ES2299241T3 - Preventivos o remedios para enfermedades intestinales inflamatorias que contienen anticuerpos antagonistas del receptor il-6. - Google Patents

Abstract

El uso de un antagonista de la interleuquina-6 (IL-6) para la producción de un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad intestinal inflamatoria en la que el antagonista de la IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6.

Description

Preventivos o remedios para enfermedades intestinales inflamatorias que contienen anticuerpos antagonistas del receptor IL-6.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad intestinal inflamatoria, que comprende como ingrediente activo un anticuerpo anti-receptor de IL6 antagonista de la interleuquina-6 (ITL 6).

La presente invención también se refiere al uso de un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, que comprende como ingrediente activo un anticuerpo anti-receptor de IL6 antagonista de IL-6.

Fundamento de la invención

La IL-6 es una citoquina denominada también factor 2 estimulante de linfocitos B (BSF2) o interferón \beta32. La IL-6 fue descubierta como un factor de diferenciación implicado en la activación de linfocitos B (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). Posteriormente, se encontró que era una citoquina multifuncional que tiene influencia sobre diversas funciones de las células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Se ha descrito que la IL-6 induce la maduración de los linfocitos T (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).

La IL-6 transmite su señal biológica a la célula a través de dos proteínas. Una de ellas es el receptor de IL-6, una proteína que se une a IL-6 con un peso molecular de aproximadamente 80 kD (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-828). El receptor de IL-6 existe no sólo en la forma unida a la membrana con el dominio transmembránico expresado en la superficie celular, sino también como un receptor de IL-6 soluble que consiste principalmente en la región extracelular.

La otra es una proteína gp130 unida a la membrana celular que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kD que está implicada en la transducción de la señal sin unión al ligando. La IL-6 y el receptor de IL-6 forman el complejo IL-6/receptor de IL-6, que después de unirse a gp130 transmite su señal biológica a la célula (Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581).

Los antagonistas de IL-6 son sustancias que inhiben la transducción de la actividad biológica de la IL-6. Como antagonistas de la IL-6, se conocen hasta ahora el anticuerpo contra IL-6 (anticuerpo anti-IL-6), el anticuerpo contra el receptor de IL-6 (anticuerpo anti-receptor de IL-6) y el anticuerpo contra gp130 (anticuerpo anti-gp130), la IL-6 alterada, los péptidos parciales de IL-6 o del receptor de IL-6 y similares.

El anticuerpo anti-receptor de IL-6 se ha descrito en diversas publicaciones (Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, Publicación de Patente Internacional WO 95/09873, Solicitud de Patente Francesa FR 2694767, Patente de Estados Unidos 521628). Se sabe que el anticuerpo PM-1 humanizado se obtuvo injertando la región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de ratón PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) a un anticuerpo molde humano (Publicación de Patente Internacional WO 92-19759).

La enfermedad intestinal inflamatoria (abreviadamente en lo sucesivo IBD, por la expresión inglesa inflammatory bowel disease) es una inflamación no específica representada por la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. En el inicio de la enfermedad están implicados trastornos inmunológicos, pero esto no ha conducido al esclarecimiento de su etiología. Sin embargo, se cree que los monocitos y los linfocitos que se agrupan en los sitios lesionados están implicados en los daños de las mucosidades, y que los mediadores inflamatorios, en particular las citoquinas (tales como IL1\beta, TNF\alpha e IL-6), requieren especial atención.

En el caso de la IL-6 entre los mediadores inflamatorios, se ha prestado atención a su relación con el estado morboso o si podría ser un índice específico para la IBD. El nivel en suero de IL-6 aumenta tanto en la enfermedad de Crohn como en la colitis ulcerosa, y dicho nivel está relacionado con el estado de la enfermedad (Holtkamp, W. et al., J. Clin. Gastroenterology (1995) 20, 123-126, Niederau, C. et al., Hepato-Gastroenterology (1997) 44, 90-107). La medida de la cantidad del mRNA de la IL-6 en el tejido como productos de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) ha revelado que está relacionada con el estado morboso tanto de la colitis ulcerosa como de la enfermedad de Crohn (Stevens, C. et al., Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826). Al aumentar la producción de IL-6 durante la IBD activa, se analizó el mecanismo y se encontró que la cantidad producida cuando las células mononucleares en la lámina propia son estimuladas por el mitógeno de fitolaca (Phytolacca americana L), está relacionada con el estado de la enfermedad (Reinecker, H. C. et al., Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181).

Más adelante, se observó la relación entre la producción de IL-6 y el estado morboso en el cultivo de células mononucleares procedentes de la lámina propia y del cultivo tisular de la mucosa obtenida de pacientes. En el primer caso, se demostró que también aumentó el número de células que producen IL-6 en el tejido de la mucosa. Entre las células mononucleares las células productoras de IL-6 más importantes son los macrófagos y se ha confirmado que existe un gran número de macrófagos CD68-positivos que producen enérgicamente IL-6 en la lámina propia de los pacientes con IBD en estado activo (Kusugami, K. et al., Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-959).

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Se ha encontrado que la producción de IL-6 relaciona la observación endoscópica de pacientes con la enfermedad de Crohn (Reimund, J. M. et al., Gut (1996) 39, 684-689). Además, existen algunos artículos que no sólo relacionan la concentración en el suero de IL-6, sino también la del receptor de IL-6 soluble con el estado morboso (Mitsuyama, K. et al., Gut (1995) 36, 45-49).

En cuanto a mediadores inflamatorios distintos de la IL-6, también se conoce la relación entre la cantidad de producción de IL-1\beta y el estado morboso. Por otro lado, no siempre se cumple esto en el caso de TNF-\alpha, en el que la cantidad de producción puede ser alta en un estado morboso de baja actividad (Reinecker, H. C. et al., Clin. Exp. lmmunol. (1993) 94, 174-181, Reimund, J. M. et al., Gut (1996) 39, 684-689).

El método actual para tratar la IBD comprende una combinación de dieta y medicación, prescribiéndose salazosulfapiridina, glucocorticoides, etc. Sin embargo, existen pacientes intolerantes a estos fármacos debido a sus efectos secundarios y por lo tanto surgen problemas en la administración prolongada.

Por otro lado, se están realizando algunas pruebas para un nuevo tratamiento de la IBD que intenta mejorar los estados morbosos por la inhibición de la actividad de las citoquinas. Sus principales objetivos son IL-1 y TNF-\alpha (Van Deventer, S.J.H., Gut (1997) 40, 443-448); en el caso de IL-1, están en estudio clínico y en animales experimentales un antagonista del receptor de IL-1 (Cominelli F. et al., Gastroenterology (1992) 103, 65-71) y un inhibidor de IL-1, CG247919A (Casini-Raggi, et al., Gastroenterelogy (1995) 109, 812-818) y similares. En el caso de TNF-\alpha, se han administrado anticuerpos monoclonales específicos a pacientes con enfermedad de Crohn, en los que se ha observado una reducción de la actividad y una úlcera curada (Van Dullemen, H. M. et al., Gastroenterology (1995) 109, 129-135). Sin embargo, no se sabía que el antagonista de IL-6 pudiera tratar la IBD para suprimir específicamente la actividad biológica de IL-6.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona el uso de un antagonista de la interleuquina-6 (IL-6) para la producción de un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad intestinal inflamatoria en el que el antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6.

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo dirigido contra el receptor de IL-6 para la producción de un agente que suprima la pérdida de peso en la enfermedad intestinal inflamatoria.

El agente preventivo o terapéutico que se describe en la presente memoria para una enfermedad intestinal inflamatoria está exento de los inconvenientes antes mencionados.

Por consiguiente, se proporciona (1) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo contra el receptor de IL-6.

También se proporciona (2) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6.

También se proporciona (3) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano. El anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano es preferiblemente el anticuerpo PM-1.

También se proporciona (4) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. El anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es preferiblemente el anticuerpo MR16-1.

También se proporciona (5) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo recombinante contra el receptor de IL-6. El anticuerpo recombinante contra el receptor IL-6 tiene preferiblemente una región constante (región C) de anticuerpo humano.

También se proporciona (6) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo un anticuerpo quimérico o humanizado contra el receptor de IL-6.

También se proporciona (7) un agente preventivo o terapéutico para una enfermedad intestinal inflamatoria que comprende como ingrediente activo el anticuerpo PM-1 humanizado.

También se proporciona (8) un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa que comprende como ingrediente activo el antagonista de IL-6 descrito en los apartados anteriores (1) a (7).

También se proporciona (9) un agente para suprimir la pérdida de peso en una enfermedad intestinal inflamatoria, comprendiendo dicho agente como ingrediente activo el antagonista de IL-6 descrito en los anteriores apartados (1) a (7).

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También se proporciona (10) un agente para suprimir la pérdida de peso en una enfermedad intestinal inflamatoria, comprendiendo dicho agente como ingrediente activo el antagonista de IL-6 descrito en los anteriores apartados (3) a (7).

