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Blutgerinnsel (Thromben) bilden sich durch eine Reihe von Zymogenaktivierungen. Im Verlauf dieser enzymatischen Kaskade katalysiert jeweils die aktivierte Form eines Faktors die Aktivierung des nächsten. Thromben sind Ablagerungen von Blutbestandteilen an der Oberfläche der Gefäss- wand und bestehen zum Grossteil aus aggregierten Blutplättchen und unlöslichem, quervernetztem Fibrin. Fibrinbildung erfolgt mittels Thrombin durch begrenzte Proteolyse von Fibrinogen. Thrombin ist das Endprodukt der Gerinnungskaskade, einem Ablauf von Zymogen-Aktivierungen an der Oberfläche von Plättchen, Leukozyten und einer Vielzahl von vaskulären Zellen (K. G. Mann, Blood, 1990, Bd. 76, S. 1-16).
Die Aktivierung von Faktor X durch den Komplex aus aktiviertem Faktor IX (F IXa) und aktivier- tem Faktor VIII (F Villa) stellt einen Schlüsselschritt der Gerinnung dar. Ein Fehlen oder eine gestörte Funktion der Komponenten dieses Komplexes ist assoziiert mit der als Hämophilie be- zeichneten Blutgerinnungsstörung (J. E. Sadler & E.W.Davie : Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's disease, in G. Stamatoyannopoulos et al. (Hrsg. ): The molecular basis of blood dis- eases. W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, S. 576-602). Hämophilie A bezeichnet ein (funktio- nelles) Fehlen der Faktor VIII-Aktivität, Hämophilie B ein Fehlen der Faktor IX-Aktivität.
Die Behandlung der Hämophilie A erfolgt derzeit über eine Ersatztherapie durch Verabreichung von Faktor VIII-Konzentraten, wobei es bei etwa 20-30% der Hämophilie A-Patienten zur Bildung von Faktor VIII-Inhibitoren (d. h. Antikörper gegen Faktor VIII) kommt, wodurch die Wirkung der verabreichten Faktor VIII-Präparate inhibiert wird.
Die Behandlung von Faktor VIII-Inhibitor-Patienten ist sehr schwierig und mit Risiken verbun- den, und bisher gibt es nur eine begrenzte Zahl spezieller Verfahren zur Behandlung dieser Patien- ten. Im Falle von Patienten mit niedrigem FVIII-Inhibitorgehalt ist es möglich, jedoch sehr teuer, hohe Dosen von Faktor VIII zu verabreichen und dadurch die Faktor VIII-Antikörper zu neutralisie- ren. Der überschüssige Faktor VIII wirkt dann hämostatisch. In vielen Fällen erfolgt eine Desensibi- lisierung, und es ist wiederum möglich, Faktor VIII-Standardbehandlungen anzuwenden. Eine solche Behandlung mit hoher Dosis erfordert jedoch grosse Mengen an Faktor VIII, ist zeitaufwen- dig und kann mit schweren anaphylaktischen Nebenreaktionen verbunden sein. Alternativ kann die Behandlung mit porcinen Faktor VIII-Molekülen erfolgen.
Eine weitere kostenintensive Methode zur Entfernung der Faktor VIII-Inhibitoren arbeitet mit der extrakorporalen Immunadsorption an Lektinen, die an Immunglobuline (Protein A, Protein G) oder an immobilisierten Faktor VIII binden. Da der Patient während dieser Behandlung mit der Apherese-Maschine verbunden sein muss, ist dieses Verfahren auch eine grosse Belastung für den Patienten und es ist nicht möglich, damit eine akute Blutung zu behandeln.
Bisher war jedoch die Therapie der Wahl die Verabreichung von aktivierten Prothrombin- Komplex-Konzentraten (activated prothrombin complex concentrates, APCC) wie FEIBA und AUTOPLEX, welches selbst bei Patienten mit hohem Inhibitor-Titer zur Behandlung akuter Blu- tungen geeignet ist (DE 31 27 318 A).
Beim intravaskulären System der Blutgerinnung ist der letzte Schritt die Aktivierung von Faktor X durch Faktor 1Xa. eine Reaktion, die durch Bindung des Faktor Villa an Faktor IXa stimuliert wird.
Dabei kommt es zur Bildung eines "Tenase"-Komplexes bestehend aus den Faktoren IXa, Villa, X und Phospholipid. Ohne Bindung von FVllla zeigt FIXa keine oder nur sehr geringe enzymatische Aktivität gegen FX.
Eine Anzahl möglicher Bindungsstellen von Faktor Villa an Faktor IXa wurde in den letzten Jahren charakterisiert und zeigte, dass Antikörper oder Peptide, die an diesen Regionen binden, die Aktivität des FIXa inhibieren (Fay et al., J.Biol.Chem., 1994, Bd. 269, S. 20522-20527, Lenting et al., J.Biol.Chem., 1996, Bd. 271, S. 1935-1940, Jorquera et al., Circulation, 1992, Bd. 86, abstract 2725).
Eine Inhibierung von Gerinnungsfaktoren, u.a. auch Faktor IX, wurde auch durch monoklonale Antikörper erreicht, mit dem Ziel, Thrombosenbildung zu verhindern (WO 97/26010 A).
Einen gegenteiligen Effekt, nämlich die Verstärkung der Faktor IXa vermittelten Aktivierung von Faktor X beschreiben Liles D. K. et al., Blood, 1997, Bd. 90, Suppl 1,2054) durch Bindung eines Faktor VIII-Peptids (Aminosäuren 698-712). Dieser Effekt tritt jedoch nur in Abwesenheit von Faktor Villa auf, in Anwesenheit von Faktor Villa wird durch dieses Peptid die Faktor IXa/Faktor Villa vermittelte Spaltung des Faktor X inhibiert.
Gerade in Hinblick auf die möglichen Risiken und Nebenwirkungen, die bei der Behandlung
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von Hämophilie-Patienten auftreten können, besteht ein grosser Bedarf an einer Therapiemöglich- keit, die vor allem auch eine effektive Behandlung von FVIII-Inhibitor-Patienten ermöglicht.
Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Präparat für die Behandlung von Blutgerin- nungsstörungen zu finden, die auch für Faktor VIII Inhibitor-Patienten besondere Vorteile zeigt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass Antikörper oder Antikörper-Derivate gegen Faktor IX/Faktor IXa hergestellt wurden, die eine Faktor Vllla-Cofaktor-Aktivität bzw. eine Faktor IXa aktivierende Aktivität aufweisen und zu einer Steigerung der prokoagulatorischen Aktivität des Faktor IXa führen.
Überraschenderweise wird die Wirkung dieser erfindungsgemässen Faktor IX/Faktor IXa akti- vierenden Antikörper und Antikörper-Derivate, durch das Vorhandensein von Inhibitoren, wie etwa Inhibitoren gegen Faktor VIII/Faktor Villa, nicht beeinträchtigt, sondern auch in diesem Fall die prokoagulatorische Aktivität des Faktor IXa verstärkt.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung liegt darin, dass die Verabreichung der erfindungsgemässen Präparation auch bei einem Fehlen des Faktor VIII bzw. Faktor Villa die rasche Blutgerinnung ermöglicht, auch wenn es sich um einen FVIII Inhibitor-Patienten handelt. Diese Agenzien sind überraschenderweise auch in Gegenwart von Faktor Villa wirksam.
Die FVIII-ähnliche Cofaktor-Aktivität der erfindungsgemässen Agenzien liegt darin, dass die Wir- kungsweise des Agens mit der Wirkungsweise von Faktor Villa im Hinblick auf die Generierung von Faktor Xa vergleichbar ist.
Die erfindungsgemässen Antikörper oder Antikörper-Derivate weisen demgemäss eine FVIII-Cofaktor-Aktivität auf, die in einem FVIII-Assay (z. B. COATEST-Test oder Immunochrom- Test) nach zwei Stunden Inkubation ein Verhältnis von Background (Grundrauschen) zu Messwert von zumindest 3 aufweisen. Die Berechnung dieses Verhältnisses kann dabei z. B. nach dem folgenden Schema erfolgen:
Antikörper-Messwert (OD 405) - Reagentienleerwert
3 Maus-IgG-Messwert (OD 405) - Reagentienleerwert nach zwei Stunden Inkubation.
OD (405) : optische Dichte der Antikörper-Testlösung bei 405 nm gemessen.
Die erfindungsgemässen Antikörper haben eine in vivo-Halbwertszeit von mindestens 5 Tagen, bevorzugt mindestens 10 Tage, besonders bevorzugt mindestens 20 Tage.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Antikörper oder Antikörper-Derivate sind in den Ansprüchen 2 bis 10 und 13 bis 29 angeführt.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Präparat enthaltend Antikörper und/oder Antikör- per-Derivate gegen Faktor IX/Faktor IXa und eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz.
Weiters kann das erfindungsgemässe Präparat zusätzlich Faktor IX und/oder Faktor IXa enthalten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die für die erfindungsgemässen Antikörper und Antikör- per-Derivate kodierenden Nukleinsäuren, Expressionsvektoren, die Hybridomzelllinien (Ansprüche 11 und 12) und Verfahren zu ihrer Herstellung (Ansprüche 30 bis 33) sowie pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemässen Antikörper oder Antikörper-Derivate, und ihre Ver- wendungen (Ansprüche 34 bis 39).
Antikörper sind Immunglobulin-Moleküle mit spezifischer Aminosäuresequenz, die nur an Anti- gene binden, die ihre Synthese induzieren (bzw. sein Immunogen) oder an Antigene (oder Immu- nogen), die den ersten sehr ähnlich sind. Jedes Immunglobulin-Molekül besteht aus zwei Typen von Polypeptidketten. Jedes Molekül besteht aus grossen, identischen schweren Ketten (H-Kette) und zwei leichten, ebenfalls identischen Ketten (L-Kette). Die Polypeptide sind verbunden über Disulfid-Brücken und nicht-kovalente Bindungen. In vivo werden die schweren und leichten Ketten an unterschiedlichen Ribosomen gebildet, in der Zelle zusammengefügt und als intakte Immunglo- buline sekretiert (Roitt I. et al., in : Immunology, zweite Ausg., 1989).
Die erfindungsgemässen Antikörper, Antikörper-Derivate und davon abgeleitete organische Verbindungen umfassen humane und tierische monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, Einzelketten-Antikörper und Miniantikörper (Fragmente von Einzelketten-Antikörpern), bispezifi- sche Antikörper, "Diabodies", "Triabodies", oder Di-, Oligo- oder Multimere davon. Mitumfasst sind auch Peptidomimetica oder Peptide, die von den erfindungsgemässen Antikörpern abgeleitet sind, beispielsweise umfassen sie eine oder mehrere der CDR-Regionen, bevorzugt die CDR3-Region.
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Ebenfalls mitumfasst sind vollständig humane monoklonale Antikörper. Weiters mitumfasst sind auch Peptid-Sequenzen, die, basierend auf einer Struktur-Aktivitäts-Verbindung, einem künstlichen Modellierungsprozess unterworfen wurden (Greer J. et al., J. Med.Chem., 1994, Bd. 37, S. 1035- 1054).
