DE68925974T2

DE68925974T2 - Konjugate zur steigerung der durchlässigkeit der gefässe

Info

Publication number: DE68925974T2
Application number: DE68925974T
Authority: DE
Inventors: Alan Epstein; Michael Glovsky
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1988-10-11
Filing date: 1989-10-11
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2009-10-12
Also published as: IL91933A; AU627785B2; EP0438497A1; EP0438497A4; AU4424589A; JPH04503945A; DE68925974D1; JP2961173B2; ATE135236T1; EP0438497B1; WO1990003801A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung von immunologischen Mitteln und anderen Mitteln mit außergewöhnlichen In-vivo- Spezifitäten, und insbesondere Mittel zur Erhöhung der Penetration und der Bindung von monoklonalen Antikörpern und anderen Makromolekülen, die zur Diagnose und zur Therapie von menschlichen Erkrankungen verwendet werden.

Hintergrund der Erfindung

Die Anwendung von tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) in der gegen mehrere verschiedene Typen menschlicher Krebsarten gerichteten Therapie ist rege untersucht worden (Levy und Miller, Fed. Proc. 42 : 2650 - 2656 (1983)), und es gibt heute eine Anzahl von Berichten über klinische Versuche. Klinische Versuche auf der Ebene von Phase I und II haben überzeugend die Sicherheit dieser Mittel demonstriert, und zwar sogar bei hohen Dosen, aber sie haben auch ergeben, daß monoklonale Antikörper ("mAbs") in vivo nicht so wirksam sind wie erwartet.
Die Wirksamkeit von Antikörpern gegen tumorassoziierte Antigene in der Krebstherapie hängt davon ab, daß die Antikörper ihre Zielzellen entweder durch direkte Cytotoxizität oder durch eine durch das Komplementsystem hervorgerufene Zell-Lyse zerstören können. Die durch das Komplementsystem hervorgerufene Lyse wird ausgelöst, wenn die C1q-Komponente des klassischen Komplementaktivierungsweges an den Fc-Teil von an die Oberfläche von Tumorzellen gebundenen Antikörpern bindet, was zur Bildung des membranattackierenden Komplexes führt. Tumorgebundene Antikörper können ferner die natürlichen Abwehrkräfte des Wirtes verstärken, indem sie mit Effektor-Zellen wechselwirken, die selber die Zielzelle lysieren. Trotz ihrer vielseitigen cytotoxischen Kapazität ist die augenblickliche experimentelle Verwendung von mAbs alleine als cytotoxische Mittel nicht zufriedenstellend. Die Versuche führten zu einigen Remissionen, im allgemeinen aber zeigten die meisten Patienten lediglich geringfügige Reaktionen, die häufig vorübergehend waren (Foon et al., Blood 64 : 1085 - 1093 (1984); Sears et al., Cancer Res. 45 : 5910 - 5913 (1985).
Forscher haben versucht, die therapeutische Wirksamkeit von monoklonalen Antikörpern zu verbessern, indem die Cytotoxizität des Antikörpermoleküls selber durch daran gebundene cytotoxische Radionuklide, Toxine und Arzneistoffe ergänzt wurde (DeNardo, S. et al., Nucl. Med. Biol. 13: 303 - 310 (1986); Hurwitz, E. et al., Cancer Research 35: 1175 - 1181 (1975); Ghose, T. et al., J. Natl. Cancer Inst. 58 : 845 - 852 (1977).
Zur Verbesserung der tumorzerstörenden Kapazität von mAbs ist ferner versucht worden, Immunmodulatoren zu binden, um Antikörperkonjugate zu erhalten, die an der Antikörperbindungsstelle außerdem eine lokale natürliche Immunantwort hervorrufen.
Ein Beispiel für diese Verwendung von Immunmodulatoren sind Konjugate aus Antikörpern und dem Cobragiftfaktor (CVF) (C. Vogel, "Immunoconjugates", Oxford U. Press, New York, (Kapitel 9) (1987)). CVF ist ein Glycoprotein, das die Eigenschaften der C3b, C3/C5-Konvertase des alternativen Komplementaktivierungsweges aufweist. Im Gegensatz zu seinem nativen Analogen wird CVF jedoch nicht durch Komplementkontrollproteine inaktiviert. Das Vorliegen von CVF an zellgebundenen Antikörpern löst die Bildung des membranattackierenden Komplexes aus und führt dadurch zum Zelltod (Vogel, C. und Müller-Eberhard, H., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78 (12): 7707 - 7711; Vogel, C. et al., "Hematology and Blood Transfusion", in Modern Trends in Human Leukemia VI, 29 : 514 - 517, (1985), Berlin, Neth et al.).
Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von Immunokonjugaten, die einen monoklonalen Antikörper und Interferon aufweisen, bei denen das Interferon die Lyse der Zielzellen durch Aktivierung der bereits vorher existierenden zellulären Immunmechanismen, beispielsweise der natürlichen Killerzellen (NK), verstärkt (Flannery, G. et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 20(6): 791 - 798 (1984); Pelham J. M. et al., Cancer Immunol Immunother 15 : 210 - 216 (1983).
Andere Forscher haben die Wirkungen von Immunokonjugaten untersucht, die ein chemotaktisches Mittel, nämlich Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), aufweisen, das die Monozyten/Macrophagen-Konzentrationen am Ort des tumorgebundenen Antikörpers erhöht (Obrist, R., Sandberg, A., Cellular Immunology 81 : 169 - 174 (1983); Obrist, R. et al., Bent 53 : 251 (1986)); Obrist, R., et al. Int. J. Immunopharmacol 5 : 307 - 314 (1983). Durch keinen dieser Versuche wurde jedoch die klinische Wirksamkeit der Antikörper-Tumortherapie wesentlich verbessert.
Im US-Patent 4 771 128 (Ferris, R. und Laird, J.), dessen Aufgabe die Bereitstellung eines cytotoxischen Konjugats ist, wird ein Immunokonjugat aus einem monoklonalen Antikörper und dem Tumornekrosefaktor beschrieben.
Untersuchungen haben gezeigt, daß diese mangelnde klinische Wirksamkeit zum großen Teil darauf beruht, daß unzureichende Mengen an mAbs zum Tumorort transportiert werden. Die Untersuchung des Tumorgewebes mit histochemischen Verfahren vor und nach der Therapie hat ergeben, daß sogar bei hohen Dosen der Tumor nur zum Teil mit Antikörpern gesättigt ist (Lowder et al., Blood 69 : 199 - 210 (1987)). Durch quantitative dosimetrische Untersuchungen unter Verwendung radiomarkierter Antikörperpräparationen ergab sich, daß lediglich ein sehr geringer Prozentsatz der Gesamtdosis tatsächlich an den Tumor bindet (0,05 - 0,2%), und zwar trotz der hohen Spezifität der verwendeten Antikörper oder des erreichten hohen Verhältnisses Tumor:Organ. Untersuchungen mit tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern deuten darauf hin, daß sogar bei guten Tumor: Blut-Konzentrationsverhältnissen die absolute Menge an radiomarkierten mAbs, die pro Gramm Tumor nachgewiesen wird, etwa 0,015% der injizierten Gesamtdosis beträgt (Epenetos et al., Cancer Research 46 : 3183 - 3191 (1986)).
Im Körper findet die Kommunikation und der Transport von Substanzen hauptsächlich über das Kreislaufsystem statt. Allgemein umfaßt das Kreislaufsystem das Blutgefäßsystem und das lymphatische System. Das Blutgefäßsystem, über das Nährstoffe, Sauerstoff, Hormone und andere Substanzen in sämtliche Teile des Körpers transportiert werden, während die Produkte des zellulären Stoffwechsels entfernt werden, umfaßt das Herz und eine Reihe von röhrenförmigen Gefäßen, nämliche die Arterien, Venen und Kapillaren. Die Arterien, die durch Verzweigung beständig zahlenmäßig zunehmen und im Durchmesser abnehmen, leiten das Blut vom Herzen zum Kapillarbett. Die Kapillaren, in denen der Austausch von Elementen zwischen dem Blut und den anderen Geweben stattfindet, bilden ein Netzwerk aus anastomosierenden Röhren. Durch die Venen wiederum gelangt das Blut aus den Kapillaren zurück zum Herzen.
Die Kapillaren bestehen typischerweise aus einfachen Endothelzellen, und verbinden den arteriellen und den venösen Teil des Kreislaufsystems. Das Kapillarennetzwerk ist überall im Körper vorhanden und variiert in den verschiedenen Geweben und Organen in der Größe und in der Form. Die Dichte des Netzwerkes wird im allgemeinen durch die Stoffwechselintensität in einer Region bestimmt. Daher ist das Netzwerk in den Lungen, in der Leber, in den Nieren, in mukösen Membranen, in Drüsen und in der Skelettmuskulatur sowie in der grauen Substanz des Gehirns dicht. Im Geweben wie den Sehnen, Nerven, der glatten Muskulatur und in serösen Membranen hat das Netzwerk große Maschen und ist dünn.
Mit Durchlässigkeit wird das Vermögen bezeichnet, Substanzen durch die Wandungen von Kapillaren zu transportieren. Die Durchlässigkeit variiert regional und unter veränderten Bedingungen lokal.
Im allgemeinen besteht Übereinstimmung darin, daß Tumoren die Bildung einer neuen Blutversorgung induzieren müssen, damit sie über einen Durchmesser von ein paar Millimetern hinaus wachsen können, und die Aufmerksamkeit hat sich stark auf die Mechanismen konzentriert, durch die der Tumor die Angiogenese induziert (vgl. beispielsweise Folkman, J., Adv. Cancer Res. 43 : 175 - 203 (1985)). Auch der Anatomie und der Physiologie der neuen Blutgefäße, die zur Versorgung der Tumoren entstehen, wurde beträchtliche Aufmerksamkeit gewidmet (Id.).
Es besteht allgemein Übereinstimmung darüber, daß Tumorgefäße anatomisch heterogene Strukturen sind. Sie bestehen häufig aus verhältnismäßig undifferenzierten Kanälen, die mit einem einfachen Endothel und mit weniger Perizyten und glatten Muskelzellen ausgekleidet sind, als bei Gefäßen mit vergleichbarer Größe in normalen Geweben zu erwarten wäre. Die funktionellen Eigenschaften von Tumorgefäßen sind umstrittener. Es wurde berichtet, daß die Tumorgefäße entweder stärker oder schwächer auf vasoaktive Mittlersubstanzen ansprechen als normale Gefäße (vgl. z. B. Hori, K. et al., J. Natl. Cancer Inst. 74 : 453 - 459 (1985)). Eine Eigenschaft von Tumorgefäßen, über die bei den meisten Forschern jedoch Übereinstimmung besteht, ist, daß Tumorgefäße im Verhältnis zu normalen Gefäßen für zirkulierende Makromoleküle überdurchlässig sind. Diese Beobachtung ist erklärungsbedürftig, und zwar aufgrund ihrer offensichtlichen Relevanz für das Verständnis der Lokalisierung von monoklonalen Antikörpern und tumorzerstörenden Arzneistoffen in soliden Tumoren (vgl. z. B. Dvorak et al., Am. J. Pathol. 133 : 95 - 109 (1988)). Obwohl kleine Moleküle normale Kapillaren und andere Gefäße mit intakten interendothelialen Zellkontakten frei durchdringen können, ist die Durchlässigkeit des normalen Gefäßsystems für Makromoleküle streng geregelt. Normalerweise werden Makromoleküle im Kreislaufsystem stark zurückgehalten, und es wird angenommen, daß die geringen Mengen, die daraus entweichen können, dies mit Hilfe von Transportvehikeln oder durch die vorübergehende Bildung von transzytoplasmatischen Kanälen durch Endothelzellen schaffen (vgl. z. B., Milici, H. A. et al., J. Cell Biol. 105 : 2603 - 2612 (1987)). Bei Entzündungen ist jedoch die Anzahl entweichender Makromoleküle stark erhöht. Agonisten wie Histamin rufen eine Kontraktion der postkapillären Endothelzellen hervor, was zur Bildung von interendothelialen Zellücken führt, durch die Makromoleküle und sogar Teilchen entkommen können. Ungeachtet der Frage, ob die Tumorgefäßversorgung nun "undicht" ist oder nicht, muß jedoch wiederholt werden, daß viele Untersuchungen zeigen, daß unzureichende Mengen an monoklonalen Antikörpern an den Tumorort transportiert werden.
Es wird angenommen, daß die Gründe für die unzulängliche Perfusion von Tumoren durch Blut hauptsächlich anatomischer Natur sind. Tumorzellen wachsen von einem zentralen Kern aus Zellen radial rasch über ihre Blutversorgung hinaus und lassen einen nekrotischen, mit Sauerstoff unterversorgten Kern zurück. In diesem Fall beträgt der Abstand der Tumorzellen zur nächsten Kapillare etwa 100 bis 150 um, ein Abstand, der groß genug ist, daß es zu einer beträchtlichen Sauerstoffunterversorgung und zu einem Perfusionsdefizit kommt. Diese mit Sauerstoff unterversorgten Zellen sind gegen Bestrahlung widerstandsfähig und sind außerdem für injizierte Arzneistoffe oder Antikörper nicht zugänglich (Kaelin, W. et al., Cancer Research 44 : 896 - 899 (1984); Thomlinson, P. und Gray, L., Br. J. Cancer 9 : 539 - 549 (1955)).
Die Beschränkungen der mAb-Tumortherapie scheinen daher hauptsächlich auf Faktoren zu beruhen, die mit dem Transport in Beziehung stehen, beispielsweise der Fähigkeit des mAb in den Tumor einzudringen und sich am Tumorort zu lokalisieren und dort zu bleiben. Der unzulängliche Transport und die ungenügende Bindung von mAbs an Tumorzellen und die sich daraus ergebende eingeschränkte klinische Wirksamkeit sind das Haupthindernis für ihre Verwendung zur Diagnose und zur Therapie. Die Verwendung von Verstärkungsmitteln wie radioaktiven Spezies, chemotherapeutischen Mitteln und toxischen Stoffen, die an die mAbs gebunden sind, überwindet dieses Hindernis nicht. Solange die mAbs sich am Tumorort nicht gut konzentrieren, ist mit diesen gebundenen Verstärkungsmitteln tatsächlich das Risiko einer erhöhten Schädigung von normalen Geweben verbunden.
Untersuchungen zeigen, daß die Aufnahme von mAbs durch Tumorgewebe gut mit der Gefäßdurchlässigkeit und der Durchblutung korreliert (Sands et al., Cancer Res. 48 : 188 - 193 (1988)). Eine ähnliche Untersuchung zeigt, daß die Verabreichung eines vasoaktiven Mittels unter bestimmten Umständen die Perfusion des Tumors im Verhältnis zu anderen Geweben erhöhen und die Tumoraufnahme und -konzentration von Radiopharmaka erhöhen kann (Bomber, P. et al., J. Nucl. Med. 27 : 243 - 245 (1986)).
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines spezifisch zielorientierten Mittels, das verwendet werden kann, um vor der Anwendung einer tumorzerstörenden Immuntherapie oder Chemotherapie die Gefäßdurchlässigkeit zu erhöhen und/oder das Tumorblutvolumen zu erhöhen, so daß die Therapie wirksamer wird.
Die Überlegungen bezüglich des unzureichenden Transports treffen ferner gleichermaßen auf die Verwendung von spezifisch zielorientierten Mitteln zu, die in vivo für bildgebende diagnostische Zwecke verwendet werden. Eine erhöhte Menge eines zum Tumorort transportierten immundiagnostischen Mittels verbessert die Genauigkeit des diagnostischen Verfahrens und gestattet eine wirksamere Verwendung von diagnostischen Mitteln und gibt den Patienten in solchen Fällen ein größeres Maß an Sicherheit, wenn das immundiagnostische Mittel, beispielsweise mit Radioisotopen markierte Antikörper, mit einem gewissen Risiko verbunden ist. Eine Aufgabe einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist daher die Bereitstellung von Mitteln, die auf ähnliche Weise vor der Anwendung des immundiagnostischen Verfahrens den Transport von immundiagnostischen Mitteln zu einem Tumor durch die spezifische Zielorientierung von vasoaktiven Mitteln auf den Ort erhöhen.
In Chemical Abstracts 109 : 90913w (1988) ist ein Konjugat aus einem an LAK-Zellen gebundenen tumorspezifischen Antikörper offenbart. Diese Literaturstelle enthält jedoch keinen Hinweis auf Konjugate, die einen an vasoaktive Mittel gebundenen Antikörper aufweisen.
Kawase et al., Cancer Research, 48 : 1173 - 1179 (1988) offenbart eine kombinierte Krebstherapie mit einem monoklonalen Antitumor-Antikörper und rekombiniertem IL-2. Immunkonjugate werden jedoch nicht offenbart.

