PT811384E - Inibidor da decomposição da proteína muscular que contém um anticorpo do receptor de il-6 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "INIBIDOR DA DECOMPOSIÇÃO DA PROTEÍNA MUSCULAR QUE CONTÉM UM ANTICORPO DO RECEPTOR DA IL-6"

Domínio técnico A presente invenção refere-se a um agente que inibe a proteólise da proteína muscular que compreende um anticorpo (anti-IL-6R) do receptor da interleucina-6 (IL-6R). Técnica antecedente A IL-6 é uma citocina geralmente referida como factor 2 de estimulação das células B ou interferão β2. Descobriu-se que a IL-6 era um factor de diferenciação implicado na activação de células linfocíticas B (Hirano, T. et al., Nature 324, 73-76, 1986). Mais tarde verificou-se que tinha um efeito sobre as funções de várias células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology 54, 1-78, 1993). A IL-6 é uma citocina multi-funcional que actua em várias fases de imunidade, hematopoiese, reacções de fase aguda e semelhantes (Taga, T. et al., Criticai Reviews in Immunol. 1992; 11: 265-280), e para além de actuar como um factor de crescimento do mieloma múltiplo, foi também descrito que está implicada em várias doenças, tais como doenças em que se observa plasmocitose, incluindo reumatismo (Hirano, T. et al., Eur. J. Immunol. 1988; 18: 1797-1801; Houssiau, F.A. et al., Arth. Rheum. 1988; 31: 784-788) e doença de Castleman (Yoshizaki, K. et al., Blood 1989; 74: 1360-1367; Brant, S.J. et al., Clin. Invest. 1990; 86: 592-599), ou nefrite proliferativa das células mesangiais (Ohta, K. et al., Clin. Nephrol. (Germany) 1992; 2 38: 185-189; Fukatsu, Ά. et al. Lab. Invest. 1991; 65: 61-66; Horii, Y. et al., J. Immunol. 1989; 143: 3949-3955) e catexia que acompanha o crescimento de tumores (Strassman, G. et al., J. Clin. Invest. 1992; 89: 1681-1684).

Em ratinhos transgénicos H-2Ld hIL-6 (IL-6 Tgm), nos quais a IL-6 humana era expressa em excesso por manipulação genética, observou-se plasmocitose de IgGl, nefrite proliferativa do mesângio, anemia, trombocitopenia e a ocorrência de autoanticorpos (Miyai, T. et al., 21st Japan Immunol. Soc. Pres. "Hematological and Servlogieal Changes Accompanying Aging In H-2Ld hIL-6 Transgenic Mice": 1991), o que sugeria que a IL-6 está implicada em várias doenças.

Para além disso, sabe- se também que a IL-6 tem o efeito de promover a proteólise da proteína muscular em mioblastos in vitro (Ebisui, T. et al., Clinicai Science, 1995; 89: 431-439).

No entanto, era até agora desconhecido que o anticorpo do receptor da interleucina-6 é eficaz na inibição da proteólise das proteínas musculares e ainda estão por fazer tentativas neste sentido.

Tsujinaka et. al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 207, No. 1, 1995, pp.168-174) estudaram ratinhos transgénicos para a interleucina-6. Às 16 semanas de idade, os músculos do gastrocnémio dos ratinhos transgénicos para a IL-6 atrofiaram-se em comparação com os ratinhos normais, enquanto que os pesos corporais aumentaram significativamente; os autores concluíram que a IL-6 é responsável pelo aumento do catabolismo muscular por activação do sistema da catepsina 3 lisossomal (B e L) . Os resultados do estudo proporcionaram uma pista de que a sobre-produção de IL-6 in vivo induz a atrofia dos músculos. Os autores concluíram que a IL-6 pode ser um candidato para o factor de indução de proteólise muscular e indicaram que estavam a planear reduzir as alterações dos músculos em ratinhos transgénicos pelo tratamento de receptor de IL-6 anti-ratinho e também a planear examinar outro sistema proteolítico importante, nomeadamente as actividades de proteossomas e da expressão do gene da ubiquitina. Estas sugestões experimentais não são suportadas com quaisquer resultados ou dados experimentais.

Descrição da invenção A presente invenção tem como objectivo proporcionar um fármaco que iniba a proteólise de proteínas musculares e, mais em particular, proporcionar um agente de inibição da proteólise de proteínas musculares que compreende um anticorpo do receptor de IL-6.

Na sequência da ocorrência de caquexia cancerosa, septicemia, traumatismo grave ou distrofia muscular e estados semelhantes, a proteólise de proteínas musculares esqueléticas prossegue de tal modo que se observa uma diminuição na massa muscular. Até agora, apenas foram implementadas medidas nosotrópicas para agentes de inibição desta proteólise das proteínas musculares nestas doenças e não foi ainda estabelecido um método fundamental de tratamento destas doenças.

