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TWI726842B - 免疫活化抗原結合分子 - Google Patents

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TWI726842B
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井川智之
宮崎太郎
谷口健治
廣庭奈緒香
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日商中外製藥股份有限公司
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Abstract

本發明發現藉由使用具有癌專一性抗原結合分域、以及TNF超級家族結合分域或TNF受體超級家族結合分域之抗原結合分子，以只於癌專一性抗原表現細胞存在下發揮對於屬於TNF超級家族或TNF受體超級家族之因子之致效劑活性以活化免疫細胞，能夠維持抗腫瘤活性且避免肝毒性等副作用。再者，發現藉由和前述抗原結合分子併用具有癌專一性抗原結合分域與T細胞受體複合體結合分域之抗原結合分子，能避免副作用且提高前述抗腫瘤活性。

Description

免疫活化抗原結合分子
本發明係關於使用雙專一性抗體之新穎的癌治療法。
癌是全世界的死亡的主要原因之一。除了一部分的癌種類外，有不少是發現時已無法手術，而且為主要治療法的使用化學療法劑的治療的成效絕對不能說是高。癌難以治療的主要原因，不只是癌細胞本身的不均勻性，而且腫瘤微小環境據啟示也有重大的作用(非專利文獻1)。近年來，有人揭示無法切除的惡性黑色瘤等中利用使抑制性T細胞減弱的抗CTLA-4抗體有治癒的可能性(非專利文獻2)。此揭示啟示腫瘤免疫活化可能成為新的癌治療戰略的基軸。
於腫瘤免疫帶有重要作用的T細胞的活化據理解係因為：1)T細胞受體(TCR)對於腫瘤組織適合基因複合體(MHC)類別I分子所提示之抗原胜肽之結合及活化；2)T細胞表面上之共刺激分子對於抗原提示細胞上之配體之結合與活化的二種信號而成。再者，有人記載T細胞表面上之CD137(4-1BB)等屬於腫瘤壞死因子(TNF)超級家族、TNF受體超級家族的分子活化對於T細胞活化為重要(非專利文獻3)。
TNF超級家族及TNF受體超級家族包括CD137、 CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、GITRL等這些分子。CD137據報告不只在T細胞表面表現，在樹狀細胞(DC)、B細胞、NK細胞、嗜中性球等其他免疫細胞表面也有表現(非專利文獻4)。
已實證CD137致效劑抗體顯示抗腫瘤效果，實驗上顯示其主要依存於CD8陽性T細胞與NK細胞之活化(非專利文獻5)。但是臨床及非臨床上，CD137致效劑抗體之非專一性肝毒性導致之副作用成為問題，藥劑之開發沒有進展(非專利文獻6；非專利文獻7)。作為其副作用之主要原因，據啟示係和介由抗體不變區向Fcγ受體之結合有關(非專利文獻8)。又，屬於TNF受體超級家族之受體之致效劑抗體為了在活體內發揮致效劑活性，據報告須利用Fcγ受體表現細胞(FcγRII表現細胞)進行抗體交聯(非專利文獻9)。亦即，因為CD137致效劑抗體之抗腫瘤效果之藥效和肝毒性等副作用均和抗體向Fcγ受體之結合有關，所以抗體對於Fcγ受體之結合若能增強，則可期待藥效提高，但肝毒性的副作用也會增大，若使抗體與Fcγ受體之結合減少，副作用減小，但藥效也會減小，至今為止，尚未有人報告藥效與副作用分離的CD137致效劑抗體。而且，CD137致效劑抗體之抗腫瘤效果本身也絕不強，希望能避免毒性且同時進一步增大藥效。
雙專一性抗體的特徵為具有至少2個結合分域，是對於該技術領域中具有通常知識者而言為周知的分子形式。其中，2個結合分域中的1個專一性地結合於癌表面抗原 且第2結合分域結合於T細胞表面抗原之CD3的這類分子已有人建構(非專利文獻10)。此雙專一性單鏈抗體會癌抗原依存性地將T細胞活化，並發揮抗腫瘤效果。
Glypican3(GPC3)是一群介隔糖基磷脂醯肌醇(glycosylphosphatidylinositol)而結合於細胞表面之硫酸肝黏糖蛋白多糖，亦即屬於Glypican家族之蛋白質(非專利文獻11)。Glypican於細胞之增殖、分化、游走扮演重要作用。GPC3在由外科切除或切片獲得之肝細胞癌組織的70%以上表現，在相鄰的非腫瘤性的肝臟病變、大部分的成人組織中則完全不表現或幾乎不表現(非專利文獻12；非專利文獻13)。且，在肝細胞癌組織GPC3表現高的患者據報告預後不佳(非專利文獻14)，GPC3據認為是對於肝細胞癌有前景的標的分子。
先前技術文獻 非專利文獻
非專利文獻1：Hanahan, Cell, 2011, 144, 646-74
非專利文獻2：Prieto, Clin Cancer Res. 2012, 18, 2039-47
非專利文獻3：Summers, Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51
非專利文獻4：Vinay, Cell Biol Int., 2009, 33, 453-65
非專利文獻5：Houot, Blood, 2009, 114, 3431-8
非專利文獻6：Ascierto, Semin Oncol., 2010, 37, 508-16
非專利文獻7：Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 59, 1223-33
非專利文獻8：Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
非專利文獻9：Li, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110(48), 19501-6
非專利文獻10：Brandl, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1551-63
非專利文獻11：Filmus, J. Clin. Invest., 2001, 108, 497-501
非專利文獻12：Zhu-Zu-W, Gut, 2001, 48, 558-564
非專利文獻13：Yamauchi, Mod. Pathol., 2005, 18, 1591-1598
非專利文獻14：Yorita, Liver Int., 2010, 1, 120-131
本發明係有鑑於如上述情況而生，目的在於提供避免毒性且同時活化免疫細胞，發揮優良的抗腫瘤效果的對於TNF超級家族或TNF受體超級家族有致效劑活性的抗原結合分子，並提供含有該抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物、或利用該醫藥組合物治療癌的方法。
本案發明人等發現：只有TNF超級家族結合分域或只有TNF受體超級家族結合分域之抗原結合分子沒有活化免疫細胞的作用，但是藉由具有癌專一性抗原結合分域與TNF超級家族結合分域、或具有癌專一性抗原結合分域與TNF受體超級家族結合分域之抗原結合分子，只於癌專一性抗原表現細胞存在下對於屬於TNF超級家族或TNF受體超級家族之因 子發揮致效劑活性，藉此免疫細胞活化，能維持抗腫瘤活性且同時避免肝毒性等副作用。再者，發現：該抗原結合分子和具有癌專一性抗原結合分域與T細胞受體複合體結合分域之抗原結合分子組合使用，藉此可避免副作用且同時可提高其抗腫瘤活性，乃完成本發明。
亦即，本發明如下。
[1]一種抗原結合分子，包含下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)腫瘤壞死因子(TNF)超級家族結合分域或腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域。
[2]如[1]之抗原結合分子，更包含FcRn結合分域。
[3]如[2]之抗原結合分子，其中，FcRn結合分域為對於Fcγ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
[4]如[1]至[3]中任一項之抗原結合分子，其中，TNF超級家族結合分域或TNF受體超級家族結合分域為CD137結合分域。
[5]如[1]至[4]中任一項之抗原結合分子，其為雙專一性抗體。
[6]一種醫藥組合物，含有如[1]至[5]中任一項之抗原結合分子作為有效成分。
[7]如[6]之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
[8]如[6]之醫藥組合物，係癌治療用之組合物。
[9]一種醫藥組合物，係將如[1]至[5]中任一項之第1抗原結合分子與第2抗原結合分子組合而成； 該第2抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)T細胞受體複合體結合分域。
[10]如[9]之醫藥組合物，其中，第2抗原結合分子係更含有FcRn結合分域之抗原結合分子。
[11]如[10]之醫藥組合物，其中，FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低的抗體的Fc區。
[12]如[9]至[11]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為T細胞受體結合分域。
[13]如[9]至[11]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為CD3結合分域。
[14]如[9]至[13]中任一項之醫藥組合物，其中，第2抗原結合分子為雙專一性抗體。
[15]如[9]至[14]中任一項之醫藥組合物，其係摻合了第1抗原結合分子與第2抗原結合分子。
[16]如[9]至[14]中任一項之醫藥組合物，係併用了第1抗原結合分子與第2抗原結合分子。
[17]如[9]至[14]中任一項之醫藥組合物，第1抗原結合分子與第2抗原結合分子係同時投予。
[18]如[9]至[14]中任一項之醫藥組合物，第1抗原結合分子與第2抗原結合分子係分別投予。
[19]如[9]至[18]中任一項之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
[20]如[9]至[18]中任一項之醫藥組合物，係癌治療用之 組合物。
[21]一種醫藥組合物，含有第1抗原結合分子作為有效成分並為了併用第2抗原結合分子；該第1抗原結合分子含有下列分域：癌專一性抗原結合分域、及(2)腫瘤壞死因子(TNF)超級家族結合分域或腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域；該第2抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域、及(2)T細胞受體複合體結合分域。
[22]如[21]之醫藥組合物，其係誘導細胞傷害之組合物。
[23]如[21]之醫藥組合物，其係癌治療用之組合物。
[24]如[21]至[23]中任一項之醫藥組合物，其中，第1抗原結合分子及/或第2抗原結合分子係更含有FcRn結合分域之抗原結合分子。
[25]如[24]之醫藥組合物，其中，FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
[26]如[21]至[25]中任一項之醫藥組合物，其中，TNF超級家族結合分域或TNF受體超級家族結合分域為CD137結合分域、或CD40結合分域。
[27]如[21]至[26]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為T細胞受體結合分域。
[28]如[21]至[26]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為CD3結合分域。
[29]如[21]至[28]中任一項之醫藥組合物，其中，第1抗原結合分子及/或第2抗原結合分子為雙專一性抗體。
[30]如[21]至[29]中任一項之醫藥組合物，係和第2抗原結合分子同時投予。
[31]如[21]至[29]中任一項之醫藥組合物，係和第2抗原結合分子分別投予。
[32]一種醫藥組合物，係含有第2抗原結合分子作為有效成分且為了併用第1抗原結合分子；該第2抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域、及(2)T細胞受體複合體結合分域；該第1抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)腫瘤壞死因子(TNF)超級家族結合分域或腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域。
[33]如[32]之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
[34]如[32]之醫藥組合物，係癌治療用之組合物。
[35]如[32]至[34]中任一項之醫藥組合物，其中，第1抗原結合分子及/或第2抗原結合分子係更含有FcRn結合分域之抗原結合分子。
[36]如[35]之醫藥組合物，其中，FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
[37]如[32]至[36]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為T細胞受體結合分域。
[38]如[32]至[36]中任一項之醫藥組合物，其中，T細胞受體複合體結合分域為CD3結合分域。
[39]如[32]至[38]中任一項之醫藥組合物，其中，TNF超級家族結合分域或TNF受體超級家族結合分域為CD137結合分域、或CD40結合分域。
[40]如[32]至[39]中任一項之醫藥組合物，其中，第1抗原結合分子及/或第2抗原結合分子為雙專一性抗體。
[41]如[32]至[40]中任一項之醫藥組合物，係和第1抗原結合分子同時投予。
[42]如[32]至[40]中任一項之醫藥組合物，係和第1抗原結合分子分別投予。
[43]一種誘導細胞傷害、抑制細胞增殖、活化對於癌細胞或含癌細胞之腫瘤組織之免疫、或治療或預防癌之方法，包括投予如前述[1]至[5]中任一項之抗原結合分子或前述[6]至[42]項中任一項之醫藥組合物之步驟。
[44]如前述[1]至[5]中任一項之抗原結合分子或前述[6]至[42]中任一項之醫藥組合物，使用在細胞傷害之誘導、細胞增殖之抑制、對於癌細胞或含癌細胞之組織之免疫之活化或癌之治療或預防。
[45]一種如前述[1]至[5]中任一項之抗原結合分子之用途，係用在前述[6]至[42]中任一項之醫藥組合物之製造。
[46]一種製造如前述[6]至[42]中任一項之醫藥組合物之方法，包含使用如前述[1]至[5]中任一項之抗原結合分子之步驟。
又，本發明係關於一種癌之治療或預防方法，其特徵為：將本發明之抗原結合分子或本發明之醫藥組合物對於須治療之患者投予。又，本發明係關於用於本發明之方法之套組，包含本發明之抗原結合分子。又，本發明係關於將本發明之抗原結合分子用在製造用於誘導細胞傷害之醫藥組合物(例如癌治療或預防用之醫藥組合物)。又，本發明係關於用於使用在本發明之方法之本發明之抗原結合分子或本發明之醫藥組合物。
第1圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗小鼠CD137抗體所致之T細胞活化作用之結果之圖。Ctrl mIgG1代表陰性對照小鼠IgG1抗體。
第2圖揭示各種分子形式之抗小鼠CD137抗體獲致之T細胞活化作用之概念圖。
第3圖揭示抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體所致之GPC3抗原依存性的T細胞活化作用的概念圖。
第4圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體所致之GPC3抗原依存性T細胞活化作用之結果圖。
第5圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體之抗體不變區改變所致對於GPC3抗原依存性T細胞活化作用之影響之結果圖。
第6圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗人類GPC3/抗小鼠 CD137雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體之混合物所致T細胞活化增強作用之結果圖。Ctrl hIgG1代表陰性對照人類IgG1抗體(Alexis公司)。
第7圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗小鼠CD137抗體於CT26腫瘤小鼠先天性模型(syngenic model)之抗腫瘤效果之圖。箭號代表抗體投予時。
第8圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗小鼠CD137抗體在CT26腫瘤小鼠先天性模型中對於血中天冬胺酸胺基轉移酶(AST)之影響之圖。
第9圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗小鼠CD137抗體於CT26腫瘤小鼠先天性模型中對於血中丙胺酸胺基轉移酶(ALT)之影響之圖。
第10圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗小鼠CD137抗體於CT26腫瘤小鼠先天性模型中對於血中總膽紅素之影響之圖。
第11圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗小鼠CD137抗體於CT26腫瘤小鼠先天性模型之肝臟病理組織學觀察到的照片。a及d代表投予溶媒，b及e代表投予1D8-MB492，c及f代表投予GPC3 ERY22-3-1D8後的小鼠代表例的肝臟切片以蘇木精‧伊紅染色而得的病理組織照片。箭頭代表肝細胞的改性‧壞死，*代表發炎的觀察現象。
第12圖揭示抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體及抗人類GPC3/小鼠CD3雙專一性抗體之併用在LLC腫瘤小鼠先天性模型的抗腫瘤效果。箭號代表抗體投予時。
第13圖揭示構成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之Fc區之胺基酸殘基與kabat之EU編號法(本說明書也稱為EU INDEX)間的關係圖。
第14圖-1揭示為了評價抗人類CD137抗體與片段化人類CD137-Fc融合蛋白質之結合之ELISA之結果。圖中「Non」代表未固定有抗原之井(Non-Coating)中的ELISA呈色值。
第14圖-2揭示將第14圖-1所示各樣本之ELISA呈色值除以Non-Coating(Non)中的ELISA呈色值(對於未固定抗原之井之結合)而得之值(對於Non coating之比值)之圖。
第15圖揭示抗人類CD137抗體之IFNγ誘導活性之圖。
第16圖揭示抗人類CD137抗體之T細胞活化作用與結合曲線。
第17圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體之混合物所致T細胞活化增強作用之結果。Ctrl hIgG1代表陰性對照人類IgG1抗體。
第18圖揭示以IFN-γ ELISA評價抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體GPC3 FAE-BMS之T細胞活化作用之結果圖。Ctrl hIgG1代表陰性對照人類IgG1抗體。
第19圖揭示以B細胞活化IL-6的產生量評價各種抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體之介由CD137之致效劑活性。CtrlhIgG1代表陰性對照人類IgG1抗體。
以下定義係為了容易理解本說明書之說明而提 供。
抗原結合分子
本發明中的「抗原結合分子」只要是包含本發明之「結合分域」之分子即可，不特別限定，也可更含有約5個胺基酸以上之長度之胜肽、蛋白質。不限於來自生物之胜肽、蛋白質，也可為由例如人工設計的序列構成的多胜肽。又，可為天然多胜肽、或合成多胜肽、重組多胜肽等中之任一者。
本發明之抗原結合分子之理想例可列舉包含抗體之Fc區所含之FcRn結合分域的抗原結合分子。延長對於活體內投予之蛋白質之血中半減期之方法，為人熟知者為對於目的蛋白質附加抗體之FcRn結合分域，並利用介由FcRn之回收(recycling)機能之方法。
本發明中，「FcRn結合分域」只要是對於FcRn有結合活性者即可，不特別限定，例如：將FcRn作為抗原之抗體之可變區、Fab、抗體之Fc區、該等之片段。本發明之理想態樣之一可列舉抗體之Fc區、或包含Fc區中之FcRn結合區之片段。在此，「Fc區」可使用例如來自天然型IgG之Fc區。天然型IgG包括和天然找到的IgG為相同之胺基酸序列，意指屬於免疫球蛋白gamma基因實質上編碼的抗體的類別的多胜肽。例如天然型人類IgG，意指天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3、天然型人類IgG4等。天然型IgG也包括由其自然產生的變異體等。就人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區而言，因多型而產生的多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其任一者。尤其就人類IgG1之序列而言，EU編號法356~358號之胺基酸序列可為DEL也可為EEM。
抗體之Fc區，例如有IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM類型之Fc區存在。本發明之抗體之Fc區可使用例如來自天然型人類IgG抗體之Fc區。本發明之Fc區可使用例如從天然型IgG之不變區，具體而言從將天然型人類IgG1作為起源之不變區(序列編號：1)、將天然型人類IgG2作為起源之不變區(序列編號：2)、將天然型人類IgG3作為起源之不變區(序列編號：3)、將天然型人類IgG4作為起源之不變區(序列編號：4)而來之Fc區。天然型IgG之不變區也包括從其自然產生之變異體等。
如此的抗體的Fc區，可藉由將例如單株抗體等抗體以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使片段吸附於Protein A管柱、或Protein G管柱，之後利用適當的溶出緩衝液等使其溶出而可理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是藉由適當設定pH等酵素之反應條件而能消化單株抗體等抗體者即可，無特殊限定，例如：胃蛋白酶、無花果酶等。
抗體之結構同型(isotype)係由不變區之結構決定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各結構同型之不變區分別稱為Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。構成人類Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4之Fc區之多胜肽之胺基酸序列例示於序列編號：5、6、7、8。構成各胺基酸序列之胺基酸殘基、與kabat之EU編號法(本說明書也稱為EU INDEX)之關係示於第13圖。
Fc區係指包括2條輕鏈及以在2條重鏈間形成鏈間雙硫鍵的方式含有CH1分域及CH2分域間之不變區之一部分的2條重鏈的F(ab')2以外的區域。本說明書揭示之構成抗原結合分子之Fc區可藉由將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使吸附於Protein A管柱之級分予以再溶出而理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是可藉由適當設定pH等酵素之反應條件而將全長抗體消化使其限制性地生成F(ab')2者即可，無特殊限定，例如：胃蛋白酶、無花果酶等。
本發明之FcRn結合分域尤佳為對於Fcγ受體之結合活性降低的分域為較佳。在此，Fcγ受體(本說明書中有時記載為Fcγ受體、FcγR或FcgR)係指能結合於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之Fc區的受體，實質上也指Fcγ受體基因所編碼的蛋白質的家族的任何成員。人類中，此家族中包含包括同功型(isoform)FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；同功型FcγRIIa(包括副型H131(H型)及R131(R型))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及包括FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及包括同功型FcγRIIIa(包括副型V158及F158之)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，及各種未被發現的人類FcγR類或FcγR同功型或副型，但不限定於此等。FcγR包括來自人類、小鼠、大鼠、兔及猴者，但不限定於此等，可為各種生物來源。小鼠FcγR類包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)，及各種未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同功型或副型，但不限 定於此等。如此的Fcγ受體的理想例可以列舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。
FcγR中，存在帶有ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)之活性型受體與帶有ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)之抑制型受體。FcγR分類為FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、FcγRIIIb之活性型FcγR，及FcγRIIb之抑制型FcγR。
