WO1999047170A1 - Agents prophylactiques ou therapeutiques pour affections intestinales inflammatoires renfermant, comme ingredient actif, des antagonistes de il-6 - Google Patents

Description

明 細 書

I L— 6 ア ンタゴニス トを有効成分と して含有する炎症性腸疾患の 予防又は治療剤 発明の分野

本発明はィ ンタ一ロ イ キ ン - 6 ( IL-6) ア ンタ ゴニス トを有効成分 と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤に関する。 また、 本 発明は、 1L-6アンタゴニス トを有効成分とするク ロ一ン病又は潰瘍 性大腸炎の予防又は治療剤に関する。 背景技術

1レ 6は B 細胞刺激因子 2 (BSF2)あるいはイ ンタ一フ ヱロ ン 32 と も呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL-6は、 B リ ンパ球系細胞の活 性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al. , Nat ure (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を及 ぼす多機能サイ ト力イ ンであるこ とが明らかになった （ Ak i ra， S. et al. , Adv. in Immunology ( 1993) 54， 1-78) 。 Iい 6は、 T リ ン パ球系細胞の成熟化を誘導するこ とが報告されている （Lotz， M. e t al. , J. Exp. Med. ( 1988) 167, 1253-1258) 。

IL- 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 Iし- 6が結合する分子量約 80kDの リ ガン ド結合性蛋白 質の Iい 6受容体である （Taga, T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 1 66, 967-981, Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 241， 825-82 8)。 IL-6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型 の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体と しても存 在する。 もう一つは、 非リ ガン ド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 Iい 6と - 6受容体は IL- 6Z！し- 6受 容体複合体を形成し、 次いで gpl30 と結合するこ と によ り 、 1し 6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga, T. et al.， Cell (198 9) 58, 573-581) 。

1L- 6ア ンタ ゴニス トは、 IL- 6の生物学的活性の伝達を阻害する物 質である。 これまでに、 Iし- 6に対する抗体 （抗 IL-6抗体） 、 Iい 6受 容体に対する抗体 （抗 1L- 6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gpl30 抗体） 、 Iし- 6改変体、 IL- 6又は 1L-6受容体部分ペプチ ド等が 知られている。

抗 1レ6受容体抗体に関しては、 い く つかの報告がある （Novick, D. et al. , Hybridoma (1991) 10, 137-146 、 Huang, Y. W. et al .， Hybridoma (1993) 12, 621 -630 、 国際特許出願公開番号 WO 95 - 09873 、 フ ラ ンス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号し' S 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM-1 (Hirata, Y. et al. , J . Immunol. (1989) 143, 2900-2906) の相捕性決定領域 （CDR; com plementar i ty determining region ) をヒ ト抗体へ移植するこ とに より得られたヒ ト型化 PM 1抗体が知られている （国際特許出願公開 番号 W0 92- 19759 ) 。

炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease, IBD) は、 潰瘍性大 腸炎とク ロー ン病を代表とする非特異的炎症である。 疾患の成立に 関しては、 免疫学的異常の関与が深く 示唆されているが、 病因解明 には至っていない。 しかし、 病変部位に集簇した単球、 リ ンパ球が 粘膜障害に関係している と考えられており、 これら細胞から産生さ れる炎症性メ デイ エ一ター、 特にサイ 卜力イ ン（ I L1 3、 TNF ひ、 IL -6など） が注目されている。

これら炎症性メ ディ ェ一ターの内、 1 L-6については疾患活動性と

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の関係、 即ち IBD 特異的指標となるか、 という点に焦点が当てられ てきた。 まず、 血清中 - 6濃度はク ロー ン病と潰瘍性大腸炎のいず れにおいても増加し、 その濃度は疾患活動性と相関する（Ho 1 tkamp, W. et al. , J. Cl in. Gastroenterology (1995) 20， 123-126、 Ni ederau, C. et al. , Hepa t o-Gas t r oen t er o 1 ogy (1997) 44, 90 - 107 ) 。 また、 組織中の IL- 6 mRNA 量を PCR (polymerase chain react i on) 産物と して検出 したところ、 潰瘍性大腸炎、 ク ロー ン病と もに 活動性と良く 相関して増加するこ とが示されている（Stevens, C. e t al. , Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826) 。 このような活動期 IBD における Iし- 6産生量昂進について、 そのメ カニズムが解析され 、 粘膜固有層中の単核細胞を Pokeweed mi togenで刺激した時の産生 量が疾患活動性と相関するこ とが明らかにされている（Reinecker, H. - C. et al. , Cl in. Exp. Immunol. (1993) 94， 174-181) 。

その後、 無刺激の粘膜固有層由来単核細胞あるいは患者粘膜の組 織培養のいずれにおいても IL-6産生と疾患活動性との相関が認めら れ、 前者においては粘膜組織中の 6産生細胞数が増加するこ と も 示された。 こ の単核細胞の内、 最も重要な IL-6産生細胞はマク ロ フ ァ一ジであり、 活動期 IBD 患者の粘膜固有層中には盛んに 1L-6を産 生している CD68陽性マク ロフ ァ一ジが多数存在するこ とが確認され ている（Kusugami, K et al. , Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-95 9)。

- 6の産生は、 ク ロー ン病患者の内視鏡的観察結果と も相関する こ とが明らかになつている。 （Reimund, J. -M. et al. , Gut (1996 ) 39, 684-689)。 また、 Iレ6のみならず血清中可溶性 1 L-6受容体濃 度と疾患活動度とが相関するとの報告もある（Mi tsuyama. K. et al .， Gut (1995) 36, 45-49)。

1レ 6以外の炎症メ ディ エーターでは、 IL-1 /3産生量が 1L-6と同様 に疾患活動性と相関するこ とが認められている。 一方、 TNF αの産 生量については必ずしも相関せず、 活動性の低い状態であっても産 生量は高い傾向にある（Reinecker, H. - et al.， Cl in. Exp. I mm unol. (1993) 94， 174-181、 Reimund, J. -M. et al. , Gut (1996)3 9, 684-689) 。

現行の I BD 治療法は、 食事療法と薬物療法の組み合わせからなり 、 サラ ゾスルフ ァ ピ リ ジ ン、 ダルコ コルチコ ィ ドなどが処方されて いる。 しかし、 これら薬物には副作用による不耐性患者が存在し、 長期連投には問題がある。

一方、 新しい 1BD の治療と してサイ トカイ ン活性の阻害により、 病態を改善しょう とする試みが進められている。 その主な標的は 1L - 1と TNF a (Van Deventer, S. J. H. Gut (1997) 40, 443-448) であ り、 IL- 1については、 IL- 1受容体ア ンタゴニス ト（Cominell i F et al. , Gastroenterology ( 1992) 103, 65-71)、 - 1阻害剤である CG P47969A(Casini-Raggi et al. , Gastroenterology ( 1995) 109, 81 2-818)などによる臨床あるいは実験動物レベルで検討されている。 また、 TNF α については特異的モノ ク ローナル抗体をク ロー ン病患 者に投与し、 他の治療に抵抗性であったク ロー ン病患者 10人中 8 人 で、 活動性の低下と潰瘍の治癒が認められている（Van Dul lemen, H . M. et al. , Gastroenterology (1995) 109, 129-135)。 しかしな がら、 I L- 6アンタゴニス トを用い IL- 6の生物学的活性を特異的に抑 制するこ とにより、 1BD に治療効果を示すこ とは知られていなかつ た。 発明の開示

本発明は、 前記の欠点を有さない炎症性腸疾患の予防又は治療剤 を提供しょう とする ものである。 すなわち、 本発明は、 （ 1 ) 1 L- 6ア ンタゴニス 卜を有効成分と し て含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。

本発明はまた、 （ 2 ) 1L-6受容体に対する抗体を有効成分と して 含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。

本発明はまた、 （ 3 ) IL-6受容体に対するモ ノ ク ロ ーナル抗体を 有効成分と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する 本発明はまた、 （ 4 ) ヒ ト IL-6受容体に対するモ ノ ク ロ ーナル抗 体を有効成分と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供 する。 ヒ ト Iい 6受容体に対するモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 好ま し く は PM-1抗体である。

