KR102101806B1 - 항-인간-her3 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분리된 항-인간-HER3 항체, 또는 이의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 HER-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 HER-3의 세포외 도메인에 결합하기 위해 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체와 경쟁하는, 분리된 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에 기재된 항체는 암 치료에 유용하다.

Description

항-인간-HER3 항체 및 이의 용도{ANTI-HUMAN-HER3 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 항-인간-HER3 항체, 및 진단 및 치료 방법에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.

수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase: RTK)의 인간 상피 성장 인자 수용체 ErbB/HER 패밀리는 4개의 구성원을 포함한다: EGFR(ErbB1/HER1), HER2(c-Neu, HER2), HER3(HER3) 및 HER4(HER4). HER 수용체는 1 내지 4로 표시되고, 막관통 도메인 및 시그날링 경로(signalling pathway)에 연결하기 위한 키나제 도메인을 포함하는 세포내 C-말단부가 이어지는 4개의 구조적 도메인으로 구성된 세포외 글리코실화 도메인(domain)을 포함한다. HER3을 제외하고, 세포내 영역은 티로신 키나제 활성을 포함한다. 시그날링은 리간드-유도 수용체 다이머화, 및 그 후에 세포질 시그날링 경로의 활성화를 유도하는 인산화를 통해 조정된다. HER2는 자연적으로 "활성" 형태에 있기 때문에 특이적인 리간드를 갖지 않는다. 다른 HER 수용체는 다이머화를 방지하기 위한 방법으로 폴딩된 분자를 갖는 불활성 모노머로서 존재한다. 도메인 1 및 3에 결합하는 리간드는 궁극적으로 수용체의 도메인 2 내의 다이머화 루프를 노출시키는 주요 형태 변화를 유도한다. 이와 같은 다이머화 루프의 노출은 수용체 다이머화를 가능하게 한다.

1990년에 처음 개시된 HER3 수용체는 고유 키나제 활성이 결여된 유일한 HER 패밀리의 구성원이고, 다운스트림(downstream) 시그날링은 헤테로다이머화를 통해 달성된다. 따라서, 모노머로서의 HER3 수용체는 "비-자가(non-self)"라고 불리고, 호모다이머(homodimer)를 형성할 수 없다. 리간드 헤레굴린(Heregulin: HRG)의 HER3 수용체에 대한 결합은 HER3와 다른 HER 패밀리 수용체(바람직하게는, HER2)의 헤테로다이머화를 촉발한다. 헤테로다이머 내에서, HER3 키나제 도메인은 이의 HER 패밀리 파트너의 알로스테릭(allosteric) 활성체로 작용한다.

HER3은 유방암 및 난소암을 포함하여 다양한 암의 종양형성에 연관된다(Lee-Hoeflich ST, Cancer Res. 2008; McIntyre E, Breast Cancer Res Treat. 2010; Tanner B, J Clin Oncol. 2006). HER3 발현은 종양 진행 및 악성 흑색종(melanoma) 및 전이(metastasis) 환자의 감소된 생존률에 관계되고, 난소암의 생존률 저하에 연관된다. 중요하게도, 유방암에서, 헤르셉틴(Herceptin) 치료에 적합하지 않은 낮은 HER2 발현을 갖는 종양은 종종 장기치료 후에 헤르셉틴에 저항성을 갖는 HER3(Smith et al. Br. J. Cancer 2004) 및 HER2+++ 종양을 강하게 발현하도록 "프로그램"되고, HER3(Narayan, Cancer Res. 2009)을 강하게 발현하도록 "재프로그램"된다. 또한, 세툭시맙(Cetuximab) 저항은 EGFR 내재화(internalization)/열화(degradation)의 조절장애(dysregulation)와 함께, 폐암(Wheeler, Oncogene 2008), 및 직장암종(colorectal carcinoma)(Lu Cancer Res 2007)에서의 HER3 과발현과 연관되었다. 최근에, HER3 과발현은 결장 암종에서의 더 낮은 무전이(metastasis-free) 생존률과 유의적으로 연관지어졌다(Ho-Pun-Cheung, Int J Cancer 2010). 따라서, HER3 과발현 및 PI3K/AKT 경로의 활성화를 통한 보상 시그날링(compensatory signalling)은 HER-표적 요법에 의한 치료(항체 및 TKI)(Wheeeler 2008, Lu 2007, Narayan, 2009, Sergina, 2007) 뿐만 아니라 IGFR-표적 요법(Desbois-Mouthon, Clin Cancer Res 2009) 및 화학치료제(Kruser, Exp Cell Res 2010)에 의한 치료에 대한 저항을 개발하는 중에 시사되었다.

상기와 같은 발견 모두는, HER3-표적 제제, 특히 항체가 암에서 HER3 시그날링의 역할을 더욱 자세하게 이해하고, 특히 효과적인 면역요법으로 사용될 수 있도록 도울 수 있다.

과학 문헌이 치료적 종양학에서 HER3를 표적화하는 것의 이점을 강조하고 있지만, 현재 치료적 항-HER3 항체는 상용화되지 않았다. 두 종류의 인간 항체가 Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis(MM-121 항체; PCT WO2008/100624) 및 U3 PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen(U3-1287 또는 AMG-888; PCT WO2007/077028)에 의해 현재 개발되고 있다. MM-121 항체는 NSCLC에 대해 임상시험 단계 I, 및 ER+ PR+ HER2- 유방암에 대해 임상시험 단계 I/II 중에 있다. U3-1287 항체는 에를로티니브(Erlotinib)에 관련된 NSCLC에 대해 단계 I에 있다. EGFR/HER3 2중 특이적 항체 DL11f(Genentech; PCT WO2010/108127)가 여전히 연구개발 중에 있다. HER2/HER3 2중 특이적 항체 MM-111(Merrimack Pharmaceuticals; PCT WO2005/117973, WO2006/091209)이 HER2-증폭(amplified) 유방암에 대해 단독으로 또는 트라스투주마브 또는 라파티니브와 조합하여 임상시험 단계 I/II 중에 있다.

상기의 항체들은 모두 HER3 수용체의 헤레굴린-결합 부위를 차단하여, 리간드-중독된 종양에 대한 상기 항체 요법을 감소시킨다. HER3의 헤레굴린-결합 부위를 표적으로 하지 않는 항체에 의해 HER3을 표적화하는 것은 저항성 HER2-증폭 유방암의 표적요법 또는 화학요법에 대한 저항을 우회하거나, 현재 상기와 같은 치료에 적합하지 않은 저HER2 유방암에 대한 표적요법의 적용 분야를 넓히거나, HER3을 발현하고 아직 사용가능한 표적요법이 없는 3중-음성 유방암을 치료할 수 있게 해야 한다.

본 발명은 분리된 항-인간-HER3 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 HER-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 HER-3의 세포외 도메인과 결합하기 위해 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마(hybridoma)로부터 획득할 수 있게 제조된 항체와 경쟁하는, 분리된 모노클로날 항체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 경쇄(variable light chain: VL)의 CDR을 포함하는 VL, 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 중쇄(variable heavy chain: VH)의 CDR을 포함하는 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VL 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 키메라 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 CDR을 포함하는 모노클로날 인간화(humanized) 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 뮤린(murine) 모노클로날 항체(16D3-C1)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디(diabody)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 상기 항체의 항체 단편을 제공한다.

본 발명자는 뮤린 항-인간-HER3 항체를 특징화하였다. 특히, 본 발명자는 2011년 5월 17일에 뮤린 항-인간-HER3 항체(16D3-C1) 생성 하이브리도마를 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁하였다. 기탁된 하이브리도마는 수탁번호 CNCM I-4486을 갖는다. 특히, 본 발명자는 상기 항체가 헤테로다이머 HER2-HER3 복합체 형성의 강력한 억제제이고, 억제는 리간드 헤레굴린과 독립적이라는 것을 보여주었다.

정의:

"HER3"이라는 용어는 [Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909 (1990)]에 개시된 바와 같은 인간 HER3 수용체를 지칭한다(또한, Kani et al., Biochemistry 44: 15842-857 (2005), Cho and Leahy, Science 297: 1330- 1333 (2002) 참조). HER3은 "HER3"으로도 알려졌다.

"항-인간-HER3 항체"라는 용어는 인간 HER3에 대한 항체를 지칭한다.

본 발명에 따르면, "항체" 또는 "면역글로불린(immunoglobulin)"은 같은 의미를 갖고, 본 발명에서는 동등하게 사용될 것이다. 여기서 사용되는 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 면역특이적으로 항원을 결합시키는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. 이와 같이, 항체라는 용어는 항체 분자 전체뿐만 아니라, 항체 단편, 및 항체 및 항체 단편의 변이체(유도체 포함)를 포함한다. 자연 항체에서, 2개의 중쇄는 이황화결합에 의해 서로 연결되고, 각 중쇄는 이황화결합에 의해 경쇄에 연결된다. 경쇄에는 람다(l) 및 카파(k) 두 종류가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 다섯 종류(또는 이소타입(isotype))의 주요 중쇄가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 사슬은 구별되는 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 보존 도메인(CL)의 2개의 도메인을 포함한다. 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH) 및 세 개의 보존 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 총괄적으로 CH로 지칭)의 4개의 도메인을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 모두의 가변영역은 항원에 대한 특이성 및 결합 인식(binding recognition)을 결정한다. 경쇄의 보존 영역 도메인(CL) 및 중쇄의 보존 영역 도메인(CH)은 항체 사슬 연관성(antibody chain association), 분비(secretion), 경태반 이동성(trans-placental mobility), 보체 결합(complement binding), 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특징을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단부이고, 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 가변부로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원성 결정인자 사이의 구조적인 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)의 잔기로 구성된다. 가끔, 비초가변 영역 또는 프레임워크 영역(framework region: FR)의 잔기가 전체적인 도메인 구조 및 그에 따라 결합 부위에 영향을 준다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 본래의 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열이다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3과 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3으로 지정된 3개의 CDR을 각각 갖는다. 따라서, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하여 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 위치하는 아미노산 서열을 지칭한다.

"키메라 항체"라는 용어는 16D3-C1 항체로부터 유래된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

본 발명에 따르면, "인간화 항체"라는 용어는 인간 항체로부터 유래된 가변 영역 프레임워크(framework) 및 보존 영역을 갖지만 16D3-C1 항체의 CDR을 보유하는 항체를 지칭한다.

"Fab"라는 용어는 IgG를 프로테아제 파파인에 의해 처리하여 획득된 단편 중에, 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭하고, 여기서 H 사슬의 N-말단 쪽의 절반 정도 및 L 사슬 전부는 이황화결합에 의해 함께 결합된다.

"F(ab')2"라는 용어는 IgG를 프로테아제 펩신에 의해 처리하여 획득된 단편 중에, 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖고, 힌지(hinge) 영역의 이황화결합에 의해 결합된 Fab 보다 약간 더 큰 항체 단편을 지칭한다.

"Fab'"이라는 용어는 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화결합을 절단함으로써 획득되는, 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭한다.

단쇄 Fv("scFv") 폴리펩티드는 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 인코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 주로 발현되는, 공유결합된 VH::VL 헤테로다이머이다. "dsFv"는 이황화결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로다이머이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv의 연계에 의해 동시에 형성될 수 있고, 또는 2가 sc(Fv)2와 같은 펩티드 링커에 의해 1가 scFv를 커플링(coupling)함으로써 생성될 수 있다.

"디아바디"라는 용어는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL). 동일한 사슬 상의 두 개의 도메인 사이의 짝짓기(pairing)를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 지어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다.

본 발명에 따른 항체 또는 뉴클레오티드에 있어서, "정제된" 및 "분리된"은 동일한 종류의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재하에 상기 지칭된 분자가 존재하는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 "정제된"이라는 용어는 바람직하게는 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 85 중량% 이상, 더욱더 바람직하게는 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 98 중량% 이상의 동일한 종류의 생물학적 거대분자가 존재하는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 "분리된" 핵산 분자는 상기 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다. 그러나, 상기 분자는 조성의 기본적인 특성에 악영향을 주지 않는 추가적인 베이스 또는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체:

본 발명은 분리된 항-인간-HER3 항체, 또는 이의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명자는 뮤린 항-인간-HER3 항체(16D3-C1) 생성 하이브리도마를 Collection Nationale de Cultures de Microoranismes(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 부다페스트 조약의 규정에 따라 2011년 5월 17일에 수탁하였다. 기탁된 하이브리도마는 수탁번호 CNCM I-4486을 갖는다.

