[go: up one dir, main page]

KR20170096112A - Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법 - Google Patents

Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170096112A
KR20170096112A KR1020177016253A KR20177016253A KR20170096112A KR 20170096112 A KR20170096112 A KR 20170096112A KR 1020177016253 A KR1020177016253 A KR 1020177016253A KR 20177016253 A KR20177016253 A KR 20177016253A KR 20170096112 A KR20170096112 A KR 20170096112A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
binding
cancer
agonist
binding antagonist
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020177016253A
Other languages
English (en)
Inventor
진 청
마루크 후세니
정 킴
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20170096112A publication Critical patent/KR20170096112A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 것을 포함한다.

Description

OX40 결합 효능제 및 PD-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법{COMBINATION THERAPY COMPRISING OX40 BINDING AGONISTS AND PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2014년 11월 17일 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/080,991호 및 2014년 12월 17일 수요일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/093,400호의 우선권을 주장하고, 상기 출원 각각은 이들의 전문이 참조로 본원에 인용된다.
서열 목록
ASCII 텍스트 파일 상에서의 하기 제출된 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 146392630640SeqList.txt, 기록된 날짜: 2015년 11월 12일 목요일, 크기: 73 KB).
발명의 분야
본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여함에 의해 암을 치료하는 방법에 대한 것이다.
T-세포에 두 개의 상이한 신호의 제공은 항원-제시 세포들(APCs)에 의한 휴지 T 림프구의 림프구 활성화를 위한 널리 허용된 모델이다. Lafferty et al, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci 53: 27-42 (1975). 이 모델은 비-자가 및 면역 내성으로부터의 자아의 식별력을 추가로 제공한다. Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). 1차 신호, 또는 항원 특이적 신호는 주요 조직적합성-복합체 (MHC)의 맥락에서 제시된 외래 항원 펩티드의 인식에 따라 T-세포 수용체 (TCR)를 통해 형질도입된다. 2차 또는 공통자극 신호는 T 세포가 클론 팽창, 사이토카인 분비 및 효과기 기능을 촉진하도록 유도하는 항원-제시 세포들(APCs)에서 발현된 공통자극 분자에 의해 T-세포에 전달된다. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996). 공동-자극의 부재에 있어서, T-세포는 항원 자극에 난치성이 될 수 있고, 유효한 면역 반응을 일으키지 않을 수 있으며, 또한 외래 항원에 대한 피로감 또는 내성을 초래할 수 있다.
두-신호 모델에서 T-세포는 양성 및 음성 2차 공통자극 신호 양자를 받는다. 이러한 양성 및 음성 신호의 조절은 면역 내성을 유지하고 자가면역을 예방하면서 숙주의 보호성 면역 반응을 극대화하는 데 중요하다. 양성 신호는 T-세포 활성화를 촉진하는 반면, 음성 2차 신호는 T-세포 내성의 유도에 필요한 것으로 보인다. 비록 간단한 2-신호 모델이 여전히 순 림프구에 대한 유효한 설명을 제공하지만, 숙주의 면역 반응은 동적인 과정이고, 그리고 공통자극 신호는 또한 항원-노출된 T-세포에 제공될 수 있다. 공동-자극의 기전은 공통자극 신호의 조작이 세포 기반 면역 반응을 증진시키거나 종료시키는 수단을 제공하는 것으로 나타났기 때문에 치료적 관심 대상이다. 최근에, T 세포 기능이상 또는 무력증은 억제성 수용체인, 프로그래밍된 사망 1 폴리펩티드 (PD-1)의 유도되고 지속된 발현과 동반하여 발생한다는 것이 밝혀졌다. 그 결과, PD-1 및 PD-1과의 상호 작용을 통해 신호를 보내는 다른 분자들, 예컨대 프로그래밍된 사망 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그래밍된 사망 리간드 2 (PD-L2)의 치료상의 표적화는 강렬한 관심 영역이다.
PD-L1은 많은 암에서 과발현되고 그리고 때로는 좋지 못한 진단과 관련된다 (문헌 [Okazaki T 등, Intern. Immun. 2007 19(7):813]) (문헌 [Thompson RH 등, Cancer Res 2006, 66(7):3381]). 흥미롭게도, 대다수의 종양 침윤하는 T 림프구는 종양-반응성 T 세포에서 PD-1의 상향조절이 손상된 항종양 면역 반응에 기여할 수 있다는 것을 나타내는 정상 조직 및 말초 혈액 T 림프구에서 T 림프구와 달리 PD-1을 우세하게 발현한다 (문헌 [Blood 2009 114 (8):1537]). 이것은 T 세포 활성화의 감쇠 및 면역 감시의 회피를 초래하는 PD-1 발현 T 세포와 상호 작용하는 PD-L1 발현 종양 세포에 의해 매개된 PD-L1 신호 전달의 개척에 기인될 수 있다 (문헌 [Sharpe 등, Nat Rev 2002]) (문헌 [Keir ME 등의, 2008 Annu.] Rev. Immunol. 26:677). 따라서, PD-L1/PD-1 상호 작용의 억제는 CD8+ T 세포-매개된 종양의 사멸을 증진시킬 수 있다.
프로그래밍된 사망 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그래밍된 사망 리간드 2 (PD-L2)와 같은, PD-1과 상호작용을 통해 신호하는 다른 분자 및 PD-1을 표적하는 치료는 강렬한 관심 영역이다. PD-L1 신호전달의 억제는 급성 및 만성적 (예를 들면, 지속적) 감염 모두를 포함하는 암 (예를 들면, 종양 면역력) 및 감염의 치료를 위한 T 세포 면역력을 증진시키는 수단으로서 제안되어 왔다. 최적의 치료적 처치는 종양 성장을 직접적으로 억제하는 제제와 PD-1 수용체/리간드 상호작용의 차단을 조합할 수 있다. 다양한 암의 치료, 안정화, 예방 및/또는 지연을 위한 최적의 요법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
공동-자극의 기전은 공통자극 신호의 조작이 세포 기반 면역 반응을 증진시키거나 종료시키는 수단을 제공하는 것으로 나타났기 때문에 치료적 관심 대상이다. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원인, OX40 (CD34, TNFRSF4, 또는 ACT35 항원으로도 공지됨)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 공통자극 신호를 제공할 수 있어, 증진된 세포 증식, 생존, 효과기 기능, 및 이동을 이끈다. OX40 신호전달은 또한 기억 T 세포 발달 및 기능을 증진시킨다. OX40은 비처리 T 세포에서 구성적으로 발현되지 않지만, T 세포 수용체 (TCR)의 참여 이후 유도된다. OX40용 리간드, OX40L은 항원 제시 세포에 우세하게 발현된다. OX40은 활성화된 CD4+ T 세포, 활성화된 CD8+ T 세포, 기억 T 세포, 및 조절 T (Treg) 세포에 의해 크게 발현된다.
종양 세포에서 탈조절된 다른 신호전달 경로와 OX40 신호전달을 조합하는 것은 치료 효능을 추가로 증진할 수 있다. 따라서, 다양한 암, 면역 관련된 질환, 및 T 세포 기능이상 장애의 발생을 치료 또는 지연시키기 위한 그와 같은 최적의 요법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
특허 출원, 특허 공개, 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함하는, 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은, 각 개별 참조가 참고로 편입될 수 있도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지적된 바와 같이 그 전체가 참고로 본 명세서에 편입되어 있다.
일 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 개체는 암을 가지거나 또는 암으로 진단되고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플에서의 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 개체는 암을 가지거나 또는 암으로 진단되고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플에서의 세포는 PD-L1을 발현한다.
또 다른 측면에서, 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)를 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 개체는 암으로 진단되고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플에서의 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 개체는 암으로 진단되고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플에서의 세포는 PD-L1을 발현한다.
