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TWI797073B - 包含雙特異性抗體建構物之醫藥組合物 - Google Patents

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TWI797073B
TWI797073B TW106102608A TW106102608A TWI797073B TW I797073 B TWI797073 B TW I797073B TW 106102608 A TW106102608 A TW 106102608A TW 106102608 A TW106102608 A TW 106102608A TW I797073 B TWI797073 B TW I797073B
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seq
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席克哈 卡納普瑞
拉米爾 拉帝柏夫
巴拉庫瑪 森納加佳
柯尼里斯 龐波
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德商安美基研究（慕尼黑）公司
美商安美基公司
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Abstract

本發明提供包含雙特異性單鏈抗體建構物、環糊精及緩衝液之新穎的穩定醫藥組合物。

Description

包含雙特異性抗體建構物之醫藥組合物
本發明係關於一種醫藥組合物。具體言之，本發明係關於一種包含雙特異性單鏈抗體建構物、β-環糊精及緩衝液之醫藥組合物。
在過去三十年中，重組DNA技術的出現使人研發出多種蛋白質藥物。蛋白質類藥物現為臨床(前)研發中及作為市售產品的增長最快的治療劑類別之一。與小型化學藥物相比，蛋白質藥物在相對較低濃度下具有高特異性及活性，且通常提供高影響力疾病(諸如各種癌症、自體免疫疾病及代謝障礙)的療法(Roberts,Trends Biotechnol . 2014年7月;32(7):372-80；Wang,Int J Pharm . 1999年8月20日;185(2):129-88)。 歸因於商業級純化方法的進步，重組蛋白質現可以在首次製造時便以高純度獲得。然而，蛋白質僅勉強穩定且非常容易發生化學降解與物理降解。化學降解係指涉及共價鍵之修飾，諸如脫醯胺、氧化、新二硫橋鍵之裂解或形成、水解、異構化或去糖基化。物理降解包括蛋白質去摺疊、不合需要的吸附到表面及聚集。處理此等物理及化學不穩定性為蛋白質藥物研發中最具有挑戰性的任務之一(Chi等人,Pharm Res ,第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁；Roberts,Trends Biotechnol . 2014年7月;32(7):372-80)。 蛋白質聚集表示蛋白質物理不穩定性的嚴重事件且因將溶劑與疏水性蛋白質殘基之間的不利熱力學相互作用降至最低的內在傾向而發生。由於在再摺疊、純化、滅菌、裝運及儲存過程期間通常會碰到，因此其特別成問題。甚至在其中蛋白質原生態在熱力學上高度有利的溶液條件(例如，中性pH及37℃)下且在壓力不存在下，仍可能會出現聚集(Chi等人,Pharm Res , 第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁；Roberts,Trends Biotechnol . 2014年7月;32(7):372-80；Wang,Int J Pharm . 1999年8月20日;185(2):129-88；MahlerJ Pharm Sci . 2009年9月;98(9):2909-34.)。 由於蛋白質聚集可削弱治療蛋白質之生物活性，因此其為成問題的。此外，蛋白質聚集會導致藥品之美觀性不合需要，且歸因於複雜純化步驟而降低自最終產物移除聚集體所需之產量。近年來，已經愈來愈關注且證明聚集蛋白質(甚至人類化或完全人類蛋白質)的存在可顯著增加患者對活性蛋白質單體產生免疫反應之風險，引起形成中和抗體和抗藥性或其他不良副作用(MahlerJ Pharm Sci . 2009 Sep;98(9):2909-34)。 已在文獻中報導若干成果以藉由各種機制將蛋白質聚集降至最低。可藉由調節蛋白質一級結構使其穩定化且因此經保護以避免聚集體形成及其他化學變化，由此增加內部疏水性且降低外部疏水性。然而，蛋白質之基因工程改造可能會導致官能性削弱及/或免疫原性升高。關注聚集體解離(稱為「解聚」)之另一方法為藉由使用諸如溫度、壓力、pH及鹽之各種機制來恢復功能性、天然單體。目前，蛋白質聚集體在後續處理之拋光步驟中作為雜質得到大部分移除。然而，在高水準之高分子量(HMW)的情況下，移除大量HMW不僅會導致產率損失相當大，且亦會使穩健後續處理之設計具有挑戰性(Chi等人,Pharm Res , 第20卷, 第9期, Sept 2003,第1325-1336頁)。 在生物應用及生物技術應用中保持蛋白質穩定性及活性面臨嚴重挑戰。在此項技術中需要最佳化之醫藥組合物，其提供用於提高治療蛋白質之穩定性且減少調配、填充、裝運、儲存及投藥期間之聚集及變性，由此預防功能喪失及不良免疫原性反應。滿足如此之需要為本發明之目標。
蛋白質不穩定性，且尤其蛋白質聚集為生物技術行業中的逐漸增長之挑戰，其中在整個治療蛋白質之壽命中，包括在再摺疊、純化、滅菌、裝運及儲存過程期間均會遇到聚集。因此，本發明之目標在於提供一種穩定醫藥組合物，其包含雙特異性單鏈抗體建構物，該建構物經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3；β-環糊精；及緩衝液。 β-環糊精可選自由以下組成之群：β-環糊精、甲基-β-環糊精、羥乙基-β-環糊精、羥丙基-β-環糊精、乙基-β-環糊精、丁基-β-環糊精、丁二醯基-(2-羥丙基)-β-環糊精、柒(2,3,6-三-O-甲基)-β-環糊精、柒(2,3,6-三-O-苯甲醯基)-β-環糊精、β-環糊精磷酸鈉鹽、β-環糊精硫酸鈉鹽、三乙醯基-β-環糊精、柒(6-O-磺酸基)-β-環糊精七鈉鹽、羧甲基-β-環糊精鈉鹽、磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽、6-O-對甲苯磺醯基-β-環糊精，且尤其選自磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽、羥丙基-β-環糊精。其可以在0.1% (w/v)至20% (w/v)，較佳0.5% (w/v)至2% (w/v)且更佳0.8% (w/v)至1.5% (w/v)範圍內之濃度存在。 雙特異性單鏈抗體建構物可以0.1 mg/ml至5 mg/ml、較佳0.2 mg/ml至2.5 mg/ml、更佳0.25 mg/ml至1.0 mg/ml之濃度範圍存在。其第一結合域可結合於CD33。詳言之，雙特異性單鏈建構物之第一結合域的胺基酸序列選自由以下組成之群：SEQ ID 99、SEQ ID 109、SEQ ID 119、SEQ ID 128、SEQ ID 137、SEQ ID 146、SEQ ID 155、SEQ ID 164及SEQ ID 173，且雙特異性單鏈建構物之第二結合域的胺基酸序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:179及SEQ ID NO:90。 緩衝液可選自由以下組成之群：磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸/丁二酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、組胺酸/組胺酸HCl、甘胺酸、Tris、麩胺酸、乙酸及其混合物，且尤其選自磷酸鉀、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸、組胺酸、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其組合。 醫藥組合物之pH可在4至7.5範圍內。 一或多種賦形劑可存在於本文所提供之醫藥組合物中，其包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、精胺酸、離胺酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188 (poloxamer 188)、普洛尼克(pluronic)及其組合。
組合物可包含一或多種防腐劑，尤其苯甲醇、氯丁醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞。針對使用此等防腐劑之結構及典型濃度描述於梅爾等人J Pharm Sci.96(12),3155之表1中。
本發明亦提供一種不含防腐劑之醫藥組合物，其包含具有SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：110之胺基酸序列且濃度為約0.5mg/ml之雙特異性單鏈抗體建構物，且進一步包含濃度為約1%(w/v)的為磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽之環糊精，且進一步包含濃度為約10mM的磷酸鉀緩衝液，該調配物進一步包含濃度為約8%(w/v)之蔗糖及在約6.0之pH下的濃度為約0.01%(w/v)之聚山梨醇酯80。
不管當前治療性生物技術產品之高品質及重組人類蛋白質及抗體與內源性人類蛋白質之相似性，蛋白質不穩定性仍為重要關注點。除了蛋白質聚集之品質相關性後果(諸如可能喪失蛋白質活性及藥品之美觀性不合需要)以外，已報導出可溶性蛋白質聚集體具有顯著細胞毒性作用，且至關重要地，其為對蛋白質產物產生免疫反應之潛在風險因素。 蛋白質聚集可出現在整個蛋白質壽命之各個時間點，包括醱酵、再摺疊、純化、填充、裝運、儲存或投藥期間且很大程度上視各種環境因素而定。在此項技術中存在一種增加穩定性且降低治療蛋白質之聚集的關鍵需求；且最佳化之醫藥調配物可有助於做到此。本發明人研究當暴露於不同環境壓力因素時，不同環糊精對雙特異性抗體建構物(具體言之，雙特異性T細胞接合分子，BiTE® )之聚集的影響。出人意料地，本發明人發現在環糊精，且尤其β-環糊精存在下，抗體建構物可得到顯著穩定。 因此，本發明提供一種穩定醫藥組合物，其包含a)雙特異性單鏈抗體建構物，該建構物經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3；b)β-環糊精及c)緩衝液。 穩定性 在本發明中，術語「穩定性」或「穩定」係關於具體言之在調配、填充、裝運、儲存及投藥期間，全部醫藥組合物之穩定性，且尤其係關於活性成分(亦即雙特異性單鏈抗體建構物)本身之穩定性。在本發明之醫藥組合物及雙特異性單鏈抗體建構物之上下文中，術語「穩定性」或「穩定的」尤其係指減少或預防形成蛋白質聚集體(HMWS)。具體言之，術語「穩定性」亦係關於包含在本文所述之醫藥組合物內的雙特異性單鏈抗體建構物之膠態穩定性。「膠態穩定性」為膠態粒子(諸如蛋白質)保持分散於液體中持續延長時間段(數天至數年)之能力。 如本文所用，術語「(蛋白質)聚集體」一般涵蓋諸如術語「寡聚物」或術語「多聚物」的較高分子量之蛋白質種屬而非所需限定種屬(例如，單體)。該術語在本文中可與術語「高分子量種屬」與「HMWS」互換使用。蛋白質聚集體之不同之處可一般在於大小(範圍介於小型(二聚體)至大型集合體(亞可見或甚至可見之粒子)及奈米至微米之直徑範圍)、形態(近似球狀至纖維狀)、蛋白質結構(天然與非天然/變性)、分子間結合之類型(共價與非共價)、可逆性及可溶性。可溶性聚集體涵蓋大約1 nm至100 nm之大小範圍，且蛋白質顆粒涵蓋亞可見(約0.1 .m至100 .m)及可見(＞100 .m)範圍。所有前述類型之蛋白質聚集體均一般由該術語涵蓋。因此術語「(蛋白質)聚集體」係指兩個或大於兩個蛋白質單體之所有類別之物理結合或化學連接的非天然種屬。 因此術語「蛋白質聚集」或「非天然聚集」表示以下之過程：藉由該過程蛋白質分子組裝成由兩種或大於兩種蛋白質構成之複合物，其中個別蛋白質表示為單體。存在引起蛋白質聚集之多個路徑，其可藉由多種條件誘導，包括溫度、諸如振盪及攪拌之機械壓力、抽吸、冷凍及/或解凍及調配。 溫度 溫度的增加會加快諸如氧化反應及蛋白質之脫醯胺的化學反應，其可反過來促進聚集。較高溫度亦直接影響蛋白質在第四結構水準、第三結構水準及第二結構水準上之構形，且可導致可促成聚集的溫度誘導之去摺疊。 冷凍及解凍 蛋白質變性及聚集可出現在冷凍/解凍期間，其歸因於複雜物理及化學變化，諸如新冰/溶液界面之形成、與容器表面之吸附、蛋白質與溶質之低溫濃縮及歸因於緩衝液組分之結晶的pH變化。 蛋白質濃度 蛋白質濃度之增加亦可促進形成蛋白質聚集體。在高蛋白質濃度下，產生大分子擁擠，該術語用於描述由大分子溶質佔據之高總體積對彼溶液中的各大分子種屬之特性的影響。根據此排除體積理論，自組裝及由此潛在的聚集可為有利的。 防腐劑 抗微生物防腐劑(諸如苯甲醇及苯酚)通常為蛋白質液體調配物中所需的，以確保其存放期期間之無菌性，且另外，為多劑量調配物及特定藥物遞送系統，例如，注射筆、微型泵及局部應用所必需的。已報導出多種防腐劑會引發蛋白質聚集，儘管潛在機制並未得到很好地理解。已提出使防腐劑結合於且填入易於聚集的未摺疊之蛋白質狀態。 有利地，本發明之醫藥組合物設想為穩定的，亦即即使當經歷壓力(尤其熱壓力)、儲存、表面誘導之壓力(諸如冷/融循環，起泡)、濃縮(藉由超透濾及透濾)或與諸如抗微生物防腐劑之有機化合物混合時，仍然不含或實質上不含蛋白質聚集體。較佳地，相較於在隨附實例中所評估的包含SBE-β-CD或HP β-CD之組合物，醫藥組合物可具有相似或甚至改良之特徵。本發明之醫藥組合物較佳為分散單體雙特異性單鏈抗體建構物之均質溶液。 技術人員應瞭解，儘管醫藥組合物有效地提供活性成分之穩定性(亦即降低或抑制形成雙特異性單鏈抗體建構物之蛋白質聚集體)，但仍可間或形成一些聚集體或構象異構體，但不會實質上損害醫藥組合物之總體可用性。在此上下文中，「實質上不含」聚集體意謂聚集體之量保持小於10% (w/v)、9% (w/v)、8% (w/v)、7% (w/v)、6% (w/v)、5% (w/v)、4% (w/v)、3% (w/v)、2% (w/v)、或1% (w/v)，尤其亦當經受環境壓力時，例如，如隨附實例中所評估。 用於測定可溶性及不溶性蛋白質聚集體之存在的方法已尤其由Mahler等人, J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34加以綜述。如隨附實例中所述，可藉由尺寸排阻超高效液相層析(SE-UPLC)來評估可溶性蛋白質聚集體之形成。SEC為用於蛋白質聚集體之偵測及量化的使用最多之分析方法中的一者。SEC分析提供確定聚集體大小並對其加以量化。SEQ-UPLC使得可基於大分子之形狀及大小(流體動力學半徑)在約5 kDa至1000 kDa分子量範圍內對大分子進行選擇性及快速分離。 蛋白質溶液顯示光學性質，其稱為乳白光或濁度。溶液之光學性質為所存在之粒子用於分散及吸收光的一項功能。蛋白質為天然膠體且水性調配物之濁度視蛋白質濃度、未溶解粒子之存在、粒徑及每體積單元之粒子數而定。濁度可藉由UV-Vis光譜法量測為340 nm至360 nm範圍內之光密度且用於偵測可溶性及不溶性聚集體兩者。 此外，藉由目測手段檢查樣品為評定蛋白質聚集體之又一重要態樣。針對不存在或存在可見聚集體之目測評估較佳根據Deutscher Arzneimittel Codex (DAC)Test 5來進行。 如本文中其他處所闡述，設想本發明之醫藥組合物最可能藉由其中所包含之β-環糊精之作用來促進雙特異性單鏈抗體建構物之膠態穩定性升高，且由此展現降低之或甚至不存在之液-液相分離(LLPS)。LLPS為熱力學驅動事件，其中均質蛋白質溶液伴隨降低之溫度分離成貧蛋白質相(通常頂層)及富蛋白質相(通常底層)。簡單地藉由將兩種相混合且升高溶液溫度，LLPS通常為完全可逆的。LLPS之出現歸因於短程吸引性蛋白質-蛋白質相互作用，使其成為蛋白質-蛋白質吸引強度之量度。與不包含β-環糊精之醫藥組合物相比較，已發現根據本發明的包含β-環糊精之醫藥組合物在LLPS貧蛋白質相中包含較高濃度之雙特異性單鏈抗體建構物。因此，當與對照比較時，設想本發明之醫藥組合物展現減少之LLPS或根本不展現LLPS，且由此促進本發明之雙特異性單鏈抗體建構物的膠態穩定性升高。LLPS可經誘導且不同相之蛋白質含量可如隨附實例中所述加以檢查。 環境壓力，尤其歸因於熱變性及/或化學變性，亦可引起構形變化，其反過來可促進聚集。出人意料地，本發明人發現，如藉由量測芳族胺基酸之固有螢光發射強度所評估，雙特異性單鏈抗體建構物對於構形變化亦為穩定的。