ES2264135T3 - Inhibidor de la descomposicion de proteinas musculares que contienen anticuerpos frente al receptor de il-6. - Google Patents
Inhibidor de la descomposicion de proteinas musculares que contienen anticuerpos frente al receptor de il-6.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN AGENTE INHIBIDOR DE LA PROTEOLISIS DE LA PROTEINA MUSCULAR QUE COMPRENDE ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DE LA INTERLEUCINA 6R). PUEDEN UTILIZARSE COMO ANTICUERPOS IL ANIMALES COMO RATONES Y RATAS, ANTICUERPOS QUIMERICOS DE ESTOS ANTICUERPOS CON ANTICUERPOS HUMANOS, Y ANTICUERPOS HUMANOS REESTRUCTURADOS Y SIMILARES. EL AGENTE INHIBIDOR DE LA PROTEOLISIS DE LA PROTEINA MUSCULAR DE LA PRESENTE INVENCION ES UTIL EN LA INHIBICION DE LA PROTEOLISIS DE LA PROTEINA MUSCULAR OBSERVADA EN ENFERMEDADES TALES COMO CAQUEXIA CANCEROSA, SEPSIS, TRAUMA GRAVE O DISTROFIA MUSCULAR.
Description
Inhibidor de la descomposición de proteínas
musculares que contienen anticuerpos frente al receptor de
IL-6.
El presente invento se refiere a un agente
inhibidor de la proteolisis de proteínas musculares que comprende
un anticuerpo (anti-IL-6R) contra el
receptor de la interleucina 6 (IL-6R).
La IL-6 es una citocina a la que
se hace genéricamente referencia como factor 2 estimulante de
células B o interferón \beta2. Se descubrió que
IL-6 es un factor de diferenciación implicado en la
activación de células linfocíticas B (T. Hirano et al.,
Nature 324, 73-76, 1986). Más tarde se mostró que
ejerce un efecto sobre las funciones de diversas células (S. Akira
et al., Adv. in Immunology 54, 1-78,
1993).
La IL-6 es una citocina
multifuncional que actúa en diversas fases de la inmunidad, la
hematopoyesis, reacciones de fase aguda, etc. (T. Taga et
al., Critical Reviews in Immunol. 1992, 11:
265-280), y también se ha comunicado que, además de
actuar como un factor de crecimiento del mieloma múltiple, está
implicada en diversas enfermedades, tales como enfermedades en que
se observa plasmocitosis, incluyendo el reumatismo (T. Hirano et
al., Eur. J. Immunol. 1988, 18: 1.797-1.801; F.
A. Houssiau et al., Arth. Rheum. 1988, 31:
784-788) y la enfermedad de Castleman (K. Yoshizaki
et al., Blood 1989, 74: 1.360-1.367; S. J.
Brant et al., Clin. Invest. 1.990, 86:
592-599), la nefritis proliferativa de células
mesangiales [K. Ohta et al., Clin. Nephrol. (Alemania) 1992,
38: 185-189; A. Fukatsu et al., Lab. Invest.
1991, 65: 61-66; Y. Horii et al., J. Immunol.
1989, 143: 3.949-3.955] y la caquexia que acompaña
al crecimiento tumoral (G. Strassman et al., J. Clin. Invest.
1992, 89: 1.681-1.684).
En ratones transgénicos H-2Ld
hIL-6 (IL-6 Tgm), que expresan
IL-6 humana (hIL-6) en exceso por
ingeniería genética, se observaron plasmocitosis IgG1, nefritis
proliferativa del mesangio, anemia, trombocitopenia y aparición de
autoanticuerpos (T. Miyai et al., 21st Japan Immunol. Soc.
Pres., "Hematological and Serological Changes Accompanying Aging
in H-2Ld hIL-6 Transgenic Mice",
1.991), lo que sugiere que IL-6 está implicada en
diversas enfermedades.
Además, se sabe también que IL-6
ejerce el efecto de provocar in vitro la proteolisis de
proteínas musculares en mioblastos (T. Ebisui et al.,
Clinical Science 1995, 89: 431-439).
Sin embargo, no se ha sabido hasta ahora que un
anticuerpo contra el receptor de la interleucina 6 sea eficaz a la
hora de inhibir la proteolisis de proteínas musculares, y dichos
intentos han de hacerse ya.
Tsujinaka et al. (Biochemical and
Biophysical Research Communications, volumen 207, nº 1, 1995,
páginas 168-174) estudiaron ratones transgénicos
para interleucina 6. A las 16 semanas de edad, los músculos
gastrocnemios de los ratones transgénicos para IL-6
se volvieron atróficos en comparación con los de los ratones
normales, mientras que los pesos corporales aumentaron
significativamente. Los autores concluyeron que la
IL-6 es responsable del catabolismo muscular
aumentado al activar el sistema lisosomal de catepsinas (B y L). Los
resultados del estudio proporcionaron la clave de que la
sobreproducción de IL-6 in vivo induce
atrofia muscular. Los autores afirmaron que la IL-6
puede ser un candidato para un factor inductor de la proteolisis
muscular e indicaron que planeaban reducir los cambios de los
músculos en los ratones transgénicos mediante el tratamiento con
anticuerpo anti-receptor de IL-6 de
ratón y también planeaban examinar otro sistema proteolítico
importante, es decir, las actividades de los proteosomas y la
expresión del gen de la ubiquitina. Estas sugerencias experimentales
no vienen respaldadas con resultados ni datos experimentales.
El presente invento pretende proporcionar un
fármaco que inhiba la proteolisis de proteínas musculares y, más
particularmente, proporciona un agente inhibidor de la proteolisis
de proteínas musculares que comprende un anticuerpo contra el
receptor de IL-6.
Después de la aparición de caquexia cancerosa,
septicemia, traumatismo grave o distrofia muscular, etc., tiene
lugar una proteolisis de la proteína del músculo esquelético de modo
que se observa una disminución de la masa muscular. Hasta ahora,
sólo se han tomado medidas nosotrópicas (dirigidas contra los
síntomas) para inhibir a los agentes de esta proteolisis de
proteínas musculares en estas enfermedades, y aún ha de establecerse
un método fundamental de tratamiento para estas enfermedades.