추가 측면에서, (예를 들면, 박테리아 또는 바이러스 또는 다른 병원체에 의한) 감염을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 감염은 바이러스 및/또는 박테리아에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 감염은 병원체에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 감염은 급성 감염이다. 일부 구현예에서, 감염은 만성적 감염이다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하는) 약제의 제조에서의 인간 PD-1 축 결합 길항제의 사용이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 약제는 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 치료는 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 약제의 투여를 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하는) 약제의 제조에서의 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 사용이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 약제는 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 치료는 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 약제의 투여를 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는데 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하는데) 사용하기 위한 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 여기서 상기 제2 조성물은 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는데 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하는데) 사용하기 위한 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 여기서 상기 제2 조성물은 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하기 위해) PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제1 약제와 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제2 약제를 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하기 위해) 제1 약제 및 제2 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 (또는, 일부 구현예에서, 감염을 치료하기 위해) OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 및 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막 암, 결장암, 신장암, 식도암, 전립선암, 결장직장암, 교모세포종, 신경교세포종, 또는 간세포 암종이다.
일부 구현예에서, 상기 개체는 암이 있거나 또는 암으로 진단되었다.
일부 구현예에서, (상기 개체로부터 암의 샘플에서) 암 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 이것이 샘플 중 0%를 포함할 때 샘플로부터 부재이다. 일부 구현예에서, 상기 PD-L1 바이오마커 발현은 (면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 계측 시) 단백질 발현에 의해 계측된다.
일부 구현예에서, (개체 유래의 암 샘플에서) 암 세포는 PD-L1을 발현한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 이것이 샘플 중 0% 초과를 포함할 경우 샘플 내 존재한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 샘플 내에서 단백질 발현에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현은 면역조직화학 (IHC)에 의해 계측된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 항-PD-L1 항체를 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 약한 염색 세기, IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기, 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 항-PDL1 항체를 사용하여 검출되고, 그리고 상기 PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로 검출된다.
일부 구현예에서, 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 대해 내성인 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 대해 난치성이다. 일부 구현예에서, 환자는 PD-1 축 결합 길항제에 대해 유효 반응을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 개체는 높은 T 세포 침윤 (예컨대, 진단성 시험에 의하여 계측될 경우)을 갖는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 낮은 또는 본질적으로 검출불가능한 T 세포 침윤 (예컨대, 진단성 시험에 의하여 계측될 경우)을 갖는 암을 갖는다.
상기 및 본 명세서에 기재된 방법, 용도, 조성물, 및 키트의 일부 구현예에서, 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 치료 또는 투여는 치료의 중단 후 개체에서 지속된 반응을 초래한다.
일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 PD-1 축 결합 길항제 (예를 들면, 항-PD-1 또는 항-PDL1 항체)로의 병용 치료는 상승작용을 나타내고, 이로써 조합에서 OX40 결합제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 유효한 용량은 단일 제제로서 OX40 결합제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 유효한 용량에 비해 감소된다.
일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 PD-1 축 결합 길항제 전에, PD-1 축 결합 길항제와 동시에, 또는 PD-1 축 결합 길항제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제는 동일한 조성물로 된다.
일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제는 별도의 조성물로 된다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PDL1 결합 길항제, 및 PDL2 결합 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 이의 리간드 결합 상대로의 PD-1 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PDL1으로의 PD-1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PDL2으로의 PD-1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PDL1 및 PDL2 둘 모두으로의 PD-1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 니볼루맙이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 펨브로리주맙이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 CT-011이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PDL1 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PD-1으로의 PDL1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 B7-1으로의 PDL1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PD-1 및 B7-1 둘 모두으로의 PDL1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 항-PDL1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI4736. 일부 구현예에서, 상기 항체는 GFTFSDSWIH의 HVR-H1 서열 (서열 번호:1), AWISPYGGSTYYADSVKG의 HVR-H2 서열 (서열 번호:2), 및 RHWPGGFDY의 HVR-H3 서열 (서열 번호:3)을 포함하는 중쇄; 및 RASQDVSTAVA의 HVR-L1 서열 (서열 번호:4), SASFLYS의 HVR-L2 서열 (서열 번호:5), 및 QQYLYHPAT의 HVR-L3 서열 (서열 번호:6)을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:7) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호:9)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PDL2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 항체이다. 일부 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 면역접합체이다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 1종 이상의 탈글리코실화 부위 돌연변이 (예를 들면, 치환)를 포함하는 항체 (예를 들면, 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 또는 항-PDL2 항체)이다. 일부 구현예에서, 치환 돌연변이는 아미노산 위치 N297, L234, L235, 및 D265 (EU 넘버링)에서 1종 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환 돌연변이는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: N297G, N297A, L234A, L235A, 및 D265A (EU 넘버링). 일부 구현예에서, 항체는 인간 IgG1이다.
일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 OX40 효능제 항체, OX40L 효능제 단편, OX40 올리고머성 수용체, 및 OX40 면역접합체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 인간 OX40에 결합한다. 일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 본 명세서에서 (예를 들면, 단락 198-226에서) 개시된 항-인간 OX40 효능제 항체 중 임의의 하나이다. 일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469, MEDI0562, 또는 MEDI6383이다. 일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 전장 IgG1 항체이다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 삼량체 OX40L-Fc 단백질이다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 하기에 기재된 삼량체 OX40L 융합 단백질이다: 미국 특허 번호 7,959,925. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 MEDI6383이 아니다. 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 MEDI0562가 아니다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 인간 및/또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예컨대, OX40 효능제 항체)는 (예를 들면, 인간 OX40을 발현하는 세포를 고갈시키는) 고갈(depleting) 항-인간 OX40 항체이다. 일부 구현예에서, 인간 OX40 발현 세포는 CD4+ 효과기 T 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 OX40 발현 세포는 Treg 세포이다. 일부 구현예에서, 고갈은 ADCC 및/또는 식균작용이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 효과기 세포에 의해 발현된 FcγR의 결합 및 인간 효과기 세포 기능의 활성화에 의해 ADCC를 매개한다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 효과기 세포에 의해 발현된 FcγR의 결합 및 인간 효과기 세포 기능의 활성화에 의해 식균작용을 매개한다. 일부 구현예에서, 인간 효과기 세포는 대식세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 및 중성구로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 인간 효과기 세포는 대식세포이다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 작용성 Fc 영역을 가진다. 일부 구현예에서, 작용성 Fc 영역의 효과기 기능은 ADCC이다. 일부 구현예에서, 작용성 Fc 영역의 효과기 기능은 식균작용이다. 일부 구현예에서, 작용성 Fc 영역의 효과기 기능은 ADCC 및 식균작용이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4이다.
상기 및 본 명세서에 기재된 방법, 용도, 조성물, 및 키트의 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)는 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입으로, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 상기 및 본 명세서에 기재된 방법, 용도, 조성물, 및 키트의 일부 구현예에서, 치료는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제로 병용 치료 전에 화학치료제로 치료된다. 일부 구현예에서, 상기 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 OX40 결합 효능제의 조합으로 치료된 개체는 화학치료제에 난치성이다. 본 출원 전반을 통해 기재된 방법, 용도, 조성물, 및 키트의 일부 구현예는 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
상기 및 본 명세서에 기재된 방법, 용도, 조성물, 및 키트의 일부 구현예에서, 개체에서 CD8 T 세포는 상기 조합의 투여 전에 비하여 프라이밍, 활성화, 증식 및/또는 세포용해 활성이 증진되었다. 일부 구현예에서, CD8 T 세포의 수는 상기 조합의 투여 전에 비하여 상승되었다. 일부 구현예에서, CD8 T 세포는 항원-특이적 CD8 T 세포이다. 일부 구현예에서, Treg 기능은 상기 조합의 투여 전에 비하여 억제된다. 일부 구현예에서, T 세포 고갈은 상기 조합의 투여 전에 비하여 감소된다. 일부 구현예에서, Treg 세포의 수는 상기 조합의 투여 전에 비하여 감소된다. 일부 구현예에서, 혈장 인터페론 감마는 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가된다. 일부 구현예에서, 기억 T 효과기 세포의 수는 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가된다. 일부 구현예에서, 기억 T 효과기 세포 활성화 및/또는 증식은 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가된다. 일부 구현예에서, 기억 T 효과기 세포는 말초 혈액에서 검출된다. 일부 구현예에서, 기억 T 효과기 세포의 검출은 CXCR3의 검출에 의한다.