Realización para llevar a cabo la invención

Los antagonistas de IL-6 para uso en la presente invención pueden ser un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de cualquier origen, clase y forma, siempre que tengan un efecto preventivo o terapéutico en la enfermedad intestinal inflamatoria o un efecto de control de la pérdida de peso en la enfermedad intestinal inflamatoria.

Los antagonistas de IL-6 bloquean la transducción de la señal por IL-6 e inhiben la actividad biológica de IL-6.

Los anticuerpos monoclonales de mamífero incluyen los producidos por hibridomas y anticuerpos recombinantes producidos por células hospedantes que han sido transformadas con un vector de expresión que contiene genes del anticuerpo producidos por ingeniería genética.

Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen el anticuerpo MH166 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) y el anticuerpo SK2 (Sato, K. et al., The 21st Nihon Mennekigakkai Soukai (General Meeting of the Japan Immunology Society), Academic Record (1991) 21, 166) y similares.

Un hibridoma productor de anticuerpos anti-IL-6 puede construirse básicamente por un procedimiento conocido como se describe a continuación. Así, la IL-6 puede usarse como antígeno sensibilizante en el método convencional de inmunización. Las células inmunizadas así obtenidas se fusionan con células precursoras conocidas en el proceso de fusión convencional y a continuación las células productoras de anticuerpos monoclonales se escrutan por métodos de escrutinio convencionales para preparar el hibridoma deseado.

Específicamente, el anticuerpo anti-IL-6 puede obtenerse de la siguiente manera. Por ejemplo, una IL-6 humana para uso como antígeno sensibilizante para obtener un anticuerpo puede obtenerse usando la secuencia de un gen/secuencia de aminoácidos de la IL-6 descrita en Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immuno. (1988) 140, 1534-1541 o Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

Después de que una célula hospedante adecuada es transformada, por inserción de la secuencia del gen de la IL-6, en un sistema vector de expresión conocido, la proteína IL-6 se purifica retirando la célula hospedante o su líquido sobrenadante del cultivo. La proteína IL-6 purificada puede usarse como antígeno sensibilizante. Alternativamente, puede usarse como antígeno sensibilizante una proteína de fusión de la proteína IL-6 y otra proteína.

Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 para uso en la presente invención pueden obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales por un método conocido. Como los anticuerpos anti-IL-6 para uso en la presente invención, se prefieren, en particular, los anticuerpos monoclonales de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales de mamíferos incluyen los producidos por hibridomas y los producidos por células hospedantes que han sido transformadas con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpos producidos por ingeniería genética. Los anticuerpos, por medio de la unión al receptor de IL-6, inhiben la unión de IL-6 al receptor de IL-6 y por tanto bloquean la transducción de la actividad biológica de IL-6 en la célula.

Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen el anticuerpo MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), el anticuerpo PM-1 (Hirata et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) o el anticuerpo AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 o el anticuerpo AUK146-15 (Publicación de Patente Internacional WO 92-19759) y similares. Entre ellos, el más preferido es el anticuerpo PM-1.

La línea celular de hibridomas que produce el anticuerpo PM-1 ha sido depositada internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como PM-1 el 10 de Julio de 1990 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Prefectura de Ibaraki, Japón, como FERM BP-2998. Además, la línea celular de hibridomas que produce el anticuerpo MR16-1 ha sido depositada internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como MR16-1 el 13 de Marzo de 1997 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Prefectura de Ibaraki, Japón, como FERM HP-5875.

El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6 puede construirse básicamente aplicando un procedimiento conocido como se describe a continuación. Así, el receptor de IL-6 se usa como antígeno sensibilizante de acuerdo con el método convencional de inmunización. Las células inmunizadas así obtenidas se fusionan con células precursoras conocidas en un proceso convencional de fusión de células y las células que producen los anticuer-
pos monoclonales pueden escrutarse por un método de escrutinio convencional para preparar un hibridoma deseado.

Específicamente, el anticuerpo anti-receptor de IL-6 puede prepararse de la siguiente manera. Por ejemplo, el receptor de IL-6 humano usado como antígeno sensibilizante para obtener un anticuerpo puede obtenerse usando la secuencia de un gen/secuencia de aminoácidos del receptor de IL-6 descrito en la Solicitud de Patente Europea EP 325474, y el receptor de IL-6 de ratón puede obtenerse usando la descripción de la Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 3(1991)-155795.

Existen dos tipos de proteínas receptoras de IL-6: el receptor de IL-6 expresado en la membrana celular y el receptor de IL-6 desprendido de la membrana celular (Receptor de IL-6 soluble) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El anticuerpo receptor de IL-6 soluble consiste esencialmente en una región extracelular de un receptor de IL-6 unido a la membrana celular que se diferencia de un receptor de IL-6 unido a la membrana en que le falta la región transmembránica o tanto la región transmembránica como la región intracelular. Como proteína receptor de IL-6, puede usarse cualquier receptor de IL-6, siempre que pueda usarse un antígeno sensibilizante para la producción del anticuerpo del receptor de IL-6 para uso en la presente invención.

Después de insertar una secuencia de un gen del receptor de IL-6 en un sistema vector de expresión conocido para transformar una célula hospedante apropiada, la proteína receptor de IL-6 deseada puede purificarse retirando las células hospedantes o su líquido sobrenadante de cultivo por un método conocido. La proteína receptor de IL-6 así purificada puede usarse como un antígeno sensibilizante. Alternativamente, pueden usarse como antígeno sensibilizante las células que expresan el receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la proteína receptor de IL-6 con otra
proteína.

La E. coli que tiene un plásmido pIBIBSF2R que contiene el cDNA que codifica el receptor de IL-6 humano ha sido depositada internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como HB101-pIBIBSF2R el 9 de Enero de 1989 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Prefectura de Ibaraki, Japón, como FERM HP-2232.

Los anticuerpos anti-gp130 pueden obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales aplicando un método conocido. Como los anticuerpos anti-gp130, se prefieren, en particular, los anticuerpos monoclonales de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales de mamíferos incluyen los producidos por hibridomas y los producidos por una célula hospedante que ha sido transformada con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpos producidos por ingeniería genética. Los anticuerpos, por medio de la unión a gp130, inhiben la unión del complejo IL-6/receptor de IL-6 a gp130, y por lo tanto bloquean la transducción de la actividad biológica de IL-6 en la célula.

Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpo AM64 (Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 3(1991) - 219894), anticuerpo 4B11 y anticuerpo 2H4 (Patente de EE.UU. 5571513), anticuerpo B-S12 y anticuerpo B-P8 (Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 8 (1996)-291199).

Un hibridoma productor de anticuerpo monoclonal puede crearse básicamente aplicando un procedimiento como se describe a continuación. Así, puede usarse como antígeno sensibilizante gp130 para inmunización en un método convencional de inmunización. Las células inmunizadas así obtenidas se fusionan con células precursoras conocidas en un proceso convencional de fusión celular y a continuación se escrutan los hibridomas productores de anticuerpos por un método de escrutinio convencional para preparar un hibridoma deseado.

Específicamente, el anticuerpo monoclonal puede obtenerse de la siguiente manera. Por ejemplo, la gp130 usada como antígeno sensibilizante para la generación de anticuerpos puede obtenerse usando una secuencia de un gen/secuencia de aminoácidos de gp130 descrita en la Solicitud de Patente Europea EP 411946.

Después de insertar la secuencia de un gen de gp130 en un sistema vector de expresión conocido, se transforma una célula hospedante adecuada con el sistema vector y la proteína gp130 se purifica retirando la célula hospedante o su líquido sobrenadante del cultivo. La proteína receptor de gp130 purificada puede usarse como antígeno sensibilizante. Alternativamente, puede usarse como antígeno sensibilizante una proteína de fusión de la proteína gp130 con otra proteína.

Aunque no están particularmente limitados los mamíferos que pueden ser inmunizados con un antígeno sensibilizante, se seleccionan preferiblemente considerando su compatibilidad con la célula precursora que se usa en la fusión celular. Generalmente están incluidos roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres y similares.

La inmunización de animales con un antígeno sensibilizante se realiza aplicando un método conocido. Un método general, por ejemplo, implica una administración intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante a un mamífero. Específicamente, se mezcla un antígeno sensibilizante que ha sido diluido y puesto en suspensión en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica, etc., según se desee, con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional, por ejemplo, adyuvante completo de Freund. Después de ser emulsionado, se administra preferiblemente varias veces a un mamífero cada 4 a 21 días. Alternativamente puede usarse un vehículo adecuado en el momento de la inmunización con el antígeno sensibilizante.

Después de la inmunización y la confirmación del aumento del título del anticuerpo deseado en el suero, se extraen del mamífero las células inmunizadas y se someten a fusión celular. Las células inmunizadas preferidas incluyen en particular las células del bazo.

Las células de mieloma de mamíferos como las otras células precursoras que se someten a fusión celular con las células inmunes antes mencionadas incluyen preferiblemente diversas líneas de células conocidas, tales como P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133) y similares.