Como resultado da condução de estudos sérios sobre os efeitos do anticorpo do receptor da IL-6 sobre a proteólise 4 de proteínas dos músculos esqueléticos, os inventores da presente invenção verificaram que o anticorpo do receptor da IL-6 inibe a expressão de sistemas de enzimas proteolíticas que promovem a proteólise de proteínas musculares bem como a sua actividade, levando deste modo à realização da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina B de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio obtida de um ratinho de controlo (x400). A Fig. 2 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina B de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio de um ratinho transgénico para IL-6 a que se administrou PBS (x400). A Fig. 3 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina B de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio de um ratinho transgénico para IL-6 a que se administrou anticorpo do receptor de IL- 6 (x400). A Fig. 4 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina L de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio obtida de um ratinho de controlo (x400). A Fig. 5 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina L de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio de um ratinho transgénico para IL-6 a que se administrou PBS (x400). A Fig. 6 é uma fotografia que apresenta os resultados da coloração imunológica com catepsina L de uma peça de tecido do músculo do gastrocnémio de um ratinho transgénico para IL-6 a que se administrou anticorpo 5 do receptor de IL-6 (x400). A Fig. 7 é uma fotografia que apresenta os resultados de hibridação de Northern sobre ARN originário do músculo do gastrocnémio de (A) um ratinho de controlo, (B) um ratinho transgénico a que se administrou PBS e (C) um ratinho transgénico a que se administrou anticorpo de receptor de IL-6, utilizando ADNc de poliubiquitina para a sonda. A Fig. 8 é uma fotografia que apresenta os resultados de hibridação de Northern sobre ARN derivado do músculo do gastrocnémio de (A) um ratinho de controlo, (B) um ratinho transgénico a que se administrou PBS e (C) um ratinho transgénico a que se administrou anticorpo de receptor de IL-6, utilizando ADNc de monoubiquitina para a sonda. A Fig. 9 é um gráfico que indica os pesos corporais de ratinhos no dia 17 da experiência, incluindo os pesos dos tumores. A Fig. 10 é um gráfico que indica os pesos das carcaças de ratinhos no dia 17 da experiência, não incluindo os pesos dos tumores. A Fig. 11 é um gráfico que indica o peso do músculo do gastrocnémio de ratinhos no dia 17 da experiência. A Fig. 12 é um gráfico que indica a actividade da catepsina B no músculo do gastrocnémio de ratinhos no dia 17 da experiência. A Fig. 13 é um gráfico que indica a actividade de catepsina B + L no músculo do gastrocnémio de ratinhos no dia 17 da experiência.

Descrição pormenorizada O agente de inibição da proteólise da proteína muscular da presente invenção inibe a degradação do músculo 6 esquelético e evita a diminuição da massa muscular reduzindo a expressão e a actividade dos sistemas de enzimas proteoliticas induzidos ou intensificados pela IL-6. Os sistemas de enzimas proteoliticas aqui referidos indicam vias de proteólise lisossomais e não lisossomais, tais como os da catepsina B ou L e da ubiquitina.

Entre os exemplos de doenças nas quais a proteólise da proteína muscular é inibida e a redução da massa muscular é evitada pelo agente de inibição da proteólise da proteína muscular da presente invenção incluem-se a caquexia cancerosa, a sepsia o trauma grave e a distrofia muscular.

Se bem que o anticorpo do receptor de IL-6 utilizado na presente invenção possa ser de qualquer origem ou tipo (monoclonal ou policlonal) desde que bloqueie a transdução de sinal pela IL-6 e iniba a actividade biológica da IL-6, é particularmente preferível o anticorpo monoclonal com origem em mamíferos. Como resultado da ligação com IL-6R, este anticorpo inibe a ligação entre a IL-6 e o IL-6R, bloqueando deste modo a transdução de sinal da IL-6 e inibindo a actividade biológica da IL-6. Não existem limitações particulares nas espécies animais das células que produzem o anticorpo monoclonal desde que seja um mamífero e o anticorpo pode ser um anticorpo humano ou derivado de células de mamífero que não seja humano. No caso de um anticorpo monoclonal derivado de células de mamífero que não seja humano, é preferível um anticorpo monoclonal de coelhos ou roedores devido à facilidade da sua produção. Se bem que não existam limitações particulares no tipo de células de roedor 7 utilizadas, exemplos preferidos incluem células de ratinho, de rato e de criceto.

Entre os exemplos particularmente preferidos deste tipo de anticorpo do receptor de IL-6 incluem-se o anticorpo MR16-1 (Tamura, T. et al. , Proc. NatI. Acad. Sei. U.S.A. 90, 11924-11928, 1993) e o anticorpo PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. 143, 2900-2906, 1989). O anticorpo monoclonal pode ser preparado do modo apresentado seguidamente utilizando técnicas conhecidas. Nomeadamente, utilizando IL-6R como o antigénio sensibilizador, um hospedeiro é imunizado com este agente sensibilizador de acordo com um método de imunização de rotina, depois do que as células imunes resultantes são fundidas com células progenitoras conhecidas de acordo com métodos de fusão de células de rotina, seguindo-se uma selecção de células produtoras de anticorpo monoclonal utilizando métodos de selecção habituais.

Mas especificamente, o procedimento seguinte pode ser seguido para preparar o anticorpo monoclonal. Por exemplo, o antigénio de sensibilização acima mencionado é obtido utilizando a sequência genética do IL-6R humano divulgada na Patente Europeia n.° EP325474. Após inserção da sequência genética do IL-6R num sistema vector de expressão conhecido e transformação de uma célula hospedeira adequada, a proteína IL-6R pretendida é purificada a partir da célula hospedeira ou do sobrenadante de cultura, depois do que esta proteína IL-6R purificada é utilizada como antigénio sensibilizador.

Para além disso, o antigénio de sensibilização acima mencionado com origem em ratinhos é obtido utilizando a sequência genética do IL-6R de ratinho divulgada na Patente Japonesa Não Examinada n.° 3-155795 e seguindo o mesmo procedimento como o utilizado para a sequência genética do IL-6R humano acima descrito.