Como resultado de llevar a cabo serios estudios
sobre los efectos de un anticuerpo contra el receptor de
IL-6 sobre la proteolisis de proteínas del músculo
esquelético, los inventores del presente invento hallaron que un
anticuerpo contra el receptor de IL-6 inhibe la
expresión de sistemas de enzimas proteolíticas que provocan la
proteolisis de proteínas musculares así como su actividad, lo que
conduce a la complexión del presente invento.
La Figura 1 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina B, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio obtenido de un ratón testigo.
La Figura 2 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina B, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio de un ratón transgénico para
IL-6 al que se ha administrado disolución salina
tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate
buffered saline).
La Figura 3 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina B, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio de un ratón transgénico para
IL-6 al que se ha administrado un anticuerpo contra
el receptor de IL-6.
La Figura 4 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina L, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio obtenido de un ratón testigo.
La Figura 5 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina L, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio de un ratón transgénico para
IL-6 al que se ha administrado PBS.
La Figura 6 es una fotografía (x400) que muestra
los resultados de una inmunotinción, con catepsina L, de un trozo
de tejido de músculo gastrocnemio de un ratón transgénico para
IL-6 al que se ha administrado un anticuerpo contra
el receptor de IL-6.
La Figura 7 es una fotografía que muestra los
resultados de una hibridación Northern sobre RNA que se origina en
músculo gactrocnemio de (A) un ratón testigo, (B) un ratón
transgénico al que se ha administrado PBS y (C) un ratón
transgénico al que se ha administrado un anticuerpo contra el
receptor de IL-6, usando cDNA de poliubiquitina
para la sonda.
La Figura 8 es una fotografía que muestra los
resultados de una hibridación Northern sobre RNA procedente de
músculo gactrocnemio de (A) un ratón testigo, (B) un ratón
transgénico al que se ha administrado PBS y (C) un ratón
transgénico al que se ha administrado un anticuerpo contra el
receptor de IL-6, utilizando cDNA de monoubiquitina
para la sonda.
La Figura 9 es un gráfico que indica los pesos
corporales de los ratones el día 17 del experimento, incluyendo los
pesos tumorales.
La Figura 10 es un gráfico que indica los pesos
de las canales de ratón el día 17 del experimento, sin incluir los
pesos tumorales.
La Figura 11 es un gráfico que indica el peso
del músculo gastrocnemio de los ratones el día 17 del
experimento.
La Figura 12 es un gráfico que indica la
actividad catepsina B en músculo gastrocnemio de ratón el día 17
del experimento.
La Figura 13 es un gráfico que indica la
actividad catepsina B + L en músculo gastrocnemio de ratón el día
17 del experimento.
El agente inhibidor de la proteolisis de
proteínas musculares del presente invento inhibe la descomposición
del músculo esquelético y previene la disminución de masa muscular
al disminuir la expresión y la actividad de sistemas de enzimas
proteolíticas inducidos o potenciados por IL-6. Los
sistemas de enzimas proteolíticas a los que aquí se hace referencia
indican rutas de proteolisis lisosomales y no lisosomales, tales
como las de catepsina B o L y de ubiquitina.
Los ejemplos de enfermedades en que la
proteolisis de proteínas musculares resulta inhibida y las
disminuciones de masa muscular son evitadas por el agente inhibidor
de la proteolisis de proteínas musculares del presente invento
incluyen caquexia cancerosa, sepsis, traumatismo grave y distrofia
muscular.
Aunque el anticuerpo contra el receptor de
IL-6 utilizado en el presente invento puede ser de
cualquier origen o tipo (monoclonal o policlonal) con tal que
bloquee la transducción de señales por IL-6 e inhiba
la actividad biológica de IL-6, es particularmente
preferible un anticuerpo monoclonal de origen mamífero. Como
resultado de la unión con IL-6R, este anticuerpo
inhibe la unión entre IL-6 e IL-6R,
bloqueando por ello la transducción de señales de
IL-6 e inhibiendo la actividad biológica de
IL-6.
No hay limitaciones particulares en cuanto a la
especie animal de la que proceden las células productoras del
anticuerpo monoclonal con tal que sea un mamífero, y el anticuerpo
puede ser un anticuerpo humano o el derivado de células de mamífero
distintas de células humanas. En el caso de un anticuerpo monoclonal
procedente de células de mamífero distintas de células humanas, es
preferible el anticuerpo monoclonal de conejos o roedores a causa
de la facilidad de su producción. Aunque no hay limitaciones
particulares sobre el tipo de células de roedor utilizadas, los
ejemplos preferibles incluyen células de ratón, rata y hámster.
Los ejemplos particularmente preferibles de este
tipo de anticuerpo contra el receptor de IL-6
incluyen el anticuerpo MR16-1 (T. Tamura et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90,
11.924-11.928, 1993) y el anticuerpo
PM-1 (Y. Hirata et al., J. Immunol. 143,
2.900-2.906, 1989).
El anticuerpo monoclonal puede ser básicamente
preparado de la manera mostrada a continuación, usando técnicas
conocidas. Es decir, usando IL-6R como antígeno
sensibilizante, se inmuniza un huésped con este agente
sensibilizante de acuerdo con un método de inmunización rutinario,
después de lo cual las células inmunes resultantes son fusionadas
con células madre conocidas de acuerdo con métodos de fusión celular
rutinarios, lo que va seguido de la exploración de células
productoras del anticuerpo monoclonal usando métodos de exploración
ordinarios.
Más específicamente, debería seguirse el
siguiente procedimiento para preparar el anticuerpo monoclonal. Por
ejemplo, se obtiene el anteriormente mencionado antígeno
sensibilizante usando la secuencia génica de IL-6R
humano descrita en la Patente Europea nº EP325474. Después de
insertar la secuencia génica de IL-6R humano en un
sistema vector de expresión conocido y transformar una célula
huésped adecuada, la proteína IL-6R objetivo es
purificada a partir de la célula huésped o del sobrenadante del
cultivo, después de lo cual esta proteína IL-6R
purificada es utilizada como antígeno sensibilizante.
Además, se obtiene el anteriormente mencionado
antígeno sensibilizante procedente de ratón usando la secuencia
génica de IL-6R de ratón descrita en la Publicación
de Patente no Examinada Japonesa nº 3-155795 y
siguiendo un procedimiento igual al seguido al utilizar la
anteriormente descrita secuencia génica de IL-6R
humano.
