JP2002531466A - γ−インターフェロンに対するヒト化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、γ−インターフェロンと結合し、そしてγ−インターフェロンを中和するヒト化免疫グロブリンを提供する。これらの抗体は、免疫系の疾患の処置のために有用であり、特に自己免疫疾患の処置のために有用である。特定の実施形態では、本発明のヒト化免疫グロブリンを含む組成物は、例えばラジオイノムアッセイまたはＥＬＩＳＡにより、γ−インターフェロンを検出するために使用され得る。また、本発明のヒト化免疫グロブリンは、有意な濃度のγ−インターフェロンを含む解剖学的部位を同定するために標識され得、そして使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規の生物製剤を開発するための組換えＤＮＡ技術およびモノクロ
ーナル抗体技術の組合せ、より詳細には、例えば、γ−インターフェロン（γ−
ＩＦＮ）に特異的な（ヒトにおける）非免疫原性の免疫グロブリンの産生ならび
にそれらのインビトロおよびインビボでの使用に、一般的に関係する。本発明は
また、より詳細には、γ−ＩＦＮに対するヒト化モノクローナル抗体、これらの
抗体をコードするポリヌクレオチド配列、これらの交代を作製するための方法、
活性成分としてこれらの抗体を含む薬学的組成物、および活性成分としての抗体
を含む、所望されない免疫応答を抑制するための治療剤に関係する。

【０００２】 （背景） 哺乳動物免疫応答は、外因性の物質（すなわち、抗原）と特異的に相互作用す
るいくつかの型の細胞によって媒介される。これらの細胞型の１つであるＢ細胞
は、抗体の産生にの原因である。別の細胞型であるＴ細胞は、ウイルスに感染さ
れた細胞を破壊する、またはＢ細胞および他の造血細胞（Ｔ細胞を含む）の両方
のインビボの機能を制御する広範な種々の細胞集団を含む。第三の細胞型である
マクロファージは、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質と共にＴ細胞
に対する抗原をプロセスしかつ提示する。これらの細胞型の間の情報伝達は、リ
ンホカイン（例えば、インターロイキン１〜６およびγ−ＩＦＮ（本明細書中の
関連部分で参考として援用される、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ
ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９９３）を一般的に参照のこと））による複合様式で媒介される。

【０００３】 １つの重要なリンホカインはγ−ＩＦＮであり、これはいくつかのＴ細胞によ
って分泌される。この抗ウイルス活性に加えて、γ−ＩＦＮは、ナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞およびＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞を刺激し、マクロファージを
活性化し、そして細胞の表面上のＭＨＣ分子の発現を刺激する（Ｐａｕｌ（前掲
）、７６４−７６６頁）。それ故、γ−ＩＦＮは一般に免疫機能の多くの局面を
増強するように働き、そしてこのような増強が所望される場合（例えば、癌を処
置する際）の治療薬物のための論理的な候補である。逆に、免疫系が過敏性（例
えば、自己免疫疾患および器官移植拒否）である疾患の状態において、γ−ＩＦ
Ｎのアンタゴニストは、γ−ＩＦＮの刺激効果を中和することにより疾患を処置
するために有用であり得る。

【０００４】 γ−ＩＦＮと結合し、そしてγ−ＩＦＮを中和するマウスモノクローナル抗体
は、報告されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｉｄｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ、６７、１０５９（１９８６）を参照のこと）。このような抗γ−ＩＦ
Ｎ抗体は、移植のインビトロおよびインビボのマウスモデルでの拒絶を遅延また
は予防することが報告されており（Ｌａｎｄｏｌｆｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９、１７６（１９８５）およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４４４６４８（１９９０）、これらの両方は、本明細書中に参考として援用され
る）。全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）様の症候群を発症する傾向にあるマウス
のγ−ＩＦＮに対するモノクローナル抗体を用いる処置は、この疾患の発症遅ら
せることが報告されている（Ｊａｃｏｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６、７９
８（１９８７））。抗γ−ＩＦＮ抗体はまた、ラットにおけるアジュバント関節
炎（Ｊａｃｏｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２、１５００（１９８９））およ
びマウスにおける結腸炎（Ｐｏｗｒｉｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １、５５３−５
６２（１９９４））を緩和することが報告されている。Ｑｕｅｅｎら、ＷＯ９２
／１１０１８はγ−ＩＦＮに対するマウスＡＦ２抗体、特定のヒト化免疫グロブ
リン、および炎症疾患を処置するための同一の使用を議論する。

【０００５】 ＡＦ２のような非ヒト化モノクローナル抗体の使用は、ヒトの処置において（
特に、以下に説明するような反復治療養生法において）特定の欠点を有する。マ
ウスモノクローナル抗体は、例えば、ヒトにおいて相対的に短く循環する半減期
を有し、そしてヒトにおいて用いる場合、他の重要な免疫グロブリン機能的特性
を欠く。

【０００６】 おそらくより重要には、マウスモノクローナル抗体は、ヒト患者に注射する場
合に免疫原となる実質的なアミノ酸配列を含む。外因性の抗体の注射の後、注射
された抗体に対して患者によって誘発される免疫応答は、非常に強力であり得、
最初の処置の後の抗体の治療的有用性を本質的に誘導し得るという、多くの研究
が示される。さらに、マウスまたは他の（ヒトに対して）抗原性のモノクローナ
ル抗体が種々のヒト疾患を処置するために使用される場合、無関係のマウス抗体
での引き続く処置は、交差反応性のために、単独では非効果的であり得るかまた
は危険でさえあり得る。

【０００７】 したがって、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療的な処方お
よび他の用途に適切な様式で、容易にかつ安価に生産される、γ−ＩＦＮ抗原に
特異的なヒト化免疫グロブリンの改善された形態の必要性がある。本発明は、こ
れらの必要性および他の必要性を満たす。

