TWI440469B

TWI440469B - Improved antibody molecules

Info

Publication number: TWI440469B
Application number: TW098131191A
Authority: TW
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Atsuhiko Maeda; Mika Sakurai; Tetsuo Kojima; Tatsuhiko Tachibana; Hirotake Shiraiwa; Hiroyuki Tsunoda; Yoshinobu Higuchi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2014-06-11
Also published as: US20240010738A1; US20220041741A1; MY153908A; RU2430111C3; FR21C1054I1; CA2699834C; PE20120079A1; US20250346677A1; US20120253016A1; HK1185887A1; EP2330193A1; CL2011000632A1; US20220306755A1; LUC00241I2; WO2010035769A1; BRPI0905076B1; LTC2330193I2; AR127010A2; NO2021048I1; CA2763039C

Description

改良之抗體分子

本發明係關於含有抗IL-6受體之抗體為有效成分之醫藥組成物及其製造方法等。

抗體在血漿中安定性高且副作用少，因此受到注意作為醫藥品。特別是IgG型的抗體藥物多數已上市，目前多數的抗體藥物被開發(非專利文獻1、非專利文獻2)。IL-6為多種自體免疫疾病、炎症性疾病、惡性腫瘤等相關的細胞激素(非專利文獻3)，人型化抗IL-受體的IgG1抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與IL-6受體特異性結合。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)中和IL-6的生物學作用，可考量利用作為風濕性關節炎等的IL-6相關疾病之治療藥(專利文獻1、2、3、非專利文獻4)，日本已承認其作為卡斯托曼氏病(castleman disease)及風濕性關節炎之治療藥(非專利文獻5)。

類似第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的人型化抗體為第一代的抗體醫藥，從改良第一代的抗體醫藥，目前開發改善藥效、便利性、成本之第二代抗體醫藥。適用於第二代抗體藥物的技術也開發出多種技術，已報導有提升效應物(effector)功能、抗原結合能力、藥物動力、安定性，或降低免疫原性風險之技術等。使藥效增強或減少投與量的方法，已有IgG抗體的Fc區域的胺基酸取代，增強抗體依賴性細胞毒性(ADCC活性)或補體依賴性細胞毒性(CDC活性)之技術報告(非專利文獻6)。又增強抗原結合能力、抗原中和能力之技術，已報導有親和力成熟(affinity maturation)技術(非專利文獻7)，可藉由導入可變區的互補決定區(CDR；complementarity determining region)等的胺基酸變異，增強對抗原的結合活性。藉由抗原結合能力的增強，可使活體外(in vitro )的生物活性提高，或者降低投與量，也可進一步提高活體內(in vivo )藥效(非專利文獻8)。目前對於效果優於抗小兒呼吸道融合病毒(RSV)抗體第一代藥之帕利珠單株抗體(palivizumab)的莫塔珠單株抗體(motavizumab)(由親和力成熟技術所製作)進行臨床試驗(非專利文獻9)。雖然已報導在抗IL-6受體的抗體中有較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)更強的親和力之抗體，其親和力為約0.05nM(專利文獻4)，但是沒有較0.05nM更強的親和力之人類抗體或人型化抗體或嵌合(chimera)抗體的報告。

目前抗體醫藥存在的問題，例如因為非常多的投與蛋白質量所造成的高製造成本。人型化抗IL-6受體的IgG1抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，也預定投與量為約8mg/kg/月的靜脈內注射(非專利文獻4)。關於投與型態，慢性自體免疫疾病的情況時希望為皮下投與製劑。一般皮下投與製劑必須為高濃度製劑，當其為IgG型的抗體製劑時，從安定性等觀點來看，一般以約100mg/mL的製劑為限(非專利文獻10)。由可發揮持續治療效果而延長抗體血漿中半衰期，減少投與蛋白質量，賦予高安定性，因此可以長投與間隔皮下投與，可提供低成本且便利性高的第二代抗體醫藥。

抗體的藥物動力與FcRn有大的關聯，關於抗體同型物(isotype)間的血漿中半衰期的差異，已知IgG1及IgG2具有最優的血漿中半衰期，IgG3及IgG4較差(非專利文獻11)。使具有優良血漿中半衰期的IgG1及IgG2抗體之血漿中半衰期更提高的方法，已報導對FcRn結合增強之恆定區的胺基酸取代(非專利文獻12、13)。從免疫原性觀點來看，雖然期望經由可變區的胺基酸取代，較恆定區的胺基酸取代，更提升血漿中半衰期的方向(專利文獻5)，然而至今沒有以改變可變區而提高IL-6受體抗體的血漿中半衰期的報告。

成功開發生物醫藥品的再一重要問題為免疫原性。一般而言，小鼠抗體經過人型化後，免疫原性會降低。經由人型化時的模板(template)架構(framework)使用生殖細胞(germline)序列，可更減少免疫原性的風險(非專利文獻14)。然而，即使是完全人抗TNF抗體之阿達目(adalimumab)，也會出現13-17%高頻率的免疫原性，出現免疫原性的患者中發現治療效果降低(非專利文獻15、16)。雖是人抗體，T細胞抗原決定位(epitope)也可能存在CDR中，有可能在CDR上的T細胞抗原決定位為免疫原性的原因。已知以電腦模擬(in silico )或試管內(in vitro )預測T細胞抗原決定位的方法(非專利文獻17、18)，可考慮除去以這些方法預測的T細胞抗原決定位，可能降低免疫原性的風險(非專利文獻19)。

人型化抗IL-6受體的IgG1抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，為人型化小鼠PM1抗體的IgG1抗體。H鏈、L鏈分別為NEW、REI的人序列，作為模板架構使用，進行CDR接枝(grafting)，但是維持活性的重要胺基酸之5胺基酸為小鼠序列，存於架構(framework)中(非專利文獻20)。至今沒有使人型化抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的架構中殘存的小鼠序列活性降低的事，沒有完全人型化的報告。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的CDR序列為小鼠序列，阿達目(adalimumab)也相同，有可能在CDR中存在T細胞抗原決定位，無法否定免疫原性的風險。在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的臨床試驗中，藥效用量為8mg/kg時不認為出現抗第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的抗體，但是在4mg/kg及2mg/kg中則認為有該抗體(專利文獻6)。由此述來看，考量關於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的免疫原性之改善空間。然而至今未有以胺基酸取代改善免疫原性風險的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的相關報告。

雖然第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物(isotype)為IgG1，但是不同的同型物即恆定區的序列不同，考量恆定區的序列對效應物(effector)功能、藥物動力、物性等具有大的影響，因此作為抗體醫藥開發的恆定區序列的選擇極為重要(非專利文獻11)。近年來，非常重視抗體醫藥的安全性，以TGN1412的第一階段(phase I)臨床試驗所發現的重大副作用的原因之一，認為抗體的Fc部分與Fcγ受體的相互作用(效應物功能)(非專利文獻21)。以中和抗原的生物作用之目標抗體醫藥中，ADCC等效應物(effector)功能中不必要與重要的Fcγ受體結合，從副作用的觀點考慮，對Fcγ受體的結合不如也考慮不適合的可能性。降低對Fcγ受體的結合之方法為使IgG抗體的同型物由IgG1變為IgG2或IgG4的方法(非專利文獻22)，但是，從對Fcγ受體的結合及藥物動力的觀點，IgG4較IgG2為所希望者(非專利文獻11)。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物(isotype)為IgG1，為IL-6受體的中和抗體，考慮ADCC等效應物功能的不必要的副作用之可能性，也可考慮同型物為IgG2的可能性。

另一方面，將抗體作為醫藥品開發之中，其蛋白質的物性、特別是均一性及安定性極為重要，IgG2同型物已知極多為來自樞紐區(hinge region)的雙硫鍵(disulfide)之異質性(heterogeneity)(非專利文獻23)。為了維持因此造成的目標物質/關聯物質的異質性之製造間差及不易大量製造作成醫藥品，以及成本增加，希望限制為可能的單一物質。而且作為抗體的H鏈C端序列的異質性，已知因C端胺基酸─離胺酸(lysine)殘基的缺少、及C端二胺基酸─甘胺酸(glycine)、離胺酸(lysine)的缺少，而使C端羧基醯胺(amide)化(非專利文獻24)，在開發IgG2同型物抗體為醫藥品上，希望維持高安定性及減少此述之異質性。為了製作便利性優良之安定的高濃度皮下投與製劑，期望不只要安定性高，關於血漿中半衰期也較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物IgG1更優良者。然而，至今沒有IgG2同型物之恆定區的抗體相關的異質性減少、具有高安定性、較IgG1同型物的恆定區的抗體具有更優良的血漿中半衰期之恆定區序列的報告。

本發明之先前技術文獻如下列所示。

【專利文献1】WO 92/19759

【專利文献2】WO 96/11020

【專利文献3】WO 96/12503

【專利文献4】WO 2007/143168

【專利文献5】WO 2007/114319

【專利文献6】WO 2004/096273

【非專利文献1】Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew C Dewitz,Monoclonal antibody successes in the clinic,Nature Biotechnology 23,1073-1078(2005).

【非專利文献2】Pavlou AK,Belsey MJ.,The therapeutic antibodies market to 2008.,Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.

【非專利文献3】Nishimoto N,Kishimoto T.,Interleukin 6:from bench to bedside.,Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26.

【非專利文献4】Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,Pavelka K,Broll J,Balint G,Emery P,Raemen F,Petersen J,Smolen J,Thomson D,Kishimoto T;CHARISMA Study Group.,Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,Tocilizumab,in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate.,Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29

【非專利文献5】Nishimoto N,Kanakura Y,Aozasa K,Johkoh T,Nakamura M,Nakano S,Nakano N,Ikeda Y,Sasaki T,Nishioka K,Hara M,Taguchi H,Kimura Y,Kato Y,Asaoku H,Kumagai S,Kodama F,Nakahara H,Hagihara K,Yoshizaki K,Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2627-32.

【非專利文献6】Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.,Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.

【非專利文献7】Rothe A,Hosse RJ,Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87.

【非專利文献8】Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,Bhatt RR,Takeuchi T,Lerner RA,Crea R.,A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.

【非專利文献9】Wu H,Pfarr DS,Johnson S,Brewah YA,Woods RM,Patel NK,White WI,Young JF,Kiener PA. Development of Motavizumab,an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007,368,652-665

【非專利文献10】Shire SJ,Shahrokh Z,Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402.

【非專利文献11】Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.

【非專利文献12】Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N.,An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life.,J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56

【非專利文献13】Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.,Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis.,Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40

【非專利文献14】Hwang WY,Almagro JC,Buss TN,Tan P,Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods. 2005 May;36(1):35-42

【非專利文献15】Bartelds GM,Wijbrandts CA,Nurmohamed MT,Stapel S,Lems WF,Aarden L,Dijkmans BA,Tak P,Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab:The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9;[Epub ahead of print]

【非專利文献16】Bender NK,Heilig CE,Droll B,Wohlgemuth J,Armbruster FP,Heilig B. Immunogenicity,efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan;27(3):269-74.

【非專利文献17】Van Walle I,Gansemans Y,Parren PW,Stas P,Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.

【非專利文献18】Jones TD,Phillips WJ,Smith BJ,Bamford CA,Nayee PD,Baglin TP,Gaston JS,Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):991-1000.

【非專利文献19】Chirino AJ,Ary ML,Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15;9(2):82-90.

【非專利文献20】Sato K,Tsuchiya M,Saldanha J,Koishihara Y,Ohsugi Y,Kishimoto T,Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6.

【非專利文献21】Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology:lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92.

【非專利文献22】Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.

【非專利文献23】Dillon TM,Ricci MS,Vezina C,Flynn GC,Liu YD,Rehder DS,Plant M,Henkle B,Li Y,Deechongkit S,Varnum B,Wypych J,Balland A,Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.

【非專利文献24】Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.