La fusión celular de las células inmunizadas anteriores con células de mieloma puede realizarse esencialmente de acuerdo con un método conocido, tal como han descrito Milstein, et al. (Kohler, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) y similares.

Más específicamente, la fusión celular anterior se efectúa en el caldo nutriente convencional en presencia de, por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como acelerador de la fusión celular puede usarse, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y similares. Además, puede añadirse si se desea un adyuvante, tal como dimetilsulfóxido, para mejorar la eficacia de la fusión.

La relación preferida de las células inmunizadas y las células de mieloma que se puede usar es, por ejemplo, 1 a 10 veces más células inmunizadas que células de mieloma. Ejemplos de medios de cultivo que se usan para la fusión celular anterior incluyen medio RPMI1640 y medio de cultivo MEM adecuado para el crecimiento de las líneas de células de mieloma anteriores, y puede añadirse el medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo celular y un suplemento de suero, tal como suero de ternero fetal (FCS).

En la fusión celular, se mezclan cantidades predeterminadas de las células inmunizadas anteriores y las células de mieloma en el medio de cultivo anterior, al que se añade una solución de PEG previamente calentada hasta aproximadamente 37ºC, por ejemplo una solución de PEG con un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000, a una concentración de 30 a 60% (p/v) y se mezcla para obtener las células fusionadas deseadas (hibridomas). Repitiendo a continuación la adición secuencial de un medio de cultivo adecuado y la centrifugación para eliminar el líquido sobrenadante, pueden eliminarse los agentes de fusión celular, etc., que son indeseables para el crecimiento del hibridoma.

Dicho hibridoma se selecciona por cultivo en un medio de selección convencional, por ejemplo, medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en el medio HAT se continúa generalmente durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la muerte de las células que no son el hibridoma deseado (células no fusionadas), generalmente de varios días a varias semanas. Se aplica el método de dilución limitante convencional, en el que se escrutan y clonan los hibridomas que producen el anticuerpo deseado.

Además para obtener el hibridoma anterior inmunizando un animal distinto de un ser humano con un antígeno, también es posible sensibilizar in vitro linfocitos humanos con un antígeno deseado o células que expresan un antígeno deseado, y los linfocitos B sensibilizados resultantes se fusionan con una célula de mieloma humana, por ejemplo U266, obteniendo un anticuerpo humano deseado que tiene la actividad de unirse al antígeno deseado o a las células que expresan el antígeno deseado (véase la Publicación de Patente Japonesa pos-examinada (Kokoku) 1(1989)-59878). Además, en el método descrito anteriormente (véanse las Publicaciones de Patentes Internacionales WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94125585, WO 96/34096 y WO 96/33735), un animal transgénico que tiene un repertorio de todos los genes del anticuerpo humano se inmuniza con un antígeno o una célula que expresa el antígeno obteniendo un anticuerpo humano deseado.

Los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal así construido pueden subcultivarse en un medio de cultivo convencional o pueden conservarse durante un periodo de tiempo prolongado en nitrógeno líquido.

Para obtener anticuerpos monoclonales a partir de dicho hibridoma, puede usarse un método en el que se cultiva dicho hibridoma en un medio convencional y se obtiene un anticuerpo en un líquido sobrenadante, o un método en el que se administra y se deja desarrollar el hibridoma en un mamífero compatible con dicho hibridoma y se obtiene en la ascitis un anticuerpo. El primer método es adecuado para obtener anticuerpos de gran pureza, mientras que el segundo es adecuado para la producción de anticuerpos a gran escala.

Específicamente, un hibridoma que produce un anticuerpo anti-receptor IL-6 puede construirse usando el método descrito en la Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 3(1989)-139293. Puede llevarse a cabo un método en el que el hibridoma que produce el anticuerpo PM-1, que ha sido depositado internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como FERM BP-2998, el 10 de Julio de 1990 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Prefectura de Ibaraki, Japón, se inyecta intraperitonealmente a ratones BALB/c para obtener el fluido ascítico a partir del cual se purifica el anticuerpo PM-1, o un método en el que se cultiva dicho hibridoma en un medio de cultivo adecuado, tal como medio RPMI1640 que contiene suero bovino fetal al 10% y BM-Condimed Hl al 5% (fabricado por Boehringer Mannheim), el medio del SFM (sistema fagocítico mononuclear) para hibridomas (fabricado por GIBCO-BRL), el medio PPHM-II (fabricado por GIBCO-BRL) y similares, y a partir del líquido sobrenadante puede purificarse el anticuerpo PM-1.

En la presente invención puede usarse como anticuerpo monoclonal un anticuerpo recombinante que se produjo por tecnología de recombinación de genes, en la que se clonó un gen del anticuerpo procedente del hibridoma y se integró en un vector adecuado, que transformó células hospedantes (véase, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K., and Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Específicamente, el mRNA que codifica una región variable (V) de un anticuerpo deseado se aísla de las células productoras del anticuerpo, tal como un hibridoma. El aislamiento de mRNA se realiza preparando el RNA total aplicando, por ejemplo, un método conocido, tal como el método de ultracentrifugación con guanidina (Chirgwin, J.M. et al. Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método AGPC (Chomzynski, P. et al., Anal. Biochem, (1987) 162, 156-159), y a continuación se purifica el mRNA del RNA total usando el kit de purificación de mRNA (fabricado por Pharmacia) y métodos similares. Alternativamente, el mRNA puede prepararse directamente usando el kit de purificación de mRNA Quick Prep (fabricado por Pharmacia).

El cDNA de una región V de un anticuerpo puede sintetizarse a partir del mRNA usando una transcriptasa inversa. El cDNA puede sintetizarse usando un kit para la síntesis de la primera cadena de un cDNA por transcriptasa inversa del AMV y similares. Alternativamente, para la síntesis y amplificación del cDNA, puede usarse un kit 5''-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y un método 5'-RACE (Frohman, M.A. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se purifica un fragmento de DNA deseado a partir del producto obtenido por PCR y puede ligarse al DNA vector. Además, con esto se construye un vector recombinante que a continuación se transforma en E. coli, etc., cuyas colonias se seleccionan para preparar un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos de un DNA deseado puede confirmarse por un método conocido, tal como el método de didesoxi.

Una vez que se ha obtenido el DNA que codifica una región V de un anticuerpo deseado, puede ligarse al DNA que codifica una región constante (región C) de un anticuerpo deseado, que se integra a continuación en un vector de expresión. Alternativamente, un DNA que codifica una región V de un anticuerpo puede integrase en un vector de expresión que contiene ya el DNA que codifica una región C de un anticuerpo.

Con el fin de producir un anticuerpo para uso en la presente invención, se integra el gen de un anticuerpo como se describe a continuación en un vector de expresión de forma que se exprese bajo el control de una región reguladora de la expresión, por ejemplo, un potenciador y/o un promotor. Posteriormente, el vector de expresión puede transformarse en una célula hospedante y allí puede expresarse el anticuerpo.

Como información, puede usarse un anticuerpo recombinante artificialmente alterado, tal como un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado, con el fin de disminuir la antigenicidad heteróloga contra los seres humanos. Estos anticuerpos alterados puede producirse usando métodos conocidos.

El anticuerpo quimérico puede obtenerse ligando el DNA que codifica una región V de anticuerpos así obtenido a un DNA que codifica una región C de un anticuerpo humano, que se integra a continuación en el vector de expresión y se transforma en la célula hospedante para la producción del anticuerpo en dicha célula (véanse la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la Publicación de Patente Internacional WO 92/19759). Usando este método conocido, puede obtenerse el anticuerpo quimérico útil de la presente invención.

Por ejemplo, el plásmido que contiene el DNA que codifica la región V de la cadena L o la región V de la cadena H del anticuerpo PM-1 quimérico se denominó pPM-k3 o pPM-h1, respectivamente, y E. coli que contiene el plásmido ha sido depositado bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como NCIMB 40366 y NCIMB 40362, respectivamente, el 11 de Febrero de 1991 en National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited.

El anticuerpo humanizado, que se denomina también anticuerpo humano reformado, se ha preparado injertando las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero distinto de un ser humano, por ejemplo, anticuerpo de ratón, en las CDR de un anticuerpo humano. También se conoce la tecnología de DNA recombinante general para la preparación de dichos anticuerpos (véanse la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la Publicación de Patente Internacional WO 92-19759).

Específicamente, se sintetiza una secuencia de DNA que se ha diseñado para ligar las CDR de un anticuerpo de ratón con regiones marco (FR) de un anticuerpo humano a partir de diversos oligonucleótidos divididos que tienen en sus extremos secciones solapantes entre sí. El DNA así obtenido se liga al DNA que codifica la región C de un anticuerpo humano y a continuación se integra en un vector de expresión, que se transforma en células hospedantes para la producción de anticuerpos (véanse la Solicitud de Patente Europea EP 239400 y la publicación de Patente Internacional WO 92-19759).