【０００８】 （本発明の目的および要旨） γ−ＩＦＮに対するヒト化モノクローナル抗体；これらの抗体をコードするポ
リヌクレオチド配列；これらの抗体を作製するための方法；活性成分としてこれ
らの抗体を含む薬学的組成物；疾患（特に自己免疫疾患）を処置するため、およ
び活性成分としてこれらの抗体を含む免疫系抑制のための治療剤；ならびにこの
ような疾患を処置するための方法の提供することが、本発明の目的である。

【０００９】 本発明は、マウスＡＦ２免疫グロブリンのヒト化バージョンであるヒト化免疫
グロブリンを提供する。マウスＡＦ２免疫グロブリンは、配列番号２に示される
軽鎖可変領域、および配列番号４に示される重鎖可変領域によって特徴付けられ
る。本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒ
ト化重鎖可変領域のフレームワークの部位１１は、マウスＡＦ２重鎖可変領域の
フレームワークの等価部位に存在するアミノ酸によって占められる。本発明の好
ましいヒト化免疫グロブリンは、配列番号６に示されるヒト化軽鎖可変領域、お
よび配列番号８に示されるヒト化重鎖可変領域を含む。

【００１０】 ヒト化免疫グロブリンは、γ−ＩＦＮ抗原と特異的に結合し、そしてγ−ＩＦ
Ｎを中和する。ヒト化免疫グロブリンはまた、γ−ＩＦＮに対するＣＤＲに寄与
するマウスモノクローナル抗体の結合をブロックし得る。好ましいヒト化免疫グ
ロブリンは、２対の軽鎖／重鎖の複合体を有し、少なくとも一方の鎖は、ヒトフ
レームワーク領域セグメントに連結する１つ以上のマウス相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）を含む。例えば、さらなる天然に関与するマウスアミノ酸残基を有するかま
たは有さないマウスＣＤＲは、ヒトフレームワーク領域に導入され、約１０⁷Ｍ^{- 1} より強い親和性レベルで抗原と結合し得るヒト化免疫グロブリンを産生し得る
。

【００１１】 結合フラグメントおよびそのフラグメントの他の誘導体を含む本発明の免疫グ
ロブリンは、種々の組換えＤＮＡ技術によって、形質転換細胞、好ましくは、ミ
エローマ細胞またはハイブリドーマ細胞のような不死化真核生物細胞における最
高の発現を伴って容易に産生され得る。ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領
域をコードする第一の配列ポリヌクレオチドおよび所望の免疫グロブリンＣＤＲ
をコードする第二の配列は、合成的にかまたは適切なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮ
Ａセグメントを結合することによって、作製され得る。

【００１２】 ヒト化免疫グロブリンは、実質的に純粋な型で利用され得、そして薬学的に受
容される剤形で調製され得る、これらは、投与の形態に依存して変動する。

【００１３】 （定義） 句「実質的に同一である」とは、２つの核酸または２つのポリペプチド（例え
ば、ヒト化免疫グロブリンをコードするＤＮＡまたはヒト化免疫グロブリンのア
ミノ酸配列）の文脈においては、以下の配列比較方法を用いて測定して、および
／または目視検査により、最大一致について比較および整列した場合、少なくと
も約８０％、最も好ましくは９０〜９５％以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残
基の同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列をいう。このような「実質的
に同一である」配列は、代表的には、相同であるとみなされる。好ましくは、「
実質的な同一性」は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたって、よ
り好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そして最も好ま
しくは、この配列は少なくとも約１５０残基にわたって、または比較されるべき
２つの配列の全長にわたって、実質的に同一である。下記のように、任意の２つ
の抗体配列は、Ｋａｂａｔの番号付けスキームを用いて、１方向にのみ整列され
得る。従って、抗体に関しては、同一性パーセントは、特有でかつ十分規定され
た意味を有する。

【００１４】 免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、それぞれ
ＨｘおよびＬｘと名付けられる。ここで、ｘは、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒ
ｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７および１９９１）のスキームに従ってアミノ酸の
位置を示す数である。Ｋａｂａｔは、各サブグループに対する抗体について多く
のアミノ酸配列を列挙しており、そしてコンセンサス配列を生成するためサブグ
ループにおいて、各残基位置について最も通常に存在するアミノ酸を列挙してい
る。Ｋａｂａｔは、列挙した配列中の各アミノ酸に対して残基数を割当てる方法
を用いており、そして残基数を割当てるこの方法は、この分野で標準となってい
る。Ｋａｂａｔのスキームは、保存されたアミノ酸に対する参照によりＫａｂａ
ｔにおけるコンセンサス配列の１つと問い合わせられた抗体とを整列することに
より、彼の概要に含まれない他の抗体に対して延長可能である。Ｋａｂａｔの番
号付けシステムの使用は、異なる抗体における等価部位のアミノ酸を容易に同定
する。例えば、ヒト抗体のＬ５０位置のアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸位置
Ｌ５０と等価部位を占める。

【００１５】 基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、２つ
の同一のポリペプチド鎖の対からなる。ここで、各対は１つの「軽」鎖（約２５
ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ
末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を
含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規
定する。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、イ
ンタクトな抗体は、２つの結合部位を有する。

【００１６】 軽鎖は、κ鎖またはλ鎖のいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、
またはεに分類され、そして抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖の中で、可変領域およ
び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域に連結されるが、これは約１
０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む重鎖を有する。（一般的には、Ｆｕｎｄ
ａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ、Ｗ編、第３版、Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９３、ＳＨ．９（全ての目的のためにその全体が参考
として援用されている）を参照のこと）。

【００１７】 Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、変化する
フレームワークおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：ＦＲ，ＣＤＲ．ＦＲ，
ＣＤＲ．ＦＲ，ＣＤＲおよびＦＲ。各領域に対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂ
ａｔ（１９８７）および（１９９１）、前出、および／またはＣｈｏｔｈｉａ＆
Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃｈ
ｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３（１９８９）の定義に従
う。

【００１８】 好ましくは、代表的なヒト化免疫グロブリンのアナログは、保存的アミノ酸置
換による代表的免疫グロブリンとは異なる。保存的または非保存的アミノ酸置換
を同定するために、アミノ酸は、以下のようにグループ化され得る：Ｉ群（疎水
性側鎖）；ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；ＩＩ群（中性親水性側鎖
）；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；ＩＩＩ群（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；ＩＶ群
（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｖ群（鎖方向の影
響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；ならびにＶＩ群（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙ
ｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内のアミノ酸間の置換を含む。非保存的
置換は、別のメンバーに対してこれらの１つのクラスのメンバーを置換すること
からなる。

