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WO1996025174A1 - Inhibiteur de decomposition des proteines musculaires contenant un anticorps du recepteur de l'interleukine-6 - Google Patents

Inhibiteur de decomposition des proteines musculaires contenant un anticorps du recepteur de l'interleukine-6 Download PDF

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Publication number
WO1996025174A1
WO1996025174A1 PCT/JP1996/000310 JP9600310W WO9625174A1 WO 1996025174 A1 WO1996025174 A1 WO 1996025174A1 JP 9600310 W JP9600310 W JP 9600310W WO 9625174 A1 WO9625174 A1 WO 9625174A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
mouse
muscle protein
receptor
protein degradation
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/000310
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshimasa Tsujinaka
Chikara Ebisui
Junya Fujita
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to EP96901998A priority Critical patent/EP0811384B1/en
Priority to US08/875,927 priority patent/US6261560B1/en
Priority to DE69636278T priority patent/DE69636278T2/de
Priority to JP52482896A priority patent/JP4540132B2/ja
Priority to CA2211578A priority patent/CA2211578C/en
Priority to AU46342/96A priority patent/AU693318B2/en
Publication of WO1996025174A1 publication Critical patent/WO1996025174A1/ja

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a muscle protein degradation inhibitor comprising an antibody against the interleukin-16 receptor (1L-6R) (anti-IL-6R antibody).
  • IL-6 is a site-powered protein termed B cell stimulating factor 2 or interferon ⁇ 2.
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of lymphocyte cells (Hirano, T. et al., Nature 324, 73-76, 1986), and subsequently affected various cell functions. (Akira, S. et al., Adv. In Immunology 54, 1-78, 1993) o
  • IL-6 is a multifunctional site cytokine that acts at various stages such as immunity, blood, and acute phase reactions [Taga, T. et al., Critical Reviews in Immunol. 1992; 11: 265-280]. ), Acting as a growth factor for multiple myeloid species, and in addition to various diseases, for example, rheumatism [Hirano, T. et al., Eur J Immunol. 1988; 18: 1797-1801; Houssiau, FA et al. Arth Rheum. 1988; 31: 784-788.) Castleman's disease [Yoshizaki, K. et al. Blood 1989; 74: 1360-1367; Brant, SJ et al. J Clin Invest.
  • IgG-2 plasmacytosis mesangial proliferative nephritis, anemia, thrombocytopenia in H-2Ld hi L-6 transgenic mice (I-6Tgm) overexpressing human-6 (hIL-6) by genetic manipulation [Tatsuya Takai et al .: The 21st Annual Meeting of the Immunology Society of Japan "Aging and blood-related changes in H-2Ld hIL-6 transgenic mice" : 1991], suggesting that IL-6 is involved in various diseases.
  • IL-6 has an effect of promoting muscle protein degradation on myoblasts in vitro (Ebisui, T. et al., Clinical Science, 1995; 89: 431-439.).
  • the present invention seeks to provide an agent that suppresses the degradation of muscle proteins. More specifically, the present invention provides a muscle protein degradation inhibitor comprising an IL-6 receptor antibody.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the effects of the IL-6 receptor antibody on the degradation of skeletal muscle proteins, and as a result, have found that the expression and activity of a proteolytic enzyme system in which the IL-6 receptor antibody promotes muscle protein degradation is investigated. Suppression And completed the present invention.
  • the present invention relates to a muscle protein degradation inhibitor comprising an IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 1 is a photograph showing an immunohistochemical staining image of force tebsin B (400 times) in a gastrocnemius muscle tissue piece obtained from a control mouse, and is a drawing substitute photograph showing the form of an organism.
  • Figure 2 is a photograph showing immunohistochemical staining of cathepsin B (400x) of a gastrocnemius muscle tissue of a 6-transgenic mouse treated with PBS, which is a drawing substitute for the morphology of the organism. is there.
  • Figure 3 is a photograph showing a catabsin B immunohistochemical staining image (400-fold) of a gastrocnemius muscle tissue slice of an I-6 transgenic mouse to which an anti-I-6 receptor antibody was administered. is there.
  • FIG. 4 is a photograph showing an immunohistochemical staining image (400 ⁇ ) of forceepsin L in a gastrocnemius muscle tissue piece obtained from a control mouse, and is a photograph substituted for a drawing showing the form of an organism.
  • FIG. 5 is a photograph showing an immunohistochemical staining image of cathepsin L of a gastrocnemius muscle tissue section of an IL-6 transgenic mouse to which PBS was administered ( ⁇ 400), and a drawing substitute photograph showing the form of an organism.
  • Figure 6 is a photograph showing immunohistochemical staining (400x) of catabsin L of a gastrocnemius muscle tissue slice of an IL-6 transgenic mouse to which an anti-IL-6 receptor antibody was administered. It is a substitute photograph.
  • Figure 7 shows that gas from the gastrocnemius muscle of control mice (A), transgenic mice (B) treated with PBS, and transgenic mice (C) treated with 1.6-receptor monoantibody were compared with those from polubitichic.
  • This figure shows Northern hybridization using the cDNA of It is a drawing substitute photograph which shows the result of an electrophoresis.
  • Figure 8 shows that the cDNA of monoubiquitin was compared to the gastrocnemius muscle RNA of control mice (A), transgenic mice (B) treated with PBS, and transgenic mice (C) treated with IL-6 receptor antibody.
  • 17 is a drawing-substitute photograph showing Northern hybridization as a probe and showing the results of electrophoresis.
  • Figure 9 is a graph showing the body weight, including tumor weight, of mice on day 17 of the experiment.
  • FIG. 10 is a graph showing the carcass weight of mice on day 17 of the experiment without tumor weight.
  • FIG. 11 is a graph showing the gastrocnemius muscle weight of mice on day 17 of the experiment.
  • FIG. 12 is a graph showing cathepsin B activity in mouse gastrocnemius muscle on day 17 of the experiment.
  • FIG. 13 is a graph showing the activity of the gastrocnemius muscle B + L activity of the gastrocnemius muscle of the mouse on day 17 of the experiment.
  • the muscle protein degradation inhibitor of the present invention suppresses the degradation of skeletal muscle by preventing the expression and activity of a proteolytic enzyme system induced or enhanced by -6, thereby preventing a decrease in muscle weight. is there.
  • the proteolytic enzyme system described here refers to lysosomal and non-lysosomal proteolytic pathways such as cathepsin B or L and ubiquitin.
  • muscle protein degradation inhibitor of the present invention Diseases in which muscle protein degradation is inhibited by the muscle protein degradation inhibitor of the present invention and muscle weight loss is prevented, such as cancer cachexia, sepsis, severe trauma or muscular dystrophy Is mentioned.
  • the I6 receptor antibody used in the present invention blocks IL-6 signaling and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the origin and type are not limited, but mammal-derived monoclonal antibodies are particularly preferred. This antibody is
  • 1L-6R By binding to 1L-6R, it is an antibody that inhibits the binding between IL-6 and IL-6R, blocks IL-6 signaling, and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the species of the clonal cells producing the monoclonal antibody there is no particular limitation on the species of the clonal cells producing the monoclonal antibody as long as it is a mammal, and it may be derived from a human antibody or a mammal other than human.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal other than a human a monoclonal antibody derived from a rabbit or a rodent is preferred because of its ease of preparation.
  • the rodent is not particularly limited, but mouse, rat, hamster and the like are preferably exemplified.
  • Such IL-6 receptor antibodies include, among others, MR16-1 antibody (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11924-11928, 1993), PM-1 antibody (Hirata , Y. et al., J. Immunol. 143, 2900-2906, 1989).