본 발명의 일 측면은 HER-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 HER-3의 세포외 도메인에 결합하기 위해 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있게 제조된 항체와 경쟁하는, 분리된 모노클로날 항체를 제공한다.

특정 구현예에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 경쇄(VL)의 CDR을 포함하는 VL, 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 중쇄(VH)의 CDR을 포함하는 VH를 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VL, 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VH를 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 키메라 항체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 CDR을 포함하는 모노클로날 인간화 항체에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 수탁번호 CNCM I-4486으로 사용가능한 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 뮤린 모노클로날 항체(16D3-C1)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상기 항체의 항체 단편을 제공한다.

경쟁적 결합 어세이( competitive binding assay ):

따라서, 본 발명은 HER-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 HER-3의 세포외 도메인에 결합하기 위해 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있게 제조된 항체와 경쟁하는, 분리된 모노클로날 항체에 관한 것이다.

에피토프 비닝(epitope binning)이 본 발명의 범위 내에 포함되는 항체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프 비닝은 동시에 HER3를 결합할 수 있거나 결합할 수 없는 항체 쌍을 식별하여, HER3상의 동일하거나 겹치는 에피토프에 결합하는 항체 쌍을 식별하도록 하는 경쟁적 결합 어세이의 사용을 지칭한다. 에피토프 비닝 실험은 항원적으로 구별되는 에티토프가 존재한다는 증거를 제공한다. 결합을 위한 경쟁은 임의의 항체 또는 단편의 쌍에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 적절한 검출 시약을 사용하여, 어떠한 출처의 항체 또는 결합 단편의 결합 특이성이 본원에 기재된 모노클로날 항체의 결합 특이성과 비교될 수 있다. 에피토프 비닝은 "분리된 항체" 또는 세포 배양 상청액에 의해 수행될 수 있다. 흔히, 비닝은 더 발달될 클론의 선택을 유도하기 위해 일차 클론 상청액에 의해 수행된다. 비교되는 항체는 실질적으로 동종의 항원 결합 도메인이어야 한다. "2중 특이적" 또는 "2중 기능적" 항체의 경우, 두 가지 다른 결합 부위의 결합 특이성은 독립적으로 평가되거나 비닝되어야 한다.

본 발명의 항체는 해당 분야에 알려진 어떠한 방법으로도 특이적 결합을 위해 분석될 수 있다. 다른 많은 경쟁적 결합 어세이 포맷(들)이 에피토프 비닝을 위해 사용될 있다. 사용될 수 있는 면역어세이(immunoassay)는 웨스턴 블롯(western blot), 방사면역어세이(radioimmunoassay), ELISA, "샌드위치" 면역어세이, 면역침강(immunoprecipitation) 어세이, 침강소(precipitin) 어세이, 겔 확산 침강소 어세이, 면역방사(immunoradiometric) 어세이, 형광(fluorescent) 면역어세이, 단백질 A 면역어세이, 및 보체고정(complement-fixation) 어세이와 같은 기법을 사용하는 경쟁적 어세이 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 어세이는 해당 분야에서 일반적이고 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New York 참조). 예를 들어, BIACORE®(GE Healthcare, Piscaataway, NJ)는 모노클로날 항체의 에피토프 빈 판넬(bin panel)에 일반적으로 사용되는 다양한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 어세이 포맷들 중 하나이다. 또한, 문헌 [Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988]에 개시된 것과 같은 일반적인 크로스-블록킹(cross-blocking) 어세이가 수행될 수 있다.

본 발명의 항체를 제조하는 방법:

본 발명의 항-인간-HER3 항체는 해당 분야에 알려진 임의의 기법, 예를 들어 화학적, 생물학적, 유전학적 또는 효소학적 기법 각각 또는 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다.

원하는 서열의 아미노산 서열을 알면, 통상의 기술자는 폴리펩티드의 제조를 위한 표준 기법에 의해 용이하게 상기 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 이들은 잘 알려진 고체상 방법을 사용하여, 바람직하게는 상용되는 펩티드 합성 장치(예를 들어, Applied Biosystems(Foster City, California)의 제품)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 합성될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체는 해당 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 항체를 인코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터에 혼입시키고, 원하는 항체를 발현시킬 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에 상기 벡터를 도입시킴으로써, DNA 발현 산물로서 항체가 획득될 수 있고, 그 후 상기 항체로부터 잘 알려진 기법을 사용하여 이들을 분리시킬 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체(예를 들어, CNCM-I-4486로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체(16D3-C1))의 VH 도메인, 또는 본 발명의 항체(예를 들어, CNCM-I-4486로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체(16D3-C1))의 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

통상적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피좀, 인공염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는, DNA 또는 RNA 분자이다.

"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 이에 의해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입되어, 숙주를 형질전환하고, 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 운반체를 의미한다.

따라서, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 대상체에 투여시 상기 항체의 발현을 일으키거나 지시하기 위해, 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 터미네이터(terminator) 등과 같은 조절요소(regulatory element)를 포함할 수 있다. 동물 세포를 위한 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami T. et al. 1987), 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y et al. 1987), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터(Mason JO et al. 1985) 및 인핸서(Gillies SD et al. 1983) 등을 포함한다.

인간 항체 C 영역을 인코딩하는 유전자가 삽입되고 발현될 수 있다면, 동물 세포를 위한 어떠한 발현 벡터도 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등을 포함한다.

플라스미드의 다른 예는 복제 개시점을 포함하는 복제 플라스미드, 예를 들어 pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 통합(integrative) 플라스미드를 포함한다.

바이러스 벡터의 다른 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 상기 재조합 바이러스는 해당 분야에 알려진 기법에 의해, 예를 들어 패키징 세포(packaging cell)의 형질감염, 또는 보조 플라스미드 또는 바이러스에 의한 일과성(transient) 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 통상적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 상기 복제-결함(replication-defective) 재조합 바이러스를 제조하기 위한 자세한 프로토콜은 예를 들어 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 발견될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염(transfect), 감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

"형질전환"이라는 용어는 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 성분, 통상적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 발현할 수 있도록, "외래(즉, 외부 또는 세포외)" 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.

본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. "발현 시스템"이라는 용어는 적합한 조건, 예를 들어 외래 DNA에 의해 코딩되고, 벡터에 의해 운반되고, 숙주 세포에 도입된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건하의 숙주 세포 및 호환되는 벡터를 의미한다.

일반적인 발현 시스템은 E. coli 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바쿨로바이러스(Baculovirus) 벡터, 및 포유류 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 원핵세포(예를 들어, 박테리아) 및 진핵세포(예를 들어, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 예는 E.coli, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 또는 사카로미세스(Saccharomyces) 효모, 포유류 세포주(예를 들어, 베로(Vero) 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등), 및 일차 또는 구축된 포유류 세포 배양체(예를 들어, 림프아세포, 섬유아세포, 배아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포 등으로부터 제조된 것)를 포함한다. 또한, 상기 예는 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(하기에서는 "DHFR 유전자"로 지칭됨)가 결여된 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 하기에서는 "YB2/0 세포"로 지칭됨) 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법으로서, (i) 전술된 재조합 핵산 또는 벡터를 컴피턴트(competent) 숙주 세포로 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 도입하는 단계; (ii) 획득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외 배양하는 단계; 및 (iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다. 상기 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

다른 특정 구현예에서, 본 방법은 (i) CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마를 16D3-C1 항체의 발현을 일으키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 항체는 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 인간 키메라 항체는 전술된 VL 및 VH 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 획득하고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 인코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포를 위한 발현 벡터에 상기 서열을 삽입함으로써 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 상기 발현 벡터를 동물 세포에 도입함으로써 코딩 서열을 발현함으로써 제조될 수 있다.

인간 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 인간 면역글로불린에 속하는 어떠한 영역도 될 수 있지만, IgG형이 적합하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같이 IgG형에 속하는 어떠한 아형도 사용될 수 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL 도메인으로서, Ig에 속하는 어떠한 영역도 될 수 있고, 카파(kappa) 종 또는 람다(lambda) 종이 사용될 수 있다.

키메라 항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 잘 알려진 종래의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다(Morrison SL. et al.(1984) 및 특허문헌 US5,202,238; 및 US5,204, 244 참조).

본 발명의 인간화 항체는 전술한 바와 같이 CDR 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 획득하고, (i) 인간 항체의 중쇄 보존 영역과 동일한 중쇄 보존 영역; 및 (ii) 인간 항체의 경쇄 보존 영역과 동일한 경쇄 보존 영역을 인코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포를 위한 발현 벡터에 상기 서열을 삽입함으로써 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 발현 벡터를 도입함으로써 유전자를 발현함으로써 획득할 수 있다.

인간화 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자 및 항체 경쇄를 인코딩하는 유전자가 분리된 벡터에 존재하는 형태, 또는 양 유전자가 모두 동일한 벡터에 존재하는 형태(탠덤(tandem)형)일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축의 용이성, 동물 세포에의 도입의 용이성, 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준간의 균형 측면에서, 탠덤형의 인간화 항체 발현 벡터가 바람직하다(Shitara K et al. 1994). 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.

종래의 DNA 및 유전자 형질감염 기법에 기반한 인간화 항체를 제조하는 방법(예를 들어, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985 참조)이 해당 분야에 잘 알려져 있다. 항체는 해당 분야에 알려진 다양한 기법, 예를 들어 CDR-그래프팅(EP 239,400; PCT 공보 WO91/09967; 미국특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 비니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(U.S. Pat. No.5,565,332)을 사용하여 인간화될 수 있다. 또한, 이와 같은 항체를 제조하는 일반적인 재조합 DNA 기술이 알려져 있다(유럽특허출원 EP 125023 및 국제특허출원 WO 96/02576 참조).

본 발명의 Fab는 인간 HER3과 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제 파파인으로 처리함으로써 획득될 수 있다. 또한, Fab는 원핵 발현 시스템 또는 진핵 발현 시스템을 위한 벡터에 항체의 Fab를 인코딩하는 DNA를 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab를 발현함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 F(ab')2는 인간 HER3과 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제 펩신으로 처리함으로써 획득될 수 있다. 또한, F(ab')2는 하기의 Fab'을 티오에테르결합 또는 이황화결합을 통해 결합시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 Fab'은 인간 HER3과 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제 디티오트레이톨에 의해 처리함으로써 획득될 수 있다. 또한, Fab'은 원핵생물을 위한 발현 벡터, 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터에 항체의 Fab' 단편을 인코딩하는 DNA를 삽입하고, 벡터를 (적절하게) 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 이의 발현을 수행함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 scFv는 전술한 바와 같이 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 cDNA를 획득하고, scFv를 인코딩하는 DNA를 구축하고, 원핵생물을 위한 발현 벡터 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터에 DNA를 삽입하고, 원핵생물 또는 진핵생물에 (적절하게) 발현 벡터를 도입하여 scFv를 발현함으로써 제조될 수 있다. 인간화 scFv 단편을 생성하기 위해, 도너(donor) scFv 단편으로부터 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 선택하는 단계, 및 이들을 알려진 3차원 구조의 인간 scFv 단편 골격에 그래프팅하는 단계를 포함하는, CDR 그래프팅이라는 잘 알려진 기법이 사용될 수 있다(예를 들어, W098/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494 참조).

본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변이(들)가 고려될 수 있다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특징을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 비인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 단순히 그래프팅함으로써 인간화 항체가 제조되는 경우에, 비인간 동물로부터 유래된 본래의 항체에 비하여 항원 결합 활성이 감소된다는 것이 잘 알려져 있다. CDR뿐만 아니라 FR의 비인간 항체의 VH 및 VL의 몇몇 아미노산 잔기들이 직접적으로 또는 간접적으로 항원 결합 활성과 연관된다는 점이 고려된다. 이에 따라, 상기 아미노산 잔기들의 인간 항체의 VH 및 VL의 FR로부터 유래된 다른 아미노산 잔기로의 치환이 결합 활성을 감소시킬 수 있다. 문제를 해결하기 위해, 인간 CDR로 그래프팅된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에 항체에 대한 결합과 직접적으로 연관되거나, 또는 CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 또는 항체의 3차원 구조를 유지하면서 항원에 대한 결합에 직접적으로 연관된 아미노산 잔기를 식별하기 위한 노력이 있었다. 감소된 항원 결합 활성은 식별된 아미노산을 비인간 동물로부터 유래된 본래의 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다.