Además del que se expresa en la membrana
celular, el IL-6R capaz de ser liberado de la
membrana celular (sIL-6R) puede ser también
utilizado como antígeno. El sIL-6R está compuesto
principalmente de la región extracelular del IL-6R
unido a la membrana celular y difiere del IL-6R
unido a la membrana en que carece de una región trasmembrana o de
una región trasmembrana y una región intracelular.
Aunque no hay limitaciones particulares en
cuanto a los mamíferos que son inmunizados con un antígeno
sensibilizante, es preferible seleccionar un mamífero considerando
su compatibilidad con las células madre utilizadas para la fusión
celular. Los ejemplos típicos de los mamíferos utilizados incluyen
ratones, ratas, hámsters y conejos.
La inmunización del animal con el antígeno
sensibilizante se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos.
Por ejemplo, como un ejemplo de un método típico, la inmunización
puede ser llevada a cabo inyectando el antígeno sensibilizante
intraperitoneal o subcutáneamente. Más específicamente, después de
diluir y suspender el antígeno sensibilizante en una cantidad
adecuada de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o
disolución salina fisiológica, la suspensión resultante es mezclada
con una cantidad adecuada de un adyuvante ordinario, tal como
adyuvante completo de Freund, según sea necesario. Después de un
emulsionamiento, la emulsión resultante es adecuadamente
administrada al mamífero a lo largo del curso de varias
administraciones cada cuatro a 21 días. Además, puede utilizarse un
vehículo adecuado durante la inmunización con el antígeno
sensibilizante.
Después de inmunizar de esta manera y confirmar
que el nivel del anticuerpo deseado ha crecido en el suero, se
extraen células inmunes del mamífero y se utilizan para la fusión
celular. Los ejemplos preferibles de células inmunes son las
células esplénicas en particular. Las células de mieloma de un
mamífero utilizadas como las otras células madres que se van a
fusionar con las anteriormente mencionadas células inmunes pueden
ser diversas cepas celulares previamente conocidas, ejemplos
preferibles de las cuales incluyen P3 (P3x63Ag8.653; J. Immunol.
123: 1.458, 1978), P3-UI (Current Topics in
Microbiology and Immunology 81: 1-7, 1978),
NS-1 (Eur. J. Immunol. 6: 511-519,
1976), MPC-11 (Cell 8: 405-415,
1976), SP2/0 (Nature 276: 269-270, 1978), FO (J.
Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med.
148: 313-323, 1978) y R210 (Nature 277:
131-133, 1979).
La fusión celular de las anteriormente
mencionadas células inmunes y células de mieloma puede ser llevada
básicamente a cabo de acuerdo con métodos conocidos, tal como el
método de Milstein et al. (Milstein et al., Methods
Enzymol. 73: 3-46, 1981). Más específicamente, la
anteriormente mencionada fusión celular es llevada a cabo durante
el curso de un cultivo normal con nutrientes en presencia de un
activador de la fusión celular. Los ejemplos de activadores de
fusión que se utilizan incluyen polietilenglicol (PEG) y virus
Sendai (HVJ). Además, puede añadirse un agente auxiliar tal como
dimetilsulfóxido y utilizarse para mejorar la eficacia de la
fusión, según se desee.
La relación utilizada de células inmunes a
células de mieloma es preferiblemente, por ejemplo, de 1 a 10
células inmunes por célula de mieloma. En cuanto al medio de
cultivo utilizado para la fusión celular anteriormente mencionada,
pueden utilizarse el medio de cultivo RPMI 1640 y el medio de
cultivo MEM, adecuados para el desarrollo de la cepa de células de
mieloma anteriormente mencionada, así como otro medio de cultivo
ordinario utilizado en este tipo de cultivo celular. Además, éste
puede ser también utilizado en combinación con complementos séricos
tales como suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal
calf serum).
Para esta fusión celular, las cantidades
prescritas de las anteriormente mencionadas células inmunes y
células de mieloma son bien mezcladas en el anteriormente
mencionado medio de cultivo, lo que va seguido de la adición de una
disolución de PEG calentada de antemano a aproximadamente 37°C, por
ejemplo, una disolución de PEG que tiene un peso molecular medio de
aproximadamente 1.000 a 6.000, normalmente en una concentración de
30 a 60% (peso/volumen), y de mezclamiento para formar las células
fusionadas objetivo (hibridoma). Continuando con la adición
secuencial de una cantidad adecuada de medio de cultivo y la
repetición de una centrifugación y una separación del sobrenadante,
pueden eliminarse los agentes de fusión celular y demás no adecuados
para el desarrollo del hibridoma.
Dicho hibridoma es seleccionado por cultivo en
un medio de cultivo selectivo ordinario, tal como medio de cultivo
HAT (medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y
timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT se continúa
normalmente durante un período de varios días a varias semanas o
durante un período que sea suficiente para eliminar todas las
células salvo el hibridoma objetivo (células no fusionadas). A
continuación, se realizan una exploración y la clonación individual
del hibridoma que produce el anticuerpo objetivo, llevando a cabo
una dilución limitante ordinaria.
El hibridoma así preparado que produce el
anticuerpo monoclonal puede ser subcultivado en un medio de cultivo
ordinario y ser almacenado durante mucho tiempo en nitrógeno
líquido.
Con objeto de obtener el anticuerpo monoclonal
de dicho hibridoma, se cultiva dicho hibridoma de acuerdo con
métodos ordinarios y se emplea un método para obtención en forma de
sobrenadante de cultivo, o se emplea un método mediante el cual el
hibridoma es trasplantado a un mamífero con el que es compatible y
es dejado crecer y luego se obtienen los anticuerpos en forma de
fluido ascítico. El primer método es adecuado para obtener un
anticuerpo muy puro, mientras que el segundo método es adecuado para
la producción de grandes cantidades de anticuerpo.
Además, el anticuerpo monoclonal no sólo se
obtiene de las células productoras de anticuerpo obtenidas al
inmunizar con antígeno y de un hibridoma producido por fusión
celular, sino que también puede utilizarse el anticuerpo monoclonal
que se produce usando tecnología de recombinación génica por
clonación de un gen de anticuerpo, incorporación de ese gen a un
vector adecuado e introducción de ese vector en una cepa celular
conocida, tal como células COS o CHO (véase, por ejemplo, A.-M.