  • Monoclonal antibodies can be prepared basically as described below using known techniques. That is, IL-6R is used as a sensitizing antigen, and immunized according to a usual immunization method. The obtained immune cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and a normal script is used. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the one-of-a-kind method.
  • a monoclonal antibody can be prepared as follows.
  • the sensitizing antigen can be obtained by using the gene sequence of human IL-6R disclosed in European Patent Application Publication No. EP325474. After inserting the human IL-6R gene sequence into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, purify the desired IL-6R protein from the host cell or culture supernatant. And this purification The IL-6R protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the mouse-derived sensitizing antigen the mouse IL-6R gene sequence disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579 was used. (4) A method similar to that using a gene sequence may be used.
  • siR6R is composed mainly of the extracellular region of IL-6R bound to the cell membrane, and has a transmembrane region or a membrane-bound 1 Different from L-6R.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Mouse, rat, hamster, and egret are used.
  • Immunization of an animal with the sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in a suitable amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then suspended as required in a normal adjuvant, such as Freund's.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant such as Freund's.
  • an appropriate carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells include splenocytes, in particular. Is mentioned.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells to be fused with the above-mentioned immune cells are already known in various cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.6. 53) (J. Immunol. 123: 1458, 1978), P3-U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Bur.J. Immunol.
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells can be basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). . More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG :), Sendai virus (HVJ), etc. are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is added to increase the fusion efficiency. Can also.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, preferably 110 to 110 times that of the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, an RPMI1640 culture medium, a MEM culture medium suitable for culturing the myeloma cell line, or a normal culture medium used for such cell culture can be used.
  • serum replacement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and the mixture is heated to about 37 ° C. in advance, for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000. Is usually added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to form a desired hybrid cell (hybridoma). Subsequently, by repeating the operation of successively adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selection culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, amino britene and thymidine). Culturing in the HAT medium is continued for a time sufficient to kill cells (non-fused cells) other than the target hybridoma, usually several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody into a single clone.
  • a normal selection culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, amino britene and thymidine). Culturing in the HAT medium is continued for a time sufficient to kill cells (non-fused cells) other than the target hybridoma, usually several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody into
  • the hybridomas producing monoclonal antibodies produced in this way can be subcultured in ordinary culture medium and can be stored for a long period in liquid nitrogen. It is.
  • a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of transplanting, growing, and obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • Monoclonal antibodies include not only those obtained from antibody-producing cells obtained by immunizing an antigen or hybridomas produced by cell fusion of the cells, but also those obtained by cloning antibody genes. Monoclonal antibodies can be used which are introduced into known cell lines, for example, COS and CH0 cells, and which are produced using a genetic recombination technique (for example, Vandamme, AM et al., Eu r. J. Biom., 192, 767-775, 1990).
  • the monoclonal antibody obtained by the above-mentioned method can be purified to a high degree of purity using ordinary purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method. Can be.
  • the monoclonal antibodies produced are radioimmunoassay (RIA), It can be confirmed that the antigen is recognized with high sensitivity and high accuracy by ordinary immunological means such as an enzyme immunoassay (EIA, BLISA) and a fluorescent antibody method (Immunofluorescence Analysis).
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to the monoclonal antibody produced by the hybridoma, but may be an artificially modified antibody for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans. May be.
  • a chimeric antibody comprising a variable region of a monoclonal antibody of a mammal other than human, for example, mouse and a constant region of a human antibody can be used.
  • Such a chimeric antibody can be a known chimeric antibody.
  • the chimeric antibody can be produced using a method for producing the antibody, particularly a gene recombination technique.
  • reshaped human antibodies can be used in the present invention. This is obtained by replacing the complementarity-determining region of a human antibody with the complementarity-determining region of a mammal other than human, for example, a mouse antibody, and a general gene recombination technique is also known. Using the known method, a reshaped human antibody useful in the present invention can be obtained.
  • amino acids in the framework (FR) region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site.
  • a preferred example of such a reshaped human antibody is a humanized PM-1 (hPM-1) antibody (see International Patent Application Publication No. W092-19759).
  • antibody fragments such as Fab or Fv, single-chain Fv in which Hv and L-chain Fv are linked by an appropriate linker, as long as they bind to antigen and inhibit the activity of A gene encoding scFv
  • Fab or Fv single-chain Fv in which Hv and L-chain Fv are linked by an appropriate linker, as long as they bind to antigen and inhibit the activity of A gene encoding scFv
  • V region of the reconstituted antibody can be used for the Fv of the H chain and the L chain used for preparing scFv.
  • the muscle protein degradation inhibitor comprising the I-6 receptor antibody of the present invention can be used in the present invention as long as it blocks IL-6 signal transduction and is effective against a disease exhibiting muscle protein degradation. it can.
  • the preventive therapeutic agent of the present invention can be preferably administered parenterally, for example, systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like. Furthermore, it can be in the form of a pharmaceutical composition kit with at least one pharmaceutical carrier or diluent.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention to a human varies depending on the condition, age or administration method of the patient, but it is necessary to select an appropriate amount as appropriate. For example, no more than four divided doses can be selected for a range of approximately 11 lmgmgZ patients. It can also be administered at a dose of 11 l OmgZ kg / week. However, the dose of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is not limited to these doses.
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • injectable preparations are prepared by dissolving the purified IL-6R antibody in a solvent, for example, physiological saline or a buffer, and then adding an anti-adsorption agent, for example, Tween 80, gelatin, and human serum albumin. (HSA) or lyophilized for reconstitution before use.
  • a solvent for example, physiological saline or a buffer
  • an anti-adsorption agent for example, Tween 80, gelatin, and human serum albumin. (HSA) or lyophilized for reconstitution before use.
  • HSA human serum albumin
  • sugar alcohols and sugars such as mannitol and glucose can be used.
  • the transgene was screened by Southern blot analysis of EcoRI-digested tail DNA, using a 32 P-labeled Taql-Banll fragment of human IL-6 cDNA as a probe.
  • Two primers specific for Taq DNA polymerase and human I 6 cDNA, CHIL6P5 (5'-A CCTCTTCAGAACGAATTGACAAA-3 ') (SEQ ID NO: 1) and CHIL6P7i (5,-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3 *) Using the SEQ ID NO: 2), transgene was detected by identifying transgenic mice by PCR analysis of the tail DNA.
  • the serum-6 concentration measured by a human I6-specific ELISA T. Matsuda et al., Eur. J. Immu nolo. 18, 951-956, 1988 was higher after 12 weeks of age. It was higher than 600 pg / ml.
  • Mouse soluble IL-6R-producing CH0 cells were prepared as described in Saito et al., J. Immunol. 147, 168-173, 1991. The cells at 37 ° C in alpha Myuipushironmyu containing 5% ⁇ Shi fetal serum (FBS), and incubated in a humidified atmosphere of air 5% C0 2. Conditioned medium was recovered and used as a mouse 6R preparation. The concentration of mouse 6R in the culture medium was determined by sandwich ELISA using the monoclonal anti-mouse I 6R antibody RS15 (Saito et al., J. Immunol. 147, 168-173, 1991). And rabbit polyclonal anti-mouse IL-6R antibody
  • Mouse siR6R was purified from the mouse siR6R preparation using an affinity column to which a monoclonal anti-mouse IL-6R antibody (RS12) was adsorbed.
  • Wister rats were immunized subcutaneously with 50 ⁇ g of purified mouse siR6R in complete Freund's adjuvant, and then twice weekly once a week after 50 weeks in incomplete Freund's adjuvant.
