KR100261941B1

KR100261941B1 - 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체

Info

Publication number: KR100261941B1
Application number: KR1019970700191A
Authority: KR
Inventors: 고우지 마츠시마; 요시히로 마츠모토; 요시키 야마다; 고 사토; 마사유키 츠키야; 다츠미 야마자키
Original assignee: 나가야마 오사무; 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 2000-07-15
Anticipated expiration: 2015-07-12
Also published as: ATE340590T1; CA2194907A1; AU701342B2; US6245894B1; US20020082396A1; EP0770628A1; HU221385B1; WO1996002576A1; US5994524A; EP0770628B9; ZA955832B; EP0770628B1; HUT77420A; DE69535243D1; DE69535243T2; EP0770628A4; AU2936395A

Abstract

본 발명은, (A) (1) 사람 L 사슬 C 영역; 및 (2) 사람 L 사슬 FR과 사람 인터루킨-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 CDR로 이루어진 L 사슬 V 영역 각각으로 이루어진 L 사슬과; (B) (1) 사람 H 사슬 C 영역; 및 (2) 사람 H 사슬 FR과 사람의 인터루킨-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 CDR로 이루어진 H 사슬 V 영역 각각으로 이루어진 H 사슬로 이루어진 사람 인터루킨-8에 대한 재구성 사람 항체에 관한 것이다.

상기한 재구성 사람 항체의 대부분이 사람 항체에서 유래하고 그 CDR은 항원성이 낮기 때문에 본 발명의 재구성 사람 항체는 사람에 대한 항원성이 낮아서, 의약적 처치에 유용할 것으로 기대된다.

Description

사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람 항체

인터루킨-8(IL-8)은 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극된 단핵세포의 배양상징액에서 발견되었으며 단핵세포에서 유도된 호중구 주화성 인자(MDNCF) 또는 호중구 활성 단백질-1(NAP-1)으로 알려진 케모킨(chemokin)이다. IL-8은 다양한 세포에 의해 제조되며 다핵형 백혈구와 임파구에 작용하고 그의 농도 그래디언트를 따라 화학주성을 일으키는 활성을 가진다. 또한, IL-8은 호중구에서 화학주성을 유도할 뿐만 아니라 과립 감소, 과산화물의 방출 및 내피 세포에 대한 고착 촉진 등의 호중구 작용을 활성화한다.

염증 질환, 구체적으로는 폐 낭포성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 성인 호흡 피로증, 유육종증 및 축농 등의 호흡기 질환과 건선 등의 피부 질환 및 만성 류마티스 관절염, 크론씨 병 및 궤양성 대장염에서 백혈구 침윤이 상기한 질병의 염증 부위에서 병리학적으로 관찰되었다. 또한, IL-8이 상기한 질병을 가지는 환자들의 시험 샘플에서 검출되어 IL-8이 염증에서 중심적인 역할을 하는 것으로 추측되었다(McElvaney, N.G. et al., J. Clin. Invest., 90, 1296-1301, 1992; Lynch Ⅲ, J.P. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 145, 1433-1439, 1992; Donnelly, S.C. et al., Lancet, 341, 643-647, 1993; Car, B.D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149, 655-659, 1994; Antony, V.B. et al., J. Immunol., 151, 7216-7223, 1993; Takematsu, H. et al., Arch. Dermatol., 129, 74-80, 1993; Brennan, F.M. et al., Eur. J. Immunol., 20, 2141-2144, 1990; Izzo, R.S. et al., Scand. J. Gastroenterol., 28, 296-300, 1993; Izzo, R.S. et al., Am. J. Gastroenterol., 87, 1447-1452, 1992).

사람의 IL-8을 항원으로 하여 마우스를 면역한 다음, Ko, Y-C 등은 사람의 IL-8에 결합하여 이 결합으로 인해 호중구에 대한 사람의 IL-8의 결합을 억제하는, 즉 사람의 IL-8에 의해 억제된 생물학적 활성을 중화하는 마우스 모노클로날 항체 WS-4를 제조하였다. 이러한 사실로부터 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 이소타입이 κ-형 L 사슬 및 Cγl-형 H 사슬로 이루어지는 것이 입증되었다(J. Immunol. Methods, 149; 227-235, 1992).

WS-4 이외에 이미 알려진 사람의 IL-8에 대한 항체의 예로는 A.5.12.14(Boylan, A.M. et al., J. Clin. Invest., 89, 1257-1267, 1992), 국제 특허출원 제WO92-04372호에 기재된 안티-Pep-1 항체와 안티-Pep-3 항체 및 DM/C7(Mulligan, M.S. et al., J. Immunol., 150, 5585-5595, 1993)이 있다.

또한, 래빗을 이용한 실험 모델에 마우스 모노클로날 항체 WS-4를 투여하여 호중구 침윤이 폐 허혈성 레퍼퓨젼 손상(Sekido, N. et al., Nature, 365, 654-657, 1993), LPS로 유발된 피부염(Harada, A. et al., Internatl. Immunol., 5,681-690, 1993) 및 LPS- 또는 인터루킨-1(IL-1)으로 유발된 관절염(Akahoshi, T. et al., Lymphokine Cytokine Res., 13, 113-116, 1994)에서 억제되는 것을 발견하였다.

사람의 IL-8의 상동성이 래빗에 존재하는데, 이것을 래빗 IL-8이라 한다. 마우스 모노클로날 항체 WS-4는 래빗 IL-8과 교잡반응하고 이 항체는 래빗 호중구에 래빗 IL-8의 결합을 억제하는 것이 명백히 입증되었으므로(Harada, A. et al., Internatl. Immunol., 5,681-690, 1993), 이러한 발견은 안티-사람 IL-8 항체가 사람의 염증 처치용 치료제로서 이용될 수 있음을 시사한다.

사람 이외의 포유동물에서 유래하는 모노클로날 항체는 사람에게서 고도의 면역원성(항원성이라고도 함)을 나타낸다. 이러한 이유로, 마우스 항체가 사람에게 투여될지라도 그것이 이물질로서 대사되기 때문에 사람 내에서 마우스 항체가 반감기가 상대적으로 짧아서 기대되는 효과가 적절하게 나타나지 못한다. 또한, 투여된 마우스 항체에 반응하여 생성되는 사람의 안티-마우스 항체는, 예를들면 혈청병 또는 기타 알러지성 반응 등의 환자에게 불편하고 위험한 면역반응을 일으킨다. 그러므로, 마우스 항체는 사람에게 자주 투여할 수 없다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 인간화된 항체를 제조하는 방법이 개발되었다. 마우스 항체는 2가지 방법에 의해 인간화될 수 있다. 보다 간단한 방법으로는 원래의 마우스 모노클로날 항체에서 가변영역(V 영역)을 유도하고 적당한 사람의 항체에서 불변영역(C 영역)을 유도하여 키메라 항체를 제조하는 방법이 있다. 생성된 키메라 항체는 완전한 형태로 마우스 항체의 가변영역을 함유하기 때문에 원래의 마우스 항체에 대하여 동일한 특이성을 가지며 항원에 결합할 것으로 기대된다.

또한, 키메라 항체에 있어서 사람 이외의 동물에서 유도된 단백질 서열의 비율은 원래의 마우스 항체와 비교하여 실질적으로 감소되기 때문에 원래의 마우스 항체와 비교하여 면역원성이 떨어질 것으로 예상된다. 상기 키메라 항체가 항원에 잘 결합하여 낮은 면역원성을 가지기는 하지만 마우스 가변영역에 대한 면역반응의 발생 가능성은 여전히 남아있다(LoBuglio, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

마우스 항체를 인간화하는 2번째 방법은 좀 더 복잡하기는 하지만 마우스 항체의 잠재된 면역원성이 상당히 제거된다. 이 방법에 있어서는, 마우스 항체의 가변영역으로부터의 상보성 결정영역(CDR)만이 사람의 가변영역 상에 융합되어 재구성 사람 가변영역을 형성한다. 그러나, 재구성 사람 가변영역의 CDR의 구조를 원래의 마우스 항체의 구조에 좀더 근접시키기 위하여 마우스 항체의 가변영역에서 사람의 가변영역까지 CDR을 지지하는 구조영역(FR)의 단백질 서열 일부를 이식하는 것이 필요한 경우도 있다.

다음으로, 이러한 재구성 사람 가변영역을 사람의 불변영역에 결합한다. 사람 이외의 단백질 서열에서 유도된 이 부분은 CDR과 인간화된 항체의 극히 일부의 FR만으로 이루어진다. CDR은 초가변 단백질 서열로 구성되고 이들은 종특이성을 나타내지 않는다. 이러한 이유로 마우스 CDR을 함유하는 재구성 사람 항체는 사람의 CDR을 함유하는 천연의 사람 항체 보다 더 강한 면역원성을 가져서는 안된다.

재구성 사람 항체에 대한 기타 상세한 내용은 다음 문헌들에 기재되어 있다: Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeyen, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 2, 124-134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co. M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; 및 Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

본 발명은 사람의 인터루킨-8(IL-8)에 대한 마우스 모노클로날 항체의 상보성 결정영역(CDRs)과 가변영역(V영역), 사람의 IL-8에 대한 사람/마우스 키메라 항체, 및 재구성된 사람의 항체에 관한 것으로, 상기에서 사람의 라이트 사슬(L사슬) 가변영역과 사람의 헤비 사슬(H사슬) 가변영역의 상보성 결정영역은 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR로 치환된다. 또한, 본 발명은 상기한 항체와 그의 일부를 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기한 DNA를 함유하는 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발현벡터와 상기 벡터로 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제조하는 방법 및 사람의 IL-8에 대한 케메라 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

제1도는 본 발명의 항체의 L 사슬과 H 사슬 각각의 발현에 유용한 사람의 연장인자-1α(HEF-1α) 프로모터/인핸서를 함유하는 발현벡터 HEF-VL-gκ 및 HEF-VH-gγ1을 나타낸 것이다.

제2도는 COS 세포의 배양 배지로 분비된 본 발명의 키메라 WS-4 항체(chL/chH)의 사람 IL-8에의 결합능을 확인하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제3도는 본 발명(A)의 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 제1버젼 "a"(RVHa)와 재구성 사람 WS-4 항체(B)의 L 사슬 V 영역의 제1버젼 "a"(RVLa) 각각의 아미노산 서열의 코드하는 DNA의 구성 다이아그램이다.

제4도는 COS 세포에서 발현된 키메라 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역(chH)과 키메라 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역(chL) 각각과 결합한 본 발명의 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역(RVLa) 및 H 사슬 V 영역(RVHa)의 사람 IL-8에 대한 결합능을 COS 세포의 배양 배지로 분비된 본 발명의 키메라 WS-4 항체(chL/chH)와 비교하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제5도는 COS 세포의 배양 배지로 분비된 본 발명의 RVLa를 함유하는 8가지 형태의 재구성 사람 WS-4 항체(RVLa/RVHa, RVLa/RVHb, RVLa/RVHc, RVLa/RVHd, RVLa/RVHe, RVLa/RVHf, RVLa/RVHg 및 RVLa/RVHh)의 사람 IL-8에 대한 결합능을 COS 세포의 배양 배지로 분비된 본 발명의 키메라 WS-4 항체(chL/chH)와 비교하기 위한 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.

제6도는 COS 세포의 배양 상징액에서 제조된 본 발명의 제2버젼 RVLb를 함유하는 8가지 형태의 재구성 사람 WS-4 항체(RVLb/RVHa, RVLb/RVHb, RVLb/RVHc, RVLb/RVHd, RVLb/RVHe, RVLb/RVHf, RVLb/RVHg 및 RVLb/RVHh)의 사람 IL-8에 대한 결합능을 COS 세포의 배양 배지로 분비된 본 발명의 키메라 WS-4 항체(chL/chH)와 비교하기 위한 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.

제7도는 본 발명의 정제된 재구성 사람 WS-4 항체 RVLa/RVHg와 RVLb/RVHg 및 본 발명의 정제된 키메라 WS-4 항체(chL/chH)의 사람의 IL-8에 대한 결합능을 비교하기 위한 ELISA의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 정제된 재구성 사람 항체 RVLa/RVHg 및 RVLb/RVHg의 IL-8 리셉터에 대한 IL-8의 결합 억제능을 본 발명의 마우스 WS-4 항체와 키메라 WS-4 항체(chL/chH)와 비교하기 위한 리간드 리셉터 결합 억제 에세이 결과를 나타낸 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 방법

마우스 V 영역을 코드하는 DNA 클로닝

사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V 영역을 코드하는 유전자를 클론하기 위해서 상기한 유전자를 획득하기 위한 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체를 제조하는 하이브리도마를 제조하여야 한다. 이 하이브리도마로부터 mRNA를 추출한 후, 상기 mRNA를 종래의 방법에 따라 단일가닥 cDNA로 전환하고, 폴리머라제 체인 반응(PCR)을 이용하여 목적 DNA를 증식시켜서 상기 유전자를 얻는다. 이 유전자의 공급원의 예로는 Ko, Y.C.등에 의해 제조된 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체를 제조하는 하이브리도마 WS-4가 있다. 이 하이브리도마를 제조하는 방법은 J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992에 기재되어 있으며 이하의 대조예 1에 기재하였다.