Para la FR de un anticuerpo humano ligado a la CDR, se selecciona la región determinante de la complementariedad que forma una estructura de unión al antígeno favorable. Cuando se desea, los aminoácidos de la región marco de la región variable del anticuerpo pueden sustituirse de modo que la región determinante de la complementariedad del anticuerpo humano reformado puede formar una estructura de unión al antígeno apropiada (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado, se usa una región C de anticuerpo humano. Como región C de anticuerpo humano, puede mencionarse la C\gamma, y pueden usarse, por ejemplo, las C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4. la región C de anticuerpo humano puede modificarse para mejorar la estabilidad del anticuerpo o su producción.

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El anticuerpo quimérico consiste en la región variable del anticuerpo procedente de un mamífero que no es un ser humano y la región C procedente de un anticuerpo humano, mientras que el anticuerpo humanizado consiste en las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo procedente de un mamífero que no es un ser humano y las regiones marco y la región C de anticuerpo procedente de un anticuerpo humano. Por consiguiente, se ha reducido su antigenicidad en el cuerpo humano de modo que son útiles como anticuerpos para uso en la presente invención.

Una realización preferida del anticuerpo humanizado para uso en la presente invención incluye el anticuerpo PM-1 humanizado (véase la Publicación de Patente Internacional WO 92-19759).

Los genes de anticuerpo construidos como se ha descrito antes pueden expresarse y se obtiene el producto por métodos conocidos. En el caso de células de mamíferos, la expresión puede realizarse usando un vector que contiene un promotor útil usado convencionalmente, el gen de anticuerpo que ha de expresarse y el DNA en el que la señal poli A ha sido unida operativamente en su extremo 3' o un vector que contiene dicho DNA. Ejemplos del promotor/potenciador incluye el promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus humano.

Adicionalmente, como promotor/potenciador que puede usarse para la expresión del anticuerpo para uso en la presente invención, existen promotores/potenciadores virales, tales como retrovirus, poliomavirus, adenovirus y virus del simio 40 (SV40), y promotores/potenciadores procedentes de células de mamífero, tal como el factor de alargamiento humano 1\alpha (HEF1\alpha).

Por ejemplo, la expresión puede realizarse fácilmente por el método de Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) cuando se usa el promotor/potenciador de SV40, o por el método de Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/potenciador de HEF1\alpha.

En el caso de E. coli, la expresión puede realizarse uniendo operativamente un promotor útil convencionalmente usado, una secuencia señal para la secreción del anticuerpo y un gen de anticuerpo para ser expresado, seguido por su expresión. Como promotor, por ejemplo, puede mencionarse el promotor lacz y el promotor araB. Puede aplicarse el método de Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASES J. (1992) 6, 2422-2427) cuando se usa el promotor lacz y puede aplicarse el método de Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043) cuando se usa el promotor araB.

Como secuencia señal para la secreción del anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli, puede usarse la secuencia señal pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Después de separar el anticuerpo acumulado en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega apropiadamente antes de su uso (véase, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como origen de replicación, pueden usarse los procedentes de SV40, poliomavirus, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Además, para la multiplicación del número de copias del gen en el sistema de células hospedantes, los vectores de expresión pueden incluir como marcadores seleccionables un gen de aminoglicosido-fosfotransferasa (APH), un gen de timidinaquinasa (TK), un gen de xantina-guaninafosforibosil-transferasa de E. coli (Ecogpt), un gen de dihidrofolato-reductasa (dhfr)y similares.

Para la producción de anticuerpos para uso en la presente invención, puede usarse cualquier sistema de producción. El sistema de producción para la preparación de un anticuerpo comprende el sistema de producción in vitro o in vivo. Como sistema de producción in vitro, puede mencionarse un sistema de producción que emplee células eucariotas y un sistema de producción que emplee células procariotas.

Cuando se usan células eucariotas, existen sistemas de producción que emplean células animales, células vegetales y células fúngicas. Las células de animales conocidas incluyen: (1) células de mamíferos, tales como células de CHO, células de COS, células de mieloma, células de riñón de cría de hámster (BHX), células HeLa y células Vero, (2) células de anfibios, tal como oocitos de Xenopus o (3) células de insectos, tales como sf9, sf21 y Tn5. Las células vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, las derivadas de_{.} Nicotiana tabacum, que pueden someterse a un cultivo de callo. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras, tal como el género Saccharomyces, más específicamente Saccharomyices cereviceae, u hongos filamentosos, tal como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.

Cuando se usan células procariotas, existen sistemas de producción que emplean células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E. coli) y Bacillus subtilis.

Transformando un gen para un anticuerpo deseado en estas células y cultivando in vitro las células transformadas, puede obtenerse el anticuerpo. El cultivo se realiza aplicando métodos conocidos. Por ejemplo, como medio de cultivo puede usarse DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM, y pueden usarse en combinación suplementos de suero, tales como suero de ternero fetal (FCS). Además, los anticuerpos pueden producirse in vivo por inyección de células transformadas por un gen de anticuerpo en la cavidad abdominal de un animal y similares.

Como sistemas de producción in vivo, pueden mencionarse los que emplean animales y los que emplean vegetales. Cuando se usan animales, existen sistemas de producción que emplean mamíferos e insectos.

Como mamíferos, pueden usarse cabras, cerdos, ovejas, ratones y ganado vacuno (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). También como insectos, puede usarse el gusano de seda.

Cuando se usan vegetales, puede emplearse, por ejemplo, el tabaco.

Los genes de anticuerpo se transforman en estos animales o vegetales, se producen los anticuerpos en dichos animales o vegetales y se recuperan. Por ejemplo, se inserta un gen de anticuerpo en la parte central del gen que codifica la proteína que se produce inherentemente en la leche, tal como caseína \beta de cabra, para preparar los genes fusionados. Los fragmentos de DNA que contienen el gen fusionado en el que se ha insertado el gen de anticuerpo se inyectan a un embrión de cabra y éste se transfiere a una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene de la leche producida por la cabra transgénica que recibió el embrión o a su descendencia. Con el fin de aumentar la cantidad de leche que contenía el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, cuando proceda puede administrarse hormonas a dicha cabra transgénica. (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se usan gusanos de seda, estos se infectan con el baculovirus en el que se ha insertado un gen de anticuerpo deseado y el anticuerpo deseado puede obtenerse del fluido corporal del gusano de seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Por otra parte, cuando se usa tabaco, se inserta el gen de anticuerpo deseado en un vector de expresión para vegetales, por ejemplo, pMON 530, y a continuación se infecta una bacteria, tal como Agrobacterium tumefaciens, con dicho vector. A continuación se infecta el tabaco, tal como Nicotiana tabacum, con dicha bacteria obteniéndose de las hojas de tabaco el anticuerpo deseado (Julian, K.C., Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando el anticuerpo se produce en sistemas de producción in vitro o in vivo, como se ha descrito antes, el DNA que codifica la cadena pesada (cadena H) o la cadena ligera(cadena L) del anticuerpo puede integrarse por separado en un vector de expresión y los hospedantes se transforman simultáneamente, o el DNA que codifica la cadena H y la cadena L puede integrarse en un sólo vector de expresión y con él se transforma un hospedante (véase la Publicación de Patente Internacional WO 94-11523).

Los anticuerpos para uso en la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o sus versiones modificadas, según se prefiera. Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo, pueden mencionarse Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario (scFv) en el que la cadena H y la cadena L del Fv estaban ligadas por medio de un enlazador ade-
cuado.

Específicamente, los anticuerpos se tratan con una enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, para producir fragmentos de anticuerpo o se construyen genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo y a continuación se integran en un vector de expresión, que se expresa en una célula hospedante adecuada (véase, por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

El fragmento scFv puede obtenerse ligando la región V de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo. En el fragmento scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se ligan preferiblemente por medio de un enlazador, preferiblemente un enlazador peptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). La región V de la cadena H y la región V de la cadena L del fragmento scFv pueden proceder de cualquiera de los anticuerpos antes mencionados. Como enlazador peptídico para ligar las regiones V, puede usarse cualquier péptido monocatenario que comprende, por ejemplo, 12 - 19 restos de aminoácidos.

El DNA que codifica el fragmento scFv puede obtenerse usando el DNA que codifica la cadena H o la región V de la cadena H del anticuerpo anterior y el DNA que codifica la cadena L o la región V de la cadena L del anticuerpo anterior como molde amplificando la porción del DNA que codifica la secuencia de aminoácidos deseada entre las secuencias anteriores por la técnica de PCR especificando el par cebador sus dos extremos, y amplificando además la combinación del DNA que codifica la porción del enlazador peptídico y el par cebador que define que los dos extremos de dicho DNA se liguen a la cadena H y a la cadena L, respectivamente.

Una vez construidos los DNA que codifican el fragmento scFv, puede obtenerse un vector de expresión que los contiene y un hospedante transformado con dicho vector de expresión por los métodos convencionales, y puede obtenerse el fragmento scFv usando el hospedante transformado por los métodos convencionales.