本発明はまた、 （ 5 ) マウス Iし- 6受容体に対するモノ ク ローナル 抗体を有効成分と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提 供する。 マウス IL-6受容体に対するモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 好ま し く は MR16-1抗体である。

本発明はまた、 （ 6 ) IL-6受容体に対する組換え型抗体を有効成 分と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。 1レ 6 受容体に対する組換え型抗体、 好ま し く はヒ ト抗体定常領域 （C 領 域） を有する。

本発明はまた、 （ 7 ) IL-6受容体に対するキメ ラ抗体又はヒ ト型 化抗体を有効成分と して含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤を 提供する。

本発明はまた、 （ 8 ) ヒ ト型化 PM-1抗体を有効成分と して含有す る炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。

本発明はまた、 （ 9 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) に記載の 1レ6ア ンタゴ 二ス トを有効成分と して含有するク ロー ン病又は潰瘍性大腸炎の予 防又は治療剤を提供する。 本発明はまた、 （ 1 0 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) に記載の - 6ア ンタ ゴニス トを有効成分と して含有する炎症性腸疾患における体重減少 抑制剤を提供する。

本発明はさ らに、 （ 1 1 ) 前記 （ 3 ) 〜 （ 8 ) に記載の IL-6受容 体に対する抗体を有効成分と して含有する炎症性腸疾患における体 重減少抑制剤を提供する。 発明の実施の形態

本発明で使用される IL 6ア ンタゴニス トは、 炎症性腸疾患の予防 又は治療効果、 又は炎症性腸疾患における体重減少抑制効果を示す ものであれば、 その由来、 種類および形状を問わない。

IL- 6アンタゴニス トは、 Iい 6によるシグナル伝達を遮断し、 IL - 6 の生物学的活性を阻害する物質である。 1L- 6ア ンタゴニス トは、 好 ま し く は IL- 6、 1L- 6受容体及び gpl30 のいずれかの結合に対する阻 害作用を有する物質である。 I L- 6アンタゴニス ト と しては、 例えば 抗 1レ6抗体、 抗 Iレ 6受容体抗体、 抗 g_P130 抗体、 - 6改変体、 可溶 性 IL-6受容体改変体あるいは IL- 6又は IL- 6受容体の部分べプチ ドぉ よび、 これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。

本発明で使用される抗 IL-6抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ロ —ナル又はモノ ク ローナル抗体と して得るこ とができる。 本発明で 使用される抗 Iし - 6抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ローナル 抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と しては、 ハ イブリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産生される もの がある。 この抗体は IL-6と結合するこ と によ り、 IL- 6の IL-6受容体 への結合を阻害して 1L-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断す る。 このような抗体と しては、 MH166 (Matsuda, T. et al. , Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951 -956) や SK2 抗体 （Sato, K. et al. , 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（ 1991) 21, 166) 等が挙げら れる。

抗 Iレ 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用 し 、 以下のよう にして作製できる。 すなわち、 IL 6を感作抗原と して 使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リ ーニング法により、 モノ ク 口一ナルな抗体産生細胞をスク リ ーニングするこ とによって作製できる。

具体的には、 抗 1L-6抗体を作製するには次のよう にすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト 1L-6は、 Eur. J . Biochem (1987) 168， 543-550 、 J. Immunol. (1988) 140， 1534 -1541 、 あるいは Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688 に開示 された IL-6遺伝子 Zァ ミ ノ酸配列を用いるこ とによつて得られる。

IL - 6の遺伝子配列を公知の発現べク ター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目 的の IL-6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 - 6蛋白質を感作 抗原と して用いればよい。 また、 IL-6蛋白質と他の蛋白質との融合 蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。

本発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ロ一ナル又はモノ ク ロ一ナル抗体と して得るこ とができる。 本 発明で使用される抗 1L-6受容体抗体と して、 特に哺乳動物由来のモ ノ ク ロ一ナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナル抗体 と しては、 ハイプリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産 生される ものがある。 この抗体は IL-6受容体と結合することにより 、 IL-6の iL-6受容体への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細胞 内への伝達を遮断する。

このよ う な抗体と しては、 MR16 1抗体 （Tamura, T. et al. Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90， 11924-11928)、 PM-1抗体 （Hi rata, Y. et al. , J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64-7 抗体あるいは AUK146-15 抗体 （国際特許出願公開 番号 W0 92 19759)などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好ま し い抗体と して PM-1抗体が挙げられる。

なお、 PM- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM-1と して、 工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号 ) に、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP 2998と してブダぺス ト条約に 基づき国際寄託されている。 また、 MR16-1 抗体産生ハイプリ ドー マ細胞株は、 Rat-mouse hybr idoma MR16- 1と して、 工業技術院生命 工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 3 月 13日に、 FERM BP-5875と してブダぺス ト条約に基づき国際 寄託されている。

抗 I L-6受容体モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的 には公知技術を使用 し、 以下のよう にして作製できる。 すなわち、 IL - 6受容体を感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にし たがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公 知の親細胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法によ り、 モノ ク ロ -ナルな抗体産生細胞をスク リ 一ニングするこ とによつて作製でき る。

具体的には、 抗 IL-6受容体抗体を作製するには次のよう にすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト 1レ6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス IL-6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された - 6受容体遺伝子 ダァ ミ ノ酸配列を用いるこ とによつて得られる。

1L-6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現している ものと細胞膜より 離脱している もの （可溶性 Iい 6受容体） （Yasukawa, . et al.， J . Biochem. (1990) 108， 673-676) との二種類がある。 可溶性 Iい 6 受容体抗体は細胞膜に結合している - 6受容体の実質的に細胞外領 域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と 細胞内領域が欠損している点で膜結合型 - 6受容体と異なっている 。 IL- 6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作 製の感作抗原と して使用されう る限り、 いずれの IL- 6受容体を使用 してもよい。

IL- 6受容体の遺伝子配列を公知の発現べク ター系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中 から目的の IL- 6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 1L-6 受容体蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 Iし- 6受容体を 発現している細胞や - 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質 を感作抗原と して用いてもよい。

ヒ ト IL- 6受容体をコ一 ドする cDNAを含むプラス ミ ド plBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. col i) は、 平成元年 （ 1989年） 1 月 9 日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に、 HB101-piB!BSF2R と して、 受 託番号 FERM BP-2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて いる。

本発明で使用される抗 gpl30 抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ローナル又はモノ ク ロ一ナル抗体と して得る こ とができる。 本発明 で使用される抗 gp 130 抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ロ一 ナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナル抗体と しては 、 ハイプリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的手法によ り抗体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産生される ものがある。 この抗体は gpl30 と結合するこ とにより、 1L-6/Iい 6 受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して！レ6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する。

このような抗体と しては、 AM64抗体 （特開平 3-219894) 、 4B11抗 体および 2H4 抗体 （US 5571513) B- S12 抗体および B-P8抗体 （特開 平 8- 291199) などが挙げられる。

抗 gpl30 モノ ク ロ一ナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 基本的には 公知技術を使用 し、 以下のよう にして作製できる。 すなわち、 gpl3 0 を感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細 胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ローナル抗 体産生細胞をスク リ ーニングするこ とによつて作製できる。

具体的には、 モノ ク ロ一ナル抗体を作製するには次のよう にすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30 遺伝子 Zア ミ ノ酸配列を用いるこ とによって得られる。

gpl30 の遺伝子配列を公知の発現べク 夕一系に揷人して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から 目的の gpl30 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 gpl30 受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や gpl30 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよい。

感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま し く 、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウ ス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は

、 皮下に注射するこ とにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン 卜、 例えば、 フ ロイ ン ト完全ア ジ ュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4-21日毎 に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用するこ とができる。

このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ 口一マ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123， 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 ( Current Topics in Microbiology and Immunol og y (1978) 81， 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Mi lstein, C. Eur. J . Immunol. (1976) 6， 511-519 ) 、 MPC-11 (Margul ies. D. H. et al. , Cell (1976) 8, 405-415 ) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276, 269-270 ) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et a l.， J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge ， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131 133 ) 等が適宜使用される。 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミ ルスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Mi lstein,