(1) 전체 RNA의 추출

사람의 Il-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코드하는 목적 DNA를 클론하기 위해서 하이브리도마 세포를 구아니딘 티오시아네이트 처리에 의해 분쇄하고 염화세슘 밀도차 원심분리하여 전체 RNA를 제조할 수 있다(Chrigwin, J.M. et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979).

또한, 유전자를 클로닝하는 동안 사용되는 다른 방법으로는, 예를들면 바나듐 착화합물 등의 리보뉴클레아제(RNase) 억제제의 존재 하에서 계면활성제 처리와 페놀 처리(Berger, S.L. et al., Biochemistry, 18, 5143-5149, 1979)를 실시하는 등의 법이 사용될 수 있다.

(2) cDNA 합성

다음으로, 올리고(dT)를 이용하여 역전사효소로 전체 RNA를 처리하고 폴리(A) 테일에 상보하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 mRNA의 3' 말단에 위치시키고 전체 RNA에 함유된 mRNA를 템플레이트로서 상기한 방법으로 얻어 mRNA에 상보하는 단일가닥 cDNA를 얻을 수 있다(Larrick, J.W. et al., Bio/Technology, 7, 934-938, 1989). 또한, 랜덤 프라이머를 동시에 사용할 수 있다. mRNA를 단리하는 것이 먼저 필요한 경우, mRNA의 폴리(A) 테일이 결합하는 올리고(dT)-셀룰로스 컬럼에 전체 RNA를 적재하여 실시할 수 있다.

(3) 폴리머라제 체인 반응에 의한 V 영역을 코드하는 DNA의 증폭

상기한 V 영역을 코드하는 cDNA를 폴리머라제 체인 반응(PCR)을 이용하여 특이적으로 증폭하였다. 마우스 모노클로날 항체의 카파(κ)형 L 사슬 V 영역을 증폭하기 위하여 서열 번호 1 내지 11(마우스 카파 가변역; MKV)에 나타낸 11 종류의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 서열번호 12(마우스 카파 불변역; MKC)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머를 5' 터미널 프라이머와 3' 터미널 프라이머로 각각 사용하였다. 상기한 MKV 프라이머는 마우스 카파형 L 사슬 리더 서열을 코드하는 DNA 서열에 혼성하였고, 상기한 MKC 프라이머는 마우스 카파형 L 사슬 C 영역을 코드하는 DNA 서열에 혼성하였다.

마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역을 증폭하기 위하여 서열 번호 13 내지 24(마우스 헤비 가변역; MHV)에 나타낸 12 종류의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 서열 번호 25(마우스 헤비 불변역; MHC)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각가 5' 터미널 프라이머와 3' 터미널 프라이머로 이용하였다. 상기한 MHV 프라이머를 마우스 H 사슬 리더 서열을 코드하는 DNA 서열에 혼성하고, 상기한 MHC 프라이머를 마우스 H 사슬 C 영역을 코드하는 DNA 서열에 혼성하였다.

또한, 모든 5' 터미널 프라이머(MKV 및 MHV)는 3' 터미널 근처에 SalI 제한효소 절단부위를 제공하는 GTCGAC 서열을 포함하고, 2개의 3'-터미널 프라이머(MKC와 MHC)는 5' 터미널 근처에 XmaI 제한효소 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열 CCCGGG를 포함한다. 이 제한효소 절단 부위는 각각의 클로닝 벡터에 2개의 V 영역을 코드하는 목적 DNA 절편의 서브클로닝에 이용된다. 제한효소 절단부위가 2개의 V 영역을 코드하는 목적 DNA 서열에 존재하는 경우, 다른 제한효소 절단부위가 각각의 클로닝 벡터에로의 서브클로닝에 사용되어야 한다.

(4) V 영역을 코드하는 DNA의 단리

마우스 모노클로날 항체의 목적 V 영역을 코드하는 DNA 절편을 얻기 위하여 PCR 증폭 생성물을 분리하여 저융점 아가로스 겔이나 또는 컬럼[PCR Product Purification kit(QIAGEN PCR Purification Spin Kit; QIAGEN); DNA 정제 키트(GENECLEAN Ⅱ, BIO101)]에 의해 정제하였다. 제한효소 SalI과 XmaI으로 정제된 증폭 생성물을 효소 처리하여 마우스 모노클로날 항체의 목적 V 영역을 코드하는 DNA 절편을 얻었다.

동일한 제한효소, SalI과 XmaI으로 플라스미드 pUC19와 같은 적당한 클로닝 벡터를 절단하고 이 pUC19에 상기한 DNA 절편을 효소적으로 결합하여 마우스 모노클로날 항체의 목적 V 영역을 코드하는 DNA 절편을 함유하는 플라스미드를 얻었다. 자동 DNA 시퀀서(Applied Biosystems)를 이용하는 등의 일반적인 방법으로 클론된 DNA의 서열을 결정할 수 있다. 목적 DNA의 클로닝과 서열 결정방법을 실시예 1과 2에 상세히 기재하였다.

상보성 결정 영역(CDRs)

본 발명은 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V 영역의 초가변영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 제공한다. 상기 항체의 L 사슬과 H 사슬 모두의 V 영역은 항원 결합부위를 형성한다. L 사슬과 H 사슬 상의 이러한 영역은 유사한 기본 구조를 가진다. 양 사슬의 V 영역은 서열이 비교적 보존되는 4개의 구조영역을 함유하며, 이러한 4개의 구조영역은 3개의 초가변 영역 또는 CDR에 의해 결합된다.(Kabat, E, A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1991).

상기한 4개의 구조영역(FR)의 대부분은 β-시이트 구조를 가지며 3개의 CDR은 루프를 형성한다. 어떤 경우에 CDR은 β 시이트 구조의 일부를 생성할 수 있다. 3개의 CDR은 FR에 의해 3차원적으로 매우 가까운 위치에 유지되며 3쌍의 CDR과 함께 항원 결합부위의 생성에 기여한다. 본 발명은 인간화된 항체의 성분으로서 유용한 CDR과 이들을 코드하는 DNA를 제공한다. V 영역 서열을 이미 알려진 V 영역의 아미노산 서열과 비교하여 Kabat, E.A. et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest"의 실험 방법으로부터 CDR을 결정할 수 있으며, 그 방법을 구현예 3에 상세히 기재하였다.

키메라 항체의 제조

사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 V 영역을 설계하기 전에 사용되는 CDR이 실제적으로 항원-결합 영역을 생성하는지를 확인하여야 한다. 이러한 목적으로 키메라 항체를 제조하였다. 키메라 항체를 제조하기 위하여는 키메라 항체의 L 사슬과 H 사슬을 코드하는 DNA를 구성하여야 한다. 2개의 DNA를 구성하는 기본 방법은 PCR 클론된 DNA에서 관찰된 마우스 리더 서열과 마우스 V 영역 서열의 각각의 DNA 서열을 포유동물 세포 발현 벡터에 이미 존재하는 사람의 C 영역을 코드하는 DNA 서열에 결합하는 것으로 이루어진다.

상기한 사람 항체 C 영역은 어떠한 종류의 사람 L 사슬 C 영역과 사람 H 사슬 C 영역도 가능하며 L 사슬에 대하여는 예를들면 사람 L 사슬 Cκ 또는 Cλ가 있으며 H 사슬에 대하여는 IgG일 경우, 예를들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3, 또는 Cγ4(Ellison, J. etd., DNA 1, 11-18(1981), Takahashi, N. et al., Cell, 29, 671-679(1982), Krawinkel, U. et al., EMBO J., 1, 403-407(1982)) 또는 기타 아이소타입이 있다.

키메라 항체의 제조를 위하여 2가지 형태의 발현 벡터가 제조되는데, 즉 인핸서/프로모터 발현 조절 영역의 조절 하에서 마우스 L 사슬 V 영역과 사람 L 사슬 C 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터와 발현 조절영역의 인핸서/프로모터 형태의 조절 하에서 마우스 H 사슬 V 영역과 사람 H 사슬 C 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터이다. 다음으로, 포유동물 세포 등의 숙주 세포를 상기한 발현 벡터 2개로 동시에 형질전환하고, 형질전환된 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양하여 키메라 항원을 제조하였다(예를들면, WO91-16928).

임의로, 마우스 L 사슬 V 영역과 사람 L 사슬 C 영역을 코드하는 DNA와 마우스 H 사슬 V 영역과 사람 H 사슬 C 영역을 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입하고 이 벡터로 숙주 세포를 형질전환한 후, 생체 내 또는 시험관 내에서 배양하여 키메라 항체를 제조하였다.

모노클로날 항체 WS-4로부터 키메라 항체의 제조를 구현예 4에 기재하였다.

마우스 WS-4 κ-형 L 사슬 리더 서열과 V 영역을 코드하는 cDNA를 PCR을 이용하여 클론하고 사람 L 사슬 Cκ 영역을 코드하는 사람 게놈 DNA를 함유하는 발현벡터에 결합하였다. 마찬가지로, 마우스 WS-4 항체의 H 사슬 리더 서열과 V 영역을 코드하는 cDNA를 PCR을 이용하여 클론하고 사람 Cγ1 영역을 코드하는 사람 게놈 DNA를 함유하는 발현 벡터에 결합하였다.

더욱 구체적으로는, 적당한 뉴클레오티드 서열을 특별히 설계된 PCR 프라이머를 이용하여 마우스 WS-4 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA의 5' 및 3' 터미널에 삽입하여, (1) 이들이 발현벡터에 용이하게 삽입될 수 있게 하고 (2) 상기 발현벡터에서 적당하게 작용하게 한다(예를들면 전사 효율이 본 발명에서 Kozak 서열을 삽입함으로써 개선되었다).

다음에, 상기한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭하여 얻어진 마우스 WS-4 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 이미 목적하는 사람 C 영역을 함유하는 HEF 발현 벡터(도 1 참조)에 삽입한다. 이러한 벡터는 다양한 포유동물 세포계에서 유전적으로 처리된 항체의 일시적인 또는 안정한 발현에 적당하다.

상기한 방법으로 제조된 키메라 WS-4 항체의 항원 결합 활성을 시험하였을 때, 키메라 WS-4 항체는 사람의 IL-8에 대하여 결합활성을 나타내었다(도 2 참조). 그러므로, 정확한 마우스 V 영역이 클론되었고 정확한 서열이 결정된 것으로 결론지어졌다.

재구성 사람 WS-4 항체의 설계

마우스 모노클로날 항체의 CDR이 사람 항체에 융합된 재구성 사람 항체를 제조하기 위하여는, 융합되어질 CDR을 가지는 마우스 모노클로날 항체의 FR의 아미노산 서열과 CDR이 융합되는 사람 모노클로날 항체의 FR의 아미노산 서열간에 고도의 동종성이 있는 것이 바람직하다.

이를 위하여 재구성 사람 WS-4 항체의 V 영역을 설계하기 위한 근거로서 사용되는 사람 V 영역은 마우스 모노클로날 항체의 FR의 아미노산 서열을 사람항체의 FR의 아미노산 서열과 비교하여 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 마우스 WS-4 항체의 L 및 H 사슬의 V 영역을 유전자 분석 소프트웨어인 GENETEX(Software Development Co., Ltd.)를 이용하여 National Biomedical Research Foundation(NBRF)의 데이타베이스에서 발견된 기존의 모든 사람 V 영역과 비교하였다.

이미 알려진 사람 L 사슬 V 영역과 비교에서 마우스 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역이 사람 항체 HAU(Watanabe, S. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 351, 1291-1295, 1970)의 L 사슬 V 영역과 69.2%의 상동성을 가지는 매우 유사한 것임을 발견하였다. 한편, 이미 알려진 사람 항체 H 사슬 V 영역과 비교에서 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역이 사람 항체 VDH26(Buluwela, L. et al., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988)의 H 사슬 V 영역과 71.4%의 상동성을 가지는 매우 유사한 것임을 발견하였다.

일반적으로 사람 V 영역의 아미노산 서열에 대한 마우스 V 영역의 아미노산 서열의 상동성은 마우스 V 영역의 아미노산 서열에 대한 상동성 보다 더 적다. 이것은 마우스 WS-4 항체의 V 영역이 사람 V 영역과 거의 닮지 않았음을 나타냄과 동시에, 마우스 WS-4 V 영역의 인간화가 사람에 있어서의 면역원성 문제를 해결하는 최선의 방법임을 나타낸다.

V 영역 FR 간의 비교를 위하여 마우스 WS-4 항체의 V 영역을 Kabat, E. A. et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office에 의해 정의된 사람 V 영역 서브그룹의 컨센서스 서열과 비교하였다. 그 결과를 표 1에 기재하였다.

마우스 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 FR은 사람 L 사슬 V 영역 서브그룹 I(HSGI)의 FR의 컨센서스 서열과 매우 유사하며, 64.4%의 상동성을 가졌다. 반면에 마우스 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 FR은 사람 H 사슬 V 영역 서브그룹 Ⅲ(HSGⅢ)의 컨센서스 서열과 매우 유사하였으며, 62.3%의 상동성을 가졌다.