본 발명의 항체의 구조, 및 이들을 인코딩하는 DNA 서열에서 변이 및 변화가 일어나도, 여전히 원하는 특성을 갖는 항체를 인코딩하는 기능성 분자를 획득할 수 있다.

아미노산 서열의 변화를 일으킬 때, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 생물학적 상호작용 기능을 부여하는 데에 있어서 아미노산 수치요법 지수의 중요성은 해당 분야에 일반적으로 알려져 있다. 아미노산의 상대적인 수치요법 지수가 생성되는 단백질의 2차 구조에 기여하여, 이는 결과적으로 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 단백질을 상호작용을 규정한다는 것이 인정된다. 각 아미노산에는 이들의 소수성 및 전하 특성에 기반하여 수치요법 지수가 부여되고, 이들은 하기와 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 변이체를 포함한다.

"기능-보존 변이체"란 폴리펩티드의 전체적인 형태 및 기능을 변화시키지 않고 단배질 또는 효소의 주어진 아미노산 잔기가 바뀐 것으로, 유사한 특성(예를 들어, 극성, 수소결합능, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등)을 갖는 다른 것으로의 아미노산의 대체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 보존된 것이라고 지시되는 것과 다른 아미노산은 단백질에 차이가 있을 수 있으며, 따라서 유사한 기능을 갖는 임의의 2개의 단백질 사이의 퍼센트 단백질 또는 아미노산 서열 유사성은 예를 들어 유사성이 MEGALIGN 알고리즘에 기반한 클러스터법(Cluster Method)에 의한 것과 같은 정렬 방법에 따라 측정시 70% 내지 99%일 수 있다. 또한, "기능-보존 변이체"는 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 측정시 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 상동성(identity)을 갖고, 비교되는 자연형(native) 또는 모 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 성질을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

더 짧은 서열의 전체 길이에 걸쳐, 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 아미노산이 동일하거나, 약 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상이 유사(기능적으로 동일)할 때, 두 개의 아미노산 서열은 "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사한 또는 상동의 서열은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램, 또는 BLAST, FASTA 등과 같은 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램, 또는 BLAST, FASTA 등과 같은 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 얼라인먼트(alignment)에 의해 식별된다.

예를 들어, 특정 아미노산은 활성의 눈에 띄는 손상 없이 단백질 구조 내의 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질이 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하기 때문에, 유사한 특성을 갖는 단백질을 획득하면서, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열, 및 서열을 인코딩하는 이의 DNA에서 물론 일어날 수 있다. 따라서, 이들의 생물학적 활성의 눈에 띄는 손상 없이, 다양한 변화가 본 발명의 항체 서열, 또는 상기 항체를 인코딩하는 대응하는 DNA 서열에서 일어날 수 있다는 점이 고려된다.

특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환되어도, 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 제조할 수 있다는 것, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 획득할 수 있다는 것이 해당 분야에 알려져 있다.

따라서, 상기한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반한다. 전술한 특성을 다양하게 고려하는 바람직한 치환은 해당 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.

본 발명의 항체의 다른 종류의 아미노산 변이가 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변화시키기에 유용할 수 있다.

"변화"는 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 성분을 제거하는 것, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.

항체의 글리코실화는 통상적으로 N-연결된다. "N-연결"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 성분을 부착하는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산)은 탄수화물 성분의 아스파라긴 측쇄에의 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 포텐셜(potential) 글리코실화 부위를 생성한다. 항체에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은 아미노산 서열이 전술한 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 포함하도록 (N-연결된 글리코실화 부위를 위해) 아미노산 서열을 변화시킴으로써 용이하게 달성된다.

다른 종류의 공유 변이(covalent modification)는 화학적으로 또는 효소학적으로 글리코시드를 항체에 커플링하는 것을 포함한다. 이들 절차는 N- 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포의 항체를 제조할 필요가 없다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 모드(mode)에 따라, 당류(들)가 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 그것과 같은 유리 설프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 그것과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 그것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 WO87/05330에 개시되어 있다.

항체에 존재하는 임의의 탄수화물 성분의 제거는 화학적으로 또는 효소학적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 동등한 화합물에 항체를 노출시키는 것을 요구한다. 상기 처리는, 항체는 그대로인 채로 놔두면서, 연결 당류(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 당의 대부분 또는 전부의 절단을 야기한다. 화학적 탈글리코실화는 Sojahr H. et al.(1987) 및 Edge, AS. et al.(1981)에 의해 개시되었다. 항체 상의 탄수화물 성분의 효소적 절단은 Thotakura, NR. et al.(1987)에 의해 개시된 바와 같이, 다양한 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제를 사용함으로써 달성될 수 있다.

항체의 다른 종류의 공유 변이는 다양한 비단백질계 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 대해 항체를 미국특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방법으로 연결하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 항체를 효과기(effector function)의 측면에서 예를 들어, 항체의 항원의존성 세포매개 세포독성(antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 및/또는 보체의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)을 강화시키기 위해 변이시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기는 Fc 영역에 도입됨으로써, 상기 영역에 사슬간 이황화결합의 형성을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 생성된 호모다이머성 항체는 내재화 능력을 개선시켰거나, 및/또는 보체매개 세포사멸 및/또는 항원의존성 세포매개 세포독성(antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)을 증가시켰을 수 있다(Caron PC. et al. 1992; and Shopes B. 1992).

면역접합체:

본 발명의 항체에는 검출가능한 표지가 접합되어 항-HER3 면역접합체를 형성할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광 표지 또는 콜로이드성 금을 포함한다. 상기와 같은 검출가능하게 표지된 면역접합체를 제조하고 검출하는 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있으며, 하기에 더욱 상세하게 기재된다.

검출가능한 표지는 자기방사선(autoradiography)에 의해 검출될 수 있는 방사성 동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 특히 유용한 동위원소는 ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 및 ¹⁴C이다.

또한, 항-HER3 면역접합체는 형광 화합물에 의해 표지될 수 있다. 형광으로 표지된 항체의 존재는 면역접합체를 적절한 파장의 빛에 노출시키고, 그에 따른 형광 발광을 검출함으로써 측정된다. 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈알데히드(o-phthalaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)을 포함한다.

선택적으로, 항-HER3 면역접합체는 화학발광 화합물에 항체를 커플링함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그된 면역접합체의 존재는 화학반응의 전개 동안에 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.

유사하게, 생물발광 화합물이 본 발명의 항-HER3 면역접합체를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 일종의 화학발광이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 표지에 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 애큐오린을 포함한다.

선택적으로, 항-HER3 면역접합체는 항-인간-HER3 모노클로날 항체를 효소에 연결함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 항-HER3-효소 접합체가 적절한 기질의 존재하에서 배양될 때, 효소 성분은 기질과 반응하여 예를 들어 분광분석, 형광분석 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학 성분을 생성한다. 다중특이적 면역접합체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소의 예는 β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파타제를 포함한다.

해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 적합한 표지를 알 것이다. 항-인간-HER3 모노클로날 항체에 마커 성분의 결합은 해당 분야에 알려진 표준 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 이와 같은 측면에서 통상적인 방법론이 [Kennedy et al ., Clin . Chim . Acta 70:1, 1976; Schurs et al ., Clin . Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al ., Int'l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res . 50:1330, 1990; 및 Coligan, supra]에 개시되어 있다.

더욱이, 면역화학 검출의 용이성 및 범용성은 아비딘, 스트렙트아비딘 및 비오틴에 접합된 항-인간-HER3 모노클로날 항체를 사용함으로써 강화될 수 있다(예를 들어, Wilchek et al .(eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology( Vol . 184)(Academic Press 1990); Bayer et al ., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology",in Methods In Molecular Biology(Vol. 10) 149-162(Manson, ed., The Humanaa Press, Inc. 1992) 참조).

면역어세이를 수행하기 위한 방법은 잘 정립되어 있다(예를 들어, Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays",in Monoclonal Antibodies: Production , Engineering , and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", in Monoclonal Antibodies : Principles and Applications 107-120(Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay(Academic Press, Inc. 1996) 참조).

다른 측면에서, 본 발명은 항-인간-HER3 모노클로날 항체-약물 접합체를 제공한다. 본원에서 사용되는 "항-인간-HER3 모노클로날 항체-약물 접합체"는 치료제에 접합된 본 발명에 따른 항-인간-HER3 모노클로날 항체를 지칭한다. 상기 항-인간-HER3 모노클로날 항체-약물 접합체는 대상체, 예를 들어 HER3-발현 암에 걸린 대상체에 통상적으로 단독으로, 그러나 다른 치료제와 조합하여 투여된 때에도, HER3-발현 세포에 임상학적으로 유익한 효과를 발생시킨다.

통상적인 구현예에서, 항-인간-HER3 모노클로날 항체는 세포독성제에 접합되어, 그에 따른 항체-약물 접합체가 세포에 의해 섭취 또는 내재화(internalize)되는 경우에, HER3-발현 세포(예를 들어, HER3-발현 암 세포)에 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 가한다. 항체에의 접합을 위해 특히 적합한 성분은 화학치료제, 효소를 전환하는 전구약물(prodrug), 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다. 예를 들어, 항-인간-HER3 모노클로날 항체는 화학치료제 또는 독소(예를 들어, 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 또는 디프테리아(diphtheria) 독소와 같은 세포증식억제제 또는 세포파괴제(cytocidal agent))와 같은 세포독성제에 접합될 수 있다.

유용한 종류의 세포독성제는 예를 들어, 항튜블린제(antitubulin agent), 아우리스타틴(auristatin), DNA 마이너 그루브 결합제(minor groove binder), DNA 복제 억제제(DNA replication inhibitor), 알킬화제(alkylating agent)(예를 들어, 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금), 및 3핵 백금 복합체 및 카르보플라틴과 같은 백금 복합체), 안트라시클린(anthracycline), 항생제(antibiotic), 항엽산제(antifolate), 항대사물질(antimetabolite), 화학요법 증감제(chemotherapy sensitizer), 듀오카르마이신(duocarmycin), 에토포시드(etoposide), 플루오르화 피리미딘(fluorinated pyrimidine), 이오노포어(ionophore), 렉시트롭신(lexitropsin), 니트로소우레아(nitrosourea), 플라티놀(platinol), 프리-포밍(pre-forming) 화합물, 퓨린 항대사물질(purine antimetabolite), 퓨로마이신(puromycin), 방사 증감제(radiation sensitizer), 스테로이드, 탁산(taxane), 토모이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 등을 포함한다.

각각의 세포독성제는 예를 들어 안드로겐, 안트라마이신(AMC), 아스파라기나제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 설폭시민, 캄프토테신(Camptothecin), 카르보플라틴, 카르무스틴(BSNU), CC-1065(Li et al ., Cancer Res . 42:999-1004, 1982), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴, 콜키신(colchicine), 시클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노시드, 사이토칼라신 B, 다카르바진(dacarbazine), 닥티노마이신(전(前) 악티노마이신), 다우노루비신, 데카르바진(decarbazine), 도세탁셀, 독소루비신(doxorubicin), 에스트로겐, 5-플루오르데옥시우리딘(fluordeoxyuridine), 에톱시드 포스페이트(VP-16), 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴(CCNU), 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C, 미톡산트론(mitoxantrone), 니트로이미다졸, 파클리탁셀(paclitaxel), 플리카마이신(plicamycin), 프로카르비진(procarbizine), 스트렙토조토신(streptozotocin), 테노포시드(tenoposide)(VM-26), 6-티오구아닌, 티오테파(thioTEPA), 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함한다.

특히 적합한 세포독성제는 예를 들어, 돌라스타틴(dolastatin)(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어, 엔다이인(enediyne) 및 렉시트롭신), 듀오카르마이신, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 퓨로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38(7-에틸-10-히드록시-캄프토테인(camptothein)), 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신(rhizoxin), 시아노모르폴리노-독소루비신, 에치노마이신(echinomycin), 콤브레타스타틴(combretastatin), 네트롭신(netropsin), 에포틸론(epothilone) A 및 B, 에스트라무스틴(estramustine), 크립토피신(cryptophysin), 세마도틴(cemadotin), 마이탄시노이드(maytansinoid), 디스코데르몰리드(discodermolide), 엘레우테로빈(eleutherobin) 및 미톡산트론을 포함한다.

특정 구현예에서, 세포독성제는 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드와 같은 종래의 화학치료제이다. 또한, CC-1065 유사체, 칼리키아미신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine), 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신, 및 팔리톡신(palytoxin)과 같은 강한 제제가 항-HER3-발현 항체에 연결될 수 있다.