C. 、 Methods Enzymol. ( 1981 ) 73, 3-46) 等に準じて行う こ とが でき る。

より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば

、 ポ リ エチ レ ング リ コ一ル （PEG ) 、 セ ンダイ ウ ィ ルス （ HVJ ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チルスル ホキシ ド等の捕助剤を添加使用するこ と もできる。

免疫細胞と ミ エローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エローマ 細胞に対して免疫細胞を卜 10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融合 に用いる培養液と しては、 例えば、 前記 ミ エローマ細胞株の増殖に 好適な RPM I I 640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養に 用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用すること もできる。

細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く 混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000 - 6000 程度の PEG 溶液を通常、 30 -60 % ( w/v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ とによりハイブリ ド一マ の生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒ ポキサンチン、 ア ミ ノ ブテ リ ンおよびチ ミ ジ ンを含む培養液） で培養するこ とにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ ー ニ ングおよびク ローニングが行われる。

また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を i n v i t r oで所望の抗原蛋白質又は抗原発現 細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミ エロ ーマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所 望のヒ ト抗体を得るこ と もできる （特公平 1 59878 参照） 。 さ らに 、 ヒ ト抗体遺伝子のレパ一 ト リ ーを有する ト ラ ンス ジ エニ ッ ク動物 に抗原又は抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗 体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93/12227 、 W0 92/ 03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/3373 5 参照） 。

このよう にして作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。

当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。

例えば、 抗 1L- 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3-139293に開示された方法により行う こ とができる。 工業技術院生 命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平 成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された PM-1抗体産生ハイブリ ドーマを BALB/cマウスの腹腔内 に注人して腹水を得、 この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、 本 ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば、 10%ゥ シ胎児血清、 5 %BM -Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RPM 11640培地、 ハイ プリ ドーマ SFM 培地 （G1BC0- BRL 製） 、 PFHM- 11 培地 （G1BC0- BRL 製） 等で培養し、 その培養上清から PM 1抗体を精製する方法で行う ことができる。 本発明には、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ロ一ニングし、 適当なベク タ一に組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いるこ とができる （例えば、 Borrebaeck C. A. K. and Larric k J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。

具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えばハイプリ ド —マから、 抗体の可変 （V ) 領域をコ一 ドする mRNAを単離する。 mR NAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジ ン超遠心法 （Chirgwin ， J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. ( 1987) 162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmac ί a製） 等を使用 して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purif icati on Kit (Pharmacia 製） を用いるこ とにより mRNAを直接調製するこ とができる。

得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First - strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行う には 5' -Ampl i FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' - RACE 法 （Frohman, M. A. et al. , Pro N atl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et a 1. , Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932 ) を使用するこ と ができる。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベ ク タ一 DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えべク タ一を作成し 、 大腸菌等に導入してコロニ一を選択して所望の組換えべク タ一を 調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォ キシ法により確認する。 目的とする抗体の V 領域をコー ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベク ター へ組み込む。 又は、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を 、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベク ター へ組み込んでもよい。

本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェ ンハ ンサー、 プロモ一ターの制御の もとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる 本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造する ことができる。

キメ ラ抗体は、 前記のように して得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べク タ 一に組み込んで宿主に導人し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92- 19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 るこ とができる。

例えば、 キメ ラ PM-1抗体のし 鎖および H 鎖の V 領域をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドは、 各々 pPM-k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラス ミ ドを有する大腸菌は、 National Col lections of Indust rial and Marine Bacteria Limitedに、 1991年 2 月 11日に、 各々 NC 1MB 40366 、 NCIMB40362と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託さ れている。

ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体と も称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR ) をヒ 卜抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92- 19759 参照） 。

具体的には、 マウ ス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域

(FR; framework region) を連結するよう に設計した DNA 配列を、 末端部にオーバ一ラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコ一 ドする DNA と連結し、 次いで発現べク ターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。

CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成する ものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のァ ミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53， 851 -856) 。

キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域と しては、 Cァが挙げられ、 例えば、 C y l 、 C r 2 、 Cァ 3 、 Cァ 4 を使用するこ とができる。 また、 抗体又はその 産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾してもよい キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域と ヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性が低下しているため、 本発 明に使用される抗体と して有用である。

本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 ヒ ト型化 PM-i抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 WO 92-19759 参照） 。

前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モータ一、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポ リ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベク タ一により発 現させるこ とができる。 例えばプロモータ一/ェンハ ンサ一と して は、 ヒ トサイ トメガロウ ィ ルス前期プロモータ一 Zェンハンサ一 （ human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ) を 挙げるこ とができる。

また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ 一夕一 Zェンハンサ一と して、 レ ト ロゥ イ ノレス、 ポ リ オ一マウ ィ ル ス、 アデノ ウ イ ルス、 シ ミ ア ンゥ イ ノレス 40 (SV 40)等のウ ィ ルスプ 口モータ一 Zェンハ ンサ一ゃ ヒ トェロ ンゲ一 シ ヨ ンフ ァ ク ター 1 ひ

(HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハ ンサ一を 用いればよい。

例えば、 SV 40 プロモータ一/ェ ンハ ンサ一を使用する場合、 Mu l liganらの方法 （Mul l igan, R. e t al. , Nature ( 1979) 277， 1 08-114) 、 また、 HEF1 αプロモータ一 Zェ ンハ ンサ一を使用する場 合、 i zush ima らの方法 (Mi zushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ) に従えば容易に実施するこ とがで きる。

大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモーターと しては、 1 acZプロモー 夕一、 araBプロモ一夕一を挙げるこ とができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward, E. S. et al. , Nature (19 89) 341, 544-546 ； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422 -2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （Be tter, M. et al. Science ( 1988) 240， 1041 -1043 ) に従えばよい 抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169， 4379-4383) を使用すればよい。 ペリ ブラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に リ フ オール ド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。

複製起源と しては、 SV 40 、 ポ リオ一マウ ィ ルス、 アデノ ウイ ノレ ス、 ゥシパピ口一マウ ィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いるこ と ができ、 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現べ ク タ一は選択マ一カーと して、 ア ミ ノ グリ コ シ ドホスホ トラ ンスフ ラーゼ （ APH ) 遺伝子、 チ ミ ジ ンキナーゼ （ TK) 遺伝子、 大腸菌 キサンチングァニンホスホ リ ボシル トラ ンスフ ェラ一ゼ （ Ecogp t) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができ る。

本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す るこ とができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vi troの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH 0 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 Heし a、 Vero 、 (2) 両生類細胞、 例えば、 アフ リ カッメ ガエル卵母細胞、 あるい は（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 が知られている。 植物 細胞と しては、 ニコチアナ . タバクム （Nicotiana t aba cum)由来の l 8 細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と し ては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミ セス （Saccharomyces ) 属、 例え ばサッカロ ミ セス ' セ レ ヒ シェ ( Saccharomyces cerevisiae) 、 糸 状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスぺ ルギルス · ニガ一 （Aspergillus niger ) などが知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. col i ) 、 枯草菌が知られている。

これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養するこ とにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640、 IMDMを使用するこ とができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用するこ と もできる。 また、 抗体遺伝子を導 人した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。

一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系がある。

哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウ ス、 ゥ シを用い るこ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applica tions, 1993 ) 。 また、 昆虫と しては、 カイ コを用いるこ とができ る。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導人し、 動物又は植物の体 内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ /3カゼ イ ンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子 の途中に揷人して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が揷人さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジヱニッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トラ ン ス ジエニッ クャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモ ンを トラ ンスジヱニッ クャギに使用 しても よい。 (Bbert, K. . et al. , Bio/Technology (1994) 12, 699-70 2 ) ο

また、 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウ ィ ルスをカイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望の抗体 を得る （Maeda, S. et al. , Nature (1985) 315, 592-594) 。 さ ら に、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベク ター 、 例えば pMON 530に揷人し、 このべク タ一を Agrobacterium tumefa ciens のようなノく クテ リ アに導入する。 こ のバク テ リ アをタバコ、 例えば Ni cot i ana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗 体を得る （Jul ian, K. _C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 2 4， 131-138) o

上述のよう に in v ro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H 鎖） 又は軽鎖 （し 鎖） をコー ドする DNA を別々 に発現べク タ一に組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H 鎖および L 鎖をコ一 ドする DNA を単一の発現べク タ一に 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。