  • the mice were subcutaneously boosted four times with 6 g of mouse 6R. One week after the last boost, the rats were intravenously administered 50 g of mouse siR 6R in 100 ul phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • the spleen was removed from the rat, and the rat splenocytes were fused with mouse p3U1 myeloma cells at a ratio of 10: 1 using polyethylene glycol (Boehringer Mannheim). .
  • polyethylene glycol Boehringer Mannheim.
  • hypoxanthine noa containing human IL-6 Medium 1001 containing minobuterin thymidine (HAT) was added to each well. Every day for 4 days, half of the medium was replaced with HAT medium.
  • hybridomas producing anti-mouse 6R were selected by mouse sIL-6R-binding assay (ELISA). Briefly, 100 l of the culture supernatant of the hybridoma was incubated for 60 minutes in a plate coated with rabbit polyclonal anti-rat IgG antibody at 1 g / ml. did. Plates were washed and incubated with 100 / g Zml of mouse sIL-6R. After washing, rabbit polyclonal anti-mouse-6R antibody was added at 2 ⁇ g / ml, the plate was washed, and the alkaline phosphatase-conjugated capipolyclonal antibody was added. Incubation was carried out for 60 minutes with a bit IgG antibody (Tago). Finally, after washing, the plate is washed with alkaline phosphatase substrate (
  • Hybridomas recognizing mouse 6R were cloned twice by limiting dilution.
  • BALB / cnu / nu mice were injected twice with 0.5 ml of pristane, and three days later, 3 ⁇ 10 6 established hybridoma cells were injected intraperitoneally. After 10 to 20 days, ascites was collected, and the monoclonal antibody MR16-1 was purified from the ascites using a protein G column (Oncogene Science).
  • the neutralizing effect of antibodies produced by MR16-1 on IL-6 was determined by the uptake of 3H-thymidine by MH60.B SF2 cells (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18: 951-956, 1988). Tested. MH60. Distribute BSF2 cells to a 96-well plate at 200 1 Z-well per cell, add mouse IL-6 (lOpg / ml) and MR16-1 or RS12 antibody to the wells, and allow the cells to reach 37 ° C. for 44 hours cultured in 5% C0 2 at. Next, 3H-thymidine (1 mCiell) was added to each well, and after 4 hours, the uptake of 3H-thymidine was measured.
  • mice produced as described above were individually caged in an air-conditioned room under 12-hour clear / 12-hour dark light conditions, and a standard laboratory from Nippon Clear Co., Ltd. Diet CE-2 was fed with free access.
  • Normal C57BL / 6J mice were bred under the same conditions as above.
  • mice were used as a comparison group.
  • the test group was intravenously administered with the mouse monoclonal antibody MR16-1 against IL-6 receptor described in Reference Example 2 so that it became 2 mgZ mouse at 5 weeks of age.
  • the mouse monoclonal antibody MR16-1 was subcutaneously administered twice a week so as to obtain 100 g mouse.
  • the mouse was dissected, the gastrocnemius muscle and the liver were removed, and the weight was measured.
  • the gastrocnemius muscle was quickly frozen in liquid nitrogen after the weight measurement.
  • the control group was administered at the same time as the test group, except that the same volume of phosphate buffered saline (PBS) was administered instead of the antibody.
  • the control group received neither antibody nor PBS.
  • mice The same breeding management as in Experiment 1 was performed.
  • Mouse gastrocnemius muscle obtained at 16 weeks of age as in Experiment 1 was washed twice with a homogenization solution (250 mM sucrose, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1, pH 7.4). Then, the cells were homogenized in 1 ml of the above homogenization solution containing 0.2% Triton-X100 by a polytron homogenizer and sonication to lyse the cells.
  • a homogenization solution 250 mM sucrose, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1, pH 7.4
  • the obtained homogenate was centrifuged at 18,000 G for 15 minutes. The supernatant was diluted against the same amount of glycerol and stored at -40 ° C until analysis. According to the method of Barrett et al. (Barrett, AJ et al., Methods Enzymol., 80, 535-561, 1976), 10 // M Z_Arg-Arg-MCA was used as a substrate at pH 6.0 for catabsin. B activity was measured.
  • the extract was combined with 1 ⁇ M of E-64 (L—3—carboxy-trans-1,2,3-epoxypropionyl-leucylamide— (4—guanidino) Incubation with butane) (Protein Research Foundation, Osaka) at 37 ° C for 5 minutes inhibited cathepsin B activity.
  • E-64 L—3—carboxy-trans-1,2,3-epoxypropionyl-leucylamide— (4—guanidino) Incubation with butane) (Protein Research Foundation, Osaka) at 37 ° C for 5 minutes inhibited cathepsin B activity.
  • Cathepsin B + L activity was measured in the same manner as for the measurement of cathepsin B activity, but using the substrate Z-Phe-Arg-AMC. This substrate is caterpillar The hydrolysis is indicated by cathepsin B + L activity, as it is hydrolyzed not only by cat L but also by cathepsin B.
  • the protein concentration of the extract was measured by the method of Bradford (Bradford, MM, Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976).
  • the breeding management was performed in the same manner as in Experiment 1, and the gastrocnemius muscle was obtained in the same manner.
  • a frozen cross section of the gastrocnemius muscle having a thickness of 4 was cut out and placed on a slide glass coated with poly-L-lysine. did.
  • One slide was stained with hematoxylin and eosin.
  • RNA sample was subjected to electrophoresis in a 1.0% agarose gel containing formaldehyde and a 20X standard saline citrate solution (SSC: 0.15 M Nacl and 15 mM sodium citrate, pH7 .0) and transfer the RNA to Hybondonnylon membrane (Amersham) overnight. Lot was locked. The RNA in the gel and the filter was visualized using an ethidium die, and photographs were taken using UV transillumination to confirm that the same amount of RNA had been transcribed.
  • SSC 20X standard saline citrate solution
  • the random primer method was performed using cDNA encoding polyubiquitin (poly-Ub) and cDNA encoding monoubiquitin (mono-Ub) (Kanayama, H. et al., Cancer Res., 51, 6677-6685, 1991).
  • poly-Ub polyubiquitin
  • mono-Ub monoubiquitin
  • the membrane was pre-hybridized for 1 hour and then hybridized with the probe using Church buffer for -night.
  • the filters were exposed to Kodak XAR-5 film on a reinforced screen at 180 ° C for 1-3 days, and then exposed using the MC1D system (Lmaging Research In, Ontario, Canada). The image on the film was quantified by a tormeter. The results are shown in Figs. Both poly-Ub and mono-Ub had enhanced RNA expression in Transgenic mice, and RNA expression was suppressed in the group to which IL-6 receptor antibody was administered.
  • mice were 6-week-old male BALB / c, and colon26 was implanted subcutaneously on the back of the mouse on the day of the experiment.
  • the body weight including tumor weight, carcass weight without tumor weight, and gastrocnemius muscle weight were observed.
  • B activity and cathepsin B + L activity were measured.
  • the measurement of cathepsin B activity and cathepsin B + L activity was performed in the same manner as in Experiment 2 described above.
  • the body weight including the tumor weight, the body weight without the tumor weight, and the gastrocnemius muscle weight on Day ⁇ of the experiment are shown in FIGS. 9, 10, and 11, respectively.
  • reductions in body weight without tumor weight and gastrocnemius muscle weight were suppressed (body weight without tumor weight was not significantly different).
  • cathepsin B activity and the cathepsin B + L activity are shown in FIGS. 12 and 13, respectively.
