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CN118302201A - 咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺化合物及其缀合物、它们的制备和它们的治疗性应用 - Google Patents

咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺化合物及其缀合物、它们的制备和它们的治疗性应用 Download PDF

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CN118302201A
CN118302201A CN202280078144.1A CN202280078144A CN118302201A CN 118302201 A CN118302201 A CN 118302201A CN 202280078144 A CN202280078144 A CN 202280078144A CN 118302201 A CN118302201 A CN 118302201A
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CN
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alkylene
antibody
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M-P·布伦
S·德凯
A·费里尔
M·弗雷德里克
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Sanofi Aventis France
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Abstract

赛诺菲“咪唑并[4,5‑c]喹啉‑4‑胺化合物及其缀合物、它们的制备和它们的治疗性应用”本披露涉及式(I)(I)的化合物，其中n是1至50的整数；R1表示氢原子、‑(C1‑C6)亚烷基‑O‑(C1‑C6)烷基、‑(C1‑C6)亚烷基‑NH‑(C1‑C6)烷基或‑(C1‑C6)烷基；R2表示‑(C1‑C6)亚烷基‑基团；R3表示‑O‑、‑NH‑或‑N((C1‑C6)烷基)‑基团；R4表示氢原子、‑(C1‑C6)烷基或‑(C1‑C6)烷氧基；R5表示‑(C1‑C6)亚烷基‑基团；并且R6表示‑L1‑RCG1基团或‑RCG1基团。本披露还涉及式(II)的缀合物，涉及它们的制备方法，涉及包含它们的组合物并且涉及它们的治疗性用途，尤其是在预防和/或治疗可受益于免疫系统激活的疾病或障碍诸如癌症中的用途。

Description

咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺化合物及其缀合物、它们的制备和 它们的治疗性应用
本披露涉及新的咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺化合物(也称为有效载荷)、新的咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺缀合物，涉及包含它们的组合物并且涉及它们的治疗性用途，例如作为Toll样受体7激动剂。本披露还涉及用于制备这些缀合物的方法。
背景技术
在过去的十年里，免疫疗法(主要是免疫检查点抑制剂(ICI))在患者中产生了令人印象深刻的临床反应。然而，对ICI有反应的患者的百分比仍然很低。值得注意的是，ICI的功效与“炎症型”肿瘤微环境(TME)相关，并且患有“非炎症型”肿瘤的患者倾向于对ICI的反应不佳。
通过将非炎症型或不良炎症型肿瘤转化为免疫炎症型肿瘤并且(重新)启动T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，TLR(Toll样受体)(诸如TLR7/8)的治疗性激活显示出用于免疫疗法的潜力。先天性免疫系统含有几个种系编码的包括Toll样受体(TLR)在内的模式识别受体(PRR)的家族。这些受体识别来自释放的称作损伤相关分子模式(DAMP)的内部细胞组分或称作病原体相关分子模式(PAMP)的微生物组分的危险信号。PAMP是广泛范围的病原体(诸如病毒、真菌、细菌和寄生虫)上的高度保守的分子结构。TLR7和TLR8两者都位于内溶酶体内并且通过其识别单链RNA PAMP以及合成小分子的能力而在病毒感染期间的免疫反应方面发挥重要作用。它们的刺激导致细胞内信号传导以及下游激活编码共刺激分子、促炎性细胞因子和I型干扰素等的基因。激动剂对TLR(诸如TLR7和/或TLR8)的激活可以诱导分泌I型干扰素(诸如IFNα和IFNβ)、肿瘤坏死因子(TNFα)和白介素(诸如IL6、IL12)，它们是启动先天性免疫和适应性免疫的重要因子。已知这些细胞因子的分泌(与共刺激分子的表达相关)可诱导树突细胞、单核细胞和巨噬细胞的成熟，促进抗原的呈递和适应性免疫反应的刺激。
各种小分子的TLR7的激动剂(通常称为TLR7激动剂)和/或TLR8的激动剂(一般称为TLR8激动剂)已经被描述为强效抗肿瘤化合物。例如，咪唑并喹啉化合物，诸如咪喹莫特(R-837)、雷西莫特(R-848，也称为R848)和嘎德莫特(Gardiquimod)。例如，咪喹莫特(咪唑并喹啉家族的先导化合物)是TLR7激动剂，并且对许多原发性皮肤肿瘤和皮肤转移瘤有效，并且作为外用配制品市售。它于1997年首次被FDA批准。雷西莫特(R848)可以同时充当TLR7激动剂和TLR8激动剂并且具有抗病毒和抗肿瘤活性。它目前在临床试验下被测试作为外用凝胶用于治疗皮肤病变(诸如由单纯疱疹病毒、多发性光线性角化病和皮肤T细胞淋巴瘤引起的皮肤病变)，作为增加疫苗有效性的佐剂以及作为过敏性鼻炎(AR)患者的免疫疗法的佐剂。
此类咪唑并喹啉激动剂的全身施用耐受性不好，使其临床用途局限于局部施用(诸如外用或肿瘤内施用)。TLR7/8激动剂的肿瘤内递送已显示出令人鼓舞的临床前和临床抗肿瘤益处。然而，目前的肿瘤内递送方法展现出差的肿瘤保留，限制了抗肿瘤益处并且促进了治疗相关的不良事件。
通过静脉内施用递送的TLR7/8激动剂也已在临床中作为如BDB-001出现，其与派姆单抗组合显示出活性，但在单一疗法下78％左右的入选患者还出现了治疗相关的不良事件(Journal of Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志]2021 39:15_增刊，2512-2512)。
最近描述了用于静脉内肿瘤靶向递送的与抗体缀合的TLR7/8激动剂。然而，当前正在开发中的TLR7/8缀合物显示了几种不良事件。
因此，仍然需要具有较少不良事件的基于TLR7/8激动剂的新免疫疗法来治疗疾病、特别是癌症。
本披露的目的是提供适合于全身递送的、尤其是适合于与抗体缀合并且呈现较少的不良反应的新的免疫刺激化合物。
本披露描述了显示出强效TLR7活性但无TLR8活性的适合于与抗体缀合的新的咪唑并喹啉化合物及其缀合物。
发明内容
本披露涉及一种式(I)的化合物(在本发明上下文中也称为有效载荷或化合物/有效载荷)或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团；并且
R6表示-L1-RCG1基团或-RCG1基团；
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被-NH2基团取代，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
RCG1表示：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，诸如-O-，并且
Ra表示氢原子，-(C1-C6)烷基，-(C3-C7)环烷基，-(C2-C6)烯基，-(C6-C10)芳基，包含4至9个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的-(C5-C10)杂芳基，或包含2至6个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C7)杂环烷基，所述-(C6-C10)芳基、-(C5-C10)杂芳基和/或-(C3-C7)杂环烷基任选地被1至5个选自以下的原子/基团取代：诸如氟原子的卤素原子、-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)烷氧基、羟基、氧代基、硝基和氰基；或
(ii)以下反应性基团中的一个：马来酰亚胺基基团；经取代的马来酰亚胺基，诸如卤代乙酰胺基基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基，诸如甲基；Cl-；N3-；HO-；HS-；活化的二硫化物，诸如H2N-；HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分，例如DBCO-胺BCN或MFCO苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如基团；基团；O-烷基羟胺或Pictet-Spengler反应底物，诸如例如RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基 苯基噁二唑基甲基砜基团基团；I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基；或基团。
本披露进一步涉及式(II)的化合物(在本发明上下文中也称为缀合物或化合物/缀合物)或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25，例如3、7、11或23；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基，例如-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基，诸如-CH2-O-C2H5基团；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团，例如-O-或-NH-；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基，例如氢原子；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-L1-G-Ab基团或-G-Ab基团，
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至G并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如L1是-(CH2)2-哌啶基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如L1是-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至G并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被NH2基团取代，例如-CH2-CH(CH2-NH2)-C(＝O)-NH-基团、-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团或-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
-Ab表示抗体，例如单克隆抗体；并且
-G表示如本披露中定义的RCG1与存在于该抗体上的反应性基团RCG2之间的反应的产物，例如G选自由以下组成的组：
例如当R7是-L1-G-Ab时，G基团的左侧连接至Ab并且G基团的右侧连接至L1，或当R7是-G-Ab时直接连接至R5，
例如，G表示以下基团：
式(I)和(II)的化合物也可以以互变异构体形式存在。确实，应理解，本披露涵盖式(I)和(II)的所有异构体及其药学上可接受的衍生物，包括所有几何异构体、互变异构体及其混合物
式(I)的化合物/有效载荷可以以碱或与酸或碱的加成盐、特别是药学上可接受的盐的形式存在。
式(I)的化合物/有效载荷的药学上可接受的盐确实形成本披露的一部分。
式(I)的化合物/有效载荷可以以碱、酸、两性离子或与酸或碱的加成盐的形式存在。此类加成盐、碱、酸和两性离子形成本披露的一部分。因此，本披露尤其涉及式(I)的化合物/有效载荷或涉及其药学上可接受的盐。
这些盐可以用药学上可接受的酸或碱制备，但可用于例如纯化或分离式(I)的化合物/有效载荷的其他酸或碱的盐也形成本披露的一部分。
本披露还涉及用于制备根据本披露的式(II)的化合物/缀合物的方法。
因此，根据一个具体的实施例，本披露涉及用于制备如本披露中定义的式(II)的化合物/缀合物的方法，该方法包括至少以下步骤：
(i)使以下接触并且反应：
-任选地借助修饰剂修饰的包含反应性RCG2基团的抗体Ab的任选缓冲的水溶液，
和
-如本披露中定义的式(I)的化合物/有效载荷的溶液，该化合物/有效载荷
包含反应性RCG1基团，
式(I)的化合物/有效载荷的RCG1基团对该抗体的RCG2基团有反应性以通过共价键形成G基团并且形成式(II)的化合物/缀合物；
(ii)并且然后任选地将步骤(i)中形成的式(II)的化合物/缀合物与未反应的式(I)的化合物/有效载荷和/或与未反应的抗体和/或与可能已形成的任何聚集体分离。
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用作药物。
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用于疗法，尤其是作为TLR7激动剂
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用于预防和/或治疗可受益于激活免疫系统的疾病或障碍，例如用于预防和/或治疗细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病，诸如皮肤病变或皮肤癌(例如，外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤)；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应(例如，过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应)；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷，例如预防和/或治疗癌症。
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用于预防和/或治疗癌症。
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用作抗癌剂。
本披露的另一个主题是选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，用于抗肿瘤疫苗。
本披露的另一个主题是预防和/或治疗可受益于激活免疫系统的疾病或障碍，例如预防和/或治疗细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病诸如皮肤病变或皮肤癌(例如，外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤)；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应(例如，过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应)；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷的方法，该方法包括向有需要的受试者例如人施用治疗有效量的选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本披露还涉及预防有需要的患者例如人的可受益于激活免疫系统的疾病或障碍，例如预防细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病诸如皮肤病变或皮肤癌(例如，外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤)；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应(例如，过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应)；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷的方法，该方法包括用疫苗免疫所述患者，该疫苗包含选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本披露还涉及抗肿瘤疫苗。
本披露进一步涉及选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐用于制造抗肿瘤疫苗和/或药剂的用途，该药剂用于预防和/或治疗可受益于激活免疫系统的疾病或障碍，例如用于预防和/或治疗细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病，诸如皮肤病变或皮肤癌(例如，外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤)；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应(例如，过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应)；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷，例如癌症。
本披露的另一个主题是药剂，该药剂包含作为活性成分的有效剂量的选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐。
本披露的另一个主题是药剂，该药剂包含选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐。
本披露的另一个主题是药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的有效剂量的选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本披露的另一个主题是药物组合物，该药物组合物包含选自以上和以下定义/列表的根据本披露的式(II)的化合物/缀合物，或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
定义
在本披露的上下文中，除非在整个本说明书中另外提及，否则以下术语具有以下定义：
-卤素原子：氟、氯、溴或碘原子，并且例如氟或溴或碘原子；
-羟基：“-OH”基团；
-氧代基：“＝O”基团；
-氰基：“-C≡N”基团；
-硝基：“-NO2”基团；
--(Cx-Cy)烷基：包含x至y个碳原子(例如，1至6个碳原子)的基于直链或支链饱和烃的脂族基团，举例来说，可以提及但不限于：甲基、乙基、丙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等；
--(Cx-Cy)亚烷基-基团：二价并且包含x至y个碳原子(例如，1至6个碳原子)的基于直链或支链饱和烃的脂族基团，即，二价的如上文定义的-(Cx-Cy)烷基。
--(Cx-Cy)烯基：基于直链或支链烃的脂族基团，其包含至少一个不饱和(双键)并且包含x至y个碳原子(x是至少2的整数)，例如2至6个碳原子。举例来说，可以提及但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等；
--(Cx-Cy)烷氧基：-O-烷基，其中烷基是如先前所定义的。例如，-(C1-C6)烷氧基。举例来说，可以提及但不限于：甲氧基；乙氧基；丙氧基；异丙氧基；直链丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基；异丁氧基；戊氧基；己氧基等；
-叠氮基：“-N3”基团；
--(C3-C10)环烷基或-(C3-C7)环烷基：环烷基，该环烷基包含(除非另外提及)3至10个碳原子的(注为“(C3-C10)环烷基”)或3至7个碳原子的(注为“(C3-C7)环烷基”)，是饱和的或部分不饱和的并且未经取代的或经取代的。举例来说，可以提及但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等；
--(C3-C7)杂环烷基或-(C3-C10)杂环烷基：单环烷基，该单环烷基包含(除非另外提及)2至6个碳原子(也注为“-(C3-C7)元杂环烷基”)并且包含1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子(换句话说，一个杂原子替代一个碳原子)；或单环烷基，该单环烷基包含(除非另外提及)2至9个碳原子(也注为“-(C3-C10)元杂环烷基”)并且包含1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子(换句话说，一个杂原子替代一个碳原子)。这种杂环烷基可以是饱和的或部分饱和的并且未经取代的或经取代的。以杂环烷基为例，可以提及但不限于：哌嗪；吗啉代；吡咯烷；四氢吡喃；硫杂环丁烷二氧化物；哌啶；硫杂环戊烷；硫杂环戊烷氧化物；硫杂环戊烷二氧化物；二氢呋喃；四氢呋喃；氮杂环丁烷；氧杂环丁烷；硫杂环丁烷；2H-吡咯；1H-、2H-或3H-吡咯啉；四氢噻吩；噁二唑和例如1,3,4-噁二唑或1,3,5-噁二唑；噻二唑和例如1,3,4-噻二唑；异噁唑啉；2-或3-吡唑啉；吡咯啉；吡唑烷；咪唑啉；咪唑烷；噻唑烷；异噁唑啉；异噁唑烷；二氧戊环；噁噻唑；噁噻二唑；二噁唑基团等。
--(C5-C10)杂芳基意指：环芳族基团，该环芳族基团包含4至9个碳原子并且包含1和4个选自氮、氧和硫的杂原子(也注为“(C5-C10)元杂芳基”)(换句话说，一个杂原子替代一个碳原子)。这种杂芳基可以是未经取代的或经取代的。以5至10元杂芳基为例，可以提及但不限于：吡啶、呋喃、吡咯、噻吩、吡唑、噁唑、异噁唑、三唑、四唑、噁二唑、呋咱、噻唑、异噻唑、噻二唑、咪唑、嘧啶、哒嗪、三嗪基团等；
--(C6-C10)芳基：环芳族基团，该环芳族基团包含6至10个碳原子(注为“(C6-C10)元芳基”)。这种芳基可以是未经取代的或经取代的。以6至10元芳基为例，可以提及但不限于：苯基、萘基等；
-PEG：聚乙二醇，PEGn意指(如本披露的通式中定义的)连接至-CH2-CH2-基团(R5)的-(CH2-CH2-O)n部分，其中n表示1至50(例如，2至30、3至25)的整数。例如，PEG4意指在(CH2-CH2-O)n部分中，n是3，PEG8意指在(CH2-CH2-O)n部分中，n是7，PEG12意指在(CH2-CH2-O)n部分中，n是11，并且PEG24意指在(CH2-CH2-O)n部分中，n是23。
-抗体：对生物靶标具有亲和力的抗体，诸如单克隆抗体。抗体的功能是将生物活性化合物(诸如TLR7/8激动剂化合物)导向生物靶标。抗体可以是单克隆的、多克隆的或多特异性的；它也可以是抗体片段；它也可以是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。“抗体”可以是天然或常规抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键连接至轻链(也称为“全长抗体”)。术语“常规(或全长)抗体”既指包含信号肽(或前肽，如果有的话)的抗体，也指在一条或多条链的分泌和蛋白水解加工后获得的成熟形式。有两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。有以下五种主要的重链类别(或同种型)，其确定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包含两个结构域或区域：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包含四个结构域：一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)两者的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链恒定区结构域(CL)和重链恒定区结构域(CH)赋予重要的生物学特性，诸如抗体链缔合、分泌、经胎盘的流动性、补体结合以及与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基构成。有时，来自非高变区或框架区(FR)的残基会影响整体结构域结构并且从而影响结合位点。CDR是指共同确定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各有三个CDR，分别指定为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，其包含来自各个重链V区和轻链V区的CDR集。
如本文所用，术语“抗体”表示常规(全长)抗体及其片段以及单结构域抗体及其片段(诸如单结构域抗体的可变重链)两者。(常规)抗体的片段典型地包含完整抗体的一部分(诸如完整抗体的抗原结合区或可变区)并且保留常规抗体的生物功能。此类片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、纳米抗体和双抗体。
-生物靶标：抗原(或抗原组)，例如位于与该肿瘤相关的癌细胞或基质细胞的表面；这些抗原可以是例如生长因子受体、癌基因产物或突变的“肿瘤抑制”基因产物、血管生成相关分子或粘附分子；
-缀合物：抗体-药物缀合物或ADC，即多肽，诸如经由接头共价附接至至少一个TLR7/8激动剂分子的抗体；
-DAR(药物与抗体比率)：经由接头附接至抗体的许多TLR7/8激动剂。DAR可以是平均数或取决于所用缀合技术的数
-Fc受体：在某些免疫细胞(诸如B淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞)表面并且有助于免疫系统的保护功能的蛋白质。它可以识别抗体的Fc(可结晶片段)区。
-接头：可以将式(I)的化合物/有效载荷共价附接至抗体以便形成式(II)的化合物/缀合物的原子团或单键；
-有效载荷：接头所共价连接的TLR7/8激动剂化合物。在本披露的情况下意指式(I)的化合物。
-修饰剂：用于修饰抗体的氨基酸侧链以引入反应性基团的化学剂；
-反应性基团：可以促进或经历化学反应的原子团；
-活化的二硫化物：如Greg T.Hermanson的Bioconjugate techniques,SecondEdition[生物共轭技术，第二版]中说明的包含至少一个倾向于发生硫醇-二硫化物交换的二硫化物基团的基团。以活化的二硫化物为例，可以提及但不限于
-活化的C≡C：如Greg T.Hermanson.的Bioconjugate techniques,SecondEdition[生物共轭技术，第二版]中说明的包含至少一个环炔C≡C键的基团。以活化的C≡C为例，可以提及但不限于环辛炔部分，例如DBCO-胺或BCN或MFCO
-环炔：单环或多环，其包含至少一个C≡C键和3至16个碳原子，并且其可以是未经取代的或经取代的。
-杂环炔：包含至少一至六个选自氧、氮和硫的杂原子的如上定义的环炔基团。
-“TLR”：术语“Toll样受体”和“TLR”是指高度保守的哺乳动物蛋白质家族的任何成员，这些高度保守的哺乳动物蛋白质识别病原体相关分子模式并且在先天性免疫中充当关键信号传导元件。TLR多肽共享特征结构，该特征结构包含具有富含亮氨酸的重复序列的细胞外结构域、跨膜结构域和参与TLR信号传导的细胞内结构域；
-“TLR7”：术语“Toll样受体7”和“TLR7”是指与可公开获得的TLR7序列(例如，人TLR7多肽的GenBank登录号AAZ99026或鼠TLR7多肽的GenBank登录号AAK62676)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性的核酸或多肽；
-“TLR8”：术语“Toll样受体8”和“TLR8”是指与可公开获得的TLR8序列(例如，人TLR8多肽的GenBank登录号AAZ95441或鼠TLR8多肽的GenBank登录号AAK62677)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性的核酸或多肽；
-“TLR激动剂”：术语“Toll样受体”是指与TLR(例如，TLR7和/或TLR8)直接或间接结合以诱导TLR信号传导的物质。任何可检测的TLR信号传导差异都可以指示激动剂刺激或激活TLR。信号传导差异可以表现为，例如，靶基因表达的变化、信号转导组分的磷酸化的变化、下游元件(诸如NF-kB)的细胞内定位的变化、某些组分(诸如IRAK)与其他蛋白质或细胞内结构的缔合的变化、或组分诸如激酶(诸如MAPK)的生化活性的变化；
-“免疫反应”：如本文所用，对抗原或成分的“免疫学反应”或“免疫反应”是指受试者对该抗原或成分产生体液免疫反应和/或细胞免疫反应。
免疫反应包括先天性免疫反应和适应性免疫反应。先天性免疫反应是对于免疫系统而言提供第一道防线的快速作用反应。相反，适应性免疫使用具有体细胞重排的受体基因(例如，T细胞受体和B细胞受体)的免疫细胞的选择和克隆扩增，该受体基因识别来自给定病原体或障碍(例如，肿瘤)的抗原，从而提供特异性和免疫记忆。先天性免疫反应(在其许多作用中)导致炎性细胞因子的快速爆发和抗原呈递细胞(APC)(诸如巨噬细胞和树突细胞)的激活。为了区分病原体和自身组分，先天性免疫系统使用检测病原体的特征的各种相对不变的受体(称为病原体相关分子模式或PAMP)。据报道，这种免疫反应增强背后的机制涉及模式识别受体(PRR)，这些模式识别受体在各种免疫细胞(包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、B细胞和一些非免疫细胞(诸如上皮细胞和内皮细胞))上差异表达。PRR的参与导致这些细胞中的一些细胞的激活以及它们细胞因子和趋化因子的分泌，以及激活的细胞而且还有未被PRR激动剂直接激活的其他细胞的成熟和迁移。随之，这创造了导致适应性免疫反应的建立的炎性环境。PRR包括非吞噬受体(诸如Toll样受体(TLR)和结合核苷酸的寡聚化结构域(NOD)蛋白)，以及诱导吞噬作用的受体(诸如清道夫受体、甘露糖受体和β-葡聚糖受体)。树突细胞被认为是用于启动幼稚CD4+辅助性T(TH)细胞的启动和用于诱导CD8+T细胞分化为杀伤细胞的最重要的一些细胞类型。据报道，TLR信号传导在确定这些辅助性T细胞反应的质量方面发挥重要作用，例如，TLR信号的性质确定了所观察到的TH反应的特定类型(例如，TH1反应与TH2反应)。抗体(体液)和细胞免疫的组合作为TH1型反应的一部分产生，而TH2型反应主要是抗体反应；
-“体液免疫反应”是指由抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是指由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(“CTL”)的抗原特异性反应。CTL对肽抗原具有特异性，这些肽抗原是与由主要组织相容性复合体(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质缔合呈递的。CTL有助于诱导并且促进细胞内微生物的破坏或被此类微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面涉及辅助性T细胞的抗原特异性反应。辅助性T细胞的作用是帮助刺激非特异性效应细胞针对在表面上展示出与MHC分子缔合的肽抗原的细胞的功能并且侧重于其活性。“细胞免疫反应”也指由激活的T细胞和/或其他白细胞产生的细胞因子、趋化因子和其他此类分子(包括源自CD4+T细胞和CD8+T细胞的此类分子)的产生；
-与TLR7和/或TLR8相关的“免疫反应”是涉及TLR7和/或TLR8受体的激活的免疫反应。TLR7和/或TLR8受体的激活可以使用方法诸如实例中所述的方法进行体外确定。
-“诱导”：“诱导”及其变体是指任何可测量的细胞活性增加。例如，免疫反应的诱导可以包括，例如，细胞因子的产生增加；免疫细胞群体的激活、增殖或成熟；和/或免疫功能增加的其他指标；
-雷西莫特或“R848”意指下式的4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1H-咪唑并(4,5-c)喹啉-1-乙醇(还称为“R-848”)，CAS号[144875-48-9]：