本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し ては、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fv又は H 鎖と L 鎖の Fvを適当な リ ンカ一で 連結させたシ ングルチェ イ ン Fv (scFv) が挙げられる。

具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシ ンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコー ドする遺伝 子を構築し、 これを発現ベク ターに導入した後、 適当な宿主細胞で 発現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. ( 1994) 152， 2968-2976、 Better, M. & Horwi tz, A. H. Methods in Enzymolog y (1989) 178, 476-496 、 Plueckthun, A. k Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、 Lamoy i, E.， Methods in E nzymology (1989) 121, 652-663 、 Rousseaux, J. et al. , Metho ds in Enzymology (1989) 121， 663-669、 Bird, R. E. et al. , TI BTECH (1991) 9, 132-137 参照） 。

scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結するこ とにより得 られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ン力一、 好ま し く は、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S . et al.ヽ Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85, 5879-5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ペプチ ドリ ンカ一と しては、 例えばア ミ ノ酸 12-19 残基からなる任 意の一本鎖ぺプチ ドが用いられる。

scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖又は、 H 鎖 V 領域をコ 一 ドする DNA 、 および L 鎖又は、 L 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA を铸 型と し、 それらの配列のうちの所望のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする DN A 部分を、 その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR 法により 增幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコ一 ドする DNA お よびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるように規定するプライ マ一対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。

また、 一旦 scFvをコ一 ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現べク タ一、 および該発現べク タ一により形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 scFvを得るこ とができる。

これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 させ、 宿主により産生させるこ とができる。 本願特許請求の範囲で いう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。

抗体の修飾物と して、 ポ リ エチレングリ コール （PEG ) 等の各種 分子と結合した抗体を使用するこ と もできる。 本願特許請求の範囲 でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような 抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とに よって得ることができる。 これらの方法はこの分野においてすでに 確立されている。

前記のよう に産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフ ィ 二ティ 一ク ロマ トグラフ ィ 一により行う こ とがで きる。 ァフ ィ 二ティ ーク ロマ 卜 グラフ ィ 一に用いるカラムと しては 、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる プロテイ ン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0 R0S 、 Sepharose F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタ ンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよ く 、 何ら限定され る ものではない。 例えば、 上記ァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフ ィ ー 以外のク ロマ ト グラフ ィ ー、 フ ィ ルター、 限外濾過、 塩析、 透析等 を適宜選択、 組み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精 製するこ とができる。 ク ロマ トグラフ ィ ーと しては、 例えば、 ィォ ン交換ク ロマ トグラフ ィ ー、 疎水ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ゲルろ過等 が挙げられる。 これらのク ロマ トグラフ ィ ーは HPLC (High perform ance liquid chromatography) に適用 し得る。 また、 逆相 HPLC (re verse phase HPLC) を用いてもよい。

上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA 等によ り行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB S (-)で適当に希釈した後、 280 の吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 35 OD と して算出する。 また、 EL ISA による場合は以下のよう に測 定するこ とができる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （PH9.6 ) で 1 〃 g/mlに希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG0製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーシ ョ ン し、 抗体を固 相化する。 ブロ ッ キ ングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサ ンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL 製） 100 / 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベー シ ョ ンする。 洗浄後、 5000倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト Ig G (B!O SOURCE製） 100〃 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュべ一 卜する。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベー シ ョ ンの後、 MI CROP LATE READER Model 3550 (Bio- Rad 製） を用いて 405nm での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。

本発明で使用される 1L-6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有 し、 且つ 1レ6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL - 6 改変体は IL- 6受容体に対し Iい 6と競合的に結合するが、 IL- 6の生物 学的活性を伝達しないため、 IL-6による シグナル伝達を遮断する。

1し- 6改変体は、 1し- 6のァ ミ ノ酸配列のァ ミ ノ酸残基を置換するこ とにより変異を導入して作製される。 IL 6改変体のもととなる 1L-6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ま し く はヒ ト IL - 6である。

具体的には、 1レ 6のァ ミ ノ酸配列を公知の分子モデリ ングプ口グ ラム、 たとえば、 WHATiF (Vriend et al. , J. Mol. Graphics (199 0) 8, 52-56 ) を用いてその二次構造を予測し、 さ らに置換される ァ ミ ノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価するこ とにより行われる。 適切な置換ア ミ ノ酸残基を決定した後、 ヒ ト IL-6遺伝子をコ一 ドす る塩基配列を含むベク タ一を铸型と して、 通常行われる PCR 法によ りア ミ ノ酸が置換されるよう に変異を導人するこ とにより、 - 6改 変体をコ一 ドする遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発 現べク タ—に組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて IL- 6改変体を得るこ とができる。

Iい 6改変体の具体例と しては、 Brakenhof f et al. , J. Biol. Ch em. (1994) 269, 86-93 、 及び Savino et al. , E BO J. ( 1994) 13 , 1357- 1367 、 WO 96 18648 、 W096- 17869に開示されている。

本発明で使用される 1L- 6部分べプチ ド又は IL-6受容体部分べプチ ドは、 各々 IL-6受容体あるいは 1L- 6との結合活性を有し、 且つ！L-6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 ！し- 6部分べプチ ド 又は IL- 6受容体部分べプチ ドは IL- 6受容体又は 1L- 6に結合し、 これ らを捕捉するこ とにより 1L- 6の IL- 6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 IL 6の生物学的活性を伝達しないため、 によ る シグナル伝達を遮断する。

IL-6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 ！L 6又は 1L-6 受容体のァ ミ ノ酸配列において IL- 6と IL- 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のァ ミ ノ酸配列からなるぺプチ ドである。 この ようなペプチ ドは、 通常 1 0〜 8 0 、 好ま し く は 2 0 〜 5 0 、 より 好ま し く は 2 0 〜 4 0 個のア ミ ノ酸残基からなる。

IL-6部分べプチ ド又は 1L-6受容体部分べプチ ドは、 1L-6又は Iし - 6 受容体のア ミ ノ酸配列において、 IL- 6と Iレ 6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その一部又は全部のア ミ ノ酸配列を通常知られる 方法、 例えば遺伝子工学的手法又はべプチ ド合成法により作製する こ とができる。

!L-6部分べプチ ド又は 1レ 6受容体部分べプチ ドを遺伝子工学的手 法により作製するには、 所望のペプチ ドをコー ドする DNA 配列を発 現ベク ターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて得るこ とができる。 - 6部分べプチ ド又は 1 L - 6受容体部分べプチ ドをぺプチ ド合成法 により作製するには、 ぺプチ ド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いるこ とができる。

具体的には、 続医薬品の開発第 1 4 巻ペプチ ド合成 監修矢島治 明廣川書店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法と しては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しょう とする ぺプチ ドの C 末端に対応するァ ミ ノ酸を結合させ、 α - ァ ミ ノ基及 び側鎖官能基を適切な保護基で保護したア ミ ノ酸を C 末端から Ν 末 端方向の順番に 1 ア ミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合した ア ミ ノ酸又はべプチ ドのひ - ア ミ ノ基の該保護基を脱離させる反応 を交互に繰り返すこ とにより、 ぺプチ ド鎖を伸長させる方法が用い られる。 固相ペプチ ド合成法は、 用いられる保護基の種類により B o c 法と Fmo c法に大別される。

このよう にして目的とするペプチ ドを合成した後、 脱保護反応及 びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応をする。 ぺプチ ド鎖との切断 反応には、 B o c 法ではフ ッ化水素又は ト リ フルォロメ タ ンスルホ ン 酸を、 又 Fmo c法では TFA を通常用いるこ とができる。 B o c 法では、 例えばフ ッ化水素中で上記保護べプチ ド樹脂をァニソ一ル存在下で 処理する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチ ド を回収する。 これを凍結乾燥するこ とにより、 粗ペプチ ドが得られ る。 一方、 Fmo c法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護 反応及びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応を行う ことができる。 得られた粗ペプチ ドは、 HP LCに適用するこ とにより分離、 精製す るこ とができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水- ァセ トニ ト リ ル系溶媒を使用 して最適条件下で行えばよい。 得られたク ロマ ト グラフ ィ ーのプロフ ァ イ ルのピークに該当する画 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このよ う にして精製したぺプチ ド画分について、 マススペク トル分析による分子量解析、 ア ミ ノ酸 組成分析、 又はア ミ ノ酸配列解析等により同定する。