有鑑於上述之狀況，本發明之目的為，提供改變人型化抗IL-6受體的IgG1抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區及恆定區的胺基酸序列之醫藥組成物(以下本說明書中也記載為「藥劑」或「製劑」)，其增強抗原中和能力且提高藥物動力，在減少投與頻率下仍發揮持續的治療效果，而且改善免疫原性、安全性、物性(安定性及均一性)，為優於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的第二代分子所組成之醫藥組成物，並提供前述醫藥組成物之製造方法。

本發明人對於改變人型化抗IL-6受體的IgG1抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區及恆定區的胺基酸序列，增強抗原中和能力且提高藥物動力，在減少投與頻率下仍發揮持續的治療效果，且改善免疫原性、安全性、物性(安定性及均一性)，優於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的第二代分子的創新製造，進行專精研究。結果，本發明人發現在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區中複數個提高對抗原結合能力(親和力)之CDR變異，經由此組合成功使親和力大幅提升。本發明人另以導入使可變區序列的等電位點降低的改變，成功提高藥物動力。本發明人更對於與抗原IL-6受體的結合賦予pH依賴性，以1分子抗體可能中和複數次抗原，成功地提高藥物動力。而且本發明人使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)架構(framework)中殘存的小鼠序列完全人型化，減少可變區中以電腦模擬(in silico)預測的T-細胞抗原決定位胜肽的數目，成功地降低免疫原性的風險。本發明人更在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的恆定區中為了提高安全性使對Fcγ受體的結合較IgG1低，較IgG1更改善藥物動力，且不降低安定性，成功地發現使來自IgG2樞紐區(hinge region)的雙硫鍵(disulfide)之異質性(heterogeneity)及來自H鏈C端之異質性(heterogeneity)降低的新穎恆定區序列。此述CDR區的胺基酸序列的改變、可變區的胺基酸序列的改變、恆定區的胺基酸序列的改變適當組合，成功創造較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)更優良的第二代分子。

本發明係關於一種經由改變人型化抗IL-6受體之IgG1抗體的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區及恆定區的胺基酸序列，具有更優良的抗原(IL-6抗體)結合能力、更優良的藥物動力、更優良的安全性、免疫原性風險、物性(安定性及均一性)之人型化抗IL-6受體之IgG抗體所形成的醫藥組成物，及該醫藥組成物之製造方法。更具體地說，本發明提供以下[1]~[11]。[1]以下(a)~(f)任一項記載之多胜肽；(a)包含具有序列識別號1(VH4-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號2(VH4-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號3(VH4-M73的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(b)包含具有序列識別號4(VH3-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號5(VH3-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號6(VH3-M73的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(c)包含具有序列識別號7(VH5-M83的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號8(VH5-M83的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號9(VH5-M83的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(d)包含具有序列識別號10(VL1的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號11(VL1的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號12(VL1的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(e)包含具有序列識別號13(VL3的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號14(VL3的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號15(VL3的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(f)包含具有序列識別號16(VL5的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號17(VL5的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號18(VL5的CDR3)序列之CDR3的多胜肽。[2]以下(a)~(c)任一項記載之抗體；(a)包含具有序列識別號1(VH4-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號2(VH4-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號3(VH4-M73的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及包含具有序列識別號10(VL1的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號11(VL1的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號12(VL1的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體；(b)包含具有序列識別號4(VH3-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號5(VH3-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號6(VH3-M73的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及包含具有序列識別號13(VL3的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號14(VL3的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號15(VL3的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體；(c)包含具有序列識別號7(VH5-M83的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號8(VH5-M83的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號9(VH5-M83的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及包含具有序列識別號16(VL5的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號17(VL5的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號18(VL5的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體。[3]以下(a)~(f)任一項記載之可變區；(a)具有序列識別號19(VH4-M73可變區)序列之重鏈可變區；(b)具有序列識別號20(VH3-M73可變區)序列之重鏈可變區；(c)具有序列識別號21(VH5-M83可變區)序列之重鏈可變區；(d)具有序列識別號22(VL1可變區)序列之輕鏈可變區；(e)具有序列識別號23(VL3可變區)序列之輕鏈可變區；(f)具有序列識別號24(VL5可變區)序列之輕鏈可變區。[4]以下(a)~(c)任一項記載之抗體；(a)包括具有序列識別號19(VH4-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號22(VL1可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(b)包括具有序列識別號20(VH3-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號23(VL3可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(c)包括具有序列識別號21(VH5-M83可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號24(VL5可變區)序列之輕鏈可變區的抗體。[5]以下(a)~(f)任一項記載之重鏈或輕鏈；(a)具有序列識別號25(VH4-M73)序列之重鏈；(b)具有序列識別號26(VH3-M73)序列之重鏈；(c)具有序列識別號27(VH5-M83)序列之重鏈；(d)具有序列識別號28(VL1)序列之輕鏈；(e)具有序列識別號29(VL3)序列之輕鏈；(f)具有序列識別號30(VL5)序列之輕鏈。[6]以下(a)~(c)任一項記載之抗體；(a)包括具有序列識別號25(VH4-M73)序列之重鏈及具有序列識別號28(VL1)序列之輕鏈的抗體；(b)包括具有序列識別號26(VH3-M73)序列之重鏈及具有序列識別號29(VL3)序列之輕鏈的抗體；(c)包括具有序列識別號27(VH5-M83)序列之重鏈及具有序列識別號30(VL5)序列之輕鏈。[7]編碼[1]~[6]任一項記載之多胜肽的基因。[8]包含[7]記載之基因的載體。[9]保持[8]記載之載體的宿主細胞。[10]培養[9]記載之宿主細胞，製造[1]~[6]任一項之多胜肽的方法。[11]包括由[1]~[6]任一項記載之多胜肽或[10]記載之方法所製造之多胜肽的醫藥組成物。

根據本發明所得之人型化抗IL-6受體之IgG抗體，為藥效增強、藥物動力提升者，可減少投與頻率，持續發揮治療效果。

本發明提供以下(a)~(f)任一項記載之多胜肽。(a)包含具有序列識別號1(VH4-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號2(VH4-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號3(VH4-M73的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(b)包含具有序列識別號4(VH3-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號5(VH3-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號6(VH3-M73的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(c)包含具有序列識別號7(VH5-M83的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號8(VH5-M83的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號9(VH5-M83的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(d)包含具有序列識別號10(VL1的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號11(VL1的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號12(VL1的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(e)包含具有序列識別號13(VL3的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號14(VL3的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號15(VL3的CDR3)序列之CDR3的多胜肽；(f)包含具有序列識別號16(VL5的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號17(VL5的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號18(VL5的CDR3)序列之CDR3的多胜肽。

本發明中多胜肽沒有特別限定，但是較佳為具有與人IL-6受體結合活性之抗原結合物質者。抗原結合物質的較佳例為抗體的重鏈可變區(VH)、抗體的輕鏈可變區(VL)、抗體的重鏈、抗體的輕鏈、抗體等。

上述(a)~(f)多胜肽中，(a)~(c)的多胜肽較佳例如抗體的重鏈可變區，(d)~(f)的多胜肽較佳例如抗體的輕鏈可變區。

此述之可變區可作為抗人IL-6受體的抗體的一部分使用。使用此述可變區的抗人IL-6受體抗體具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性。本發明中，所謂優良藥物動力或藥物動力提升是指，從生物體內投與抗體時血漿中濃度變化計算的藥物動力參數「清除率(clearance,CL)」的降低、「濃度曲線下面積(area under curve,AUC)」的增加、「平均滯留時間(mean residence time)」的增加、「血漿中半衰期(t1/2)」的增加之任一種。本發明中，所謂優良物性或物性提升是指安定性提升、異質性降低等，但沒有特別限定。

與CDR連接的人抗體的架構區域(framework region；FR)選擇CDR形成良好抗原結合部位者。本發明中可變區使用的FR沒有特別限定，可以使用任何的FR，但較佳使用來自人的FR。來自人的FR可以使用具有自然序列的FR，視需要CDR形成適當抗原結合部位時，具有天然序列之架構區域可有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等。例如可藉由測定及評價胺基酸經取代的FR之抗體對抗原的結合活性，選擇具有所期望性質之變異FR序列(Sato,K. et al.,Cancer Res.(1993) 53,851-856)。

又上述的CDR序列中也可有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等。1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等的CDR序列宜與改變前的CDR序列在結合活性、中和活性、安定性、免疫原性及/或藥物動力上具有相同活性。取代、缺少、增加及/或插入的胺基酸數目沒有特別限定，但是較佳為1個CDR中有3個胺基酸以內，更佳為2個胺基酸以內，再更佳為1個胺基酸。

將1個或複數個胺基酸殘基以目的的其他胺基酸取代之方法，例如部位特異性變異誘發法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Nat1 Acad Sci USA. 82,488-492)。使用此方法可將抗體所希望的胺基酸取代為目的的其他胺基酸。而且，也可以藉由使用架構拖曳(framework shuffling)(Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)及CDR修復(repair)(US2006/0122377)等基因庫(library)技術，將架構及CDR中的胺基酸取代為適當的其他胺基酸。

本發明更提供以下(a)~(c)任一項記載之抗體。(a)包含具有序列識別號1(VH4-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號2(VH4-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號3(VH4-M73的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及具有序列識別號10(VL1的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號11(VL1的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號12(VL1的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體；(b)包含具有序列識別號4(VH3-M73的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號5(VH3-M73的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號6(VH3-M73的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及具有序列識別號13(VL3的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號14(VL3的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號15(VL3的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體；(c)包含具有序列識別號7(VH5-M83的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號8(VH5-M83的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號9(VH5-M83的CDR3)序列之CDR3的重鏈可變區，及具有序列識別號16(VL5的CDR1)序列之CDR1、具有序列識別號17(VL5的CDR2)序列之CDR2、及具有序列識別號18(VL5的CDR3)序列之CDR3的輕鏈可變區之抗體。

上述抗體可作為具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性的抗人IL-6受體之抗體使用。

本發明之與CDR連接的人抗體的架構區域(framework region;FR)選擇CDR形成良好抗原結合部位者。本發明的可變區之FR沒有特別限定，可以使用任何的FR，但是較佳使用來自人的FR。來自人的FR可以使用具有自然序列的FR，視需要CDR形成適當抗原結合部位時，天然序列之架構區域可有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等。例如可藉由測定及評價胺基酸取代的FR之抗體對抗原的結合活性，選擇具有所期望性質之變異FR序列(Sato,K. et al.,Cancer Res.(1993) 53,851-856)。

又本發明之抗體所使用之恆定區沒有特別限定，可以使用任何恆定區。本發明抗體使用的恆定區較佳例如來自人的恆定區(來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Cκ、Cλ的恆定區等)。來自人的恆定區可以有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入。例如來自人的恆定區較佳例子為，重鏈恆定區可例如具有序列識別號31(VH4-M73恆定區)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號32(VH3-M73恆定區)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號33(VH5-M83恆定區)的胺基酸序列之恆定區，輕鏈恆定區可例如具有序列識別號34(VL1)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號35(VL3)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號36(VL5)的胺基酸序列之恆定區。

胺基酸的取代、缺少、增加、及/或插入等可根據上述方法進行。

本發明更提供以下(a)~(f)任一項記載之可變區。(a)具有序列識別號19(VH4-M73可變區)序列之重鏈可變區；(b)具有序列識別號20(VH3-M73可變區)序列之重鏈可變區；(c)具有序列識別號21(VH5-M83可變區)序列之重鏈可變區；(d)具有序列識別號22(VL1可變區)序列之輕鏈可變區；(e)具有序列識別號23(VL3可變區)序列之輕鏈可變區；(f)具有序列識別號24(VL5可變區)序列之輕鏈可變區。

上述可變區可作為抗人IL-6受體的抗體的一部分使用。此述可變區使用的抗人IL-6受體抗體具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性。

上述可變區可有1個或複數個(例如5個胺基酸以內，較佳為3個胺基酸以內)的胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入。將1個或複數個胺基酸殘基取代為目的的其他胺基酸之方法可例如上述之方法。