-3M012或3M-012意指下式的1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺，CAS号[642473-95-8]：
缩写
Ab：抗体；AcOH：乙酸；ADIBO：氮杂二苯并环辛炔；AP-1：激活蛋白-1；Ar：氩气；CH3CN：乙腈；CRS：细胞因子释放综合征；DAR：药物与抗体比率；DBCO：二苄基环辛炔；DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DIEA：N,N-二异丙基乙胺；DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺；DMA：二甲基乙酰胺；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DPBS：杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco'sphosphate-buffered saline)；DSC：N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯；EC50：有效浓度50；EDTA：乙二胺四乙酸；ES：电喷雾；Et2O：乙醚；EtOAc：乙酸乙酯；H2O：水；HCl：盐酸；HEK：人胚肾；HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；HIC：疏水相互作用色谱法；HPLC：高压液相色谱法；HRMS：高分辨率质谱法；IEC：离子交换色谱法；IFN：干扰素；ISG：干扰素刺激基因；KD：解离常数；K2HPO4：磷酸氢二钾；MeOH：甲醇；MTBE：甲基叔丁基醚；LAR：接头与抗体比率；LCMS：液相色谱质谱法；mAb或MAb：单克隆抗体；MFI：中值荧光强度；MgSO4：硫酸镁；NF-kB：核因子活化B细胞κ轻链增强子；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；Na2S2O3：硫代硫酸钠；NMR：核磁共振；NT：未测试；OD：光密度；PBMC：外周血单个核细胞；PBS：磷酸盐缓冲盐水；Pd/C：钯碳；PEG：聚乙二醇；PEGn：包含数字n(整数)个乙二醇单元的聚乙二醇；PES：聚醚砜；PODS：苯基噁二唑基甲基砜；PS：聚山梨醇酯；R848：雷西莫特(CAS号[144875-48-9])；PVDF：聚偏二氟乙烯；RP：反相；RT：室温；sat.：饱和的；SEAP：分泌型胚胎碱性磷酸酶；SEC：尺寸排阻色谱法；T：温度；TEA：三乙胺；THF：四氢呋喃；3M012或3M-012：(CAS号[642473-95-8])；TLR：Toll样受体；UPLC：超高效液相色谱法；～：约。
具体实施方式
本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团；并且
R6表示-L1-RCG1基团或-RCG1基团；
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被-NH2基团取代，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
RCG1表示：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，诸如-O-，并且
Ra表示氢原子，-(C1-C6)烷基，-(C3-C7)环烷基，-(C2-C6)烯基，-(C6-C10)芳基，包含4至9个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的-(C5-C10)杂芳基，或包含2至6个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C7)杂环烷基，所述-(C6-C10)芳基、-(C5-C10)杂芳基和/或-(C3-C7)杂环烷基任选地被1至5个选自以下的原子/基团取代：诸如氟原子的卤素原子、-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)烷氧基、羟基、氧代基、硝基和氰基；或
(ii)以下反应性基团中的一个：马来酰亚胺基基团；经取代的马来酰亚胺基，诸如卤代乙酰胺基基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基，诸如甲基；Cl-；N3-；HO-；HS-；活化的二硫化物，诸如H2N-；HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分，例如DBCO-胺或BCN或MFCO苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如基团；基团；O-烷基羟胺或Pictet-Spengler反应底物，诸如例如RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基 苯基噁二唑基甲基砜基团基团；I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基；或基团。
如上所提及的，可以提及的RCG1的实例包括：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，诸如-O-，并且
Ra表示氢原子，-(C1-C6)烷基，-(C3-C7)环烷基，-(C2-C6)烯基，-(C6-C10)芳基，包含4至9个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的-(C5-C10)杂芳基，或包含2至6个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C7)杂环烷基，所述-(C6-C10)芳基、-(C5-C10)杂芳基和/或-(C3-C7)杂环烷基任选地被1至5个选自以下的原子/基团取代：诸如氟原子的卤素原子、-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)烷氧基、羟基、氧代基、硝基和氰基；或
(ii)以下反应性基团中的一个：马来酰亚胺基基团；经取代的马来酰亚胺基，诸如卤代乙酰胺基基团，其中R21表示氢原子或--(C1-C6)烷基，诸如甲基；Cl-；N3-；HO-；HS-；活化的二硫化物，诸如H2N-；HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分，例如DBCO-胺或BCN或MFCO苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如基团；基团；-O-烷基羟胺或Pictet-Spengler反应底物，诸如Agarwal P.等人，Bioconjugate Chem[生物共轭化学]2013,24,846-851中所述的例如RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基 苯基噁二唑基甲基砜基团基团；I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基；或基团。
例如，RaZa-可以表示HO-、CH3O-、CH2＝CH-CH2O-、(O-NHS)、其中阳离子表示例如钠、钾或铯或 基团，其中GI表示至少一个电感基团，诸如-NO2或卤素原子(诸如氟原子(F))。例如，它们可以是以下基团：
另一种类型的RaZa-C(＝O)-基团是以下：
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由n是3至25的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由n是3、7、11或23的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R1表示-CH2-O-C2H5基团(也称为-CH2-O-Et基团)的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R2表示支链-(C1-C6)亚烷基-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R2表示-CH2-C(CH3)2-基团的化合物(例如，CH2基团连接至咪唑并[4,5-c]喹啉环的氮原子并且C(CH3)2基团连接至R3)构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R3表示-O-或-NH-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R3表示-O-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R3表示-NH-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R4表示氢原子的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R5表示直链-(C1-C6)亚烷基-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R5表示-(CH2)2-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示RCG1基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示RCG1基团的化合物构成，RCG1是-N3基团或I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示RCG1基团的化合物构成，RCG1是-N3基团或I-CH2-C(＝O)-NH-基团。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示-L1-RCG1基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示-L1-RCG1基团的化合物构成，
RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基苯基噁二唑基甲基砜基团基团；或基团，并且
L1是：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如-(CH2)2-哌啶基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被NH2基团取代，例如-CH2-CH(CH2-NH2)-C(＝O)-NH-基团、-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团或-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，一组化合物由R6表示-L1-RCG1基团的化合物构成，
RCG1是马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基苯基噁二唑基甲基砜基团基团，并且
L1是：
--NH-；
--(CH2)2-C(＝O)-NH-基团，例如-(CH2)2-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；或
--NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5。
所有这些单独或组合采用的子组都是本披露的一部分。
根据特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)烷基；并且
R6表示RCG1基团，RCG1是-N3基团或I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基。
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R6表示RCG1基团，RCG1是-N3基团或I-CH2-C(＝O)-NH-基团。
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-NH-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团；并且
R6表示RCG1基团，RCG1是-N3基团。
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-NH-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R6表示RCG1基团，RCG1是-N3基团。
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)烷基；并且
R6表示L1-RCG1基团，RCG1是马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基苯基噁二唑基甲基砜基团基团，并且
L1是：
--NH-；
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；或
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5。
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R6表示L1-RCG1基团，RCG1是马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基苯基噁二唑基甲基砜基团或基团，并且
L1是：
--NH-；
--(CH2)2-C(＝O)-NH-基团，例如-(CH2)2-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；或
--NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5。
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，可以提及例如以下化合物
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，可以提及例如以下化合物
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，可以提及例如以下化合物
在作为本披露的主题的式(I)的化合物中，可以提及例如以下化合物：
(1)1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例1)；
(2)1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例7)；
(3)1-(38-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36--十二氧杂三十八烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例13)；
(4)1-(74-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例19)；
(5)1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例25)；
(6)1-(38-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十一氧杂-3-氮杂三十八烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例27)；
(7)1-(26-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12,15,18,21,24-七氧杂-3-氮杂二十六烷基)-2-(乙氧基-甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例29)；
(8)N-(74-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺甲酸盐(实例31)；
(9)N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-3-(3-甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙酰胺(实例44)；
(10)N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-3-(3,4-二甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙烯酰胺(实例45)；
(11)N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-N'-[4-(5-甲基磺酰基-1,3,4-噁二唑-2-基)苯基]戊二酰胺(实例48)；
(12)N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-2-碘-乙酰胺(实例50)；
(13)(E)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-4-氧代-4-苯基-丁-2-烯酰胺(实例52)；或
其药学上可接受的。
在前面列出的式(I)的化合物中，可以例如引用以下感兴趣的化合物：
(4)1-(74-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(实例19)；
(8)N-(74-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺甲酸盐(实例31)；
或其药学上可接受的盐。
根据本披露的式(I)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐可以根据技术人员已知的任何方法制备，并且例如通过以下方法制备。
式(I)的化合物/有效载荷的合成：
·接头的合成
环PEGn硫酸酯的合成
方案1
步骤(i)：在碱(诸如例如DMAP与TEA的组合)的存在下通过用亚硫酰氯处理进行乙二醇大环化；
步骤(ii)：在催化量的氯化钌(III)三水合物的存在下通过用氧化试剂(诸如例如高碘酸钠)处理将亚硫酸酯氧化为硫酸酯。
方案1描绘了以PEG4-OH(CAS号[112-60-7])或PEG8-OH(CAS号[5117-19-1])开始的合成，但也可以适用于可商购的n范围为1至12的其他PEGn-OH。
叠氮基PEGn醛的合成
方案2
步骤(i)：在碱(诸如例如TEA或戴斯-马丁高价碘化物(Dess-Marinperiodinane))的存在下，在碱(诸如例如碳酸氢钠)的存在下，使用草酰氯将醇氧化成醛。
方案2描绘了以叠氮基-PEG4-OH(CAS号[86770-67-4])、叠氮基-PEG8-OH(CAS号[352439-36-2])或叠氮基-PEG12-OH(CAS号[1821464-55-4])开始的合成，但也可以适用于可商购的n范围为1至24的其他PEGn-OH。
马来酰亚胺基接头的合成
方案3
步骤(i)：将马来酸酐在酸性介质(诸如例如乙酸)中转化为马来酰亚胺衍生物；
步骤(ii)：在碱(诸如例如DIEA)的存在下通过用DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
·式(I)的化合物/有效载荷的合成：
式(I)的R848化合物/有效载荷的合成
方案4
步骤(i)：使用三苯甲基氯和碱(诸如例如TEA)用三苯甲基保护R848伯胺；
步骤(ii)：R848醇的两步O-烷基化包括使用氢化钠生成醇盐并且使其与环PEGn硫酸酯反应；
步骤(iii)：在碱性条件(诸如例如吡啶溶液(例如，在二噁烷中的溶液))下进行O-脱硫酸化；
步骤(iv)：使用甲苯磺酰氯和碱(诸如例如DMAP和TEA的组合)将醇激活为甲苯磺酸酯；
步骤(v)：通过用叠氮化钠处理用叠氮基取代甲苯磺酸酯基团；
步骤(vi)：使用盐酸溶液(例如，在二噁烷中的溶液)对三苯甲基进行去保护；
步骤(vii)：使用例如甲酸铵和催化剂(诸如例如钯碳)还原叠氮基；
步骤(viii)：与活化的酯(诸如NHS)和碱(诸如例如DIEA)进行肽偶联。
方案4描绘了以环PEG4硫酸酯或环PEG8硫酸酯开始的合成，但也可以适用于可以根据方案1制备的n范围为1至12的其他环硫酸酯。从环PEG8硫酸酯开始用环PEG4硫酸酯重复步骤(iii)允许制备叠氮基-PEG12-R848；从环PEG8硫酸酯开始用环PEG8硫酸酯重复两次步骤(iii)允许制备叠氮基-PEG24-R848。
式(I)的3M012化合物/有效载荷的合成：
方案5
步骤(i)：在还原试剂(诸如例如三乙酰氧基硼氢化钠)的存在下用叠氮基-PEGn-醛进行3M012的还原胺化。
方案5描绘了以叠氮基-PEG4-醛、叠氮基-PEG8-醛或叠氮基-PEG12-醛开始的合成，但也可以适用于可根据方案2制备的n范围为1-24的其他叠氮基-PEGn-醛。
如本披露中定义的具体的式(I)的化合物/有效载荷在表1中指示(编号和式)并且在下文中进一步详述。在表2中，还指示了1H NMR和液相色谱/质谱法。
表2的1H NMR是如实验部分中定义的1H NMR谱(400MHz,δ以ppm计，DMSO-d6)。
根据实验部分中所述的七种方法之一获得表2的液相色谱/质谱(LC/MS)。
表1
表2
本披露还涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25，例如3、7、11或23；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基，例如-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基，诸如-CH2-O-C2H5基团；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团，例如-O-或-NH-；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基，例如氢原子；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-L1-G-Ab基团或-G-Ab基团，
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至G并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如L1是-(CH2)2-哌啶基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如L1是-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至G并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被NH2基团取代，例如-CH2-CH(CH2-NH2)-C(＝O)-NH-基团、-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团或-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
-Ab表示抗体，例如单克隆抗体；并且
-G表示如本披露中定义的RCG1与存在于该抗体上的反应性基团RCG2之间的反应的产物，例如G选自由以下组成的组：
例如当R7是-L1-G-Ab时，G基团的左侧连接至Ab并且G基团的右侧连接至L1，或当R7是-G-Ab时直接连接至R5，
例如，G表示以下基团：
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由n是3至25的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由n是3、7、11或23的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R1表示-CH2-O-C2H5基团(也称为-CH2-O-Et基团)的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R2表示支链-(C1-C6)亚烷基-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R2表示-CH2-C(CH3)2-基团的化合物(例如，CH2基团连接至咪唑并[4,5-c]喹啉环的氮原子并且C(CH3)2基团连接至R3)构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R3表示-O-或-NH-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R3表示-O-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R3表示-NH-的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R4表示氢原子的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R5表示直链-(C1-C6)亚烷基-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R5表示-(CH2)2-基团的化合物构成。
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R7表示-G-Ab基团的化合物构成，
-Ab表示抗体，诸如单克隆抗体，例如特赛妥单抗(Tusamitamab)(CAS[2349294-95-5])或特赛妥单抗的变体、hu2H11_R35R74、曲妥珠单抗、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)或西妥昔单抗，并且
-G表示式的基团；或特别地G是
在作为本披露的主题的式(II)的化合物中，一组化合物由R7表示-L1-G-Ab基团的化合物构成，
-Ab表示抗体，诸如单克隆抗体，例如特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])或特赛妥单抗的变体、hu2H11_R35R74、曲妥珠单抗、依诺妥珠单抗或西妥昔单抗；
-G表示式的基团；或特别地G是并且
-L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至G并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如-(CH2)2-哌啶基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如L1是-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至G并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被NH2基团取代，例如-CH2-CH(CH2-NH2)-C(＝O)-NH-基团、-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团或-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5。
所有这些单独或组合采用的子组都是本披露的一部分。
根据特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)烷基；并且
R7表示-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)烷基；并且
R7表示-L1-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-L1-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1表示-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基；
R3表示-NH-；
R4表示氢原子；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团；并且
R7表示-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
根据另一个特定的实施例，本披露涉及式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，其中
R1表示-CH2-O-Et基团；
R2表示-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-NH-；
R4表示氢原子；
R5表示-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-G-Ab基团，Ab是抗体(诸如单克隆抗体)并且G是
在作为本披露的主题的式(II)的化合物/缀合物中，可以提及例如以下化合物：
其中Ab表示抗体，例如单克隆抗体。
特赛妥单抗变体根据以下列表中的EU编号命名。
特别地，在作为本披露的主题的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐中，可以提及例如以下化合物：
(c1)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-R848ADC(实例2)；
(c2)EphA2_hu2H11_R35R74-PEG4-R848ADC(实例3)；
(c3)HER2_曲妥珠单抗-PEG4-R848ADC(实例4)；
(c4)EGFR_西妥昔单抗-PEG4-R848ADC(实例5)；
(c5)B7H3_依诺妥珠单抗-PEG4-R848ADC(实例6)；
(c6)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-R848ADC(实例8)；
(c7)EphA2_hu2H11_R35R74-PEG8-R848ADC(实例9)；
(c8)HER2_曲妥珠单抗-PEG8-R848ADC(实例10)；
(c9)EGFR_西妥昔单抗-PEG8-R848ADC(实例11)；
(c10)B7H3_依诺妥珠单抗-PEG8-R848ADC(实例12)；
(c11)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-R848ADC(实例14)；
(c12)EphA2_hu2H11_R35R74-PEG12-R848ADC(实例15)；
(c13)HER2_曲妥珠单抗-PEG12-R848ADC(实例16)；
(c14)EGFR_西妥昔单抗-PEG12-R848ADC(实例17)；
(c15)B7H3_依诺妥珠单抗-PEG12-R848ADC(实例18)；
(c16)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20a)；
(c17)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20b)；
(c18)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20c)；
(c19)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20d)；
(c20)EphA2_hu2H11_R35R74-PEG24-R848ADC(实例21)；
(c21)HER2_曲妥珠单抗-PEG24-R848ADC(实例22)；
(c22)EGFR_西妥昔单抗-PEG24-R848ADC(实例23)；
(c23)B7H3_依诺妥珠单抗-PEG24-R848ADC(实例24)；
(c24)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-3M-012ADC(实例26)；
(c25)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-3M012ADC(实例28)；
(c26)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-3M-012ADC(实例30)；