FcγRI之多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載於NM_000566.3及NP_000557.1，FcγRIIa之多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載為BC020823.1及AAH20823.1，FcγRIIb之多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載於BC146678.1及AAI46679.1，FcγRIIIa之多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載於BC033678.1及AAH33678.1，FcγRIIIb之多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載於BC128562.1及AAI28563.1(RefSeq註冊號)。又，FcγRIIa中，存在FcγRIIa的131號的胺基酸取代成組胺酸(H型)或精胺酸(R型)的2種基因多型(J.Exp.Med,172,19-25,1990)。又，FcγRIIb存在FcγRIIb之232號胺基酸取代成異白胺酸(I型)或蘇胺酸(T型)之2種基因多型(Arthritis.Rheum.46：1242-1254(2002))。又，FcγRIIIa存在FcγRIIIa之158號胺基酸取代成纈胺酸(V型)或苯基丙胺酸(F型)的2種基因多型(J.Clin.Invest.100(5)：1059-1070(1997))。又，FcγRIIIb存在NA1型、NA2型的2種基因多型(J.Clin.Invest.85：1287-1295(1990))。
對於Fcγ受體之結合活性是否為低，可藉由FACS、ELISA格式、ALPHAscreeen(Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等周知方法確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHAscreeen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Screen)，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。結合於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子進行生物學性交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。
例如：抗原結合分子含有抗體之Fc區作為FcRn結合分域時，則準備具有野生型Fc區之抗原結合分子、與具有已加諸用以使對於Fcγ受體之結合變化之胺基酸變異的變異Fc區之抗原結合分子，使提供者珠和經生物素(biotion)標記的抗原結合分子結合，使接受者珠和經麩胱甘肽S轉移酶(GST)加標籤的Fcγ受體結合。於具有變異Fc區之抗原結合分子存在下，具有野生型Fc區之抗原結合分子會和Fcγ受體交互作用並產生520-620nm的信號。具有變異Fc區之抗原結合分子未加標籤時，則具有野生型Fc區之抗原結合分子會和Fcγ受 體間之交互作用競爭。藉由將競爭結果表示的螢光減少進行定量，可決定相對性的結合親和性。抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等進行生物素化係為公知。作為將Fcγ受體以GST加標籤的方法，可適當採用在保持了編碼為Fcγ受體之多核苷酸與編碼為GST之多核苷酸於讀框內融合而得的融合基因能表現之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱進行精製的方法等。將獲得之信號使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等軟體，擬合於利用非線形回歸解析的的一部位競爭(one-site competition)模型，可理想地解析。
將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表面之溶媒之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感應圖)。從感應圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。
本說明書中，「對於Fcγ受體之結合活性降低」，例如指依據上述解析方法，和作為對照之具有Fc區之抗原結合分子之結合活性比較，待驗抗原結合分子之結合活性顯示50%以下，較佳為45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下，尤佳為10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下之結合活性。
成為對照之抗原結合分子，可以適當使用具有含有例如：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體之Fc區之分域的抗原結合分子。該Fc區之結構記載於序列編號：1(RefSeq註冊號AAC82527.1之N末端有A附加)、序列編號：2(RefSeq註冊號AAB59393.1之N末端有A附加)、序列編號：3(RefSeq註冊號CAA27268.1之N末端有A附加)、序列編號：4(RefSeq註冊號AAB59394.1之N末端有A附加)。又，當使用具有某特定結構同型抗體之Fc區之變異體的抗原結合分子作為待驗物質時，藉由使用具有該特定結構同型之抗體之Fc區的抗原結合分子作為對照，可驗證該變異體擁有之變異所致對於Fcγ受體之結合活性的效果。以上述方式，可適當製作具有已驗證對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區之變異體的抗原結合分子。
作為如此的變異體，例如依EU編號法指定之胺基酸231A-238S之缺失(WO 2009/011941)、C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.Rheumatol(2007)34,11)、C226S、C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1),47-54)、C226S、 C229S、E233P、L234V、L235A(Blood(201607)109,1185-1192)等變異體為公知。
亦即，具有構成特定結構同型之抗體之Fc區的胺基酸中之依EU編號法指定的下列任一胺基酸：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位被取代之Fc區之抗原結合分子為理想例。就Fc區之起源抗體之結構同型而言，不特別限定，可以適當使用將IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體作為起源之Fc區，可理想地利用將天然型人類IgG1抗體作為起源之Fc區。
可適當使用具有已施以例如構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一取代(數字代表依EU編號法指定之胺基酸殘基之位置，位在數字前之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位在數字後之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)：(a)L234F、L235E、P331S、(b)C226S、C229S、P238S、(c)C226S、C229S、(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
之Fc區、或具有231位至238位之胺基酸序列缺失之Fc區的抗原結合分子。
又，也可適當使用具有已施以構成IgG2抗體之Fc 區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一取代(數字代表依EU編號法指定之胺基酸殘基之位置，位在數字前之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位在數字後之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)：(e)H268Q、V309L、A330S、P331S(f)V234A17(g)G237A(h)V234A、G237A(i)A235E、G237A(j)V234A、A235E、G237A
的Fc區的抗原結合分子。
又，也可以適當使用具有施以構成IgG3抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一取代(數字代表依EU編號法指定之胺基酸殘基之位置、位在數字前之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基、位在數字後之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)：(k)F241A(l)D265A(m)V264A
之Fc區之抗原結合分子。
又，也可適當使用具有施以構成IgG4抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一取代(數字代表依EU編號法指定之胺基酸殘基之位置，位在數字前之單字母的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位在數字後之單字母 的胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)：(n)L235A、G237A、E318A(o)L235E(p)F234A、L235A
之Fc區的抗原結合分子。
就其他理想例而言，可列舉具有構成天然型人類IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一胺基酸：233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位取代為對應之IgG2或IgG4中之此EU編號法所對應之胺基酸的Fc區的抗原結合分子。
就其他理想例，可列舉具有構成天然型人類IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之下列任一個或更多胺基酸：234位、235位、297位取代為其他胺基酸之Fc區之抗原結合分子為理想例。取代後存在之胺基酸之種類不特別限定，尤佳為具有234位、235位、297位中之任一個或更多胺基酸取代為丙胺酸之Fc區之抗原結合分子。
就其他理想例而言，可列舉具有構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號法指定之265位之胺基酸取代為其他胺基酸之Fc區的抗原結合分子為理想例。取代後存在之胺基酸之種類不特別限定，尤佳為具有265位之胺基酸取代為丙胺酸之Fc區之抗原結合分子。
本發明之抗原結合分子含有之「癌專一性抗原結合分域」、「腫瘤壞死因子(TNF)超級家族結合分域」、「腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域」及「T細胞受體複 合體結合分域」(以下將此等4個結合分域總稱為抗原結合分域)，意指對各自的抗原即癌專一性抗原、屬於TNF超級家族之因子、屬於TNF受體超級家族之因子、或T細胞受體複合體之一部分或全部專一性結合之區域，例如作為結合分域，可列舉包含抗體之抗原結合區的區域。抗原之分子量大時，抗體之抗原結合區可只結合在抗原的特定部分。該特定部分稱為抗原決定基(epitope)。抗原結合分域可由一或多數之抗體之可變分域提供。較佳為抗原結合分域包括抗體輕鏈可變區(VL)與抗體重鏈可變區(VH)。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等為理想例。
在此，「癌專一性抗原」係指能夠區別癌細胞與健常細胞的由癌細胞表現的抗原，例如包括伴隨細胞之惡性化而表現之抗原、細胞於癌化時出現在細胞表面、蛋白質分子上的異常糖鏈。具體而言，例如：ALK受體(多向因子(pleiotrophin)受體)、多向因子、KS 1/4胰臟癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸磷酸、前列腺專一性抗原(PSA)、黑色素瘤關連抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺專一性膜抗原、癌性胚抗原(CEA)、多型上皮黏蛋白抗原、人類乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1及LEA等結腸直腸腫瘤關連抗原、Burkitt淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人類B淋巴瘤抗原-CD20、CD33、神經節苷脂(ganglioside)GD2、神經節苷脂 GD3、神經節苷脂GM2及神經節苷脂GM3等黑色素瘤專一性抗原、腫瘤專一性移植型細胞表面抗原(TSTA)、T抗原、DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒之封套(envelope)抗原等病毒所誘導之腫瘤抗原、結腸之CEA、5T4癌胎兒滋養層糖蛋白質及膀胱腫瘤癌胎兒抗原等癌胎兒抗原α-fetoProtein、人類肺癌抗原L6及L20等分化抗原、纖維肉瘤之抗原、人類白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖蛋白質、神經脂質、EGFR(上皮增殖因子受體)等乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16及HER2抗原(p185HER2)、多型上皮黏蛋白(PEM)、惡性人類淋巴球抗原-APO-1、胎兒紅血球找到的I抗原等分化抗原、成人紅血球找倒的初期內胚葉I抗原、移植前之胚、胃癌找到的I(Ma)、乳腺上皮找到的M18、M39、骨髓細胞找到的SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌找到的D156-22、TRA-1-85(血液群H)、睪丸及卵巢癌找到的SCP-1、結腸癌找到的C14、肺癌找到的F3、胃癌找到的AH6、Y半抗原、胚胎性癌細胞找到的Ley、TL5(血液群A)、A431細胞找到的EGF受體、胰臟癌找到的E1系列(血液群B)、胚胎性癌細胞找到的FC10.2、胃癌抗原、腺癌找到的CO-514(血液群Lea)、腺癌找到的NS-10、CO-43(血液群Leb)、A431細胞之EGF受體找到的G49、結腸癌找到的MH2(血液群ALeb/Ley)、結腸癌找到的19.9、胃癌黏蛋白、骨髓細胞找到的T5A7、黑色素瘤找到的R24、胚胎性癌細找到的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2，及M1：22：25：8及4~8細胞階段的胚胎找到的SSEA-3及SSEA-4、皮下T細胞淋巴瘤抗原、MART-1抗原、sialyl Tn(STn)抗原、結腸癌抗原 NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12變異體A、腺癌抗原ART1、腫瘤伴隨性關連腦-睪丸癌抗原(癌神經抗原MA2、腫瘤伴隨性神經抗原)、神經癌腹部抗原2(NOVA2)、血液細胞癌抗原基因520、腫瘤關連抗原CO-029、腫瘤關連抗原MAGE-C1(癌/睪丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b及MAGE-X2、癌-睪丸抗原(NY-EOS-1)、YKL-40及上述多胜肽中之任一者的片段或對此等修飾而得之結構等(前述修飾磷酸基、糖鏈等)、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、serial SSEA-1(SLX)、HER2、PSMA、CEA、CLEC12A等。作為成為本發明之癌專一性抗原結合分域之對象之癌專一性抗原，尤宜是表現在細胞表面者，如此的癌專一性抗原，例如：CD19、CD20、EGFR、HER2、EpCAM、EREG。
又，作為屬於「TNF超級家族」或「TNF受體超級家族」之因子，已知有貢獻於各種免疫細胞之活化的具有3聚體結構之配體及該配體所結合之3聚體結構之受體(Nat.Rev.Immunol.,2012,12,339-51)。屬於TNF超級家族或TNF受體超級家族之因子，例如：CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、GITRL。理想的因子，例如CD137、CD40。更理想的因子，例如CD137。
又，「T細胞受體複合體」可以為T細胞受體本身，也可以為和T細胞受體一起構成T細胞受體複合體之承接(adaptor)分子。承接分子，宜為CD3。
T細胞受體可為可變區也可為不變區，T細胞受體 結合分域所結合的抗原決定基宜為存在於不變區之抗原決定基。不變區之序列可列舉例如RefSeq註冊號CAA26636.1之T細胞受體α鏈(序列編號：9)、RefSeq註冊號C25777之T細胞受體β鏈(序列編號：10)、RefSeq註冊號A26659之T細胞受體γ1鏈(序列編號：11)、RefSeq註冊號AAB63312.1之T細胞受體γ2鏈(序列編號：12)、RefSeq註冊號AAA61033.1之T細胞受體δ鏈(序列編號：13)之序列。
本發明中，使用「CD3結合分域」作為T細胞受體複合體結合分域時，CD3結合分域可由一或多數的抗體可變分域提供。較佳為CD3結合分域包括CD3抗體的輕鏈可變區(VL)與CD3抗體的重鏈可變區(VH)。如此的CD3結合分域，可列舉「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等為理想例。
本發明之CD3結合分域只要是結合在構成人類CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈序列存在之抗原決定基即可，也可為結合於任一抗原決定基者。本發明中，較佳為使用結合在人類CD3複合體之ε鏈之細胞外區域存在之抗原決定基的包括CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與CD3抗體之重鏈可變區(VH)的CD3結合分域。如此的CD3結合分域，可理想地使用包括OKT3抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,4914-4917)、各種公知之CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與CD3抗體之重鏈可變區(VH)的CD3結合分域。又，可適當使用將藉由把構成人類CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈依前述方法對於理想的動物進行免疫而取 得的有理想性質的CD3抗體作為起源的CD3結合分域。成為CD3結合分域之起源之CD3抗體可適當使用如下列適當人類化的抗體、人類抗體。構成CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈之結構，其多核苷酸序列記載於序列編號：14(NM_000073.2)、16(NM_000732.4)及18(NM_000733.3)，其多胜肽序列記載於序列編號：15(NP_000064.1)、17(NP_000723.1)及19(NP_000724.1)(括弧內代表RefSeq註冊號)。
又，本發明之「抗原結合分子」之理想態樣之一，可列舉包括本發明之抗體之可變區的抗體。
本發明提供之抗體，例如以下[1]至[9]的抗體。
[1]一種抗體，具有序列編號66記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號85記載之胺基酸序列作為輕鏈可變區。
[2]一種抗體，具有序列編號67記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號86記載之胺基酸序列作為輕鏈可變區。
[3]一種抗體，具有序列編號70記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號89記載之胺基酸序列作為輕鏈可變區。
[4]一種抗體，具有序列編號76記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號95記載之胺基酸序列作為輕鏈可變區。
[5]一種抗體，具有序列編號77記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號96記載之胺基酸序列作為輕鏈可變 區。
[6]一種抗體，具有序列編號78記載之胺基酸序列作為重鏈可變區，及序列編號97記載之胺基酸序列作為輕鏈可變區。
[7]如[1]~[6]中任一項之抗體，具有序列編號99記載之胺基酸序列作為重鏈不變區，及序列編號59記載之胺基酸序列或序列編號60記載之胺基酸序列作為輕鏈不變區。
[8]一種抗體，和如[1]~[7]中任一項之抗體有同等活性。
[9]一種抗體，和如[1]至~[7]項中任一項之抗體所結合之抗原決定基結合在相同抗原決定基。
如上述[8]之抗體中，「同等活性」係指向CD137之致效劑活性為如上述[1]~[7]中任一項之抗體之結合活性的70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上。
又，本發明也提供上述[9]記載之和本發明揭示之抗CD137抗體所結合之抗原決定基結合於相同抗原決定基的抗體。如此的抗體例如可依以下方法獲得。
待驗抗體是否和某抗體共有抗原決定基，可以利用兩者對於相同抗原決定基的競爭來確認。抗體間之競爭可利用交叉阻斷分析等來檢驗。例如競爭ELISA分析為理想的交叉阻斷分析。具體而言，於交叉阻斷分析，將微滴定板之井上包被的CD137蛋白質於候選的競爭抗體存在下、或非存在下預溫育後，添加本發明之抗CD137抗體。井中之CD137蛋白質結合的本發明之抗CD137抗體的量，間接地相關於對於向相同抗原決定基之結合進行競爭的候選競爭抗體(待驗抗體)的結 合能力。亦即，對於相同抗原決定基之待驗抗體的親和性愈大，則本發明之抗CD137抗體向已包被CD137蛋白質的井的結合量愈低，且待驗抗體向已包被CD137蛋白質之井之結合量增加。
結合於井(well)之抗體量可藉由預先將抗體予以標記而輕易地測定。例如，經生物素標記的抗體，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體和適當的基質以測定。利用過氧化酶等酵素標記的交叉阻斷分析，特別稱為競爭ELISA分析。抗體可利用能檢測或測定的其他標記物質進行標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
又，於待驗抗體具有來自和本發明之抗CD137抗體為不同種之不變區時，結合於井之抗體之量亦可以藉由認識此抗體之不變區的標記抗體進行測定。或即使是來自同種的抗體，當類別不同時，可藉由識別各類別的抗體來測定結合於井之抗體之量。
和於候選的競爭抗體非存在下實施之對照試驗中獲得之結合活性比較，候選抗體只要能夠阻斷至少20%，較佳為至少20~50%，更佳為至少50%的抗CD137抗體的結合即可，該候選競爭抗體可結合於和本發明之抗CD137抗體實質上相同的抗原決定基，或是對相同抗原決定基之結合競爭之抗體。
和上述[1]至[7]中任一項之抗體所結合之抗原決定基結合在相同抗原決定基的抗體的理想例，例如：認識CD137蛋白質中之具有SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKE CSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC之序列(序列編號113)之區域的抗體。
再者，可列舉認識CD137蛋白質中之具有DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC之序列(序列編號108)之區域的抗體。
藉由將上述抗人類CD137抗體改變成和癌專一性抗原抗體(例如：抗人類GPC3抗體)之雙專一性抗體，並且評價癌專一性抗原依存的CD137致效劑能力，能提供發揮所望之抗腫瘤效果之抗癌抗原/抗人類CD137雙專一性抗體。
作為本發明之一非限定態樣，提供包含癌專一性抗原結合分域，及人類CD137結合分域的雙專一性抗體。
本發明提供之雙專一性抗體，例如以下[i]至[iv]的抗體。
[i]一種雙專一性抗體，作為人類CD137結合分域具有序列編號122記載之胺基酸序列(重鏈可變區)及序列編號123記載之胺基酸序列(輕鏈可變區)。
[ii]一種雙專一性抗體，作為人類CD137結合分域具有序列編號124記載之胺基酸序列(重鏈可變區)，及序列編號82記載之胺基酸序列(輕鏈可變區)。
[iii]一種雙專一性抗體，作為人類CD137結合分域具有序列編號125記載之胺基酸序列(重鏈可變區)，及序列編號84記載之胺基酸序列(輕鏈可變區)。
[iv]一種抗體，結合於和如[i]~[iii]中任一項之雙專一性抗體所結合之抗原決定基為相同抗原決定基。
癌專一性抗原結合分域所含有的重鏈可變區及輕鏈可變區，可因應標的癌抗原，由該技術領域中具有通常知識者適當選擇結合於該癌抗原之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列。
本發明也提供上述[iv]記載之結合於和本發明揭示之抗癌專一性抗原/抗人類CD137雙專一性抗體所結合之抗原決定基為相同抗原決定基的雙專一性抗體。如此的抗體可依例如以下方法獲得。
待驗抗體是否和某抗體共有抗原決定基，可以利用兩者對於相同抗原決定基的競爭來確認。抗體間之競爭可利用交叉阻斷分析等來檢驗。例如競爭ELISA分析為理想的交叉阻斷分析。具體而言，於交叉阻斷分析，將微滴定板之井上包被的CD137蛋白質於候選的競爭抗體存在下、或非存在下預溫育後，添加本發明之抗CD137抗體。井中之CD137蛋白質結合的本發明之抗CD137抗體的量，間接地相關於對於向相同抗原決定基之結合進行競爭的候選競爭抗體(待驗抗體)的結合能力。亦即，對於相同抗原決定基之待驗抗體的親和性愈大，則本發明之抗CD137抗體向已包被CD137蛋白質的井的結合量愈低，且待驗抗體向已包被CD137蛋白質之井之結合量增加。
結合於井之抗體量可藉由預先將抗體予以標記而輕易地測定。例如，經生物素標記的抗體，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體和適當的基質以測定。利用過氧化酶等酵素標記的交叉阻斷分析，特別稱為競爭ELISA分析。抗體可利用能檢測或測定的其他標記物質進行標記。具體而言，放射標記 或螢光標記等為公知。
又，於待驗抗體具有來自和本發明之抗CD137抗體為不同種之不變區時，結合於井之抗體之量亦可以藉由認識此抗體之不變區的標記抗體進行測定。或即使是來自同種的抗體，當類別不同時，可藉由識別各類別的抗體來測定結合於井之抗體之量。
和於候選的競爭抗體非存在下實施之對照試驗中獲得之結合活性比較，候選抗體只要能夠阻斷至少20%，較佳為至少20~50%，更佳為至少50%的抗CD137抗體的結合即可，該候選競爭抗體可為結合於和本發明之抗CD137抗體實質上相同的抗原決定基、或對相同抗原決定基之結合競爭之抗體。