Estos fragmentos de anticuerpo pueden producirse obteniendo su gen de manera similar al antes mencionado y dejándolo expresarse en un hospedante. "Anticuerpo" como se usa en las reivindicaciones de la presente solicitud abarca estos fragmentos de anticuerpo.

Como anticuerpos modificados, pueden usarse anticuerpos asociados con diversas moléculas, tal como polietilenglicol (PEG). "Anticuerpo" como se usa en las reivindicaciones de la presente solicitud abarca estos anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos así obtenidos. Estos métodos ya están establecidos en la técnica.

Los anticuerpos producidos y expresados como se ha descrito anteriormente pueden separarse del interior o exterior de la célula hospedante y a continuación pueden purificarse hasta homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención puede realizarse por cromatografía de afinidad. Como columna usada para dicha cromatografía de afinidad, pueden mencionarse la columna de Proteína A y la columna de Proteína G. Ejemplos de los soportes usados en la columna de Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharose F. F., y similares.

Alternativamente, pueden aplicarse sin ninguna limitación métodos para la separación y purificación usados convencionalmente para proteínas. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención puede realizarse combinando, cuando proceda, cromatografía distinta de la cromatografía de afinidad antes mencionada, filtración, ultrafiltración, precipitación por adición de sales, diálisis y similares. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, de filtración por gel y similares. Estas cromatografías pueden aplicarse a cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Alternativamente, puede usarse la HPLC en fase inversa.

La concentración del anticuerpo obtenido anteriormente puede determinarse midiendo la absorbancia o por enzimoinmunoensayo (ELISA) y similares. Así, cuando se emplea la medida de la absorbancia, se diluye apropiadamente una muestra con PBS(-) y a continuación se mide la absorbancia a 280 nm, realizando el cálculo a continuación usando el coeficiente de absorción de DO 1,35 a 1 mg/ml. Cuando se aplica el método ELISA, la medida se realiza como sigue. Así, se añaden 100 \mul de IgG anti-humana de cabra (fabricada por TAGO) diluida hasta 1 \mug/ml en tampón de hidrogenocarbonato 0,1 M, a pH 9,6, a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nunc) y se incuba durante una noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, se añaden 100 \mul de cada uno de los anticuerpos apropiadamente diluidos descritos en la presente memoria o una muestra que contenga el anticuerpo, o 100 \mul de IgG humana (fabricada por CAPPEL) como patrón, y se incuba a la temperatura ambiente durante 1 hora.

Después de lavado, se añaden 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humana marcada con fosfatasa alcalina diluida 5000 veces (fabricada porBIOSOURCE) y se incuba a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavado, se añade la solución de sustrato y se incuba, y a continuación se realiza la medida de la absorbancia a 405 nm con el MICROPLATE READER Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado.

La IL-6 alterada tiene una actividad de unión al receptor de IL-6 y no transmite la actividad biológica de la IL-6. Por consiguiente, la L-6 alterada, aunque compite con la IL-6 en su unión al receptor de IL-6, no transmite la actividad biológica de la IL-6, y por tanto bloquea la transducción de la señal por la IL-6.

La IL-6 alterada puede construirse por la introducción de una mutación sustituyendo los restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la IL-6. La IL-6, fuente de la IL-6 alterada, puede ser de cualquier origen, pero cuando se tiene en cuenta la antigenicidad, se prefiere la IL-6 humana.

Específicamente, la estructura secundaria de la IL-6 se predice aplicando un programa conocido de modelación molecular de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52-56) y se evalúan los efectos globales sobre el residuo de aminoácidos que va a ser reemplazado. Después que se determina un residuo de aminoácidos apropiado, se introduce la mutación por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usado convencionalmente empleando un vector que contenga la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la IL-6 humana obteniendo con ello un gen que codifica la IL-6 alterada. Este se integra a continuación, según sea conveniente, en un vector de expresión apropiado, a partir del cual puede obtenerse la IL-6 alterada obtenida de acuerdo con la expresión, producción y purificación de dicho anticuerpo recombinante.

Ejemplos específicos de la IL-6alterada están descritos en Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, y Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, documentos WO 96-18648 y WO 96-17869.

Los péptidos parciales de la IL-6 o del receptor de IL-6 tienen una actividad de unión al receptor de IL-6 o a la IL-6, respectivamente, y no transmiten la actividad biológica de la IL-6. Así, los péptidos parciales de la IL-6 o del receptor de IL-6 se unen al receptor de IL-6 o a la IL-6, respectivamente, y lo capturan. Como resultado, no transmiten la actividad biológica de la IL-6 y bloquean la transducción de la señal de la IL-6.

Los péptidos parciales de la IL-6 o del receptor de IL-6 son péptidos que comprenden parte o toda la secuencia de aminoácidos de la región implicada en la unión a la IL-6 y al receptor de IL-6 en la secuencia de aminoácidos de la IL-6 o el receptor de IL-6. Dichos péptidos comprenden generalmente 10 - 80, preferiblemente 20 - 50, más preferiblemente 20 - 40 restos de aminoácidos.

Los péptidos parciales de la IL-6 o del receptor de IL-6 pueden construirse especificando la región implicada en la unión a la IL-6 y al receptor de IL-6 en la secuencia de aminoácidos de la IL-6 o del receptor de IL-6, y produciendo parte o toda la secuencia de aminoácidos por un método convencional, tal como una tecnología de ingeniería genética o un método de síntesis de péptidos.

Para producir los péptidos parciales de la IL-6 o del receptor de IL-6 por tecnología de ingeniería genética, la secuencia de DNA que codifica el péptido deseado se integra en un vector de expresión, a partir del cual puede obtenerse el péptido por expresión, producción y purificación de dicho anticuerpo recombinante.

La producción del péptido parcial de la IL-6 o del receptor de IL-6 por el método de síntesis de péptidos puede efectuarse aplicando un método usado generalmente en la síntesis de péptidos, tal como la síntesis en fase sólida o la síntesis en fase líquida.

Específicamente puede usarse el método descrito en Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peputido Gousei (Peptide Synthesis), editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. El método de síntesis en fase sólida incluye, por ejemplo, una reacción en la que un aminoácido correspondiente al extremo C del péptido que se ha de sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos y a continuación un aminoácido, en el que el grupo \alpha-amino o un grupo funcional de la cadena lateral ha sido protegido con un grupo protector apropiado, se condensa a la vez con un aminoácido desde el extremo C en la dirección del extremo N y se repite alternativamente una reacción en la que se elimina dicho grupo protector del grupo \alpha-amino del aminoácido o del péptido unido a la resina, para alargar la cadena peptídica. Los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida se dividen en el método Boc y el método Fmoc dependiendo del tipo de grupo protector que
se use.

Después que se completa la síntesis del péptido deseado, se realiza una reacción de desprotección y una reacción para separar la cadena peptídica del soporte. Para la separación de la cadena peptídica, se usan generalmente fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico en el método Boc y TFA en el método Fmoc. En el método Boc, por ejemplo, la resina peptídica anterior se trata con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Posteriormente, se elimina el grupo protector y se recupera el péptido separándolo del soporte. Por liofilización puede obtenerse el péptido en bruto. Por otro lado, en el método Fmoc, se usa, por ejemplo, TFA de manera similar a la anterior para realizar la reacción de desprotección y la reacción de separación del soporte.

El péptido en bruto así obtenido puede separarse y purificarse por HPLC. Su elución puede efectuarse en un sistema disolvente de agua-acetonitrilo que se usa generalmente para la purificación de proteínas en condiciones óptimas. Se recoge la fracción correspondiente al pico del perfil de la cromatografía obtenida y se liofiliza. La fracción peptídica así purificada se identifica sometiéndola a análisis del peso molecular por espectroscopía de masas, análisis de la composición de aminoácidos o análisis de la secuencia de aminoácidos y similares.

Ejemplos específicos del péptido parcial de la IL-6 o del péptido parcial del receptor de IL-6 están descritos en la Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 2(1990)-188600, Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 7(1995)-324097, Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 8(1996)-311098 y Patente de Estados Unidos US 5210075.

La actividad del antagonista de IL-6 puede evaluarse aplicando un método conocido convencionalmente. Específicamente, se cultiva la célula dependiente de la IL-6 MH60.BSF2, se le añade IL-6 y la actividad puede evaluarse con la incorporación de ^{3}H-timidina a dicha célula dependiente de laIL-6 en coexistencia con el antagonista de IL-6. Alternativamente, puede efectuarse la evaluación por cultivo de U266, una célula que expresa el receptor de IL-6, añadiendo al mismo tiempo IL-6 marcada con ^{125}I y un antagonista de IL-6 y determinando a continuación la IL-6 marcada con ^{125}I unida a la célula que expresa el receptor de IL-6. En el sistema de ensayos anterior, se forma un grupo control negativo que no contenga antagonistas de IL-6, además del grupo en el que está presente un antagonista del receptor de IL-6, y se comparan los resultados obtenidos con ambos para evaluar la actividad inhibidora de la IL-6 del antagonista del receptor de IL-6.