本發明又提供包含上述可變區之多胜肽。

本發明進一步提供(a)~(c)任一項記載之抗體。(a)包括具有序列識別號19(VH4-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號22(VL1可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(b)包括具有序列識別號20(VH3-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號23(VL3可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(c)包括具有序列識別號21(VH5-M83可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號24(VL5可變區)序列之輕鏈可變區的抗體。

上述可變區可作為抗人IL-6受體的抗體的一部分使用。使用此述可變區的抗人IL-6受體抗體具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性。

又本發明之抗體使用之恆定區沒有特別限定，可以使用任何恆定區。本發明抗體使用的恆定區較佳例如來自人的恆定區(來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、κ鏈、λ鏈的恆定區等)。來自人的恆定區可以有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入。例如來自人的恆定區較佳例子為，重鏈恆定區可例如具有序列識別號31(VH4-M73恆定區)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號32(VH3-M73恆定區)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號33(VH5-M83恆定區)的胺基酸序列之恆定區，輕鏈恆定區可例如具有序列識別號34(VL1)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號35(VL3)的胺基酸序列之恆定區、具有序列識別號36(VL5)的胺基酸序列之恆定區。

本發明更提供以下(a)~(f)任一項記載之重鏈或輕鏈。(a)具有序列識別號25(VH4-M73)序列之重鏈；(b)具有序列識別號26(VH3-M73)序列之重鏈；(c)具有序列識別號27(VH5-.M83)序列之重鏈；(d)具有序列識別號28(VL1)序列之輕鏈；(e)具有序列識別號29(VL3)序列之輕鏈；(f)具有序列識別號30(VL5)序列之輕鏈。

上述重鏈或輕鏈可作為抗人IL-6受體的抗體的一部分使用。使用此述重鏈或輕鏈的抗人IL-6受體抗體具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性。

上述重鏈或輕鏈可有1個或複數個(例如10個胺基酸以內，較佳為5個胺基酸以內，更佳為3個胺基酸以內)的胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入。將1個或複數個胺基酸殘基取代為目的的其他胺基酸之方法可例如上述之方法。

1個或複數個的胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入，可在可變區中，也可在恆定區中，或者也可在可變區與恆定區兩者中。

本發明更提供以下(a)~(c)任一項記載之抗體。(a)包括具有序列識別號25(VH4-M73)序列之重鏈及具有序列識別號28(VL1)序列之輕鏈的抗體；(b)包括具有序列識別號26(VH3-M73)序列之重鏈及具有序列識別號29(VL3)序列之輕鏈的抗體；(c)包括具有序列識別號27(VH5-M83)序列之重鏈及具有序列識別號30(VL5)序列之輕鏈。

上述抗體可為具有優良結合活性、優良藥物動力、優良安全性‧免疫原性、及/或優良物性的抗人IL-6受體之抗體。

上述抗體可有1個或複數個(例如20個胺基酸以內，較佳為10個胺基酸以內，更佳為5個胺基酸以內)的胺基酸取代、缺少、增加、及/或插入。將1個或複數個胺基酸殘基取代為目的的其他胺基酸之方法可例如上述之方法。

本發明之抗體較佳為人型化(humanized)抗體。

人型化抗體又稱為再構成(reshaped)人抗體，為來自人以外的哺乳動物的CDR移植到人抗體的CDR者，其一般的基因重組方法也為已知(參考歐洲專利申請公開號EP 125023、WO 96/02576)。

具體而言，例如設計為連接目的CDR與目的架構區(FR)的DNA序列，由在CDR及FR兩方的末端區域具有重疊部分所製作的數個寡核苷酸作為引子使用，經PCR法合成(參考WO98/13388)。所得的DNA與編碼人抗體恆定區或人抗體恆定區改變體的DNA連接，之後組入表現載體，將此載體導入宿主，使該DNA產生而獲得(歐洲專利申請公開號EP 239400、國際專利申請公開號WO 96/02576)。

與CDR連接的人抗體的架構區域選擇CDR形成良好抗原結合部位者。可視需要抗體的可變區中的架構區域之胺基酸可有取代、缺少、增加、及/或插入等。

人型化抗體的恆定區中，可使用人抗體恆定區或人抗體恆定區中有1個或複數個胺基酸取代、缺少、增加及/或插入的人抗體恆定區改變體。

例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L鏈可使用Cκ、Cλ。Cκ的胺基酸序列如序列識別號38所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號37所示。Cγ1的胺基酸序列如序列識別號40所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號39所示。Cγ2的胺基酸序列如序列識別號42所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號41所示。Cγ4的胺基酸序列如序列識別號44所示，編碼該胺基酸序列的鹼基序列如序列識別號43所示。

為了改善抗體或其產生的安定性，也可修飾人抗體的C區。人型化時使用的人抗體，可為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何同型物(isotype)的人抗體，但是本發明中較佳使用IgG。IgG可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。

而且，製作人型化抗體後，可變區(例如CDR、FR)或恆定區中的胺基酸也可以其他胺基酸取代、缺少、增加及/或插入等，本發明之人型化抗體也可包含此類胺基酸取代等的人型化抗體。

本發明之抗體限於具有與IL-6受體結合活性及/或中和活性者，不只為IgG代表的二價抗體，也可以包含一價抗體、或IgM代表的多價抗體。本發明之多價抗體包含具有完全相同抗原結合位之多價抗體、或者具有部分或完全不同的抗原結合位之多價抗體。本發明之抗體不限於抗體的全長分子，但限於可與IL-6受體蛋白質結合者，也可以是低分子化抗體或其修飾物。

低分子化抗體為包含一部分全長抗體(whole antibody，例如whole IgG等)缺少的抗體片段之抗體，只要是具有與IL-6受體結合活性及/或中和活性者，沒有特別限制。本發明中低分子化抗體限於包含全長抗體的一部分，沒有特別限定，但是較佳為包含VH或VL的低分子化抗體，特佳為包含VH及VL兩者的低分子化抗體。又本發明之低分子化抗體的其他較佳例子如，包含抗體CDR的低分子化抗體。低分子化抗體中所含的CDR也可包含抗體的6個CDR全部，或者也可包含部分的CDR。

本發明中的低分子化抗體較佳為較全長抗體的分子量更小者，例如形成二元體(dimer)、三元體(trimer)、四元體(tetramer)等的多量體，但是也可較全長抗體的分子量更大。

抗體片段的具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv等。低分子化抗體的具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙功能抗體(diabody)、sc(Fv) 2(單鏈(Fv) 2)等。此述之抗體的多元體(例如二元體、三元體、四元體、多元體(polymer))也包含於本發明之低分子化抗體中。

抗體片段可獲得自例如以酵素處理抗體而形成抗體片段。形成抗體片段的酵素，例如木瓜酵素、胃蛋白酶或血纖維蛋白溶酶(plasmine)等已為公知。或者，構築編碼此述抗體片段的基因，將其導入表現載體後，在適當宿主細胞中表現(例如Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994) 152,2968-2976、Better,M. & Horwiiz,A. H. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496、Plueckthun,A. & Skerra,A. Methods in Enzymology(1989) 178,497-515、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989) 121,652-663、Rousseaux,J. et al.,Methods in Enzymology(1989) 121,663-66、Bird,R. E. et al.,TIBTECH(1991) 9,132-137.)。

消化酵素切斷抗體片段的特定位置，給予如下述的特定構造之抗體片段。由此類酵素獲得的抗體片段可利用基因工程的方法使抗體的任意部分缺少。

使用上述消化酵素時所得的抗體片段如以下所示。

木瓜酵素：F(ab) 2或Fab

胃蛋白酶：F(ab’) 2或Fab’

血纖維蛋白溶酶(plasmine)：Facb

本發明中的低分子化抗體限於具有與IL-6受體結合活性及/或中和活性者，可包含缺少任意區域的抗體片段。

雙功能抗體(diabody)表示經基因融合構築的二價(bivalent)抗體片段(Holliger P et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097、WO93/11161等)。雙功能抗體(diabody)是由2個多胜肽鍵所構成的二元體(dimer)。一般而言，構成二元體的多胜肽鍵係各自在同一化學鍵中以連接物(linker)使VL與VH結合。雙功能抗體(diabody)中的連接物(linker)通常短於VL與VH無法互相結合的位置。具體而言，構成連接物(linker)的胺基酸殘基例如約為5個殘基。因此，同一多胜肽鏈上編碼的VL及VH不能形成單鏈可變區片段(fragment)，而形成其他單鏈可變區片段(fragment)與二元體。此結果使雙功能抗體(diabody)成為具有2個抗原決定位。

ScFv抗體為以連接物(linker)等結合VH及VL成為單鏈多胜肽的抗體(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85,5879-5883、Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol. 113,Resenburg及Moore編,Springer Verlag,New York,pp. 269-315,(1994))。scFv中H鏈V區及L鏈V區也可來自本說明書記載之任一抗體。連結V區的胜肽連接物(linker)沒有特別限制。例如可由約3-25殘基所形成的任一單鏈胜肽作為連接物(linker)使用。具體地說，例如可使用下述的胜肽連接物(linker)等。

兩鏈的V區可使用例如上述PCR法連結。為了以PCR法連接V區，首先下列的DNA中，將編碼全部胺基酸序列或希望的部分胺基酸序列之DNA作為模板利用。編碼抗體H鏈或H鏈V區的DNA序列，及編碼抗體L鏈或L鏈V區的DNA序列。

使用具有對應應擴增的DNA兩端序列之序列的引子一對，經PCR法，使編碼H鏈及L鏈的V區的DNA各自擴增。其次準備編碼胜肽連接物(linker)部分的DNA。利用編碼胜肽連接物(linker)的DNA及PCR而合成。此時利用的引子的5’端，增加可與各別合成的各V區擴增產物連接之鹼基序列。其次，利用[H鏈V區DNA]-[胜肽連接物DNA]-[L鏈V區DNA]的各DNA及聚合(assembly)PCR用的引子，進行PCR反應。

聚合(assembly)PCR用的引子由連接(aneal)於[H鏈V區DNA]5’端的引子及連接(aneal)於[L鏈V區DNA]3’端的引子組合而成。也就是說，聚合(assembly)PCR用的引子為可擴增編碼應合成的scFv全長序列的DNA之引子組。另一方面，[胜肽連接物DNA]中增加可與各V區DNA連結的鹼基序列。結果為，此述的DNA被連結，而且藉由聚合PCR用的引子，最終產生全長scFv的擴增產物。一旦製作編碼scFv的DNA，可遵循常法，取得包含前述DNA之表現載體，及由該表現載體轉形的重組細胞。而且經由培養此結果所得的重組細胞，使編碼該scFv的DNA表現，可取得該scFv。

結合的VH及VL順序沒有特別限定，也可以任何順序排列，例如可為下列順序。

[VH]連接[VL]

[VL]連接[VH]

sc(Fv)2為2個VH及2個VL以連接物等結合的單鏈低分子化抗體(Hudson et ak、J Immunol. Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2例如可將scFv以連接物結合製作。

又雖然2個VH及2個VL較佳為以單鏈多胜肽的N端為基點，依VH、VL、VH、VL([VH]連接[VL]連接[VH]連接[VL])的順序連接為特徵的抗體，但是2個VH及2個VL的順序不特定限於上述的配置，也可以為任何順序連接。例如可為以下順序。

[VL]連接[VH]連接[VH]連接[VL]

[VH]連接[VL]連接[VL]連接[VH]

[VH]連接[VH]連接[VL]連接[VL]

[VL]連接[VL]連接[VH]連接[VH]

[VL]連接[VH]連接[VL]連接[VH]

低分子抗體中的VH或VL的胺基酸序列也可有取代、缺失、增加、及/或插入。而且在使VH及VL會合的情形，只要抗原結合活性即可，也可使部分缺少，或增加其他多胜肽。又可變區也可被嵌合化(chimera)或人型化。