【００１９】 用語エピトープは、免疫グロブリンに特異的に結合し得る任意のタンパク質決
定基を含む。エピトープ性決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面分類（例
えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、そして一般に、特異的な３次元構造特
性、ならびに特異的荷電特性を有する。

【００２０】 本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリン」は、４量体抗体および
種々の形態のさらなる抗体をいう；これには、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（
ａｂ’）２ならびに二機能性のハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃ
ｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７、１０５（１９８７））、および
単鎖（例えば、本明細書において参考として援用される、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５、５８７９〜５８８３（
１９８８）およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３〜４２６（１９
８８））を含む。（一般には、本明細書において参考として援用される、Ｈｏｏ
ｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、ＮＹ、第２版（１９８４）、
ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８８）ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３２３、１５〜１６（１９８６）を参照のこと）。

【００２１】 本明細書において用いる場合、用語「フレームワーク領域」は、Ｋａｂａｔら
、（前掲）に規定されているように、単一種における異なる免疫グロブリンのな
かで比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域（すなわち
、ＣＤＲ以外）のその位置をいう。本明細書において用いる場合、「ヒトフレー
ムワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域に実質的に（
約８５％以上）同一であるフレームワーク領域である。

【００２２】 本明細書において用いる場合、用語「ヒト化免疫グロブリン」とは、ヒトフレ
ームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、および存在する任意の
定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一な（すなわち、少なくと
も約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一な）領域を含む免疫グロブ
リンをいう。従って、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分（できればＣＤＲを除
く）は、１つ以上のネイティブなヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質
的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、キメラマウス可変領域／ヒ
ト定常領域抗体を含まない。

【００２３】 用語「患者」は、ヒトおよび獣医学の被験体を含む。

【００２４】 用語「実質的に純粋」または「単離された（単離した）」は、目的の種が優先
的に存在する（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも
豊富である）ことを意味し、そして好ましくは実質的に精製された画分は、目的
の種が全ての存在する高分子種の少なくとも約５０パーセント（モルベースで）
を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全
ての高分子種の約８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％より
多くを含む。最も好ましくは、この目的の種は、本質的な均質性（混入種が、従
来の検出方法により組成物中で検出され得ない）まで精製され、ここでこの組成
物は、本質的に単一の高分子種からなる。

【００２５】 （詳細な説明） 本発明は、γーＩＦＮに特異的に結合するヒト化免疫グロブリン、および所望
されない免疫応答を抑制するためのこれらの使用方法を提供する。

【００２６】 （Ｉ．γ−ＩＦＮのためのヒト化抗体種） 本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グ
ロブリンと名付けられる）に実質的に由来する可変フレームワーク領域、好まし
くは、ヒトアクセプター抗体ＥＵ、およびＡＦ２と名付けられるマウス免疫グロ
ブリン（ドナー免疫グロブリンと言われる）に実質的に由来するＣＤＲを有する
。定常領域はまた、もし存在するならば、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来す
る。ヒト化抗体は、少なくとも１０⁷、１０⁸、１０⁹、または１０¹⁰Ｍ^-1のγ−
ＩＦＮに対する特異的結合親和性を示す。通常、ヒトγ−ＩＦＮに対するヒト化
抗体の結合親和性の上限は、ＡＦ２の結合親和性の３、４、５または１０という
因数内である。しばしば、結合親和性の下限はまた、ＡＦ２の結合親和性の３、
４、５または１０という因数内である。好ましいヒト化免疫グロブリンは、γ−
ＩＦＮへの結合についてＡＦ２と競合し、そしてγ−ＩＦＮレセプターへのγ−
ＩＦＮの結合を妨げ、それによりγ−ＩＦＮレセプターを通じる応答を変換する
。ヒト化抗体は、好ましくは、１、２、５、１０、２０、５０または１００倍モ
ル過剰で、γ−インターフェロン活性の８０、９０、９５、または９９％を中和
する。

【００２７】 マウスＡＦ２抗体は、Ｑｕｅｅｎら、ＷＯ９２／１１０１８により記載されて
おり、そして配列番号２および配列番号４に示される重鎖および軽鎖の可変領域
を有する。このマウス抗体は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプおよびκ軽鎖を有する。
好ましいヒトアクセプター抗体ＥＵの重鎖および軽鎖の可変領域、および他の可
能なヒトアクセプター抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌ
ｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７および１９９１）により記載されてい
る。このヒトアクセプター抗体は、その可変領域がマウスＡＦ２抗体の可変領域
と高い程度の配列同一性を示すように選択される。重鎖および軽鎖の可変フレー
ムワーク領域は、同じかまたは異なるヒト抗体配列から誘導され得る。ヒト抗体
配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、またはいくつかのヒト
抗体のコンセンサス配列であってもよい。

【００２８】 ヒト化免疫グロブリンの設計は以下のとおり実行され得る。アミノ酸が以下の
カテゴリー内におさまる場合、用いられるべきヒト免疫グロブリン（アクセプタ
ー免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸は、ＣＤＲ−提供非ヒト免疫グロ
ブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸により置き換え
られる： （ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸は
、その位置でヒト免疫グロブリンには珍しいが、ドナー免疫グロブリン中の対応
するアミノ酸は、その位置でのヒト免疫グロブリンに代表的である； （ｂ）このアミノ酸の位置は、ＣＤＲの１つにすぐ隣接している；または （ｃ）このアミノ酸はＣＤＲと相互作用し得る（両方ともそれぞれ参考として
本明細書において援用される、Ｑｕｅｅｎら（前掲）およびＣｏら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、２８６９（１９９１）を参照のこ
と）。ヒト化免疫グロブリンの産生の詳細な説明については、Ｑｕｅｅｎら、（
前掲）およびＣｏら（前掲）を参照のこと。