Vandamme et al., Eur. J. Biochem. 192:
767-775, 1990).
Además, el anticuerpo monoclonal obtenido al
usar los métodos anteriormente mencionados puede ser purificado
hasta una pureza elevada utilizando técnicas de purificación
ordinarias tales como precipitación salina, filtración en gel y
cromatografía de afinidad. Puede confirmarse que el anticuerpo
monoclonal producido de esta manera reconoce al antígeno, tanto con
elevada sensibilidad como con elevada exactitud, mediante técnicas
inmunológicas ordinarias tales como radioinmunoensayo (RIA),
inmunoensayo enzimático (EIA, ELISA) y análisis por
inmunofluorescencia.
El anticuerpo monoclonal utilizado en el
presente invento no se limita al anticuerpo monoclonal producido
por el hibridoma sino que también puede ser el que ha sido
artificialmente modificado con el fin de reducir la
heteroantigenicidad para seres humanos. Por ejemplo, puede
utilizarse un anticuerpo quimérico que esté compuesto de las
regiones variables del anticuerpo monoclonal de un ratón u otro
mamífero distinto de un ser humano, y regiones constantes de un
anticuerpo humano. Este tipo de anticuerpo quimérico puede ser
producido utilizando métodos conocidos para producir anticuerpos
quiméricos y, particularmente, usando tecnología de recombinación
génica.
Además, en el presente invento también puede
utilizarse un anticuerpo humano remodelado. Un anticuerpo remodelado
es aquél en que las regiones determinantes de complementariedad de
un anticuerpo humano están sustituidas por las regiones
determinantes de complementariedad de un anticuerpo de un mamífero
distinto de un ser humano, tal como un ratón, y se conocen sus
técnicas generales de recombinación génica. Usando éstos métodos
conocidos, puede obtenerse un anticuerpo humano remodelado que sea
útil en el presente invento.
Además, pueden sustituirse aminoácidos de las
regiones estructurales (FR; del inglés, framework) de
la región variable del anticuerpo con objeto de formar un adecuado
sitio ligante de antígeno en las regiones determinantes de
complementariedad del anticuerpo humano remodelado (Sato et
al., Cancer Res. 53: 1-6, 1933). Un ejemplo
preferible de este tipo de anticuerpo humano remodelado es
PM-1 humanizado (hPM-1; véase la
Solicitud de Patente Internacional nº WO
92-19759).
Además, puede construirse un gen que codifique
fragmentos de anticuerpo, tal como Fab o Fv, o un Fv de una sola
cadena (scFv; del inglés, single chain Fv) en que Fvs
de la cadena H y la cadena L están unidos por un conector adecuado;
este gen puede luego expresarse en una célula huésped adecuada y
utilizarse después para el fin anteriormente descrito con tal que
se una al antígeno e inhiba la actividad de IL-6
(véanse, por ejemplo, Bird et al., TIBTECH 9:
132-137, 1991; Huston et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85, 5.879-5.883, 1988). Además, la
región V del anticuerpo remodelado anteriormente mencionado puede
ser usada para las Fvs de la cadena H y la cadena L utilizadas para
producir scFv.
El agente inhibidor de enzimas proteolíticas de
proteínas musculares que comprende un anticuerpo contra el receptor
de IL-6 del presente invento puede ser utilizado en
el presente invento con tal que bloquee la transducción de señales
de IL-6 y sea eficaz frente a las enfermedades que
presentan descomposición de proteína muscular. El fármaco
terapéutico preventivo del presente invento es preferiblemente
administrado parenteralmente y puede ser administrado sistémica o
tópicamente mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, inyección
intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea.
Además, puede tener la forma de una composición o sistema
farmacéutico con al menos un tipo de vehículo o agente diluyente
farmacéutico.
Aunque la dosis varía de acuerdo con el estado y
la edad del paciente o con el método de administración, es
necesario seleccionar una dosis adecuada para la dosis del fármaco
preventivo o terapéutico del presente invento para seres humanos.
Por ejemplo, puede seleccionarse una dosis dividida entre cuatro
administraciones o menos dentro del intervalo de aproximadamente 1
a 1.000 mg/paciente. Además, puede administrarse en una dosis de 1
a 10 mg/kg/semana. Sin embargo, el fármaco preventivo o terapéutico
del presente invento no se limita a estas dosis.
El fármaco preventivo o terapéutico del presente
invento puede ser preparado de acuerdo con métodos rutinarios. Por
ejemplo, para preparar una preparación para inyección, el anticuerpo
purificado contra IL-6R es disuelto en un
disolvente tal como disolución salina fisiológica o tampón
fisiológico, lo que va seguido de la adición de un agente para
prevenir la adsorción, tal como Tween80, gelatina o albúmina sérica
humana (HSA; del inglés, human serum albumin).
Alternativamente, puede ser también liofilizado con objeto de ser
reconstituido antes de su uso. Los ejemplos de vehículos que pueden
ser utilizados para la liofilización incluyen alcoholes de azúcar y
azúcares tales como manitol y glucosa.
Aunque a continuación se proporciona una
explicación detallada del presente invento por medio de sus Ejemplos
y Ejemplos de Referencia, el presente invento no se limita a
éstos.
Ejemplo de Referencia
1
Un fragmento Sph1-XhoII de 3,3
kb que contenía cDNA de IL-6 humana fusionado con el
promotor de H-2Ld
(Ld-IL-6; Suematsu et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 7.547, 1989) fue inyectado
mediante microinyección en el pronúcleo del óvulo fertilizado de
ratones CS7BL/6J (B6; Japan Clea) de acuerdo con el método de
Yamamura et al. descrito en J. Biochem. 96, 357, 1984.
