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TWI664192B - 抗ｃｅａｃａｍ５抗體及其用途 - Google Patents

抗ｃｅａｃａｍ５抗體及其用途 Download PDF

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TWI664192B
TWI664192B TW102142388A TW102142388A TWI664192B TW I664192 B TWI664192 B TW I664192B TW 102142388 A TW102142388 A TW 102142388A TW 102142388 A TW102142388 A TW 102142388A TW I664192 B TWI664192 B TW I664192B
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赫夫 柏查德
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史蒂芬妮 狄卡瑞
保羅 菲瑞里
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Abstract

本發明揭示結合人類及食蟹獼猴(Macaca fascicularis)CEACAM5蛋白之抗體以及包括編碼該等抗體之序列之經分離核酸、載體及宿主細胞。本發明亦揭示包括該等抗體偶聯或連接至生長抑制劑之免疫偶聯物，及包括本發明抗體或免疫偶聯物之醫藥組合物。本發明之該等抗體或免疫偶聯物係用於治療癌症或用於診斷目的。

Description

抗CEACAM5抗體及其用途
ANTI-CEACAM5 ANTIBODIES AND USES THEREOF
本發明揭示特異性結合人類及食蟹獼猴(Macaca fascicularis)CEACAM5蛋白之抗體以及包括編碼該等抗體之序列之經分離核酸、載體及宿主細胞。本發明亦揭示包括偶聯或連接至生長抑制劑之該等抗體之免疫偶聯物及包括本發明抗體或免疫偶聯物之醫藥組合物。本發明揭示本發明抗體或免疫偶聯物用於治療癌症或用於診斷目的之用途。
癌胚胎抗原(CEA)係一種參與細胞黏著之糖蛋白。CEA係於1965年(Gold及Freedman，J Exp Med,121,439,1965)首次經鑑別為在懷孕的前六個月期間由胎腸正常表現之蛋白質，且發現於胰臟癌、肝癌及結腸癌中。CEA家族屬於免疫球蛋白超家族。CEA家族係由18個基因組成且分為兩個蛋白質亞群：癌胚胎抗原相關細胞黏著分子(CEACAM)亞群及懷孕特異性糖蛋白亞群(Kammerer及Zimmermann，BMC Biology 2010,8：12)。
在人類中，CEACAM亞群係由7個成員組成：CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8。諸多研究已顯示，與最初鑑別的CEA相同，CEACAM5在結腸直腸、胃、肺、乳、前列腺、卵巢、子宮頸及膀胱腫瘤細胞之表面上具有高表現，且在少數正常上皮組織(例如結腸柱狀上皮及杯狀細胞、胃黏液頸細胞及食道及子宮頸鱗狀上皮細胞)中具有弱表現(Hammarström等人，2002，「Tumor markers,Physiology,Pathobiology, Technology及Clinical Applications」，Diamandis E.P.等人編輯，AACC Press,Washington，第375頁)。因此，CEACAM5可構成適用於腫瘤特異性靶向方法之治療靶，例如免疫偶聯物。本發明提供針對CEACAM5之單株抗體，且顯示其可偶聯至細胞毒性劑以誘導能夠殺死活體外腫瘤細胞之細胞毒性活性並引起活體內腫瘤消退。
CEACAM家族成員之細胞外結構域係由重複免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域構成，根據序列同源性，該等重複免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域已分為3種類型：A、B及N。CEACAM5含有7個該等結構域，即N、A1、B1、A2、B2、A3及B3。
一方面CEACAM5 A1、A2及A3結構域與另一方面B1、B2及B3結構域顯示高序列同源性，人類CEACAM5之A結構域呈現84%至87%成對序列相似性，且B結構域呈現69%至80%成對序列相似性。此外，結構中呈現A及/或B結構域之其他人類CEACAM成員(即CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8)顯示與人類CEACAM5之同源性。具體而言，人類CEACAM6蛋白之A及B結構域分別展現與人類CEACAM5之A1及A3結構域以及B1至B3結構域中任一者之序列同源性，該序列同源性甚至高於在人類CEACAM5之A結構域及B結構域中所觀察到之序列同源性。
諸多抗CEA抗體係鑒於CEA靶向診斷或治療目的而產生。對相關抗原之特異性始終作為該領域中之問題被提及，由Sharkey等人(1990,Cancer Research 50,2823)作為實例提及。由於上文所提及之同源性，故一些先前所闡述之抗體可展示，與存在於不同免疫球蛋白結構域中之CEACAM5重複表位之結合顯示與缺乏針對CEACAM5之特異性的其他CEACAM成員(例如CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7或CEACAM8)之交叉反應性。抗CEACAM5抗體之特異性在靶向CEA之療法中合意以使其結合至表現人類CEACAM5之腫瘤細胞，而不與一 些表現其他CEACAM成員之正常組織結合。值得注意的是，CEACAM1、CEACAM6及CEACAM8已闡述為由人類及非人類靈長類動物之嗜中性球表現(Ebrahimmnejad等人，2000,Exp Cell Res,260,365；Zhao等人，2004,J Immunol Methods 293,207；Strickland等人，2009 J Pathol,218,380)，其中已顯示其調控粒細胞生成且在免疫反應中起作用。
已闡述抗CEACAM6抗體藥物偶聯物，例如由Genentech研發之類美登素(maytansinoid)抗CEACAM6抗體(Strickland等人，2009 J Pathol,218,380)，已顯示其誘導非人類靈長類動物之CEACAM6依賴性造血毒性。作者將因骨髓中抗體藥物偶聯物之累積以及顆粒球及其細胞前體之消耗造成之此毒性視為主要安全問題。因此，更精確而言，出於治療之目的，抗CEACAM5抗體與CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7或CEACAM8之交叉反應性可藉由增加對正常組織之毒性來減小化合物之治療指數。因此，其顯著優點在於，獲得不與CEACAM家族之其他分子交叉反應之特異性針對CEACAM5之抗體，尤其用作抗體藥物偶聯物(ADC)或利用任何其他作用模式殺死靶細胞。
此外，由於CEACAM5闡述為可表現，但在一些正常細胞組織中含量較低，故研發出能夠結合至人類CEACAM5且結合至食蟹猴(食蟹獼猴)CEACAM5之抗CEACAM5抗體至關重要，此乃因該等抗體可容易地於食蟹猴之臨床前毒理學研究中測試以評估其安全曲線。由於已顯示在功能性抗體之情形(Doern等人2009,J.Biol.Chem 284 10254)及在涉及效應子功能之情形(Beers等人Semin Hematol 47：107-114)二者下治療性抗體之效率可取決於表位在靶標中之定位，故必須顯示人類/猴交叉反應性抗體結合人類及食蟹猴蛋白質之相同重複Ig樣同源結構域中之表位。
根據人類與食蟹獼猴CEACAM蛋白質之間之總體序列同源性， 該等抗體對物種交叉反應性與對人類及食蟹獼猴CEACAM5之特異性(即無與其他食蟹獼猴及人類CEACAM成員之交叉反應性)之需要的組合進一步增加了複雜度。
實際上，食蟹獼猴CEACAM5序列與人類CEACAM5序列(AAA51967.1/GI：180223，702個胺基酸)之整體成對序列比對指示僅78.5%一致性。選殖食蟹獼猴CEACAM1、CEACAM5及CEACAM6基因且實施人類與食蟹獼猴A、B及N結構域之整體比對。此比對預測極少數區域(若存在)定位將為人類及獼猴CEACAM5所共用且不與任何其他家族成員共享之理想表位。出於該等原因，預期研發與人類及食蟹獼猴CEACAM5交叉反應而不與其他人類及食蟹獼猴CEACAM成員交叉反應之抗體很難成功。值得注意的是，幾乎從未有過先前所闡述之抗CEACAM5抗體對食蟹獼猴之交叉反應性之記載，僅有極少數例外(MT111，參見下文)。
抗人類CEACAM5抗體已用於臨床試驗中，例如Immunomedics拉貝珠單抗(labetuzumab)(亦稱為hMN14，Sharkey等人，1995,Cancer Research 55,5935)。已顯示此抗體不與相關抗原結合，且不與來自食蟹獼猴之CEACAM5交叉反應。值得注意的是，Micromet之MT111抗體(亦稱為MedImmune MEDI-565抗體)係結合至人類CEACAM5及人類CD3之雙特異性抗體(Peng等人，PLoS ONE 7(5)：e3641；WO 2007/071426)。稱MT111係藉由融合抗體之識別人類及食蟹猴CEACAM5之單鏈可變片段(scFv)與抗體之識別人類CD3之scFv來產生(Oberst等人之海報，AACR年會2009年4月Denver,CO)。亦已報導，MT111並不結合其他CEACAM家族成員(Peng等人，PLoS ONE 7(5)：e3641)。MT111結合至人類CEACAM5之A2結構域中之構象表位。此構象表位在人類CEACAM5之剪接變體中丟失，該構象表位與全長CEACAM5在腫瘤上同時表現(Peng等人，PLoS ONE 7(5)：e3641)。此 外，業內尚無證據表明MT111結合至食蟹獼猴CEACAM5中之相同表位。
在出於治療之目的產生具有最佳特徵之針對CEACAM5表面蛋白之新抗體的嘗試中，本發明者已使用重組蛋白及腫瘤細胞來免疫小鼠。其已使用CEACAM家族之若干重組蛋白上之ELISA及相關細胞系之流式細胞術篩選出數百個雜交瘤，以僅選擇具有有利特徵之免疫球蛋白(IgG)。出乎意料的是，其能夠選擇雜交瘤純系且產生包括所有期望特徵之相應的成熟IgG。其以高親和力特異性結合至人類CEACAM5之A3-B3結構域且並不識別人類CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8蛋白。在細胞背景下，該等抗體展現針對腫瘤細胞之高親和力(奈莫耳濃度範圍內)。此外，該等抗體亦結合至食蟹獼猴CEACAM5蛋白且猴/人類之親和力比率小於或等於10。本發明抗體特異性結合至食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域且並不識別其他食蟹獼猴CEACAM成員。
藉由靶向CEACAM5之A3-B3結構域，該等抗體已增加靶向腫瘤之潛能，此乃因其具有結合全長人類CEACAM5及結合至其由Peng等人(PLoS ONE 7(5)：e3641)鑑別之剪接變體二者之能力。
最後，CEACAM5在文獻中闡述為較差內化表面蛋白(綜述於Schmidt等人，2008,Cancer Immunol.Immunother.57,1879中)，且因此可能並非抗體藥物偶聯物之有利靶標。儘管在先前技術中已報導，但本發明者已顯示其已產生之抗體能夠使CEACAM5-抗體複合物在結合後內化，且當與細胞毒性劑組合時誘導對活體外腫瘤細胞之細胞毒性活性。與細胞毒性劑組合之相同抗體亦能夠顯著抑制帶有人類原發性結腸及胃腫瘤之小鼠之腫瘤生長。
定義
如本文所使用，「CEACAM5」指示「癌胚胎抗原相關細胞黏著 分子5」，亦稱為「CD66e」(分化簇66e)或CEA。CEACAM5係一種參與細胞黏著之糖蛋白。CEACAM5尤其在結腸直腸、胃、肺及子宮腫瘤細胞之表面上具有高表現。
全長人類CEACAM5之參考序列(包含信號肽(位置1-34)及前肽(位置686-702))可以登錄號AAA51967.1(SEQ ID NO：52)自GenBank數據庫獲得。五個非同義SNP已在高加索人(caucasian population)中經鑑別具有高於2%之頻率，其中的四個位於N結構域(在位置80、83、112、113處)中，最後一個位於人類CECAM5之A2結構域(SEQ ID NO：58)(在位置398處)中。GenBank AAA51967.1含有主要單倍型(I80、V83、I112、I113及E398)。
本發明者所選殖之食蟹獼猴CEACAM5之細胞外結構域序列揭示於SEQ ID NO：53中。
「結構域」可係蛋白質之通常基於序列同源性定義且通常與特定結構或功能性實體相關之任何區域。已知CEACAM家族成員係由Ig樣結構域構成。在此文件中使用術語結構域來指示個別Ig樣結構域(例如「N-結構域」)或連續結構域之群(例如「A3-B3結構域」)。
人類CEACAM5之結構域組成如下(基於GenBank AAA51967.1序列；SEQ ID NO：52)：
因此，人類CEACAM5之A3-B3結構域係由SEQ ID NO：52之位置499-685處之胺基酸組成。
食蟹獼猴CEACAM5之結構域組成如下(基於所選殖之細胞外結構域序列；SEQ ID NO：53)：
因此，食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域係由SEQ ID NO：53之位置465-654處之胺基酸組成。
「編碼序列」或「編碼」表現產物(例如RNA、多肽、蛋白質或酶)之序列係表現時產生該RNA、多肽、蛋白質或酶之核苷酸序列，即核苷酸序列編碼該多肽、蛋白質或酶之胺基酸序列。蛋白質之編碼序列可包含起始密碼子(通常為ATG)及終止密碼子。
如本文所使用，對特定蛋白質(例如抗體)之提及可包含具有天然胺基酸序列之多肽以及變體及修飾形式，而與其來源或製備模式無關。具有天然胺基酸序列之蛋白質係具有與自自然界中所獲得相同之胺基酸序列之蛋白質。該等天然序列蛋白質可自自然界分離或可使用標準重組及/或合成方法來製備。天然序列蛋白質特定涵蓋天然截短或可溶形式、天然變體形式(例如替代性剪接形式)、天然對偶基因變體及包含轉譯後修飾之形式。天然序列蛋白質包含攜載一些胺基酸殘基之轉譯後修飾(例如糖基化或磷酸化或其他修飾)之蛋白質。
術語「基因」意指編碼或對應於包括一或多種蛋白質或酶之全部或部分之具體胺基酸序列之DNA序列，且可或可不包含諸如啟動子序列等決定例如基因表現條件之DNA調控序列。一些並非結構基因之 基因可自DNA轉錄至RNA，但並不轉譯成胺基酸序列。其他基因可起結構基因調控子或DNA轉錄調控子之作用。具體而言，術語基因可係意欲編碼蛋白質之基因組序列，即包括調控子、啟動子、內含子及外顯子序列之序列。
「與參考序列至少85%一致」之序列係基於其整個長度與參考序列之整個長度具有85%或更大、例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
「序列一致性」百分比可藉由在比較窗口中比較兩個最佳比對序列來測定，其中與參考序列(其不包括添加或缺失)相比，比較窗口中多核苷酸或多肽序列之部分可包括添加或缺失(即空位)以達成兩個序列之最佳比對。該百分比係藉由以下方式來計算：測定一致核酸鹼基或胺基酸殘基在兩個序列中出現之位置數以產生匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗口中之位置總數，並用結果乘以100，產生序列一致性百分比。比較用序列之最佳比對係藉由整體成對序列比對使用例如Needleman算法及Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)來實施。序列一致性百分比可使用例如Needle程式與BLOSUM62矩陣以及下列參數空位開放罰分=10、空位延伸罰分=0.5來容易地測定。
「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基經具有化學性質(例如電荷、大小或疏水性)相似之側鏈R基團之另一胺基酸殘基取代者。通常，保守胺基酸取代並不實質上改變蛋白質之功能性質。具有化學性質相似之側鏈之胺基酸之群的實例包含1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。保守胺基酸取代基團亦可基於胺基酸大小來定義。
「抗體」可係兩條重鏈藉由二硫鍵彼此連接且每一重鏈藉由二硫鍵連接至輕鏈之天然或習用抗體。存在兩種類型之輕鏈，λ(1)及κ(k)。存在五類(或同種型)決定抗體分子之功能活性之主要重鏈：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。每鏈含有不同序列結構域。輕鏈包含兩個結構域或區域：可變結構域(VL)及恆定結構域(CL)。重鏈包含四個結構域：一個可變結構域(VH)及三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)及重鏈(VH)二者之可變區決定對抗原之結合識別及特異性。輕鏈(CL)及重鏈(CH)之恆定區結構域賦予重要生物性質，例如抗體鏈締合、分泌、經胎盤活動性、補體結合及與Fc受體(FcR)之結合。Fv片段係免疫球蛋白Fab片段之N端部分且由一輕鏈及一重鏈之可變部分組成。抗體之特異性在於抗體結合位點與抗原決定簇之間之結構互補。抗體結合位點係由主要來自超變或互補決定區(CDR)之殘基構成。偶然地，來自非超變或框架區(FR)之殘基影響總體結構域結構，且因此影響結合位點。因此，互補決定區或CDR係指一起定義天然免疫球蛋白結合位點之天然Fv區結合親和力及特異性之胺基酸序列。免疫球蛋白之輕鏈及重鏈各自具有三個CDR，分別稱為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L及CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，習用抗體抗原結合位點包含六個CDR，包括重鏈及輕鏈V區之每一者之CDR集合。
「框架區」(FR)係指插入CDR之間之胺基酸序列，即指彼等免疫球蛋白輕鏈及重鏈可變區中在單一物種之不同免疫球蛋白中相對保守之部分。免疫球蛋白之輕鏈及重鏈各自具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L及FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所使用，「人類框架區」係與天然人類抗體之框架區實質上一致(約85%或更大，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之框架區。
在本發明背景下，免疫球蛋白輕鏈或重鏈中之CDR/FR定義係基於IMGT定義(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1)：55-77；www.imgt.org)來確定。
如本文所使用，術語「抗體」指示習用抗體及其片段以及單一結構域抗體及其片段，尤其單一結構域抗體之可變重鏈及嵌合、人類化、雙特異性或多特異性抗體。
如本文所使用，抗體或免疫球蛋白亦包含最近已闡述之「單一結構域抗體」及互補決定區為單一結構域多肽之一部分之抗體。單一結構域抗體之實例包含重鏈抗體、天然不含輕鏈之抗體、源自習用四鏈抗體之單一結構域抗體、經改造單一結構域抗體。單一結構域抗體可源自任何物種，包含(但不限於)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、山羊、兔、牛。單一結構域抗體可係天然單一結構域抗體，稱為不含輕鏈之重鏈抗體。具體而言，駱駝科(Camelidae)物種(例如駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝及原駝)產生天然不含輕鏈之重鏈抗體。駱駝科重鏈抗體亦缺少CH1結構域。
業內將該等不含輕鏈之單一結構域抗體之可變重鏈稱為「VHH」或「奈米抗體」。與習用VH結構域相似，VHH含有四個FR及三個CDR。奈米抗體具有優於習用抗體之優點：其係IgG分子之約1/10，且因此適當摺疊之功能性奈米抗體可藉由活體外表現來產生，同時達成高產率。此外，奈米抗體非常穩定，且對蛋白酶之作用具有抗性。奈米抗體之性質及產生已由Harmsen及De Haard HJ(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007年11月；77(1)：13-22)加以綜述。
如本文所使用之術語「單株抗體」或「mAb」係指單一胺基酸序列之針對特定抗原之抗體分子，且不應理解為該抗體需要藉由任何具體方法來產生。單株抗體可藉由B細胞或雜交瘤之單一純系產生，但亦可為重組，即藉由蛋白質改造產生。
術語「嵌合抗體」係指在其最廣泛意義上含有一或多個來自一個抗體之區域及一或多個來自一或多個其他抗體之區域的經改造抗體。在實施例中，嵌合抗體包括源自非人類動物之抗體之VH結構域及VL結構域以及另一抗體(在實施例中為人類抗體)之CH結構域及CL結構域。可使用任何動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如此類)作為非人類動物。嵌合抗體亦可指示對至少兩種不同抗原具有特異性之多特異性抗體。
術語「人類化抗體」係指以下抗體：完全或部分為非人類來源，且已經修飾以替代例如VH及VL結構域之框架區中之某些胺基酸，以避免或最小化人類之免疫反應。人類化抗體之恆定結構域大多為人類CH及CL結構域。
(習用)抗體之「片段」包括完整抗體之一部分，尤其完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包含Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、自抗體片段形成之雙鏈抗體、雙特異性及多特異性抗體。習用抗體之片段亦可係單一結構域抗體，例如重鏈抗體或VHH。
術語「Fab」指示具有約50,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其中重鏈N端側之約一半及整個輕鏈係經由二硫鍵鍵結在一起。片段通常尤其係藉由用木瓜蛋白酶處理IgG來獲得。
術語「F(ab')2」係指具有約100,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其稍大於經由鉸鏈區之二硫鍵鍵結之2個相同Fab片段。片段通常尤其係藉由用胃蛋白酶處理IgG來獲得。
術語「Fab'」係指具有約50,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其係藉由切割F(ab')2之鉸鏈區之二硫鍵來獲得。
單鏈Fv(「scFv」)多肽係共價連接之VH：：VL異源二聚體，其通常自包含由肽編碼連接體連接之VH及VL編碼基因之基因融合物表 現。本發明之人類scFv片段包含藉由例如使用基因重組技術保持在適當構象中之CDR。二價及多價抗體片段可藉由締合單價scFv自發地形成或可藉由肽連接體偶合單價scFv來產生，例如二價sc(Fv)2。「dsFv」係藉由二硫鍵穩定之VH：：VL異源二聚體。「(dsFv)2」指示藉由肽連接體偶合之兩個dsFv。
術語「雙特異性抗體」或「BsAb」指示在單一分子內組合兩種抗體之抗原結合位點之抗體。因此，BsAb能夠同時結合兩種不同抗原。已愈發頻繁地使用遺傳改造來設計、修飾並產生如例如EP 2 050 764 A1中所闡述之具有結合性質及效應子功能之期望集合的抗體或抗體衍生物。
術語「多特異性抗體」指示在單一分子內組合兩種或更多種抗體之抗原結合位點之抗體。
術語「雙鏈抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包括在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結構域(VL)連接之重鏈可變結構域(VH)。藉由使用太短而不允許在相同鏈之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。
術語「雜交瘤」指示藉由以下方式獲得之細胞：用抗原免疫非人類哺乳動物，使由此製備之B細胞與源自小鼠或諸如此類之骨髓瘤細胞經歷細胞融合，產生具有抗原特異性之期望單株抗體。
「純化」及「經分離」在提及多肽(即本發明抗體)或核苷酸序列時意指所指示分子以實質上缺乏相同類型之其他生物大分子方式存在。如本文所使用之術語「純化」意指存在至少75重量%、85重量%、95重量%、96重量%、97重量%或98重量%之相同類型的生物大分子。編碼具體多肽之「經分離」核酸分子係指實質上不含不編碼個體多肽之其他核酸分子之核酸分子；然而，該分子可包含一些對組合物 之基本特徵不造成有害影響之額外鹼基或部分。
如本文所使用，術語「個體」指示哺乳動物，例如齧齒類動物、貓、犬及靈長類動物。此外，本發明之個體為人類。
抗體
本發明者已成功地產生、篩選並選擇特異性小鼠抗CEACAM5抗體，該等抗體對人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白二者展現高親和力，且並不與人類CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8蛋白以及食蟹獼猴CEACAM1、CEACAM6及CEACAM8蛋白顯著交叉反應。
本發明者已測定該等單株抗體(所謂的抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5)之可變重鏈及輕鏈之序列。
所謂的「抗體MAb1」包括：- 重鏈可變結構域，其係由序列EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYIYYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARPAYYGNPAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：31，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-H跨越胺基酸位置1至25，CDR1-H跨越胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：1)，FR2-H跨越胺基酸位置34至50，CDR2-H跨越胺基酸位置51至58(SEQ ID NO：2)，FR3-H跨越胺基酸位置59至96，CDR3-H跨越胺基酸位置97至109(SEQ ID NO：3)，且FR4-H跨越胺基酸位置110至120，及- 輕鏈可變結構域，其係由序列DILMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：32，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-L跨越胺基酸位置1至26，CDR1-L跨越胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：4)，FR2-L跨越胺基酸位置33至49，CDR2-L跨越胺基酸位置50至52，FR3-L跨越胺基酸位置53至88，CDR3-L跨越胺基酸位置89至98(SEQ ID NO：6)，且FR4-L跨越胺基酸位置99至108。
所謂的「抗體MAb2」包括：- 重鏈可變結構域，其係由序列EVQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGITYFPDTVQGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAIYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：33，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-H跨越胺基酸位置1至25，CDR1-H跨越胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：7)，FR2-H跨越胺基酸位置34至50，CDR2-H跨越胺基酸位置51至58(SEQ ID NO：8)，FR3-H跨越胺基酸位置59至96，CDR3-H跨越胺基酸位置97至109(SEQ ID NO：9)，且FR4-H跨越胺基酸位置110至120，及- 輕鏈可變結構域，其係由序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：34，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-L跨越胺基酸位置1至26，CDR1-L跨越胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：10)，FR2-L跨越胺基酸位置33至49，CDR2-L跨越胺基酸位置50至52，FR3-L跨越胺基酸位置53至88，CDR3-L跨越胺基酸位置89至97(SEQ ID NO：12)，且FR4-L跨越胺基酸位置98至107。
抗體MAb2之變體亦係藉由在CDR2-L中引入K52R取代來產生。此變體(在本文中稱為「Mab2K52R」)對人類及食蟹獼猴CEACAM5具有與MAb2基本上相同之親和力。
所謂的「抗體MAb3」包括：- 重鏈可變結構域，其係由序列 EVKLVESGGGLVKPGGSLTLPCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGDTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILFLQMSSLRSEDTGMYYCARVNYYDSSFLDWWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：35，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-H跨越胺基酸位置1至25，CDR1-H跨越胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：13)，FR2-H跨越胺基酸位置34至50，CDR2-H跨越胺基酸位置51至57(SEQ ID NO：14)，FR3-H跨越胺基酸位置58至95，CDR3-H跨越胺基酸位置96至108(SEQ ID NO：15)，且FR4-H跨越胺基酸位置109至119，及- 輕鏈可變結構域，其係由序列DIVMTQSQRFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：36，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-L跨越胺基酸位置1至26，CDR1-L跨越胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：16)，FR2-L跨越胺基酸位置33至49，CDR2-L跨越胺基酸位置50至52，FR3-L跨越胺基酸位置53至88，CDR3-L跨越胺基酸位置89至98(SEQ ID NO：18)，且FR4-L跨越胺基酸位置99至108。