Para confirmar los efectos conseguidos, un antagonista de IL-6 para uso en la presente invención se administra a animales que padecen la enfermedad intestinal inflamatoria por inyección de células CD4-positivas y CD45RB-fuertemente positivas (células CD4^{+}CD45RB^{alto}) y puede evaluarse el efecto sorprendente de pérdida de peso y mejora en la valoración de la enfermedad intestinal inflamatoria. Como efectos adicionales de la presente invención se dan los efectos de supresión de la anorexia, reducción de los dolores abdominales, mejora de la diarrea o la prevención de la reaparición de la enfermedad intestinal inflamatoria.

Las células CD4^{+}CD45RB^{alto} que son transferidas a animales por un antagonista de IL-6 pueden aislarse usando, por ejemplo, el método descrito en el Ejemplo siguiente. Los animales de los que proceden las células CD4^{+}CD45RB^{alto} pueden ser los usados corrientemente en los experimentos, tales como ratones y ratas.

Como se describe en el Ejemplo siguiente, en los animales que desarrollan la enfermedad intestinal inflamatoria, la administración de anticuerpo del receptor de IL-6 dio como resultado la supresión de la pérdida de peso y la mejora en la valoración de la enfermedad intestinal inflamatoria y por consiguiente se reveló que los antagonistas de IL-6, tal como el anticuerpo del receptor de IL-6, ejerce un efecto terapéutico sobre la enfermedad intestinal inflamatoria.

El sujeto que va a tratarse en la presente invención es un mamífero. El sujeto que va a tratarse es preferiblemente un ser humano.

Los agentes preventivos o terapéuticos descritos en la presente memoria pueden administrarse por vía oral o parenteral, sistémica o localmente. Por ejemplo, pueden seleccionarse inyección intravenosa, tal como infusión por goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, supositorios, lavado intestinal, comprimidos recubiertos entéricos para vía oral y similares, y el método de administración puede elegirse, cuando proceda, dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación eficaz se elige en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal por administración. Alternativamente, puede elegirse la dosificación en el intervalo de 1 a 1000 mg, preferiblemente de 5 a 50 mg por paciente.

Los agentes preventivos o terapéuticos para la enfermedad intestinal inflamatoria como se describen en la presente invención pueden contener vehículos o aditivos farmacéuticamente aceptables dependiendo de la vía de administración. Ejemplos de dichos vehículos o aditivos incluyen agua, un disolvente orgánico farmacéuticamente aceptable, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato sódico, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantán, goma arábiga, caseína, gelatina, agar-agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, seroalbúmina humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, un tensioactivo farmacéuticamente aceptable y similares. Los aditivos utilizados se eligen, aunque sin limitación, de los anteriores o sus combinaciones dependiendo de la forma farmacéutica.

La enfermedad objeto que ha de tratarse de acuerdo con la presente invención es la enfermedad intestinal inflamatoria. La enfermedad intestinal inflamatoriaincluye colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Estas enfermedades se dan principalmente en gente joven de alrededor de 20 años y son poco conocidos, incluso hoy día, los antígenos causantes o el mecanismo de la patología inflamatoria. Sin embargo, está en marcha una amplia investigación para determinarlos, con diversas células y citoquinas.

En los últimos años se han hecho progresos en el análisis de células que provocan la enfermedad intestinal inflamatoria. Por tanto, es evidente que puede construirse un modelo animal de la enfermedad intestinal inflamatoria por transferencia de células CD4-positivas y CD45R33-fuertemente positivas purificadas (CD4^{+}CD45RB^{alto}) a ratones inmunodeficientes (ratones SCID) (Morrissey, P. J. et al., J. Exp. Med. (1993)178, 237-244; Leach, M. W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515; Aranda, R. et al., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473).

Por otro lado, se ha demostrado que las células CD4-positivas, CD45RB-débilmente positivas (CD4^{+}CD45RB^{bajo}) no pueden inducir la enfermedad intestinal inflamatoria, si no que más bien suprimen la inducción de la enfermedad intestinal inflamatoria por las células CD4-positivas y CD45RB-fuertemente positivas (Powrie, F. R. et al., J. Exp. Med. (1994) 179, 589-600). Se sabe que el grado de expresión de CD45RB por la célula está relacionado con el modelo de producción de citoquina. Por tanto, se cree que las células CD4-positivas y CD45RB-fuertemente positivas son células similares a las células auxiliares tipo 1 (Th1) que producen IFN-\gamma y TNF-\alpha, mientras que las células CD4-positivas y CD45RB-débilmente positivas son células similares a las células auxiliares tipo 2 (Th2) que producen IL-4, IL-10 y similares (Lee, W. et al., J. Immunol. (1990) 144, 3288-3295).

Por tanto, se cree que el inicio de la IBD está asociado más probablemente a la alteración del equilibrio entre Th1 y Th2, y esto ha sido demostrado por el hecho de que la enteritis crónicas, parecida a la colitis ulcerosa humana, se desarrolla en ratones deficientes en IL-10 que fueron transformados por el método dirigido a un gen (Kuhn, R. et al., Cell (1993) 75, 263-274).

Los animales modelo usados en el Ejemplo son muy similares a los pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn en los aspectos histológicos del colon (Leach, M. W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515). En la colitis ulcerosa, las lesiones se observan con frecuencia en una sucesión amplia desde el recto y está especialmente afectado los epitelios de las mucosas. En el presente modelo, las patologías clínicas son muy similares porque los sitios lesionados cubren amplias zonas, aunque localizadas principalmente en el colon, y se extiende la cripta.

Por otro lado, la enfermedad de Crohn es una inflamación en todo el grosor, no localizada en la mucosa, y diseminada en cualquier parte del canal alimentario desde la cavidad bucal hasta el ano. Histológicamente, se caracteriza por la inflamación del granuloma no caseificante. Este modelo es muy similar al de la enfermedad de Crohn porque la inflamación no se encuentra localizada en la capa mucosal, donde se acumulan los macrófagos, los linfocitos y las células
gigantes multinucleares y con frecuencia toma la forma de granuloma y rara vez se encuentra un absceso en la cripta.

Así, hasta el momento se han descrito en la investigación clínica casos en los que coexisten los rasgos de la colitis ulcerosa y de la enfermedad de Crohn (Tanaka, M. et al., Hepatogastroenterology (1990) 37, 18-31). En la enfermedad intestinal inflamatoria, en el epitelio se encuentra una mayor expresión del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (Trejdosiewiez, L. K. et al., Dig. Dis. Sci. (1989) 34, 1449-1456) y lo mismo ocurre en el presente modelo. En este modelo, aparece un espesamiento característico del tejido epitelial, que se cree que está asociado a un mayor crecimiento celular encontrado en pacientes con colitis ulcerosa (Serafini, E. P. et al., Gut (1981) 22, 648-652).

El presente modelo es muy similar al modelo clínico de la enfermedad intestinal inflamatoria y puede inducir pérdida de peso en casos graves. En un experimento que utiliza el presente modelo, mejoraron notablemente las lesiones histológicas y no se observó pérdida de peso, lo que indica que un antagonista de IL-6 tiene un efecto terapéutico sobre la enfermedad intestinal inflamatoria, tal como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.

Ejemplos

A continuación se explicará con más detalle la presente invención con referencia a los Ejemplos de Trabajo, los Ejemplos de Referencia y los Ejemplos Experimentales. Sin embargo, debe observarse que la presente invención no está limitada de ningún modo por ellos.

Ejemplo de Trabajo

Se extrajo asépticamente el bazo de ratones BALB/c machos y después de homogeneización se pipeteó formando una suspensión de células individuales. A continuación, con el fin de eliminar los eritrocitos, se trató el sedimento celular con la solución de lisis (una mezcla 9:1 de NH_{4}Cl 0,16 M y tampón Tris 0,17 M a pH 7,2), y a continuación se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato obteniendo células de bazo de ratón.

Las células de bazo de ratón lavadas se pusieron en suspensión en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 2% y después del recuento celular se ajustó hasta 1,1 x 10^{8}/ml. A esto se añadió anticuerpo anti-CD4 de ratón (L3T4 Microbeads, fabricado por Miltenyi Biotec) a un volumen 1/9 y se unió a las células sobre hielo durante 15 minutos (a una densidad celular de 1 x 10^{8}/ml). Además por una operación en columna con el sistema de separación Mini MACS (fabricado por Miltenyi Biotec), se recogió la fracción de células CD4-positivas. Después del recuento celular, dicha fracción se puso en suspensión en una solución salina tamponada con fosfato a la que se había añadido FCS al 2% para ajustar la densidad celular a 4 x 10^{7}/ml.