本發明中結合抗體可變區的連接物(linker)可使用經基因工程導入的任意胜肽連接物，或合成化合物的連接物，例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996揭示之連接物。

本發明中較佳的連接物(linker)為胜肽連接物。胜肽連接物的長度沒有特別限定，可視目的由該技術領域人士適當選擇，但是通常為1-100個胺基酸，較佳為3-50個胺基酸，更佳為5-30個胺基酸，特佳為12-18個胺基酸(例如15個胺基酸)。

胜肽連接物的胺基酸序列可例舉如以下序列。

Ser

Gly‧Ser

Gly‧Gly‧Ser

Ser‧Gly‧Gly

Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：45)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：46)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：47)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：48)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：49)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：50)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：51)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly。Gly(序列識別號：52)

(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：47)) n

(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：48)) n

[n為l以上的整數]等。

胜肽連接物的胺基酸序列可視目的由該技術領域人士適當選擇。例如決定上述胜肽連接物長度的n，通常為1-5，較佳為1-3，更佳為1或2。

合成化合物的連接物(化學交聯劑)為胜肽交聯常用的交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫基雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫基雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二號珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(磺基-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺基氧基羰氧基)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀醯亞胺基氧基羰氧基)乙基]碸(磺基-BSOCOES)等，此述的交聯劑為市售。

結合4個抗體可變區的情形時，通常必須要3個連接物。複數個連接物可使用相同或不同的連接物。

本發明之抗體也包含本發明抗體的胺基酸序列中增加1個或複數個胺基酸殘基的抗體。此述抗體與其他胜肽或蛋白質也包含經融合的融合蛋白。融合蛋白的製作方法宜為將編碼本發明抗體的多核苷酸與編碼其他胜肽或多胜肽的多核苷酸使其框架(frame)相同而連接，將其導入表現載體，在宿主中表現，可使用該技術領域中人士公知的方法。與本發明抗體融合的其他胜肽或多胜肽可使用例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988) 6,1204-1210)、6個His(組胺酸)殘基構成的6×His、10×His、流行性感冒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-微管蛋白(tubulin)片段、B-tag、蛋白C片段等公知的胜肽。又與本發明抗體融合的其他多胜肽，例如GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流行性感冒凝集素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。市售的編碼前述胜肽或多胜肽之多核苷酸與編碼本發明抗體的多核苷酸融合，使由此調製的融合多核苷酸表現，可製造融合多胜肽。

本發明之抗體也可為與聚乙二醇(PEG)或透明質酸等高分子物質、放射性物質、螢光物質、發光物質、酵素、毒素等各種分子結合的結合抗體(conjugate antibody)。此述的結合抗體可對所得的抗體進行化學修飾而得。抗體的修飾方法在此技術領域中已確立(例如US 5057313、US 5156840)。本發明中的「抗體」也包括此述的結合抗體。

本發明的抗體也包括糖鏈改變的抗體。

而且，本發明使用的抗體也可為雙特異性抗體(bispecific antibody)。所謂雙特異性抗體(bispecific antibody)是在同一抗體分子內具有辨識不同抗原決定位的可變區之抗體。本發明中，雙特異性抗體可為辨識IL-6受體分子上不同抗原決定位的雙特異性抗體，一抗原結合位辨識IL-6受體，另一抗原結合位辨識其他物質的雙特異性抗體。由辨識IL-6受體的本發明抗體所形成的雙特異性抗體，另一抗原結合部位所結合的抗原例如IL-6,TNF α,TNFR1,TNFR2,CD80,CD86,CD28,CD20,CD19,IL-1α,IL-β,IL-1R,RANKL,RANK,IL-17,IL-17R,IL-23,IL-23R,IL-15,IL-15R,BlyS,淋巴細胞毒素(lymphotoxin)α,淋巴細胞毒素(lymphotoxin)β,LIGHT配體(ligand),LIGHT,VLA-4,CD25,IL-12,IL-12R,CD40,CD40L,BAFF,CD52,CD22,]L-32,IL-21,IL-21R,GM-CSF,GM-CSFR,M-CSF,M-CSFR,IFN-α,VEGF,VEGFR,EGF,EGFR,CCR5,APRIL,APRILR等。

製造雙特異性抗體的方法為公知。例如使辨識不同抗原的2種抗體結合，可製作雙特異性抗體。結合的抗體可以各自為具有H鏈及L鏈的1/2分子，也可以為只有H鏈的1/4分子。或者，也可以使產生不同單株抗體的融合瘤(hybridoma)融合，製作產生雙特異性抗體的融合細胞。更可以藉由基因工程方法製作雙特異性抗體。

本發明之抗體在經過產生後述抗體的細胞或宿主或純化方法，可在胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈或型態等上不同。然而，所得的抗體只要具有與本發明抗體相同功能者，皆包含於本發明中。例如本發明抗體以原核細胞(例如大腸桿菌)表現的情形時，在抗體本身的胺基酸序列N端增加甲硫胺酸(methionine)殘基。本發明之抗體也包括此類抗體。

本發明之抗IL-6受體的抗體等之多胜肽可根據該技術領域中公知方法製造。

例如，以所得的抗IL-6受體的抗體序列為基礎，使用該技術領域中公知的基因重組技術，可製造抗IL-6受體的抗體。具體地說，構築編碼以辨識IL-6受體的抗體序列為基礎的抗體之多核苷酸，將其導入表現載體後，在適當宿主細胞中表現為佳(例如Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994) 152,2968-2976;Better,M. and Horwitz,A. H.,Methods Enzymol.(1989) 178,476-496;Pluckthun,A. and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989) 178,497-515;Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986) 121,652-663;Rousseaux,J. et al.,Methods Enzymol.(1986) 121,663-669;Bird,R. E. and walker,B. W.,Trends Biotechnol.(1991) 9,132-137)。

因此，本發明提供藉由本發明之多胜肽或編碼本發明多胜肽之基因，製造編碼的多胜肽之方法，包括培養含有導入編碼本發明多胜肽之多核苷酸的載體之宿主細胞的步驟。

更具體地說，提供包括以下步驟之本發明多胜肽的製造方法。(a)培養含有導入編碼本發明多胜肽之基因的載體之宿主細胞的步驟；(b)由該基因取得被編碼的多胜肽之步驟。

載體的例子，例如M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又在以cDNA次選殖(subcloning)、篩選出來為目的的情況下，除上述載體以外，例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在產生本發明抗體的目的中，使用載體的情形特別以表現載體為有效。作為表現載體例如以大腸桿菌表現為目的的情形，載體除具有以大腸桿菌擴增的特徵以外，當宿主為JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等的大腸桿菌的情形時，必須具有大腸桿菌可更有效率地表現的啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子(Ward等,Nature(1989) 341,544-546；FASEB J.(1992) 6,2422-2427)、araB啟動子(Better等,Science(1988) 240,1041-1043)、或T7啟動子。此類的載體除上述載體以外，例如pGEX-5X-1(Pharmacy製)、「QIAexpress system」(Qiagen製)、pEGFP、或pET(此種情形下，宿主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)。

表現質體(plasmid)的載體可包含抗體分泌用的訊息(signal)序列。所謂抗體分泌用的訊息(signal)序列，為產生大腸桿菌的胞漿(periplasma)的情形時，可使用pe1B訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol.(1987)169,4379)。對宿主細胞的載體導入可使用例如氯化鈣法、電穿孔法(electroporation)進行之。

除了大腸桿菌以外，製造本發明抗體的載體例如來自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen製)或pEF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、來自昆蟲的表現載體(例如「Bac-to-BAC桿狀病毒(baculovirus)表現系統」(GIBCO BRL製)、pBacPAK8)、來自植物的表現載體(例如pMH1、pMH2)、來自動物病毒的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIPneo)、來自酵母菌的表現載體(例如、「Pichia Expression Kit」(Invitrogen製)、pNV11、SP-Q01)、來自枯草菌的表現載體(例如、pPL608、pKTH50)。

以CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞表現為目的的情形時，表現質體的載體必須具有細胞內表現的必要啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima 等,Nucleic Acids Res.(1990) 18,5322)、CMV啟動子等，更佳為具有篩選細胞轉形用的基因(例如藥劑(neomycin、G418等)可判別的藥劑耐受性基因)。具有此類特性的載體例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

而且，以安定地表現基因且在細胞內擴增基因的複製數為目的的情形時，例如在缺少核酸合成路徑的CHO細胞中導入具有與其互補的DHFR基因之載體(例如pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))等)，經由甲基喋呤(Methotrexate；MTX)擴增的方法，或者以基因暫時性表現為目的的情形時，例如使用在染色體上具有表現SV40T抗原之基因的COS細胞，以具有SV40複製起點的載體(pcD等)轉形的方法。複製的開始點可使用來自多瘤病毒(polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、牛乳突狀病毒(BPV)等者。而且為了以宿主細胞系擴增基因複製數，表現載體可包括胺基糖基轉移酶(amino glycosyltransferase；APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫業酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標誌(marker)。

如此所得的本發明抗體可由宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離，實質上純化為均一的抗體而精製。抗體的分離、精製可使用通常的抗體精製所使用的分離、純化方法，沒有任何限定。例如適當選擇或組合層析柱、過濾、限制過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，可分離、純化抗體。

層析法例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、膠濾過法、逆相層析法、吸附層析法等(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。此述的層析法可使用液相層析法，例如HPLC、FPLC等的液相層析法進行。親和性層析法使用的柱例如蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A的柱例如Hyper D,POROS,Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)等所示。本發明也包含使用此述的純化方法高度精製的抗體。

所得的抗體對IL-6受體的結合活性之測定可以該技術領域人士公知方法進行。例如測定抗體的抗原結合活性之方法可使用ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光抗體法。例如使用酵素免疫測定法時，在塗覆抗原的盤上加入含有抗體的試料，例如抗體產生細胞的培養上清液或純化抗體。添加以鹼化磷酸酶等酵素標記的次級抗體，培養該盤，洗淨後加入p-硝苯基磷酸等的酵素基質，測定吸光度，評價抗原結合活性。

醫藥組成物

本發明更提供含有上述多胜肽為有效成分的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可用於與IL-6關聯的風濕性關節炎等的疾病。即本發明亦提供以上述抗體為有效成分的風濕性關節炎等疾病之治療劑。本發明之對象的疾病較佳例如風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎、卡斯托曼(Castleman)病、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、克隆氏(clone)症、淋巴癌(lymphoma)、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎氏症、史迪爾氏(Sti11)症、類澱粉症(amyloidosis)、多發性硬化症、移植、老年性黃斑變性症、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性關節炎、慢性阻塞肺疾病(COPD)、IgA腎病、變形性關節炎、氣喘、糖尿病性腎病、GVHD、子宮內膜症、肝炎(NASH)、心肌梗塞、動脈硬化、敗血症、骨質酥鬆症、糖尿病、多發性骨髓瘤、前列腺癌、腎炎、B細胞非霍奇金氏症(B-cell non-Hodgkin’s)、胰臟癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌惡病質(cachexia)、癌神經浸潤、心肌梗塞、近視性脈絡膜血管新生、特發性脈絡膜血管新生、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、延遲性過敏症、接觸性皮膚炎、異位性皮膚炎、間皮瘤(mesothelioma)、多發性肌炎、皮膚肌炎、泛葡萄膜炎、前部葡萄膜炎、中間部葡萄膜炎、強膜炎、角膜炎、眼窩炎、視神經炎、糖尿病視網膜症、增殖性玻璃體視網膜症、乾眼症、術後炎症等，但不限於此。

所謂含有抗IL-6受體的抗體為「有效成分」，是指含有抗IL-6受體的抗體為至少1個活性成分，不限制其含有率。本發明之醫藥組成物也包含與上述多胜肽組合的其他有效成分。