所謂的「抗體MAb4」包括：- 重鏈可變結構域，其係由序列EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAFISSYGGRTYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCAAHYFGTSGPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：37，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-H跨越胺基酸位置1至25，CDR1-H跨越胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：19)，FR2-H跨越胺基酸位置34至50，CDR2-H跨越胺基酸位置51至58(SEQ ID NO：20)，FR3-H跨越胺基酸位置59至96，CDR3-H跨越胺基酸位置97至109(SEQ ID NO：21)，且FR4-H跨越胺基酸位置110至120，及 - 輕鏈可變結構域，其係由序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGIPFTFGSGTKLELK(SEQ ID NO：38，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-L跨越胺基酸位置1至26，CDR1-L跨越胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：22)，FR2-L跨越胺基酸位置33至49，CDR2-L跨越胺基酸位置50至52，FR3-L跨越胺基酸位置53至88，CDR3-L跨越胺基酸位置89至97(SEQ ID NO：24)，且FR4-L跨越胺基酸位置98至107。
所謂的「抗體MAb5」包括：- 重鏈可變結構域，其係由序列ELQLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVTYINSGGGITYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCTAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：39，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-H跨越胺基酸位置1至25，CDR1-H跨越胺基酸位置26至33(SEQ ID NO：25)，FR2-H跨越胺基酸位置34至50，CDR2-H跨越胺基酸位置51至58(SEQ ID NO：26)，FR3-H跨越胺基酸位置59至96，CDR3-H跨越胺基酸位置97至109(SEQ ID NO：27)，且FR4-H跨越胺基酸位置110至120，及- 輕鏈可變結構域，其係由序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：40，CDR以粗體字母顯示)組成，其中FR1-L跨越胺基酸位置1至26，CDR1-L跨越胺基酸位置27至32(SEQ ID NO：28)，FR2-L跨越胺基酸位置33至49，CDR2-L跨越胺基酸位置50至52，FR3-L跨越胺基酸位置53至88，CDR3-L跨越胺基酸位置89至97(SEQ ID NO：30)，且FR4-L跨越胺基酸位置98至107。
因此，本發明係關於結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5之抗體。
在實施例中，本發明抗體結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域。更特定而言，抗體可無差別地結合至人類及食蟹獼猴A3-B3結構域，不論以經分離形式表現抑或存於可溶細胞外結構域或膜錨定全長CEACAM5蛋白中。
抗體對人類CEACAM5之A3-B3結構域之特異性有利之原因在於，在此結構域中不存在高加索人中頻率高於2%之SNP，此最小化在部分人群中改變CEACAM5上之抗體表位之風險。
本發明亦提供與包括選自由所謂的抗體MAb1、MAb2、MAb2K52R、MAb3、MAb4及MAb5組成之群、即選自由以下組成之群之抗體的可變重鏈及輕鏈之抗體競爭結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域的抗體：a)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：31及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：32之抗體；b)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：33及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：34之抗體；c)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：33及位置52處之K已經R替代之輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：34之抗體；d)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：35及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：36之抗體；e)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：37及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：38之抗體；及f)包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：39及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：40之抗體。
可藉由例如競爭性ELISA容易地分析候選抗體與包括選自由抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5組成之群之抗體的可變重鏈及 輕鏈之抗體(下文中稱為「參考」抗體)競爭結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域的能力，其中抗原(即人類或食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域，或包括或由包含人類或食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域、尤其細胞外結構域之人類或食蟹獼猴CEACAM5片段的多肽)結合至固體載體，且添加分別含有候選抗體及參考抗體之兩種溶液，並使抗體競爭結合至抗原。然後可量測結合至抗原之參考抗體之量，且與針對陰性對照(例如不含抗體之溶液)量測之結合至抗原之參考抗體的量進行比較。與陰性對照存在下所結合參考抗體之量相比，候選抗體存在下所結合參考抗體之量減少指示候選抗體與參考抗體存在競爭。方便地，可標記參考抗體(例如用螢光)以幫助檢測所結合之參考抗體。可使用候選及/或參考抗體之連續稀釋物來實施重複量測。
根據實施例，該抗體及例如與如上文b)、c)、e)及f)中所定義之抗體競爭結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域的抗體結合至人類CEACAM5蛋白之A3-B3結構域之兩個區域，該兩個區域分別由人類CEACAM5蛋白之A3-B3結構域中位置109-115(SEQ ID NO：76)處之胺基酸及位置131-143(SEQ ID NO：77)處之胺基酸組成。實際上，MAb2抗體之構象表位已經鑑別屬於人類CEACAM5蛋白之A3-B3結構域之區域109-115及131-143，且MAb2、MAb4及MAb5在結構上密切相關，本發明者假定該等抗體結合至相同表位。
根據實施例，本發明抗體對人類及食蟹獼猴CEACAM5表面蛋白具有特異性。在實施例中，本發明抗體並不與下列蛋白質結合或並不與其顯著交叉反應：人類CEACAM1、人類CEACAM6、人類CEACAM7、人類CEACAM8、食蟹獼猴CEACAM1、食蟹獼猴CEACAM6及食蟹獼猴CEACAM8蛋白。
具體而言，該抗體並不與前述人類及食蟹獼猴CEACAM蛋白之 細胞外結構域結合或並不與其顯著交叉反應。
人類CEACAM1全長蛋白可在GenBank數據庫中以登錄號NP_001703.2(SEQ ID NO：11)獲得。人類CEACAM1之細胞外結構域係由SEQ ID NO：11之位置35-428處之胺基酸組成。人類CEACAM6全長蛋白可在GenBank數據庫中以登錄號NP_002474.3(SEQ ID NO：71)獲得。人類CEACAM6之細胞外結構域係由SEQ ID NO：71之位置35-327處之胺基酸組成。
人類CEACAM7全長蛋白可在GenBank數據庫中以登錄號NP_008821.1(SEQ ID NO：72)獲得。人類CEACAM7之細胞外結構域係由SEQ ID NO：72之位置36-248處之胺基酸組成。
人類CEACAM8全長蛋白可在GenBank數據庫中以登錄號NP_001807.2(SEQ ID NO：73)獲得。人類CEACAM8之細胞外結構域係由SEQ ID NO：73之位置35-332處之胺基酸組成。
食蟹獼猴CEACAM1細胞外結構域係由全長蛋白之位置35-428處之胺基酸(即SEQ ID NO：57之胺基酸1-394)組成。
食蟹獼猴CEACAM6細胞外結構域係由全長蛋白之位置35-327處之胺基酸(即SEQ ID NO：61之胺基酸1-293)組成。
食蟹獼猴CEACAM8細胞外結構域係由全長蛋白之位置35-332處之胺基酸(即SEQ ID NO：63之胺基酸1-298)組成。
「親和力」在理論上係藉由整個抗體與抗原之間之平衡締合來定義。其在實驗上可藉由多種已知方法來評價，例如使用表面電漿子共振量測締合及解離速率或在免疫化學分析(ELISA、FACS)中量測EC50(或表觀KD)。在該等分析中，EC50係在所定義濃度之抗原(ELISA，酶聯免疫吸附分析)或表現抗原之細胞(FACS，螢光活化細胞分選)下暴露某一指定時間後，誘導介於基線與最大值間之一半反應之抗體的濃度。
當兩種抗原之EC50處於相似範圍內時，結合至抗原1(Ag1)之單株抗體對抗原2(Ag2)具有「交叉反應性」。在本申請案中，當Ag2親和力對Ag1親和力之比率等於或小於10(例如5、2、1或0.5)時，結合至Ag1之單株抗體對Ag2具有交叉反應性，兩種抗原之親和力係使用相同方法來量測。
當兩種抗原之親和力非常不同時，結合至Ag1之單株抗體對Ag2「無顯著交叉反應性」。若結合反應太低，則無法量測Ag2之親和力。在本申請案中，在相同實驗設置及相同抗體濃度下，在單株抗體對Ag2之結合反應小於同一單株抗體對Ag1之結合反應的5%時，結合至Ag1之單株抗體對Ag2無顯著交叉反應性。在實踐中，所使用之抗體濃度可係EC50或達到使用Ag1獲得之飽和平穩段所需之濃度。
倘若單株抗體對Ag2無顯著交叉反應性，則其「特異性結合」至Ag1或「對Ag1具有特異性」。因此，本發明抗體之人類CEACAM5親和力對食蟹獼猴CEACAM5親和力之比率為10，例如5、2、1或0.5。因此，本發明多肽可用於在猴中所實施之毒理學研究中，此乃因在猴中所觀察到之毒性特徵將與人類中之預期潛在不利效應相關。
本發明實施例對人類CEACAM5或食蟹獼猴CEACAM5或二者之親和力10nM，例如5nM、3nM、1nM或0.1nM，例如親和力為0.01nM至5nM，及/或親和力為0.1nM至5nM或0.1nM至1nM。
在使用可溶重組CEACAM5作為捕獲抗原之ELISA中，可將對人類CEACAM5或對食蟹獼猴CEACAM5之親和力確定為EC50值。
本發明抗體亦可具有表觀解離常數(表觀KD)，如可藉由對腫瘤細胞系MKN45(DSMZ,ACC 409)或對源自患者之異種移植物腫瘤細胞(CR-IGR-034P，可自Oncodesign Biotechnology腫瘤集合CReMEC獲 得)進行FACS分析來測定，該表觀解離常數係25nM，例如20nM、10nM、5nM、3nM或1nM。表觀KD可在0.01-20nM範圍內或可在0.1-20nM、0.1-10nM或0.1-5nM範圍內。
此外已顯示，本發明抗體能夠藉由免疫組織化學檢測冷凍並經福馬林(formalin)固定及石蠟包埋(FFPE)之組織切片中之CEACAM5表現。
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5抗體之VH與VL區序列之比對顯示於圖7中。CRD-H與CDR-L序列之比較指示，一方面MAb2、MAb4及MAb5與另一方面MAb1及MAb3在結構上密切相關，該等抗體可能結合至相同表位。CRD-H與CDR-L序列之比較進一步鑑別出在兩組抗體之間嚴格保守且因此假定對特異性至關重要之CDR位置，而其他位置可進行取代。
本發明者已進一步鑑別出，MAb2 VH之位置101-109處之殘基(即CDR3-H之殘基)及MAb2 VL之位置47-54及88-104處之殘基(即分別包含CDR2-L及CDR3-L之區域)構成人類CEACAM5-A3B3結構域抗體互補位的一部分或形成該抗體互補位。
此外，已藉由單酸取代將MAb2 VL之位置27、28、29、31、51、52、89、90、93、94、96及97處之殘基(即在CDR1-L、CDR2-L及CDR3-L內)以及MAb2 VH之位置26至31、51至58、97、103、104、107及109處之殘基(即在CDR1-H內、所有CDR2-H及在CDR3-H內)鑑別為對與人類及食蟹猴CEACAM5細胞外結構域的結合呈中性。此外已顯示，MAb2 VL之位置30及92處之殘基(即在CDR1-L及CDR3-L內)以及MAb2 VH之位置98及100處之殘基(即在CDR3-H內)經受保守取代。由於MAb2、MAb4及MAb5攜載同組6個CDR或非常密切相關者，故認為VH或VL或VH及CL序列二者中MAb4或MAb5之相同位置處之變化亦將產生維持對人類及食蟹猴CEACAM5的結合特異性及/或親和 力之變體抗體。
值得注意的是，CDR2-H之所有殘基經鑑別對與人類及食蟹猴CEACAM5細胞外結構域之結合呈中性，本發明者假定CDR2-H可能不參與相互作用。因此，在本發明抗體中，CDR2-H可係具有6至10個胺基酸之任一序列，6至10個胺基酸係人類抗體中CDR2-H序列之固定長度。
因此，本發明抗體包括：a)CDR1-H，其係由序列X1X2X3X4X5X6YD(SEQ ID NO：83)組成，其中X1、X2、X3、X4、X5及X6中之每一者為任一胺基酸；及CDR2-H，其係由長6至10個胺基酸之序列、較佳長8個胺基酸之序列組成，其中任一胺基酸可存在於任一位置處；及CDR3-H，其係由序列X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO：84)組成，其中X1、X4、X5、X6及X7中之每一者為任一胺基酸，X2係A或S，且X3係Y、F或W；及/或b)CDR1-L，其係由序列X1X2X3X4X5Y(SEQ ID NO：85)組成，其中X1、X2、X3及X5中之每一者為任一胺基酸，且X4係Y、F或W；及CDR2-L，其係由序列NX1X2組成，其中X1及X2中之每一者為任一胺基酸；及CDR3-L，其係由序列X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO：86)組成，其中X1、X2、X4、X5、X6及X7中之每一者為任一胺基酸，X3係Y、F或W。
在實施例中，在由序列X1X2X3X4X5X6YD(SEQ ID NO：83)組成之CDR1-H中，X1係G，或X2係F，或X3係T、A或V，或X4係F，或X5係S，或X6係S或其任一組合。
在實施例中，CDR2-H係由序列IX1SX2GGX3T(SEQ ID NO：79)組成，其中X1係S或N(尤其S)，X2係Y或G(尤其G)，X3係R或I。在又一 實施例中X3係I。
在實施例中，在由序列X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO：84)組成之CDR3-H中，X1係A或T，或X4係T或S，或X5係S，或X6係F，或X7係Y或其任一組合。
在實施例中，在由序列X1X2X3X4X5Y(SEQ ID NO：85)組成之CDR1-L中，X1係E，或X2係N，或X3係I，或X5係S或其任一組合。
在實施例中，CDR2-L係由序列NX1X2組成，其中X1係A或T，且X2係K或R。
在實施例中，在由序列X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO：86)組成之CDR3-L中，X1係Q，或X2係H，或X4係G，或X5係T，或X6係F，或X7係T或其任一組合。根據實施例，本發明抗體包括：a)CDR1-H，其係由序列GFX1FSSYD(SEQ ID NO：78)組成，其中X1係T、A或V；及CDR2-H，其係由序列IX1SX2GGX3T(SEQ ID NO：79)組成，其中X1係S或N(尤其S)，X2係Y或G(尤其G)，X3係R或I；及CDR3-H，其係由序列X1AHYFGX2SGPFAY(SEQ ID NO：80)組成，其中X1係A或T(尤其A)，且X2係T或S；及/或b)CDR1-L，其係由序列ENIFSY(SEQ ID NO：10)或ENIYSY(SEQ ID NO：22)組成；及CDR2-L，其係由序列NX1X2組成，其中X1係A或T，且X2係K或R、尤其R；CDR2-L尤其由NAK、NTK及NTR組成；及CDR3-L，其係由序列QHHYGTPFT(SEQ ID NO：12)或QHHYGIPFT(SEQ ID NO：24)組成。
根據實施例，在CDR2-H中，X1係S或N，X2係G且X3係I。
根據實施例，CDR2-H係由ISSGGGIT(SEQ ID NO：8)、ISSYGGRT(SEQ ID NO：20)或INSGGGIT(SEQ ID NO：26)組成。
根據實施例，在CDR3-H中，X1係A或T，且X2係S。
根據實施例，CDR3-H係由AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：9)、AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO：21)或TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：27)組成。
該等實施例之任一組合構成本發明之一部分。
另一選擇為，本發明抗體包括：a)CDR1-H，其係由序列GFTFSX1YX2(SEQ ID NO：81)組成，其中X1係R或S、尤其S，且X2係A或D；及CDR2-H，其係由序列ISSGGX1X2X3(SEQ ID NO：82)組成，其中X1係不存在、S或G(尤其G)，X2係D、Y或I，且X3係T或I；及CDR3-H，其係由序列ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO：3)或ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO：15)組成；及/或b)CDR1-L，其係由序列QNVGTN(SEQ ID NO：4)組成；及CDR2-L，其係由序列SAS組成；及CDR3-L，其係由序列QQYNSYPLYT(SEQ ID NO：6)或QQYNNYPLYT(SEQ ID NO：18)組成。
根據實施例，CDR2-H係由序列ISSGGSYI(SEQ ID NO：2)或ISSGGDT(SEQ ID NO：14)組成。
根據實施例，CDR2-H係由序列ISSGGSYI(SEQ ID NO：2)組成且CDR3-H係由序列ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO：3)組成。
根據實施例，CDR2-H係由ISSGGDT(SEQ ID NO：14)組成且CDR3-H係由序列ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO：15)組成。
根據實施例，本發明抗體包括所謂的抗CEACAM5抗體MAb1、MAb2、MAb2K52R、MAb3、MAb4及MAb5中之一者之重鏈及/或輕鏈的CDR序列。
因此，本發明係關於包括以下各項之抗體： a)CDR1-H，其具有序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：1)或與SEQ ID NO：1相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-H，其具有序列ISSGGSYI(SEQ ID NO：2)或與SEQ ID NO：2相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR3-H，其具有序列ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO：3)或與SEQ ID NO：3相差一個胺基酸取代之序列；CDR1-L，其具有序列QNVGTN(SEQ ID NO：4)或與SEQ ID NO：4相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-L，其具有序列SAS或與SAS相差一個胺基酸取代之序列；及CDR3-L，其具有序列QQYNSYPLYT(SEQ ID NO：6)或與SEQ ID NO：6相差一個胺基酸取代之序列；或b)CDR1-H，其具有序列GFVFSSYD(SEQ ID NO：7)或與SEQ ID NO：7相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-H，其具有序列ISSGGGIT(SEQ ID NO：8)或與SEQ ID NO：8相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR3-H，其具有序列AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：9)或與SEQ ID NO：9相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR1-L，其具有序列ENIFSY(SEQ ID NO：10)或與SEQ ID NO：10相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-L，其具有序列NTK或NTR或與NTK或NTR相差一個胺基酸取代之序列；及CDR3-L，其具有序列QHHYGTPFT(SEQ ID NO：12)或與SEQ ID NO：12相差一個胺基酸取代之序列；或c)CDR1-H，其具有序列GFTFSRYA(SEQ ID NO：13)或與SEQ ID NO：13相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-H，其具有序列ISSGGDT(SEQ ID NO：14)或與SEQ ID NO：14相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR3-H，其具有序列ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO：15)或與SEQ ID NO：15相差一個胺基酸取代之序列；CDR1-L，其具有序列QNVGTN(SEQ ID NO：16)或與SEQ ID NO：16相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-L，其具有序列SAS或與SAS相差一個胺基酸取代之序列；及CDR3-L，其具有序列QQYNNYPLYT(SEQ ID NO：18)或與SEQ ID NO：18相差一個胺基酸取代之序列；或d)CDR1-H，其具有序列GFTFSSYD(SEQ ID NO：19)或與SEQ ID NO：19相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-H，其具有序列ISSYGGRT(SEQ ID NO：20)或與SEQ ID NO：20相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR3-H，其具有序列AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO：21)或與SEQ ID NO：21相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR1-L，其具有序列ENIYSY(SEQ ID NO：22)或與SEQ ID NO：22相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-L，其具有序列NAK或與NAK相差一或多個胺基酸取代之序列；及CDR3-L，其具有序列QHHYGIPFT(SEQ ID NO：24)或與SEQ ID NO：24相差一個胺基酸取代之序列；或e)包括以下各項之抗體：CDR1-H，其具有序列GFAFSSYD(SEQ ID NO：25)或與SEQ ID NO：25相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-H，其具有序列INSGGGIT(SEQ ID NO：26)或與SEQ ID NO：26相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR3-H，其具有序列TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：27)或與SEQ ID NO：27相差一或多個胺基酸取代之序列；CDR1-L，其具有序列ENIYSY(SEQ ID NO：28)或與SEQ ID NO：28相差一個胺基酸取代之序列；CDR2-L，其具有序列NAK或與NAK相差一或多個胺基酸取代之序列；及CDR3-L，其具有序列QHHYGTPFT(SEQ ID NO：30)或與SEQ ID NO：30相差一個胺基酸取代之序列。
在上述CDR序列中之一或多者中，可藉由取代、尤其藉由保守取代來改變一或多個個別胺基酸。該改變可意欲例如結合抗體之人類化移除糖基化位點或去醯胺位點。
可基於MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5之VH與VL區序列之比對並基於MAb2抗體變體中之單酸取代來取代胺基酸：
- 在CDR1-H中：在CDR1-H序列GFVFSSYD(SEQ ID NO：7)、GFTFSSYD(SEQ ID NO：19)或GFAFSSYD(SEQ ID NO：25)之位置1至6 之一或多者處，例如在位置3處；或在CDR1-H序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：1)或GFTFSRYA(SEQ ID NO：13)之位置6處；及/或
- 在CDR2-H中，在CDR2-H序列ISSGGGIT(SEQ ID NO：8)、ISSYGGRT(SEQ ID NO：20)或INSGGGIT(SEQ ID NO：26)之一或多個任一位置處或在位置2、4及7中之一者、兩者或三者處；或在CDR2-H序列ISSGGSYI(SEQ ID NO：2)或ISSGGDT(SEQ ID NO：14)之位置6、7及8(其中該序列長度為8個胺基酸)中之一者、兩者或三者處；及/或參見上文
- 在CDR3-H中，在CDR3-H序列AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：9)、AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO：21)或TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：27)之位置1、7、8、11及13中之一或多者處，例如在位置1及7中之一或兩者處；或在序列ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO：3)或ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO：15)之位置3、4、7、8、9、10或11處；及/或
- 在CDR1-L中，在CDR1-L序列ENIFSY(SEQ ID NO：10)或ENIYSY(SEQ ID NO：28)之位置1至5中之一或多者處，尤其在位置1、2、3及5中之一或多者處或在位置4處；及/或
- 在CDR2-L中，在序列NAK、NTK或NTR之位置2及/或位置3處，尤其若K存在則至少在位置3處。在該情形下，R例如可取代CDR2-L之位置3處之K；及/或
- 在CDR3-L中，在CDR3-L序列QHHYGIPFT(SEQ ID NO：24)或QHHYGTPFT(SEQ ID NO：30)之位置1、2、5、6、8及9中之一或多者處，例如在位置6處；或在CDR3-L序列QQYNSYPLYT(SEQ ID NO：6)或QQYNNYPLYT(SEQ ID NO：18)之位置5處。
根據實施例，在本發明抗體中：- CDR3-H序列AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：9)、 AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO：21)或TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：27)之位置5；及/或- CDR1-L序列ENIFSY(SEQ ID NO：10)或ENIYSY(SEQ ID NO：28)之位置6；及/或- CDR3-L序列QHHYGIPFT(SEQ ID NO：24)或QHHYGTPFT(SEQ ID NO：30)之位置3
未經修飾。
根據實施例，在CDR1-H序列GFVFSSYD(SEQ ID NO：7)、GFTFSSYD(SEQ ID NO：19)或GFAFSSYD(SEQ ID NO：25)中，取代CDR1-H之位置3處胺基酸之胺基酸係選自由T、A或V組成之群。
根據實施例，在CDR1-H序列GFTFSSYA(SEQ ID NO：1)或GFTFSRYA(SEQ ID NO：13)中，取代CDR1-H之位置6處胺基酸之胺基酸係R或S。
根據實施例，在CDR3-H序列AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：9)、AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO：21)或TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO：27)中，取代CDR3-H之位置1處胺基酸之胺基酸係A或T，及/或取代CDR3-H之位置7處胺基酸之胺基酸係T或S。