Zusammenfassung der Erfindung

Nach einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Immunokonjugat bereit, das folgendes aufweist:
einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe in einem Säuger befähigt ist, und ein vasoaktives Mittel, das entweder die Gefäßdurchlässigkeit von Gewebe erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, welches an den monoklonalen Antikörper gebunden ist, wobei das Immunokonjugat entweder die Gefäßdurchlässigkeit des Gewebes erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Mittel nicht um den Tumornekrosefaktor, Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), den Cobragiftfaktor oder eine Zelle handelt.
Die Erfindung stellt Immunokonjugate bereit, die an monoklonale Antikörper (mAbs) gebundene biologisch aktive Mittel aufweisen, welche eine vasoaktive Reaktion hervorrufen können. Die mAbs haben die Fähigkeit zur bevorzugten Bindung an neoplastisches Gewebe wie Tumorzellen oder Tumor- Ghost-Zellen, wenn sie einem Wirt in vivo verabreicht werden. Das biologisch aktive Mittel wird auf diese Weise an der Stelle mit dem neoplastischen Gewebe lokalisiert, an der es eine Reaktion hervorruft, durch die über Gefäßerweiterung und Erhöhung der Gefäßdurchlässigkeit oder durch den Mechanismus einer entzündlichen Reaktion der lokale Blutkreislauf und die lokale Blutversorgung des Tumorgewebes verbessert werden. Die Zunahme des Blutvolumens im Tumor gestattet, daß therapeutische und diagnostische Mittel, die im Anschluß daran in den Wirt eingeführt werden, den Tumor vollständiger durchdringen können und daher in einer höheren und wirksameren Dosis zugeführt werden.
Die Verwendung von wirksamen vasoaktiven Konjugaten vor der Anwendung einiger immuntherapeutischer Verfahren verstärkt nicht nur die Wirkung der Therapien, sondern verringert auch beträchtlich das Risiko schädlicher Nebenwirkungen bei der Verwendung von Antikörperkonjugaten, die cytopathische Substanzen wie antineoplastische Arzneistoffe, Toxine oder Radionuklide aufweisen. Diese Antikörperkonjugate, die ungebunden im Kreislauf bleiben, können zur unbeabsichtigten Zerstörung von normalem Gewebe führen, und zwar insbesondere Geweben von Organen des renalen, hepatischen und retikuloendothelialen Systems, die sie aus dem Körper entfernen müssen. Durch die Erhöhung der relativen Dosis, die an den Zielturmor binden kann, ermöglichen die vasoaktiven Konjugate die Verwendung einer niedrigeren effektiven Dosis, wodurch sich die Menge an dem ungebundenen zirkulierenden cytotoxischen Mittel und das Risiko für das normale Gewebe verringert.
Obwohl die Bezeichnung "Immunokonjugate" überall in der Beschreibung verwendet wird, wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß ein aus mindestens einem immunoaktiven Rest bestehendes Konjugat nur ein Beispiel für eine Reihe von diversen Konjugaten ist, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
Es werden solche monoklonalen Antikörper selektiert, die nach der intravenösen ("i.v.") Verabreichung die Fähigkeit zur bevorzugten Bindung an Tumoren oder an Blutgefäße und an verwandte Strukturen in entzündeten Bereichen oder in an strukturell abnormale Blutgefäße am Tumorort haben. Das vasoaktive Mittel wird auf diese Weise selektiv am Ort des Tumors oder der Entzündung lokalisiert, wo es eine weitere Erhöhung der Durchlässigkeit hervorruft. Diese Erhöhung ist ortsselektiv und erleichtert den Übertritt von anschließend i.v. verabreichten therapeutischen Mitteln aus dem Blut in die Gewebe an den Orten.
Die selektive Erhöhung der Durchlässigkeit, die durch diese vasoaktiven Antikörperkonjugate ausgelöst wird, dient zur Erhöhung des Anteils oder der Dosis der i.v. verabreichten Mittel, der/die den Ort erreicht, an dem die gewünschte therapeutische Wirkung eintreten soll. Dadurch wird nicht nur die therapeutische Wirkung verstärkt, sondern auch das Risiko von schädlichen Nebenwirkungen durch toxische Metaboliten oder durch die Entwicklung von immunologischen Überempfindlichkeitsreaktionen beträchtlich erniedrigt.
Nach einem bevorzugten Aspekt ist das Konjugat groß genug, daß es das normale, gesunde Gefäßendothel nicht durchdringen kann, aber das Gefäßendothel von Tumorgewebe durchdringen kann. Bei einer anderen Variante erhöht das Mittel die Gefäßdurchlässigkeit an einer Wirkstelle im Gefäßendothel oder ruft an einer Wirkstelle im Gefäßendothel eine lokale entzündliche Reaktion hervor oder verstärkt diese. Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung schlägt ein Vasokonjugat in Kombination mit einem antineoplastischen Radioisotop oder einem antineoplastischen Toxin vor. Der monoklonale Antikörper wird hier als Beförderungsvehikel verwendet. Beide Bezeichnungen werden hier synonym verwendet.
Nach einem weiteren Aspekt schlägt die vorliegende Erfindung ein Abbildungsverfahren zur Verwendung für die Diagnose von neoplastischem Gewebe vor, bei dem einem das Gewebe aufweisenden Wirt eine wirksame Menge eines Beförderungsvehikels verabreicht wird, das die Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe hat, wobei das Beförderungsvehikel an ein Mittel konjugiert ist, das die Blutversorgung des neoplastischen Gewebes erhöht, und gleichzeitig oder danach ein Tumorabbildungsmittel an den Wirt verabreicht wird. In einer weiteren Ausführungsform wird das diagnostische Mittel in Form eines Konjugats verabreicht, das ein an das Tumorabbildungsmittel konjugiertes Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe aufweist.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Immunokonjugate bereitgestellt, die monoklonale Antikörper mit der Fähigkeit zur Lokalisation an Tumoren oder in der Umgebung von strukturell abnormen Blutgefäßen, neuen Blutgefäßen oder entzündeten Blutgefäßen am Tumorort umfassen, wobei diese Konjugate außerdem ausgewählte Vasoaktivatoren enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der monoklonale Antikörper eine Spezifität für subendotheliale Bestandteile der Blutgefäßwandung auf, die in entzündeten Gefäßen oder in strukturell abnormen Gefäßen wie sie in Tumoren vorgefunden werden für zirkulierende Antikörper zugänglich werden. Diese Zielantigene umfassen Fibronectin, Laminin und Typ IV-Kollagen. In einer weiteren Ausführungsform weisen die Antikörper eine Spezifität für Bestandteile der Blutgerinnungskaskade auf, die in den Wandungen oder in der unmittelbaren Umgebung von entzündeten Blutgefäßen oder in den nekrotisierenden Bereichen des Tumors aktiviert werden. Diese Antigene umfassen Fibrin, Thrombin und Bestandteile des Komplementsystems. Antikörper mit diesen Spezifitäten sind verfügbar. In einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper mit einer Spezifität für Antigene verwendet, die selektiv auf endothelialen Zellen in entzündeten Blutgefäßen exprimiert werden, nicht aber in normalen Gefäßen. Diese Antigene umfassen verschiedene Zellhaftmoleküle, die für das Anhaften von polymorphkernigen Leukozyten an entzündete Blutgefäßwandungen verantwortlich sind. Das Blutgerinnungsprodukt Fibrin ist ein besonders vorteilhaftes Ziel für diesen Ansatz. Fibronectin, das in den Blutgefäßen subendothelial verteilt ist und durch strukturelle Abnormitäten oder durch Änderungen der Durchlässigkeit freigelegt wird, ist ein weiteres Ziel, auf das sich dieser Ansatz konzentriert.
Bei einer weiteren erfindungsgemäß vorgeschlagenen Ausführungsform ist ein vasoaktiver Rest an einen für den Tumor spezifischen mAb chemisch gebunden. In diesem Fall bewirkt der mAb die Lokalisation des vasoaktiven Restes am Tumorort während oder nach der Bindung an Tumorzellen im Tumor. Der vasoaktive Rest wirkt dann auf die umgebenden Gefäße im unmittelbaren Bereich der mAb-Bindung ein.
In einer weiteren erfindungsgemäß vorgeschlagenen Ausführungsform ist ein Beförderungsvehikel auf molekularer Ebene an ein vasoaktives Mittel gebunden, d. h. durch die Konstruktion einer "Kassette", die in einen Organismus eingeführt wird, wobei die Kassette als Minimum die Gene enthält, die das Beförderungsvehikel und das gefäßwirksame Peptid kodieren. Die Kassette könnte in einer weiteren Ausführungsform ferner Regulationssequenzen enthalten. Die Kassette könnte in das Genom des Organismus, in ein Plasmid oder in einen Vektor wie einen Virus oder einen Retrovirus eingeführt werden, um ein Beispiel zu geben.
Die Erfindung offenbart weiterhin mindestens drei Antigenmarker für die Tumorgefäßversorgung oder die "undichte" Gefäßversorgung, welche die neue Tumorgefäßversorgung emuliert, und schlägt deren Verwendung zur Konstruktion von Beförderungsvehikeln vor, die zur spezifischen Lokalisation an Tumororten, in entzündeten Geweben, in Abszessen und an ähnlichen Stellen, die "undichte" Gefäße enthalten, befähigt sind.
Daher werden nach einem Aspekt der Erfindung Immunokonjugate bereitgestellt, die einen monoklonalen Antikörper mit der Fähigkeit zur Lokalisation an der Stelle mit neoplastischen Gewebe (mAb) und ein daran gebundenes vasoaktives Mittel aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der mAb eine Spezifität für Tumorzellen, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat der mAb eine Spezifität für Antigene, die mit den Zellen des B-Zellen- Lymphoms verbunden sind. Nach dieser Ausführungsform kann es sich bei dem monoklonalen Antikörper um Lym-1 oder Lym-2 handeln.
Nach einer Ausführungsform umfaßt das vasoaktive Mittel ein Peptid, und in einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Tachykinin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Tachykinin aus der aus Phyllomedusin, Physalaemin und der Substanz P bestehenden Gruppe ausgewählt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das vasoaktive Peptid ein Leukotrien. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Leukotrien aus der aus B4, C4, D4 und E4 bestehenden Gruppe ausgewählt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das vasoaktive Peptid ein Anaphylatoxin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Anaphylatoxin aus der aus C3a und C5a bestehenden Gruppe ausgewählt.
Nach einer weiteren Ausführungsform ist das vasoaktive Peptid ein Lymphokin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Lymphokin aus der aus Interleukin-1, Interleukin-2 und dem Tumornekrosefaktor bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vasoaktive Peptid der chemotaktische Faktor ECF-A.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vasoaktive Peptid ein Entzündungserreger. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Entzündungserreger aus der aus Mastoparan und Bestatin bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vasoaktive Peptid eine Protease. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Protease aus der aus Trypsin, Chyase und Thrombin bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vasoaktive Mittel ein vasoaktives Kohlenhydrat. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Kohlenhydrat aus der aus Glucan und Proteoglucanen bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vasoaktive Mittel ein Lipid. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Lipid aus der aus dem plättchenaktivierenden Faktor und Prostaglandinen bestehenden Gruppe ausgewählt. Alternativ kann das Lipid derivatisiert sein, wie z. B. der Arzneistoff Viprostol.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das vasoaktive Mittel ein biogenes Amin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Amin Histamin.
Der mAb des Immunokonjugats kann ein intaktes Immunglobulin sein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der mAb ein Immunglobulinfragment sein, das aus der einwertigen HL- Isoform besteht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem mAb um einen solchen, von dem der Fc-Teil entfernt wurde. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt der mAb in Form des F(ab')2-Teils vor.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bereitgestellt, bei dem einem Tumorwirt ein vasoaktives Immunokonjugat verabreicht wird, wobei das Immunokonjugat einen mAb oder ein anderes Beförderungsvehikel aufweist, der/das die Fähigkeit zur Lokalisation an der Stelle mit dem neoplastischen Gewebe hat, das Immunokonjugat an das Tumorgewebe binden und die vasoaktive Wirkung des Immunokonjugats eintreten gelassen wird, und entweder gleichzeitig oder danach ein therapeutisches Mittel an den Tumorwirt verabreicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das verabreichte therapeutische Mittel ein cytotoxisches chemisches Mittel. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das verabreichte therapeutische Mittel ein cytotoxisches immunologisches Mittel.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Diagnose eines Tumors bereitgestellt, bei dem an den Tumorwirt ein vasoaktives Immunokonjugat verabreicht wird, wobei das Immunokonjugat einen mAb mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem neoplastischen Gewebe aufweist, das Immunokonjugat an das Tumorgewebe binden und die vasoaktive Wirkung des Immunokonjugats eintreten gelassen wird, und dann entweder gleichzeitig oder danach an den Wirt ein immundiagnostisches Mittel verabreicht wird.
Außerdem werden nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Konjugate bereitgestellt, die ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Lokalisation an der Stelle mit neoplastischem Gewebe und ein an das Beförderungsvehikel gebundenes Mittel aufweisen, wobei das Mittel die Wirkung eines davon verschiedenen antineoplastischen Mittels gegen das Gewebe durch Erhöhung von dessen Blutversorgung verstärkt. Eine weitere Ausführungsform schlägt ein Konjugat mit einer ausreichenden Größe vor, so daß dieses normales, gesundes Gefäßendothel nicht durchdringen kann, aber das Gefäßendothel von Tumorgewebe durchdringen kann.
In einer weiteren Ausführungsform erhöht das Mittel an einer Wirkstelle im Gefäßendothel die Gefäßdurchlässigkeit, während in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Mittel an einer Wirkstelle im Gefäßendothel eine lokale entzündliche Reaktion hervorruft oder verstärkt.
In verschiedenen Ausführungsformen der offenbarten Erfindung kann das Mittel beispielsweise einen Arzneistoff, ein vasoaktives Peptid, ein biogenes Amin oder eine pharmazeutische Verbindung umfassen. Entsprechend kann das Konjugat beispielsweise ein Kohlenhydrat wie ein Glucan oder Proteoglucan aufweisen, oder es kann ein Lipid wie den plättchenaktivierenden Faktor oder Prostaglandine aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform hat das Beförderungsvehikel eine Spezifität für subendotheliale Bestandteile der Blutgefäßwandung, die in entzündeten Gefäßen und in strukturell abnormen Gefäßen, wie sie in Tumoren vorgefunden werden, für zirkulierende Antikörper zugänglich werden. Diese Bestandteile umfassen ohne Beschränkung Fibronectin, Laminin und Typ-IV-Collagen.
Eine weitere Ausführungsform offenbart ein Beförderungsvehikel mit einer Spezifität für Bestandteile der Blutgerinnungskaskade, die in den Gefäßwandungen, in der unmittelbaren Umgebung von entzündeten Blutgefäßen oder in den nekrotischen Bereichen des Tumors aktiviert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Bestandteile Fibrin, Thrombin und Bestandteile des Komplementsystems.
In einer weiteren Ausführungsform hat das Beförderungsvehikel eine Spezifität für Antigene, die selektiv in oder auf endothelialen Zellen in entzündetem Gefäßgewebe wie dem in der Umgebung von Tumoren vorgefundenen exprimiert werden, aber nicht in nicht-entzündetem Gefäßgewebe. Die von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen Antigene umfassen Zellhaftmoleküle, die für das Anhaften von polymorphkernigen Leukozyten an entzündetes Gefäßgewebe verantwortlich sind, Fibrin, Fibronectin, Fibrin-Abbauprodukte, Zellenzyme, Blutplättchen und Zellprodukte von Blutblättchen. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Enzyme Peroxidasen oder andere Proteine, die in nekrotischen oder entzündeten Geweben freigesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung schlägt ferner ein Verfahren zur Behandlung oder zur Diagnose von neoplastischem Gewebe vor, bei welchem dem Wirt des Gewebes eine wirksame Menge eines Beförderungsvehikels mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe verabreicht wird, wobei der Antikörper an ein Mittel konjugiert ist, das die Wirkung eines davon verschiedenen antineoplastischen Mittels gegen das Gewebe durch Erhöhung von dessen Blutversorgung verstärkt, und gleichzeitig oder danach an den Wirt ein zweites Konjugat verabreicht wird, das ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe, an das ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel konjugiert ist, aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Immuntherapie von neoplastischem Gewebe vorgeschlagen, bei dem einem Tumorwirt eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Konjugats verabreicht wird, und gleichzeitig oder danach dem Tumorwirt ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe zur darauf gerichteten Therapie verabreicht wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Immuntherapie von neoplastischem Gewebe vorgeschlagen, bei dem einem Wirt des Gewebes eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Konjugats verabreicht wird, und gleichzeitig oder danach an den Wirt ein zur Therapie des Gewebes bestimmtes pharmakologisches Mittel verabreicht wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Immundiagnose von neoplastischem Gewebe offenbart, wobei bei dem Verfahren an einen Wirt des Gewebes eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Konjugats verabreicht wird, und gleichzeitig oder danach an den Wirt ein zweites Konjugat verabreicht wird, das ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe und ein daran gebundenes nachweisbares Mittel aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Immuntherapie von entzündetem Gewebe offenbart, bei dem einem Tumorwirt eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Konjugats verabreicht wird, und gleichzeitig oder danach dem Tumorwirt ein zweites Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Konzentration an der Stelle mit dem Gewebe zur darauf gerichteten Therapie verabreicht wird.
Ferner wird hier ein Verfahren zur Immuntherapie von entzündetem Gewebe offenbart, bei dem einem Wirt des Gewebes eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Konjugats verabreicht wird, und gleichzeitig oder danach dem Wirt ein pharmakologisches Mittel zur Therapie des Gewebes verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung schlägt außerdem ein Verfahren zur Konstruktion eines Konjugats für pharmazeutische Zwecke vor, bei dem ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe, oder ein solches kodierende Nukleotide, an mindestens ein Mittel, das die Blutversorgung von neoplastischem Gewebe erhöht, oder an ein solches kodierende Nukleotide, konjugiert wird. Die vorliegende Erfindung schlägt ferner einen therapeutischen Kit vor, der folgendes aufweist: ein Konjugat, das ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Lokalisation an der Stelle mit dem neoplastischen Gewebe und ein Mittel, das an das Beförderungsvehikel gebunden ist und die Blutversorgung des neoplastischen Gewebes erhöht, aufweist, und ein antineoplastisches therapeutisches Mittel. Außerdem offenbart die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, der folgendes aufweist: ein Konjugat, das ein Beförderungsvehikel mit der Fähigkeit zur Lokalisation an der Stelle mit dem neoplastischen Gewebe und ein Mittel, das an das Beförderungsvehikel gebunden ist und die Blutversorgung des neoplastischen Gewebes erhöht, aufweist, und ein Tumorabbildungsmittel.
Schließlich wird nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Ausführungsform ein Verfahren zur genetischen Konstruktion eines Konjugats vorgeschlagen, bei dem mindestens ein Mittel, oder dieses kodierende Nukleotide, an mindestens ein Beförderungsvehikel, oder dieses kodierende Nukleotide, gebunden wird/werden.
Diese und weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden weiteren Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen und der beigefügten Patentansprüche klarer.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht die Wirkung des Lym/IL-2- Immunokonjugats auf die Aufnahme von radiomarkiertem Lym-1- F(ab')&sub2; in Raji-Zellen beherbergenden Nacktmäusen.
Fig. 2 veranschaulicht die Wirkungen, die durch Koinjektion von IL-2 und des Vasokonjugats Lym-1/IL-2 in ein Lymphom beherbergenden Nacktmäusen hervorgerufen werden.
Fig. 3 veranschaulicht die Wirkungen einer stufenweise erhöhten Vordosierung mit dem Lym-1/IL-2-Vasokonjugat auf die Tumoraufnahme eines I-125-Lym-1-F(ab')&sub2;-Markers.
Fig. 4 veranschaulicht die Wirkungen des Verabreichungszeitpunkts des Lym-1/Il-2-Vasokonjugats in ein Lymphom beherbergenden Nacktmäusen.