상기한 결과들은 종래의 사람 항체와 사람 L 사슬 V 영역 서브그룹 I에 속하는 사람 항체 HAU의 L 사슬 V 영역 및 사람 H 사슬 V 영역 서브그룹 Ⅲ에 속하는 사람 항체 VDH26의 H 사슬 V 영역을 비교하여 얻어진 결과를 뒷받침한다. 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 설계하기 위하여는 서브그룹 I(HSGI)에 속하는 사람 L 사슬 V 영역을 사용하는 것이 가장 바람직하고, 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 설계하기 위하여는 서브그룹 Ⅲ(HSGⅢ)에 속하는 사람 항체의 H 사슬 V 영역을 사용하는 것이 가장 바람직할 것이다.

종래의 사람 항체의 L 사슬 V 영역과의 비교에서 마우스 항체 WS-4의 L 사슬 V 영역은 사람 L 사슬 V 영역의 서브그룹 I에 속하는 사람 항체 REI의 L 사슬 V 영역과 매우 유사하였다. 그러므로, REI의 FR을 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 설계하는데 이용하였다. REI에 기초한 상기한 사람 FR 내에는 원래 문헌(Palm, W. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 167-191, 1975; Epp, O. et al., Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975)에 기록된 사람 REI와 비교하여 5개 아미노산의 차이(39, 71, 104, 105 및 107 위치; 표 2 참조)가 있다.

표에 기재된 아미노산 수는 Kabat, E. A. et al. (1991)의 경험에 기초한 것이다. 39와 71 위치의 2개의 아미노산의 변화는 래트 CAMPATH-1H 항체(Riechmann, et al., 1988)의 L 사슬 V 영역의 FR에 존재하는 아미노산에 의해 발생된 동일한 변화이다. Kabat, 등(1991)에 따르면, FR4에서 다른 3개의 아미노산(104, 105 및 107 위치)의 변화는 다른 사람 κL 사슬로부터의 J 영역에 기초한 것으로 사람으로부터 벗어나지 않는다.

재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 2개 버젼을 설계하였다. 제1버젼 RVLa에서 FR은 재구성 사람 CAMPATH-1H항체(Riechmann, et al., 1988)에 존재하는 REI에 기초한 FR과 동일하였고, CDR은 마우스 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR과 동일하였다. 제2버젼, RVLb는 RVLa에 기초하였고, 사람 FR3의 71 위치의 1개의 아미노산 만이 달랐다. Chothia, C. et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987에 의해 정의된 바와 같이, 잔기 71은 L 사슬 V 영역의 CDR1의 기본구조의 일부이다.

이 위치의 아미노산은 L 사슬 V 영역의 CDR1 루프의 구조에 직접 영향을 미치는 것으로 예측되므로, 항원 결합에 상당한 영향을 미칠 것으로 생각된다. 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 RVLb에서 71 위치의 페닐알라닌은 티로신으로 변화된다. 표 2에 마우스 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역, 재구성 사람 CAMPATH-1H 항체(Riechmann, et al., 1988)에 사용하기 위한 변성된 REI의 FR 및 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 2개 버젼의 각각의 아미노산 서열을 나타내었다.

주 : REI의 FR은 재구성 사람 CAMPATH-1H 항체(Riechmann, et al., 1988)에서 발견되었다. REI의 FR에서 밑줄친 5개의 아미노산은 사람 REI의 아미노산 서열과 다른 아미노산이다. 아미노산은 단일문자 코드로 나타내었다. 아미노산 번호는 Kabat 등에 따른 것이다.

마우스 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 FR은 서브그룹 Ⅲ(표 1)에 속하는 사람 H 사슬 V 영역과 매우 유사하다.

이미 알려진 사람 H 사슬 V 영역과의 비교에서 마우스 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역은 FR1에서 FR3까지 사람 H 사슬 V 영역의 서브그룹 Ⅲ중 하나인, 사람 항체 VDH26(Buluwela, L. et al., EMBO J., 7,2003-2010, 1988)의 H 사슬 V 영역과 매우 유사하였다. FR4와 관련하여는, VDH26의 FR4 서열은 보고되어 있지 않으므로 서브그룹 Ⅲ에 속하는 사람 항체 4B4(Sanz, I. et al., J. Immunol., 142, 883--887, 1989)의 FR4 아미노산 서열을 이용하기로 결정되었다. 상기한 사람 H 사슬 V 영역은 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 설계하기 위한 근거로 사용되었다.

재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 8개 버젼을 설계하였다. 8개 버젼 모두에서 사람 FR1, FR2 및 FR3는 사람 항체 VDH26의 FR1, FR2 및 FR3에 기초하였고, FR4는 사람 항체 4B4의 FR4에 기초하였다. 마우스 CDR은 마우스 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR과 동일하였다.

표 3과 4에는 마우스 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역, 사람 항체 VDH26의 템플레이트 FR1 내지 FR3, 사람 항체 4B4의 FR4 및 재구성 사람 WSD-4 항체의 H 사슬 V 영역의 8개 버젼 각각의 아미노산 서열을 나타내었다.

주 : RVHa-h는 RVHa, RVHb, RVHc, RVHd, RVHe, RVHe, RVHf, RVHg 및 RVHh이다. 아미노산은 단일문자 코드를 이용하여 나타내었다. 아미노산 번호는 Kabat 등의 정의에 따른다.

재구성 사람 WS-4 항체의 V 영역을 코드하는 DNA의 제조

재구성 사람 WS-4 항체의 V 영역을 제조하는 방법을 실시예 5에 상세히 기재하였다.

재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 및 H 사슬 V 영역 각각의 제1버젼을 코드하는 DNA를 합성하였다. 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 및 H 사슬 V 영역의 버젼 "a"의 전체 DNA 서열이 서열 결정에 의한 정확한 아미노산 서열을 코드하는 것을 확인하였다. 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 버전 "a"의 서열을 서열번호 62에 기재하였고, 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 버젼 "a"의 서열을 서열번호 38에 기재하였다.

재구성 사람 WS-4 항체 V 영역의 다른 버젼을 코드하는 DNA는 제1버젼 "a"를 템플레이트로 하여 종래의 PCR-돌연변이 유도방법(Kammann, M. et al., Nucleic Acids Res., 17, 5404, 1989)을 약간 변형하여 제조하였다. 재구성 사람 WS-4 항체의 V 영역의 설계와 관련하여 상기에 기재한 바와 같이, 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 7개의 추가 버젼(버젼 "b", "c", "d", "e", "f", "g" 및 "h")을 코드하는 DNA 뿐만 아니라 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 1개의 추가 버젼(버젼 "b")을 코드하는 DNA를 제조하였다.

상기한 추가 버젼들은 제1버젼으로부터의 일련의 아미노산 서열 내에 약간의 변화를 포함하며, 이러한 아미노산 서열 내의 변화는 PCR 돌연변이 유도방법을 이용하여 DNA 서열 내에 약간의 변화를 일으켜 얻어진다. DNA 서열 내에 필요한 변화를 도입한 PCR 프라이머를 설계하였다. 일련의 PCR 반응 후에, PCR 생성물을 클론하고 서열을 결정하여 DNA 서열 내의 변화가 설계된 대로 일어났는지를 확인하였다. 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 버젼 "b"의 서열을 서열번호 65에 나타내었고, 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 버젼 "b", "c", "d", "e", "f", "g" 및 "h"의 서열번호 41, 44, 45, 48, 51, 54 및 55에 각각 나타내었다.

서열 결정에 의해 재구성 사람 WS-4 항체 V 영역의 여러 버젼들의 DNA 서열을 확인한 후, 재구성 사람 WS-4 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 사람 C 영역을 코드하는 DNA가 미리 함유된 포유동물 세포의 발현벡터에 서브클론하였다. 즉, 재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA를 사람 L 사슬 C 영역을 코드하는 DNA 서열에 결합하였고, 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA는 사람 Cγ1 영역을 코드하는 DNA 서열에 결합하였다.

다음으로, 재구성 사람 L 사슬 V 영역의 버젼 "a" 또는 "b"와 H 사슬 V 영역의 버젼 "a" 내지 "h"의 모든 조합에 대하여 사람 IL-8에 대한 결합을 시험하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 L 사슬 버젼 "a" 또는 "b" 및 H 사슬 버젼 "g"(RVLa/RVHg 및 RVLb/RVHg)를 함유하는 2개의 재구성 사람 항체는 키메라 WS-4 항체와 같은 정도의 사람 IL-8에 대한 결합능을 나타내었다.

동물 세포 또는 구축된 포유동물 세포 등의 진핵세포, 균류 세포, 효모 세포 및, 박테리아 세포(예를들면, E. coil) 등의 원핵 세포 등의 어떠한 발현 시스템도 본 발명의 사람 IL-8에 대한 키메라 항체 또는 재구성 사람 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 키메라 항체 또는 재구성 항체는 COS 세포 또는 CHO 세포 등의 포유 동물 세포에서 발현되는 것이 바람직하다. 이 경우, 포유동물 세포에서의 발현을 위하여 유용한 일반적으로 사용되는 프로모터를 사용할 수 있다. 예를들면, 사람 사이토메갈로바이러스 인접 초기(HCMV) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV 프로모터를 함유하는 발현벡터의 예로는 HCMV-VH-HCγ1과 HCMV-VL-HCκ를 들 수 있고, 이외에 pSV2neo(국제 특허출원 공개 제WO92-19759호)에서 유도된 것을 들 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 포유동물 세포의 유전적 발현의 기타 프로모터들의 예로는 사람 폴리펩티드 사슬 연장인자-1α(HEF-1α) 등의 포유동물 세포에서 유래한 프로모터 뿐만 아니라, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 및 사이미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터가 있다. 예를들면, SV40 프로모터를 사용하는 경우에는 Mulligan, R.C. 등(Nature, 277, 108-114, 1979)의 방법에 따라 발현하거나, 또는 HEF-1α 프로모터를 사용하는 경우에는 Mizushima, S. 등(Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990)의 방법에 따라 발현시킬 수 있다.

본 발명의 유용한 프로모터의 또다른 특정한 예는 HEF-1α 프로모터이다. HEF-VH-gγ1 및 HEF-VL-gκ(도 1)는 이 프로모터를 함유하는 발현벡터에 포함된다. 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, SV40 또는 소 파필로마 바이러스(BPV) 등에서 유래하는 DNA 서열은 리플리케이터 포인터로서 사용할 수 있다. 또한, 숙주 세포에서 유전자 복제의 수를 증폭하기 위하여 아미노글루코시드-3'-포스포트랜스퍼라제, 네오-내성 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, E. coli 크산틴-구아닌 포스포리보실-트랜스퍼라제(XGPRT) 유전자 또는 디히드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 선택 마커로서 사용할 수 있다.

요약하면, 먼저 본 발명은 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역과 H 사슬 V 영역 이외에, 상기 L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA와 상기 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA를 제공한다. 이들은 사람/마우스 키메라 항체와 사람 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제조하는데 유용하다. 모노클로날 항체의 예로는 WS-4가 있다. L 사슬 V 영역은, 예를들면 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 가지며, H 사슬 V 영역은, 예를들면 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 가진다. 이러한 아미노산 서열은, 에를들면 서열번호 26과 27 각각에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드된다.

본 발명의 사람 IL-8에 대한 키메라 항체는,

(1) 사람 L 사슬 C 영역과 마우스 L 사슬 V 영역; 및

(2) 사람 H 사슬 C 영역과 마우스 H 사슬 V 영역으로 이루어진다.

마우스 L 사슬 V 영역, 마우스 H 사슬 V 영역 및 이들을 코드하는 DNA는 상기한 바와 같다. 상기한 사람 L 사슬 C 영역으로는 어떠한 사람 L 사슬 C 영역도 가능하며, 예를들면 사람 Cκ 및 Cλ 영역이 있다. 상기한 사람 H 사슬 C 영역으로는 어떠한 사람 H 사슬 C 영역도 가능하며, 예를들면 사람 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 영역이 있다(Ellison, J. et al., DNA, 1, 11-18(1981), Takahashi, N. et al., Cell, 29, 671-679(1982); Krawinkel, U. et al., EMBO J., 1, 403-407(1982)).

키메라 항체를 제조하기 위하여 2가지 형태의 발현벡터를 제조하였다. 즉, 발현 조절영역의 인핸서/프로모터 형태의 조절 하에서 마우스 L 사슬 V 영역과 사람 L 사슬 C 영역을 코드 하는 DNA를 함유하는 발현벡터와 발현 조절영역의 인핸서/프로모터 형태의 조절 하에서 마우스 H 사슬 V 영역과 사람 H 사슬 C 영역을 코드 하는 DNA를 함유하는 발현벡터이다. 다음으로, 포유동물 세포의 상기 방법에서의 숙주 세포를 상기한 발현벡터로 동시에 형질전환하고, 형질전환된 세포를 생체 내 또는 시험관 내에서 배양하여 키메라 항체를 제조하였다.

임의로, 마우스 L 사슬 V 영역과 사람 L 사슬 C 영역을 코드하는 DNA와 마우스 H 사슬 V 영역과 사람 H 사슬 C 영역을 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입할 수 있고, 숙주 세포는 이 벡터를 사용하여 형질전환하고, 이러한 형질전환된 세포는 그 다음에 생체 내 또는 시험관 내에서 배양하여 키메라 항체를 제조하였다.