Para além do que é expresso na membrana celular, o IL-6R capaz de ser libertado da membrana celular (sIL-6R pode também ser utilizado como antigénio. 0 sIL-6R é composto principalmente pela região extracelular do IL-6R ligada à membrana celular e difere do IL-6R ligado à membrana por ser deficiente na região transmembrana ou numa região transmembrana e numa região intracelular.

Se bem que não existam limitações particulares nos mamíferos que são imunizados com um antigénio sensibilizador, é preferível seleccionar um mamífero tendo em consideração a compatibilidade com as células progenitoras utilizadas para a fusão celular. Entre os exemplos típicos de mamíferos utilizados incluem-se ratinhos, ratos, cricetos e coelhos. A imunização do animal com o antigénio sensibilizador é efectuada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, como um exemplo de um método típico, a imunização pode ser efectuada por injecção do antigénio sensibilizador por via quer intraperitoneal quer subcutânea. Mas especificamente, depois de diluir e suspender o antigénio sensibilizador numa quantidade adequada de salina tamponizada com fosfato (PBS) ou salina fisiológica, a suspensão resultante é misturada com uma quantidade adequada de um adjuvante habitual, tal como um adjuvante completo de Freund, conforme necessário. A seguir a emulsificação, a emulsão 9 resultante é administrada de modo adequado ao mamífero no decurso de várias administrações de 4 a 4 ou de 21 a 21 dias. Para além disso, pode ser utilizado uma substância veicular adequada durante a imunização com o antigénio sensibilizador.

Após imunização deste modo e confirmação de que o nivel do anticorpo pretendido aumentou no soro, são retiradas células imunes do mamífero e são utilizadas para a fusão celular. São exemplos preferidos de células imunes em particular células do baço. As células de mieloma de um mamífero utilizadas como as outras células progenitoras a fundir com as células imunes acima mencionadas podem ser várias estirpes de células anteriormente conhecidas, exemplos preferíveis destas incluindo P3 (P3x63Ag8.653) (J.

Immunol. 123: 1458, 1978), P3-UI (Current Topics in

Microbiology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J.

Immunol. 6: 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8: 405-415, 1976), SP2/0 (Nature, 276: 269-270, 1978), FO (J. Immunol.

Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148: 313-323, 1978) e R210 (Nature, 277: 131-133, 1979). A fusão celular das células imunes anteriormente mencionada e das células de mieloma pode ser basicamente efectuada de acordo com métodos conhecidos, tais como o método de Milstein, et al. (Milstein, et al., Methods Enzymol. 73: 3-46,1981). Mais especificamente, a fusão celular anteriormente mencionada é efectuada durante o decurso de cultura com nutrientes normal na presença de um promotor de fusão celular. Os exemplos de promotores de fusão que são utilizados incluem polietilenoglicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Para além disso, pode ser adicionado um adjuvante tal como sulfóxido de dimetilo e pode ser 10 utilizado para aumentar a eficácia da fusão conforme pretendido. A proporção entre células imunes e células de mieloma utilizada é de preferência, por exemplo, de 1 a 10 vezes de células imunes para as células de mieloma. Podem ser utilizados para o meio de cultura usado para a fusão celular atrás mencionada o meio de cultura RPMI1640 e o meio de cultura MEM apropriados para o crescimento da estirpe de células de mieloma anteriormente referida bem como outros meios de cultura habituais utilizados neste tipo de cultura de células. Para além disso, este pode também ser utilizado em combinação com suplementos de soro, tais como soro fetal de vitela (FCS).

Para esta fusão celular, as quantidades prescritas das células imunes e de células de mieloma anteriormente mencionadas são bem misturadas no meio de cultura referido e em seguida adiciona-se uma solução de PEG aquecida previamente até cerca de 37 °C, por exemplo uma solução de PEG que tenha um peso molecular médio de cerca de 1000 a 6000, normalmente numa concentração de 30 a 60% (p/v) e mistura-se para formar as células fundidas pretendidas (hibridoma). Em seguida, por adição sequencial de uma quantidade adequada de meio de cultura e repetição da centrifugação e remoção do sobrenadante, podem ser removidos os agentes de fusão celular e os outros componentes não apropriados para a cultura de hibridomas. O referido hibridoma é seleccionado por cultura num meio de cultura selectivo habitual, tal como meio de cultura HAT (meio de cultura que contém hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura no referido meio de 11 cultura HAT é normalmente continuada durante vários dias a várias semanas ou durante um período de tempo que seja suficiente para a eliminação de todas as células que não sejam o hibridoma pretendido (células não fundidas). Em seguida, realiza-se a selecção e a clonagem simples do hibridoma que produz o anticorpo pretendido por execução de diluição limitante normal. 0 hibridoma assim preparado que produz anticorpo monoclonal pode ser subcultivado em meio de cultura normal e armazenado durante um longo período em azoto líquido. A fim de obter anticorpo monoclonal a partir do hibridoma referido, o referido hibridoma é cultivado de acordo com métodos habituais e utiliza-se um método para obter sob a forma de sobrenadante de cultura ou utiliza-se um método no qual o hibridoma é transplantado para um mamífero com o qual seja compatível, deixado crescer e em seguida os anticorpos são obtidos sob a forma de ascites. O primeiro método é adequado para a obtenção de anticorpo de elevada pureza, enquanto que o último método é adequado para a produção de uma grande quantidade de anticorpo.