Detaillierte Beschreibung

Es wurde gezeigt, daß systemisch verabreichte vasoaktive Mittel in Tumorgefäßen umfangreichere Veränderungen auslösen als in normalen Gefäßen (vgl. z. B. Cater et al., Br. Cancer 20 : 517 (1966)). Dieser Effekt kann maximiert werden, indem vasoaktive Mittel an monoklonale Antikörper oder andere Reste gebunden werden, die an Moleküle in der Gefäßwandung, oder in der unmittelbaren Umgebung, von abnormen Blutgefäßen in Tumoren binden. Diese Anmeldung ist daher eine Erweiterung unserer oben zitierten früheren Anmeldung, in der Antikörper mit einer Spezifität für Tumorzellen mit vasoaktiven Mitteln konjugiert wurden, um eine Änderung der Durchlässigkeit zu induzieren. Die vorliegende Anmeldung unterscheidet sich davon durch die Erkenntnis, daß Änderungen der Durchlässigkeit effektiver erreicht werden können, indem Antikörper mit einer Spezifität für Bestandteile der Blutgefäßwandung oder andere Moleküle in der unmittelbaren perivaskulären Umgebung verwendet werden, und zwar als Alternative zur Verwendung von Antikörpern gegen Tumorzellen, die einen gewissen Abstand von den Blutgefäßen haben können und daher von den im Blutstrom zirkulierenden Antikörpern nicht "gesehen" werden.
Vorzugsweise haben die zu verwendenden Antikörper folgende Eigenschaften. Erstens behalten sie im Anschluß an die chemische Konjugation an verschiedene vasoaktive Mittel ihre Fähigkeit zur Bindung mit dem Antigen. Zweitens binden sie nicht an irgendwelche Bestandteile des Bluts oder des normalen, intakten, nicht-entzündeten Endothels. Drittens zeigen sie nur eine geringe oder gar keine Neigung, durch das Endothel von normalen Blutgefäßen vom Blut in die Gewebe überzugehen. Viertens binden sie an Moleküle, die selektiv in oder in der Nähe von entzündeten oder strukturell abnormen Blutgefäßen, d. h. vielen Gefäßen in Tumoren, exprimiert werden. Schließlich befördert der konjugierte Antikörper nach der Bindung die vasoaktiven Verbindungen direkt an die Wirkstelle in der Blutgefäßwandung. Die sich daran anschließende explosionsartige Änderung der Durchlässigkeit begünstigt die weitere Bindung von monoklonalen Antikörpern an die Stelle, wodurch sich physiologische Änderungen in den Tumorgefäßen ergeben, während normale Gefäße nicht betroffen werden.
Unmittelbar nach der Induktion dieser lokalen Änderung der Durchlässigkeit und/oder Erhöhung der Tumordurchblutung zeigt ein potentielles therapeutisches Mittel, z. B. ein Arzneistoff oder ein monoklonaler Antikörper, das/der intravenös injiziert wird, einen bevorzugten Durchtritt vom Blut in die Gewebeflüssigkeit an der abnormal durchlässigen Stelle. Durch diesen Mechanismus wird der Prozentsatz der zum Tumorort beförderten Dosis eines verabreichten Mittels in den hier beschriebenen Untersuchungen 2- bis 6-fach erhöht. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Beförderung von Antikrebsmitteln, und zwar entweder Arzneistoffen, monoklonalen Antikörpern oder Konjugaten aus monoklonalen Antikörpern und Arzneistoffen, Toxinen oder Radioisotopen, an die Tumorstelle zu verbessern.
Die gleichen Überlegungen gelten für: 1) die Beförderung eines Antikörper-Isotopen-Konjugats zu Tumorstellen zum Erhalt einer verbesserten Radioabbildung, 2) die Beförderung von antimikrobiellen Mitteln zu Stellen, an denen durch infektiöse Agentien eine Entzündung verursacht wurde, um die Konzentration an dem Mittel in der Umgebung des Organismus zu erhöhen, ohne die an den Patienten zu verabreichende Gesamtdosis zu erhöhen, und 3) die Beförderung von verschiedenen entzündungshemmenden Arzneistoffen zu Stellen mit akuter oder chronischer Entzündung überall im Körper, um die schädlichen Wirkungen der Entzündung zu unterdrücken. In jedem Fall geht der i.v.-Verabreichung des gewählten therapeutischen Mittels eine i.v.-Injektion des Konjugats aus dem Antikörper und dem vasoaktiven Mittel, das zur Erzeugung einer vorübergehenden Erhöhung der Durchlässigkeit an der gewünschten Wirkstelle des therapeutischen Mittels konstruiert wurde, voraus.
In einer weiteren Ausführungsform werden monoklonale Antikörper gegen Makromoleküle verwendet, die in strukturell abnormen Gefäßen in nekrotischen Bereichen in Tumoren oder entzündeten Geweben dem Blutstrom ausgesetzt werden. Diese Antigene umfassen Fibrin-Abbauprodukte und verschiedene Zellenzyme wie beispielsweise Peroxidasen, die von Granulozyten oder anderen Zellen in nekrotischen oder entzündeten Geweben freigesetzt werden.
Die verschiedenen vasoaktiven Verbindungen zur Bindung an die Antikörper sind den im folgenden beschriebenen analog und umfassen Peptide, Kohlenhydrate, Lipide und deren Derivate.
In einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper mit einer Spezifität für Antigene verwendet, die selektiv auf endothelialen Zellen in entzündeten Blutgefäßen exprimiert werden, nicht aber in normalen Gefäßen. Diese Antigene umfassen verschiedene Zellhaftmoleküle, die für das Anhaften von polymorphkernigen Leukozyten an entzündete Blutgefäßwandungen verantwortlich sind. Das Blutgerinnungsprodukt Fibrin ist ein besonders bevorzugtes Ziel für diesen Ansatz. Fibrin ist normalerweise im Blutstrom nicht vorhanden und existiert lediglich in Form eines zirkulierenden Vorläufermoleküls, nämlich Fibrinogen, das ein Molekulargewicht (MW) von etwa 340 Kilodalton (KD) hat.
Desgleichen ist Fibrin in normalem Gewebe oder normalen Gewebeflüssigkeiten nicht vorhanden. Fibrinogen kommt ebenfalls in Gewebeflüssigkeiten nicht vor, weil sein hohes Molekulargewicht das Entweichen aus dem Blut durch normales, intaktes Endothel ausschließt.
Beim Vorliegen von Endothelschädigungen oder erhöhter Durchlässigkeit kann Fibrinogen jedoch in die Gewebe entweichen, wo es durch die Aktivierung von intravaskulären Gerinnungsmechanismen rasch in Fibrin umgewandelt wird. Daher bilden sich an der Stelle mit der geänderten Durchlässigkeit Fibrin-Ablagerungen. In Tumoren finden sich Fibrin-Mikroablagerungen besonders in den Kapillarsprossen und in der Umgebung von Blutkanälen, denen eine vollständige Endothelauskleidung fehlt.
Fibrinogen dient ferner aufgrund seines charakteristischen Molekulargewichts als Marker für Undichtigkeiten in Gefäßen. Desweiteren wird sein Nachweis dadurch erleichtert, daß es sich unmittelbar nach dem Entweichen aus dem Gefäß in ein unlösliches Produkt umwandelt. Gegen Fibrin gerichtete monoklonale Antikörper (die mit Fibrinogen nicht reagieren) zeigen daher ein selektives Homing für durchlässige Gefäße, die durch Freisetzung von Fibrinogen und Fibrin- Ablagerung "markiert" sind.
Fibronectin, das in Blutgefäßen in einer subendothelialen Verteilung vorliegt und durch strukturelle Abnormalität oder durch Änderung der Durchlässigkeit freigelegt wird, ist ein weiteres Ziel, auf das sich dieser Ansatz konzentriert (vgl. z. B. Christensen et al., Cancer 1988; Dvorak et al., NEJM 315 : 1650 (1986); und Jain, Cancer Res. 48: 2641 (1988)).
Ferner können auch andere Ausführungsformen der vasoaktiven Konjugate wirksam sein, beispielsweise solche, welche die extravaskuläre Penetration und Bindung von monoklonalen Antikörpern sowie anderen Arzneistoffen oder Molekülen verbessern können. So wie die hier offenbarten Konjugate eine verbesserte Wirksamkeit ergeben, wenn große Moleküle verwendet werden, können auch kleinere Moleküle wie chemotherapeutische Arzneistoffe eine erhöhte Penetration und Bindung zeigen.
Die Immunokonjugate der Erfindung werden nach genetischen Konzepten hergestellt, oder indem ein ausgewählter klinisch verwendbarer mAb kovalent oder auf andere Weise an ein ausgewähltes biologisch aktives Mittel, das eine Entzündung hervorruft und vorzugsweise vasoaktiv ist, gebunden wird. Das Verknüpfungsmittel und das chemische Verfahren zur Zusammensetzung des Immunokonjugats sollten so ausgewählt bzw. durchgeführt werden, daß die Bindung des Antikörpers an Zielzellen oder die Stimulation natürlicher Abwehrmechanismen durch das vasoaktive Mittel in ihrer Wirksamkeit nicht gefährdet werden.