Iし- 6部分べプチ ド及び Iレ6受容体部分べプチ ドの具体例は、 特開 平 2- 188600、 特開平 7 324097、 特開平 8 311098及び米国特許公報 US

5210075に開示されている。

本発明で使用される I L- 6ア ンタゴニス トの Iレ 6シグナル伝達阻害 活性は、 通常用いられる方法により評価するこ とができる。 具体的 には、 Iし- 6依存性細胞 MH60. BSF2 を培養し、 これに IL-6を添加し、 同時に Iし- 6ァンタゴニス 卜を共存させるこ とにより 1し- 6依存性細胞 の ³H-チ ミ ジ ン取込みを測定すればよい。 また、 1し- 6受容体発現細 胞である U266を培養し、 標識 IL-6を添加し、 同時に Iし- 6ア ン タゴニス トを加えるこ とにより、 1L-6受容体発現細胞に結合した ' ²⁵1 標識 IL- 6を測定する。 上記ア ツセィ系において、 IL- 6ア ンタゴ ニス トを存在させる群に加え 1レ6アンタゴニス トを含まない陰性コ ン ト ロール群をおき、 両者で得られた結果を比較すれば IL- 6ア ンタ ゴニス トの 1L-6阻害活性を評価するこ とができる。

本発明の効果を確認するには、 CD4 陽性且つ CD45RB強陽性の細胞

( CD4— CD45RB^{h 1 g h}細胞） を移人して炎症性腸疾患を発症した動物 に本発明で使用される Iし- 6アンタゴニス トを投与し、 体重減少抑制 効果や炎症性腸疾患スコアの改善効果を評価するこ とによ り行う こ とができる。 また、 本発明の他の効果と して、 炎症性腸疾患におけ る食欲不振抑制効果、 腹痛軽減効果、 下痢軽減効果あるいは炎症性 腸疾患の再発防止効果がある。

IL- 6アンタゴニス トによる動物に移人される CD4— CD45RB^{h s h}細 胞は、 例えば後述の実施例に記載の方法を用いるこ とにより単離す ることができる。 また、 CD4— CD45RB^{h l} "細胞が由来する動物と し ては、 通常実験に用いられる動物でよ く 、 例えばマウス、 ラ ッ 卜な どを用いるこ とができる。

後述の実施例に示されるよう に、 抗 - 6受容体抗体の投与により 、 炎症性腸疾患を発症した実験動物において、 体重減少の抑制及び 腸疾患ス コアの改善が認められたこ とから、 抗 - - 6受容体抗体等の I L - 6ア ンタゴニス トは炎症性腸疾患治療効果を有するこ とが示され た。

本発明における治療対象は哺乳動物である。 治療対象の哺乳動物 は、 好ま し く はヒ トである。

本発明の予防又は治療剤は、 経口的にまたは非経口的に全身ある いは局所的に投与するこ とができる。 例えば、 点滴などの静脈内注 射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐薬、 注腸、 経口性腸溶 剤などを選択するこ とができ、 患者の年齢、 症状により適宜投与方 法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体重 1 k gあ たり 0. 0 1 m g から 1 00 mgの範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 1〜 1 000 m g 、 好ま し く は 5〜 5 0 m の投与量を選ぶこ とができる 本発明の予防又は治療剤は、 投与経路次第で医薬的に許容される 担体や添加物を共に含むものであつてもよい。 このよ うな担体およ び添加物の例と して、 水、 医薬的に許容される有機溶媒、 コラーゲ ン、 ポ リ ビニルアルコール、 ポ リ ビニルピロ リ ドン、 力ルボキシ ビ 二ルポ リ マー、 力ノレボキシメ チルセルロースナ ト リ ウ ム、 ポ リ ア ク リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキス ト ラ ン、 カノレボキシメ チルスターチナ ト リ ウ ム、 ぺク チ ン、 メ チルセル口一 ス、 ェチルセルロース、 キサ ンタ ンガム、 アラ ビア ゴム、 カゼイ ン 、 ゼラチ ン、 寒天、 ジグ リ セ リ ン、 プロ ピレ ング リ コール、 ポ リ エ チ レ ングリ コ一ル、 ワセ リ ン、 ノ、。ラ フ ィ ン、 ステア リ ノレアルコール 、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブ ミ ン （ H S A ) 、 マ ンニ トール、 ソ ノレビ トール、 ラ ク ト一ス、 医薬添加物と して許容される界面活性剤 などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて上記の中か ら適宜あるいは組合せて選択される力く、 これらに限定される もので はない。

本発明における治療対象疾患は、 炎症性腸疾患である。 炎症性腸 疾患には、 潰瘍性大腸炎と ク ローン病が含まれる。 これらの疾患は 、 いずれも 20歳前後の若年者に好発する慢性疾患であり、 未だにそ の原因となる抗原 · 炎症病態のメ 力二ズムはほとんど解明されてい ない。 しかし、 これを解明しょう とする研究は細胞 ' サイ ト力イ ン などを手かがかり と して盛んにおこなわれている。

最近数年の間に腸疾患惹起細胞に関する解析が主にマウスの系を 用いて進んでいる。 すなわち、 精製した CD4 陽性 CD45RB強陽性細胞 (CD4— CD45RB^h'^{g h}) を免疫不全マウ ス（SC I D マウス） に移植する こ とにより慢性腸疾患の病態を誘導できることが明らかになつている (Morr i ssey, P. J. et al. , J. Exp. Med. (1993) 178, 237-244， Leach, M. W. et al. , Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515, A randa, R. et al. , J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473) 。

一方、 CD4 陽性 CD45RB弱陽性細胞（CD4— CD45RB¹ ) は腸疾患を 惹起することができず、 むしろ CD4 陽性 CD45RB強陽性細胞による腸 疾患の誘発を抑制するこ とが示されている（Powrie, F. R. et al. , J. Exp. Med. (1994) 179， 589-600)。 CD45RB発現量はサイ トカ イ ン産生パター ンとの相関が知られている。 すなわち、 CD4 陽性 CD 45RB強陽性細胞は、 IFN ァ、 TNF αなどを産生する 1 型へルバ一細 胞（Thl) 様であるのに対し、 CD4 陽性 CD45RB弱陽性細胞は IL- 4， IL -10 などを産生する 2 型へルバ一細胞（Th2) 様であると考えられて いる（Lee, W. et al. , J. Immunol. ( 1990) 144， 3288-3295) 。

したがって、 ！BD の発症は、 Thl と Th2 とのバラ ンスが崩れるこ と と関係している可能性が高いと考えられる力 このこ とは Thl 機 能を抑制する I L- 10 遺伝子を遺伝子ターゲッティ ング法により欠損 させたマウスにおいて、 ヒ ト潰瘍性大腸炎に類似する慢性腸炎が発 生するこ とからも裏付けられる（Kuhn, R. et al.， Cell (1993) 75 ， 263-274)。

本実施例で用いられたモデル動物は、 大腸の組織学的特徴が潰瘍 性大腸炎およびク ロー ン病患者と非常に良く 似ている（Leach, M. W . et al. , Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503- 1515) 。 潰瘍性大腸 炎は、 直腸から連続性で広域に病変がみられるこ とが多く 、 粘膜上 皮が特異的に障害される。 本モデルでは、 障害される部位が主に大 腸に限局する ものの広い範囲にわたるこ と、 陰窩が伸張するこ とな どが臨床病態と類似している。

一方、 ク ロー ン病は口腔から肛門まで消化管のどこにでも散在性 に発生し、 粘膜に限局しない全層性炎症である。 また、 組織学的に は非乾酪性肉芽腫炎症巣を特徴と している。 本モデルでは、 粘膜層 に限局しない炎症が見いだされ、 マク ロフ ァ ージ、 リ ンパ球、 多核 巨細胞などが集積するこ と、 しばしば肉芽腫様形態をとるこ と、 陰 窩膿瘍がほとんど見つからないこ となどはク ローン病に類似してい る。