作為另一態樣，關於待驗抗體和其他抗體之結合的競爭或交叉競爭的能力，可以使用該發明所屬之技術領域已知之標準的結合分析，例如BIAcore分析、或流式細胞術等由該技術領域中具有通常知識者適當決定。又，決定抗原決定基之空間構形之方法，包括例如：X射線結晶學及二維核磁共振(參照Methods inMolecular Biology，G.E.Morris監修，Vol.66，Epitope Mapping Protocols(1996))。
就結合於上述[i]至[iii]中任一項記載之雙專一性抗體所結合之人類CD137抗原決定基為相同抗原決定基之雙專一性抗體之理想例，例如認識人類CD137蛋白質中之具SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC之序列(序列編號 113)之區域、具DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC之序列(序列編號108)之區域、具LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC之序列(序列編號111)之區域、或具有LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC之序列(序列編號106)之區域之雙專一性抗體。
更佳為認識例如：人類CD137蛋白質中之具LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC之序列(序列編號111)之區域、或具LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTC之序列(序列編號106)之區域之雙專一性抗體。
作為本發明之一非限定態樣，提供包含癌專一性抗原結合分域，及人類CD40結合分域之雙專一性抗體。癌專一性抗原結合分域所含之重鏈可變區及輕鏈可變區，可因應標的癌抗原由該技術領域中具有通常知識者適當選擇結合於該癌抗原之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列。
抗體之結合活性
抗體之抗原結合活性之測定可使用公知方法(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。可使用例如：ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)、FACS、ALPHAscreeen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法或螢光免疫法等。又，可列舉測定抗體對於在細 胞表現的抗原的結合活性的方法，例如：前述Antibodies A Laboratory Manual中的359-420頁記載的方法。
又，作為測定在懸浮於緩衝液等的細胞的表面上表現的抗原與和該抗原對抗之抗體的結合的方法，特別宜採用使用流式細胞儀的方法。使用的流式細胞儀，例如：FACSCantoTM II,FACSAriaTM,FACSArrayTM,FACSVantageTM SE,FACSCaliburTM(以上，BD Biosciences公司)、EPICS ALTRA HyPerSort,Cy28tomics FC 500,EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上，Beckman Coulter公司)等。
作為待驗CD137抗體對於抗原之結合活性之理想測定方法，舉一例可列舉以認識和表現CD137之細胞反應之待驗抗體的經FITC標記之二次抗體染色後，利用FACSCalibur(BD公司)實施測定，並使用CELL QUEST Software(BD公司)解析其螢光強度的方法。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或利用部分的或完全合成製造的免疫球蛋白。抗體可從其天然存在的血漿、血清等天然資源、產生抗體的融合瘤細胞的培養上清單離，或可藉由使用基因重組等方法而部分或完全地合成。抗體，例如免疫球蛋白之結構同型及此等結構同型的次類別為理想例。人類之免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM的9種類別(結構同型)。本發明之抗體可含有該等結構同型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
製作具有所望結合活性之抗體之方法在該技術領域中具有通常知識者為公知，可取得成為多株或單株抗體的形式。本發明之抗體可理想地製作來自哺乳動物的單株抗體。來自哺乳動物之單株抗體，包括由融合瘤產生者，及由利用基因工程的方法以含有抗體基因之表現載體轉形的寄主細胞產生者等。
用以取得抗體之免疫哺乳動物，不限於特定動物，宜考慮和為了製作融合瘤之細胞融合使用的親代細胞間的適合性進行選擇較佳。一般，宜使用囓齒類動物，例如：小鼠、大鼠、倉鼠、或兔、猴等為理想。
依公知方法將上述動物利用敏化抗原(sensitized antigen)進行免疫。例如一般方法為：藉由將敏化抗原對於哺乳動物的腹腔內或皮下注射以投予而實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)、生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋好的敏化抗原視須要和通常的佐劑，例如佛洛依德完全佐劑混合、乳化後，將該敏化抗原對於哺乳動物每隔4至21日投予，投予數次。又，敏化抗原免疫時可使用適當擔體。特別當使用分子量小的部分胜肽作為敏化抗原時，有時將已結合白蛋白、鑰孔血藍素(keyhole limpet hemocyanin)等擔體蛋白質的該敏化抗原胜肽進行免疫較理想。
又，產生所望抗體之融合瘤，也可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係藉由使已投予構築載體DNA使成為編碼為抗原蛋白質之基因能在免疫動物中表現之態樣的該免疫動物中，敏化抗原在該免疫動物之活體內表現以給予 免疫刺激的免疫方法。比起將蛋白質抗原對於免疫動物投予的一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-能維持膜蛋白質之結構而給予免疫刺激
-無須精製免疫抗原
為了利用DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現抗原蛋白質的DNA對於免疫動物投予。編碼為抗原蛋白質之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入到適當的表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可適當地使用pcDNA3.1等市售表現載體。作為將載體對於活體投予之方法，可利用一般使用的方法。例如，可藉由已吸附表現載體之金粒子利用基因槍(gene gun)對於免疫動物個體的細胞內導入以實施DNA免疫。
如上方式，將哺乳動物免疫並確認血清中之和抗原結合之抗體力價上昇後，從哺乳動物收集免疫細胞，並供細胞融合。理想的免疫細胞，特別可使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記(selection marker)。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死 滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞，例如：P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等為理想。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例 如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌 呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。所望的抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現抗體所結合抗原之細胞。用於篩選之較佳細胞為使該抗原強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之抗原的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於抗原強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生所望單株抗體之融合瘤。
或將表現成為對象抗原的細胞固定化，且抗體對於該抗原表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將抗原表現細胞固定化在ELISA平板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠 免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入，及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
為了取得編碼為抗體之可變區(V區)之cDNA，通常從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從 融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類別而各不相同的鹼基序列。因此，次類別理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之 基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之固定區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於抗原之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸所望的抗原表現細胞之步驟、(2)檢測該抗原表現細胞與抗體之間的結合之步驟，及(3)選擇與該抗原表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與該抗原表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與該抗原表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用該抗原表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類別之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬 菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗體之V區的cDNA插入到適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體不變區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於框架內融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指不變區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具不變區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體不變區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於框架內融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入到表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。將表現的多胜肽的信號序列之羧基末端部分切斷，抗體可分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取 得表現編碼為抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 94/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之癌專一性抗原結合分域、腫瘤壞死因子受體超級家族(TNFRSF)、T細胞受體複合體結合分域。
真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero等
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等畢赤酵母 (Pichia)屬
絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，抗體基因藉由於框架內插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入山羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌山羊體內。從接受胚胎的山羊產生之基因轉殖山羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖山羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖山羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，當使用含有、抗體可變區之分域作為該分子中之各種抗原結合分域時，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可 使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的各種結合分域所使用之抗體之可變區，通常由夾在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針對4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於框架內連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為 小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於框架內融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於框架內融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
噬菌體呈現法以外，作為使用人類抗體庫利用淘選取得人類抗體之技術，已有使用無細胞轉譯系之技術、在細胞或病毒表面提示抗原結合分子之技術、使用乳劑的技術等為已知。例如：使用無細胞轉譯系之技術可使用：藉由去除終止密碼子等而介由核糖體形成mRNA與經轉譯之蛋白質之複合體的核糖體呈現法、利用嘌呤黴素(puromycin)等化合物使基因序列和經轉譯之蛋白質共價鍵結之cDNA呈現法、mRNA呈現 法、使用對應核酸之結合蛋白質形成基因和轉譯之蛋白質之複合體之CIS呈現法等。又，作為在細胞或病毒表面提示抗原結合分子之技術，可使用噬菌體呈現法，除此以外可使用E.coli呈現法、格蘭氏陽性菌呈現法、酵母呈現法、哺乳類細胞呈現法、病毒呈現法等。作為使用乳劑之技術，可使用使基因及轉譯關連分子內包在乳劑中的體外病毒呈現法等。該等方法已為公知(Nat Biotechnol.2000 Dec；18(12)：1287-92、Nucleic Acids Res.2006；34(19)：e127、Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Mar 2；101(9)：2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Jun 22；101(25)：9193-8、Protein Eng Des Sel.2008 Apr；21(4)：247-55、Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Sep 26；97(20)：10701-5、MAbs.2010 Sep-Oct；2(5)：508-18、MethodsMol Biol.2012；911：183-98)。
本發明中，「專一性」係指專一性地結合的分子中的其中之一的分子對於其結合的一或多數對方的分子以外的分子不顯示某種顯著結合的狀態。又，也使用在抗原結合分域對於在某抗原中所含之多數抗原決定基當中的特定抗原決定基為專一性的情形。又，當抗原結合分域所結合之抗原決定基包括在多數不同抗原中，具有該抗原結合分域之抗原結合分子可和包括該抗原決定基的各種抗原結合。
又，意指抗原中存在之抗原決定位的「抗原決定基(epitope)」，係代表本說明書揭示之抗原結合分子中之各種結合分域所結合的抗原上的部位。故，例如：抗原決定基可由其結構來定義。又，也可利用認識該抗原決定基之抗原結合分 子對於抗原之結合活性來定義該抗原決定基。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定基之胺基酸殘基來指定抗原決定基。又，抗原決定基為糖鏈時，可利用特定的糖鏈結構來特定抗原決定基。
直線狀抗原決定基係包括認識胺基酸一次序列之抗原決定基的抗原決定基。直線狀抗原決定基，普通在固有序列中包括至少3個，最普通為至少5個，例如約8~約10個、6~20個胺基酸。
立體結構抗原決定基，和直線狀抗原決定基成為對照，係指包括抗原決定基之胺基酸之一次序列並非認識的抗原決定基的單一規定成分的抗原決定基(例如：胺基酸之一次序列不一定是規定抗原決定基之抗體所認識之抗原決定基)。立體結構抗原決定基有可能包括相對於直線狀抗原決定基為較多數目的胺基酸。關於立體結構抗原決定基之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維結構。例如：當蛋白質分子折疊成三維結構時，形成立體結構抗原決定基的某胺基酸及/或多胜肽主鏈成為並列，使抗體能認識抗原決定基。決定抗原決定基之立體結構之方法，包括例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標記及電磁常磁性共振分光學，但不限定於此等。例如：參照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
下列列舉確認待驗抗原結合分子向癌專一性抗原中之抗原決定基之結合之方法，但是確認向其他結合分域之對象抗原中之抗原決定基之結合的方法也可依下列例示而適當 實施。
例如可依如下方式確認包括對抗癌專一性抗原之抗原結合分域的待驗抗原結合分子認識於該抗原分子中存在之線狀抗原決定基。為了上述目的，例如可合成包括構成癌專一性抗原之細胞外分域的胺基酸序列的線狀胜肽。該胜肽可以化學合成。或利用癌專一性抗原之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，利用基因工程的方法獲得。然後，評價包括構成細胞外分域之胺基酸序列而得的線狀胜肽，和包括對抗癌專一性抗原之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用將已固定化的線狀胜肽作為抗原的ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據在該抗原結合分子對於表現癌專一性抗原之細胞之結合中，線狀胜肽所致之抑制的程度，可以明白對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗可明白該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
上述包括對抗抗原之抗原結合分域的待驗抗原結合分子是否認識立體結構抗原決定基，可依以下方式確認。例如：包括對抗癌專一性抗原之抗原結合分域的抗原結合分子當接觸癌專一性抗原表現細胞時會強力結合於該細胞，另一方面，該抗原結合分子對於包括構成固定有癌專一性抗原之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽則實質上不結合時等。在此，實質上不結合係指為對於抗原表現細胞之結合活性之80%以下，通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
測定包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子對於抗原表現細胞之結合活性的方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用將抗原表現細胞作為抗原之ELISA、FACS(fluorescence activated cell sorting)的原理進行評價。
ELISA格式中，包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子對於抗原表現細胞之結合活性可藉由比較因酵素反應生成之信號的水平而定量地評價。亦即，在已固定抗原表現細胞之ELISA板添加待驗抗原結合分子，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記抗體來檢測已結合於該細胞之待驗抗原結合分子。或於FACS，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，並決定對於抗原表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可以比較待驗抗原結合分子對於抗原表現細胞之結合活性。
待驗抗原結合分子對於於懸浮在緩衝液等的細胞表面上表現之抗原的結合，可利用流式細胞儀檢測。流式細胞儀已知例如下的裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司之商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)
例如作為上述包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子對於抗原之結合活性之理想測定方法，可舉以下方法為一例。首先，以認識會和表現抗原之細胞反應的待驗抗原結合分子的經FITC標記的二次抗體進行染色。將待驗抗原結合分子利用適當的理想緩衝液稀釋，將該抗原結合分子調整成所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。然後，利用FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度與細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映在使用CELL QUEST Software(BD公司)解析而得之螢光強度，亦即Geometric Mean之值。亦即，藉由取得該Geometric Mean之值，可以測定由待驗抗原結合分子之結合量所表示的待驗抗原結合分子的結合活性。
本發明之包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子是否和某抗原結合分子共有抗原決定基，可以藉由兩者對於相同抗原決定基之競爭來確認。抗原結合分子間之競爭可利用交叉阻斷分析等檢測。例如競爭ELISA分析為理想的交叉阻斷分析。
具體而言，於交叉阻斷分析，將包被於微滴定板之井上的抗原於成為候選者之競爭抗原結合分子存在下、或非存在下預溫育後，添加待驗抗原結合分子。結合於井中之抗原之待驗抗原結合分子之量，和對於相同抗原決定基之結合進行競爭的成為候選者的競爭抗原結合分子的結合能力間接地相 關。亦即若競爭抗原結合分子對於同一抗原決定基之親和性愈大，則待驗抗原結合分子對於包被了抗原的井的結合活性愈低。
介由抗原而結合於井之待驗抗原結合分子的量可藉由預先將抗原結合分子予以標記而輕易地測定。例如，經生物素標記的抗原結合分子，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體和適當的基質以測定。利用過氧化酶等酵素標記的交叉阻斷分析，特別稱為競爭ELISA分析。抗體可利用能檢測或測定的其他標記物質進行標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
和於候選的競爭抗原結合分子非存在下實施之對照試驗中獲得之結合活性比較，競爭抗原結合分子只要能夠阻斷至少20%，較佳為至少20~50%，更佳為至少50%的包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子的結合即可，該待驗抗原結合分子可結合於和競爭抗原結合分子所結合者為實質上相同的抗原決定基，或是對相同抗原決定基之結合競爭之抗原結合分子。
當已鑑別本發明之包括抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定基之結構時，可以藉由比較兩者的抗原結合分子對於已在構成該抗原決定基之胜肽導入了胺基酸變異的胜肽的結合活性而評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子是否共有抗原決定基。
如此的結合活性之測定方法，可藉由比較例如待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於在前述ELISA格式 已導入變異之線狀胜肽的結合活性而測定。作為ELISA以外之方法，可藉由利用定量使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流入管柱後在溶出液中溶出之抗原結合分子對於已結合於管柱之該變異胜肽之結合活性而測定。使變異胜肽例如和GST之融合胜肽吸附於管柱的方法為公知。