특정 변형예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 아우리스타틴 E(해당분야에서 돌라스타틴-10으로도 알려짐) 또는 이의 유도체이다. 통상적으로, 아우리스타틴 E 유도체는 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 제조할 수 있다. 다른 통상적인 아우리스타틴 유도체는 AFP(디메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민), MMAF(도발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌), 및 MAE(모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함한다. 아우리스타틴 E 및 이의 유도체의 합성 및 구조는 미국특허출원공보 제20030083263호; 국제특허출원공보 WO 2002/088172 및 WO 2004/010957; 및 미국특허 제6,884,869호; 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기재되어 있다.

다른 변형예에서, 세포독성제는 DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어, 미국특허 제6,130,237호 참조) 예를 들어, 특정 구현예에서, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 구현예에서, 마이너 그루브 결합제는 엔다이인(예를 들어, 칼리키아미신(clicheamicin))이다.

특정 구현예에서, 항체-약물 접합체는 항-튜블린제를 포함한다. 항-튜블린제의 예는 예를 들어, 탁산(예를 들어, Taxol®(파클리탁셀), Taxotere®(도세탁셀)), T67(Tularik), 빈카 알킬로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 다른 항-튜블린제는 예를 들어 박카틴 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸(nocodazole), 콜키신 및 콜시미드(colcimid), 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드 및 엘레우테로빈을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 세포독성제는 다른 그룹의 항-튜블린제인 마이탄시노이드이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마이탄시노이드는 메이탄신 또는 DM-1이다(ImmunoGen, Inc.; see also Chari et al ., 암 Res . 52:127-131, 1992).

다른 구현예에서, 세포독성제는 항대사물질이다. 항대사물질은 예를 들어, 퓨린 길항제(antagonist)(예를 들어, 아조티오프린 또는 마이코페놀레이트 모페틸), 디히드로폴레이트 환원효소 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트), 아시클로비르(acyclovir), 강시클로비르(gangcyclovir), 지도부딘(zidovudine), 비다라빈(vidarabine), 리바바린(ribavarin), 아지도티미딘(azidothymidine), 시티딘 아라비노시드, 아만타딘, 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 이오도데옥시우리딘(iododeoxyuridine), 포스카르네트(poscarnet) 또는 트리플루리딘(trifluridine)일 수 있다.

다른 구현예에서, 항-인간-HER3 모노클로날 항체는 효소를 전환하는 전구약물에 접합된다. 효소를 전환하는 전구약물은 알려진 방법을 사용하여 항체에 재조합적으로 융합되거나, 화학적으로 접합된다. 효소를 전환하는 예시적인 전구약물은 카르복시펩티다제 G2, β-글루쿠로니다제, 페니실린-V-아미다제, 페니실린-G-아미다제, β-락타마제, β-글루코시다제, 니트로환원효소 및 카르복시펩티다제 A이다.

치료제를 단백질, 및 특히 항체에 접합하기 위한 기법은 잘 알려져 있다(예를 들어, Arnon et al ., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al . eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al ., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery(Robinson et al . eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al . eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al . eds., Academic Press, 1985); 및 Thorpe et al ., 1982, Immunol . Rev . 62:119-58. 또한, 예를 들어 PCT 공보 WO 89/12624 참조).

진단용도:

본 발명의 다른 목적은 HER3 발현과 관련된 암 질병을 진단 및/또는 관찰하기 위한 본 발명의 항-인간-HER3 항체에 관한 것이다. HER3 발현과 관련된 암 질병은 통상적으로 편평상피세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교아종(glioblastoma) 및 신경섬유종증(neurofibromatosis)과 같은 교질 세포 종양, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암(hepatoma), 유방암, 결장암, 흑색종, 대장암, 자궁내막암종, 침샘암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 종류의 두경부암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 진단된 암은 유방암 또는 난소암이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 유방암 및 난소암을 진단하기에 유용하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 형광 분자, 방사성 분자, 또는 전술한 바와 같이 해당 분야에 알려진 다른 표지와 같은 검출가능한 분자 또는 성분에 의해 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사성 분자는 I123, I124, In111, Re186, Re188과 같은 신티그래프(scintigraphy) 연구를 위한 방사성 원자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 항체는 요오드-123, 요오드-131, 인듐-I11, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance: NMR) 이미징(소위 자기공명 이미징(magnetic resonance imaging: MRI))을 위한 스핀 표지에 의해 표지될 수 있다. 항체의 투여 후에, 환자 내에서의 항체의 분배가 검출된다. 특정 표지의 분배를 검출하기 위한 방법이 해당 분야의 통상의 기술자에 알려져 있고, 어떠한 적절한 방법도 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 컴퓨터 단층촬영(computed tomography: CT), 양전자 단층촬영(positron emission tomography: PET), 자기공명 이미징(magnetic resonance imaging: MRI), 형광, 화학발광 및 초음파검사(sonography)를 포함한다.

본 발명의 항체는 HER3 발현과 관련된 암 질병의 스테이징(staging)에 유용할 수 있다(예를 들어, 방사선 영상에서). 예를 들어, 본 발명의 항체는 유방암 또는 난소암을 스테이징하는데 유용할 수 있다. 이들은 단독으로, 또는 다른 유방암 또는 난소암 마커와 조합하여 사용될 수 있고, HER2, CAl 25, HE4 및 메소텔린을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

통상적으로, 상기 진단 방법은 환자로부터 획득된 생물학적 샘플의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 대상체로부터 획득하고, 진단 또는 관찰 어세이에 사용될 수 있는 다양한 종류의 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 근원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 생검시료 또는 조직 배양체, 이들로부터 유래된 세포와 같은 고체 조직 샘플, 및 이들의 자손(progeny)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 HER3 발현과 관련된 암 질병을 갖는 것으로 의심되는 개인으로부터 수집된 조직 샘플로부터, 및 바람직한 구현예에서는 유방 또는 난소로부터 획득된 세포를 포함한다. 따라서, 생물학적 샘플은 임상학적 샘플, 배양체 내의 세포, 세포 상청액, 세포 용해액(lysate), 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 샘플을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 대상체로부터의 세포 상의 HER3을 검출함으로써 HER3 발현과 관련된 대상체의 암 질병을 진단하는 방법이다. 특히, 상기 진단 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

(a) 항체가 HER3을 발현하는 생물학적 샘플의 세포와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서, HER3 발현과 관련된 암 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체의 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 복합체를 검출 및/또는 정량하는 단계로서, 상기 복합체의 검출은 HER3 발현과 관련된 암 질병을 나타내는 단계.

암 질병을 관찰하기 위해, 본 발명에 따른 진단방법은 다른 간격의 시간을 두고 반복되어, 샘플에 결합하는 항체가 증가 또는 감소하는지 측정하고, 여기서 암 질병이 진행 또는 퇴행하는지 측정된다.

치료용도:

본 발명의 항체, 단편 또는 면역접합체는 임의의 HER3-발현 암을 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 임의의 적합한 제제와 조합하여 사용될 수 있다.

HER3-발현 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 암의 더욱 구체적인 예는 편평상피세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교아종 및 신경섬유종증과 같은 교질 세포 종양, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 흑색종, 대장암, 자궁내막 종양, 침샘 종양, 신장암, 신암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료되는 암은 유방암 또는 난소암이다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 항체, 단편 또는 면역접합체를 치료적으로 유효한 양으로 필요 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, HER3의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본원에서, "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 상기 용어가 적용되는 장애 또는 질환, 또는 상기 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 반전, 완화, 진행의 억제 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, "환자" 또는 "필요대상 환자"라는 용어는 인간 HER3의 발현과 관련된 암에 걸렸거나, 걸릴 위험이 있는 인간 또는 비인간 포유류를 의도한다.

본 발명의 항체의 "치료적으로 유효한 양"은 임의의 의료적 치료에 적용되는 합리적인 수익성/위험성 비로 상기 암을 치료하기에 충분한 항체의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체 및 조성물의 1일 총 사용량은 합리적인 의료적 판단의 범위 내에서 담당의사에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자를 위한 구체적인 치료적으로 유효한 투여 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특이적 항체의 활성; 사용되는 특이적 조성물; 환자 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식습관; 투여의 시간, 투여의 경로, 및 사용되는 특이적 항체의 분비율; 치료의 기간; 사용되는 특이적 항체와 조합하여 또는 함께 사용되는 약물; 의학 분야에 잘 알려진 유사한 요소를 포함하여 다양한 요소에 의존할 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준으로 화합물의 투여를 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것이 해당 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있다.

특정 구현예에서, 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체가 질병 또는 장애의 치료를 위한 제2 제제와 조합하여 사용된다. 암을 치료하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체는 예를 들어 수술, 방사능치료, 화학요법 또는 이들의 조합과 같은 종래의 암 치료요법과 조합하여 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명에 따른 항-HER3 항체 또는 항체-약물 접합체와의 조합 암 치료요법에 유용한 다른 치료제는 항-혈관형성제를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체-약물 접합체는 사이토카인(예를 들어, 종양에 대한 면역반응을 자극하는 사이토카인)과 공동투여된다.

다른 일부 측면에서, 조합 치료요법에 유용한 다른 치료제는 예를 들어, EGFR, HER2 또는 HER4와 같이 종양 성장에 연관된 특정 요소의 길항제를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체는 트라스투주마브(Trastuzumab) 또는 페르투주마브(Pertuzumab)와 같은 항-인간-HER2 모노클로날 항체와 조합하여 사용된다.

일부 구현예에서, 전술된 바와 같은 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체는 티로신 키나제 억제제(Tyrosine Kinase Inhibitor: TKI)와 조합하여 사용된다. BAY 43-9006(sorafenib, Nexavar®) 및 SU11248(sunitinib, Sutent®)은 승인된 상기와 같은 두 TKI이다. 다른 TKI는 이마티니브 메실레이트(Imatinib mesylate)(Gleevec®, Novartis); 게피티니브(Gefitinib)(Iressa®, AstraZeneca); 에를로티니브 히드로클로라이드(Erlotinib hydrochloride)(Tarceva®, Genentech); 반데타니브(Vandetanib)(Zactima®, AstraZeneca); 티피파르니브(Tipifarnib)(Zarnestra®, Janssen-Cilag); 다사티니브(Dasatinib)(Sprycel®, Bristol Myers Squibb); 로나파르니브(Lonafarnib)(Sarasar®, Schering Plough); 바탈라니브 숙시네이트(Vatalanib succinate)(Novartis, Schering AG); 라파티니브(Lapatinib)(Tykerb®, GlaxoSmithKline); 닐로티니브(Nilotinib)(Novartis); 레스타우르티니브(Lestaurtinib)(Cephalon); 파조파니브 히드로클로라이드(Pazopanib hydro클로라이드)(GlaxoSmithKline); 악시티니브(Axitinib)(Pfizer); 카네르티니브 디히드로클로라이드(Canertinib dihydro클로라이드)(Pfizer); 펠리티니브(Pelitinib)(National Cancer Institute, Wyeth); 탄두티니브(Tandutinib)(Millennium); 보수티니브(Bosutinib)(Wyeth); 세막사니브(Semaxanib)(Sugen, Taiho); AZD-2171(AstraZeneca); VX-680(Merck, Vertex); EXEL-0999(Exelixis); ARRY-142886(Array BioPharma, AstraZeneca); PD-0325901(Pfizer); AMG-706(Amgen); BIBF-1120(Boehringer Ingelheim); SU-6668(Taiho); CP-547632(OSI); AEE-788(Novartis); BMS-582664(Bristol-Myers Squibb); JNK-401(Celgene); R-788(Rigel); AZD-1152 HQPA(AstraZeneca); NM-3(Genzyme Oncology); CP-868596(Pfizer); BMS-599626(Bristol-Myers Squibb); PTC-299(PTC Therapeutics); ABT-869(Abbott); EXEL-2880(Exelixis); AG-024322(Pfizer); XL-820(Exelixis); OSI-930(OSI); XL-184(Exelixis); KRN-951(Kirin Brewery); CP-724714(OSI); E-7080(Eisai); HKI-272(Wyeth); CHIR-258(Chiron); ZK-304709(Schering AG); EXEL-7647(Exelixis); BAY-57-9352(Bayer); BIBW-2992(Boehringer Ingelheim); AV-412(AVEO); YN-968D1(Advenchen Laboratories); 미도스타우린(Midostaurin)(Novartis); 페리포신(Perifosine)(AEterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute); AG-024322(Pfizer); AZD-1152(AstraZeneca); ON-01910Na(Onconova); 및 AZD-0530 (AstraZeneca)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

약학조성물:

투여를 위해, 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체는 약학조성물로서 제형화될 수 있다. 항-인간-HER3 모노클로날 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 약학조성물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 알려진 방법에 따라 제형화될 수 있고, 여기서 치료적 분자는 약학적으로 허용되는 캐리어와의 혼합물로 조합될 수 있다. 조성물은 이의 투여가 투여받는 환자에 의해 용인될 수 있으면 "약학적으로 허용되는 캐리어"로 불린다. 살균 포스페이트-완충된 살린이 약학적으로 허용되는 캐리어의 일 예이다. 다른 적합한 캐리어가 해당 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있다(예를 들어, Gennaro(ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) 참조). 제형은 하나 이상의 부형제, 방부제, 용해제, 완충제, 유리병 표면상에서 단백질의 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 더 포함할 수 있다.