【００２９】 Ｑｕｅｅｎら、ＷＯ９２／１１０１８は、ＡＦ２の特定のヒト化形態を報告す
る。これには、ＡＦ２由来のＣＤＲ領域、およびＥＵ由来の可変領域フレームワ
ーク（ここで特定の位置が置換されている）を含む。本発明のヒト化免疫グロブ
リンは、好ましくは、Ｑｕｅｅｎら、（前出）に記載されたものと同じ置換物を
含む。しかし、さらなる置換がまた存在する。詳細には、Ｈ１１部位は、マウス
ＡＦ２重鎖の等価部位を占めるアミノ酸で置換される。

【００３０】 部位Ｈ１１は、上記の置換に関する基準を満たさないが、やはりこの置換を組
み込むヒト化免疫グロブリンにおける中和活性に対する有意な寄与を作製する。
この位置での置換の所望性は、ヒトＥＵ抗体における等価部位由来のアミノ酸を
有するキメラＡＦ２抗体（すなわち、マウス可変ドメインおよびヒト定常領域を
有する）における種々の位置の置換により決定された。Ｈ１１部位の置換は、γ
−ＩＦＮに対するキメラ抗体の中和活性において有意な低下を生じた。

【００３１】 通常、ヒト化抗体におけるＣＤＲ領域は、実質的に同一であり、そしてより通
常には、それらの領域が由来する、マウス抗体における対応するＣＤＲ領域に同
一である。通常は所望されないが、得られたヒト化免疫グロブリンの結合親和性
に対して認められるほどは影響することなく、ＣＤＲ残基の１つ以上の保存的ア
ミノ酸置換を作製することが時に可能である。たまには、ＣＤＲ領域の置換は、
結合親和性を増強し得る。

【００３２】 上記の特異的アミノ酸置換について以外、ヒト化免疫グロブリンのフレームワ
ーク領域は、通常、実質的に同一であり、そしてより通常には、その領域が由来
するヒト抗体のフレームワーク領域に同一である。当然ながら、フレームワーク
領域におけるアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和性にほとんど、または
全く貢献しない。従って、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、得
られたヒト化免疫グロブリンの特異性または親和性の認識されるほどの変化なし
に、耐溶性であり得る。

【００３３】 ＨｕＺＡＦのアナログは、ＨｕＺＡＦと実質的なアミノ酸配列同一性を示す。
アナログの重鎖および軽鎖の可変領域は、ＨｕＺＡＦの重鎖または軽鎖可変領域
をコードする核酸またはそれらの縮重形態と、ストリンジェントな条件下で、ハ
イブリダイズする核酸配列によりコードされる。ファージ表示技術は、保持して
いる結合親和性および特異性により、ＨｕＺＡＦのこのようなアナログを選択す
るために強力な技術を提供する（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１
；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７；およびＨｕｓｅ、ＷＯ９２
／０６２０４（それぞれは、全ての目的のためにその全体が参考として援用され
る）を参照のこと）。

【００３４】 前記のように生成されるヒト化抗体の可変セグメントは、代表的に、免疫グロ
ブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なく
とも一部に連結する。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の手順に従って、種々の
ヒト細胞（ただし、好ましくは、固定されたＢ細胞）から単離され得る（Ｋａｂ
ａｔら、前出、およびＷＯ８７／０２６７１）。通常、この抗体は、軽鎖および
重鎖の定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１領域、ヒンジ領域
、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびときにＣＨ４領域を含む。

【００３５】 ヒト化抗体は、全ての型の定常領域を有する抗体を含む。これらの抗体は、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ、ならびに任意のアイソタイプ（Ｉ
ｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）を含む。ヒト化抗体が細胞
傷害性活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは、通常、補体結合定常
ドメインであり、そしてこのクラスは代表的にＩｇＧ₁である。このような細胞
傷害性活性が所望されない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ₂クラスであり得る。
ヒト化抗体は、１つより多いクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。

【００３６】 ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲおよびフレームワーク成分を概念的に選択すれ
ば、種々の方法がこのような免疫グロブリンを生成するために利用可能である。
遺伝子コードの縮重によって、種々の核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配
列をコードする。所望の核酸配列が、新規の固相ＤＮＡ合成により、または所望
のポリヌクレオチドの早期に調整された改変体のＰＣＲ変異誘発により生成され
得る。本願に記載された抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれ
る。

【００３７】 一旦発現されれば、本発明の抗体全体、それらのダイマー、個々の軽鎖および
重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、当該分野の標準的手順により精製され
得る。この手順としては、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラ
ムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的には、参考とし
て、本明細書において援用される、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２
）を参照のこと）。薬学的使用のためには、少なくとも約９０％〜９５％均質性
の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、そして９８〜９９％以上の均質性
が最も好ましい。一旦精製されれば（所望の場合、部分的にまたは均質性に）、
次いでこのポリペプチドは、治療的に（体外的を含む）、またはアッセイ手順、
免疫蛍光染色などを発展させるためそして実行するために用いられ得る。（一般
には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第ＩおよびＩＩ巻、Ｌｅ
ｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９７９および１９８１）を参照のこと）。

【００３８】 （ＩＩ．治療方法） 本発明の免疫グロブリンを含む薬学的組成物は、非経口投与（すなわち、皮下
的に、筋肉内におよび特に静脈内に）のために有用である。この非経口投与のた
めの組成物は、通常受容可能なキャリア（好ましくは水溶性のキャリア）に溶解
した、抗体またはそのカクテルの溶液を含む。多様な水溶性キャリアが使用され
得る（例えば、水、緩衝水溶液、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）
。これらの溶液は、滅菌性であり、そして一般的に粒状物質を含まない。この組
成物は、ほぼ生理学的条件に必要とされるように、薬学的に受容可能な補助物質
（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば酢酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、ヒスチジン
およびアルギニン））を含み得る。これらの処方物における免疫グロブリンの濃
度は、広く変化し得（すなわち重量で、約０．０１％未満、通常少なくとも約０
．１％から、５％ほどまで）、そして選択された投与の特定の様式に従って、主
に流体体積、および溶解度に基づいて選択される。