又，鑑別的抗原決定基為立體抗原決定基時，可依以下方法評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子是否共有抗原決定基。首先製備表現成為抗原結合分域之對象之抗原的細胞和表現已於抗原決定基導入變異之抗原的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而得的細胞懸浮液添加待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子。其次，對於已經過適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能認識待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之經FITC標記之抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定經標記抗體染色的細胞的螢光強度與細胞數。待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之濃度可藉由以理想的緩衝液適當稀釋成所望濃度後使用。例如可以使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映在使用CELL QUEST Software(BD公司)解析而得的螢光強度，亦即Geometric Mean之值。亦即，藉由獲取該Geometric Mean之值，可測定由標記抗體之結合量表達的待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子的結合活性。
又，本發明之「抗原結合分子」係在單一多胜肽鏈內包括形成本發明之「抗體之可變區」之重鏈及輕鏈兩者，但也可為欠缺不變區的抗體片段。如此的抗體片段，例如：雙 體抗體(diabody；Db)、scFv、單鏈抗體、sc(Fv)2、sc(Fab')2。
Db係由2條多胜肽鏈構成的二聚物(Holliger P et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404，097號、W093/11161號等)，各多胜肽鏈在同鏈中以L鏈可變區(VL)及H鏈可變區(VH)彼此無法結合的程度的短的例如：5個殘基左右的連結子結合。
在同一多胜肽鏈上編碼的VL與VH因為其間的連結子短，無法形成單鏈可變區片段，係藉由二聚化而形成2個抗原結合部位。
又，本說明書中，「scFv」、「單鏈抗體」、或「sc(Fv)2」的用語，係在單一多胜肽鏈內包括來自重鏈及輕鏈兩者的可變區，但也意指欠缺不變區之抗體片段。一般，單鏈抗體更包括為了能進行抗原結合的形成所望結構的位在VH分域與VL分域之間之多胜肽連結子。單鏈抗體在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷，Rosen48burg，及、Moore編，Springer-Verlag,New York,269~315(1994)已由Pluckthun詳細研究。同樣，參考國際專利出願公開WO1988/001649及美國專利第4,946,778號及同第5,260,203號。於特定態樣中，單鏈抗體可為雙專一性，及/或可人類化。
scFv係構成Fv之VH與VL利用胜肽連結子連結成的抗原結合分域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16),5879-5883)。利用該胜肽連結子，能使VH與VL保持靠近狀態。
sc(Fv)2係二條VL與二條VH之4個可變區以胜肽 連結子等連結子予以連結成單鏈的單鏈抗體(J Immunol.Methods(1999)231(1-2),177-189)。此二個VH與VL可能來自不同的單株抗體。例如：Journal of Immunology(1994)152(11),5368-5374揭示之認識同一抗原中存在之2種抗原決定基之雙專一性(bispecific sc(Fv)2)亦為理想例。sc(Fv)2可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法製作。例如：可藉由將scFv利用胜肽連結子等連結子連結以製作。
本說明書中，作為構成sc(Fv)2之抗原結合分域之結構，可列舉特徵為二條VH與二條VL以單鏈多胜肽之N末端側作為基點而按VH、VL、VH、VL([VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL])的順序排列的抗體，但二條VH與二條VL的順序不特別限於上述構成，可以為任意順序。例如可如以下順序。
[VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL]
[VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH]
[VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL]
[VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH]
[VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]
sc(Fv)2之分子形態在WO2006/132352亦有詳細記載，該技術領域中具有通常知識者可依該等記載，為了製作本說明書揭示之抗原結合分子而適當製作所望的sc(Fv)2。
在此，Fv(variable fragment)係指從由抗體之輕鏈可變區(VL(light chain variable region))與抗體之重鏈可變區(VH(heavy chain variableregion))的配對構成的抗體而來的抗 原結合分域的最小單位。1988年Skerr與與Pluckthun發現藉由在細菌的信號序列的下游插入了抗體基因的大腸菌中誘導該基因的表現，能以均勻且保持活性的狀態從大腸菌的胞外質級分製備(Science(1988)240(4855),1038-1041)。從胞外質級分製備的Fv，VH與VL以對於抗原有結合的態樣締合。
又，本發明之抗原結合分子也可以接合PEG等攜帶體(carry)高分子、抗癌劑等有機化合物。也可插入糖鏈附加序列，並為了獲得理想效果而適當附加糖鏈。
作為結合抗體可變區之連結子，可以使用已揭示能利用基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如參照：Protein Engineering,9(3),299-305,1996)之連結子等，但本發明中以胜肽連結子為較佳。胜肽連結子之長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。sc(Fv)2包含3個胜肽連結子時，可使用均為同長度的胜肽連結子，也可使用不同長度的胜肽連結子。
例如：胜肽連結子的情形可列舉：
Ser Gly‧Ser Gly‧Gly‧Ser Ser‧Gly‧Gly Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：20)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：21)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：22)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：23)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：24)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：25)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：26)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：27)
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：22))n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：23))n
[n為1以上之整數]等。惟胜肽連結子之長度、序列可因應目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。
合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
將4個抗體可變區結合時，通常須3個連結子，可全使用相同連結子，也可使用不同的連結子。
又，「Fab」由一條輕鏈及一條重鏈的CH1區及可變區構成。Fab分子的重鏈無法和其他重鏈分子形成雙硫鍵。
「F(ab')2」及「Fab'」，係指藉由將免疫球蛋白(單株抗體)利用為蛋白質分解酵素之胃蛋白酶或木瓜酶等處理以製造，於鉸鏈區中之2條H鏈間存在的雙硫鍵的前後消化生成的抗體片段。例如：藉由將IgG以木瓜酶處理，將鉸鏈區中之2條H鏈間存在的雙硫鍵的上游切斷，可製造由VL(L鏈可變區)與CL(L鏈不變區)構成之L鏈，及由VH(H鏈可變區)與CHγ1(H鏈不變區中之γ1區)構成之H鏈片段，在C末端區利用雙硫鍵結合而得的相同的2個抗體片段。此等2個相同的抗體片段各稱為Fab'。
「F(ab')2」包括2條輕鏈，及以在鏈間之雙硫鍵形成於2個重鏈間的方式包括CH1分域及CH2分域之一部分不變區的2條重鏈。構成本說明書揭示之抗原結合分子之F(ab')2可藉由將具有所望抗原結合分域之全長單株抗體等利用胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使Fc片段吸附於Protein A管柱並除去以理想地取得。該蛋白質分解酵素，只要是可藉由適當設定pH等酵素的反應條件而能將全長抗體消化成生成限制性的F(ab')2者即可，無特殊限定，例如：胃蛋白酶、無花果酶等。
本發明之「抗原結合分子」之一理想態樣，可列舉多重專一性抗體。使用對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區作為多重專一性抗體之Fc區時，也可適當使用將多重專一性抗體作為起源之Fc區。本發明之多重專一性抗體尤佳為雙專一性抗體。
多重專一性抗體之締合化，可以應用對於抗體H 鏈之第二不變區(CH2)或H鏈之第三不變區(CH3)之界面導入電荷性排斥以抑制不欲之H鏈彼此締合的技術(WO2006/106905)。
於對於CH2或CH3之界面導入電荷性排斥而抑制不欲之H鏈彼此的締合的技術中，在H鏈的其他不變區的界面接觸的胺基酸殘基，例如相對應於CH3區中之EU編號法356號的殘基、EU編號法439號的殘基、EU編號法357號的殘基、EU編號法370號的殘基、EU編號法399號的殘基、EU編號法409號的殘基的區域。
更具體而言，例如可為在包括2種H鏈CH3區域之抗體中，從第1H鏈CH3區中之以下(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組中選出之1組至3組胺基酸殘基為有同種電荷的抗體；(1)為H鏈CH3區含有之胺基酸殘基且係EU編號法356位及439位之胺基酸殘基、(2)為H鏈CH3區含有之胺基酸殘基且係EU編號法357位及370位之胺基酸殘基、(3)為H鏈CH3區含有之胺基酸殘基且係EU編號法399位及409位之胺基酸殘基。
又，可為在和上述第1的H鏈CH3區不同的第2的H鏈CH3區中，從前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出之胺基酸殘基之組且和前述第1的H鏈CH3區中之有同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組對應的1組至3組胺基酸殘基，係和前述第1的H鏈CH3區中的對應胺基酸殘基具有相反電荷的抗體。
上述(1)~(3)記載的各胺基酸殘基於締合時彼此靠 近。該技術領域中具有通常知識者可針對所望之H鏈CH3區或H鏈不變區，採用利用市售軟體的同源性模擬(homology modeling)等來找出上述(1)~(3)記載之胺基酸殘基所對應的部位，能適當將該部位之胺基酸殘基供改變。
上述抗體中，「具有電荷之胺基酸殘基」例如宜從以下(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基中選擇較佳；(a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)、(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述抗體中，「具有同種電荷」，係指例如：2個以上的胺基酸殘基中任一者具有上述(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基。「具有相反電荷」，係指例如：2個以上的胺基酸殘基中的至少1個胺基酸殘基具有上述(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基時，其餘的胺基酸殘基具有在不同群所含之胺基酸殘基。
在理想態樣中，上述抗體中的第1的H鏈CH3區與第2的H鏈CH3區也可利用雙硫鍵交聯。
本發明中供改變之胺基酸殘基不限於上述抗體之可變區或抗體之不變區之胺基酸殘基。若為該技術領域中具有通常知識者，可針對多胜肽變異體或異種多聚體採用使用市售軟體的同源模擬等，找出形成界面的胺基酸殘基，並以控制締合的方式，將該部位之胺基酸殘基供改變。
又，本發明之多重專一性抗體之締合化可更使用其他公知技術。將位在抗體的其中一H鏈可變區的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob；突起)，位在另一H鏈的相對可變區的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole；空隙)，藉此能將突起配置 於空隙，以有效率地發生具有Fc區之有不同胺基酸的多胜肽彼此間的締合(WO1996/027011、Ridgway JB et al.,Protein Engineering(1996)9,617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology(1998)16,677-681、US20130336973)。
此外，本發明之多重專一性抗體之形成可更使用其他公知技術。藉由使用抗體其中1條H鏈的CH3的一部分為和此部分對應的來自IgA的序列，另1條H鏈的CH3的互補的部分導入和此部分對應的來自IgA的序列而得的strand-exchange engineered domain CH3，能利用CH3的互補的締合化而有效率地引起具不同序列之多胜肽之締合化(Protein Engineering Design & Selection,23；195-202,2010)。使用此公知技術也能有效率地目的多重專一性抗體形成。
此外，多重專一性抗體之形成，也可用以下技術：WO2011/028952、WO2014/018572、Nat Biotechnol.2014 Feb；32(2)：191-8.記載之利用抗體之CH1與CL之締合化、利用VH、VL之締合化之抗體製作技術、使用WO2008/119353、WO2011/131746記載之分別製備的單株抗體彼此而製作雙專一性抗體之技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768、WO2013/063702記載之控制抗體重鏈之CH3間之締合之技術、製作由WO2012/023053記載之2種輕鏈與1種重鏈構成之雙專一性抗體之技術、利用Christoph等人(Nature Biotechnology Vol.31,p 753-758(2013))記載之分別表現由1條H鏈與1條L鏈構成之抗體之單條鏈的2個細菌細胞株的製作雙專一性抗體的技術等。
多重專一性抗體之形成之一態樣可列舉：如上述，將2種單株抗體於還原劑存在下混合，使核鉸鏈的雙硫鍵開裂後使其再締合而獲得異二聚化的雙專一性抗體的方法(FAE)，藉由於CH3區之交互作用界面導入靜電交互作用(WO2006/106905)，能於再締合時更有效率地誘發異二聚化(WO2015/046467)。因為使用了天然型IgG的FAE，再締合係隨機發生，故理論上只能以50%的效率獲得雙專一性抗體，但該方法能以高產率製造雙專一性抗體。
又，即使無法以良好效率形成目的之多重專一性抗體，仍可藉由從產生的抗體之中將目的之多重專一性抗體予以分離、精製而獲得本發明之多重專一性抗體。例如：藉由於2種H鏈的可變區導入胺基酸取代並賦予等電點的差，能將2種的同體(homebody)與目的之異抗體以離子交換層析精製之方法已有人報告(WO2007114325)。又，作為精製異體(heterobody)的方法，至今為止已有人報告：使用Protein A來精製由和Protein A結合之小鼠IgG2a之H鏈與未和Protein A結合之大鼠IgG2b之H鏈構成之異二聚化抗體之方法(WO98050431、WO95033844)。而且，也可使用藉由將IgG與ProteinA之結合部位即EU編號法435號及436號胺基酸殘基取代為Tyr、His等向ProteinA之結合力不同的胺基酸而得的H鏈，以使各H鏈與Protein A之交互作用變化，並使用Protein A管柱，而只有效率地精製異二聚化抗體。
又，也可取得不同的多數能賦予H鏈結合能力的共通L鏈，作為多重專一性抗體之共通L鏈使用。藉由將如此 的共通L鏈與不同的多數H鏈基因導入到細胞而使IgG表現，能以良好效率表現多重專一性IgG(Nature Biotechnology(1998)16,677-681)。選擇共通H鏈時，可利用對應於任意的不同H鏈且顯示高結合能力的共通L鏈的方法(WO2004/065611)。
又，本發明之Fc區可適當使用Fc區之C末端之異質性有所改善的Fc區。更具體而言，提供構成IgG1、IgG2、IgG3或IgG4為起源之Fc區的二條多胜肽的胺基酸序列當中依EU編號法指定之446位之甘胺酸，及447位之離胺酸為缺失的Fc區。
該等技術可以組合多數，例如組合2種以上使用。又，該等技術也可適當地分別使用在欲締合的2條H鏈。再者，該等技術也可組合使用在上述對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區。又，本發明之抗原結合分子，可為已施加上述改變者為基礎，並另外製作有相同胺基酸序列之抗原結合分子者。
本發明之抗原結合分子(第1抗原結合分子)可包含前述(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)腫瘤壞死因子(TNF)超級家族結合分域、或腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域，其結構不限定。第1抗原結合分子藉由含有此等2個結合分域，為表現屬於TNF超級家族或TNF受體超級家族之分子之細胞，能將表現癌專一性抗原之細胞或含有該細胞之腫瘤組織中所含之細胞予以專一性活化，對於表現癌專一性抗原之該細胞或含有該細胞之腫瘤組織誘導優良(專一性的)的細胞傷害作用。本發明之癌專一性抗原結合分域、TNF超級家族結合分域及TNF受體超級家族結合分域，可分別從屬於上述癌專 一性抗原、或TNF超級家族或TNF受體超級家族之抗原適當選擇。該等結合分域可藉由胜肽鍵直接連結，也可介由連結子結合。
本發明之抗原結合分子也可更含有FcRn結合分域。該FcRn結合分域，當使用上述抗體之Fc區時，宜為對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區較佳。藉由使對於Fcγ受體之結合活性降低，可抑制因為Fcγ受體表現細胞與表現屬於TNF受體超級家族之因子的細胞間的交聯導致細胞介素釋出等免疫活化所引起的副作用。
本發明之抗原結合分子可使用上述公知方法製作。例如：當(1)癌專一性抗原結合分域為F(ab')2、(2)TNF超級家族結合分域或TNF受體超級家族結合分域為F(ab')2、(3)FcRn結合分域為含有對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區的分域時，將(1)與(2)記載之抗原結合分域與(3)記載之包含Fc區的分域以胜肽鍵直接連結時，已連結的多胜肽形成抗體結構。為了製作如此的抗體，除了從前述融合瘤之培養液精製以外，也可從穩定保持編碼為構成該抗體之多胜肽的多核苷酸的所望寄主細胞的培養液將該抗體精製。
又，此外，當介由連結子連結各分域時，採用的連結子除了上述例示之連結子，也可適當使用具有例如His tag、HA tag、myc tag、FLAG tag等胜肽標籤的連結子。又，也可適當利用因為氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合的性質。例如：利用抗體之CH1與CL間之親和性，或在異Fc區之締合時使用起源於前述多重專 一性抗體之Fc區。
本發明中，第1抗原結合分子可更和第2抗原結合分子組合使用。
該第2抗原結合分子只要是包含(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)T細胞受體複合體結合分域即可，和第1抗原結合分子同樣，其結構不限定，可以和第1抗原結合分子以同樣方法取得。又，第2抗原結合分子只要是含有癌專一性抗原結合分域與T細胞受體複合體結合分域即可，其結構無須和第1抗原結合分子相同。又，第1抗原結合分子之癌專一性抗原結合分域所結合之癌專一性抗原與第2抗原結合分子之癌專一性抗原結合分域所結合之癌專一性抗原可為相同抗原也可為不同抗原，但宜為相同的癌專一性抗原較佳。癌專一性抗原相同時，第1抗原結合分子與第2抗原結合分子所結合之抗原決定基可相同也可不同。此等第1抗原結合分子與第2抗原結合分子組合的話，能獲得優良的細胞傷害活性。第2抗原結合分域所含之癌專一性抗原結合分域及T細胞受體複合體結合分域，可以分別從上述癌專一性抗原或屬於T細胞受體複合體之抗原適當選擇。
本發明之第2抗原結合分子也和第1抗原結合分子同樣可更含有FcRn結合分域。該FcRn結合分域當使用上述抗體之Fc區時，和第1抗原結合分子同樣宜為對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區較佳。藉由使對於Fcγ受體之結合活性降低，可抑制因為Fcγ受體表現細胞與T細胞受體複合體表現細胞及/或表現屬於TNF受體超級家族之因子之細胞間的交 聯導致產生細胞介素釋出等免疫活化所引起的副作用。
又，本發明係關於編碼為本發明之抗原結合分子之多核苷酸。本發明之抗原結合分子可納入到任意的表現載體。可以用表現載體將適當的寄主轉形成為抗原結合分子的表現細胞。若培養抗原結合分子的表現細胞並從培養上清回收表現產物，可取得該多核苷酸所編碼的抗原結合分子。亦即，本發明係關於包含編碼為本發明之抗原結合分子之多核苷酸的載體、保持該載體之細胞，及培養該細胞並從培養上清回收抗原結合分子的抗原結合分子之製造方法。此等例如可依和前述重組抗體為同樣的方法獲得。
醫藥組合物
於另一觀點，本發明提供含有上述第1抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物。又，本發明係關於含有該抗原結合分子作為有效成分之誘導細胞傷害之醫藥組合物(細胞傷害誘導治療劑)、細胞增殖抑制劑及抗癌劑。本發明之醫藥組合物也可作為癌治療劑或癌預防劑。本發明之細胞傷害誘導治療劑、細胞增殖抑制劑及抗癌劑，宜對於罹癌的對象或有再發之可能性的對象投予較佳。
又，本發明中，含有上述第1抗原結合分子作為有效成分之細胞傷害誘導治療劑、細胞增殖抑制劑及抗癌劑，也可表達為包括將該抗原結合分子對於對象投予之步驟的誘導細胞傷害的方法、抑制細胞增殖的方法、對於癌細胞或含癌細胞之腫瘤組織活化免疫之方法、或預防或治療癌之方法，或也可表達為用以誘導細胞傷害之醫藥組合物、細胞增殖抑制劑 及抗癌劑之製造時該抗原結合分子之使用，或可表達為細胞傷害之誘導、細胞增殖之抑制、對於癌細胞或含癌細胞之腫瘤組織之免疫活化或癌之治療或預防使用的該抗原結合分子。
本發明中，「含有抗原結合分子作為有效成分」，係指含有該抗原結合分子作為主要活性成分，並不限制該抗原結合分子之含有率。
又，本發明中之醫藥組合物、或用於誘導細胞傷害之醫藥組合物、細胞增殖抑制劑及抗癌劑(以下稱為醫藥組合物等)，可以和上述第2抗原結合分子組合使用。藉由在含有第1抗原結合分子之醫藥組合物等組合使用第2抗原結合分子，能強化對於表現該抗原之細胞的細胞傷害作用。在此，「組合使用第2抗原結合分子」，可為將第2抗原結合分子一起摻合於含有第1抗原結合分子之醫藥組合物等之中，也可在和含有第1抗原結合分子之醫藥組合物等為不同的醫藥組合物等之中含有第2抗原結合分子。其劑型可相同也可不同。又，第1抗原結合分子與第2抗原結合分子含於不同的醫藥組合物等之中時，該等醫藥組合物等可以對於對象同時投予，也可分別投予。且也可將該等醫藥組合物等以套組形式提供。
又，本發明之第1抗原結合分子或含有第1抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物，可藉由和第2抗原結合分子或含有第2抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物等併用，而作為用以提高其細胞傷害活性之誘導、或強化細胞傷害活性之醫藥組合物使用。又，第2抗原結合分子或含有第2抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物，藉由和第1抗原結合 分子或含有第1抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物等併用，可作為用以提高其細胞傷害活性之誘導、或用以強化細胞傷害活性之醫藥組合物使用。
在此，「併用」包括將含有第1抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等與含有第2抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等對於對象同時投予，也包括將其分別投予。又，其劑型可相同也可不同。再者，該等醫藥組合物等能以套組的形式提供。
又，本發明藉由併用上述第1抗原結合分子或含有該結合分子作為有效成分之醫藥組合物等、與第2抗原結合分子或含有第2抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等所生之效果，提供利用第1抗原結合分子或含有第1抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等來強化第2抗原結合分子或含有第2抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等的細胞傷害活性或抗腫瘤效果的方法。又，提供利用第2抗原結合分子或含有第2抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等來強化第1抗原結合分子或含有第1抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物等的細胞傷害活性或抗腫瘤效果的方法。
又，本發明之醫藥組合物等，視需要可組合多種第1抗原結合分子及/或第2抗原結合分子使用。例如藉由使用結合在相同抗原的多數本發明之抗原結合分子的混合物(cocktail)，可能強化對於表現該抗原之細胞之細胞傷害作用。