根據實施例，在CDR3-H序列ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO：3)或ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO：15)中，取代CDR3-H之位置3處胺基酸之胺基酸係V或P，取代位置4處胺基酸之胺基酸係A或N，取代位置7處胺基酸之胺基酸係D或G，取代位置8處胺基酸之胺基酸係S或N，取代位置9處胺基酸之胺基酸係S或P，取代位置10處胺基酸之胺基酸係F或A，或取代位置11處胺基酸之胺基酸係W或Y。
根據實施例，取代CDR1-L之位置4處胺基酸之胺基酸係Y或F。
根據實施例，在CDR2-L序列NAK、NTK或NTR中，取代CDR2-L之位置2處胺基酸之胺基酸係A或T。
根據實施例，在CDR3-L序列QQYNSYPLYT(SEQ ID NO：6)或QQYNNYPLYT(SEQ ID NO：18)中，取代CDR3-L之位置5處胺基酸之胺基酸係N或S。
根據實施例，在CDR3-L序列QHHYGIPFT(SEQ ID NO：24)或QHHYGTPFT(SEQ ID NO：30)中，取代CDR3-L之位置6處胺基酸之胺基酸係I或T。
上述實施例之任一組合構成本發明之一部分。
在實施例中，本發明抗體係習用抗體，例如習用單株抗體或抗體片段、雙特異性或多特異性抗體。
在實施例中，本發明抗體包括IgG或其片段或由其組成。
本發明亦提供如上文所定義至少進一步包括以下各項之抗體：五種所謂的抗CEACAM5抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5中之一者之重鏈可變結構域及/或輕鏈可變結構域。
因此，本發明實施例係關於包括以下各項之抗體：a)序列SEQ ID NO：31或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及/或序列SEQ ID NO：32或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或b)序列SEQ ID NO：33或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及/或序列SEQ ID NO：34或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或c)序列SEQ ID NO：35或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及/或序列SEQ ID NO：36或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或d)序列SEQ ID NO：37或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及/或序列SEQ ID NO：38或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或 e)序列SEQ ID NO：39或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及/或序列SEQ ID NO：40或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域。例如，若適宜，重鏈或輕鏈可變結構域之序列可與參考序列SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40不同，此不同之處在於一或多個胺基酸取代，尤其在於一或多個保守胺基酸取代及/或經規範殘基取代。在實施例中，重鏈或輕鏈可變結構域之序列可與參考序列SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40不同，此不同之處僅在於保守胺基酸取代。
與序列SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40相比之序列變化基本上將存在於框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L及/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H中之一或多者中。
然而，亦可在一或多個CDR中進行胺基酸取代。在實施例中，輕鏈可變結構域之序列可與序列SEQ ID NO：34不同，此不同之處至少在於用K取代SEQ ID NO：34位置52處之R(在CDR2-L中)。
本發明抗體及其片段可分別為鼠類抗體及鼠類抗體之片段。
抗體亦可為嵌合抗體，且在實施例中為鼠類/人類抗體，例如包括鼠類重鏈及輕鏈可變結構域及人類抗體之CH結構域及CL結構域之抗體。多肽可為該抗體之片段。
根據實施例，本發明抗體係：a)包括以下各項或由其組成之嵌合抗體：序列SEQ ID NO：41或與其至少85%一致之序列的重鏈或序列SEQ ID NO：42或與其至少85%一致之序列的輕鏈(即如實例5中所闡述之chMAb1之重鏈及/或輕鏈)；或重鏈及輕鏈，或b)包括以下各項或由其組成之嵌合抗體：序列SEQ ID NO：43或與其至少85%一致之序列的重鏈或序列SEQ ID NO：44或與其至少85%一致之序列的輕鏈；(即如實例5中所闡述之chMAb2之重鏈及/或輕 鏈)；或重鏈及輕鏈，或c)包括以下各項或由其組成之嵌合抗體：序列SEQ ID NO：45或與其至少85%一致之序列的重鏈或序列SEQ ID NO：46或與其至少85%一致之序列的輕鏈(即如實例5中所闡述之chMAb3之重鏈及/或輕鏈)；或重鏈及輕鏈，或d)包括以下各項或由其組成之嵌合抗體：序列SEQ ID NO：47或與其至少85%一致之序列的重鏈或序列SEQ ID NO：48或與其至少85%一致之序列的輕鏈(即如實例5中所闡述之chMAb4之重鏈及/或輕鏈)；或重鏈及輕鏈，或e)包括以下各項或由其組成之嵌合抗體：序列SEQ ID NO：49或與其至少85%一致之序列的重鏈或序列SEQ ID NO：50或與其至少85%一致之序列的輕鏈(即如實例5中所闡述之chMAb5之重鏈及/或輕鏈)；或重鏈及輕鏈，或f)如a)、b)、c)、d)或e)中所定義之嵌合抗體之片段。
抗體亦可係人類化抗體或人類化抗體之片段。在實施例中，本發明抗體可源自上文a)、b)、c)、d)、e)或f)中所定義之任一嵌合抗體之人類化。
諸多用於人類化抗體序列之方法為業內已知；例如參見Almagro及Fransson(2008)Front Biosci.13：1619-1633。一種常用方法係CDR移植或抗體改型，其涉及將供體抗體、通常為小鼠抗體之CDR序列移植至具有不同特異性之人類抗體之框架支架中。由於CDR移植可降低CDR經移植之非人類抗體之結合特異性及親和力，且因此降低生物活性，故可在CDR經移植抗體之所選位置引入回復突變以保留親代抗體之結合特異性及親和力。可使用可在文獻及抗體數據庫中獲得之資訊來鑑別可能回復突變之位置。作為回復突變候選者之胺基酸殘基通常係彼等位於抗體分子之表面者，而經埋藏或具有低表面暴露度之殘基 通常將發生變化。針對CDR移植及回復突變之替代性人類化技術係表面重修，其中保留非人類來源之非表面暴露殘基，而表面殘基變成人類殘基。另一替代技術稱為「引導選擇」(Jespers等人(1994)Biotechnology 12,899)且可用於自鼠類抗體衍生全人類抗體，從而保留親代抗體之表位及結合特徵。
對於嵌合抗體，人類化通常涉及可變區序列框架區之修飾。
為CDR一部分之胺基酸殘基通常並不結合人類化而發生改變，但在某些情形下可能期望改變個別CDR胺基酸殘基，以例如移除糖基化位點、去醯胺位點或不期望半胱胺酸殘基。N連接之糖基化係藉由將寡糖鏈連接至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中之天冬醯胺殘基來發生，其中X可係除Pro外之任一胺基酸。N-糖基化位點之移除可藉助例如保守取代使Asn或Ser/Thr殘基突變成不同殘基來達成。天冬醯胺及麩醯胺酸殘基之去醯胺可端視諸如pH及表面暴露等因素來發生。天冬醯胺殘基主要在存在於序列Asn-Gly中時，且其次在其他二肽序列(例如Asn-Ala)中，尤其易於去醯胺。當CDR序列中存在該去醯胺位點(例如Asn-Gly)時，可因此期望通常藉由保守取代移除一個相關殘基來移除該位點。在CDR序列中進行取代來移除一個相關殘基亦意欲涵蓋於本發明中。
採用所謂的「抗體MAb2」作為實例，人類化抗體或其片段可包括可變重鏈中之以下突變：P替代位置9之G；及/或G替代位置10之V；及/或S替代位置19之K；及/或R替代位置43之K；及/或G替代位置44之R；及/或A替代位置60之F；及/或S替代位置62之D；及/或K替代位置65之Q；及/或T替代位置87之K；及/或V替代位置89之I；及/或S替代位置113之A；該等位置係藉由參考SEQ ID NO：33給出。
仍採用所謂的「抗體MAb2」作為實例，人類化抗體或其片段可包括可變輕鏈中之下列突變：D替代位置17之E；及/或R替代位置18 之T；及/或P替代位置40之Q；及/或K替代位置45之Q；及/或R替代位置52之K；及/或D替代位置70之Q；及/或T替代位置74之K；及/或S替代位置76之N；及/或A替代位置84之G；及/或T替代位置85之S；該等位置係藉由參考SEQ ID NO：34給出。
在實施例中，本發明抗體係包括包含下列突變之重鏈或由其組成之人類化抗體，該等位置係藉由參考SEQ ID NO：33給出：a)P替代位置9之G；及G替代位置10之V；及S替代位置19之K；及R替代位置43之K；及S替代位置62之D；及K替代位置65之Q；及T替代位置87之K；或b)P替代位置9之G；及G替代位置10之V；及S替代位置19之K；及R替代位置43之K；及G替代位置44之R；及A替代位置60之F；及S替代位置62之D；及K替代位置65之Q；及T替代位置87之K；及V替代位置89之I；及S替代位置113之A；及/或包括包含下列突變之輕鏈之人類化抗體，該等位置係藉由參考SEQ ID NO：34給出：c)D替代位置17之E；及P替代位置40之Q；及K替代位置45之Q；及T替代位置74之K；及S替代位置76之N；或d)D替代位置17之E；及R替代位置18之T；及P替代位置40之Q；及K替代位置45之Q；及D替代位置70之Q；及T替代位置74之K；及S替代位置76之N；及A替代位置84之G；及T替代位置85之S；或e)D替代位置17之E；及R替代位置18之T；及P替代位置40之Q；及K替代位置45之Q；及R替代位置52之K；及D替代位置70之Q；及T替代位置74之K；及S替代位置76之N；及A替代位置84之G；及T替代位置85之S。
在實施例中，本發明抗體係藉由將本發明抗體之CDR移植至替代性抗體框架區、更具體而言移植至人類框架區中獲得之人類化抗體。 採用MAb2作為實例，已將MAb2K52R之6個CDR移植至由IGHV3-23及IGKV1D-39基因組成之人類框架中，且對應於VL(SEQ ID NO.34)中之位置34及位置53以及VH(SEQ ID NO.33)中之位置50引入三個回復突變，從而產生包括重鏈可變結構域序列SEQ ID NO：74及輕鏈可變結構域序列SEQ ID NO：75之抗體。
在實施例中，本發明抗體係包括以下各項或由其組成之人類化抗體：序列SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：74或與其至少85%一致之序列的重鏈；及/或序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：75或與其至少85%一致之序列的輕鏈(MAb2之人類化可變結構域重鏈及輕鏈)。
在實施例中，本發明抗體係包括以下各項之人類化抗體：序列SEQ ID NO：51或與其至少85%一致之序列的重鏈及序列SEQ ID NO：17或與其至少85%一致之序列的輕鏈，或序列SEQ ID NO：5或與其至少85%一致之序列的重鏈及序列SEQ ID NO：23或與其至少85%一致之序列的輕鏈，或序列SEQ ID NO：5或與其至少85%一致之序列的重鏈及序列SEQ ID NO：29或與其至少85%一致之序列的輕鏈，或序列SEQ ID NO：51或與其至少85%一致之序列的重鏈及序列SEQ ID NO：55或與其至少85%一致之序列的輕鏈，或序列SEQ ID NO：74或與其至少85%一致之序列的重鏈及序列SEQ ID NO：75或與其至少85%一致之序列的輕鏈。
在該人類化抗體或其片段中，可變結構域重鏈及輕鏈可包括人類受體框架區。人類化抗體進一步包括(若存在)人類重鏈及輕鏈恆定結構域。
在實施例中，本發明抗體係抗體huMAb2-3或其變體，即結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域且包括以下各項之經分離抗體： a)由序列SEQ ID NO：87或與其至少85%一致之序列組成的重鏈；或b)由序列SEQ ID NO：88或與其至少85%一致之序列組成的輕鏈或重鏈及輕鏈。
在實施例中，本發明抗體係抗體huMAb2-4(MAb2_VL1d VH1-IgG1)或其變體，即結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域且包括以下各項之經分離抗體：c)由序列SEQ ID NO：89或與其至少85%一致之序列組成的重鏈；及/或d)由序列SEQ ID NO：90或與其至少85%一致之序列組成的輕鏈。
本發明抗體亦可係單一結構域抗體或其片段。在本發明實施例中，單一結構域抗體片段可由可變重鏈(VHH)組成，該可變重鏈包括如上文所闡述抗體之CDR1-H、CDR2-H及CDR3-H。抗體亦可係重鏈抗體，即不含輕鏈之抗體，該抗體可或可不含有CH1結構域。
單一結構域抗體或其片段亦可包括駱駝科單一結構域抗體之框架區及視情況駱駝科單一結構域抗體之恆定結構域。
本發明抗體亦可係選自由以下組成之群之抗體片段(例如人類化抗體片段)：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2及雙鏈抗體。
抗體亦可係自抗體片段形成之雙特異性或多特異性抗體，至少一個抗體片段係本發明之抗體片段。多特異性抗體係如例如EP 2 050 764 A1或US 2005/0003403 A1中所闡述之多價蛋白複合物。
本發明之雙特異性或多特異性抗體可對以下各項具有特異性：(a)人類/食蟹獼猴CEACAM5上之A3-B3表位，其由所謂的MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5抗體中之一者所靶向；及(b)至少一種 其他抗原。根據實施例，至少一種其他抗原並非人類或食蟹獼猴CEACAM家族成員，且在實施例中並非人類及食蟹獼猴CEACAM1、人類及猴CEACAM6、人類及食蟹獼猴CEACAM7以及人類及食蟹獼猴CEACAM8中之至少一者或所有。根據另一實施例，至少一種其他抗原可係人類食蟹獼猴CEACAM5上之表位而非所謂的MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5抗體中之一者所靶向之該A3-B3表位。
該等抗體可藉由業內已知之任何技術來產生。在實施例中，該等抗體係藉由如下文所闡述之技術來產生。本發明之抗體及其片段可以經分離(例如純化)形式使用或含於載體(例如膜或脂質囊泡(例如脂質體))中。
核酸、載體及重組宿主細胞
本發明之又一目標係關於包括編碼如上文所定義之本發明抗體之序列或由其組成之核酸序列。
通常，該核酸為DNA或RNA分子，其可包含於任何適宜載體中，例如質體、黏質體、游離基因體、人工染色體、噬菌體或病毒載體。
術語「載體」、「選殖載體」及「表現載體」意指可藉助其將DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主細胞中以轉化宿主且促進所引入序列之表現(例如轉錄及轉譯)之媒劑。
因此，本發明之又一目標係關於包括本發明核酸之載體。
該等載體可包括調控元件，例如啟動子、增強子、終止子及諸如此類，以在投與個體後引起或直接表現該多肽。動物細胞用表現載體中所使用啟動子及增強子之實例包含SV40之早期啟動子及增強子(Mizukami T.等人1987)、莫洛尼小鼠(Moloney mouse)白血病病毒之LTR啟動子及增強子(Kuwana Y等人1987)、免疫球蛋白H鏈之啟動子(Mason JO等人1985)及增強子(Gillies SD等人1983)及諸如此類。
可使用任何動物細胞用表現載體，只要可插入並表現編碼人類抗體C區之基因即可。適宜載體之實例包含pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O'Hare K等人1981)、pSG1 β d2-4-(Miyaji H等人1990)及諸如此類。
質體之其他實例包含包括複製起點之複製質體或整合質體，例如pUC、pcDNA、pBR及諸如此類。
病毒載體之其他實例包含腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、皰疹病毒載體及AAV載體。該等重組病毒可藉由業內已知技術來產生，例如藉由轉染包裝細胞或藉由用輔助質體或病毒瞬時轉染來產生。病毒包裝細胞之典型實例包含PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞等。用於產生該等複製缺陷重組病毒之詳細方案可參見例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056及WO 94/19478。
本發明之又一目標係關於已經本發明之核酸及/或載體轉染、感染或轉化之細胞。
術語「轉化」意指將「外源」(即外來)基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞中，以使宿主細胞表現所引入之基因或序列，從而產生期望物質，通常為由所引入基因或序列編碼之蛋白質或酶。接受並表現所引入DNA或RNA之宿主細胞已經「轉化」。
可在適宜表現系統中使用本發明核酸來產生本發明重組抗體。術語「表現系統」意指在適宜條件下用於例如表現由載體攜載且引入宿主細胞中之外源DNA所編碼之蛋白質之宿主細胞及相容載體。
常用表現系統包含大腸桿菌(E.coli)宿主細胞及質體載體、昆蟲宿主細胞及桿狀病毒載體以及哺乳動物宿主細胞及載體。宿主細胞之其他實例包含(但不限於)原核細胞(例如細菌)及真核細胞(例如酵母菌 細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)。特異性實例包含大腸桿菌、克魯維酵母菌(Kluyveromyce)或釀酒酵母菌(Saccharomyce)、哺乳動物細胞系(例如Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞等)以及原代或已建立之哺乳動物細胞培養物(例如自淋巴母細胞、纖維母細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞產生者等)。實例亦包含小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、CHO細胞(其中二氫葉酸還原酶基因(下文稱為「DHFR基因」)有缺陷(Urlaub G等人；1980))、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662，下文稱為「YB2/0細胞」)及諸如此類。在實施例中，使用YB2/0細胞，此乃因嵌合或人類化抗體在此細胞中表現時ADCC活性增強。
為表現人類化抗體，表現載體可為以下類型：編碼抗體重鏈之基因及編碼抗體輕鏈之基因存在於單獨載體上或該兩個基因存在於同一載體上(串聯型)。根據構築人類化抗體表現載體之容易程度、引入動物細胞中之容易程度及動物細胞中抗體H鏈與L鏈表現量之間之平衡，人類化抗體表現載體為串聯型ShitaraK等人J Immunol Methods.1994年1月3日；167(1-2)：271-8)。串聯型人類化抗體表現載體之實例包含pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18及諸如此類。
本發明亦係關於產生表現本發明抗體之重組宿主細胞之方法，該方法包括由以下組成之步驟：(i)將如上文所闡述之重組核酸或載體以活體外或離體方式引入勝任宿主細胞中，(ii)以活體外或離體方式培養所獲得之重組宿主細胞，及(iii)視情況選擇表現及/或分泌該抗體之細胞。
可使用該等重組宿主細胞來產生本發明抗體。
產生本發明抗體之方法
本發明抗體可藉由業內已知之任何技術來產生，例如(但不限於) 單獨或呈組合形式之任何化學、生物、遺傳或酶技術。
已知期望序列之胺基酸序列，熟習此項技術者可藉由用於產生多肽之標準技術容易地產生該等抗體或免疫球蛋白鏈。例如，其可使用熟知固相方法使用市售肽合成裝置(例如由Applied Biosystems,Foster City,California製造者)並遵循製造商之說明書來合成。另一選擇為，本發明之抗體及免疫球蛋白鏈可藉由如業內所熟知之重組DNA技術來合成。例如，該等片段可以DNA表現產物形式於以下步驟後獲得：將編碼期望(多)肽之DNA序列納入表現載體中並將該等載體引入將表現期望多肽之適宜真核或原核宿主中，隨後可使用熟知技術將其自該等宿主分離。
本發明進一步關於產生本發明抗體之方法，該方法包括由以下組成之步驟：(i)培養本發明之經轉化宿主細胞；(ii)表現該抗體或多肽；及(iii)回收所表現之抗體或多肽。
本發明抗體可藉由習用免疫球蛋白純化程序自培養基適宜地分離，該等純化程序係例如蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
在實施例中，本發明之人類化嵌合抗體可藉由以下方式來產生：獲得編碼如前文所闡述之人類化VL及VH結構域之核酸序列，藉由將該等序列插入具有編碼人類抗體CH及人類抗體CL基因之動物細胞用表現載體中來構築人類嵌合抗體表現載體，及藉由將表現載體引入動物細胞中來表現編碼序列。
作為人類嵌合抗體之CH結構域，其可係屬於人類免疫球蛋白重鏈之任一區域，但彼等IgG類適宜，且亦可使用屬於IgG類之任一子類，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。而且，作為人類嵌合抗體之CL，其可係屬於人類免疫球蛋白輕鏈之任一區域，且可使用彼等κ類或λ類。
涉及習用重組DNA及基因轉染技術產生人類化或嵌合抗體之方法為業內所熟知(參見Morrison SL.等人(1984)及專利文件US5,202,238；及US5,204,244)。
基於習用重組DNA及基因轉染技術產生人類化抗體之方法為業內所熟知(例如，參見Riechmann L.等人1988；Neuberger MS.等人1985)。抗體可使用多種業內已知之技術來人類化，該等技術包含例如申請案WO2009/032661中所揭示之技術、CDR移植(EP 239,400；PCT公開案WO91/09967；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾(veneering)或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka GM等人(1994)；Roguska MA.等人(1994))及鏈改組(美國專利第5,565,332號)。亦知用於製備該等抗體之一般重組DNA技術(參見歐洲專利申請案EP 125023及國際專利公開案WO 96/02576)。
本發明Fab可藉由用蛋白酶(例如木瓜酶)處理與CEACAM5特異性反應之抗體來獲得。而且，該Fab可藉由以下方式來產生：將編碼抗體之兩條Fab鏈之DNA序列插入用於原核表現或真核表現之載體中，並將載體引入原核或真核細胞(若適宜)中以表現Fab。
本發明F(ab')2可藉由胃蛋白酶處理與CEACAM5特異性反應之抗體獲得。而且，該F(ab')2可經由硫醚鍵或二硫鍵結合下文所闡述之Fab'來產生。
本發明Fab'可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇)處理與CEACAM5特異性反應之F(ab')2來獲得。而且，該Fab'可藉由以下方式來產生：將編碼抗體Fab'鏈之DNA序列插入用於原核表現之載體或用於真核表現之載體中，並將載體引入原核或真核細胞(若適宜)中以實施其表現。
本發明scFv可藉由以下方式來產生：採集如前文所闡述之CDR或 VH及VL結構域之序列，構築編碼scFv片段之DNA，將DNA插入原核或真核表現載體中，且然後將表現載體引入原核或真核細胞(若適宜)中以表現scFv。為產生人類化scFv片段，可使用稱為CDR移植之熟知技術，該技術涉及選擇本發明之互補決定區(CDR)，並將其移植至已知三維結構之人類scFv片段框架上(例如，參見W098/45322；WO 87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。
本發明抗體之修飾
本發明涵蓋本文所闡述抗體之胺基酸序列修飾。例如，可期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。已知當人類化抗體係藉由在人類抗體VH及VL中之FR中僅簡單移植源自非人類動物之抗體VH及VL中之CDR來產生時，抗原結合活性與源自非人類動物之初始抗體之抗原結合活性相比可能有所降低。人們認為，非人類抗體VH及VL之不僅CDR且FR中之若干胺基酸殘基可能與抗原結合活性直接或間接相關。因此，源自人類抗體VH及VL之FR之不同胺基酸殘基對該等胺基酸殘基之取代將降低結合活性。為解決該問題，在移植有非人類CDR之人類抗體中，必須進行嘗試以鑑別在人類抗體VH及VL之FR之胺基酸序列中具有以下性質之胺基酸殘基：與抗體之結合直接相關，或與CDR之胺基酸殘基相互作用，或維持抗體之三維結構，並與抗原之結合直接相關。降低的抗原結合活性可藉由用源自非人類動物之初始抗體之胺基酸殘基替代經鑑別之胺基酸來提高。
在本發明之一實施例中，將本發明鼠類抗體之六個CDR及來自其框架之三個胺基酸移植至人類框架中，從而產生具有重鏈序列SEQ ID NO：74及輕鏈序列SEQ ID NO：75之人類化抗體(MAb2_VLg5VHg2)，該人類化抗體維持與人類及食蟹猴CEACAM5之結合特徵。
可對本發明抗體之結構及編碼本發明抗體之DNA序列作出修飾 及改變，且仍產生具有期望特徵之功能抗體或多肽。
在對多肽之胺基酸序列作出改變中，可考慮胺基酸之親疏水性指數。胺基酸親疏水性指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中之重要性通常為業內所理解。人們公認，胺基酸之相對親疏水特徵有利於所得蛋白質之二級結構，該二級結構進而定義該蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及諸如此類)之相互作用。已基於胺基酸之疏水性及電荷特徵對每一胺基酸指派親疏水性指數，該等係：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
本發明之又一目標亦涵蓋本發明多肽之功能保守變體。
例如，在蛋白質結構中在不顯著損失活性之情況下，某些胺基酸可經其他胺基酸取代。由於蛋白質之相互作用能力及性質定義其生物功能活性，故可在蛋白質序列(且當然在其DNA編碼序列中)進行某些胺基酸取代，但同時仍獲得具有類似性質之蛋白質。因此，預期可對本發明之抗體序列或編碼該等多肽之相應DNA序列作出各種改變，而不會對其生物活性造成明顯損失。
業內已知，某些胺基酸可經具有相似親疏水性指數或評分之其他胺基酸取代，且仍產生具有相似生物活性之蛋白質，即仍獲得在生物功能上等效之蛋白質。亦可使用已廣為接受之技術(例如丙胺酸掃描方法)來鑑別本發明抗體或多肽中所有可經取代而不會對抗原結合造成顯著損失之胺基酸。可將該等殘基定性為中性，此乃因其並不參與抗原結合或維持抗體之結構。該等中性位置中之一或多者可經丙胺酸或另一胺基酸取代而不改變本發明抗體或多肽之主要特徵。
此在本發明中藉由對MAb2K52R之CDR實施丙胺酸掃描方法來闡釋，其顯示該等CDR之若干位置呈現為中性，此乃因丙胺酸確實可經取代而不對與人類及食蟹猴CEACAM5之結合造成顯著影響。因此，預期源自該等中性取代之抗體變體與親代抗體功能一致。在所提供之實例6.4中，對MAb2之人類化變體進行取代，但可預測在MAb2、Mab4或Mab5之任一變體中引入相同變化形式時亦將維持生物功能，此乃因該等相關抗體皆攜載同組6個CDR或非常密切相關者。中性位置可定義為此抗體家族(SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：75)VL序列之殘基27、28、29、31、51、52、89、90、93、94、96、97及此抗體家族(SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：74)VH序列之殘基26至31、51至58、97、103、104、107、109。
中性位置可視為Mab2、Mab4或Mab5 CDR中可納入任一胺基酸取代之位置。實際上，在丙胺酸掃描之原理中，選擇丙胺酸之原因在於此殘基不攜帶特異性結構或化學特徵。通常認為，若丙胺酸可取代特定胺基酸而不改變蛋白質之性質，則許多其他(若非所有)胺基酸取代亦可能呈中性。在丙胺酸為野生型胺基酸之相反情形下，若可顯示特異性取代呈中性，則其他取代可能亦為中性。
在所提供之實例6.4中，亦鑑別出Mab2、Mab4或Mab5之CDR中之四個位置在丙胺酸掃描中並非中性，但其中保守型胺基酸取代具有中性效應(此抗體家族VL序列之殘基30及92以及VH序列之殘基98及100)。
亦預期，兩條抗體鏈序列之任一者或兩者中不同位置之兩個或更多個中性突變組合時通常產生基本上保持親代抗體之功能活性之抗體。此已由例如MAb2_VLg5VHg2中之組合取代LC_T51A與 LC_T94A、VL_S31A與VH_G54Y、或VL_T53I與VH_S53A闡釋。
如上文概述，因此胺基酸取代通常係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小及諸如此類。將任一前述特徵考慮在內之實例性取代為熟習此項技術者所熟知，且包含：精胺酸與離胺酸；麩胺酸與天冬胺酸；絲胺酸與蘇胺酸；麩醯胺酸與天冬醯胺酸；以及纈胺酸、白胺酸與異白胺酸。
亦可期望改變本發明抗體之效應子功能，例如以增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。此可藉由在抗體之Fc區引入一或多個胺基酸取代達成。另一選擇或另外，可在Fc區中引入半胱胺酸殘基，由此允許在此區域中形成鏈間二硫鍵。因此產生之同二聚抗體可具有改良之內化能力及/或增強之補體介導之殺細胞及/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Caron PC.等人1992；及Shopes B.1992)。
本發明抗體之另一胺基酸修飾類型可用於改變抗體之初始糖基化模式，即藉由缺失一或多個於抗體中發現之碳水化合物部分及/或添加一或多個抗體中不存在之糖基化位點來實施。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸中任一者之存在產生潛在糖基化位點，其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸。可藉由改變胺基酸序列以使抗體中含有一或多個上文所闡述之三肽序列(對於N-連接之糖基化位點)來向抗體中方便地添加或缺失糖基化位點。