Além disso, o anticorpo monoclonal não é obtido apenas a partir de células produtoras de anticorpos obtidas por imunização com antigénio ou a partir de um hibridoma produzido por fusão celular, mas o anticorpo monoclonal pode também ser utilizado quando produzido utilizando tecnologia de recombinação genética por clonagem de um gene de anticorpo, incorporação deste gene num vector adequado e introdução deste vector numa estirpe celular conhecida, tal como células COS ou CHO (ver, por exemplo, Vandamme, A-M et ai., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990). 12

Para além do referido, o anticorpo monoclonal obtido por utilização dos métodos anteriormente mencionados pode ser purificado até uma elevada pureza utilizando técnicas de purificação habituais, tais como precipitação salina, filtração em gel ou cromatografia de afinidade. Pode-se confirmar que o anticorpo monoclonal produzido deste modo reconhece o antigénio tanto com elevada sensibilidade como com elevada precisão por técnicas imunológicas habituais, tais como análise radioimunológica (RIA), análise imunológica enzimática (ETA, ELISA) e análise por imunofluorescência. O anticorpo monoclonal utilizado na presente invenção não se limita a um anticorpo monoclonal produzido por hibridoma, mas pode também ser um anticorpo monoclonal que tenha sido modificado artificialmente com o objectivo de reduzir a heteroantigenicidade para seres humanos. Por exemplo, podem ser utilizado um anticorpo quimérico que é composto das regiões variáveis do anticorpo monoclonal de um ratinho ou de outro mamífero que não seja humano e as regiões constantes do anticorpo humano. Este tipo de anticorpo quimérico pode ser produzido utilizando métodos conhecidos para a produção de anticorpos quiméricos e em particular a tecnologia de recombinação genética.

Para além disso, pode também ser utilizado na presente invenção um anticorpo humano modificado ne sua forma. Um anticorpo modificado na sua forma é um anticorpo no qual as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo humano são substituídas pelas regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo de um mamífero não humano, tal como de ratinho, e as suas técnicas de recombinação genéticas gerais são conhecidas. 13

Um anticorpo humano modificado na sua forme que é útil no presente pode ser obtido por utilização destes métodos conhecidos.

Além do referido, os ácidos aminados das regiões da estrutura (FR) da região variável do anticorpo podem ser substituídos de tal modo que formam um sítio de ligação de antigénio adequado nas regiões de determinação de complementaridade do anticorpo humano modificado na sua forma (Sato, et al., Câncer Res. 53: 1-6, 1933) . Um exemplo preferido deste tipo de anticorpo humano modificado na sua forma é o PM-1 humanizado (hPM-1) (ver Pedido de Patente Internacional n.° WO 92-19759).

Para além disso, pode ser construído um gene que codifica para fragmentos de anticorpo, tal como Fab ou Fv, ou um Fv de cadeia simples (scFv) no qual o Fv da cadeia H e a cadeia L estão ligados com um ligante apropriado, este gene pode então ser expresso numa célula hospedeira adequada e em seguida utilizado para o objectivo descrito acima, com a condição de que se ligue ao antigénio e iniba a actividade da IL-6 (ver, por exemplo, Bird, et al., TIBTECH, 9: 132-137, 1991; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 5879-5883, 1988). Além disso, a região V do anticorpo modificado na sua forma atrás mencionado pode ser utilizada para o Fv da cadeia H e da cadeia L utilizado para a produção de scFv. 0 agente de inibição da enzima proteolítica do músculo que compreende o anticorpo do receptor de IL-6 da presente invenção pode ser utilizado na presente invenção desde que bloqueie a transdução de sinal da IL-6 e seja eficaz contra doenças que apresentam proteína de degradação 14 muscular. 0 fármaco terapêutico de profilaxia da presente invenção é de preferência administrado por via parentérica e pode ser administrado por via sistémica ou tópica por, por exemplo, injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção intraperitoneal ou injecção subcutânea. Além disso, pode também tomar a forma de uma composição farmacêutica ou conjunto com pelo menos um tipo de veiculo ou diluente farmacêutico.

Se bem que varie de acordo com a condição do doente e a idade ou com o método de administração, é necessário seleccionar uma dose adequada para a dose do fármaco profilático ou terapêutico da presente invenção para seres humanos. Por exemplo, pode ser seleccionada uma dose dividida entre quatro administrações ou menos no intervalo de cerca de 1 a 1000 mg/doente. Para além disso, pode ser administrada uma dose de 1 a 10 mg/kg. semana. No entanto, o fármaco profilático ou terapêutico da presente invenção não está limitado a estas doses. O fármaco profilático ou terapêutico da presente invenção pode ser preparado de acordo com métodos de rotina. Por exemplo, para preparar uma preparação injectável, dissolve-se anticorpo de IL-6R purificado num solvente tal como salina fisiológica ou tampão e em seguida adiciona-se um agente que evite a adsorção tal como Tween 80, gelatina ou albumina do soro humano (HSA) . Em alternativa, pode também ser liofilizado a fim de ser reconstituído antes de utilização. Entre os exemplos de veículos que podem ser utilizados para liofilização incluem-se álcoois-açúcares e açúcares, tais como manitol e glucose. 15

Exemplos

Se bem que os exemplos que se seguem proporcionem uma explicação pormenorizada da presente invenção através dos seus exemplos de referência e de exemplos, a presente invenção não está limitada a estes.