又，可因應須要將本發明之抗原結合分子封入到微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等微膠 囊)，成為膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16thedition",Oslo Ed.(1980)等)。再者，將藥劑製成緩釋性藥劑的方法已為公知，該方法可適用在本發明之抗原結合分子(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15,267-277、Chemtech.(1982)12,98-105、美國專利第3773719號、歐洲專利公開公報EP58481號‧EP133988號、Biopolymers(1983)22,547-556)。
本發明之醫藥組合物、或細胞增殖抑制劑及抗癌劑可利用經口、非經口投予中任一者對於患者投予。較佳為非經口投予。投予方法具體而言可列舉注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予，例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如可利用注射投予將本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導治療劑、細胞增殖抑制劑及抗癌劑進行全身或局部投予。又，可依患者的年齡、症狀選擇適當投予方法。投予量，例如選擇就1次投予體重每1kg投予0.0001mg至1000mg之範圍內的投予量。或，可選擇例如每名患者在0.001mg/body至100000mg/body之範圍內的投予量。但是本發明之醫藥組合物不限於該等投予量。
本發明之醫藥組合物可依常法製劑化(例如：Remington's Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Comp62any,Easton,U.S.A)，也可同時含有醫藥上可容許的擔體、添加物。例如界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結 劑、崩壞劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。也不限於此等，可適當使用其他常用的擔體。具體而言，擔體可列舉輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。
又，本發明提供藉由使表現某癌專一性抗原之細胞和會結合於該癌專一性抗原之本發明之第1抗原結合分子、或第1抗原結合分子及第2抗原結合分子接觸，而對於癌專一性抗原之表現細胞或含有該癌專一性抗原之表現細胞之腫瘤組織引起傷害之方法、或抑制該細胞或該腫瘤組織之增殖之方法。會結合於該癌專一性抗原之本發明之抗原結合分子所結合之細胞只要是表現該癌專一性抗原之細胞即可，無特殊限定。本發明之理想的該癌抗原的表現細胞，具體而言，卵巢癌、前列腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌及大腸癌細胞等為理想例。
本發明中，「接觸」係藉由在例如體外培養的癌抗原表現細胞的培養液添加會和該癌抗原結合之本發明之抗原結合分子以進行。於此情形，添加的抗原結合分子的形狀可適當使用溶液或利用冷凍乾燥等獲得之固體等形狀。當以水溶液形式添加時，可純粹是只含有本發明之抗原結合分子的水溶液，可為含有例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結 劑、崩壞劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。添加濃度不特別限定，就培養液中之最終濃度而言，較佳為1pg/ml至1g/ml之範圍，更佳為1ng/ml至1mg/ml，又更佳為1μg/ml至1mg/ml。
又，本發明中，「接觸」於另一態樣，也可藉由對於在體內已移植癌專一性抗原之表現細胞的非人類動物、內在具有表現該癌專一性抗原之癌細胞的動物投予結合於該癌抗原之本發明之抗原結合分子以實施。投予方法可藉由經口、非經口投予中之任一者實施。尤佳為利用非經口投予的投予方法，該投予方法具體而言可列舉注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予，例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如可以利用注射投予將本發明之醫藥組合物、或用以誘導細胞傷害之醫藥組合物、細胞增殖阻害劑及抗癌劑進行全身或局部地投予。又，可依待驗動物的年齡、症狀選擇適當投予方法。以水溶液形式投予時，可為只單純含有本發明之抗原結合分子之水溶液，也可為包含例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩壞劑、滑沢劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。投予量，例如：每一次投予，於體重每1kg為0.0001mg至1000mg之範圍內選擇投予量。或例如：每位患者，從0.001至100000mg/body之範圍內選擇投予量。但是本發明之抗原結合分子投予量不限於該等投予量。
作為評價或測定因為本發明之抗原結合分子之接 觸在表現構成該抗原結合分子之癌專一性抗原結合分域所結合之癌專一性抗原的細胞引起的細胞傷害的方法，可理想地使用以下方法。作為於體外評價或測定該細胞傷害活性之方法可以列舉細胞傷害性T細胞活性等之測定法。本發明之抗原結合分子是否有T64細胞性傷害活性可依公知方法測定(例如：Current protocols in Immunology,Chapter 7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan et al.,John Wiley & Sons,Inc.,(1993)等)。活性測定時，將和本發明的抗原結合分域結合之抗原為不同之抗原且結合於試驗使用之細胞未表現之抗原的抗原結合分子作為對照，和本發明之抗原結合分子同樣地使用，本發明之抗原結合分子比起作為對照之抗原結合分子顯示更強的細胞傷害活性，則可判定活性。
又，為了於活體內評價或測定細胞傷害活性，例如將表現構成本發明之抗原結合分子之癌專一性抗原結合分域所結合之抗原之細胞移植到非人類待驗動物的皮內或皮下後，從當日或次日開始以一天或數日的間隔將待驗抗原結合分子對於靜脈或腹腔內投予。經日測定腫瘤大小，藉此可將該腫瘤大小之變化之差異規定為細胞傷害活性。和在體外的評價同樣投予成為對照的抗原結合分子，當本發明之抗原結合分子之投予群之腫瘤大小比起對照抗原結合分子之投予群之腫瘤之大小顯著較小，則可判定本發明之抗原結合分子有細胞傷害活性。
作為評價或判定因為本發明之抗原結合分子之接觸所致表現構成該抗原結合分子之癌專一性抗原結合分域所 結合之抗原之細胞之增殖的抑制效果的方法，可理想地使用細胞攝入經同位素標定的胸腺嘧啶的測定、MTT法。又，作為於活體內評價或測定細胞增殖抑制活性之方法，可理想地使用和上述記載之評價或測定在活體內之細胞傷害活性之方法為同樣方法。
又，本發明提供本發明之抗原結合分子或包含依本發明之製造方法製造之抗原結合分子之本發明之方法中使用的套組。該套組中，除此以外，可先包裝藥學上可容許之擔體、介質、記載了使用方法的指示書等。
又，本發明係關於用以在本發明之方法使用之本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子。
該技術領域中具有通常知識者當然理解：本說明書記載之一或多數態樣予以任意組合者，只要基於該技術領域中具有通常知識者之技術常識於技術性矛盾即包括在本發明。
又，本說明書引用的全部先前技術文獻納入於本說明書作為參考。
實施例
以下以實施例更詳細說明本發明，但該等實施例不限定本發明之範圍。
[參考例1]抗體之表現載體之製作及抗體之表現與精製
編碼為精製抗體之可變區之H鏈及L鏈之鹼基序列之全長基因之合成，係使用Assemble PCR等並依該技術領域中具有 通常知識者公知之方法製作。胺基酸取代之導入係使用PCR等並依該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施。將獲得之質體片段插入到動物細胞表現載體並製作H鏈表現載體及L鏈表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。將製作的質體暫時性導入到來自人類胎兒腎癌細胞之HEK293H株(Invitrogen公司)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)並實施抗體表現。回收獲得之培養上清後，通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)或0.45μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)，獲得培養上清。從獲得之培養上清使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)依該技術領域中具有通常知識者公知的方法精製抗體。精製抗體濃度使用分光光度計測定於280nm之吸光度，並從獲得之值使用依PACE等方法算出之吸光係數，算得抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
[參考例2]小鼠Fcγ受體(mFcγR)之製備方法及改變抗體與mFcγR間的交互作用解析方法
依以下方法製備小鼠FcγR的細胞外分域。首先，依該技術領域中具有通常知識者公知的方法實施FcγR之細胞外分域之基因之合成。此時，依NCBI登錄的資訊製作各FcγR之序列。具體而言，就mFcγRI依NCBI Reference Sequence：NP_034316.1、就mFcγRII依NCBI Reference Sequence：NP_034317.1、就mFcγRIII依NCBI ReferenceSequence：NP_034318.2、就mFcγRIV依NCBI Reference Sequence： NP_653142.2之序列製作，並於C末端附加His標籤。將獲得之基因片段插入到動物細胞表現載體並製成表現載體。將製作的表現載體對於來自人類胎兒腎癌細胞之FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)暫時性導入，並實施目的蛋白質之表現。回收獲得之培養上清後，通過0.22μm濾器獲得培養上清。獲得之培養上清原則上依以下的4步驟精製。第1步驟實施離子交換管柱層析，第2步驟實施對於His標籤的親和性管柱層析(HisTrap HP)，第3步驟實施凝膠過濾管柱層析(Superdex200)，第4步驟實施無菌過濾。第1步驟之離子交換管柱層析中，mFcγRI使用Q Sepharose HP、mFcγRII及mFcγRIV使用SP Sepharose FF、mFcγRIII使用SP Sepharose HP。又，第3步驟以後使用的溶媒為D-PBS(-)，但就mFcγRIII使用含有0.1M Arginine之D-PBS(-)。針對精製好的蛋白質，使用分光光度計測定於280nm之吸光度，從獲得之值使用依PACE等方法算出之吸光係數算得精製蛋白質之濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。使用Biacore T100(GE Healthcare)、Biacore T200(GE Healthcare)、Biacore A100、Biacore 4000，實施各改變抗體與上述製備之Fcγ受體間的交互作用解析。運行緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，測定溫度設為25℃。晶片使用在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)或Series S SensorChip CM4(GE Healthcare)依胺偶聯法固定有Protein L(ACTIGEN或BioVision)的晶片。使該等感應晶片捕捉目的抗體，和經運行緩衝液稀釋的mFcγ67R進行交互作用，測定對於抗體之結合量，並於抗體間進行比較。 惟，因為mFcγR之結合量依存於捕捉到的抗體的量，故比較將mFcγR之結合量除以各抗體的捕捉量而得的校正值進行比較。又，使其和10mM glycine-HCl、pH1.5反應，洗滌在感應晶片捕捉到的抗體，將感應晶片再生並重複使用。又，用以計算各改變抗體對於FcγR之KD值之動力學的解析，依以下方法實施。首先使上述感應晶片捕捉目的抗體，使其和經運行緩衝液稀釋之mFcγR交互作用，對於獲得之感應圖，利用Biacore Evaluation Software將測定結果以1：1 Langmuir binding model進行global fitting，以算出結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(l/s)，並從此值算出解離常數KD(mol/L)。
[參考例3]實驗動物及細胞株
實驗動物使用C57BL/6雌性小鼠(日本Charles River(股)公司)、或Balb/c雌性小鼠(日本Charles River(股)公司)，於動物飼養室以一定條件(溫度：20~26℃、明暗：12小時之明暗周期)於飼料與飲水自由攝取下飼養。於小鼠肺癌細胞株LLC(ATCC No.CRL-1642)之染色體依該技術領域中具有通常知識者公知的方法嵌入人類GPC3基因，獲得高表現人類GPC3之細胞株LLC-GPC3。人類GPC3表現水平(2.3x105/cell)使用QIFI套組(Dako公司)依製造商建議的方法決定。同樣地，對於小鼠大腸癌細胞株CT-26(ATCC No.CRL-2638)也嵌入人類GPC3基因，獲得高表現株CT26-GPC3(表現水平：3.1x105/cell)。將此等重組細胞株在ATCC建議的培養基中，為了保持人類GPC3基因，對於LLC-GPC3添加400μg/ml的Geneticin(GIBCO)，對於CT26-GPC3添加200μg/ml的 Geneticin進行培養。培養後將該等細胞以2.5g/L胰蛋白酶-1mMEDTA(nacalai tesque公司)剝離後使用在各實驗。
抗CD137小鼠抗體之製作與致效劑活性之評價
1-1.抗小鼠CD137小鼠抗體之製作及向mFcγR之結合評價
依參考例1的方法，就抗體H鏈可變區而言，製作WO2005/017148揭示之對抗小鼠CD137之可變區1D8VH(序列編號：28)，就抗體H鏈不變區而言，製作具有天然型小鼠IgG1之H鏈不變區之1D8VH-mIgG1(序列編號：29)。又，製作對於1D8VH-mIgG1導入了WO2012/133782記載之排除向FcγR之結合之改變即EU編號法235號的Pro取代為Lys之改變，及EU編號法239號的Ser取代為Lys之改變而得的1D8VH-mF18(序列編號：30)。再者，製作將對於mFcgRII之結合增強的改變(T230E、V231P、P232N、S238E、S239D、N324D)導入到1D8VH-mIgG1而得的1D8VH-MB492(序列編號：31)。抗體L鏈可變區使用WO2005/017148揭示5 11D8VL，L鏈不變區使用帶有小鼠κ鏈之不變區之1D8VL-mk0(序列編號：32)，依參考例1之方法表現、精製，以獲得1D8VH-mIgG1/1D8VL-mk0、1D8VH-mF18/1D8VL-mk0、1D8VH-MB492/1D8VL-mk0。該等抗體於以下簡稱為1D8-mIgG1、1D8-mF18、1D8-MB492。
又，為了測定各不變區對於mFcγR之結合，製作具有WO2009/125825記載之抗人類介白素6受體抗體之可變區即H237(序列編號：33)作為H鏈可變區之H237-mIgG1(序列 編號：34)、H237-MB492(序列編號：35)。抗體L鏈使用tocilizumab之L鏈MRAL-k0(序列編號：36)，依參考例1之方法表現、精製，獲得H237-mIgG1/MRAL-k0、H237-MB492/MRAL-k0。又，同樣地製作就抗體H鏈可變區而言具有向人類IL6R之結合之具小鼠抗體mouse PM-1(Sato,Cancer Res.,1993,53,851-856)之可變區(mPM1H)的mPM1H-mIgG1(序列編號：37)、mPM1H-mF18(序列編號：38)。抗體L鏈使用MRAL-k0，依參考例1之方法表現、精製，獲得mPM1H-mIgG1/MRAL-k0、mPM1H-mF18/MRAL-k0。
依參考例2之方法，評價mPM1H-mIgG1/MRAL-k0及mPM1H-mF18/MRAL-k0對於mFcγRII、mFcγRIII之結合能力。天然型小鼠IgG1(mIgG1)，在4種小鼠FcγR之中，不結合於mFcγRI及mFcγRIV，只對於mFcγ69RII及mFcγRIII顯示結合(Nimmerjahn,2005,Science,310,1510-1512)。故藉由對於天然型mIgG1導入向mFcγR之結合減弱的改變，可期待獲得向mFcγRII及mFcγRIII之結合減弱，對於全部mFcγR的結合減弱的改變體。結果示於表1。
Figure 104111074-A0202-12-0080-1
由以上之結果顯示不變區mF18為對於mFcγR之結合顯著減低的改變體。
又，同樣地評價H237-mIgG1/MRAL-k0及H237-MB492/MRAL-k0向mFcγRII、mFcγRIII之結合，結果示 於表2。
Figure 104111074-A0202-12-0081-2
表中之「相對的結合活性」，係指令天然型mIgG1對於各mFcγR之結合活性為1時之MB492之結合活性。由以上之結果，顯示MB492係對於mFcγRII顯示mIgG1之621.5倍、對於mFcγRIII增強10.9倍的改變體。
1-2.抗小鼠CD137抗體之體外CD137致效劑作用之評價
從未改變(naive)的C57BL/6雌性小鼠取出脾臟，使細胞懸浮在於含FBS 10%之RPMI1640培養基添加了0.5μg/ml離子黴素及10ng/ml PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE(PMA)的培養基，以2×105細胞/100μl/井的密度接種到96井板。於其中以3μg/ml的濃度添加抗小鼠CD137抗體，於37℃、5% CO2的條件下培養3日。回收培養後的上清，以ELISA測定所含之小鼠IFN-γ濃度，評價來自脾臟之T細胞之活化。ELISA依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果(第1圖)，製作之抗小鼠CD137小鼠IgG1抗體向FcγR之結合減為極弱者(1D8-mF18)未觀察到活性，野生型Fc者(1D8-mIgG1)則確認T細胞活化。而且，對於FcγRIIB之結合能力提高者(1D8-MB492)，比起野生型Fc，比活性上昇約8倍。
由此可知，如Proc Natl Acad Sci U S A.2013, 110(48),19501-6記載，和其他之對於TNFRSF之致效劑抗體同樣，為了使抗CD137抗體發揮致效劑活性，抗體須向FcγRII結合，和表現CD137之T細胞結合之抗CD137抗體須利用FcγRII表現細胞交聯(第2圖)。FcγRII會在B細胞等多數免疫細胞‧吞噬細胞表現，所以，據認為抗CD137抗體所致致效劑活性係全身性地發生，因此產生副作用。
[實施例2]抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體之製作與致效劑活性之評價
2-1.由癌抗原與CD137之雙專一性抗體獲得癌抗原依存性致效劑抗體之概念
從實施例1的研究可推測：因通常之抗CD137抗體所致之致效劑活性係全身性發生，所以無法將抗腫瘤效果與在正常組織之副作用(T細胞活化等)予以分離。而，考慮到若使用癌抗原與CD137之雙專一性抗體，將表現CD137之T細胞與表現癌抗原之細胞(癌細胞等)利用該雙專一性抗體予以交聯，是不是能只於癌抗原存在之癌組織發揮抗CD137抗體所致之致效劑活性(第3圖)。
2-1.抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體(GPC3ERY22-1D8、GPC3ERY22-G2-1D8、GPC3ERY22-G4-1D8)之製作
製作具有人類IgG1、IgG2、IgG4之不變區之3種抗人類GPC3/抗小鼠CD71137雙專一性抗體。該等分子中，為了控制H鏈與L鏈的締合並以良好效率獲得雙專一性抗體，使用Schaefer等人報告的CrossMab技術(Schaefer,Proc.Natl.Acad. Sci.,2011,108,11187-11192)。亦即，該等分子成為WO2012/073985記載之對抗人類GPC3之Fab之VH分域與VL分域經取代之分子。又，抗體H鏈不變區，為了促進異締合，使用Knobs-into-Holes技術。Knobs-into-Holes技術，係將存在其中一H鏈之CH3區的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(Knob；突起)，將存在另一H鏈之CH3區之胺基酸側鏈取代為較小側鏈(Hole；空隙)，以將突起配置於空隙內而促進向H鏈之異二聚化，並能有效率的取得目的之異二聚化抗體的技術(Burmeister,Nature,1994,372,379-383)。以下，將已導入Knob改變的不變區稱為Kn、已導入Hole改變的不變區稱為Hl。又，作為使對於FcγR之結合減弱之改變，使用WO2011/108714記載之改變。具體而言，對於IgG1型、IgG4型導入將EU編號法234號、235號、297號取代為Ala之改變。又，對於IgG2型導入將234號、237號、297號取代為Ala之改變。為了從抗體H鏈之C末端取除EU編號法446號的Gly及447號的Lys並對於其進一步表現抗體後之精製為容易，在抗人類GPC3側的H鏈的C末端附加組胺酸標籤，在抗小鼠CD137側的H鏈的C末端附加FLAG標籤。就已導入以上改變之抗人類GPC3側H鏈，製作GC33(2)H-G1dKnHS(序列編號：39)、GC33(2)H-G2dmKnHS(序列編號：40)、GC33(2)H-G4dKnHS(序列編號：41)。又，作為抗小鼠CD137側之H鏈，製作1D8VH-G1dHlFS(序列編號：42)、1D8VH-G2dmHlFS(序列編號：43)、1D8VH-G4dHlFS(序列編號：44)。在此，具有IgG2型之不變區之GC33(2)H-G2dmKnHS及1D8VH-G2dmHlFS，成為只有CH1分 域及鉸鏈區之前半部分的IgG1型。具體而言，和天然型人類IgG2之CH1之序列比較，EU編號法131號成為Ser，133號成為Lys，137號、138號成為Gly，鉸鏈區的219號成為Ser。作為抗體L鏈，抗人類GPC3側共通使用GC33(2)L-k0(序列編號：45)，抗小鼠CD137側共通使用1D8VL-k0(序列編號：46)。將該等抗體以表3的組表現，獲得目的雙專一性抗體。又，該等抗體之表現係依1-1，在FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)暫時性表現。將獲得之培養上清加到Anti FLAG M2管柱(Sigma公司)，洗滌該管柱後，實施利用0.1mg/mL FLAG胜肽(Sigma公司)所為之溶出。將含有抗體之級分加到HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司)並洗滌該管柱後，實施利用咪唑之濃度梯度的溶出。將含抗體之級分以超過濾膜濃縮後，將濃縮液加到Superdex 200管柱(GE Healthcare公司)，只回收此溶出液之單體之抗體，以獲得精製抗體。
Figure 104111074-A0202-12-0084-3
2-2.抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體之GPC3依存性體外CD137致效劑作用之評價
將小鼠T細胞株CTLL-2(ATCC Cat.No.TIB-214)懸浮於在含FBS 10%之RPMI1640培養基中添加了0.5μg/ml離子黴素及10ng/ml PMA而得之培養基，以2×104細胞/100μl/井的密度接種到96井板。於其中，將表現人類GPC3之小鼠肺癌細胞株LLC-GPC3(參考例3)以相同培養基懸浮，以2×104細胞 /100μl/井的密度接種在96井板。再製備CTLL-2與LLC-GPC3各含同細胞數之懸浮液，以4×104細胞/100μl/井的密度接種在96井板。於其中，將向FcγR之結合已減為極弱的抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性人類IgG1型抗體(GPC3 ERY22-1D8)、或抗人類GPC3單一專一性人類IgG型抗體(由GC33(2)H2-G1dS及GC33(2)L2-k0構成的GC33(2)-hG1S)以5μg/ml的濃度添加，於37℃、5% CO2的條件下培養24小時。回收培養後的上清，利用ELISA測定含有的小鼠IFN-γ濃度，以評價CTLL-2之活化。ELISA依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果，只於LLC-GPC3及CTLL-2兩者的細胞存在的條件下觀測到小鼠IFN-γ之高累積(第4圖)。此據認為係和GPC3表現細胞結合的多數前述雙專一性抗體導致T細胞上之CD137之締合化所伴隨引起的T細胞活化(第3圖)。
又，前述雙專一性抗體之Fc部分改變為向FcγR之結合極度減弱的人類IgG2型(GPC3 ERY22-G2-1D8)及人類IgG4型(GPC3 ERY22-G4-1D8)時的活性示於第5圖。即使改變抗體的次類別，CD137致效劑活性仍無大差異。
從該等結果可確認：向FcγR之結合已減弱之對抗癌抗原(本實施例中為GPC3)和CD137之雙專一性抗體，只於表現癌抗原之細胞(癌細胞等)存在時方發生和T細胞上之CD137之締合化，並能發揮致效劑活性。亦即，於癌抗原不存在之正常組織中，因T細胞不活化，據認為能減小或避免副作用。
[實施例3]抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體之混合物所致之T細胞活化增強作用
3-1.概念
已知抗CD137致效劑抗體藉由活化T細胞以發揮抗腫瘤效果，但也已知抗CD137致效劑抗體於單劑時其效果低。而，為了增強抗癌抗原/抗CD137雙專一性抗體所致之T細胞活化能力並發揮更強的抗腫瘤效果，有人探討併用將T細胞活化的藥劑。抗癌抗原/抗CD3雙專一性抗體可將T細胞重導到癌抗原，並利用T細胞而對於癌細胞發揮細胞傷害活性，但抗癌抗原/抗CD3雙專一性抗體亦為於單劑時並不一定能提高其抗腫瘤效果。而，有人探討藉由併用抗癌抗原/抗CD137雙專一性抗體與抗癌抗原/抗CD3雙專一性抗體，是否能發揮相乘性的T細胞活化能力與抗腫瘤效果。
3-2.GPC3ERY22-3-1D8、GPC3ERY22-3-2C11之製作