대상체로부터 수득된 백혈구를 포함하는 샘플 (예를 들면, 말초 혈액)에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) (예를 들면, 사이토카인, 예를 들면, 감마 인터페론) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준 (예를 들면, Treg의 백분율 및/또는 Treg의 절대 수; 예를 들면, CD8+ 효과기 T 세포의 수)을 계측함에 의해 OX40 효능제 치료의 약동학적 활성을 모니터링하는 방법, 여기서 상기 대상체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 처리되고, 그리고 상기 1종 이상의 마커 유전자는 T 세포 마커 유전자, 또는 기억 T 세포 마커 유전자 (예를 들면, T 효과기 기억 세포의 마커)로부터 선택됨; 및 참조와 비교될 때 대상체로부터 수득된 샘플에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준에 기반하여 약동학적 활성을 나타내는 것으로 치료를 결정하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조와 비교될 때 1종 이상의 마커 유전자의 증가된 발현 수준은 OX40 효능제 치료에 대해 약동학적 활성을 나타낸다. 마커 유전자, 단백질 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준은 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 방법으로 계측될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 (예를 들면, 말초 혈액 샘플)에서 CD8+ T 세포가 증식하는 수준 (예를 들면, Ki67+/총 CD8+ T 세포의 백분율)을 계측하는 것을 포함하는, OX40 효능제 치료 및 PD-1 축 결합 길항제 병용 치료의 약동학적 활성을 모니터링하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조 (예를 들면, 병용 치료 전의 수준)와 비교될 때 샘플에서 CD8+ T 세포가 증식하는 증가된 수준은 병용 치료에 대한 약동학적 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 (예를 들면, 말초 혈액 샘플)에서 활성화된 CD8+ T 세포의 수준 (예를 들면, CXCR3 +/총 CD8+ T 세포의 백분율)을 계측하는 것을 포함하는, OX40 효능제 치료 및 PD-1 축 결합 길항제 병용 치료의 약동학적 활성을 모니터링하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조 (예를 들면, 병용 치료 전의 수준)와 비교될 때 샘플에서 활성화된 CD8+ T 세포의 증가된 수준은 병용 치료에 대한 약동학적 활성을 나타낸다.
대상체로부터 수득된 백혈구를 포함하는 샘플 (예를 들면, 말초 혈액)에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) (예를 들면, 사이토카인, 예를 들면, 감마 인터페론) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준 (예를 들면, Treg의 백분율 및/또는 Treg의 절대 수; 예를 들면, 말초 혈액 샘플 내 CD8+ 효과기 T 세포의 수)을 계측함에 의해 OX40 효능제 치료에 대한 대상체의 반응성을 모니터링하는 방법, 여기서 상기 대상체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 처리되고, 그리고 상기 1종 이상의 마커 유전자는 T 세포 마커 유전자, 또는 기억 T 세포 마커 유전자 (예를 들면, T 효과기 기억 세포의 마커)로부터 선택됨; 및 참조와 비교될 때 대상체로부터 수득된 샘플에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준에 기반하여 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성으로 상기 대상체를 분류하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조와 비교될 때 1종 이상의 마커 유전자의 증가된 발현 수준은 OX40 효능제 치료에 대해 반응성 또는 반응성의 결여를 나타낸다. 마커 유전자, 단백질 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준은 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 방법으로 계측될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 (예를 들면, 말초 혈액 샘플)에서 CD8+ T 세포가 증식하는 수준 (예를 들면, Ki67+/총 CD8+ T 세포의 백분율)을 계측하는 것을 포함하는, OX40 효능제 치료 및 PD-1 축 결합 길항제 병용 치료의 반응성을 모니터링하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조 (예를 들면, 병용 치료 전의 수준)와 비교될 때 샘플에서 CD8+ T 세포가 증식하는 증가된 수준은 병용 치료에 대한 반응성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 (예를 들면, 말초 혈액 샘플)에서 활성화된 CD8+ T 세포의 수준 (예를 들면, CXCR3 +/총 CD8+ T 세포의 백분율)을 계측하는 것을 포함하는, OX40 효능제 치료 및 PD-1 축 결합 길항제 병용 치료의 반응성을 모니터링하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조 (예를 들면, 병용 치료 전의 수준)와 비교될 때 샘플에서 활성화된 CD8+ T 세포의 증가된 수준은 병용 치료에 대한 반응성을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합될 수 있어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구현예는 후술하는 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.
도 1: 종양 침윤 CD8+T 세포는 CT26 결장직장 동계의 종양 모델 (대조군 처리된 마우스)에서 높은 수준의 PD-1 억제성 수용체를 발현한다. PD-1 발현 CD8 + TILs의 대략 절반이 또한 OX40을 발현한다. 대조군 항체로 치료 시작 2일 후, 5마리 마우스 중 하나로부터 대표적인 유세포계측 도트 플롯.
도 2A 및 2B: (도 2A) 항-OX40 효능제 항체 단독 및 항-PDL1 길항제 항체와 조합하여 항-OX40 효능제 항체로의 치료는 종양 내의 Foxp3 + T 조절 세포의 비율 (CD45 + 세포의 총 수에 비례함)을 유의미하게 감소시켰다. (도 2B) 항-OX40 효능제 항체 단독 및 항-PDL1 길항제 항체와 조합하여 항-OX40 효능제 항체로의 치료는 CT26 결장직장 종양 모델에서 종양 내의 Foxp3 + T 조절 세포의 절대 수를 유의미하게 감소시켰다. 하기 둘 모두 (도 2A) 및 (도 2B): 데이터는 치료 시작 9일 후부터이며, 각 기호는 개별 마우스를 나타낸다. 마우스는 1일에 제1 용량에 대해 10mg/kg IV로, 그 다음 5mg/kg IP BIW (매주 2회)로 대조군 항체 또는 항-PDL1 항체로 복용되었다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 용량에 대해 0.1mg/kg IV로, 그 다음 0.1mg/kg IP TIW (매주 3회)로 복용된다.
도 3A 및 3B: 항-OX40 효능제 항체로의 치료는 하기 상의 PDL1 발현을 증대시킨다: (도 3A) 종양내 골수 (CD11b+ Gr-1저/중) 세포 및 (도 3B) 종양 세포 (CT26 결장직장 동계 종양 모델 내). 데이터는 치료 시작 9일 후부터이다. 각 점/정사각형은 하나의 개별적인 마우스를 나타낸다. PDL1 발현은 유세포계측에 의해 기하 평균 형광 세기 (geo MFI)에 의해 계측되었다. 쌍으로 되지 않은 된 t-시험에 의해 계산된 것으로, **p<0.01, *p<0.05. 이 실험에서 투약은 대조군 항체에 대해 1일에 제1 용량인 10mg/kg IV, 그 다음 5mg/kg IP BIW였다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 용량에 대해 0.1mg/kg IV, 그 다음 0.1mg/kg IP TIW로 복용되었다.
도 4A, 4B: 항-OX40 효능제 항체 및 항-PDL1 길항제 항체로의 치료는 C57BL/6 마우스의 MC38 결장직장암 동계의 종양 모델에서 상승작용적 조합 효능을 입증하였다. (도 4A) 치료 그룹에 의한 경시적으로 (일) 평균 종양 부피 (mm3) 계측, n=10/그룹. (도 4B) 치료 그룹에 의한 경시적으로 개별적인 종양 부피 계측. 흑색 선은 그룹의 평균을 나타낸다. 청색 점선은 대조군 그룹의 평균을 나타낸다. 회색 선은 개별 동물이다. 적색 선은 궤양이 생긴 종양 또는 과도한 종양 크기 때문에 연구로부터 탈락된 개별 동물을 나타낸다. 대조군 항체, 항-PDL1 항체, 또는 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 용량에 대해 10mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 10mg/kg IP TIW로 복용되었다.