另一修飾類型涉及以電腦模擬或實驗方式移除經鑑別為可能產生抗體製劑之降解產物或異質性之序列。作為實例，天冬醯胺及麩醯胺酸殘基之去醯胺可端視諸如pH及表面暴露等因素而發生。天冬醯胺殘基主要在存在於序列Asn-Gly中時，且其次在其他二肽序列(例如Asn-Ala)中，尤其易於去醯胺。當本發明抗體或多肽中存在該去醯胺位點(尤其Asn-Gly)時，可因此期望通常藉由保守取代移除一個相關 殘基來移除該位點。在序列中進行該等取代來移除一個相關殘基亦意欲涵蓋於本發明中。
另一共價修飾類型涉及使糖苷與抗體化學或酶偶合。該等程序之優點在於其無需在宿主細胞中產生對N-或O-連接之糖基化具有糖基化能力之抗體。端視所使用偶合模式，可使糖連接至以下各項：(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離巰基，例如半胱胺酸之游離巰基；(d)游離羥基，例如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之游離羥基；(e)芳香族殘基，例如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳香族殘基；或(f)麩醯胺酸之醯胺基團。例如，該等方法闡述於WO87/05330中。
抗體上存在之任何碳水化合物部分之移除可以化學或酶方式來完成。化學去糖基化需要將抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理使得除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)外之大部分或所有糖裂解，同時使得抗體完整。化學去糖基化闡述於Sojahr H.等人(1987)及Edge,AS.等人(1981)中。抗體上碳水化合物部分之酶裂解可藉由使用多種內切及外切糖苷酶來達成，如Thotakura,NR.等人(1987)中所闡述。
抗體之另一共價修飾類型包括抗體與多種非蛋白質性聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧基伸烷基)中之一者以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所闡釋之方式連接。
免疫偶聯物
本發明亦包含細胞毒性偶聯物、或免疫偶聯物、或抗體-藥物偶聯物、或偶聯物。如本文所使用，所有該等術語具有相同含義且可互換。
已經由SPDB連接體(吡啶基二硫丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)將鼠類 抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5偶聯至類美登素(DM4)。發現所得抗體-藥物偶聯物(ADC)對MKN45人類胃癌細胞具有細胞毒性活性，且IC50值係1nM。
相似地，抗體-SPDB-DM4偶聯物係基於MAb1、MAb2、MAb4及MAb5中每一者之嵌合形式製備。針對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤來評估兩種劑量之所得chMAb1-SPDB-DM4、chMAb2-SPDB-DM4、chMAb3-SPDB-DM4及chMAb4-SPDB-DM4。對每一治療組及對照組之腫瘤體積變化以及腫瘤消退%之分析指示，chMAb2-SPDB-DM4、chMAb4-SPDB-DM4及chMAb5-SPDB-DM4至少在所分析之最高劑量下具有高活性，且chMAb2-SPDB-DM4在兩種分析劑量下皆有活性。尤其獲得高達82%之腫瘤消退百分比。
抗體-SPDB-DM4偶聯物亦係使用MAb2之人類化變體(huMAb2-1-SPDB-DM4、huMAb2-2-SPDB-DM4及huMAb2-3-SPDB-DM4)來製備。比較包含MAb2之嵌合(chMAb2-SPDB-DM4)或人類化變體之ADC與不相關抗體-SPDB-DM4對MKN45細胞之細胞毒性活性。MAb2ADC之所有嵌合及人類化變體皆展現IC50值1nM，即IC50值係所量測不相關DM4偶聯物細胞毒性活性的1/53至1/35，由此指示抗CEACAM5偶聯物之CEACAM5介導之細胞毒性活性。
評估huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-4-SPDB-DM4對皮下植入雌性CD-1裸小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤的抗腫瘤活性且與chMAb2-SPDB-DM4進行比較。所有偶聯物在所分析之最高劑量(10mg/kg)下皆具有高活性。
進一步評估huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-3-磺基-SPDB-DM4對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤的抗腫瘤活性。huMAb2-3-SPDB-DM4在5mg/kg及2.5mg/kg下具有活 性，huMAb2-3-磺基-SPDB-DM4在5mg/kg下具有高活性且在2.5mg/kg下具有活性。
進一步評估huMAb2-3-SPDB-DM4對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性肺LUN-NIC-0014腫瘤的抗腫瘤活性且發現其在10mg/kg及5mg/kg下具有高活性。
每一DM4偶聯物包含平均數目介於2至5範圍內之DM4分子(或「藥物對抗體比率」或「DAR」)。
因此，本發明係關於包括連接或偶聯至至少一種生長抑制劑(例如細胞毒性劑或放射性同位素)之本發明抗體之「免疫偶聯物」。
「生長抑制劑」或「抗增殖劑」可無差別地使用，其係指在活體外或活體內抑制細胞、尤其腫瘤細胞生長之化合物或組合物。
如本文所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。術語「細胞毒性劑」意欲包含化學治療劑、酶、抗生素及毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變體)以及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌藥。在一些實施例中，細胞毒性劑係類紫杉醇、長春花、類美登素或類美登素類似物(例如DM1或DM4)、小藥物、茅屋黴素(tomaymycin)或吡咯并苯并二氮呯衍生物、念珠藻素(cryptophycin)衍生物、來普黴素(leptomycin)衍生物、奧裏斯他汀(auristatin)或多拉司他汀(dolastatin)類似物、前藥、拓撲異構酶II抑制劑、DNA烷基化劑、抗微管蛋白劑、CC-1065或CC-1065類似物。
如本文所使用，「類美登素」指示類美登素及類美登素類似物。類美登素係抑制微管形成且對哺乳動物細胞具有高毒性之藥物。
適宜類美登素之實例包含美登木醇(maytansinol)及美登木醇類似物。
適宜美登木醇類似物之實例包含彼等具有經修飾芳香環及彼等 具有其他位置修飾者。該等適宜類美登素揭示於美國專利第4,424,219號；第4,256,746號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,362,663號；第4,364,866號；第4,450,254號；第4,322,348號；第4,371,533號；第6,333,410號；第5,475,092號；第5,585,499號；及第5,846,545號中。
具有經修飾芳香環之適宜美登木醇類似物之特定實例包含：(1)C-19-去氯(美國專利第4,256,746號)(藉由安絲菌素(ansamytocin)P2之LAH還原來製備)；(2)C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4,361,650號及第4,307,016號)(藉由使用鏈黴菌屬(Streptomyce)或放線菌屬(Actinomyce)去甲基化或使用LAH去氯來製備)；及(3)C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(藉由使用醯氯醯化來製備)。
具有其他位置修飾之適宜美登木醇類似物之特定實例包含：(1)C-9-SH(美國專利第4,424,219號)(藉由使美登木醇與H2S或P2S5反應來製備)；(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利第4,331,598號)；(3)C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4,450,254號)(自奴卡菌屬(Nocardia)製備)；(4)C-15-羥基/醯氧基(美國專利第4,364,866號)(藉由鏈黴菌屬轉化美登木醇來製備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利第4,313,946號及第4,315,929號)(自滑桃樹(Trewia nudiflora)分離)；(6)C-18-N-去甲基(美國專利第4,362,663號及第4,322,348號)(藉 由鏈黴菌屬對美登木醇去甲基化來製備)；及(7)4,5-去氧基(美國專利第4,371,533號)(藉由美登木醇之三氯化鈦/LAH還原來製備)。
在本發明實施例中，本發明之細胞毒性偶聯物使用含有硫醇之類美登素(DM1)(在形式上稱為N 2’-去乙醯基-N 2’-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(maytansine))作為細胞毒性劑。DM1係由以下結構式(I)表示：
在另一實施例中，本發明之細胞毒性偶聯物使用含有硫醇之類美登素DM4(在形式上稱為N 2’-去乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素)作為細胞毒性劑。DM4係由以下結構式(II)表示：
在本發明之又一實施例中，可使用其他美登素，包含在帶有硫原子之碳原子上帶有單或二烷基取代之含有硫醇及二硫化物之類美登 素。該等類美登素包含在C-3、C-14羥基甲基、C-15羥基或C-20去甲基處具有經帶有位阻巰基之醯基醯化之胺基酸側鏈之類美登素，其中帶有硫醇官能基之醯基之碳原子具有一或兩個取代基，該等取代基為CH3、C2H5、直鏈或具支鏈烷基或烯基，具有可存在於溶液中之1至10種試劑及任何聚集物。
該等細胞毒性劑及偶聯方法之實例進一步在申請案WO2008/010101中給出，該申請案以引用方式併入本文中。
術語「放射性同位素」意欲包含適用於治療癌症之放射性同位素，例如At211、Bi212、Er169、I131、I125、Y90、In111、P32、Re186、Re188、Sm153、Sr89及Lu之放射性同位素。該等放射性同位素通常主要發射β-輻射。在實施例中，放射性同位素為α-發射體同位素，更精確而言為發射α輻射之釷227。本發明之免疫偶聯物可如申請案WO2004/091668中所闡述來製備。
在一些實施例中，本發明抗體直接或經由可裂解或不可裂解連接體共價連接至至少一種生長抑制劑。
如本文所使用，「連接體」意指包括將多肽共價連接至藥物部分之共價鍵或原子鏈之化學部分。
偶聯物可藉由活體外方法來製備。為連接藥物或前藥與抗體，使用連接基團。適宜連接基團為業內所熟知且包含二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團及酯酶不穩定性基團。本發明抗體與細胞毒性劑或生長抑制劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白偶合劑來製造，該等雙功能蛋白偶合劑包含(但不限於)吡啶基二硫丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)、丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫]-2,5-二側氧基-1-吡咯啶基酯(硝基-SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫基)-2-磺基-丁酸(磺基-SPDB)、(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDP)、(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基 酯(SMCC)、亞胺基硫(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人(1987)中所闡述來製備。經碳標記之1-異硫氰酸苄基甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑(WO 94/11026)。
連接體可係促進細胞毒性劑或生長抑制劑在細胞中釋放之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、酯酶不穩定性連接體、光不穩定性連接體或含有二硫化物之連接體(例如，參見美國專利第5,208,020號)。連接體亦可係在一些情形下可引起較佳耐受之「不可裂解連接體」(例如SMCC連接體)。
另一選擇為，包括本發明抗體及細胞毒性或生長抑制性多肽之融合蛋白可藉由重組技術或肽合成來製造。DNA之長度可包括編碼偶聯物之兩個部分之各別區域，該等部分彼此毗鄰或藉由編碼連接體肽之區域隔開，該編碼連接體肽之區域不會破壞偶聯物之期望性質。
本發明抗體亦可藉由使多肽與活化前藥之酶偶聯來用於酶介導之依賴性前藥療法中，該酶將前藥(例如，肽基化學治療劑，參見WO81/01145)轉化為活性抗癌藥物(例如，參見WO 88/07378及美國專利第4,975,278號)。可用於ADEPT之免疫偶聯物之酶組份包含任何能夠以將前藥轉化為其活性、細胞毒性更強之形式的方式作用於前藥之酶。可用於本發明方法中之酶包含(但不限於)鹼性磷酸酶，其可用於將含磷酸酯之前藥轉化為游離藥物；芳基硫酸酯酶，其可用於將含硫酸酯之前藥轉化為游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其可用於將非毒性氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌(serratia)蛋 白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B及L)，其可用於將含肽前藥轉化為游離藥物；D-丙胺醯羧肽酶，其可用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，例如O-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其可用於將糖基化前藥轉化為游離藥物；P-內醯胺酶，其可用於將經P-內醯胺衍生之藥物轉化為游離藥物；及青黴素(penicillin)醯胺酶，例如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶，其可用於將胺氮處分別經苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生之藥物轉化為游離藥物。該等酶可藉由業內熟知之技術(例如使用上文所論述之異雙功能性交聯試劑)共價結合至本發明多肽。
根據實施例，在本發明偶聯物中，生長抑制劑為類美登素，在實施例中為DM1或DM4。
在該偶聯物中，抗體係藉由連接基團偶聯至該至少一種生長抑制劑。在實施例中，該連接基團為可裂解或不可裂解連接體，例如SPDB、磺基-SPDB或SMCC。
偶聯物可選自由以下組成之群： i)式(III)之抗體-SPDB-DM4偶聯物 ii)式(IV)之抗體-磺基-SPDB-DM4偶聯物 及iii)式(V)之抗體-SMCC-DM1偶聯物
在該實施例中，偶聯物中所包含之抗體係選自由以下組成之群：i)包括重鏈序列SEQ ID NO：51及輕鏈序列SEQ ID NO：17之人類化抗體，ii)包括重鏈序列SEQ ID NO：5及輕鏈序列SEQ ID NO：23之人類化抗體，iii)包括重鏈序列SEQ ID NO：5及輕鏈序列SEQ ID NO：29之人類 化抗體，及iv)包括重鏈序列SEQ ID NO：51及輕鏈序列SEQ ID NO：55之人類化抗體。
在實施例中，偶聯物係如上文所定義之式(III)、(IV)或(V)偶聯物，其中抗體係包括重鏈序列SEQ ID NO：5及輕鏈序列SEQ ID NO：29之人類化抗體。
通常，偶聯物可藉由包括以下步驟之製程來獲得：(i)使視情況緩衝之細胞結合劑(例如本發明抗體)水溶液與連接體及細胞毒性化合物之溶液接觸；(ii)然後視情況分離(i)中所形成之偶聯物與未反應之細胞結合劑。
細胞結合劑水溶液可使用諸如磷酸鉀、乙酸鹽、檸檬酸鹽或N-2-羥基乙基六氫吡-N’-2-乙磺酸(Hepes緩衝液)等緩衝液來緩衝。緩衝液取決於細胞結合劑之性質。細胞毒性化合物係存於極性有機溶劑(例如二甲基亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA))之溶液中。
反應溫度通常包括20℃與40℃之間者。反應時間可自1小時至24小時變化。細胞結合劑與細胞毒性劑之間之反應可藉由粒徑排阻層析(SEC)使用折射及/或UV檢測器來監測。若偶聯物產率過低，則可延長反應時間。
熟習此項技術者可使用多種不同層析方法來實施步驟(ii)之分離：可藉由例如SEC、吸附層析(例如離子交換層析、IEC)、疏水相互作用層析(HIC)、親和層析、混合載體層析(例如羥基磷灰石層析)或高效液相層析(HPLC)來純化偶聯物。亦可使用透析或透析過濾來純化。
如本文所使用，術語「聚集物」意指可在兩種或更多種細胞結合劑之間形成之締合，該等試劑可藉由偶聯修飾或不經修飾。聚集物 可在多個參數之影響下形成，該等參數係例如溶液中細胞結合劑之高濃度、溶液pH、高剪切力、所鍵結二聚體之數目及其疏水性特徵、溫度(參見Wang及Gosh,2008,J.Membrane Sci.,318：311-316及其中所引用之參考文獻)；應注意，並未明確確認該等參數中之一些之相對影響。在蛋白質及抗體之情形下，熟習此項技術者將參考Cromwell等人(2006,AAPS Jounal,8(3)：E572-E579)。可使用諸如SEC等熟習此項技術者熟知之技術來測定聚集物中之內容物(參見Walter等人，1993,Anal.Biochem.,212(2)：469-480)。
在步驟(i)或(ii)後，可將含有偶聯物之溶液提交給層析、超濾及/或透析過濾之額外步驟(iii)。
在該等步驟結束時在水溶液中回收偶聯物。
根據實施例，本發明偶聯物之特徵在於介於1至10、例如2至5、尤其3至4範圍內之「藥物對抗體比率」(或「DAR」)。包含類美登素分子之偶聯物通常如此。
此DAR值可隨所使用抗體及藥物(即生長抑制劑)之性質以及用於偶聯之實驗條件(如生長抑制劑/抗體比率、反應時間、溶劑及共溶劑(若存在)之性質)而變化。因此，抗體與生長抑制劑之間之接觸形成包括若干藥物對抗體比率彼此不同之偶聯物、視情況裸抗體、視情況聚集物的混合物。因此，所測定之DAR為平均值。
可用於測定DAR之方法在於以分光光度計方式量測實質上純化之偶聯物溶液在λD與280nm下之吸光度之比率。280nm係通常用於量測蛋白質濃度(例如抗體濃度)之波長。選擇波長λD以便辨別藥物與抗體，即如熟習此項技術者所易知，λD係藥物具有高吸光度之波長且λD與280nm距離足夠遠以避免藥物與抗體吸光度峰之大量重疊。在類美登素分子之情形下λD可選擇為252nm。DAR計算之方法可源自AntonwS.Dimitrov(編輯)，LLC,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols， 第525,445卷，Springer Science：偶聯物在λD(AλD)及280nm(A280)下之吸光度係在粒徑排阻層析(SEC)分析之單體峰(以允許計算「DAR(SEC)」參數)上或使用典型分光光度計裝置(以允許計算「DAR(UV)」參數)來量測。吸光度可如下表示：AλD=(cD×εDλD)+(cA×εAλD)
A280=(cD×εD280)+(cA×εA280)
其中：
˙cD及cA分別為溶液中藥物及抗體之濃度
˙εDλD及εD280分別為藥物在λD及280nm下之莫耳消光係數
˙εAλD及εA280分別為抗體在λD及280nm下之莫耳消光係數。
對該兩個具有未知數之等式之解析產生以下等式：cD=[(εA280×AλD)-(εAλD×A280)]/[(εDλD×εA280)-(εAλD×εD280)]
cA=[A280-(cD×εD280)]/εA280
然後自藥物濃度對抗體濃度之比率計算平均DAR：DAR=cD/cA。
醫藥組合物
本發明抗體或免疫偶聯物可與醫藥上可接受之賦形劑及視情況持續釋放基質(例如生物可降解聚合物)組合，以形成治療性組合物。
因此，本發明之另一目標係關於包括本發明之抗體或免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。
本發明亦係關於本發明之多肽或免疫偶聯物，其用作藥劑。
「醫藥上」或「醫藥上可接受」係指當投與哺乳動物、尤其人類(若適宜)時並不產生不利、過敏或其他不幸反應之分子實體及組合物。醫藥上可接受之載劑或賦形劑係指無毒性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或任何類型之調配物輔助劑。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包含任何及所有溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌及抗真菌劑及生理上相容之類似試劑。適宜載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包含以下各項中之一或多者：水、胺基酸、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液；胺基酸及衍生物，例如組胺酸、精胺酸、甘胺酸、脯胺酸、甘胺醯甘胺酸；無機鹽NaCl、氯化鈣；糖或多元醇，例如右旋糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性劑，例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆(poloxamer)188；及諸如此類，及其組合。在許多情形下，在組合物中較佳包含等滲劑，例如糖、多元醇或氯化鈉，且調配物亦可含有抗氧化劑(例如色胺)及穩定劑(例如Tween 20)。
醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案通常端視欲治療之病況、疾病之嚴重程度、患者之年齡、體重及性別等而定。
本發明之醫藥組合物可經調配以供局部、口服、非經腸、鼻內、靜脈內、肌內、皮下或眼內投與及諸如此類。
在實施例中，醫藥組合物含有為能夠注射之調配物醫藥上可接受之媒劑。該等媒劑可為等滲、無菌、鹽水溶液(磷酸一鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及諸如此類或該等鹽之混合物)或視情況添加無菌水或生理鹽水後可構成可注射溶液之乾燥、尤其凍乾組合物。
醫藥組合物可經由藥物組合器件來投與。
用於投與之劑量可隨各種參數之變化及例如相關病理之所使用投與模式之變化或另一選擇為隨治療之期望持續時間之變化來調整。
為製備醫藥組合物，可將有效量之本發明抗體或免疫偶聯物溶解或分散於醫藥上可接受之載劑或水性介質中。
適於可注射應用之醫藥形式包含無菌水溶液或分散液；調配 物，其包含芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；及無菌粉末，其用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液。在所有情形下，該形式必須無菌且可使用適當器件或系統注射以便遞送而不降解。其必須在製造及儲存條件下穩定且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。
呈游離鹼或藥理上可接受之鹽形式之活性化合物之溶液可在與表面活性劑適當混合之水中製備。分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
可將本發明之多肽、抗體或免疫偶聯物調配成呈中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽包含酸加成鹽(使用蛋白質之游離胺基形成者)及使用無機酸(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸及諸如此類)形成者。使用游離羧基形成之鹽亦可源自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等無機鹼或諸如異丙胺、三甲胺、甘胺酸、組胺酸或普魯卡因(procaine)及諸如此類等有機鹼。
載劑亦可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及植物油。可(例如)藉由使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液情形下藉由維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑或抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來防止微生物作用。在許多情形下，較佳應包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
無菌可注射溶液可藉由以下方式來製備：將所需量之活性化合物納入視需要具有上文所列舉之任一其他成份之適當溶劑中，然後進 行過濾滅菌。通常，分散液係藉由以下方式來製備：將各種無菌活性成份納入含有基本分散介質及來自彼等上文所列舉成份之所需其他成份之無菌媒劑中。在使用無菌粉末製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其可自預先經無菌過濾之溶液產生由活性成份加上任一所期望額外成份構成之粉末。
本文亦涵蓋用於直接注射之更濃或高度濃縮溶液之製備，其中預期使用DMSO作為溶劑可產生極快速滲透，從而將高濃度之活性劑遞送至小腫瘤區域。
調配後，溶液將以與劑量調配物相容之方式並以治療有效量來投與。調配物可容易地以諸如上文所闡述之可注射溶液類型等多種劑型投與，但亦可採用藥物釋放膠囊及諸如此類。
例如，對於水溶液之非經腸投與，溶液(若需要)應經適當緩衝且藉助足量鹽水或葡萄糖首先使液體稀釋劑等滲。該等水溶液尤其適於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。就此而言，根據本發明，可採用之無菌水性介質將為彼等熟習此項技術者所知。例如，可將一劑量溶解於1ml NaCl等滲溶液中且添加至1000ml皮下灌注液中或在所提出之輸注位點處注射(例如，參見「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版，第1035-1038頁及第1570-1580頁)。端視所治療個體之病況，劑量必然將發生一些變化。負責投與之人在任何情形下將決定個別個體之適宜劑量。
本發明抗體或免疫偶聯物可在治療混合物內經調配以使每劑量包括約0.01毫克至100毫克左右。
除經調配用於非經腸投與(例如靜脈內或肌內注射)之抗體或免疫偶聯物之外，其他醫藥上可接受之形式包含例如錠劑或用於口服投與之其他固體、時間釋放膠囊及當前所使用之任何其他形式。
在某些實施例中，涵蓋使用脂質體及/或奈米粒子將多肽引入宿 主細胞中。脂質體及/或奈米粒子之形成及使用為彼等熟習此項技術者所知。
奈米膠囊通常可以穩定且再現之方式囊封化合物。為避免因細胞內聚合物過載而產生之副作用，通常使用能夠在活體內降解之聚合物來設計該等超細粒子(大小約為0.1μm)。預期在本發明中使用滿足該等要求之生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯奈米粒子或生物可降解的聚乳酸或聚乳酸共乙交酯奈米粒子，且可容易地製造該等粒子。
脂質體係自分散於水性介質中且自發形成多層同心雙層囊泡(亦稱為多層囊泡(MLV))之磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm之直徑。對MLV進行音波處理可形成單層小囊泡(SUV)，其直徑介於200Å至500Å範圍內，核心中含有水溶液。脂質體之物理特徵取決於pH、離子強度及二價陽離子之存在。
治療方法及用途
本發明者已顯示，五種其已產生之抗體能夠內化結合後之CEACAM5-抗體複合物。此外其已顯示，該等抗體與細胞毒性類美登素(DM4)之組合誘導針對活體外人類MKN45腫瘤細胞之細胞毒性活性。其亦已顯示，在源自患者之人類原發性結腸腫瘤異種移植物之鼠類模型中，該等免疫偶聯物在以5mg/kg及2.5mg/kg之劑量使用且在植入腫瘤後第14天單次注射時誘導顯著的活體內抗腫瘤活性。
因此，本發明之多肽、抗體、免疫偶聯物或醫藥組合物可用於治療癌症。
欲使用本發明之抗體、免疫偶聯物或醫藥組合物治療之癌症係表現CEACAM5、尤其與同一組織來源之正常(即非腫瘤)細胞相比過表現CEACAM5之癌症。癌細胞對CEACAM5之表現可容易地如以下「診斷用途」部分中所闡述藉由例如使用本發明抗體及尤其藉由例如如實例8中所闡述之免疫組織化學方法來分析。
在實施例中，癌症可為結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌(例如膽管癌)、前列腺癌或皮膚癌。藉由免疫組織化學使用本發明之小鼠抗人類CEACAM5抗體對一組人類腫瘤之篩選確實顯示該等類型之癌症中之抗體染色，如實例8中進一步詳細闡述。
本發明之抗體或免疫偶聯物可單獨使用或與任何適宜生長抑制劑組合使用。
本發明抗體可偶聯或連接至如前文所闡述之生長抑制劑、細胞毒性劑或活化前藥之酶。本發明抗體確實可用於使該生長抑制劑、細胞毒性劑或前藥靶向在其表面上表現或過表現CEACAM5之癌細胞。
業內亦熟知治療性單株抗體可消耗帶有抗體所特異性識別之抗原之細胞。此消耗可經由至少三種機制來介導：抗體介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性溶解及藉助抗體所靶向之抗原給出之信號的腫瘤生長之直接抗腫瘤抑制。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下靶細胞之溶解。典型補體路徑之活化係藉由結合補體系統之第一組份與結合至其同源抗原之抗體來起始。為評價補體活化，可實施例如如Gazzano-Santoro等人(1997)中所闡述之CDC分析。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)上之分泌抗體使該等細胞毒性效應子細胞能夠特異性結合至帶有抗原之靶細胞且隨後殺死該靶細胞之細胞毒性形式。為評價所關注分子之ADCC活性，可實施例如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所闡述之活體外ADCC分析。