(c27)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C-PEG24-R848ADC(实例32)；
(c28)CEACAM5_特赛妥单抗_S239C-PEG24-R848ADC(实例33)；
(c29)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-PEG24-R848ADC(实例34)；
(c30)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-PEG24-R848ADC(实例35)；
(c31)CEACAM5_特赛妥单抗_K326C-PEG24-R848ADC(实例36)；
(c32)CEACAM5_特赛妥单抗_K320C-PEG24-R848ADC(实例37)；
(c33)CEACAM5_特赛妥单抗_K340C-PEG24-R848ADC(实例38)；
(c34)CEACAM5_特赛妥单抗_S375C-PEG24-R848ADC(实例39)；
(c35)CEACAM5_特赛妥单抗_N361C-PEG24-R848ADC(实例40)；
(c36)CEACAM5_特赛妥单抗_K414C-PEG24-R848ADC(实例41)；
(c37)CEACAM5_特赛妥单抗_V422C-PEG24-R848ADC(实例42)；
(c38)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C-PEG24-R848ADC(实例43)；
(c39)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-实例44(实例46)；
(c40)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例44(实例47)；
(c41)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例48(实例49)；
(c42)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例50(实例51)；或
(c43)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例52(实例53)。
根据特定实施例，根据本披露的式(II)的化合物/有效载荷或其药学上可接受的盐具有式：
在前面列出的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐中，例如可以引用以下感兴趣的化合物：
(c16)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20a)；
(c17)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20b)；
(c18)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20c)；
(c19)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20d)；
(c20)EphA2_hu2H11_R35R74-PEG24-R848ADC(实例21)；
(c21)HER2_曲妥珠单抗-PEG24-R848ADC(实例22)；
(c22)EGFR_西妥昔单抗-PEG24-R848ADC(实例23)；
(c23)B7H3_依诺妥珠单抗-PEG24-R848ADC(实例24)；
(c27)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C-PEG24-R848ADC(实例32)；
(c28)CEACAM5_特赛妥单抗_S239C-PEG24-R848ADC(实例33)；
(c29)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-PEG24-R848ADC(实例34)；
(c30)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-PEG24-R848ADC(实例35)；
(c31)CEACAM5_特赛妥单抗_K326C-PEG24-R848ADC(实例36)；
(c32)CEACAM5_特赛妥单抗_K320C-PEG24-R848ADC(实例37)；
(c33)CEACAM5_特赛妥单抗_K340C-PEG24-R848ADC(实例38)；
(c34)CEACAM5_特赛妥单抗_S375C-PEG24-R848ADC(实例39)；
(c35)CEACAM5_特赛妥单抗_N361C-PEG24-R848ADC(实例40)；
(c36)CEACAM5_特赛妥单抗_K414C-PEG24-R848ADC(实例41)；
(c37)CEACAM5_特赛妥单抗_V422C-PEG24-R848ADC(实例42)；
(c38)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C-PEG24-R848ADC(实例43)；
(c39)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-实例44(实例46)；
(c40)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例44(实例47)；
(c41)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例48(实例49)；
(c42)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例50(实例51)；或
(c43)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例52(实例53)。
在前面列出的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐中，例如可以引用以下特别感兴趣的化合物：
(c1)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-R848ADC(实例2)；
(c6)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-R848ADC(实例8)；
(c11)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-R848ADC(实例14)；
(c16)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20a)；
(c17)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20b)；
(c18)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20c)；
(c19)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20d)；
(c24)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-3M-012ADC(实例26)；
(c25)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-3M012ADC(实例28)；
(c26)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-3M-012ADC(实例30)；
(c27)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C-PEG24-R848ADC(实例32)；
(c28)CEACAM5_特赛妥单抗_S239C-PEG24-R848ADC(实例33)；
(c29)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-PEG24-R848ADC(实例34)；
(c30)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-PEG24-R848ADC(实例35)；
(c31)CEACAM5_特赛妥单抗_K326C-PEG24-R848ADC(实例36)；
(c32)CEACAM5_特赛妥单抗_K320C-PEG24-R848ADC(实例37)；
(c33)CEACAM5_特赛妥单抗_K340C-PEG24-R848ADC(实例38)；
(c34)CEACAM5_特赛妥单抗_S375C-PEG24-R848ADC(实例39)；
(c35)CEACAM5_特赛妥单抗_N361C-PEG24-R848ADC(实例40)；
(c36)CEACAM5_特赛妥单抗_K414C-PEG24-R848ADC(实例41)；
(c37)CEACAM5_特赛妥单抗_V422C-PEG24-R848ADC(实例42)；
(c38)CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C-PEG24-R848ADC(实例43)；
(c39)CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-实例44(实例46)；
(c40)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例44(实例47)；
(c41)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例48(实例49)；
(c42)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例50(实例51)；或
(c43)CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例52(实例53)。
在前面列出的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐中，例如可以引用以下更特别感兴趣的化合物：
(c16)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20a)；
(c17)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20b)；
(c18)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20c)；或
(c19)CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC(实例20d)。
根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐可以根据技术人员已知的任何方法制备，并且例如通过以下方法制备。方法也在本披露的实验部分中详述。
式(II)的化合物/缀合物可以通过以下方式制备：
(i)使以下接触并且反应：
-任选地借助修饰剂修饰的包含反应性RCG2基团的抗体Ab的任选缓冲的水溶液，
和
-如本披露中定义的式(I)的化合物/有效载荷的溶液，该化合物/有效载荷包含反应性RCG1基团；
式(I)的化合物/有效载荷的RCG1基团对抗体的RCG2基团有反应性以通过共价键形成G基团并且形成式(II)的化合物/缀合物；
(ii)并且然后任选地将步骤(i)中形成的式(II)的化合物与未反应的式(I)的化合物和/或与未反应的该抗体和/或与可能已形成的任何聚集体分离。
可以提及的RCG2(存在于抗体上)的实例包括(Garnett M.C.等人，Advanced DrugDelivery Reviews[先进药物递送综述]2001,53,171-216)：
(i)由存在于该抗体的表面的赖氨酸残基的侧链携带的ε-氨基(ε-NH2基团)；
(ii)该抗体的重链或轻链的N末端氨基酸的α-氨基(α-NH2基团)；
(iii)铰链区的糖基团；
(iv)通过还原该抗体的链内二硫键产生的半胱氨酸残基的巯基(-SH)，或该抗体的工程化半胱氨酸残基的-SH；
(v)由存在于该抗体的表面的谷氨酰胺残基的侧链携带的酰胺基团(-C(O)NH2基团)；
(vi)使用甲酰甘氨酸生成酶引入的醛基团(-C(O)H基团)；以及
(vii)任选地借助修饰剂引入的RCG2基团。
最近，已考虑了其他位点特异性缀合方法，例如通过突变引入半胱氨酸(JunutulaJ.R.等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]2008,26,925-932)、引入非天然氨基酸允许其他类型的化学(Axup J.Y.等人，PNAS2012,109,40,16101-16106)、或在抗体聚糖上缀合(Zhou Q.等人，Bioconjugate Chem.[生物共轭化学]2014,25,510-520)。已描述了使用桥接二溴马来酰亚胺的半胱氨酸(Behrens C.R.等人，Mol.Pharmaceutics[分子药剂学]2015,3986-3998)和双砜试剂(Bryant P.等人，Mol.Pharmaceutics[分子药剂学]2015,1872-1879)以交联抗体并且可适用于本披露。
另一种用于位点特异性修饰抗体的方法基于酶缀合，其例如使用细菌转谷氨酰胺酶(Jeger S.等人，Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]2010,49,9995-9997；StropP.等人，Chem.Biol.[化学与生物学]2013,20,161-167)或甲酰甘氨酸生成酶(Hudak J.E.等人，Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]2012,51,4161-4165)。对于位点特异性缀合策略的综述，参见Agarwal P.和Bertozzi C.R.,Bioconjugate Chem[生物共轭化学]2015,26,176-192。这些缀合技术也可以适用于本披露中所述的式(I)的化合物/有效载荷。
也可以化学修饰抗体以引入新型RCG2反应性基团。因此，本领域技术人员熟知如何借助于引入例如活化的二硫化物、硫醇、马来酰亚胺基、卤代乙酰胺基、叠氮基、炔或环炔基团的修饰剂修饰抗体(尤其参见WO 2005/077090第14页和WO 2011/001052)。修饰使得可以改进缀合反应并且使用存在于式(I)的化合物/有效载荷上的更广泛种类的RCG1基团。
例如，在RCG1是上面定义的类型(ii)的情况下，也就是说以下反应性基团之一：马来酰亚胺基基团；经取代的马来酰亚胺基，诸如卤代乙酰胺基基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基，诸如甲基；Cl-；N3-；HO-；HS-；活化的二硫化物，诸如H2N-；HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分，例如DBCO-胺或BCN或MFCO苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如 基团；基团；O-烷基羟胺或Pictet-Spengler反应底物，诸如例如RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基苯基噁二唑基甲基砜基团基团；I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基；或基团，
可以使用适当的修饰剂化学修饰抗体或者引入一种或多种非天然氨基酸以引入适当的RCG2基团。例如：
-当RCG1表示N-羟基琥珀酰亚胺酯时，RCG2表示-NH2基团；
-当RCG1表示马来酰亚胺基官能团、卤代乙酰胺基官能团、氯原子或活化的二硫化物时，RCG2可以表示-SH基团；
-当RCG1表示-N3基团时，RCG2可以是-C＝CH官能团或活化的C＝C官能团，诸如环辛炔部分；
-当RCG1表示-OH基团或-NH2基团时，RCG2可以是羧酸或酰胺官能团；
-当RCG1表示-SH基团时，RCG2可以是马来酰亚胺基官能团、卤代乙酰胺基官能团或活化的二硫化物官能团；
-当RCG1表示-C＝CH官能团或活化的-C＝C官能团时，RCG2可以是-N3基团；
-当RCG1表示O-烷基羟胺官能团或Pictet-Spengler反应底物时，RCG2可以是醛或酮官能团。
如上所指示的，可以提及的G的实例包括：
例如当R7是-L1-G-Ab时，G基团的左侧连接至Ab并且G基团的右侧连接至L1，或当R7是-G-Ab时直接连接至R5。
例如，G表示以下基团：
·修饰剂的合成
方案6
步骤(i)：二苯并环辛炔-胺与戊二酸酐偶联；
步骤(ii)：通过以下方式将羧酸活化为活性酯：
·在碱(诸如例如DIEA)的存在下用DSC处理；或
·在偶联试剂(诸如例如DCC)的存在下用N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐处理；或
·在偶联试剂(诸如例如DIC)的存在下用4-羟苯基二甲基锍硫酸甲酯盐处理；或
·在偶联试剂(诸如例如DIC)的存在下用2,3,5,6-四氟-4-羟基苯磺酸钠盐处理。
方案6描绘了以二苯并环辛炔-胺(CAS号[1255942-06-3])开始的合成，但也可以适用于可商购的其他环辛炔-胺。它描绘了使用戊二酸酐的合成，但也可以适用于可商购的n范围为3至10的琥珀酸酐或烷基二酸。
式(II)的化合物/缀合物的制备：
本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐可以经由包括至少以下步骤的方法获得：
(i)使以下接触并且反应：
-任选地借助修饰剂修饰的包含反应性RCG2基团的抗体Ab的任选缓冲的水溶液，
和
-如本披露中定义的式(I)的化合物/有效载荷的溶液，该化合物/有效载荷包含反应性RCG1基团，
式(I)的化合物/有效载荷的RCG1基团对抗体的RCG2基团有反应性以通过共价键形成G基团并且形成式(II)的化合物/缀合物。
根据例如步骤(ii)中的一个变体，将来自步骤(i)的式(II)的化合物/缀合物与未反应的式(I)的化合物/有效载荷、与所形成的任何聚集体和/或任何未反应的抗体分离。
接触的功能是使RCG1基团和RCG2基团反应以确保式(I)的化合物/有效载荷通过形成共价键与抗体附接，诸如，
·当RCG1表示氯原子或马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基时，抗体可以包含巯基；
·当RCG1表示叠氮基时，抗体可以包含-C＝CH部分或活化的C≡C(诸如环辛炔基)；
·当RCG1表示-NH2基团时，可以使用酶催化在抗体的酰胺官能团(诸如由抗体的谷氨酰胺(Gln)残基的侧链携带的酰胺基团)上进行反应。
·当RCG1表示HC≡C-或活化的C≡C基团(诸如环辛炔部分)时，抗体可以包含叠氮基。
术语“聚集体”意指两个或更多个抗体之间可形成的缔合，这些抗体可能通过缀合进行了修饰。聚集体易于在多种参数(诸如溶液中抗体的高浓度、溶液的pH、高剪切力、移植药物的数量及其疏水性质、温度)的影响下形成(参见J.Membrane Sci.[膜科学杂志]2008,318,311-316的引言中引用的参考文献)，然而，其中一些的影响还未得到清晰地阐明。在蛋白质或抗体的情况下，可以参考AAPS Journal,“Protein Aggregation andBioprocessing[蛋白质聚集和生物加工]”2006,8(3),E572-E579。聚集体含量可以经由已知技术(诸如SEC)确定(在这方面参见Analytical Biochemistry[分析生物化学]1993,212(2),469-480)。
抗体的水溶液可以用缓冲液(例如，磷酸钾或HEPES或缓冲液(诸如稍后所述的缓冲液A、B、C和D)的混合物)缓冲。缓冲液取决于抗体的性质。将式(I)的化合物/有效载荷溶解在极性有机溶剂(诸如DMSO或DMA)中。
反应通常在20℃至40℃范围内的温度下发生。反应时间可以在1至24小时范围内。抗体与式(I)的化合物/有效载荷之间的反应可以用折射法和/或紫外检测器和/或HRMS通过SEC监测以便确定其进展程度。如果取代度不足，反应可以留得更久和/或可以添加式(I)的化合物/有效载荷。对于特定条件的进一步细节，可以参考实例部分。特定实施例描述在实例2至6、8至12、14至18、20至24、26、28和30、32至43、44、46、47、49、51和53中。
本领域技术人员具有可供其使用的用于步骤(ii)的分离的各种色谱技术：式(II)的化合物/缀合物可以例如通过以下纯化：空间排阻色谱法(SEC)、吸附色谱法(例如，离子交换、IEC)、疏水相互作用色谱法(HIC)、亲和色谱法、在混合支持物(诸如陶瓷羟基磷灰石)上的色谱法、或HPLC。也可以使用通过透析或渗滤的纯化。
在步骤(i)或(ii)后，式(II)的化合物/缀合物的溶液可以经历超滤和/或渗滤步骤(iii)。在这些步骤后，因此获得在水溶液中的式(II)的化合物/缀合物。
本披露还涉及可以经由根据本披露的一种或多种方法获得的式(II)的化合物。
抗体
抗体可以是选自由鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组的单克隆抗体。
在一个实施例中，抗体是单特异性抗体，即与一个单一靶标特异性结合的抗体。可替代地，它可以是多特异性抗体。
在一个实施例中，抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
根据本披露的抗体与靶标特异性结合，从而将式(II)的化合物/缀合物导向所述靶标。如本文所用，“特异性结合”或“与……特异性结合”或“与……结合”等意指抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合可以通过至少约1x10-8M或更小(例如，KD越小表示结合越紧密)的平衡解离常数(KD)来表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所述，已例如使用表面等离子体共振(例如，BIACORETM)通过抗体与靶标和/或靶抗原的特异性结合表征了抗体。
靶标典型地对应于在细胞表面表达的蛋白质，例如在肿瘤细胞表面表达的蛋白质。
在一个实施例中，靶标是CEACAM5受体。CEACAM5受体是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)受体家族的成员并且也被称为“CEA细胞粘附分子5”或“CD66e”。与CEACAM5受体特异性结合的抗体可以例如对应于WO 2014/079886(US 9617345B2)中所述的抗体之一，
在一个实施例中，靶标是EphA2受体。EphA2受体是肝配蛋白受体并且也被称为“Eph受体A2”或“上皮细胞受体蛋白-酪氨酸激酶”。与EphA2受体特异性结合的抗体可以例如对应于WO 2008/010101(USRE47123E)或WO 2011/039724(US 8,668,910)中所述的抗体之一。
在一个实施例中，靶标是ERBB2/HER-2受体。HER-2受体是人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员并且也称为erb-b2受体酪氨酸激酶2或NEU、NGL、TKR1、HER-2/neu或CD340(分化群340)。与HER2受体特异性结合的抗体可以例如对应于也称为(CAS[180288-69-1])的曲妥珠单抗。对于曲妥珠单抗的氨基酸序列，它可以被称为下文中披露的SEQ ID NO.5(轻链)和SEQ ID NO.6(重链)。
在一个实施例中，靶标是EGFR受体。EGFR受体是人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员并且被称为表皮生长因子受体，或ERBB、ERRP、HER1、ERBB1、PIG61或NISBD2。与EGFR受体特异性结合的抗体可以例如对应于也被称为(CAS[205923-56-4])的西妥昔单抗。对于西妥昔单抗的氨基酸序列，它也可以被称为下文中披露的SEQID NO.7(轻链)和SEQ ID NO.8(重链)。
在一个实施例中，靶标是B7H3免疫检查点。B7H3免疫检查点是B7-CD28家族的成员并且也被称为CD276(分化群276)、B7-H3、4Ig-B7-H3。与B7H3免疫检查点特异性结合的抗体可以例如对应于依诺妥珠单抗(CAS[1353485-38-7])。对于依诺妥珠单抗的氨基酸序列，它也可以被称为下文中披露的SEQ ID NO.9(轻链)和SEQ ID NO.10(重链)。
抗体可以任选地用修饰剂修饰以促进如前所述的式(I)的化合物/有效载荷的附接。抗体尤其可以是单克隆的、多克隆的或多特异性的。它也可以是抗体片段。它也可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。除曲妥珠单抗、西妥昔单抗和依诺妥珠单抗之外，本披露的实例中所用的抗体是：
·特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，针对CEACAM5受体的抗体。遵循WO 2014/079886(US 9617345B2)中所述的程序，特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])的序列由SEQ IDNO:88(抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])的轻链)以及由SEQ ID NO:87(抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])的重链)表示。对于特赛妥单抗的氨基酸序列，它也可以被称为下文中披露的SEQ ID NO.1(轻链)和SEQ ID NO.2(重链)，
·hu2H11_R35R74，针对EphA2受体的拮抗剂抗体。遵循WO 2011039724 A1(US 8,668,910)中所述的程序，hu2H11_R35R74的序列由SEQ ID NO:16(抗体hu2H11_R35R74的轻链)和SEQ ID NO:18(抗体hu2H11_R35R74的重链)表示。对于hu2H11_R35R74的氨基酸序列，它也可以被称为下文中披露的SEQ ID NO.3(轻链)和SEQ ID NO.4(重链)，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_E152C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_E150C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Glu被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_S239C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_S252C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Ser被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K274C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K287C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K290C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K307C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K326C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K345C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K320C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K320C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K340C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K340C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_S375C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K398C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Ser被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_N361C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_N361C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Asn被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_K414C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_K445C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Lys被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_V422C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_V453C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Val被在指示位置的Cys替代，
·根据EU编号的CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C，根据Kabat编号也称为CEACAM5_特赛妥单抗_E150C_S398C，针对CEACAM5受体的抗体。它对应于抗体特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])，其中Glu和Ser两者都被在指示位置的Cys替代。
上文的特赛妥单抗变体包含用于位点特异性缀合的Fc突变，其中突变的氨基酸根据来自Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA[美国国家科学院院刊],63,78-85(1969).PMID:5257969的EU编号和/或来自Kabat,E.A.等人，Sequences of proteins ofimmunological interest.5th Edition-US Department of Health and Human Services[免疫学上感兴趣的蛋白质序列第5版-美国卫生与人类服务部],NIH公开号91-3242，第662,680,689页(1991)的Kabat编号来鉴定。
式(II)的化合物/缀合物(缀合物)：
式(II)的化合物/缀合物通常包含约1至10个共价附接至抗体的式(I)的化合物/有效载荷(这是移植度或“药物与抗体比率”或“DAR”)。此数字随着抗体的性质和式(I)的化合物/有效载荷以及还有缀合方法中所用的操作条件(例如，式(I)的化合物/有效载荷相对于抗体的当量数、反应时间、溶剂和任何助溶剂的性质)的不同而变化。使抗体和式(I)的化合物/有效载荷接触导致包含以下的混合物：通过不同的DAR彼此单独区分的几种式(II)的化合物/缀合物；任选地，未反应的抗体；任选地聚集体。因此，在最终溶液上确定的DAR对应于平均DAR。DAR可以由式(II)的化合物/缀合物的SEC-HRMS光谱的解卷积来计算。DAR(HRMS)是例如大于0.5，例如在1至10的范围内，诸如在2至7的范围内。
式(II)的化合物/缀合物可以用作抗癌剂。由于抗体的存在，使得式(II)的化合物/缀合物对肿瘤细胞而不是健康细胞具有高度选择性。这使得可以将式(II)的化合物/缀合物引导在与其类似的环境中或直接引导在其中。治疗实体癌或液体癌是可能的。式(II)的化合物/缀合物可以单独使用或与至少一种其他的抗癌剂组合使用。
式(II)的化合物/缀合物以通常范围为1至10mg/mL的浓度配制成缓冲水溶液的形式配制。此溶液本身可以以灌注形式注射或者可以重新稀释以形成灌注溶液。