La introducción del transgén anteriormente
mencionado fue explorada mediante un análisis, por transferencia
Southern, de DNA caudal sometido a digestión con EcoRI, utilizando
un fragmento TaqI-BanII de cDNA de
IL-6 humana marcado con ^{32}P para la sonda. El
transgén fue detectado al identificar los ratones transgénicos
mediante análisis, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del
inglés, polymerase chain reaction), de DNA
caudal utilizando TaqDNA polimerasa y dos tipos de cebadores
específicos para cDNA de IL-6 humana, es decir,
CHIL6P5 (5'-ACCTCTTCAG
AACGAATTGACAAA-3'; SEQ ID. NO: 1) y CHIL6p7i (5'-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3'; SEQ ID NO: 2). Las concentraciones de IL-6 en suero, según se determinaron mediante un ensayo ELISA específico para IL-6 humana (T. Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18, 951-956, 1988), en estos ratones transgénicos fueron superiores a 600 pg/ml después de 12 semanas de edad.
AACGAATTGACAAA-3'; SEQ ID. NO: 1) y CHIL6p7i (5'-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3'; SEQ ID NO: 2). Las concentraciones de IL-6 en suero, según se determinaron mediante un ensayo ELISA específico para IL-6 humana (T. Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18, 951-956, 1988), en estos ratones transgénicos fueron superiores a 600 pg/ml después de 12 semanas de edad.
Ejemplo de Referencia
2
Se prepararon células CHO productoras de
IL-6R soluble de ratón del modo descrito por Saito
et al., J. Immunol. 147, 168-173, 1991.
Estas células fueron cultivadas en medio \alphaMEM que contenía
suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine
serum) al 5% a 37°C en una atmósfera húmeda que contenía
CO_{2} al 5% en aire. El medio acondicionado fue recuperado y fue
usado como una preparación de sIL-6R. La
concentración de sIL-6R de ratón en el medio fue
medida mediante un ensayo ELISA sándwich usando el anticuerpo
monoclonal RS15 anti-IL-6R de ratón
(Saito et al., J. Immunol. 147, 168-173,
1991) y anticuerpo policlonal de conejo
anti-IL-6R de ratón.
El sIL-6R de ratón fue
purificado mediante una columna de afinidad en la que estaba
adsorbido anticuerpo monoclonal
anti-IL-6R de ratón (RS12). Se
inmunizaron ratas Wistar mediante una inyección subcutánea de 50
\mug de sIL-6R purificado de ratón en adyuvante
completo de Freund, seguida de un refuerzo con cuatro inyecciones
de 50 \mug de sIL-6R de ratón en adyuvante
incompleto de Freund una vez a la semana comenzando dos semanas más
tarde. Una semana después del refuerzo final, se administraron
intravenosamente 50 \mug de sIL-6R de ratón en
100 \mul de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) a las
ratas.
Se extirparon los bazos de las ratas 3 días más
tarde y se fusionaron las células esplénicas de rata con células de
mieloma p3U1 de ratón en una relación de 10:1 usando
polietilenglicol (Boehringer-Mannheim). Después de
una incubación durante la noche en 100 \mul de medio RPMI1690 que
contenía FBS al 10%, a 37°C, en los pocillos de una placa de 96
pocillos (Falcon 3075). Se añadieron 100 \mul de medio de
hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT) que contenía
IL-6 humana a cada pocillo. La mitad del medio fue
diariamente sustituida por medio HAT durante 4 días.
Después de 7 días, se seleccionó el hibridoma
que producía anti-sIL-6R de ratón
mediante un ensayo de unión a sIL-6R de ratón
(ELISA). En otras palabras, se incubaron 100 \mul del sobrenadante
de hibridoma durante 60 minutos en placas revestidas con anticuerpo
policlonal de conejo anti-IgG de rata en una
concentración de 1 \mug/ml. Las placas fueron lavadas y fueron
incubadas con 100 \mug/ml de sIL-6R de ratón.
Después de un lavado, se añadió anticuerpo policlonal de conejo
anti-IL-6R de ratón en una
concentración de 2 \mug/ml, después de lo cual las placas fueron
lavadas y fueron luego incubadas durante 60 minutos con anticuerpo
policlonal de cabra anti-IgG de conejo, unido a
fosfatasa alcalina (Tago).
Finalmente, después de un lavado, las placas
fueron incubadas con sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma 104;
p-nitrofenilfosfato) y fueron luego leídas
utilizando un aparato para lectura de placas (Tosoh), a 405 nm. El
hibridoma que reconocía sIL-6R de ratón fue clonado
dos veces por dilución limitada. Con objeto de preparar el fluido
ascítico, se inyectaron dos veces 0,5 ml de pristano a ratones
BALB/c nu/nu, después de lo cual, 3 días más tarde, se inyectaron
intraperitonealmente 3 x 10^{6} células de hibridoma establecidas.
El fluido ascítico fue recogido de 10 a 20 días más tarde, y el
anticuerpo monoclonal MR16-1 fue purificado del
fluido ascítico usando una columna de proteína G (Oncogene
Science).
El efecto neutralizante del anticuerpo producido
por MR16-1 sobre IL-6 fue analizado
de acuerdo con la incorporación de ^{3}H-timidina
por células MH60.BSF2 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18,
951-956, 1988). Se distribuyeron células MH60.BSF2
en una placa de 96 pocillos en una cantidad de 1 x 10^{4}
células/200 \mul/pocillo, lo que fue seguido de la adición de
IL-6 de ratón (10 pg/ml) y anticuerpo
MR16-1 o RS12, después de lo cual las células se
cultivaron durante 44 horas en CO_{2} al 5% a 37°C. A
continuación, se añadió ^{3}H-timidina (3,7 x
10^{7} Bq/pocillo) a cada pocillo, y, 4 horas más tarde, se midió
la incorporación de ^{3}H-timidina.
Ejemplo
1
Experimento
1
Se mantuvieron ratones transgénicos como los
descritos anteriormente en jaulas individuales dentro de una
habitación con aire acondicionado, ajustada a un ciclo de
luz/oscuridad de 12 horas al día. Los animales se alimentaron ad
libitum con dieta estándar CE-2 de laboratorio,
obtenida de Japan Clea. Para el testigo, se mantuvieron ratones
C57BL/6J normales bajo idénticas condiciones. Se asignaron los
ratones a tres grupos. Se asignaron seis de los ratones normales al
grupo testigo (C-1 a C-6, todos
hembras). Se asignaron seis de los susodichos ratones transgénicos
a los grupos de ensayo (A-1 a A-4 =
hembras; A-5 y A-6 = machos). Se
asignaron cinco de los susodichos ratones transgénicos a un grupo
de comparación (P-1 a P-4 = hembras;
P-5 = macho).