본 발명에 따른 재구성 사람 WS-4 항체는,

(A) (1) 사람 L 사슬 C 영역과,

(2) 사람 L 사슬 FRs과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬 CDR로 이루어지는 L 사슬 V 영역 각각으로 이루어진 L 사슬; 및

(B) (1) 사람 H 사슬 C 영역과,

(2) 사람 H 사슬 FRs과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 LH 사슬 CDR로 이루어지는 H 사슬 V 영역 각각으로 이루어진 H 사슬로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 L 사슬 CDR은 표 5에서 정의된 아미노산 서열의 범위 내에서 서열번호 26에 나타난 아미노산 서열 내에 있고, H 사슬 CDR은 표 5에 정의된 아미노산 서열의 범위 내에서 서열번호 27에 나타난 아미노산 서열 내에 있고, 사람의 L 사슬 FR은 REI에서 유도되고, 사람의 H 사슬 FR1, FR2 및 FR3는 VDH26에서 유도되고, FR4는 4B4에서 유도되고, 사람의 L 사슬 C영역은 사람의 Cκ 영역이고, 사람의 H 사슬 C 영역은 사람의 Cγ1 영역이다. 또한, 사람의 H 사슬 C 영역은 사람의 Cγ4 영역일 수 있고, 방사선 동위원소가 사람의 L 사슬 C 영역 및/또는 사람의 H 사슬 C 영역 대신에 결합할 수 있다.

특정 항원에 대해 충분한 활성을 갖는 재구성 사람 항체를 제조하기 위하여 상기한 사람 FR의 아미노산 서열 일부를 치환하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, L 사슬 V 영역은 표 2의 RVLa 또는 RVLb으로 나타난 아미노산 서열을 갖는 반면, H 사슬 V 영역은 표 3과 표 4의 RVHa, RVHb, RVHc, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg 또는 RVHh으로 나타난 아미노산 서열을 갖는다. 또한, H 사슬 V 영역 FR2의 41 위치에 있는 아미노산은 프롤린이고 47 위치에 있는 아미노산은 트립토판이거나, 및/또는 상기 FR3의 67 위치에 있는 아미노산은 페닐알라닌이고, RVHb, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg 또는 RVHh로 나타난 아미노산 서열을 갖는 아미노산이 더욱 바람직하다. RVHg가 H 사슬 V 영역으로 존재하는 아미노산이 가장 바람직하다.

재구성 항체를 생산하기 위하여 2가지 형태의 발현벡터를 제조하였다. 즉, 발현 조절영역의 인핸서/프로모터 형태에 의한 조절 하에 앞서 정의한 재구성 사람 L 사슬을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터와 발현 조절영역의 인핸서/프로모터 형태에 의한 조절 하에 앞에서 정의한 재구성 사람 H 사슬을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터를 제조하였다. 그 다음에, 포유동물 세포 등의 숙주 세포가 이러한 발현벡터에 의해 동시에 형질전환되고, 형질전환된 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 배양되어 재구성 사람의 항체를 생성한다.

또는, 재구성 사람 L 사슬을 코드하는 DNA와 재구성 사람의 H 사슬을 코드하는 DNA를 단일한 발현벡터에 삽입하면 숙주 세포는 상기 벡터를 사용하여 형질전환되고, 형질전환된 세포는 생체내 또는 시험관 내에서 배양되어 목적인 재구성 사람의 항체를 생성한다.

상기한 방법으로 생성된 키메라 항체 또는 재구성 사람의 항체는 단백질 A 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과법 등의 통상적인 방법으로 단리하여 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 키메라 L 사슬 또는 재구성 사람의 L 사슬은 H 사슬과 결합하여 완전한 항체를 제조하는 데에 사용할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 키메라 H 사슬 또는 재구성 사람의 H 사슬은 L사슬과 결합하여 완전한 항체를 제조하는 데에 사용할 수 있다.

마우스의 L 사슬 V 영역, 재구성 사람의 L 사슬 V 영역, 마우스의 H 사슬 V영역과 재구성 사람의 H 사슬 V 영역은 본래 사람의 IL-8 형태로 항원과 결합하는 고유 영역이다. 이들은 단독 또는 다른 단백질과의 융합 단백질 형태로 제약, 진단 약물로 유용할 것으로 간주된다.

또한, 본 발명에 따른 L 사슬 V 영역 CDR과 H 사슬 V 영역 CDR은 사람의 IL-8 형태로 항원에 결합하는 고유 부분이다. 이들은 단독 또는 다른 단백질과의 융합 단백질 형태로 제약, 진단 약물로 유용할 것으로 간주된다.

본 발명의 마우스의 L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA는 키메라 L 사슬을 코드하는 DNA, 또는 재구성 사람의 L 사슬을 코드하는 DNA의 제조에 유용하다. 마찬가지로, 마우스의 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA는 키메라 H 사슬을 코드하는 DNA 또는 재구성 사람의 H 사슬을 코드하는 DNA의 제조에 유용하다. 또한, 본 발명의 L 사슬 V 영역 CDR을 코드하는 DNA는 재구성 사람의 L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA 또는 재구성 사람의 L 사슬을 코드하는 DNA의 제조에 유용하다.

마찬가지로, 본 발명의 H 사슬 V 영역 CDR을 코드하는 DNA는 재구성 사람의 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA와 재구성 사람의 H 사슬을 코드하는 DNA의 제조에 유용하다. 또한, H 사슬과 L 사슬의 Fv를 결합시키는 재구성 사람의 항체인 F(ab')₂, Fab 또는 Fv, 또는 단일 사슬 Fv는 적합한 숙주에서 생성되고 상기한 목적으로 사용될 수 있다(예를 들면 Bird, R.E.et al., TIBTECH,9, 132-137, 1991 참조).

단일 사슬 Fv는 재구성 사람의 항체 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역을 사람의 IL-8에 연쇄시켜서 이루어진다. 이러한 단일 사슬 Fv에서, H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 링커에 의해 연쇄되고, 바람직하게는 펩티드 링커에 의해 연쇄된다(Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988).

상기한 단일 사슬 Fv의 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 재구성 사람의 항체 H 사슬과 L 사슬 V 영역의 하나일 수 있다. 이러한 구체적인 예에는 서열번호 38, 41, 44, 45, 48, 51과 54에 기재된 아미노산 서열로 구성된 H 사슬 V 영역과 서열번호 62 또는 65에 기재된 아미노산 서열로 구성된 L 사슬 V 영역을 함유하는 단일 사슬 Fv을 포함한다(제WO88-009344호 참조).

상기 V 영역은 바람직하게는 펩티드 링커로 연쇄된다. 사용되는 펩티드 링커의 예로는 12 내지 19 잔기로 구성된 임의의 단일 사슬 펩티드 등을 포함한다.

단일 사슬 Fv을 코드하는 DNA는 템플레이트로서 재구성 사람의 항체 H 사슬 또는 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA와 상기 재구성 사람의 항체 L 사슬 또는 L 사슬 V 영역을 사용하는 것과, 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 PCR로 양 말단을 정의한 한 쌍의 프라이머를 사용하여 증폭시키는 것과, H 사슬과 L 사슬을 연결하기 위해 폴리펩티드 링커를 양 말단에서 코드하는 DNA를 정의하는 한 쌍의 프라이머를 결합하여 증폭시키는 것에 의해 얻어진다.

또한, 단일 사슬 Fv을 코드하는 DNA가 제조되면 발현벡터에 의해 형질 변환된 숙주와 함께 이들을 함유하는 발현벡터가 통상적인 방법으로 얻어진다. 또한, 단일 사슬 Fv는 상기 숙주를 사용하여 통상적인 방법으로 얻을 수 있다.

항체 분자와 비교하여, 단일 사슬 Fv는 향상된 조직으로의 침투성을 나타내며, 방사선 동위 원소로 표지하여서 이미지화에 사용될 것으로 예상되고, 재구성 사람의 항체에 대해 유사한 기능을 갖는 치료제로 사용될 것으로 예상된다.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(Enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 또는 형광 항체 기술이 본 발명의 IL-8에 대한 키메라 항체, 재구성 사람의 항체와 그 F(ab')₂, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv의 결합 활성도의 확인에 사용될 수 있다. 예를들면, 키메라 항체와 재구성 사람 항체로의 효소 면역분석을 사용할 경우에는 사람의 IL-8을 안티-사람 IL-8 폴리클로날 항체로 피복된 배지에 첨가하고, 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체 또는 재구성 사람의 항체를 생성하는 세포의 배양 상징액 또는 정제 샘플을 첨가하고, 알칼리성 탈 인산가수 분해 효소 등의 효소로 표지한 적합한 2차 항제를 첨가한다. 배지를 보온하고 세척한 후에 p-니트로페닐포스페이트 등의 효소 기질을 첨가하고 흡수도를 측정하여 항원 결합 활성도를 평가한다.

사람의 IL-8에 대한 키메라 항체, 재구성 사람의 항체, 및 그 F(ab')2, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv의 IL-8 결합 억제 활성도는 통상적인 리간드 수용기 결합 억제 분석에 의해 평가된다. 예를 들면, 호중구에 있는 IL-8 수용기에 대한 IL-8 결합억제를 분석하기 위해서 헤파린을 가한 혈액으로부터 원심 분리 또는 다른 방법으로 얻은 호중구를 분리한 후에 상기한 분석에서 사용할 수 있는 적합한 수를 갖는 세포 현탁액을 제조한다.

¹²⁵I 등으로 적합하게 표지한 IL-8과 표지하지 않는 IL-8을 함유한 용액을 적합한 농도로 제조한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 함유한 용액과 함께 혼합하고, 이 혼합물을 상기 호중구 현탁액에 첨가한다. 일정 시간 후에 호중구를 분리하고, 호중구에 있는 표지된 활성도를 분석한다.

Grob, P.M.et al., J. Biol.Chem., 265, 8311-8316, 1990에 기재된 방법과 같은 공지의 통상적인 방법을 본 발명의 항체 또는 그 단편에 의한 호중구 주화성의 억제를 평가하기 위해 사용할 수 있다.

시판되는 주화성 연소실을 사용하는 경우에는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 적합한 배양 매질로 희석한 후에 IL-8을 상기 연소실에 첨가하고 희석 항체 또는 그 단편을 첨가한다. 그 다음에, 제조한 호중구 현탁액을 연소실에 첨가하고 일정 기간동안 방치한다. 이동하는 호중구는 연소실에 설치한 여과기에 점착하기 때문에, 이러한 호중구의 수는 착색 또는 형광 항체 방법 등의 통상적인 방법으로 평가할 수 있다. 또한, 측정은 현미경을 사용한 극미 평가 또는 기계를 사용한 자동 측정에 의해 실시된다.

박막 여과기를 사용한 여과에 의해 멸균한 후, 본 발명에 따른 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체, 재구성 사람의 항체와 그 F(ab')2, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편을 제약적 치료제로서 바람직하게는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복막내 주사 또는 피하 주사 또는 분사기 등을 사용한 기관 침투 등의 비경구적인 방법으로 투여한다. 환자의 연령과 증상에 따라 다양하지만, 사람의 정상적인 복용량은 1 내지 1000mg/body이고, 1 내지 10mg/kg/week의 분할 복용량을 선택할 수 있다.

이들의 정제된 결합 활성도를 평가한 후에, 본 발명의 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체, 재구성 사람의 항체와 그 F(ab')2, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편이 생리적 활성 단백질의 제조에 사용되는 통상적인 방법에 의해 제약적 치료제로 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사 제제물은 사람의 IL-8에 대한 정제된 키메라 항체, 재구성 사람의 항체 또는 그 F(ab')2, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편을 생리식염 용매 또는 완충 용매 등에 용해시키고, 트윈 80, 젤라틴 또는 사람의 혈청 알부민(HSA) 등의 비흡착제를 첨가하는 것으로 이루어진다. 또는, 상기 제제물을 사용하기 전에 용해용과 재조합용으로 동결-건조할 수 있다. 동결-건조에 사용되는 담체의 예로 만니톨과 글루코즈 등의 당-알코올 또는 당이 있다.

상기한 바와 같이 재구성 사람 항체가 치료 목적에 유용한 것으로 기대되지만 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체는 알려져 있지 않다. 재구성 사람 항체를 제조하기 위한 임의의 항체에 일반적으로 적용될 수 있는 기준 방법 또한 없다. 그러므로, 특이적 항원에 대하여 충분한 결합 활성 및/또는 중화 활성을 나타내는 재구성 사람 항체를 제조하기 위하여는 다양한 계획이 필요하다(예를 들면, Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993). 본 발명은 면역원성이 낮은 사람의 IL-8에 대한 항체를 제공하는 것이다.

본 발명은 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 상기한 재구성 사람 항체의 제조방법에 유용한 사람/마우스 키메라 항체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 재구성 사람 항체의 절편을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 키메라 항체와 재구성 사람 항체 및 이들의 절편을 제조하기 위한 발현 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명은 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체와 그의 절편의 제조방법 및 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체와 그의 절편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은

(1) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역; 과

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역을 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 사람 L 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬; 및

(2) 사람 H 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역으로 이루어진 H 사슬을 제공한다.