【００３９】 従って、注射のための代表的な薬学的組成物は、１ｍｌの滅菌性緩衝水溶液、
および１〜１００ｍｇの免疫グロブリンを含むように調合され得る。静脈内導入
のための代表的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌性リンガー液、および１０ｍｇの
免疫グロブリンを含むように調合され得る。非経口投与可能な組成物を調製する
実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであり、そして例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１
５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ Ｐｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）により詳細に記載され、これは本明細書中に
参考として援用される。

【００４０】 本発明の免疫グロブリンは、貯蔵のために凍結または凍結乾燥され得、そして
使用の前に適切なキャリア中で再構成され得る。この技術は、従来の免疫グロブ
リンでは有効であることが示されており、当該分野で公知の凍結乾燥技術および
再構成技術が、使用され得る。凍結乾燥および再構成は、種々の程度の免疫グロ
ブリン活性損失をもたらし得（例えば、従来の免疫グロブリンに対して、ＩｇＭ
抗体は、ＩｇＧ抗体よりも大きな活性損失を有する傾向がある）、そしてその使
用レベルは、補正するために調整されるべきであり得る。

【００４１】 この組成物は、予防処置、および／または治療処置のために投与され得る。治
療的適用において、組成物は、望ましくない免疫応答で既に罹患している患者に
、状態およびその合併症を、治療または少なくとも部分的に抑制するために十分
な量で、投与される。このことを達成するために適切な量は、「治療的に有効な
用量」として規定される。この使用のために有効な量は、状況の厳しさおよび患
者個人の免疫系の全身状態に依存するが、一般的には１用量当たり約０．０１ｍ
ｇから約１００ｍｇの抗体にわたり、患者当たり０．１ｍｇから５０ｍｇの投薬
および患者当たり１ｍｇから１０ｍｇの投薬がより一般的に使用されている。日
単位、週単位または月単位のスケジュールでの、単一投与または多回投与は、処
置する医師により選択される用量レベルおよび用量パターンで実行され得る。本
発明の物質は、一般に、深刻な疾患状態（生命が脅かされている状態または潜在
的に生命が脅かされている状態）において使用され得る、ということを念頭に置
かなければならない。このような場合において、外来物質の最少限化および「異
種物質」の拒絶のより低い確率（これらは本発明のヒト化免疫グロブリンにより
達成される）を考慮して、処置する医師により、これらの免疫グロブリンの実質
的に過剰量を投与することは、可能であり、そして望ましいと思われ得る。

【００４２】 予防適用においては、組成物は、不適当な免疫応答を生じる危険のある患者に
、その応答を抑圧するために十分な量で投与される。このような量は、「予防に
有効な用量」であると規定される。この使用において、正確な量はまた、患者の
健康状態および患者の免疫の通常のレベルに依存するが、一般的に１用量あたり
０．１ｍｇから１００ｍｇの範囲であり、特に患者当たりでは１ｍｇから１０ｍ
ｇの範囲である。

【００４３】 この方法は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原および／またはＴｈ１細胞により媒介され
る、望ましくない免疫応答に関連する種々の疾患状態に有効である。このような
疾患状態は、移植片対宿主疾患および臓器移植（例えば、心臓、肺、腎臓、およ
び肝臓）を受けた患者における移植拒絶、ならびに自己免疫疾患（例えば、タイ
プＩ糖尿病、多重硬化症、慢性間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本甲
状腺腫、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、および炎症性腸疾患（例えば、クローン病
））を含む。

【００４４】 ヒト化免疫グロブリンは、実質的に純粋な形態で単独で使用され得、または化
学療法薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、または免疫
抑制薬）とともに使用され得る。これらの薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬（例
えばアスピリン、イブプロフェン）、ステロイド（例えばプレドニゾン）および
免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、メトトレキセートサイトキサン）を含
み得る。

【００４５】 本発明のヒト化免疫グロブリンはまた、他の抗体、特に他のリンフォカインま
たはリンフォカインレセプターと反応性のヒト化抗体と組合せて使用され得る。
例えば、ヒト化免疫グロブリンのカクテルが反応し得る、適切な抗原は、インタ
ーロイキン１〜１８ならびにＩＬ−２レセプターのｐ５５鎖およびｐ７５鎖を含
む（Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，８７５（１
９８９）、およびＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６，１００２９（１９８９）を参照のこと、これらの両方が、本明細書中
で参考として援用される）。他の抗原は、疾患の原因である細胞上の抗原を含む
（例えば、いわゆる「分化のクラスター（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ Ａ．
Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ
１９８７）、これは、本明細書中に参考として援用される）。 （診断方法） ヒト化抗γ−ＩＦＮ抗体はまた、診断方法において有用である。ヒト化抗γ−
ＩＦＮ抗体は、γ−ＩＦＮの発現、および必然的な免疫応答の発生を測定するた
めに有用である。診断の方法は、患者由来の細胞サンプル（例えば、血液サンプ
ル、リンパ節生検または組織）を使用してインビトロで行われ得るか、またはイ
ンビボ画像化により行なわれ得る。ヒト化抗γ−ＩＦＮ抗体はまた、ヒトγ−Ｉ
ＦＮを精製するために有用である。

【００４６】 特定の実施形態では、本発明のヒト化免疫グロブリンを含む組成物は、例えば
ラジオイノムアッセイまたはＥＬＩＳＡにより、γ−ＩＦＮを検出するために使
用され得る。従って、ＡＦ２抗体により同定される抗原決定基に結合するヒト化
免疫グロブリンのような、本発明のヒト化免疫グロブリンは、有意な濃度のγ−
ＩＦＮを含む解剖学的部位を同定するために標識され得、そして使用され得る。
例えば（限定のためではないが）、１つ以上の標識化部分は、ヒト化免疫グロブ
リンに付加され得る。例示的な標識化部分としては、放射線不透過性の色素、放
射性造影剤、蛍光性分子、スピン標識分子、酵素、または特に放射線学的画像化
技術もしくは磁気共鳴画像化技術において、診断的価値のある他の標識化部分が
挙げられるが、これらに限定されない。