以下实例描述了根据本披露的式(I)和(II)的一些化合物的制备。下面例示的化合物的数量与上文给出的那些相匹配。除非另外规定，否则所有反应均在惰性气氛下进行。
在以下实例中，当未指定起始产物的来源时，应理解所述产物是已知化合物。
实例
以下实例描述了根据本披露的某些化合物的制备。这些实例是非限制性的，并且仅说明本披露。特赛妥单抗变体是根据EU编号命名的。
所使用的分析方法
高压液相色谱-质谱法(LCMS)
方法M1
在Waters UPLC-SQD上获得谱。
电离：在正和/或负模式下的电喷雾(ES+/-)。
·柱ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1x50mm
·溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)B：CH3CN(0.1％甲酸)
·柱温：50℃
·流速：0.90mL/min
·梯度(2.5min)：在1.8min内5％至100％B；2.4min：100％B；2.45min：5％B
方法M2
在Waters UPLC-SQD上获得谱。
电离：在正和/或负模式下的电喷雾(ES+/-)。
·柱ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1x50mm
·溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)B：CH3CN(0.1％甲酸)
·柱温：50℃
·流速：0.80mL/min
·梯度(10min)：在8.6min内5％至100％B；9.6min：100％B；9.8min：5％B
方法M3
在Waters UPLC-SQD上获得谱。
电离：在正和/或负模式下的电喷雾(ES+/-)。
·柱ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1x50mm
·溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)B：CH3CN(0.1％甲酸)
·柱温：50℃
·流速：0.80mL/min
·梯度(5min)：0.2：5％B；在3.4min内5％至98％B；3.7min：98％B；4.1min：5％B
方法M4
在Waters UPLC-SQD上获得谱。
电离：在正和/或负模式下的电喷雾(ES+/-)。
·柱ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1x30mm
·溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)B：CH3CN(0.1％甲酸)
·柱温：35℃
·流速：0.70mL/min
·梯度(4min)：0.18：5％B；在3.02min内5％至99％B；3.4min：99％B；3.55min：5％B
方法M5
在Waters UPLC-SQD上获得谱。
电离：在正和/或负模式下的电喷雾(ES+/-)。
·柱ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1x50mm
·溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)B：CH3CN(0.1％甲酸)
·柱温：35℃
·流速：0.70mL/min
·梯度(5min)：0.15：3％B；在3.3min内3％至100％B；3.45min：100％B；3.85min：3％B
1H核磁共振(NMR)
1H NMR谱在型号DRX-400或DRX-500的Bruker Avance波谱仪上获得。化学位移(δ)以ppm给出。
尺寸排阻色谱-高分辨率质谱法(RP-HRMS)
在UPLC-XEVO-G2-XS-QTOF(沃特斯公司(Waters))上进行分析。反相色谱分析在80℃下使用Agilent BioHPLC PLRP-S5μm柱(2.1x50mm)以流速0.5mL/min和以下洗脱梯度进行：在1min时5％B，在4min时50％B，在5min时50％B，在6min时5％B，在7min时5％B(溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)；B：CH3CN(0.1％甲酸))。在正模式的电喷雾电离(ES+)进行质谱法。用Waters MaxEnt1软件对质谱进行解卷积。观察到的分子量分别对应于裸抗体(如果存在)的质量以及1(D1)、2(D2)、n(Dn)个药物在抗体上的缀合。
需要时，使用以下条件进行初步ADC还原：将ADC用1/10(以体积计)的在水中的0.5M TCEP溶液处理，并且在SEC HRMS分析前在室温下放置30min。
分析型尺寸排阻色谱法(SEC)
在Hitachi Labchrom系统上进行分析，该系统配备有光电二极管阵列检测器和具有0.2mL/min流速的Tosoh Bioscience TSK-GEL SuperSW 4μm(4.6×150mm)柱或具有0.5mL/min流速的Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5μm(7.8×300mm)柱并且用含有0.2M的KCl、0.052M的KH2PO4、0.107M的K2HPO4和按体积计20％的异丙醇的pH 7缓冲液等度洗脱15分钟。
缓冲液
·缓冲液A(pH 5.5)：乙酸钠(20mM)，10％(w/v)蔗糖
·缓冲液B(pH 5.5)：乙酸钠(20mM)，5％(w/v)蔗糖，0.01％PS80
·缓冲液C(pH 7.4)：NaPi(10mM)，NaCl(140mM)
·缓冲液D(pH 6.5)：KPi(50mM)，NaCl(50mM)，EDTA(2mM)
·缓冲液E(pH 6.5)：10mM组氨酸，10％(w/v)蔗糖
·缓冲液F(pH 5.5)：10mM组氨酸，8％(w/v)蔗糖
·DPBS：Na2HPO4(8.10mM)，KH2PO4(1.47mM)，NaCl(136.9mM)，KCl(2.67mM)
用于制备环PEGn硫酸酯的通用方法(M1)
在氩气下，将适当的乙二醇(1当量)溶解在无水DCM(225mL)中。在0℃下，添加TEA(4.9当量)和DMAP(0.001当量)。经2h逐滴添加亚硫酰氯(2当量)在DCM(10mL)中的溶液。然后将反应混合物在室温下搅拌直到反应完成。将棕色溶液在冰浴中冷却并且缓慢添加水(25mL)。将有机层用水(2x25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以提供预期的呈棕色油状物的环PEGn亚硫酸酯。
将环PEGn亚硫酸酯吸收在20mL的混合物DCM/CH3CN(1:1)中。在0℃下，在剧烈搅拌下，添加在水(15mL)中的高碘酸钠(1.5当量)溶液和在水(1mL)中的氯化钌(III)三水合物(0.001当量)溶液。在0℃下搅拌1h后，允许将反应混合物加温至室温过夜，然后经Clarcel过滤。将滤液用水(3x25mL)洗涤，与MgSO4和木炭一起搅拌，再次经Clarcel过滤并且在真空中浓缩。将粗油状物搅拌并且用乙醚(3x15mL)萃取。将乙醚相在真空中浓缩以提供预期的呈无色油状物的环PEGn硫酸酯。
用于O-烷基化反应的通用方法(M2)
在氩气下，在0℃下向氢化钠(2当量)在无水DMF(2mL)中的悬浮液中逐滴添加三苯甲基-R848，化合物1(1当量)在DMF(2mL)中的溶液。在0℃下搅拌45分钟后，将反应混合物搅拌30分钟至室温。将黄色溶液在0℃下冷却，然后逐滴添加环PEGn硫酸酯(1.6当量)在DMF(2mL)中的溶液。允许将反应混合物加温至室温过夜。将反应混合物在0℃下用1.5mL水淬灭并且搅拌10分钟。在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发后，将固体残余物用DCM(3x20mL)萃取，在真空中浓缩并且通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM至DCM/MeOH/H2O 80:20:1)纯化，以提供预期的化合物。
用于脱硫酸化反应的通用方法(M3)
将由O-烷基化反应M2产生的硫酸酯化合物在80℃下在吡啶和1,4-二噁烷(4:1)(50mL/g)的混合物中加热。在反应完成后，将无色溶液在真空中浓缩。将残余物用DCM(50mL)吸收，用水(3x10mL)和饱和盐水(3x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以提供预期的化合物。
用于PEGn链伸长反应的通用方法(M4)
在氩气下，在0℃下向氢化钠(2当量)在无水DMF(2-4mL)中的悬浮液中逐滴添加由脱硫酸化反应M3(1当量，130-250mg)产生的三苯甲基-R848-PEGn-OH在DMF(3-6mL)中的溶液。在45分钟后，将反应混合物搅拌(30-60分钟)至室温。将黄色悬浮液在T<+4℃下冷却，然后逐滴添加环PEGn硫酸酯(1.6当量)在DMF(3-6mL)中的溶液。允许将反应混合物加温至室温过夜。将反应混合物在0℃下用5mL水淬灭并且搅拌30分钟。在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发后，将固体残余物用DCM(3x50mL)萃取并且过滤。将合并的有机层在真空中浓缩并且通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM至DCM/MeOH/H2O 80:20:1)纯化，以提供呈无色油状物的预期的化合物。
用于三苯甲基去保护的通用方法(M5)
向在冰浴中的三苯甲基化合物在1,4-二噁烷中的溶液中添加在1,4-二噁烷中的4N HCl溶液。在30分钟后去除冰浴并且将反应混合物在室温下搅拌直到反应完成。然后添加MeOH以溶解混合物并且将溶液在真空中浓缩。将残余物溶解在水(10mL)中，用EtOAc(3x10mL)和Et2O(10mL)洗涤。将水层的pH在搅拌下在冰浴中用0.1N NaOH调节至pH 10。将产物用DCM或EtOAc(6x10mL)萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤，在真空中浓缩，并且然后通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM至DCM/MeOH/H2O 80:20:1)纯化，以提供所预期的呈无色油状物的化合物。
用于制备PEGn醛的通用方法(M6)
在氩气下，在-75℃下向草酰氯(1.2当量)在无水DCM(2mL)中的溶液中添加DMSO(3.6当量)。在-75℃下30分钟后，添加叠氮基-PEGn-OH(1当量)在DCM(2mL)中的溶液，将反应混合物在-75℃下搅拌30分钟，随后添加TEA(7.2当量)。将反应混合物在-75℃下再搅拌30分钟并且允许加温至室温。将反应混合物用水(4mL)淬灭，用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以提供预期的PEGn醛。
用于还原胺化反应的通用方法(M7)
向由通用方法M6(1当量)产生的PEGn醛在THF(2mL)中的溶液中添加咪唑并喹啉3M-012(1当量)和三乙酰氧基硼氢化钠(1.3当量)。将反应混合物在室温下搅拌2h，用水淬灭并且用EtOAc萃取三次。将合并的有机层用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，在真空中浓缩并且通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以提供预期的化合物。
用于制备式(II)的化合物/缀合物的通用方法：
·用于使用NHS酯制备mAb-DBCO的通用方法(M8和M9)
M8：向最终用DPBS稀释的抗体在水性缓冲液中的溶液中添加1NHEPES(组成由96:4至100:0不等)。将溶液用过量的大约20mM的NHS酯DBCO接头在DMA或DMSO中的溶液处理，使得最终抗体浓度是1-11mg/mL并且DMA或DMSO在水性缓冲液中的百分比为2％-20％。在室温下搅拌1-3小时后，将混合物通过SEC HPLC分析，以便对单体抗体群体确定接头与抗体比率(LAR)。如果发现LAR不足，则将混合物在搅拌下用另外过量的在DMA或DMSO中的接头溶液在室温下处理长达另外2小时。
M9：向最终用DPBS稀释的抗体在水性缓冲液中的溶液中添加1NHEPES(组成由99:1至100:0不等，换句话说0％至1％HEPES(v/v))。将溶液用过量的大约20mM的NHS酯DBCO接头在DMA中的溶液处理，使得最终抗体浓度是约10mg/mL并且DMA在水性缓冲液中的百分比为20％。在室温下搅拌1小时后，通过SEC HPLC分析混合物以对单体抗体群体确定LAR。如果发现LAR不足，则将混合物在搅拌下用另外过量的在DMA中的接头溶液在室温下处理长达另外2小时。然后将混合物使用经具有20％DMA的DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团(GE Healthcare))通过凝胶过滤进行纯化。
·用于使用水溶性活性酯制备mAb-DBCO的通用方法(M10)
将抗体在用30mM K2HPO4缓冲液稀释以调节pH在7至8之间的水性缓冲液中的溶液用过量的大约50mM的水溶性活性酯在DMSO或无菌水中的溶液处理，使得最终抗体浓度为约10mg/mL。在室温下搅拌1至3小时后，通过SEC HPLC和/或RP-HRMS分析混合物以对单体抗体群体确定LAR。
·用于制备式(II)的化合物/缀合物的通用方法(M11至M13)
M11：将mAb-DBCO在含有20％DMA(最终用DPBS稀释)的水性缓冲液中的溶液用过量(6至12当量)的7至20mM的叠氮基有效载荷在DMA中的溶液处理，使得最终抗体浓度为1-6mg/mL并且DMA在水性缓冲液中的百分比为20％。在室温下过夜搅拌后，将反应混合物通过RP-HRMS分析，以对单体抗体群体确定药物与抗体比率(DAR)。将混合物使用经最终水性缓冲液(缓冲液A或DPBS)预平衡的SephadexTM G25基质(或HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。最终对式(II)的化合物/缀合物进行无菌过滤(-SV 0.22μm，PVDF，密理博公司(Millipore))。将式(II)的最终化合物/缀合物通过UV光谱法或SEC HPLC测定以测量式(II)的化合物/缀合物浓度，通过SECHPLC测定以确定单体纯度，并且通过RP-HRMS测定以由式(II)的化合物/缀合物的质谱的解卷积确定DAR。
M12：将mAb-DBCO在含有20％DMA(最终用DPBS稀释)的水性缓冲液中的溶液用过量(7至14当量)的10至20mM的叠氮基有效载荷在DMA中的溶液处理，使得最终抗体浓度为1-4mg/mL并且DMA在水性缓冲液中的百分比为约20％。在室温下过夜搅拌后，将反应混合物通过RP-HRMS分析，以对单体抗体群体确定DAR。最终将混合物用含有20％DMA的DPBS缓冲液用超滤旋转柱(PES膜50K，赛多利斯公司(Sartorius))通过超滤进行纯化。然后将混合物使用在含有高达10％DMA的DPBS缓冲液中预平衡的SuperdexTM 200pg基质(16/60或26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。将含有单体缀合抗体的级分汇集，并且最终通过在(PES膜50K，赛多利斯公司)上的超滤进行浓缩，以达到2与5mg/mL之间的浓度。在一些情况下，将缀合物使用经最终水性缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(或HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。最终对缀合物进行无菌过滤(-SV 0.22μm，PVDF，密理博公司)，然后通过UV光谱法或SEC HPLC测定以测量缀合物浓度，通过SEC HPLC测定以确定单体纯度并且通过RP-HRMS测定以由缀合物的质谱的解卷积确定DAR。
M13：将mAb-DBCO在含有20％DMA(最终用DPBS稀释)的水性缓冲液中的溶液用过量(12至14当量)的10至20mM的叠氮基有效载荷在DMA中的溶液处理，使得最终抗体浓度为1-4mg/mL并且DMA在水性缓冲液中的百分比为约20％。在室温下过夜搅拌后，将混合物通过RP-HRMS分析，以对单体抗体群体确定DAR。将混合物用超滤旋转柱(PES膜50K，赛多利斯公司或Ultra:Ultracel膜，50K，密理博公司)通过渗滤进行纯化，然后使用经最终水性缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。根据如通过HRMS评估的残余游离药物含量，用最终缓冲液通过渗滤进行另外的纯化。最终对缀合物进行无菌过滤(-SV 0.22μm(PVDF，Durapore，密理博公司))。将最终缀合物通过UV光谱法或SEC HPLC测定以测量缀合物浓度，通过SEC-HPLC测定以确定单体纯度并且通过RP-HRMS测定以由缀合物的质谱的解卷积确定DAR。
用于还原叠氮基-PEGn-R848有效载荷的通用方法(M14)
向215μmol的叠氮基-PEGn-R848在10ml MeOH中的溶液中添加甲酸铵(10当量)和5％(w/w)的10％Pd/C。将混合物在回流下加热1小时，然后经Clarcel Flo过滤。将滤液在真空中浓缩并且将粗品通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM与DCM/MeOH/H2O 40:5:0.5)纯化，以提供预期的化合物。
用于合成NHS-马来酰亚胺基接头的通用方法(M15)
在氩气下，将马来酸酐衍生物(1.2当量，R＝H或Me)添加到氨基酸(1当量，m＝1至6)在10体积的AcOH中的溶液中。将混合物在120℃下搅拌6小时，冷却至室温后倒入水中，并且用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，并且在真空中浓缩，以得到粗产物，将该粗产物通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM至DCM/MeOH 9:1)纯化，以提供预期的化合物。
在氩气下，向先前的中间体在20体积的无水DCM中的溶液中添加DSC(1当量)和DIEA(1当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并且然后通过快速色谱法在硅胶上(梯度洗脱DCM至DCM/丙酮8:2)纯化，以提供预期的化合物。
用于合成马来酰亚胺基-PEGn-R848有效载荷的通用方法(M16)
在氩气下，向氨基-PEGn-R848(1当量)在10体积的无水DMF中的溶液中添加NHS取代的马来酰亚胺基接头(1当量)和DIEA(2-3当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在真空中浓缩并且将粗化合物使用梯度CH3CN/H2O(含0.1％甲酸或三氟乙酸)在C18硅胶(Chromabond RS40 C18ec)上纯化，以在冻干后提供预期的化合物。
用于制备式(II)的化合物/缀合物的通用Cys缀合方法(M17)
向1-11mg/mL的thiomAb在DPBS中的溶液中添加DTT(64当量的在H2O或DPBS中的100-300mM溶液)。将混合物在37℃下在45min至1h期间搅拌，并且然后使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(或HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。向还原的thiomAb的溶液中添加DHAA(14-15当量的在DPBS中的25-100nM溶液)。在室温下搅拌3小时并且添加DMA(10％-20％v/v)后，将混合物用过量的马来酰亚胺基化合物(1.5至2当量/在DMA中的10至20mM溶液的未加帽硫醇)处理，使得最终抗体浓度为1-4mg/mL并且DMA在水性缓冲液中的百分比为约10％-20％。在室温下过夜搅拌后，将混合物通过RP-HRMS分析，以对单体抗体群体确定DAR。在使用在水性缓冲液(诸如含有5％至20％的有机溶剂(诸如DMA或EtOH)的DPBS)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60或26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化之前或之后，将混合物用超滤旋转柱(Ultra：PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤进行浓缩，并且然后使用经最终水性缓冲液A、缓冲液E或缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质或HiprepTM26/10脱盐柱(通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。根据如通过HRMS评估的残余游离药物含量，用最终缓冲液通过渗滤进行另外的纯化。最终对缀合物进行无菌过滤(-SV 0.22μm，PVDF，Durapore，密理博公司)。将缀合物通过UV光谱法或SEC HPLC测定以测量缀合物浓度，通过SEC-HPLC测定以确定单体纯度并且通过RP-HRMS测定以由缀合物的质谱的解卷积确定DAR。
化合物1的合成：1-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇
向R848([144875-48-9]，250mg，0.755mmol)在CH3CN(9.5mL)中的溶液中添加TEA(263μL，1.89mmol)和三苯甲基氯(253mg，0.906mmol)。将反应混合物加热至回流持续45分钟，冷却至室温并且然后放置在冰浴中。将固体通过过滤收集，用冷乙腈洗涤并且在室温下在真空中干燥，以得到320mg呈白色粉末的化合物1(76％)。
NMR 1H(400MHz，δ以ppm计，氯仿-d)：1.24至1.37(m，9H)；3.36(s，1H)；3.68(q，J＝7Hz，2H)；4.71(s大，2H)；4.87(s，2H)；7.02(s，1H)；7.15至7.30(m，12H)；7.45至7.50(m，6H)；7.93(d，J＝8Hz，1H)。
环PEGn硫酸酯的合成
化合物2：1，3，6，9，12-五氧杂-2-硫杂环十四烷2，2-二氧化物
遵循通用方法M1中所述的程序，由四乙二醇(1.52mL，8.71mmol)制备环PEG4硫酸酯化合物2并且获得了白色固体(553mg，24％)。
NMR 1H(400MHz，δ以ppm计，DMSO-d6)：3.54(m，4H)；3.61(m，4H)；3.76(t，J＝5Hz，4H)；4.42(t，J＝5Hz，4H)；LCMS(M1)：tR＝0.60，[M+H]+＝257；IR：1397；1195；1103；1004；939；910；828；603和508cm-1。
化合物3：1，3，6，9，12，15，18，21，24-九氧杂-2-硫杂环二十六烷2，2-而氧化物
遵循通用方法M1中所述的程序，由八乙二醇(1.69g，4.33mmol)制备环PEG8硫酸酯并且获得了白色固体(880mg，42％)。
NMR 1H(400MHz，δ以ppm计，DMSO-d6)：3.50至3.58(m，24H)；3.71(m，4H)；4.39(m，4H)；LCMS(M1)：tR＝0.75，[M+H]+＝433；IR：2886；1184；1097；1008；920；918；589和519cm-1。
二苄基环辛炔接头的合成
化合物5a的合成：ADIBO-戊二酰-ONHS
化合物4：5-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04，9]十六-1(12)，4(9)，5，7，13，15-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基]-5-氧代-戊酸
向二苯并环辛炔-胺([1255942-06-3]，77.5mg，280μmol)在无水DCM(2mL)中的溶液中添加戊二酸酐(42.5mg，364μmol)。将无色反应混合物在室温下搅拌过夜并且通过快速色谱法在5g硅胶上(梯度洗脱EtOAc至EtOAc/MeOH/H2O 7:2:1)纯化，以得到94mg呈白色泡沫的化合物4(86％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.59(quin,J＝7Hz,2H)；1.83(ddd,J＝6,8和16Hz,1H)；1.94(t,J＝8Hz,2H)；2.11(t,J＝7Hz,2H)；2.40(ddd,J＝6,8和16Hz,1H)；2.87(m,1H)；3.09(m,1H)；3.63(d,J＝14Hz,1H)；5.04(d,J＝14Hz,1H)；7.26至7.42(m,3H)；7.43至7.52(m,3H)；7.54至7.67(m,3H)；12.01(大s,1H)。
化合物5a：(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-5-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基]-5-氧代-戊酸酯
在氩气下，向化合物4(31mg，79μmol)在无水DCM(1.7mL)中的溶液中添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(43mg，159μmol)，随后添加DIEA(28μL，159μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并且然后通过快速色谱法在4.3g二醇硅胶上(梯度洗脱庚烷/EtOAC)纯化，以得到18.5mg呈白色固体的化合物5a(47％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.65至1.77(m,2H)；1.85(ddd,J＝6,8和16Hz,1H)；2.04(t,J＝7Hz,2H)；2.40(m,1H)；2.59(t,J＝7Hz,2H)；2.81(s,4H)；2.95(m,1H)；3,09(m,1H)；3.63(d,J＝14Hz,1H)；5.05(d,J＝14Hz,1H)；7.26至7.54(m,6H)；7.55至7.71(m,3H)；LCMS(M1):tR＝1.03,ES,m/z＝488[M+H]+,m/z＝486[M-H]-,m/z＝532[M-H+HCO2H]-。
水溶性二苄基环辛炔接头化合物5b、5c和5d的合成
在氩气下，向化合物4(1当量)在无水DMF或CH3CN(1.5mL)中的溶液中添加水溶性活性酯(1.0-1.2当量)和诸如DIC或DCC的偶联剂(1.2-1.9当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并且然后通过在冰浴中与MTBE一起研磨进行纯化并且沉降。在过滤并且在真空中干燥后，获得呈白色固体的预期的活性酯。
化合物5b：1-[5-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六-1(16),4(9),5,7,12,14-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氧基-2,5-二氧代-吡咯烷-3-磺酸钠
遵循上文通用程序中所述的程序，由化合物4(78.5mg，0.2mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(45.1mg，0.21mmol)和DCC(74.8mg，0.36mmol)在DMF(0.25mL)中制备化合物5b并且获得了白色固体(35mg，35％)。
1H NMR(400MHz,δ以ppm计DMSO-d6):1.72(m,2H)；1.85(m,2H)；2.05(t,J＝7Hz,2H)；2.42(m,2H)；2.56(t,J＝7Hz,2H)；2.85(m,2H)；2.95(m,1H)；3.11(m,1H)；3.63(d,J＝15Hz,1H)；3.91(m,1H)；5.05(d,J＝15Hz,1H)；7.30-7.70(m,9H)；LCMS(M):tR＝3.83,ES,m/z＝568。
化合物5c：[4-[5-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六-1(16),4(9),5,7,12,14-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氧基苯基]-二甲基-锍硫酸甲酯盐
遵循上文通用程序中所述的程序，由化合物4(97.6mg，0.25mmol)、4-羟苯基二甲基锍磺酸甲酯盐(76.6mg，0.29mmol)和DIC(40.4mg，0.32mmol)在CH3CN(2.5mL)中制备化合物5c并且获得了白色固体(96mg，60％)。
1H NMR(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.75(m,2H)；1.85(m,2H)；2.05(t,J＝7Hz,2H)；2.42(m,2H)；2.68(t,J＝7Hz,2H)；2.95(m,1H)；3.11(m,1H)；3.63(d,J＝15Hz,1H)；5.05(d,J＝15Hz,1H)；7.30-7.70(m,9H)；LCMS(M):tR＝1.16,ES,m/z＝527。
化合物5d：4-[5-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六-1(16),4(9),5,7,12,14-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氧基-2,3,5,6-四氟-苯磺酸钠
遵循上文通用程序中所述的程序，由化合物4(100.5mg，0.26mmol)、2,3,5,6-四氟-4-羟基苯磺酸钠盐(74.8mg，0.28mmol)和DIC(61mg，0.48mmol)在CH3CN(3.5mL)中制备化合物5d并且获得了无色油状物(67mg，40％)。
1H NMR(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.76(m,2H)；1.85(m,2H)；2.05(t,J＝7Hz,2H)；2.42(m,2H)；2.55(t,J＝7Hz,2H)；2.95(m,1H)；3.11(m,1H)；3.19(s,3H)；3.28(s,6H)；3.65(d,J＝15Hz,1H)；5.04(d,J＝15Hz,1H)；7.25-7.52(m,8H)；7.57-7.70(m,3H)；8.02(d,J＝8Hz,2H)；LCMS(M):tR＝1.79,ES,m/z＝619。
mAb 1a的合成：CEACAM5_特赛妥单抗-DBCO
遵循通用方法M9制备mAb 1a。向4mL的抗CEACAM5特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])抗体(22.5mg/mL，在缓冲液B中)中添加DPBS(2.8mL)和DMA(1.5mL)。将此溶液用255μL的化合物5a在DMA中的溶液(20.89mM)处理并且反应2h。将粗品使用经80:20DPBS/DMA预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；获得呈无色透明溶液的mAb 1a(93mg，5.84mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.32并且单体纯度为98.6％。
mAb 1b的合成：CEACAM5_特赛妥单抗-DBCO
遵循通用方法M8制备mAb 1b。向1.6mL的抗CEACAM5特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])抗体(19.7mg/mL，在缓冲液B中)中添加DPBS(0.78mL)、1M HEPES(19μL)和DMA(0.52mL)。将此溶液用80μL的化合物5a在DMA中的溶液(21.6mM)处理并且反应2h；获得呈无色透明溶液的粗品mAb 1b(32mg，10.5mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.4并且单体纯度为97.7％。
mAb 1c的合成：CEACAM5_特赛妥单抗-DBCO
遵循通用方法M10制备mAb 1c。向5mL的抗CEACAM5特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])抗体(21.3mg/mL，在缓冲液A中)中添加30mM K2HPO4(5mL)。将此溶液用147μL的化合物5b在DMSO中的溶液(50mM)处理并且反应3h。将粗品使用SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；获得呈无色透明溶液的mAb 1c(106.5mg，10.495mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.17并且单体纯度为97.4％。