因此較佳地，本發明之醫藥組合物亦降低或抑制構象異構體(亦即非天然、異常摺疊蛋白質種屬)形成。 抗體建構物 如先前所解釋，本發明之穩定醫藥組合物包含雙特異性單鏈抗體建構物，該建構物經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3。 術語「抗體建構物」一般係指結構及/或功能基於抗體(例如全長或完整免疫球蛋白分子)之結構及/或功能的分子。因此，抗體建構物能夠結合於其特異性標靶或抗原。此外，本發明之抗體建構物包含抗體之允許標靶結合之最小結構需求。此最小需求可例如藉由存在至少三個輕鏈CDR (亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)定義。本文所述之建構物所基於的抗體包括例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。 包括駱駝抗體及其他由生物技術或蛋白質工程改造方法或製程產生之免疫球蛋白抗體的全長或完整抗體在「抗體建構物」之定義內。此等全長抗體可為例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。全長抗體之片段(諸如VH、VHH、VL、(s)dAb、 Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」 (「半抗體」))亦在「抗體建構物」之定義內。抗體建構物亦可為抗體之經修飾片段，亦稱為抗體變異體，諸如scFv；di-scFv或bi(s)-scFv；scFv-Fc；scFv拉鏈；scFab；Fab2；Fab3；雙功能抗體；單鏈雙功能抗體；串聯雙功能抗體(Tandab)；串聯di-scFv；串聯tri-scFv；「微型抗體」，其由如下結構例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2；多功能抗體，諸如三功能抗體或四功能抗體；及單域抗體，諸如奈米抗體；或僅包含一個可變域(其可為VH H、VNAR VH或VL)之獨立於其他V區或域特異性結合抗原或抗原決定基的單可變域抗體。由(至少)兩個單域單株抗體及連接子構成之單域抗體建構物亦由術語「抗體建構物」涵蓋，該域獨立地選自包含以下之群：VH、VL、VH H及VNAR 。連接子較佳為肽連接子形式。類似地，「scFv單域mAb」為由至少一個上述單域抗體及一個上述scFv分子構成之單株抗體建構物。同樣，連接子較佳為肽連接子形式。 此外，術語「抗體建構物」之定義一般包括單價、二價及多價(polyvalent/multivalent)建構物，且因此包括特異性結合於僅一種抗原結構之單特異性建構物以及經由不同結合域特異性結合超過一種抗原結構(例如兩種、三種或大於三種)之雙特異性及多特異性(polyspecific/multispecific)建構物。此外，術語「抗體建構物」之定義包括僅由一個多肽鏈組成之分子以及由超過一個多肽鏈組成之分子，該等鏈可相同(均二聚體、均三聚體或均寡聚物)或不同(雜二聚體、雜三聚體或雜寡聚物)。在本發明之上下文中，尤其設想雙特異性單鏈抗體建構物經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3。 結合域 術語「結合域」表徵(特異性)結合於/相互作用於/識別既定靶抗原決定基或靶分子上之既定標靶位點(抗原)之域。結合域較佳為多肽形式。此類多肽可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑，諸如戊二醛)。蛋白質(包括其片段，較佳生物活性片段及肽，通常具有少於30個胺基酸)包含兩個或大於兩個經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(產生胺基酸之鏈)。如本文所用，術語「多肽」描述分子之群，其通常由超過30個胺基酸組成。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體以及更高級寡聚物，亦即由超過一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不相同。此類多聚體之相應高階結構因此稱為均二聚體或雜二聚體、均三聚體或雜三聚體等。雜多聚體之一實例為抗體分子，其在其天然存在之形式下由兩個相同多肽輕鏈及兩個相同多肽重鏈組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦指經天然修飾之肽/多肽/蛋白質，其中修飾例如藉由轉譯後修飾(如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾)進行。「肽」、「多肽」或「蛋白質」在本文提及時亦可經化學修飾，諸如聚乙二醇化。此類修飾為此項技術中所熟知的且描述於下文中。 第一結合域之結構及功能，及較佳地，亦及第二結合域之結構及/或功能係基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能。第一結合域之特徵在於存在三個輕鏈CDR (亦即可變輕鏈(VL)區之CDR1、CDR2及CDR3)及三個重鏈CDR(亦即可變重鏈(VH)區之CDR1、CDR2及CDR3)。第二結合域較佳亦包含抗體之允許標靶結合之最小結構需求。更佳地，第二結合域包含至少三個輕鏈CDR (亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。 如上文所提及，結合域通常可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而其不必包含兩者。舉例而言，Fd片段具有兩個VH區且常常保留完整抗原結合域之一些抗原結合功能。(經修飾之)抗原結合抗體片段之實例包括(1) Fab片段，其為具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段；(2) F(ab')2片段，其為具有藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接的兩個Fab片段之二價片段；(3) Fd片段，其具有兩個域(VH及CH1)；(4) Fv片段，其具有抗體之單一臂之VL及VH域，(5) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-546)，其具有VH域；(6)分離互補決定區(CDR)及(7)單鏈Fv (scFv)。 可變區 術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白域之部分，其序列展現變化性且其參與測定特定抗體之特異性及結合親和力(亦即「可變域」)。可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)一起配對形成單一抗原結合位點。最接近於VH的CH域稱為CH1。各輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵連接於重(H)鏈，而兩個H鏈視H鏈同型而定藉由一或多個二硫鍵彼此連接。 可變性並不均勻分佈於抗體之整個可變域中；其集中於各重鏈及輕鏈可變區之子域中。此等子域稱為「高變區」或「互補決定區」(CDR)。CDR含有負責抗體與抗原之特異性相互作用的大部分殘基，且因此促成抗體分子之功能活性：其為抗原特異性之主要決定因素。 使精確界定的CDR邊界及長度經歷不同分類及編號系統。CDR可因此藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義(包括本文所述之編號系統)提及。儘管邊界不同，但此等系統中之每一者在構成可變序列內之所謂「高變區」之要素方面具有一些程度之重疊。因此，根據此等系統之CDR定義的長度及相對於相鄰構架區之邊界區域可有所不同。參見例如Kabat (基於跨物種序列可變性之方法)、Chothia (基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法)及/或MacCallum (Kabat等人, 上述引文；Chothia等人, J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917；及MacCallum等人, J. MoI. Biol, 1996, 262: 732)。用於表徵抗原結合位點之又一標準為供Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用之AbM定義。參見例如，蛋白質序列及抗體可變域之結構分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)。於：Antibody Engineering Lab Manual (編：Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)中。在兩種殘基鑑別技術定義重疊區域但非相同區域之程度上，其可組合以定義混合CDR。然而，根據所謂Kabat系統編號為較佳的。 通常，CDR形成可歸類為典型結構的環形結構。術語「典型結構」係指由抗原結合(CDR)環採用之主鏈構形。由比較結構研究發現，六個抗原結合環中有五個僅具有有限譜系之可用構形。各典型結構之特徵可為多肽主鏈之扭轉角。因此，儘管在環之大部分中具有高胺基酸序列可變性，但抗體之間的對應環可具有極類似三維結構(Chothia及Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901；Chothia等人, Nature, 1989, 342: 877；Martin及Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800)。此外，在所採用之環形結構與其周圍之胺基酸序列之間存在關係。特定典型類別之構形由環之長度及位於環內以及保守構架(亦即環外)內關鍵位置處之胺基酸殘基決定。可因此基於此等關鍵胺基酸殘基之存在進行分配至特定典型類別。 術語「典型結構」亦可包括關於例如Kabat (Kabat等人,上述引文)所編錄之抗體之線性序列的考慮因素。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式對抗體可變域之胺基酸殘基編號的標準且亦如本文其他處所提及為本發明中所用之較佳方案。其他結構考慮因素亦可用於確定抗體之典型結構。舉例而言，Kabat編號不能完全反映之彼等差異可由Chothia等人之編號系統描述及/或由其他技術(例如結晶學及二維或三維電腦模型化)揭示。因此，既定抗體序列可歸於典型類別，其尤其允許鑑別適當框架序列(例如基於在庫中包括多種典型結構的需要)。如由Chothia等人, 上述引文所描述的抗體胺基酸序列之Kabat編號及結構考慮因素及其對於建構抗體結構之典型態樣的推論描述於該文獻中。不同類別之免疫球蛋白的次單元結構及三維構型為此項技術中所熟知的。對於抗體結構之綜述，參見Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow等人編, 1988。 輕鏈之CDR3及尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合的最重要決定子。在一些抗體建構物中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。可使用僅CDR3變化之活體外選擇方案來改變抗體之結合特性或確定促成抗原結合之殘基。因此，CDR3通常為抗體結合位點內分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。 構架區及恆定區 可變域之較保守(亦即非高變)部分稱為「構架」區(FRM)且提供三維空間中之六個CDR之骨架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈及輕鏈的可變域各自包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其主要採用β片構型，藉由三個高變區連接，從而形成連接β片結構且在一些情形下形成β片結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FRM與另一鏈之高變區緊密結合在一起，促成抗原結合位點之形成(參見Kabat等人，上述引文)。恆定域不直接參與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。 結合特異性 雙特異性抗體建構物 如先前所解釋，尤其將本發明之醫藥組合物內所包含之抗體建構物設想為雙特異性單鏈抗體建構物。如本文所用，術語「雙特異性」係指抗體建構物為「至少雙特異性」，亦即，其包含至少一個第一結合域及第二結合域，其中第一結合域結合於一個抗原或目標，且第二結合域結合於另一個抗原或目標。因此，術語所涵蓋之抗體建構物包含針對至少兩種不同抗原或目標之特異性。因此，術語「雙特異性抗體建構物」亦涵蓋多特異性抗體建構物，諸如三特異性抗體建構物，後者包括三個結合域，或具有超過三個(例如四個、五個……)特異性之建構物。鑒於抗體建構物為(至少)雙特異性，因此其不會天然產生且其與天然產生之產物明顯不同。因此，「雙特異性」抗體建構物為具有至少兩個相異結合位點的具有不同特異性之人工混合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可藉由此項技術中已知之各種方法產生，例如藉由兩個不同純化單株抗體(mAb)或抗體片段之化學接合或藉由融合兩種融合瘤，引起四源融合瘤產生尤其雙特異性IgG分子(綜述參見Kontermann及Brinkmann,Drug Discov Today . 2015 Jul;20(7):838-47)。 目標 如先前所闡述，本發明之醫藥組合物包含雙特異性單鏈抗體建構物，該建構物經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3。 術語「(特異性)結合於」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」及「與……(特異性)反應」根據本發明意謂結合域與位於靶向蛋白質或抗原上之抗原決定基的一或多個、較佳至少兩個、更佳至少三個且最佳至少四個胺基酸相互作用或特異性相互作用。 術語「抗原決定基」係指抗原上結合域(諸如抗體或免疫球蛋白或抗體或免疫球蛋白之衍生物或片段)特異性結合的位點。「抗原決定基」為抗原性的，且因此術語抗原決定基有時在本文中亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因此，結合域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性識別」。「抗原決定基」可藉由連續胺基酸(線性抗原決定基)或藉由蛋白質之三級摺疊而並列之非連續胺基酸(構形抗原決定基)形成。線性抗原決定基在獨特序列中通常包括至少3個或至少4個，且較通常至少5個或至少6個或至少7個，例如約8至約10個胺基酸。通常，構形抗原決定基相對於線性抗原決定基包含數目增加之胺基酸。確定抗原決定基之構形的方法包括(但不限於) x射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜法及定點旋轉標記及電子順磁共振(EPR)光譜法。 結合域與抗原決定基或抗原決定基群之間的相互作用意指結合域展現出對特定蛋白質或抗原上之抗原決定基或抗原決定基群之可觀的親和力，且一般而言，並未展現與非靶向蛋白質或抗原之顯著反應性。「可觀的親和力」包括與約10- 6 M (KD)或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10- 12 M至10- 8 M、10- 12 M至10- 9 M、10- 12 M至10- 10 M、10- 11 M至10- 8 M，較佳約10- 11 M至10- 9 M時，將結合視為特異性。較佳地，本發明之結合域基本上或實質上不結合於除其靶向蛋白質或抗原以外之蛋白質或抗原(亦即，第一結合域及第二結合域不能結合於除其對應靶向蛋白以外之蛋白質)。 術語「基本上/實質上不結合」或「不能結合」意謂本發明之結合域不結合除其靶向蛋白質或抗原以外之蛋白質或抗原，亦即不展示與除其靶向蛋白質或抗原以外之蛋白質或抗原超過30%、較佳不超過20%、更佳不超過10%、尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%之反應性，其中與其對應靶向蛋白質或抗原之結合設定成100%。 如本文中所解釋，設想雙特異性單鏈抗體建構物包含能夠結合於靶細胞表面抗原之第一結合域及能夠結合於T細胞表面抗原CD3之第二結合域。尤其設想抗體建構物、結合域且尤其第二結合域(其結合於T細胞之表面上的人類CD3)具有以下形式：VH區與VL區之對呈單鏈抗體(scFv)形式。