Unter dem Begriff Faktor IX/IXa aktivierende Antikörper und Antikörper-Derivate können auch Proteine mitumfasst sein, die durch Expression einer veränderten, Immunglobulin-kodierenden Region in einer Wirtszelle hergestellt werden, beispielsweise "technisch modifizierte Antikörper", z. B. synthetische Antikörper, chimäre oder humanisierte Antikörper oder Mischungen davon, oder Antikörper-Fragmente, denen die konstante Region teilweise oder zur Gänze fehlt, z. B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab)'2 etc.. In diesen technisch modifizierten Antikörpern können beispielsweise ein Teil oder Teile der leichten und/oder schweren Kette ersetzt sein. Beispielsweise können solche Mole- küle Antikörper umfassen, die aus einer humanisierten schweren Kette und einer unmodifizierten leichten Kette (oder Chimären leichten Kette) bestehen, oder umgekehrt.
Die Begriffe Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F (ab)2 wie im Stand der Technik beschrieben, verwendet. (Harlow E. and Lane D., in "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab)2-Fragmenten, die aus monoklonalen Antikörpern (mAb) abstammen, die gegen Faktor IX/Faktor IXa gerichtet sind und eine Steigerung der prokoagulatorischen Aktivität des Faktor IXa bewirken.
Bevorzugterweise werden die heterologen Framework-Regionen und konstanten Regionen aus den humanen Immunglobulinklassen und Isotypen ausgewählt, wie IgG (Subtypen 1 bis 4), lgM, IgA und IgE. Im Verlauf der Immunreaktion kann auch ein "Class Switch" der Immunglobuline erfolgen, beispielsweise ein Switch von IgM zu IgG, dabei werden die konstanten Regionen ausge- tauscht, z. B. von zu y. Ein Class-Switch kann auch ganz gezielt mittels gentechnischer Verfahren ("Directed Class Switch Recombination") hervorgerufen werden, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist (Esser C. und Radbruch A., Annu.Rev.lmmunol., 1990, Bd. 8, S. 717-735).
Die Antikörper und Antikörper-Derivate gemäss der vorliegenden Erfindung müssen aber nicht nur humane Sequenzen der Immunglobulin-Proteine umfassen.
In einer besonderen Ausführungsform enthält ein humanisierter Antikörper "Complement de- termining regions" (CDRs) aus murinen monoklonalen Antikörpern, die in die Framework-Bereiche ausgewählter humaner Antikörper-Sequenzen insertiert sind. Es können aber auch humane CDR-Regionen verwendet werden. Bevorzugterweise sind die variablen Regionen in den humanen leichten und schweren Ketten durch eine oder mehrere CDR-Austausche technisch verändert. Es ist auch möglich, alle sechs CDRs oder verschiedenste Kombinationen von weniger als sechs CDRs zu verwenden.
Der humanisierte Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung hat bevorzugterweise die Struktur eines humanen Antikörpers oder eines Fragments davon und weist die Kombination von Eigenschaften auf, die für eine effiziente therapeutische Anwendung notwendig ist, d. h. z. B. die Behandlung von Gerinnungsstörungen in Patienten, bevorzugt von Faktor VIII-Inhibitor-Patienten.
Ein chimärer Antikörper unterscheidet sich vom humanisierten Antikörper dadurch, dass er die gesamten variablen Regionen inklusive der Framework-Regionen der schweren und leichten Kette nicht-humanen Usprungs enthält, in Verbindung mit den konstanten Regionen beider Ketten aus humanem Immunglobulin. Beispielsweise kann ein chimärer Antikörper bestehend aus Maus- Sequenzen und humanen Sequenzen hergestellt werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung können die Antikörper und Antikörper-Derivate auch Ein- zelketten-Antikörper ("Single-chain antibody") oder Miniantikörper (scFv-Fragmente, die beispiels- weise verknüpft sind mit Prolin-reichen Sequenzen und Oligomerisierungsdomänen, siehe Pluckthun A. und Pack P., Immunotechnology, 1997, Bd. 3, S. 83-105) oder Einzelketten Fv (sFv) sein, die die gesamte Antikörperbindungsregion in einer einzelnen Polypeptid-Kette inkorporieren.
Beispielsweise können die Einzelketten-Antikörper durch Verknüpfung der V-Gene mit einem Oligonukleotid, das als Linker-Sequenz konstruiert wurde und den C-Terminus der ersten V-Region mit dem N-Terminus der zweiten V-Region verbindet, beispielsweise in der Anordnung VH-Linker- VL oder LV-Linker-HV; sowohl VH als auch VL können also die N-terminale Domäne darstellen.
(Huston JS et al., Int.Rev. Immunol., 1993, Bd. 10, S. 195-217 ; R. und Whitlow M., FASEB J., 1995, Bd. 9, S. 73-80). Das Protein, das als Linker-Sequenz verwendet werden kann, kann
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beispielsweise eine Länge von bis zu 150 A, bevorzugt bis 80 A, besonders bevorzugt bis 40 A, aufweisen. Besonders bevorzugt sind wegen ihrer Flexibilität Linker-Sequenzen, die Glycin und Serin enthalten, bzw. Glutamin und Lysin wegen der Löslichkeit. Die Wahl der Aminosäuren erfolgt auch nach den Kriterien der Immunogenität und Stabilität, auch abhängig davon, ob diese Einzel- kettenantikörper für physiologische oder industrielle Anwendungen (z.B. Immunoaffinitätschroma- tographie) geeignet sein sollen. Die Einzelkettenantikörper können auch als Aggregate vorliegen, beispielsweise als Trimere, Oligomere oder Multimere.
Die Linker-Sequenz kann aber auch fehlen, und die Verknüpfung der VH- und VL-Ketten direkt erfolgen.
Bispezifische Antikörper sind makromolekulare, heterobifunktionelle "Cross-Linker" mit zwei verschiedenen Bindungsspezifitäten innerhalb eines einzelnen Moleküls. Zu dieser Gruppe gehö- ren beispielsweise bispezifische (bs) IgGs, bs IgM-lgAs, bs IgA-Dimere, bs (Fab') 2, bs(scFv)2, Diabodies, bs bis Fab Fc etc. (Cao Y. and Suresh M. R., Bioconjugate Chem., 1998, vol. 9, pp.
635-644).
Unter "Peptidomimetica" werden Protein-Komponenten von niedrigem Molekulargewicht ver- standen, die die Struktur einer natürlichen Peptid-Komponente nachahmen, oder von Konformati- ons-Schablonen ("Templates"), die eine spezifische Strukturformation in einer angrenzenden Peptidsequenz induzieren (Kemp DS, Trends Biotechnol., 1990, pp. 249-255). Die Peptidomimeti- ca können beispielsweise von CDR3-Domänen stammen.
Mit dem Begriff Antikörper und Antikörper-Derivate können auch Agenzien umfasst sein, die mit- tels einer Erfassung von Daten zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung erhalten wurden. Diese Verbin- dungen können auch als Peptidomimetics eingesetzt werden (Grassy G. et al., Nature Biotechnol., 1998, vol. 16, pp. 748-752 ; J. et al., J. Med.Chem., 1994, vol. 37, pp. 1035-1054).
Beispiele für Hybridome, die die erfindungsgemässen Antikörper oder Antikörperderivate produ- zieren, wurden am 9. September 1999 unter den Nummern 99090924 (#198/A1), 99090925 (#198/B1) und 99090926 (#198/BB1 ) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG:
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können durch die aus dem Stand der Technik be- kannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch konventionelle Hybridom-Techniken, oder mittels Phage display-Genbanken, lmmunglobulinketten-"Shuffling" oder Humanisierungs- Techniken (Aharlow E. und Lane D., in : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Die Herstellung der erfindungsgemässen Antikörper und Antikörper-Derivate kann mittels je- dem, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgen. Beispielsweise durch konventio- nelle Hybridom-Techniken (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Hrsg. Harlow und Lane, S. 148-242). Gemäss der vorliegenden Erfindung können dafür humane aber auch nicht-humane Spezies herangezogen werden, wie etwa Rinder, Schweine, Affen, Hühner oder Nagetiere (Mäuse, Ratten). Es können beispielsweise normal immunkompeten- te Balb/c-Mäuse oder FIX-defiziente Mäuse verwendet werden. (Die Faktor IX-defizienten Mäuse stammen von Dr. Darrel Stafford von der University of North Carolina, Chapel Hill).
Dabei kann die Immunisierung beispielsweise mittels Faktor IX, Faktor IXaa oder vollständig aktiviertem Faktor IXass erfolgen, oder mit Fragmenten davon.
Die Hybridome werden dahingehend selektiert, dass die Antikörper und Antikörper-Derivate in den Überständen der Hybridomzellen an Faktor IX/Faktor IXa binden und eine Steigerung der prokoagulatorischen Aktivität des Faktor IXa bewirken. Die Steigerung der prokoagulatorischen Aktivität kann beispielsweise durch Testverfahren nachgewiesen werden, wie sie aus dem Stand der Technik für die Messung von Faktor Vlll-ähnlicher Aktivität bekannt sind, beispielsweise chro- mogene Assays.
Alternativ dazu können die erfindungsgemässen Antikörper und Antikörper-Derivate auch über rekombinante Herstellungsverfahren produziert werden. Dabei kann die DNA-Sequenz der erfin- dungsgemässen Antikörper mittels bekannter Techniken ermittelt und Teile oder die Gesamtheit der Antikörper-DNA in geeigneten Systemen exprimiert werden. Es können rekombinante Herstel- lungsverfahren verwendet werden, wie etwa die Verwendung von Phage display, synthetischen und natürlichen Libraries ; der Antikörperproteine in bekannten Expressionssystemen,
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Expression in transgenen Tieren etc. (Jones et al., Nature, 1986, Bd. 321, S. 522-525 ; PhageDisplay of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, 1996, Hrsg. Kay et al., S.127-139 ; US 4,873,316).
Die Expression von rekombinant hergestellten Antikörpern kann mittels konventioneller Ex- pressionsvektoren erfolgen, wie etwa bakterielle Vektoren, wie pBR322 und dessen Derivate, pSKF oder eukaryotische Vektoren, wie pMSG, SV40 Vektoren etc. Dabei können jene Sequen- zen, die für den Antikörper kodieren, mit regulatorischen Sequenzen versehen werden, die die
Replikation und Expression und weiters die Sekretion aus der Wirtszelle regulieren. Diese regulato- rischen Sequenzen umfassen Promotoren, z. B. CMV oder SV40 ; undSignal-Sequenzen.
Die Expressionsvektoren können auch Selektions- und Amplifikationsmarker enthalten, wie das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (DHFR), Hygromycin B-Phosphotransferase, Thymidin-Kinase etc..
Die Komponenten der verwendeten Vektoren, wie Selektionsmarker, Replicons, Enhancer etc., können entweder käuflich erworben werden oder mittels konventioneller Verfahren hergestellt werden. Die Vektoren können für die Expression in verschiedensten Zellkulturen konstruiert wer- den, z. B. für Säuger-Zellen wie CHO, COS; Fibroblasten, Insektenzellen, Hefe oder Bakterien, wie E. coli etc.. Bevorzugt werden jene Zellen verwendet, die eine optimale Glykosylierung des expri- mierten Proteins erlauben. Besonders bevorzugt ist der Vektor pBax (s. Fig. 17), der in CHO-Zellen oder SK-Hep exprimiert wird.