mAb 1d的合成：CEACAM5_特赛妥单抗-DBCO
遵循通用方法M10制备mAb 1d。向5mL的抗CEACAM5特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])抗体(21.3mg/mL，在缓冲液A中)中添加30mM K2HPO4(5mL)。将此溶液用147μL的化合物5c在水中的溶液(50mM)处理并且反应3h。将粗品使用SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；获得呈无色透明溶液的mAb 1d(106mg，10.495mg/mL)，其中LAR(HRMS)为1.94并且单体纯度为98.8％。
mAb 1e的合成：CEACAM5_特赛妥单抗-DBCO
遵循通用方法M10制备mAb 1e。向5mL的抗CEACAM5特赛妥单抗(CAS[2349294-95-5])抗体(21.3mg/mL，在缓冲液A中)中添加30mM K2HPO4(5mL)。将此溶液用147μL的化合物5d在水中的溶液(50mM)处理并且反应3h。将粗品使用SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；获得呈无色透明溶液的mAb 1e(106mg，10.495mg/mL)，其中LAR(HRMS)为5并且单体纯度为97.5％。
mAb 2的合成：EphA2_hu2H11_R35R74-DBCO
遵循通用方法M8制备mAb 2。向4mL的抗EphA2hu2H11_R35R74抗体(11.1mg/mL，在缓冲液D中)中添加1.1mL的DPBS和1.2mL的DMA。将此溶液用120μL的化合物5a在DMA中的溶液(20mM)处理并且反应约3h；获得呈无色透明溶液的粗品mAb 2(45mg，6.9mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.1并且单体纯度为96.6％。
mAb 3的合成：HER2_曲妥珠单抗-DBCO
遵循通用方法M8制备mAb 3。向5.86mL的抗HER2抗体曲妥珠单抗(17.78mg/mL在DPBS中)中添加1.365mL的DMA。将此溶液用126μL的化合物5a在DMA中的溶液(20mM)处理并且反应5h；获得呈无色透明溶液的粗品mAb3(45mg，6.1mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.1并且单体纯度为98％。
mAb 4的合成：EGFR_西妥昔单抗-DBCO
遵循通用方法M8制备mAb 4。向23mL的抗EGFR抗体西妥昔单抗(2mg/mL，在缓冲液C中)中添加3mL的DMA。将此溶液用126μL的化合物5a在DMA中的溶液(20mM)处理并且反应3h；获得呈无色透明溶液的粗品mAb 4(46mg，1.6mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.13并且单体纯度为97.7％。
mAb 5的合成：B7H3_依诺妥珠单抗-mAb-DBCO
遵循通用方法M8制备mAb 5。向27mL的抗B7H3抗体依诺妥珠单抗(1.7mg/mL，在DPBS中)中添加6.6mL的DMA。将此溶液用126μL的化合物5a在DMA中的溶液(20mM)处理并且反应3h；获得呈无色透明溶液的粗品mAb 5(45mg，1.36mg/mL)，其中LAR(SEC)为4.14并且单体纯度为98.8％。
实例1至6的合成：叠氮基-PEG4-R848和对应的ADC
化合物6：硫酸14-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-13,13-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基酯钠
遵循通用方法M2中所述的程序，由化合物1(100mg，0.179mmol)和化合物2(73mg，0.287mmol)制备化合物6并且获得了白色固体(122mg，81％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.11至1.26(m,9H)；3.31至3.58(m,18H)；3.75至3.81(m,2H)；4.68至5.09(m,2H)；7.01(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.31(m,11H)；7.40(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.30,ES,m/z＝813[M+H]+,m/z＝811[M-H]-。
化合物7：14-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-13,13-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四-1-醇
遵循通用方法M3中所述的程序，由在6mL的吡啶与1,4-二噁烷的4:1混合物中的化合物6(118mg，0.141mmol)制备化合物7并且获得了无色油状物(105mg，定量)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.07至1.28(m,9H)；3.34至3.56(m,20H)；4.59(t,J＝5Hz,1H)；4.75(大s,2H)；7.03(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.31(m,10H)；7.40(d,J＝8Hz,7H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)。LCMS(M1):tR＝1.10,ES,m/z＝733[M+H]+。
化合物8：4-甲基苯磺酸14-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-13,13-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基酯
在氩气下，在0℃下向化合物7(120mg，0.164mmol)在无水DCM(6mL)中的溶液中添加DMAP(3mg，0.024mmol)和TEA(114μL，0.818mmol)，随后添加甲苯磺酰氯(93mg，0.491mmol)。允许将反应混合物加温至室温。在反应完成后，将混合物用DCM(50mL)稀释，用水(3x 10mL)和饱和盐水(3x13mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗的黄色油状物通过快速色谱法在10g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到90mg呈无色油状物的化合物8(62％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,氯仿-d):1.10至1.36(m,15H)；2.42(s,3H)；3.36至3.60(m,16H)；3.64(m,2H)；4.13(m,2H)；4.74(s,2H)；7.00(s,1H)；7.07至7.35(m,14H)；7.40至7.57(m,6H)；7.78(d,J＝8Hz,2H)；7.99(d,J＝8Hz,1H)。
化合物9：1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-N-三苯甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
在氩气下，向化合物8(90mg，0.101mmol)在无水DMF(6mL)中的溶液中添加叠氮化钠(33mg，0.507mmol)。在80℃下搅拌过夜后，将黄色反应混合物在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发。将残余物吸收在DCM(50mL)与水(10mL)的混合物中。将有机层用水(2x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法在10g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到77mg呈黄色油状物的化合物9(定量)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.12至1.31(m,9H)；3.34至3.41(m,8H)；3.44至3.59(m,12H)；4.76(大s,2H)；7.01(s,1H)；7.10(d,J＝8Hz,1H)；7.18至7.32(m,11H)；7.41(d,J＝8Hz,6H)；8.25(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.28,ES,m/z＝758[M+H]+；IR:3419；2873；2104；1591；1534；1490；1096和699cm-1。
实例1：1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M5中所述的程序，将在1,4-二噁烷(2.4mL)中的化合物9(85mg，0.112mmol)用在1,4-二噁烷中的4N HCl(4.8mL)处理，以得到呈无色油状物的实例1(49mg，84％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.10至1.26(m,9H)；3.32至3.70(m,20H)；4.77(大s,2H)；6.54(大s,2H)；7.22(t,J＝7Hz,1H)；7.41(t,J＝8Hz,1H)；7.59(d,J＝8Hz,1H)；8.29(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝0.70,ES,m/z＝516[M+H]+。
实例2：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-R848ADC
遵循通用方法M11制备实例2；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 1a(15mg，5.84mg/mL)与53.06μL的实例1在DMA中的溶液(12.48mM)反应过夜。将粗混合物使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化并且进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例2(13.05mg，1.45mg/mL，总产率87％)，其中DAR(HRMS)为4.3并且单体纯度为98.1％。
RP-HRMS:147417(裸mAb)；148305(D1)；149195(D2)；150082(D3)；150970(D4)；151857(D5)；152747(D6)；153634(D7)；154521(D8)；155411(D9)。
实例3：EphA2_hu2H11_R35R74-PEG4-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例3；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 2(10.5mg，7mg/mL)与85μL的实例1在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例3(6.4mg，2.65mg/mL，总产率60％)，其中DAR(HRMS)为3.92并且单体纯度为97.6％。
RP-HRMS:149355(裸mAb)；150241(D1)；151130(D2)；152018(D3)；152905(D4)；153793(D5)；154681(D6)；155569(D7)；156454(D8)；157347(D9)。
实例4：HER2_曲妥珠单抗-PEG4-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例4；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 3(11mg，10mg/mL)与91μL的实例1在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例4(6.67mg，2.78mg/mL，总产率59％)，其中DAR(HRMS)为3.84并且单体纯度为98.2％。
RP-HRMS:148059(裸mAb)；148945(D1)；149832(D2)；150720(D3)；151608(D4)；152495(D5)；53384(D6)；154269(D7)；155158(D8)；156048(D9)。
实例5：EGFR_西妥昔单抗-PEG4-R848ADC
遵循通用方法M12制备实例5；将在80:20缓冲液C/DMA中的mAb 4(12mg，1.6mg/mL)与99μL的实例1在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩，然后使用SuperdexTM 200pg基质(16/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩并且使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例5(6.9mg，2.48mg/mL，总产率60％)，其中DAR(HRMS)为4.3并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:153690(D1)；154566(D2)；155448(D3)；156348(D4)；157229(D5)；158106(D6)；159002(D7)。
实例6：B7H3_依诺妥珠单抗-PEG4-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例6；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 5(11.3mg，1.36mg/mL)与93μL的实例1在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将反应混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例6(5.67mg，3.07mg/mL，总产率50％)，其中DAR(HRMS)为4.3并且单体纯度为98.4％。
RP-HRMS:147998(裸mAb)；148895(D1)；149780(D2)；150669(D3)；151558(D4)；152447(D5)；153332(D6)；154219(D7)；155106(D8)。
实例7至12的合成：叠氮基-PEG8-R848和对应的ADC
化合物10：硫酸26-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)25,25-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基酯钠
遵循通用方法M2中所述的程序，由化合物1(200mg，0.359mmol)和化合物3(279mg，0.646mmol)制备化合物10并且获得了无色油状物(363mg，90％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.11至1.29(m,9H)；3.33至3.58(m,34H)；3.77(m,2H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.32(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.33,ES,m/z＝989[M+H]+,m/z＝987[M-H]-,m/z＝455[M+2H-SO3H]2+。
化合物11：26-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-25,25-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-十氧杂二十六-1-醇
遵循通用方法M3中所述的程序，由在19.5mL的吡啶与1,4-二噁烷的4:1混合物中的化合物10(325mg，0.321mmol)制备化合物11并且获得了白色固体(211mg，72％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.11至1.33(m,9H)；3.35至3.56(m,36H)；4.54(s,1H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.17至7.31(m,11H)；7.39(m,6H)；8.24(d,J＝9Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.11,ES,m/z＝909[M+H]+,m/z＝455[M+2H]2+,m/z＝953[M-H+HCOOH]-。
化合物12：4-甲基苯磺酸26-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-25,25-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-十氧杂二十六烷基酯
在氩气下，在0℃下向化合物11(98mg，0.107mmol)在无水DCM(7mL)中的溶液中添加DMAP(2.6mg，0.021mmol)和TEA(105μL，0.754mmol)，随后添加甲苯磺酰氯(102mg，0.539mmol)。允许将反应混合物加温至室温。在反应完成后，将反应混合物用DCM(50mL)稀释，用水(3x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗的黄色油状物通过快速色谱法在10g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到71mg呈无色油状物的化合物12(62％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.12至1.29(m,9H)；2.40(s,3H)；3.33至3.65(m,34H)；4,10(大s,2H)；4.74(大s,2H)；6.99(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.31(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；7.43至7.50(m,J＝8Hz,2H)；7.75至7.80(m,J＝8Hz,2H)；8.23(d,J＝7Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.35,ES,m/z＝1063[M+H]+,m/z＝532[M+2H]2+。
化合物13：1-(26-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-2-(乙氧基-甲基)-N-三苯甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
在氩气下，向化合物12(69mg，0.065mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中添加叠氮化钠(21mg，0.324mmol)。在80℃下搅拌过夜后，将黄色溶液在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发。将残余物吸收在DCM(50mL)与水(10mL)的混合物中。将有机层用水(2x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法在5g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到60mg呈白色固体的化合物13(定量)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.09至1.26(m,9H)；3.32至3.62(m,36H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.14至7.32(m,11H)；7.39(d,J＝7Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.26,ES,m/z＝934[M+H]+。
实例7：1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M5中所述的程序，将在1,4-二噁烷(1.5mL)中的化合物13(51mg，0.054mmol)用在1,4-二噁烷中的4N HCl(3mL)处理，以得到呈无色油状物的实例7(33mg，87％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.10至1.28(m,9H)；3.32至3.60(m,36H)；4.77(大s,2H)；6.55(大s,2H)；7.,23(t,J＝8Hz,1H)；7.41(t,J＝8Hz,1H)；7.59(d,J＝8Hz,1H)；8.29(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝0.74,ES,m/z＝692[M+H]+。
实例8：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-R848ADC
遵循通用方法M11制备实例8；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 1b(52mg，10.5mg/mL)与430μL的实例7在DMA中的溶液(9.96mM)反应过夜。将粗混合物使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化并且进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例8(44.72mg，2.6mg/mL，总产率85％)，其中DAR(HRMS)为4.2并且单体纯度为98.3％。
RP-HRMS:147826(裸mAb)；148492(D1)；149554(D2)；150619(D3)；151683(D4)；152748(D5)；153814(D6)；154880(D7)；155943(D8)；157007(D9)。
实例9：EphA2_hu2H11_R35R74-PEG8-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例9；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 2(10.5mg，6.95mg/mL)与45μL的实例7在DMA中的溶液(18.9mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例9(6.3mg，2.47mg/mL，总产率61％)，其中DAR(HRMS)为3.82并且单体纯度为97.8％。
RP-HRMS:149352(裸mAb)；150419(D1)；151482(D2)；152546(D3)；153611(D4)；154676(D5)；155739(D6)；156802(D7)；157870(D8)；158934(D9)。
实例10：HER2_曲妥珠单抗-PEG8-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例10；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 3(11mg，6.14mg/mL)与49μL的实例7在DMA中的溶液(18.92mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例10(6.7mg，2.4mg/mL，总产率61％)，其中DAR(HRMS)为3.92并且单体纯度为98.2％。
RP-HRMS:148056(裸mAb)；149120(D1)；150184(D2)；151248(D3)；152314(D4)；153376(D5)；154439(D6)；155502(D7)；156580(D8)；157633(D9)；158697(D10)。
实例11：EGFR_西妥昔单抗-PEG8-R848ADC
遵循通用方法M12制备实例11；将在80:20缓冲液C/DMA中的mAb4(12mg，1.6mg/mL)与52μL的实例7在DMA中的溶液(18.9mM)反应过夜。将混合物在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩，然后使用SuperdexTM 200pg基质(16/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩并且使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例11(7.3mg，2.62mg/mL，总产率63％)，其中DAR(HRMS)为3.8并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:152781(裸mAb)；153849(D1)；154920(D2)；155980(D3)；157052(D4)；158109(D5)；159170(D6)；160224(D7)；161303(D8)。
实例12：B7H3_依诺妥珠单抗-PEG8-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例12；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 5(11.3mg，1.36mg/mL)与49μL的实例7在DMA中的溶液(18.92mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例12(6.5mg，3.42mg/mL，总产率59％)，其中DAR(HRMS)为4.45并且单体纯度为97.6％。
RP-HRMS:149071(D1)；150131(D2)；151196(D3)；152261(D4)；153324(D5)；154389(D6)；155450(D7)；156516(D8)；157582(D9)。
实例13至18的合成：叠氮基-PEG12-R848和对应的ADC
化合物14：硫酸38-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)37,37-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷基酯钠
遵循通用方法M4中所述的程序，由化合物11(138mg，0.151mmol)制备化合物14并且获得了无色油状物(178mg，98％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.10至1.28(m,9H)；3.25至3.59(m,50H)；3.78(dd,J＝4和6Hz,2H)；4.64至4.82(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(dd,J＝1和8Hz,1H)；7.14至7.32(m,11H)；7.35至7.44(m,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.35,ES,m/z＝1165[M+H]+,m/z＝1163[M-H]-,m/z＝543[M+2H-SO3H]2+。
化合物15：38-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-37,37-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八-1-醇
遵循通用方法M3中所述的程序，由在13.5mL的吡啶与1,4-二噁烷的4:1混合物中的化合物14(176mg，0.148mmol)制备化合物15并且获得了无色油状物(100mg，62％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.03至1.32(m,9H)；3.31至3.55(m,52H)；4.54(s,1H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.31(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.11,ES,m/z＝1085[M+H]+,m/z＝543[M+2H]2+,m/z＝1129[M-H+HCOOH]-。
化合物16：4-甲基苯磺酸38-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-37,37-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷基酯
在氩气下，在0℃下向化合物15(97mg，0.089mmol)在无水DCM(7mL)中的溶液中添加DMAP(2.2mg，0.018mmol)和TEA(87μL，0.625mmol)，随后添加甲苯磺酰氯(85mg，0.446mmol)。允许将反应混合物加温至室温。在反应完成后，将混合物用DCM(50mL)稀释，用水(3x 10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗的黄色油状物通过快速色谱法在10g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到95mg呈无色油状物的化合物16(85％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.03至1.30(m,9H)；2.41(s,3H)；3.32至3.61(m,50H)；4.10(m,2H)；4.65至5.03(大m,2H)；6.99(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.16至7.31(m,11H)；7.36至7.42(m,6H)；7.47(d,J＝8Hz,2H)；7.78(d,J＝1Hz,2H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.33,ES,m/z＝1239[M+H]+,m/z＝1237[M-H]-,m/z＝620[M+2H]2+,m/z＝1283[M-H+HCOOH]-。
化合物17：1-(38-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷基)-2-(乙氧基甲基)-N-三苯甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
在氩气下，向化合物16(94mg，0.075mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中添加叠氮化钠(24mg，0.379mmol)。在80℃下搅拌过夜后，将黄色反应混合物在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发。将残余物吸收在DCM(50mL)与水(10mL)的混合物中。将有机层用水(2x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法在5g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化，以得到81mg呈无色油状物的化合物17(96％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.08至1.28(m,9H)；3.30至3.70(m,52H)；4.62至5.09(m大,2H)；6.99(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.15至7.33(m,11H)；7.39(d,J＝7Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.25,ES,m/z＝1110[M+H]+,m/z＝541[M+2H-C2H5]2+,m/z＝1154[M-H+HCOOH]-。