【００４７】 以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。これらの実施
例は、γ−ＩＦＮ抗原に高い結合親和性を有するヒト化抗体を産生する、ヒト化
ＡＦ２抗体に関するが、γ−ＩＦＮのエピトープに結合する他のモノクローナル
抗体由来のＣＤＲを使用することも考慮されることが理解される。

【００４８】 本明細書中に言及される全ての刊行物（例えば、本発明に関連して使用され得
る刊行物に記載される構成、および方法論）は、説明および開示の目的のために
本明細書中に参考として援用される。上記および文章全体で考察された刊行物は
、本出願の出願日の前に、単にそれらの開示のために提供される。本明細書中に
おいて、本発明者らが先行発明の効力によるこのような開示に先んじる権利がな
い、という容認として解釈されるべきものはなにもない。

【００４９】 （実施例） （１．ヒト化免疫グロブリンの産生、マウスＡＦ２可変領域ｃＤＮＡのクロー
ニングおよび配列決定） マウスＡＦ２抗体の軽鎖および重鎖の可変部をコードするｃＤＮＡ配列のクロ
ーニングが、Ｑｕｅｅｎら，ＷＯ９２／１１０１８により記載される。これらの
ｃＤＮＡの配列は、図１に示される。

【００５０】 ２つのプラスミドベクターを、キメラ抗体（ヒト定常領域に連結されたマウス
ＡＦ２抗体の可変ドメインを含む）の構築および発現のために調製した。プラス
ミドｐＶｇ１−ｄｈｆｒ（Ｑｕｅｅｎら，前出）は、ヒトサイトメガウイルスＩ
Ｅ１プロモーターおよびエンハンサー（Ｍ．Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ ４１
，５２１（１９８５））、そのすぐ前のイントロンの一部を含むヒトゲノムのＣ
ｇ１セグメント、ならびにジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（本明細書
中で参考として援用されるＳｉｍｏｎｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２４９５（１９８４））を選択のために含む。プラス
ミドｐＶｋ（Ｑｕｅｅｎら，前出）は、ｐＶｇ１−ｄｈｆｒと類似しているが、
ヒトゲノムＣｋセグメントおよびｇｐｔ遺伝子を含む。ＡＦ２重鎖およびＡＦ２
軽鎖の可変領域の誘導体を、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡから調製した
。５’プライマーは、ＡＴＧコドンで始まるＶ領域にハイブリダイズし、そして
ＸｂａＩ部位を含み；３’プライマーは、Ｊ領域の最後の１５ヌクレオチドにハ
イブリダイズし、そしてスプライス（ｓｐｌｉｃｅ）ドナーシグナルおよびＸｂ
ａＩ部位を含んだ（本明細書中で参考として援用されるＱｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９（１９８９）を参照
のこと）。改変されたＶ領域を、定常領域のＣＭＶプロモーターと部分的イント
ロンとの間にあるそれぞれのプラスミドベクターのＸｂａＩ部位にクローン化し
た。 キメラ抗体の発現のために、重鎖プラスミドおよびκ鎖プラスミドを、エ
レクトロポレーションによりｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトし
、そしてｇｐｔ発現について細胞を選択した。最大量の完全な抗体を分泌するク
ローンを、ＥＬＩＳＡにより検出した。ＥＬＩＳＡにより、キメラＡＦ２抗体が
、ヒトγ−ＩＦＮに結合することが示された。

【００５１】 （ヒト化ＡＦ２可変領域の設計） ヒト化抗体におけるマウス抗体の結合親和力を保持するために、Ｑｕｅｅｎら
の一般的な手順に従った（Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９（１９８９）ならびに米国特許第５，５８５，０
８９号および同第５，６９３，７６２号）。骨格残基の選択は、高い結合親和力
を保持において重要であり得る。原則として、任意のヒト抗体由来の骨格配列は
、ＣＤＲ移植のためのテンプレートとして役立ち得る；しかしながら、このよう
な骨格への直接的なＣＤＲ置換は、抗原に対する結合親和力の有意な損失を生じ
得ることが実証されてきた（Ｔｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９：２６６（１９９２）；Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７：２１
７（１９９２））。ヒト抗体が最初のネズミ抗体とより相同性である程、ヒト骨
格は、親和性を減少させ得るマウスＣＤＲに変形を与えないようである。抗体配
列データベースに対する配列相同性検索に基づいて、マウスＡＦ２抗体に対して
良い骨格相同性を提供するヒト抗体Ｅｕを選択した。他の高度に相同的なヒト抗
体鎖はまた、ヒト化抗体骨格（特に、ヒト下位群Ｉからのκ軽鎖およびヒト下位
群ＩＩからのカッパ重鎖）を提供するために適切である（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉ
ｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１によりで定義されるように
）。

【００５２】 コンピュータープログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔら，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５（１９８３））を、ＡＦ２可変ドメインの
分子モデルを構築するために用い、その分子モデルを、ＡＦ２骨格中でアミノ酸
（潜在的にＣＤＲと相互作用するために十分な程、ＣＤＲに近い）を位置決めす
るために用いた。ヒト化ＨｕＺＡＦの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を設計す
るために、マウスＡＦ２抗体由来のＣＤＲをヒトＥｕ抗体の骨格領域に移植した
。コンピューターモデルがＣＤＲとの有意な接触を示唆する骨格位置で、マウス
抗体由来のアミノ酸を、元来のヒト骨格アミノ酸で置換した。ＨｕＺＡＦと示さ
れるＡＰ２のヒト化形態については、これは、重鎖の残基２７，２８（Ｃｈｏｔ
ｈｉａ ＣＨＲ Ｈ１内）３０、３８、４８、６７、６８、７０、７２、７４、
９８および１０７で、ならびに軽鎖の残基４８、６３および７０でなされた。さ
らに、ヒト抗体のデータベースにおけるそれらの位置でまれにのみ生じた骨格残
基を、それらの位置でのヒトコンセンサスアミノ酸により、または、対応するマ
ウス抗体アミノ酸により置換した。ＨｕＺＡＦについては、これは、重鎖の残基
９３、９５、９８、１０７、１０８、１０９および１１１で、ならびに軽鎖の残
基４８、６３および７０でなされた。