  • the increase in cathepsin B activity and cathepsin B + L activity observed over time was suppressed by administration of the 1 L-6 receptor 1 antibody (there was no significant difference in cathepsin B activity).
  • IL-6 is involved in the degradation of skeletal muscle via the proteolytic enzyme system.
  • the muscle protein degradation inhibitory action of the IL-6 receptor antibody was observed, suggesting that the present invention is useful as a muscle protein degradation inhibitor.
  • Sequence type nucleic acid
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Description

明 細 書
IL-6レセプター抗体を含んでなる筋蛋白分解抑制剤 発明の分野
本発明はイ ンターロイキン一 6 レセプター （ 1L- 6R)に対する抗体 (抗 IL-6R 抗体） を含んで成る、 筋蛋白分解抑制剤に関する。 背景技術
IL-6は、 B細胞刺激因子 2 あるいはィ ンター フ ェ ロ ン β 2 と呼称 された、 サイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 Β リ ンパ球系細胞の活性化 に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. ら、 Nature 324, 73-76, 1986)、 その後、 種々の細胞の機能に影響を及ぼすこ とが明 りカヽとなった（Aki ra， S. ら、 Adv. in Immunology 54, 1-78, 1993) o
IL-6は多機能性を有するサイ トカイ ンで、 免疫、 血液、 急性期反 応等の様々な段階で作用 し 〔Taga， T. ら、 Critical Reviews in Im munol.1992;11:265-280. ) 、 多発性骨髄種の増殖因子と して作用す るに加え種々の疾患、 例えば、 リ ウマチ 〔Hirano， T. ら、 Eur J Im munol.1988;18:1797-1801； Houssiau, F. A. ら Arth Rheum.1988 ; 31 :784-788. 〕 Castleman' s disease [Yoshizaki, K. ら Blood 1989 ;74:1360-1367; Brant, S. J. ら J Clin Invest.1990;86:592-599. ) のようなプラズマサイ トーシスがみられる病気、 あるいはメサンギ ゥム細胞増殖性肾炎 〔0hta， ら Clin Nephrol. (Germany)1992;38: 185-189; Fukatsu, A. らし ab Invest.1991;65:61-66; Hori i, Y. ら J Immunol.1989;143:3949-3955. 〕 、 腫瘍増殖に伴う悪液質 〔Stra ssmann, G. ら J Clin Invest.1992;89:1681-1684. ) などに 関与す ることが報告されている。
遗伝子操作によってヒ ト - 6 (hIL- 6)を過剰発現させた H-2Ld hi L-6 トラ ンスジヱニッ クマウス （Iい 6 Tgm) では IgGlプラズマサイ トーシス、 メサンギゥム増殖性腎炎、 貧血、 血小板減少症、 自己抗 体の出現などが観察され 〔宫井達也ら ： 第 21回日本免疫学会発表 「 H-2Ld hIL-6 トラ ンスジヱニックマウスの加齢に伴う血液および血 清学的変化」 ： 1991〕 、 IL-6の多彩な疾患に対する関与が示唆され た。
また、 in vitroにおいて筋芽細胞に対し IL-6が筋蛋白分解促進作 用を有すること力く、 知られている （Ebisui, T. ら Clinical Science , 1995;89:431-439. ) 。
しかしながら、 イ ンターロイキン一 6 レセプターに対する抗体が 、 筋蛋白質の分解を抑制することにおいて有効であることはこれま で知られておらず、 また、 そのような試みもなされていなかった。 発明の開示
本発明は、 筋蛋白質の分解を抑制する薬剤を提供しょう とするも のである。 より詳しく は、 IL- 6レセプター抗体を含んで成る、 筋蛋 白分解抑制剤を提供するものである。
癌悪液質、 敗血症、 重度外傷または筋ジス ト ロフ ィ ー等に罹患す ると、 骨格筋蛋白の分解が進み、 筋重量の低下が認められる。 これ まで、 これらの疾患時の筋蛋白分解抑制剤と しては、 対症療法的な 処置がとられているにすぎず、 根本的な治療法は確立されていなか つた。
本発明者らは、 骨格筋蛋白の分解における IL- 6レセプター抗体の 及ぼす効果について鋭意検討を重ねた結果、 IL- 6レセプター抗体が 筋蛋白分解を促進する蛋白分解酵素系の発現およびその活性を抑制 することを見出し、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、 I L-6レセプター抗体を含んで成る、 筋蛋白 分解抑制剤に関する。 図面の簡単な説明
図 1 はコ ン ト ロールマウスから得られた腓腹筋組辙片における力 テブシン Bの免疫組織染色像（400倍） を示す写真であり、 生物の形 態を表わす図面代用写真である。
図 2 は PBS を投与した Iい 6 ト ラ ンスジヱニックマウスの腓腹筋組 織片のカテブシ ン Bの免疫組織染色像（400倍） を示す写真であり、 生物の形態を表わす図面代用写真である。
図 3 は抗 Iい 6レセプター抗体を投与した Iし- 6トランスジヱニッ ク マウスの腓腹筋組織片のカテブシン Bの免疫組織染色像（400倍） を 示す写真であり、 生物の形態を表わす図面代用写真である。
図 4 はコン トロールマウスから得られた腓腹筋組織片における力 テプシ ン Lの免疫組織染色像（400倍） を示す写真であり、 生物の形 態を表わす図面代用写真である。
図 5 は PBS を投与した I L-6ト ラ ンスジヱニッ クマウスの腓腹筋組 織片のカテブシ ン Lの免疫組織染色像（400倍） を示す写真であり、 生物の形態を表わす図面代用写真である。
図 6 は抗 I L-6レセブター抗体を投与した I L-6 ト ラ ンスジヱニッ ク マウスの腓腹筋組織片のカテブシン Lの免疫組織染色像（400倍） を 示す写真であり、 生物の形態を表わす図面代用写真である。
図 7 はコ ン ト ロールマウス （ A ) 、 PBS を投与した ト ラ ンス ジ ヱ ニッ クマウス （B ) および 1い 6レセブタ一抗体を投与した トランス ジヱニッ クマウス （ C ) の腓腹筋由来 RNA に対し、 ポリュビキチ ン の cDNAをプローブと したノザンハイブリ ダィゼーショ ンを示し、 電 気泳動の結果を示す図面代用写真である。
図 8 はコ ン トロールマウス （ A) 、 PBS を投与した トラ ンスジェ ニッ クマウス （ B ) および IL-6レセブター抗体を投与した ト ラ ンス ジエニッ クマウス （ C) の腓腹筋由来 RNA に対し、 モノュビキチン の cDNAをブローブと したノザンハイブリ ダィゼーシ ョ ンを示し、 電 気泳動の結果を示す図面代用写真である。
図 9 は、 実験 17日目のマウスの腫瘍重量を含む体重を示すグラフ こ'、め O
図 10は、 実験 17日目のマウスの腫瘍重量を含まない体重 （carcas s weight) を示すグラフである。
図 11は、 実験 17日目のマウスの腓腹筋重量を示すグラフである。 図 12は、 実験 17日目のマウス腓腹筋のカテブシン B活性を示すグ ラフである。
図 13は、 実験 17日目のマウスの腓腹筋の力テオゥ シン B + L活性 を示すグラフである。 具体的な説明
本発明の筋蛋白分解抑制剤は、 - 6により誘導または増強される 蛋白分解酵素系の発現および活性を低下させるこ とにより、 骨格筋 の分解を抑制し、 筋重量の低下を防止する ものである。 こ こに述べ る蛋白分解酵素系とは、 カテブシン Bまたは L、 ュビキチン等の リ ソソーマル、 非リ ソソ一マル系の蛋白分解径路を指す。
本発明の筋蛋白分解抑制剤により、 筋蛋白分解が抑制され、 筋重 量の低下が防止される疾患と して、 癌悪液質、 敗血症、 重度外傷ま たは筋ジス ト ロフ ィ ー等が挙げられる。
本発明で使用される Iい 6レセプター抗体は、 IL-6による シグナル 伝達を遮断し、 IL-6の生物学的活性を阻害するものであれば、 その 由来および種類 （モノ ク ローナル、 ポリ クローナル） を問わないが 、 特に哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体が好ま しい。 この抗体は
1L-6R と結合することにより、 IL-6と IL-6R の結合を阻害して、 IL -6のシグナル伝達を遮断し、 IL- 6の生物学的活性を阻害する抗体で ある。
モノ クローナル抗体の産生細胞の勦物種は哺乳類であれば特に制 限されず、 ヒ ト抗体またはヒ ト以外の哺乳動物由来であってよい。 ヒ ト以外の哺乳動物由来のモノ クローナル抗体と しては、 その作成 の簡便さからゥサギあるいはげつ歯類由来のモノ クローナル抗体が 好ま しい。 げっ歯類と しては、 特に制限されないが、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスターなどが好ま しく例示される。