VH及VL區按VH-VL或VL-VH次序排列。較佳地，VH區N端定位於連接子序列且VL區C端定位於連接子序列。 本發明之醫藥組合物內所包含的抗體建構物之第二結合域能夠結合於T細胞表面抗原CD3。T細胞或T淋巴細胞為在細胞介導之免疫性中起主要作用的淋巴細胞(本身為白血球類型)之類型。存在數種T細胞亞群，各具有不同功能。T細胞可藉由細胞表面上T細胞受體(TCR)之存在而區別於其他淋巴細胞，諸如B細胞及NK細胞。TCR負責識別結合於主要組織相容複合體(MHC)分子之抗原且由兩個不同蛋白鏈組成。在95%之T細胞中，TCR由α及β鏈組成。當TCR與抗原肽及MHC (肽/MHC複合物)接合時，T淋巴細胞經由相關酶、共受體、特定接附分子及活化或釋放之轉錄因子介導之一系列生物化學事件活化。 CD3受體複合物為一種蛋白複合物且由四個鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩個CD3ε鏈。此等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂ζ鏈結合以形成T細胞受體CD3複合物且在T淋巴細胞中產生活化信號。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈為含有單一細胞外免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族的高度相關細胞表面蛋白。CD3分子之胞內尾部含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或簡稱為ITAM的單一保守基元，其對TCR之信號傳導能力為至關重要的。CD3ε分子為在人類中由位於染色體11上之CD3E 基因編碼的多肽。 本發明之醫藥組合物內所包含的雙特異性單鏈抗體建構物之第二結合域能夠結合於靶細胞表面抗原。一般而言，該靶細胞表面抗原可為可藉由第二結合域識別且結合於第二結合域之任何抗原。設想藉由使雙特異性單鏈抗體建構物結合於CD3及靶細胞表面抗原而在T細胞與靶細胞之間形成連接。因此認為雙特異性單鏈抗體建構物將T細胞募集至靶細胞，且較佳地，藉由產生如穿孔蛋白之促凋亡蛋白及顆粒酶而引起T細胞對靶細胞施加細胞毒活性，藉此產生靶細胞。因此靶細胞通常將為意欲作為針對T細胞介導之細胞毒性的目標，且因此進行細胞溶解之細胞。例如，靶細胞可為諸如惡性母之腫瘤細胞。靶細胞表面抗原可因此選自CD33、CD19、FAPα、MSLN、FLT3或BCMA。尤其將CD33設想為針對本發明之雙特異性單鏈抗體建構物的第一結合域之目標。 如隨附實例中所評估，本發明之較佳的雙特異性單鏈抗體建構物包括AMG 103 (包含識別CD19之第一結合域)、AMG 330 (包含識別CD33之第一結合域)、CD33特異性HLE BiTE、FLT3特異性HLE BiTE及BCMA特異性HLE BiTE。 具體言之，雙特異性單鏈建構物之第一結合域之胺基酸序列可選自由以下組成之群：SEQ ID 99、SEQ ID 109、SEQ ID 119、SEQ ID 128、SEQ ID 137、SEQ ID 146、SEQ ID 155、SEQ ID 164、SEQ ID 173、SEQ ID 183、SEQ ID 185及SEQ ID 187，且雙特異性單鏈建構物之第二結合域之胺基酸序列可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:179及SEQ ID NO:90。 本發明之較佳的雙特異性單鏈抗體建構物因此包括包含具有如選自由以下組成之群的SEQ ID NO中所描繪之胺基酸序列的多肽或由具有如選自由以下組成之群的SEQ ID NO中所描繪之胺基酸序列的多肽組成之建構物：SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188。 肽連接子 本發明抗體建構物之至少兩個結合域及可變域可包含或可不包含肽連接子(間隔肽)。根據本發明，術語「肽連接子」定義如下胺基酸序列，藉由該胺基酸序列本發明抗體建構物之一個(可變及/或結合)域與另一(可變及/或結合)域之胺基酸序列彼此連接。此類肽連接子之基本技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。適合肽連接子描述於美國專利第4,751,180號及第4,935,233號或WO 88/09344中。 在使用連接子之情況下，此連接子較佳具有一定長度及序列以足以確保第一及第二域各自可彼此獨立地保留其不同結合特異性。對於連接抗體建構物中之至少兩個結合域(或兩個可變域)之肽連接子而言，彼等肽連接子可包含僅若干數目之胺基酸殘基，例如，12個胺基酸殘基或小於12個胺基酸殘基，諸如11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基。所設想的具有小於5個胺基酸之肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸且可為富Gly的，亦即可由單一胺基酸Gly組成。其他有用之肽連接子之特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:178)，亦即Gly4 Ser或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x，其中x為1或大於1之整數。較佳地，不促成任何二級結構之肽連接子為較佳的。製備融合及操作連接之雙特異性單鏈建構物及在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法為此項技術中熟知的(例如 Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012)。 衍生物 術語「抗體建構物」亦涵蓋衍生物。術語「衍生物」一般係指已經共價修飾而引入額外功能性之抗體建構物。可藉由使分子之特異性胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N端或C端殘基反應之有機衍生劑反應來轉譯後引入抗體建構物之共價修飾。抗體建構物之衍生作用可用於附接治療劑或診斷劑、標記、延長分子之血清半衰期的基團或非天然胺基酸之插入。通常所施用之化學修飾包括以下： 半胱胺醯基殘基最常與α-鹵代乙酸酯(及相對應的胺)(諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應以產生羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生。 組胺醯基殘基藉由在pH 5.5至pH 7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生，因為此試劑對組胺醯基側鏈具相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴化物亦有用；反應物較佳在pH 6.0下用0.1 M二甲胂酸鈉進行。離胺醯基及胺基末端殘基與丁二酸或其他羧酸酐反應。用此等試劑進行衍生作用具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基的試劑包括醯亞胺酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮及轉胺酶催化之與乙醛酸酯之反應。 精胺醯基殘基藉由與一種或若干種習知試劑(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮(ninhydrin))反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺酸殘基之衍生作用需要反應在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。 可對酪胺醯基殘基進行特定修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基使用125 I或131 I碘化以製備用於放射免疫分析之經標記蛋白質，上文所述之氯胺T方法為適合的。 羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N--R')反應而選擇性地修飾，其中R及R'為視情況選用之不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。 用雙官能試劑衍生適用於使本發明之抗體建構物交聯成多種方法中所用的不溶於水之支撐基質或表面。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙官能醯亞胺酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯)及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙醯亞胺甲酯之衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間體。或者，美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中所述之反應性水不溶性基質(諸如溴化氰活化之碳水化合物)及反應性基板用於蛋白質固定。 常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基以分別形成對應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，此等殘基在適度酸性條件下脫去醯胺基。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇內。 其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基之羥基或羥丁胺醯基殘基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, 第79至86頁)N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。 糖基化及去糖基化 本發明範疇內所包括的抗體建構物之另一類共價修飾包含改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。下文論述特定表現系統。 多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，在多肽中存在此等三肽序列中之任一者皆產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸(雖然亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸但最常使用絲胺酸或蘇胺酸)連接。 向抗體建構物添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者而實現(對於N連接之糖基化位點)。亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由其取代來進行改變(對於O連接之糖基化位點)。出於簡易性，抗體建構物之胺基酸序列較佳經由DNA水準改變，尤其藉由突變預選鹼基處編碼多肽之DNA以使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子而改變。 增加抗體建構物上碳水化合物部分之數目的另一手段為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N連接及O連接之糖基化。視所用偶合模式而定，糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)游離羧基，(c)游離硫氫基，諸如半胱胺酸之硫氫基，(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之羥基，(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基，或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259至306頁中。 存在於起始抗體建構物上之碳水化合物部分之移除可以化學或酶促方式實現。化學脫糖基化作用需要將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理使得除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳胺糖)外之大多數或所有糖裂解，而保持多肽完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人, 1981,Anal.Biochem. 118:131加以描述。多肽上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol. 138:350所述之各種內醣苷酶及外醣苷酶來達成。在潛在糖基化位點處之糖基化可藉由使用如由Duskin等人, 1982, J.Biol.Chem. 257:3105所述之化合物衣黴素(tunicamycin)來阻止。衣黴素會阻斷蛋白質-N-醣苷鍵形成。 非蛋白質聚合物 抗體建構物之其他修飾涵蓋於本文中。舉例而言，抗體建構物之另一類共價修飾包含將抗體建構物連接於多種非蛋白質聚合物，其包括(但不限於)多種多元醇，諸如聚乙二醇(聚乙二醇化)、聚丙二醇、聚氧伸烷基或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物、或碳水化合物(諸如羥乙基澱粉(例如，HESylation®)或聚唾液酸(例如PolyXen® technology))之共聚物。此外，如此項技術中已知，可在抗體建構物內之多個位置中進行胺基酸取代，例如以有助於聚合物(諸如PEG)添加。 標記 在一些實施例中，本發明抗體建構物之共價修飾包含添加一或多個標記。標記基團可經由各種長度之間隔臂與抗體建構物偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知的，且可用於進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測標記。一般而言，標記屬於多種類別，視偵測標記之分析而定，以下實例包括(但不限於)： a) 同位素標記，其可為放射性或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核種(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、89 Zr、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I) b) 磁性標記(例如磁性粒子) c) 氧化還原活性部分 d) 光學染料(包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團)，諸如螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體)、化學發光基團及可為「小分子」螢光或蛋白質螢光之螢光團 e) 酶類基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼磷酸酶) f) 經生物素標記之基團 g) 由二級報導子識別的預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等) 「螢光標記」意謂可經由固有螢光特性偵測之任何分子。適合之螢光標記包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、赤藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、Malacite綠、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade BlueJ、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow及R-藻紅素(PE) (Molecular Probes, Eugene, OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce, Rockford, IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)。適合光學染料(包括螢光團)描述於Richard P. Haugland之Molecular Probes Handbook中。 