약학조성물의 형태, 투여의 경로, 투여량 및 식이요법은 치료되야 하는 상태, 병의 중증도, 환자의 나이, 체중 및 성별 등에 자연적으로 의존한다.

본 발명의 약학조성물은 국부, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.

바람직하게는, 약학조성물은 주사될 수 있는 제형을 위해 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 이들은 특히 등장성 살균 식염수(saline solution)(모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 살균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사가능한 용액의 구성을 가능하게 하는 건조, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.

투여를 위해 사용되는 투여량은 적절한 병리학, 또는 선택적으로 원하는 치료 기간의 다양한 매개변수의 함수로, 특히 사용된 투여 모드의 함수로 조정될 수 있다.

약학조성물을 제조하기 위해, 유효량의 항체가 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 수 있다.

주사용으로 적합한 약학 형태는 살균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 주사가능한 살균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 살균되어야하고, 용이한 주사가능성(syringability)이 존재하는 범위 내로 유체성이어야 한다. 제조 및 저장의 조건에서 안정적이어야 하고, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.

유리 염기 또는 약물학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀루로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합하여 물 중에 제조될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 유류 중에 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 보통 조건에서, 상기 제조는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 포함한다.

본 발명의 항체는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)을 포함하고, 이는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 제조될 수 있다. 또한, 유리 카르복실기에 의해 형성된 염은 예를 들어, 나트륨, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.

또한, 캐리어는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 포함하는, 용매 또는 분산매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 원하는 입자크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제(isotonic agent), 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 조성물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에서의 사용에 의해 달성될 수 있다.

주사가능한 살균 용액은 적절한 용매에 활성화합물을 원하는 양으로 전술한 다양한 다른 성분과 함께 첨가하고, 여과살균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성성분, 및 전술된 필요한 다른 성분을 염기성 분산매질을 포함하는 살균 운반체에 첨가함으로써 제조된다. 주사가능한 살균용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 앞서 살균여과된 용액으로부터 활성성분 및 임의의 원하는 추가적인 성분의 분말을 생산하는 진공건조 및 동결건조 기법이다.

또한, 직접주사를 위한 더욱 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 고려되고, 여기서 높은 농도의 활성제를 작은 종양 구역에 전달하는 극히 빠른 침투를 위해 용매로서 DMSO의 사용이 고려된다.

제형화되면, 용액은 투여 제형에 적합한 방법 및 약학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 전술된 주사가능한 용액의 종류와 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐(drug release capsule) 등도 사용될 수 있다.

수용액 중의 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요하면 적절하게 버퍼(버퍼)되고, 액체 희석액은 우선 충분한 살린 또는 글루코스에 의해 등장성이 되도록한다. 상기 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 같은 이유로, 사용될 수 있는 살균 수성 매질이 본 발명의 기재내용에 비추어 해당 분야의 통상의 기술자에 알려질 것이다. 예를 들어, 1회 투여량이 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해된 후, 1000 ml의 피하주액(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나, 권장된 주입 지점에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, p. 1035-1038 및 1570-1580 참조). 대상체의 상태에 따라 투여량의 변화가 필연적으로 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 자가 어떠한 경우에도 각 대상체를 위한 적절한 투여량을 결정할 것이다.

본 발명의 항체는 1회 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 mg, 또는 약 0.001 내지 0.1 mg, 또는 0.1 내지 1.0 mg, 또는 약 10 mg 정도를 포함하도록 치료 혼합물에 제형화될 수 있다. 또한, 복수회 투여로 투여될 수 있다.

정맥내 또는 근육내 주사같은 비경구 투여를 위해 제형화된 화합물에 부가하여, 다른 약학적으로 허용되는 형태는 예를 들어 타블렛 또는 경구 투여를 위한 다른 고체; 지속방출 캡슐(time release capsule); 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.

특정 구현예에서, 리포좀 및/또는 나노입자의 사용이 숙주 세포로 항체의 도입을 위해 고려된다. 리포좀 및/또는 나노입자의 형성 및 사용은 해당 분야의 통상의 기술자에 알려져 있다.

나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재생가능한 방법으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 폴리머의 과부하에 따른 부작용을 피하기 위해, 상기와 같은 초미세 입자(약 0.1 ㎛의 크기)가 일반적으로 체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계된다. 상기 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에서 사용이 고려되고, 상기 입자는 용이하게 제조될 수 있다.

수성 매질 중에 분산된 인지질로부터 리포좀이 형성되고, 동시에 다층 동심 2중막 소포체(다층 소포체(MLV)로도 불림)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 200 내지 500Å의 직경을 갖고, 코어 내에 수용액을 포함하는 소형 단층 소포체(SUV)의 형성을 야기한다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다.

키트 :

마지막으로, 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 하나 이상 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 키트는 HER3 발현를 검출하는 것, 또는 치료적 또는 진단적 어세이에 용도가 있다. 본 발명의 키트는 고체 지지체, 예를 들어 조직 배양 플레이트 또는 비드(예를 들어, 세파로스(sepharose) 비드)에 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 시험관내(in vitro) HER3의 검출 및 정량을 위한 항체를 포함한 채로 제공될 수 있다. 검출에 유용한 상기 항체는 형광물질 또는 방사능표지와 같은 표지와 함께 제공될 수 있다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 따라 더욱 자세하게 설명될 것이다. 그러나, 이들 도면 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 고려되어서는 안 된다.
도 1a는 선별된 모노클로날 항체의 HER3 vs HER2 및 Fc 결합을 나타낸다.
도 1b는 Ab6 항체에 관한, 본 발명의 정제된 마우스 IgG 항체의 마우스 HER3에 대한 반응성을 나타낸다.
도 2는 HER3 항원에 대한 정제된 mAb의 ELISA 결합 곡선(a) 및 제조(b)를 나타낸다.
도 3은 wt-, EGFR-, HER2-, HER3-, HER2/HER3- 및 EGFR/HER4-형질감염된 NIH 3T3 세포에 대한 정제된 마우스 IgG 4H9-B11, 9B4-D6, 9F7-F11, 11G10-D2, 12H8-B11, 14H1-H8, 15D4-F2 및 16D3-C1의 유동 세포분석 특이적 결합 프로파일(기하 평균)을 나타낸다. Px 항체는 음성 대조군이다. 경쟁자 항체 Ab6 및 U1-59가 표시되었다.
도 4는 mAb 16D3-C1, 9F7-F11 및 12H8-B11의 BIACORE 결합 동적특성을 나타낸다. 표 6은 Ab6 항체에 대한 본 발명의 정제된 마우스 항체 9F7-F11, 11G10-D2, 12H8-B11, 14H1-H8, 15D4-F2 및 16D3-C1의 친화도를 나타낸다.
도 5는 SKBR3 세포 상의 헤리굴린과 HER3-특이적 항체 16D3-C1, 9F7-F11 및 12H8-B11의 FACS 경쟁 실험을 나타낸다. HER3-특이적 양성 대조군 항체 A, B 및 C가 표시되었다.
도 6은 ELISA에 의해 측정된, 항-HER3 뮤린 mAb에 의해 처리된 HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포의 전체 HER2 인산화를 나타낸다.
도 7은 ELISA에 의해 측정된, 항-HER3 뮤린 mAb에 의해 처리된 HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포의 전체 HER3 인산화를 나타낸다.
도 8은 HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포에서 항-HER3 mAb에 의한 HER3/Y1196 HER2(a) 및 Y1262 HER3/Y1112 HER2(b)의 인산화의 억제를 나타낸다. GAPDH는 웨스턴 블롯에서 대조군으로 사용되었다.
도 9는 BxPC3 췌장 암종 세포에서 항-HER3 뮤린 mAb 16D3-C1 및 9F7-F11을 사용함에 따른 HER2/HER3 수용체 및 다운스트림(dowstream) PI3K/Akt 시그날링(signalling)의 인산화의 억제를 나타낸다.
도 10은 BxPC3 췌장 암종에서 HER3 내재화의 항체-유도 억제를 웨스턴 블롯에 의해 나타내고(a), HER3 내재화의 정량을 나타낸다(이미지 J 소프트웨어)(b).
도 11은 MTS 어세이에 의해 측정된, HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포 및 종양 세포주의 뮤린 HER3-특이적 항체에 의한 증식 억제를 나타낸다.
도 12는 TR-FRET 분석에 의해 측정된, HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포에서 항-HER3 mAb에 의한 HER2/HER3 헤테로다이머화의 억제를 나타낸다.
도 13은 16D3-C1 mAb에 의해 인식된 에피토프를 식별한다. (A) 항-HER3 항체 16D3-C1에 의해 인식된 영역의 스폿 분석, (B) 16D3-C1 mAb에 의해 인식된 영역의 알라스칸(Alascan) 분석, 및 (C) HER3 펩티드에 결합하는 16D3-C1의 픽셀 정량(이미지 J 소프트웨어).
도 14는 9F7-F11 mAb에 의해 인식된 에피토프를 식별한다. (A) 항-HER3 항체 9F7-F11에 의해 인식된 영역의 스폿 분석, (B) 9F7-F11 mAb에 의해 인식된 영역의 알라스칸 분석, 및 (C) HER3 펩티드에 결합하는 9F7-F11의 픽셀 정량(이미지 J 소프트웨어).
도 15는 비리간드 HER3 수용체의 결정학적 구조에서 mAb 16D3-C1 및 9F7-F11에 의해 인식된 스폿-기여 잔기(Spot-Contributing Residue)의 포지셔닝(pdb 1M6B)(좌측), 및 페르투주마브에 결합된 HER2 수용체의 결정학적 구조에서 상기 에피토프의 슈퍼포지션(우측)(pdb 1S78)을 나타낸다.
도 16은 HRG-중독된 HER2-비증폭/PIK3CA-wt/p53-mut 편평세포 A431 암 세포가 이종이식된 누드 마우스에서 mAb 16D3-C1 및 9F7-F11에 의한 종양 진행의 억제(A), 및 대응되는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선(B)을 나타낸다.
도 17은 HER2-비증폭/PIK3CA-wt/p53-wt 췌장 BxPC3 암 세포가 이종이식된 누드 마우스에서 mAb 9F7-F11 및 16D3-C1에 의한 종양 진행의 억제(A), 및 대응되는 카플란-마이어 생존 곡선(B)을 나타낸다.
도 18은 운반체- 또는 16D3-C1-처리된 마우스로부터의 추출된 BxPC3 이종이식체에서 전체 HER3 발현 및 Y1289-HER3의 인산화 수준을 나타낸다.
도 19는 HRG-중독된 HER2^low 편평세포 A431 (A) 및 폐 A549 (B) 암 세포에서, 단독으로 또는 트라스투주마브와 조합하여 사용된 HER3-특이적 mAb 16D3-C1에 의한 종양 진행의 억제를 나타낸다.