製作抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體GPC3 ERY22-3-1D8，及抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體GPC3 ERY22-3-2C11。GPC3 ERY22-3-1D8，係於實施例2-1製作之雙專一性抗體GPC3 ERY22-1D8之不變區，為了方便精製而加諸了該技術領域中具有通常知識者公知的改變而得者。具體而言，製作對於抗人類GPC3側H鏈不變區基因GC33(2)H-G1dKnHS，為了方便精製而施加該技術領域中具有通常知識者公知的改變即H435R改變的GC33(2)H-G1dKnHSG3(序列編 號：48)。也同時製作從抗小鼠CD137側H鏈不變區基因1D8VH-G1dHlFS去除了FLAG標籤的1D8VH-G1dHlS(序列編號：47)。又，抗小鼠CD3抗體之H鏈可變區使用2C11VH(序列編號：49)之序列，製作2C11VH-G1dHlS(序列編號：50)。就抗體L鏈而言，抗人類GPC3側使用GC33(2)L-k0、抗小鼠CD137側使用1D8VL-k0、抗小鼠CD3側使用2C11VL-k0(序列編號：51)，將該等抗體以表4的組合表現，獲得目的之雙專一性抗體。又，該等抗體之表現係依參考例1，於FreeStyle293細胞暫時性表現。將獲得之培養上清加到MabSelect SuRe管柱(GE Healthcare公司)，洗滌該管柱後，實施以50mM乙酸所為之溶出。將含抗體之級分添加到HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司)或Ni Sepharose FF管柱(GE Healthcare公司)，洗滌該管柱後，實施咪唑所為之溶出。將含抗體之級分以超過濾膜濃縮後，將濃縮液添加到Superdex 200管柱(GE Healthcare公司)，只回收此溶出液之單體之抗體，獲得精製抗體。
Figure 104111074-A0202-12-0087-4
又，作為比較對照，以相同抗人類GPC3抗體製作向FcγR之結合減弱的GC33(2)-G1dS。GC33(2)-G1dS為未使用CrossMab技術之天然型抗人類GPC3抗體，具有向FcγR之結合減弱的不變區。具體而言，製作就抗體H鏈可變區而言，帶有GC33(2)H2(序列編號：52)，就抗體H鏈不變區而言，對於G1d導入了L234A、L235A、N297A的GC33(2)H2-G1dS(序 列編號：53)。抗體L鏈使用GC33(2)L2-k0(序列編號：54)，依參考例1之方法表現、精製，以獲得GC33(2)H2-G1dS/GC33(2)L2-k0。以下，為了簡化，將此抗體記載成GC33(2)-G1dS。
3-3.抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體之混合物所致體外T細胞活化增強作用之評價
從未改變(naïve)的C57BL/6雌性小鼠取出脾臟，將細胞以4×106細胞/ml的密度懸浮於在含FBS 10%之RPMI1640培養基中添加了10ng/ml小鼠IL2的培養基。又，將表現人類GPC3的小鼠大腸癌細胞株CT26-GPC3(參考例3)也以相同培養基以4×105細胞/ml的密度懸浮。將兩細胞懸浮液各等量混合，以100μl/井接種在96井板。於一部分井更添加0.5μg/ml離子黴素及10ng/ml PMA。於其中以3μg/ml的濃度添加向FcγR之結合減為極弱的抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體(GPC3ERY22-1D8)及向FcγR之結合減為極弱的抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體(GPC3 ERY22-2C11：從GPC3 ERY22-3-2C11將H435R改變回復到原本者)，於37℃、5% CO2的條件下培養24小時。回收培養後的上清，利用ELISA測定含有的小鼠IFN-γ濃度，以評價脾臟細胞所含之T細胞之活化。ELISA依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果(第6圖)，1D8-MB492及GPC3 ERY22-1D8於添加離子黴素及PMA時顯示IFN-γ誘導活性。此結果據推測係因為促分裂原(mitogen)等的刺激於脾臟T細胞誘導了CD137。並且，於GPC3 ERY22-1D8及GPC3 ERY22-2C11之 混合物觀測到IFN-γ之高累積。此啟示藉由同時實施CD3刺激與CD137刺激，強力誘發T細胞活化。
[實施例4]抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體之抗腫瘤效果及對於肝臟之毒性之減輕作用
4-1.抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體與抗小鼠CD137抗體之藥效比較
將表現人類GPC3之重組小鼠大腸癌細胞株CT26-GPC3(參考例3)以Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)製備為5 x 106細胞/mL，將200μL(1 x106細胞)移植到BALB/c小鼠(雌、7週大、日本Charles River公司)的腹部皮下。隨機以5隻為一群，分成5群後，於移植3日後、7日後、10日後、17日後利用尾靜脈注射投予抗體。抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體(GPC3 ERY22-3-1D8)以溶媒(含150mM NaCl、20mM His-HCl之水溶液(pH 6.0)通過0.22μm濾器者)調配成0.75mg/mL、0.15mg/mL並以10mL/kg投予(各7.5mg/kg、1.5mg/kg)。抗小鼠CD137抗體(1D8-MB492)以溶媒調配成1.5mg/mL、0.3mg/mL，並以10mL/kg投予(各15mg/kg、3mg/kg)。腫瘤增殖抑制率(%)利用依下式算出之腫瘤體積評價。
腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)x短徑(mm)x短徑(mm)/2
腫瘤增殖抑制率(%)=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100
T：各群各測定日之平均腫瘤體積
T0：各群初次投予日之平均腫瘤體積
C：對照群之各測定日之平均腫瘤體積
C0：對照群之初次投予日之平均腫瘤體積
如第7圖，已投予抗體的任一群，顯示腫瘤增殖抑制率為95%以上的強抗腫瘤效果。亦即，抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體和抗小鼠CD137抗體同樣顯示強抗腫瘤效果，即使以癌抗原依存性地活化CD13仍表現強抗腫瘤效果。
4-2.於CT26-GPC3皮下移植模型中之抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體獲致之肝傷害減低
抗體投予藥效試驗結束時於麻醉下利用全身採血實施安樂死處置後，將血漿分離。使用血漿，使用自動分析裝置TBA-120FR(Toshiba medical systems(股)公司)測定天冬胺酸胺基轉移酶(AST；JSCC Transferable法)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT；JSCC Transferable法)、總膽紅素(TBIL；酵素法)。解剖時採取肝臟，於10%中性緩衝福馬林液固定，依常法製作石蠟包埋薄切組織標本(蘇木精‧伊紅(HE))，以光學顯微鏡以病理組織學進行觀察。統計解析，利用相對於對照群之無母數(nonparametric)Dunnett型多重比較檢定進行。
其結果如第8圖至第11圖，抗小鼠CD137抗體(1D8-MB492)投予群在每一用量均有血中AST、ALT及TBIL之增加或增加傾向，在全部例中觀察到病理組織學上的輕微至輕度肝細胞的變性‧壞死、發炎症這些肝傷害。另一方面，抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體(GPC3 ERY22-3-1D8)投予群中，未觀測到血中AST、ALT及TBIL中據認為起因於肝傷害之變化，於病理組織學上的輕微肝細胞變性‧壞死或發炎，在各用量群中，於5例中有2至3例，肝傷害有所減輕。又，同抗體3mg/kg投予群之1例中，血中AST及ALT有顯著 增加，但血中TBIL未觀察到變化，肝臟之病理組織學的觀察未見到啟示肝傷害之觀察結果，故判斷此酵素之來源不會引起肝傷害。
由以上之結果，顯示抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體GPC3 ERY22-3-1D8不會引起像通常的抗CD137致效劑抗體至今報告般的嚴重肝傷害，而是有強抗腫瘤效果。亦即，向FcγR之結合減低之對抗癌抗原與CD137之雙專一性抗體藉由以癌抗原依存性地發揮CD137致效劑活性，並只將腫瘤中的T細胞活化，能選擇性對於癌細胞發揮細胞傷害活性，在正常組織則不活化T細胞，據認為能避免細胞傷害、細胞介素釋出等副作用。
[實施例5]抗人類GPC3/抗小鼠CD137雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體併用獲致之抗腫瘤效果
將表現人類GPC3之小鼠肺癌細胞株LLC-GPC3(參考例3)以HBSS懸浮成5 x106細胞/mL，向C57BL/6N小鼠(雌、6週大、日本Charles River公司)之腹部皮下移植200μL(1 x 106細胞)。移植10日後，基於腫瘤體積與體重數據，無偏頗地每群5隻，分成5群，於移植10日後、14日後、17日後利用尾靜脈注射投予抗體。抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體(GPC3 ERY22-3-1D8)以溶媒(含150mM NaCl、20mM His-HCl之水溶液(pH 6.0)通過0.22μm濾器者)調配成0.5mg/mL，並以10mL/kg投予(5mg/kg)。將抗人類GPC3/小鼠CD3雙專一性抗體(GPC3 ERY22-3-2C11)以溶媒調配成0.45mg/mL並以 10mL/kg投予(4.5mg/kg)。再設定併用2種抗體並投予群。腫瘤增殖抑制率(%)依從下式算出之腫瘤體積進行評價。
腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)x短徑(mm)x短徑(mm)/2
腫瘤增殖抑制率(%)=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100
T：各群各測定日之平均腫瘤體積
T0：各群初次投予日之平均腫瘤體積
C：對照群之各測定日之平均腫瘤體積
C0：對照群之初次投予日之平均腫瘤體積
如第12圖，腫瘤移植23日後之腫瘤增殖抑制率，於抗人類GPC3/小鼠CD137雙專一性抗體單獨投予群為36%、抗人類GPC3/小鼠CD3雙專一性抗體單獨投予群為29%，但兩抗體之併用投予群顯示100%的抑制率，顯然有相乘的併用效果。又，藥效試驗結束時以和4-2同樣方法實施血漿中之肝機能參數(AST、ALT，及TBIL)之解析與利用肝臟組織切片之HE染色之病理組織學的解析，但每一投予群均未認為有啟示肝傷害之變化。
由以上結果顯示：藉由併用對抗癌抗原及CD137之雙專一性抗體、與對抗癌抗原及CD3之雙專一性抗體，腫瘤局部專一性地將CD137與CD3同時締合化，藉此能發揮於體外試驗觀察到的各單獨刺激無法達成的強大T細胞活化能力，藉此呈現出在體內各單劑無法發揮的強抗腫瘤效果。
[實施例6]使用噬菌體呈現技術從人類抗體庫取得結合於人類CD137之抗體
6-1.無改變人類抗體噬菌體呈現庫之製作
將從人類PBMC製作之多A RNA、市售之人類多A RNA等作為模板，依該技術領域中具有通常知識者公知的方法，建構由提示彼此不同之人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成的人類抗體噬菌體呈現庫。
6-2.利用珠粒淘選從無改變人類抗體庫取得結合於人類CD137之抗體
從實施例6-1建構的無改變人類抗體噬菌體呈現庫實施呈現對於抗原之結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對於珠粒捕捉到的抗原顯示結合活性的抗體的噬菌體。抗原使用生物素化人類CD137。具體而言，實施使用固定於磁珠之抗原的淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
首先依一般方法精製從保持著構築之噬菌體呈現用噬粒的大腸菌產生的噬菌體。之後獲得經以TBS透析處理之噬菌體庫液。然後，添加BSA使噬菌體庫液成為終濃度4%。
之後於製備之噬菌體庫液加入250pmol的生物素化人類CD137，以使該噬菌體庫液和人類CD137於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液中加入經BSA阻斷的磁珠，使人類CD137與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠粒以TBS洗1次。之後，將已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立刻使用磁座而從分離珠粒回收噬菌體溶液。回收的噬菌體溶液添加到成對數增殖期(OD600為0.4~0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩 慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm的板。然後，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
於第2次淘選，亦實施可對於人類CD137結合之噬菌體之濃縮。於獲得之噬菌體庫液添加100pmol之生物素化人類CD137，藉此使該噬菌體庫液和人類CD137於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液添加經BSA阻斷的磁珠，使人類CD137與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween20之TBS)洗滌3次，以TBS洗滌2次。之後將加有1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立刻使用磁座從分離的珠粒回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4~0.7)的10mL的大腸菌株ER2738。37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm的板。然後從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備成噬菌體庫液。
以同樣程序重複3次取得可對於人類CD137結合之抗體之淘選。惟，第4次的淘選使用40pmol之生物素化人類CD137。
6-3.合成人類抗體噬菌體呈現庫之製作
依該技術領域中具有通常知識者公知的方法，使用10種重鏈germline(生殖系列)序列、7種輕鏈germline序列建構合成人類抗體噬菌體呈現庫。使用的Germline序列係將在人類B細胞曲目的出現頻度、在可變區家族的物理化學性質作為指 標，選擇VH1-2、VH1-69、VH3-23、VH3-66、VH3-72、VH4-59、VH4-61、VH4-b、VH5-51、VH6-1、Vκ1-39、Vκ2-28、Vκ3-20、Vλ1-40、Vλ1-44、Vλ2-14、Vλ3-21。以模擬人類B細胞之抗體之曲目的方式，使合成抗體庫的抗原認識部位帶有多樣性。
6-4.利用珠粒淘選從合成人類抗體庫取得對於人類CD137結合之抗體
從實施例6-3建構的合成人類抗體噬菌體呈現庫實施對於抗原顯示結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對於珠粒捕捉到的抗原顯示結合活性之抗體之噬菌體。抗原使用生物素化人類CD137。
將從保持著建構之噬菌體呈現用噬粒的大腸菌產生的噬菌體依一般的方法精製。將對於已實施噬菌體產生的大腸菌的培養液添加2.5M NaCl/10%PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以獲得噬菌體庫液。然後，於噬菌體庫液添加BSA使終濃度成為4%。實施使用固定於磁珠之抗原的淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
之後，於製備之噬菌體庫液添加250pmol之生物素化人類CD137，以使該噬菌體庫液和人類CD137於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使人類CD137與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。珠粒以TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立刻使用磁座從分離 的珠粒回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4~0.7)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm的板。然後從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備成噬菌體庫液。
於第2次淘選中，係實施能結合於人類CD137之噬菌體之濃縮。於獲得之噬菌體庫液加入100pmol之生物素化人類CD137，以使該噬菌體庫液與人類CD137於室溫接觸60分鐘。然後，於噬菌體庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使人類CD137與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠粒以TBST洗滌3次、以TBS洗滌2次。之後，將加有1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立刻使用磁座從分離的珠粒回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4~0.7)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm的板。然後從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備成噬菌體庫液。
依同樣程序重複3次取得可對於人類CD137結合之抗體之淘選。惟，第4次淘選使用40pmol的生物素化人類CD137。
6-5.利用噬菌體ELISA實施之人類CD137結合性之評價
從依上述實施例所示之淘選(Panning)法獲得之大腸菌之 單一群落仿照常法(Method Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌體之培養上清。
將已加有TBS之噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原(生物素化人類CD137)之100μL之TBS於室溫包被1小時。將該板的各井以TBST(含0.1% Tween20之TBS)洗滌以去除未結合於板之抗原後，將該井以250μL之2% SkimMilk-TBS阻斷1小時以上。去除2% SkimMilk-TBS，之後將已於各井加入製備之噬菌體的該板於室溫靜置1小時，以使提示抗體之噬菌體和各井存在的抗原結合。在經TBST洗滌的各井中，將經TBS稀釋之以添加HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)的板溫育1小時。以TBST洗滌後，以添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之呈色反應後，利用450nm之吸光度測定該呈色。
從實施噬菌體ELISA之192個選殖體之中，確認對於人類CD137有結合活性之多數抗體。噬菌體ELISA之結果示於表5。
Figure 104111074-A0202-12-0097-5
6-6.生物素化人類CD137結合抗體之序列解析
從實施例6-5所示之噬菌體ELISA之結果判斷對於人類CD137有專一性結合活性之選殖體，解析使用專一性引子對 (未改變人類抗體庫：序列編號55及56、合成人類抗體庫：序列編號57及56)放大的基因的鹼基序列。解析之結果，確認存在對於人類CD137有結合活性之多種抗體之序列。
6-7.人類CD137結合抗體之製備
將實施例6-6取得之判斷對於生物素標記人類CD137有結合活性之選殖體之中，來自無改變人類抗體庫之5個選殖體(R1~R5)，及來自合成人類抗體庫之14個選殖體(R6~R19)之重鏈及輕鏈之可變區序列，和重鏈抗體不變區(人類IgG1之不變區已改變之序列；序列編號：58)或輕鏈kappa不變區序列(序列編號：59)或lambda不變區序列(序列編號：60)連結，分別插入到動物表現用質體。各選殖體之重鏈及輕鏈之可變區序列示於表6。
Figure 104111074-A0202-12-0098-6
各抗體依參考例1記載之方法表現‧精製。然後， 為了增強抗人類CD18537抗體之體外T細胞活化作用，製作將表6所示VH區與和已增強向人類FcγRIIB之結合增強之不變區(序列編號99)予以連結的基因插入到動物細胞表現用的質體載體，使可變區之組合成為表6所示之組合的方式，以同樣方法將抗體表現‧精製。
[實施例7]抗人類CD137抗體之抗原決定基解析
7-1.片段化人類CD137-Fc融合蛋白質之製備及抗體之製備
為了解析取得之抗人類CD137抗體之抗原決定基，參考和TNFRSF共通之結構及J Exp Med.2014 Jun 30；211(7)：1433-48，製作稱為CRD之利用以Cys-Cys形成之結構區分分域之片段化人類CD137與抗體之Fc區的融合蛋白質(表7)。片段化人類CD137-Fc融合蛋白質，係以含有表7所示之胺基酸序列的方式，從編碼為全長人類CD137-Fc融合蛋白質(序列編號100)之多核苷酸利用PCR法取得各基因片段，並以該技術領域中具有通常知識者公知的方法嵌入到動物細胞表現用之質體載體。片段化人類CD137-Fc融合蛋白質以和參考例1記載之方法和抗體同樣地精製。再者，作為ELISA之對照(Control)，將編碼為WO2005/035584A1記載之抗人類CD137抗體(簡稱B)之H鏈不變區改變為人類IgG1之H鏈不變區之C末端之Gly及Lys已除去之不變區的抗體(H鏈序列編號101、L鏈序列編號102)、以及WO2012/145183A3記載之抗人類CD137抗體(簡稱M)之不變區改變為向人類FcγRIIB之結合已增強之不變區之抗體(H鏈序列編號103、L鏈序列編號104)的基因嵌入到動物細胞表現用質體載體，並依參考例1記載之 方法取得抗體。
Figure 104111074-A0202-12-0100-7
7-2-1.使用片段化人類CD137-Fc融合蛋白質之抗原決定基解析
使用實施例7-1製備之片段化人類CD137-Fc融合蛋白質，以ELISA法實施前述實施例6獲得之抗體(重鏈不變區使用序列編號99)會和人類CD137的哪個部位結合的結合評價。例如：為結合於分域1之抗體時，預測會和含分域1之片段化人類CD137-Fc融合蛋白質結合，但不和不含分域1之片段化人類CD137-Fc融合蛋白質結合。
7-2-2.ELISA法
將片段化人類CD137-Fc融合蛋白質稀釋於製備成pH9.6 之碳酸鈉水溶液中使成為2μg/mL。將稀釋之片段化人類CD137-Fc融合蛋白質各50μL添加到Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate(Nunc)之各井。於4℃靜置1晚以上後，於室溫靜置1小時，使板和室溫成為相同溫度。將含片段化人類CD13787-Fc融合蛋白質之溶液傾倒除去，將各井以Wash buffer(含0.1% Tween20之TBS、TaKaRa)300μL洗滌3次。然後，於各井各加入阻斷緩衝液(Blocking Buffer)(含2% BSA之TBS)150μL，靜置1小時以上。將阻斷緩衝液傾倒除去，以清洗緩衝液將各井以和先前步驟同樣地洗滌3次後，將預先以TBS稀釋成10μg/mL或5μg/mL之抗體溶液於各井各添加50μL。以於室溫1小時600rpm左右的速度使經固相化之抗原和抗體結合。將抗體溶液傾倒除去後，以清洗緩衝液(Wash Buffer)將各井以和先前步驟同樣地洗滌3次。將以含0.1% Tween20之TBS稀釋為1000倍之2次抗體對於各井各添加100μL。又，二次抗體，於為帶有Kappa鏈之抗體時，使用BIOSOURCE公司ANTIBODY ALKALINE PHOSPHATASECONJUGATE HUMAN IMMUNO GLOBULIN ABSORBED Goat Anti-Human Kappa Alkaline Phosphate，於為帶有Lambda鏈之抗體時，使用BETHYL LABORATORIES.INC,Human Lambda Light Chain Antibody；Goat anti-Human Lambda Light Chain Antibody Alkaline Phosphatase Conjugated。於室溫靜置並使其反應1小時後，將抗體溶液傾倒除去，以清洗緩衝液將各井以和先前之步驟同樣地洗滌3次。使用KPL公司之Blue Phos Microwell套組進行呈色。使用KPL公司之AP stop solution使呈色反應 停止後，以吸光光度計測定620nm之吸光度。其結果示於第14圖。如第14圖，各抗體對於各片段化人類CD137-Fc融合蛋白質呈現不同的呈色值，顯示係和人類CD137-Fc中的不同部分結合。再者，顯示取得之抗體是和既有的抗體B、M不同。
[實施例8]抗人類CD137抗體之體外T細胞活化作用之評價
從市售PBMC(AllCells公司)使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco,11132D)將T細胞進行擴大培養。於含10% FBS、60U/ml人類IL2、0.5μg/ml離子黴素、10ng/ml PMA，及有既定濃度盤尼西林及鏈黴素的RPMI1640培養基中，將人類T細胞以4×105細胞/ml的密度懸浮。又，將人類B細胞淋巴瘤株Raji以相同培養基以4×105細胞/ml的密度懸浮。將兩細胞懸浮液等量混合，以100μl/井接種於96井板。於其中將實施例6獲得之人類CD137結合抗體(R1~R19；使用和實施例7記載的ELISA為相同抗體)以5μg/ml的濃度添加，於37℃、5% CO2的條件下培養3日。回收培養後的培養上清，將含有的人類IFN-γ濃度以ELISA測定，以評價人類T細胞之活化。ELISA係依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果(第15圖)，和對照人類IgG(Allexis,804-133-C100：第15圖中之hIgG)相比，R7,R15以外的選殖體均顯示IFN-γ誘導活性。該等具有IFN-γ誘導活性之抗體判段為對抗CD137之致效劑抗體。