而且，本發明之醫藥組成物不只為治療目的，也可用於預防目的。

本發明之多胜肽可依慣例製劑化(例如Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U. S. A)。而且可視需要同時包含醫藥容許載劑及/或添加劑。例如可包含界面活性劑(PEG、Tween等)、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、著色料、香料、保存料、安定劑、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、其他有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等張劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑、流動促進劑、矯味劑等。然而，本發明的炎症性疾病之預防劑或治療劑不限於此述，也可適當包含其他常用的載劑。具體地說，例如輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酯、聚乙烯吡咯酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。也可包含其他低分子量的多胜肽、血清白蛋白、明膠及免疫球蛋白等的蛋白質及胺基酸。當為注射用的水溶液時，將抗IL-6受體的抗體溶解於含有例如生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥的等張溶液中。輔助藥也可與例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等，更可以並用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子界面活性劑(聚山梨糖醇80、HCO50)等。

可視需要將多胜肽封入微膠囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等的微膠囊)，也可作成膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微粒、微乳化液、奈米粒子、及奈米膠囊等)(參考Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition &,Oslo Ed. (1980)等)。而且將藥劑作成徐放性藥劑的方法也是公知，可適用於多胜肽(Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res. (1981)15:167-277;Langer,Chem. Tech. (1982)12:98-105；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman et al.,Biopolymers(1983) 22:547-56;EP第133,988號)。而且也可在本劑中添加或混和玻尿酸酶(hyaluronidase)增加皮下投與的液量。

本發明之醫藥組成物可經口或非經口投與，但是較佳為非經口投與。具體為經由注射及經皮投與來投與患者。注射劑型可例如以靜脈內注射、肌肉內注射、或皮下注射等全身性或局部性投與。也可對治療部位或其週邊局部注入，特別是以肌肉內注射為佳。經皮投與的劑型例如軟膏劑、膠劑、霜劑、濕布劑、及貼劑等，可全身性或局部投與。又可根據患者年齡、症狀選擇適當投與的方法。投與量可選擇例如每次每1kg體重的活性成分為0.0001mg-100mg的範圍。或者例如投與人患者時，可選擇每位患者投與0.001-1000mg/kg體重之範圍，每次投與量宜包含例如本發明抗體約0.01-50mg/kg體重的量。然而，本發明之醫藥組成物不限於此述之投與量。

而且，本發明記載之胺基酸序列所包含的胺基酸也可為轉譯後經修飾(例如N端的穀胺酸(glutamine)為焦穀胺酸化(pyroglutamine)的焦穀胺酸修飾為該技術領域人士已知之修飾)，此類胺基酸即使為轉譯後修飾的情形，也包含於本發明記載之胺基酸序列。

結合的糖鏈也可以是任何的構造。EU編號297號的糖鏈可以是任何的糖鏈構造(較佳為炭藻糖(fucosyl)化的糖鏈)，或者也可以不與糖鏈結合(例如以大腸桿菌生產時，或者EU編號297號可能不與糖鏈結合而改變)。

本說明書中引用的所有先前技術參照併入本說明書中。【實施例】以下由實施例具體說明本發明，然而，本發明不限於此述實施例。

[實施例1]使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)對IL-6受體的親和性提升的可變區變異位置之確認

為了使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)(H鏈WT-IgG1/序列識別號53，L鏈WT-κ/序列識別號54)對IL-6受體的親和性提升，製作CDR序列中導入變異的資料庫(library)，進行檢討。篩選CDR中導入變異的資料庫，結果發現對IL-6受體的親和性提升的變異，如第1圖所示。組合此述變異的高親和性第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，例如RDC-23(H鏈RDC23H-IgG1/序列識別號55、L鏈RDC-23L-κ/序列識別號56)。RDC-23對可溶型IL-6受體的親和性及BaF/gp130的生物活性，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)作比較(方法參考參考例)。

測定親和性的結果如表1所示。測定BaF/gp130的生物活性(IL-.6終濃度為30ng/mL)的結果如第2圖所示。發現與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，RDC-23提高約60倍的親和性，BaF/gp130的100%抑制濃度提高約100倍活性。

[實施例2]因第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點降低而增加藥物動力的變異之確認

為了使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的藥物動力增加，對於與IL-6受體的結合未大幅降低、及可使可變區的等電點降低的變異位置，進行檢討。篩選由第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)立體構造模型所推知的可變區變異位置的結果，發現對IL-6受體的結合未大幅降低、及可使可變區的等電點降低的變異位置，如第3圖所示。組合此述變異的等電點降低的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，例如H53/L28(H鏈H53-IgG1/序列識別號57、L鏈L28-κ/序列識別號58)。將H53/L28對可溶型IL-6受體的親和性、BaF/gp130的生物活性、等電點、及小鼠中的藥物動力，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)比較(方法參考參考例)。

測定親和力的結果如表2所示。測定BaF/gp130的生物活性(IL-6終濃度為30ng/mL)的結果如第4圖所示。發現與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，H53/L28提高約6倍的親和性，BaF/gp130的100%抑制濃度提高約數倍的活性。

由該技術領域公知的等電點電泳測定等電點的結果，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點為約9.3，H53/L28的等電點為約6.5~6.7，H53/L28較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點降低約2.7。又以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算可變區VH/VL的理論等電點，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的理論等電點為約9.20，H53/L28的理論等電點為約4.52，H53/L28較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點降低約4.7。

為了評價等電點降低的改變抗體H53/L28的藥物動力，進行第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H53/L28在正常小鼠中的藥物動力。將第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H53/L28以1mg/kg靜脈內(IV)及皮下(SC)單次投與小鼠(C57BL/6J，日本Charles River)，評價血漿中濃度變化。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H53/L28的靜脈內投與後血漿中濃度變化如第5圖所示，皮下投與後的血漿中濃度變化如第6圖所示，經WinNonlin(Pharsight社製)所得的藥物動力學的參數(清除率(CL)、半衰期(T1/2))如表3所示。H53/L28的靜脈內投與後的血漿半衰期(T1/2)為第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)者延長約1.3倍，清除率降低約1.7倍。H53/L28的皮下投與後的T1/2為第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)者延長約2倍，清除率降低約2.1倍。發現藉由此類的胺基酸取代使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點降低，可使藥物動力大幅提升。

[實施例3]降低第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的免疫原性之變異位置的確認

降低因存在可變區的T細胞抗原決定位之免疫原性風險之變異位置的確認

存在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區序列之T細胞抗原決定位，使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec；34(4):468-75)分析。結果預測L鏈CDR2中存在與多的HLA結合之T細胞抗原決定位(存在免疫原性風險高的序列)。此處，檢討TEPITOPE分析中使L鏈CDR2的免疫原性風險降低，安定性、結合活性、中和活性不降低的胺基酸取代。

篩選結果發現，如下述的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的L鏈CDR2(序列識別號59)的L51(Kabat編號，Kabat EA et al‧　1991‧　Sequences of Proteins of Immunological Interest‧NIH)的蘇胺酸(threonine)被甘胺酸(glycine)取代，L53的精胺酸(arginine)被穀胺酸(glutamine)取代(序列識別號60)，發現可在不降低安定性、結合活性、中和活性下，使免疫原性風險降低。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB) L鏈CDR2(序列識別號59)去除T細胞抗原決定位的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB) L鏈CDR2(序列識別號60)

[實施例4]第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區架構(framework)序列經完全人型化的免疫原性風險的降低

在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區序列中，H鏈FR1的H27、H28、H29、H30及H鏈FR3的H71(Kabat編號，Kabat EA et al‧　1991‧　Sequences of Proteins of Immunological Interest‧NIH)，在人型化過程中為了維持結合活性，以架構(framework)序列殘存小鼠序列(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)。由於殘存的小鼠序列能形成免疫原性風險增高的原因，對於使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的免疫原性風險更降低而使架構(framework)序列完全人型化，進行檢討。

結果發現，當第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的H鏈FR1(序列識別號61)被以下的人型化H鏈FR1-A(序列識別號62)取代者，或當第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的H鏈FR3(序列識別號63)被以下的人型化H鏈FR3(序列識別號64)取代者，可在不降低安定性、結合活性、中和活性下，使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的全部架構(framework)完全人型化。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)H鏈FR1(序列識別號61)人型化H鏈FR1-A(序列識別號62)(來自Germline IMGT hVH_4_)第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB) H鏈FR3(序列識別號63)人型化H鏈FR3(序列識別號64)(來自Mol. Immunol. 2007,44(4):412-422)

[實施例5]第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)對IL-6受體因pH依賴結合之藥物動力提高的變異位置之確認

使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的藥物動力提高的方法之一，考量改良使1分子的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與複數個IL-6受體重複結合、中和的分子之方法。當第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與膜型IL-6受體結合後，以結合於膜型IL-6受體的狀態內在化(internalization)進入細胞內囊胞(endosome)內，之後第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與膜型IL-6受體結合的狀態移向溶胞體(lysosome)，共同經溶胞體被分解。亦即，考量通常1分子的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與1分子或2分子的膜型IL-6受體(1價或2價)結合，內在化(internalization)後，以溶胞體(lysosome)分解，因此1分子的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)只能與1分子或2分子的膜型IL-6受體結合、中和。

此處，如果可以製造第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)在中性條件下維持結合、且只有在酸性條件下的結合大幅降低之pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，如第7圖所示，pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)在內囊胞(endosome)內從作為抗原的膜型IL-6受體解離，與存在於內囊胞內的FcRn結合，可回到血漿中，回到血漿中的pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，可再次與膜型IL-6受體結合。重複此述在血漿中的結合及內囊胞內的解離，可使1分子的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與複數個分子的IL-6受體反覆結合、中和，因此與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的藥物動力提高。

內囊胞內的酸性條件中，為了使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)從IL-6受體解離，在酸性條件中的結合必須要比在中性條件下的結合大幅度地弱。細胞表面由於必須與IL-6受體強力結合而中和，因此必須要細胞表面的pH值為pH7.4，使第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與等量以上的IL-6受體結合。已報導內囊胞內的pH通常為pH5.5~pH6.0(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.)，因此如果改良成在pH5.5~pH6.0中與IL-6受體結合弱的pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，則判斷在內囊胞內的酸性條件下從IL-6受體解離。亦即，如果改良成在細胞表面的pH為pH7.4中與IL-6受體結合強，而在內囊胞內的pH為pH5.5~pH6.0中與IL-6受體結合弱的pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，判斷可以1分子與複數個IL-6受體結合、中和，而使藥物動力提升。

對於賦予第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)對IL-6受體結合的pH依賴性，pka為6.0~6.5左右，思考中性條件下(pH7.4)及酸性條件下(pH5.5~pH6.0)之間質子解離狀態變化的組胺酸(histidine)殘基導入於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區之方法。此處，對於由第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的立體構造模型推測的可變區之組胺酸(histidine)導入位置，進行篩選。又製作以第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)選擇的可變區序列中隨意取代為組胺酸所設計的資料庫，進行篩選。前述篩選以在pH7.4中與IL-6結合、在pH5.5-pH5.8中從IL-6受體解離、或親和力降低者為指標，進行。

結果發現可對第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的IL-6受體結合賦予pH依賴性(在pH7.4結合、在pH5.8解離的性質)的變異位置，如第8圖所示。第8圖的H27的酪胺酸(tyrosine)取代為組胺酸(histidine)，沒有CDR，有H鏈FR1的變異，但H27的組胺酸序列已記載於Eur. J. Immunol. 1992. 22:1719-1728，因為存在為人序列(序列識別號65)，因此可使用下列的架構(framework)配合實施例4，使其完全人型化。人型化H鏈FR1-B(序列識別號65)

組合此述變異的pH依賴結合的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，例如H3pI/L73(H鏈H3pI-IgG1/序列識別號66、L鏈L73-κ/序列識別號67)。H3pI/L73在pH7.4中與可溶型IL-6受體的親和力、在pH7.4及pH5.8中從膜型IL-6受體解離的速度、BaF/gp130的生物活性、及在食蟹猴及人IL-6受體轉殖基因小鼠中的藥物動力，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)比較(方法參考參考例)。