適合之蛋白質螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白，包括GFP之海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物種(Chalfie等人, 1994,Science 263:802-805)、EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank寄存編號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9；Stauber, 1998,Biotechniques 24:462-471；Heim等人, 1996,Curr . Biol . 6:178-182)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories, Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人, 1993,J . Immunol . 150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人, 1988,Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A . 85:2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號；第5418155號；第5683888號；第5741668號；第5777079號；第5804387號；第5874304號；第5876995號；第5925558號)。 白胺酸拉鏈域為促進可發現該等白胺酸拉鏈域之蛋白質之寡聚的肽。白胺酸拉鏈最初在數種DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人, 1988,Science 240:1759)，且此後曾在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈當中為二聚或三聚的天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性寡聚蛋白之白胺酸拉鏈域的實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且來源於肺表面活性蛋白D (SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人, 1994,FEBS Letters 344:191中。經修飾之白胺酸拉鏈允許與其融合之異源蛋白質穩定三聚之用途描述於Fanslow等人, 1994,Semin . Immunol . 6:267-78中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之CDH19抗體片段或衍生物的重組融合蛋白表現於適合之宿主細胞中，且所形成之可溶性寡聚CDH19抗體片段或衍生物自培養物上清液回收。 抗體建構物亦可包含額外肽或域，其例如有助於分子分離或與分子之經調適之藥物動力學概況相關。有助於分離抗體建構物之域可選自肽基元或二次引入之部分，其可在分離方法(例如分離管柱)中捕捉。此類額外域之非限制性實施例包含已知為Myc標記、HAT標記、HA標記、TAP標記、GST標記、甲殼素結合域(CBD標記)、麥芽糖結合蛋白(MBP標記)、Flag標記、Strep標記及其變異體(例如StrepII標記)及His標記之肽基元。His標記域一般已知為分子之胺基酸序列中的連續His殘基，較佳六個His殘基之重複。適用於延長血清半衰期(亦即經由生物過程，例如代謝、分泌等消除所投與藥物之50%的時間)的抗體建構物之域或肽包括能夠以人體中之較佳的藥物動力學概況結合於其他蛋白質之域或肽，諸如血清白蛋白(例如AB156肽)或免疫球蛋白之恆定區(Fc域或其變異體)。 設想雙特異性單鏈抗體建構物以至多約5 mg/mL，亦即約4.0 mg/mL、3.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL或0.1 mg/mL之濃度存在於本發明之醫藥組合物中。較佳地，雙特異性單鏈抗體建構物以0.1 mg/mL至5 mg/mL之間、較佳0.2 mg/mL至2.5 mg/mL、更佳0.25 mg/mL至1.0 mg/mL之濃度存在於醫藥組合物中。 環糊精 除雙特異性單鏈抗體建構物及緩衝液以外，本發明之醫藥組合物進一步包含β-環糊精。一般而言，術語「環糊精」或「CD」係指由至少6個或大於6個1→4連接之α-D-葡萄哌喃糖苷單元構成之環寡醣。環糊精之整體結構之特徵在於在內部具有醚基且在外部具有極性之疏水性腔，其特徵在於一級羥基。多種環糊精為此項技術中已知的，包括6員環糊精(α-環糊精)、7員環糊精(β-環糊精)及8員環糊精(γ-環糊精)。包含7個α-D-葡萄哌喃糖苷單元之β-環糊精為本發明之醫藥組合物的尤其較佳組分，因為其已展示出能夠在多種壓力條件下有效地使雙特異性單鏈抗體建構物穩定。 術語「環糊精」(且尤其「β-環糊精」)亦涵蓋經化學修飾(β-)之環糊精衍生物。一般而言，可設想任何化學修飾，只要其不會降低或消除如隨附實例中所展現之醫藥組合物之有利特性即可，且尤其只要使醫藥組合物保持其穩定性即可。經化學修飾之環糊精衍生物由醚化或在葡萄糖殘基之2-羥基、3-羥基及6-羥基處引入其他官能基而產生。因此，該術語包括包含羥基之一或多個取代基之環糊精，例如，烷基化及羥基烷基化環糊精。 出於本發明目的，術語「環糊精」亦包括其醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，片語「醫藥學上可接受之鹽」意謂對於投藥而言為安全且有效的環糊精之彼等鹽。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。當然，藥物中所使用之任何相對離子必須考慮為安全的，且存在醫藥學上經批准之相對離子的若干清單，其視來源而變化。經批准之鹽形成體可例如見於Handbook of Pharmaceutical Salts (Stahl PH, Wermuth CG編 2002. Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use. Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA.)。 因此，設想本發明之醫藥組合物包含β-環糊精，尤其選自由以下組成之群的β-環糊精：β-環糊精、甲基-β-環糊精、羥乙基-β-環糊精、羥丙基-β-環糊精、乙基-β-環糊精、丁基-β-環糊精、丁二醯基-(2-羥丙基)-β-環糊精、柒(2,3,6-三-O-甲基)-β-環糊精、柒(2,3,6-三-O-苯甲醯基)-β-環糊精、β-環糊精磷酸鈉鹽、β-環糊精硫酸鈉鹽、三乙醯基-β-環糊精、柒(6-O-磺酸基)-β-環糊精七鈉鹽、羧甲基-β-環糊精鈉鹽、磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽及及6-O-對甲苯磺醯基-β-環糊精。具體而言，β-環糊精可為磺基丁醚-β-環糊精(「SBE-β-CD」)鈉鹽、羥丙基-β-環糊精(「HP-β-CD」)。 β-環糊精可以在0.1% (w/v)至20% (w/v)、較佳0.5% (w/v)至2% (w/v)且更佳0.8% (w/v)至1.5% (w/v)範圍內之濃度存在於醫藥組合物中。尤其設想未經化學修飾之β-環糊精之濃度為約1.8 % (w/v)或小於1.8 % (w/v)，諸如約1.6% (w/v)、約1.5% (w/v)、約 1.4% (w/v)、約1.3% (w/v)、約1.2% (w/v)、約1.1% (w/v)、約1.0% (w/v)、約0.9% (w/v)、約0.8% (w/v)或小於約0.8% (w/v)，下至約0.1% (w/v)之濃度。 緩衝液 本發明之醫藥組合物進一步包含緩衝液，其可選自由以下組成之群：磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸/丁二酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、組胺酸/組胺酸HCl、甘胺酸、Tris、麩胺酸、乙酸及其混合物，且尤其選自磷酸鉀、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸、組胺酸、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其組合。 適合緩衝液濃度涵蓋約200 mM或小於200 mM之濃度，諸如約190 mM、180 mM、170 mM、160 mM、150 mM、140 mM、130 mM、120 mM、110 mM、100 mM、80 mM、70 mM、60 mM、50 mM、40 mM、30 mM、20 mM、10 mM或5 mM。技術人員將易能夠調整緩衝液濃度以便提供如本文所述之醫藥組合物之穩定性。特定言之，所設想的本發明之醫藥組合物中的緩衝液濃度在約5 mM至約200 mM、較佳約5 mM至約100 mM且更佳約10 mM至約50 mM範圍內。 pH 根據本發明之醫藥組合物之pH可在約4至約7.5範圍內，亦即pH為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5。較佳地，pH在約5至約7.5，更佳約5.5至約7.5範圍內。 醫藥組合物 如本文所使用，術語「醫藥組合物」係關於一種適合於向有需要之個體投與之組合物。在本文中可互換地使用之術語「個體」或「個人」或「動物」或「患者」係指需要投與本發明之醫藥組合物的任何個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、天竺鼠、家兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛及其類似動物，其中人類為較佳的。本發明之醫藥組合物為穩定的且為醫藥學上可接受的，亦即能夠在不導致任何不合需要之局部或全身性效應的情況下在投與醫藥組合物之個體中引起所需治療效應。本發明之醫藥學上可接受之組合物可尤其為滅菌的及/或在醫藥學上為惰性的。具體言之，術語「醫藥學上可接受」可意謂經監管機構或其他一般公認之藥典批准用於動物，且較尤其用於人類中。 本發明之醫藥組合物包含較佳呈治療有效量之一個或複數個本文所述之雙特異性單鏈抗體建構物、β-環糊精及緩衝液。「治療有效量」意謂引起所需治療效應的該建構物之量。治療功效及毒性可藉由標準醫藥學程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如ED50 (在群體之50%中治療有效之劑量)及LD50 (導致群體之50%死亡之劑量)。治療效應與毒性效應之間的劑量比為治療指數，且其可表示為ED50 /LD50 比。展現大治療指數之醫藥組合物一般為較佳的。 賦形劑 除前述β-環糊精及緩衝液以外，醫藥組合物可視情況包含一或多種另外賦形劑，只要其不會降低或消除如本文所述之醫藥組合物之有利特性，且尤其醫藥組合物之穩定性即可。 賦形劑在本發明中可用於廣泛多種目的，諸如調整調配物之物理、化學或生物特性，諸如調整黏度及或本發明之方法以進一步改良有效性及或進一步穩定此類調配物及針對由於例如在製造、運送、儲存、使用前製備、投與及此後期間出現的壓力而降解及腐敗的方法。術語「賦形劑」一般包括填充劑、黏合劑、崩解劑、塗料、吸附劑、抗黏劑、滑動劑、防腐劑、抗氧化劑、調味劑、著色劑、甜味劑、溶劑、共溶劑、緩衝劑、螯合劑、黏度賦予劑、界面活性劑、稀釋劑、保濕劑、載劑、稀釋劑、防腐劑、乳化劑、穩定劑及張力調節劑。 可接受之賦形劑較佳為醫藥學上可接受的，亦即在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。 例示性賦形劑包括(但不限於)： •  胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電胺基酸，較佳離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸鹽及/或組胺酸； •  防腐劑，包括諸如抗細菌劑及抗真菌劑之抗菌劑； •  抗氧化劑，諸如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉； •  緩衝液、緩衝系統及緩衝劑，其用於使組合物維持在生理pH或略微較低的pH下，通常在約5至約8或9之pH範圍內；緩衝液之實例為硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、丁二酸鹽、磷酸鹽、組胺酸及乙酸鹽；例如約pH 7.0至8.5之Tris緩衝液或約pH 4.0至5.5之乙酸鹽緩衝液； •  非水性溶劑，諸如丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)； •  水性載劑，包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質； •  可生物降解聚合物，諸如聚酯； •  膨化劑，諸如甘露糖醇或甘胺酸； •  螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)； •  等張及吸收延緩劑； •  複合劑，諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精； •  填充劑； •  單醣；雙糖；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可為非還原糖，較佳海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨糖醇或木糖醇； •  (低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質載劑，諸如人類或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳來源於人類； •  著色劑及調味劑； •  含硫還原劑，諸如麩胱甘肽、硫辛酸、硫乙醇酸鈉、硫代甘油、[α]-單硫代甘油及硫代硫酸鈉 •  稀釋劑； •  乳化劑； •  親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮； •  成鹽相對離子，諸如鈉； •  防腐劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物；實例為：氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫； •  金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質錯合物； •  溶劑及共溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)； •  糖及糖醇，包括多元醇、海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇(inositol))、聚乙二醇；及多羥基糖醇； •  懸浮劑； •  界面活性劑或濕潤劑，諸如普朗尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)；界面活性劑可為分子量較佳＞1.2 KD之清潔劑及/或分子量較佳＞3 KD之聚醚；較佳清潔劑之非限制性實例為Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及Tween 85；較佳聚醚之非限制性實例為PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000及PEG 5000； •  穩定性增強劑，諸如蔗糖或山梨糖醇； •  張力增強劑，諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇山梨糖醇； •  非經腸遞送媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液或不揮發性油； •  靜脈內遞送媒劑，包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之補充劑)。 對於熟習此項技術者顯而易見的是，醫藥組合物之不同賦形劑(例如上文所列之賦形劑)可具有不同效應，例如胺基酸可充當緩衝劑、穩定劑及/或抗氧化劑；甘露糖醇可充當膨化劑及/或張力增強劑；氯化鈉可充當遞送媒劑及/或張力增強劑；等。 