본 발명은 또한,

(1) 각각 사람 L 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬들과;

(2) 각각 사람 H 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역으로 이루어진 H 사슬들로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬 V 영역과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬 V 영역을 제공한다.

본 발명은

(1) 사람 L 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬; 및

(2) 사람 H 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬 V 영역으로 이루어진 H 사슬을 제공한다.

본 발명은 또한,

(1) 각각 사람 L 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬들과;

(2) 각각 사람 H 사슬 C 영역과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬 V 영역으로 이루어진 H 사슬들로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 키메라 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 사람의 IL-8에 대한 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR을 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR을 제공한다.

본 발명은

(1) 사람 L 사슬 V 영역의 구조영역(FRs)과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 L 사슬 V 영역, 및

(1) 사람 H 사슬 V 영역의 구조영역(FRs)과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 H 사슬 V 영역을 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 사람 L 사슬 C 영역과;

(2) 사람 L 사슬 FR과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 CDR로 이루어진 L 사슬 V 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 L 사슬, 및

(1) 사람 H 사슬 C 영역과;

(2) 사람 H 사슬 FR과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 CDR로 이루어진 H 사슬 V 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 H 사슬을 제공한다.

본 발명은

(A) 각각 (1) 사람 L 사슬 C 영역과 (2) 사람 L 사슬의 FR 및 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬의 CDR로 이루어진 L 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬과;

(B) 각각 (1) 사람 H 사슬 C 영역과 (2) 사람 H 사슬의 FR과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬의 CDR로 이루어진 H 사슬 V 영역으로 이루어진 H 사슬로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은

(1) 다음 서열 또는 그 일부를 가지는 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬 V 영역의 CDR과;

CDR1 : Arg Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

CDR2 : Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp

CDR3 : Gln His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr

(2) 다음 서열 또는 그 일부를 가지는 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬 V 영역의 CDR을 제공한다.

CDR1 : Asp Tyr Tyr Leu Ser

CDR2 : Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly

CDR3 : Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala Tyr

또한, 본 발명은

(1) 사람 L 사슬 V 영역의 구조영역(FR)과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬 V 영역의 CDR로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 L 사슬 V 영역; 및

(1) 사람 H 사슬 V 영역의 구조영역(FR)과;

(2) 사람의 IL-8에 대한 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬 V 영역의 CDR로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 H 사슬 V 영역을 제공한다.

본 발명은 또한,

(1) 사람 L 사슬 C 영역과;

(2) 사람 L 사슬의 FR과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬의 CDR로 이루어진 L 사슬 V 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 L 사슬; 및

(1) 사람 H 사슬 C 영역과;

(2) 사람 H 사슬의 FR과 사람의 IL-8에 대한 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬의 CDR로 이루어진 H 사슬 V 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 재구성 사람 H 사슬을 제공한다.

또한 본 발명은

(A) 각각 (1) 사람 L 사슬 C 영역과 (2) 사람 L 사슬의 FR 및 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 L 사슬의 CDR로 이루어진 L 사슬 V 영역으로 이루어진 L 사슬과;

(B) 각각 (1) 사람 H 사슬 C 영역과 (2) 사람 H 사슬의 FR과 사람의 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체 WS-4의 H 사슬의 CDR로 이루어진 H 사슬 V영역으로 이루어진 H 사슬로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제공한다.

상기한 사람 L 사슬의 FR의 예로는 다음 아미노산 서열 또는 그 일부를 가지는 것들이 있다:

FR1 : Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

FR2 : Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

FR3 : Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

FR4 : Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 또는,

FR2 : Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

FR3 : Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

FR4 : Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

상기한 사람 H 사슬의 FR의 예로는 다음 아미노산 서열 또는 그 일부를 가지는 것들이 있다:

FR1 : Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Gly

FR3 : Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser;

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR3 : Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Seu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser;

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Gly

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser;

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser;

FR2 : Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser;

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR3 : Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser; 또는

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser; 또는,

FR2 : Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

FR4 : Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

본 발명은 상기한 여러가지 항체를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 이들의 절편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기한 DNA를 함유하는 벡터에 관한 것으로, 예를들면 발현벡터가 있다. 또한, 본 발명은 상기한 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 제공한다.

본 발명은 또한 사람 IL-8에 대한 키메라 항체와 그의 절편을 제조하는 방법 및, 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체와 그의 절편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

다음에 기재된 실시에는 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위를 다음 실시예에 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

사람 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V 영역을 코드하는 DNA의 클로닝

사람 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA를 다음에 설명한 방법으로 클론하였다.

1. 전체 RNA의 제조

전체 RNA를 Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979에 기재된 Chirgwin, J.M. 등의 염화세슘 밀도차 원심분리방법을 변형하여 하이브리도마 WS-4로부터 제조하였다.

즉, 1×10⁷하이브리도마 WS-4 세포를 4M 구아니딘 티오시아네이트(Fluka) 25㎖내에서 완전히 균질화하였다. 균질액을 원심 분리 튜브에 있는 5.7M 염화세슘 용액위에 적층시키고 RNA를 베크만 SW 40 로터에서 14시간 동안 20℃에서 31,000rpm으로 원심분리하여 침전시켰다.

RNA 침전물을 80% 에탄올로 세척하고, 10mM EDTA와 0.5% N-라우릴사르코신산 나트륨을 함유한 20mM 트리스-HCl(pH 7.5) 200㎕에 용해시켰다. 프로테나제(Boehringer)를 0.5mg/㎖ 농도로 첨가한 후에, 발생한 혼합물을 37℃의 수조에서 30분동안 배양하였다. 혼합물을 페놀과 클로로포름으로 추출하고, RNA를 에탄올로 침전시켰다. 그 다음에, RNA 침전물을 1mM EDTA를 함유한 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)200㎕에 용해하였다.

2. 메신저 RNA(mRNA)의 추출

마우스의 모노클로날 항제 WS-4의 H 사슬을 코드하는 mRNA를 추출하기 위해서, 다(A)-양성 mRNA를 고속 트랙 mRNA 단리 장치 버젼 3.2(Invitrogen)를 사용하여 사용 설명서에 기재된 절차에 따라서 상기 1 단계에서 획득한 전체 RNA로부터 추출하였다.

3. 단일가닥 cDNA의 합성

단일가닥 cDNA를 cDNA 사이클 장치(Invitrogen)를 사용하여 설명서에 기재된 절차에 따라 상기 2 단계에서 회득한 mRNA 약 40ng으로 합성하였다. 그 다음에, 발생한 생성물을 마우스의 H 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA를 증폭하기 위해 사용하였다. 또한, 마우스의 L 사슬 V영역을 코드하는 cDNA를 증폭하기 위해서, 단일가닥 cDNA를 상기의 전체 RNA 약 10㎍으로부터 합성하였다.

4. PCR에 의한 항체 변이 영역을 코드하는 유전자의 증폭

(1) 마우스의 H 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA의 증폭

서열번호 13 내지 24에 나타난 MHV(마우스의 헤비 가변역)의 프라이머 1 내지 12와 서열번호 25에 나타난 MHC(마우스의 헤비 불변역)의 프라이머(Jones, S.T. 등, Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 PCR 프라이머에 사용하였다. PCR 용액 100㎕에는 10mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 0.1mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5mM MgCl2, 0.001%(w/v) 젤라틴, DNA 폴리머라제 앰플리태크 5단위(Perkin Elmer Cetus), 0.25μM의 서열번호 13 내지 24에 나타난 MHV 프라이머 중의 하나, 75μM의 서열번호 25에 나타난 MCH 프라이머, 및 상기 3단계에서 획득한 1.5μM 단일가닥 cDNA 용액이 함유되어 있다. PCR 용액을 각각 MHV 프라이머 1 내지 12을 위해 제조하였다. 각 용액을 미네랄 오일 50㎕로 회수한 후에, 94℃의 처음 온도에서 약 3분동안 가열하고 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분을 1주기로 하였다. 상기 가열 주기를 20회 반복한 후에, 반응 혼합물을 추가의 10분동안 72℃에서 보온하였다.

(2) 마우스의 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA의 증폭

서열번호 1 내지 11에 나타난 MKV(마우스의 카파 가변역)의 프라이머 1 내지 11과 서열번호 12번에서 나타난 MKC(마우스의 카파 불변역)의 프라이머를 PCR 프라이머에 사용하였다.

cDNA의 증폭은 0.25μM의 MKV 프라이머 혼합물과 3.0μM MCK 프라이머 각각을 사용하여 증폭을 실시하는 것을 제외하고 상기 4 단계 (1)부에서 H 사슬 V 영역 유전자의 증폭에서 기재된 것과 동일한 방법으로 상기 3단계에서 회득한 단일가닥 cDNA 2.0㎕로부터 실시하였다.

5. PCR 생성물의 정제 및 절편화

상기 PCR에 의해 증폭된 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역의 DNA 절편 각각을 1.5%의 저융점 아가로즈(Sigma)를 사용하여 아가로즈 전기 영동에 의해 분리하였다. 길이가 약 450bp인 H 사슬 DNA 절편과 길이가 약 400bp인 L 사슬 DNA 절편을 함유하는 아가로즈 편(片)을 분리하여 절단하고, 65℃에서 5분동안 융해시킨 후에 2mM EDTA와 300mM NaCl을 함유한 20mM 트리스-HCl(pH 7.5)를 동량으로 첨가하였다.

상기 혼합물을 에탄올과 클로로포름으로 추출하고, DNA 절편을 에탄올 침전으로 회수하고, 1mM EDTA를 함유한 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 용해하였다. 그 다음에, 상기 절편을 10mM MgCl₂, 및 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.9)에 있는 제한 효소 XmaI(New England BioLabs) 5단위를 사용하여 37℃에서 3분동안 소화시켰다. 그 다음에, 상기 DNA 절편을 제한효소 SalI(Takara Shuzo) 40단위를 사용하여 37℃에서 2시간동안 소화시키고, 그 결과로 발생한 DNA 절편을 1.5% 저융점 아가로즈(Sigma)를 사용하여 아가로즈 전기 영동에 의해 분리하였다.

DNA 절편을 함유하는 아가로즈 편을 절단하고, 65℃에서 5분동안 융해시킨 후에, 2mM EDTA와 300mM NaCl을 함유한 20mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 동량으로 첨가하였다. 그 다음에, 이 혼합물을 페놀과 클로로포름으로 추출하고, 상기 DNA 절편을 에탄올 침전으로 회수하고, 1mM EDTA를 함유한 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 용해하였다.

따라서, 마우스의 κ-형 L 사슬 V 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 절편과 마우스의 H 사슬 V 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 절편을 각각 획득하였다. 상기 DNA 절편 모두는 5' 말단에 SalI 접착부를 갖고, 3' 말단에 XmaI 접착부를 갖는다.

6. 연쇄 및 형질전환

상기 방법으로 제조한 마우스의 카파-형 L 사슬 V 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 SalI-XmaI DNA 절편 약 0.3㎍을 SalI, XmaI 및 대장균(Escherichia coli)의 알칼리성 포스파타제(BAP; Takara Shuzo)로 소화시켜 제조한 pUC19 벡터(Takara Shuzo) 약 0.1㎍과 T4 DNA 리가제(Gibco BRL) 1 단위를 함유한 완충 반응 혼합물 내에서 16℃로 하여 4시간동안 혼합하고 추가 완충제를 첨가하여 연쇄시켰다.

다음에, 대장균 DH5α(Gibco BRL) 50㎕을 30분동안 얼음에 방치하고 1분동안 42℃에, 다시 1분동안 얼음에 방치한 후에, 여기에 상기 연쇄 혼합물 5㎕을 첨가하였다. 그 다음에, 2×YT 배지(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 400㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 보온한 후에, 대장균을 암피실린(Meiji Seika) 50㎍/㎖을 함유한 2×YT 아가 배지(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 상에 도포하고, 하룻밤 동안 37℃에서 보온하여 대장균의 형질전환체를 획득하였다.

이어서, X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드, Takara Shuzo) 50㎍을 이 때의 선택 마커로서 사용하였다.

상기 형질전환체를 암피실린 50mg/㎖를 함유하는 2×YT 배지 10㎖에서 하룻밤 동안 37℃에서 보온하고, 플라스미드 DNA를 QIAGEN 플라스미드 소형 장치(QIAGEN)를 사용하여 상기 배양물로부터 제조하고, 설명서에 따라 실시하였다.

상기 방법으로 획득한 하이브리도마 WS-4에서 생긴 마우스 κ-형 L 사슬 V 영역을 코드하는 유전자를 함유한 플라스미드를 pUC-WS4-VL로 명명하였다.

대장균 적응 세포 대신에 JM109를 사용하는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법을 사용하여 하이브리도마 WS-4에서 유래한 마우스의 H 사슬 V 영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 SalI-Xmal DNA 절편으로부터 제조하였다. 발생한 플라스미드를 pUC-WS4-VH로 명명하였다.