Die Herstellung von Fab-Fragmenten oder F (ab)2-Fragmenten gemäss Verfahren erfolgen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. durch Spaltung der mAb mit proteolytischen Enzymen, wie Papain und/oder Pepsin, oder mittels rekombinanter Verfahren.
Diese Fab- und F (ab)2-Fragmente auch mittels einer Phage display-Genbank herge- stellt werden (Winter et al., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12 :433-455).
Die Antikörper-Derivate können auch mittels Verfahren hergestellt werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise durch molekulares Modellieren, z. B. aus Grassy G. et al., Nature Biotechnol., 1998, Bd. 16, S. 748-752, oder Greer J. et al., J. Med.Chem., Bd. 37, S.
1035-1054, oder Rees A. et al., in : "Protein Structure Predicition. A practical approach", Hrsg.
Sternberg M.J.E., IRL press, 1996, Kap. 7-10, S. 141-261.
Die Reinigung der erfindungsgemässen Antikörper und Antikörper-Derivate kann ebenfalls mit- tels Verfahren durchgeführt werden, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, z. B. Ammon- sulfat-Präzipitation, Affinitätsreinigung (Protein G-Sepharose), lonenaustauschchromatographie, Gelchromatographie etc.
Als Testverfahren, in dem nachgewiesen wird, dass die hergestellten Antikörper und Antikörper- Derivate an Faktor IX/Faktor IXa binden, die prokoagulatorische Aktivität des Faktor IXa steigern bzw. Faktor VIII-ähnliche Aktivität aufweisen, können beispielsweise folgende Methoden verwendet werden : Ein-Stufen-Gerinnungstest (Mikaelsson und Oswaldson, Scand.J.Haematol. Suppl., 33, S.
79-86,1984) oder chromogene Tests, wie COATEST VIII:C (Chromogenix) oder Immunochrom (IMMUNO). Prinzipiell können alle Verfahren verwendet werden, wie sie auch für die Bestimmung der Faktor VIII-Aktivität herangezogen werden. Als Kontroll-Leerwert für die Messungen kann beispielsweise unspezifischer Maus-IgG-Antikörper herangezogen werden.
Die vorliegenden Antikörper und Antikörper-Derivate sind geeignet zur therapeutischen Ver- wendung bei der Behandlung von Gerinnungsstörungen, z. B. bei Hämophilie A, Faktor VIII Inhibi- tor-Patienten etc. Die Verabreichung kann über jede Methode erfolgen, die dazu geeignet ist, das therapeutische Agens wirkungsvoll im Patienten zur Anwendung zu bringen, z. B. durch Verabrei- chung, wie etwa oral, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
Therapeutische Mittel gemäss der Erfindung können als Präparate hergestellt werden, die eine ausreichende Menge an Antikörper bzw. Antikörper-Derivaten als aktives Agens in einer pharma- zeutisch akzeptablen Trägersubstanz enthalten. Diese Mittel können sowohl in flüssiger als auch in pulverisierter Form vorliegen.
Weiters können die erfindungsgemässen Präparate aber auch Mischungen verschiedener Anti- körper, deren Derivate und/oder davon abgeleitete organische Verbindungen oder auch Mischun- gen, bestehend aus Antikörpern und Faktor IX und/oder Faktor IXa, enthalten. Faktor IXa kann dabei als Faktor IXaa und/oder Faktor IXass vorliegen. Wässrige Trägersubstanz kann beispiels- weise Kochsalzlösung sein. Die Lösungen sind steril, die Sterilisation erfolgt mittels konventioneller Verfahren.
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Die Antikörper oder Antikörper-Derivate gemäss der Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert vorliegen und vor Verabreichung in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert werden. Dieses Verfahren hat sich allgemein als vorteilhaft für die konventionellen Immunglobuline erwiesen, bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionsverfahren können dabei angewendet werden.
Weiters können die erfindungsgemässen Antikörper- und Antikörper-Derivate auch für indus- trielle Anwendungen verwendet werden, beispielsweise für die Reinigung von Faktor IX/Faktor IXa mittels Affinitätschromatographie, oder als Bestandteil von Nachweisverfahren (z.B. ELISA- Assays), oder als Agens für die Identifizierung von und Interaktion mit funktionellen Domänen aus einem Zielprotein.
Die vorliegende Erfindung wird durch folgende Beispiele und Zeichnungsfiguren näher be- schrieben, soll aber selbstverständlich nicht durch diese begrenzt sein:
Es zeigen:
Fig. 1. Ergebnisse eines Screenings auf FVIII-ähnliche Aktivität von Überständen aus Hybri- domzellkulturen. Vorselektierte Klone aus Fusionsexperimenten, #193, #195 und #196 wurden in einem chromogenen Assay getestet.
Fig. 2 : eines Screenings einer IgG vermittelten Faktor VIII-ähnlichen Aktivität in Über- ständen einer Hybridom-Zellkultur einer "Master"-Platte.
Fig. 3: Subklonierung des Klons 193/CO, Ergebnis der ersten Klonierungsrunde.
Fig. 4: Vergleich der chromogenen FVIII-ähnlichen Aktivität und Faktor IX-ELISA-Reaktivität der Hybridom-Kulturen, abgeleitet vom Ausgangsklon 193/CO.
Fig. 5 : der Messung der chromogenen Aktivität einiger Master-Klone und Subklone.
Fig. 6A: FVIII-ähnliche Aktivität von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern 193/AD3 und 196/AF2.
Fig. 6B : der chromogenen Aktivität von Faktor VIII, 196/AF1, 198/AC1/1 und Maus- IgG.
Fig. 7A : der Kinetik der Faktor Xa-Generierung durch Faktor VIII und 196/AF2 mit und ohne Zugabe eines Faktor Xa spezifischen Inhibitors.
Fig. 7B: Vergleich der Kinetik der Faktor Xa-Generierung durch Faktor VIII, Maus-IgG und Anti- Faktor IX/IXa-Antikörper 198/AM1 mit und ohne Zugabe eines Faktor Xa spezifischen Inhibitors.
Fig. 8A : der Abhängigkeit der Faktor VIII-ähnlichen Aktivität von gereinigtem anti- Faktor IX/IXa-Antikörper 198/AC1/1 von der An- und Abwesenheit von Phospholipiden, FIXa/FX und Calcium-Ionen.
Fig. 8B : der Abhängigkeit der FXa-Generierung durch anti-FIXa-Antikörper 196/AF1 von der Anwesenheit von Phospholipiden, Ca2+ in FIXa/FX.
Fig. 8C : der FXa-Generierung durch unspezifische Maus-lgG-Antikörper.
Fig. 9 : GraphischeDarstellung der Gerinnungszeiten von Faktor VIII-defizientem Plasma in ei- nem APTT-Assay unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an Anti-Faktor IX/IXa- Antikörper 193/AD3.
Fig. 10A: Antikörper 193/AD3 führt bei Anwesenheit von Faktor IXa zu einer Reduktion der Ge- rinnungszeit von Faktor VIII-defizientem Plasma.
Fig. 10B: Dosis-abhängige Reduktion der Gerinnungszeit durch den Antikörper 193/AD3 in Anwesenheit von Faktor IXa- und Faktor VIII-Inhibitoren.
Fig. 11 : Aktivität der Antikörper 198/A1, 198/B1 und 198/AP1 in An- und Abwe- senheit von humanem FIXa.
Fig. 12: Primer-Sequenzen für die Amplifikation der Gene der variablen schweren Kette des Maus-Antikörpers.
Fig. 13 : für die Amplifikation der Gene der variablen leichten (kappa-) Kette des Maus-Antikörpers.
Fig. 14 : und abgeleitete Proteinsequenz des scFv aus der Hybridom-Zellinie 193/AD3.
Fig. 15 : und abgeleitete Proteinsequenz des scFv aus der Hybridom-Zellinie 193/K2.
Fig. 16 : und abgeleitete Proteinsequenz des scFv aus der Hybridom-Zellinie 198/B1/1.
Fig. 17 : VektorpBax-lgG1.
EMI6.1
Fig. 19A und 19B : Aktivität von Faktor IXa in Anwesenheit des Antikörpers 198/B1 bzw. 198/A/F1.
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Beispiele:
Beispiel 1: Immunisierung immunkompetenter Mäuse und Generierung von anti-FIX/IXa- Antikörper sekretierenden Hybridomzellen
Gruppen von 1-3 normalen, immunkompetenten, 5-8 Wochen alten Balb/c-Mäusen wurden mit 100mg Antigen (100ml-Dosen) auf intraperitonealem Weg immunisiert. Bei einem typischen Ver- such wurden die Mäuse entweder mit rekombinantem humanem Gerinnungsfaktor (F) IX (Bene- fixTM, humanem aktiviertem (FIXa) FIXaa (Enzyme Research Laboratories, Lot HFIXaa 1190L) oder humanem FIXass (Enzyme Research Laboratories, Lot: HFIXAass 1332 AL), adjuvantiert mit AI(OH)3 oder KFA, geimpft.
EMI7.1
boostert und zwei Tage später getötet. Milzzellen wurden entfernt und mit P3 x63-Ag8 6. 5.3 Mye- lom-Zellen, im wesentlichen wie von Lane et al., 1985 (J. Immunol.
Methods, Bd. 81, S. 223-228) beschrieben, verschmolzen. Jeder Fusionsversuch wurde einzeln numeriert, d. h. #193,195, 196 oder 198.
Hybridomzellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen auf einer Makrophagen-Feeder-Schicht (etwa 105 Zellen/ml) gezüchtet und in HAT-Medium (RPMI-1640 Medium, ergänzt mit Antibiotika, 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol und HAT (HAT 100x: 1,Ox10-2 M Hypo- xanthin in H20 (136,1 mg/100 ml H20), 4,Ox10-5 M Aminopterin in H20 (1,76 mg/100ml H20) and 1,6x10-3 M Thymidin in H20 (38,7 mg/100ml H20) ausgewählt. Das Medium wurde nach 6 Tagen zum ersten Mal und danach zweimal pro Woche gewechselt.
Nach 2-3 Wochen ging man von HAT-Medium auf HT-Medium über (RPMI-1640, ergänzt mit Antibiotika, 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol und HT) und danach (nach weiteren 1-2 Wochen) zu normalem Wachstumsmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin und 2-Mercaptoethanol) (vgl.: HYBRIDOMA TECHNIQUES, EMBO, SKMB Kurs 1980, Basel).
Bei einem anderen Satz von Versuchen wurden FIX-defiziente C57B16-Mäuse (Lin et al., 1997, Blood, 90 :3962) zur Immunisierung und nachfolgenden Hybridom-Erzeugung verwendet. Da FIX-k.o.-Mäuse keinen endogenen FIX exprimieren, nimmt man an, dass das erreichbare anti-(a)- FIX-Antikörper-Spektrum anders als bei normalen Balb/c-Mäusen ist (fehlende Verträglichkeit).
Beispiel 2 : Untersuchung der FVIII-ähnlichen Aktivität in Überständen von anti-FIX/FIXa- Antikörper-sekretierenden Hybridomzellen
Um die FVIII-ähnliche Aktivität von anti-FiXa-Antikörpem, die von Hybridomzellen sekretiert wurden, zu testen, wurde der im Handel erhältliche Test-Kit COATEST VIII:C/4 (Chromogenix) verwendet. Der Test erfolgte im wesentlichen wie vom Hersteller beschrieben, mit den folgenden Modifizierungen :
Um ein Screenen mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, wurde der Test auf Mikrotiterplatten- format reduziert. Kurz gesagt wurden 25 l Aliquots von Hybridom-Überständen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Costar, #3598) übertragen und auf 37 C erwärmt.
Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin-Inhibitor (1-2581), Faktor (F) IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstituiert, und FIXa/FX wurde mit Phospholipiden gemäss den Vorschriften des Herstel- lers gemischt. Pro Umsetzung wurden 50 l der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 l CaCI2 (25 mM) und 50 l des Substrat/Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion in Gang zu setzen, wurden 125 l der Vormischung zum Hybridom-Überstand in den Mikrotiterplatten zugegeben und bei 37 C inkubiert. Die Absorption bei 405nm und 490nm der Proben wurde zu verschiedenen Zeiten (30 min bis 12 h) gegen einen Reagentienleerwert (MLW, Zellkulturmedium anstelle des
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abgelesen.
Die FVIII-ähnliche Aktivität der Proben wurde durch Vergleichen der Absorption der Proben mit der Absorption eines verdünnten FVIII-Referenz-Standards (IMMUNO AG #5T4AROO)
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Die Ergebnisse eines Screenens auf FVIII-ähnliche Aktivität in Hybridom-Zellkultur- Überständen sind in Fig. 1 gezeigt. Vorgewählte Klone, die aus den Fusionsversuchen #193, #195 und #196 stammten (siehe oben) wurden in einem chromogenen FVIII-Assay wie beschrieben untersucht. Die Klone 193/M1, 193/N1 und 193/P1 sind Subklone, die vom Master-Klon 193/CO (siehe unten) stammen. Der Master-Klon 195/10 stammte aus dem Fusionsversuch #195, und die Klone 196/AO, 196/BO und 196/CO stammten vom Fusionsversuch #196. Bei einem typischen
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Screening-Versuch wurden etwa 1000 Klone (in 96 Vertiefungen) aus einem einzigen Fusionsver- such im Hinblick auf FVIII-ähnliche Aktivität vorgescreent. Danach wurden ausgewählte Klone in grösserem Massstab gezüchtet (3-5ml Überstand) und in einem chromogenen Test wiederum analy- siert.
Als negative Kontrolle wurde Zellkulturmedium aufjeder Platte (MLW) untersucht.
Vertiefungen, die entweder zuerst eine hohe FVIII-ähnliche Aktivität oder bei einer zweiten Ge- legenheit eine wesentliche FVIII-ähnliche Aktivität aufwiesen, wurden der Subklonierung unterzo- gen. Der Selektions- und Subklonierprozess ist beispielhaft für das Screenen und Subklonieren einer IgG-produzierenden Zellinie (d. h. 193/CO) angegeben, wurde jedoch auf genau dieselbe Weise für einen IgM- (d. h. 196/CO, siehe unten, Fig. 5)-produzierenden Klon durchgeführt.
Der Selektionsprozess erfolgte, indem anfänglich alle Hybridom-Zellklone, die aus einem einzi- gen Fusionsversuch stammten, auf zehn Platten mit je 96 Vertiefungen plattiert wurden, wodurch die sogenannten "Master-Platten" erzeugt wurden. Einzelne Positionen (Vertiefungen) auf einer Master-Platte enthalten gewöhnlich mehr als einen Hybridom-Zellklon (gewöhnlich 3 bis 15 ver- schiedene Klone). Danach wird der Antikörper, der nur von mehreren 1000 Zellen sekretiert wird, getestet. Diese Zellen wachsen unter Bedingungen, die für die Antikörperproduktion suboptimal sind, von der man weiss, dass sie am besten in sterbenden Zellen ist. Daher kann die erwartete spezifische anti-FIX-Antikörperkonzentration im Überstand im Bereich von 10-12 bis 10-14 M liegen.
Dies erklärt auch, warum die Inkubationszeiträume im Vergleich zu Standard-FVIII-Assays verlän- gert sein müssen.
Die Ergebnisse eines Screenings auf IgG-vermittelte FVIII-ähnliche Aktivität in Hybridom- Zellkulturüberständen einer Master-Platte sind in Fig. 2 gezeigt. Die Überstände wurden in einem chromogenen FVIII-Assay untersucht. Gezeigt sind die Ergebnisse, die von der fünften Master- Platte des Fusionsversuches Nummer #193 (Balb/c-Mäuse, immunisiert mit FIXaa) stammen. Die Absorption wurde nach 4stündiger Inkubation bei 37 C abgelesen. Position E5 wurde als jene identifiziert, die eine wesentlich höhere FVIII-ähnliche Aktivität aufwies als der Leerwert (MLW).
Dieser Zellenpool wurde mit 193/CO bezeichnet und weiter subkloniert (Fig. 3). Da jede Vertiefung der Master-Platte mehr als einen Hybridom-Zellklon enthält, wurden die Zellen einer einzigen positiven Vertiefung expandiert und mit einer berechneten Zelldichte von 2-0,2 Zellen/Vertiefung auf eine Platte mit 96 Vertiefungen plattiert. Wiederum wurden die Überstände auf FVIII-ähnliche Aktivität getestet, und die positiven Positionen wurden einer weiteren Subklonierrunde unterzogen.
Typischerweise wurden drei bis vier Subklonierrunden mit jedem Klon, der eine FVIII-ähnliche Aktivität aufwies, durchgeführt, um homogene Zellpopulationen zu erhalten. Hier sind die Ergeb- nisse des chromogenen Tests der 193/CO-Subklone gezeigt. Die Absorption wurde nach einer 4stündigen Inkubationsdauer bei 37 C abgelesen. Die Positionen A6 und D5 zeigten wesentliche FVIII-ähnliche Aktivität und wurden mit 193/M1 bzw. 193/P1 bezeichnet. Diese beiden Klone wur- den einer weiteren Subklonierrunde unterzogen. Als negative Kontrolle wurde einfaches Zellkul- turmedium auf jeder Platte getestet (MLW(H1)).
Fig. 4 zeigt einen Vergleich zwischen chromogener FVIII-ähnlicher Aktivität und FIX-ELISA- Reaktivität von Hybridom-Kulturen kleinen Massstabes (3ml). Bevor eine Entscheidung getroffen wurde, ob ein Master-Klon (oder Subklon) weiter subkloniert wurde, wurden die Klone auf 3-5ml Massstab gezüchtet und die Überstände wiederum überprüft. Dieses Schaubild zeigt die FIX-spezifischen ELISA-Resultate und die FVIII-ähnliche chromogene Aktivität des Master-Klons 193/CO und all seiner Subklone, die als positiv identifiziert und wieder überprüft wurden. Leerwerte (Absorption des chromogenen Reagens selbst) wurden im Falle des ELISA sowie der hier gezeig- ten chromogenen Test-Ablesungen abgezogen. Der Klon 193/M1 wurde subkloniert und ergab die Klone 193N2, 193/M2 und 193/U2.
Die anderen Klone der zweiten Runde stammten von 193/P1, 193/AB2 und 193/P2 wurden subkloniert. 193/AF3,193/AB3 und 193/AE3 sind Subklone von 193/AB2, die anderen Klone der dritten Runde stammen von 193/P2. Schliesslich wurden 193/AF3
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193/AH4, 193/AD4, 193/AI4, 193/AK4) subkloniert.
Von jedem Fusionsversuch wurden mehrere (5-15) Master-Klone (ausgewählt aus der Master- Platte) identifiziert und der Subklonierung unterzogen. Meistens waren die Zellinien nach 3 Subklo- nierungsrunden homogen, wie mittels ELISA und chromogener Aktivitätsanalyse (vgl. Fig. 4) sowie mittels cDNA-Sequenzanalyse gezeigt wurde. Ein spezifischer Master-Klon und all seine Subklone erzeugen denselben FIX/FIXa-bindenden Antikörper, es gibt jedoch riesige Unterschiede bei den
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Antikörper-Proteinsequenzen von Klonen, die von verschiedenen Master-Klonen stammen (vgl.
Beispiel 11). Die meisten Hybridom-Zellinien exprimieren Antikörper aus der IgG-Unterklasse (d. h.
Klone #193, #198, wie 198/A1,198/B1, 198/BB1). Wir konnten jedoch auch einige Klone selektie- ren, die IgM-Antikörper exprimieren.
Die chromogene Aktivität des Hybridom-Überstands einiger wichtiger Master-Klone und Sub- klone. Die Absorption wurde nach einer Inkubation von 1h 30 min und 3h 30 min bei 37 C gemes- sen (Fig. 5). Im Gegensatz zu allen Klonen aus der 193. Fusion, erzeugen der Klon 196/CO und sein Subklon 196/AP2 einen FIX/FIXa-spezifischen IgM-Antikörper, der selbst nach einer kurzen Inkubationszeit eine starke chromogene Aktivität ergibt.
Um eine genauere Analyse der biochemischen Eigenschaften bestimmter Antikörper durchzu- führen, wurden homogene Hybridom-Zellinien, die verschiedene Antikörper mit FVIII-ähnlicher Aktivität exprimieren, expandiert und zur Expression des in Frage stehenden Antikörpers in grösse-
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über Nacht) beschichtet und mehrere Male mit TBST (TBS, 0,1% (V/V) Tween 20) gewaschen.
50 l Hybridom-Überstand wurde 1 :1 mit50 l TBST/2%BSA verdünnt und zur beschichteten ELISA-Platte zugegeben. Nach einer Inkubationsdauer von 2 h bei Raumtemperatur (RT) wurden
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TBST/1%BSA) eines anti-Maus-IgG- (Fc-spezifischen) -Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Sigma, #A-0168) inkubiert (2h, RT). Die Vertiefungen wurden 5-mal mit TBST gewaschen und schliesslich mit 100 l frisch zubereiteter Färbelösung (10m1 50mM Natriumzitrat, pH 5, ergänzt mit
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aufgezeichnet.
In bestimmten Fällen wurde anstelle eines anti-Maus-IgG-ELISA ein anti-Maus-IgM-ELISA durchgeführt.
Reinigung von Maus-IgG aus Hybridom-Zellkulturüberständen:
Ein Hybridom-Überstand (100-500 ml) wurde mit 200 mM Tris/HCI-Puffer (pH 7,0) und festem NaCI zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris bzw. 3M NaCI ergänzt. Der Überstand wurde dann durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 5500xg geklärt. Eine 1 ml Protein-GAffinitätschromatographie-Säule (Protein G Sepharose Fast Flow, Amersham-Pharmacia) wurde mit 15 ml 20mM Tris/CI, pH 7,0, gewaschen und danach mit 10 ml von 20mM Tris/CI-Puffer, pH 7,0, der 3 M NaCI enthielt, äquilibriert. Der Hybridom-Überstand, der 3M NaCI enthielt, wurde dann mittels Schwerkraft auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 15 ml von 20mM Tris/CI- Puffer, pH 7,0, der 3M NaCI enthielt, gewaschen.