第16圖顯示整理獲得之抗體之性質。獲得了多數 和前述實施例所示之抗人類CD137抗體B、M認識不同抗原決定基之抗體。將該等抗人類CD137抗體改變為和GC33抗體(抗人類GPC3抗體)之雙專一性抗體，並評價癌抗原(GPC3)依存的CD137致效劑能力，可提供發揮所望抗腫瘤效果之抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體。
[實施例9]抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體(GPC3 FAE-FGK45)之製作
依以下程序製作具有人類IgG1之不變區之抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體GPC3FAE-FGK45。於抗小鼠CD40側，重鏈可變區使用FGK45VH6(序列編號120)、輕鏈可變區使用FGK45VL4(序列編號121)。此時，重鏈不變區及輕鏈不變區各使用F760nG3P17(序列編號119)、k0(序列編號118)。就抗人類GPC3側之抗體，重鏈可變區H0000(序列編號115)及輕鏈可變區GL4(序列編號116)係共通使用。此時不變區，係使用向Fcγ受體之結合減低且施以2個重鏈會進行異締合化之改變的重鏈不變區F760nN17(序列編號117)、輕鏈不變區k0(序列編號118)。將該等抗體使用以下方法表現。於FreeStyle293 Expression Medium培養基(Invitrogen)以1.33 x 106細胞/mL的細胞密度懸浮，對於已接種之來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，將所製備之質體利用脂染法(lipofection)法導入。從在CO2培養箱(37℃、8%CO2、90rpm)培養4日後的培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)，以該技術領域中具有通常知識者公 知的方法精製抗體。使用分光光度計測定精製之抗體溶液之於280nm之吸光度。從獲得之測定值使用依PACE法算出之吸光係數，計算精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。將已精製之各同體(homobody)以表8的組合混合，使用該技術領域中具有通常知識者公知的方法(WO2015/046467)製作目的之雙專一性抗體。
Figure 104111074-A0202-12-0104-8
[實施例10]抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體與抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體之混合物獲致之體外脾細胞活化增強作用之評價
從無改變的Balb/c雌性小鼠取出脾臟，於含有FBS 10%、0.5μg/ml離子黴素，及10ng/ml PMA之RPMI1640培養基添加了10ng/ml小鼠IL2而得的培養基中，將細胞以4×106細胞/ml的密度懸浮。又，將表現人類GPC3之小鼠大腸癌細胞株CT26-GPC3(參考例3)以相同培養基，以4×105細胞/ml的密度懸浮。將兩細胞懸浮液等量混合，以100μl/井接種到96井板。於其中以3μg/ml的濃度添加向FcγR之結合已極度減弱的抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體(GPC3 ERY22-FGK45)、以1μg/ml濃度添加向FcγR之結合極度減弱的抗人類GPC3/抗小鼠CD3雙專一性抗體(GPC3 ERY22-2C11)，於37℃、5% CO2的條件下培養72小時。回收培養後的上清，以ELISA測定含有的小鼠IFN-γ濃度，以評價脾臟細胞含有的T細胞的活化。 ELISA係依套組製造業者(PeproTech公司)的指示實施。
其結果(第17圖)，GPC3 ERY22-2C11以單劑顯示IFN-γ誘導活性，另一方面，GPC3 ERY22-FGK45單劑幾乎不顯示活性。但是GPC3 ERY22-FGK45及GPC3 ERY22-2C11之混合物中，可見IFN-γ之高累積。此啟示：相對多樣的免疫細胞混合物，同時實施CD3刺激與CD40刺激，結果會強力誘發T細胞的活化。
[實施例11]抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體之製作與致效劑活性之評價
11-1.抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體之製作
具有人類IgG1之不變區之抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體依以下的程序製作。將在實施例7已確認和人類CD137結合之序列(R3與R5)，使用設計成重鏈CDR3之胺基酸隨機改變引子進行改變。可變區序列示於表9。此時從R3及R5改變時，重鏈不變區及輕鏈不變區各使用在實施例9建構的F760nG3P17序列的C末端附加了Gly-Lys(也記載為"GK")的序列、lambda不變區序列(序列編號：60)。抗人類GPC3側之抗體，共通使用重鏈可變區H0000(序列編號115)及輕鏈可變區GL4(序列編號116)。此時，不變區使用向Fcγ受體之結合減低且施加了使2個重鏈會進行異締合化之改變的重鏈不變區F760nN17(序列編號117)、輕鏈不變區k0(序列編號118)。該等抗體使用以下方法表現。於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)以1.33 x 106細胞/mL的細胞密度懸浮，並將製備的質體利用脂染法導入於接種的來自人類胎兒腎 細胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)。從在CO2培養箱(37℃、8%CO2、90rpm)培養4日的培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE HEALTHCARE)，以該技術領域中具有通常知識者公知的方法精製抗體。使用分光光度計測定精製之抗體溶液於280nm之吸光度。從獲得之測定值使用由PACE法算出之吸光係數計算精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。又，就抗人類CD137抗體(來自R3與R5)，令E1%=14進行計算。如表9所示，將和實施例9同樣精製之抗人類GPC抗體與人類CD137抗體各自的同體混合，使用該技術領域中具有通常知識者公知的方法(WO2015/046467)製作目的之雙專一性抗體。
Figure 104111074-A0202-12-0106-9
11-2.抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體之GPC3依存性的體外CD137致效劑作用之評價
從市售PBMC(AllCells公司)使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco,11132D)將T細胞進行擴大培養。於將人類T細胞以4×105cells/ml的密度懸浮含有10% FBS、60U/ml人類IL2、0.5μg/ml離子黴素、10ng/ml PMA， 及規定濃度的盤尼西林鏈黴素之RPMI1640培養基中。又，將表現人類GPC3之小鼠大腸癌細胞株CT26-GPC3(參考例3)以相同培養基以4×105cells/ml的密度懸浮。將兩細胞懸浮液等量混合，以100μl/井接種在96井板。於其中以10μg/ml的濃度添加對照人類IgG(Allexis,804-133-C100：第18圖中之Ctrl hIgG1)或前項11-1製備之GPC3 FAE-BMS(向FcγR之結合極度減弱之抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體)，於37℃、5% CO2的條件下培養3日。回收培養後的上清，以ELISA測定含有的人類IFN-γ的濃度，評價T細胞之活化。ELISA依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果(第18圖)，抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體顯示IFN-γ誘導活性。此啟示：人類T細胞中也和使用實施例2所示之小鼠T細胞同樣，藉由實施CD137刺激可強力誘發T細胞之活化。
11-3.抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體之GPC3依存性的體外CD137致效劑作用之評價
人類CD137在B細胞株HDML-2也會表現，CD137之致效劑活性也可使用HDML-2測定。於含有20% FBS及規定濃度之盤尼西林鏈黴素之RPMI1640培養基中，將人類B細胞癌細胞株HDLM-2以8×105cells/ml的密度懸浮。又，將表現人類GPC3之小鼠大腸癌細胞株CT26-GPC3(參考例3)以相同培養基以4×105cells/ml的密度懸浮。將兩細胞懸浮液等量混合，以100μl/井向96井板接種。於其中以10μg/ml的濃度添加對照人類IgG(Allexis,804-133-C100：第19圖中之Ctrl hIgG1) 或前項11-1製備之向FcγR之結合極度減弱的抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體，於37℃、5% CO2的條件下培養3日。回收培養後的上清，利用ELISA測定含有的人類IL-6濃度，以評價B細胞的活化。ELISA依套組製造業者(PeproTech公司)之指示實施。
其結果(第19圖)，抗人類GPC3/抗人類CD137雙專一性抗體顯示IL-6誘導活性。此顯示：人類B細胞株也和使用實施例2所示之小鼠T細胞之情形、使用實施例11-2所示之人類T細胞之情形同樣，能評價CD137刺激。依實施例11-2與11-3，顯示人類CD137也和以小鼠CD137實施之實施例2至5所示之結果同樣，以雙專一性抗體具有致效劑活性，據認為可期待和小鼠CD137有同樣的效果。
[產業利用性]
依本發明能提供沒有癌抗原非依存性的細胞介素風暴(cytokine storm)、正常組織傷害等所致毒性，安全性高、且有優良抗腫瘤活性的新穎的抗原結合分子或醫藥組合物。含有本發明之抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物藉由以癌抗原依存的地將免疫細胞活化，能帶來將包括癌細胞之各種細胞為標的之細胞傷害作用，能夠治療或預防各種癌。能成為對於患者而言，不只安全性高，且身體負擔少、便利性也高的理想治療。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
<120> 免疫活化抗原結合分子
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<160> 125
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Figure 104111074-A0202-12-0109-10
Figure 104111074-A0202-12-0110-11
Figure 104111074-A0202-12-0111-12
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Figure 104111074-A0202-12-0111-13
Figure 104111074-A0202-12-0112-14
Figure 104111074-A0202-12-0113-15
<210> 3
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Figure 104111074-A0202-12-0113-16
Figure 104111074-A0202-12-0114-17
Figure 104111074-A0202-12-0115-18
<210> 4
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Figure 104111074-A0202-12-0115-19
Figure 104111074-A0202-12-0116-20
Figure 104111074-A0202-12-0117-21
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 5
Figure 104111074-A0202-12-0117-22
Figure 104111074-A0202-12-0118-23
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 6
Figure 104111074-A0202-12-0119-24
Figure 104111074-A0202-12-0120-25
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 7
Figure 104111074-A0202-12-0121-26
Figure 104111074-A0202-12-0122-27
Figure 104111074-A0202-12-0123-28
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
<400> 8
Figure 104111074-A0202-12-0123-29
Figure 104111074-A0202-12-0124-30
<210> 9
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Figure 104111074-A0202-12-0125-31
<210> 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Figure 104111074-A0202-12-0126-32
<210> 11
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Figure 104111074-A0202-12-0127-33
Figure 104111074-A0202-12-0128-34
<210> 12
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<213> Homo sapiens
<400> 12
Figure 104111074-A0202-12-0128-35
Figure 104111074-A0202-12-0129-36
<210> 13
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Figure 104111074-A0202-12-0129-37
Figure 104111074-A0202-12-0130-38
<210> 14
<211> 549
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
Figure 104111074-A0202-12-0130-39
<210> 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Figure 104111074-A0202-12-0131-40
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<210> 16
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
Figure 104111074-A0202-12-0132-42
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Figure 104111074-A0202-12-0132-43
Figure 104111074-A0202-12-0133-44
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<213> Homo sapiens
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Figure 104111074-A0202-12-0133-45
Figure 104111074-A0202-12-0134-46
<210> 19
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Figure 104111074-A0202-12-0134-47
Figure 104111074-A0202-12-0135-48
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 20
Figure 104111074-A0202-12-0135-49
<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 21
Figure 104111074-A0202-12-0135-50
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0136-51
<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0136-52
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0136-53
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
<400> 25
Figure 104111074-A0202-12-0137-54
<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0137-55
<210> 27
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<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0137-56
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<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0139-59
Figure 104111074-A0202-12-0140-60
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0142-63
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<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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<213> 人工
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<223> 人工合成序列
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<223> 人工合成序列
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Figure 104111074-A0202-12-0149-74
Figure 104111074-A0202-12-0150-75
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<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 35
Figure 104111074-A0202-12-0151-76
Figure 104111074-A0202-12-0152-77
Figure 104111074-A0202-12-0153-78
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 36
Figure 104111074-A0202-12-0153-79
Figure 104111074-A0202-12-0154-80
<210> 37
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 37
Figure 104111074-A0202-12-0154-81
Figure 104111074-A0202-12-0155-82
Figure 104111074-A0202-12-0156-83
Figure 104111074-A0202-12-0157-84
<210> 38
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 38
Figure 104111074-A0202-12-0157-85
Figure 104111074-A0202-12-0158-86
Figure 104111074-A0202-12-0159-87
<210> 39
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 39
Figure 104111074-A0202-12-0159-88
Figure 104111074-A0202-12-0160-89
Figure 104111074-A0202-12-0161-90
Figure 104111074-A0202-12-0162-91
<210> 40
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 40
Figure 104111074-A0202-12-0162-92
Figure 104111074-A0202-12-0163-93
Figure 104111074-A0202-12-0164-94
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 41
Figure 104111074-A0202-12-0165-95
Figure 104111074-A0202-12-0166-96
Figure 104111074-A0202-12-0167-97
<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 42
Figure 104111074-A0202-12-0167-98
Figure 104111074-A0202-12-0168-99
Figure 104111074-A0202-12-0169-100
<210> 43
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 43
Figure 104111074-A0202-12-0170-101
Figure 104111074-A0202-12-0171-102
Figure 104111074-A0202-12-0172-103
<210> 44
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 44
Figure 104111074-A0202-12-0172-104
Figure 104111074-A0202-12-0173-105
Figure 104111074-A0202-12-0174-106
<210> 45
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 45
Figure 104111074-A0202-12-0175-107
Figure 104111074-A0202-12-0176-108
<210> 46
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 46
Figure 104111074-A0202-12-0176-109
Figure 104111074-A0202-12-0177-110
<210> 47
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 47
Figure 104111074-A0202-12-0177-111
Figure 104111074-A0202-12-0178-112
Figure 104111074-A0202-12-0179-113
Figure 104111074-A0202-12-0180-114
<210> 48
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 48
Figure 104111074-A0202-12-0180-115
Figure 104111074-A0202-12-0181-116
Figure 104111074-A0202-12-0182-117
<210> 49
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 49
Figure 104111074-A0202-12-0182-118
Figure 104111074-A0202-12-0183-119
<210> 50
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 50
Figure 104111074-A0202-12-0183-120
Figure 104111074-A0202-12-0184-121
Figure 104111074-A0202-12-0185-122
<210> 51
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 51
Figure 104111074-A0202-12-0186-123
Figure 104111074-A0202-12-0187-124
<210> 52
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 52
Figure 104111074-A0202-12-0187-125
Figure 104111074-A0202-12-0188-126