因此，本發明之目標係關於治療癌症之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明多肽、抗體、免疫偶聯物或其醫 藥組合物。
在本發明背景下，如本文所使用之術語「治療(treating或treatment)」意指逆轉、減輕、抑制該術語所應用之病症或病況或該病症或病況之一或多種症狀之進展、或預防該術語所應用之病症或病況或該病症或病況之一或多種症狀。如本文所使用之術語「治療癌症」意指抑制惡性腫瘤細胞之生長及/或來自該腫瘤之轉移之進展。該治療亦可使腫瘤生長消退，即減小可量測腫瘤之大小。具體而言，該治療使腫瘤或轉移完全消退。
根據本發明，術語「患者」或「有需要之患者」欲指受惡性腫瘤侵襲或可能受其侵襲之人類或非人類哺乳動物。具體而言，該患者可係例如根據如下文所闡述之方法已確定易受靶向CEACAM5之治療劑、尤其本發明之抗體或免疫偶聯物影響之患者。
本發明多肽之「治療有效量」意指足以以適於任一醫學治療之合理益處/風險比來治療該癌症疾病的多肽之量。然而，應理解，本發明多肽及組合物之總日用量將由主治醫生在合理的醫學判斷範疇內決定。任一具體患者之特定治療有效劑量量將取決於多種因素，包含所治療之病症及該病症之嚴重程度；所採用特定多肽之活性；所採用之特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所採用特定多肽之投與時間、投與途徑及排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定多肽組合或同時使用之藥物；及醫學技術中所熟知之類似因素。例如，熟習此項技術者熟知以低於彼等達成期望治療效應所需之量來起始化合物之劑量，且逐步增加劑量直至達成期望效應。
本發明之另一目標係關於本發明之多肽、抗體、免疫偶聯物或醫藥組合物用於治療惡性腫瘤。
多肽、抗體、免疫偶聯物或醫藥組合物可用於抑制惡性腫瘤轉移之進展。
本發明多肽可與任何其他治療策略組合使用來治療惡性腫瘤(例如佐劑療法)及/或減緩轉移性腫瘤之生長。
使用本發明抗體或免疫偶聯物治療之功效可容易地在活體內進行分析，例如在小鼠癌症模型上且藉由量測例如如實例5.3中所定義之治療組與對照組之間之腫瘤體積變化、腫瘤消退%、部分消退及/或完全消退來分析。
診斷用途
已報導，CEACAM5在結腸直腸、胃、肺、子宮腫瘤細胞之表面上具有高表現且在少數正常上皮細胞(例如結腸及食道上皮細胞)中具有弱表現。此外，藉由免疫組織化學使用本發明之小鼠抗人類CEACAM5抗體對一組人類腫瘤之篩選顯示以下各項中之抗體染色：結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌(尤其膽管癌)、前列腺癌及皮膚癌。
因此，CEACAM5構成癌症標記，且因此可用於指示抗癌療法之有效性或檢測疾病復發。
在實施例中，本發明抗體係用作靶向表現CEACAM5之腫瘤之療法背景下的分析組份，以測定患者對治療劑之敏感性，監測抗癌療法之有效性或檢測治療後疾病之復發。具體而言，本發明之相同抗體係用作治療劑組份及診斷分析組份二者。
因此，本發明之又一目標係關於本發明之抗體用於活體內檢測個體中之CEACAM5表現或用於離體檢測個體之生物樣品中之CEACAM5表現。該檢測可尤其欲用於藉由檢測腫瘤細胞上表面蛋白CEACAM5之表現
a)診斷個體中癌症之存在，或b)測定患有癌症之患者對靶向CEACAM5之治療劑、尤其本發 明免疫偶聯物之敏感性，或c)監測抗CEACAM5癌症療法之有效性或檢測抗CEACAM5癌症療法、尤其使用本發明免疫偶聯物之療法後的癌症復發；在實施例中，抗體意欲用於活體外或離體用途。
例如，可使用本發明抗體以活體外或離體方式檢測自個體獲得之生物樣品中之CEACAM5。本發明之用途亦可為活體內用途。例如，向個體投與本發明抗體且檢測及/或量化抗體-細胞複合物，藉此該等複合物之檢測可指示癌症。
本發明進一步關於檢測個體中癌症存在之活體外或離體方法，該方法包括由以下組成之步驟：(a)尤其在抗體與該生物樣品足以形成複合物之條件下，使個體之生物樣品與本發明抗體接觸；(b)量測結合至該生物樣品之抗體之量，(c)藉由比較結合抗體與對照之量測量來檢測癌症之存在，結合抗體比對照增加之量可指示癌症。
本發明亦係關於測定患有癌症之患者對靶向CEACAM5之治療劑、尤其本發明免疫偶聯物之敏感性之活體外或離體方法，該方法包括由以下組成之步驟：(a)尤其在抗體與該生物樣品足以形成複合物之條件下，使患有癌症之患者之生物樣品與本發明抗體接觸；(b)量測結合至該生物樣品之抗體之量，(c)比較結合至該生物樣品之抗體之量測量與結合至對照之抗體的量；其中結合至該生物樣品之抗體比結合至對照之抗體增加的量可指示患者易受靶向CEACAM5之治療劑影響。
在上述方法中，該對照可為相同類型之正常非癌性生物樣品， 或將參考值確定為相同類型之正常生物樣品中抗體結合量之代表。
在實施例中，本發明抗體可用於診斷表現CEACAM5之癌症，例如結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌(尤其膽管癌)、前列腺癌或皮膚癌。
本發明進一步關於監測抗CEACAM5癌症療法之有效性之活體外或離體方法，該方法包括由以下組成之步驟：(a)尤其在抗體與該生物樣品足以形成複合物之條件下，使經受抗CEACAM5癌症療法之個體之生物樣品與本發明抗體接觸；(b)量測結合至該生物樣品之抗體之量，(c)比較結合抗體之量測量與結合至對照之抗體之量；其中結合至該生物樣品之抗體比結合至對照之抗體減少的量可指示該抗CEACAM5癌症療法之有效性。
在該方法中，結合至該生物樣品之抗體比結合至對照之抗體增加的量可指示該抗CEACAM5癌症療法之無效性。
在實施例中，該對照係與提交給分析之生物樣品類型相同之生物樣品，但該對照係在抗CEACAM5癌症療法之前、在療程期間自個體獲得。
本發明進一步關於檢測抗CEACAM5癌症療法後癌症復發之活體外或離體方法，該方法包括由以下組成之步驟：(a)尤其在抗體與該生物樣品足以形成複合物之條件下，使具有完全抗CEACAM5癌症療法之個體之生物樣品與本發明抗體接觸；(b)量測結合至該生物樣品之抗體之量，(c)比較結合抗體之量測量與結合至對照之抗體之量；其中結合至該生物樣品之抗體比結合至對照之抗體增加的量可指示抗CEACAM5癌症療法後之癌症復發。
該對照尤其係與提交給分析之生物樣品類型相同之生物樣品，但該對照係在完成抗CEACAM5癌症療法之前、之時或之後獲得。
該抗CEACAM5癌症療法尤其係使用本發明之抗體或免疫偶聯物之療法。該抗CEACAM5癌症療法靶向表現CEACAM5之癌症，尤其結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌(尤其膽管癌)、前列腺癌或皮膚癌。
在實施例中，本發明抗體可以可檢測分子或物質(例如螢光分子、放射性分子或業內已知提供(直接或間接)信號之任何其他標記)標記。
如本文所使用，關於本發明抗體之術語「經標記」意欲涵蓋藉由將可檢測物質(例如放射性藥劑或螢光團(例如螢光異硫氰酸鹽(FITC)或藻紅素(PE)或綠靛花青(Indocyanine)(Cy5)))偶合(即物理連接)至多肽之抗體直接標記以及藉助與可檢測物質之反應性之多肽間接標記。
本發明抗體可藉由業內已知之任何方法使用放射性分子來標記。例如，放射性分子包含(但不限於)用於閃爍法研究之放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188、Tc99。本發明多肽亦可經用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記來標記，例如碘-123、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
「生物樣品」涵蓋自個體獲得之多種樣品類型且可用於診斷或監測分析中。生物樣品包含(但不限於)生物來源之血液及其他液體樣品、固體組織樣品(例如源自其之生檢樣本或組織培養物或細胞)及其子代。因此，生物樣品涵蓋臨床樣品、所培養細胞、細胞上清液、細胞溶解物、血清、血漿、生物流體及組織樣品，尤其腫瘤樣品。
在實施例中，生物樣品可係經福馬林固定且經石蠟包埋(FFPE)之組織樣品。實際上，本發明抗體可有利地用於為大多數醫院所使用來收集並存檔組織樣品之格式之FFPE組織上。
本發明亦係關於檢測個體中癌症存在之活體內方法，該方法包括由以下組成之步驟：a)向患者投與以可檢測方式標記之本發明抗體；b)藉由成像檢測患者中該以可檢測方式標記之抗體之定位。
本發明抗體可用於癌症分期(例如在放射性成像中)。其可單獨使用或與其他癌症標記組合使用。
如本文所使用之術語「檢測」或「經檢測」包含在參考或不參考對照下之定性及/或定量檢測(量測量)。
在本發明內容中，如本文所使用，術語「診斷」意指意欲自大量收集數據鑑別侵襲個體之病理來確定醫學病況之性質。
在該方法中，癌症係表現CEACAM5之癌症，尤其結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌(尤其膽管癌)、前列腺癌或皮膚癌。
套組
最後，本發明亦提供包括至少一種本發明抗體或免疫偶聯物之套組。含有本發明抗體之套組可用於檢測表面蛋白CEACAM5或治療或診斷分析。本發明之套組可含有偶合至諸如組織培養板或珠粒(例如sepharose珠粒)等固體載體之多肽或抗體。可提供含有用於在活體外(例如在ELISA或西方墨點(Western blot)中)檢測並量化表面蛋白CEACAM5之抗體之套組。可用於檢測之該抗體可提供有諸如螢光或放射性標記等標記。
序列簡單說明
SEQ ID NO：1-4及6顯示所謂的「MAb1」抗體之CDR1-H、CDR2- H、CDR3-H、CDR1-L及CDR3-L之序列。
SEQ ID NO：5顯示人類化MAb2抗體之VH變體序列VH1a。
SEQ ID NO：7-10及12顯示所謂的「MAb2」抗體之CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L及CDR3-L之序列。
SEQ ID NO：11顯示如可自GenBank NP_001703.2獲得之人類CEACAM1之序列。
SEQ ID NO：13-16及18顯示所謂的「MAb3」抗體之CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L及CDR3-L之序列。
SEQ ID NO：17顯示人類化MAb2抗體之VL變體序列VL1。
SEQ ID NO：19-22及24顯示所謂的「MAb4」抗體之CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L及CDR3-L之序列。
SEQ ID NO：23顯示人類化MAb2抗體之VL變體序列VL1a。
SEQ ID NO：25-28及30顯示所謂的「Mab5」抗體之CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L及CDR3-L之序列。
SEQ ID NO：29顯示人類化MAb2抗體之VL變體序列VL1c。
SEQ ID NO：31顯示「MAb1」抗體之VH序列。
SEQ ID NO：32顯示「MAb1」抗體之VL序列。
SEQ ID NO：33顯示「MAb2」抗體之VH序列。
SEQ ID NO：34顯示「MAb2」抗體之VL序列。
SEQ ID NO：35顯示「MAb3」抗體之VH序列。
SEQ ID NO：36顯示「MAb3」抗體之VL序列。
SEQ ID NO：37顯示「MAb4」抗體之VH序列。
SEQ ID NO：38顯示「MAb4」抗體之VL序列。
SEQ ID NO：39顯示「MAb5」抗體之VH序列。
SEQ ID NO：40顯示「MAb5」抗體之VL序列。
SEQ ID NO：41顯示chMAb1抗體之重鏈序列。
SEQ ID NO：42顯示chMAb1抗體之輕鏈序列。
SEQ ID NO：43顯示chMAb2抗體之重鏈序列。
SEQ ID NO：44顯示chMAb2抗體之輕鏈序列。
SEQ ID NO：45顯示chMAb3抗體之重鏈序列。
SEQ ID NO：46顯示chMAb3抗體之輕鏈序列。
SEQ ID NO：47顯示chMAb4抗體之重鏈序列。
SEQ ID NO：48顯示chMAb4抗體之輕鏈序列。
SEQ ID NO：49顯示chMAb5抗體之重鏈序列。
SEQ ID NO：50顯示chMAb5抗體之輕鏈序列。
SEQ ID NO：51顯示人類化MAb2抗體之VH變體序列VH1。
SEQ ID NO：52顯示如可以登錄號AAA51967.1自GenBank數據庫獲得之全長人類CEACAM5之序列。
SEQ ID NO：53顯示食蟹獼猴CEACAM5之細胞外結構域之序列。
SEQ ID NO：54顯示包括K52至R52突變之嵌合抗體(源自「MAb2」抗體)輕鏈之序列。
SEQ ID NO：55顯示人類化MAb2抗體之VL變體序列VL1d。
SEQ ID NO：56顯示hCEACAM1細胞外結構域之序列(全長hCEACAM1(NP_001703.2)之位置35-428，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸)。
SEQ ID NO：57顯示cCEACAM1細胞外結構域之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：58顯示hCEACAM5細胞外結構域之序列(全長hCEACAM5(AAA51967.1)之位置35-685，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸)。
SEQ ID NO：59顯示cCEACAM5細胞外結構域之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：60顯示hCEACAM6細胞外結構域之序列(全長hCEACAM6(NP_002474.3)之位置35-327，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸)。
SEQ ID NO：61顯示cCEACAM6細胞外結構域之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：62顯示hCEACAM8細胞外結構域之序列(全長hCEACAM8(NP_001807.2)之位置35-332，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：63顯示cCEACAM8細胞外結構域之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：64顯示hCEACAM7細胞外結構域之序列(全長hCEACAM7(NP_008821.1)之位置36-248，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸)。
SEQ ID NO：65顯示hCEACAM5 N-A1-B1之序列(全長hCEACAM5(AAA51967.1.)之位置35-320)，其後為6胺基酸His標籤。
SEQ ID NO：66顯示hCEACAM5-A2-B2之序列(全長hCEACAM5(AAA51967.1.)之位置321-498)，其後為6胺基酸His標籤。
SEQ ID NO：67顯示hCEACAM5 A3-B3之序列(全長hCEACAM5(AAA51967.1.)之位置499-685)，其後為6胺基酸His標籤。
SEQ ID NO：68顯示cCEACAM5 N-A1-B1之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：69顯示cCEACAM5 A2-B2之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：70顯示cCEACAM5 A3-B3之序列，其後為含有His標籤之24個胺基酸延伸。
SEQ ID NO：71顯示如可自GenBank NP_002474.3獲得之人類 CEACAM6全長蛋白之序列。
SEQ ID NO：72顯示如可自GenBank NP_008821.1獲得之人類CEACAM7全長蛋白之序列。
SEQ ID NO：73顯示如可以GenBank NP_001807.2獲得之人類CEACAM8全長蛋白之序列。
SEQ ID NO：74顯示人類化變體MAb2_VLg5VHg2之VH序列。
SEQ ID NO：75顯示人類化變體MAb2_VLg5VHg2之VL序列。
SEQ ID NO：76顯示人類CEACAM5 A3-B3之位置109-115處之胺基酸序列。
SEQ ID NO：77顯示人類CEACAM5 A3-B3之位置131-143處之胺基酸序列。
SEQ ID NO：78顯示基於序列比較之MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR1-H之共有序列。
SEQ ID NO：79顯示基於序列比較之MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR2-H之共有序列。
SEQ ID NO：80顯示基於序列比較之MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR3-H之共有序列。
SEQ ID NO：81顯示MAb1/MAb3抗體家族CDR1-H之共有序列。
SEQ ID NO：82顯示MAb1/MAb3抗體家族CDR2-H之共有序列。
SEQ ID NO：83顯示基於在人類及食蟹獼猴CEACAM5細胞外結構域之結合中鑑別為中性之殘基的MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR1-H之共有序列。
SEQ ID NO：84顯示基於在人類及食蟹獼猴CEACAM5細胞外結構域之結合中鑑別為中性之殘基的MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR3-H之共有序列。
SEQ ID NO：85顯示基於在人類及食蟹獼猴CEACAM5細胞外結構 域之結合中鑑別為中性之殘基的MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR1-L之共有序列。
SEQ ID NO：86顯示基於在人類及食蟹獼猴CEACAM5細胞外結構域之結合中鑑別為中性之殘基的MAb2/MAb4/MAb5抗體家族CDR3-L之共有序列。
SEQ ID NO：87顯示huMAb2-3(MAb2_VL1cVH1a-IgG1)之重鏈序列。
SEQ ID NO：88顯示huMAb2-3(MAb2_VL1cVH1a-IgG1)之輕鏈序列。
SEQ ID NO：89顯示huMAb2-4(MAb2_VL1dVH1-IgG1)之重鏈序列。
SEQ ID NO：90顯示huMAb2-4(MAb2_VL1d VH1-IgG1)之輕鏈序列。
實例
本發明藉由不應視為進一步限制之以下實例進一步闡釋。
序列表、圖以及整個本申請案所引用之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之全部內容皆以引用方式併入本文中。
實例1：CEACAM蛋白之重組細胞外結構域之製備
在此實例中，已藉由在人類胚胎腎HEK293細胞中使用可表現如表1中所概述之各別cDNA之質體瞬時表現來製備人類(h)或食蟹猴(c)來源之CEACAM之細胞外蛋白結構域(ECD)。
每一表現質體皆複合有293fectinTM(Life Technologies)且添加至懸浮培養之293-F細胞(源自HEK293細胞)中。轉染後第8天時，收集培養物上清液且藉由IMAC(GE Healthcare)純化相應的可溶蛋白以產生蛋白批次(參見表1)。
實例2：小鼠抗CEACAM5單株抗體之產生
在此實例中，單株抗體係根據可產生抗CEACAM5 mAb之方案在小鼠免疫後產生。
實例2.1： 免疫及雜交瘤傳代
免疫、融合及篩選係使用具有人類CEACAM5之細胞外結構域、食蟹猴CEACAM5之細胞外結構域之P3X63-Ag8.653骨髓瘤細胞或使用如Wennerberg A.E等人，1993.Am.J.Pathol.,143(4),1050-1054及Kilpatrick等人1997.Hybridoma 16：381389中所闡述之人類UMC11腫瘤細胞來實施。
使用如Kilpatrick等人(1997.Hybridoma 16：381389)所闡述之RIMMS方法，使6-8週齡之雌性BALB/c小鼠(S082342；Charles River Labs,Bar Harbor,ME)以3-4天之間隔在14天過程中各自接受四輪免疫。向六個沿小鼠背部之毗鄰引流淋巴結之位點及六個沿腹部之相鄰位點皮下投與於Titermax佐劑(TierMax Gold佐劑；Sigma編號T2684)中乳化之抗原。在最後一次注射後第4天時殺死小鼠。無菌分離雙側膕、淺鼠蹊、腋窩及鰓淋巴結且用新鮮RPMI培養基洗滌。
使用如Wennerberg A.E等人(1993.Am.J.Pathol.,143(4),1050-1054)所闡述之典型方法，使6-8週齡之雌性BALB/c小鼠(S082342；Charles River Labs,Bar Harbor,ME)在41天過程中各自接受三輪免 疫。向小鼠之腹面位點腹膜內投與抗原。在最後一次注射後第3天時殺死小鼠，且無菌分離脾並用新鮮RPMI培養基洗滌。
自淋巴結或脾釋放淋巴球且用RPMI培養基將單細胞懸浮液洗滌兩次，然後使用聚乙二醇與P3X63-AG8.653骨髓瘤細胞融合。融合後，在37℃下在培育器中將細胞混合物培育16-24小時。將所得細胞製劑轉移至選擇性半固體培養基中且無菌平鋪於100mm Petri板上並在37℃下培育。在開始選擇後第10天時，檢查板之雜交瘤生長，且拾取活菌落並置於含有200μL生長培養基之96孔板中。將96孔板於培育器中於37℃下保持2天至4天。
實例2.2： 鼠類抗CEACAM5抗體之篩選及活體外特徵
用於抗CEACAM5 IgG產生之初步篩選係藉由使用人類CEACAM5蛋白(如實例1中所闡述來製備)作為捕獲抗原之酶聯免疫吸附分析(ELISA)及使用若干人類腫瘤細胞(H460、MKN45、SW1463、SKMEL28及UMC11)之FACS來實施。對於ELISA分析，使用人類CEACAM5蛋白以存於PBS中之0.25μg/孔塗覆板且將100μL/孔之抗CEACAM5抗體添加至板中。將板於37℃下培育1h且用含有0.05% Tween-20之PBS(PBS-T)洗滌5次。然後，將100μL偶聯有辣根過氧化物酶(Sigma；編號A9044)之兔抗小鼠IgG之1：50,000稀釋物添加至每一孔中。在37℃下在黑暗中培育1h後，用PBS-T將板洗滌5次。藉由添加TMB-H202緩衝液使抗體結合可視化且在450nm波長下讀取。對於FACS分析，以40,000個細胞/孔在96孔高結合板(MSD L15XB-3)上塗覆人類腫瘤細胞，且在4℃下經45min添加100μL/孔之抗CEACAM5抗體，並用PBS 1% BSA洗滌3次。在4℃下經45min添加100μL/孔之偶聯有Alexa647(Invitrogen；編號A2135)之山羊抗小鼠IgG，且用PBS 1% BSA洗滌3次。藉由添加200μl/孔PBS 1% BSA離心並重懸細胞後評估抗體結合且使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統讀 取。
為評估抗CEACAM5抗體對CEACAM5之特異性，使用與先前所闡述相同之塗覆條件用重組人類CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8蛋白(如實例1中所闡述來製備)塗覆96孔板。將抗CEACAM5抗體添加至板中且藉由使用偶聯有辣根過氧化物酶(Sigma；編號A9044)之兔抗小鼠IgG來檢測。藉由添加TMB-H2O2緩衝液使抗體結合可視化且在450nm波長下讀取。圖1中所呈現之結果顯示，抗CEACAM5抗體對人類CEACAM5之選擇性優於對人類CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8之選擇性。
實例2.3： mAb結合特徵
抗CEACAM5抗體對在人類MKN45(DSMZ,ACC 409)腫瘤細胞表面上表現之hCEACAM5之表觀親和力係藉由Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統來測定。以40,000個細胞/孔在96孔高結合板(MSD L15XB-3)上塗覆MKN45腫瘤細胞，且在4℃下經45min添加100μL/孔之抗CEACAM5抗體於分析稀釋劑中之2倍連續稀釋(自20μg/ml開始，多達12次稀釋)，並用PBS 1% BSA洗滌3次。在4℃下經45min添加100μL/孔之偶聯有Alexa647(Invitrogen；編號A2135)之山羊抗小鼠IgG，且用PBS 1% BSA洗滌3次。藉由添加200μl/孔PBS 1% BSA離心並重懸細胞後評估抗體結合且使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統讀取。分別使用BIOST@T-BINDING及BIOST@T-SPEED軟體來估計表觀KD及EC50值。
抗CEACAM5抗體對人類CEACAM5及食蟹猴CEACAM5蛋白之結構域定位係藉由ELISA來測定。使用與先前所闡述相同之塗覆條件用 CEACAM5蛋白之重組人類A1(143-237)、A1-B1(143-320)、A2-B2(321-498)及A3-B3(499-685)結構域(如實例1中所闡述來製備)以及CEACAM5蛋白之重組食蟹猴N-A1-B1(1-320)、A1-B1(143-320)、A2-B2(321-498)及A3-B3(499-688)結構域(如實例1中所闡述來製備)來塗覆96孔板。將經純化抗體添加至板中且藉由使用偶聯有辣根過氧化物酶(Sigma；編號A9044)之兔抗小鼠IgG來檢測。藉由添加TMB-H2O2緩衝液使抗體結合可視化且在450nm波長下讀取。結果呈現於圖2及圖3中且顯示，抗CEACAM5抗體結合至人類及食蟹猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域。
個別mAb之同種型係根據製造商之說明書使用小鼠IgG同種型套組(SEROTEC參考編號MMT1)來測定。五種CEACAM5特異性mAb為k同種型IgG1。
實例3：鼠類抗CEACAM5抗體之特徵 實例3.1： 鼠類抗CEACAM5抗體之活體外特徵
於T500燒瓶中產生表現CEACAM5特異性Ab之小鼠雜交瘤且在生長7天後收集條件化培養基。藉由使條件化培養基通過蛋白質-G管柱來純化CEACAM5特異性Ab，洗滌且用甘胺酸/HCl 100mM pH 2.7緩衝液溶析。針對PBS透析溶析物，然後無菌過濾且儲存在4℃下。
藉由ELISA評價所有CEACAM5特異性mAb結合人類及靈長類動物CEACAM5蛋白之能力。用人類或靈長類動物CEACAM5蛋白塗覆板，將抗hCEACAM5 mAb添加至板中且用偶聯有辣根過氧化物酶(Sigma；編號A9044)之兔抗小鼠IgG檢測。藉由添加TMB-H2O2緩衝液使抗體結合可視化且在450nm波長下讀取。
表3：對應於CEACAM5特異性mAb至靈長類動物CEACAM5蛋白之結合能力之EC50值
實例3.2： 藉由流式細胞術檢測之抗CEACAM5抗體與晚期人類原發性結腸腫瘤細胞CR-IGR-034P之表觀親和力及抗體結合能力
小鼠中之晚期人類原發性結腸腫瘤CR-IGR-034P(Julien等人，Clin Cancer Res 2012年10月1日，18：5314-5328)係自源自患者之異種移植物獲得。在4℃下使用IV型膠原酶(Invitrogen；編號17104-019)及去氧核糖核酸酶I(Invitrogen；編號18047-019)將腫瘤CR-IGR-034P酶解離1h。使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統藉由應用Viacount來估計細胞活力。為估計表觀親和力，以40,000個細胞/孔在96孔高結合板(MSD L15XB-3)上塗覆CR-IGR-034P腫瘤細胞，且在4℃下經45min添加100μL/孔之抗CEACAM5抗體於分析稀釋劑中之2倍連續稀釋(自20μg/ml開始，至多達12次稀釋)，並用PBS 1% BSA洗滌3次。在4℃下經45min添加100μL/孔之偶聯有Alexa647(Invitrogen；編號A2135)之山羊抗小鼠IgG或偶聯有Alexa488(Invitrogen；編號A11013)之山羊抗人類IgG，且用PBS 1% BSA洗滌3次。藉由添加200μl/孔PBS 1% BSA離心並重懸細胞後評估抗體結合且使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統讀取。分別使用BIOST@T-BINDING及BIOST@T-SPEED軟體來估計表觀KD及EC50值。
根據製造商之說明書使用小鼠IgG校準物套組(Biocytex編號7208)或人類IgG校準物套組(Biocytex編號CP010)來測定抗CEACAM5抗體之抗體結合能力。
實例3.3 ：鼠類CEACAM5特異性抗體之內化活性
為評估抗CEACAM5抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5之內化，將MKN45活細胞與10μg/ml經AlexaFluor488預先標記之抗CEACAM5抗體於37℃/5% CO2(或4℃冰上，用於陰性對照)下培育24h。然後，用培養基沖洗一部分孔且藉由將細胞與抗AlexaFluor 488抗體(50μg/mL)於冰上一起培育30min來淬滅結合至細胞之細胞外經AF標記之抗體(細胞內螢光量)。將另一部分孔在相同時間條件下僅與培養基一起培育(總螢光量)。
然後分離細胞並洗滌，且於培養基中收集，隨後使用MACSQUANT Vyb分析儀進行流式細胞術分析。量測1×104個細胞之細胞締合螢光，且量化設門活細胞之平均螢光強度。藉由用所淬滅之細胞締合螢光除以總細胞締合螢光乘以100來確定內化比率(%)。數據表示為平均值±標準偏差(SD)
五種CEACAM5特異性抗體在結合於細胞表面膜上表現之 CEACAM5後經受內化，此支持其在抗體免疫偶聯物領域中特異性地向癌細胞呈送細胞毒性之用途。抗CEACAM5抗體MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5在培育24小時後分別顯示在MKN45人類癌細胞系中49.9%、45%、51.1%、42.5%、51.7%之內化。
實例3.4 ：相應鼠類ADC對MKN45細胞系之細胞毒性活性
偶聯鼠類抗體以定義其活體外細胞毒性活性。在15ml管中，在室溫(23℃)下，在磁力攪拌下相繼引入mAb、緩衝液A/HEPES(4%)、DMA(二甲基乙醯胺，20% v/v)，然後引入6當量SPDB連接體。在室溫下保持一夜後，添加存於15mM DMA溶液中之DM4(類美登素，9.6當量)，且反應5小時。在Superdex 200pg 16/60或G25 26/10管柱(PBS-Na pH7.4/5% NMP)上純化粗偶聯混合物，以5000g在Amicon 15上濃縮，且在0.22μm Millex上過濾。