在pH7.4中與可溶型IL-6受體的親和力的測定結果，如表4所示。BaF/gp130的生物活性(IL-6終濃度為30ng/mL)的測定結果如第9圖所示。顯示H3pI/L73在pH7.4中與可溶型IL-6受體的親和力及BaF/gp130活性，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)大約相同。

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H3pI/L73在pH7.4及pH5.8中從膜型IL-6受體解離速度的測定結果，如表5所示。H3pI/L73在PH5.8中的解離速度變快，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，H3pI/L73從膜型IL-6受體解離的速度之pH依賴性，顯示增加約2.6倍。

以1mg/kg的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H3pI/L73靜脈內單次投與食蟹猴，評價血漿中濃度變化。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H3pI/L73靜脈內投與後的血漿中濃度變化如第10圖所示。其結果，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，H3pI/L73在食蟹猴中的藥物動力大幅改善。

以25mg/kg的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H3pI/L73靜脈內單次投與人IL-6受體轉殖基因小鼠(hIL-6Rtg小鼠，Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May23;92(11):4862-6)，評價血漿中濃度變化。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及H3pI/L73靜脈內投與後的血漿中濃度變化如第11圖所示。其結果，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，H3pI/L73在人IL-6受體轉殖基因小鼠中的藥物動力大幅改善。

pH依賴結合之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的H3pI/L73，因為在食蟹猴及人IL-6受體轉殖基因小鼠中，相較於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，藥物動力大幅改善，因此具有在pH7.4與抗原結合、在pH5.8從抗原解離的性質，思考可以1分子與複數個IL-6受體結合、中和。而且，與IL-6受體的結合上，具有較H3pI/L73具有更強的pH依賴性者，可更加改善藥物動力。

[實施例6]第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的恆定區的理想化

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的H鏈C端異質性(heterogeity)的降低

IgG抗體的H鏈C端序列的異質性已知為C端胺基酸的賴胺酸(lysine)殘基的缺少，及C端的二個胺基酸甘胺酸(glycine)及賴胺酸(lysine)的缺少，而使C端的羧基醯胺化(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的主成分雖然為鹼基序列上存在的C端胺基酸賴胺酸(lysine)經轉譯後修飾而缺少的序列，但是賴胺酸(lysine)殘留的副成分及因為甘胺酸(glycine)及賴胺酸(lysine)兩者的缺少而使C端的羧基醯胺化的副成分，也存在異質性。要維持目的物質/關聯物質的異質性之製造間差及大量製造醫藥品並不容易，關於成本增加，希望可能限於單一物質，在開發抗體作為醫藥品上，降低此述的異質性。因此，在開發醫藥品上，希望不存在H鏈C端的異質性。

以降低C端胺基酸的異質性為目的，進行C端胺基酸的改變。結果發現，在第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的H鏈恆定區的C端賴胺酸(lysine)及甘胺酸(glycine)，預先在鹼基序列上缺少，可能避免來自C端的異質性。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、C端缺少賴胺酸(lysine)的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)(TOCILIZUMABΔ K、H鏈WT-IgG1ΔK/序列識別號68、L鏈WT-κ/序列識別號54)、及C端缺少賴胺酸(lysine)及甘胺酸(glycine)的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)(TOCILIZUMABΔGK、H鏈WT-IgG1ΔGK/序列識別號69、L鏈WT-κ/序列識別號54)，以陽離子交換層析法評價異質性。使用ProPac WCX-10,4×250mm(Dionex)作為層析柱，移動相A為25mmol/L MES/NaOH,pH 6.1，移動相B為25mmol/L MES/NaOH,250mmol/L NaCl,pH 6.1，使用適當流量及梯度來進行。經陽離子交換層析法評價的結果如第12圖所示。結果發現，不只是H鏈恆定區的C端賴胺酸(lysine)，H鏈恆定區的C端賴胺酸(lysine)及甘胺酸(glycine)兩者，事先在鹼基序列上缺少者，可能降低開始的C端胺基酸的異質性。在人抗體恆定區IgG1、IgG2、IgG4中，C端序列的EU編號第447位變成為賴胺酸、第446位變成為甘胺酸，因此判斷以本檢討所發現的降低C端胺基酸異質性的方法，也可適用於IgG2恆定區及IgG4恆定區或其改變體。

來自第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的IgG2同型物(isotype)的雙硫鍵(disulfide)之異質性的減少

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物為IgG1，因為第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)為中和抗體，考慮免疫原性及副作用時，判斷與Fcγ受體結合不佳的可能性。降低對Fcγ受體的結合的方法，考慮將IgG抗體的同型物由IgG1變成IgG2或IgG4(Ann Hematol. 1998 Jun；76(6):231-48.)，從與Fcγ受體結合及藥物動力的觀點，認為IgG2較IgG4更為所期望者(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。另一方面，當開發抗體作為醫藥品時，蛋白質的物性、特別是均一性及安定性極為重要，IgG2同型物已知有極多來自樞紐區的雙硫鍵鍵結的異質性(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.)。要維持來自上述的目的物質/關聯物質的異質性之製造間差，並且大量製造作為醫藥品，並不容易，關於成本增加，希望可能限於單一物質。因此，以IgG2同型物的抗體作為醫藥品開發上，希望在不降低安定性下，減少來自雙硫鍵鍵結的異質性。

以減少IgG2同型物的異質性為目的檢討各種改變體的結果為，在IgG2的恆定區序列中，在H鏈CH1區(domain)的EU編號第131位的半胱胺酸(cysteine)與第133位的精胺酸(arginine)分別被取代為絲胺酸(serine)及賴胺酸(lysine)，而且，在H鏈的上樞紐(upper hinge)的EU編號第219位的半胱胺酸(cysteine)被取代為絲胺酸(serine)之WT-SKSC(序列識別號：70)的恆定區，發現在不使安定性降低下，可降低異質性。製作第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1(H鏈WT-IgG1/序列識別號：53、L鏈WT-κ/序列識別號：54)、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2(H鏈WT-IgG2/序列識別號：71、L鏈WT-κ/序列識別號：54)、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC(H鏈WT-SKSC/序列識別號：70、L鏈WT-κ/序列識別號：54)，進行異質性及安定性的評價。異質性的評價由陽離子交換層析法實施。柱為ProPac WCX-10(Dionex)，移動相A為20mM乙酸鈉，pH5.0，移動相B為20mM乙酸鈉、1M NaCl，pH5.0，使用適當流量及梯度實施。經陽離子交換層析法評價結果如第13圖所示。安定性的評價經由示差掃描熱量測定(DSC)(VP-DSC、Microcal社製)，評價熱變性中間溫度(Tm值)。在20mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH6.0中的DSC測定結果及Fab區(domain)的Tm值如第14圖所示。

結果為，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1相比，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2明顯異質性增大，但是第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC的異質性卻大幅降低。再與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1相比，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2在DSC中的Fab區的熱變性波峰因為異成分(hetero component)判斷安定性低，即認為是Tm低的短峰(Fab*)的成分，但是第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC由異成分判斷的Tm值低的短峰消失，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2的Fab區顯示相同的約94℃的Tm值，因此發現第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC具有高的安定性。

提升第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的藥物動力之恆定區變異位置的確認

如上述，從第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物IgG1，發現C端異質性降低、對Fcγ受體的結合性降低、維持高安定性的狀態之IgG2同型物恆定區抗體的異質性降低，但是關於藥物動力也希望有較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的同型物IgG1更優良的恆定區。

為了發現較IgG1同型物的恆定區抗體具有更優良的血漿中半衰期的恆定區，對於具有高安定性及與IgG2同型物恆定區抗體相關的上述異質性降低的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC而言，以使藥物動力上升為目的，篩選變異位置的結果發現，對WT-SKSC的EU編號第137位的麩胺酸(glutamic acid)被取代為甘胺酸(glycine)，第138位的絲胺酸(serine)被取代為甘胺酸(glycine)，第268位的組胺酸(histidine)被取代為麩醯胺酸(glutamine)，第355位的精胺酸(arginine)被取代為麩醯胺酸(glutamine)，第419位的麩醯胺酸(glutamine)被取代為麩胺酸(glutamic acid)，以及為了降低H鏈C端異質性而缺少第446位的甘胺酸(glycine)及第447位的賴胺酸(lysine)之WT-M58(序列識別號72(胺基酸序列))。而且，另一方面，製作對IgG1的第434位的天冬醯胺酸(asparagine)取代為丙胺酸(alanine)的WT-M44(序列識別號73(胺基酸序列))。再製作對M44的降低H鏈C端異質性而缺少第446位的甘胺酸(glycine)及第447位的賴胺酸(lysine)之WT-M83(序列識別號74(胺基酸序列))。另製作對WT-M58的第434位的天冬醯胺酸(asparagine)取代為丙胺酸(alanine)的WT-M73(序列識別號75(胺基酸序列))。

製造第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44(H鏈WT-M44/序列識別號73、L鏈WT-κ/序列識別號54)、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58(H鏈WT-M58/序列識別號72、L鏈WT-κ/序列識別號54)及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73(H鏈WT-M73/序列識別號75、L鏈WT-κ/序列識別號54)，對於人FcRn的親和性及人FcRn的轉殖基因鼠，評價藥物動力(方法參考參考例)。

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73對人FcRn結合性的評價由Biacore進行，結果如表6所示，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73的結合性，分別較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1優良約2.7倍、約1.4倍及約3.8倍。

對於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73的人FcRn轉殖基因鼠中的藥物動力進行評價，結果如第15圖所示。第15圖中第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73任一個與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1相比，皆出現藥物動力上升。此藥物動力上升的效果與對人FcRn的結合能力相關。其中關於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1相比，在28天後的血漿中濃度改善約16倍來看，人體中具有M73恆定區的抗體與具有IgG1恆定區的抗體相比，藥物動力大幅上升。

[實施例7]改善PK/PD的完全人型化IL-6受體的抗體之製作

由上述實施例中發現的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的可變區及恆定區的變異，將該變異複數個組合製作成第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)改變體，實施各種篩選的結果，發現將Fv3-M73(H鏈VH4-M73/序列識別號25、L鏈VL1-κ/序列識別號：28)、Fv4-M73(H鏈VH3-M73/序列識別號：26、L鏈VL3-κ/序列識別號：29)、Fv5-M83(H鏈VH5-M83/序列識別號：27、L鏈VL5-κ/序列識別號：30)作為完全人型化IL-6受體的抗體。

製作的Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83對IL-6受體的親和性，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)作比較(方法參考參考例)。這些抗體在pH7.4中對可溶型IL-6受體的親和性之測定結果，如表7所示。再比較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與控制組(參考例中公知高親和性IL-6受體的抗體、US2007/0280945中的VQ8F11-21 hIgG1)的BaF/gp130的中和活性(方法參考參考例)。測定這些抗體的BaF/gp130生物活性之結果，如第16圖(IL-6終濃度300ng/mL：第六介白質受.體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv5-M83)及第17圖(IL-6終濃度30ng/mL：第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、Fv3-M73、Fv4-M73)所示。如表7所示，Fv3-M73、Fv4-M73具有較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)約2-3倍的強親和性，Fv5-M83則顯示較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)約100倍的強親和性(Fv5-M83的親和性測定上有困難，因此使用恆定區為IgG1的Fv5-IgG1(H鏈VH5-IgG1/序列識別號76、L鏈VL5-κ/序列識別號30)測定親和性，判斷恆定區通常不影響親和性)。如第17圖所示，Fv3-M73、Fv4-M73顯示較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)稍微強的活性，第16圖顯示，Fv5-M83在50%抑制濃度上，具有較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)100倍以上的極強活性，而且與公知的高親和性抗IL-6受體抗體之控制組相比，在50%抑制濃度上也顯示約10倍的高中和活性。