A una suspensión de células CD4-positivas se añadieron un volumen 1/100 de anticuerpo anti-CD4 de ratón de rata marcado con PE (L3T4) (0,2 mg/ml, clon RM4-5, fabricado por Pharmingen)y un volumen 1/100 de anticuerpo anti-CD45RB de ratón de rata marcado con FITC (0,5 mg/ml, clon 16A, fabricado por Pharmingen). Dejándolo reposar en hielo durante 20 minutos, se unió a ella el anticuerpo. A las células marcadas se añadió un medio RPMI1640 al que se había añadido FCS al 2%, se lavó por centrifugación y se volvió a poner en suspensión en una solución salina tamponada con fosfato al que se había añadido FCS al 2% y se conservó en un lugar oscuro y frío.

A partir de las células CD4-positivas marcadas, se seleccionaron las células del grupo de células CD4-positivas y CD45RB-fuertemente positivas (células CD4^{+}CD45RB^{alto}) con un citómetro de flujo (FACS Vantage, fabricado por Becton Dickinson). Este grupo de células corresponde a más del 50% de las células que tienen una alta expresión de CD45RB entre las células CD4- y CD45RB-positivas. Las células obtenidas después de centrifugación, se pusieron en suspensión en solución salina tamponada con fosfato hasta una concentración de 4 x 10^{8}/ml. La pureza de las células fue 97% como células CD45RB-positivas y su índice de supervivencia 98%.

Estas células altamente purificadas se inyectaron intraperitonealmente a 4 x 10^{5}/ml (100 \mul de cada una de 4 x 10^{5}/ml) a ratones scid C.B-17 para preparar el modelo de enfermedad intestinal inflamatoria (Leach, M. W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515, Aranda, R. et al., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473). El experimento se realizó en los siguientes tres grupos por el método de tratamiento: (1) el grupo sin administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 y con transferencia de células, 5 ratones, (2) el grupo con administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 y con transferencia de células, 3 ratones y (3) el grupo sin transferencia de células, 3 ratones.

El anticuerpo anti-receptor de IL-6, MR16-1, se administró como sigue. En primer lugar, se ajustó hasta 20 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato, 100 \mul por ratón de la cual se administró intraperitonealmente 15 a 30 minutos antes de la inyección de las células anteriores. Una semana más tarde, se ajustó hasta 10 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato, 100 \mul por ratón de la cual se administró intraperitonealmente. Esto se repitió cada semana hasta 8 semanas después de la transferencia de las células. El grupo al que no se le administró anticuerpo recibió de manera similar solución salina tamponada con fosfato.

Se pesaron los ratones 8 a 9 semanas después de la transferencia de células, se extrajo el tejido del colon (la porción de colon descendente) y se sumergió en el compuesto OCT. Se congelaron muestras a -80ºC usando un criostato y bloques de muestras se cortaron en rodajas con una sección congelada de 6 \mum de espesor, que se fijaron en una solución de formalina al 10%. La sección fijada se tiñó dos veces con el método de hematoxilina-eosina para análisis histológico.

La evaluación de la eficacia de los fármacos se realizó por determinación de los cambios en el peso corporal (relación entre los valores de antes y después de la transferencia celular) y el análisis histológico antes de la inducción de la enfermedad intestinal inflamatoria por la transferencia celular y 8-9 semanas después de la transferencia celular. Para el análisis histológico, se evaluó el tejido de cada ratón basándose en las siguientes 4 etapas de la valoración de la enfermedad intestinal inflamatoria (denominada de aquí en adelante valoración de la enfermedad intestinal) (Ito, H. et al., J. Autoimmunity (1997) 10, 455-459).

Puntuación de la enfermedad intestinal inflamatoria:

Categoría 0 (no): indistinguible de los ratones BAL3/c normales,

Categoría 1 (mínima): una ligera hipertrofia de los tejidos epiteliales observados,

Categoría 2 (moderada): un estado intermedio entre la Categoría 1 y 3,

Categoría 3 (grave): una hipertrofia marcada de los tejidos epiteliales acompañada por una amplia infiltración de células inflamatorias y una deficiencia de células caliciformes.

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Los resultados en los cambios del peso corporal y en la evaluación de la enfermedad intestinal inflamatoria se muestran en la Tabla 1.

Los ratones a los que se implantaron las células CD4-positivas y CD45RB-fuertemente positivas desarrollaron la enfermedad intestinal inflamatoria y se observó también histológicamente una notable inflamación. Mostraron también debilidad asociada al inicio de la enfermedad y una disminución del 11% en el peso corporal medio. Por otro lado, en el grupo de administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6, se observó una supresión estadísticamente significativa de pérdida de peso manteniéndose el mismo peso corporal que antes de la transferencia celular. Además, las puntuaciones histológicas de la enfermedad intestinal inflamatoria han mostrado también la mejora de la enfermedad intestinal inflamatoria.

Para el ensayo estadístico de los cambios en el peso corporal, se realizó en primer lugar un ANOVA (Análisis de la varianza con el programa SFSS para Windows ver. 6, SPSS Inc.) para confirmar la relevancia seguido de una comparación múltiple por el método de Bonferroni, en el que se observó la relevancia con un nivel de relevancia del 5%.

Este modelo es muy similar al de la enfermedad intestinal inflamatoria y por consiguiente se demostró que el anticuerpo anti-receptor de IL-6 es eficaz como agente preventivo o terapéutico para la enfermedad intestinal inflamatoria, tal como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.

TABLA 1 Supresión de la pérdida de peso y del agravamiento de la enfermedad intestinal por el anticuerpo anti-receptor de IL-6

1

El cambio en el peso corporal se expresó como la media \pm la desviación típica del grupo.

La puntuación de la enfermedad intestinal se expresó como la media del grupo.

Ejemplo de Referencia 1

Preparación del receptor de IL-6 humano soluble

El receptor de IL-6 soluble se preparó por el método de PCR usando un plásmido pBSF2R.236 que contiene el cDNA que codifica el receptor de IL-6 obtenido de acuerdo con el método de Yamasaki et al., (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828). El plásmido pBSF2R.236 se sometió a digestión con una enzima de restricción Sph I obteniéndose el cDNA del receptor de IL-6, que se insertó a continuación en mp18 (fabricado por Amersham). Usando un oligocebador sintético diseñado para insertar un codón de parada en el cDNAdel receptor deIL-6, se produjo una mutación en el cDNA del receptor de IL-6 por el método de PCR usando el sistema de mutagénesis in vitro (fabricado por Amersham). El procedimiento dio como resultado la inserción de un codón de parada en el aminoácido en la posición 345 y el cDNA que codifica el receptor de IL-6 soluble.

Para expresar el cDNA del receptor de IL-6 soluble en células de CHO, se ligó al plásmido pSV (fabricado por Pharmacia) obteniendo el plásmido pSVL344. El cDNA del receptor de IL-6 soluble que se escindió con Hind III-Sal I se insertó en el plásmido pECEdhfr que contenía el cDNA de dhfrobteniéndose el plásmido pECEdhfr344 que puede expresarse en las células de CHO.

Se transfectaron 10 \mug del plásmido pECEdhfr344 a una línea de células DXB-11 de dhfr-CHO (Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) por el método de precipitación con fosfato de calcio (Chen C. et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Las células de CHO transfectadas se cultivaron durante 3 semanas en un medio de selección \alpha-MEM exento de nucleósidos que contenía glutamina 1 mM, FCS dializado al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.

Las células de CHO seleccionadas se escrutaron por el método de dilución limitante obteniéndose un único clon de células de CHO. El clon de células de CHO se amplificó en metotrexato (MTX) 20 nM - 200 nM obteniéndose una línea de células de CHO 5E27 que produce el receptor de IL-6 humano soluble. La línea de células de CHO 5E27 se cultivó en un medio Dulbecco modificado por Iscov (IMDM, fabricado por Gibco) que contenía FBS al 5%. Se recogió el líquido sobrenadante de cultivo y la concentración del receptor de IL-6 soluble en dicho líquido se determinó por ELISA. El resultado confirmó que el receptor de IL-6 soluble está presente en el líquido sobrenadante de
cultivo.

Ejemplo de Referencia 2

Preparación del anticuerpo anti-IL-6 humano

Ratones BALB/c se inmunizaron con 10 \mug de la IL-6 recombinante (Hirano et al., lmmunol. Lett., 17:41, 1988) junto con adyuvante completo de Freund, repitiéndose esto cada semana hasta que el anticuerpo anti-IL-6 puede ser detectado en el suero. Se extrajeron las células inmunes del ganglio linfático local y a continuación se mezclaron con la línea de células de mieloma P3U1 usando polietilenglicol 1500. Se seleccionaron los hibridomas de acuerdo con el método de Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunolgy, W. H. Freeman and Co., SanFrancisco, 351, 1980) que emplea el medio HAT y se estabilizó el hibridoma que produce el anticuerpo anti-IL-6 humano.

El hibridoma que produce el anticuerpo anti-IL-6 humano se sometió a un ensayo de unión a la IL-6 como sigue. Así, una placa de microvaloración de 96 pocillos de polivinilo flexible (fabricado por Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) se revistió con 100 \mul de Ig anti-ratón de cabra (10 \mul/ml, fabricado por Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) durante una noche a 4ºC. Posteriormente, la placa se trató con PBS que contenía seroalbúmina bovina (BSA) al 1% a temperatura ambiente durante 2 horas.