Exemplo de referência 1. Preparação de B6Ld-IL-6

Ratinhos transgénicos

Injectou-se por microinjecção um fragmento de 3,3 kb Sphl-XholI que continha ADNc de IL-6 humana fundido com o promotor H-2Ld (Ld-IL-6) (Suematsu, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86, 7547, 1989) no pronúcleo do ovo fertilizado de ratinhos CS7BL/6J (B 6) (Japan Clea) de acordo com o método de Yamamura, et al. descrito em J. Biochem. 96, 357, 1984. A introdução do trans-gene atrás mencionado foi verificada por análise de mancha de Southern de ADN caudal digerido por EcoRI utilizando um fragmento Taql-BanII marcado com 32P de ADNc de IL-6 humano para a sonda. 0 trans-gene foi detectado por identificação dos ratinhos transgénicos por análise de PCR de ADN caudal utilizando polimerase TaqADN e dois tipos de iniciadores específicos para ADNc de IL-6 humana, nomeadamente CHIL6P5 (5' — ACCTCTTCAGAACGAATTGACAAA-3') (SEQ ID NO: 1) e CHIL6P7Í (5'-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT-3') (SEQ ID NO: 2). As concentrações de IL-6 no soro, conforme determinadas por ELISA específica de IL-6 humana (Matsuda, T. et al., Eur. 16 J. Immunolo., 18, 951-956, 1988) nestes ratinhos transgénicos, eram superiores a 600 pg/ml após 12 semanas de idade.

Exemplo de referência 2. Preparação de anti-IL-6R de rato Anticorpo

Prepararam-se células CHO produtoras de IL-6R solúvel de ratinho conforme descrito em Saito, et al., J. Immunol. 147, 168-173; 1991. Estas células foram cultivadas em aMEM que continha soro de bovino fetal a 5% (FBS) a 37 °C numa atmosfera húmida que continha 5% de CO2 no ar. O meio condicionado foi recuperado e utilizado como uma preparação de sIL-6R. A concentração de sIL-6R de ratinho no meio foi medida por ELISA de sanduíche utilizando anticorpo RS15 anti-ratinho monoclonal (Saito, et al., J. Immunol. 147, 168-173, 1991) e anticorpo de IL-6R anti-ratinho policlonal de coelho. O sIL-6R de ratinho foi purificado por uma coluna de afinidade a qual tinha adsorvido anticorpo de IL-6R anti-ratinho monoclonal (RS12). Imunizaram-se ratos Wistar por injecção subcutânea de 50 pg de aIL-6R de ratinho purificado em adjuvante de Freund completo, e em seguida procedeu-se à intensificação com quatro injecções de 50 pg de sIL-6R de ratinho em adjuvante de Freund incompleto uma vez por semana com início duas semanas mais tarde. Uma semana depois da intensificação final, administrou-se por via intravenosa aos ratos 50 pg de sIL-6R de ratinho em 100 pl de salina tamponizada com fosfato (PBS).

Os baços foram removidos dos ratos 3 dias mais tarde 17 e as células de4 baço de rato foram fundidas com células de mieloma de ratinho p3Ul a uma proporção de 10:1 utilizando polietilenoglicol (Boehringer-Mannheim) . Após incubação de um dia para o outro em 100 μΐ de meio RPMI1690 que continha 10% de FBS a 37 °C em poços de uma placa de 96 poços (Falcon 3075) , adicionaram-se a cada poço 100 μΐ de meio de hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT) que continha IL-6 humana. Metade do meio foi substituído por meio HAT diariamente durante 4 dias.

Após 7 dias, os hibridomas que produziam sIL-6R anti-ratinho foram seleccionados por análise de ligação de sIL-6R de ratinho (ELISA). Por outras palavras, incubaram-se 100 μΐ de sobrenadante de hibridoma durante 60 minutos em placas revestidas com anticorpo de IgG anti-rato policlonal de coelho a 1 pg/ml. As placas foram em seguida lavadas e incubadas com 100 pg/ml de sIL-6R de ratinho. Após lavagem, adicionou-se anticorpo de IL-6R anti-ratinho policlonal de coelho a 2 pg/ml, depois do que as placas foram lavadas e em seguida incubadas durante 60 minutos com anticorpo de IgG anti-coelho policlonal de cabra ligado por fosfatase alcalina (Tago).

Por fim, após lavagem, as placas foram incubadas com substrato de fosfatase alcalina (Sigma 104; p-nitrofenil-fosfato) e em seguida lidas utilizando um leitor de placas (Tosoh) a 405 nm. O hibridoma que reconhecia o sIL-6R de ratinho foi clonado duas vezes por diluição limitante. A fim de preparar as ascites, injectaram-se 0,5 ml de pristano duas vezes em ratinhos BALB/c nu/nu, depois do que 3 x 106 células de hibridoma estabelecidas foram injectadas por via intraperitoneal 3 dias maia tarde. As ascites foram reunidas 10 a 20 dias mais tarde e o anticorpo monoclonal 18 MR16-1 foi purificado a partir das ascites utilizando uma coluna de proteína G (Oncogene Science). 0 efeito de neutralização sobre a IL-6 pelo anticorpo produzido por MR16-1 foi ensaiado de acordo com a absorção de 3H-timidina por células MH60.BSF2 (Matsuda, et al., Eur. J. Immunol. 18: 951-956, 1988). As células MH60.BSF2 foram distribuídas numa placa de 96 poços numa quantidade de 1 x 104 células/200 μΐ/poço e em seguida adicionou-se IL-6 de ratinho (10 pg/ml) e anticorpo MR16-1 ou RS12, depois do que as células foram cultivadas durante 44 horas em CO2 a 5% a 37 °C. Em seguida adicionou-se 3H-timidina (1 mCi/poço) a cada poço e mediu-se a absorção de 3H-timidina 4 horas mais tarde.

Exemplo 1

Experiência 1.