Gebundenes IgG wurde weiter mit 12ml Glyzin/HCI-Puffer, pH 2,8, eluiert, und 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt. 100 l von 1 M Tris, pH 9,0, wurden zu jeder Fraktion zwecks Neutralisierung zugegeben. Fraktionen, die das IgG
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mit Wasser verdünnt) in Vertiefungen einer Mikroplatte gemischt wurden. Die positiven Fraktionen wurden gepoolt, in einer Ultrafiltrations-Konzentrations-Vorrichtung (Centricon Plus 20, Amicon) gemäss den Vorschriften des Herstellers auf 1 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 19m1 TBS (20mM Tris/CI-Puffer, pH 7,0, enthaltend 150mM NaCI) verdünnt und wiederum auf 1 ml konzentriert. Der Verdünnungs-Konzentrations-Schritt wurde noch zweimal wiederholt, um IgG in TBS zu bringen.
Reinigung von Maus-IgM aus Hybridom-Zellüberständen: 100-500m1 Hybridom-Zellkulturüberstand wurde auf 5-10m1 konzentriert, entweder mit einem
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Ultrafiltrations-Konzentrationsgerät (Centricon Plus 20, Amicon) gemäss den Vorschriften des Herstellers oder mittels Ammoniumsulfatfällung (40% Sättigung, 0 C) und Wiederlösen des Nie- derschlags mit 5-10m1 TBS. In jedem Fall wurde das Konzentrat gegen 20mM Tris-CI-Puffer, pH 7,4, enthaltend 1,25M NaCi, dialysiert und weiter auf 1ml in einem Centricon Plus 20-(Amicon)- Ultrafiltrationsgerät konzentriert. IgM wurde aus diesem Konzentrat mit dem ImmunoPure IgM Purification Kit (Pierce) gemäss den Vorschriften des Herstellers gereinigt.
Fraktionen, die während der Elution aus der Maltose-bindenden Protein-Säule gesammelt wurden, wurden auf IgM getestet, gepoolt, konzentriert, und in TBS gebracht, wie für IgG beschrieben.
Bestimmung der IgG-Konzentrationen in gereinigten Präparationen :
Gesamt-lgG-Gehalt:
280nm - Extinktion geeigneter Verdünnungen wurden gemessen. E280 = 1,4 entspricht 1 mg/ml Protein.
Faktor IX-spezifisches IgG (quantitativer ELISA):
Die Vertiefungen einer Mikroplatte (Nunc Maxisorp) wurden mit 2 g/ml Faktor IXa, verdünnt in TBS (25mM Tris/HCI, pH 7,5, enthaltend 150mM NaCI) über Nacht bei 4 C inkubiert. Die Vertie- fungen wurden viermal mit TBST (25mM Tris/HCI, pH 7,5, enthaltend 150 mM NaCI und 0,1% (VN) Tween 20) gewaschen. Als Standard-monoklonaler AB wird der HIX1-anti-FIX (accurate) verwendet. Standard und Proben wurden in TBST, enthaltend 2% (Gew.Nol.) BSA, verdünnt. Die Standard-Verdünnungsserie und geeignete Verdünnungen der Proben wurden auf der ELISA- Platte 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit TBST gewaschen und
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(Fc-spezifischen) -Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Sigma, #A-0168) FIXa inkubiert (2h, RT).
Die Vertiefungen wurden 5-mal mit TBST gewaschen und schliesslich mit 100 l einer frisch zuberei- teten Färbelösung (10 ml 50mM Natriumzitrat, pH 5, ergänzt mit 100 l OPD (60mg OPD/ml) und 10 l 30% H202) gefärbt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 l H2S04 gestoppt, und nach 30 min wurde die optische Dichte bei 492nm und 620nm in einem Labsystems iEMS Reader MFTM
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ähnliche Aktivität aufweisen
Mehrere anti-FIX/FIXa-Antikörper-produzierende Hybridom-Klone wurden bis zu viermal subkloniert und die resultierende monoklonale Hybridom-Zellinie verwendet, um monoklonalen Antikörperenthaltenden Überstand herzustellen. Aus diesen Überständen stammende IgG-lsotyp- Antikörper wurden über Affinitätssäulen gereinigt und gegen TBS dialysiert (siehe oben).
IgM-Antikörper wurden genauso verwendet wie ungereinigte Überstand-Fraktionen. Die folgenden Versuche wurden mit zwei Sätzen repräsentativer Antikörper durchgeführt : und
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wurden 25 l Aliquots einer monoklonalen Antikörper enthaltenden Probe (ungereinigter Hybridom- Überstand oder, wo angegeben, eine bestimmte Menge an FIX-spezifischem Antikörper) in Mikroti- terplatten-Vertiefungen übertragen und auf 37 C gewärmt. Chromogenes Substrat (S-2222), syn- thetischer Thrombin-Inhibitor (1-2581), Faktor (F) IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstitu- iert, und FIXa/FX mit Phospholipiden gemäss den Angaben des Herstellers gemischt. Pro Reaktion
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strat/Inhibitor-Cocktails vereinigt.
Um die Reaktion in Gang zu setzen, wurden 125 l der Vormi- schung zur monoklonalen Antikörper-Lösung in den Mikrotiterplatten zugegeben und bei 37 C inkubiert. Die Absorption bei 405nm und 490nm der Proben wurde zu verschiedenen Zeiten (5min
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TBS und zu Zellkulturmedium aufwiesen, ist in Fig. 6A gezeigt. Nach einer Verzögerungsphase führen beide Antikörper zur Spaltung von chromogenem Substrat, wie durch die zunehmende
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optische Dichte, die bei 405nm Wellenlänge messbar ist, beurteilt.
Der zeitliche Verlauf der chromogenen FVIII-ähnlichen Aktivität, die die monoklonalen Antikör-
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gleich zu Human-FVIII (16mE/ml) und 10 g/ml Maus-IgG aufweisen, ist in Fig. 6B gezeigt. Nach einer Verzögerungsphase führen beide Antikörper zur Spaltung von chromogenem Substrat, wie durch die zunehmende optische Dichte, die bei 405nm Wellenlänge messbar ist, beurteilt.
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Die Faktor VIII-Aktivität wird üblicherweise in einem chromogenen und/oder in einem auf APTT basierenden Gerinnungstest charakterisiert. Beide Testarten beruhen auf der FVllla/FIXa- vermittelten Faktor Xa-Generierung. Im Falle eines chromogenen FVIII-Assays wird der erzeugte Faktor Xa danach mit einem chromogenen Substrat reagieren, was spektroskopisch, d. h. in einem ELISA-Lesegerät, überwacht werden kann. Bei einem Gerinnungstest auf Basis von APTT ver- sammelt sich freier Faktor Xa mit FVa auf einer PL-Oberfläche im sogenannten Prothrombinase- Komplex und aktiviert Prothrombin zu Thrombin. Thrombin führt wiederum zur Fibrin-Generierung und schliesslich zur Gerinnselbildung. Wesentlich für beide Testsysteme ist die Faktor Xa-Generierung durch den FVllla/FIXa-Komplex.
Um zu beweisen, dass die von anti-FIX/FIXa-Antikörpem gezeigte FVIII-ähnliche Aktivität tat- sächlich Faktor Xa generiert, wurde der folgende Versuch durchgeführt:
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in Mikrotiterplatten-Vertiefungen transferiert und auf 37 C gewärmt. Als positive Kontrolle wurden
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der Hybridom-Überstand. Als negative Kontrolle wurde einfaches Hybridom-Medium verwendet.
Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin-Inhibitor (1-2581), Faktor (F) IXa und FX wurde in sterilem Wasser rekonstitutiert, und FIXa/FX wurde mit Phospholipiden gemäss den Anga- ben des Herstellers rekonstituiert. Pefabloc XaR. ein Faktor Xa-spezifischer Proteinase-Inhibitor (Pentapharm, LTD) wurde mit Wasser zu einer Endkonzentration von 1 mM/1 rekonstituiert. Pro
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Substrat/Thrombin-Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion in Gang zu setzen, wurden 125 l der Vormischung zu den Proben in der Mikrotiterplatte zugegeben und bei 37 C inkubiert. Soferne angegeben, wurden 35 uM Pefabloc Xa zugegeben. Die Absorption bei 405nm und 490nm wurde zu verschiedenen Zeiten (alle 5 min bis 6 h) gegen einen Reagentienleerwert (Zellkulturmedium) in
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Die Ergebnisse der Faktor IXa-Stimulierung durch die FVIII-ähnliche Aktivität, die der IGM-anti- FIX/FIXa-Antikörper 196/AF2 aufweist, generiert Faktor Xa, wie mittels der leicht messbaren Spal- tung des chromogenen Substrats S-2222 (vgl. "16mE FVIII" und "196/AF2") beurteilt, sind in Fig. 7A gezeigt. Die Faktor Xa-Aktivität wird durch den FXa-spezifischen Inhibitor "Pefabloc XaR" (vergleiche "196/AF2" gegenüber "196/AF2 35 uM Pefabloc XAR") wirksam blockiert, was darauf hinweist, dass FXa tatsächlich generiert wird.
Derselbe Versuch wurde unter Verwendung gereinigter IgG-Präparationen des Klons 198/AM1 durchgeführt (Fig. 7B). Gereinigtes IgG wurde in TBS auf eine Endkonzentration von 0,4mg/ml verdünnt, und 25 l (d. h. insgesamt 10ug) wurden in Mikrotiterplatten-Vertiefungen transferiert und auf 37 C gewärmt. Als positive Kontrolle wurden 6mE eines von Plasma stammenden FVIII ver- wendet. 10 g unspezifisches Maus-IgG (Sigma, 1-5381) dienten als negative Kontrolle. Der Test wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Weitere Versuche zeigen, dass die Faktor Xa-Stimulierung durch die FVIII-ähnliche Aktivität, die der IgG-anti-FIX/FIXa-Antikörper 198/AM1 aufweist, Faktor Xa generiert, wie mittels der leicht messbaren Spaltung des chromogenen Substrats S-2222 beurteilt (Fig. 7B). Wiederum generieren Faktor VIII und der Antikörper 198/AM1 FXa, welcher durch den FXa-spezifischen Inhibitor "Pe- fabloc XaR" wirksam blockiert wird. Als negative Kontrolle wurde unspezifisches Maus-IgG (Sigma, 1-5381) getestet.
Bei einem weiteren Satz von Versuchen konnte die Abhängigkeit der FVIII-ähnlichen Aktivität entweder gereinigter anti-FIX/FIXa-Antikörper (lgM, Fig. 8A) oder ungereinigter, aus Zellkulturüber-
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ständen stammender Antikörper (lgG, Fig. 8B) von der Anwesenheit von Phospholipiden (PL), FIXa/FX und Ca2+ nachgewiesen werden. Maus-IgG wurde als Kontrolle verwendet (Fig. 8C). Die Faktor VIII-ähnliche Aktivität wurde im wesentlichen wie oben beschrieben getestet. Wenn ange- geben, wurde entweder die FIXa/FX-Mischung, das PL oder Ca2+ aus der Reaktion weggelassen.
Die Absorption bei 405nm und 490nm der Proben wurde zu verschiedenen Zeiten gegen einen Reagentienleerwert (Puffer anstelle von gereinigtem Antikörper) in einem Labsystems iEMS Rea-
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Fig. 8C gezeigt.