Auswahl von Beförderungsvehikeln

1. Monoklonale Antikörper

Geeignete monoklonale Antikörper zur Verwendung in der Erfindung umfassen nicht nur solche mit einer Spezifität für Antigene, die nur auf Tumorzellen vorkommen, sondern auch solche, die eine entsprechende Spezifität für Antigenen auf normalen Geweben haben. Die wesentliche Eigenschaft ist, daß diese monoklonalen Antikörper gemäß dem Zweck der Erfindung als Träger wirken können, die vasoaktive Mittel vorzugsweise am Tumorort konzentrieren. Geeignete monoklonale Antikörper können solche mit einer Spezifität für Antigene wie beispielsweise interzelluläre Substanzen sein, die entweder in Tumorgewebe häufiger vorkommen oder leichter gebunden werden als in normalem Gewebe. Ein Beispiel ist der im US-Patent 4 861 581 offenbarte Antikörper gegen Kernantigene.
Einige mAbs gegen Antigene von Tumoren oder normalen Zellen, die sich zur Verwendung in den Immunokonjugaten der Erfindung eignen, sind im Handel erhältlich (Centocor, Malvern, PA; Hybritech. San Diego, CA). Andere können nach dem gut eingeführten Hybridom-Verfahren von Köhler und Milstein, (Nature 256 : 495 (1975)), hergestellt werden, wobei im Handel erhältliche Kits dieses Verfahren erleichtern. Zur Herstellung von Hydridom-Zell-Linien werden Splenozyten von mit dem Tumorantigen immunisierten Mäusen mit Zellen einer nicht-sekretierenden Maus-Myelom-Fusions- Zell-Linie wie P3X63-Ag8.653 (American Type Culture Collecton, Rockwell, MD) gemäß den dem Kit, beispielsweise dem HyBRL Prep Kit (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD), beigefügten Anweisungen fusioniert. Die fusionierten Hybridom-Zellen werden dann in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten überführt, wo sie mehrere Tage gezüchtet werden. Die Überstände in den Vertiefungen werden mit einem beliebigen geeigneten Immunoassay, beispielsweise einem ELISA, auf gebildete mAbs gegen Tumor- oder zelluläre Antigene untersucht, und mit den positiven Hybridom-Zell- Linien, d. h. solchen, die geeignete mAbs bilden, werden Permanentkulturen hergestellt. Die mAbs können aus den Überständen dieser Kulturen durch Gelchromatographie, beispielsweise unter Verwendung der Protein-A-Affi-Gel-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA), gereinigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden für Lymphomzellen spezifische, im Handel erhältliche mAbs verwendet, nämlich Lym-1 und Lym-2 (Techniclone International Inc., Tustin, Californien)
Die Eignung der tumorspezifischen mAbs für die In-vivo- Anwendung wird durch die Bioverteilung, die zelluläre Lokalisation, die selektive Bindung und die Clearance- Geschwindigkeit aus dem Tumorwirt oder einem Tiermodell für den Tumorwirt bestimmt. Das Verhalten der zusammengesetzten Immunokonjugate kann auch durch parallele Untersuchungen bestimmt werden. Die Untersuchungen zur Beurteilung der Eignung werden zweckmäßigerweise mit Hilfe von markierten mAbs durchgeführt, beispielsweise ¹³¹I-mAbs, die beispielsweise nach dem modifizierten Chloramin-T-Verfahren von McFarlane, A., Biochem. J. 62 : 135 - 143 (1956) radiojodiert wurden.
Die Immunreaktivität der radiomarkierten Antitumor-mAbs kann mit einem In-vitro-Radioimmunoassayverfahren mit lebenden Zellen bestimmt werden, beispielsweise mit dem in Beispiel 1 für die Lym-1- und Lym-2-mAbs beschrieben (vgl. Epstein, A. et al., Malignant Lymphomas and Hodgkin's Disease: Experimental und Therapeutic Advances, Martinus N&ijlig;off Publ. Co., Boston (1985), S. 569 - 577).
Die Wirksamkeit eines Antitumor-mAbs in vivo kann durch geeignete Radioabbildungs-, Bioverteilungs- und histologische Studien sowie autoradiographische Verfahren bestimmt werden, die nach dem Injizieren des markierten mAbs in den tumortragenden Wirt durchgeführt werden.
Die Fähigkeit des mAb zur selektiven Konzentration am Tumorort wird durch Radioabbildung bestimmt. Nach der Injektion des radiomarkierten mAb werden unter Verwendung einer Gammaszintillationskamera mit einem Lochblendenkollimator an aufeinanderfolgenden Tagen Gammaszintigrammbilder (100 000 cpm) des anästhesierten Wirts aufgenommen. Die Kamera ist vorzugsweise über eine Schnittstelle mit einem Computersystem verbunden. Zur Quantifizierung der Daten wird ein geeigneter ¹³¹I-Standard mit der gleichen Aktivität ausgezählt.
Zu einem optimalen Zeitpunkt, der sich durch die Abbildungsuntersuchungen ergibt, wird das Wirtstier getötet und das Blut, die Hauptorgane und das Tumorgewebe werden entnommen und gewogen und dann zur Bestimmung der Bioverteilung des mAb ausgezählt. Außerdem kann das Tumorgewebe fixiert und eingebettet werden, woraufhin Gewebeschnitte durch Autoradiographie zur Bestimmung des an den Tumor gebundenen radiomarkierten mAb untersucht werden.
Der mAb des Immunokonjugats kann entweder ein intakter ganzer Antikörper, die monovalente HL-Isoform, der F(ab')&sub2;- Teil des Antikörpers oder ein Fab-Antikörperfragment sein. Die Entfernung des gesamten oder eines Teils des Fc-Teils eines Antikörpermoleküls, wobei aber die Antigenbindungsstellen intakt bleiben, kann dessen Anwendung erleichtern, weil Stellen oder Domänen entfernt werden, die mit Nicht- Tumorbestandteilen wie Fc-Rezeptoren oder dem Komplement wechselwirken. Antikörperfragmente wie Fab, HL und F(ab')&sub2;, die 1/3, 1/2 bzw. 2/3 des Gewichts des gesamten Antikörpers haben, können die Kapillarwandungen durchdringen und diffundieren leichter durch das interstitielle Gewebe und können so rascher zum Tumor diffundieren. Andererseits werden die Fab-, HL- und F(ab')&sub2;-Fragmente jedoch rascher aus dem Kreislauf geklärt. Wilbonk et al., Cancer 48: 1768 - 1775 (1981), fanden bei Fab-Fragmenten höhere Bindungsverhältnisse Tumor zu Organ, aber eine dreifach höhere absolute Konzentration des vollständigen Antikörpers im Tumor. Wahl et al., J. Nucl. Med. 24 : 316 - 325 (1983), haben bei Untersuchungen unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen die carcinoembryonalen Antigene (CEA) gefunden, daß F(ab')&sub2;-Fragmente den besten Kompromiß zwischen den rasch geklärten Fab-Fragmenten und dem langsam geklärten vollständigen Antikörper darstellen. Fab-Fragmente können durch Abbau des vollständigen Antikörpers mit Papain hergestellt werden, oder durch Abbau des vollständigen Antikörpers zu F(ab')&sub2;-Fragmenten mit Pepsin und anschließenden Abbau der Disulfid-Bindungen zwischen den Ketten unter Erhalt von einwertigen Fragmenten (vgl. Porter, R., Biochem. J. 73 : 119 (1959)). HL-Fragmente können nach der in Nature 194 : 355 (1962) oder PNAS (USA) 50: 314 - 321 (1963) angegebenen Technik hergestellt werden.

Auswahl von vasoaktiven Mitteln

Die vasoaktiven Immunokonjugate der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich in ihrer Wirkungsweise von Arzneistoff- und Toxin-Immunokonjugaten. Arzneistoff- und Toxinkonjugate werden zur direkten Abtötung von Tumorzellen verwendet. Vasoaktive Konjugate werden verwendet, um die Blutzufuhr und/oder die Durchlässigkeit der Gefäße des Tumors zu erhöhen, so daß die extravasuläre Penetration und Bindung von monoklonalen Antikörpern und anderen Arzneistoffen oder Molekülen in vivo verbessert wird. Sie können durch Erhöhung des Tumordurchblutungsvolumens oder Erhöhung der "undichten Stellen" der Tumorblutgefäße direkt oder durch Auslösung einer entzündlichen Immunreaktion am Tumorort indirekt wirken. Die Entzündung kann durch chemotaktische Faktoren ausgelöst werden, durch die polymorphkernige Leukozyten, Makrophagen, eosinophile Zellen, basophile Zellen, Mastzellen, T-Zellen und andere mit Entzündungen verbundene Zellen angelockt werden. Wenn diese Zellen stimuliert werden, sezernieren sie Immunmodulationsfaktoren, die dann auf die Tumordurchblutung und die Blutgefäßdurchlässigkeit einwirken und den Prozentsatz der injizierten Dosis, die zum Tumor penetriert und daran bindet, erhöhen.
Vasoaktive Mittel mit der beschriebenen Reaktivität am Tumorort, die zur Bindung an monoklonale Antikörper in Form eines Immunokonjugats geeignet sind, finden sich in verschiedenen biochemischen Klassen, die beispielsweise Peptide, Kohlenhydrate und Lipide und deren Derivate umfassen.
Die Peptide, und zwar sowohl natürliche, synthetische als auch rekombinierte, stellen die häufigste Quelle für vasoaktive Mittel dar, die sich zur Verwendung in Immunokonjugaten eignen.
Die Tachykinine sind eine Familie von Deca-, Enceda- und Dodecapeptidamiden, die einen Phenylalanin(Phe)-Rest in Position 5 vom COOH-Terminus aufweisen. Sie haben kräftige pharmakologische Wirkungen auf den Blutdruck, die nichtvaskuläre glatte Muskulatur und die exokrinen Drüsen (Erspamer, V., TINS, Nov. 1981, S. 267 - 269). Die Substanz P, ein Säuger-Tachykinin, fördert die Gefäßerweiterung und den Austritt von Plasma aus den Gefäßen durch gegenläufige Stimulation von chemosensitiven Nervenfasern (Lambeck, F. und Halzer, P., Naunyn-Schmeideberg's Arch. Pharmacol. 310: 175 - 183 (1979)). Substanz P verursacht ferner die Freisetzung von Histamin aus Gewebe-Mastzellen (Hagermark, O. et al., J. Invert. Dermatol. 71 : 233 - 235 (1978)). In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Substanz P und ein Amphibien-Analoges, nämlich Physalaemin, an klinisch verwendbare mAbs konjugiert, um die Erweiterung der Tumormikrogefäße zu fördern.