도 5A, 5B: 항-OX40 효능제 항체 및 항-PDL1 길항제 항체로 치료는 Balb/c 마우스의 CT26 결장직장 동계의 종양 모델에서 상승작용적 조합 효능을 입증하였다. (도 5A) 치료 그룹에 의한 경시적으로 (일) 평균 종양 부피 (mm3) 계측, n=10/그룹. (도 5B) 치료 그룹에 의한 경시적으로 개별적인 종양 부피 계측. 대조군 항체 또는 항-PDL1은 1일에 제1 용량에 대해 10mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 5mg/kg IP TIW로 복용되었다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 1mg/kg IV로 단회 용량으로 투여되었다. 흑색 선은 그룹의 평균을 나타낸다. 청색 점선은 대조군 그룹의 평균을 나타낸다. 회색 선은 개별 동물이다. 적색 선은 궤양이 생긴 종양 또는 과도한 종양 크기 때문에 연구로부터 탈락된 개별 동물을 나타낸다.
도 6A, 6B: 항-OX40 효능제 항체 단일 제제 치료는 Balb/c 마우스의 CT26 결장직장암 동계의 종양 모델에서 용량 반응성을 나타낸다. (도 6A) 치료 그룹에 의한 경시적으로 (일) 평균 종양 부피 (mm3) 계측, n=10/그룹. (도 6B) 치료 그룹에 의한 경시적으로 개별적인 종양 부피 계측. 흑색 선은 그룹의 평균을 나타낸다. 청색 점선은 대조군 그룹의 평균을 나타낸다. 회색 선은 개별 동물이다. 적색 선은 궤양이 생긴 종양 또는 과도한 종양 크기 때문에 연구로부터 탈락된 개별 동물을 나타낸다. 대조군 항체는 1일에 제1 용량에 대해 1mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 1mg/kg IP TIW로 복용되었다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 용량에 대해 0.01mg/kg, 0.1mg/kg, 또는 1mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 TIW IP로 복용되었다.
도 7A, 7B: 항-OX40 효능제 항체 플러스 항-PDL1 길항제 항체의 하위-최대 용량으로 병용 치료는 Balb/c 마우스의 CT26 결장직장암 동계의 종양 모델에서 상승작용적 조합 효능을 입증하였다. (도 7A) 치료 그룹에 의한 경시적으로 (일) 평균 종양 부피 (mm3) 계측, n=10/그룹. (도 7B) 치료 그룹에 의한 경시적으로 개별적인 종양 부피 계측. 흑색 선은 그룹의 평균을 나타낸다. 청색 점선은 대조군 그룹의 평균을 나타낸다. 회색 선은 개별 동물이다. 적색 선은 궤양이 생긴 종양 또는 과도한 종양 크기 때문에 연구로부터 탈락된 개별 동물을 나타낸다. 대조군 항체 또는 항-PDL1은 1일에 제1 용량에 대해 10mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 10mg/kg IP TIW로 복용되었다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 용량으로 0.1mg/kg, 그리고 후속의 3주 동안 0.1mg/kg IP TIW로 투약이 제공되었다.
도 8A, 8B: 별도 실험에서, 단일 0.1mg/kg IV 주사의 하위-최대 유효한 용량으로 복용된 항-OX40 효능제 항체 플러스 항-PDL1은 Balb/c 마우스의 CT26 결장직장암 동계의 종양 모델에서 상승작용적 조합 효능을 입증하였다. (도 8A) 치료 그룹에 의한 경시적으로 (일) 평균 종양 부피 (mm3) 계측, n=10/그룹. (도 8B) 치료 그룹에 의한 경시적으로 개별적인 종양 부피 계측. 흑색 선은 그룹의 평균을 나타낸다. 청색 점선은 대조군 그룹의 평균을 나타낸다. 회색 선은 개별 동물이다. 적색 선은 궤양이 생긴 종양 또는 과도한 종양 크기 때문에 연구로부터 탈락된 개별 동물을 나타낸다. 대조군 항체 또는 항-PDL1은 1일에 제1 용량에 대해 10mg/kg IV로, 그 다음 3주 동안 5mg/kg IP TIW로 복용되었다. 항-OX40 효능제 항체는 1일에 제1 또는 단회 용량 IV로 0.1mg/kg, 그리고 후속의 3주 동안 0.1mg/kg IP TIW로 투약이 제공되었다.
도 9A-9D: 말초 혈액에서 증식하는 T 세포, Treg 세포, 혈장 인터페론-감마, 및 활성화된 T 세포의 수준에 대한 OX40 효능제 항체 및 PDL1 길항제 (항-PDL1 길항제 항체)로의 병용 치료의 효과. 조합 치료된 CT26 마우스로부터 취해진 말초 혈액의 분석은 효과기 세포 증식 및 염증성 T 세포 마커의 증가를 드러냈다. CD8+ T 세포의 증식 수준(도 9A), Treg 세포 (도 9B), 혈장 인터페론 감마 수준 (도 9C) 및 활성화 T 세포 (도 9D)를 계측하였다. (도 9A) (ki67+/총 CD8+ T 세포의 백분율로 표현된) 증식한 CD8+ T 세포의 수준은 OX40 효능제 항체 또는 PDL1 길항제 항체 단독으로 치료 대비 OX40 효능제 항체 및 PD-L1 길항제의 조합으로 치료된 동물에서 유의미하게 증가되었다. (도 9B) 감소된 말초 혈액 Tregs는 하기로 관측되었다: OX40 효능제 항체 단일 제제에 의한 치료 및 OX40 효능제 항체 및 PDL1 길항제의 조합으로의 치료. (도 9C) 증가된 혈장 감마 인터페론 (IFNg)은 OX40 효능제 및 PDL1 길항제의 조합으로의 치료로 관측되었다. (도 9D) 활성화된 T 세포 (특이적으로, 활성화된 기억 Teff 세포)의 수준이 OX40 효능제 또는 PDL1 길항제 단독으로 치료 대비 OX40 효능제 항체 및 PD-L1 길항제의 조합으로 치료된 동물에서 유의미하게 증가되었다.
도 10은 하기가 있는 인간 환자로부터 암 샘플에서 PDL1 진단 상태와 OX40 발현의 연관을 도시한다: 요상피 방광암 (UBC; 도 10A) 및 비-소세포 폐암 (NSCLC; 도 10B). 조직 샘플은, 항-PD-L1 항체, MPDL3280A로의 1상 임상 시험에 참여한 환자 유래의 것이다. 종양 침윤 면역 세포 (IC)의 PD-L1 바이오마커 상태를 본원에 개시된 IHC를 사용하여 계측하였다. OX40 발현 수준을, rtPCR 분석 (Fluidigm)을 사용하여 계측하였다. 삼각형은 환자가 부분적 또는 완전 임상적 반응을 가졌다는 것을 의미하고; 원은 환자가 무변 질환을 나타내었다는 것을 의미하며; 사각형은 환자가 진행성 질환을 가졌다는 것을 의미한다.
도 11A-11F: 대조군 세포 샘플의 예시적 IHC 분석을 나타낸다. (도 11A) 친계 HEK-293 세포의 음성 대조군 IHC 염색; (도 11B) 약한 염색 세기로, 재조합 인간 PD-L1로 형질감염된 HEK-293 세포의 IHC 염색; (도 11C) 중간정도의 염색 세기로, 재조합 인간 PD-L1로 형질감염된 HEK-293 세포의 IHC 염색; (도 11D) 강한 염색 세기로, 재조합 인간 PD-L1로 형질감염된 HEK-293 세포의 IHC 염색; (도 11E) 태반 조직 샘플의 양성 조직 대조군 IHC 염색; (도 11F) 편도 조직 샘플의 양성 조직 대조군 IHC 염색. 모든 IHC 염색을 전매 항-PD-L1 항체를 사용하여 수행하였다.
도 12A-12C: 하기 유래의 종양 샘플의 예시적 PD-L1 양성 IHC 염색을 나타낸다: (도 12A) 삼중-음성 유방암; (도 12B) 악성 흑색종; (도 12C) NSCLC, 선암종.
본원의 발명자들은 항-PD-L1 면역 요법과 항-인간 OX40 효능제 항체의 조합이 종양 성장의 상승작용적 억제, 및 증가된 반응 속도를 초래했다는 것을 입증하였다.