然後使用Cell Titer-Glo套組(Promega)測試抗CEACAM5類美登素偶聯物對腫瘤細胞活力之效應。為此，將MKN45人類胃癌細胞平鋪於96孔板中且使其在37℃/5% CO2氣氛下在4小時期間附著。將不同濃度之抗CEACAM5偶聯物添加至接種細胞中。然後將細胞於相同氣氛下培育96小時。然後在室溫下經10min將Cell Titer-Glo試劑添加至孔中，且使用EnVision板計數器(Perkin-Elmer)量測發光信號。
偶聯至類美登素(DM4)之抗CEACAM5抗體MAb1-SPDB-DM4、MAb2-SPDB-DM4、MAb3-SPDB-DM4、MAb4-SPDB-DM4及MAb5-SPDB-DM4顯示活體外細胞毒性活性，且IC50分別為0.89nM、0.14nM、0.53nM、0.96nM及0.24nM。
實例4：抗CEACAM5 mAb之重鏈及輕鏈之序列測定
自雜交瘤檢索mAb之可變結構域序列且選殖至表現載體中以確保所選殖mAb具有與初始鼠類mAb相同之特徵。
所衍生之胺基酸序列提供與藉由重鏈及輕鏈(LC、HC)之N端測序及質譜(LC/MS)基於源自雜交瘤之經純化mAb獲得之數據一致的資訊(參見表7)。
*：MAb2i係由一種所選殖雜交瘤產生且藉由在VL及VH之框架 區中引入規範殘基衍生出所謂的「MAb2」之抗體，如實例5中所解釋。
實例5：抗體藥物偶聯物(ADC)(嵌合體) 實例5.1 ：裸嵌合體mAb
將可變結構域VH、VL之核酸序列分別選殖至融合有人類IgG1或人類Cκ恆定結構域編碼序列之表現載體中以隨後如實例1中所闡述藉由在HEK293中瞬時表現來產生嵌合體mAb批次。人類及食蟹猴CEACAM5對鼠類及嵌合體mAb之親和力保持相似。在表8中，親和力係由使用人類或食蟹猴CEACAM5之ELISA獲得之EC50來闡釋。
使用IMGT命名法自蛋白質序列推導出CDR區之序列。其對應於SEQ ID NO：1-4、6、7-10、12、13-16、18、19-22、24、25-28、30。
應注意，與所選殖雜交瘤產生之抗體(MAb2i)相比，已將規範殘基引入純系MAb2 VL上之位置41G、42K及45Q處以及VH上之位置5Q 及7S處。
此外，純系MAb2 CEA-4之VL上位置52處之離胺酸位於CDR2中，其在純系Mab2K52R中已經精胺酸替代。在與對應於純系MAb2之條件相同之條件下產生一批次，且其產生與表7中所顯示相似之對人類及食蟹猴CEACAM5細胞外結構域之親和力。其強調可在CDR中製造此點突變而不對結合造成任何影響。
純系MAb2及純系Mab2K52R之嵌合體mAb之LC及HC序列對應於SEQ ID NO：43、44、54。
如實例4中所闡述來構築chMAb2。其係源自具有人類Ck同種型IgG1之純系MAb2之嵌合體mAb。該等序列對應於SEQ ID NO：43及44。藉由在HEK293中瞬時表現然後進行蛋白質A親和層析純化來製備300mg規模之批次，結合數據參見表7。使用裸mAb來產生ADC。
實例5.2 ：ADC之產生及特徵
在此實例中，自裸嵌合體mAb製備免疫偶聯物。然後評價活體內功效。
DAR計算：
偶聯物通常包括1分子至10分子共價連接至抗體之類美登素(所謂的「藥物對抗體比率」或「DAR」)。此數值可隨所使用抗體及類美登素之性質以及用於偶聯之實驗條件(如類美登素/抗體比率、反應時間、溶劑及共溶劑(若存在)之性質)而變化。因此，抗體與類美登素之間之接觸形成包括若干藥物對抗體比率彼此不同之偶聯物、視情況裸抗體、視情況聚集物的混合物。因此，所測定之DAR為平均值。
本文用於測定DAR之方法在於以分光光度計測量實質上純化之偶聯物溶液在252nm與280nm之吸光度之比率。特別地，該DAR可以分光光度計使用抗體及類美登素分別在280nm及252nm測量之消光係數(εD280=5,180M-1cm-1及εD252=26,159M-1cm-1)測定。計算方法係源 自Antony S.Dimitrov(編輯)，LLC,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols，第525,445卷，Springer Science，且更詳細闡述於下文中：偶聯物在252nm吸光度(A252)及在280nm吸光度(A280)係在粒徑排阻層析(SEC)分析之單體峰(允許計算「DAR(SEC)」參數)上或使用典型分光光度計裝置(允許計算「DAR(UV)」參數)測量。吸光度可如下表示：A252=(cD×εD252)+(cA×εA252)
A280=(cD×εD280)+(cA×εA280)
其中：
˙cD及cA分別為溶液中類美登素及抗體之濃度
˙εD252及εD280分別為類美登素在252nm及280nm之莫耳消光係數
˙εA252及εA280分別為抗體在252nm及280nm之莫耳消光係數。
對該兩個具有兩個未知數之方程式之解析產生以下方程式：cD=[(εA280×A252)-(εA252×A280)]/[(εD252×εA280)-(εA252×εD280)]
cA=[A280-(cD×εD280)]/εA280
然後自藥物濃度對抗體濃度之比率計算平均DAR：DAR=cD/cA。
偶聯物之去糖基化及高解析度質譜(HRMS)
去糖基化係一種藉助糖苷酶之酶消化技術。去糖基化係自500μl偶聯物+100μl 50mM Tris HCl緩衝液+10μl聚糖酶-F酶(100單位凍乾酶/100μl水)製造。渦旋培養基且在37℃下維持一夜。然後準備在HRMS中分析去糖基化樣品。基於Waters Q-Tof-2系統以電噴射陽性模式(ES+)獲得質譜。層析條件如下：管柱：4μm BioSuite 250 URH SEC 4.6×300mm(Waters)；溶劑：A：25mM甲酸銨+1%甲酸；B： CH3CN；管柱溫度：30℃；流速0.4ml/min；等梯度溶析70% A+30% B(15min)。
分析型粒徑排阻層析(SEC)
- 管柱：TSKgel G3000 SWXL 5μm管柱，7.8mm×30cm，TOSOH BIOSCIENCE，LLC Part編號08541+保護管柱TSK-GEL SWXL 7μM，40mm×6mm，TOSOH BIOSCIENCE，LLC Part編號08543
- 流動相：KCl(0.2M)、KH2PO4(0.052M)、K2HPO4(0.107M)、iPrOH(20體積%)
-分析條件：等梯度溶析，0.5ml/min，30min
- 在Lachrom Elite HPLC系統(Merck)上使用L2455 DAD分光光度計檢測器實施分析。
緩衝液內容物
- 緩衝液A(pH 6.5)：NaCl(50mM)、磷酸鉀緩衝液(50mM)、EDTA(2mM)
- 緩衝液HGS(pH 5.5)：組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、5%蔗糖(w/v)、HCl(8mM)
所使用之縮寫
CV：管柱體積；DAR：藥物抗體比率；DMA：二甲基乙醯胺；HEPES：4-(2-羥基乙基)-1-六氫吡-乙磺酸；HRMS：高解析度質譜；NHS：N-羥基琥珀醯亞胺；硝基-SPDB：丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]-,2,5-二側氧基-1-吡咯啶基酯(可如WO2004016801專利中所闡述來製備)；NMP：N-甲基吡咯啶酮；RT：室溫；SEC：粒徑排阻層析
ADC(嵌合體)：chMAb1-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=148438g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=213320；ε252nm(Ab)=73473
ε280nm(DM4)=5180et ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.59ml chMAb1(C=5.72mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.312ml DMA及0.046ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。在磁力攪拌下，相繼添加3.8ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.389ml DMA及0.074ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2.5小時後，在經1CV 1MNaOH、2CV水及含有5體積% NMP之2CV PBS緩衝液(pH7.4)預處理之HiLoad 26/60去鹽管柱(Superdex 200pg；GE Healthcare)上純化粗反應混合物。用含有5% NMP之PBS緩衝液(pH7.4)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，在Amicon Ultra-15(Ultracel 10k,Millipore)上濃縮，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得7.6ml呈無色透明溶液形式之chMAb1-SPDB-DM4偶聯物(c=2.19mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.38；DAR(SEC)=3.34；RT=17.54min；單體純度=99.8%。
HRMS分析之結果顯示於圖8中。
chMAb2-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147900g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε252nm(Ab)=70889
ε280nm(DM4)=5180et ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.8ml chMAb2(C=5.08mg/ ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.337ml DMA及0.0433ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。在磁力攪拌下，相繼添加3.12ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.319ml DMA及0.069ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1CV 1M NaOH、2CV水及含有5體積% NMP之2CV PBS緩衝液(pH7.4)預處理之HiLoad 26/60去鹽管柱(Superdex 200pg；GE Healthcare)上純化。用含有5% NMP之PBS緩衝液(pH7.4)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，在Amicon Ultra-15(Ultracel 10k,Millipore)上濃縮，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得7.5ml呈無色透明溶液形式之chMAb2-SPDB-DM4偶聯物(c=1.8mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=4.10；DAR(SEC)=4.05；RT=17.52min；單體純度=99.9%。
HRMS分析之結果顯示於圖9中。
chMAb4-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=148124g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm 280nm(Ab)=204380；ε280nm 252nm(Ab)=73142
ε280nm 280nm(DM4)=5180et ε280nm252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.63ml chMAb4(C=5.69mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.316ml DMA及0.0465ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。在磁力攪拌下，相繼添加3.8ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.389ml DMA及0.074ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2小時後，在經1CV 1M NaOH、2CV水及含有5體積% NMP之2CV PBS緩衝液(pH7.4)預處理之HiLoad 26/60去鹽管柱(Superdex 200pg；GE Healthcare)上純化粗反應混合物。用含有5% NMP之PBS緩衝液(pH7.4)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，在Amicon Ultra-15(Ultracel 10k,Millipore)上濃縮，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得6.5ml呈無色透明溶液形式之chMAb4-SPDB-DM4偶聯物(c=2.20mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.87；DAR(SEC)=3.85；RT=17.52min；單體純度=99.8%。
HRMS分析之結果顯示於圖10中。
chMAb5-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=148040g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm 280nm(Ab)=207360；ε280nm 252nm(Ab)=72288
ε280nm 280nm(DM4)=5180et ε280nm252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.15ml chMAb5(C=6.38mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.269ml DMA及0.0453ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。在磁力攪拌下，相繼添加4.1ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.317ml DMA及0.072ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1CV 1M NaOH、2CV水及含有5體積% NMP之2CV PBS緩衝液(pH7.4)預處理之HiLoad 26/60去鹽管柱(Superdex 200pg；GE Healthcare)上純化。用含有5% NMP之PBS緩衝液(pH7.4)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，在Amicon Ultra-15(Ultracel 10k,Millipore)上濃縮，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得7.5ml呈無色透明溶液形式之抗CEACAM5_hyb_1917CEA4_VH5Q7S_VL41G42K45Q_IgG1-SPDB-DM4偶聯物(c=3.4mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.4；DAR(SEC)=3.4；RT=17.49min；單體純度=99.8%。
HRMS分析之結果顯示於圖11中。
實例5.3： 活體內功效
針對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤評估2種劑量之四種嵌合偶聯物(chMAb4-SPDB-DM4、chMAb1-SPDB-DM4、chMAb5-SPDB-DM4及chMAb2-SPDB-DM4)。對照組未經處理。偶聯物之劑量係以mg/kg給出。其係在腫瘤植入後第14天時藉由靜脈內(IV)濃注以5mg/kg及2.5mg/kg來投與。
為評估偶聯物之抗腫瘤活性，每天對動物稱重且每週藉助卡尺將腫瘤量測2次。將在最低點產生20%重量損失(組平均值)或10%或更大藥物死亡之劑量視為毒性過高劑量。動物體重包含腫瘤重量。腫瘤體積係使用下式來計算：質量(mm3)=[長度(mm)×寬度(mm)2]/2。初始功效終點為△T/△C、中值消退百分數、部分及完全消退(PR及CR)。
藉由自指定觀察日之腫瘤體積減去第一治療日(分期日)之腫瘤體積來計算每一治療組(T)及對照組(C)中每一腫瘤之腫瘤體積變化。計算治療組之中值△T且計算對照組之中值△C。然後計算△T/△C比率且表示為百分比：△T/△C=(△T/△C)×100。
當△T/△C低於40%時，將劑量視為具有治療活性，且當△T/△C低於10%時，將劑量視為具有極高活性。若△T/△C低於0，則將劑量視為具有高活性且記錄消退百分比(Plowman J、Dykes DJ、Hollingshead M、Simpson-Herren L及Alley MC.Human tumor xenograft models in NCI drug development.In：Feibig HH BA編輯Basel：Karger.；1999第101-125頁)：腫瘤消退%定義為治療組在指定觀察日之腫瘤體積與其在第一治療之第一日之體積相比減小的%。
在特定時間點計算每一動物之消退%。然後計算該組之中值消退%：
部分消退(PR)：若腫瘤體積減小至開始治療時腫瘤體積的50%，則消退定義為部分消退。
完全消退(CR)：當腫瘤體積=0mm3時達成完全消退(當無法記錄腫瘤體積時視為CR)。
結果：
結果呈現於圖4及表9(下文)中。使用2.5mg/kg及5mg/kg之單次投與方案，此研究中所測試之所有偶聯物皆未引起毒性。
chMAb1-SPDB-DM4在5mg/kg及2.5mg/kg下極有活性且△T/△C分別為0%及7%(相對於對照p<0.0001且p=0.0170)。chMAb4-SPDB-DM4及chMAb5-SPDB-DM4在5mg/kg下具有高活性且△T/△C分別為-5%及-7%(相對於對照p<0.0001)，且腫瘤消退分別為25%及65%。其在2.5mg/kg下極有活性且△T/△C分別為7%及2%(相對於對照p=0.0152及p=0.0020)。chMAb2-SPDB-DM4在5mg/kg及2.5mg/kg下具有高活性且△T/△C分別為-10%及-8%(相對於對照p<0.0001)，腫瘤消退分別為82%及39%，且CR/6分別為3及1。
自該等結果可看出，所有嵌合偶聯物chMAb4-SPDB-DM4、chMAb1-SPDB-DM4、chMAb5-SPDB-DM4及chMAb2-SPDB-DM4皆可用於研發治療性ADC。
實例6：抗CEACAM5_MAb2 mAb之人類化
在此實例中，已在電腦中設計親代鼠類IgG MAb2之人類化變體。產生所得mAb且提供與嵌合IgG ch-MAb2相似之特徵。
實例6.1： 4D-人類化方案 a)基於分子動力學軌跡之人類化
針對蛋白質數據庫(PDB)(Berman等人，Nucleic Acids Research,2000,28：235-242)比較鼠類MAb2純系之VL與VH序列。使用下列模板：輕鏈及重鏈框架-3EHB(90.9%框架輕鏈一致性及90.8%框架重鏈一致性)、L1-1I8M、L2-1F6L、L3-1P7K、H1-2QHR、H2-1IGT及H3-1P4B以使用Molecular Operating Environment(MOE)(2011.10版-Chemical Computing Group,Quebec,Canada)建立抗CEACAM5 LC及HC之同源模型。隨後使用MOE所執行之標準程序使同源模型能量最小化。
隨後實施鼠類MAb2之最小化3D同源模型之分子動力學(MD)模擬，且約束蛋白質骨架，在500K溫度下在廣義博恩(Generalized Born)隱性溶劑中保持1.1奈秒(ns)。在最後1ns中每100皮秒(ps)自此第一MD運行提取10種不同構象。然後將該等不同構象各自提交給MD模擬，且對蛋白骨架無約束並在300K溫度下保持2.3ns。然後，對於10次MD運行中之每一者，使用來自MD軌跡之每ps一次之最後2,000次快照來計算每一鼠類MAb2胺基酸之與參考代表物件(medoid)位置相比之均方根偏差(rmsd)。藉由比較給定胺基酸之10次單獨MD運行之平均rmsd與所有MAb2鼠類胺基酸之總體平均rmsd，可判定該胺基酸是否具有足夠撓性(如在MD期間可見)，以被視為可能與T細胞受體相互作用且負責活化免疫反應。鼠類MAb2抗體中有32個胺基酸被鑑別為撓性，不包括CDR及與其直接相鄰之5Å範圍。
然後，比較在20ns(10×2ns)分子動力學模擬期間60個最具撓性 之鼠類MAb2胺基酸之運動與49個人類3D同源模型之相應撓性胺基酸的運動，其各自運行相同MD模擬。該49個人類種系模型係藉由系統性地組合7條人類輕鏈(即vk1、vk2、vk3、vk4、vλ1、vλ2、vλ3)之代表組與7條人類重鏈(即vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)之代表組來構建(Nucleic Acid Research,2005，第33卷，數據庫期號D593-D597)。
與鼠類MAb2抗體之撓性胺基酸相比，vk1-vh6組合顯示其撓性胺基酸之最高(72.6%)4D相似性；因此，使用此模型來人類化集中於撓性胺基酸之MAb2抗體。對於鼠類MAb2與vk1-vh6胺基酸之間之成對胺基酸締合，基於2個相應同源模型之α碳之最佳3D疊加來比對該2條序列。
b)穩定突變
為改良抗CEACAM5抗體VL及VH區之穩定性，最初提出將輕鏈及重鏈相對於其各別規範序列(CDR除外)出現頻率較低之胺基酸突變成最頻繁發現之胺基酸(ΔΔGth>0.5千卡/mol；(Monsellier等人J.Mol.Biol.2006,362,580-593)。用於LC及HC之共有突變之第一列表已限於在最近人類模型中發現之胺基酸(即vk1-vh6)。該等突變皆不位於「游標」區中(Foote等人，J.Mol.Biol.1992,224,487-499)。將其他準則考慮在內以考慮可能穩定抗CECAM5 MAb2抗體之該等共有突變。該等準則係表面處親疏水性之有利改變或基於分子力學預測之突變體之穩定。考慮文獻(Bedouelle,H.J.Mol.Biol.2006,362,580-593；Steipe B.J.Mol.Biol.1994,240,188-192)中所報導獲得成功之穩定突變。
c)不期望序列基序之移除
考慮以下序列基序：Asp-Pro(酸不穩定鍵)、Asn-X-Ser/Thr(糖基化，X=除Pro外之任何胺基酸)、Asp-Gly/Ser/Thr(在撓性區域中形成琥珀醯亞胺/異-asp)、Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(所暴露去醯胺位 點)、Met(所暴露區域之氧化)。針對免疫表位數據庫(IEDB)((PLos Biol(2005)3(3)e91)http：//www.immuneepitope.org)對所得人類化序列之序列相似性進行blast處理，以確保該等序列皆不含其中所列示之任何已知B-或T-細胞表位。
d)人類化VH及VL區
提出三種形式之輕鏈(VL1、VL1a及VL1c)及三種形式之重鏈(VH1、VH1a及VH1b)。在每一人類化MAb2 VL及VH變體中改變之胺基酸殘基之具體組合分別闡釋於表10及表11中。人類化VH及VL結構域之完整胺基酸序列闡釋於表12中。
VL1變體展現5個源自直接比較抗CEACAM5 MAb2輕鏈與vk1人類輕鏈序列之間之最具撓性的非CDR胺基酸之突變。
VL1a變體係源自VL1且包含4個共有(vk1序列)且可能穩定之新突變。此外，該等突變中之1者解決了可能有問題之去醯胺位點(D17T18)。
VL1c變體係源自VL1a且引入1個突變R替代位置52處之K。實際上，此K52位於CDR L2中且可係偶聯過程之「靶」。
VH1變體展現7個源自直接比較抗CEACAM5重鏈與vh6人類重鏈序列之間之最具撓性的非CDR胺基酸之突變。
VH1a變體係源自VH1且包含4個共有(vh6序列)且可能穩定之新突變。
人類化抗CEACAM5 MAb2抗體VL及VH結構域組合如下：VL1與VH1；VL1a與VH1a；VL1c與VH1a；VL1a與VH1b
實例6.2： 人類化抗CEACAM5 mAb之序列
藉由Geneart自電腦模擬VL及VH變體之胺基酸序列衍生並合成核酸序列。將該等序列分別選殖至融合有人類IgG1或人類Cκ恆定結構域編碼序列之表現載體中。
實例6.3： 產生及活體外特徵
藉由在HEK293中瞬時表現產生人類化mAb批次且藉由蛋白質A親和層析來純化。藉由SDS-PAGE分析、粒徑排阻層析及質譜來確認結構及一致性。
藉由ELISA來驗證與人類及食蟹猴CEACAM5之親和力，EC50提供於表13中。
表13：人類化抗CEACAM5 mAb與人類及食蟹猴CEACAM5之親
藉由ELISA來驗證人類CEACAM5相對於人類CEACAM1、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8之特異性。其報告為佔與人類CEACAM5之完全結合之結合百分比，參見表14。
藉由ELISA來驗證表位結合結構域且顯示人類化變體特異性識別A3-B3結構域。其在表15中報告為佔與人類CEACAM5之完全結合之結合百分比。
藉由表面電漿子共振分析使用BIAcore 2000(BIAcore公司，Uppsala,NJ)來測定與嵌合MAb2相比人類化抗CEACAM5_MAb2變體對重組人類CEACAM5(hCEACAM5)及食蟹猴CEACAM5(cCEACAM5)之結合動力學。
簡言之，將CM5 BIAcore生物感測器晶片對接至儀器中且在室溫下用70μL 1：1 NHS/EDC活化。將小鼠抗α人類Fc IgG1(BIAcore編號BR-1008-39)(50μg/mL，存於1M乙酸鹽緩衝液(pH5)中)固定在所有流動細胞中之經活化晶片上。在10μL/min之流速下實施固定直至飽和。然後藉由注射70μL乙醇胺-HCl(pH8.5)來封阻晶片，隨後用3M MgCl2洗滌一次。為量測抗CEACAM5 mAb與人類CEACAM5蛋白或食蟹猴CEACAM5蛋白之結合，使用存於BIAcore運行緩衝液(HBS-EP)中之1-5μg/mL之抗體。注射1nM至500nM之抗原(人類CEACAM5或食蟹猴CEACAM5)。完成注射期後，在流速相同之BIAcore運行緩衝液中經600sec監測解離。使用2×5μL 3M MgCl2(2×30s)使表面在注射之間再生。使用BIA評估軟體來分析個別感測圖。
藉由ELISA來驗證與嵌合MAb2相比人類化抗CEACAM5_MAb2變體對食蟹猴CEACAM5相對於食蟹猴CEACAM1、CEACAM6及CEACAM8之特異性。其報告為佔與CEACAM5之完全結合或以EC50結合之結合百分比，參見下表17。
實例6.4： 藉由移植至人類種系框架獲得之Mab2之人類化變體之特徵
在此實例中，Mab2之人類化變體係藉由CRD移植方法獲得。此外，將人類化抗體之CDR提交給丙胺酸掃描方法以顯示可取代若干位置而不影響與人類及食蟹獼猴CEACAM5之結合。
首先在電腦中藉由基於與鼠類抗體Mab2之結構同源性選擇人類種系框架來產生Mab2之人類化形式之序列。對於輕鏈，所選人類框架係由基因IGKV1D-39*01及IGKJ2*02定義，且對於重鏈，所選人類框架係由基因IGHV3-23*04及IGHJ4*01定義。將Mab2K52R之6個CDR移植至該等人類框架中。對應於VL(SEQ ID NO.34)中之位置34及位置53(分別為FR2-L及FR3-L區)及VH(SEQ ID NO.33)中之位置50(FR2-H區)引入三個回復突變，從而產生定義為MAb2_VLg5VHg2之 以下序列。
藉由優先用丙胺酸單一替代6個CDR之每一胺基酸來獲得MAb2_VLg5VHg2之若干變體。當發現在H-CDR3中出現之丙胺酸已位於MAb2_VLg5VHg2 CDR中時，取代另一胺基酸(SEQ ID NO：74之殘基97處之Val、殘基98處之Arg及殘基108處之Asp)。
藉由基因合成自VL及VH變體之電腦模擬胺基酸序列衍生並產生核酸序列。將該等序列分別選殖至融合有人類IgG1或人類Cκ恆定結構域編碼序列之哺乳動物表現載體中。藉由在HEK293細胞中瞬時表現來產生人類化MAb2_VLg5VHg2、與其相差一個位置之單一變體及有限數目之組合突變體。將含有分泌IgG(20μg/ml至70μg/ml)之細胞上清液稀釋至1μg/ml用於與人類CEACAM5 ECD、食蟹獼猴ECD及人類CEACAM5之A3-B3結構域之結合分析中。
為評估該等修飾之影響，藉由使用Biacore T200單元(GE Healthcare)量測SPR信號來測定IgG結合。經由胺偶合套組將抗人類Fc抗體偶合至S CM5系列晶片以達到10,000個反應單位(RU)之量。藉由以60秒接觸時間及10μL/min之流速注射1μg/mL之上清液捕獲每一變體之約300RU至600RU。所有實驗皆係在25℃下使用HBS-EP+(10 mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20)作為運行緩衝液來實施。在篩選模式中，在所捕獲之IgG變體上方以30μL/min之流速經1分鐘注射50nM之人類CEACAM5/食蟹猴CEACAM5/人類A3B3結構域。保持60秒之解離期，然後藉由以10μL/分鐘之流速及30秒之接觸時間1脈衝注射3M MgCl2使表面再生。
對於每一實驗皆使用參考表面來處理反應數據，由此校正總體折射率變化及任何非特異性結合。使用來自空白注射之反應來對數據進行雙重參考。根據來自GE Healthcare之應用註解(應用註解28-9777-72 AA)中所闡述之篩選方法，考慮兩個參數以針對結合特徵對變體進行分級。首先，藉由佔所量測之理論最大信號之比例(Rmax之百分比，參見圖16)來估計結合活性。其次，使用解離報告點(第一點為注射結束後10秒且第二點為注射結束後50秒)來計算剩餘信號之百分比，且反映結合之穩定性(參見圖17)。
與初始抗體相比，以下位置之單一丙胺酸變體展示等效結合參數，此表明該等位置之CDR胺基酸對於結合呈中性：LC殘基27、28、29、31、51、52、89、90、93、94、96、97及HC殘基26至31、51至58、97、103、104、107、109。該等變體之行為與人類及猴CEACAM5相似，因此維持其交叉反應性。亦發現與CEACAM5之A3-B3結構域之結合未受影響。亦產生一些兩種中性取代之組合且發現結合參數並未改變，如藉由LC_T51A與LC_T94A、LC_S31A與HC_G54Y或LC_T53I與HC_S53A之締合所闡釋。