[실시예 2]

DNA 뉴클레오티드 서열의 결정

상기 플라스미드에 있는 cDNA 코드화 영역의 뉴클레오티드 서열을 서열 프라이머인 M13 프라이머 RV와 M13 프라이머 M4(모두 Takara Shuzo), 자동 DNA 서열장치(Applied Biosystems Inc.) 및 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle 서열장치(Apllied Biosystems Inc.)를 제조자가 설명한 안내서에 따라 사용하여 결정하였다. 플라스미드 pUC-WS4-VL에 함유된 마우스의 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26번에 나타나 있다. 또한, 플라스미드 pUC-WS4-VH에 함유된 마우스의 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 27번에 나타나 있다.

[실시예 3]

CDR의 결정

L 사슬 및 H 사슬 V 영역의 기본 구조는 서로 유사성을 가지는데, 각각은 3개의 초가변 영역, 즉 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 구조영역을 가진다. 구조영역의 아미노산 서열은 상대적으로 잘 보존되지만, CDR 영역의 아미노산 서열은 가변성이 매우 높다(Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, 1991).

상기 사실에 근거하여, 사람의 IL-8에 대한 마우스의 모노클로날 항체의 가변영역 아미노산 서열을 Kabat 등에 의해 제조된 항체의 아미노산 서열에 대한 데이타 베이스와 비교하므로써 상동성을 조사하여서 표 5에 나타난 바와 같이 CDR을 결정하였다.

[실시예 4]

클론된 cDNA의 발현 확인(키메라 WS-4 항체의 제조)

발현벡터의 제조

키메라 WS-4 항체를 발현하는 벡터를 제조하기 위해서, 마우스 WS-4의 L 사슬과 H 사슬 V 영역을 각각 코드하는 cDNA 클론, pUC-WS4-VL과 pUC-WS4-VH를 PCR에 의해 변성하였다. 그 다음에, 이들을 HEF 발현벡터(상기한 제WO92-19759호 및 도 1에 기재)에 삽입하였다.

L 사슬 V 영역에 대한 뒤쪽 프라이머(서열번호 28)와 H 사슬 V 영역에 대한 뒤쪽 프라이머(서열번호 29)를 V 영역의 선두 서열 시초를 코드하는 DNA로 각각 혼성시키고, Kozak 교감 서열(Kozak, M. et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987)와 HindⅢ 제한 부위를 갖도록 배열하였다. L 사슬 V 영역에 대한 앞쪽 프라이머(서열번호 30)와 H 사슬 V 영역에 대한 앞쪽 프라이머(서열번호 31)를 J 사슬의 말단을 코드하는 DNA 서열로 혼성시키고, 접합 공급체 서열과 BamHI 제한 부위를 첨가하도록 배열하였다.

20mM 트리스-HCl(pH 8.2), 10mM KCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 1% 트리톤 X-100, 100μM dNTPs, 1.5mM MgCl₂, 각 프라이머 100pmole씩, 템플레이트 DNA(pUC-VL 또는 pUC-VH) 100ng 및 앰플리태크 효소 2.5U를 함유하는 PCR 반응 혼합물 100㎕을 광유 50㎕으로 차폐시켰다. 94℃에서 3분동안 처음 변성시킨 후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 이루어진 가열 주기를 30회 반복하고 72℃에서 10분동안 최종 보온을 하였다.

PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, HindⅢ와 BamHI로 소화시켰다. 상기 L 사슬 V 영역을 HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ에 클론화시키는 반면, H 사슬 V 영역을 HEF 발현벡터 HEF-VH-gγ1에 클론화시켰다. DNA 서열을 결정한 후, 정확한 DNA 서열을 갖는 DNA 절편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-chWS4L-gκ와 HEF-chWS4H-gγ1로 명명하였다.

COS 세포로의 감염

키메라 WS-4 항체의 일시 발현을 관찰하기 위해서, 상기 발현벡터를 COS 세포내에서 시험하였다. HEF-chWS4L-gκ와 HEF-chWS4H-gγ1을 동시에 유전자 펄서 시스템(BioRad)을 사용한 전기 영동에 의해 COS 세포에 감염시켰다. 각 DNA(10㎍)을 1×10⁷세포/㎖의 PBS를 함유한 분액 0.8㎖에 첨가하고, 정전 용량을 25μF으로 하여 1.5kV에서 진동시켰다.

실온에서 10분을 회수 주기로 한 후에, 전기 영동한 세포를 조직 배양 그릇에 있는 5% 송아지 γ-글로불린 유리 혈청을 함유한 DMEM 배양 매질(GIBCO) 15㎖에 현탁하였다. 96시간동안 보온한 후에 배양 매질을 선별하고, 세포 잔해는 원심분리하여 제거하고, 상청액은 구경이 0.4μm인 원판 필터(Gelman Science)에 여과하였다.

ELISA

항원 결합과 항체 농도를 측정하기 위한 ELISA 배지를 다음과 같이 제조하였다. 항원 결합 활성도를 측정하기 위한 ELISA 배지는 다음 방법으로 제조하였다. 완충제(0.1M 이탄산 나트륨, 0.02%의 아자이드 나트륨)의 고체층에 용해시킨 염소의 안티-사람 IL-8 폴리클로날 항체 100㎕을 사용하여 농도가 2㎍/㎖인 고체 층을 96-웰 배지(Nunc)의 각 웰에 형성시키고, 희석 완충제(50mM 트리스-HCl(pH 7.2), 1% 송아지 혈청 알부민(BSA), 1mM MgCl₂, 0.15M NaCl, 0.05% 트윈 20, 및 0.02% 아자이드 나트륨) 200㎕으로 차단한 후, 재구성 사람 IL-8(Amersham)(5ng/㎖) 100㎕을 첨가하였다.

키메라 항체의 정제 샘플 또는 이를 발현하는 COS 세포의 배양 상징액을 연속으로 희석시키고 각 웰에 첨가하였다. 그 다음에, 알칼리성 포스파타제를 표지화한 염소의 안티-사람 IgG 항체(TAGO)(1㎍/㎖) 100㎕을 첨가하였다. 보온 및 세척후에 기질 용액(1㎎/㎖ p-니트로페닐-포스페이트)을 첨가하고 405nm에서 흡수도를 측정하였다.

항체 농도를 측정하기 위해서, 96-웰 플레이트의 웰에 염소의 안티-사람 IgG 항체(TAGO) 100㎕으로 농도가 1㎍/㎖인 고체 층을 형성시키고 차단한 후에 키메라 항체의 정제 샘플 또는 이를 발현하는 COS 세포의 배양 배지를 연속으로 희석시키고 각 웰에 첨가하였다. 그 다음에, 알카리성 포스파타제로 표지한 염소의 안티-사람의 IgG 항체(TAGO)(1㎍/㎖) 100㎕를 첨가하였다. 보온 및 세척후에, 기질 용액(1㎎/㎖ p-니트로페닐포스페이트)을 첨가하고 405nm에서 흡수도를 측정하였다.

그 결과 키메라 항체 WS-4는 IL-8에 대해 특정 결합을 나타냈기 때문에, 이러한 키메라 항체는 마우스의 모노클로날 항체 WS-4의 V 영역의 정확한 구조를 갖는 것으로 간주되었다(도 2 참조).

또한, 부다페스트 협약의 규정에 따라 각각 FERM BP-4739와 FERM BP-4740 명칭으로 1994년 7월 12일에 Bioengineering Industrial Technology Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan)에 상기한 플라스미드 HEF-chWS4L-gκ를 갖는 대장균을 대장균 DH5α(HEF-chWS4L-gκ)로 기탁하였고, 상기 플라스미드 HEF-chWS4H-gγ1을 갖는 대장균은 대장균 JM109(HEF-chWS4H-gγ1)로 기탁되었다.

[실시예 5]

재구성 사람의 WS-4 항체의 제조

재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 제조

재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA를 다음에 기재한 방법으로 설계하였다. 재구성 사람의 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역을 코드하는 완전 DNA를 사람의 항체 VDH26의 FR1 내지 FR3과 사람의 항체 4B4을 각각 코드하는 공지의 DNA 서열이 마우스의 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR을 코드하는 DNA 서열과 연쇄되도록 설계하였다.

그 다음에, HindⅢ 인지 부위/코자크 컨센서스 서열과 BamHI 인지 부위/절편 공급체 서열을 각각 상기 DNA 서열의 5'면과 3'면에 첨가한 후에 HEF 발현벡터에 삽입하였다. 올리고뉴클레오티드 집합을 방해할 가능성이 있는 올리고 뉴클레오티드 2차 구조를 컴퓨터로 분석한 후에 상기 방법으로 설계된 DNA 서열을 4개의 거의 동등한 올리고뉴클레오티드로 분할하였다.

4개의 올리고뉴클레오티드 서열을 서열번호 32 내지 35에서 나타내었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 113 내지 143 염기의 길이를 갖고, 인접한 올리고 뉴클레오티드는 20개의 염기로 이루어진 상호 중복 영역을 갖는다. 상기 4개의 올리고뉴클레오티드의 HF1(서열번호 32)와 HF3(서열번호 34)은 센스 DNA 서열을 갖는 반면, 다른 HF2(서열번호 33)와 HF4(서열번호 35)은 안티센스 DNA 서열을 갖는다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동 DNA 합성기(Apllied Biosystems)에 의해 합성되었다.

또한, 상기 4개의 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 조합하는 방법이 도 3에 예시되어 있다. HF1와 HF2 및 HF3와 HF4를 각각 약 100ng씩 결합시키고, 최종 부피가 98㎕이고 2.5U Pfu DNA 폴리머라제를 함유한 PCR 반응 혼합물에 첨가하였다. 처음 3분동안 94℃에서 변성시킨 후, 상기 용액을 94℃에서 2분, 55℃에서 2분, 및 72℃에서 2분으로 이루어진 주기를 2 주기동안 보온하였다.

상기 PCR 반응 용액 부피의 1/2를 상호 대체한 후에 추가 보온을 2 주기동안 계속하였다. 외부 프라이머로 RVH5'프라이머(서열번호 36번)와 RVH3' 프라이머(서열번호 37번)을 각각 100pmole씩 외부 프라이머로 첨가한 후에 PCR 반응 용액을 광유 50㎕으로 차폐시켰다. 처음 3분동안 94℃에서 변성시킨 후에, 반응 용액을 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분으로 이루어진 보온 주기를 45회 반복한 후, 최종으로 72℃에서 10분동안 보온하였다.

약 450 염기쌍을 함유하는 DNA 절편을 1.5% 저융점 아가로즈 겔 상에서 정제하고, HindⅢ와 BamHI로 소화시키고, HEF 발현벡터 HEF-VH-g-γ에 클론화 시켰다(도 1). EF-1 프라이머(서열번호 66)와 HIP 프라이머(서열번호 67)를 사용하여 DNA 서열을 결정한 후에 H 사슬 V 영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 절편을 함유한 플라스미드를 HEF-RVHa-gγ1으로 명명하였다. 상기 플라스미드 HEF-RVHa-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드는 서열번호 38에 나타났다.

재구성 사람의 WS-4 항체의 H 사슬 V 영역의 각 버젼 "b", "c", "d", "e", "f", "g", 및 "h"은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

버젼 "b"(RVHb)은 47위치의 로이신이 트립토판, 양 말단을 정의하는 프라이머용으로 RVH5'(서열번호 36)와 RVH3'(서열번호 37), 및 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVHa-Gγ1으로 대체되어 플라스미드 HEF-RVHb-gγ1이 얻어지도록 배열한 변이 유발소 프라이머 LTW1(서열번호 39)와 LTW2(서열번호 40)을 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVHb-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열이 서열번호 41에 나타났다.

버젼 "c"는 41위치의 글루탐산이 플롤린, 및 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVHa-gγ1로 대체되어 플라스미드 HEF-RVHc-gγ1이 얻어지도록 배열된 변이 유발소 프라이머 QTP1(서열번호 42)와 QTP2(서열번호 43)을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVHc-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은 서열번호 44에 나타나 있다.

버젼 "d"는 변이 유발소 프라이머인 QTP1과 QTP2를 사용한 PCR과 템플레이트 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHb-gγ1를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHd-gγ1이 얻어졌다. 상기 플라스미드 HEF-RVHd-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 45에 나타내었다.

버젼 "e"는 40 위치의 알라닌이 프롤린, 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVHd-gγ1으로 대체되어 플라스미드 HEF-RVHe-gγ1이 얻어지도록 배열된 변이 유발소 프라이머 ATP1(서열번호 46)과 ATP2(서열번호 47)을 사용하여 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVHe-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 48에 나타내었다.

버젼 "f"는 44 위치의 글리신이 알라닌, 및 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVHd-gγ1에 의해 대체되어 플라스미드 HEF-RVHf-gγ1이 얻어지도록 배열된 변이 유발소 프라이머 GTA1(서열번호 49)와 GTA2(서열번호 50)을 사용하여 증폭되었다. 상기 HEF-RVHf-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 51에 나타내었다.

버젼 "g"는 67위치의 로이신이 페닐알라닌, 및 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVHg-gγ1로 대체되어 플라스미드 HEF-RVHg-gγ1이 얻어지도록 배열된 변이 유발소 프라이머 LTF1(서열번호 52)과 LTF2(서열번호 53)을 사용하여 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVHg-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 54에 나타내었다.