일 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법, 조성물 및 용도가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키기 위한 방법, 조성물 및 용도가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 (예를 들면, 박테리아 또는 바이러스 또는 다른 병원체로) 감염을 치료하기 위한 방법, 조성물 및 용도가 본 명세서에서 제공된다.
I. 정의
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정한 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며, 그것은 물론 가변적일 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 기재하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는, 그 내용이 다르게 명확히 지시되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"에 대한 지칭은 2개 또는 그 초과의 그와 같은 분자의 조합 등을 임의로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 본 기술 분야의 숙련가에게 쉽게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서 "약(about)" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다).
본원에 기재된 발명의 측면 및 구현예는 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting) 및 "~로 본질적으로 구성되는"의 측면 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "OX40"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 OX40를 나타낸다. 용어는 "전장" 비가공된 OX40 뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 야기되는 OX40의 임의의 형태를 포함한다. 용어는 또한 OX40의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 신호 펩티드가 결핍된 예시적 인간 OX40의 아미노산 서열은 서열 번호: 60에 나타난다
(LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI).
"OX40 활성화"는 OX40 수용체의 활성화를 지칭한다. 일반적으로, OX40 활성화는 신호 형질도입을 초래한다.
용어 "항-OX40 항체" 및 “OX40에 결합하는 항체"는 항체가 OX40를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 OX40에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-OX40 단백질에 항-OX40 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 계측된 것으로 OX40에 대한 항체의 약 10% 미만의 결합이다. 특정 구현예에서, OX40에 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-OX40 항체는 상이한 종 유래의 OX40 중 보존되어 있는 OX40의 에피토프에 결합한다.
용어 “PD-1 축 결합 길항제”는, T-세포 작용 (예컨대, 증식, 시토카인 생산, 표적 세포 사멸)을 복구하거나 증진하는 결과를 갖는, PD-1 신호전달 축 상의 신호전달로부터 유발된, T-세포 기능이상을 제거하기 위하여, 이의 결합 상대 중 하나 또는 그 이상과의 PD-1 축 결합 상대의 상호작용을 억제하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 “PD-1 결합 길항제”는, PD-1 의, 이의 결합 상대 예컨대 PD-L1, PD-L2 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 이의 결합상대 중 하나 이상으로의 PD-1 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-L1 및/또는 PD-L2로의 PD-1 결합을 억제한다. 예를 들어, PD-1 결합 길항제는 하기를 포함한다: PD-L1 및/또는 PD-L2 와의 PD-1 의 상호작용으로 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는, 항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 기타 분자. 일 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1을 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 통해 매개된 음성 공통자극 신호를 감소시켜서 기능이상 T-세포에 기능이상을 덜게 한다 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 증진함). 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기술된 MDX-1106 (니볼루맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기술된 MK-3475 (펨브로리주맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기술된 CT-011 (피딜리주맙)이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기술된 AMP-224이다.
용어 “PD-L1 결합 길항제”는, PD-L1 의, 이의 결합 상대 예컨대 PD-1, B7-1 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 이의 결합상대로의 PD-L1 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1 및/또는 B7-1로의 PD-L1 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 하기를 포함한다: PD-L1 의, 이의 결합 상대 예컨대 PD-1 및/또는 B7-1 중 하나 또는 그 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는, 항-PD-L1 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역콘주게이트, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 기타 분자. 일 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1을 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 통해 매개된 음성 공통자극 신호를 감소시켜서 기능이상 T-세포에 기능이상을 덜게 한다 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 증진함). 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 MDX-1105이다. 한편 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 MPDL3280A이다. 한편 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 MEDI4736이다.
용어 “PD-L2 결합 길항제”는, PD-L2 의, 이의 결합 상대 예컨대 PD-1 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 이의 결합상대 중 하나 이상으로의 PD-L2 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-1로의 PD-L2 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-L2 길항제는 하기를 포함한다: PD-L2 의, 이의 결합 상대 예컨대 PD-1 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는, 항-PD-L2 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 기타 분자. 일 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2를 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 통해 매개된 음성 공통자극 신호를 감소시켜서 기능이상 T-세포에 기능이상을 덜게 한다 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 증진함). 일부 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 면역접합체이다.
면역 기능이상의 맥락에서의 용어 “기능이상”은 항원성 자극에 대한 감소된 면역 반응성의 상태를 지칭한다. 상기 용어는 항원 인식이 발생할 수 있으나, 차후의 면역 반응이 감염 또는 종양 성장을 조절하기에 비효과적인 고갈 및/또는 무감작(anergy) 둘 모두의 통상적 요소를 포함한다.
용어 “기능이상”은, 본원에 사용된 바와 같이, 또한 항원 인식에 대한 난치성 또는 비반응성, 특히 항원 인식을 다운-스트림 T 세포 효과기 작용, 예컨대 증식, 시토카인 생산 (예컨대, IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸로 번역하는 능력의 손상을 포함한다.
용어 “무감작”은, T 세포 수용체를 통하여 전달된 불완전하거나 불충분한 신호로 인하여 유발된 항원 자극에 대한 비반응성 상태 (예컨대, ras-활성화의 부재 하에서 세포내 Ca+ 2 의 증가)를 지칭한다. 　T 세포 무감작은 또한, 공-자극의 부재하에서 항원에 의한 자극에서의 결과일 수 있으며, 이는 세포 내에서 공자극의 맥락 내에서도 항원에 의한 차후 활성화에 난치성이 되는 것을 유발한다. 비반응성 상태는 종종 인터류킨-2의 존재에 의하여 무시될 수 있다. 　비감작 T 세포는 클론성 증식을 경험하고/하거나 효과기 기능을 획득하지 않는다.
용어 “고갈”은 다수의 만성 감염 및 암 동안 발생하는 지속된 TCR 신호로부터 야기된 T 세포 기능이상의 상태로서의 T 세포 고갈을 지칭한다. 　이는, 이것이 불완전하거나 결핍된 신호전달을 통하여 야기되나, 지속된 신호전달로부터 야기된다는 점에서 무감작과 구별된다. 　이는 하기에 의하여 정의된다: 불량한 효과기 작용, 억제성 수용체의 지속된 발현, 및 작용성 효과기 또는 기억 T 세포의 것과 구별되는 전사 상태. 고갈은 염증 및 종양의 최적 조절을 방해한다. 고갈은 하기 둘 모두에 의하여 유발될 수 있다: 음성 조절 경로 (예컨대, 면역조절 시토카인), 뿐만 아니라 세포 고유 음성 조절 (공자극) 경로 (PD-1, B7-H3, B7-H4 등).
“T 세포 작용 증진”은, 지속되거나 증폭된 생물학적 작용을 갖기 위하여, 또는 고갈되거나 비활성인 T 세포를 갱신하거나 재활성화하기 위하여, T 세포를 유도, 유발, 또는 자극하는 것을 의미한다. T 세포 작용 증진의 예시는 하기를 포함한다: CD8+ T-세포 유래의 감마-인터페론의 증가된 분비, 증가된 증식, 증가된 항원 반응성 (예컨대, 바이러스, 병원체, 또는 종양 청소율) (처치 전 수준과 비교하여). 일 구현예에서, 증진의 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%이다. 이러한 증진을 계측하는 방식은 본 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
“T 세포 기능이상 장애”는 항원 자극에 대하여 감소된 반응성으로 특징화된 T 세포의 장애 또는 병태이다. 특정 구현예에서, T-세포 기능이상 장애는 특히 PD-1을 통한 적절한 증가된 신호전달과 관련된 장애이다. 또 다른 구현예에서, T 세포 기능이상 장애는, T 세포가 시토카인을 분비하고, 세포용해 활성을 증식 또는 실행하는데 있어서 무감작성이거나 감소된 능력을 갖는 것이다. 특정 양태에서, 감소된 반응성은 면역원을 발현하는 병원체 또는 종양의 비효율적 조절을 유발한다. T 세포 기능이상으로 특징화되는 T 세포 기능이상 장애의 예시는 미해결 급성 감염, 만성 감염, 및 종양 면역성을 포함한다.