多元醇在液態及凍乾調配物中為適用穩定劑以保護蛋白質免受物理及化學降解過程影響，且亦適用於調整調配物之張力。多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇及諸如甘油及丙二醇之多元醇及(出於本文論述之目的)聚乙二醇(PEG)及相關物質。甘露糖醇通常用於確保凍乾調配物中之塊狀物的結構穩定性。其確保凍乾塊之結構穩定性。其一般與凍乾保護劑(例如蔗糖)一起使用。山梨糖醇及蔗糖為通常用於調整張力之試劑且用作在運輸期間避免凍融壓力或在製造過程期間避免製備塊體的穩定劑。PEG適用於使蛋白質穩定且用作低溫保護劑。 界面活性劑常規用於預防、最小化或減少表面吸附。蛋白質分子可易於吸附於表面上及變性且隨後在氣-液、固-液及液-液界面聚集。此等效應一般與蛋白質濃度成反比。此等有害相互作用一般與蛋白質濃度成反比且通常藉由諸如在產品裝運及操作期間產生的物理攪動而加劇。常用界面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇聚乙氧基化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188。界面活性劑亦常用於控制蛋白質構形穩定性。就此而言，界面活性劑之用途具有蛋白質特異性，因為任何給定界面活性劑通常將使一些蛋白質穩定且使其他蛋白質不穩定。 聚山梨醇酯易於氧化降解且常常在供應時含有足夠量之過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈(尤其甲硫胺酸)氧化。因此，聚山梨醇酯應謹慎使用且當使用時，應在其最低有效濃度下使用。 抗氧化劑可藉由維持環境氧氣及溫度之適當水準且藉由避免曝露於光而在一定程度上防止醫藥調配物中之蛋白質受到有害氧化。亦可使用抗氧化劑賦形劑來防止蛋白質之氧化降解。就此而言，適用之抗氧化劑為還原劑、氧氣/自由基清除劑及螯合劑。供用於治療蛋白質調配物中之抗氧化劑較佳為水溶性的且在整個產品之存放期中保持其活性。EDTA為適用實例。 金屬離子可充當蛋白質輔助因子且使得能夠形成蛋白質配位錯合物。金屬離子亦可抑制一些降解蛋白質之過程。然而，金屬離子亦催化降解蛋白質之物理及化學過程。鎂離子(10 mM至120 mM)可用於抑制天冬胺酸異構化成異天冬胺酸。Ca+ 2 離子(至多100 mM)可增加人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg+ 2 、Mn+ 2 及Zn+ 2 可使rhDNase去穩定化。類似地，Ca+ 2 及Sr+ 2 可使因子VIII穩定，因子VIII可藉由Mg+ 2 、Mn+ 2 及Zn+ 2 、Cu+ 2 及Fe+ 2 去穩定化，且其聚集可藉由Al+ 3 離子增加。 防腐劑具有抑制微生物生長之主要功能且確保產品在整個存放期或藥品使用期中之無菌性，且為多劑量調配物所特別需要的。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有較長的與小分子注射劑一起使用之歷史，但研發包括防腐劑之蛋白質調配物可能具有挑戰性。防腐劑幾乎始終具有對蛋白質之不穩定化效應(聚集)且此已變成限制其在蛋白質調配物中使用的主要因素。到目前為止，已調配大多數蛋白質藥物僅用於單次使用。然而，當多劑量調配物為可能的時，其具有使得患者能夠方便且增加可銷售性的附加優勢。良好實例為人類生長激素(hGH)，其中防腐調配物的研發已使得較為方便的多次使用注射筆呈現商業化。 如可預期，研發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰性。凍乾產品可在無防腐劑的情況下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復原。此縮短防腐劑與蛋白質接觸的時間，使相關穩定性風險顯著降至最低。在液體調配物之情況下，應歷經整個產品存放期(約18至24個月)維持防腐劑有效性及穩定性。注意的重點為防腐劑有效性應展現在含有活性藥物及全部賦形劑組分之最終調配物中。 可根據本發明使用鹽以例如調整醫藥調配物之離子強度及/或等張性及/或進一步改良抗體建構物或其他成分之可溶性及/或物理穩定性。如所熟知，離子可藉由結合於蛋白質表面上之帶電殘基且藉由遮蔽蛋白質中之帶電及極性基團且減小其靜電相互作用、吸引及排斥相互作用的強度而使天然狀態之蛋白質穩定。離子亦可藉由結合於詳言之蛋白質之變性肽鍵(--CONH)而使變性狀態之蛋白質穩定。此外，離子與蛋白質中之帶電及極性基團的相互作用亦可減小分子間靜電相互作用，由此防止或減少蛋白質聚集及不可溶性。離子種屬之不同之處在於其對蛋白質之效應。已完善可用於調配根據本發明之醫藥組合物的多種類別等級的離子及其對蛋白質之效應。一個實例為霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)，其藉由對蛋白質在溶液中之構形穩定性的效應排列離子及極性非離子溶質。使溶質穩定稱為「親液的」。使溶質去穩定化稱為「離液的(chaotropic)」。親液劑通常在高濃度(例如＞1莫耳濃度硫酸銨)下使用以使蛋白質自溶液沈澱(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白質變性及/或溶解(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性定義其在霍夫梅斯特序列中之位置。 游離胺基酸可作為膨化劑、穩定劑及抗氧化劑用於醫藥組合物中以及其他標準用途中。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白質穩定。甘胺酸適用於凍乾以確保恰當的凍乾塊結構及特性。精胺酸可適用於在液態及凍乾調配物中抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。 用於調配醫藥組合物的特別適用之賦形劑包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、精胺酸、離胺酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普洛尼克及其組合。該賦形劑可以不同濃度存在於醫藥組合物中，只要組合物展現出如文中所例示之所期望之特性，且尤其促進所含雙特異性單鏈抗體建構物之穩定性即可。舉例而言，蔗糖可以2% (w/v)與12% (w/v)之間之濃度，亦即以12% (w/v)、11% (w/v)、10% (w/v)、9% (w/v)、8% (w/v)、7% (w/v)、6% (w/v)、5% (w/v)、4% (w/v)、3% (w/v)或2% (w/v)之濃度存在於醫藥組合物中。較佳的蔗糖濃度在4% (w/v)與10% (w/v)之間且更佳在6% (w/v)與10% (w/v)之間的範圍內。聚山梨醇酯80可以0.001% (w/v)與0.5% (w/v)之間之濃度，亦即以0.5% (w/v)、0.2% (w/v)、0.1% (w/v)、0.08% (w/v)、0.05% (w/v)、0.02% (w/v)、0.01% (w/v)、0.008% (w/v)、0.005% (w/v)、0.002% (w/v)或0.001% (w/v)之濃度存在於醫藥組合物中。較佳的聚山梨醇酯80濃度在0.002% (w/v)與0.5% (w/v)之間，且較佳在0.005% (w/v)與0.02% (w/v)之間的範圍內。 本文所提供之醫藥組合物可尤其包含一或多種防腐劑。 用於調配醫藥組合物之適用防腐劑一般包括抗菌劑(例如抗細菌劑或抗真菌劑)、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物；實例為：氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)。抗微生物防腐劑為用於藉由減少微生物增殖來延長藥物存放期之物質。特別適用於調配本發明之醫藥組合物的防腐劑包括苯甲醇、氯丁醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞。關於使用此等防腐劑之結構及典型濃度描述於Meyer等人 J Pharm Sci. 96(12), 3155之表1中。 前述防腐劑可以不同濃度存在於醫藥組合物中。舉例而言，苯甲醇可以介於0.2% (v/v)與1.1% (v/v)之間的濃度存在，氯丁醇以介於0.3% (v/v)至0.5% (v/v)之間的濃度存在，苯酚以介於0.07% (v/v)與0.5% (v/v)之間的濃度存在，間甲酚以介於0.17% (v/v)與0.32% (v/v)之間的濃度存在或硫柳汞以介於0.003% (v/v)至0.01% (v/v)之間的濃度存在。對羥基苯甲酸甲酯之較佳濃度在0.05% (v/v)與0.5% (v/v)範圍內，苯氧基乙醇之較佳濃度在0.1% (v/v)與3% (v/v)範圍內，對羥基苯甲酸丙酯之較佳濃度在0.05% (v/v)與0.5% (v/v)範圍內。 然而，亦可設想醫藥組合物不包含任何防腐劑。具體而言，本發明尤其提供一種不含防腐劑之醫藥組合物，其包含濃度為約0.5 mg/ml的具有如SEQ ID NO. 100及SEQ ID NO. 110中所描繪之胺基酸序列的雙特異性單鏈抗體建構物，濃度為約1% (w/v)之磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽及濃度為約10 mM之磷酸鉀，且進一步包含濃度為約8% (w/v)之蔗糖及在約6.0之pH下的濃度為約0.01%(w/v)之聚山梨醇酯80。 形式 本發明之醫藥組合物可調配呈各種形式，例如呈固體形式、液體形式、冷凍形式、氣態形式或凍乾形式，且可尤其呈軟膏、乳膏、經皮貼片、凝膠、粉末、錠劑、溶液、氣溶膠、顆粒、丸劑、懸浮液、乳液、膠囊、糖漿、液體、酏劑、萃取物、酊劑或流浸膏(fluid extract)形式。 一般而言，可設想本發明之醫藥組合物呈多種儲存及/或劑量形式，其一般視所欲投藥途徑、遞送形式及所需劑量而定(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第22版, Oslo, A.,編, (2012))。技術人員將意識到此類特定劑型之選擇可例如影響本發明之抗體建構物的實體狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。 舉例而言，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑實際上可為水性或非水性的。適合媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液，其中可能補充有供非經腸投與之組合物中所常見之其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水為另外的例示性媒劑。 當考慮非經腸投與時，可以包含所需抗體建構物的於醫藥學上可接受之媒劑中的無熱原質、可非經腸接受之水溶液形式提供本發明之治療性組成物。尤其適合於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中抗體建構物調配成恰當保存之無菌等張溶液。製備可涉及所需分子與諸如可注射微球、生物易侵蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑一起調配，該試劑可提供可經由儲槽式注射遞送之產物的受控或持續釋放。亦可使用玻糖醛酸，其具有在循環中促進持續作用時間的作用。植入式藥物遞送裝置可用於引入所需抗體建構物。 亦在本文中設想持續或受控遞送/釋放調配物。用於調配多種其他持續或受控遞送方式(諸如脂質體載劑、生物易侵蝕微粒或多孔珠粒及儲槽式注射劑)的技術亦為熟習此項技術者所知。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其描述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合微粒的受控釋放。持續釋放製劑可包括呈成形製品(例如膜或微囊)形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示)、L-麩胺酸及L-麩胺酸γ-乙酯之共聚物(Sidman等人, 1983, Biopolymers 2:547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯) (Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277及Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人, 1981，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備之脂質體。參見例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號。抗體建構物亦可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別為例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第22版, Oslo, A.,編, (2012)中。 用於活體內投與之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提供。可藉由經由無菌過濾膜過濾來實現滅菌。當組合物經凍乾時，使用此方法之滅菌可在凍乾及復原之前或之後進行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。非經腸組合物一般置放於具有無菌接取口之容器中，例如具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。 本文所揭示之抗體建構物亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於遞送藥物至哺乳動物之界面活性劑構成的小囊泡。脂質體之組分通常排列為雙層形式，類似於生物膜之脂質排列。含有抗體建構物之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，該等方法諸如描述於Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號及WO 97/38731中。循環時間增加之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。特別適用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。本發明之抗體建構物的Fab'片段可如Martin等人 J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)中所述經由二硫鍵互換反應與脂質體結合。脂質體內視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人 J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。 其他活性劑 據設想，視組合物之預期用途而定，除本文所定義之雙特異性單鏈抗體建構物以外，本發明之組合物可包含其他生物學活性劑。此類藥劑可處於作用於腫瘤及/或惡性細胞之特定藥物中，但視醫藥組合物之所欲用途而定，亦可設想其他活性劑，包括作用於胃腸系統之藥劑、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節發炎反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或諸如細胞介素的本領域中已知之藥劑。亦設想本發明之醫藥組合物施用於輔助療法中，亦即與另一抗癌藥劑組合。 儲存 醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌瓶中。此類調配物可以即用形式或在投與前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。例如，凍乾組合物可在(例如)注射用抑菌水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或蛋白質在凍乾之前所處之相同調配物中復原。 投藥途徑 本發明之醫藥組合物可一般經調配以藉由任何適合之投藥途徑來遞送。在本發明之情形下，投藥途徑包括(但不限於)局部途徑(諸如上表皮、吸入、鼻、眼、經耳/耳、陰道、黏膜)；經腸途徑(諸如經口、胃腸道、舌下、唇下、頰內、直腸)；及非經腸途徑(諸如靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、官腔內)。 