このような IL- 6レセプター抗体と しては、 特に MR16-1抗体 （Tamu ra, T. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 90, 11924-11928, 1993) 、 PM- 1抗体 (Hirata, Y. ら、 J. Immunol.143, 2900-2906, 1989) などが 好ま しい。
モノ クローナル抗体は、 基本的には公知技術を使用し、 以下のよ うにして作成できる。 すなわち、 IL- 6R を感作抗原と して使用して 、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を 通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスク リ 一二ング法により、 モノ クローナルな抗体産生細胞をスク リーニン グすることによつて作成できる。
より具体的には、 モノ クローナル抗体を作成するには次のように すればよい。 例えば、 前記感作抗原としては、 欧州特許出願公開番 号 EP325474号に開示されたヒ ト IL- 6R の遗伝子配列を用いることに よって得られる。 ヒ ト IL- 6R の遺伝子配列を公知の発現ベクター系 に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中ま たは、 培養上清中から目的の IL-6R タンパク質を精製し、 この精製 I L-6R タンパク質を感作抗原と して用いればよい。
また、 マウス由来の前記感作抗原と しては、 日本特許出願公開番 号特開平 3- 155795に開示されたマウス I L- 6R の遗伝子配列を用い、 上記ヒ ト I L- 6R の遗伝子配列を用いたのと同様な方法にしたがえば よい。
I L-6R は細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱して いる可能性のもの （S I L-6R) が抗原と して使用できる。 s iい 6Rは細 胞膜に結合している I L- 6R の主に細胞外領域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損してい る点で膜結合型 1 L-6R と異なっている。
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま しく、 一般的にはマウス、 ラ ッ ト、 ハムスター、 ゥサギ 等が使用される。
感作'抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物に腹腔内また は、 皮下に注射することにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phospha t e-Bu f f ered Sa l i ne) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えば、 フロイ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4 一 21日 毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担 体を使用することができる。
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れるが、 好ま しい免疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。 前 記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミエロー マ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 ( P3x63Ag8. 6 53) (J. Immunol.123:1458, 1978), P3-U1 (Current Topics in Mic ro - biology and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Bur. J. Immunol .6:511-519， 1976), MPC-11 (Cell, 8:405-415， 1976) ： SP2/0 (N ature, 276:269-270, 1978)， F0 (J. Immuno 1. Me th.35: 1-21, 1980) , S194 (J. Exp. Med.148:313-323, 1978)， R210 (Nature, 277:131- 133, 1979)等が好適に使用される。
前記免疫細胞と ミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の 方法、 たとえば、 ミルスティ ンらの方法 （Milsteinら、 Methods En zymol.73:3-46, 1981) 等に準じて行う ことができる。 より具体的に は、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養 培養中で実施される。 融合促進剤と しては例えば、 ポリエチレング リ コール （PEG：)、 センダイウイルス（HVJ) 等が使用され、 更に所望 により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシ ド等の補助剤を 添加使用することもできる。
免疫細胞と ミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1 一 10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融 合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の增殖 に好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、 この他、 その種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000 - 6000程度の PEG 溶液を通常、 30— 60% (w/ v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハ イブリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し 、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリ ドー マの生育に好ま しく ない細胞融合剤等を除去できる。 当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 ア ミ ノ ブリテンおよびチ ミ ジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継統する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ ー ニングおよび単一ク ローン化が行われる。
このようにして作成されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存する こ とが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に移植して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
また、 モノ ク ローナル抗体は、 抗原を免疫して得られる抗体産生 細胞あるいはこれを細胞融合させて生ずるハイプリ ドーマから得ら れる ものだけでなく 、 抗体遗伝子をク ローニングし、 適当なベク タ 一に組み込んで、 これを公知の細胞株、 例えば、 COS 、 CH0 細胞に 導入し、 遺伝子組換技術を用いて産生させたモノ ク ローナル抗体を 用いることができる （例えば、 Vandamme, A-M ら、 Eu r. J. B i oc e m. , 192, 767 -775, 1990参照） 。
さ らに、 前記の方法により得られるモノ ク ローナル抗体は、 塩析 法、 ゲル濂過法、 ァフィ二ティーク ロマ ト グラフ ィ ー法等の通常の 精製手段を利用 して高純度に精製するこ とができる。 このように して、 作成されるモノ ク ローナル抗体は、 放射免疫測定法 （R I A)、 酵素免疫測定法 （EIA, BLISA) 、 蛍光抗体法 （Immunofluorescence Ana sis)等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度 で認識することを確認することができる。
本発明に使用されるモノ ク ローナル抗体は、 ハイプリ ドーマが産 生するモノ クローナル抗体に限られるものではなく、 ヒ トに対する 異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したもの であってよい。 例えば、 ヒ ト以外の哺乳動物、 例えば、 マウスのモ ノ クローナル抗体の可変領域とヒ 卜抗体の定常領域とからなるキメ ラ抗体を使用することができ、 このようなキメ ラ抗体は、 既知のキ メ ラ抗体の製造方法、 特に遺伝子組換技法を用いて製造することが できる。
さらに、 再構成 （reshaped) したヒ ト抗体を本発明に用いること ができる。 これはヒ ト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補 性決定領域により ヒ ト抗体の相補性決定領域を置換したものであり 、 その一般的な遗伝子組換手法も知られている。 その既知方法を用 いて、 本発明に有用な再構成ヒ ト型抗体を得ることができる。