Die Leukotriene sind Sulfidopeptide, bei denen es sich um kräftige Mittlerstoffe der atopischen Allergie handelt. Die Wirkung dieser Mittlerstoffe auf Blutgefäße und die damit verbundene entzündliche Reaktion ist für die klinischen Erscheinungsformen und physikalischen Merkmale der Erkrankung verantwortlich. 1 nmol der Leukotriene C&sub4;, D&sub4; oder E&sub4; ruft Hautrötung und Quaddelbildung hervor. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Leukotriene B&sub4;, C&sub4;, D&sub4; und E&sub4; an klinisch verwendbare mAbs konjugiert, um eine lokale entzündliche Reaktion am Tumorort hervorzurufen.
Anaphylatoxine sind Peptidfragmente, die während der Aktivierung des Serumkomplementsystems freigesetzt werden. Die enzymatische Spaltung der Komplement-Proteine C3 und C5 setzt die Aktivierungspeptide C3a bzw. C5a frei. Diese Peptide werden als Anaphylatoxine bezeichnet, weil sie eine Reaktion hervorrufen können, die dem anaphylaktischen Schock ähnelt. Sowohl C3a als auch C5a können die Gefäßdurchlässigkeit erhöhen und Serotonin und Histamin enthaltende Granula aus Gewebe-Mastzellen freisetzen. C5a ist außerdem, und zwar möglicherweise in Zusammenwirkung mit C3a, ein chemotaktischer Wirkstoff, der die Wanderung und die Aggregation von neutrophilen Zellen auslöst (vgl. Nagata, S. et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 82: 4 - 9 (1987)). In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind C3a, C5a, oder deren biologisch wirksamen Peptidsequenzen, entweder einzeln oder in Kombination an tumorspezifische mAbs konjugiert und werden zur Erzeugung einer lokalen entzündlichen Reaktion am Tumorort verwendet, nämlich als alternatives Konzept zur Erhöhung der extravasulären Penetration von monoklonalen Antikörpern.
Die biologische Aktivität dieser Peptide kann mit synthetischen Oligopeptiden reproduziert werden, die 8 bis 21 Aminosäuren lang sind und die Reste enthalten, die natives C3 an seinem COOH-terminalen Ende aufweist (vgl. z. B. Hugli, T. und Erickson, B., PNAS USA 74 : 1826 - 1830 (1977)).
Die Lymphokine, welche die Interleukine IL-1 und IL-2 und den Tumornekrosefaktor (TNF) umfassen, sind endogene Stimulatoren der Immunreaktion, die bei der Verteidigung eines Organismus gegen fremde Agentien in komplexer Weise wirken und wechselwirken (vgl. z. B. Kampschmidt, R., J. Leukocyte Biol. 36 : 341 - 355 (1984)).
IL-2 ist zur Verwendung in Immunokonjugaten besonders wichtig. Dieses Lymphokin hat selber keine Antitumorwirkung, es scheint aber eine starke Wirkung zu haben, wenn es mit Lymphokin aktivierten Killerzellen (LAK) verabreicht wird. Seine Verwendbarkeit als Antitumormittel scheint eingeschränkt zu sein, weil es aufgrund seiner Fähigkeit, Gefäßdurchlässigkeit und Extravasation hervorzurufen, im Wirt aufgrund der Zurückhaltung von Flüssigkeit schwere Nebenwirkungen hervorruft (vgl. Fairman, R. et al., Cancer Res. 47 : 3528 - 3532 (1987); Rosenstein et al., J. Immunol. 137 : 1735 - 1742 (1986)). Die vasoaktiven Eigenschaften von IL-2 eignen sich jedoch gut für dessen Verwendung in den Immunokonjugaten dieser Erfindung. Da IL-1 die Bildung von IL-2 in Lymphozyten stimuliert und TNF synergistische Eigenschaften in Verbindung mit anderen Lymphokinen zu haben scheint, könnten ihre Immunokonjugate in Kombination mit denen mit IL-2 nützlich sein (vgl. Talmadge et al., Cancer Res. 47 : 2563 - 2570 (1987); Philip, R. und Epstein, L., Nature 323, 4. Sept., S. 86 - 89 (1986)).
Wie im Fall des C3a-Anaphylatoxins können kleine synthetische Oligopeptide, welche die funktionelle Region von Interleukin aufweisen, sich ebenfalls zur Verwendung in den Immunokonjugaten eignen (vgl. z. B. Antoni, G. et al., J. Immunol. 137 : 3201 - 3204 (1986)).
Eine weitere Gruppe von Peptiden, die sich zur Verwendung in den vasoaktiven Immunokonjugaten eignen, sind die menschlichen eosinophilen sauren Tetrapeptide (ECF-A), nämlich Val-Gly-Ser-Glu und Ala-Gly-Ser-Glu, die durch Chemotaxis eine lokale Eosinophilie fördern können (Turnball, L. et al., Immunology 32 : 57 - 63 (1977)).
Außerdem sind bestimmte Peptide, nämlich die Entzündungserreger, in der Lage, Mastzellen am Tumorort zu degranulieren, wodurch Histamin freigesetzt und eine lokale entzündliche Reaktion hervorgerufen wird, wenn sie in vasoaktiven Immunokonjugaten verwendet werden. Ein derartiger Entzündungserreger, nämlich Mastoparan, ist ein Tetradecapeptid, das aus dem Wespengift isoliert wurde (Okano, Y. et al., Fed. Europ. Biochem. Soc. 188(2): 363 - 366 (1985)). In einer bevorzugten Ausführungsform wird Mastoparan, das entweder aus der natürlichen Quelle isoliert oder synthetisch hergestellt wurde, an einen tumorspezifischen mAb gebunden (vgl. Hirai, Y, et al., Chem. Pharm. Bull. 27(8): 1942 - 1944 (1979)).
Die Proteasen, die aus Mastzellen durch immunologische Aktivierung freigesetzt werden, scheinen Überempfindlichkeitsreaktionen in der Haut hervorzurufen. Die möglichen Wirkungen dieser Proteasen umfassen den Abbau der Basalmembran der Blutgefäße, was eine erhöhte Gefäßdurchlässigkeit und den Einstrom von sekundären Entzündungszellen zur Folge hat. Tryptase, eine dem Pankreas-Trypsin ähnliche Endopeptidase, ist ein Tetramer, das aus zwei 35-Kilodalton- und zwei 37-Kilodalton-Untereinheiten zusammengesetzt ist. Sie ist die Hauptprotease der menschlichen Lungen- Mastzellen und ist in den Mastzellen an allen anderen Orten vorhanden. Chymase, die in menschlichen Haut-Mastzellen vorgefunden wird, hat eine ähnliche Spezifität wie Pankreas-Chymotrypsin (Serafin, W. und Austin, K., NEJM, 2. Juli, S. 30 - 34 (1987)). In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Tryptase und Chymase an tumorspezifische mAbs konjugiert, um eine lokale entzündliche Reaktion am Tumorort hervorzurufen.
Bestimmte Lipid-Verbindungen können in Form von Immunokonjugaten wirksam sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der plättchenaktivierende Faktor (PAF) das vasoaktive Mittel des Immunokonjugats. PAF ist ein Phospholipid, das von menschlichen neutrophilen Zellen gebildet wird und ein kräftiger Mittlerstoff der Immunantwort zu sein scheint (vgl. Braquet, P. und Rola- Pleszezynski, M., Immunology Today, 8(11): 345 - 352 (1987)). PAF ist anscheinend mit allen Entzündungs- und Immunprozessen verbunden, beispielsweise im Hinblick auf die oben angegebenen vasoaktiven Peptide. PAF stimuliert die Freisetzung der Substanz P und löst die Bildung von anderen vasoaktiven Mitteln, beispielsweise der Leukotriene oder Prostaglandine, aus. Seine Verwendung in Immunokonjugaten kann die Wirkung dieser anderen Mittel verstärken, und zwar sowohl endogen als auch durch Verwendung in komplementären Immunokonjugaten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das blutdrucksenkende Mittel Viprostol, ein Prostaglandin- Derivat (American Cyanamid, Pearl River, NY), das aktive Mittel in dem Immunokonjugat. Viprostol erniedrigt den arteriellen Blutdruck hauptsächlich durch Gefäßerweiterung (vgl. Chan, P. et al., J. Hypertension 4(6): 741 - 746 (1986)). Die Verwendung einer tumorspezifischen, zielorientierten Viprostol-Dosis erweitert die Gefäße des Tumors, so daß das Blutvolumen darin erhöht wird.
Auf ähnliche Weise können in anderen Ausführungsformen die natürlichen Prostaglandine (PGE's) oder synthetische Analoge, die bekanntermaßen blutdrucksenkende Wirkungen besitzen, wirksam verwendet werden (vgl. Birnbaum et al., J. Medicinal Chem. 25(5): 492 - 494 (1982)).
Histamin, ein Bestandteil der Mastzellengranula, die durch Immunstimulation freigesetzt werden, wirkt über zwei Rezeptortypen, die mit H&sub1; und H&sub2; bezeichnet werden, und erzeugt u. a. eine erhöhte Durchlässigkeit der Venen und eine Gefäßerweiterung, wie sie für die Leukotriene beschrieben wird (Serafin, W. und Austin, K., NEJM, 2. Juli, S. 30 - 34 (1987)). In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist Histamin an tumorspezifische mAbs konjugiert, um eine lokale entzündliche Reaktion am Tumorort hervorzurufen.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den wirksamen Mitteln der Immunokonjugate um vasoaktive Kohlenhydrat-Verbindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem vasoaktiven Kohlenhydrat um Glucan. Glucan ist eine β-1,6-verknüpfte Polyglucose, die aus Saccharomyces cerevisiae stammt und eine Anzahl von immunverstärkenden Wirkungen besitzt (Glovsky, M. et al., J. Reticuloendothelial Society 33 : 401 - 413 (1983)), aber im Gegensatz zum Interleukin IL-2 ungiftig ist (vgl. Sherwood, E. et al., J. Biological Response Modifiers 7: 185 - 198 (1988)). Glucan scheint seine Wirkungen durch die Stimulation des Komplementsystems auszuüben, durch die, abgesehen von anderen Komplement-Fragmenten, die vasoaktiven Peptide C3a und C5a gebildet werden. Mit Hilfe von spezifischen mAbs auf Tumoren ausgerichtetes Glucan könnte lokal durch C3a und C5a die Gefäße des Tumors erweitern.
Die Moleküle zur Konjugation werden entsprechend der Verfügbarkeit und der Eignung zur Erreichung der Ziele der Therapie oder der Untersuchung ausgewählt.