本文所述之醫藥組合物尤其適用於非經腸投與，例如藉由諸如快速注射之注射或藉由諸如連續輸注之輸注進行例如皮下或靜脈內遞送。醫藥組合物可使用醫療裝置投與。用於投與醫藥組合物之醫療裝置的實例描述於美國專利第4,475,196號；第4,439,196號；第4,447,224號；第4,447, 233號；第4,486,194號；第4,487,603號；第4,596,556號；第4,790,824號；第4,941,880號；第5,064,413號；第5,312,335號；第5,312,335號；第5,383,851號；及第5,399,163號中。 亦可不間斷地投與本發明之醫藥組合物。作為一非限制性實例，可藉由用於對流入患者體內之抗體建構物進行定量的由患者穿戴之小型泵系統來實現不間斷的或實質上不間斷的，亦即連續投藥。可藉由使用該等泵系統投與醫藥組合物。此類泵系統一般為此項技術中已知，且通常依賴於定期更換容納欲輸注治療劑之藥筒。在更換此類泵系統中之藥筒時，可繼而暫時中斷治療劑向患者身體之流動，否則該流動為不間斷的。在此情況下，在本發明之醫藥手段及方法之含義內，藥筒更換前之投藥階段及藥筒更換後之投藥階段仍認為一起構成此類治療劑之一次「不間斷投與」。 連續或不間斷投與本發明之醫藥組合物可為靜脈內或皮下投與，其藉助於包括用於驅使流體離開儲集器之流體驅動機構及用於致動驅動機構之致動機構的流體傳遞裝置或小型泵系統。用於皮下投與之泵系統可包括用於穿透患者皮膚且向患者體內遞送適合組合物之針或導管。該等泵系統可直接獨立於靜脈、動脈或血管固定或附著於患者之皮膚，從而使得泵系統與患者皮膚之間可直接接觸。泵系統可附著於患者皮膚24小時至數天。在小體積儲集器之情況下，泵系統可具有小尺寸。作為一非限制性實例，用於投與適合醫藥組合物之儲集器的體積可在0.1 ml與50 ml之間。 連續投藥亦可藉助於皮膚上穿戴之貼片且以一定時間間隔更換來以經皮形式達成。熟習此項技術者已知適用於此目的之用於藥物遞送之貼片系統。值得注意地，經皮投藥尤其適於不間斷投藥，因為更換第一費貼片可藉由例如在緊鄰第一費貼片之皮膚的表面上置放新的第二貼片且隨後立即移除第一費貼片而同時有利地實現。不會發生流動中斷或電源電池故障之問題。 技術人員將容易理解，本發明之醫藥組合物可一般包含前述賦形劑中之任一者或額外活性劑，或可以任何適合之形式提供，只要其為穩定的且較佳展現出與隨附實例中所評估的包含β-環糊精之醫藥組合物相同之有利特性即可。技術人員將容易能夠調整各種組分以便提供穩定的，亦即較佳實質上不含其中所包含的雙特異性單鏈抗體片段之聚集體及/或構象異構體的醫藥組合物。 ***** 必須注意，如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，例如對「試劑」之提及包括此類不同試劑中之一或多者，且對「方法」之提及包括提及一般熟習此項技術者已知的可對本文所述之方法進行修改或取代的等效步驟及方法。 除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指該系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所述的本發明之特定實施例之多種等效物。本發明意欲涵蓋此類等效物。 本文各處所用之術語「及/或」包括「及」、「或」及「由該術語連接之要素之所有或任何其他組合」之含義。 如本文所用，術語「約」或「大約」意謂在給定值或範圍之20%內、較佳10%內且更佳5%內。然而，其亦包括具體數目，例如約20包括20。 術語「小於」或「大於」包括該具體數目。舉例而言，小於20意謂小於或等於20。類似地，超過或大於分別意謂超過或等於，或大於或等於。 在整個本說明書及隨後之申請專利範圍中，除非本文另有規定，否則「包含(comprise)」一詞及變化形式(諸如「包含(comprises/comprising)」)應理解為暗示包括所述整體或步驟或整體或步驟之群，但不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟之群。當在本文中使用時，術語「包含」可經術語「含有」或「包括」取代，或有時當在本文中使用時，經術語「具有」取代。 當在本文中使用時，「由……組成」排除所主張要素中未規定之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除實質上不影響申請專利範圍之基本及新穎特徵之材料或步驟。 在本文各情況下，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中任一者可經其他兩個術語中之任一者替換。 應理解，本發明不限於本文所述之具體方法、方案、材料、試劑及物質等且因此可有所變化。本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而並不意欲限制本發明之範疇，該範疇僅由申請專利範圍界定。 本說明書之文本中所引用之所有出版物及專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商之說明書、說明等)，無論前述或下述，特此以全文引用之方式併入。本文不應解釋為承認本發明無權先於先前發明之此類揭示內容。以引用的方式併入之材料達到與本說明書矛盾或不一致之程度時，本說明書將替代任何此類材料。 本發明及其優點之較佳理解將由以下實例獲得，所提供之實例僅為達成說明之目的。實例意欲不會以任何方式限制本發明之範疇。 實例 實例1：經溫度誘導之壓力對包含AMG330及HP-β-CD之調配物之影響 使羥基磷灰石層析所產生之AMG 330蛋白質池(SEQ ID NO:100)在由100 mM tris鹼、50 mM 磷酸氫二鈉、處於pH 5.2下之4% (w/v)二水合海藻糖構成的調配鹼緩衝液中透析。藉由重量莫耳滲透濃度量測驗證透析終點。藉由超濾及離心將所透析之本體濃縮至濃度為0.96 mg/mL且藉助於0.2 µm PVDF過濾器進行無菌過濾。將經預調配之本體劃分為三個同等大小之體積部分。使用5M氫氧化鈉分別將此等部分調整為pH 5.2、pH 5.6及pH 6.0且再次用0.2 µm PVDF過濾器過濾。pH調整之後，將所需體積之儲備溶液外加於預調配之本體，該等儲備溶液含有1% (w/V)聚山梨醇酯20、1% (w/V)聚山梨醇酯80或4% (w/V)HP-β-CD任一者。最終調配物中之聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及HP-β-CD之濃度展示於圖1中。使用如上所述所構成之鹼緩衝液將各調配物之濃度調整為0.4 mg/mL。全部賦形劑均以藥典級施加。在聚丙烯反應試管中填充150 µL最終調配物且在30℃下之受控箱中培育72小時。用尺寸排阻超高效液相層析(SE-UPLC)測定構象異構體及高分子量物種(HMWS)之含量。使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)在Acquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。管柱溫度設定成25℃。藉由在0.4 mL/min之流動速率下施用等度方法達成各尺寸變異體之分離。移動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl (pH 6.8)構成。總運作時間為6.0分鐘。樣品在自動取樣器內保持在8℃下直至加以分析。注射體積為7.5 µL。為了避免殘留，在各樣品之後進行40% ACN之中間注射。偵測係基於螢光(Ex 280 nm，Em 325 nm)。使用Empower® 軟體進行峰積分。報導單體及尺寸變異體之相對AUC。可能顯示在HP-β-CD存在下非單體蛋白質種屬(包括構象異構體及高分子量種屬)之形成在熱壓力(30℃)期間可得到抑制(圖1)。對比而言，含有聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80之調配物隨時間推移展現出形成非單體種屬。 實例2：經表面誘導之壓力對包含AMG330及HP-β-CD之調配物的影響 進行另一實驗以評定HP-β-CD是否會不受經表面誘導之壓力條件而使AMG 330穩定。以35 mM tris鹽酸鹽、17.5 mM磷酸氫磷酸鈉、100 mM L-精胺酸鹽酸鹽及1.4% (w/V)二水合海藻糖(pH 6.0)調配之AMG 330原料藥補充有圖2中所描繪之不同濃度下的聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或HP-β-CD (x軸)。全部賦形劑均以藥典級施加。在預洗滌及預滅菌I型玻璃小瓶中填充1.0 mL調配物。用滅菌丁基橡膠塞子塞住小瓶且用鋁蓋密封。藉由(1)十次連續連續冷凍/解凍循環及(2)發泡來使調配物受壓力。在Epsilon 2-6D中試規模凍乾器(Christ，Germany)中進行冷凍及解凍。冷凍及解凍之目標溫度分別設定成-50℃及20℃。使用0.3 K/min.之冷凍及解凍速率。各溫度之後為1小時等溫平穩階段。藉由歷經1小時使用21G注射針頭以每分鐘80 mL將氮氣注射至對應溶液中來達成發泡。使用配備有無菌過濾器之第二注射針頭來使小瓶排氣。儲存於-70℃下之樣品用作未受壓力之對照。根據Deutscher Arzneimittel Codex (DAC)測試5藉由SE-UPLC及可見光檢測來分析樣品。如根據實例1所述進行SE-UPLC。經由在280 nm下之吸收另外進行蛋白質濃度偵測之評定。在未受壓力之對照樣品中，變得顯而易見的是，若與具有HP-β-CD之調配物相比，含有聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80之調配物中的包括構象異構體、二聚體及聚集體之非單體種屬較為充足。當藉由發泡及冷凍/解凍而受壓力時，含有聚山梨醇酯之調配物中非單體種屬增加(圖2)。HP-β-CD之使用減少非單體種屬之形成。在不存在任何界面活性劑之情況下，觀測到大於80%之蛋白質損失而使用聚山梨醇酯及HP-β-CD引起定量蛋白質復原。與不含界面活性劑之調配物相比，含有HP-β-CD之調配物在可見大小範圍內幾乎不含蛋白質聚集體(表1)。表 1 ： 根據PhEur 2.9.20的可見粒子之評定。根據Deutscher Arzneimittel Codex (DAC)測試5指定檢測結果等級。
Figure AA1
 1 根據Deutscher Arzneimittel Codex (DAC)測試5之藥典要求：檢測結果＜4.5 實例3：苯甲醇對包含AMG103及HP-β-CD或SBE-β-CD之調配物的影響 在含有0.6 mg/mL AMG 103 (布林莫單抗(blinatumomab))之調配物中研究在苯甲醇存在下HP-β-CD及SBE-β-CD對BiTE® 抗體建構物之穩定性的影響。因此，以20 mM組胺酸、2% (w/v)二水合海藻糖、0.9% (w/v)氯化鈉(pH 7.0)調配AMG 103。此調配物補充有不同濃度之HP-β-CD (0.5% w/V及1.0% w/V)或SBE-β-CD (0.5% w/V、1.0 % w/V及2.0 % w/V)。不含環糊精之調配物充當對照。將全部調配物中之AMG 103濃度調整至0.6 mg/mL。全部賦形劑均以藥典級施加。全部調配物均外加0.9% (V/V)苯甲醇且在聚丙烯反應試管中填充至0.5 mL。在37℃下進行培育24小時。藉由UV吸收分析樣品以測定350 nm下之光密度作為蛋白質聚集之量度且藉由固有螢光發射強度量測以便偵測可能之構形變化。在Infinite M1000盤讀取器(Tecan)上使用透明的半面96孔培養盤(Corning)進行UV吸收。各孔填充有100 µL樣品溶液。以一式三份進行樣品量測。在350 nm下記錄UV吸收。自底部在同一培養盤中分析固有螢光發射強度。在278 nm下實現激發。使用1 nm增量自300 nm至500 nm記錄發射強度。激發及發射狹縫分別設定成10 nm及5 nm。在UV及螢光量測期間，控制培養盤溫度(25℃)。 350 nm下之光學密度(OD)指示在HP-β-CD或SBE-β-CD存在下降低之AMG 103聚集傾向。伴隨增加環糊精濃度影響較為明顯(圖3)。在苯甲醇存在下AMG 103之聚集轉譯為由固有螢光展現之局部環境色胺酸殘基變化。此等變化伴隨不同β-CD之濃度增加而降至最低(圖4)。 實例4：苯甲醇對包含不同濃度之AMG103及β-CD的調配物之影響 升高濃度之HP-β-CD及SBE-β-CD對AMG 103(布林莫單抗)之聚集傾向的影響由2級4因子全階乘實驗性設計來論述。如根據實例2所述調配AMG 103。然而，其濃度在0.2 mg/mL與0.6 mg/mL之間變化(表2)。表 2 ：評定在苯甲醇存在下SBE-β-CD及HP-β-CD對AMG 103之聚集傾向的影響之2級4因子全階乘實驗性設計
Figure AA2
 在37℃下在透明半面96孔培養盤(Corning)中直接培育全部樣品96小時。用黏著箔片覆蓋培養盤以避免蒸發損失。同樣，將350 nm下之光學密度視為AMG 103聚集之量度(參見實例3)。使用Statistica® 軟體經由變異數分析(ANOVA)評估分析性資料。藉由對照原始殘數繪製期望正常值來以圖形方式驗證所量測值之正常分佈。基於分析性資料之回歸由Statistica® 產生預測模型(圖5)。藉此，將純因子效應以及因子之間的線性相互作用考慮在內。在AMG 103及苯甲醇之給定濃度下，AMG 103之聚集可隨HP-β-CD或SBE-β-CD之含量增加而減少(圖5)。 實例5：經儲存誘導之壓力對包含雙特異性抗體建構物及β-CD之調配物的影響 分別在20 mM檸檬酸、6% (w/V)蔗糖(pH 5.0)中及在20 mM磷酸鉀、6% (w/V)蔗糖(pH 6.0)中透析含有於20 mM磷酸鉀中之大約1 mg/mL CD33_2-hALB、150 mM L-精胺酸鹽酸鹽及6% (w/V)二水合海藻糖(pH 6.0)之預調配原料藥。經由重量莫耳滲透濃度量測測定透析終點。使用Slide A Lyzer® 裝置進行透析。透析之後，用VivaSpin® 裝置將檸檬酸鹽緩衝材料直接濃縮超過7 mg/mL。在2℃至8℃下以大約2000 g進行離心5分鐘。同樣處理磷酸鉀緩衝材料。然而，在離心步驟之前會將材料劃分成兩個同等大小之體積部分。將一個部分調整至pH 7.0。第二部分之pH維持在pH 6.0下。經由0.2 µm PVDF過濾器無菌過濾之後，藉由適用時添加聚山梨醇酯80與SBE-β-CD之儲備溶液最終調配成濃縮液。CD33_2-hALB目標濃度為5.0 mg/mL。將最終經調配之本體填充至預洗滌及預滅菌之I型玻璃瓶。用滅菌丁基橡膠塞子塞住小瓶且用鋁蓋密封。填充體積總計為1.0 mL。調配物之概述由表3提供。在處於37℃下之溫度受控箱中將小瓶儲存六天。使用根據實例1所述之方法藉由SE-UPLC對高分子量種屬進行定量。蛋白質注入量總計為3 µg。表 3 ：CD33_2-hALB調配物之概述
Figure AA3
 若與不含環糊精之製備物相比，含有SBE-β-CD之調配物(F2、F4、F6)在培育之後顯示較低量之高分子量種屬(HMWS)。影響在pH 6及pH 7下比在pH 5下更明顯(圖6)。 實例6：超濾及透濾對包含雙特異性抗體建構物及β-CD之調配物的影響 藉由超濾(UF)逐步濃縮純化MSLN-hALB(亦即，SEQ ID NO:176)。首先使用配備有再生纖維素膜及0.11 m2 之表面的盒子進行七倍濃縮。用表面為50 cm2 之較小膜進行另一七倍濃縮。兩種膜之分子量截止值(MWCO)均為10 kDa。對於超濾及透濾步驟而言，跨膜壓力限制在1.4巴。濃縮池分成兩個部分。將第一部分透濾成由20 mM磷酸鉀、150 mM L-精胺酸鹽酸鹽、6% (w/V)二水合海藻糖(pH 6.0)構成之緩衝液。將第二部分透濾成由20 mM磷酸鉀、2% (w/V)蔗糖(pH 6.0)構成之緩衝液。藉由將濃縮儲備溶液添加至透濾材料中來調整列於表4中之最終調配物。全部賦形劑均以藥典級施加。目標MSLN-hALB濃度為1.0 mg/mL。表 4 ：MSLN-hALB調配物之概述
Figure AA4
 經由0.2 µm PVDF過濾器無菌過濾最終MSLN-hALB原料藥且填充至預洗滌及預滅菌I型玻璃瓶中。用滅菌丁基橡膠塞子塞住小瓶且用鋁蓋密封。填充體積總計為1.0 mL。分別在處於25℃及37℃下之溫度受控箱中將小瓶儲存至多兩週。使用根據實例1所述之方法藉由SE-UPLC對高分子量種屬進行定量。蛋白質注入量總計為3 µg。使用弱陽離子交換超高效液相層析(WCX-UPLC)測定酸性電荷變異體。使用Protein-Pak Hi Res CM 7μm 4.6×100mm管柱在UPLC H類Aquity (Waters)上進行WCX-UPLC。管柱溫度設定成30℃。為了達成層析分離，應用以下梯度(表5)：表 5 ：WCX-UPLC梯度之概述
Figure AA5