Die Abhängigkeit der FVIII-ähnlichen Aktivität von gereinigtem anti-FIXa-Antikörper 198/AC1/1
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Anwesenheit von Phospholipiden (PL, FIXa/FX und Ca2+ ist weiters in Fig. 8A gezeigt. Wie leicht erkennbar ist, führt nur der komplette Test, einschliesslich Antikörper, PL, Ca2+, FIXa/FX zu einer annehmbaren FXa-Generierung.
Die Abhängigkeit der FVIII-ähnlichen Aktivität des Zellkultur-Überstandes, der ungereinigten
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FIXa/FX und Ca2+ ist in Fig. 8B gezeigt.
Wiederum ergibt, wie bereits für die gereinigte IgG-Präparation (Fig. 8A), Antikörper 198/AC1/1, gezeigt, nur der vollständige Test einschliesslich PL, Ca2+ FIXa/FX eine angemessene Menge an FXa-Generierung. Um die Spezifität der Reaktion nachzuweisen, wurde Gesamt-IgG, hergestellt aus normalem Maus-Plasma, unter denselben Bedingungen wie oben getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 8C gezeigt : konnte keine FVIII-ähnliche Aktivität nachgewiesen werden.
Wie erwartet, ist in Abwesenheit von Phospholipiden FIXa/FX und Ca2+ keine Aktivität nachweis- bar. Alle Versuche wurden in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, und die OD405 wurde 6 h lang alle 5 min gescannt.
Beispiel 6 : Bestimmte anti-FIXIFIXa-Antikörper sind in Anwesenheit von FIXa prokoagu- latorisch
Während der normalen Hämostase wird FIX anfangs entweder auf dem Gewebefaktor (TF) /Faktor Vlla-Weg oder später durch aktivierten Faktor XI (FXIa) aktiviert. Nach seiner Aktivie- rung verbindet sich FIXa an der Blutplättchenoberfläche in einem Membran-gebundenen Komplex mit aktiviertem FVIII. Faktor IXa selbst hat nur eine geringe oder keine enzymatische Aktivität gegenüber FX, wird jedoch in Anwesenheit von FVllla hoch aktiv.
Um zu zeigen, dass bestimmte anti-FIX/FIXa-Antikörper eine FVIII-ähnliche Aktivität aufweisen und daher in einem FVIII-defizienten Human-Plasma prokoagulatorisch wirken, wurde der folgende Versuch durchge- führt : Verschiedene Mengen von Antikörper 193/AD3 oder, als Kontrolle, Maus-IgG wurden in einem Standard-Einstufen-Gerinnungstest auf APTT-Basis verwendet. Kurz gesagt wurden 100 l
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(PTT-Reagent for determining activated Thromboplastin Time ; IMMUNO AG)-Reagens in einem KC10A-Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Soferne angegeben, wurde eine Gesamtmenge von 50ng aktiviertem FIX in der Reaktionsmischung inkludiert. Nach 4 Minuten Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 l CaCI2 (25mM) in Gang gesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Fig. 9 gezeigt.
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<tb>
Gerinnungszeit <SEP> (Sekunden)
<tb>
<tb> g <SEP> AB <SEP> 193/AD3 <SEP> Maus-lgG
<tb>
<tb>
<tb> 50ng <SEP> FIXa <SEP> 50ng <SEP> FIXa
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 101,6 <SEP> 102,5
<tb>
<tb>
<tb> 4,5 <SEP> 95,6 <SEP> 103,2
<tb>
<tb>
<tb> 2,25 <SEP> 93,1 <SEP> 103,2
<tb>
<tb>
<tb> 1,8 <SEP> 93,7 <SEP> 101,9
<tb>
<tb>
<tb> 1,35 <SEP> 91,4 <SEP> 103,4
<tb>
<tb>
<tb> 0,9 <SEP> 94,4 <SEP> 102,2
<tb>
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<tb> Gerinnungszeit <SEP> (Sekunden)
<tb>
<tb>
<tb> pg <SEP> AB <SEP> 193/AD3 <SEP> Maus-IgG
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50ng <SEP> FIXa <SEP> 50ng <SEP> FIXa
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,45 <SEP> 98,1 <SEP> 101,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,34 <SEP> 97,1 <SEP> 103,9
<tb>
<tb>
<tb> 0,23 <SEP> 99,3 <SEP> 103,7
<tb>
Tabelle 1 :
Gerinnungszeiten von FVIII-defizientem Plasma in einem Gerinnungstest auf Basis der APTT unter Verwendung verschiedener Mengen an prokoagulatorischem (193/AD3) und Kontroll-Antikörper (Maus-IgG) in Anwesenheit von 50ng aktiviertem FIX (0,01 E FIX). Das Mol- verhältnis der Antikörpers in der Reaktion zum aktivierten FIX ist 10:1. Das Molverhältnis zwischen Antikörper und Gesamt-FIX (FIX und FIXa, unter der Annahme, dass FVIII-defizientes Human- Plasma 1 E (5ug) FIX enthält) variiert zwischen 6:1 (9ug Antikörper in der Reaktion) zu 1:6 (0,23ug Antikörper in der Reaktion). Bei der optimalen Verkürzung der Gerinnungszeit ist das Molverhältnis zwischen Antikörper und Gesamt-FIX 1:1. Die Gerinnungszeit ohne Zugabe von FIXa liegt im Bereich von 120 Sekunden.
Fig. 9 zeigt eine graphische Darstellung der Gerinnungszeiten von FVIII-defizientem Plasma in einem Gerinnungs-Test auf Basis der APTT unter Verwendung verschiedener Mengen von proko- agulatorischen (193/AD3) und Kontroll-(Maus-lgG)-Antikörper in Anwesenheit von 50ng aktiviertem FIX. Es besteht eine deutliche (und reproduzierbare) dosisabhängige Reduktion der Gerinnungs- zeit bei Proben, die mit dem Antikörper 193/AD3 ergänzt sind. Diese Ergebnisse implizieren, dass der Antikörper 193/AD3 in Anwesenheit von FIXa prokoagulatorisch wirkt.
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FIXa prokoagulatorisch
Eine schwere Komplikation der Standard-FVIII-Ersatztherapie ist die Entwicklung von gegen FVIII gerichteten Alloantikörpern, die zu einer FVIII-Neutralisierung und einem Zustand führen, in welchem das Blut des Patienten nicht mehr gerinnungsfähig ist.
Um zu zeigen, dass bestimmte anti-FiXa-Antikörper eine FVIII-ähnliche Aktivität selbst in Anwe- senheit von FVIII-Inhibitoren aufweisen, wurde der folgende Versuch durchgeführt : Mengen des Antikörpers 193/AD3 oder, als Kontrolle, von Maus-IgG wurden in einem Standard- Einstufen-Gerinnungstest auf Basis der APTT verwendet. Kurz gesagt wurden eine 100 l- Antikörper-Probe entweder mit 100 l von FVIII-defizientem Plasma (Fig. 10A) oder FVIII-Inhibitor- Plasma ((Inhibitor-Stärke 400BE/ml), Fig. 10B), sowie mit 100 l DAPTTIN-Reagens in einem KC10A-Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Zusätzlich wurde eine Gesamtmenge von 50ng aktivier- tem FIXa in der Reaktionsmischung inkludiert. Nach 4minütiger Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 l CaCI2 (25mM) in Gang gesetzt.
Um gleiche Bedingungen zu gewährleis- ten, wurde der Versuch unter Verwendung von FVIII-defizientem Plasma und FVIII-Inhibitor- Plasma Seite an Seite durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 10A und 10B gezeigt. Wie bereits in Beispiel 6 gezeigt, liegt eine deutliche (und reproduzierbare) dosisabhängige Verringe- rung der Gerinnungszeit bei Proben, die mit dem Antikörper 193/AD3 ergänzt sind, in Anwesenheit von FVIII-Inhibitoren vor.
Beispiel 8: Anti-FIXa-Antikörper wirken in Anwesenheit von defektem FVIII und FIXa pro- koagulatorisch
Um zu zeigen, dass bestimmte anti-FIXa-Antikörper in Anwesenheit von defektem FVIII eine FVIII-ähnliche Aktivität aufweisen, könnten die folgenden Versuche durchgeführt werden : mende Mengen von Antikörper 193/AD3 oder, als Kontrolle, Maus-IgG werden in einem Standard- Einstufen-Gerinnungstest auf Basis der APTT verwendet. Bei diesem Gerinnungstest wird Plasma von Hämophilie-A-Patienten verwendet, das infolge der Anwesenheit von defektem FVIII (DF8)
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entweder mit 100 l von DF8-Plasma oder FVIII-defizientem Plasma sowie mit 100 l DAPTTIN-
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Reagens in einem KC10A-Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Zusätzlich wird eine Gesamtmenge von 50ng aktiviertem FIXa in der Reaktionsmischung inkludiert.
Nach einer kurzen Inkubation wird
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DF8-Plasma Seite and Seite durchgeführt.
Beispiel 9 : Anti-FIX/FIXa-Antikörper mit prokoagulatorischer Aktivität in Anwesenheit von FIXa unterscheiden zwischen humanem und bovinem FIXa
Aus dem 198. Fusionsversuch ausgewählte FIX/FIXa-spezifische monoklonale Antikörper wur- den vom jeweiligen Hybridom-Überstand gereinigt und quantifiziert, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Diese Antikörper wurden in einem modifizierten einstufigen Gerinnungstest (wie in Beispiel 6 beschrieben) analysiert, und einige wiesen eine prokoagulatorische Aktivität auf.
Die chromogene Aktivität dieser Antikörperpräparationen wurde im folgenden FXa- Generierungskinetik-Test gemessen: 10 g monoklonaler Antikörper (in 25 l) wurde in Mikroti- terplatten-Vertiefungen transferiert und auf 37 C gewärmt. Chromogenes Substrat (S-2222), syn- thetischer Thrombin-Inhibitor (1-2581), Faktor (F) IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstitu- iert, und Faktor IXa/FX (beide vom Rind) mit Phospholipiden gemäss den Angaben des Herstellers gemischt. Pro Reaktion wurden 50 l der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 l CaCI2 (25mM) und 50 l des Substrat/Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion in Gang zu setzen, wurden 125 l der Vormischung zur monoklonalen Antikörper-Lösung in den Mikrotiterplatten gegeben und bei 37 C inkubiert.
Die Absorption bei 405nm und 490nm der Proben wurde zu verschiedenen Zeiten (5min bis 2h) gegen einen Reagentienleerwert (25 l TBS anstelle der monoklonalen Antikörper) in
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50ng Human-FIXa pro Reaktion zugegeben wurden. Jene Antikörper, die eine prokoagulatorische Aktivität zeigten, wiesen keine chromogene Aktivität im Fall von bovinem FIX auf, zeigten aber eine hohe Aktivität, wenn humaner FIXa anwesend war.
Fig. 11 zeigt den zeitlichen Verlauf der chromogenen FVIII-ähnlichen Aktivität, die die mo- noklonalen Antikörper 198/A1, 198/B1 und 198/AP1 mit (+) und ohne (-) Zugabe von 50ng Human- FIXass aufwiesen. Unspezifisches polyklonales Maus-IgG wurde als Kontrolle verwendet. 198/A1 und 198/B1 weisen eine prokoagulatorische Aktivität (ähnlich wie 193/AD3 in Beispiel 6) auf, 198/AP1 jedoch nicht. Der Antikörper 198/BB1 hatte dasselbe Aktivitätsmuster (Daten nicht ge- zeigt). Weitere, in diesem Versuch erhaltene Zellinien mit erfindungsgemässen Antikörpern umfass- ten die Zellinien 198/D1, 198/T2, 198/U2 und 198/G2.