このよ う に、 潰瘍性大腸炎とク ロー ン病の特徴が混在する症例は これまでにも臨床で報告されている（Tanaka, M et al. , Hepato-ga stroenterology ( 1990) 37, 18-31)。 また、 炎症性腸疾患において は、 上皮細胞において主要組織適合性抗原 class IIの発現昂進が見 いだされる（Trejdosiewicz, L. K. et al. , Dig. Dis. Sci. (1989 )34, 1449-1456) 力く、 本モデルにおいても同様である。 なお、 本モ デルにおいては上皮組織の肥厚が特徴的に現れるが、 これは潰瘍性 大腸炎の患者で見いだされる細胞増殖の昂進（Seraf ini， E. P. et al. , Gut ( 1981) 22, 648-652)と関係している ものと考えられる。 本モデルは臨床での炎症性腸疾患と類似性が高く 、 重症時には体 重減少を引き起こす。 本モデルを用いた実験により、 組織学的に障 害が著し く軽減され、 体重減少が認められなかったこ とは、 I L-6ァ ンタ ゴニス 卜が潰瘍性大腸炎又はク ロー ン病などの炎症性腸疾患に 対し治療効果を発揮するこ とを示すものである。

実施例

以下、 実施例、 参考例および実験例により本発明を具体的に説明 する力 本発明はこれらに限定される ものではない。

実施例

BALB/c系雄性マウスから脾臓を無菌的に採取し、 これをつぶした 後、 良く ピペッ ティ ングして単細胞懸濁液と した。 次に赤血球を除 去するため、 細胞ペレ ツ トを Lysis solution (0. 16M NH, CIと pH7. 2 の 0.17M Tris緩衝液を 9: 1 の比率で混合したもの） にて処理し、 さ らに リ ン酸緩衝食塩水にて 2 回洗浄し、 マウス脾臓細胞を得た。 洗浄したマウス脾臓細胞を 2 CS 添加 RPM 11640培地に懸濁して細 胞数を計測後、 1. 1 X 10⁸ /ml に調製した。 これに抗マウ ス CD4 抗 体（L3T4 icrobeads, Mi 1 tenyi Biotec 社製） を 1/9 容添加し、 氷 温下にて 15分間細胞に結合させた （細胞密度 1 x lO⁸ /ml)o さ らに 、 ini MACS separation system (Mi 1 tenyi Biotec社製） を用いた カ ラ ム操作により、 CD4 陽性細胞画分を分取した。 細胞数計測後、 2¾FCS 添加リ ン酸緩衝食塩水に懸濁し、 細胞密度を 4 X 10⁷ /ml に 合わせた。

CD4 陽性細胞懸濁液に 1/100 容の PE標識ラ ッ ト抗マウス CD4(L3T4 ) 抗体（0.2mg/ml， clone R 4-5, Pharm i ngen社製） と 1/100 容の FI TC標識ラ ッ ト抗マウ ス CD45RB抗体（0.5fflg/ml， clone 16A, Pharming en社製） を添加した。 これを 20分間氷温下に静置するこ とにより抗 体を結合させた。 標識した細胞は、 2¾FCS 添加 RPM 11640培地を添加 して遠沈する こ とにより洗浄し、 2 FCS 添加リ ン酸緩衝食塩水に懸 濁し直し、 冷喑所に保持した。

標識した CD4 陽性細胞から、 CD4 陽性かつ CD45RB強陽性の細胞群 (CD4" CD45RB^{h l i; h}) をフ ロ ーサイ トメ 一タ一 （FACS Vantage, Beet on Dickenson社製） を用いて分取した。 本細胞群は、 CD4 、 CD45RB 両陽性細胞の内、 CD45RB発現量の多い上位約 50% に相当する。 得ら れた細胞は遠沈後、 4 X 10⁶ /ml となるよう に リ ン酸緩衝食塩水に 懸濁した。 細胞の純度は、 CD45RB強陽性細胞と して 97¾ であり、 そ の生存率は 98¾ であった。

高度に精製した本細胞群を 4 X 10⁵ 個ずつ （4 X 10⁶ /ml を 100 1 ずつ） 、 B- Π scid マウ スの腹腔内に移植するこ とにより炎 症性腸疾患モデルを作製した（Leach, . W. et al. , Am. J. Patho 1. (1996) 148, 1503-1515, Aranda, R. et al. , J. Immunol. (199 7) 158， 3464-3473)。 実験は、 処理方法により以下の 3 群にておこ なった。 （1) 細胞移植 · 抗 IL-6受容体抗体非投与群、 5 匹、 （2) 細 胞移植 · 抗 1L-6受容体抗体投与群、 3 匹、 （3) 細胞非移植群、 3 匹 抗！L-6受容体抗体 MR16-1の投与は以下のようにおこなつた。 まず 、 リ ン酸緩衝食塩水にて 20mg/ml と したものを 1 匹あたり 100 / 1 ずつ、 前記細胞を移植する 15— 30分前に腹腔内投与した。 1 週間後 、 リ ン酸緩衝食塩水にて 10mg/ml と したものを 1 匹あたり 100 1 ずつ腹腔内投与し、 これを一週毎に繰り返し 8 週間後まで継続した 。 抗体非投与群については、 リ ン酸緩衝食塩水を同様の手法により 投与した。

細胞移植後 8 〜 9 週間後にマウスの体重を測定した後、 大腸組織 (下行結腸部分） を採取し、 OCT compoundに浸けて- 80 °Cに冷却し 凍結させた。 これをク リ オスタ ッ 卜を用いて、 6 m の凍結切片を 作製した後、 10¾' ホルマリ ン液にて固定した。 固定した組織切片は 、 へマ トキン リ ン ' ェォシ ン（hematoxyl in- eosin) 法により重染色 をおこない、 組織学的に解析した。

薬効の評価は、 細胞移植により炎症性腸疾患を惹起する前と細胞 移植後 8 〜9 週間後との体重変化 （前者に対する比率で表示） なら びに組織学的解析によりおこなった。 組織学的解析では、 各マウ ス 組織について、 以下の 4 段階の炎症性腸疾患スコア （以下、 腸疾患 スコアと もいう） に分類するこ とで評価した（ 0， H. et al. , J. Autoimmuni ty (1997) 10, 455 - 459)。

炎症性腸疾患スコァ

Grade 0 (non)： 正常の BALB/cマウスと判別不能

Grade 1 (minimal)： 軽度の上皮組織肥厚が見られる。

Grade 2 (moderate)： Grade 1と 3 の中間

Grade 3 (severe)： 広範囲での炎症性浸潤と杯細胞の欠損を伴つ た著しい上皮組織の肥厚が見られる。

体重変化と炎症性腸疾患スコアの結果を表 1 に示した。

CD4 陽性 CD45強陽性細胞を移植されたマウ スは、 炎症性腸疾患を 発症し、 組織学的にも著しい炎症像が認められた。 また、 発症に伴 つて衰弱し、 体重は平均 11% 減少した。 一方、 抗 IL-6受容体抗体を 投与した群では、 統計学的に有意な体重減少の抑制が観察され、 細 胞移植前と同程度の体重を維持した。 また、 組織学的な炎症性腸疾 患スコアからも炎症性腸疾患が軽減されているこ とが明らかとなつ た。

尚、 体重変化の検定には、 最初に AN0VA 法（Analysis of varianc e， SPSS for windows ver.6, SPSS Inc. ) をおこなって有意性を確 認した後、 Bonferroni法による多重比較を用い、 危険率 5%以下で有 意性が認められた。

本モデルはヒ トの炎症性腸疾患と類似性が高く 、 したがって抗 IL -6受容体抗体が潰瘍性大腸炎又はク ロー ン病等の炎症性腸疾患の予 防又は治療剤と して有効であるこ とが明らかとなった。

表 1 抗 1レ6受容体抗体による体重減少と腸疾患悪化の抑制

体重変化は、 群の平均値土標準偏差で表記した。

腸疾患スコアは、 群の平均値で表記した。

参考例 1. ヒ ト可溶性 IL- 6受容体の調製

Yamasakiらの方法 (Yamasaki, K. et al. , Science (1988) 241, 825-828) に従い得られた Iい 6受容体をコ一 ドする cDNAを含むブラ ス ミ ド pBSF2R.236を用いて、 PCR 法により可溶性 1 L- 6受容体を作成 した。 プラス ミ ド pBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 IL- 6受 容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に揷人した。 IL- 6受容体 cDNAにス ト ップコ ドンを導入するよう にデザィ ンした合成オリ ゴプ ラ イ マ一を用いて、 イ ン ビ ト ロ ミ ュータ ジ エネ シス システム （Amer sham製） により、 PCR 法で Iい 6受容体 cDNAに変異を導入した。 この 操作によりス ト ップコ ドンがァ ミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 Iい 6受容体をコ一 ドする cDNAが得られた。