“종양 면역성”은 종양이 면역 인식 및 청소율에 대해 회피되는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서, 종양 면역성은, 상기 회피가 약화되고, 상기 종양이 면역계에 의하여 인식되고 공격될 경우 “치료된” 것이다. 종양 인식의 예시는 종양 결합, 종양 수축, 및 종양 청소를 포함한다.
"면역원성"은 면역 반응을 일으키는 특정 물질의 능력을 지칭한다. 종양은 면역원성이며, 면역 반응에 의한 종양 세포의 청소를 보조하는 종양 면역원성을 증진시킨다. 종양 면역원성을 증진시키는 예는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제로의 치료를 포함한다.
“지속된 반응”은, 치료 중지 후 종양 성장 감소에 대한 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는, 투여 단계의 개시시점에서의 크기와 비교하여 상동하거나 보다 작게 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 지속된 반응은, 적어도 치료 기간의 적어도 1.5X, 2.0X, 2.5X, 또는 3.0X 길이의 치료 기간과 상동한 기간을 갖는다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에 허용 불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 나타낸다. 그러한 제형은 무균성일 수 있다. "약학적으로 허용가능한" 부형제 (비히클, 첨가제)는 이용된 활성 성분의 유효한 용량을 제공하기 위해 대상체 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, “치료”는 임상 병리학적 과정 동안 치료받는 개체 또는 세포의 본래의 과정을 변화시키려는 시도에서의 임상적 중재를 지칭한다. 목적 치료 효과는 하기를 포함한다: 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, 차도, 또는 개선된 진단성. 예를 들어, 개체는, 만약 암과 관련된 1종 이상의 증상이 비제한적으로 하기를 포함하여 경감 또는 제거되었다면 성공적으로 “치료된” 것이다: 암성 세포의 증식 감소 (또는 파괴), 질환으로 유발된 증상의 감소, 질환을 앓는 군의 생활의 질 증가, 질환을 치료하는데 요구되는 기타 약제의 투여량 감소, 및/또는 개체 생존의 연장.
본원에서 사용된 바와 같이, “질환의 진행 지연"은 질환 (예컨대 암)의 진행을 보류, 방해, 지체, 저지, 안정화, 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 상기 지연은 질환의 이력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간의 길이일 수 있다. 당해분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발병이 지연될 수 있다.
“유효량”은 특정 장애의 계측이능한 개선 또는 예방을 부여하는데 요구되는 최소한의 최소량이다. 본원의 유효량은 개체의 질환 단계, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인, 및 환자에서의 목적 반응을 일으키는 항체의 능력에 따라 가변될 수 있다. 유효량은 또한, 치료의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적 유익 효과를 능가하는 것이다. 예방 용도에 대하여, 유익한 또는 원하는 결과는 결과 예컨대 위험 제거 또는 감소, 중증도 약화, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상, 질환의 발달 동안 나타나는 그 합병증 및 중간체 병리적 표현형을 포함하여, 질환의 개시 지연을 포함한다. 치료 용도에 대하여, 유익한 또는 원하는 결과는 임상 결과 예컨대 질환에서 비롯되는 하나 이상의 증상 감소, 질환을 앓는 군의 삶의 질 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약제의 용량 감소, 예컨대 질환의 표적화, 질환 진행의 지연을 통한 기타 약제의 효과 증강, 및/또는 생존 연장을 포함한다. 암 또는 종양의 경우, 치료학적 유효량의 약물은 암 세포수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 말초 장기로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 느리게 하거나 정지)하고/하거나; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 느리게 하거나 바람직하게는 정지)하고/하거나; 종양 성장을 어느 정도로 억제하고/하거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 완화시키는 것에 대한 효과를 가질 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하는데 충분한 양이다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제 투여의 맥락에서 고려될 수 있고, 그리고 만일 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되면 단일 제제는 효과적인 양으로 제공되는 것으로 고려될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "~와 결합하여”는 기타 치료 양식에 더하여 일 치료 양식을 투여하는 것을 지칭한다. 따라서, "~와 결합하여”는 개체에게 기타 치료 양식을 투여하기 전, 동안, 또는 후의 일 치료 양식을 투여하는 것을 지칭한다.
“장애”는 하기를 비제한적으로 포함하는 치료로부터 이점을 얻을 임의의 병태이다: 포유동물이 문제 장애를 갖기 쉽게 만드는 병리적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환.
용어 “세포 증식성 장애” 및 “증식성 장애”는 일정 정도의 비정상 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 일 구현예에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 일 구현예에서, 세포 증식성 장애는 종양이다.
본원에서 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든, 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 그리고 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다. 용어들 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 상호 배타적인 것이 아니다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징되는 포유동물의 생리 조건을 지칭하거나 설명한다. 암의 예는, 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함한다. 상기 암의 더욱 특정한 예는 하기를, 비제한적으로, 포함한다: 편평상피 세포 암 (예를 들면, 상피성 편평상피 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 포함한 폐암, 복막의 암, 간세포암, 위장암 및 위장 기질 암을 포함한 위 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로의 암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종(저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프구성 NHL; 고등급 소 비-절단 세포 NHL; 대부피성 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함); 만성적 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성적 골수아세포 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종 (예컨대 뇌 종양과 관련된 것), 메이그스 증후군, 뇌, 뿐만 아니라 두경부암, 및 관련된 전이. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체에 의한 치료를 잘 받아들이는 암은 하기를 포함한다: 유방암, 대장암, 직장암, 비소세포 폐암, 교모세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장 세포 암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부 암, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종. 일부 구현예에서, 암은 하기로부터 선택된다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경교세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 대장암 (CRC), 및 간세포 암종. 추가의, 일부 구현예에서, 암은 하기로부터 선택된다: 상기 암의 전이성 형태를 포함한, 비소세포 폐암, 대장암, 교모세포종 및 유방 암종.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성 약물"은 세포에 해로운 (예를 들면, 세포사를 야기하고, 증식을 억제하고, 또는 달리는 세포질의 기능을 방해하는) 임의의 제제를 지칭한다. 세포독성제는, 비제한적으로, 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제; 성장 억제성 제제; 효소 및 그 단편 예컨대 핵산분해 효소; 및 독소 예컨대 작은 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 단편 및/또는 이의 변이체를 포함한다. 예시적 세포독성 제제는 하기로부터 선택될 수 있다: 항-미세소관 제제, 백금 배위 착물, 알킬화제, 항생제 제제, 토포이소머라제 II 억제제, 항대사물질, 토포이소머라제 I 억제제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 신호 형질도입 경로 억제제, 비-수용체 티로신 키나아제 혈관신생 억제제, 면역치료제, 세포자멸유도 제제, LDH-A의 억제제; 지방산 생합성의 억제제; 세포 주기 신호전달 억제제; HDAC 억제제, 프로테아솜 억제제; 및 암 대사의 억제제. 일 구현예에서, 세포독성제는 탁산이다. 일 구현예에서 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀이다. 일 구현예에서, 세포독성제는 백금 제제이다. 일 구현예에서 세포독성 제제는 EGFR의 길항제이다. 일 구현예에서 EGFR의 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (예를 들면, 에를로티닙)이다. 일 구현예에서 세포독성 제제는 RAF 억제제이다. 일 구현예에서, RAF 억제제는 BRAF 및/또는 CRAF 억제제이다. 일부 구현예에서, RAF 억제제는 베무라페닙이다. 일 구현예에서 세포독성 제제는 PI3K 억제제이다.