Beispiel 10: Struktur und prokoagulatorische Aktivität von Antikörper-Derivaten, die von anti-FIX/FIXa-Antikörpern stammen
Subklonierung von variablen Domänen der Antikörper aus den Hybridom-Zellinien 193/AD3,193/K2 und 198/B1: Klonierungsverfahren: Messenger-RNA wurde aus 1x106 Hybridom-Zellen derjeweiligen Zellinie (entweder 193/AD3,193/K2 oder 198/B1) unter Verwendung des "QuickPrep Micro mRNA Purification Kit" (Pharmacia) gemäss den Vorschriften des Herstellers hergestellt. Die entsprechen- de cDNA wurde durch retro-Transkription von mRNA unter Verwendung des "Ready-To-Go-You- Prime-First-strand Beads kit" (Pharmacia) gemäss den Vorschriften des Herstellers erzeugt. Se- quenzen, die für die schwere und leichte Kette kodieren, wurden unter Verwendung eines Satzes von Primern in die entsprechende cDNA übergeführt.
Um für die schwere Kette spezifische mRNA (VH) revers zu transkribieren, wurde eine äquimolare Mischung der Oligonukleotide MOCG1-2FOR (5' CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC 3'), MOCG3FOR (5' CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT 3') und MOCMFOR (5' TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT 3') verwendet (RTmixl). Im selben Reaktionsröhrchen wurde für die leichte Kette spezifische cDNA (VL) synthe- tisiert, wobei der Primer MOCKFOR (5' CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC 3') verwendet wurde.
Die für VH kodierenden Sequenzen wurden mittels PCR amplifiziert, wobei die in Fig. 12 abge- bildeten Primer-Sätze und die spezifische cDNA, die aus der oben beschriebenen revers- Transkriptionsmischung (RTmixl) stammte, als Konformations-Schablone diente. VK-Ketten-Gene
<Desc/Clms Page number 15>
wurden unter Verwendung der in Fig. 13 abgebildeten Primer-Sätze und ebenfalls unter Verwendung von Rtmix1 als Konformations-Schablone amplifiziert. Das VH-PCR-Produkt wurde SFil-Ascl gespalten und in Sfil-Ascl-verdauten Vektor pDAP2 (GeneBank Akzessionsnummer : insertiert. Die erhaltenen pDAP2-VH-Konstrukte wurden mit pDAP2-193AD3/VH bzw. pDAP2- 193/K2/VH bezeichnet.
Beide Plasmide wurden danach mit Ascl-Notl gespalten, und das korrespondierende Ascl-Notl-verdaute VK-Gen-PCR-Produkt wurde insertiert. Die resultierenden Vektoren wurden mit pDAP2-193/AD3scFv und pDAP2-193/K2scFv bezeichnet und kodieren für das VH-Gen und das VL-Gen der monoklonalen Antikörper 193/AD3 und 193/K2. Beide Ketten sind durch die Kodiersequenz für einen künstlichen, flexiblen Linker (G4SGGRASG4S; Engelhardt et al., 1994) verknüpft und ermöglichen die Expression der scFv-Variante des jeweiligen Antikörpers.
In Fig. 14 sind die DNA und die abgeleitete Proteinsequenz des von der Hybridom-Zellinie 193/AD3 stammenden scFv dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 357 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 358 bis 402 für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 403 bis 726 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3-Region der schweren Kette hat die Sequenz YGNSPKGFAY und ist in fetten Buchstaben gezeigt. Die künstliche Linker-Sequenz (G4SGGRASG4S) ist in Kursiv-Schrift gezeigt.
In Fig. 15 sind die DNA und die abgeleitete Proteinsequenz des von der Hybridom-Zellinie 193/K2 stammenden scFv dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 363 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 364 bis 408 für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 409 bis 747 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz vom CDR3 der schweren Kette hat die Sequenz DGGHGYGSSFDY und ist in fetten Buchstaben gezeigt. Die künstliche Linker-Sequenz (G4SGGRASG4S) ist in Kursiv-Schrift gezeigt.
In Fig. 16 sind die DNA und die abgeleitete Protein-Sequenz des von der Hybridom-Zellinie 198/B1/1 stammenden scFv dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 366 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 367 bis 411 für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 412 bis 747 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3-Region der schweren Kette hat die Sequenz EGGGFTVNWYFDV und ist in fetten Buchstaben gezeigt. Die künstliche Linker-Sequenz (G4SGGRASG4S) ist in Kursiv-Schrift gezeigt.
Die Derivate werden getestet und weisen im chromogenen Test eine prokoagulatorische Aktivität auf.
Beispiel 11: Prokoagulatorische Aktivität von Peptiden, die aus den CDR3-Regionen von anti-FIX/FIXa-Antikörpern stammen
Die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers stammt aus der Nebeneinanderstellung der sechs "Komplement-bestimmenden Regionen" ("complement determining regions, CDR's) am N-terminalen Ende des VL-HL-Dimers (oder Fv-Region). Drei CDRs stammen von der leichten Kette, und drei stammen von der schweren Kette. Der Beitrag eines einzigen CDR zur AntikörperSpezifität für ein bestimmtes Antigen kann beträchtlich variieren, doch im allgemeinen nimmt man an, dass die CDR3-Region der schweren Kette (CDR3H) besonderen Einfluss hat, d. h. die besondere Proteinsequenz der CDR3H-Region kann für die Antigen-Erkennung sehr wichtig sein.
Es wurde berichtet, dass die Länge der CDR3H-Regionen beträchtlich variiert und im Bereich von 4-25 Aminosäuren liegt (Borrebaeck, S. 16).
Peptide, die von FVIII stammen, weisen in einem in vitro-Test ein gewisses Ausmass an prokoagulatorischer Aktivität auf. Für ein einzelnes Plasma eines Hämophilie-Patienten konnte eine Verringerung der Gerinnungszeit auf APTT-Basis von 20 Sekunden im Vergleich zur Grundlinie nachgewiesen werden (Liles et al., 1997). Bei einem ähnlichen Versuch verwenden wir die Peptide, die aus der CDR3H-Region (der putativen FIXa-Wechselwirkungs-Region) der Antikörper 193/K2,193/AD3 und 198/B1 stammen, um eine Dosis-abhängige Reduktion der Gerinnungszeit eines FVIII-defizienten Plasmas im Vergleich zu einem Kontroll-Peptid nachzuweisen.
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Peptidquelle <SEP> Peptidsequenz <SEP> Bemerkungen
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<tb> 193/AD3 <SEP> YGNSPKGFAY <SEP> CDR3H <SEP> 193/AD3#6
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<tb> CDR3H <SEP> 193/AD3#6
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<tb> GANGYKYPFS <SEP> gemischte <SEP> Version
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<tb> (Kontrolle)
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<tb> CXXYGNSPKGFAYXXC <SEP> CDR3H <SEP> 193/AD3#6
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<tb> zyklisches <SEP> Peptid <SEP> 1
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<tb> CDR3H <SEP> 193/AD3#6
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<tb> YGNSPKGFAY <SEP> zyklisches <SEP> Peptid <SEP> 2
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<tb> 193/K2#1 <SEP> DGGHGYGSSFDY <SEP> CDR3H <SEP> 193/K2#1
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<tb> CDR3H <SEP> 193/K2#
1
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<tb> SGHDGSYFYGDG <SEP> gemischte <SEP> Version
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<tb> (Kontrolle)
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<tb> 198/B1 <SEP> EGGGFTVNWYFDV <SEP> CDR3H <SEP> 198/B1
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<tb> CDR3H <SEP> 198/B1
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<tb> GFVWGVEDGYTF <SEP> gemischte <SEP> Version
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<tb> (Kontrolle)
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<tb> hFVlll <SEP> FRNRGMTALLKVSSCD <SEP> FVIII <SEP> 697-712 <SEP>
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<tb> (Liles <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1997)
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<tb> FVIII <SEP> 697-712 <SEP>
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<tb> SVKLFGNMSDRLARCT <SEP> gemischte <SEP> Version
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<tb> (Kontrolle)
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Tabelle 2 : Peptide, die in einem einstufigen Gerinnungstest auf APTT-Basis verwendet wurden. X kann jede beliebige Aminosäure sein.
Beispiel 12 : Prokoagulatorische Aktivität von (Peptid) -Derivaten, die von den CDR3Regionen von anti-FIX/FIXa-Antikörpern erhalten wurden
Im Prinzip kann man sich das Antikörper-Molekül als biologische Einrichtung zur Präsentation einer Kombinations- Anordnung von Peptid-Elementen im dreidimensionalen Raum vorstellen (vgl.
Gao et al., 1999, PNAS, 96 :6025). kann ein Antikörper (oder ein Antikörper-Derivat, d.h. scFv, Fab usw. ) entweder als Werkzeug zur Detektion funktionell wichtiger Domänen eines spezifischen Zielproteins und anderseits zur Darstellung von Aminosäuresequenzen, die insbesondere bestimmte Wechselwirkungen vermitteln, d. h. die Aktivität von FIXa gegenüber dem physiologischen Substrat FX aktivieren oder verbessern, verwendet werden. Das letztere Verfahren hat zur Evaluierung einer Anzahl von von CDR3H-stammenden Peptidsequenzen als FIXaVerstärkungsmitteln geführt (Beispiel 11).
Anderseits ist die prokoagulatorische Aktivität der erhaltenen Peptide bisher nicht optimal, ist aber durch eine Sequenz-Variierung innerhalb der PeptidRegionen, die für die Vermittlung der FIXa-Aktivitäts-verstärkenden Region kritisch sind, weiter verbessert.
Als erster Schritt zu Peptidsequenzen mit verbesserter prokoagulatorischer Aktivität wird die Bindungsstelle des Antikörpers 198/B1 am FIXa-Molekül kartiert, wobei die SequenzVergleichsanalyse, kompetitive Bindungstests, Western blot-Analyse und kompetitive ELISAAnalyse verwendet werden. Da die Kristall-Struktur von FIX bekannt ist, wird das MolekülModelling verwendet, um das Einpassen der von 198/B1 stammenden Peptide in die 198/B1Bindungsstelle an humanem FIXa zu verbessern. Die so erhaltenen Daten werden es uns ermöglichen, eine methodische Mutationsanalyse des Peptids CDR3H 198/B1 durchzuführen.
Kurz gesagt werden Peptide (oder Peptid-Banken im Fall eines Screenens mit hohem Durchsatz), die spezielle Mutationen enthalten (die logische Grundlage für eine spezifische Mutation ist gegeben, d. h. durch Molekül-Modellieren), auf prokoagulatorische Aktivität getestet.
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Ein Beispiel für eine methodische Mutationsanalyse der Wildtyp-CDR3H 198/B1- Aminosäuresequenz (EGGGFTVNWYFDV) ist nachstehend angeführt. Die Peptidsequenz wurde nur in einer Position über die Kern-Sequenz variiert (Änderungen sind in fettgedruckten Buchsta- ben gezeigt). Alle Peptide können in einem einstufigen Gerinnungstest auf APTT-Basis auf proko- agulatorische Aktivität getestet und mit derselben Konzentration verwendet werden. Die Gerin- nungsaktivität der Wildtypsequenz wird willkürlich als 100% festgesetzt.