실시예 1: 면역화에 의한 마우스 모노클로날 항체 생성

하이브리도마의 Balb /c 면역화 및 생성

HER3에 대한 모노클로날 항체가 Balb/c 마우스의 순차적 면역화(sequential immunization)에 의해 개발되었다. HER3-Fc 단백질(R&D 시스템)이 항원으로서 사용되었다. 5마리의 Balb/c 마우스의 제1군에 아쥬반트 프로인트 완전체 또는 불완전체(Freund's complete or incomplete)의 존재하에서 0일, 14일 및 28일에 10 ㎍의 가용성 HER3-Fc를 피하 주사하였다. 5마리의 Balb/c 마우스의 제2군에 HER2/HER3 헤테로다이머 형성을 촉진하기 위해 헤레굴린(HRG)에 의해 미리 자극된, HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포주(약 2x10⁶ 세포)를 복강내 주사하였다. 항체 반응을 관찰하기 위해, 항체 타이터(titer)가 ELISA 또는 유동 세포분석(flow cytometry)에 의해 측정되었다. 면역된 마우스로부터의 췌장 세포가 골수종(myeloma) PX63Ag8.653을 사용하여 이미 공지된 프로토콜(Salhi et al. Biochem. J. 2004)에 따라 융합되었다. 웰(well) 당 10⁵개의 융합된 세포가 하이브리도마 선별을 위한 HAT 배지에 의해 플레이트에서 배양되었다. 융합 후 12일 후에, 하이브리도마 상청액 스크리닝(screening)이 단백질 HER3-Fc를 항원으로 사용함으로써 ELISA에 의해 수행되었다. 대조군에서, 스크리닝(screening)은 오직 항원 HER2-Fc 및 Fc 단편을 구별하는 것과 동시에 수행될 것이다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 13개의 HER3-특이적 모노클로날 항체(mAb)가 선별되었다. 이들은 가용성 HER3-Fc에 특이적이고, Fc 성분을 인식하지 않는다. 4개의 항-HER3이 HER3-Fc-면역화된 Balb/c 마우스로부터 선별되었고, 9개의 항-HER3이 헤레굴린-자극된 HER2/HER3-형질감염된 3T3 세포에 의해 면역화된 Balb/c 마우스로부터 선별되었다. HER2-Fc 항원과의 결합은 관찰되지 않았다.

선별된 항-HER3 항체가 2개의 다른 항-HER3 항체 Ab6(Merrimack Pharmaceuticals) 및 U1-59(Amgen/U3 Pharma-Daiichi Sankyo)와 비교되었다. U1-59 및 Ab6은 각각 특허 US2008/0124345A1 및 US2009/0291085A1의 개시내용에 기반하여 구축되었다.

마우스 HER3 수용체와의 교차반응성은 250 ng/ml에서 코팅된 고정화 인간 HER3-Fc 및 마우스 HER3-Fc(재조합 마우스 세포외 도메인 ErbB3/HER3 Fc 키메라, R&D 시스템)에 의한 비교 ELISA 어세이를 통해 분석되었다. Ab6 항체는 마우스 및 인간 HER3을 모두 인식하였지만, 본 발명의 클론 대부분은 1 ㎍/ml의 농도에서 마우스 HER3과 교차반응하지 않았다(도 1b). 클론 9F7-F11 및 16D3-C1은 가장 좋은 결합체(binder)였다. 무관한 대조군 항체 Px는 인간 및 마우스 HER3 수용체 어디에도 결합하지 않았다.

HER3 에 대한 ELISA 결합

96-웰 효소 면역어세이 플레이트(Nunc, Paisley, UK)가 4℃에서 밤새 160 mM PBS pH 7.2 중에 250 ng/ml의 농도로 HER3-Fc 항원에 의해 코팅되었다. 0.1% Tween 20(PBS-T)을 포함하는 160 mM PBS pH 7.2에서 4번의 세척 후에, 플레이트는 PBS-T 버퍼(buffer) 중 소혈청 알부민(BSA)의 1% 용액에 의해 37℃에서 60분 동안 포화되었다. 정제된 HER3-특이적 mAb의 2배 연속 희석액이 PBS-T에서 4번 세척 후에 첨가되었고, 플레이트는 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. PBS-T에서 4번 세척 후에, 100 ㎕의 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG 항체(Sigma)가 각 웰에 첨가되었다. 접합체는 PBS-T-1% BSA 중에 1:2000 희석하여 사용되었다. 플레이트는 37℃에서 60분 동안 배양된 후, PBS-T에서 4번 세척되었다. 마지막으로, 오르토-페닐렌디아민 용액(Sigma)이 암실에서 주위온도에서 30분 동안 첨가되었고, 흡광도가 450 nm에서 측정되었다. 항-HER3 mAb는 투여량-특이적인 방식으로 HER3 항원과 특이적으로 반응하였으며; 항체 16D3-C1, 9F7-F11, 15D4-F2 및 23H2-B3이 가장 반응성이 높았다(도 2a). 반면, Ab6 및 U1-59 항체는 HER3 수용체에 대한 결합에 대해 반응성이 더 낮았다. 항체 16D3-C1, 9F7-F11, 15D4-F2 및 23H2-B3에 대해 50%의 흡광도를 제공하는 항체 농도는 1-10 ng/ml 미만이었고, 반면 Ab6 및 U1-59는 200 ng/ml 주변에서 50%-시그날을 나타냈다. HER3-특이적 항체 모두는 복수액(ascitic fluid)에서 제조되었고, 단백질 A-면역친화성에 의해 정제되었다(도 2b).

HER3 -양성 세포에 대한 유동 세포분석

EGFR-, HER2-, HER3-, HER2/HER3- 및 EGFR/HER4-형질감염된 NIH 3T3 섬유아세포(10⁶ 세포)가 항-HER3 mAb와 함께 PBS-BSA 0.1%, 4℃에서 1시간 동안 배양되었다. PBS-BSA 0.1%에서 3번 세척 후에, 세포는 플루오레세인-접합된 항-마우스 IgG(1:50)(Sigma)와 함께 4℃에서 암실에서 45분 동안 배양되었다. 그 후, 세포는 EPICS 유동세포분석장치(Beckman-Coulter, Fullerton, CA)를 사용한 분석을 위해 PBS에서 3번 세척 및 현탁되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, HER3-특이적 mAb는 모두 HER3- 및 HER2/HER3-에 결합하였지만, 야생형-, EGFR-, HER2- 및 EGFR/HER4-형질감염된 NIH 3T3 세포에는 결합하지 않았다. HER2/HER3-형질감염된 NIH3T3 세포에 대한 결합도(기하 평균)는 항체 Ab6 및 U1-59보다 항체 9B4-D6, 12H8-B11, 15D4-F2 및 16D3-C1에 대해 더 높았다.

BIACORE 에 의한 친화도 측정

선별된 항체의 HER3 결합이 BIACORE 분석에 의해 확인되었다(도 4). BIACORE 분석은 Montpellier 암연구소에 위치한 상호작용 분석 시설(PP2I 플랫폼, M. Pugniere)을 사용하여 수행되었다. 선별된 항체에 대한 HER3 수용체의 결합의 동력학적 매개변수가 BIACORE 3000 장치(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용한 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 25℃에서 측정되었다. HER3-특이적 항체가 포획된 토끼 항-마우스 폴리클로날 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하여 CM5 센서칩에 고정되었다. 포획된 항체는 제조사의 지시에 따라 고정되었다. 그 후, 10 mM의 헤페스(Hepes)(pH 7.4), 3 mM의 EDTA, 150 mM의 NaCl, 및 0.005%의 비이온성 계면활성제 P20(GE Healthcare)를 포함하는 HBS-EP 버퍼 중의 HER3 수용체가 유동세포에 50 ㎍/ml의 농도로 주입되었고, 그 후 해리 상(dissociation phase)에 대해 10 mM HCl 용액에 의한 재생 단계가 수행되었다(도 4). 유속은 50 ㎕/min이었다. 모든 센서그램(sensorgram)은 대조 유동 세포 시그날을 감하여 보정되었다. 데이터는 BIAevaluation Version 4.1.1 소프트웨어를 사용하여 2가 분석물질 모델(bivalent analyte model)에 포괄적으로 맞추어졌다(도 4). 선별된 항체에 대한 연합 속도(association rate)(k _a )는 Ab6 항체에 대해 획득된 것과 상당히 유사하게 약 1x10⁵M^-1s^-1이었다(표 1). 반면, 각 항체에 대한 해리상수는 더욱 가변적이었고, 이는 K_D 값의 뚜렷한 차이가 관찰되는 것을 설명한다. 항체 16D3-C1, 12H8-B11 및 9F7-F11은 Ab6 항체에 대해 측정된 값과 유사하게 1-5 nM의 범위에서 최고의 친화도를 나타냈다.

헤레굴린과의 경쟁

SKBR3 세포-기초 어세이에서 항체가 HER3에 결합하는 것을 억제하는 HRG의 능력을 정량하기 위해 세포분석 경쟁 실험이 수행되었다. 이를 위해, 10⁵ SKBR3 세포가 얼음 상에서 1.5시간 동안 경쟁하는 HRG 리간드의 농도를 다양하게 하여 사전배양되었다. PBS-1% BSA에 의해 1번 세척 후, 항-HER3 mAb가 50% 최대 결합을 제공하는 농도에서 각 웰에 얼음 상에서 1시간 동안 첨가되었다. 일부 실험에서, HRG 리간드 및 항-HER3 항체가 얼음 상에서 2시간 동안 공동배양되었다. 그 후, 세포가 세척되고, Quanta 장치(Beckman-Coulter)에서의 세포분석 전에 적절한 FITC-접합된 2차 항체(Sigma)의 1:60 희석액과 얼음 상에서 45분 동안 더욱 배양되었다. FACS에 의한 경쟁 실험은 9F7-F11 항체가 헤레굴린과 경쟁하지 않았다는 것을 입증하였고, 이는 상기 항체가 HRG-결합 부위에 결합하지 않았다는 것을 시사한다(도 5). 9F7-F11 항체 결합은 HRG가 첨가되었을 때 더욱 강화되었고, 반면 양성 대조 항체 A의 결합은 HRG 배양에 의해 변화되지 않았다. 이와 달리, 항체 12H8-B11 및 16D3-C1, 뿐만 아니라 양성 대조 항체 B 및 C는 HER3 수용체에 대한 HRG-의존성 결합 감소를 나타내었고, 이는 상기 항체에 의해 인식된 에피토프가 HRG-결합 부위에 가깝거나 HRG-결합 부위에 위치하거나, 또는 HRG가 다이머화를 위해 활성 HER3 수용체의 변형을 유도하는 경우에 항체 결합을 위해 입체구조적으로 손상될 수 있다는 것을 입증한다(도 5). 50% 결합을 야기하는 억제 농도는 항체 12H8-B11 및 16D3-C1에 대해 약 2.5 nM의 HRG 리간드였다. 항체와 HRG의 순차배양 또는 공동배양에 의해 유사한 결과가 획득되었다.

실시예 2: 본 발명의 항-HER3 항체에 의한 HER2 및 HER3 인산화의 억제

형질감염된 NIH 3 T3 섬유아세포의 HRG 자극

총 8x10⁴의 ErB2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포가 6-웰 플레이트에서 RPMI-FCS 5%에서 72시간 동안, 추가적으로 RPMI-FCS 1%에서 24시간 동안 배양되었다. 그 후, 세포가 37℃에서 1시간 동안 RPMI-FCS 1% 중 20 ㎍/ml의 농도로 HER3-특이적 마우스 mAb와 배양되었다. 항체를 제거한 후에, 항체-처리된 세포를 100 ng/ml HRG의 용액과 37℃에서 10분 동안 배양함으로써 리간드 자극이 수행되었다. 차가운 Dulbecco-PBS(D-PBS)에서 세척한 후, 세포는 0.5 ml의 차가운 D-PBS에서 고무 폴리스먼트를 사용하여 플라스틱 디쉬에서 2번 스크레이프(scrape)되었다. 11,000 g에서 1분 원심분리 후에, 세포 펠릿이 20 mM의 Tris pH 7.5, 150 mM의 NaCl, 1.5 mM의 MgCl₂, 1 mM의 EDTA, 1%의 트리톤(Triton) X-100(v/v), 10%의 글리세롤(v/v), 100 mM의 소듐 플루오라이드, 0.1 mM의 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM의 소듐 오르토바나데이트(Sigma), 및 하나의 완전 프로테아제 억제제 혼합물 타블렛(Roche Diagnostics, Meylan, France)을 포함하는 50 ㎕의 세포용해 버퍼에서 용해되었다. 30분의 배양 후에, 샘플에서 원심분리에 의해 불용성 분획을 제거하고, 세포 용해액의 단백질 농도를 브래드포드 비색반응(Bradford colorimetric reaction)에 의해 측정하였다.