相反發現，在所有其他CDR位置處，用丙胺酸取代初始胺基酸會使結合完全喪失或顯著改變結合參數。重鏈之位置101或輕鏈之位置32及位置91係圖16及圖17中所顯示之實例，第二組變體包括測試一些該等位置處之更保守突變。鑒於此，發現以下保守取代對於抗原結合呈中性：Tyr對MAb2_VLg5之殘基30處之Phe、Phe對MAb2_VLg5之殘 基92處之Tyr、Ser對MAb2_VHg2之殘基98處之Ala及Phe對MAb2_VHg2之殘基100處之Tyr(顯示於圖中)。
實例7：MAb2藥物偶聯物之人類化變體 實例7.1： 產生及特徵 huMAb2-2-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147360g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε280nm(Ab)=71693
ε280nm(DM4)=5180；ε280nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入19.4mg huMAb2-2(C=5.1mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.375ml DMA及0.0439ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌2小時。添加額外體積之0.0044ml硝基-SPDB連接體溶液(5.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下在磁力攪拌下保持2小時後，相繼添加2ml PBS緩衝液(pH=7.5)及0.0702ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1 CV 1M NaOH、2 CV水及2 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上純化。用組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得10.3ml呈無色透明溶液形式之huMAb2-2-SPDB-DM4偶聯物(c=1.35mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.7；DAR(SEC)=3.6；RT=17.29min；單體純度=97.9%。
HRMS分析之結果顯示於圖12中。
huMAb2-1-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147563g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε252nm(Ab)=69669
ε280nm(DM4)=5180；ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.8ml huMAb2-1溶液(C=5.08mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.341ml DMA及0.0392ml硝基-SPDB連接體溶液(4.5當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。添加額外體積之0.0087ml硝基-SPDB連接體溶液(1.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下在磁力攪拌下保持2小時後，相繼添加2.62ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.254ml DMA及0.076ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持1小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1 CV 1M NaOH、2 CV水及2 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上純化。用組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得9.5ml呈無色透明溶液形式之huMAb2-1-SPDB-DM4偶聯物(c=1.35mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=4.1；DAR(SEC)=4.0；RT=17.39min；單體純度=96.7%。
HRMS分析之結果顯示於圖13中。
huMAb2-3-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147417g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε252nm(Ab)=71451
ε280nm(DM4)=5180；ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.8ml huMAb2-3溶液(C=5.09mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.336ml DMA及0.0437ml硝基-SPDB連接體溶液(5當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。添加額外體積之0.0035ml硝基-SPDB連接體溶液(0.4當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下在磁力攪拌下保持1小時後，相繼添加2.60ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.248ml DMA及0.074ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持1小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1 CV 1M NaOH、2 CV水及2 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上純化。用組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得11ml呈無色透明溶液形式之huMAb2-3-SPDB-DM4偶聯物(c=1.08mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.9；DAR(SEC)=3.8；RT=17.44min；單體純度=98.4%。
HRMS分析之結果顯示於圖14中。
huMAb2-4-SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147628g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε252nm(Ab)=70628
ε280nm(DM4)=5180；ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入3.8ml huMAb2-4溶液(C=5.09mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入0.345ml DMA及0.0448ml硝基-SPDB連接體溶液(5當量-存於DMA中之15mM溶液)。將溶液渦旋30sec且然後在室溫下緩慢攪拌3小時。添加額外體積之0.0027ml硝基-SPDB連接體溶液(0.3當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下在磁力攪拌下保持1小時後，相繼添加2.70ml PBS緩衝液(pH7.5)、0.263ml DMA及0.075ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持1小時後，在0.45μm過濾器上過濾粗反應混合物，且在經1 CV 1M NaOH、2 CV水及2 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上純化。用組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得11ml呈無色透明溶液形式之huMAb2-4-SPDB-DM4偶聯物(c=1.23mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.8；DAR(SEC)=3.8；RT=17.53min；單體純度=99.3%。
HRMS分析之結果顯示於圖15中。
實例7.2： 活體外毒性 材料及方法：
如實例3.4中所闡述來評價抗CEACAM5類美登素偶聯物對腫瘤細胞活力之效應。
結果：
表19：CEACAM5特異性人類化ADC對CEACAM5+ MKN45細胞系之細胞毒性活性
該等chMAb2-SPDB-DM4、huMAb2-1-SPDB-DM4、huMAb2-2-SPDB-DM4及huMAb2-3-SPDB-DM4偶聯物及DM4不相關偶聯物顯示針對培養物中MKN45細胞之活體外細胞毒性活性，且IC50分別為0.24nM、0.18nM、0.23nM、0.16nM及8.52nM。抗CEACAM5偶聯物之細胞毒性活性係所量測不相關DM4偶聯物活性的1/53至1/35，從而指示抗CEACAM5偶聯物之CEACAM5介導之細胞毒性活性。
實例7.3： 針對皮下植入雌性CD-1裸小鼠中之原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤之活體內功效 材料及方法
針對皮下植入雌性CD-1裸小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤評估與chMAb2-SPDB-DM4相比之4種劑量量之兩條人類化序列偶聯物huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-4-SPDB-DM4。對照組未經處理。偶聯物之劑量係以mg/kg給出。其係在腫瘤植入後第19天時藉由靜脈內(IV)濃注以10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg及1.25mg/kg來投與。
如實例5中所報告評估毒性及功效。
結果：
結果呈現於圖5及表20(下文)中。
使用1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg之單次投與方 案，此研究中所測試之所有偶聯物皆未引起毒性。
huMAb2-4-SPDB-DM4及chMAb2-SPDB-DM4在10mg/kg下具有高活性且ΔT/ΔC為-4%(相對於對照p<0.0001)，且腫瘤消退分別為21及19%；在5mg/kg下有活性且ΔT/ΔC分別為12%(相對於對照p=0.0105)及17%(相對於對照p=0.0417)；且在2.5mg/kg下稍有活性且ΔT/ΔC分別為36%及37%(相對於對照不顯著)；且在1.25mg/kg下無活性。huMAb2-3-SPDB-DM4在10mg/kg下具有高活性且ΔT/ΔC為-6%(相對於對照p<0.0001)，且腫瘤消退為31%；在5mg/kg下極有活性且ΔT/ΔC為4%(相對於對照p<0.0001)；在2.5mg/kg下有活性且ΔT/ΔC為12(相對於對照p=0.0322)；且在1.25mg/kg下稍有活性，且ΔT/ΔC為34%(相對於對照不顯著)。
自該等結果可看出，兩條人類化序列huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-4-SPDB-DM4皆可用於研發治療性ADC。huMAb2-3-SPDB-DM4係該兩條序列中之最佳者。
實例7.4： 針對皮下植入雌性SCID小鼠中之原發性胃STO-IND-006腫瘤之活體內功效 材料及方法
針對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性胃STO-IND-006腫瘤評估3種劑量量之人類化偶聯物huMAb2-3-SPDB-DM4。對照組未經處理。偶聯物之劑量係以mg/kg給出。其係在腫瘤植入後第27天時藉由靜脈內(IV)濃注以10mg/kg、5mg/kg及2.5mg/kg來投與。
如實例5中所報告評估毒性及功效。
結果：
使用2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg之單次投與方案，huMAb2-3-SPDB-DM4未引起毒性。
如圖6及表21中所顯示，huMAb2-3-SPDB-DM4在10mg/kg下極有活性且ΔT/ΔC為7%(相對於對照p<0.0001)，在5mg/kg下有活性且ΔT/ΔC為36%(相對於對照p=0.0281)，且在2.5mg/kg下無活性。
實例7.5： 針對皮下植入雌性SCID小鼠中之原發性肺LUN-NIC-0014腫瘤之活體內功效 材料及方法
針對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性肺LUN-NIC-0014腫瘤評估3種劑量量之人類化偶聯物huMAb2-3-SPDB-DM4。對照組未經處理。偶聯物之劑量係以mg/kg給出。其係在腫瘤植入後第29天時藉由靜脈內(IV)濃注以10mg/kg、5mg/kg及2.5mg/kg來投與。
如實例5中所報告評估毒性及功效。
結果
使用2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg之單次投與方案，huMAb2-3-SPDB-DM4未引起毒性。
如圖18及表22中所顯示，huMAb2-3-SPDB-DM4在10mg/kg及5mg/kg下具有高活性且ΔT/ΔC在0%以下(相對於對照p<0.0001)，且腫瘤消退分別為67%及57%；且在2.5mg/kg下有活性，且ΔT/ΔC為12%(相對於對照p=0.0363)。
實例7.6： 針對皮下植入雌性SCID小鼠中之原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤之活體內功效 材料及方法
針對皮下植入雌性SCID小鼠中之可量測原發性結腸CR-IGR-034P腫瘤評估2種劑量量之由人類化huMAb2-3經由兩種不同連接體(SPDB及磺基-SPDB)偶聯至DM4構成之三種偶聯物。對照組未經處理。偶聯物之劑量係以mg/kg給出。其係在腫瘤植入後第19天時藉由靜脈內(IV)濃注以5mg/kg及2.5mg/kg來投與。
如實例5中所報告評估毒性及功效。
結果
使用2.5mg/kg及5mg/kg之單次投與方案，huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-3-磺基-SPDB-DM4未引起毒性。
如圖19及表23中所顯示，huMAb2-3-SPDB-DM4在5mg/kg及2.5mg/kg下有活性且ΔT/ΔC分別為12%及40%(相對於對照p<0.0001)，huMAb2-3-磺基-SPDB-DM4在5mg/kg下具有高活性且ΔT/ΔC在0%以下(相對於對照p<0.0001)，且腫瘤消退為12%，且在2.5mg/kg下有活性，且ΔT/ΔC為1%(相對於對照p<0.0001)。
實例8：專用於檢測經福馬林固定且經石蠟包埋(FFPE)之組織中之人類及猴CEACAM5蛋白之免疫組織化學(IHC)方案的研發 材料及方法 組織
使用FFPE組織微陣列(TMA，表24)作為人類(腫瘤及非腫瘤)以及食蟹猴(正常)組織之來源。
抗體
使用MAb2作為初級小鼠抗人類CEACAM5單株抗體。使用生物素偶聯之山羊抗小鼠IgG1(特異性γ1鏈)(參考編號1070-08，批次L4309-X761,Southern Biotech,USA)作為二級抗體。
免疫染色
利用細胞處理1(CC1)緩衝液將抗原修復程序於95℃下應用8min，且然後在100℃下應用28min。在內源生物素封阻步驟後，將載玻片與在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋之5μg/mL初級抗抗體於24℃下一起培育2小時。將0.5μg/mL之生物素偶聯之山羊抗小鼠二級抗體於24℃下培育32分鐘。根據製造商之建議使用來自DABMapTM發色檢測套組(760-124,Ventana Medical Systems公司，USA)之3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)進行免疫染色。使用蘇木精(760-2037,Ventana Medical Systems公司，USA)實施對比染色步驟且施加發藍試劑(760-2037,Ventana Medical Systems公司，USA)。將所染色載玻片脫水且用cytoseal XYL(8312-4,Richard-Allan Scientific,USA)覆蓋。
IHC評分
使用ScanScope XT系統(Aperio Technologies,Vista,CA)掃描免疫 染色之載玻片。使用ImageScope軟體(10.2.2.2319版，Aperio Technologies)以×20放大倍數捕獲數位化影像。
染色評估包含反應性之組織學位點、主要反應細胞類型、染色強度及細胞染色頻率。陰性樣品評為0+分。陽性樣品係以1+至4+之強度量表評分。強度之範圍闡述為弱[0；2+]、中等[2+；3+]及強[3+；4+]。細胞頻率係經免疫染色之細胞之百分比且係藉由組織學家觀察樣品中值來估計。細胞頻率分為5類比例評分：1(0%-5%)、2(6%-25%)、3(26%-50%)、4(51%-75%)及5(76%-100%)。
對於腫瘤，整體表現評分係改編自Allred評分(AS)(Mohsin S、Weiss H、Havighurst T、Clark GM、Berardo M、Roanh LD等人Progesterone receptor by immunohistochemistry and clinical outcome in breast cancer：a validation study.Mod.Pathol.2004；17：1545-1554)。此AS係藉由添加強度及比例分以獲得介於0-9範圍內之總分來獲得。AS報告為最大值整體評分之百分數且分為5級：極低(0%-25%)、弱(26%-50%)、中等(51%-75%)及高(76%-100%)。發病率定義為適應症之陽性病例之百分數。
說明性統計分析
說明性統計學係使用Microsoft Excel 2003軟體來計算。對於每一適應症，闡述病例數、陽性病例數、發病率、強度評分中值、頻率中值、Allred評分平均值、強度範圍、頻率範圍及Allred評分範圍。
實例8.1： 藉助免疫組織化學(IHC)來評估FFPE人類腫瘤中之CEACAM5蛋白之抗CEACAM5單株抗體的用途
使用商業組織陣列載玻片(FFPE格式)來研究大量人類腫瘤。CEACAM5蛋白之表現位於腫瘤細胞之膜+/-細胞質中(圖1C、D)。一些膜染色在更加分化的腫瘤細胞之頂孔處發生極化。發現CEACAM5蛋白在以下各項中表現：
‧89%的結腸腺癌病例(194/219、強度2-2.5+、頻率53%-59%、AS 60%-66%)
‧49%的胃腺癌病例(95/195、強度2.5+、頻率53%、AS 62%)
‧41%的肺腺癌病例(24/58、強度1.8-2+、頻率50%-53%、AS 54-58%)
‧79%的子宮頸鱗狀癌病例(11/14、強度2+、頻率22%、AS 46%)
‧53%的胰臟腺癌病例(18/34、強度2+、頻率23%、AS 42%)
‧37%的食道鱗狀細胞癌病例(23/62、強度2+、頻率16%、AS 38%)
‧4%的卵巢癌病例(3/77、強度2+、頻率43%、AS 54%)
‧11%的甲狀腺癌病例(2/18、強度1.5+、頻率63%、AS 56%)
‧25%的膀胱癌病例(5/20、強度1.5+、頻率61%、AS 56%)
‧7%的子宮內膜腺癌例(1/14、強度2+、頻率50%、AS 56%)
‧11%的乳腺導管癌病例(2/18、強度1.5+、頻率53%、AS 50%)
‧53%的膽管癌例(2/6、強度1.5+、頻率75%、AS 50%)
‧53%的肺鱗狀細胞癌病例(31/148、強度1.5+、頻率22%、AS 39%)
‧8%的前列腺腺癌例(1/13、強度2+、頻率50%、AS 44%)
‧25%的皮膚鱗狀癌病例(2/8、強度1.5+、頻率23%、AS 39%)
實例8.2： 食蟹猴(食蟹獼猴)中抗CEACAM5單株抗體之組織交叉反應性及與人類表現模式之比較
藉由在含有CEACAM5 cDNA質體之人類胚胎腎HEK293細胞中瞬時表現來製備人類(h)或食蟹猴(c)來源之CEACAM5細胞外蛋白結構域(實例1、表1)。將細胞沈澱物於10%福馬林(Sigma Aldrich,USA)中固定16小時，且根據標準組織學程序在石蠟中作為一片組織包埋。
使用商業TMA作為人類及猴正常組織來源(表21)。
藉由經人類及猴CEACAM5轉染之細胞中之免疫染色(膜及細胞質定位)顯示Mab2之交叉反應性。
在食蟹猴正常組織中，發現CEACAM5蛋白在吸收性柱狀上皮細胞(2/3陽性病例，中值強度1.5+、平均頻率55%)中表現。
在人類非腫瘤組織中，亦觀察到CEACAM5在吸收性柱狀上皮細胞(62/64陽性病例，中值強度2+、平均頻率90%)中表現。在人類組織中，觀察到CEACAM5在食道上皮細胞、頭頸上皮細胞、胃小凹上皮細胞及子宮頸上皮細胞中有較小程度的表現。
實例9：抗體藥物偶聯物(變體) 抗CEACAM5 huMAb2-3-磺基SPDB-DM4 分析數據：
MW(Ab)=147417g/mol；MW(DM4)=780.38g/mol
ε280nm(Ab)=201400；ε252nm(Ab)=71451
ε280nm(DM4)=5180；ε252nm(DM4)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入7.0ml抗CEACAM5 huMAb2-3溶液(C=5.32mg/ml，存於PBS緩衝液(pH=7.4)中)，然後引入1.6ml DMA及168.4μl硝基-磺基SPDB連接體(闡述於WO2009134977中)溶液(10當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下將溶液緩慢攪拌3小時。添加額外體積之3.4μl硝基-磺基SPDB連接體溶液(2.0當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下在磁力攪拌下保持2小時後，相繼添加2.90ml PBS緩衝液(pH7.4)、0.407ml DMA及0.322ml DM4溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持1小時且在5℃下保持16小時後，在經1 CV 1M NaOH、2 CV水及2 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上純化粗反應混合物。用組胺酸(10 mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得19ml呈無色透明溶液形式之抗CEACAM5 huMAb2-3-磺基SPDB-DM4偶聯物(c=1.51mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=3.4；DAR(SEC)=3.3；單體純度=99.8%；HRMS數據：參見圖20。
抗CEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DMI 分析數據：
MW(Ab)=147417g/mol；MW(DM1)=738g/mol
ε 280nm (Ab)=201400；ε 252nm (Ab)=71451
ε 280nm (DM1)=5180；ε 252nm (DM1)=26159
在攪拌下在室溫下，在容器中引入11.3ml抗CEACAM5 huMAb2-3溶液(C=3.47mg/ml，存於緩衝液A(pH=6.5)中)，然後引入0.387ml DMA及178μl SMCC連接體溶液(10當量-存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下將溶液緩慢攪拌2小時。在經2 CV 0.2M NaOH、5 CV水及5 CV檸檬酸鹽緩衝液(pH 5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Sephadex G25,GE Healthcare)上對粗反應混合物進行緩衝液交換。用檸檬酸鹽緩衝液(pH 5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，並在0.22μm過濾器上過濾。在攪拌下在室溫下，向此溶液中相繼添加0.476ml DMA及0.124ml DM1溶液(存於DMA中之15mM溶液)。在室溫下保持2小時後，在經2 CV 0.2M NaOH、5 CV水及5 CV組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH5.5)預處理之HiPrep 26/10去鹽管柱(Superdex G25,GE Healthcare)上將粗反應混合物純化兩次。用組胺酸(10mM)、甘胺酸(130mM)、蔗糖(5%)緩衝液(pH=5.5)溶析偶聯物，且彙集單體偶聯物流份，在0.22μm過濾器上過濾。
因此，獲得9.5ml呈無色透明溶液形式之抗CEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1(c=1.73mg/ml)。然後分析偶聯物之最終藥物載量及單體純度：DAR(UV)=2.7；DAR(SEC)=2.9；單體純度=99.6%；HRMS數據：參見圖21。
實例10：使用氫-氘交換結合質譜(HDX MS)測定之與MAb2_VH1aVL1c Fab複合之CEACAM5-A3B3之表位及互補位的特徵 實例10.1： HDX MS之原理
醯胺氫-氘交換(HDX)結合質譜(MS)使得能夠鑑別構象變化或相互作用中所暗示之蛋白質區域。此技術使得能夠更特定地鑑別，在氘化緩衝液中培育及蛋白水解後顯示以結合至抗體之形式比呈其游離形式之氘納入減少的抗原區域。
該表位屬於該等區域，其交換因與抗體結合而減慢。近期論文詳細闡述了使用此方法表徵表位之不同步驟(Zhang,Q.、Willison,L.N.、Tripathi,P.、Sathe,S.K.、Roux,K.H.、Emmett,M.R.、Blakney,G.T.、Zhang,H.M.及Marshall,A.G.(2011).Analytical Chemistry 83,7129-7136.)。
實例10.2： 材料
將MAb2_VH1aVL1c之可變結構域編碼序列(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：29)選殖至哺乳動物表現載體中，該表現載體分別融合有人類CH1結構域(如於源自經木瓜酶裂解之IgG1之Fab中所發現)之編碼序列、其後為六組胺酸標籤或融合有人類Cκ恆定結構域之編碼序列。藉由瞬時轉染複合有293fectinTM(Invitrogen)之編碼兩條鏈之兩種表現質體在懸浮培養之HEK293-FSTM細胞中產生MAb2_VH1aVL1c Fab批次。轉染後7天時收穫含有分泌蛋白之培養物上清液，離心且在0.22μm膜上過濾。藉由IMAC(HisTrap,GE Healthcare)上之親和層析使用 存於PBS中之咪唑梯度來純化Fab。然後，藉由經PBS平衡之粒徑排阻層析(Superdex 200,GE Healthcare)純化含有Fab之流份彙集物。
藉由瞬時轉染表現質體利用於燒瓶中培養之HEK293-FSTM細胞產生經His標記之hCEACAM5-A3B3結構域(SEQ ID NO：67)。每天添加幾夫鹼(Kifunensine)(修整糖基化過程之抑制劑)。轉染後7天時收穫含有分泌蛋白之培養物上清液，離心且在0.22μm膜上過濾。將內切酶H添加至上清液中最高至625u/ml，然後在37℃下培育3h。藉由IMAC(HisTrap,GE Healthcare)上之親和層析使用存於PBS中之咪唑梯度來純化去糖基化hCEACAM5-A3B3。然後，藉由經PBS平衡之粒徑排阻層析(Superdex 200,GE Healthcare)純化含有去糖基化hCEACAM5-A3B3之流份彙集物。去糖基化hCEACAM5-A3B3之質譜分析顯示兩個物種(22 485Da及22 278Da)，此指示該蛋白質攜載7或8個N-乙醯基葡糖胺殘基(GlcNAc)。
為建立複合物，對於1莫耳Fab，將兩種蛋白質與1.5莫耳過量之去糖基化hCEACAM5-A3B3彙集。藉由經磷酸鹽緩衝鹽水平衡之superdex 200上之粒徑排阻層析移除此過量。將對應於Fab與抗原之複合物之流份用於氘交換研究。
實例10.3： 方法
使用PAL自動取樣器(CTC Analytics)使氫/氘交換(HDX)實驗完全自動化。其使交換能夠起始並淬滅，控制蛋白水解溫度(4℃)，注射氘化肽，管控注射及洗滌閥並觸發質譜儀及HPLC幫浦之獲取。Peltier冷卻盒(4℃)含有兩個Rheodyne自動閥(6個注射用埠及10個洗滌用埠)、去鹽柱(peptide Micro Trap，來自Bruker-Michrom)及HPLC管柱(Poroshell 120 EC-C18,1×50mm,2.7μM，來自Agilent Technologies)。藉由使用存於D2O中之PBS將CEACAM5、mAb或複合物稀釋5倍來氘化。使用2M GndHCl、0.8M TCEP、1M甘胺酸來淬 滅反向交換且在4℃下經2min還原二硫橋。
用胃蛋白酶及豬籠草蛋白酶(nepenthesin protease)消化蛋白質且使用Agilent Technologies HPLC幫浦用存於水中之0.03% TFA以100μL/min對肽去鹽。然後使用另一Agilent Technologies HPLC幫浦用15%-100% B梯度經20min(A：存於水中之0.03% TFA；B：90%乙腈、存於水中之0.03% TFA)分離肽。使用電噴射-TOF質譜儀(Agilent 6210)來量測肽質量。
藉由串聯MS(MSMS)使用Bruker APEX-Q FTMS(9.4 T)及Bruker 12 T SolariX來鑑別肽。
使用Data Analysis(Bruker)及Mass Hunter(Agilent Technologies)軟體獲取數據。使用Data Analysis及Mascot(Matrix Science)來處理MSMS數據。使用Mass Hunter及HD Examiner(Sierra Analytics)軟體來處理HDX數據。
將HDX實驗重複至少三次。
實例10.4： 結果 肽之鑑別及選擇