버젼 "h"는 변이 유발소 프라이머 LTF1과 LTF2, 및 플라스미드 HEF-RVHh-gγ1이 얻어지는 템플레이트 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHg-gγ1을 사용하여 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVHh-gγ1에 함유된 H 사슬 V 영역의 아미노산 사열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 55에 나타내었다.

재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 제조

재구성 사람 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 코드하는 DNA를 다음 방법으로 설계하였다. 재구성 사람의 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역을 코드하는 완전 DNA를 사람의 항체 REI의 FR을 코드하는 DNA 서열이 마우스의 WS-4 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR을 코드하는 DNA 서열과 연쇄되도록 배열하였다.

그 다음에, HindⅢ 인지 부위/코자크 컨센서스 서열과 BamHI 인지 부위/절편 공급체 서열을 상기 DNA 서열의 5'쪽과 3'쪽에 각각 첨가하여 DNA 서열이 HEF 발현벡터에 삽입될 수 있도록 하였다. 이러한 방법으로 설계된 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드의 2차 구조가 올리고뉴클레오티드의 조합을 방해할 수 있으므로 컴퓨터로 분석한 후에 4개의 거의 동등한 올리고뉴클레오티드로 분할 하였다.

4개의 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 56 내지 59에 나타내었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 106 내지 124 염기의 길이를 갖고, 인접한 올리고뉴클레오티드와 19 내지 23 염기로 이루어진 상호 중복 영역을 갖는다. 이러한 4개의 올리고뉴클레오티드의 LF1(서열번호 56)와 LF3(서열번호 58)은 센스 DNA 서열을 갖는 반면, 다른 LF2(서열번호 57)와 LF4(서열번호 59)은 안티센스 DNA 서열을 갖는다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 상기 HF1 내지 HF4의 경우와 동일한 방법을 사용하여 합성하였다.

조합하기 위해서, 4형태의 뉴클레오티드 각각 100ng씩과 앰플리태크 5U을 함유한 PCR 혼합물 98㎕을 94℃에서 3분동안 처음 변성시킨 후에, 상기 혼합물을 94℃에서 2분, 55℃에서 2분, 및 72℃에서 2분으로 이루어진 보온을 2주기 동안 보온하였다. PVL5'프라이머(서열번호 60번)와 RVL3' 프라이머(서열번호 61번) RKR 100pmole씩을 외부 프라이머로 첨가한 후에, PCR 반응 혼합물을 미네랄 오일 50㎕로 회수하였다. 94℃에서 3분동안 처음 변성한 후에, 반응 용액을 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분을 1주기로 하여 30회 동안 보온하고, 72℃에서 10분동안 최종 보온하였다(도 3 참조).

약 400 염기쌍을 함유한 DNA 절편을 1.5% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, HindⅢ과 BamHI로 소화시키고, HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ에 클론화 시켰다(도 1). EF-1 프라이머(서열번호 66)와 KIP 프라이머(서열번호 68)을 사용하여 DNA 서열을 결정한 후에 L 사슬 V 영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 절편을 함유한 플라스미드를 HEF-RVLa-gκ로 명명하였다. 상기 플라스미드 HEF-RVLa-gκ에 함유된 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 62에 나타내었다.

버젼 "b"(RVLb)는 71 위치의 페닐 알라닌이 티로신, 양 말단을 정의하는 프라이머인 RVL5'(서열번호 60)와 RVL3'(서열번호 61), 및 템플레이트 DNA인 플라스미드 HEF-RVLa-gκ에 의해 대체되어 플라스미드 HEF-RVLb-gκ이 얻어지도록 배열된 변이 유발소 프라이머 FTY1(서열번호 63)과 FTY2(서열번호 64)을 사용하여 증폭되었다. 상기 플라스미드 HEF-RVLb-gκ에 함유된 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 서열번호 65에 나타내었다.

재구성 사람의 WS-4 항체의 각 사슬 항원 결합 활성을 평가하기 위해서, 첫째로 COS 세포를 재구성 사람의 WS-4 항체의 L 사슬의 버젼 "a"에 대한 발현벡터 HEF-RVLa-gκ, 및 키메라 WS-4 항체의 H 사슬에 대한 발현벡터 HEF-chWS4H-gγ에 관련하여 상기한 방법으로 동시 감염시켰다. 상기와 마찬가지로 배양 배지를 선별한 후에 생성 항체의 양과 항원 결합 활성도를 상기 실시예 4의 ELISA 부분에서 기재한 방법을 사용하여 생성 항체에 대해 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군으로 사용된 키메라 항체(chL/chH)와 재구성 L 사슬, 키메라 H 사슬(RVLa/chH)로 이루어진 항체 간에는 항원 결합 활성의 차이가 없음이 확인되었다.

동시에, 키메라 WS-4 항체에 대한 발현벡터 HEF-chWS4L-gκ와 재구성 사람의 WS-4 항체의 H 사슬의 버젼 "a"의 결합을 측정하기 위해서, 2개 모두를 COS 세포에 CO 동시 전염시키고, 생성된 항체의 양과 항원 결합 활성도를 상기 실시예 4의 "ELISA" 부분에서 기재한 방법을 사용하여 발생한 항체에 대해 측정하였다. 항원 결합 활성도는 상기 항원(chL/RVHa)에 대해 증명되지 않았다(도 4 참조).

상기한 바와 같이, 재구성 사람의 WS-4 항체 L 사슬의 버젼 "a"는 키메라 WS-4 항원의 L 사슬의 버젼 "a"와 동일한 항원 결합 활성을 나타내기 때문에, 모든 재구성 H 사슬의 각 버젼의 평가는 재구성 H 사슬의 각 버젼과 재구성 사람의 WS-4 항체(RVLa)의 L 사슬의 버젼 "a"로 COS 세포를 동시에 전염시켜서 실시하였다.

결과적으로 재구성 H 사슬의 버젼 "b", "d", "e", "f", "g", 및 "h"를 갖는 상기 항체는 양성 대조군으로 사용된 키메라 WS-4 항원(chL/chH)의 경우에 필적하는 항원 결합 활성도를 나타내고, 따라서 상기 결합이 사람의 항체에서 기능적인 항원 결합 부위를 형성하는 것을 나타내었다. 그러나, 생성된 항체의 양과 관련하여, 버젼 "g"를 제외한 모든 버젼은 키메라 WS-4 항체(chL/chH)보다 적은 양으로 생성되었다. 또한, 항원 결합 활성도는 H 사슬의 버젼 "c"를 갖는 항체에서는 관찰되지 않았다(도 5 참조).

상기 발견에 근거하여, 재구성 사람의 WS-4 항체(RVLa)의 L 사슬의 버젼 "a"와 재구성 사람 WS-4 항체의 H 사슬의 버젼 "g"를 갖는 항체는 유리한 항원 결합 활성도를 나타내는 기능적인 항원 결합 부위를 수정하고, COS 세포로의 동시 전염 후에 키메라 WS-4 항체(chL/chH)에 필적하는 항체 생성 수준이 발현되는 것으로 결론지어졌다.

그 다음에, 재구성 사람의 WS-4 항체(RVLb)의 L 사슬의 "b" 버젼의 평가는 재구성 사람 WS-4 항체(RVLb)의 L 사슬의 버젼 "b"를 갖는 H 사슬의 각 버젼으로 COS 세포를 동시 감염시켜서 실시한다. 상기 결과는 재구성 사람의 WS-4 항체 중 H 사슬의 버젼 "g"를 갖는 항체(RVLb/RVHg)만이 양성 대조군으로 사용된 키메라 WS-4 항체(chL/chH)에 필적하는 항원 결합 활성도를 발현하는 것을 나타내었고, 이 결합이 사람의 항체내에 기능적인 항원 결합 부위를 형성하는 것으로 결론지어졌다. 또한, 생성 항체의 양에 대하여, 버젼 "g"(RVHg)을 제외한 모든 버젼은 키메라 WS-4 항체(chL/chH)보다 더 적은 양으로 생성되었다(도 6 참조).

상기 평가에 있어서, 사람의 IL-8에 대한 결합 활성도를 나타낸 재구성 사람의 항체의 2형태(RVLa/RVHg와 RVLb/RVHg)와 키메라 WS-4 항체(chL/chH)에 필적한 생성 정도를 실시예 4의 ELISA 부분에서 기재한 방법을 사용하여 정확하게 결합 활성도를 측정한 후에 각각 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. 상기 결과는 키메라 WS-4 항체(chL/chH), RVLa/RVHg 항체, 및 RVLb/RVHg 항체 전체가 동일 정도의 결합 활성도를 발현하는 것을 나타내었다(도 7 참조).

상기 발견에 근거하여, 재구성 사람의 WS-4 항체의 L 사슬의 버젼 "a"(RVLa) 또는 버젼 "b"(RVLb)와 재구성 사람의 WS-4 항체의 H 사슬의 버젼 "g"(RVHg)는 유리한 항원 결합 활성도를 발현하는 기능적인 항원 결합 부위를 수정하고, COS 세포로의 동시 전염 후에 항생 생성 정도가 키메라 WS-4 항체(chL/chH)에 필적하는 것으로 결론지어졌다.

재구성 사람의 WS-4 항체의 H 사슬의 버젼 "a"(RVLa)와 H 사슬의 버젼 "g"(RVHg), 또는 상기 L 사슬의 버젼 "b"(RVLb)와 상기 H 사슬의 버젼 "g"(RVHg)로 이루어진 재구성 사람 항체의 IL-8 수용기에 대한 IL-8 결합 억제의 활성도는 리간드 수용기 결합 억제 분석에 의해 평가되었다.

정상적인 대상의 헤파린을 가한 혈액 샘플 약 100㎖을 단 분리-다 분리 용액(ICN Biomedicals) 15㎖상에 분액 35㎖으로 적층시키고, 사람의 호중구 층을 첨부 안내서에 따라 원심분리기로 단리하였다. 이 세포를 1% BSA를 함유한 RPMI-1640 매질로 세척한 후에, 오염 적혈구를 150mM 염화 암모늄 용액으로 제거하였다. 원심분리후에, 세포를 1% BSA를 함유한 RPMI-1640으로 세척하고, 2×10⁷세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. Diff-Quik 착색제(Green Gross)와 함께 시토스핀(Shadon)을 사용하여 제조한 도말 표본종을 착색하여 상기 세포 현탁액의 호중구 함량을 측정한 결과, 95% 이상인 것으로 발견되었다.

상기 호중구 현탁액을 원심분리하고, 결합 완충제(1% BSA와 0.1% 아자이드 나트륨을 함유한 D-PBS)을 사용하여 2×10⁷농도로 재현탁하였다. 이 때에, 본 발명에 따른 사람의 항체의 것과 동일한 Fc 부분을 갖는 SK2 키메라 항체(국제 특허출원 제 PCT/JP94/00859호 참조)와 그 항체인 사람의 IL-6을 각각 약 50㎍/㎖와 약 40ng/㎖ 농도로 첨가하고, 호중구의 Fc 수용기를 예비 포화하기 위하여 얼음 용기에서 약 30분동안 보온하였다.

¹²⁵I으로 방사선 표지한 IL-8(74 TBq/mmol, Amersham)와 표지하지 않은 IL-8(Amersham)을 각각 4ng/㎖ 농도의 결합 완충제에서 혼합하여 제조하였다. 키메라 WS-4 항체(chL/chH), 재구성 사람 항체(RVLa/RVHg와 RVLb/RVHg), 음성 대조군인 사람의 항체(PAESEL+LOREI) 또는 양성 대조군인 마우스 WS-4 항체를 결합 완충제를 단계적으로 2배씩 희석한 2000ng/㎖ 내지 8ng/㎖의 농도에 각각 희석하였다. IL-8 용액 50㎕와 각 항체의 용액 50㎕을 얼음 용기에서 30분동안 보온하였다. 그 다음에, 상기 호중구 현탁액 100㎕을 첨가하고, 매 15분마다 혼합하면서 추가로 1시간 더 보온을 계속하였다. 보온 후에, 상기 세포 현탁액을 20% 사카로스 용액 200㎕상에 적층시킨 다음, 원심분리하고 동결하였다. 상기 세포에 결합한 IL-8을 측정하기 위해서, 세포 침전물을 버리고 감마 측정기(Aroka)를 사용하여 방사능을 측정하였다. 상기 결과를 도 8에 나타내었다.

재구성된 사람의 WS-4 항체의 L 사슬의 버젼 "a"(RVLa)와 H 사슬의 버젼 "g"(RVHg), 또는 상기 L 사슬의 버젼 "b"와 상기 H 사슬의 버젼 "g"를 갖는 항체는 IL-8 수용기에 대한 IL-8의 결합 측면에서 키메라 항체(chL/chH) 경우에 필적하는 결합 억제 활성도를 명백하게 나타내었다.

또한, 부다페스트 협약의 규정에 따라 각각 FERM BP-4738과 FERM BP-4741 명칭으로 1994년 7월 12일에 Bioengineering Industrial Technology Research Insitute of the Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan)에 상기한 플라스미드 HEF-RVLa-gκ을 가지는 대장균은 대장균 DH5α(HEF-RVLa-gκ)로 기탁되었고, 상기한 플라스미드 HEF-RVHg-gγ1을 함유하는 대장균은 대장균 JM109(HEF-RVHg-gγ1)으로 기탁되었다.