可溶性 IL-6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラス ミ ド pSV (Pharmacia製） と連結させ、 プラ ス ミ ド pSVL344 を得た。 dhfr の cDNAを含むプラス ミ ド pECEdhfrに Hind 111-Sal Iで.切断した可溶 性 Iい 6受容体 cDNAを揷入し、 CH0 細胞発現プラ ス ミ ド pECEdhfr344 を得た。

10 / のプラ ス ミ ド pECEdhfr344 を dhf r- CH0細胞株 DXB- 11 (Urla ub, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216-42 20) へカルシウムフ ォ スフ ヱイ ト沈降法 （Chen, C. et al.， Mol. Cel l. Biol. ( 1987) 7, 2745-2751 ) によ り 、 ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 し た。 ト ラ ンスフ エ ク 卜 した CH0 細胞を ImM グルタ ミ ン、 10% 透析 FC S 、 100U/ml のペニシ リ ンおよび 100〃 /mi のス ト レプ ト マイ シ ン を含むヌ ク レオシ ド不含 α MEM 選択培養液で 3 週間培養した。

選択された CH0 細胞を限界希釈法でス ク リ ーニ ングし、 単一の CH 0 細胞ク ローンを得た。 この CH0 細胞ク ロ一ンを 20nM- 200nMの濃度 のメ 卜 ト レキセ一 卜で増幅し、 ヒ ト可溶性 1L-6受容体産生 CH0 細胞 株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイ スコ―ブ改変ダル ペコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回収し、 培 養上清中の可溶性 IL- 6受容体の濃度を ELISA にて測定した。 その結 果、 培養上清中には可溶性 Iレ 6受容体が存在することが確認された 参考例 2. 抗ヒ ト 1L- 6抗体の調製

10 g の組換型 Iい 6 (Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. , 17: 41, 1988) をフ ロイ ン ト完全ア ジュバン ト と と もに BALB/cマウスを 免疫し、 血清中に抗 IL-6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを続 けた。 局部の リ ンパ節から免疫細胞を摘出 し、 ポ リ エチ レ ングリ コ —ル 1500を用いて ミ エ口一マ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイプリ ド —マを HAT 培養液を用いる 0iらの方法 （Selective Methods in Cel lular Immunology, W. H. Freeman and Co.， San Francisco, 351， 1 980 ) に従って選択し、 抗ヒ ト IL-6抗体を産生するハィブリ ド一マ を樹立した。

抗ヒ ト I L-6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のようにして I L -6結合ア ツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポ リ ビニル製の 96 穴マイ ク ロプレー 卜 （Dynatech Laboratories, Inc. 製， Al exandr ia, VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩衝液 ( pH 9.6) 中で 100 1 のャギ抗マウ ス Ig ( 10 / 1/ml, Cooper Biomedical, I nc製 Malvern, PA) により 4 °Cでー晚コ一 卜 した。 次いで、 プレー トを 100 1 の 1 %ゥ シ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS により 室温で 2 時間処理した。

これを PBS で洗浄した後、 100 z l のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにて一晩イ ンキュベー ト した。 プレー トを洗浄し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるよう に 標識組換型 iL-6を各穴 へ添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウ ンタ一 （Beckma n Gamma 9000, Beckman Instruments, Ful lerton, CA) で測疋した 。 216 ハイブリ ドーマク ロー ンのう ち 32のノヽイブリ ドーマク ロー ン が Iし- 6結合ァ ッセィにより陽性であった。 これらのク ロー ンのなか で最終的に安定な MH166. BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが産生 する抗^- 6抗体 MH 166 は IgGl /c型のサブタイプを有する。

ついで、 Iい 6依存性マウスハイブリ ドーマク 口一 ン MH60. BSF2 を 用いて MH166 抗体によるハイプリ ドーマの増殖に関する中和活性を 調べた。 MH60. BSF2 細胞を 1 X 10⁴ /200〃 1 /穴となるように分注し 、 これに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 0.5 Ci/ 穴の ³H チ ミ ジン （New England Nuclear, Boston, MA ) を加 えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフ ィ ルタ一ぺーパ 一上（こおき、 自動ノヽ —ベスター ( Labo Mash Science Co. , Tokyo, Japan ) で処理した。 コ ン ト ロールと してゥサギ抗 - 6抗体を用い た。

その結果、 MH166 抗体は -6により誘導される MH60. BSF2 細胞の 3 H チ ミ ジ ンの取込みを容量依存的に阻害した。 このこ とより、 MH 166 抗体は IL-6の活性を中和するこ とが明らかとなった。

参考例 3. 抗ヒ ト 1L 6受容体抗体の調製

Hirataらの方法 （Hirata, Y. et al. J. Immunol. , 143:2900-29 06, 1989) により作成した抗 IL-6受容体抗体 MT18を CNBrにより活性 ィ匕させたセフ ァ ロ —ス 4B (Pharmacia Fine Chemicals製， P i scataw ay, NJ) と添付の処方にしたがって結合させ、 6受容体 （Yamasa ki, . et al. , Science ( 1988) 241, 825-828) を精製した。 ヒ ト ミ エローマ細胞株 U266を 1 ジギ トニ ン （Wako Chemicals製） ， 10mM ト リエタノ ールァ ミ ン （_PH 7.8) および 0. 15M NaClを含む ImM p -パ ラア ミ ノ フ ヱニルメ タ ンスノレフ ォニルフルオラィ ドノヽィ ドロ ク ロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギ トニ ン緩衝液） で可溶化し、 セフ ァ ロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合した。 その後、 ビーズ をジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫するための部分精製 IL-6受 容体と した。

BALB/cマウスを 3 X 10⁹ 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL-6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL 6受容体への結合活性を調べた。 5 X 10⁷ 個のし' 266細胞を ^{3 5}S 一メ チォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギ トニン緩衝液で可 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセフ ァ ロース 4Bビ一 ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギ トニン緩衝液 （pH3.4 ) により ³⁵ S —メ チ ォニン標識 Iい 6受容体を流出させ、 0.025ml の 1M Tris ( H 7.4) で中和した。

0.05mlのハイプリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セフ ァ ロ ―ス （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セフ ァ ロ一スを上 記で調製した 0.005ml の ³⁵ S 標識 Iレ 6受容体溶液とと もにイ ンキュ ペー ト した。 免疫沈降物質を SDS-PAGEで分析し、 - 6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ド一マク ロー ン PM- 1を樹立した。 ハイプリ ドーマ PM- 1から産生さ れる抗体は、 ！gGl /c型のサブタイプを有する。

ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト 1L-6受容体に対する 1L -6の結合阻害活性をヒ ト ミ エ口一マ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組換型 Iい 6を大腸菌より調製し （Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (1988) 17， 41-45) 、 ボル ト ン—ハンター試薬 （New Engl an d Nuclear, Boston, MA ) により ^{1 25} I 標識した (Taga, T. et al . , J. Exp. Med. (1987) 166， 967-981 ) 。 4 x 10⁵ 個の U266細胞 を 1 時間、 70% (v/v ) のハイプリ ドーマ PM-1の培養上清および 14 OOOcpmの ' ²⁵ I 標識 Iい 6とともに培養した。 のサンプルを 4 00 u 1 のマイ ク ロ フ ユ一 ジポ リ エチ レ ンチューブに 300 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活性を測定した。

その結果、 ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体は、 IL-6の IL-6受 容体に対する結合を阻害するこ とが明らかとなった。

参考例 4. 抗マウス IL-6受容体抗体の調製

Sai to, T. et al. , J. Immunol. (1991) 147， 168- 173 に記載の 方法により、 マウ ス IL - 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体を調製 した。