Chemische Konjugationsverfahren

Die strukturelle Verknüpfung zwischen dem mAb, dem Makromolekül oder dem Mikroteilchen und dem vasoaktiven Mittel und das chemische Verfahren, durch das sie verbunden werden, sollten so ausgewählt werden, daß das Bindungsvermögen des mAb und die biologische Aktivität des Mittels nur minimal beeinflußt werden, wenn sie zu dem Konjugat verknüpft werden.
Die wirksamstem Konjugationsverfahren können unter den folgenden Verfahren ausgewählt werden:
a) Carbodiimide können als Anhydride von Harnstoffen betrachtet werden. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (ECDI) bildet Vernetzungen zwischen dem Antikörper und dem daran zu konjugierenden Stoff, und zwar ungeachtet der Orientierung jedes Moleküls. Die Konjugate ergeben sich durch Kondensation des Antikörpers mit dem zu konjugierenden Stoff unter sauren Bedingungen mit ECDI. Dieses Verfahren ist ein rasches und einfaches Mittel zur Konjugation (vgl. Goodfriend, T. et al., Science 144: 1344 - 1346 (1964)). Die Verwendung von ECDI zur Bindung von Physalaemin oder Interleukin-2 an Lym-1 oder Lym-2 ist in den Beispielen 2 und 7 veranschaulicht.
b) N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) ist ein heterodifunktionelles Reagens, das Thiol-Gruppen am Amino-Terminus von Proteinen einführt und wurde zur Herstellung einer Anzahl von Immunokonjugaten verwendet (Carlsson, J. et al., Biochem. J. 173 : 723 - 737 (1978)).
c) Die Anwendung des SMCC-Verfahrens zur Konjugation von C3a an F(ab')&sub2;-Fragmente von mAbs ist in Beispiel 3 veranschaulicht.
d) Die von Shen et al. beschriebene cis-Aconitsäure- Verknüpfung hat die Eigenschaft, daß der konjugierte Stoff bei niedrigem pH-Wert freigesetzt wird, beispielsweise in einem sekundären Lysosom im Anschluß an die Endozytose des rezeptorgebundenen Antikörpermoleküls. Das Verfahren gestattet die Konjugation an die Kohlenhydratseitengruppen der Antikörpermoleküle (Shen, W.-C. und Ryser, H., Biochem. Biophys. Res. Comm. 102(3): 1048 - 1054 (1981)). Die Anwendung der cis-Aconityl-Derivatisierung und Konjugation des Arzneistoffes Viprostal an einen mAb ist Beispiel 4 veranschaulicht.
e) Die Perjodat-Oxidation kann angewendet werden, um Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen in einem Zuckerring zu oxidieren und zu spalten. Die freigelegten Endgruppen können dann an NH&sub2;-Gruppen in Proteinen gebunden werden, und zwar in Form einer Schiff'schen Base, die mit NaBH&sub4; reduziert wird (Kitao, T. und Hattori, K., Nature 265, 6. Januar, S. 81 - 82 (1977)). Die Anwendung der Perjodat- Oxidation zur Konjugation von Glucan an einen mAb ist in Beispiel 5 veranschaulicht.
f) N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert eine endständige COOH-Gruppe, beispielsweise die eines Peptids, so daß ein aktives Ester-Derivat gebildet wird, das kovalent an das Protein des monoklonalen Antikörpers gekuppelt werden kann. Dieses Verfahren wurde angewendet, um 30 Moleküle Chlorambucil/Antikörper mit geringem Verlust an Bindungsaktivität zu binden (Smyth, M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 76(3): 503 - 510 (1986)). Die Anwendung des NHS- Verfahrens zur Konjugation von Mastoparan an einen mAb ist in Beispiel 6 veranschaulicht.

Gentechnische Verfahren zur Konstruktion von Vasokonjugaten

Als alternatives Verfahren zur chemischen Bindung von vasoaktiven Mitteln an mAbs kann die genetische Sequenz der vasoaktiven Peptide in die Sequenz des mAbs konstruiert werden, nämlich wie in Beispiel 11 veranschaulicht.

Verwendung von vasoaktiven Immunokonjugaten

Vor der In-vivo-Anwendung werden die Immunokonjugate in vitro mit dem von Bindon et al., Br. J. Cancer 47 : 123 - 133 (1983), beschriebenen und in Beispiel 8 veranschaulichten Proliferationsradioimmunoassay untersucht, um die beibehaltene Immunreaktivität und biologische Aktivität des Produkts zu bestimmen. Für die In-vivo-Versuche werden nur solche Immunokonjugate verwendet, die im Vergleich mit dem unkonjugierten Antikörper eine Immunreaktivität von höher als 80% aufweisen.
Ein erfolgreiches Immunokonjugat maximiert die Effektivität von auf monoklonalen Antikörpern beruhrenden diagnostischen und therapeutischen Verfahren in der Klinik. In der Klinik wird das vasoaktive Immunokonjugat vor oder mit der immundiagnostischen, chemotherapeutischen oder immuntherapeutischen Dosis verabreicht, so daß die Tumorgefäße von den wirksamen Mitteln darin leichter durchdrungen werden können. Die zur Erzeugung des maximalen vasoaktiven Effekts erforderliche Zeit hängt von dem gewählten speziellen Konjugat und dessen Wirkungsmechanismus ab. Es ist klar, daß im Falle der Verabreichung vor der mAb-Dosis, der minimale Zeitraum zwischen der Verabreichung des vasoaktiven Immunokonjugats und der Verabreichung des diagnostischen oder therapeutischen Mittels mindestens etwa 20 min beträgt. Der maximale Zeitraum beträgt etwa 72 h. Das optimale Interval zwischen dem Verabreichungszeitpunkt des vasoaktiven Immunokonjugats und der Verabreichung der Dosis kann durch Tierversuche oder geeignete Untersuchungen am Tumorwirt experimentell bestimmt werden, und zwar mit den oben beschriebenen Abbildungs- und Bioverteilungs-Untersuchungen und histologischen Verfahren unter Verwendung eines markierten Immunokonjugats.
Die zu verabreichende Dosis an dem vasoaktiven Immunokonjugat ist von der medizinischen Beurteilung und Erfahrung abhängig, und zwar sowohl im objektiven als auch im subjektiven Sinn. Ein ausreichendes Maß für eine wirksame Dosis ist jedoch die Menge, die erforderlich ist, um die Lokalisation eines anschließend verabreichten diagnostischen oder therapeutischen Mittels in einem Ausmaß zu erhöhen, das sich die klinische Wirksamkeit der Therapie oder die Genauigkeit der Diagnose statistisch signifikant erhöht. Behandelte und unbehandelte Tumorwirtstiere, an die äquivalente Dosen des diagnostischen oder therapeutischen Mittels verabreicht wurden, werden verglichen. Sofern zutreffend, beispielsweise bei der Verwendung von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln, die für normales Gewebe giftig sind, handelt es sich bei einer wirksamen Dosis eines vasoaktiven Konjugats um eine solche, bei der derartige toxische Wirkungen entsprechend verringert sind.
Die immundiagnostische Dosis kann einen mAb mit einer Spezifität für einen Tumor und einer in vivo nachweisbaren Markierung aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist dieser Marker ein radioaktives Isotop auf. Die immuntherapeutische Dosis kann entsprechend einen klinisch verwendbaren mAb aufweisen. Dieser mAb kann ferner an ein tumorzerstörendes Mittel gebunden sein, beispielsweise an ein Radioisotop, an einen chemotherapeutischen Arzneistoff oder an ein Toxin.