实例13：1-(38-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂八-三十烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M5中所述的程序，将在1,4-二噁烷(2mL)中的化合物17(71mg，0.064mmol)用在1,4-二噁烷中的4N HCl(4mL)处理，以得到呈无色油状物的实例13(51mg，92％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.07至1.29(m,9H)；3.35至3.66(m,52H)；4.78(大s,2H)；6.53(大s,2H)；7.23(t,J＝7Hz,1H)；7.42(t,J＝8Hz,1H)；7.60(d,J＝8Hz,1H)；8.30(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝0.77,ES,m/z＝868[M+H]+,m/z＝420[M+2H-C2H5]2+,m/z＝912[M-H+HCOOH]-。
实例14：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-R848ADC
遵循通用方法M11制备实例14；将在74:6:20DPBS/1M HEPES/DMA中的mAb 1b(31.5mg，10.5mg/mL)与188μL的实例13在DMA中的溶液(13.6mM)反应过夜。将粗混合物使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化并且进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例14(28.8mg，3.6mg/mL，总产率91％)，其中DAR(HRMS)为4.1并且单体纯度为97.5％。
RP-HRMS:147422(裸mAb)；148669(D1)；149906(D2)；151148(D3)；152385(D4)；153624(D5)；154869(D6)；156105(D7)；157340(D8)；158560(D9)。
实例15：EphA2_hu2H11_R35R74-PEG12-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例15；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 2(10.5mg，6.95mg/mL)与63μL的实例13在DMA中的溶液(13.6mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例15(5.8mg，2.77mg/mL，总产率58％)，其中DAR(HRMS)为3.58并且单体纯度为97.7％。
RP-HRMS:149353(裸mAb)；150594(D1)；151836(D2)；153076(D3)；154317(D4)；155556(D5)；156797(D6)；158036(D7)；159274(D8)。
实例16：HER2_曲妥珠单抗-PEG12-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例16；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 3(11mg，6.14mg/mL)与67μL的实例13在DMA中的溶液(13.62mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在使用缓冲液A在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上再次渗滤后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例16(5.7mg，2.7mg/mL，总产率57％)，其中DAR(HRMS)为3.22并且单体纯度为98.3％。
RP-HRMS:148057(裸mAb)；149295(D1)；150538(D2)；151776(D3)；153014(D4)；154253(D5)；155493(D6)；156735(D7)；157966(D8)。
实例17：EGFR_西妥昔单抗-PEG12-R848ADC
遵循通用方法M12制备实例17；将在80:20缓冲液C/DMA中的mAb4(11.4mg，1.6mg/mL)与69μL的实例13在DMA中的溶液(13.6mM)反应过夜。将混合物用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用SuperdexTM 200pg基质(16/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩并且使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例17(5mg，2.73mg/mL，总产率44％)，其中DAR(HRMS)为3.9并且单体纯度为99.7％。
RP-HRMS:154043(D1)；155283(D2)；156515(D3)；157765(D4)；159004(D5)；160250(D6)；161488(D7)
实例18：B7H3_依诺妥珠单抗-PEG12-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例18；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 5(11.3mg，1.36mg/mL)与49μL的实例18在DMA中的溶液(18.92mM)反应过夜。将反应混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例18(6.3mg，2.86mg/mL，总产率57％)，其中DAR(HRMS)为3.83并且单体纯度为98.5％。
RP-HRMS:148003(裸mAb)；149244(D1)；150484(D2)；151723(D3)；152966(D4)；154206(D5)；155444(D6)；156684(D7)；157929(D8)。
实例19至24的合成：叠氮基-PEG24-R848和对应的ADC
化合物18：硫酸50-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)49,49-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十六氧杂五十烷基酯钠
遵循通用方法M4中所述的程序，由化合物11(222mg，0.244mmol)和化合物3(158mg，0.366mmol)制备化合物18并且获得了无色油状物(354mg，定量)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.04至1.26(m,9H)；3.31至3.68(m,66H)；3.78(m,2H)；4.66至4.99(m大,2H)；6.99(s,1H)；7.09(dd,J＝1和8Hz,1H)；7.15至7.32(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝9Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.36,ES,m/z＝1341[M+H]+,m/z＝1339[M-H]-,m/z＝631[M+2H-SO3H]2+。
化合物19：50-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-49,49-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十六氧杂五十-1-醇
遵循通用方法M3中所述的程序，由在30mL的吡啶与1,4-二噁烷的4:1混合物中的化合物18(350mg，0.256mmol)制备化合物19并且获得了无色油状物(258mg，79％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.03至1.31(m,9H)；3.34至3.55(m,68H)；4.54(t,J＝6Hz,1H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(dd,J＝1和8Hz,1H)；7.16至7.31(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.12,ES,m/z＝1261[M+H]+,m/z＝631[M+2H]2+,m/z＝1305[M-H+HCOOH]-。
化合物20：硫酸74-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基酯钠
遵循通用M4中所述的程序，由化合物19(256mg，0.203mmol)制备化合物20并且获得了无色油状物(308mg，88％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.01至1.33(m,9H)；3.33至3.66(m,98H)；3.78(t,J＝5Hz,2H)；4,75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.09(d,J＝8Hz,1H)；7.14至7.34(m,11H)；7.39(d,J＝8Hz,6H)；8.24(d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.38,ES,m/z＝1692[M-H]-,m/z＝847[M+2H]2+。
化合物21：74-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四-1-醇
遵循通用方法M3中所述的程序，由在30mL的吡啶与1,4-二噁烷的4:1混合物中的化合物20(305mg，0.177mmol)制备化合物21并且获得了无色油状物(199mg，69％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.05至1.31(m,9H)；3.33至3.61(m,100H)；4.55(t,J＝6Hz,1H)；4.76(大s,2H)；7.01(s,1H)；7.10(dd,J＝1和8Hz,1H)；7.16至7.33(m,11H)；7.40(d,J＝7Hz,6H)；8.25(d,J＝8Hz,1H)，LCMS(M1):tR＝1.13,ES,m/z＝1613[M+H]+,
m/z＝807[M+2H]2+,m/z＝1657[M-H+HCOOH]-。
化合物22：4-甲基苯磺酸74-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基酯
在氩气下，在0℃下向化合物21(197mg，0.122mmol)在无水DCM(14mL)中的溶液中添加DMAP(7.5mg，0.061mmol)和TEA(170μL，1.22mmol)，随后添加甲苯磺酰氯(186mg，0.976mmol)。允许将反应混合物加温至室温。在反应完成后，将反应混合物用DCM(50mL)稀释，用水(3x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗的黄色油状物通过快速色谱法在15g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)纯化，以得到194mg呈无色油状物的化合物22(90％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.06至1.30(m,9H)；2.42(s,3H)；3.34至3.78(m,98H)；4,11(m,2H)；4.76(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.10(d,J＝8Hz,1H)；7.15至7.34(m,11H)；7.40(d,J＝8Hz,6H)；7.49(d,J＝8Hz,2H)；7.79(d,J＝8Hz,2H)；8.25(d,J＝8Hz,1H)。LCMS(M2):tR＝4.83,ES,m/z＝1768[M+H]+,m/z＝884[M+2H]2+,m/z＝1812[M-H+HCOOH]-。
化合物23：1-(74-叠氮基-2,2-二甲基3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-N-三苯甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
在氩气下，向化合物22(189mg，0.106mmol)在无水DMF(10mL)中的溶液中添加叠氮化钠(34mg，0.534mmol)。在80℃下搅拌过夜后，将黄色反应混合物在真空中浓缩并且与甲苯共蒸发。将残余物吸收在DCM(75mL)与水(10mL)的混合物中。将有机层用水(2x10mL)和饱和盐水(2x10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法在15g硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)纯化，以得到143mg呈无色油状物的化合物23(81％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.12至1.27(m,9H)；3.34至3.70(m,100H)；4.75(大s,2H)；7.00(s,1H)；7.10(dd,J＝2和8Hz,1H)；7.16至7.34(m,11H)；7.40(d,J＝7Hz,6H)；8.25(d,J＝7Hz,1H)，LCMS(M1):tR＝1.23,ES,m/z＝1638[M+H]+,m/z＝819[M+2H]2+,m/z＝1682[M-H+HCOOH]-。
实例19：1-(74-叠氮基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M5中所述的程序，将在1,4-二噁烷(4mL)中的化合物23(141mg，0.086mmol)用在1,4-二噁烷中的4N HCl(8mL)处理，以得到呈无色油状物的实例19(118mg，98％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.89至1.03(m,9H)；3.10至3.48(m,100H)；4.55(大s,2H)；6.32(m,2H)；7.00(t,J＝8Hz,1H)；7.20(t,J＝8Hz,1H)；7.36(t,J＝8Hz,1H)；8.06(d,J＝8Hz,1H)，LCMS(M1):tR＝0.83,ES,m/z＝1396[M+H]+,m/z＝698.5[M+2H]2+。
实例20a：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC
遵循通用方法M12制备实例20a；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 1a(58mg，5.09mg/mL)与309μL的实例19在DMA中的溶液(9.55mM)反应过夜，然后添加62μL的实例19并且将反应混合物搅拌4h。将它使用经DPBS预平衡的SuperdexTM 200pg基质(26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化并且进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例20a(45mg，1.41mg/mL，总产率88％)，其中DAR(HRMS)为4.2并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:149171(D1)；150936(D2)；152706(D3)；154478(D4)；156247(D5)；158015(D6)；159782(D7)；161541(D8)。
实例20b：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC
将mAb 1c(10.15mL，10.495mg/mL)在20mM K2HPO4pH 7.5(10.96mL)中稀释并且与192μL的实例19在DMSO中的溶液(50mM)反应过夜。将粗反应混合物在(0.22μm，PVDF膜，密理博公司)上过滤并且使用SephadexTM G25基质(HiprepTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；最终获得呈无色透明溶液的实例20b(106mg，5mg/mL，定量)，其中DAR(HRMS)为3.69并且单体纯度为97.6％。
SEC-HRMS:147401(裸mAb)；149170(D1)；150939(D2)；152709(D3)；154479(D4)；156246(D5)；158015(D6)；159786(D7)；161536(D8)。
实例20c：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC
将mAb 1d(10.15mL，10.495mg/mL)在20mM K2HPO4pH 7.5(10.9mL)中稀释并且与221μL的实例19在DMSO中的溶液(50mM)反应过夜。将粗反应混合物在(0.22μm，PVDF膜，密理博公司)上过滤并且使用SephadexTM G25基质(HiprepTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；最终获得呈无色透明溶液的实例20c(106mg，5mg/mL，定量)，其中DAR(HRMS)为1.5并且单体纯度为98.8％。
RP-HRMS:147414(裸mAb)；149183(D1)；150952(D2)；152721(D3)；154490(D4)；156256(D5)。
实例20d：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG24-R848ADC
将mAb 1e(10.15mL，10.495mg/mL)在20mM K2HPO4pH 7.5(10.9mL)中稀释并且与221μL的实例19在DMSO中的溶液(50mM)反应过夜。将粗反应混合物在(0.22μm，PVDF膜，密理博公司)上过滤并且使用SephadexTM G25基质(HiprepTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化；最终获得呈无色透明溶液的实例20d(106mg，5mg/mL，定量)，其中DAR(HRMS)为3.6并且单体纯度为97.5％。
RP-HRMS:147406(裸mAb)；149181(D1)；150943(D2)；152718(D3)；154488(D4)；156249(D5)；158029(D6)；159799(D7)。
实例21：EphA2_hu2H11_R35R74-PEG24-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例21；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 2(10.5mg，7mg/mL)与85μL的实例19在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在使用缓冲液A再次渗滤后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例21(5.5mg，3.24mg/mL，总产率52％)，其中DAR(HRMS)为3.43并且单体纯度为98％。
RP-HRMS:149343(裸mAb)；151110(D1)；152879(D2)；154647(D3)；156415(D4)；158185(D5)；159952(D6)；161718(D7)；163496(D8)；165278(D9)。
实例22：HER2_曲妥珠单抗-PEG24-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例22；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 3(11mg，6.14mg/mL)与91μL的实例19在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上再次渗滤后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例22(5.85mg，3.55mg/mL，总产率53％)，其中DAR(HRMS)为3.4并且单体纯度为98.3％。
RP-HRMS:148059(裸mAb)；149836(D1)；151605(D2)；153374(D3)；155143(D4)；156909(D5)；158674(D6)；160442(D7)；162224(D8)。
实例23：EGFR_西妥昔单抗-PEG24-R848ADC
遵循通用方法M12制备实例23；将在80:20缓冲液C/DMA中的mAb4(11.4mg，1.6mg/mL)与94μL的实例19在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用SuperdexTM 200pg基质(16/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上浓缩并且使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例23(6.7mg，3.7mg/mL，总产率59％)，其中DAR(HRMS)为4.4(对还原的ADC分析后的重建DAR)并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:DARLC＝0.21；23423(裸LC)；25192(LC1)；DARHC＝1.99；52764(HC)；54525(HC1)；56298(HC2)；58065(HC3)；59832(HC4)。
实例24：B7H3_依诺妥珠单抗-PEG24-R848ADC
遵循通用方法M13制备实例24；将在80:20DPBS/DMA中的mAb 5(11.3mg，1.36mg/mL)与93μL的实例19在DMA中的溶液(10mM)反应过夜。将混合物使用80:20DPBS/DMA在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上渗滤，然后使用经最终水性缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在使用缓冲液A在(PES膜，50K，赛多利斯公司)上再次渗滤后，在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例24(4.4mg，2.68mg/mL，总产率39％)，其中DAR(HRMS)为4.2并且单体纯度为99.3％。
RP-HRMS:149788(D1)；151554(D2)；153321(D3)；155089(D4)；156859(D5)；158625(D6)；160389(D7)；162174(D8)。
叠氮基PEGn醛的合成
化合物24：2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醛
遵循通用方法M6中所述的程序，由2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇或PEG4-叠氮化物(200mg，0.912mmol)获得化合物24并且获得了无色油状物(161mg，81％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):3.40(t,J＝5Hz,2H)；3.50至3.65(m,10H)；4.19(s,2H)；9.57(s,1H)。
化合物25：23-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂二十三醛
使用戴斯-马丁试剂进行醛的替代性合成。在氩气下，将碳酸氢钠(159mg，0.625mmol)和戴斯-马丁高价碘化物(273mg，0.625mmol)添加到2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇或PEG8-叠氮化物(250mg，0.625mmol)在干DCM(5mL)中的溶液中。将由此获得的反应混合物在室温下搅拌2h。添加Na2S2O3(4mL)的水溶液并且将有机层用饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以得到300mg呈无色油状物的化合物25(定量)。
化合物26：35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五醛
遵循通用方法M6中所述的程序，由2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙-1-醇或PEG12-叠氮化物(1.69g，4.33mmol)获得化合物26并且获得了无色油状物(178mg，90％)。
实例25和26的合成：叠氮基-PEG4-3M012和对应的ADC
实例25：1-(14-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M7中所述的程序，由3M-012([12244966-68-4]，46mg，0.148mmol)和化合物24(32mg，0.147mmol)，获得呈无色油状物的实例25(40mg，53％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.92至1.20(m,9H)；3.39(遮蔽的m,21H)；6.56(s,2H)；6.66(大s,2H)；7.23(t,J＝8Hz,1H)；7.42(t,J＝8Hz,1H)；7.59(d,J＝8Hz,1H)；8.31(d,J＝8Hz,1H)。LCMS(M1):tR＝0.37,ES,m/z＝515[M+H]+。
实例26：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG4-3M-012ADC
遵循通用方法M12制备实例26；将在80/20DPBS/DMA中的mAb 1a(15.13mg，5.84mg/mL)与47μL的实例25在DMA中的溶液(14.09mM)反应过夜。将混合物使用经DPBS预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例26(10.1mg，1mg/mL，总产率66％)，其中DAR(HRMS)为4并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:148309(D1)；149195(D2)；150083(D3)；150970(D4)；151857(D5)；152744(D6)；153631(D7)；154532(D8)。
实例27和28的合成：叠氮基-PEG8-3M012和对应的ADC
实例27：1-(38-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十一氧杂-3-氮杂三十八烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M7中所述的程序，由3M-012([12244966-68-4]，200mg，0.638mmol)和化合物26(251mg，0.638mmol)，获得呈无色油状物的实例27(133mg，30％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.05(大s,6H)；1.14(t,J＝7Hz,3H)；3.33至3.63(m,37H)；4.66(大m,2H)；6.54(大s,2H)；7.23(t,J＝7Hz,1H)；7.41(t,J＝8Hz,1H)；7.59(d,J＝8Hz,1H)；8.31(d,J＝8Hz,1H)，LCMS(M1):tR＝0.39至0.43,ES,m/z＝691[M+H]+,m/z＝346[M+2H]2+。
实例28：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG8-3M012ADC
遵循通用方法M12制备实例28；将在80/20DPBS/DMA中的mAb 1a(15.13mg，5.84mg/mL)与52μL的实例27在DMA中的溶液(12.83mM)反应过夜。将混合物使用经DPBS预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例28(13.5mg，1.69mg/mL，总产率89％)，其中DAR(HRMS)为4并且单体纯度为97.7％。
RP-HRMS:148482(D1)；149545(D2)；150607(D3)；151667(D4)；152733(D5)；153797(D6)；154862(D7)；155921(D8)；156892(D9)。
实例29和30的合成：叠氮基-PEG12-3M012和对应的ADC
实例29：1-(26-叠氮基-2,2-二甲基-6,9,12,15,18,21,24-七氧杂-3-氮杂二十六烷基)-2-(乙氧基-甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M7中所述的程序，由3M-012([12244966-68-4]，76mg，0.242mmol)和化合物25(138mg，0.242mmol)，获得呈无色油状物的实例29(63mg，30％)。
NMR 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.05(m,6H)；1.14(t,J＝7Hz,3H)；2.59(m,2H)；3.35至3.57(m,49H)；3.59(m,2H)；4.53至5.06(大m,2H)；6.59(大s,2H)；7.23(t,J＝8Hz,1H)；7.41(t,J＝8Hz,1H)；7.60(dd,J＝1和8Hz,1H)；8.31(dd,J＝1和8Hz,1H)，LCMS(M1):tR＝0.49,ES,m/z＝867[M+H]+,m/z＝434[M+2H]2+。
实例30：CEACAM5_特赛妥单抗-PEG12-3M-012ADC
遵循通用方法M12制备实例30；将在80/20DPBS/DMA中的mAb 1a(15.13mg，5.84mg/mL)与89.79μL的实例29在DMA中的溶液(7.38mM)反应过夜。将混合物使用经DPBS预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例30(12.1mg，1.18mg/mL，总产率80％)，其中DAR(HRMS)为4.15并且单体纯度为99.8％。
RP-HRMS:147420(裸mAb)；148660(D1)；149900(D2)；151139(D3)；152378(D4)；153618(D5)；154856(D6)；156099(D7)；157338(D8)；158570(D9)。
实例31至43的合成：马来酰亚胺基丙酰基-PEG24-R848和对应的ADC
化合物27：1-(74-氨基-2,2-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺
遵循通用方法M14中所述的程序，由实例19(300mg，0.21mmol)制备化合物27并且获得了白色泡沫(270mg，92％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.05-1.30(m,6H)；1.14(t,J＝7Hz,3H)；2.87(t,J＝5Hz,2H)；3.20-3.70(m部分隐藏,96H)；4.50-5.20(m,4H)；6.40-6,65(m,2H)；7.22(td,J＝8,1Hz,1H)；7.41(td,J＝8,1Hz,1H)；7.59(dd,J＝8,1Hz,1H)；8.28(br d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.06,ES,m/z＝1414[M-H+HCOOH]-。