なお、 必要に応じ、 再構成ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗 原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフ レームワーク （FR ) 領域のアミ ノ酸を置換してもよい （Satoら、 Cancer Res.53:1-6, 1933)。 このような再構成ヒ ト抗体と してヒ ト型化 PM- 1 (hPM- 1)抗 体が好ま しく例示される （国際特許出願公開番号 W092-19759を参照
) 0
さ らには抗原に結合し、 1レ6の活性を阻害するかぎり抗体の断片 、 たとえば Fab あるいは Fv, H鎖と L鎖の Fvを適当なリ ンカ一で連 結させたシングルチェイ ン Fv (scFv) をコー ドする遺伝子を構築し 、 これを適当な宿主細胞で発現させ、 前述の目的に使用することが できる。 （例えば、 Birdら、 TIBTECH, 9:132-137, 1991； Hustonら 、 Pro c. Na t l . Acad. S c i . USA, 85， 5879 - 5883， 1 988 を参照） 。 さ ら に、 s cFvを作成するために用いる H鎖および L鎖の Fvには、 上記再 構成された抗体の V領域を用いることができる。
本発明の Iレ 6レセプター抗体を含んで成る筋蛋白分解抑制剤は、 I L-6のシグナル伝達を遮断し、 筋蛋白の分解を呈する疾患に有効で ある限り、 本発明において使用することができる。 本発明の予防治 療剤は、 好ま しく は非経口的に、 たとえば、 静脈内注射、 筋肉内注 射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身あるいは局部的に投与する ことができる。 さ らに、 少なく とも一種の医薬用担体または希釈剤 とともに医薬組成物ゃキッ 卜の形態をとることができる。
本発明の予防治療剤のヒ 卜に対する投与量は患者の病態、 年齢あ るいは投与方法により異なるが、 適宜適当な量を選択することが必 要である。 例えば、 およそ 1 一 l OOOmgZ患者の範囲で 4回以下の分 割用量を選択することができる。 また、 1 一 l OmgZ kgノ週の用量で 投与することができる。 しかしながら、 本発明の予防治療剤はこれ らの投与量に制限されるものではない。
本発明の予防治療剤は常法にしたがって製剤化することができる 。 たとえば、 注射用製剤は、 精製された I L- 6R 抗体を溶剤、 たとえ ば、 生理食塩水、 緩衝液などに溶解し、 それに、 吸着防止剤、 たと えば、 Twe en80 、 ゼラチン、 ヒ ト血清アルブミ ン（HSA) などを加え たものであり、 または、 使用前に溶解再構成するために凍結乾燥し たものであってもよい。 凍結乾燥のための賦形剤と しては例えばマ ンニ トール、 ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが できる。 実施例
以下、 参考例および実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定される ものではない。
参考例 1 . B6Ld-IL-6 トラ ンスジヱニッ クマウスの作製
H-2Ld プロモーターと融合したヒ ト IL-6CDNAを含有する 3.3kb の Sphl-Xhol 断片 (Ld-IL-6 ) (Suematsuら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 86， 7547, 1989)を、 Yamamuraら、 J. Biochem. 96， 357， 19 84に記載されている方法に従って、 C57BL/6J (B6) マウス （日本ク レア） からの受精卵の前核にマイ ク ロイ ンジヱ ク シヨ ンにより注入 した
前記 トラ ンスジーンの導入を、 プローブと してヒ ト IL- 6cDNAの 32 P—標識化 Taql- Banll断片を用いて、 EcoRI —消化尾部 DNA のサザ ンブロ ッ ト分析によりスク リ ーニングした。 TaqDNAポ リ メ ラーゼ及 びヒ ト Iい 6cDNAについて特異的な 2種のプライマー、 CHIL6P5(5' - A CCTCTTCAGAACGAATTGACAAA-3' ) (配列番号 ： 1 ) 及び CHIL6P7i (5， - AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3* ) (配列番号 ： 2 ) を用いて、 尾部 DNA の PCR 分析により トラ ンスジヱニッ クマウスを同定するこ とに より トラ ンスシヱーンを検出 した。 これらの トラ ンスジエニッ クマ ウスにおいて、 ヒ ト Iい 6特異的 ELISA (T. Matsuda ら、 Eur. J. Immu nolo. 18, 951-956, 1988)により測定した血清 - 6濃度は 12週齢の 後 600pg/mlより高かった。
参考例 2. ラ ッ ト抗 IL-6R 抗体の調製
マウス可溶性 IL-6R 生産性 CH0 細胞を Saitoら、 J. Immunol.147， 168-173, 1991に記載されているようにして調製した。 この細胞を 、 5 %ゥ シ胎児血清 （FBS)を含有する α ΜΕΜ 中で 37°Cにて、 空気中 5 %C02 の加湿雰囲気下で培養した。 馴化 （condi tioned)培地を回 収し、 そ してマウス siい 6R調製物と して使用 した。 培地中のマウス siい 6Rの濃度は、 サン ドイ ッチ EL ISA により、 モノ ク ローナル抗マ ウス Iい 6R 抗体 RS15 (Saito ら、 J. Immunol.147， 168-173, 1991) 及 びラ ビッ トポ リ ク ローナル抗—マウス IL-6R 抗体を用いて測定した o
マゥス siい 6Rをマウス siい 6R調製物から、 モノ ク ローナル抗マウ ス IL- 6R 抗体 （RS12) を吸着させたァフ ィ二ティ一カラムにより精 製した。 フロイ ン ドの完全アジュバン ト中 50〃 gの精製マウス siい 6Rにより Wisterラ ッ 卜を皮下注射免疫し、 次に 2週間後から 1 週間 に 1 回、 フロイ ン ドの不完全アジュバン ト中 50〃 gのマウス siい 6R により 4 回皮下に追加免疫した。 最後の追加免疫から 1 週間後、 ラ ッ トに 100〃 1 のリ ン酸緩衝液 （PBS)中 50 gのマウス siい 6Rを静 脈内投与した。
3 日後にラ ッ 卜より脾臓を摘出し、 そしてポ リエチレングリ コー ル （ベーリ ンガーマンハイム） を用いて、 ラ ッ トの脾細胞とマウス p3Ulミ エローマ細胞とを 10 ： 1 の比で融合処理した。 96—ゥエルプ レー ト （Falcon3075) のゥエル中 37°Cにて、 10%FBS を含有する RP Ml 1640培地 100〃 1 中で一夜イ ンキュベー ト した後、 ヒ ト IL- 6を含 有する ヒポキサンチンノア ミ ノブテリ ン チ ミ ジン（HAT) 含有培地 100 1 を各ゥエルに添加した。 4 日間にわたり毎日、 培地の半分 を HAT 培地により置換した。
7 日後、 抗マウス siい 6Rを産生するハイプリ ドーマをマウス sIL - 6R—結合アツセィ（ELISA) により選択した。 要約すれば、 ハイプリ ドーマの培養上清 100〃 1 を 60分間、 ラ ビッ トポ リ ク ロ一ナル抗一 ラ ッ 卜 IgG 抗体を 1 g /mlでコー 卜 したプレー ト中でイ ンキュべ 一卜 した。 プレー トを洗浄し、 そして 100 / g Zmlのマウス sIL- 6R と共にイ ンキュベー ト した。 洗浄後、 ラ ビッ トポ リ ク ローナル抗一 マウス - 6R 抗体を 2 〃 g /mlで加え、 そ してプレー トを洗浄し、 そ してアル力 リ性ホスフ ァターゼー結合ャギポ リ ク ローナル抗—ラ ビッ 卜 IgG 抗体 （Tago) と共に 60分間ィ ンキュペー ト した。 最後に、 洗浄後、 プレー トを、 アルカ リホスフ ァタ一ゼの基質 （
Sigma 104 ； p —ニ トロフ ニルホスフヱー ト） と共にイ ンキュべ 一卜 し、 そして 405nmにてブレー ト リーダー （東ソ一） を用いて読 み取った。 マウス siい 6Rを認識するハイプリ ドーマを限界希釈法に より 2回クローニングした。 腹水の作製のため、 BALB/c nu/nuマゥ スに 0.5mlのプリスタンを 2回注射し、 そして 3 日後に 3 X 106 個 の樹立されたハイプリ ドーマ細胞を腹腔内注射した。 10〜20日後に 腹水を集め、 そして腹水からプロテイ ン Gカラム （Oncogene Scien ce) を用いてモノ クローナル抗体 MR16-1を精製した。
MR16- 1により生産された抗体の IL-6に対する中和効果を、 MH60. B SF2 細胞 (Matsuda ら、 Eur. J. Immunol.18 :951-956, 1988) による 3H—チミ ジ ンの取り込みにより試験した。 MH60. BSF2 細胞を 96— ゥエルプレー トに 1 細胞 200 1 Zゥエルの量で分配し、 マウス IL-6 (lOpg/ml) と MR16- 1又は RS12抗体とをゥエルに加え、 そして細胞を 37°Cにて 5 %C02 中で 44時間培養した。 次に、 各ゥェ ルに 3H—チミ ジ ン （ 1 mci ゥエル） を加え、 4 時間後に 3H— チミ ジ ンの取り込みを測定した。
実施例 1
実験 1 .