Beispiel 1

Immunreaktivität von radiomarkierten monoklonalen Antikörpern

Raji-Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS, das 1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,02% Natriumazid enthielt, gewaschen (vgl. z. B. J. Nat'l Cancer Inst. 37 : 547 - 559 (1966) bezüglich einer Beschreibung der Raji-Zellen und Verfahren zu deren Erhalt). Die Zellen (5 · 10&sup5;) wurden in 100 µl Waschpuffer resuspendiert und in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Immulon Removawell Strips; Dynatech Labs., Inc., Alexandria, VA) pipettiert. Die Mikrotiterplatten waren in der vorhergehenden Nacht mit BSA (10 mg/ml) in PBS mit Azid vorbehandelt worden, um zu verhindern, daß die Antikörper-Lösungen an die Wandungen binden (im Handel erhältliche mAbs, die für Lymphom-Zellen spezifisch sind, nämliche Lym-1 und Lym-2, sind von Techniclon International, Inc., Tustin, Californien zu beziehen). Dann wurden radiomarkierter Lym-1 und Lym-2 (100 000 cpm/Vertiefung) in einem Volumen von 100 µl/Vertiefung dazugegeben, worauf die Platten 30 min bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln inkubiert wurden. Dann wurden die Platten viermal durch 5minütiges Zentrifugieren bei einer Drehzahl von 1000 min&supmin;¹ gewaschen, worauf die Überstände mit einer Vielfachmikropipette mit 12 Spitzen abgesaugt wurden. Dann wurden die Zellen unter Verwendung einer Titertek-Mehrkanalpipette (Flow Labs, McLean, VA) in 200 µl Waschpuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Vertiefungen mechanisch getrennt und in einem Gammazähler zur Quantifizierung der an die Zellen gebundenen Markermenge ausgezählt.

Beispiel 2

Konjugation von Physalaemin an monoklonale Antikörper mit dem CDI-Verfahren

Physalaemin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde nach dem Carbodiimid-Verfahren an die monoklonalen Antikörper Lym-1 und Lym-2 konjugiert. Physalaemin, Lym-1 oder Lym-2 und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl-1)carbodiimidmetho-p- toluolsulfonat (CDI) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurden in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 3,6 : 36 vermischt und bei Raumtemperatur bei pH 5,0 20 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Dialyse über Nacht gegen PBS, pH 7,2, beendet. Das Konjugat wurde durch Superose-FPLC-Säulenchromatographie (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und bei 4ºC in PBS aufbewahrt.

Beispiel 3

Konjugation des C3a-Peptids an monoklonale F(ab')&sub2;- Antikörper mit dem SMCC-Verfahren

Das C3a(57-77)-Peptid wurde unter Verwendung eines difunktionellen Reagens, nämlich Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), an monoklonale F(ab')&sub2;-Antikörper gekuppelt (M. Herman, et al., "Antipeptide antibody of predetermined specificity recognize and neutralize the bioactivity of the panspecific hematopoietic IL-3", J. Immunol. 138 : 1099 - 1104, (1987)).
Die monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung von Pepsin in F(ab')&sub2;-Fragmente gespalten, um die unspezifische Bindung an Leukozyten durch den Fc-Teil des Antikörpers zu vermeiden. Das C3a(57-77), das einen N-terminalen Cystein- Rest enthielt, wurde unter Anwendung der automatisierten Protein-Synthese synthetisiert. Das C3a-Peptid (1 mg) wurde in 300 µl 4M Guanidinium-PBS, pH 7,5, gelöst. Der pH-Wert wurde durch Dialyse gegen etwa 3 l 17%ige H&sub3;PO&sub4; auf einen Wert zwischen 3 und 4 eingestellt. Diese Lösung wurde in ein Auffangröhrchen (17 · 100 mm) gegeben.
Der F(ab')&sub2;-Antikörper (60 nmol) wurde in 1,0 ml PBS, pH 7,5, gelöst und mit 2400 nmol "Reagens" (SMCC), das in Dimethylformamid (DMF) gelöst war, umgesetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das F(ab'&sub2;)-Gemisch wurde auf eine Sephadex-G-10-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) (2 ml) aufgetragen, 1 min bei 1500 g zentrifugiert und in dem Auffangröhrchen gesammelt. Die Säule wurde mit 300 µl PBS, pH 7,5 gewaschen und wieder zentrifugiert. Dann wurde der pH auf einen Wert zwischen 7,0 und 7,7 eingestellt, woraufhin das Gemisch 3 h bei Raumtemperatur gerührt wurde.
Der konjugierte Antikörper wurde bei 4ºC aufbewahrt.
C5a wurde unter Verwendung der difunktionellen Vernetzungsreagentien Dimethylsuperimidat oder SPDP an F(ab')&sub2;-Antikörper gekuppelt. Die Bedingungen wurden so eingestellt, daß 1/1-C5a-F(ab)&sub2;-Konjugate gebildet und die Polymerisation von entweder C5a oder F(ab)&sub2; alleine minimiert wird.

Beispiel 4

Konjugation von Viprostol an monoklonale Antikörper durch cis-Aconityl-Derivatisierung

Viprostol kann derivatisiert werden, indem ein cis- Aconityl-Spacerarm über seine 11-Hydroxy-Gruppe angefügt wird. Bei dieser Umsetzung wurde Viprostol (5 mg) in einem Reagenzglas in 1 ml 0,1M Na&sub2;HPO&sub4; gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Dann wurde langsam ein molarer Überschuß (5 mg) cis-Aconitylanhydrid (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI) unter Rühren zu der Lösung gegeben, wobei der pH-Wert durch vorsichtige Zugabe von 1N NaOH zwischen 8 und 9 gehalten wurde. Durch Dünnschichtchromatographie von Proben wurde das Fortschreiten der Umsetzung verfolgt. Als Markierung kann ³H- oder ¹&sup4;C-markiertes Viprostol zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden, so daß das Fortschreiten der Umsetzung durch Autoradiographie der Dünnschichtplatten verfolgt werden kann. Die Abtrennung und Reinigung des Derivats kann durch Ansäuern und Reinigung des Produkts oder mit einem säulenchromatographischen Verfahren erfolgen. Um Viprostol an monoklonale Antikörper zu konjugieren, wurde eine Lösung des Viprostol-cis-Aconityl- Derivats zu einer Lösung gegeben, welche die monoklonalen Antikörper Lym-1 oder Lym-2 enthielt. Anschließend wurde das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur bei pH 5,0 inkubieren gelassen. Dann wurde die Umsetzung abgebrochen, und das Konjugat wurde durch Elution der Probe durch eine Sephadex- G-25-Säule oder durch Superose-FPLC-Säulenchromatographie gereinigt.

Beispiel 5

Konjugation von Glucan an monoklonale Antikörper durch Perjodat-Oxidation

Das Glucan wurde durch Anwendung der Perjodat-Oxidation zur Spaltung eines seiner Zuckerreste ohne Beeinträchtigung seiner Bioaktivität unter Verwendung lediglich eines 1 bis 2fachen molaren Überschusses an NaIO&sub4; vorsichtig oxidiert. Die durch die Oxidation in dem Glucan gebildeten Aldehyd- Gruppen reagieren mit -NH&sub2;-Gruppen an den monoklonalen Antikörpern unter Bildung einer Schiff'schen Base. Die Verknüpfung über die Schiff'sche Base wird dann mit NaBH&sub4; in einer Konzentration von 0,3 mg/ml reduziert, um eine stabile Amin-Verknüpfung des Glucan-mAb-Konjugats zu erhalten.

Beispiel 6

Konjugation von Mastoparan an monoklonale Antikörper mit dem NHS-Verfahren

Durch Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) in Dimethylformamid und unter Verwendung von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als als Kondensationsmittel wurde ein aktiver Ester von Mastoparan hergestellt. Die Lösung des aktiven Mastoparanesters in DMF wurde dann zu einer die monoklonalen Antikörper Lym-1 oder Lym-2 bei pH 7,0 enthaltenden Lösung gegeben und 1 bis 2 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nichtgelöste Reagentien, und zwar hauptsächlich Dicyclohexylharnstoff und/oder präzipitiertes Protein, wurden durch Zentrifugation entfernt. Freies Mastoparan und andere nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien können durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Sephadex-G-25-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt werden. Die in das Konjugat eingeführte Menge an Mastoparan wurde mit Hilfe einer Markierung aus Tritium (H³)-markiertem Mastoparan bestimmt.

Beispiel 7

Konjugation von Interleukin-2 an tumorspezifische monoklonale Antikörper mit CDI

Rekombiniertes Interleukin-2 (rIL-2) (Cetus Corporation, Emeryville, California) wird in Gefäßen geliefert, die 0,3 mg oder 1,2 mg/Gefäß enthalten. Ein gereinigter monoklonaler Antikörper wie Lym-1 wurde an rIL-2 konjugiert, und zwar unter Verwendung von 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethylcarbodiimidmetho-p-toluolsulfonat ("CDI") und N- Hydroxysulfosuccinimid im Gewichtsverhältnis 1 : 2 : 50 : 50, so daß sich ein Gesamtvolumen von 0,3 ml in Phosphat-Puffer, pH 7,4, ergab. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei einer Drehzahl von 4000 min&supmin;¹ bei 4ºCwurde der lösliche gekuppelte Antikörper auf einer mit Dextranblau geeichten Sephadex-G-100-Säule chromatographiert. Durch Anwendung dieses Verfahrens wurden etwa 1-2 Moleküle rIL-2 an jedes Molekül des monoklonalen Antikörpers ("mAb") gekuppelt. Die Immunokonjugat-Präparation wurde dann auf 1 mg/ml eingestellt, steril filtriert und bis zur Verwendung bei 4ºC aufgewahrt. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um rIL-2 an einen beliebigen tumorspezifischen monoklonalen Antikörper zu kuppeln.

Beispiel 8

Konjugation von Interleukin-2 an ein therapeutisches Mittel

Das oben beschriebene Konjugationsverfahren kann angewendet werden, um rIL-2 an einen monoklonalen Antikörper mit einer Spezifität für Tumorendothel zu binden. Beispielsweise wurde gezeigt, daß monoklonale Antikörper gegen Fibronectin im Vergleich zu normalem Endothel selektiv an Tumorgefäße binden. Da die Hauptwirkung des rIL-2 am Tumorort die Erhöhung der Gefäßdurchlässigkeit ist, wäre die Zielorientierung des vasoaktiven Immunokonjugats auf das Tumorendothel optimal. Außerdem kann dann unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens, ergänzend oder im Anschluß an die Behandlung mit dem rIL-2-Konjugat, unter Verwendung von herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln wie beispielsweise cis-Platin eine Behandlung der verschiedenen Krebstypen erfolgen.