【００５３】 さらに、ＨｕＺＡＦにおいて、位置Ｈ１１を、マウス抗体ＡＦ２の重鎖の同等
な位置を占めるアミノ酸で置換した。キメラＡＦ２抗体における種々の位置の、
ヒトＥＵ抗体における同等な位置からのアミノ酸での置換により（即ち、置換さ
れた位置以外でマウス可変ドメインを有する）、Ｈ１１を置換のための候補とし
て同定し、そして、減少した中和活性についてそれぞれの改変体を試験した。上
述の全ての置換を組み入れた、ＨｕＺＡＦの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ド
メインの最終配列を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。

【００５４】 マウスＡＦ２ ＣＤＲ領域およびヒトＥＵ可変領域をまた含むが、上記置換の
種々のサブセットを含む、他のヒト化免疫グロブリンを設計した（図３を参照の
こと）。Ｈａｆ２５は、その抗体が位置Ｈ１１およびＨ３８に置換がないことを
除いてはＨｕＺＡＦと等しい。ＨｕＸＡＦは、前者の抗体が位置Ｈ３８で置換が
ないことを除いてはｈｕＺＡＦと等しい。

【００５５】 しかし、置換を受けることもできる多くの潜在的なＣＤＲ−接触残基が存在し
、それらは、抗体が、抗原に対するかなりの親和力を保持することを可能にし得
る。例えば、ヒト化ＡＦ２軽鎖における第１の４つのＮ−末端アミノ酸残基は、
そのＣＤＲとの接触によって、代わりにネズミの抗体由来の配列で置換され得る
。

【００５６】 同様に、ヒト化抗γ−ＩＦＮ重鎖および軽鎖においてＣＤＲと接触していない
多くの骨格残基は、ヒト化抗体の親和性または非免疫抗原性の有意な損失を伴う
ことなく、ヒトＥＵ抗体の対応する位置からのアミノ酸、他のヒト抗体からのア
ミノ酸、マウスＡＦ２抗体からアミノ酸、または他のマウス抗体からのアミノ酸
の置換に適応し得る。

【００５７】 種々の代替のアミノ酸は、親和力、特異性、非免疫抗原性、製造の容易さ、お
よび他の所望の特性の種々の組み合わせを有するヒト化抗γ−ＩＦＮのバージョ
ンを産生するために選択され得る。従って、限定ではなく説明を目的として実施
例が提供される。

【００５８】 ヒト化抗体のための遺伝子の構築のために、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖のタ
ンパク質配列、ならびに代表的な免疫グロブリンシグナル配列を（一般にはマウ
スの配列において見られるコドンを利用して）コードするヌクレオチド配列を選
択した。いくつかの縮重コドンは、制限部位を与えるように、または所望でない
部位を除去するように変化した。このヌクレオチド配列はまた、キメラ遺伝子お
よびＸｂａＩ部位のそれぞれの末端で用いられる同一のスプライスドナーシグナ
ルを含んだ。特定の遺伝子を、４つの重複合成ヌクレオチドから構築した。各々
の可変ドメイン遺伝子のために、コード配列の全体、ならびにシグナルペプチド
およびそのスプライスドナーシグナルを取り囲む２対の重複オリゴヌクレオチド
を、交互鎖上に合成した。このオリゴヌクレオチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成機で合成した。各々のオリゴは、約１５
塩基オーバーラップを有する、約１１０〜１４０塩基長であった。二本鎖ＤＮＡ
フラグメントを、各々のオリゴヌクレオチド対からＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを
用いて合成し、制限酵素を用いて消化し、ｐＵＣ１８ベクターに結合し、そして
配列決定した。次いで、正確な半分の配列をそれぞれ有する２つのフラグメント
を、ｐＶｇ１−ｄｈｆｒ発現ベクターまたはｐＶｋ発現ベクターのＸｂａＩ部位
に適切な方向で連結し、完全な重鎖および軽鎖遺伝子を産生した。ヒト化ＡＦ２
改変体についての特定の遺伝子を、前の遺伝子のＰＣＲ変異誘発により産生した
。

【００５９】 重鎖および軽鎖プラスミドを、エレクトロポレーションにより、Ｓｐ２／０マ
ウス骨髄腫細胞にトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現について細胞を選択し
た。クローンを、ＥＬＩＳＡにより培養上清中でのヒト抗体の産生をアッセイす
ることによりスクリーニングし、そして最良に産生したクローンから抗体を精製
した。組織培養上清を、ブドウ球菌のプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムに通すことにより、抗体を精製した。結
合した抗体を、０．２Ｍ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０で溶出し、そして１Ｍ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
通すことにより、または透析により、この緩衝液をＰＢＳに交換した。

【００６０】 （２．γ−ＩＦＮに対する中和活性についてのアッセイ） γ−ＩＦＮは、応答性の細胞株上のＭＨＣ分子の発現レベルを増加する。Ｈｓ
２９４Ｔは、４８〜７２時間、γ−ＩＦＮとインキュベートした場合、表面上に
発現するＭＨＣクラスＩＩ分子の量をアップレギュレートするヒト骨髄腫細胞株
である（Ｚａｒｎｉｅｃｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４０、４２１７
−４２２３（１９９８））。この増加は、アップレギュレートされた分子に特異
的なモノクローナル抗体、ならびに間接的免疫蛍光法およびそれに続くフローサ
イトメトリーを用いて検出され得る。抗体が、この細胞株上のＭＨＣクラスＩＩ
分子のアップレギュレーションを阻害するか否かを測定することにより、抗体は
、γ−ＩＦＮ中和活性に関してアッセイされ得る。アッセイにおける使用のため
のγ−ＩＦＮは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、６１４ ＭｃＫｉｎｌｅｙ Ｐｌａ
ｃｅ、Ｎ．Ｅ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ ５５４１３から購入した。

