbumin (HSA) und Biotin, einem anti-idiotypischen Antikörper und einem galaktosylierten anti-idiotypischen Antikörper enthält.
Sterile, injizierbare Borzusammensetzung für die Anwendung am Menschen mit einer Zusammensetzung zur Verwendung beim Zielen von Boratomen auf Tumorzellen, welche eine Borverbindung enthält mit einem Konjugat aus (i) einem Teil eines spezifischen Bindungspaares, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem einzelstnangigen Oligonukleotid, einem doppelstrangigen Oligonukleotid, einem Enzym, einem Enzymsubstrat, Avidin und Biotin besteht, wobei das Biotin als ein gegen Biotinidase beständiges Biotinanalogon bereitgestellt wird, welches einen Biotinrest aufweist, der über eine Peptidbindung an eine nicht natürliche D-Aminosäure gebunden ist, und (ii) Boratomen.
Borverbindung nach Anspruch 7, welche ein Konjugat des Teils des spezifischen Bindungspaares und Dextran, derivatisiert mit 1200 bis 1500 Boratomen, enthält.
Borverbindung nach Anspruch 8, wobei das Dextran mit Natriumborocaptat (NaB₂B₁₂H₁₁SH) derivatisiert ist.
Borverbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Borverbindung mit einer feststellbaren Markierung radioaktiv markiert ist.
Borverbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Teil des spezifischen Bindungspaares in dem Konjugat Biotin ist und die Borverbindung 1 bis 3 Biotinmoleküle pro Molekül der Verbindung enthält.
Verwendung einer Borverbindung nach Anspruch 4, 7, 8, 9, 10 oder 11 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Zielen von Boratomen auf Tumorzellen in einem Patienten, wobei (i) mit der Borverbindung ein Vor-Zielen auf die Tumorzellen durch Verabreichen einer zielenden Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 stattfindet und man die Zusammensetzung sich an dem Ort der Tumorzellen einfinden läßt, und (ii) wobei man die Borverbindung sich am Ort der Tumorellen einfinden läßt.
Verwendung einer Borverbindung nach Anspruch 4, 7, 8, 9, 10 oder 11 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Durchführung einer Borneutroneneinfangtherapie (BNCT) von Tumorzellen in einem Patienten, wobei (i) ein Vor-Zielen der Borverbindung auf die Tumorzellen stattfindet durch (a) Verabreichen einer zielenden Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und indem man die Zusammensetzung sich am Ort der Tumorzellen einfinden läßt, und (ii) man die Borverbindung sich am Ort der Tumorzellen einfinden läßt und (iii) man die Boratome der Borverbindung, die sich an den Tumorzellen eingefunden hat, zur Durchführung von BNCT der Tumorzellen bestrahlt.
Verwendung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei die Borverbindung eine radioaktive Markierung aufweist und der Ort der Borverbindung durch Feststellen der radioaktiven Markierung bestimmt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, welche weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Klärzusammensetzung nach Anspruch 6 verabreicht wird, nachdem man die zielende Zusammensetzung sich am Ort der Tumorzellen hat einfinden lassen.