Ratinhos transgénicos preparados conforme descrito acima foram conservados em gaiolas individuais numa sala com ar condicionado em que se efectuou um ciclo luz/escuridão de 12 horas por dia. Os animais foram alimentados à vontade com dieta normal de laboratório CE-2 obtida de Japan Clea. Para o controlo, conservaram-se ratinhos C57BL/6J normais sob condições idênticas. Os ratinhos foram divididos em três grupos. Seis dos ratinhos normais foram atribuídos ao grupo de controlo (C-l a C-6, todos fêmeas). Seis dos ratinhos transgénicos atrás mencionados foram atribuídos aos grupos de ensaio (A-l a A-4 = fêmeas, A-5 a A-6: machos). Cinco dos ratinhos 19 transgénicos atrás mencionados foram atribuídos a um grupo de comparação (P-l a P-4 = fêmeas, P-5 = macho).

Após serem conservados até 4 semanas de idade, administrou-se por via intravenosa aos ratinhos do grupo de ensaio anticorpo monoclonal de ratinho MR16-1 a receptores de IL-6 descrito no Exemplo de Referência 2 a uma dose de 2 mg/ratinho a 5 semanas de idade. O anticorpo monoclonal de ratinho MR16-1 atrás mencionado foi em seguida administrado por via subcutânea duas vezes por semana a uma dose de 100 pg/ratinho de 6 a 14 semanas de idade. Após pesagem dos ratinhos a 15 semanas de idade, o ratinho foi autopsiado para remover o músculo gastrocnémio e o baço, depois do que os respectivos pesos foram medidos. As amostras de músculo gastrocnémio foram rapidamente congeladas em azoto líquido depois da medição do peso. No grupo de comparação, os animais foram tratados simultaneamente aos do grupo de ensaio com a excepção do administrado de um volume igual de salina tamponizada por fosfato (PBS) no lugar de anticorpo. Aos animais do controlo não se administrou nem anticorpo nem PBS.

Estes resultados são apresentados no Quadro 1.

Quadro 1 ratinho sexo Peso corporal (g) Peso do músculo gastrocnémio (mg) Peso do baço (mg) peso média D.P. peso média D.P. peso média D.P. \—1 1 o F 21,67 131,9 964 C-2 F 19,77 112,8 877 C-3 F 21,58 127,8 911 04 F 20,31 112,1 864 05 F 18,58 110,1 823 06 F 21,11 20,5 1,2 121,2 119,3 9,09 738 862,8 77,4 20 ratinho sexo Peso corporal (g) Peso do músculo gastrocnémio (mg) Peso do baço (mg) peso média D.P. peso média D.P. peso média D.P. P-l F 23,84 91,8 1303 P-2 F 18,07 71,8 1061 P-3 F 21,19 109, 1 977 P-4 F 23,68 21,7 2,7 91,3 91,0 15,2 1628 1242 292 P-5 M 30,56 192,1 1722 A-l F 20,09 110,1 921 A-2 F 19,6 121,8 888 A-3 F 18,15 106, 9 843 A-4 F 21,03 19,7 1,2 130,4 117,3 10,8 902 888,5 33,2 A-5 M 23,52 144,2 1032 A-6 M 23,60 23,6 0,06 139, 7 142,0 3,18 1049 1041 12

Apesar de os pesos corporais do grupo de comparação serem mais elevados do que os do grupo de controlo, os pesos do músculo gastrocnémio eram mais baixos e foi observada atrofia muscular. Para além disso, foi também observado um aumento do peso do baço. Por outro lado, estas alterações não foram observadas no grupo de ensaio e os resultados foram aproximadamente os mesmos do que os do grupo de controlo para todos os parâmetros.

Experiência 2.

Os animais foram conservados e tratados do mesmo modo que os da Experiência 1. Seis dos ratinhos normais atrás mencionado (C-l a C-6 = todos fêmeas) foram atribuídos ao grupo de controlo e cinco dos ratinhos transgénicos atrás mencionado (A-l a A-4 = fêmeas, A-5 = macho) foram atribuídos ao grupo de ensaio. Cinco dos ratinhos transgénicos atrás mencionados (P-l a P-4 = fêmeas, P-5 = macho) foram atribuídos ao grupo de comparação. Os músculos de gastrocnémio de ratinho obtidos a 16 semanas de idade do 21 mesmo modo que na Experiência 1 foram lavados duas vezes com uma solução de homogeneização (sucrose 250 mM, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, tris-HCl 20 mM, pH 7,4) e em seguida procedeu-se a homogeneização para preparar uma suspensão de células utilizando um homogeneizador Polytron e tratamento por ultra-sons em 1 ml da solução de homogeneização anteriormente mencionada que continha 0,2% de Triton-X100. O produto homogéneo resultante foi separado por centrifugação durante 15 minutos a 18.000 G. O sobrenadante foi diluído com um volume igual de glicerol e armazenado a -40 °C até ao momento da análise. A actividade da catepsina B foi então analisada a pH 6,0 utilizando como substrato Z-Arg-Arg-AMC 10 μΜ de acordo com o método de Barrett, et al. (Barrett, A.J. et al., Methods Enzymol., 80, 535-561, 1976). Em separado, a fim de obter uma amostra de branco, o extracto anteriormente mencionado foi incubado durante 5 minutos a 37 °C com E-64 (L-3-carboxi-trans-2,3-epoxipropionil-leucilamido-(4-guanidino)butano) (Protein Research Foundation, Osaka) a fim de inibir a actividade da catepsina B. A actividade de catepsina B + L foi analisada do mesmo modo que a análise da actividade da catepsina B com a excepção de que se utilizou como substrato Z-Phe-Arg-AMC. Uma vez que este substrato é hidrolisado não apenas pela catepsina L, mas também pela catepsina B, a sua hidrólise pode ser utilizada como um indicador da actividade de catepsina B + L. A concentração de proteína do extracto foi determinada de acordo com o método de Bradford (Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976). A actividade específica (nmol de AMC/mg proteína hora) foi calculada para cada animal por divisão da taxa de 22 produção de AMC na análise atrás mencionada (nmol AMC/ml.h) pela concentração de proteína (mg/ml). Estes resultados são apresentados nos Quadros 2 e 3.