【００６１】 漸増濃度の抗体を、固定量のγ−ＩＦＮ（ＨＳ２９４Ｔ細胞上でＭＨＣクラス
ＩＩ分子のレベルをアップレギュレートすることが以前に示された）に添加した
。細胞を、４８〜７２時間、抗体−γ−ＩＦＮ混合物とインキュベートし、そし
て、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的なマウスモノクローナル抗体を用いる間
接的免疫蛍光法により、ＭＨＣクラスＩＩ分子のレベルに関して試験した。フロ
ーサイトメトリーによる分析により、細胞集団の中央蛍光強度の決定が可能にな
り、次いで、その抗体の中和能力を示すためにそれを抗体濃度に対してそれをプ
ロットした。

【００６２】 図４に示すように、ＨｕＺＡＦは、ｈａｆ２５よりも有意により良好な中和活
（すなわち、位置Ｈ１１およびＨ３８での置換は、中和活性を増進した）を有す
る。ＨｕＸＡＦはまた、ｈａｆ２５よりもより良好な中和活性を有し、このこと
は、Ｈ１１での置換のみが中和活性に重要な貢献をしたことを示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１ＡおよびＢは、マウス抗体ＡＦ２の軽鎖可変領域（Ａ）（配列番号１およ
び２）ならびに重鎖可変領域（Ｂ）（配列番号３および４）のｃＤＮＡの配列お
よび翻訳されたアミノ酸配列である。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ配列に下線を付す。

【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、ヒト化抗体ＨｕＺＡＦの軽鎖および重鎖の成熟可変領域
のｃＤＮＡ配列（配列番号５および７）ならびにアミノ酸配列（配列番号６およ
び８）。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ配列に下線を付す。

【図３】 図３は、マウスＡＦ２、ヒト化免疫グロブリンＨｕＺＡＦおよびヒト化免疫グ
ロブリンｈａｆ２５、およびＨｕＸＡＦの重鎖可変領域アミノ酸配列の比較。

【図４】 図４は、マウスＡＦ２、ならびにヒト化抗体ｈａｆ２５、ＨｕＸＡＦおよびＨ
ｕＺＡＦのγ−ＩＦＮに対する中和活性。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 17/06 17/06 21/02 21/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 37/00 37/00 37/06 37/06 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツルシタ， ナオヤ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306， パロ アルト， レッドウッド サーク ル 3719 (72)発明者 クイーン， カリー エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94022， ロス アルトス， ベンベニュー アベ ニュー 622 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 CA04 CA06 DA02 EA04 GA14 HA01 4C085 AA13 AA33 CC22 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA28 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に示された軽鎖可変領域、および配列番号４に示
   された重鎖可変領域を有するマウスＡＦ２免疫グロブリンのヒト化バージョンで
   あるヒト化免疫グロブリンであって、該ヒト化免疫グロブリンは、ヒト化重鎖お
   よび軽鎖を含む、ただし該ヒト化重鎖可変領域のフレームワークの部位１１が、
   該マウスＡＦ２重鎖可変領域のフレームワークの等価部位に存在するアミノ酸に
   よって占められる、ヒト化免疫グロブリン。
2. 【請求項２】 前記マウスＡＦ２免疫グロブリン由来のＣＤＲおよび前記Ｅ
   Ｕヒト化免疫グロブリン由来の重鎖および軽鎖の可変領域のフレームワークを含
   む、請求項１に記載のヒト化免疫グロブリン。
3. 【請求項３】 部位Ｈ３８が前記マウスＡＦ２重鎖可変領域のフレームワー
   クの等価部位に存在するアミノ酸によって占められることがさらに提供される、
   請求項２に記載のヒト化免疫グロブリン。
4. 【請求項４】 部位Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４８、Ｈ
   ６７、Ｈ６８、Ｈ７０、Ｈ７２、Ｈ７４、Ｈ９３、Ｈ９５、Ｈ９８、Ｈ１０７、
   Ｈ１０８、Ｈ１０９、Ｈ１１１が前記マウスＡＦ２重鎖の等価部位に存在するア
   ミノ酸によって占められること、部位Ｌ４８、およびＬ７０が前記マウスＡＦ２
   軽鎖の等価部位に存在するアミノ酸によって占められること、そして部位Ｌ６３
   がヒト免疫グロブリンの軽鎖のコンセンサス配列の等価部位に存在するアミノ酸
   によって占められることがさらに提供される、請求項２に記載のヒト化免疫グロ
   ブリン。
5. 【請求項５】 前記マウスＡＦ２抗体の親和性の４倍以内の親和性定数を有
   する、ヒトγ−ＩＦＮと特異的に結合する、請求項１に記載のヒト化免疫グロブ
   リン。
6. 【請求項６】 配列番号６の成熟軽鎖に少なくとも９０％の配列同一性を有
   するヒト化成熟軽鎖、および配列番号８の成熟重鎖に少なくとも９０％の配列同
   一性を有するヒト化成熟重鎖を含むγ−ＩＦＮと特異的に結合する、請求項１に
   記載のヒト化免疫グロブリン。
7. 【請求項７】 ２つの軽鎖／重鎖ダイマーを含む、請求項１に記載のヒト化
   免疫グロブリン。
8. 【請求項８】 ＩｇＧ１イソタイプの免疫グロブリンである、請求項１に記
   載のヒト化免疫グロブリン。
9. 【請求項９】 少なくとも９５％の同質性にまで精製される、請求項１に記
   載のヒト化免疫グロブリン。
10. 【請求項１０】 配列番号６に示された成熟重鎖可変領域、および配列番号
    ８に示された成熟軽鎖可変領域を含む、ヒト化免疫グロブリン。
11. 【請求項１１】 請求項１または１０に記載のヒト化免疫グロブリンおよび
    薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
12. 【請求項１２】 有害な免疫応答に罹患した患者を処置する方法であって、
    請求項１または１０に記載の薬学的組成物の治療的有効量を投与する工程を包含
    する、方法。
13. 【請求項１３】 前記患者が自己免疫疾患に罹患する、請求項１２に記載の
    方法。