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、Fv3-M73、及Fv4-M73在pH7.4及pH5.8中從膜型IL-6受體解離的速度之測定結果，如表8所示(方法參考參考例)。Fv3-M73及Fv4-M73由膜型IL-6受體解離的速度之pH依賴性，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)相比，分別升高約11倍及10倍。與實施例5中的H3pI/L73相比，由於解離速度的pH依賴性大幅升高，判斷Fv3-M73及Fv4-M73的藥物動力較H3pI/L73大幅升高。

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83的等電點由該技術領域公知方法以等電點電泳測定，結果為第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的等電點為約9.3，控制組為約8.4~8.5，Fv3-M73為約5.7~5.8，Fv4-M73為約5.6~5.7，Fv5-M83為5.4~5.5，任一個抗體的等電點皆較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組者大幅降低。可變區VH/VL的理論等電點由GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算，第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的理論等電點為9.20，控制組為7.79，Fv3-M73為5.49，Fv4-M73為5.01，Fv5-M83為4.27，任一個抗體的等電點皆較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組者大幅降低。實施例2中因為等電點降低顯示藥物動力改善，因此判斷Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組相比，藥物動力提高。

存在於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83的可變區序列中的T細胞抗原決定位使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)進行分析。結果如實施例3所示，預測第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)中存在許多序列與HLA結合之T細胞抗原決定位，但是Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83中預測與T細胞抗原決定位結合的序列卻大幅減少。又Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83被完全人型化，架構(framework)中不存在小鼠序列。因此暗示，Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83可能較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)大幅減少免疫原性風險。

[實施例8]完全人型化IL-6受體抗體的猴PK/PD試驗

靜脈內單次投與食蟹猴1mg/kg的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83，評價血漿中濃度變化(方法參考參考例)。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83在靜脈內投與後血漿中濃度變化如第18圖所示。結果為，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組在食蟹猴體內的藥物動力皆大幅改善。其中，Fv3-M73及Fv4-M73的藥物動力較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)大幅改善。

為了評價食蟹猴的膜型IL-6受體的中和程度之藥效，從投與抗體的第6天至第18天(第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)從第3天至第10天)，對食蟹猴腰背部連日皮下投與5μg/kg的IL-6，24小時後測量各個體的CRP濃度(方法參考參考例)。各抗體投與時的CRP濃度變化如第19圖所示。為了評價食蟹猴的可溶性IL-6受體的中和程度的藥效，測定食蟹猴血漿中非結合型的食蟹猴可溶型IL-6受體濃度，計算非結合型的可溶型IL-6受體率(方法參考參考例)。各抗體投與時非結合型的可溶型IL-6受體率的變化如第20圖所示。

Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83任一個與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及公知高親和性抗IL-6受體抗體之控制組相比，皆較持續地中和食蟹猴的膜型IL-6受體，及長時間抑制CRP的增加。而且，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83任一個與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組相比，皆較持續地中和食蟹猴的可溶型IL-6受體，及長時間抑制非結合型的食蟹猴可溶型IL-6受體的增加。因此，關於膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體的中和持續性方面，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83皆較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組優良。其中以Fv3-M73及Fv4-M73的中和持續性極為優良。另一方面，由於Fv5-M83較Fv3-M73及Fv4-M73在CRP及非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體的抑制低，因此，判斷Fv5-M83較Fv3-M73及Fv4-M73及公知高親和性抗IL-6受體抗體之控制組對膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體具有更強地中和。此係在食蟹猴體內(in vivo)反應之結果所判斷，Fv5-M83對IL-6受體的親和性較控制組強，且BaF/gp130中的生物活性較控制組強。

因此，與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及控制組相比，Fv3-M73及Fv4-M73作為抗IL-6受體中和抗體的作用持續性極優，可大幅降低投與頻率及投與量，而且，Fv5-M83作為抗IL-6受體中和抗體的作用強度極優，且作用持續性亦優。因此Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83可有效作為IL-6拮抗劑的醫藥品。

[實施例9]

單核球趨化性蛋白(MCP)-1已知與單核球、T細胞、NK細胞、噬鹼性(basophil)的細胞浸潤有關。已報導MCP-1在RA患者的滑膜組織、滑液中為高表現(J Clin Invest. 1992 Sep;90(3):772-9)，判斷與RA病症有關(Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar;7(1):53-66.)。

VEGF已知為強力的血管新生因子，從RA患者的滑膜中巨噬細胞、纖維芽細胞、滑膜細胞等所產生(J Rheumatol. 1995 Sep;22(9):1624-30.)。而且，RA患者的血清中VEGF濃度與疾病的活動性或放射性進展(radiographic progression)相關(Arthritis Rheum. 2003 Jun;48(6):1521-9.、ArthTitis Rheum. 2001 Sep;44(9):2055-64.)，RA患者經由抗IL-6抗體之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)治療，從血清中VEGF濃度降低來看，判斷VEGF也在RA病症中扮演重要角色(Mod Rheumatol. 2009;19(1):12-9.、Mediators Inflamm. 2008;2008:129873)。

此處，對於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及Fv4-M73是否可抑制經sIL-6R及IL-6刺激使來自人RA患者之滑膜細胞的MCP-1及VEGF產生，以下述方法檢討。

將來自人RA患者的滑膜細胞(TOYOBO)以2x10⁴ /0.05mL/孔播種於含有5%FCS的IMDM培養基之96孔盤，在CO₂ 培養箱(37℃，5% CO₂ )中靜置90分鐘。添加0.05mL適當稀釋濃度之第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及Fv4-M73，靜置15分鐘後，添加0.05mL可溶型IL-6受體(SR344，根據參考例之方法調配)，再靜置30分鐘，再加入0.05mL的IL-6(TORAY)(可溶型IL-6受體及IL-6的終濃度各為50ng/mL)。培養2日後，回收培養上清液，該培養上清液中的MCP-1及VEGF濃度以ELISA套組(Biosource及Pierce Biotechnology)測定。結果如第21及22圖所示。第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及Fv4-M73對於以可溶型IL-6受體及IL-6刺激來自人RA患者的滑膜細胞之MCP-1及VEGF的產生，有濃度依賴地抑制。

因此，Fv4-M73在作為抗IL-6受體中和抗體的作用(與IL-6受體結合，阻斷膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體的訊號)的持續性，極優於第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)，可較第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)大幅降低投與頻率及投與量，而且，因為Fv4-M73抑制來自人RA患者的滑膜細胞之MCP-1及VEGF的產生，顯示Fv4-M73為RA極為有效之治療藥。

[參考例]

重組的可溶型人IL-6受體的製造

作為抗原之人IL-6受體的重組可溶型人IL-6受體，如以下調配。如J.Biochem. 108,673-676(1990)報導，製作由N端第1位至第344位的胺基酸序列所形成的可溶型人IL-6受體(Yamasaki等、Science 1988；241：825-828(GenBank # X12830))之CHO細胞恆定表現株。從SR344表現的CHO細胞所得的培養上清液，經過Blue Sepharose 6FF柱層析法、柱上固定對SR344特異抗體之親和性層析法、膠濾過柱層析法之3種柱層析法，純化可溶型人IL-6受體。主峰的溶出的分層(fraction)為最終純產物。

重組的可溶型食蟹猴IL-6受體(cIL-6R)的製造

將已公開的恆河猴IL-6受體的基因序列(Birney et al,Ensembl 2006,Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.)製作寡DNA引子，從食蟹猴胰臟製造的cDNA為模板，使用引子，經PCR法製造編碼全長食蟹猴IL-6受體基因的DNA片段。所得的DNA片段插入哺乳動物細胞的表現載體，以此製作CHO恆定表現株(產生cyno.sIL-6R的CHO細胞)。以HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)純化產生cyno.sIL-6R的CHO細胞之培養液後，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)濃縮，以Superdex200pg16/60膠濾過柱(GE Healthcare Bioscience)進一步純化，作成可溶型食蟹猴IL-6受體(以下簡稱cIL-6R)的最終純產物。

重組的食蟹猴IL-6(cIL-6)的製造

食蟹猴IL-6如以下製造。製作編碼登記為SWISSPROT Accession No.P79341的212個胺基酸之鹼基序列，選殖(cloning)哺乳動物細胞表現載體，導入CHO細胞，製作恆定表現細胞株(cyno.sIL-6R生產CHO細胞)。將cyno.sIL-6R生產CHO細胞的培養液以SP-Sepharose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)純化後，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮，再以Superdex75pg26/60膠濾過柱(GE Healthcare Bioscience)進一步純化，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮，作成食蟹猴IL-6(以下簡稱cIL-6)的最終純產物。

公知高親和性抗IL-6受體的抗體之製作

公知的高親和性抗IL-6受體的抗體，如US2007/0280945 A1記載之高親和性抗IL-6受體的抗體之VQ8F11-21hIgG1(US 2007/0280945 A1,H鏈胺基酸序列為序列識別號77，L鏈胺基酸序列為序列識別號78)，為使其表現，構築哺乳動物細胞表現用載體。關於抗體可變區，將合成的寡DNA經組合PCR法(聚合(assembly)PCR)製作，關於恆定區使用IgG1。經聚合PCR法使抗體的可變區與恆定區結合，插入哺乳動物細胞表現用載體，製作目標的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體之鹼基序列由該技術領域中公知方法決定。使用製作的表現載體，進行表現、純化。表現、純化以實施例1記載之方法進行，獲得高親和性抗IL-6受體抗體(以下記載為控制組)。

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的變異體之製作、表現、純化

第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的變異體使用快速改變位導向的突變套組(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene))根據其說明書記載之方法製作變異體，所得的質體(plasmid)片段插入哺乳動物細胞表現載體，製作目標的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體之鹼基序列以該技術領域中公知方法決定。抗體的表現使用以下方法進行。來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6x10⁵ 個/mL的細胞密度10mL接種於各連接細胞皿(dish)(直径10cm,CORNING)，在CO₂ 培養箱(37℃、5% CO₂ )中培養一夜後，吸除培養基，添加6.9mL的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)。調製的質體(plasmid)以脂染法(lipofection)導入細胞。回收所得的培養上清液後，離心(約2000g、5分間、室温)去除細胞，再通入0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)，滅菌，獲得培養上清液。由所得上清液使用rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)以該技術領域中公知方法純化抗體。純化的抗體濃度，以分光計測定在280nm的吸光度。從得到的數值以PACE法計算的吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995;4:2411-2423)。

人gp130表現的BaF3細胞株的建立

了獲得顯示IL-6依賴增殖性的細胞株，如以下所示，建立表現人gp130的BaF3細胞株。

全長的人gp130的cDNA(Hibi等、Cell 1990；63：1149-1157(GenBank # NM_002184))經PCR擴增，去除pCHOI(Hirata等、FEBS Letter 1994；356：244-248)的DHFR基因表現部位，選殖(cloning)插入Zeocin耐受性的基因表現部位之表現載體pCOS2Zeo，構築pCOS2Zeo/gp130。全長人IL-6R的cDNA經PCR擴增，選殖於pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，構築hIL-6R/pcDNA3.1(+)。

將10μg的pCOS2Zeo/gp130與懸浮於PBS的BaF3細胞(0.8x10⁷ 個細胞)混合，使用Gene Pulser(Bio-Rad)，以0.33kV，950μFD的容量加上脈衝。經過電穿孔(electroporation)處理，導入基因，將該導入基因的BaF3細胞培養於含有0.2ng/mL小鼠介白素-3(Peprotech、10%胎牛血清(以下稱為FBS，HyClone)的RPMI1640培養基(Invitrogen)過夜，加入含有100ng/mL的人介白素-6(R&D systems)、100ng/mL的人介白素-6可溶性受體(R&D systems)及含10% FBS的RPMI1640培養基、篩選，建立人gp130表現的BaF3細胞株(以下以BaF3/gp130表示)。該BaF3/gp130在人介白素-6(R&D systems)及可溶型人IL-6受體存在下增殖，因此，可用於抗IL-6受體的抗體的增殖抑制活性(即IL-6受體的中和活性)之評價。