实例31：N-(74-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-73,73-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧杂七十四烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺甲酸盐
遵循通用方法M16中所述的程序，由化合物27(270mg，197μmol)和3-马来酰亚胺基丙酸琥珀酰亚胺基酯(CAS[55750-62-4]，55mg，197μmol)制备实例31并且获得了白色泡沫的甲酸盐(165mg，53％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1,05-1,30(m,6H)；1.15(t,J＝7Hz,3H)；2.28-2.37(m,2H)；3.15(q,J＝6Hz,2H)；3.25-3.70(m,96H)；4.60-5.20(m,4H)；6.55(br s,2H)；7.01(s,2H)；7.23(br t,J＝7Hz,1H)；7.41(br t,J＝7Hz,1H)；7.60(br d,J＝8Hz,1H)；8.01(t,J＝6Hz,1H)；8.19(s,1H)；8.29(br d,J＝8Hz,1H)；LCMS(M1):tR＝1.23,ES,m/z＝1521[M+H]+。
实例32：CEACAM5_特赛妥单抗_E152C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例32。将CEACAM5_特赛妥单抗_E152C(41.6mg，10.4mg/mL)在DPBS中的溶液与66μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与69μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(2.6mL，20％v/v)和34μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)浓缩(9mL，2.57mg/mL)后，将它使用经DPBS/10％DMA预平衡的SuperdexTM 200pg基质(26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化并且使用经缓冲液E预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例32(21.4mg，3.1mg/mL，总产率49％)，其中DAR(HRMS)为1.85并且单体纯度为99.8％。
RP-HRMS:148973(D1)；150458(D2)。
实例33：CEACAM5_特赛妥单抗_S239C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例33。将CEACAM5_特赛妥单抗_S239C(37mg，9.24mg/mL)在DPBS中的溶液与58μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与69μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.67mL，20％v/v)和34μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制，并且通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例33(20.0mg，4.4mg/mL，总产率54％)，其中DAR(HRMS)为1.8并且单体纯度为98.8％。
RP-HRMS:147455(裸mAb)；148976(D1)；150499(D2)。
实例34：CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例34。将CEACAM5_特赛妥单抗_K274C(34.7mg，8.68mg/mL)在DPBS中的溶液与53μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与66μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.86mL，20％v/v)和33μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制，并且通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例34(23.0mg，3.06mg/mL，总产率66％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为99.6％。
RP-HRMS:150412(D2)。
实例35：CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例35。将CEACAM5_特赛妥单抗_K290C(42mg，10.51mg/mL)在DPBS中的溶液与65.1μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与71μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.98mL，20％v/v)和41μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制，并且通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例35(28mg，4.07mg/mL，总产率68％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为99.7％。
RP-HRMS:150417(D2)。
实例36：CEACAM5_特赛妥单抗_K326C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例36。将CEACAM5_特赛妥单抗_K326C(42mg，10.47mg/mL)在DPBS中的溶液与115μL的158mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与55μL的71mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.86mL，20％v/v)和60μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)浓缩后，然后将它使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例36(19.4mg，2.99mg/mL，总产率46％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为98.6％。
RP-HRMS:150418(D2)。
实例37：CEACAM5_特赛妥单抗_K320C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例37。将CEACAM5_特赛妥单抗_K320C(43.4mg，9.65mg/mL)在DPBS中的溶液与108μL的180mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与57μL的68mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(2.2mL，20％v/v)和39μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制，并且通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例37(27.2mg，3.2mg/mL，总产率63％)，其中DAR(HRMS)为1.92并且单体纯度为99.6％。
RP-HRMS:149003(D1)；150533(D2)。
实例38：CEACAM5_特赛妥单抗_K340C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例38。将CEACAM5_特赛妥单抗_K340C(40.6mg，9.67mg/mL)在DPBS中的溶液与63μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与65μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.75mL，20％v/v)和32.4μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行纯化和配制，并且通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例38(28.7mg，4.29mg/mL，总产率71％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为97.1％。
RP-HRMS:150413(D2)。
实例39：CEACAM5_特赛妥单抗_S375C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例39。将CEACAM5_特赛妥单抗_S375C(40mg，9.96mg/mL)在DPBS中的溶液与63μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与74μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.73mL，20％v/v)和37μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60或26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩，并且使用经缓冲液E预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例39(25mg，3mg/mL，总产率63％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为99.8％。
RP-HRMS:150540(D2)。
实例40：CEACAM5_特赛妥单抗_N361C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例40。将CEACAM5_特赛妥单抗_N361C(60mg，10.77mg/mL)在DPBS中的溶液与150μL的100mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与152μL的25mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(3.6mL，20％v/v)和110μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它用超滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤浓缩至7mL(约8mg/mL)并且使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例40(43mg，4.67mg/mL，总产率73％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为97.9％。
RP-HRMS:150446(D2)。
实例41：CEACAM5_特赛妥单抗_K414C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例41。将CEACAM5_特赛妥单抗_K414C(49.2mg，9.84mg/mL)在DPBS中的溶液与142μL的100mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与94μL的25mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(4.1mL，20％v/v)和250μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它用超滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤浓缩至9mL(6.06mg/mL)并且使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例41(32.8mg，3.64mg/mL，总产率66.6％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为97.7％。
RP-HRMS:150419(D2)。
实例42：CEACAM5_特赛妥单抗_V422C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例42。将CEACAM5_特赛妥单抗_V422C(51.35mg，10.27mg/mL)在DPBS中的溶液与140μL的100mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与200μL的25mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(3.6mL，20％v/v)和200μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它用超滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤浓缩并且使用经缓冲液A预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例42(36.45mg，5.36mg/mL，总产率71％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为99％。
RP-HRMS:150478(D2)。
实例43：CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C-PEG24-R848ADC
遵循通用方法17制备实例43。将CEACAM5_特赛妥单抗_E152C_S375C(34.3mg，11.42mg/mL)在DPBS中的溶液与66.2μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(HiprepTM 26/10脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与118μL的50mM DHA溶液在室温下反应3小时，然后添加DMA(1.73mL，20％v/v)和37μL的实例31在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60或26/60脱盐柱，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，通过渗滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)进行浓缩，并且使用经缓冲液E预平衡的SephadexTM G25基质(HitrapTM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例43(12.2mg，2.41mg/mL，总产率46％)，其中DAR(HRMS)为3.75并且单体纯度为100％。
RP-HRMS:151984(D3)；153536(D4)。
实例44至47的合成：单甲基-和二甲基-马来酰亚胺基丙酰基-PEG24-R848和对应 的ADC
化合物28：3-(3-甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
遵循通用方法M15中所述的程序，由柠康酸酐(350mg，3.13mmol)制备化合物28并且获得了白色粉末(74mg，13％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1,9(s,6H)；2,5(t,2H)；3,6(t,2H)；12,4(s,1H)；LCMS(M1):tR＝0.96,ES,m/z＝281[M+H]+。
化合物29：3-(3,4-二甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
遵循通用方法M15中所述的程序，由2,3-二甲基马来酸酐(255mg，2.02mmol)制备化合物29并且获得了白色粉末(133mg，27％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):2,8(s,4H)；3,5(t,2H)；3,75(t,2H)；7(d,2H)；LCMS(M1):tR＝1.11,ES,m/z＝295[M+H]+。
实例44：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-3-(3-甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙酰胺
遵循通用方法M16中所述的程序，由化合物27(91.7mg，65.2μmol)和化合物28(18.8mg，65.2μmol)制备实例44并且获得了无色油状物和三氟乙酸盐(80mg，53％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.05-1.35(m,6H)；1.16(t,J＝7Hz,3H)；1.98(d,J＝2Hz,3H)；2.32(t,J＝7Hz,2H)；3.15(q,J＝6Hz,2H)；3.19-3.70(m,98H)；4.40-5.40(m,4H)；6.60(m,1H)；7.52(t,J＝8Hz,1H)；7.69(t,J＝8Hz,1H)；7.80(d,J＝8Hz,1H)；7.97(t,J＝5Hz,1H)；8.20-9.50(m,2H)；8.53(d,J＝8Hz,1H)；13.30(br s,1H)；LCMS(M1):tR＝1.28,ES,m/z＝512[M+3H]3+。
实例45：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-3-(3,4-二甲基-2,5-二氧代-吡咯-1-基)丙酰胺
遵循通用方法M16中所述的程序，由化合物27(84.6mg，61.7μmol)和化合物29(18.2mg，61.72μmol)制备实例45并且获得了无色油状物和呈三氟乙酸盐(82mg，80％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1,08-1.30(m,6H)；1.17(t,J＝7Hz,3H)；1.88(s,6H)；2.28-2.36(m,2H)；3.15(q,J＝6Hz,2H)；3.18-3.70(m,98H)；4.40-5.30(m,4H)；7.52(t,J＝8Hz,1H)；7.69(t,J＝8Hz,1H)；7.80(d,J＝8Hz,1H)；7.96(br t,J＝5Hz,1H)；8.20-9.40(m,2H)；8,53(d,J＝8Hz,1H)；13.31(br s,1H)；LCMS(M1):tR＝1.31,ES,m/z＝1549[M+H]+。
实例46：CEACAM5_特赛妥单抗_K290C-实例44ADC
遵循通用方法17制备实例46。将CEACAM5_特赛妥单抗_K290C(26mg，10.4mg/mL)在DPBS中的溶液与25.5μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与36μL的50mM DHA溶液在室温下反应3h，然后添加DMA(453μL，10％v/v)和25.5μL的实例44在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它用超滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤进行浓缩，使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，并且使用经缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例46(7.3mg，2.42mg/mL，总产率28％)，其中DAR(HRMS)为2并且单体纯度为99％。
RP-HRMS:150439(D2)。
实例47：CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例44ADC
遵循通用方法17制备实例47。将CEACAM5_特赛妥单抗_K274C(11.5mg，7.58mg/mL)在DPBS中的溶液与17.9μL的280mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与20μL的50mM DHA溶液在室温下反应3h，然后添加DMA(335μL，10％v/v)和32.3μL的实例44在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它用超滤(Ultra:PES膜，50K，密理博公司)通过渗滤进行浓缩，使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，并且使用经缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例47(7.7mg，0.96mg/mL，总产率67％)，其中DAR(HRMS)为1.57并且单体纯度为97.6％。
RP-HRMS:150438(D2)。
实例48和49的合成：PODS-PEG24-R848和对应的ADC
化合物30：5-[4-(5-甲基硫烷基-1,3,4-噁二唑-2-基)苯胺基]-5-氧代-戊酸
向如Bioconjugate Chemistry[生物共轭化学]2018,29(4),1364-1372中所述制备的4-(5-甲基硫烷基-1,3,4-噁二唑-2-基)苯胺(70mg，338μmol)在DCM(7mL)中的溶液中添加在DCM(1mL)中的戊二酸酐(46mg，405μmol)和THF(几滴)。将混合物在室温下搅拌48h，然后添加DIEA(6μL，338μmol)。在室温下搅拌1h，将反应混合物在减压下浓缩。将残余物用DCM稀释，用1M盐酸溶液洗涤并且在减压下浓缩。获得呈淡黄色固体的化合物30(96mg，89％产率)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.82(quin,J＝7.32Hz,2H)；2.28(t,J＝7.36Hz,2H)；2.40(t,J＝7.40Hz,2H)；2.76(s,3H)；7.80(d,J＝8.84Hz,2H)；7.87(d,J＝8.80Hz,2H)；10.29(s,1H)；12.11(s,1H)；LCMS(M5):tR(min)＝1.26,ES,m/z＝322[M+H+]+。
化合物31：5-[4-(5-甲基磺酰基-1,3,4-噁二唑-2-基)苯胺基]-5-氧代-戊酸
向化合物30(41mg，0.128mmol)在DCM(3mL)和DMF(0.5mL)中的溶液中分4次经24h添加mCPBA(总共243mg，1.41mmol)在DCM(4mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌48h并且在减压下浓缩。将残余物吸收在EtOAc中，过滤并且空气干燥。获得呈淡黄色固体的化合物31(23mg，51％产率)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.82(quin,J＝7.20Hz,2H)；2.29(t,J＝7.32Hz,2H)；2.42(t,J＝7.40Hz,2H)；3.70(s,3H)；7.86(d,J＝8.72Hz,2H)；8.04(d,J＝8.72Hz,2H)；10.36(s,1H)；12.11(s,1H)；LCMS(M3):tR(min)＝1.59,ES,m/z＝354[M+H+]+。
实例48：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-N'-[4-(5-甲基磺酰基-1,3,4-噁二唑-2-基)苯基]戊二酰胺
向化合物31(11.4mg，32.3μmol)在THF(2mL)中的溶液中添加EDC(5.2μL，29.4μmol)和在THF(1mL)中的HOBT(3.97mg，29.4μmol)。将所得溶液在室温下搅拌30min，之后添加在THF(2.5mL)中的化合物27(40.3mg，29.4μmol)和DIEA(5.1μL，29.4μmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h，然后在减压下浓缩。将残余物用DCM稀释，用0.1M盐酸溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经MgSO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过快速色谱法在用1//0至0//1的DCM//DCM/MeOH/H2O(9/1/0.1)洗脱的硅胶(4g Interchim柱)上纯化，以提供呈淡黄色油状物的实例48(20mg，40％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.82(quint,J＝7.44Hz,2H)；2.15(t,J＝7.36Hz,2H)；2.37(t,J＝7.40Hz,2H)；3.34-3.60(m,98H)；3.70(s,3H)；6.58(s,2H)7.86(d,J＝8.80Hz,2H)；7.89(t,J＝5.68Hz,1H)；8.04(d,J＝8.80Hz,2H)；10.33(s,1H)。LCMS(M3):tR(min)＝2.04,ES,m/z＝854[M+2H+]2+。
实例49：CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例48ADC
遵循通用方法17制备实例49。将CEACAM5_特赛妥单抗_K274C(34.7mg，8.68mg/mL)在DPBS中的溶液与59μL的272mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与69μL的50mM DHA溶液在室温下反应3h；然后向2.3mL的此粗反应混合物(4.79mg/mL)中添加DMA(515μL)和60μL的实例48在DMA中的溶液(5mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，并且使用经缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质(NAP10TM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例49(6.7mg，4.47mg/mL，总产率61％)，其中DAR(HRMS)为1.96并且单体纯度为99.6％。
RP-HRMS:148962(D1),150616(D2),152240(D3)。
实例50和51的合成：碘乙酰胺基-PEG24-R848和对应的ADC
实例50：N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-2-碘-乙酰胺
向化合物27(20mg，14.6μmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIPEA(3μL，17.5μmol)和在DCM(0.5mL)中的碘乙酸酐(6.4mg，17.5μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后加载到Sephadex LH20柱(8g的Sephadex LH-20m树脂，先前用EtOAc洗涤)上。将柱用EtOAc(3mL/min)洗脱，将含有化合物的级分合并，并且浓缩。将粗产物使用Macherey Nagel C18柱筒(25g)通过色谱法进一步纯化并且用5//95至90//10的CH3CN//H2O/TFA(99.9/0.1)洗脱以提供实例50，获得了无色油状物(13mg，60％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):6.54(s,2H)；3.34至3.60(m,98H)；3.19(q,J＝5.56Hz,2H)；3.65(s,2H)；LCMS(M3):tR(min)＝1.97,ES,m/z＝770[M+2H+]2+。
实例51：CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例50ADC
遵循通用方法17制备实例51。将CEACAM5_特赛妥单抗_K274C(34.7mg，8.68mg/mL)在DPBS中的溶液与59μL的272mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与69μL的50mM DHA溶液在室温下反应3h；然后向2.3mL的此粗反应混合物(4.79mg/mL)中添加DMA(560μL)、1N HEPES(57μL)和15μL的实例50在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，并且使用经缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质(NAP10TM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例49(5.7mg，3.79mg/mL，总产率52％)，其中DAR(HRMS)为1.79并且单体纯度为99.6％。
RP-HRMS:148745(D1),150187(D2)。
实例52和53的合成：苯基丙烯酰胺基-PEG24-R848和对应的ADC
实例52：(E)-N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-1,1-二甲基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]-4-氧代-4-苯基-丁-2-烯酰胺
在Ar下在-10℃下向(E)-4-氧代-4-苯基-丁-2-烯酸(14.5mg，81μmol)中添加DMF(2mL)、氯甲酸异丁酯(10.7μL，81μmol)和4-甲基吗啉(6.5μL，59μmol)。将反应混合物在-10℃下搅拌10min并且加温至室温持续15min，以提供混合酸酐。向化合物27(20mg，14.6μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加4-甲基吗啉(2.4μL，22μmol)并且将溶液在Ar下在室温下搅拌5min，之后在-10℃下添加575μL的混合酸酐溶液。将反应混合物在-10℃下搅拌15min，然后在室温下搅拌30min并且在压力下浓缩。将粗产物通过快速色谱法在用100/0至95/5的DCM/MeOH洗脱的二醇硅胶(4gMacherey-Nagel)上纯化，以提供呈无色油状物的实例52(14.4mg，65％)。
NMR 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):6.52(s,2H)；3.34至3,60(m,98H)；8.68(t,J＝5.36Hz,1H)；8.01(d,J＝7.20Hz,2H)；7.59(d,J＝8.00Hz,2H)；7.70(t,J＝7.40Hz,2H)；LCMS(M4):tR(min)＝1.47,ES,m/z＝1530[M+H+]+。
实例53：CEACAM5_特赛妥单抗_K274C-实例52ADC
遵循通用方法17制备实例53。将CEACAM5_特赛妥单抗_K274C(34.7mg，8.68mg/mL)在DPBS中的溶液与59μL的272mM DTT溶液在37℃下反应45min。在使用经DPBS缓冲液预平衡的SephadexTM G25基质(PD10TM脱盐柱，通用电气医疗集团)凝胶过滤后，将还原的抗体与69μL的50mM DHA溶液在室温下反应3h；然后向2.3mL的此粗反应混合物(4.79mg/mL)中添加DMA(560μL)和15μL的实例52在DMA中的溶液(20mM)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将它使用在DPBS/10％DMA(v/v)中预平衡的Superdex 200pg基质(16/60，通用电气医疗集团)通过凝胶过滤进行纯化，并且使用经缓冲液F预平衡的SephadexTM G25基质(NAP10TM脱盐，通用电气医疗集团)进行配制。在无菌过滤后最终获得呈无色透明溶液的实例49(7.2mg，3.79mg/mL，总产率65％)，其中DAR(HRMS)为1.94并且单体纯度为99.2％。