HER2/HER3-형질감염된 3T3 섬유아세포에서 HER2 및 HER3 전체 인산화의 ELISA 측정

세포용해액의 티로신-인산화된 HER2 및 HER3이 제조사의 지시에 따라 DuoSet^R 샌드위치 ELISA(RD 시스템s, Minneapolis, MN)를 사용하여 정량되었다. 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, mAb 16D3-C1 및 9B4-D6은 대조군 트라스투주마브처럼 HER2 및 HER3 전체 인산화를 억제하였다. mAb 9F7-F11 및 24E3-C10은 HER2의 인산화를 차단하였다.

HER2/HER3-형질감염된 3T3 섬유아세포에서 Y1112 및 Y1196 HER2 인산화 vs Y1262 및 Y1289 HER3 인산화의 PAGE - SDS 및 웨스턴 블롯 분석

환원 조건 하에서 7% SDS-PAGE 상의 전기영동 후에, 세포용해액은 0.1% Tween 20(TNT) 및 5% 탈지 분유를 포함하는 150 mM NaCl 버퍼, 25 mM Tris pH 7.4에서 주변온도에서 1시간 동안 포화된 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Millipore, Molsheim, France)으로 이동되었다. HER2-인산화된 Y1112(Millipore) 또는 Y1196(RD systems), 및 HER3-인산화된 Y1262(RD systems) 또는 Y1289(Cell Signaling Technology)에 대한 항체의 TNT-BSA 5% 용액 1 ㎍/ml가 4℃에서 18시간 동안 배양되었다. TNT에서 5번의 세척 후에, 블롯(blot)이 주위온도의 TNT-5% 탈지 분유에서 1시간 동안 퍼옥시다제-접합된 마우스-특이적(1/2000) 또는 래빗-특이적(1/10000) 항체(Sigma)와 적절하게 배양되었다. TNT에서 5번 세척 후에, 블롯은 화학발광 기질(Western Lightning Plus-ECL, Perkin Elmer)을 사용하여 시각화되었다. 도 8a 및 도 8b에서 웨스턴 블롯에 의해 나타난 바와 같이, mAb 16D3-C1 및 9B4-D6은 대조군 트라스투주마브처럼 Y1196 및 Y1112 HER2 인산화, 및 Y1262 및 Y1289 HER3 인산화를 차단하였다.

BxPC3 췌장 암종 세포에서 HER3 수용체의 인산화 및 내재화의 억제

500 및 1000개의 BxPC3 종양 세포가 6-웰 배양 플레이트의 각 웰에 37℃에서 24시간 동안 첨가되었다. RPMI 완전 배지에서 1% FCS와 16시간 동안 혈청기아(serum starvation) 및 추가 세척 후에, 세포는 50 ㎍/ml 농도의 항체 16D3-C1 및 9F7-F11, 또는 음성 대조군 항체와 37℃에서 15분 동안 세척 및 후속되는 100 ng/ml의 헤레굴린 희석액에 의한 자극 또는 무자극 전에 사전배양되었다. 그 후, 세포는 세척되고, 스크레이프되고, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1% 트리톤, 10% 글리세롤, 0.1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 100 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM 소듐 오르토바나데이트(Sigma-Aldrich), 및 하나의 완전 프로테아제 억제제 혼합물 타블렛(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)을 포함하는 버퍼에 세포용해되었다. 30분 배양 후에, 샘플에서 원심분리에 의해 불용성 분획이 제거되고, 세포용해액의 단백질 농도가 브래드포드 어세이에 의해 측정되었다. 이와 같은 단백질 용해액은 램리(Laemmli) 버퍼(표적 및 세포주에 따라 1-20 ㎍의 총 단백질)와 직접적으로 혼합되고, 95℃에서 5분 동안 가열되었다. 환원 조건에서 7% SDS-PAGE 상의 전기영동 후에, 단백질이 5% 탈지 분유를 포함하는 TNT 버퍼(Tris 25 mM pH 7.4　, NaCl 150 mM, Tween 0.1%)에서 25℃에서 1시간 동안 포화된 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Millipore)으로 이동되었다. 키나제 수용체 또는 시그날링 키나제에 대한 제1항체, 및 이들의 인산화된 형태가 TNT-5% BSA 버퍼에서 4℃에서 18시간 동안 배양되었다. TNT 버퍼에서 5번 세척 후에, 퍼옥시다제-접합된 토끼, 염소 또는 마우스 폴리클로날 항체(Sigma-Aldrich)가 5% 탈지 분유를 포함하는 TNT 버퍼에 25℃에서 1시간 동안 적절하게 첨가되었다. TNT 버퍼에서 5번 세척 후에, 블롯은 화학발광 기질(Western lightning Plus-ECL, Perkin Elmer)을 사용하여 시각화되었다.

놀랍게도, 항체 16D3-C1 및 9F7-F11은 HER3 잔기 Y1289 및 Y1262 상의 리간드-유도 인산화를 차단하였으며(도 9); 항체 9F7-F11이 가장 효율적이었다. Ser473 및 Thr308 상의 Akt 인산화의 억제는 BxPC3 세포상에서 항체 16D3-C1 및 9F7-F11의 15분 단기 처리 후에 부수적으로 나타났다. 또한, AKT-촉발된 다운스트림 시그날링의 인산화는 선별된 항체, 즉 단백질 합성을 감소시키는 포스포(phospho)-S6 리보좀 단백질 인산화의 억제, 세포사멸 및 세포 주기 정지를 야기하는 유전자 핵 전사를 촉진하는 FoxO1a의 인산화의 봉쇄, p53 분해를 방지하는 포스포-MDM2의 감소, 및 세포 주기를 차단하고 세포사멸을 촉진하는 포스포-GSK3α/β의 억제에 의해 영향을 받았다(도 9).

BxPC3 세포는 다양한 시간과 온도에 대해 9F7-F11 및 16D3-C1 항체에 노출시킨 후에 HER3 수용체의 세포 표면 발현을 위해 분석되었다. 도 10a에 나타난 바와 같이, 37℃에서 BxPC3 세포의 2시간-항체 배양은 HER3 세포 표면 발현을 강하게 감소시켰다. 세포가 4℃에서 처리되었을 때 상기 항체-유도된 HER3 하향 조절이 폐지되었고, 따라서 이는 HER3-특이적 항체 9F7-F11 및 16D3-C1이 HER3 내재화를 유도하였다는 것을 입증한다. 반면, BxPC3 세포가 Ab6 항체에 의해 처리되었을 때, HER3 내재화가 더 낮았다(도 10a). HER3 내재화의 정량에 의해, HER3 내재화를 유도하는데 Ab6보다 16D3-C1 및 9F7-F11 항체가 더 효율적이라는 것이 확인되었다(도 10b). 2시간-항체 처리는 항체 16D3-C1 및 9F7-F11에 의해 각각 73% 및 78% HER3 내재화, 및 Ab6 항체에 대해 42% 내재화만을 유도하였다(도 10b).

실시예 3: 세포 증식의 억제

총 10⁴의 HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 섬유아세포가 DMEM 완전 배지에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 배양되었다. 그 후, 세포는 100 ㎍/ml의 최종 농도에서 항-HER3 항체와 37℃에서 5일 동안 배양되었다. 증식은 40 ㎕/웰의 테트라졸륨 화합물 MTS[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨] 및 전자 커플링 시약 PMS(페나진 메토설페이트)을 포함하는 용액을 첨가함으로써 측정되었다. MTS는 세포에 의해 조직 배양 배지에서 가용성인 포르마잔 생성물로 환원된다. 490nm에서 포르마잔의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다. 도 11에 나타난 바와 같이, mAb 16D3-C1 및 9F7-F11은 각각 HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 섬유아세포 증식의 23.7% 및 32.0%를 억제하였다. HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3의 유의적인 억제는 다른 HER3-특이적 항체와는 관찰되지 않았다. 또한, 16D3-C1 및 9F7-F11은 A431 편평세포 암종, 유방암 세포주 MCF7 및 MDA-MB361, 제1 복수(ascite) 1(클론 A5) 및 2(클론 C9)로부터의 상피 난소 종양, 전이 2815, 및 OVCAR3 및 SKOV3 세포주의 증식을 억제하였다. 유방암 세포주 T47D, 및 A549 폐 암종의 증식은 mAb 9F7-F11에 의해서만 억제되었다.

실시예 4: 시간분해-형광 공명 에너지 전이(TIME RESOLVED-FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER: TR-FRET)에 의한 HER2/HER3 헤테로다이머화의 항체-유도 억제의 측정

어세이는 각각 루미4-테르븀 크립테이트(Lumi4-terbium cryptate) 및 D2 수용체 염료(Cisbio Bioassays)에 의해 표지된 항-HER2(FRP5) 및 항-HER3(15D4-F2)을 사용하여 부착 세포에서 수행되었다. 상기 mAb는 연구된 관심 mAb와 다른 이들의 표적 에피토프에 따라 선택되었다. HER2/HER3-형질감염된 NIH 3T3 세포는 10%의 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM 배지(페놀 레드 없이)에서 96-웰 살균된 블랙 마이크로플레이트에서 웰 당 3x10⁵로 24시간 동안 플레이트되었다. 이들은 다양한 농도의 HER3-특이적 뮤린에 의해 37℃에서 30분 동안 처리되었다. KREBS 버퍼에서 세척 후에, 세포는 10% 포르말린(Sigma-Aldrich)에서 2분 동안 고정되었고, KREBS에 의해 1번 세척되었다. 37℃에서 6시간 동안 KREBS에 희석된 표지된 항체(각각 5 nM)와 배양 후에, 세포는 KREBS 버퍼에 의해 4번 세척되었다. 루미4-테르븀 및 D2의 형광발광이 Pherastar FS 장치에서 337 nm 여기(excitation)에서 각각 620 및 665 nm(60㎲ 딜레이(delay), 400㎲ 인테그레이션(integration))에서 측정되었다. KREBS 중 루미4-테르븀 표지된 항체의 연속 희석액이 동일한 마이크로타이터 플레이트에서 동시에 측정되었으며, 665 nm 방출(emission)이 620 nm 방출에 대해 플롯(plot)되었다. 결과 곡선은 샘플의 620 nm 방출(E620)을 사용하여 테르븀으로부터의 665 nm 기여도(contribution)(E665_Tb)를 산출하기 위해 사용되었다. TR-FRET 시그날은 Δ665(%) = Δ665 / 665_Tb로 표현되었으며, 여기서 Δ665 = E665c - E665_Tb이고; 샘플로부터의 665 nm 및 620 nm 방출은 백그라운드(background)로부터 E665c = E665_sample - E665_background 및 E620c = E620_sample - E620_background로 수정되었다. E665_background 및 E620_background은 판독 버퍼만 함유하는 블랭크상에서 측정된 것임. Δ665(%)로 표현된 TR-FRET 시그날은 HER2/HER3 다이머의 양을 나타낸다. 620 nm 시간분해 형광 방출(time resolved fluorescence emission)은 HER2 양과 연관된다. 동시에, D2의 즉각 형광(prompt fluorescence)은 HER3 수용체를 정량하기 위해 620 nm 여기에 따라 670 nm에서 측정되었다. 각 샘플에 대해, 대조군은 미처리된 세포 또는 무관한 항체, 트라스투주마브 및 페르투주마브에 의해 처리된 세포에 의해 동일한 실험을 수행함으로써 획득되었다. 도 12에 나타난 바와 같이, mAb 16D3-C1, 24E3-C10 및 9F7-F11은 HER2/HER3 헤테로다이머화의 투여량-의존성 억제를 유도하였고, 반면 다른 항체(특히, 12H8-B11)는 그렇지 않았다. 무관한 항체에 의해서는 차단(blockade)이 관찰되지 않았다. 페르투주마브 및 트라스투주마브는 강하게 다이머 억제를 유도하였다.