Tras dejarlos hasta 4 semanas de edad, los
ratones del grupo de ensayo recibieron intravenosamente el
anticuerpo monoclonal MR16-1 de ratón contra
receptores de IL-6 descrito en el Ejemplo de
Referencia 2, en una dosis de 2 mg/ratón a las 5 semanas de edad.
Luego se administró subcutáneamente el susodicho anticuerpo
monoclonal MR16-1 de ratón dos veces a la semana en
una dosis de 100 \mug/ratón desde las 6 hasta la 14 semanas de
edad. Tras ser pesados a las 15 semanas de edad, los ratones fueron
sacrificados y sometidos a una autopsia para extraer el músculo
gastrocnemio y el bazo, después de lo cual se midieron sus pesos.
Las muestras de músculo gastrocnemio fueron rápidamente congeladas
en nitrógeno líquido después de la medición del peso. Los animales
del grupo de comparación fueron tratados simultáneamente a los del
grupo de ensayo con la excepción de la administración de un volumen
igual de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) en lugar de
anticuerpo. Los animales del grupo testigo no recibieron anticuerpo
ni PBS.
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
| Ratón | Sexo | Peso corporal (g) | Peso del músculo | Peso del bazo (mg) | ||||||
| gastrocnemio (mg) | ||||||||||
| Peso | Media | SD | Peso | Media | SD | Peso | Media | SD | ||
| C-1 | H | 21,67 | 131,9 | 964 | ||||||
| C-2 | H | 19,77 | 112,8 | 877 | ||||||
| C-3 | H | 21,58 | 127,8 | 911 | ||||||
| C-4 | H | 20,31 | 112,1 | 864 | ||||||
| C-5 | H | 18,58 | 110,1 | 823 | ||||||
| C-6 | H | 21,11 | 20,5 | 1,2 | 121,2 | 119,3 | 9,09 | 738 | 862,8 | 77,4 |
| P-1 | H | 23,84 | 91,8 | 1.303 | ||||||
| P-2 | H | 18,07 | 71,8 | 1.061 | ||||||
| P-3 | H | 21,19 | 109,1 | 977 | ||||||
| P-4 | H | 23,68 | 21,7 | 2,7 | 91,3 | 91,0 | 15,2 | 1.628 | 1.242 | 292 |
| Ratón | Sexo | Peso corporal (g) | Peso del músculo | Peso del bazo (mg) | ||||||
| gastrocnemio (mg) | ||||||||||
| Peso | Media | SD | Peso | Media | SD | Peso | Media | SD | ||
| P-5 | M | 30,56 | 192,1 | 1.722 | ||||||
| A-1 | H | 20,09 | 110,1 | 921 | ||||||
| A-2 | H | 19,6 | 121,8 | 888 | ||||||
| A-3 | H | 18,15 | 106,9 | 843 | ||||||
| A-4 | H | 21,03 | 19,7 | 1,2 | 130,4 | 117,3 | 10,8 | 902 | 888,5 | 33,2 |
| A-5 | M | 23,52 | 144,2 | 1.032 | ||||||
| A-6 | M | 23,60 | 23,6 | 0,06 | 139,7 | 142,0 | 3,18 | 1.049 | 1.041 | 12 |
| SD = desviación estándar (del inglés, standard deviation) |
\vskip1.000000\baselineskip
A pesar de que los pesos corporales del grupo de
comparación eran mayores que los del grupo testigo, los pesos del
músculo gastrocnemio eran menores y se observó atrofia muscular.
Además, también se observó un aumento del peso del bazo. Por otra
parte, estos cambios no se observaron en el grupo de ensayo, y los
resultados fueron casi iguales a los del grupo testigo para todos
los parámetros.
Experimento
2
Se mantuvieron y trataron animales de la misma
manera que en el Experimento 1. Se asignaron seis de los susodichos
ratones normales (C-1 a C-6 = todos
hembras) al grupo testigo y se asignaron cinco de los susodichos
ratones transgénicos (A-1 a A-4 =
hembras; A-5 = macho) al grupo de ensayo. Se
asignaron cinco de los susodichos ratones transgénicos
(P-1 a P-4 = hembras;
P-5 y P-6 = machos) al grupo de
comparación. Se lavó dos veces el músculo gastrocnemio de ratón,
obtenido a las 16 semanas de edad de la misma manera que en el
Experimento 1, con una disolución de homogeneización (sacarosa 250
mM, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH de
7,4), lo que fue seguido de homogeneización para preparar una
suspensión celular usando un homogeneizador Polytron y tratamiento
ultrasónico en 1 ml de la susodicha disolución de homogeneización
que contenía Triton-X100
al 0,2%.
al 0,2%.
El producto de homogeneización resultante fue
separado por centrifugación durante 15 minutos a 18.000 G. El
sobrenadante fue diluido con un volumen igual de glicerol y fue
guardado a -40°C hasta el momento del análisis. Luego se ensayó la
actividad catepsina B en un pH de 6,0 utilizando
Z-Arg-Arg-AMC 10
\muM como sustrato, de acuerdo con el método de Barrett et
al. (A. J. Barrett et al., Methods Enzymol. 80:
535-561, 1976). Al margen de esto, con objeto de
obtener una muestra en blanco, el extracto anteriormente mencionado
fue incubado durante 5 minutos a 37°C con E-64
[L-3
carboxi-trans-2,3-epoxipropionil-leucilamido-(4-guanidino)butano;
Protein Research Foundation, Osaka, Japón] 1 \muM para inhibir la
actividad catepsina B.
Se ensayó la actividad catepsina B + L de la
misma manera que en el ensayo de la actividad catepsina B con la
excepción de que se usó
Z-Phe-Arg-AMC como
sustrato. Puesto que este sustrato es hidrolizado no sólo por
catepsina L sino también por catepsina B, su hidrólisis puede ser
utilizada como un indicador de la actividad catepsina B + L. La
concentración de proteína del extracto fue determinada de acuerdo
con el método de Bradford (M. M. Bradford, Anal. Biochem. 72:
248-254, 1976).