 溶離劑A由pH 6.5下之20 mM磷酸鈉構成。溶離劑B由20 mM磷酸鈉、250 mM氯化鈉(pH 6.5)構成。蛋白質注入量總計為3 µg。流動速率為0.65 mL/min。在注入之前，將樣品保持在8℃下之自動取樣器中。蛋白質偵測依賴於固有螢光強度之量測。在280 nm下進行激發且在330 nm下進行發射。基於相對曲線下面積(AUC)對酸性電荷變異體進行定量。使用Empower® 軟體進行積分。 針對具有SBE-β-CD之調配物觀測到最低高分子量種屬(HMWS)形成速率(圖7B)。由酸性電荷變異體之最低部分所指示，含有SBE-β-CD之調配物的化學穩定性亦為最明顯的(圖8)。 實例7：具有SBE-β-CD及海藻酸鹽之AMG 330的LLPS LLPS：液-液相分離(LLPS)由膠態粒子(例如蛋白質)之間的淨吸引引起且由此為此吸引之強度的量度。當蛋白質之間存在吸引時，在共存富蛋白質相與蛋白質相中發生LLPS，限制條件為溫度足夠低。在LLPS中，共存相處於真正的熱力學平衡且為完全可逆的，且共存相之濃度僅視溫度而定而並非視初始蛋白質濃度而定。LLPS可藉由添加PEG來引起。若蛋白質之間存在較強吸引，則發生LLPS所需之PEG濃度較低，其反過來指示此等蛋白質將容易聚集。在給定溫度及PEG濃度下，增加蛋白質之膠態穩定性的賦形劑引起貧蛋白質相之蛋白質濃度較高。可相對於不含賦形劑之對照以層析方式量測此蛋白質濃度之增加。在調配物研發中，期望觀測到LLPS且評估蛋白質分子之間的吸引。 此實驗目的在於使用LLPS來評估SBE-β-CD及海藻酸鹽對AMG 330之膠態穩定性的影響。表 6 .溶液組成及製備：
Figure AA6
 表 7. 樣品組成及製備：
Figure AA7
 如上表6及表7中所提及，製備不同溶液/樣品組合物及製備物。製備樣品(最終AMG 330濃度為0.12 mg/ml)且在40℃下培育三天。隨後微離心樣品(Eppendorf Centrifuge 5418，St.Louis，MO，USA)20秒且移除 80 µL清液層且藉由分析性CEX (ProPac WCX-10管柱，2mm ID)在Agilent層析系統(Agilent 1200，Santa Clara，CA，USA)中分析。 分析性CEX：將70 µL樣品注入至經20 mM檸檬酸、0.005%疊氮化鈉(pH 6.0)平衡且用20 mM檸檬酸、1 M氯化鈉、0.005%疊氮化鈉(pH 6.0)溶離之CEX管柱中，梯度時間為30分鐘(總運作時間：每次注入45分鐘)，氯化鈉最大濃度為500 mM，流動速率為0.2 mL/min。在運作期間，自動取樣器溫度維持在40℃下。根據層析圖計算樣品之峰面積(圖9及圖10)。 實例8：緩衝液交換及在4種不同調配物(包括SBE-β-CD)存在下藉由超濾離心進行的AMG 330蛋白質濃縮表 8 ：溶液組成及製備(體積以mL為單位)：
Figure AA8
Figure AA8-1
 表 9 ：樣品組成及製備：
Figure AA9
 初始蛋白質濃度為0.4 mg/ml。將2 mL 0.4 mg/ml AMG 330置放於Amicon ultra 15 ml離心過濾器，MWCO 10,000中。將10 mL合適緩衝液添加至各試管中且與蛋白質小心混合且在4℃下以2000 rpm離心(Allegra 6R Centrifuge，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)3小時。隨後與保留物小心混合且在25℃下以2500 rpm將試管離心1.5小時。按照保留物體積為200 µL至250 µL，將10 mL合適緩衝液添加至各者中且與保留物小心混合，且隨後在25℃下以2500 rpm離心30分鐘達至200 µL至250 µL之最終體積。4種不同調配物中之最終蛋白質濃度介於2.9 mg/ml至3.7 mg/ml。 分析性SEC：藉由分析性SEC (TSKgel G3000SWXL，7.8mm ID，PA，USA)在Agilent層析系統(Agilent 1200，Santa Clara，CA，USA)中用100 mM磷酸鈉、250 mM氯化鈉，pH 6.8之運作緩衝液以0.5 mL/min之流動速率分析樣品(總運作時間：每次注入35分鐘)。在運作期間，自動取樣器溫度維持在4℃下。 SBE-β-CD之存在呈現提供對AMG 330之顯著保護以免在藉由以最低相對量之聚集體超濾進行蛋白質濃縮期間在含有SBE-β-CD之調配物中形成HMW。含有精胺酸、麩胺酸、蔗糖、甘露糖醇及PS-80之調配物具有最高量之HMW，之後為含有Tris、磷酸鹽、精胺酸、海藻糖及PEG 4000之調配物(圖11)。CEX分析顯示相似影響(資料未展示)。 實例9：包括SBE-β-CD之AMG 330的小規模調配物研究(LLPS、FT、UFC) 此實驗目的在於評估AMG 330在14種不同調配物中在多種壓力之後的穩定性。具體言之，在LLPS、20次冷凍/解凍(F/T)循環及藉由超濾/離心(UFC)濃縮之後評估AMG 330。如實例8中所示，SBE-β-CD提供保護以免AMG 330聚集且在此實驗中進一步加以評估。對於UFC (圖12A、圖12B)而言，僅研究5種調配物。對於LLPS及F/T研究(圖12C、圖12D)而言，研究14種調配物。藉由分析性CEX分析LLPS樣品，而藉由分析性SEC及CEX兩者分析UFC及F/T樣品。 材料及方法：表 10 .儲備溶液製備：
Figure AA10
 超濾/離心(UFC)：表 11 . 針對UFC之樣品組合物製備(體積以µL為單位)。
Figure AA11
 對於各樣品而言，將4 mL 0.4 mg/mL AMG 330置放於MWCO 10,000之Amicon Ultra 15 ml離心過濾管中。將8 mL合適緩衝液添加至各試管中且與蛋白質小心混合且在20℃下以2000 rpm(4000 rcf)離心(Allegra 6R Centrifuge，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)直至保留物體積為200 µL至250 µL為止。針對總共3個濃縮步驟，將此過程重複多於兩次。隨後保留物與移液器小心混合，自過濾管移除，置放於Eppendorf試管中，且以最大速度微離心(Eppendorf Centrifuge 5418，St.Louis，MO，USA) 2分鐘。在此之後，針對清液層量測蛋白質濃度，且藉由注入20 µL藉由分析性SEC來分析(詳情與實例8中相同)。一式兩份地製備各樣品。 LLPS： 如下表中所概述製備樣品且在4℃下培育5天。全部樣品之最終體積均為240 µL。培育之後，對樣品進行微離心(Eppendorf Centrifuge 5418，St.Louis，MO，USA)持續20秒，隨後針對分析性CEX移除200 µL清液層(詳情與實例7中相同)，不同之處在於將自動取樣器溫度維持在25℃下。表 12 ：針對LLPS之樣品組合物製備：
Figure AA12
 SBE-β-CD之增加濃度引起單體回收同時維持相對較低水準之聚集體。當與蔗糖、甘露糖醇及蔗糖組合，且尤其與甘胺酸及蔗糖組合時，SBE-β-CD之效能甚至較佳。此為尤其顯著的，因為單獨的甘胺酸之效能非常不佳且與蔗糖組合亦並未較佳。 冷凍/解凍(F/T)：表 13 .針對F/T之樣品組合物製備：
Figure AA13
Figure AA13-1
 如以上所列表製備樣品。進行20次F/T循環，其中在各冷凍期間將樣品儲存在-70℃或-30℃下至少一小時，且在解凍期間將樣品儲存在室溫下不超過一小時。各樣品之最終體積為240 µL。在0次及20次循環之後移除等分試樣用於分析性SEC (與實例8相同)。 與其他調配物相比，SBE-β-CD之存在在F/T期間呈現為減少聚集且增加相對單體水準提供益處。其中SBE-β-CD與其他賦形劑組合使用，尤其與甘胺酸及蔗糖組合使用之調配物之效能亦為良好的。 實例10：比較SBE-β-CD與2-羥丙基-β-環糊精之影響 SBE-β-CD在先前UFC實驗中已顯示為AMG 330提供顯著保護以免在蛋白質濃縮期間聚集。在本實驗中，在SBE-β-CD或另一環糊精，2-羥丙基-β-環糊精(2-HP-β-CD)存在下藉由UFC比較蛋白質濃縮期間對AMG 330之影響。 材料及方法： 在MWCO 10,000之Amicon Ultra 15 mL離心過濾管中將20 mL之0.4 mg/mL AMG 330濃縮至約10 mL。合併管中之保留物，且隨後藉由SoloVPE(使用2.319 mL/(mg*cm)之消光係數)量測蛋白質濃度且被認為是0.83 mg/mL。隨後使用此蛋白質製備UFC樣品。 全部樣品均含10 mM磷酸鉀、8%蔗糖、0.01%聚山梨醇酯-80，pH 6.0。 測試五種調配條件：1)僅具有緩衝液之對照，2)添加1% SBE-β-CD，3)添加2% SBE-β-CD，4)添加1% 2-HP-β-CD，及5)添加2% 2-HP-β-CD。製備50 mL之5種緩衝溶液中之每一者。測試各調配物之兩種重複樣品。 對於各樣品而言，將0.875 mL AMG 330置放於MWCO 10,000之Amicon Ultra 4 mL離心過濾管中。將3.125 mL合適緩衝液添加至各試管中且與蛋白質小心混合，且在25℃下以4000 rcf對管進行離心(Allegra 6R Centrifuge，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)直至保留物體積為約100 µL為止。添加4 mL額外緩衝液，且再將樣品濃縮至約100 μL。隨後將保留物與移液器小心混合，且自過濾管移除45 μL，置放於Eppendorf試管中，且以最大速度微離心(Eppendorf Centrifuge 5418，St.Louis，MO，USA) 2分鐘。藉由分析性SEC 分析清液層(與實例8相同)。亦分析未經濃縮之AMG 330 (0.4 mg/mL)用於對比目的。 在此實驗中，在1%及2% SBE-β-CD或2-HP-β-CD存在下將AMG 330濃縮至約10 mg/mL。含有SBE-β-CD之調配物藉由星號指示。左側之對照(標記為0.4 mg/mL)濃縮不超過其0.4 mg/mL之起始濃度。自左側之第二(在圖4a及圖4b中標記為對照)為在無任何環糊精之情況下經濃縮之樣品。SBE-β-CD調配物與2-HP-β-CD調配物之間的比較展現使用SBE-β-CD之優點。圖13顯示所達至的最高濃度；圖14揭示就聚集體%及單體%而言的此等濃縮溶液之組成。 實例11：針對四種不同環糊精保持AMG 330呈可溶性非聚集形式之能力對該等環糊精之作用進行比較。 SBE-β-CD在先前實驗中已顯示減少AMG 330中之聚集。此實驗目的在於與SBE-β-CD比較來評估其他環糊精。在4℃及25℃下用4種不同環糊精培育1天至4天之後量測AMG 330中之聚集程度。 材料及方法： 全部樣品亦含有約2 mg/mL AMG 330、20 mM檸檬酸鹽及0.01%聚山梨醇酯-80，pH 6.0。製備樣品且儲存於Eppendorf試管中(表14)。將試管包覆在塑膠中且在培育期間避光。在4℃及25℃下培育1天及4天之後獲取等分試樣(Thermofisher Scientific，(Newington，NH) Haake A28)。對等分試樣進行簡單地微離心(Eppendorf Centrifuge 5418，St.Louis，MO，USA)且藉由分析性SEC分析清液層。表 14 . 溶液組成及製備：
Figure AA14
 表 15 .樣品組成及製備：
Figure AA15
Figure AA15-1
 針對保持AMG 330呈可溶性非聚集形式之能力測試包括SBE-β-CD之四種不同環糊精。在不進一步濃縮之情況下在4℃及25℃下培育約2 mg/ml之蛋白質4天。全部樣品亦均含有20 mM檸檬酸鹽及0.01%聚山梨醇酯-80，pH 6.0。 在4℃下4天結束時，0.5% SBE-β-CD調配物藉由SEC具有較大總峰面積，其指示較高可溶性蛋白質濃度。其他調配物以不同程度沈澱且聚集。此結果證明，與似乎僅在25℃下表現較佳之α-環糊精、γ-環糊精或羥丙基-β-環糊精相比，SBE-β-CD在兩種溫度(4℃及25℃)下均為AMG 330之較有效穩定劑及增溶劑(圖15)。 實例12：呈1 mg/mL且儲存於約20℃、約30℃及-70℃下持續至多6週的13種不同調配物中之AMG 330。 此實驗目的在於產生AMG 330 SBE-β-CD之穩定的冷凍及凍乾調配物，且Triton X-100評估為調配物賦形劑。聚碳酸酯酸瓶將用於模擬原料藥(DS)冷凍儲存。 材料及方法： 在AMG 330之起始濃度為0.4 mg/mL之情況下，使用兩個cogent µScale TFF系統以設定在約23 psi下之δ壓力進行UF/DF緩衝液交換(列於表16中之緩衝液)。使用四個Millipore Pellicon 3 Ultracel 10 kD 0.11 m2 盒及兩個cogent管配件。交換後，將材料過濃縮至1.2 mg/mL且收集於無菌Nalgene容器中。表 16 .調配物組成：
Figure AA16
 新製調配物緩衝液、PEG及界面活性劑原料且添加以產生最終調配材料。在30 mL PC酸瓶(Nalgene)中填充15 mL體積之樣品以用於此實驗。在填充之前使用sterivex過濾器裝置(0.22 µm)在無菌罩中過濾全部樣品。PC酸瓶中之最終蛋白質濃度為1 mg/mL。 對於靜態實驗而言，在t = 0及t=6週時藉由分析性SEC (與實例8相同)量測樣品。 結果： SBE-β-CD包括於在多種溫度下培育之AMG 330調配物中。儲存6週之後的結果顯示，與基於使用PEG-4000且不含SBE-β-CD之調配物相比，含有SBE-β-CD之全部調配物為穩定的。 SBE-β-CD與基於PEG之調配物之間的比較證明使用SBE-β-CD之優點。基於PEG之調配物在-20℃下儲存之後大量聚集且微粒化(圖16)。 實例13：對兩種環葡聚糖(SBE-β-CD及α-環糊精)作為AMG 330凍乾調配物之賦形劑之評估。 進行此實驗以確定可研發用於BiTE® 分子之平台凍乾調配物。AMG 330 BiTE® 用作模型蛋白質。評估作為調配物賦形劑的兩種環糊精(SBE-β-CD及α-環葡聚糖)。 材料及方法： AMG 330原料藥濃度為0.4 mg/mL。使用Millipore Centriprep (30K NMWL，15 mL)，使AMG 330在相應緩衝液(列於表17中)中進行緩衝交換： 1.每種調配物等分30 mL AMG 330 DS至兩個(2×15 mL)Centriprep樣品容器中 2.將4.4 mL相應調配物緩衝液添加至各Centriprep濾液收集器中(以防止DS過濃縮) 3.在25℃下以1500×g離心(Allegra 6R離心機，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)20分鐘(離心至平衡)；約5 mL蛋白質殘留在各樣品容器中，3倍濃縮至1.2 mg/mL目標 4.傾析各濾液收集器中的濾液且用4.4 mL新製調配物緩衝液置換；將10 mL新製調配物緩衝液添加至各樣品容器中 5.根據步驟3進行離心 6.重複步驟4至步驟5四次以上(總計五次緩衝液交換；約243倍總稀釋度) 7.經緩衝液交換之材料在4℃下儲存隔夜表 17 ：用於凍乾之調配物組分：
Figure 02_image005
Figure AA17
Figure AA17-1
 添加調配物緩衝液及界面活性劑原料以產生最終調配材料。以2 mL體積將樣品填充於5cc玻璃瓶(Schott型1A)中，其中每種調配物總共4個小瓶。在填充之前使用Sterivex過濾器裝置(0.22 µm)在無菌罩中過濾全部樣品。填充之後，用橡膠塞子寬鬆地蓋上小瓶以用於凍乾(圖17A)。 使用經保守修飾之凍乾循環(-17℃黏接溫度，66小時總循環時間)來凍乾每種調配物之三個小瓶。每種調配物剩餘的一個小瓶保留用於t=0 (凍乾前)分析。在復原之前，針對結構完整性及美觀性目測檢查凍乾餅。用1.96 mL Milli-Q水復原凍乾樣品且平緩旋動直至完全溶解以用於其他分析。藉由分析性SEC及微流成像(MFI)來分析凍乾前及復原後樣品。 SEC結果揭示，與具有α-環葡聚糖或不含環葡聚糖之調配物相比，含有SBE-β-CD之調配物在凍乾前及凍乾後產生較低水準之HMW種屬。其他調配物賦形劑(蔗糖、甘胺酸、甘露糖醇)並未呈現顯著影響HMW種屬之水準(圖17B、圖17C)。 MFI揭示在凍乾之後大部分調配物之亞可見粒子(大多數在1 µm至2 µm範圍內)適度增加。α-環葡聚糖調配物中之一者C60AcL觀測到顯著增加。兩種含有SBE-β-CD (captisol)調配物，C60CpT及C60CpMSuT在凍乾之後含有最少數目之亞可見粒子(圖17D)。 實例14：包括SBE-β-CD及α-環葡聚糖之Fap α BiTE® 的小規模調配物研究(UFC、LLPS及F/T)。 此實驗目的在於評估多種調配物中多種壓力之後Fap α BiTE® 之穩定性。具體言之，在LLPS、20次冷凍/解凍(F/T)循環，且藉由超濾/離心(UFC)濃縮之後評估FAP α BiTE® (SEQ ID NO:177)。根據使用相似調配物之先前研究之結果已顯示，SBE-β-CD對AMG 330 BiTE® 穩定性具有積極影響，且在此研究中研究SBE-β-CD對FAP BiTE® 之影響。 材料及方法： 針對各所測試之調配物製備30 mL緩衝液。表 18 ：樣品組成及製備。對照物(FRM1)於10 mM磷酸鉀、161 mM精胺酸 pH 7.6 + 4%海藻糖(2.65 mg/mL)中調配。