실시예 5: 항- HER3 항체의 에피토프 맵핑

막이 아비메드(Abimed)(Langenfeld, Germany)로부터 획득되었다. Fmoc 아미노산 및 N-히드록시벤조트리아졸은 노바바이오켐(Novabiochem)(Laufelfingen, Switzerland)으로부터 획득되었다. ASP222 로봇(Abimed)이 커플링 단계를 위해 사용되었다. HER3 수용체의 세포외 도메인을 나타내는, 1개의 잔기로 프레임쉬프트(frameshift)된 213개의 중복 도데카펩티드가 셀룰로스 막에서 합성되었다. 모든 펩티드가 이들의 N-말단에서 아세틸화되었다. 펩티드 서열이 조립된 후에, 기를 보호하는 측쇄가 트리플루오로아세트산 처리에 의해 제거되었다. TBS 버퍼(137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 50 mM Tris)에서 3번 세척 후에, 막이 0.1% Tween 20(TBS-T) 및 2% 반탈지유(semi-skimmed milk)를 포함하는 TBS 버퍼에 의해 4℃에서 18시간 동안 포화되었다. TBS-T에서 1번 세척 후에, 항-HER3 mAb 16D3-C1 및 9F7-F11의 1 ㎍/ml 용액이 막에 37℃에서 1시간 30분 동안 첨가되었다. 결합된 항체는 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG(Sigma, St Louis, MO)의 1:2000 희석액에서 1시간 동안 37℃에서 막의 배양, 및 그 후 전기화학형광 발현(electrochemiluminescent revelation)에 의해 검출되었다. 16D3-C1 mAb는 111-129 영역을 인식하였고(도 13a), 반면 9F7-F11 mAb는 35-53 영역에 결합하였으며(도 14a); 상기 두 영역은 HER3 수용체의 D1 도메인에 위치하였다.

상기 항체에 의해 인식된 에피토프를 정밀하게 식별하기 위해, 스폿 알라닌 스캐닝 분석이 수행되었다. 도 13a 및 도 13b에서 앞서 식별된 항체-면역반응성 아미노산 서열에 대응되는 12개의 펜타데카펩티드, 및 각 펩티드의 15개의 알라닌 유사체가 스폿법에 의해 합성되었다. 셀룰로스-결합된 펩티드의 항체 반응성이 전술한 바와 유사하게 분석되었다. 스폿의 반응성이 막을 스캔하고, 이미지 J 소프트웨어 1.44(http://rsbweb.nih.gov/ij)에 의해 스폿의 강도를 측정함으로써 평가되었다. mAb 16D3-C1 및 9F7-F11에 의해 인식된 HER3 에피토프에 속하는 스폿 기여 잔기(Spot Contributing Resodue: SCR)는 미변형 펩티드 서열의 20% 이상인 감소된 항체-결합 능력에 기반하여 식별되었다. HER3/D1 도메인으로부터의 5개의 펜타데카펩티드 ¹¹¹ALRQLRLTQLTEILS¹²⁵(서열번호 1), ¹¹²LRQLRLTQLTEILSG¹²⁶(서열번호 2), ¹¹³RQLRLTQLTEILSGG¹²⁷(서열번호 3), ¹¹⁴QLRLTQLTEILSGGV¹²⁸(서열번호 4) 및 ¹¹⁵LRLTQLTEILSGGVY¹²⁹(서열번호 5)의 연구에 의해 mAb 16D3-C1를 위한 결합 모티브(motif)로서 ¹¹²L―T―TEILS¹²²(서열번호 6)가 식별되었고(도 13b), 여기서 Leu¹²⁰, Glu¹²², Ile¹²³ 및 Leu¹²⁴가 주요 SCR이었다(도 13c). 항-HER3 항체 9F7-F11은 HER3/D1 도메인에서 모티브 ⁴⁴LEIVL⁴⁸ (SEQ ID NO:7)를 인식하였고(도 14b), 여기서 잔기 Leu⁴⁴, Ile⁴⁶ 및 Leu⁴⁸는 SCR로서 식별되었다(도 14c).

항체 16D3-C1 및 9F7-F11의 결합 모티브로부터 비리간드 HER3 수용체(pdb 1M6B)의 결정학적 구조에 대해 SCR의 포지셔닝(positioning)을 수행하였다(도 15, 좌측). 9F7-F11 에피토프 ⁴⁴LEIVL⁴⁸는 도메인 3을 60-Å 거리에서 접하고, D2 도메인 위로 돌출된 도메인 1의 시작점에서 튀어나온 β-가닥 중 하나에 층을 이루었다. 16D3-C1 결합 모티프는 D1 도메인의 β-가닥 구조 내부에 더욱 깊숙하게 위치하였다. 현재, 리간드에 결합된 HER3 수용체의 결정 구조는 보고된바 없다. 서열 상동성에 의해, HER3-특이적 항체 16D3-C1 및 9F7-F11에 의해 인식된 에피토프가 페르투주마브에 결합된 HER2 수용체의 결정학적 구조에 겹쳐졌다(pdb 1S78)(도 15, 우측).

실시예 6: 이종이식( Xenograft ) 종양 연구

무흉선(Athymic) 6- 내지 8-주-생 암컷 BALB/c 누드 마우스가 [Janvier and Charles Rivers Laboratories]로부터 구매되었다. HER2-비증폭/PIK3CA-wt/p53-mut 편평세포 A431(1x10⁶), HER2-비증폭/PIK3CA-wt/p53-wt 췌장 BxPC3(3.5x10⁶) 및 HER2-비증폭/PIK3CA-wt/p53-wt 폐 A549(5x10⁶) 암 세포가 무흉선 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 s.c. 주입되었다. 이들은 모두 HER3 수용체를 낮은 수준으로 발현하였다(10000 내지 20000 수용체/세포). 또한, A431 및 A549 암 세포는 HER3 리간드 HRG를 분비하였고, HRG-중독되었다(Yonesaka, 2011, Zhou 2006).

모든 생체내 실험은 동물 실험을 위한 프랑스 지침을 준수하여 수행되었다(조약 no. B34-172-27).

종양이 약 100 mm³의 부피에 도달하였을 때, 종양-보유 마우스가 다른 처리 군에서 임의로 추출되었다. 마우스가 HER3-특이적 항체 16D3-C1 또는 9F7-F11 vs 운반체(PBS)의 i.p. 주사에 의해 처리되었다. 주사된 항체의 양은 6주간 연속하여 1주일에 3번(Q2d, 15mg/kg) 300㎍/회였다. 종양 크기는 캘리퍼(caliper)에 의해 1주일에 2번 측정되었고, 부피는 식 D1xD2xD3/2에 의해 계산되었다. 종양 진행은 식 [(최종 부피)-(최초 부피)]/(최초 부피)에 의해 계산되었다. 또한, 결과는 종양이 2,000 mm³의 정해진 최종 부피에 도달하는데 걸린 시간을 사용하여 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curve)에 의해 표현되었다. 중앙 지연값(median delay)이 마우스의 50%가 정해진 부피에 도달한 종양을 가질 때의 시간을 정의되었다.

A431 암 세포는 HER3 리간드 HRG를 분비하였고(Yonesaka, 2011), 세포당 17000개의 HER3 수용체를 발현하였다. 이식 후 31일(처리의 시작 후 20일에 대응됨), 항-HER3 mAb가 A431 암 세포 종양 성장을 대조군 운반체와 비교하여 유의적으로 약 53±6% 억제하였다(도 16a; p<0.001). 16D3-C1 및 9F7-F11 mAb는 50%-평균 생존 시간을 21일 지연하였고, 각 군의 처리된 마우스 8마리 중 1마리는 실험의 마지막(120일)에는 치료되었다(도 16b).

도 17a에 나타난 바와 같이, 운반체에 의해 처리된 마우스에서 측정된 종양 크기에 비해, 종양 이식 후 56일(항체 처리의 시작 후 26일에 대응됨)에 항체-처리된 마우스에서 췌장 BxPC3 종양 성장의 유의적인 68±4%-감소가 관찰되었다(p<0.001). 실험의 마지막(135일)에, 카플란-마이어 분석이 항-HER3 mAb 9F7-F11에 의해 처리된 췌장 BxPC3-이종이식된 마우스에 대한 50%-평균 생존 시간에서 18일 지연을 나타내었다(도 17b). 또한, HER3-특이적 mAb 16D3-C1은 HER2-비증폭/PIK3CA-wt BxPC3 췌장 종양 세포가 이종이식된 마우스의 생존 시간에서 더욱 연장된 24일 지연을 유도하였고, 8마리의 마우스 중 1마리가 완전히 치료되었다. 이와 같은 경우(도 18), 16D3-C1-처리된 마우스로부터 추출된 종양은 운반체-처리된 마우스로부터 추출된 종양에 대해 Y1289 HER3 인산화의 억제, 및 HER3 수용체의 하향조절을 입증하였다. 종합하면, 상기 결과들은 mAb 16D3-C1 및 9F7-F11은 HRG 중독 또는 p53 돌연변이 상태와 독립적으로 종양에 효과적일 수 있다는 것을 입증한다.

치료적 항체 트라스투주마브를 다른 표적 치료요법과 조합하는 것은 낮은 HER2 발현을 갖는 암종에 상승 효과를 나타냄을 앞서 입증하였다(Larbouret, 2007, 2010). 낮은 HER2 발현을 갖는 암종에 대한 항-HER2 트라스투주마브(Tz)와의 2중 제제로서 HER3-특이적 항체의 생체내 효과를 확인하기 위해, 각각 HRG를 분비하고(Yonesaka, 2011; Zhou, 2006) 트라스투주마브 치료요법에 대해 적절한 효과(Nakamura, 2005)를 보이지 않는(Farhan, 2006) HER2^low 편평세포 A431 및 폐 A549 암 세포를 마우스에 이종이식하였다. 잠재적인 상승 효과를 구분하기 위해, 트라스투주마브와 조합된 유효량 미만의 항-HER3 muAb 16D3-C1 3일에 10mg/kg씩 4주 동안(Q3d-4W) 투여되었다. 도 19a에 나타난 바와 같이, 16D3-C1-처리된 마우스의 종양 크기의 25%-감소가 관찰되고, 트라스투주마브만으로 또는 운반체에 의해 처리된 이종이식된 마우스에서 효과가 관찰되지 않은 것에 비하여, 16D3-C1 및 Tz(p<0.001)의 2중 조합에 의해 처리된 마우스에서 종양 이식 후 35일에 A431 종양 성장의 60%-퇴보가 유의적으로 관찰되었다. 유사하게, 항체만으로 처리된 마우스에서 관찰된 것(50%)과 비교하여, 2중 조합 16D3-C1 + Tz에 의해 처리된 A549-이종이식된 마우스의 종양 성장에서 유의적인 75%-이상의 퇴보가 측정되었다(p<0.001). 종합하면, 상기 결과는 HER3-특이적 항체 및 항-HER2 항체의 2중 조합이 트라스투주마브 치료요법에 적합하지 않은 HER2^low 암종에 효과적일 수 있다는 것을 입증하였다.

참고문헌:

본원에 걸쳐 다양한 참고문헌이 본 발명과 관련된 선행 기술을 개시한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 본 발명의 기재내용에 참고용으로 삽입된다.

CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) CNCM-I-4486 20110517

SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) CENTRE VAL D'AURELLE - PAUL LAMARQUE UNIVERSITE DE MONTPELLIER 1 <120> ANTI-HUMAN-HER3 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> IP20132318FR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 1 Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 2 Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 3 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 4 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 5 Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 6 Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 7 Leu Glu Ile Val Leu 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 8 Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 9 Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 10 Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 11 Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 12 Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His Asn 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 13 Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 14 Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp 1 5 10 15

Claims (15)

1. HER-3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, 인간 HER-3의 세포외 도메인과의 결합에 대해 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체와 경쟁하는 분리된 모노클로날 항체로,
   상기 분리된 모노클로날 항체가 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 경쇄(VL: variable light chain)의 CDR을 포함하는 VL, 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 중쇄(VH: variable heavy chain)의 CDR을 포함하는 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
3. 제1항에 있어서,
   CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VL 및 CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
4. 제3항에 있어서,
   CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 키메라 항체인 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
5. 제1항에 있어서,
   CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 항체의 CDR을 포함하는 모노클로날 인간화 항체인 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
6. 제1항에 있어서,
   CNCM-I-4486으로 기탁된 하이브리도마로부터 획득할 수 있는 뮤린 모노클로날 항체(16D3-C1)인 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
7. Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디로 이루어진 군에서 선택되는, 제1항에 따른 분리된 모노클로날 항체의 항체 단편.
8. 제1항에 따른 분리된 모노클로날 항체의 VH 도메인 또는 제1항에 따른 분리된 모노클로날 항체의 VL 도메인을 인코딩하는 핵산.
9. 제8항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
10. 제8항에 따른 핵산에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포.
11. 제9항에 따른 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포.
12. 제1항에 따른 분리된 모노클로날 항체를 포함하는 암 치료용 약학조성물.
13. 제7항에 따른 항체 단편을 포함하는 암 치료용 약학조성물.
14. 제1항에 있어서,
    암 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는, 분리된 모노클로날 항체.
15. 제7항에 있어서,
    암 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는, 항체 단편.

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