Se calculó la actividad específica (nanomoles de
AMC/mg de proteína hora) para cada animal al dividir la velocidad
de producción de AMC en el ensayo anteriormente mencionado
(nanomoles de AMC/ml h) por la concentración de proteína (mg/ml).
Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.
| Ratón | \DeltaAMC | Conc. Proteína | Actividad específica | Media | SD |
| C-1 | 0,0065 | 2.381,4 | 3,602 | ||
| C-2 | 0,0054 | 2.195,3 | 3,221 | ||
| C-3 | 0,0056 | 2.477,1 | 2,979 | ||
| C-4 | 0,0045 | 2.189,3 | 2,737 | ||
| C-5 | 0,0049 | 1.998,3 | 3,213 | ||
| C-6 | 0,0066 | 2.255 | 3,88 | 3,272 | 0,41 |
| B-1 | 0,142 | 2.188,3 | 85,69 | ||
| B-2 | 0,1757 | 3.029,2 | 76,58 | ||
| B-3 | 0,0367 | 2.304,1 | 21,02 | ||
| B-4 | 0,137 | 2.176,8 | 83,1 | ||
| B-5 | 0,0412 | 3.091,9 | 17,59 | 56,8 | 34,4 |
| A-1 | 0,0068 | 2.188,8 | 4,083 | ||
| A-2 | 0,0084 | 2.303,1 | 4,817 | ||
| A-3 | 0,0056 | 2.171,8 | 3,382 | ||
| A-4 | 0,0073 | 2.356,3 | 4,083 | ||
| A-5 | 0,0054 | 2.579,4 | 2,761 | 3,825 | 0,78 |
| Ratón | \DeltaAMC | Conc. proteína | Actividad específica | Media | SD |
| C-1 | 0,1112 | 2.381,4 | 61,64 | ||
| C-2 | 0,1276 | 2.195,3 | 76,72 | ||
| C-3 | 0,11408 | 2.477,1 | 60,79 | ||
| C-4 | 0,11685 | 2.189,3 | 70,45 | ||
| C-5 | 0,1034 | 1.998,3 | 68,31 | ||
| C-6 | 0,11234 | 2.255 | 65,76 | 67,28 | 5,942 |
| B-1 | 0,90735 | 2.188,3 | 547,3 | ||
| B-2 | 1,0155 | 3.029,2 | 442,5 | ||
| B-3 | 0,30005 | 2.304,1 | 171,9 | ||
| B-4 | 0,85004 | 2.176,8 | 515,5 | ||
| B-5 | 0,26715 | 3.091,9 | 114,1 | 358,2 | 201,2 |
| A-1 | 0,09708 | 2.188,8 | 58,55 | ||
| A-2 | 0,13749 | 2.303,1 | 78,8 | ||
| A-3 | 0,07708 | 2.171,8 | 46,85 | ||
| A-4 | 0,08475 | 2.356,3 | 47,48 | ||
| A-5 | 0,04716 | 2.579,4 | 24,14 | 51,16 | 19,88 |
Aunque las actividades catepsina B y catepsina B
+ L estaban significativamente aumentadas en el grupo de
comparación, el nivel de actividad en el grupo de ensayo era casi el
mismo que en el grupo testigo.
Experimento
3
Se mantuvieron y trataron los animales de la
misma manera que en el Experimento 1, se obtuvo el músculo
gastrocnemio de la misma manera, se prepararon cortes transversales
congelados de dicho músculo gastrocnemio con un grosor de 4 \mum
y se pusieron los cortes en portaobjetos revestidos con
poli-L-lisina. Uno de los
portaobjetos fue teñido con tintura de hematoxilina y eosina.
En cuanto a los otros portaobjetos, una vez
bloqueada la peroxidasa intrínseca durante 20 minutos en azida
sódica al 0,1% (peso/volumen) que contenía peróxido de hidrógeno al
0,3% (volumen/volumen), se trataron durante 20 minutos con suero
normal de cabra al 3% (volumen/volumen) para bloquear toda unión
inespecífica. Luego se incubaron los cortes durante la noche con
anticuerpo purificado de conejo contra catepsina B de rata (E.
Kominami et al., J. Biochem. 98: 87-93, 1985)
(2 \mug/ml) y anticuerpo de conejo contra catepsina L de rata
(Y. Banco et al., J. Biochem. 100: 35-42,
1986) (10 \mug/ml) en una habitación humidificada a 4°C.
Tras un lavado en PBS, se añadió inmunoglobulina
anti-conejo de ratón conjugada con biotina (sistema
Histofine SAB-PO, Nichirei Co., Ltd.), después de
lo cual se incubaron los portaobjetos durante 20 minutos a
temperatura ambiental. Después de un lavado a fondo en PBS, se
añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa, tras lo cual se
incubaron adicionalmente los portaobjetos durante 20 minutos.
Se desarrollaron los productos inmunoteñidos
dejándolos reaccionar durante 3 minutos con
3,3-diaminobencidina al 0,02% (peso/volumen) e
hidrógeno peroxidasa al 0,03% (volumen/volumen) en
Tris-HCl 0,05 M (pH de 7,6). Cada ensayo de tinción
contenía un testigo negativo al usarse suero normal de cabra. Los
resultados se muestran en las Figuras 1 a 6. Las catepsinas B y L
resultaron intensamente teñidas en los ratones transgénicos para
IL-6. Por otra parte, la expresión de catepsinas B y
L resultó inhibida en los ratones transgénicos a los que se había
administrado el anticuerpo contra el receptor de
IL-6.
Experimento
4
Se mantuvieron y trataron los animales de la
misma manera que en el Experimento 1. Se usaron diez de los
anteriormente mencionados ratones normales para el grupo testigo,
mientras que se usaron 10 de los anteriormente mencionados ratones
transgénicos para el grupo de ensayo. Se extrajo el RNA total del
músculo gastrocnemio utilizando tiocianato de guanidina de acuerdo
con el método de J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18:
5.291-5.301, 1979, el cual fue luego cuantificado
de acuerdo con la densidad óptica a 260 nm.