Quadro 2 Catepsina B ratinho áAMC Cone. de proteína Actividade específica média D.P. C-l 0,0065 2381,4 3, 602 C-2 0,0054 2195,3 3,221 C-3 0,0056 2477,1 2, 979 O 1 0,0045 2189,3 2,737 C-5 0,0049 1998,3 3,213 0 1 <J\ 0,0066 2255 3, 88 3,272 0, 41 B-l 0, 142 2188,3 85, 69 B-2 0,1757 3029,2 76,58 B-3 0,0367 2304,1 21,02 B-4 0,137 2176,8 83,1 B-5 0,0412 3091,9 17,59 56,8 34,4 A-l 0,0068 2188,8 4,083 A-2 0,0084 2303,1 4,817 A-3 0,0056 2171,8 3,382 A-4 0,0073 2356,3 4,083 > 1 Cn 0,0054 2579,4 2,761 3,825 0,78

Quadro 3 Catepsina B + L ratinho hAMC Cone. de proteína Actividade específica média D.P. \—1 1 o 0,1112 2381,4 61,64 0 1 Kl 0,1276 2195,3 76,72 C-3 0,11408 2477,1 60,79 0 1 0,11685 2189,3 70,45 0 1 Cn 0,1034 1998,3 68,31 C-6 0,11234 2255 65,76 67,28 5, 942 23 ratinho AAMC Cone. de proteína Actividade específica média D.P. B-l 0,90735 2188,3 547,3 B-2 1,0155 3029,2 442,5 B-3 0,30005 2304,1 171,9 B-4 0,85004 2176,8 515,5 B-5 0,26715 3091,9 114,1 358,2 201,2 A-l 0,09708 2188,8 58,55 A-2 0,13749 2303,1 78,8 A-3 0,07708 2171,8 46,85 A-4 0,08475 2356,3 47,48 A-5 0,04716 2579,4 24,14 51,16 19,88

Se bem que a actividade de catepsina B e de catepsina B + L estejam significativamente aumentadas no grupo de comparação, um nível de actividade no grupo de ensaio era quase o mesmo do que o do grupo de controlo.

Experiência 3.

Os animais foram conservados e tratados do mesmo modo do que na Experiência 1, o músculo do gastrocnémio foi obtido do mesmo modo, prepararam-se secções de corte congeladas do referido músculo do gastrocnémio com uma espessura de 4 pm e as secções foram colocadas em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina. Uma das lâminas de vidro foi corada com corante de hematoxilina e eosina.

Para as outras lâminas de vidro, após bloqueamento da peroxidase intrínseca durante 20 minutos em azida de sódio a 0,1% Ip/v) que continha 0,3% (v/v) de peróxido de hidrogénio, as lâminas foram tratadas durante 20 minutos com soro de cabra normal a 3% (v/v) a fim de bloquear 24 qualquer ligação não especifica. As secções foram em seguida incubadas de um dia para o outro numa câmara humidificada a 4 °C com anticorpo de coelho purificado contra catepsina B de rato (Kominami, E., et al., J. Biochem., 98, 87-93, 1985) (2 pg/ml) e anticorpo de coelho contra catepsina L de rato (Banco, Y. et ai., J. Biochem., 100, 35-42, 1986) (10 yg/ml).

Após lavagem em PBS, adicionou-se imunoglobulina de ratinho anti-coelho conjugada com biotina (conjunto Histofine SAB-PO, Nichirei Co., Ltd.), depois do que as lâminas foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem profunda em PBS, adicionou-se estreptavidina conjugada com peroxidase, depois do que as lâminas foram incubadas durante mais 20 minutos.

Os produtos corados imunologicamente foram revelados deixando reagir durante 3 minutos com 3,3-diaminobenzidina a 0,02% (p/v) e peroxidase de hidrogénio a 0,03% (v/v) em tris-HCl 0,05 M (pH 7,6). Cada ensaio de coloração continha um controlo negativo utilizando soro de cabra normal. Estes resultados são apresentados nas Figs. 1 a 6. As catepsinas B e L foram fortemente coradas nos ratinhos transgénicos de IL-6. Por outro lado, a expressão de catepsina B e L foi inibida nos ratinhos transgénicos a que se tinha administrado o anticorpo do receptor de IL-6.

Experiência 4.

Os animais forma conservados e tratados do mesmo modo que os da Experiência 1. Dez dos ratinhos normais atrás mencionado foram atribuídos ao grupo de controlo, enquanto 25 que 10 dos ratinhos transgénicos atrás mencionado foram utilizados para o grupo de ensaio. O ARN total foi extraído do músculo do gastrocnémio utilizando tiocianato de guanidina de acordo com o método de Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18, 5291-5301, 1979, que foi então quantificado de acordo com a densidade óptica a 260 nm.