前記のようにして作製した ト ラ ンス ジヱニッ クマウ スを、 12時間 一明/ 12時間一暗の光条件下で空調室中で個別にケージに入れ、 そ して日本ク レアからの標準実験室餌 CE- 2を自由に摂取させることに より飼育した。 対象と して、 正常 C57BL/6Jマウスを上記と同一の条 件下で飼育した。 マウスを 3群用意し、 対照群と して上記正常マウ ス 6匹 （ C一 1〜C一 6 =雌性） を使用し、 試験群と して上記 トラ ンス ジ エニ ッ ク マウ ス 6匹 （A— 1〜A— 4 =雌性 ； A— 5、 A— 6 =雄性） を使用し、 そして比較群と して上記 ト ラ ンスジエニッ ク マウス 5匹 （ P — 1 〜 P — 4 =雌性 ； P 5 =雄性） を使用した。 試験群には、 4週齢まで飼育した後、 5週齢において 2 mgZマウ スとなるように参考例 2 に記載の IL-6レセプターに対するマウスモ ノ クローナル抗体 MR16-1を静脈内投与し、 第 6週齡〜第 14週齢にお いて、 100 gノマウスとなるように上記マウスモノ クロ一ナル抗 体 MR16-1を週 2回づっ皮下投与した。 15週齢においてマウスの体重 を測定した後マウスを解剖して腓腹筋及び肝臓を摘出して重量を測 定し、 腓腹筋については重量測定後液体窒素中で急速凍結した。 比 較群においては、 抗体の代りに同体積のリ ン酸緩銜液 （PBS)を投与 したほかは試験群と同時に管理した。 対照群には抗体及び PBS のい ずれも投与しなかった。
結果は次の表 1 に示す通りであった。
表 1
Figure imgf000017_0001
比較群は、 対照群より体重が増加していたにも係わらず、 腓腹筋 重量が減少しており、 筋萎縮が観察された。 また、 肝重量の増加も 認められた。 一方、 試験群では、 これらの変化は認められず、 いず れの項目も対照群とほぼ同じ結果であった。
実験 2 .
実験 1 と同様の飼育管理を行った。 対照群と して前記の正常マウ ス 6匹 （ C — 1 〜 C一 6 ==雌性） 、 試験群と して前記 ト ラ ンス ジ ェ ニッ クマウ ス 5匹 （A— 1 〜A 4 =雌性 ； A 5 =雄性） を使用し、 そして比較群と して前記トラ ンスジ ヱニッ クマウス 5匹 （ P — 1 〜 P — 4 =雌性 ； P — 5 =雄性） を使用した。 実験 1 と同様にして 16 週齡に得られたマウス腓腹筋をホモジネーシ ョ ン溶液 （ 250mM シ ュ 一ク ロース、 2 mMEGTA, 2 mMEDTA、 20mMTr i s - HC 1、 pH7.4)によ り 2 回洗浄し、 さらに 0.2%の Tri ton- X100 を含有する上記ホモジネー ショ ン溶液 1 ml中でポリ トロンホモジナイザーおよび超音波処理に よりホモジナイズし、 細胞溶解した。
得られたホモジネ一 トを 18, 000Gにて 15分間遠心分離した。 上清 を同じ量のグリセロールに対して希釈し、 そして分析するまで— 40 °Cにて貯蔵した。 Barrett らの方法 （ Barret t, A. J. ら、 Methods En zymol. , 80, 535-561, 1976) に従って、 10// M Z_Arg- Arg-MCAを基 質と して用いて PH6.0 にてカテブシ ン B活性を測定した。 別途、 ブ ランクサンプルを得るため、 前記抽出物を 1 〃 Mの E- 64 ( L — 3 — カルボキシ一 ト ラ ンス一 2 , 3一エポキシプロ ピオ二ルー ロイ シル ア ミ ド— （ 4 —グァニジノ） ブタン） （Protein Research Foundat ion，大阪） と共に 37°Cにて 5分間イ ンキュベー ト してカテブシ ン B 活性を阻害した。
カテブシ ン B + L活性は、 カテブシ ン Bの活性測定と同様にして 、 但し基質 Z-Phe- Arg- AMC を用いて測定した。 この基質はカテブシ ン Lによってのみならずカテブシン Bによっても加水分解されるの で、 その加水分解はカテブシン B + L活性と して示される。 抽出物 の蛋白質濃度は、 Bradfordの方法 （ Bradford, M. M.， Anal. Biochem . 72, 248-254， 1976)により測定した。
各動物について、 上記の測定における AMC の生成速度 （n mol AM C Zml * 時） を蛋白質の濃度 （mgZrol) で除すことにより比活性 （ n mol AMC Zmg蛋白質 · 時） を算出した。 その結果を表 2及び表 3 に示す。
表 2
カテブシン B マウス AAMC 蛋白質濃度 比活性 平均 標準偏差
C - 1 0.0065 2381.4 3.602
C- 2 0.0054 2195.3 3.221
C一 3 0.0056 2477.1 2.979
C一 4 0.0045 2189.3 2.737
C一 5 0.0049 1998.3 3.213
C— 6 0.0066 2255 3.88 3.272 0.41
B— 1 0.142 2188.3 85.69
B— 2 0.1757 3029.2 76.58
B— 3 0.0367 2304.1 21.02
B— 4 0.137 2176.8 83.1
B - 5 0.0412 3091.9 17.59 56.8 34.4
A— 1 0.0068 2188.8 4.083
A— 2 0.0084 2303.1 4.817
A— 3 0.0056 2171.8 3.382
A— 4 0.0073 2356.3 4.083
A— 5 0.0054 2579.4 2.761 3.825 0.78
表 3
カテブシン B + L
Figure imgf000020_0001
比較群では、 カテブシン Bおよびカテブシン B + Lの比活性が著 し く上昇していたが、 試験群では対照群と同定度の活性しか認めら れな力、つた。
実験 3 .