Se sometió una muestra de RNA de 10 \mug a
electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% que contenía
formaldehído, después de lo cual el RNA fue transferido durante la
noche a una membrana de nailon High-Bond (Amersham)
usando una disolución estándar de citrato y sal 20x (SSC: del
inglés, standard salt citrate; NaCl 0,15 M y
citrato sódico 15 mM, pH de 7,0). Se visualizó el RNA del gel y el
filtro con bromuro de etidio y se tomaron fotografías mediante
transiluminación UV para confirmar que se habían transcrito
cantidades iguales de RNA.
Se prepararon sondas radiactivamente marcadas de
acuerdo con el método del cebador aleatorio utilizando cDNA que
codifica poliubiquitina (poli-Ub) y cDNA que
codifica monoubiquitina (mono-Ub) (H. Kanayama et
al., Cancer Res. 51: 6.677-6.685, 1991). Una
vez prehibridada la susodicha membrana durante 1 hora, fue hibridada
durante la noche con las sondas anteriormente mencionadas usando
tampón Church. El filtro fue expuesto a una película Kodak
XAR-5 durante un periodo de 1 a 3 horas a -80°C
usando una pantalla reforzada. Las imágenes de la película fueron
luego cuantificadas con un densitómetro utilizando un sistema MCID
(Imaging Research Inc., Ontario, Canadá). Los resultados se
muestran en las Figuras 7 y 8. La expresión de RNA estaba potenciada
en los ratones transgénicos para poli-Ub y
mono-Ub, y la expresión de RNA estaba inhibida en el
grupo al que se había administrado el anticuerpo contra el receptor
de IL-6.
Ejemplo
2
Se estudió el efecto inhibidor del anticuerpo
contra el receptor de IL-6 sobre la proteolisis de
proteína muscular en ratones portadores de tumor colon 26. Se
utilizaron ratones BALB/c machos de seis semanas de edad en el
estudio, y se trasplantó subcutáneamente colon 26 en la ijada de los
ratones el día en que se inició el experimento. Se administró
subcutáneamente el anticuerpo MR16-1 contra el
receptor de IL-6 de ratón (véase el Ejemplo de
Referencia 2) en una cantidad de 0,5 mg/ratón los días 4, 6, 8, 10,
12, 14 y 16 después del trasplante de colon 26 el día en que se
inició el experimento. Con este método, se había confirmado en
experimentos previos que hay poca aparición de anticuerpo
neutralizante contra anticuerpo de proteína heterogénea de rata.
Además, se administró IgG de rata (KH5) de acuerdo con el mismo
programa tanto a un grupo testigo portador de tumor (n = 7) como a
un grupo testigo no portador de tumor (n = 7).
Se observaron los animales en cuanto al peso
corporal incluyendo el peso tumoral, el peso corporal excluyendo el
peso tumoral (peso de la canal) y el peso del músculo gastrocnemio
el día 17 después del inicio del experimento, y también se
analizaron las actividades catepsina B y catepsina B + L del músculo
gastrocnemio. Además, el ensayo de actividad catepsina B y
actividad catepsina B + L fue llevado a cabo del mismo modo que en
el Experimento 2 anteriormente mencionado.
En las Figuras 9, 10 y 11 se muestran,
respectivamente, el peso corporal incluyendo el peso tumoral, el
peso corporal excluyendo el peso tumoral (peso de la canal) y el
peso del músculo gastrocnemio el día 17 después del inicio del
experimento. Las disminuciones en el peso de la canal y en el peso
del músculo gastrocnemio estaban inhibidas en el grupo de
administración de anticuerpo contra el receptor de
IL-6 (no hubo diferencias significativas en el peso
corporal que incluía el peso tumoral).
\newpage
En las Figuras 12 y 13 se muestran,
respectivamente, la actividad catepsina B y la actividad catepsina B
+ L el día 17 del experimento. Los aumentos de actividad catepsina
B y actividad catepsina B + L observados a lo largo del tiempo
resultaban inhibidos por la administración de anticuerpo contra el
receptor de IL-6 (no hubo diferencias
significativas observadas en cuanto a la actividad catepsina B).
La IL-6 está implicada en la
descomposición del músculo esquelético mediada por sistemas de
enzimas proteolíticas. Puesto que se ha observado que el anticuerpo
contra el receptor de IL-6 presenta efectos
inhibidores sobre la proteolisis de proteína muscular, se sugiere
que el presente invento es útil como un agente inhibidor de la
proteolisis de proteína muscular.
SEQ ID NO: 1
| Longitud de la secuencia: 24 |
| Forma de la secuencia: ácido nucleico |
| Nº de cadenas: Cadena única |
| Tipo de secuencia: DNA sintético |
| Secuencia: ACCTCTTCAG AACGAATTGA CAAA |
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 2
| Longitud de la secuencia: 25 |
| Forma de la secuencia: ácido nucleico |
| Nº de cadenas: Cadena única |
| Tipo de secuencia: DNA sintético |
| Secuencia: AGCTGCGCAG AATGAGATGA GTTGT |
Claims (8)
1. Uso de un anticuerpo contra el
receptor de la interleucina 6 para la fabricación de un medicamento
para aplicación terapéutica como un agente inhibidor de la
proteolisis de proteínas musculares.
2. Un uso como el expuesto en la
reivindicación 1, en el que el anticuerpo contra el receptor de la
interleucina 6 es un anticuerpo que inhibe la actividad biológica de
la interleucina 6.
3. Un uso como el expuesto en la
reivindicación 1, en el que el anticuerpo contra el receptor de la
interleucina 6 reconoce el receptor de la interleucina 6 humana.
4. Un uso como el expuesto en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo contra el
receptor de la interleucina 6 es un anticuerpo monoclonal.
5. Un uso como el expuesto en la
reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
6. Un uso como el expuesto en la
reivindicación 4, en el que el anticuerpo monoclonal es el
anticuerpo PM-1.
7. Un uso como el expuesto en la
reivindicación 6, en el que el anticuerpo PM-1 es
anticuerpo PM-1 humanizado.
8. Un uso como el expuesto en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la aplicación terapéutica
es la inhibición de la proteolisis de proteínas musculares que tiene
lugar durante la caquexia cancerosa, la sepsis, el traumatismo
grave o la distrofia muscular.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-46587 | 1995-02-13 | ||
| JP4658795 | 1995-02-13 | ||
| JP33435695 | 1995-11-30 | ||
| JP7-334356 | 1995-11-30 |
Publications (1)
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