“화학치료제”는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학치료제의 예시는 하기를 포함한다: 에를로티닙 (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), 보르테조밉 (VELCADE®, Millennium Pharm.), 디설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트, 살리노스포라마이드 A, 카르필조밉, 17-AAG (젤다나마이신), 라디시콜, 락테이트 탈수소효소 A (LDH-A), 풀베스트란트 (FASLODEX®, AstraZeneca), 서니팁 (SUTENT®, Pfizer/Sugen), 레트로졸 (FEMARA®, Novartis), 이마티닙 메실레이트 (GLEEVEC®, Novartis), 피나서네이트 (VATALANIB®, Novartis), 옥살리플라틴 (ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, RAPAMUNE®, Wyeth), 라파티닙 (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파밉 (SCH 66336), 소라페닙 (NEXAVAR®, Bayer Labs), 게피티닙 (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (하기 포함: 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민(trimethylomelamine); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (하기 포함: 토포테칸 및 이리노테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC1065 (하기 포함: 그것의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 아드레노코르티코스테로이드 (하기 포함: 프레드니손 및 프레드니솔론); 사이프로테론 아세테이트; 5α-환원효소 (하기 포함: 피나스테라이드 및 두타스테라이드)); 보리노스태트, 로미뎁신, 파노비노스태트, 발프로산, 모세티노스태트 돌라스타틴; 알데스류킨, 탈크 듀오카르마이신 (하기 포함: 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로마파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 γ1I 및 칼리키아마이신 ω1I (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33:183-186); 다이네마이신 (하기 포함: 다이네마이신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® (독소루비신), 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피머, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피담놀; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS 다당류 복합체 (JHS 천연 생성물, Eugene, Oreg.); 라족산; 라이족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("아라(Ara)-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들 면, TAXOL (파클리탁셀; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (크레모포어 부재), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 TAXOTERE® (도세탁셀, 독세탁셀; Sanofi-Aventis); 클로르람부실; GEMZAR® (젬시타빈); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® (비노렐빈); 노반트론; 테니포시드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (XELODA®); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체.
화학치료제는 또한 (i) 예를 들면, 타목시펜 (NOLVADEX®; 타목시펜 시트레이트를 포함함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 아오독시펜 , 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON® (토레미핀 시트레이트)을 포함하는, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERMs)과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제; (ii) 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® (메게스트롤 아세테이트), AROMASIN® (엑세메스탄; 화이자), 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR® (보로졸), FEMARA® (레트로졸; 노바티스), 및 ARIMIDEX® (아나스트로졸; AstraZeneca)와 같은 효소 방향화효소를 억제하고, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 방향화효소 억제제; (iii) 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 부세렐린, 트립테레린, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 디에틸스틸베스트롤, 프레마린, 플루옥시메스테론, 모든 트렌스레티노산, 펜레티나이드 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나제 억제제; (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 예를 들면, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras와 같은, 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들; (vii) 리보자임 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들면, ANGIOZYME®) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, 및 VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; 토포이소머라제 1 억제제 예컨대 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; 및 (ix) 임의의 상기의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체를 포함한다.
화학치료제는 또한 하기를 포함한다: 알렘투주맙(캄파스(Campath)), 베바시주맙(AVASTIN®, Genentech); 세툭시맙(ERBITUX®, Imclone); 파니투무맙(VECTIBIX®, Amgen), 리툭시맙(RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), 퍼투주맙(OMNITARG®, 2C4, Genentech), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 토시투모맙(Bexxar, Corixia) 및 항체 약물 컨쥬게이트, 젬투주맙 오조가미신(MYLOTARG®, Wyeth). 본 발명의 화합물과 조합된 제제로서 치료적 잠재력을 갖는 추가의 인간화된 단클론성 항체는 하기를 포함한다: 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 루벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 유르톡사주맙, 및 비실리주맙, 항-인터류킨-12 (예컨대, ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories (인터류킨-12 p40 단백질을 인식하기 위하여 유전적으로 변형된 재조합 배타적 인간-서열, 전장 IgG1 λ 항체).
화학치료제는 또한 하기를 포함한다: “EGFR 억제제,” (EGFR에 결합하거나, 달리는 이에 직접 상호작용하고, 이의 신호전달 활성을 예방 또는 감소시키는 화합물로 지칭되고, 대안적으로 “EGFR 길항제”로 지칭됨). 상기 제제의 예시는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예시는 하기를 포함한다: MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (참고: 미국 특허 번호 4,943, 533, Mendelsohn et al.) 및 이의 변이체, 예컨대 키메라화된 225 (C225 또는 세툭시맙; ERBUTIX®) 및 재형상화된 인간 225 (H225) (참고, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적 항체 (Imclone); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기재된, EGFR에 결합하는 인간화되고 키메라성인 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 파니투무맙의 ABX-EGF (참고 WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (마투주맙) EGFR 결합 (EMD/Merck)을 위하여 EGF 및 TGF-알파 둘 모두와 경쟁하는 EGFR에 대하여 지향된, 인간화된 EGFR 항체; 및 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR (GenMab); 완전 인간 항체 (하기로 공지됨: E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6 3 및 E7.6. 3 그리고 하기에 기술됨: US 6,235,883); MDX-447 (Medarex Inc); 및 mAb 806 또는 인간화된 mAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). 항-EGFR 항체는 세포독성 제제와 콘주게이트되어 이로써 면역접합체를 생성할 수 있다 (참고: 예를 들어 EP659439A2,Merck Patent GmbH). EGFR 길항제는 하기를 포함한다: 하기에 기술된 화합물과 같은 소분자: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008, 및 5,747,498, 뿐만 아니라 하기의 PCT 공보: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016, 및 WO99/24037. 특정한 소분자 EGFR 길항제는 하기를 포함한다: OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, TARCEVA® Genentech/OSI 의약품); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디하이드로클로라이드, Pfizer Inc.); ZD1839, 게피티닙 (IRESSA®) 4-(3’-클로로-4’-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모폴리노프로폭시)퀴나졸린, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-하이드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드(butynamide); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나제 억제제 예컨대 라파티닙 (TYKERB®, GSK572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3 플루오로페닐)메톡시]페닐]-6[5[[[2메틸설포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민).
화학치료제는 또한 하기를 포함할 수 있다: "티로신 키나제 억제제" (선행 단락에 주지된 EGFR-표적화된 약물 포함); 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제 예컨대 TAK165 (Takeda로부터 이용가능함); CP-724,714, ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제 (Pfizer 및 OSI); 이중-HER 억제제 예컨대 EKB-569 (Wyeth로부터 이용가능함) (EGFR에 우선적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR-과발현 세포 둘 모두를 억제함); 라파티닙 (GSK572016; Glaxo-SmithKline로부터 이용가능함), 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제; PKI-166 (Novartis로부터 이용가능함); 팬(pan)-HER 억제제 예컨대 카네르티닙 (CI-1033; Pharmacia); Raf-1 억제제 예컨대 안티센스 제제 ISIS-5132 (Raf-1 신호전달을 억제하는 ISIS 의약품으로부터 이용가능함); 비-HER 표적화된 TK 억제제 예컨대 이마티닙 메실레이트 (GLEEVEC®, Glaxo SmithKline로부터 이용가능함); 다중-표적화된 티로신 키나제 억제제 예컨대 수니티닙 (SUTENT®, Pfizer로부터 이용가능함); VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 예컨대 바탈라닙 (PTK787/ZK222584, Novartis/Schering AG로부터 이용가능함); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 억제제 CI-1040 (Pharmacia로부터 이용가능함); 퀴나졸린, 예컨대 PD 153035,4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘; 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 타이르포스틴 (니트로티오펜 모이어티 함유); PD-0183805 (Warner-Lamber); 안티센스 분자 (예를 들면, HER-암호화 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린 (미국 특허 번호 5,804,396); 트리포스틴 (미국 특허 번호 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); 팬(pan)-HER 억제제 예컨대 CI-1033 (Pfizer); 아피니탁 (ISIS 3521; Isis/Lilly); 이마티닙 메실레이트 (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); 세막시닙 (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), 라파마이신 (시롤리무스, RAPAMUNE®); 또는 하기 특허 공보 중 임의의 것에 기재된 것들: 미국 특허 번호 5,804,396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) 및 WO 1996/33980 (Zeneca).