マゥス可溶性 IL- 6受容体を産生する CH0 細胞を 10¾iFCSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清から抗マウス iL- 6受容体抗体 RS12 ( 上記 Saito, T. et al 参照） を Affigel 10ゲル （Biorad製） に固定 したァフ ィ 二ティ 一カラムを用いてマウス可溶性 IL- 6受容体を精製 した。

得られたマウス可溶性 IL-6受容体 50 z g をフロイ ン ト完全ア ジュ バン ドと混合し、 ウィ スターラ ッ トの腹部に注射した。 2 週間後か らはフロイ ン ト不完全アジュバン ドで追加免疫した。 45日目にラ ッ ト脾臓細胞を採取し、 2 X 10⁸ 個を 1 X 10⁷ 個のマウ ス ミ エローマ 細胞 P3U1と 50% の PEG1500 (Boehringer Mannheim 製） をもちいて 常法により細胞融合させた後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リ ーニングした。

ゥサギ抗ラ ッ ト IgG 抗体 （Cappel製） をコー ト したプレー トにハ イブリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウ ス可溶性 iL-6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL- 6受容体抗体およびアルカ リ フ ォ スフ ァタ一ゼ標識ヒッジ抗ゥサギ 1 gG による EL I SA 法によりマウ ス可溶性 Iい 6受容体に対する抗体を産生するハイブリ ドーマをスク リ ーニングした。 抗体の産生が確認されたハイプリ ドーマク ローン は 2 回のサブスク リ ーニングを行い、 単一のハイプリ ドーマク 口一 ンを得た。 このク ローンを MR16- 1と名付けた。

このハイプリ ドーマが産生する抗体のマウス 1L- 6の情報伝達にお ける中和活性を MH60. BSF2 細胞 （Matsuda, T. et al. , J. Immunol . (1988) 18, 951 - 956) を用いた ³ H チ ミ ジ ンの取込みで調べた。 96ゥ ヱルプレー トに MH60. BSF2 細胞を 1 x 10⁴ 個/ 200 1/ゥ ヱルと なるように調製した。 このプレー トに 10pg/ml のマウス iL-6と MR16 -1抗体又は RS12抗体を 12.3- 1000ng/ml加えて 37° (：、 5¾C0₂ で 44時間 培養した後、 1〃 Ci/ ゥ ヱルの ³H チ ミ ジンを加えた。 4 時間後に 3H チ ミ ジ ンの取込みを測定した。 その結果 MR16-1抗体は MH60. BSF 2 細胞の ³H チ ミ ジ ン取込みを抑制した。

したがって、 ハイプリ ド一マ MR16-1が産生する抗体は、 1レ6の！し -6受容体に対する結合を阻害するこ とが明らかとなつた。 産業上の利用可能性

本発明により、 抗 Iし- 6受容体抗体等の IL-6アンタゴニス 卜が炎症 性腸疾患の治療効果を有するこ とが示された。 したがって、 1L-6ァ ン タ ゴ二ス トはク ロー ン病又は潰瘍性大腸炎等の治療剤と して有用 であることが明らかにされた。

Claims

請 求 の 範 囲

I . イ ンターロイ キ ン - 6 ( - 6) ア ンタ ゴニス トを有効成分と し て含有する炎症性腸疾患の予防又は治療剤。

2. I L- 6ア ンタゴニス 卜が I L-6受容体に対する抗体である請求項

1 記載の予防又は治療剤。

3. IL- 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するモノ ク ロ一ナ ル抗体である請求項 2 に記載の予防又は治療剤。

4. IL-6受容体に対する抗体がヒ ト 1L-6受容体に対するモノ ク ロ ーナル抗体である請求項 3 に記載の予防又は治療剤。

5. IL- 6受容体に対する抗体がマウス 1L-6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体である請求項 3 に記載の予防又は治療剤。

6. IL- 6受容体に対する抗体が組換え型抗体である請求項 2〜 5 のいずれか 1 項に記載の予防又は治療剤。

7. ヒ ト 1L - 6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が PM - 1抗体であ る請求項 4 に記載の予防又は治療剤。

8. マウス - 6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が MR16 1抗体 である請求項 5 に記載の予防又は治療剤。

9. IL- 6受容体に対する抗体が iL-6受容体に対するキメ ラ抗体又 はヒ ト型化抗体である請求項 2 〜 4 のいずれか 1 項に記載の予防又 は治療剤。

1 0. IL-6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体であ る請求項 9 に記載の予防又は治療剤。

I I . 炎症性腸疾患が、 ク ロー ン病又は潰瘍性大腸炎である、 請 求項 1 〜 1 0 のいずれか 1 項に記載の予防又は治療剤。

1 2. IL- 6ア ンタ ゴニス トを有効成分と して含有する炎症性腸疾 患における体重減少抑制剤。

1 3 . IL- 6受容体に対する抗体を有効成分と して含有する炎症性 腸疾患における体重減少抑制剤。

1 4 . イ ンタ一ロイ キ ン 6 ( IL-6) ア ンタ ゴニス トを対象者に投 与するこ とを含んで成る炎症性腸疾患の予防又は治療方法。

1 5 . 1L-6アンタゴニス トが 1L- 6受容体に対する抗体である請求 項 1 4記載の方法。

1 6 . 1レ6受容体に対する抗体が！レ6受容体に対するモノ ク ロ一 ナル抗体である請求項 1 5 に記載の方法。

1 7 . IL - 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体である請求項 1 6 に記載の方法。

1 8 . IL-6受容体に対する抗体がマウス 1L-6受容体に対するモノ ク ロ一ナル抗体である請求項 1 6 に記載の方法。

1 9 . IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である請求項 1 5 〜 1 8 のいずれか 1 項に記載の方法。

2 0. ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が PM - 1抗体で ある請求項 1 7 に記載の方法。

2 1 . マウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が MR16 1抗 体である請求項 1 8 に記載の方法。

2 2 . IL- 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するキメ ラ抗体 又はヒ ト型化抗体である請求項 1 5 〜 1 7 のいずれか 1 項に記載の 方法。

2 3 . IL- 6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM-1抗体であ る請求項 2 2 に記載の方法。

2 4 . 炎症性腸疾患が、 ク ロ一ン病又は潰瘍性大腸炎である、 請 求項 1 4 〜 2 3 のいずれか 1 項に記載の方法。

2 5 . 1L-6アンタ ゴニス トを対象者に投与するこ とを含んで成る 炎症性腸疾患における体重減少を抑制する方法。

2 6. IL- 6受容体に対する抗体を対象者に投与するこ とを含んで 成る炎症性腸疾患における体重減少を抑制する方法。

2 7. 炎症性腸疾患の予防又は治療剤の製造のためのイ ンター口 ィキン - 6 ( IL-6) ア ンタ ゴニス 卜の使用。

2 8. IL-6ア ンタゴニス トが IL-6受容体に対する抗体である請求 項 2 7記載の使用。

2 9. Iし- 6受容体に対する抗体が 1L-6受容体に対するモノ ク ロ一 ナル抗体である請求項 2 8 に記載の使用。

3 0. IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である請求項 2 9 に記載の使用。

3 1 . IL- 6受容体に対する抗体がマウ ス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である請求項 2 9 に記載の使用。

3 2. 1レ6受容体に対する抗体が組換え型抗体である請求項 2 8 〜 3 1 のいずれか 1 項に記載の使用。

3 3. ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が PM-1抗体で ある請求項 3 0 に記載の使用。

3 4. マウス IL- 6受容体に対するモノ ク ロ一ナル抗体が MR16-1抗 体である請求項 3 1 に記載の使用。

3 5. IL-6受容体に対する抗体が 1レ 6受容体に対するキメ ラ抗体 又はヒ ト型化抗体である請求項 2 8〜 3 0 のいずれか 1 項に記載の 使用。

3 6 . IL- 6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM-1抗体であ る請求項 3 5 に記載の使用。

3 7. 炎症性腸疾患が、 ク ロー ン病又は潰瘍性大腸炎である、 請 求項 2 7 〜 3 6 のいずれか 1 項に記載の使用。

3 8. 炎症性腸疾患における体重減少抑制剤の製造のための IL - 6 ア ンタ ゴニス 卜の使用。

3 9 . 炎症性腸疾患における体重減少抑制剤の製造のための Iし - 6 受容体に対する抗体の使用。