Después de lavado en PBS, se añadieron a cada pocillo 100 \mul del líquido sobrenadante del cultivo del hibridoma y a continuación se incubaron durante una noche a 4ºC. La placa se lavó, se añadió a cada pocillo IL-6 recombinante marcada con ^{125}I hasta una concentración de 2000 cpm/0,5 ng/pocillo y a continuación la radiactividad de cada pocillo después de lavado se determinó con un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). De 216 clones de hibridoma clones, 32 dieron positivos en el ensayo de unión a la IL-6. De estos clones, se obtuvo finalmente MH166.BSF2 estable. El anticuerpo anti-IL-6 MH166 producido por dicho hibridoma tiene un subtipo de IgG1\kappa.

A continuación, se usó el clon de hibridoma de ratón dependiente de IL-6 MH60.BSF2 para examinar la actividad neutralizante en relación con el desarrollo del hibridoma por el anticuerpo MH166. Las células MH60.BSF2 se distribuyeron hasta 1 x 10^{4}/200 \mul/pocillo y a ellas se añadieron muestras que contenían el anticuerpo MH166, se cultivaron durante 48 horas, se añadió 0,5 \muCi/pocillo de ^{3}H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA) y se continuó el cultivo durante 6 horas más. Las células se colocaron sobre papel de filtro sobre vidrio y se trataron con un recolector automático (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japón). Como testigo, se usó anticuerpo anti-IL-6 de conejo.

Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibía, dependiendo de la dosis, la incorporación de ^{3}H-timidina de las células MH60.BSF2 inducidas por IL-6. Esto revela que el anticuerpo MH166 neutraliza la actividad de IL-6.

Ejemplo de Referencia 3

Preparación de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano

El anticuerpo anti-receptor de IL-6 MT18 preparado por el método de Hirata et al. (Hirata, Y. et al., J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989) se unió a Sepharose 4B activada con CNBr (fabricado por Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) de acuerdo con el régimen adjunto y se purificó el receptor de IL-6 (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828). Una línea de células de mieloma humano U266 se solubilizó con hidrocloruro de fluoruro de p-para-aminofenil-metanosulfonilo 1 mM (fabricado por Wako Chemicals) que contiene digitonina al 1% (fabricado por Wako Chemicals), trietanolamina 10 mM (pH 7,8) y NaCl 0,15 M (tampón de digitonina) y se mezcló con anticuerpo MT18 unido a perlas de Sepharose 4B. A continuación, se lavaron seis veces las perlas con el tampón de digitonina para preparar el receptor de IL-6 parcialmente purificado.

Ratones BALB/c se inmunizaron cuatro veces cada diez días con el receptor de IL-6 parcialmente purificado obtenido de 3 x 10^{9} células U266 y a continuación se preparó un hibridoma con un método estándar. El líquido sobrenadante del cultivo de hibridoma procedente del pocillo con crecimiento positivo se analizó para determinar su actividad de unión al receptor de IL-6 de acuerdo con el método descrito a continuación. 5 x 10^{7} células U266 se marcaron con ^{35}S-metionina (2,5 mCi) y se solubilizaron con el tampón de digitonina anterior. Las células U266 solubilizadas se mezclaron con 0,04 ml de anticuerpo MT18 unido a perlas de Sepharose 4B y a continuación se lavaron seis veces con el tampón de digitonina. El receptorde IL-6 marcado con ^{99}S-metionina se eluyó con 0,25 ml del tampón de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó en 0,025 ml de Tris 1M (pH 7,4).

0,05 ml del líquido sobrenadante del cultivo de hibridoma se mezclaron con 0,01 ml de Proteína G Sepharose (fabricada por Pharmacia). Después de lavado, se incubó la Sepharose con 0,005 ml de solución de receptor de IL-6 marcado con ^{35}S preparada como se ha descrito anteriormente. El inmunoprecipitado se analizó por SDS-PAGE para analizar el líquido sobrenadante del cultivo de hibridomas que reacciona con el receptor de IL-6. Como resultado, se estableció el clon de hibridoma positivo PM-1. El anticuerpo producido a partir del hibridoma PM-1 tiene un subtipo de IgG1\kappa.

Se estudió la actividad inhibidora del anticuerpo producido por el hibridoma PM-1 contra la unión de la IL-6 al receptor de IL-6 humano utilizando la línea de células de mieloma humano U266. A partir de E. coli se preparó una IL-6 recombinante humana (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41-45, 1988) y se marcó con ^{125}Iusando el reactivo de Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981). Se cultivaron 4 x 10^{5} células U266 con el 70% (v/v) del líquido sobrenadante de cultivo de hibridoma PM-1 junto con 14.000 cpm de la IL-6 marcada con ^{125}I una hora a la temperatura ambiente. 70 \mul de la muestra se extendieron como capas sobre 300 \mul de FCS en un tubo de polietileno de 400 \mul para microcentrífuga. Después de centrifugación, se determinó la radiactividad de la célula.

El resultado reveló que el anticuerpo producido por el hibridoma PM-1 inhibe la unión de la IL-6 al receptor de IL-6.

Ejemplo de Referencia 4

Preparación del anticuerpo anti-receptor de IL-6 de ratón

Se preparó un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón de acuerdo con el método descrito en Saito et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173.

Se cultivaron células de CHO que producen el receptor de IL-6 soluble de ratón en el medio IMDM que contiene FCS al 10%. A partir del líquido sobrenadante de cultivo se purificó el receptor de IL-6 soluble de ratón usando el anticuerpo del receptor de IL-6 soluble de ratón RS12 (véase Saito et al., supra) y una columna de afinidad fijada al gel Affigel 10 (fabricada por Biorad).

El receptor de IL-6 soluble de ratón (50 \mug) se mezcló con adyuvante completo de Freund, que se inyectó a continuación en la cavidad abdominal de ratas Wistar. Dos semanas después de su administración, los animales se revacunaron con adyuvante incompleto de Freund. El día 45, se sacrificaron las ratas y aproximadamente 2 x 10^{8} células de bazo se fusionaron con 1 x 10^{7} células de mieloma de ratón P3U1 usando PEG1500 al 50% (Boehringer Mannheim) de acuerdo con el método convencional y a continuación se escrutaron por el medio de cultivo HAT.

Después que los líquidos sobrenadantes de cultivo de hibridomas se añadieron a la placa recubierta de anticuerpo IgG anti-rata de conejo (fabricado por Cappel), se añadió receptor de IL-6 soluble de ratón. Posteriormente, usando anticuerpo anti-receptor de IL-6 de ratón de conejo y anti-IgG de conejo de oveja marcada con fosfatasa alcalina, se escrutaron por ELISA hibridomas que producen el anticuerpo anti-receptor de IL-6 soluble de ratón. Después que se confirmó la producción del anticuerpo deseado, los clones de hibridoma se subescrutaron dos veces obteniendo un único clon de hibridoma. El clon se denominó MR16-1.

Se examinó la actividad neutralizante del anticuerpo producido por el hibridoma en la transducción de la señal de la IL-6 de ratón por incorporación de ^{3}H-timidina usando células MH60.BSF2 (Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). Se prepararon las células MH60.BSF2 a 1 x 10^{4} células/200 \mul/pocillo en microplacas de 96 pocillos. A cada pocillo se añadieron 10 pg/ml de IL-6 de ratón y anticuerpo MR16-1 o anticuerpo RS12 a 12,3 - 1000 ng/ml y a continuación se cultivaron a 37ºC durante 44 horas en CO_{2} al 5% y a continuación se añadió 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-timidina. Después de 4 horas, se midió la incorporación de ^{3}H-timidina. Como resultado, el anticuerpo MR16-1 suprimió la incorporación de ^{3}H-timidina de las células MH60.BSF2.

Así, se demostró que el anticuerpo producido por el hibridoma MR16-1-inhibe la unión de la IL-6 al receptor de IL-6.

Aplicación industrial

De acuerdo con la presente invención, se demostró que un antagonista de IL-6, el anticuerpo anti-receptor de IL-6, tiene un efecto terapéutico sobre la enfermedad intestinal inflamatoria. Así, se demostró que dicho antagonista es útil como agente terapéutico para la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.

Claims (11)

1. El uso de un antagonista de la interleuquina-6 (IL-6) para la producción de un agente preventivo o terapéutico para la enfermedad intestinal inflamatoria en la que el antagonista de la IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano es el anticuerpo PM-1.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es el anticuerpo MR16-1.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico o humanizado contra el receptor de IL-6.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo PM-1 humanizado.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la enfermedad intestinal inflamatoria es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.

11. El uso de un anticuerpo antagonista de la IL-6 dirigido contra el receptor de IL-6 para la producción de un agente para la supresión de pérdida de peso en la enfermedad intestinal inflamatoria.