<210> 53
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 53
Figure 104111074-A0202-12-0188-127
Figure 104111074-A0202-12-0189-128
Figure 104111074-A0202-12-0190-129
<210> 54
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 54
Figure 104111074-A0202-12-0190-130
Figure 104111074-A0202-12-0191-131
Figure 104111074-A0202-12-0192-132
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 55
Figure 104111074-A0202-12-0192-133
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 56
Figure 104111074-A0202-12-0192-134
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 57
Figure 104111074-A0202-12-0192-135
<210> 58
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 58
Figure 104111074-A0202-12-0193-136
Figure 104111074-A0202-12-0194-137
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Figure 104111074-A0202-12-0194-138
Figure 104111074-A0202-12-0195-139
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Figure 104111074-A0202-12-0195-140
Figure 104111074-A0202-12-0196-141
<210> 61
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 61
Figure 104111074-A0202-12-0196-142
Figure 104111074-A0202-12-0197-143
<210> 62
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 62
Figure 104111074-A0202-12-0197-144
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 63
Figure 104111074-A0202-12-0198-145
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 64
Figure 104111074-A0202-12-0199-146
<210> 65
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 65
Figure 104111074-A0202-12-0199-147
Figure 104111074-A0202-12-0200-148
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 66
Figure 104111074-A0202-12-0200-149
Figure 104111074-A0202-12-0201-150
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 67
Figure 104111074-A0202-12-0201-151
Figure 104111074-A0202-12-0202-152
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 68
Figure 104111074-A0202-12-0202-153
Figure 104111074-A0202-12-0203-154
<210> 69
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 69
Figure 104111074-A0202-12-0203-155
<210> 70
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 70
Figure 104111074-A0202-12-0204-156
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 71
Figure 104111074-A0202-12-0205-157
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 72
Figure 104111074-A0202-12-0205-158
Figure 104111074-A0202-12-0206-159
<210> 73
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 73
Figure 104111074-A0202-12-0206-160
Figure 104111074-A0202-12-0207-161
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 74
Figure 104111074-A0202-12-0207-162
Figure 104111074-A0202-12-0208-163
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 75
Figure 104111074-A0202-12-0208-164
Figure 104111074-A0202-12-0209-165
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 76
Figure 104111074-A0202-12-0209-166
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 77
Figure 104111074-A0202-12-0210-167
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 78
Figure 104111074-A0202-12-0211-168
<210> 79
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 79
Figure 104111074-A0202-12-0211-169
Figure 104111074-A0202-12-0212-170
<210> 80
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 80
Figure 104111074-A0202-12-0212-171
Figure 104111074-A0202-12-0213-172
<210> 81
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 81
Figure 104111074-A0202-12-0213-173
Figure 104111074-A0202-12-0214-174
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 82
Figure 104111074-A0202-12-0214-175
<210> 83
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 83
Figure 104111074-A0202-12-0215-176
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 84
Figure 104111074-A0202-12-0215-177
Figure 104111074-A0202-12-0216-178
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 85
Figure 104111074-A0202-12-0216-179
Figure 104111074-A0202-12-0217-180
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 86
Figure 104111074-A0202-12-0217-181
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 87
Figure 104111074-A0202-12-0218-182
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 88
Figure 104111074-A0202-12-0219-183
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 89
Figure 104111074-A0202-12-0219-184
Figure 104111074-A0202-12-0220-185
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 90
Figure 104111074-A0202-12-0220-186
Figure 104111074-A0202-12-0221-187
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 91
Figure 104111074-A0202-12-0221-188
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 92
Figure 104111074-A0202-12-0222-189
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 93
Figure 104111074-A0202-12-0222-190
Figure 104111074-A0202-12-0223-191
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 94
Figure 104111074-A0202-12-0223-192
Figure 104111074-A0202-12-0224-193
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 95
Figure 104111074-A0202-12-0224-194
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 96
Figure 104111074-A0202-12-0225-195
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 97
Figure 104111074-A0202-12-0225-196
Figure 104111074-A0202-12-0226-197
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 98
Figure 104111074-A0202-12-0226-198
Figure 104111074-A0202-12-0227-199
<210> 99
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 99
Figure 104111074-A0202-12-0227-200
Figure 104111074-A0202-12-0228-201
Figure 104111074-A0202-12-0229-202
<210> 100
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 100
Figure 104111074-A0202-12-0229-203
Figure 104111074-A0202-12-0230-204
Figure 104111074-A0202-12-0231-205
<210> 101
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 101
Figure 104111074-A0202-12-0231-206
Figure 104111074-A0202-12-0232-207
Figure 104111074-A0202-12-0233-208
Figure 104111074-A0202-12-0234-209
<210> 102
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 102
Figure 104111074-A0202-12-0234-210
Figure 104111074-A0202-12-0235-211
<210> 103
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 103
Figure 104111074-A0202-12-0235-212
Figure 104111074-A0202-12-0236-213
Figure 104111074-A0202-12-0237-214
<210> 104
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 104
Figure 104111074-A0202-12-0238-215
Figure 104111074-A0202-12-0239-216
<210> 105
<211> 163
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Figure 104111074-A0202-12-0239-217
Figure 104111074-A0202-12-0240-218
<210> 106
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Figure 104111074-A0202-12-0240-219
<210> 107
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Figure 104111074-A0202-12-0240-220
Figure 104111074-A0202-12-0241-221
<210> 108
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Figure 104111074-A0202-12-0241-222
<210> 109
<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Figure 104111074-A0202-12-0241-223
<210> 110
<211> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Figure 104111074-A0202-12-0242-224
<210> 111
<211> 63
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Figure 104111074-A0202-12-0242-225
Figure 104111074-A0202-12-0243-226
<210> 112
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Figure 104111074-A0202-12-0243-227
<210> 113
<211> 72
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Figure 104111074-A0202-12-0244-228
<210> 114
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Figure 104111074-A0202-12-0244-229
Figure 104111074-A0202-12-0245-230
<210> 115
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 115
Figure 104111074-A0202-12-0245-231
Figure 104111074-A0202-12-0246-232
<210> 116
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 116
Figure 104111074-A0202-12-0246-233
<210> 117
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 117
Figure 104111074-A0202-12-0247-234
Figure 104111074-A0202-12-0248-235
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 118
Figure 104111074-A0202-12-0249-236
<210> 119
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 119
Figure 104111074-A0202-12-0249-237
Figure 104111074-A0202-12-0250-238
Figure 104111074-A0202-12-0251-239
<210> 120
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 120
Figure 104111074-A0202-12-0251-240
Figure 104111074-A0202-12-0252-241
<210> 121
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 121
Figure 104111074-A0202-12-0252-242
Figure 104111074-A0202-12-0253-243
<210> 122
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 122
Figure 104111074-A0202-12-0253-244
Figure 104111074-A0202-12-0254-245
<210> 123
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 123
Figure 104111074-A0202-12-0254-246
<210> 124
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 124
Figure 104111074-A0202-12-0255-247
<210> 125
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 125
Figure 104111074-A0202-12-0255-248
Figure 104111074-A0202-12-0256-249

Claims (30)

  1. 一種雙專一性抗體，包含下列分域：(1)癌專一性抗原結合Fab分域，(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合Fab分域，其中，TNF受體超級家族結合Fab分域為CD137結合Fab分域或CD40結合Fab分域，及(3)FcRn結合分域，其中，該FcRn結合分域為對於Fc γ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
  2. 一種醫藥組合物，含有如申請專利範圍第1項之雙專一性抗體作為有效成分。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
  4. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，係癌治療用之組合物。
  5. 一種醫藥組合物，係將如申請專利範圍第1項之雙專一性抗體與抗原結合分子組合而成；該抗原結合分子包含下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)CD3結合分域。
  6. 如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為更包含FcRn結合分域之抗原結合分子。
  7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中，該FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低的抗體的Fc區。
  8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子為雙專一性抗體。
  9. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，其係摻合了該雙專一性抗體與該抗原結合分子。
  10. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，係併用了該雙專一性抗體與該抗原結合分子。
  11. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，該雙專一性抗體與該抗原結合分子係同時投予。
  12. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，該雙專一性抗體與該抗原結合分子係分別投予。
  13. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
  14. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之醫藥組合物，係癌治療用之組合物。
  15. 一種醫藥組合物，其含有雙專一性抗體作為有效成分且用於併用抗原結合分子；該雙專一性抗體含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合Fab分域，(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合Fab分域，其中，TNF受體超級家族結合Fab分域為CD137結合Fab分域或CD40結合Fab分域，及(3)FcRn結合分域，其中，該FcRn結合分域係對於Fc γ受體之結合活性降低之抗體之Fc區；該抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及 (2)CD3結合分域。
  16. 如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其係誘導細胞傷害之組合物。
  17. 如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其係癌治療用之組合物。
  18. 如申請專利範圍第15至17項中任一項之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子係更包含FcRn結合分域。
  19. 如申請專利範圍第18項之醫藥組合物，其中，該FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
  20. 如申請專利範圍第15至17項中任一項之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為雙專一性抗體。
  21. 如申請專利範圍第15至17項中任一項之醫藥組合物，係和該抗原結合分子同時投予。
  22. 如申請專利範圍第15至17項中任一項之醫藥組合物，係和該抗原結合分子分別投予。
  23. 一種醫藥組合物，其含有抗原結合分子作為有效成分且用於併用雙專一性抗體；該抗原結合分子含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合分域，及(2)CD3結合分域；該雙專一性抗體含有下列分域：(1)癌專一性抗原結合Fab分域，(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體超級家族結合分域，其中，TNF受體超級家族結合Fab分域為CD137結合Fab分域或CD40 結合Fab分域，及(3)FcRn結合分域，其中，該FcRn結合分域係對於Fc γ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
  24. 如申請專利範圍第23項之醫藥組合物，係誘導細胞傷害之組合物。
  25. 如申請專利範圍第23項之醫藥組合物，係癌治療用之組合物。
  26. 如申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子係更包含FcRn結合分域。
  27. 如申請專利範圍第26項之醫藥組合物，其中，該FcRn結合分域係對於Fcγ受體之結合活性降低之抗體之Fc區。
  28. 如申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為雙專一性抗體。
  29. 如申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組合物，係和該雙專一性抗體同時投予。
  30. 如申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組合物，係和該雙專一性抗體分別投予。
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