二硫橋在氘化期間保持完整以保持與其相關之結構資訊。為有助於蛋白水解及肽鑑別，在低pH及低溫下實施淬滅步驟後用TCEP還原橋。在消化CEACAM5-Fab複合物後，使用MSMS可鑑別大量源自三條蛋白質鏈之肽。在HDX實驗後，僅選擇給出良好品質信號者：分別來自CEACAM5-A3-B3抗原、MAb2_VH1aVL1c Fab重鏈及MAb2_VH1aVL1c輕鏈之25號肽、30號肽及20號肽。該等肽分別覆蓋89%、77%及68%的CEACAM5-A3-B3抗原、MAb2_VH1aVL1c Fab重鏈及MAb2_VH1aVL1c輕鏈序列(表25)。Fab鏈之未覆蓋區域主要在其C端部分。
為潛在糖基化位點之所有8個天冬醯胺殘基經鑑別在若干具有自內切酶H去糖基化剩餘之GlcNAc之肽內。具體而言，發現N114位於肽108-115中。在第一實驗(並非用於HDX)中，發現N166位於兩種形式(具及不具GlcNAc)中。其可能解釋在去糖基化後在CEACAM5-A3B3質譜中所觀察到之異質性，此對應於7及8個GlcNAc。
表位及互補位鑑別
在4℃下在2min或20min期間或在室溫(26℃)下經20min氘化游離抗原、游離Fab及其複合物。考慮到醯胺氫與溫度之交換動力學(10℃增加約3倍交換)，最後條件等效於在4℃下氘化200min。
表位
當抗原以游離形式氘化且當其與Fab複合時，比較CEACAM5- A3B3之25條所選肽之氘納入動力學。若干肽並未顯示兩種狀態之間之任何顯著HDX差異(ΔHDX)。相反，其中的一些(108-115及128-143)顯示顯著ΔHDX。第二區域經5種不同肽覆蓋：128-142、128-143、130-142、130-143及140-143，此顯示氘化2min後13%-15%±2%(最高1.6±0.2D)ΔHDX。
比較128-142與130-142及128-143與130-143，在每一情形下並未量測出任何顯著ΔHDX變化(氘化2min後，對於前兩種肽為1.3-1.4D，且對於後兩種肽為1.6)，此意味著醯胺W129及R130可能並未在表位中有所涉及。相反，比較128-142與128-143及130-142與130-143，量測出小ΔHDX變化(約0.2D)，此意味著涉及醯胺F143。肽140-143中之ΔHDX(約0.3D)指示亦可能涉及醯胺V141或L142。在I131至Q140之9個醯胺內，其中的若干在表位中有所涉及(平均共享約1 ΔHDX)。
氘納入之該等差異指示，該表位尤其屬於區域(醯胺)，即肽序列SGANLNL(SEQ ID NO：76)及INGIPQQHTQVLF(SEQ ID NO：77)。
互補位
當Fab係以游離形式氘化且當其與抗原複合時，比較Fab重鏈之30條所選肽之氘納入動力學。幾乎所有肽皆未顯示兩種狀態之間之任何顯著ΔHDX。在氘化200min後僅一種肽(100-109)呈現ΔHDX：11%±2%(0.7±0.2D)。暗示MAb2_VH1aVL1c Fab重鏈之區域(醯胺)101-109位於互補位中。
當Fab係以游離形式氘化且當其與抗原複合時，比較Fab輕鏈之20條所選肽之氘納入動力學。幾乎所有肽皆未顯示兩種狀態之間之任何顯著ΔHDX。僅兩種肽(47-54及87-104)呈現差異。氘化20min後，對於第一種肽為10±2%(0.6±0.2D)，對於第二種肽為5±2%(0.9±0.2D)。MAb2_VH1aVL1c輕鏈之區域48-54及88-104在互補位中有所涉及。
圖1：抗CEACAM5抗體選擇性之評估。
圖2：人類CEACAM5上抗CEACAM5抗體之結構域定位。
圖3：食蟹猴CEACAM5上抗CEACAM5抗體之結構域定位。
圖4：在SCID雌性小鼠中chMAb4-SPDB-DM4、chMAb1-SPDB-DM4、chMAb5-SPDB-DM4及chMAb2-SPDB-DM4偶聯物對原發性人類結腸腺癌CR-IGR-034P之抗腫瘤活性之評估。
圖5：在SCID雌性小鼠中huMAb2-3-SPDB-DM4、huMAb2-4-SPDB-DM4及chMAb2-SPDB-DM4偶聯物對原發性人類結腸腺癌CR-IGR-034P之抗腫瘤活性之評估。
圖6：在SCID雌性小鼠中huMAb2-3-SPDB-DM4偶聯物對原發性人類胃腺癌STO-IND-006之抗腫瘤活性之評估。
圖7：MAb1、MAb2、MAb3、MAb4及MAb5抗體之VH與VL區之 序列比對。
圖8：chMAb1-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖9：chMAb2-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖10：chMAb4-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖11：chMAb5-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖12：huMAb2-2-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖13：huMAb2-1-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖14：huMAb2-3-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖15：huMAb2-4-SPDB-DM4偶聯物之HRMS分析。
圖16：MAb2之人類化變體至人類及猴CEACAM5細胞外結構域之結合活性。
圖17：MAb2之人類化變體至人類及猴CEACAM5細胞外結構域之結合穩定性。
圖18：在SCID雌性小鼠中huMAb2-3-SPDB-DM4偶聯物對原發性人類肺腺癌LUN-NIC-0014之抗腫瘤活性之評估。
圖19：在CD1雌性裸小鼠中huMAb2-3-SPDB-DM4及huMAb2-3-磺基-SPDB-DM4偶聯物對原發性人類結腸腺癌CR-IGR-034P之抗腫瘤活性之評估。
圖20：huMAb2-3-磺基SPDB-DM4之HRMS分析。
圖21：huMAb2-3-SMCC-DM1之HRMS分析。
圖22：MAb2、MAb4、MAb5、人類化VH1a、人類化VH1及人類化VHg2之重鏈可變結構域比對。
圖23：MAb2、MAb4、MAb5、人類化VL1、人類化VL1a、人類化VL1c、人類化VL1d及人類化VLg5之輕鏈可變結構域比對。
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<221> DOMAIN
<222> (1)..(286)
<223> hCEACAM5 N-A1-B1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (287)..(292)
<223> His標簽
<400> 65
<210> 66
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(178)
<223> hCEACAM5 A2-B2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (179)..(184)
<223> His標簽
<400> 66
<210> 67
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(187)
<223> hCEACAM5 A3-B3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (188)..(193)
<223> His標簽
<400> 67
<210> 68
<211> 310
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(286)
<223> 食蟹猴CEACAM5之結構域N-A1-B1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (287)..(310)
<223> 具有His標簽之延伸
<400> 68
<210> 69
<211> 202
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(178)
<223> 食蟹猴CEACAM5之結構域A2-B2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (179)..(202)
<223> 具有His標簽之延伸
<400> 69
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(190)
<223> 食蟹猴CEACAM5之結構域A3-B3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (191)..(214)
<223> 具有His標簽之延伸
<400> 70
<210> 71
<211> 344
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
<210> 72
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
<210> 73
<211> 349
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAb2_VHg2
<400> 74
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAb2_VLg5
<400> 75
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類CEACAM5-A3B3之位置109-115處之殘基
<400> 76
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類CEACAM5-A3B3之位置131-143處之殘基
<400> 77
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa係T、A或V
<400> 78
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係S或N(尤其係S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa係Y或G(尤其係G)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa係R或I(尤其係I)
<400> 79
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係A或T(尤其係A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa係T或S(尤其係S)
<400> 80
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa係R或S，尤其係S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa係A或D
<400> 81
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa係不存在、S或G(尤其係G)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa係D、Y或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa係T或I(尤其係T)
<400> 82
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> Xaa係任一胺基酸
<400> 83
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係A或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa係Y、F或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(8)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa係任一胺基酸
<400> 84
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa係Y、F或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa係任一胺基酸
<400> 85
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa係Y、F或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa係任一胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(9)
<223> Xaa係任一胺基酸
<400> 86
<210> 87
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMAb2-3之重鏈序列
<400> 87
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMAb2-3之輕鏈序列
<400> 88
<210> 89
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAb2重鏈VH1-IgG1
<400> 89
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAb2輕鏈VL1d
<400> 90

Claims (46)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類及食蟹獼猴(Macaca fascicularis)CEACAM5蛋白之A3-B3結構域，且包含：a)CDR1-H，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；CDR2-H，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；CDR3-H，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；CDR1-L，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；CDR2-L，其包含胺基酸序列SAS；及CDR3-L，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；或b)CDR1-H，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：7相差一個胺基酸取代之序列，該胺基酸取代係位於對應於SEQ ID NO：33之位置26至31中任一者之殘基；CDR2-H，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：8相差一或多個胺基酸取代之序列，該一或多個胺基酸取代係位於任何位置；CDR3-H，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：9相差一或多個胺基酸取代之序列，該一或多個胺基酸取代係位於對應於SEQ ID NO：33之位置97、103、104、107及109中一或多者之一或多個殘基；CDR1-L，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：10相差一個胺基酸取代之序列，該胺基酸取代係位於對應於SEQ ID NO：34之位置27至29及31中任一者之殘基；CDR2-L，其包含胺基酸序列NTK或NTR，或與NTK或NTR相差一個胺基酸取代之序列，該胺基酸取代係位於對應於SEQ ID NO：34之位置51或52之殘基；及CDR3-L，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：12相差一個胺基酸取代之序列，該胺基酸取代係位於對應於SEQ ID NO：34之位置89、90、93、94、96及97中任一者之殘基；或c)CDR1-H，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；CDR2-H，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；CDR3-H，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；CDR1-L，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；CDR2-L，其包含胺基酸序列SAS；及CDR3-L，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；或d)CDR1-H，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；CDR2-H，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；CDR3-H，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；CDR1-L，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；CDR2-L，其包含胺基酸序列NAK；及CDR3-L，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；或e)CDR1-H，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；CDR2-H，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；CDR3-H，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列；CDR1-L，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；CDR2-L，其包含胺基酸序列NAK；及CDR3-L，其包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5之A3-B3結構域：a)對人類CEACAM5之親和力與對食蟹獼猴CEACAM5親和力之比率
    Figure TWI664192B_C0001
    12；或b)對人類CEACAM5及/或食蟹獼猴CEACAM5之親和力
    Figure TWI664192B_C0002
    10nM，或c)a及b兩種情況。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類CEACAM5蛋白之該A3-B3結構域之兩個區域，該兩個區域分別包括序列SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：77。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該胺基酸取代係保守胺基酸取代。
  5. 如請求項1、2及4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括：a)序列SEQ ID NO：31或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：32或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或b)序列SEQ ID NO：33或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域，及序列SEQ ID NO：34或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或c)序列SEQ ID NO：35或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域，及序列SEQ ID NO：36或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或d)序列SEQ ID NO：37或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域，及序列SEQ ID NO：38或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域；或e)序列SEQ ID NO：39或與其至少85%一致之序列的重鏈可變結構域，及序列SEQ ID NO：40或與其至少85%一致之序列的輕鏈可變結構域。
  6. 如請求項1、2及4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係嵌合或人類化抗體。
  7. 如請求項1、2及4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係包括以下之抗體：a)序列SEQ ID NO：41之重鏈及序列SEQ ID NO：42之輕鏈；或b)序列SEQ ID NO：43之重鏈及序列SEQ ID NO：44之輕鏈；或c)序列SEQ ID NO：45之重鏈及序列SEQ ID NO：46之輕鏈；或d)序列SEQ ID NO：47之重鏈及序列SEQ ID NO：48之輕鏈；或e)序列SEQ ID NO：49之重鏈及序列SEQ ID NO：50之輕鏈。
  8. 如請求項1、2及4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括：a)序列SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：74之重鏈可變結構域；及b)序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：75之輕鏈可變結構域。
  9. 如請求項1、2及4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括：a)序列SEQ ID NO：51之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：17之輕鏈可變結構域，或b)序列SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：23之輕鏈可變結構域，或c)序列SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：29之輕鏈可變結構域，或d)序列SEQ ID NO：51之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：55之輕鏈可變結構域，或e)序列SEQ ID NO：74之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：75之輕鏈可變結構域。
  10. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類及食蟹獼猴CEACAM5蛋白之A3-B3結構域且包括a)由序列SEQ ID NO：87或與其至少85%一致之序列組成的重鏈；及b)由序列SEQ ID NO：88或與其至少85%一致之序列組成的輕鏈。
  11. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係抗體片段。
  12. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係單一結構域抗體之可變重鏈(VHH)。
  13. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係雙特異性或多特異性抗體。
  14. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群之片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2及雙鏈抗體(diabodies)。
  15. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於治療癌症。
  16. 如請求項15之抗體或其抗原結合片段，其中該癌症係表現CEACAM5之癌症。
  17. 如請求項15之抗體或其抗原結合片段，其中該癌症係結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌或皮膚癌。
  18. 如請求項1、2、4及10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於離體(ex vivo)檢測個體之生物樣品中之CEACAM5表現。
  19. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體經可檢測分子或物質標記。
  20. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中該用途係用於診斷個體中癌症之存在，測定患有癌症之患者對靶向CEACAM5之治療劑之敏感性，或監測抗CEACAM5癌症療法之有效性或在抗CEACAM5癌症療法後檢測癌症復發。
  21. 一種經分離之核酸，其包括編碼如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段之序列。
  22. 一種宿主細胞，其已由如請求項21之核酸轉化。
  23. 一種免疫偶聯物(immunoconjugate)，其包括如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段偶聯或連接至至少一種生長抑制劑。
  24. 如請求項23之免疫偶聯物，其中該生長抑制劑係細胞毒性劑或放射性同位素。
  25. 如請求項23或24之免疫偶聯物，其中該生長抑制劑係選自由以下組成之群：化學治療劑、酶、抗生素及毒素、類紫杉醇、長春花、紫杉烷、類美登素(maytansinoid)或類美登素類似物、茅屋黴素(tomaymycin)或吡咯并苯并二氮呯衍生物、念珠藻素(cryptophycin)衍生物、來普黴素(leptomycin)衍生物、奧裏斯他汀(auristatin)或多拉司他汀(dolastatin)類似物、前藥、拓撲異構酶II抑制劑、DNA烷基化劑、抗微管蛋白劑及CC-1065或CC-1065類似物。
  26. 如請求項25之免疫偶聯物，其中該毒素係小分子毒素或酶活性毒素。
  27. 如請求項23或24之免疫偶聯物，其中該生長抑制劑係N 2’-去乙醯基-N 2’-(3-巰基-1-側氧基(oxo)丙基)-美登素(maytansine)(DM1)或N 2’-去乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
  28. 如請求項23或24之免疫偶聯物，其中該抗體經由可裂解或不可裂解連接體共價連接至該至少一種生長抑制劑。
  29. 如請求項28之免疫偶聯物，其中該連接體係選自由以下組成之群：吡啶基二硫丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫基(sulfanyl))-2-磺基-丁酸(磺基-SPDB)及(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)。
  30. 如請求項23或24之免疫偶聯物，其中該抗體包括序列SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域及序列SEQ ID NO：29之輕鏈可變結構域。
  31. 如請求項23或24之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物之特徵在於介於1至10範圍內之藥物對抗體比率(DAR)。
  32. 一種免疫偶聯物，其包含抗體，該抗體包含SEQ ID NO：7序列之CDR1-H，SEQ ID NO：8之序列之CDR2-H，SEQ ID NO：9之序列之CDR3-H，SEQ ID NO：10之序列之CDR1-L，序列NTR之CDR2-L，及SEQ ID NO：12序列之CDR3-L，其中該抗體經由吡啶基二硫丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)共價連接至N 2’-去乙醯基-N-2’(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
  33. 如請求項32之免疫偶聯物，其中該抗體包含由SEQ ID NO：87序列組成的重鏈及由SEQ ID NO：88序列組成的輕鏈。
  34. 如請求項23、24、32或33之免疫偶聯物，其用於治療癌症。
  35. 如請求項34之免疫偶聯物，其中該癌症係表現CEACAM5之癌症。
  36. 如請求項34之免疫偶聯物，其中該癌症係結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌或皮膚癌。
  37. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項23至33中任一項之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
  38. 如請求項37之醫藥組合物，其用於治療癌症。
  39. 如請求項38之醫藥組合物，其中該癌症係表現CEACAM5之癌症。
  40. 如請求項38或39之醫藥組合物，其中該癌症係結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌或皮膚癌。
  41. 一種如1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項23至33中任一項之免疫偶聯物或如請求項37之醫藥組合物之用途，其係用於製備用於治療癌症之藥物。
  42. 如請求項41之用途，其中該癌症係表現CEACAM5之癌症。
  43. 如請求項41或42之用途，其中該癌症係結腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌或皮膚癌。
  44. 一種如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於離體(ex vivo)檢測個體之生物樣品中之CEACAM5表現。
  45. 如請求項44之用途，其中該抗體或其抗原結合片段經可檢測分子或物質標記。
  46. 如請求項44或45之用途，其中該用途係用於診斷個體中癌症之存在，測定患有癌症之患者對靶向CEACAM5之治療劑之敏感性，或監測抗CEACAM5癌症療法之有效性或在抗CEACAM5癌症療法後檢測癌症復發。
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