人gp130表現的BaF3細胞(BaF/gp130)的生物活性評價

使用具有IL-6/IL-6受體依賴性增殖之BaF/gp130，評價IL-6受體的中和活性。以含有10%FBS的RPMI1640培養基清洗BaF/gp130三次後，以5x10⁴ 細胞/mL之600ng/mL至60ng/mL的人介白素-6(TORAY)(終濃度為300ng/mL至30ng/mL)懸浮於含有適當量可溶型人IL-6受體及10%FBS的RPMI1640培養基，在96孔盤(CORNING)的各孔中每孔分注50μL。在37℃、5%CO₂ 條件下培養3天，每孔加入以PBS稀釋2倍的WST-8試劑(Cell Counting Kit-8，株式會社同仁化學研究所)20μL，隨即以SUNRISE CLASSIC(TECAN)測定450nm的吸光度(參考波長620nm)。再培養2小時後，再次測定450nm的吸光度(參考波長620nm)，以兩小時的吸光度變化作為評價IL-6受體中和活性的指標。

以Biacore評價對可溶型人IL-6受體的結合

使用Biacore T100(GE Healthcare)進行抗原抗體反應的速度論分析。在感應晶片上以胺偶合法(amine coupling)將蛋白A或蛋白A/G或抗-IgG(γ-鏈特異)F(ab’)₂ 適量固定，再於pH7.4中與目的抗體結合，再於將於pH7.4中調配成各種濃度的可溶型IL-6受體作為分析物流動，測定抗體與可溶型人IL-6受體的相互作用。該測定全程於37℃實施。由測定所得的感應圖，計算結合速度係數Ka(1/Ms)及解離速度係數Kd(l/s)之動能參數(kinetics parameter)，由前述值算K_D (M)。各參數的計算由Biacore T100評估軟體(GE Healthcare)計算。

以Biacore評價對膜型人IL-6受體的pH依賴性解離

使用Biacore T100(GE Healthcare)，觀察檢測在pH5.8、pH7.4中對膜型IL-6受體的抗原抗體反應。以評價對固定在感應晶片上的可溶型人IL-6受體的結合，評價對膜型IL-6受體的結合。根據該技術人士公知之方法使SR344生物素(biotin)化，利用卵白素(Streptavidin)與生物素(biotin)的親和性，藉由卵白素(Streptavidin)使生物素化的可溶型人IL-6受體固定在感應晶片上。該測定全程於37℃實施，移動相的緩衝液為10mM MES pH5.8，150mM NaCl，0.05% Tween20，此時在pH7.4的條件下加入pH依賴結合的選殖株(clone)，與可溶型人IL-6受體結合之中(加入樣本的緩衝液為10mM MES pH7.4，150mM NaCl，0.05% Tween20)，觀察在移動相pH為5.8時各選殖株的pH依賴性解離。樣本濃度為0.25μg/mL，在10mM MES pH7.4、150mM NaCl、0.05% Tween20中結合，只有在10mM MES pH5.8、150mM NaCl、0.05% Tween20中解離時的在pH5.8中的解離相，使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)調整，計算pH5.8中的解離速度係數(Kd(l/s))。相同地，樣本濃度為0.5μg/mL，在10mM MES pH7.4、150mM NaCl、0.05% Tween20中結合，只有在10mM MES pH7.4、150mM NaCl、0.05% Tween20中解離時的在pH7.4中的解離相，使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)調整，計算pH7.4中的解離速度係數(K_d (l/s))。

對人FcRn結合的評價

FcRn為FcRn與β2-微球蛋白(microglobulin)的複合體。已公開的人FcRn基因序列(J. Exp. Med. 180(6),2377-2381(1994))製作寡DNA引子。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)為模板，使用製作的引子經PCR調整編碼全長基因的DNA片段。以所得的DNA片段為模板，經PCR擴增編碼含有訊息區域的細胞外區域(Met1-Leu290)之DNA片段，插入哺乳動物細胞表現載體(人FcRn胺基酸序列/序列識別號：79)。相同地，將已公開的人β2-微球蛋白(microglobulin)基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(26),16899-16903(2002))製作寡DNA引子。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)為模板，使用製作的引子經PCR調整編碼全長基因的DNA片段。以所得的DNA片段為模板，經PCR擴增編碼含有訊息區域的β2-微球蛋白(microglobulin)全長(Met1-Met119)之DNA片段，插入哺乳動物細胞表現載體(人β2-微球蛋白(microglobulin)胺基酸序列/序列識別號：80)。

可溶型人FcRn的表現如以下順序進行。將調製的人FcRn及人β2-微球蛋白(microglobulin)的質體，經10%胎牛血清(Invitrogen)之脂染法(lipofection)導入來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)的細胞。回收所得的培養上清液後，使用IgG Sepharose 6速流(Amersham Biosciences)，根據J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.方法純化。之後經HiTrap Q HP(GE Healthcare)純化。

小鼠中抗體血漿中濃度的測定

小鼠的血漿中抗體濃度的測定根據該技術領域中公知方法以ELISA法測定。

藉由猿PK/PD試驗測定抗體血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6受體

食蟹猴的血漿中濃度測定根據該技術領域中公知方法以ELISA法測定。

CRP濃度以SCIENCE R CRP(關東化學株式會社)使用自動分析装置(TBA-120FR、東芝MEDICAL SYSTEM株式會社)測定。

食蟹猴的血漿中非結合型的可溶型食蟹猴IL-6受體的濃度如以下所述測定。取30μL食蟹猴的血漿添加在0.22μm的過濾蓋(Millipore)中乾燥的適量rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)樹脂，使血漿中的全部IgG型抗體(食蟹猴IgG、抗人IL-6受體的抗體及抗人IL-6受體的抗體-可溶型食蟹猴IL-6受體複合體)吸附在蛋白A上。之後以高速離心機旋轉，回收通過的溶液。

由於該通過的溶液不含有與蛋白A結合的抗人IL-6受體抗體-可溶型食蟹猴IL-6受體複合體，因此藉由測定蛋白通過溶液中的可溶型食蟹猴IL-6受體濃度，可測得非結合型的可溶型1L-6受體濃度。可溶型食蟹猴IL-6受體濃度使用上述製作的可溶型食蟹猴IL-6受體(cIL-6R)為標準，以該技術領域中公知方法測定人IL-6受體濃度。非結合型的可溶型IL-6受體率如以下算式計算。

(投與抗體後的非結合型可溶性IL-6受體濃度÷投與抗體前的可溶性IL-6受體濃度)x100

第1圖列出提高第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)對IL-6受體的親和性之變異位置。HCDR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號81；HCDR2的變異後序列(上段)顯示為序列識別號82；HCDR2的變異後序列(下段)顯示為序列識別號83；HCDR3的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號84；HCDR3的變異後序列(上段)顯示為序列識別號85；HCDR3的變異後序列(下段)顯示為序列識別號86；LCDR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號87；LCDR1的變異後序列(上段)顯示為序列識別號88；LCDR1的變異後序列(下段)顯示為序列識別號89；LCDR3的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號90；LCDR3的變異後序列(上段)顯示為序列識別號91；LCDR3的變異後序列(下段)顯示為序列識別號92。

第2圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與RDC-23之BaF/gp130的中和活性。

第3圖列出對第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的IL-6受體之IL-6受體的結合不大幅降低、可變區的等電點降低的變異位置。圖中的星號標記為形成人序列但未影響等電點的變異位置。HFR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號93；HFR1的變異後序列顯示為序列識別號94；HCDR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號95；HCDR1的變異後序列顯示為序列識別號96；HFR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號97；HFR2的變異後序列顯示為序列識別號98；HCDR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號81；HCDR2的變異後序列顯示為序列識別號99；HFR4的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號100；HFR4的變異後序列顯示為序列識別號101；LFR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號102；LFR1的變異後序列顯示為序列識別號103；LCDR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號87；LCDR1的變異後序列顯示為序列識別號104；LFR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號105；LFR2的變異後序列顯示為序列識別號106；LCDR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號107；LCDR2的變異後序列顯示為序列識別號108、109；LFR3的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號110；LFR3的變異後序列顯示為序列識別號111；LFR4的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號112；LFR4的變異後序列顯示為序列識別號113。

第4圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H53/L28之BaF/gp130的中和活性。

第5圖顯示小鼠靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H53/L28後的血漿中濃度變化。

第6圖顯示小鼠皮下投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H53/L28後的血漿中濃度變化。

第7圖顯示IgG分子在內囊胞(endosome)內從膜型抗原解離再次與新的抗原結合的模式圖。

第8圖列出對第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)的IL-6受體結合可賦予pH依賴性(在pH7.4結合，pH5.8解離)之變異位置。HFR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號93；HFR1的變異後序列顯示為序列識別號114；HCDR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號95；HCDR1的變異後序列顯示為序列識別號115；LCDR1的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號87；LCDR1的變異後序列顯示為序列識別號116；LCDR2的第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)序列顯示為序列識別號107；LCDR2的變異後序列顯示為序列識別號117。

第9圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H3pI/L73之BaF/gp130的中和活性。

第10圖顯示食蟹猴靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H3pI/L73後的血漿中濃度變化。

第11圖顯示人IL-6受體基因轉殖鼠靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)與H3pI/L73後的血漿中濃度變化。

第12圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)Δ K、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)Δ GK，經陽離子交換層析法，進行來自C端的異質性(heterogeneity)評價之結果。

第13圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC，經陽離子交換層析法，進行來自雙硫鍵(disulfide)的異質性(heterogeneity)評價之結果。

第14圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG2、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-SKSC，經示差掃描熱量測定(DSC)之測定的變性曲線及各Fab區(domain)的Tm值。

第15圖顯示人FcRn基因轉殖鼠靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-IgG1、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M44、第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M58、及第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)-M73後的血漿中濃度變化。

第16圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、及Fv5-M83之BaF/gp130的中和活性。

第17圖顯示第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、Fv3-M73、及Fv4-M73之BaF/gp130的中和活性。

第18圖顯示食蟹猴靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83後的血漿中濃度變化。

第19圖顯示食蟹猴靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83後的CRP濃度變化。

第20圖顯示食蟹猴靜脈內投與第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)、控制組、Fv3-M73、Fv4-M73、及Fv5-M83後的非結合型可溶型IL-6受體率的變化。

第21圖顯示來自人RA患者的滑膜細胞因第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及Fv4-M73之抑制MCP-1產生的作用。

第22圖顯示來自人RA患者的滑膜細胞因第六介白質受體拮抗劑(TOCILIZUMAB)及Fv4-M73之抑制VEGF產生的作用。

Claims

一種抗體，為以下(a)~(c)任一項記載之抗體；(a)包括具有序列識別號20(VH3-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號23(VL3可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(b)包括具有序列識別號19(VH4-M73可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號22(VL1可變區)序列之輕鏈可變區的抗體；(c)包括具有序列識別號21(VH5-M83可變區)序列之重鏈可變區及具有序列識別號24(VL5可變區)序列之輕鏈可變區的抗體。
一種抗體，為以下(a)~(c)任一項記載之抗體；(a)包括具有序列識別號26(VH3-M73)序列之重鏈及具有序列識別號29(VL3)序列之輕鏈的抗體；(b)包括具有序列識別號25(VH4-M73)序列之重鏈及具有序列識別號28(VL1)序列之輕鏈的抗體；(c)包括具有序列識別號27(VH5-M83)序列之重鏈及具有序列識別號30(VL5)序列之輕鏈。
一種基因，編碼如申請專利範圍第1或2項所述之抗體。
一種載體，包含如申請專利範圍第3項所述之基因。
一種宿主細胞，保持如申請專利範圍第4項所述之載體。
一種製造如申請專利範圍第1或2項所述之抗體之方法，藉由培養如申請專利範圍第5項所述之宿主細胞。
一種醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1或2項所述之抗體或如申請專利範圍第6項所述之方法所製造之抗體。