RP-HRMS:148887(D1),150421(D2),151950(D3)。
药理学活性
实例A：通过体外测定评价式(II)的化合物/缀合物对人TLR7或人TLR8的刺激
使根据本披露的式(II)的化合物/缀合物、R848和3M012经受药理学测试，以确定其作为TLR7和TLR8激动剂的活性。R848和3M012是熟知的TLR7/8激动剂。
分别使用亲本HEK-BlueTMhTLR7细胞和工程化的表达肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR7细胞作为报告细胞进行以下测试，这些测试涉及测量本披露的一些化合物对人TLR7通路的体外活性。
分别使用亲本HEK-BlueTMhTLR8(#hkb-htlr8)细胞和工程化的表达肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR8细胞作为报告细胞进行测试，这些测试涉及测量本披露的一些化合物对人TLR8通路的体外活性。
以下所述的活性(关于人TLR7或人TLR8)由半最大有效浓度(EC50)给出，该半最大有效浓度对应于获得50％激活所需的浓度。EC50越低，产生最大激活的50％所需的化合物浓度就越低并且效力就越高。以下EC50在1至300nM之间被认为展现出良好的通路激活，并且EC50≥1000nM被认为展现出不存在通路激活。
R848和3M012的EC50已根据以下测试进行了测试。
根据制造商的说明书，使用来自安维沃根公司(InvivoGen)的HEK-BlueTMhTLR7细胞(#hkb-htlr7)和HEK-BlueTMhTLR8细胞(#hkb-htlr8)以及工程化的表达肿瘤抗原的细胞。HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞通过以下方式获得：在HEK293细胞中共转染hTLR7或hTLR8基因和经优化的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，该报告基因被置于与五个NF-κB和AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下。表达人肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR7和hTLR8细胞通过以下方式获得：在亲本细胞中转染肿瘤抗原基因，随后进行多克隆选择以富集过表达肿瘤抗原的细胞。用TLR7/8配体刺激激活了NF-kB和AP-1，其诱导SEAP的产生。将细胞以3.10E4个细胞/孔接种在96孔板中，并且在37℃、5％CO2下孵育24小时，之后添加待评价的缀合物。随后，将细胞用每种化合物的3倍连续稀释液(0.01nM至1μM)在37℃、5％CO2下孵育96小时。接下来，收获20μL上清液并且与200μL的QUANTI-BlueTM溶液一起孵育。在37℃、5％CO2下孵育3小时后，通过用Envision微孔板读取器读取620nm处的光密度(OD)来评估SEAP活性，并且计算半最大有效浓度(EC50)并且用于对化合物进行排序。
结果总结于下表中。
表1a：
NT＝未测试
表1b：
表1c：
表1d：
以上结果表明，本披露的式(II)的化合物/缀合物在工程化的表达肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR7细胞中很好地激活TLR7通路，但在不表达肿瘤抗原的亲本细胞中不激活。本披露的式(II)的化合物/缀合物对TLR7通路的激活取决于在细胞的膜表面的肿瘤抗原的表达。
表2：
以上结果表明，无论在亲本或工程化的表达肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR8细胞中，本披露的式(II)的化合物/缀合物都不激活TLR8通路。考虑到R848能够在亲本HEK-BlueTMhTLR8(EC50：1.01μM)和工程化的表达肿瘤抗原的HEK-BlueTMhTLR8(EC50：0.905μM)中激活TLR8通路，这些结果是出乎意料的。这意味着按照本披露的式(II)的化合物/缀合物的TLR7/8激动剂不激活TLR8通路，而它们能够激活TLR7通路，如表1所例示的。
已知TLR7和TLR8受体触发促成不同细胞因子分泌表型的不同信号传导通路，本披露的式(II)的化合物/缀合物激活TLR7通路但不激活TLR8通路的这种针对性对于治疗性用途是值得注意地有利的。
TLR7通路的激活优先诱导分泌1型干扰素和IFN调节的趋化因子(诸如I-TAC(CXCL11)和IP-10(CXCL10))，而TLR8通路的激活主要诱导促炎性细胞因子和趋化因子，包括IL6、TNFα、IL-12和MIP-1α(CCL3)(Gorden等人，2005)。IL6和TNFα属于在患有细胞因子释放综合征(CRS)的患者的血清中发现升高的核心细胞因子，CRS可能引起流感样症状而且还可能引起可能危及生命的非特异性和全身性症状(随CRS的分级而定)。
此外，已描述了静脉内抗体-TLR8激动剂缀合物在非人灵长类动物中诱导急性过敏样反应(WO 2020/056008)。
因此，通过仅激活TLR7通路而不激活TLR8通路，本披露的式(II)的化合物/缀合物对于限制不良反应(诸如限制受治疗患者的CRS)并且确保静脉内施用的治疗性用途特别有利。
实例B：通过体外测定评价表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞的细胞结合(表观亲和力)：
使根据本披露的式(II)的化合物/缀合物经受药理学测试，以确定它们与表达人CEACAM5的细胞的细胞结合(表观亲和力)。
使用表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞进行以下测试，这些测试涉及测量本披露的式(II)的一些化合物/缀合物的细胞结合。
以下所述的活性由半最大有效浓度(EC50)给出，该半最大有效浓度对应于获得50％细胞结合所需的浓度。EC50越低，产生最大结合的50％所需的式(II)的化合物/缀合物的浓度就越低并且效力就越高。
以下EC50在1至10nM之间被认为展现出细胞结合。
将所测试的化合物/缀合物用Alexa Fluor 488(AF488)共价标记。将表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞以2.10E5个细胞/孔接种在96孔板中，并且用每种AF488标记的化合物的2倍连续稀释液(1.3nM至167nM)在4℃下孵育1小时。在用PBS的洗涤步骤后，使用胰蛋白酶/EDTA将细胞脱离并且在VYB流式细胞仪(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))上分析。平均荧光强度值获自直方图并且用于绘制结合曲线。计算半最大有效浓度(EC50)并且用于对化合物进行排序。
表3：
以上结果表明，本披露的式(II)的化合物/缀合物与表达CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞很好地结合。
实例C：通过体外测定评价表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞对式(II)的化合物/缀合物的内化：
使根据本披露的式(II)的化合物/缀合物经受药理学测试，以确定它们的内化能力。
使用表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR8细胞进行以下测试，这些测试涉及测量本披露的式(II)的一些化合物/缀合物的内化。
以下所述的活性由内化的式(II)的化合物/缀合物的量给出，该量对应于在37℃、5％CO2下孵育4、24、48和72小时时测量的内化荧光强度(内化MFI)的中值。内化MFI越高，内化的式(II)的化合物/缀合物的量越大。
以下内化MFI值>1000被认为展现出所测试的式(II)的化合物/缀合物在细胞中的内化。以下内化MFI值<1000被认为展现出不存在内化。
将所测试的式(II)的化合物/缀合物用Alexa Fluor 488(AF488)共价标记。将表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR8细胞以1.10E5个细胞/孔接种在96孔板中并且用10μg/ml的AF488标记的化合物在37℃、5％CO2下孵育4、24、48和72小时。然后，通过在4℃下孵育板来停止内化；将抗AF488抗体(英杰公司(Invitrogen)，A11094)以50μg/ml添加在每孔中并且在4℃下孵育45min，以猝灭来自细胞表面的荧光信号，保存在37℃、5％CO2的孵育阶段期间被细胞内化的化合物的荧光信号。在用PBS的洗涤步骤后，使用胰蛋白酶/EDTA将细胞脱离并且在VYB流式细胞仪(美天旎生物技术公司)上分析。内化荧光强度(内化MFI)中值获自直方图并且用于确定被表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和表达人CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR8细胞内化的式(II)的化合物/缀合物的量。
表4：
表5：
以上结果表明，本披露的式(II)的化合物/缀合物被表达CEACAM5的HEK-BlueTMhTLR7和HEK-BlueTMhTLR8细胞很好地内化并且随孵育时间积聚到细胞中。式(II)的化合物/缀合物的内化取决于在细胞表面表达的CEACAM5，因为不识别任何膜蛋白的不相关的人IgG1不被内化并且不随着孵育时间积聚。这确认了本披露的式(II)的化合物/缀合物的内化在两种细胞系中都是CEACAM5介导的。
实例D：通过体外测定评价人THP-1单核细胞的刺激
使根据本披露的式(II)的化合物/缀合物经受药理学测试，以确定它们对在膜表面表达Fc受体的人单核细胞的活性，这些Fc受体显示出对式(II)的化合物/缀合物的Fc部分的结合特异性。
使用THP1-DualTM细胞作为报告单核细胞进行以下测试，这些测试涉及测量本披露的式(II)的一些化合物/缀合物的体外活性。
以下所述的活性由半最大有效浓度(EC50)给出，该半最大有效浓度对应于获得50％激活所需的浓度。EC50越低，产生最大激活的50％所需的化合物浓度就越低并且效力就越高。
以下EC50在0.3至400nM之间被认为展现出激活；EC50≥1000nM被认为展现出不存在激活。
根据制造商的说明书使用来自安维沃根公司的THP1-DualTM细胞(#thpd-nfis)。通过在人THP-1单核细胞中稳定整合两种诱导型报告构建体获得细胞：被置于与五个NF-κB和三个c-Rel结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下的优化的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因和被置于与五个干扰素(IFN)刺激的反应元件融合的ISG54最小启动子的控制下的分泌型Lucia萤光素酶基因。
因此，THP1-DualTM细胞允许通过监测SEAP的活性来研究NF-κB通路的激活，以及通过评估Lucia萤光素酶的活性来研究干扰素调节因子通路的激活。用TLR7、TLR7/8或TLR8配体刺激THP1-DualTM细胞激活了NF-kB和c-Rel，其诱导SEAP的产生，如以下记录的。
表6：
将细胞以1.10E5个细胞/孔接种在96孔板中，并且随后用每种化合物的3倍连续稀释液(0.01nM至1μM)在37℃、5％CO2下孵育96小时。接下来，收获20μL上清液并且与200μL的QUANTI-BlueTM溶液一起孵育。在37℃、5％CO2下孵育3小时后，通过用Envision微孔板读取器读取620nm处的光密度(OD)来评估SEAP活性，并且计算半最大有效浓度(EC50)并且用于对式(II)的化合物/缀合物进行排序。
结果总结于下表中。
表7a：
表7b：
以上结果表明，本披露的式(II)的化合物/缀合物激活THP1dual细胞中的NFkB通路。这意味着本披露的式(II)的化合物/缀合物经由抗体的Fc部分结合免疫细胞，内化并且激活NFkB通路。
实例E：用于评价缀合物的免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤活性的体外测定
使根据本披露的缀合物经受药理学测试，以确定它们经由免疫细胞激活的肿瘤细胞杀伤活性。
使用免疫细胞杀伤测定进行以下测试，该免疫细胞杀伤测定包括将人外周血单个核细胞(PBMC)和NucLight红标记的人MKN-45肿瘤细胞共培养，这些测试涉及测量本披露的一些化合物的体外肿瘤细胞杀伤活性。此免疫细胞杀伤测定允许与肿瘤细胞数量的实时自动分析结合来直接测量免疫细胞介导的MKN-45肿瘤细胞杀伤。
使用MKN-45(胃肿瘤细胞系，德国微生物菌种保藏中心(DSMZ Germany))，因为它们呈现了非常高的CEACAM5表达(抗原结合能力≈3.10E5个受体/细胞)。为了在不改变其功能的情况下实时计数活MKN-45细胞，将MKN45细胞染色，因为基于慢病毒的标记试剂能够表达核限制性红色(Nuclight Red)荧光蛋白。
将NucLight红标记的人MKN-45细胞以7.5.10E3个细胞/孔(80μl)接种在96孔板中，并且随后在37℃、5％CO2下孵育24小时。然后，在孔中添加本披露的缀合物。将所有缀合物在含20％FBS的RPMI中稀释并且以10nM的最终浓度添加在孔中。
通过Ficoll密度梯度离心从获自健康供体的外周血样品分离PBMC。将新鲜分离的PBMC用PBS洗涤两次并且重悬在补充有20％FBS的RPMI-1640培养基中并且以1:30的比率(即，80μl中2.25 10E5个PBMC)添加到Nuclight红MKN-45肿瘤细胞中。
然后将板放置在活细胞分析装置中。使用逐细胞分析模块量化NucLight红标记的MKN-45肿瘤细胞随时间变化的数量。
以下所述的活性通过120小时孵育后的免疫细胞介导的杀伤活性的百分比给出。百分比越高，杀伤活性就越高。以下百分比值>20被认为展现出所测试的化合物对细胞的显著杀伤活性。以下百分比值<20被认为展现出不存在活性。
以上实例表明，本披露的缀合物引发免疫介导的肿瘤细胞杀伤，并且因此显示出治疗性作用，尤其是作为有前途的癌症治疗。
本披露的式(I)的化合物/有效载荷能够被缀合，并且式(II)的化合物/缀合物显示出良好的溶解度和良好的稳定性。
本披露的式(II)的化合物/缀合物能够选择性刺激TLR7通路而不刺激TLR8通路，通过抗体与肿瘤靶标结合并且内化到靶细胞内，以FcyR依赖性结合和TLR7激活刺激免疫细胞，并且最终由激活的免疫细胞提供肿瘤细胞杀伤。
此外，式(II)的化合物/缀合物(通过不刺激TLR8)是具有较少不良事件(诸如与NFK-β通路有关联的不良事件，例如CRS)的用于治疗性用途并且特别用于预防和/或治疗癌症的良好候选物。
应理解，本文所述的实例和实施例仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变将是本领域技术人员所想到的并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
因此，在其另一个方面，本披露提供了包含至少一种根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐的药剂。
根据本披露的另一个方面，本披露还涉及根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，用作药剂。
根据本披露的另一个方面，本披露还涉及根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，用于疗法。
这些药剂治疗性地使用，尤其是用于预防和/或治疗可受益于免疫系统激活的疾病或障碍。
这些药剂治疗性地使用，尤其是用于预防和/或治疗可受益于免疫系统激活的疾病或障碍，例如预防和/或治疗细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病，诸如皮肤病变或皮肤癌(例如，外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤)；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应(例如，过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应)；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷，例如预防和/或治疗癌症。
在实施例中，是本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，用于预防和/或治疗癌症。
预防和/或治疗实体癌或液体癌是可能的。
在实施例中，癌症选自骨癌、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、甲状腺癌、头颈癌。
在另一个实施例中，是本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，用于抗肿瘤疫苗。
根据本披露的另一个方面，本披露还涉及预防和/或治疗以上指示的病理病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐。
在此治疗方法的实施例中，受试者是人。
本披露还涉及根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐用于制造药剂的用途，该药剂可用于预防和/或治疗以上指示的任何病理病症，例如可用作抗肿瘤疫苗或用于预防和/或治疗癌症。
本披露的式(II)的化合物/缀合物也可以在单一疗法中使用或与放射疗法或化学疗法组合使用。例如，靶向化学疗法、分子靶向疗法(诸如干扰肿瘤发生和肿瘤生长所需的特定靶分子的药物、干扰癌细胞新陈代谢的药物)、免疫疗法(包括但不限于检查点抑制剂、细胞免疫疗法、抗体疗法和细胞因子疗法)、基于放射疗法的模式、抗血管生成疗法或辅助疗法或新辅助疗法。
式(II)的化合物/缀合物可以单独使用或与至少一种其他的抗癌剂组合使用。
根据本披露的另一个方面，本披露涉及药物组合物，这些药物组合物包含有效剂量的至少一种根据本披露的式(II)的化合物/缀合物或其药学上可接受的盐，以及还有至少一种药学上可接受的赋形剂。
根据所希望的药物形式和施用方法，所述赋形剂选自本领域技术人员已知的惯用赋形剂。
适当的单位施用形式包括眼内和鼻内施用形式；用于吸入性、外用、透皮、皮下、肌内或静脉内施用的形式；直肠施用形式和植入物。对于外用应用，可以在乳膏、凝胶、软膏或洗剂中使用根据本披露的化合物。
序列表
-特赛妥单抗
>LC，抗CEACAM5_hyb_769_4DVL1c_4DVH1a_IgG1
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO.1)
>HC，抗CEACAM5_hyb_769_4DVL1c_4DVH1a_IgG1
EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO.2)
-Hu2H11-R35-R74
>LC
DVVMTQTPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLIHSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSRLDSGVPDRFTGSGAGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.3)
>HC
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTAYYMHWVKQSPVQSLEWIGLVNPYNGFSSY
NQKFQGKASLTVDRSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCAREFYGYRYFDVWGQGTAVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO.4)
-曲妥珠单抗
>LC
IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS
RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.5)
>HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTR
YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.6)
-西妥昔单抗
>LC
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS
RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.7)
>HC
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYN
TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.8)
-依诺妥珠单抗
>LC
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.9)
>HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYY
ADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELV
GGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQ
YNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.10)
在以上序列表与所附序列表中披露的序列之间存在任何差异的情况下，正确的序列是本披露中以上披露的序列。

Claims (17)

1.一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团；并且
R6表示-L1-RCG1基团或-RCG1基团；
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至RCG1并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被-NH2基团取代，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至RCG1并且-NH-连接至R5；
RCG1表示：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，诸如-O-，并且
Ra表示氢原子，-(C1-C6)烷基，-(C3-C7)环烷基，-(C2-C6)烯基，-(C6-C10)芳基，包含4至9个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的-(C5-C10)杂芳基，或包含2至6个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C7)杂环烷基，所述-(C6-C10)芳基、-(C5-C10)杂芳基和/或-(C3-C7)杂环烷基任选地被1至5个选自以下的原子/基团取代：诸如氟原子的卤素原子、-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)烷氧基、羟基、氧代基、硝基和氰基；或
(ii)以下反应性基团中的一个：马来酰亚胺基基团；经取代的马来酰亚胺基，诸如卤代乙酰胺基基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基，诸如甲基；Cl-；N3-；HO-；HS-；活化的二硫化物，诸如H2N-；HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分，例如DBCO-胺或BCN或MFCO苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如 基团；基团；O-烷基羟胺或Pictet-Spengler反应底物，诸如例如RCG1是N3-；马来酰亚胺基经取代的马来酰亚胺基 苯基噁二唑基甲基砜基团 基团；I-CH2-C(＝O)-NR21-基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基；或基团。
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是3、7、11或23。
3.根据权利要求1或2所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1表示-CH2-O-C2H5基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2表示-CH2-C(CH3)2-基团。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3表示-O-或-NH-。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4表示氢原子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5表示-CH2-CH2-基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，
-其中R6表示RCG1基团，RCG1是-N3基团或I-CH2-C(＝O)-NH-基团，或者-其中R6表示-L1-RCG1基团，L1是-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团、-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团或-NH-基团，并且RCG1是马来酰亚胺基基团、经取代的马来酰亚胺基 基团；或苯基噁二唑基甲基砜基团(PODS)，诸如
9.根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物选自由以下组成的组：
10.一种式(II)的化合物或其药学上可接受的盐
其中
n是1至50的整数，例如2至30，诸如3至25，例如3、7、11或23；
R1表示氢原子、-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)亚烷基-NH-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷基，例如-(C1-C6)亚烷基-O-(C1-C6)烷基，诸如-CH2-O-C2H5基团；
R2表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-C(CH3)2-基团；
R3表示-O-、-NH-或-N((C1-C6)烷基)-基团，例如-O-或-NH-；
R4表示氢原子、-(C1-C6)烷基或-(C1-C6)烷氧基，例如氢原子；
R5表示-(C1-C6)亚烷基-基团，例如-CH2-CH2-基团；并且
R7表示-L1-G-Ab基团或-G-Ab基团，
L1表示：
--NH-；
--C(＝O)-NH-，例如-C(＝O)-连接至G并且-NH-连接至R5；
--(C1-C6)亚烷基-R8-C(＝O)-NH-基团，R8是-(C3-C10)亚环烷基-基团或包含2至9个碳原子和1至4个选自氧、氮、硫、-S(O)-和-SO2-的杂原子的-(C3-C10)杂亚环烷基-基团，例如L1是-(CH2)2-哌啶基-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
--NH-C(＝O)-(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，例如L1是-NH-C(＝O)-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，一个-NH-连接至G并且另一个-NH-连接至R5；或
--(C1-C6)亚烷基-C(＝O)-NH-基团，-(C1-C6)亚烷基-基团任选地被NH2基团取代，例如-CH2-CH(CH2-NH2)-C(＝O)-NH-基团、-(CH2)2-C(＝O)-NH-基团或-(CH2)3-C(＝O)-NH-基团，例如-(C1-C6)亚烷基-基团连接至G并且-NH-连接至R5；
-Ab表示抗体，例如单克隆抗体；并且
-G表示如权利要求1中定义的RCG1与存在于该抗体上的反应性基团RCG2之间的反应的产物，例如G选自由以下组成的组：
例如当R7是-L1-G-Ab时，G基团的左侧连接至Ab并且G基团的右侧连接至L1，或当R7是-G-Ab时直接连接至R5，
例如，G表示以下基团：
11.根据权利要求10所述的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中RCG2选自由以下组成的组：
(i)由存在于该抗体的表面的赖氨酸残基的侧链携带的ε-氨基(ε-NH2基团)；
(ii)该抗体的重链或轻链的N末端氨基酸的α-氨基(α-NH2基团)；
(iii)铰链区的糖基团；
(iv)通过还原该抗体的链内二硫键产生的半胱氨酸残基的巯基(-SH基团)，或该抗体的工程化半胱氨酸残基的-SH基团；
(v)由存在于该抗体的表面的谷氨酰胺残基的侧链携带的酰胺基团(-C(O)NH2基团)；
(vi)使用甲酰甘氨酸生成酶引入的醛基团(-C(O)H基团)；以及
(vii)任选地借助修饰剂引入的RCG2基团。
12.根据权利要求10所述的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
-当RCG1表示N-羟基琥珀酰亚胺酯时，RCG2表示-NH2基团；
-当RCG1表示马来酰亚胺基官能团、卤代乙酰胺基官能团、氯原子或活化的二硫化物时，RCG2表示-SH基团；
-当RCG1表示-N3基团时，RCG2表示HC≡C-或活化的C≡C，诸如环辛炔部分；
-当RCG1表示-OH或-NH2基团时，RCG2表示羧酸或酰胺官能团；
-当RCG1表示-SH基团时，RCG2表示马来酰亚胺基官能团、卤代乙酰胺基官能团或活化的二硫化物官能团；
-当RCG1表示HC≡C-或活化的C≡C时，RCG2表示-N3基团；
-当RCG1表示O-烷基羟胺官能团或Pictet-Spengler反应底物时，RCG2表示醛或酮官能团。
13.根据权利要求10所述的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物选自由以下组成的组：
其中Ab表示抗体，例如单克隆抗体。
14.一种用于制备根据权利要求10至13中任一项所定义的式(II)的化合物的方法，该方法包括至少以下步骤：
(i)使以下接触并且反应：
-任选地借助修饰剂修饰的包含反应性RCG2基团的抗体Ab的任选缓冲的水溶液，
和
-根据权利要求1至9中任一项所定义的式(I)的化合物的溶液，该化合物包含反应性RCG1基团；
式(I)的化合物的RCG1基团对该抗体的RCG2有反应性以通过共价键形成G基团并且形成式(II)的化合物；
(ii)并且然后任选地将步骤(i)中形成的式(II)的化合物与未反应的式(I)的化合物和/或与未反应的该抗体和/或与可能已形成的任何聚集体分离。
15.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求10至13中任一项所述的式(II)的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
16.根据权利要求10至13中任一项所述的式(II)的化合物，用作药物。
17.根据权利要求10至13中任一项所述的式(II)的化合物，用于预防和/或治疗可受益于免疫系统激活的疾病或障碍，例如用于预防和/或治疗细胞增殖性疾病；癌症；慢性髓细胞性；毛细胞白血病；皮肤疾病，诸如皮肤病变或皮肤癌，例如外生殖器和肛周疣/尖锐湿疣、生殖器疱疹、光线性角化病、基底细胞癌或皮肤T细胞淋巴瘤；自身免疫病；炎性疾病；呼吸系统疾病；脓毒症；变态反应，例如过敏性鼻炎或呼吸系统变态反应；哮喘；移植物排斥；移植物抗宿主病和免疫缺陷，例如预防和/或治疗癌症。
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