Figure AA18
 對於各樣品而言，將375 µL之2.65 mg/mL FAP α BiTE® (以10 mM磷酸鉀、161 mM精胺酸 pH 7.6 + 4%海藻糖調配)置放於MWCO 10,000之Amicon Ultra 4 mL離心過濾管中。將3.5 mL合適緩衝液添加至各試管中且與蛋白質小心混合，且在25℃下以4000 rcf對管進行離心(Allegra 6R Centrifuge，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)直至保留物體積為約50 µL為止。再將緩衝液添加及離心離心步驟重複兩次以用於總共3次濃縮步驟。隨後保留物與移液器小心混合，自過濾管移除，置放於Eppendorf試管中，且以最大速度微離心(Eppendorf Centrifuge 5418，St. Louis，MO，USA)2分鐘。隨後藉由SEC分析清液層。一式兩份地製備各樣品。亦分析未經濃縮之FAP α BiTE® (2.65 mg/mL)用於對比目的。 SBE-β-CD之存在呈現藉由在蛋白質濃縮期間抑制HMW種屬之形成來增加相對SEC主峰。α-環葡聚糖之存在導致蛋白質回收率極低且HMW種屬之水準相對較高。Fap α LLPS 結果 ：Fap α BiTE® 與SBE-β-CD之LLPS結果與AMG 330之LLPS結果類似。α-環葡聚糖並未顯示對此分子之膠態穩定性的任何積極或負面影響(圖18)。 實例15：CD33-scFc BiTE抗體建構物之調配物研究 使用蛋白質A及陽離子交換層析(CEX)純化CD33-scFc BiTE抗體建構物。使用含有分子量截止值(MWCO)為10 kDa之膜的透析盒將CEX溶離液透析於10 mM L-麩胺酸緩衝液(pH 4.2)中。在2℃至8℃下進行透析。經透析之混合材料之濃度總計為2.3 mg/mL。使用含有MWCO為10 kDa之膜的濃縮器管經由超濾離心(UFC)進一步濃縮材料。經由孔徑為0.22 µm之過濾器過濾濃縮材料。過濾後濃度總計為2.7 mg/mL。藉由外加濃縮儲備溶液將材料完全調配至表 19 . 中所列之調配物中。最終蛋白質濃度總計為1.0 mg/mL。 表19：所測試調配物之概述；HPBCD：羥丙基-β-環糊精；PS 80：聚山梨醇酯80。
Figure AA19
 在2R I型玻璃瓶中將調配物填充至1.0 mL，該等玻璃瓶用丁基橡膠塞子及輕拍式鋁密封件(aluminum flip off seal)封閉。將小瓶儲存在-20℃及-70℃下。在指定時間點抽吸樣品。取樣之後，在環境溫度下使小瓶解凍且經由尺寸排阻超高效能層析(SE-UPLC)分析以便對高分子量種屬之百分比含量進行定量。使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)在Acquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。管柱溫度設定成25℃。藉由在0.4 mL/min之流動速率下施用等度方法達成各尺寸變異體之分離。流動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl pH 6.8構成。運作時間總計為6.0分鐘。樣品在自動取樣器內保持在8℃下直至加以分析。注入3 µg總量之蛋白質。為了避免殘留，在各樣品之後進行40% ACN之中間注射。偵測係基於螢光(280 nm下激發，325 nm下發射)。使用Empower® 軟體進行峰積分。報導HMWS之相對曲線下面積(圖 18 )。 經調配之CD33-scFc BiTE抗體建構物在-70℃或低於-70℃下之儲存抑制HMWS形成。然而，在-20℃下儲存期間不含HPBCD之調配物的HMWS顯著增加。對比而言，與其濃度(6%或12%)無關，在HPBCD存在下在-20℃下防止蛋白質形成HMWS。由HMWS增加指示，在-20℃下甘露糖醇之存在對穩定性產生不利影響。 實例16：FLT3-scFc BiTE抗體建構物之調配物研究 使用蛋白質A及CEX層析純化兩種不同FLT3-scFc BiTE抗體建構物(FL1-scFc及FL2-scFc)。CEX後，將全部建構物透濾於由10 mM L-麩胺酸、4% (w/v)蔗糖(pH 4.2)構成之緩衝液中。所用膜之MWCO為10 kDa。透濾池(蛋白質濃度為1.7 mg/mL)經由超濾(MWCO為10 kDa)濃縮直至達成7.6 mg/mL之濃度為止。隨後經由0.2 µm過濾器過濾材料且經由外加賦形劑儲備溶液充分調配。調配物之概述由表 20 提供。 表20：所測試調配物之概述；將全部調配物之pH調整至4.2；HPBCD：羥丙基-β-環糊精；PS 80：聚山梨醇酯80。
Figure AA20
 在2R I型玻璃瓶中將兩種調配物填充至1.3 mL，該等玻璃瓶用丁基橡膠塞子及輕拍式鋁密封件封閉。將小瓶儲存在-20℃下。在指定時間點抽吸樣品。取樣之後，在環境溫度下使小瓶解凍且經由尺寸排阻超高效能層析(SE-UPLC)分析以便對高分子量種屬之百分比含量進行定量。使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)在Acquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。管柱溫度設定成25℃。藉由在0.4 mL/min之流動速率下施用等度方法達成各尺寸變異體之分離。移動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl (pH 6.8)構成。總運作時間為6.0分鐘。樣品在自動取樣器內保持在8℃下直至加以分析。注入3 µg總量之蛋白質。為了避免殘留，在各樣品之後進行40% ACN之中間注射。偵測係基於螢光(280 nm下激發，325 nm下發射)。使用Empower® 軟體進行峰積分。報導HMWS之相對曲線下面積(圖 19 )。 實例17：BCMA-scFc BiTE抗體建構物之調配物研究 如根據實例 16 所述純化、調配、儲存且分析兩種BCMA-scFc BiTE抗體建構物(BC1-scFc及BC2-scFc)。調配物之概述由表 21 提供。 表21：所測試調配物之概述；將全部調配物之pH調整至4.2；HPBCD：羥丙基-β-環糊精；PS 80：聚山梨醇酯80。
Figure AA21
 圖 20 顯示兩種抗體建構物之調配物之函數中的百分比HMWS含量。四週之後在不含HPBCD之調配物中HMWS之百分比含量分別增加1.6% (BC1-scFc)與1.9% (BC-scFc)。對比而言，在含有6%HPBCD之調配物中HMWS形成得到抑制。
Figure AA101
Figure AA101-1
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圖1：在含有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或HP-β-CD之AMG 330(SEQ ID NO：100)製劑中藉由尺寸排阻超高效液相層析(SE-UPLC)對高分子量種屬及構象異構體之定量。
圖2：在壓力因素：未受壓力(A)、發泡(B)及10次冷凍/解凍循環(C)之運作下，AMG 330製劑中之聚山梨醇酯(PS)20、PS 80及HP-β-CD對非單體種屬(包括構象異構體、二聚體、聚集體)之量的影響。藉由尺寸排阻超高效層析(SE-UPLC)達成種屬之定量。藉由同一(A280偵測)論述蛋白質濃度。
圖3：在0.9%(V/V)苯甲醇存在下，HP-β-CD與SBE-β-CD對AMG 103之聚集傾向(藉由350nm下之光學密度量測；光學密度係指10mm之路徑長度)的濃度相關性影響。
圖4：在0.9%(V/V)苯甲醇存在下，AMG 103在37℃下培育24 小時之前(A)及之後(B)的固有螢光發射強度量測。
圖5：由實驗性設計研究(2級4因子全階乘(2-level 4-factor full factorial))衍生的預測性模型，其描述HP-β-CD(A)與SBE-β-CD(B)的逐漸增加之濃度對AMG 103(SEQ ID NO：174)製劑在350nm下之光密度的影響。
圖6：藉由尺寸排阻層析在含有5mg/mL CD33_2-hALB(SEQ ID NO：175)之不同調配物中進行高分子量種屬(HMWS)之評定。
圖7：藉由尺寸排阻層析(SEC)測定的三種不同MSLN-hALB(SEQ ID NO：176)調配物在25℃及37℃下之高分子量種屬形成速率(K60RTrT(A)、K60SBESuT(B)及K60RMSuT(C))。
圖8：藉由弱陽離子交換超高效液相層析(WCX-UPLC)測定的三種不同MSLN-hALB調配物在25℃及37℃下之酸性電荷變異體的形成。
圖9.在12%PEG-3350存在下，AMG 330在40℃下之可溶性。當以較高濃度使用時，SBE-β-CD(Captisol)及海藻酸鹽(Protanal)均增加聚集及單體AMG 330之可溶性。然而，SBE-β-CD優先使單體溶解。左側之對照(1× PBS)係在無SBE-β-CD之情況下培育，而右側之對照(1× PBS)係在無PEG及SBE-β-CD之情況下培育。
圖10：來自如9圖中所示之同一實驗的資料，其說明SBE-β-CD及海藻酸鹽之不同濃度對AMG 330中之單體%及聚集體%之影響。以聚集體為代價(藉由綠色箭頭所示)在單體含量逐漸增加下，約0.1%至1%之SBE-β-CD為有效的。對比而言，海藻酸鹽資料顯示逐漸增加之聚集體(藉由紅色箭頭所示)的相反趨勢。SBE-β-CD在此情況下亦顯示降低過度濃縮之不利影響。
圖 11 ：緩衝液交換及藉由超過濾/離心進行蛋白質濃縮之後的AMG 330的平均SEC相對峰面積。圖 12 . A ：由SEC主峰+ HMW所計算，藉由過濃縮達成的最大AMG 330濃度之彙總。SBE-β-CD調配物(藉由星號指示)達至較高濃度且維持較高單體%。B ：來自如圖12A中所示之同一實驗的資料，其中在存在或不存在甘胺酸及蔗糖之情況下在濃度逐漸增加之SBE-β-CD存在下(參見星號)，AMG 330經濃縮高達7 mg/mL至8 mg/mL。左側之對照在無SBE-β-CD的情況下進行濃縮。右側之對照濃縮至不超過其0.4 mg/ml之起始濃度。標記為「2%甘胺酸，1%蔗糖」之額外樣品在無SBE-β-CD的情況下濃縮以證明使用SBE-β-CD之優點。C ：在4℃下培育5天之後的AMG 330 CEX相對峰面積，其為一式兩份之平均值。所有樣品均含有20 mM檸檬酸鹽、0.01%PS-80，pH 6.0。D ：SEC分析之後的AMG 330相對主峰面積。所有樣品亦均包括20 mM檸檬酸鹽、0.01%PS-80，pH 6.0。圖 13 ：由SEC主峰+ HMW計算之AMG 330濃度。圖 14 ：緩衝液交換及濃縮之後來自SEC的AMG 330相對峰面積。圖 15 ：與各種環糊精一起培育之後的AMG 330 SEC總峰面積(主峰+ HMW)峰。圖 16 ：呈1 mg/mL且儲存於-20℃、-30℃及-700℃持續至多6週的13種不同調配物中之AMG 330。圖 17：A ：SBE-β-CD在0.5%下自身可能不會完全足以提供良好的凍乾餅，但其與較常見之膨化劑，諸如甘胺酸及甘露糖醇相容。在SBE-β-CD存在下，所有此等凍乾餅會很好地復原，且幾乎不產生，甚至不產生聚集體或顆粒。B ：使用SBE-β-CD(藍色層析圖，由箭頭指示)而非α-環葡聚糖(粉色層析圖，由箭頭指示)會降低復原後之聚集體%。不存在任何環糊精之對照調配物(呈粗黑線形式)亦顯示升高水準之聚集體，儘管小於α-環葡聚糖。此等結果證明使用SBE-β-CD之優點。C ：不同調配物之分析性SEC(前(pre)及後(post)表示凍乾前及復原後)。D ：凍乾之後對不同調配物進行的MFI分析。圖 18 .藉由過度濃縮達成的最大Fapα BiTE® (SEQ ID NO:177)濃度之彙總。與α-環葡聚糖相比，SBE-β-CD調配物(由星號指示)達至較高蛋白質濃度且維持較高單體%。α-環葡聚糖調配物由於沈澱而損失其大部分可溶性蛋白質。圖 19 .在CD33-scFc BiTE抗體建構物調配物之運作下，藉由尺寸排阻超高效層析(SE-UPLC)測定的高分子量種屬(HMWS)之百分比含量的概觀。圖 20 .在FLT3-scFc BiTE抗體建構物調配物之運作下，藉由尺寸排阻超高效層析(SE-UPLC)測定的高分子量種屬(HMWS)之百分比含量的概觀。圖 21 .在BCMA-scFc BiTE抗體建構物調配物之運作下，藉由尺寸排阻超高效層析(SE-UPLC)測定的高分子量種屬(HMWS)之百分比含量的概述。

Claims (10)

  1. 一種醫藥組合物，其包含雙特異性單鏈抗體建構物，其經由第一結合域結合於靶細胞表面抗原CD19或CD33且經由第二結合域結合於T細胞表面抗原CD3，其中該雙特異性單鏈建構物包含具有如SEQ ID NO：100或174所示之胺基酸序列的多肽或由該多肽組成；β-環糊精及緩衝液，其中該組合物減少或預防蛋白質聚集體之形成，其中該β-環糊精係磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽，其中該β-環糊精以0.1%(w/v)至20%(w/v)範圍內之濃度存在，且其中該組合物之pH在4至7.5範圍。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該β-環糊精以0.5%(w/v)至2%(w/v)範圍之濃度存在。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該雙特異性單鏈抗體建構物以0.1mg/ml至5mg/ml之濃度範圍存在。
  4. 如請求項1之醫藥組合物，其中該緩衝液係選自由以下組成之群：磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸/丁二酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、組胺酸/組胺酸HCl、甘胺酸、Tris、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其混合物。
  5. 如請求項4之醫藥組合物，其中該緩衝液係選自由以下組成之群：磷酸鉀、檸檬酸/檸檬酸鈉、丁二酸、組胺酸、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其組 合。
  6. 如請求項1之醫藥組合物，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的賦形劑：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、精胺酸、離胺酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188(poloxamer 188)、普洛尼克(pluronic)及其組合。
  7. 如請求項1之醫藥組合物，其包含一或多種防腐劑。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該一或多種防腐劑係選自由以下組成之群：苯甲醇、氯丁醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丙酯及硫柳汞。
  9. 如請求項1之醫藥組合物，其中該組合物不含防腐劑，該雙特異性單鏈抗體建構物之胺基酸序列為SEQ ID NO：100，且該建構物濃度為約0.5mg/ml，該環糊精為約1%(w/v)濃度之磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽，該緩衝液為約10mM濃度之磷酸鉀，且該組合物進一步包含在約6.0之pH下濃度為約8%(w/v)之蔗糖及濃度為約0.01%(w/v)之聚山梨醇酯80。
  10. 如請求項1之醫藥組合物，其中該雙特異性單鏈抗體建構物之胺基酸序列為SEQ ID NO：100，其中該環糊精為約1%(w/v)濃度之磺基丁醚-β-環糊精鈉鹽，該緩衝液為約10mM濃度之磷酸鉀，且該組合物進一步包含在約6.0之pH下濃度為約4%(w/v)之甘露糖醇、濃度為約2%(w/v)之蔗糖及濃度為約0.01%(w/v)之聚山梨醇酯80。
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