実験 1 と同様にして飼育管理を行い、 同様にして腓腹筋を得、 該 腓腹筋の 4 の厚さの凍結横断切片を切り出し、 そしてポ リ 一 L 一 リ ジンをコー ト したスライ ドガラス上に載置した。 1 つのスライ ドはへマ トキシ リ ン及びェォシンにより染色した。
他のスライ ドにおいては、 0.3% (vZv) 過酸化水素を含有す る 0. 1% (w/ V ) ナ ト リ ウムアジ ド中で 20分間、 内因性ペルォキ シダーゼをブロ ッキングした後、 3 % ( V / V ) 正常ャギ血清によ り 20分間処理して非特異的結合をブロ ッ ク した。 これらの切片を、 精製したラ ッ トカテブシン Bに対するラ ビッ ト抗体 （Kominami, E. ら、 J. Biochem. 98, 87-93， 1985) ( 2 〃 gZml) 、 及びラ ッ ト力 テプシン Lに対するラビッ ト抗体 （Banco, Y. ら、 J. Biochem. 100, 35-42， 1986) ( 10 / g /ml) と共に 4 °Cにて湿室中で一夜イ ンキュ ペー ト した。
PBS 中で洗浄した後、 ピオチンを結合させたマウス抗一ラビッ ト 免疫グロブリ ン （Histofine SAB-P0キッ ト、 ニチレイ株式会社） を 添加し、 そしてスライ ドを室温にて 20分間ィ ンキュペー ト した。 PB S 中で十分に洗浄した後、 パーォキシダーゼを結合したス ト レプ ト アビジンを添加し、 そしてスライ ドを再度 20分間ィ ンキュペー ト し 免疫染色物を、 0.05M Tris-HCl (pH7.6)中 0.02% ( w/ v ) の 3 , 3 ' —ジァ ミ ノべンジジン及び 0.03% ( V / V ) の過酸化水素に より 3分間反応させた後、 発色させた。 各染色試験において、 正常 ャギ血清を用いる陰性対照を含めた。 結果を図 1 〜6 図に示す。 IL -6トランスジヱニッ クマウスでは、 カテブシン Βおよび Lが強く染 色された。 一方、 IL- 6レセプター抗体を投与した トラ ンスジヱニッ クマウスでは、 カテブシン Βおよび Lの発現が抑制された。
実験 4.
実験 1 と同様の飼育管理を行った。 対照群と して前記正常マウス 10匹を用い、 そして試験群と して前記 トランスジヱニックマウス 10 匹を用いた。 腓腹筋から、 Chirgwin, J. Μ. ら、 Biochemistry 18, 5 291-5301, 1979の方法によりチオシアン酸グァニジンを用いて全 RN A を抽出し、 そして 260nmでの吸光度により定量した。
10 gの RNA サンプルをフ オルムアルデヒ ドを含む 1,0%ァガロ ースゲル中での電気泳動にかけ、 そして 20 X標準食塩クェン酸塩溶 液（SSC : 0.15M Nacl 及び 15mMクェン酸ナ ト リ ウム、 pH7.0)を用い て、 RNA をハイボン ドナイ ロ ンメ ンブレン （アマシャム） に一夜ブ ロ ッ ト した。 ゲル及びフィルタ一中の RNA をェチジゥムブ口マイ ド により可視化し、 UVトラ ンスイルミ ネーショ ンにより写真を撮るこ とにより等量の RNA が転写されたことを確認した。
ポリュビキチン（poly- Ub) をコー ドする cDNA及びモノュビキチン (mono-Ub) をコー ドする cDNA (Kanayama, H. ら、 Cancer Res.， 51 , 6677-6685, 1991) を用いて、 ラ ンダムプライマー法により放射能 ラベルされたプローブを調製した。 前記のメ ンブレンを 1 時間プレ ハイブリダィズさせた後、 Church緩衝液を用いて、 前記プローブと —夜ハイブリダィズさせた。 フィルターをコダッ ク XAR- 5 フ ィ ルム に、 強化スク リ ーンを用いて一 80°Cにて 1 〜 3 日間暴露し、 そして MC1Dシステム （Lmaging Research In ，カナダ、 オンタ リオ） を用 いてデンシ トメ一ターによりフィルム上の像を定量した。 この結果 を図 7および 8図に示す。 poly-Ub および mono- Ub ともに トラ ンス ジエニッ クマウスにて RNA の発現が増強しており、 IL- 6レセプター 抗体を投与した群では RNA の発現が抑制された。
実施例 2
colon26 担癌マウスにおける IL-6レセプタ一抗体の筋蛋白分解抑 制効果を検討した。 マウスは 6週齢の雄性 BALB/cを用い、 実験開始 日に colon26 をマウスの側背部皮下に移植した。 マウス IL- 6レセプ タ一抗体 MR16- 1 (参考例 2参照） は、 実験開始日の colon26 移植後 、 4， 6 , 8， 10, 12, 14および 16日目に 0. SmgZマウスを皮下投 与した （ n = 6 ) 。 この方法では、 異種蛋白のラ ッ ト抗体に対する 中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。 なお、 担癌コン トロール群 （ n = 7 ) および非担癌コン トロール群 （ n = 7 ) 共に、 ラ ッ ト IgGl (KH5)を同様のスケジュールで投与した。 実験開始 17日に腫瘍重量を含む体重、 腫瘍重量を含まない体重 （ carcass weight) 、 および腓腹筋重量を観察し、 腓腹筋のカテブシ ン B活性およびカテブシ ン B + L活性を測定した。 なお、 カテブシ ン B活性とカテブシ ン B + L活性の測定は、 前記実験 2 と同様に行 っナ：。
実験開始 Π日目の腫瘍重量を含む体重、 腫瘍重量を含まない体重 および腓腹筋重量を、 各々、 図 9、 図 10及び図 1 1に示す。 I L- 6レセ プター抗体投与群では、 腫瘍重量を含まない体重および腓腹筋重量 の減少が抑制された （腫瘍重量を含まない体重については有意差な し） 。
実験 17日目にカテブシ ン B活性およびカテブシ ン B + L活性を、 各々、 図 12及び図 13に示す。 経時的に観察されるカテブシ ン B活性 およびカテブシ ン B + L活性の上昇は、 1 L-6レセプタ一抗体の投与 により抑制された （カテブシン B活性については有意差なし） 。 産業上の利用可能性
蛋白分解酵素系を介した骨格筋の分解には、 I L-6が係わっている 。 I L-6レセプター抗体による筋蛋白分解抑制作用が認められたこと から、 本発明は、 筋蛋白分解抑制剤と しての有用性が示唆された。
配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACCTCTTCAG AACGAATTGA CAAA 24 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 2 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AGCTGCGCAG AATGAGATGA GTTGT 25

Claims

請 求 の 範 囲
1 . イ ンターロイキン _ 6 レセプターに対する抗体を含んでなる 、 筋蛋白分解抑制剤。
2 . イ ンターロイキン一 6 レセプターに対する抗体が、 イ ンター ロイキン一 6の生物学的活性を阻害する抗体であることを特徴とす る、 請求項 1 の筋蛋白分解抑制剤。
3 . イ ンターロイキン一 6 レセプターに対する抗体がヒ トイ ンタ 一ロイキン一 6 レセプターを認識することを特徴とする、 請求項 1 の筋蛋白分解抑制剤。
4 . イ ンターロイキン一 6 レセプターに対する抗体がモノ クロー ナル抗体であることを特徴とする請求項 1 ないし 3の筋蛋白分解抑 制剤。
5 . イ ンターロイキン— 6 レセプターに対する抗体が MR16-1抗体 であることを特徴とする請求項 4の筋蛋白分解抑制剤。
6 . イ ンターロイキン— 6 レセプターに対する抗体が PM-1抗体で あることを特徴とする請求項 4の筋蛋白分解抑制剤。
7 . イ ンタ一ロイキン— 6 レセプターに対する抗体がヒ ト型化 PM -1抗体であることを特徴とする請求項 4の筋蛋白分解抑制剤。
8. 筋蛋白分解が、 癌悪液質、 敗血症、 重度外傷または筋ジス ト ロフィ 一の際に生ずることを特徴とする請求項 1 ないし 7の筋蛋白 分解抑制剤。
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