Aplicou-se uma amostra de 10 pg a electroforese em um gel de agarose a 1,0% que continha formaldeído, depois do que o ARN foi marcado numa membrana de Nylon de revestimento espesso (Amersham) de um dia para o outro utilizando solução de sal citrato padrão 20x (SSC: NaCl 0,15 M e citrato de sódio 15 mM, pH 7,0) O ARN no gel e no filtro foi visualizado com brometo de etídio e fizeram-se fotografias por transiluminação de UV para confirmar que tinham sido transcritas quantidades iguais de ARN.

Foram preparadas sondas marcadas por isótopos radioactivos de acordo com o método de iniciador aleatório utilizando ADNc que codificava para poliubiquitina (poli-Ub) e ADNc que codificava para monoubiquitina (mono-Ub) (Kanayama, H. et al., Câncer Res., 51, 6677-6685, 1991). Após pré-hibridação da membrana atrás mencionada durante 1 hora, hibridou-se a mesma com as sondas anteriormente mencionadas de um dia para o outro utilizando tampão de Church. O filtro foi exposto a película Kodak XAR-5 durante 1 a 3 horas a -80 °C utilizando uma tela reforçada. As imagens na película foram em seguida quantificadas com um densitómetro utilizando um sistema MCID (Imaging Research Inc., Ontario, Canadá). Estes resultados são apresentados nas Figs. 7 e 8. A expressão de ARN foi intensificada nos ratinhos transgénicos tanto para poli-Ub como para mono-Ub e a expressão de ARN foi inibida no grupo a que se tinha 26 administrado anticorpo de receptor de IL-6

Exemplo 2.

Estudou-se o efeito inibidor sobre a proteólise da proteína muscular pelo anticorpo do receptor de IL-6 em ratinhos que tinham um tumor cólon 26. Utilizaram-se no estudo ratinhos BALB/c machos de 6 semanas de idade e transplantou-se cólon 26 por via subcutânea no flanco dos ratinhos no dia de início da experiência. Administrou-se por via subcutânea anticorpo MR16-1 do receptor de IL-6 de ratinho (ver Exemplo de referência 2) a 0,5 mg/ratinho nos dias 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 após transplante do cólon 26 no dia em que a experiência foi iniciada. Neste método, tinha sido confirmado em experiências anteriores que há um pequeno aparecimento de anticorpo de neutralização contra anticorpo de rato de proteína heterogénea. Para além disso, administrou-se IgG de rato (KH5) de acordo com o mesmo programa tanto ao grupo de controlo que tinha o tumor (n = 7) como ao grupo de controlo que não tinha tumor (n = 7).

Os animais foram observados no que se refere ao peso corporal incluindo o peso de tumor, peso corporal excluindo o peso de tumor (peso da carcaça) e peso do músculo do gastrocnémio no dia 17 depois do início da experiência e as actividades da catepsina B e da catepsina B + L do músculo do gastrocnémio foram também analisadas. Para além disso, foi realizada uma análise da actividade da catepsina B e a actividade da catepsina B + L do mesmo modo como na Experiência 2 atrás mencionada. O peso corporal incluindo o peso do tumor, o peso 27 corporal excluindo o peso do tumor (peso da carcaça) e o peso do músculo do gastrocnémio no dia 17 depois do inicio da experiência são apresentados nas Figs. 9, 10 e 11, respectivamente. Foram inibidas as diminuições no peso da carcaça e no peso do músculo do gastrocnémio no grupo a que se tinha administrado anticorpo do receptor de IL-6 (não havia diferenças significativas no peso corporal incluindo o peso do tumor). A actividade da catepsina B e a actividade da catepsina B + L no dia 17 da experiência são apresentadas nas Figs. 12 e 13, respectivamente. Os aumentos na actividade da catepsina B e na actividade da catepsina B + L observados ao longo do tempo foram inibidos por administração de anticorpo do receptor de IL-6 (não havia diferenças significativas observadas no que se refere à actividade da catepsina B).

Aplicação industrial A IL-6 está implicada na degradação dos músculos esqueléticos mediada por sistemas de enzimas proteoliticas. Uma vez que foi observado que o anticorpo do receptor da IL-6 apresenta efeitos inibitórios na proteólise da proteína muscular, sugere-se que a presente invenção é útil como um agente de inibição da proteólise da proteína muscular.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1

Comprimento da sequência: 24 Forma da sequência: Ácido nucleico N.° de cadeias: Cadeia simples Tipo de sequência: ADN sintético Sequência: ACCTCTTCAG AACGAATTGA CAAA SEQ ID NO: 2

Comprimento da sequência: 25 Forma da sequência: Ácido nucleico N.° de cadeias: Cadeia simples Tipo de sequência: ADN sintético Sequência: AGCTGCGCAG AATGAGATGA GTTGT

Lisboa, 18 de Setembro de 2006

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo contra o receptor da interleucina-β para a preparação de um medicamento para aplicação terapêutica como agente de inibição da proteólise da proteína muscular.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo contra o receptor da interleucina-6 é um anticorpo que inibe a actividade biológica da interleucina-6.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo contra o receptor da interleucina-6 reconhece o receptor da interleucina-6 humana.

4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo contra o receptor da interleucina-6 é um anticorpo monoclonal.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo monoclonal é o anticorpo PM-1.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o anticorpo PM-1 é um anticorpo PM-1 humanizado.

8. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que a aplicação terapêutica é a inibição da proteólise da proteína muscular que ocorre durante a 2 ou a catexia cancerosa, a sepsia, o trauma grave distrofia muscular. Lisboa, 18 de Setembro de 2006