Beispiel 9

Durch Rekombination konstruierte vasoaktive Immunokonjugate

Anstatt vasoaktive Peptide chemisch an monoklonale Antikörper zu binden, deren Ziel Tumore oder Tumorgefäße sind, kann die genetische Sequenz des vasoaktiven Peptids in die Sequenz des monoklonalen Antikörpers konstruiert werden. Beispielsweise wird die mRNA isoliert, die den monoklonalen Antifibronectin-Antikörper kodiert. Aus dieser mRNA wird eine cDNA sowohl für die schweren als auch für die leichten Ketten des Immunglobulins synthetisiert. Diese cDNA wird im Anschluß daran 1) unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, 2) sequenziert, und 3) mit Restriktionsendonukleasen kartiert. Dann wird die geeignete DNA- Sequenz des vasoaktiven Peptids, beispielsweise IL-2, in der konstanten Region an die Enden des Gens für die schwere Kette ligasiert.
Das vervollständigte konstruierte Gen wird dann durch Gen- Transfektionsverfahren (beispielsweise unter Anwendung der Elektroporation oder des Calciumphosphat-Verfahrens) wieder in ein eukaryotisches oder prokaryotisches Expressionssystem eingeführt, so daß das Proteinprodukt in Zellkulturen im großem Maßstab exprimiert wird. Wie in Fig. 1 veranschaulicht, sind zwei aktive IL-2-Reste Teil jedes Immunglobulinmoleküls. Die besten Stellen zur Befestigung jedes vasoaktiven Peptids können sich unterscheiden und ohne weiteres durch experimentelle Verfahren bestimmt werden. Die Sequenz für das vasoaktive Peptid kann entweder an die Sequenzen für die schweren Ketten von Immunglobulinen des Menschen oder der Maus ligasiert werden, um menschliche, Maus-, chimäre oder andere Spezies oder Kombinationen von Immunglobulinmolekülen herzustellen.

Beispiel 10

Bestimmung der funktionellen Aktivität von Immunokonjugaten mit einem Proliferationsassay

Um die funktionelle Aktivität des rIL-2-Immunokonjugats zu überprüfen, wurde ein Proliferationsassay durchgeführt.
Frische Maus-Splenocyten wurden mit rIL-2 nach 3tägiger Stimulation mit PHA 7 Tage lang kultiviert. Dann wurden die Zellen von rIL-2 freigewaschen und in RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kalbsserum und Antibiotika ergänzt war, resuspendiert. 100 µl, die 10&sup5; Zellen enthielten, wurden 3- fach in Mikrotiterplatten-Vertiefungen gegeben, und zwar in Gegenwart von 100 µl Immunokonjugat (Versuchsprobe) in verschiedenen Konzentrationen, rIL-2 (positive Kontrolle) und Lym-1 oder Lym-2 (negative Kontrolle). Die Kulturen wurden bei 37ºC 24 h inkubiert, woraufhin 2 µCi ¹²&sup5;I-IUDR (New England Nuclear Co., Boston, MA) zugegeben und 4 h inkubiert wurde. Die Zellen wurden dann durch 3maliges Waschen mit PBS und einmaliges Waschen mit 5%iger Trichloressigsäure geerntet und anschließend in einem Gammazähler ausgezählt. Unter Verwendung von gereinigtem rIL-2 als positiver Kontrolle können die ¹²&sup5;I-IUDR-Einbaudaten gegen log&sub2; der rIL-2-Verdünnung aufgetragen werden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu ergeben. Die Verdünnungskoordinate der Kontrollprobe auf der x-Achse, die diese Kurve bei 50% der maximalen ¹²&sup5;I-IUDR-Aufnahme (Koordinate auf der y-Achse) schneidet, ist als der Wert definiert, der einer Einheit rIL-2-Aktivität entspricht. Auf diese Weise kann die rIL-2-Aktivität der Immunokonjugat-Präparationen von Charge zu Charge quantifiziert werden.

Beispiel 11

Verwendung von vasoaktiven Verbindungen zur Steigerung der extravaskulären Penetration eines Tumors durch den monoklonalen Antikörper Lym-1

Um die relativen Auswirkungen des vasoaktiven IL-2-Immunokonjugats auf die Bioverteilung und die Aufnahme von Lym-1 in den Tumor in ein Lymphom beherbergenden Nacktmäusen zu prüfen, wurde einer Gruppe von 5 Mäusen, die jeweils 0,5 g des Raji-Lymphoms in Form von subkutanen Transplantaten beherbergten, intravenöse Dosen Lym-1 (Kontrolle) oder Lym- 1/IL-2-Immunokonjugat (Versuch) verabreicht, und zwar zum Zeitpunkt Null oder 2 1/2 h vor der Verabreichung von 20 µg Lym-1-F(ab')&sub2;, das mit 50 µCi I-125 radiomarkiert war. Drei Tage später wurden sämtliche Mäuse getötet, und die Tumoren und die normalen Organe wurden zur Quantifizierung der Markermenge pro Gramm Gewebe entfernt. Wie im folgenden dargestellt, zeigten diejenigen Mäuse, welche das Lym-1/IL-2- Versuchsvasokonjugat bekamen, einen 200%igen Anstieg der mAb-Lokalisation im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen (Fig. 1). Wie in den folgenden Fig. 2 - 4 veranschaulicht, erhöht sich außerdem durch diesen Anstieg der mAb- Lokalisation das Tumor/Blutverhältnis etwa um das 2fache (Fig. 2), und zwar in Abhängigkeit von der Dosis (maximale Wirkung zwischen 30 - 50 µg Vasokonjugat, Fig. 3) und in Abhängigkeit von der Zeit (Fig. 4) mit maximaler Wirkung 2 1/2 h vor der Verabreichung des mAb.

Beispiel 12

Klinische Verwendung und Anwendung

Die vasoaktiven Immunokonjugate sollten verwendet werden, um den Transport von 1) Arzneistoffen oder Arzneistoffe enthaltenden Liposomen und 2) therapeutischen monoklonalen Antikörpern zu erhöhen. Der Wirkungsmechanismus des Immunokonjugats ist die Erzeugung eines Anstiegs der Durchlässigkeit und/oder der Blutzufuhr am Tumorort. Daher wird das Immunokonjugat im allgemeinen 1 bis 3 h vor der Verabreichung der therapeutischen Dosis des Arzneistoffs, des monoklonalen Antikörpers oder des Liposoms verabreicht.
In einem Tiermodell bewirkt die Verwendung von an Lym-1 gebundenem rIL-2 2 1/2 h vor der Verabreichung von I-131- Lym-1-F(ab')&sub2; im Vergleich zu Kontrollen einen Anstieg der Dosis des letzteren um 200%. Die Verwendung von konstruierten Immunokonjugaten kann deren Wirksamkeit in vivo signifikant erhöhen.

Claims

1. Immunokonjugat, das folgendes aufweist: einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe in einem Säuger befähigt ist, und ein vasoaktives Mittel, das entweder die Gefäßdurchlässigkeit von Gewebe erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, welches an den monoklonalen Antikörper gebunden ist, wobei das Immunokonjugat entweder die Gefäßdurchlässigkeit des Gewebes erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Mittel nicht um den Tumornekrosefaktor, Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), den Cobragiftfaktor oder eine Zelle handelt.

2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Konjugat eine ausreichende Größe hat, so daß es das normale, gesunde Gefäßendothel nicht durchdringen kann, aber das Gefäßendothel von Tumorgewebe durchdringen kann.

3. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Mittel die Gefäßdurchlässigkeit an einer Wirkstelle im Gefäßendothel erhöht.

4. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Mittel an einer Wirkstelle im Gefäßendothel eine lokale entzündliche Reaktion hervorruft oder verstärkt.

5. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4 in Kombination mit einem antineoplastischen Radioisotop.

6. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4 in Kombination mit einem antineoplastischen Toxin.

7. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei das Mittel eine pharmazeutisch wirksame Verbindung aufweist.

8. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Mittel ein Kohlenhydrat ist.

9. Konjugat nach Anspruch 8, wobei das Kohlenhydrat aus der aus Glucan und Proteoglucanen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

10. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei das Mittel ein Lipid ist.

11. Konjugat nach Anspruch 10, wobei das Lipid aus der aus dem plättchenaktivierenden Faktor und Prostaglandinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

12. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei das Mittel ein Peptid ist.

13. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei der Antikörper eine Spezifität für Moleküle aufweist, die selektiv in beschädigtem, entzündetem oder strukturell abnormalem Gefäßendothel exprimiert werden.

14. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei der Antikörper Spezifität für subendotheliale Bestandteile der Blutgefäßwandung aufweist, die in entzündeten Gefäßen oder in strukturell abnormen Gefäßen wie sie in Tumoren vorgefunden werden für zirkulierende Antikörper oder andere Makromoleküle zugänglich werden.

15. Konjugat nach Anspruch 14, wobei die Bestandteile Fibronectin, Laminin, Typ-IV-Collagen oder ähnliche Moleküle subendothelialen Ursprungs umfassen.

16. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei der Antikörper Spezifität für Bestandteile der Blutgerinnungskaskade aufweist, die in den Gefäßwandungen, in der unmittelbaren Umgebung von entzündeten Blutgefäßen oder in den nekrotisierenden Bereichen des Tumors aktiviert werden.

17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei die Bestandteile Fibrin und Thrombin umfassen.

18. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei der Antikörper Spezifität für Antigene aufweist, die selektiv in oder auf endothelialen Zellen in entzündetem Gefäßgewebe exprimiert werden, aber nicht in nicht entzündetem Gefäßgewebe.

19. Konjugat nach Anspruch 18, wobei die Antigene Zellhaftmoleküle umfassen, die für das Anhaften von polymorphkernigen Leukozyten an entzündetes Gefäßgewebe verantwortlich sind.

20. Konjugat nach Anspruch 18, wobei die Antigene Fibrin umfassen.

21. Konjugat nach Anspruch 18, wobei die Antigene Fibronectin umfassen.

22. Konjugat nach Anspruch 18, wobei die Antigene Fibrin- Abbauprodukte umfassen.

23. Konjugat nach Anspruch 18, wobei die Antigene Zellenzyme, Blutplättchen oder Zellprodukte von Blutplättchen umfassen.

24. Konjugat nach Anspruch 23, wobei die Enzyme Peroxidasen umfassen, die in nekrotischen oder entzündeten Geweben freigesetzt werden.

25. Konjugat nach Anspruch 1, 3 oder 4, wobei der Antikörper Spezifität für Antigene aufweist, die selektiv in oder auf endothelialen Zellen in neuem Gefäßgewebe exprimiert werden.

26. Verwendung eines Immunokonjugats, das folgendes aufweist: einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe in einem Säuger befähigt ist, und ein vasoaktives Mittel, das entweder die Gefäßdurchlässigkeit von Gewebe erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, welches an den monoklonalen Antikörper gebunden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an den Säuger, um entweder die Gefäßdurchlässigkeit des Gewebes zu erhöhen oder die Blutversorgung des Gewebes zu erhöhen, wobei die Verabreichung gleichzeitig mit oder zur Vorbereitung der Verabreichung einer wirksamen Menge eines antineoplastischen therapeutischen Mittels an den Säuger erfolgt.

27. Verwendung eines Immunokonjugats, das folgendes aufweist: einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe in einem Säuger befähigt ist, und ein vasoaktives Mittel, das entweder die Gefäßdurchlässigkeit von Gewebe erhöht oder die Blutversorgung des Gewebes erhöht, welches an den monoklonalen Antikörper gebunden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an den Säuger, um entweder die Gefäßdurchlässigkeit des Gewebes zu erhöhen oder die Blutversorgung des Gewebes zu erhöhen, wobei die Verabreichung gleichzeitig mit oder zur Vorbereitung der Verabreichung einer wirksamen Menge eines Tumorabbildungsmittels an den Säuger erfolgt.

28. Therapeutischer Kit, der folgendes aufweist: ein Konjugat, das einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe befähigt ist, und ein Mittel, das an das Beförderungsvehikel gebunden ist und die Blutversorgung des neoplastischen Gewebes erhöht, aufweist, und ein antineoplastisches therapeutisches Mittel.

29. Diagnostischer Kit, der folgendes aufweist: ein Konjugat, das einen monoklonalen Antikörper, der zur Lokalisation an einer Stelle mit neoplastischem Gewebe befähigt ist, und ein Mittel, das an das Beförderungsvehikel gebunden ist und die Blutversorgung des neoplastischen Gewebes erhöht, aufweist, und ein Tumorabbildungsmittel.