Peptidsequenz
EGGGFTVNWYFDV
EGGGRTVNWYFDV
EGGGFRVNWYFDV
EGGGFTRNWYFDV
EGGGFTVRWYFDV
EGGGFTVNRYFDV
EGGGFTVNWRFDV
EGGGFTVNWYRDV
EGGGATVNWYFDV
EGGGFAVNWYFDV
EGGGFTANWYFDV
EGGGFTVAWYFDV
EGGGFTVNAYFDV
EGGGFTVNWAFDV
EGGGFTVNWYADV
EGGGDTVNWYFDV
EGGGFDVNWYFDV
EGGGFTDNWYFDV
EGGGFTVDWYFDV
EGGGFTVNDYFDV
EGGGFTVNWDFDV
EGGGFTVNWYDDV
EGGGPTVNWYFDV
EGGGFPVNWYFDV
EGGGFTPNWYFDV
EGGGFTVPWYFDV
EGGGFTVNPYFDV
EGGGFTVNWPFDV
EGGGFTVNWYPDV
Tabelle 3 : Generierung von von 198/B1 stammenden Peptidvarianten
Beispiel 13 : Umwandlung des 196/C4-lgM in lgG1;
Da einige IgM-Antikörper eine extrem hohe chromogene FVIII-ähnliche Aktivität aufweisen, wurden Versuche unternommen, IgM-Antikörper in IgG (aber auch in rekombinanten Fab, F(ab)2, scFv usw. ) überzuführen.
Die Gewinnung der IgM-Gene mit variabler Region ist detailliert be- schrieben :
Konstruktion des Expressionsplasmids pBax-IgG:
Der Vektor pBax-lgG1 (Fig. 17) wurde aus den Vektoren pSl (Promega) und pEF/Bsd (Invitro- gen) durch mehrfache Klonierungsschritte konstruiert.
B-Lymphozyten eines Spenders werden vom Blut gereinigt, und reife mRNA wurde aus diesen Zellen unter Verwendung des "micro-mRNA-purification-kit" (Pharmacia) gereinigt. Die cDNA einer
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humanen kappa-Kette und einer humanen gamma-1-Kette werden unter Verwendung des "You- prime-first-strand-cDNA"-Sets (Pharmacia) und den folgenden Primern hergestellt:
Die Kodiersequenz der konstanten Domäne einer humanen kappaleichten Kette wird aus der cDNA mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert:
Das Gen einer konstanten Region einer humanen gamma-1-Kette (CH1-Verknüpfung-CH2- CH3) wird aus der cDNA mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert:
Das PCR-Produkt der konstanten Domäne der leichten Kette wird mit Xbal und Nhel verdaut und in verdautes pSl insertiert.
Der resultierende Vektor wird mit EcoRI und Xbal gespalten, und die folgenden angelagerten Oligonukleotide wurden insertiert, was zum Vektor pSI-Ckappa führt.
Die angelagerten Oligonukleotide liefern den Leader und die Sacl-Xbal-Stellen zur Insertion der variablen Region der kappa-Kette. Das PCR-Produkt der konstanten Region der humanen gamma 1-Kette wird mit Spel und BamHI verdaut und in vedautes pSl insertiert. Der resultierende Vektor wird mit Spel und Notl gespalten, und die folgenden angelagerten Oligonukleotide werden inser- tiert, was zum Vektor pSI-Cgamma führt. Die angelagerten Oligonukleotide liefern den Leader und die Xhol-BstEI-Stellen zur Insertion der variablen Region der schweren Kette. Vektor pEF/Bd wird mit Nhel und Sfil verdaut, durch Klenow-Behandlung stumpfendig gemacht, und die ganze Expres- sionskassette von pSI-Ckappa, die mit Bglll und BamH1 herausgeschnitten wird, wird insertiert (nach Klenow-Behandlung).
Der resultierende Vektor wird mit EcoRI und Hindlll verdaut und mit Klenow behandelt. Die ganze Expressionskassette von pSI-Cgamma wird mit Bglll herausgeschnit- ten und BamH1 wird insertiert (nach Klenow-Behandlung). Der resultierende Vektor wird als pBax-lgG1 gezeichnet.
Die variable Region der leichten Kette kann zwischen die Stellen Sacl-Xbal insertiert werden, was die komplette Kodiersequenz einer kappa-leichten Kette ergibt. Die variable Region der schweren Kette kann zwischen die Stellen Xhol-BstEI kloniert werden, was zu einem kompletten IgG1-Gen der schweren Kette führt. Beide offenen Leserahmen werden unter der Steuerung des SV40-Promotors exprimiert und beinhalten die Kodiersequenzen eines Signal-Peptids am 5'-Ende des Gens zur Sekretion der schweren und leichten Ketten in das endoplasmatische Retikulum. Die Transfektion in COS-Zellen ermöglicht die Expression eines lgG1 mit denselben Bindungseigen- schaften wie das Stamm-IgM.
Konstruktion des Plasmids pBax-196/C4
Der VH des 196/C4 scFv (subkloniert, wie im Versuch beschrieben) wird mittels PCR unter Verwendung der Primer amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit Xhol und BstEll verdaut und in mit Xhol und BstEll verdautes pBax lgG1 insertiert. Der VL des 196/C4 scFv wird mittels PCR unter Verwendung der Primer amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit Sacl und Xbal verdaut und in mit Sacl und Xbal-verdautes pBax IgG1-VH insertiert. Der resultierende Vektor (pBax-196/C4) wird in COS-Zellen mittels Elektroporation transfiziert, und Hybrid-lgG1-Moleküle (murine variable Region und humane konstante Region) mit derselben Spezifität wie das Stamm-IgM werden exprimiert.
Tabelle 4. Aminosäuresequenz der von der 198/B1 Antikörper-CDR3 Region abgeleiteten und weiter modifizierten Peptide.
Das Peptid B1/7 wurde hinsichtlich seiner FIXa aktivierenden Aktivität (FVIII -ähnlichen Aktivi- tät) zuerst in einem chromogenen Assay untersucht (Durchführung siehe Beispiel 4). Der verwen- dete chromogene Assay enthält als Reagens bovinen FIXa, der mit den verschiedenen Peptiden nicht kreuzreagiert. Dem Assay wurde daher 2,3nM humaner FIXa zusätzlich zugesetzt. Wie in Abbildung 18A ersichtlich führt der Zusatz von verschiedenen Konzentrationen vom Peptid B1/7 zum Reaktionsgemisch zu einer gut messbaren FXa Generierung. Der Zusatz von 38 M Pefabloc Xa dagegen führt zu einer deutlichen Reduzierung der Reaktion (Abb. 18B). Dies impliziert, dass unter den gegebenen Bedingungen tatsächlich FXa gebildet wird. Umgekehrt ist keine FXa Bildung nachweisbar wenn FIXa und FX der Reaktion nicht zugesetzt werden.
Werden die Peptide B1 und B1/4 unter den selben Bedingungen analysiert zeigen sie nur relativ schwache Aktivität. Das Peptid B1/6, sowie die Kontrollpeptide B1/5 und B1/7scr3 sind erwartungsgemäss wirkungslos (Daten nicht gezeigt).
In einer zweiten Serie von Experimenten wurde die prokoagulatorische Wirkung der Peptide B1/6, B1/7 und B1/7scr3 in einem einstufigen Gerinnungstest auf APTT Basis untersucht. Die Experimente wurden genau wie im Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 5A und Tabelle 5B dargestellt.
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
EMI19.2
<tb> (-) <SEP> (-) <SEP> (-) <SEP> (-) <SEP> (-)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B1/6 <SEP> 115 <SEP> 110 <SEP> 111 <SEP> 111 <SEP> 110 <SEP> B347
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B1/7 <SEP> 157 <SEP> 112 <SEP> 109 <SEP> 110 <SEP> 110 <SEP> B347
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B1/7scr3 <SEP> 115 <SEP> 105 <SEP> 106 <SEP> 105 <SEP> 107 <SEP> B430
<tb>
Tabelle 5A. Gezeigt sind die Gerinnungszeiten (in Sekunden) eines FVIII defizienten Plasmas in einem einstufigen Gerinnungstest ohne den Zusatz von aktivierten humanen FIX (-).
Das Peptid B1/7 wirkt im Vergleich mit der Pufferkontrolle und ohne dem Zusatz von FIXa inhibitorisch (Ver- längerte Gerinnungszeit bei hoher Peptidkonzentration). Während die Peptide B1/6 und B1/7scr3 keine signifikante Veränderung der Gerinnungszeit gegenüber der Pufferkontrolle aufweisen.
EMI19.3
EMI19.4
<tb> (+) <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> #
<tb>
<tb> B1/6 <SEP> 103 <SEP> 100 <SEP> 101 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> B347
<tb>
<tb>
<tb> B1/7 <SEP> 84 <SEP> 92 <SEP> 99 <SEP> 99 <SEP> 100 <SEP> B347
<tb>
EMI19.5
Tabelle 5B. Gezeigt sind die Gerinnungszeiten in Sekunden von FVIII defizientem Plasma, in einem einstufigen Gerinnungstest mit dem Zusatz von aktivierten humanen FIX (+). Das Peptid B1/7 führt in Gegenwart von FIXa zu einer signifikanten und dosisabhängigen Verkürzung der Gerinnungszeit.
Dies kann für die Peptide B1/6 und B1/7scr3 nicht beobachtet werden.
Die Durchführung des Tests erfolgt genau wie im Beispiel 4 beschrieben nur das anstelle von FVIII oder einem Antikörper, ein in einem Puffer (50mM Imidazol, 100mM NaCI, pH7,2, IZ Puffer) verdünntes Peptid der Reaktion zugesetzt wird. Angegeben ist die Endkonzentration vom Peptid im Reaktionsansatz. Die Reaktion enthielt weiters normalerweise zusätzlich 2,3nM humanen FIXa.
Wo angegeben wurde der Reaktion der FXa spezifische Inhibitor Pefabloc Xa (Pentapharm) in einer Endkonzentration von 35 M zugesetzt. Ohne FIXa/FX heisst dass in diesem Ansatz das FIXa/FX Gemisch durch Puffer ersetzt wurde.
Beispiel 15 : Aktivierung der amidolytischen Aktivität von FIXa durch FIXa Antikörper.
20 l Faktor IXa (enthaltend 200mU FIXa (Stago)) wurden bei 37 C mit 200 l Reaktionspuffer (50mM TrisCI pH7. 4, 100mM NaCI, 5mM CaCI2 and 40% Ethylenglycol), 25 l FIXa Substrat (CH3S02-D-CHG-Gly-Arg-pNA, AcOH, 10 M/ml, Pentapharm LTD) in Abwesenheit oder Anwe- senheit von unterschiedlichen Mengen an anti-FIX Antikörpern 198B1 (lgG-lsotyp) oder 196 AF1 (lgM-lstoyp) inkubiert. Die spezifische Spaltung von FIXa Substrat wurde bei 405 nm in einem ELISA Lesegerät aufgezeichnet.
Die Anwesenheit von anti-FIXa Antikörpern führte zu einer mindestens 2-fachen Verstärkung der amidolytischen Aktivität von FIXa (vgl. Fig.19A und 19B).
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.