[대조예 1]

하이브리도마 WS-4의 제조

안티-사람 IL-8 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 통상적인 방법에 따라 사람의 IL-8으로 면역한 BALB/c 마우스의 비장 세포와 마우스의 골수종 세포 P3×63-Ag8.653을 융해시켜서 제조하였다. 하이브리도마 WS-4을 측정하는 판정 기준으로 사람 IL-8과의 결합 활성을 사용하여 스크리닝을 실시하였다(Ko, Y.C.et.al., J.Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992).

본 발명은 사람의 IL-8에 대한 재구성 사람 항체를 제공하는 것으로, 상기 항체에서 사람 항체의 V 영역의 CDR은 사람 IL-8에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR로 대체된다. 이러한 재구성 사람 항체의 대부분은 사람에서 유래하고 CDR은 본래 낮은 항원성을 갖기 때문에, 본 발명의 재구성 사람 항체는 사람에 대한 항원성이 낮고, 이 때문에 의약 치료에서 유용할 것으로 기대된다.

특허협력조약 국제 기탁당국의 제13항의 규정 하에 기탁된 미생물 목록 :

명칭 : National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology

주소 : 일본국, 이바라키, 츠쿠바, 히가시 1-초메 1-3

기탁 번호와 기탁 일자 :

(1) 대장균 DH5α (HEF-RVLa-gκ)

기탁 번호 : FERM BP-4738

기탁 일자 : 1994년 7월 12일

(2) 대장균 DH5α (HEF-chWS4L-gκ)

기탁 번호 : FERM BP-4739

기탁 일자 : 1994년 7월 12일

(3) 대장균 JM109 (HEF-chWS4L-gγ1)

기탁 번호 : FERM BP-4740

기탁 일자 : 1994년 7월 12일

(4) 대장균 JM109 (HEF-RVHg-gγ1)

기탁 번호 : FERM BP-4741

기탁 일자 : 1994년 7월 12일

[서열표]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 40

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV1

서열

ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40

서열번호 : 2

서열의 길이 : 39

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV2

서열

ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39

서열번호 : 3

서열의 길이 : 40

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV3

서열

ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40

서열번호 : 4

서열의 길이 : 43

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV4

서열

ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43

서열번호 : 5

서열의 길이 : 40

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV5

서열

ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40

서열번호 : 6

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV6

서열

ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37

서열번호 : 7

서열의 길이 : 41

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV7

서열

ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41

서열번호 : 8

서열의 길이 : 41

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV8

서열

ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41

서열번호 : 9

서열의 길이 : 35

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV9

서열

ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35

서열번호 : 10

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV10

서열

ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37

서열번호 : 11

서열의 길이 : 38

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKV11

서열

ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38

서열번호 : 12

서열의 길이 : 27

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MKC

서열

GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27

서열번호 : 13

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV1

서열

ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37

서열번호 : 14

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV2

서열

ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRATCAT SYTCTT 36

서열번호 : 15

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV3

서열

ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37

서열번호 : 16

서열의 길이 : 35

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV4

서열

ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35

서열번호 : 17

서열의 길이 : 40

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV5

서열

ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40

서열번호 : 18

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV6

서열

ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37

서열번호 : 19

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV7

서열

ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36

서열번호 : 20

서열의 길이 : 33

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV8

서열

ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33

서열번호 : 21

서열의 길이 : 40

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV9

서열

ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40

서열번호 : 22

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV10

서열

ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37

서열번호 : 23

서열의 길이 : 38

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV11

서열

ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38

서열번호 : 24

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : MHV12

서열

ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37

서열번호 : 25

서열의 길이 : 28

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : HMC

서열

GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

서열번호 : 26

서열의 길이 : 382

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : cDNA

서열의 명칭 : WS4VL

기원

생물명 : 마우스

직접적인 기원

클론명 : pUC-WS4-VL

특징 : 1..60 sig 펩티드

61..382 mat 펩티드

서열

서열번호 : 27

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : cDNA

서열의 명칭 : WS4VH

기원

생물명 : 마우스

직접적인 기원

클론명 : pUC-WS4-VH

특징 : 1..57 sig 펩티드

58..424 mat 펩티드

서열

서열번호 : 28

서열의 길이 : 34

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : chVL backward primer

서열

ACAAAGCTTC CACCATGAGT GTGCTCACTG AGGT 34

서열번호 : 29

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : chVH backward primer

서열

GATAAGCTTC CACCATGAAG TTGTGGTTAA ACTGGGT 37

서열번호 : 30

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : chVL forward primer

서열

CTTGGATCCA CTCACGTTTG AGTTCCAGCT TGGTGCC 37

서열번호 : 31

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : chVH forward primer

서열

GTCGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTGA CCAGAGT 37

서열번호 : 32

서열의 길이 : 137

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : HF1

서열

서열번호 : 33

서열의 길이 : 143

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : HF2

서열

서열번호 : 34

서열의 길이 : 113

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : HF3

서열

서열번호 : 35

서열의 길이 : 117

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : HF4

서열

서열번호 : 36

서열의 길이 : 37

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : RVH5' primer

서열

GATAAGCTTC CACCATGGAG TTTGGGCTGA GCTGGGT 37

서열번호 : 37

서열의 길이 : 31

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : RVH3' primer

서열

GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA C 31

서열번호 : 38

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : RVHa

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHa-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 39

서열의 길이 : 34

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : LTW1

서열

GGCTAGAGTG GGTGGGTCTC ATTAGAAACA AAGC 34

서열번호 : 40

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : SyntheticDNA

서열의 명칭 : LTW2

서열

GAGACCCACC CACTCTAGCC CTTTCCCTTG AGCTTG 36

서열번호 : 41

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHb

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHb-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 42

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : QTP1

서열

TGGGTCCGCC AAGCTCCAGG GAAAGGGCTA GA 32

서열번호 : 43

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : QTP2

서열

TCTAGCCCTT TCCCTGGAGC TTGGCGGACC CA 32

서열번호 : 44

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHc

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHc-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 45

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHd

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHd-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 46

서열의 길이 : 26

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : ATP1

서열

TGGGTCCGCC AACCTCCAGG GAAAGG 26

서열번호 : 47

서열의 길이 : 26

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : ATP2

서열

CCTTTCCCTG GAGGTTGGCGG GACCCA 26

서열번호 : 48

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHe

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHe-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 49

서열의 길이 : 29

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : GTA1

서열

CAAGCTCCAG GGAAAGCGCT AGAGTGGGT 29

서열번호 : 50

서열의 길이 : 29

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : GTA2

서열

ACCCACTCTA GCGCTTTCCC TGGAGCTTG 29

서열번호 : 51

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHf

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHf-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 52

서열의 길이 : 23

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LTF1

서열

GTGAAGGGCA GATTTACCAT CTC 23

서열번호 : 53

서열의 길이 : 23

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LTF2

서열

GAGATGGTAA ATCTGCCCTT CAC 23

서열번호 : 54

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHg

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHg-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 55

서열의 길이 : 424

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVHh

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVHh-gγ1

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-30 : FR1

아미노산 31-35 : CDR1

아미노산 36-49 : FR2

아미노산 50-68 : CDR2

아미노산 69-100 : FR3

아미노산 101-111 : CDR3

아미노산 112-122 : FR4

서열

서열번호 : 56

서열의 길이 : 124

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LF1

서열

서열번호 : 57

서열의 길이 : 122

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LF2

서열

서열번호 : 58

서열의 길이 : 121

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LF3

서열

서열번호 : 59

서열의 길이 : 106

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : LF4

서열

서열번호 : 60

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVL5'

서열

서열번호 : 61

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVL'3

서열

서열번호 : 62

서열의 길이 : 379

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVLa

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVLa-gκ

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-23 : FR1

아미노산 24-34 : CDR1

아미노산 35-49 : FR2

아미노산 50-56 : CDR2

아미노산 57-88 : FR3

아미노산 89-97 : CDR3

아미노산 98-107 : FR4

서열

서열번호 : 63

서열의 길이 : 38

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : FTY1

서열

AGCGGTAGCG GTACCGACTA CACCTTCACC ATCAGCAG 38

서열번호 : 64

서열의 길이 : 38

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : FTY2

서열

CTGCTGATGG TGAAGGTGTA GTCGGTACCG CTACCGCT 38

서열번호 : 65

서열의 길이 : 379

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : RVLb

기원

생물명 : 마우스 및 사람

직접적인 기원

클론명 : HEF-RVLb-gκ

아미노산 -19--1 : 리더

아미노산 1-23 : FR1

아미노산 24-34 : CDR1

아미노산 35-49 : FR2

아미노산 50-56 : CDR2

아미노산 57-88 : FR3

아미노산 89-97 : CDR3

아미노산 98-107 : FR4

서열

서열번호 : 66

서열의 길이 : 18

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : EF1

서열

CAGACAGTGG TTCAAAGT 18

서열번호 : 67

서열의 길이 : 17

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : HIP

서열

GCCCCAAAGC CAAGGTC 17

서열번호 : 68

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : Synthetic DNA

서열의 명칭 : KIP

서열

AACTCAATGC TTTAGGCAAA 20

Claims

다음 구조를 가지는 사람의 인터루킨-8(IL-8)에 대한 항체의 라이트(L) 사슬 가변(V) 영역.

상기 식에서, CDR1¹, CDR2¹및 CDR3¹은 다음 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열 세트로 이루어진 3개의 상보성 결정 영역(CDR¹S) 세트 또는 그의 작용 등가물을 나타낸다:

서열번호 1

상기 식에서, FR1¹, FR2¹, FR3¹및 FR4¹는 사람 서브 그룹 I항체(HSGI)의 L사슬 V 영역으로부터 유도된 4개의 구조 영역(FR's)의 세트 또는 그의 작용 등가물을 나타낸다.
제1항에 있어서, 상기 HSGI가 REI 항체인 것인 L사슬 V영역.
제2항에 있어서, REI 항체 중 FR1¹, FR2¹, FR3¹및 FR4¹또는 그의 작용 등가물은 다음 서열번호 2 및 서열번호 3으로 나타낸 아미노산 서열의 세트 또는 그의 작용 등가물로 이루어진 L사슬 V영역.

서열번호 2

서열번호 3
제1항에 있어서, 서열번호 62 또는 65로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 L사슬 V영역.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 따른 V영역 및 불변(C) 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 L사슬.
제5항에 있어서, C 영역은 Cκ인 것인 L사슬.
다음 구조를 가지는 사람의 인터루킨-8(IL-8)에 대한 항체의 헤비(H) 사슬 가변(V) 영역.

상기 식에서, CDR1², CDR2²및 CDR3²은 다음 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열 세트로 이루어진 3개의 상보성 결정 영역(CDR¹S) 세트 또는 그의 작용 등가물을 나타낸다:

서열번호 4

상기 식에서, FR1², FR2², FR3²및 FR4²는 사람 서브 그룹 Ⅲ항체(HSGⅢ)의 H사슬 V영역으로부터 유도된 4개의 구조 영역(FR's)의 세트 또는 그의 작용 등가물을 나타낸다.
제7항에 있어서, HSGⅢ는 VDH26 항체 및/또는 4B4 항체인 것인 H사슬 V영역.
제8항에 있어서, VDH26 항체 중 FR1², FR2², FR3²및 4B4 항체 중 FR4²는 다음 서열번호 5 내지 서열번호 12로 나타낸 아미노산 서열의 세트 또는 그의 작용 등가물로 이루어진 H사슬 V영역.

서열번호 5

서열번호 6

서열번호 7

서열번호 8

서열번호 9

서열번호 10

서열번호 11

서열번호 12
제7항에 있어서, 서열번호 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54 또는 55로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 H사슬 V영역.
제7항 내지 10항 중 어느 하나의 항에 따른 V영역 및 사람 항체로 부터 유도된 불변(C) 영역으로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체의 H사슬.
제11항에 있어서, C영역은 Cκ인 것인 H사슬.
제5항 또는 제6항에 따른 두 개의 L 사슬 및 제11항 또는 제12항에 따른 두 개의 H사슬로 이루어진 사람의 IL-8에 대한 항체.
F(ab')2, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv 또는 제13항에 따른 항체의 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 L사슬 V영역을 코드하는 DNA.
제5항 또는 제6항에 따른 L사슬을 코드하는 DNA.
제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 H사슬 V영역을 코드하는 DNA.
제11항 또는 제12항에 따른 H사슬을 코드하는 DNA.
제15항 또는 제16항에 따른 DNA로 이루어진 벡터.
제17항 또는 제18항에 따른 DNA로 이루어진 벡터.
제15항 또는 제16항에 따른 DNA 및 제94항 또는 제95항에 따른 DNA로 이루어진 벡터.
제19 및/또는 제20항에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포.
제19항에 따른 발현 벡터와 제20항에 따른 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 목적하는 항체를 회수하는 단계로 이루어진 사람 IL-8에 대한 항체의 제조방법.
제21항에 따른 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 목적하는 항체를 회수하는 단계로 이루어진 사람 IL-8에 대한 항체의 제조방법.