화학요법제는 덱사메타손, 인터페론, 콜히친, 메토프린, 사이클로스포린, 암포테리신, 메트로니다졸, 알레투주맙, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 아미포스틴, 삼산화비소, 아스파라기나제, BCG 생균, 베바쿠지맙, 베사로틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 다베포에틴 알파, 데니류킨, 덱스라족산, 에포에틴 알파, 엘로티닙, 필그라스팀, 히스트렐린 아세테이트, 이브리투모맙, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 레날리도미드, 레바미졸, 메스나, 메톡살렌, 난드롤론, 넬라라빈, 노페투모맙, 오프렐베킨, 팔리페르민, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파가제, 페그필그라스팀, 페메트렉세드 디소듐, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 퀴나크린, 라스부리카제, 사르그라모스팀, 테모졸로미드, VM-26, 6-TG, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 졸레드로네이트 및 졸레드론산 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
화학치료제는 또한 하기를 포함한다: 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 코르티손 아세테이트, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 알코올, 모메타손, 암시노나이드, 부데소니드, 데소나이드, 플루오시노나이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 베타메타손, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 플루오코르톨론, 하이드로코르티손-17-부티레이트, 하이드로코르티손-17-발레레이트, 아클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 프레드니카르베이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타솔-17-프로피오네이트, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트 및 플루프레드니덴 아세테이트; 면역 선택적 항-염증성 펩티드 (ImSAID) 예컨대 페닐알라닌-글루타민-글리신 (FEG) 및 그것의 D-이성질체 형태 (FEG) (IMULAN 생물학적 치료제, LLC); 항-류마티스성 약물 예컨대 아자티오프린, 사이클로스포린 (사이클로스포린 A), D-페니실아민, 금 염, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드미노사이클린, 설파살라진, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 차단제 예컨대 에타네르셉트 (Enbrel), 인플릭시맙 (Remicade), 아달리무맙 (Humira), 세르톨리주맙 페골 (Cimzia), 골리무맙 (Simponi), 인터류킨 1 (IL-1) 차단제 예컨대 아나킨라 (Kineret), T 세포 상호자극 차단제 예컨대 아바타셉트 (Orencia), 인터류킨 6 (IL-6) 차단제 예컨대 토실리주맙 (ACTEMERA®); 인터류킨 13 (IL-13) 차단제 예컨대 레브리키주맙; 인터페론 알파 (IFN) 차단제 예컨대 론탈리주맙; 베타 7 인테그린 차단제 예컨대 rhuMAb 베타7; IgE 경로 차단제 예컨대 항-M1 프라임; 분비된 동형삼량체 LTa3 및 막 결합된 헤테로트리머 LTa1/β2 차단제 예컨대 항-림프독소 알파 (LTa); 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 여러 종류의 조사 제제 예컨대 티오플라틴, PS-341, 페닐부티레이트, ET-18- OCH3, 또는 파르네실 전달효소 억제제 (L-739749, L-744832); 폴리페놀 예컨대 쿠에르세틴, 레스베라트롤, 피세아탄놀, 에피갈로카테카인(epigallocatechine) 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 베툴린산 및 그것의 유도체; 자가포식 억제제 예컨대 클로로퀸; 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콘; 콜히친; 베툴린산; 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 포도필로톡신; 테가푸르 (UFTORAL®); 벡사로텐 (TARGRETIN®); 비스포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들면, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 팔미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리센드로네이트 (ACTONEL®); 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신 예컨대 THERATOPE® 백신; 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들면 셀레콕십 또는 에토리콕십), 프로테오좀 억제제 (예를 들면 PS341); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제 예컨대 오블리메르센 나트륨 (GENASENSE®); 픽산트론; 파르네실전달효소 억제제 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, SARASARTM); 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합 예컨대 CHOP, 하기의 병용요법에 대한 약어: 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론; 및 폴폭스, 하기를 갖는 치료 레지멘에 대한 약어: 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (ELOXATINTM).
화학치료제는 또한 하기를 포함한다: 진통, 해열 및 항-염증성 효과를 갖는 비-스테로이드 항-염증성 약물. NSAID는 효소 사이클로옥시게나제의 비-선택적 억제제를 포함한다. NSAID의 구체적인 예는 하기를 포함한다: 아스피린, 프로피온산 유도체 예컨대 이부프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르바이프로펜, 옥사프로진 및 나프록센, 아세트산 유도체 예컨대 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 디클로페낙, 에놀산 유도체 예컨대 피록시캄, 멜록시캄, 테녹시캄, 드록시캄, 로르녹시캄 및 이속시캄, 페남산 유도체 예컨대 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 및 COX-2 억제제 예컨대 셀레콕십, 에토리콕십, 루미라콕십, 파레콕십, 로페콕십, 로페콕십, 및 발데콕십. NSAID는 하기 병태의 증상 완화에 대해 표지될 수 있다: 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증성 관절병증, 강직 척추염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 급성 통풍, 월경이상증, 전이성 골 통증, 두통 및 편두통, 수술후 통증, 염증 및 조직 부상으로 인한 경도-내지-중간 정도 통증, 열증, 장폐색증, 및 신장 산통.
본원에서 사용되는 "성장 억제성 제제"는 시험관내 또는 생체내 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일 구현예에서, 성장 억제성 제제는 항원이 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 예방 또는 감소시키는 성장 억제성 항체이다. 또 다른 구현예에서, 성장 억제성 제제는 S 상에서 세포의 백분율을 유의미하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제된 제제의 예는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단하는 제제, 예컨대 G1 상 및 M-상 정지를 유도하는 제제를 포함한다. 고전적 M-상 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 제제, 예를 들면, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 아라-C도 S-상 정지로 번진다. 추가 정보는 하기에서 발견될 수 있다: Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), 예컨대, p. 13. 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목(yew tree)에서 유도된 항암 약물이다. 유럽 주목에서 유도된 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀의 반합성 유사체(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 어셈블리를 촉진하고, 탈중합 방지에 의해 미세소관을 안정화하여 세포에서 유사분열의 억제를 야기한다.
"방사선 요법"은 세포를 정상적으로 작용하도록 하거나 세포를 파괴하는 것을 함께 제한하기 위하여 세포에 충분한 손상을 유도하기 위하여 지시된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 치료의 투여량 또는 기간을 결정하기 위하여 본 분야에서 많은 방법이 있을 것이라는 것이 고려된다. 전형적인 치료를 1회성 투여로 실시하였으며, 전형적인 투여량은 1일 당 10 내지 200 단위 (Grays)의 범위이다.
치료의 목적을 위한 "대상체" 또는 "개체"는, 인간, 가정용 및 농장용 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 등을 포함하여, 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 언급한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이다.
용어 "항체"는 본원에서 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 그것의 천연 환경의 구성요소로부터 확인되고 분리되고 및/또는 회수된 항체이다. 그 천연 환경의 오염물질 성분은 항체에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들면, Lowry 방법에 의해 계측된 항체의 95 중량% 초과로, 일부 구현예에서 99 중량% 초과로; (2) 예를 들면, 회전 컵 시쿼네이터를 이용해서 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도15 개 잔기를 수득하기 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들면, 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 이용해서 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도1종의 구성요소가 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 동일계내에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1종의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"원상태 항체"는 보통 2개의 동일한 가벼운 (L) 사슬 및 2개의 동일한 무거운 (H) 사슬로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 디설파이드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 다변한다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH)과 그 다음 수많은 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인을(VL) 그리고 그 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은, 항원 결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분, 즉 가변 도메인에 비하여 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부문을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 불릴 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 불릴 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변성 부분이고 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 그리고 그것의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 언급한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 고르게 분포되어 있지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변성 영역(HVR)으로 불리는 3 개 절편에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 원상태 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 대부분 베타-시트 배치를 채용하며, 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에서 그 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3 개의 HVR에 의해 연결된 4 개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬에서 HVR은 FR 영역에 의해 가까운 부근에서 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다(참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포성 독성에서의 항체 참여를 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체(면역글로불린) "경쇄"는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2 개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
용어 IgG "이소형" 또는 "하위부류"는 본원에서 사용된 바와 같이 그의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위부류가 의미된다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체(면역글로불린)는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유니트 구조 및 3-차원 입체배치는 잘 알려지고 일반적으로, 예를 들어, 하기에 기술된다: Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
본원에서 사용된 용어들 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 상호교환적으로 아래에서 정의된 바와 같이 항체 단편이 아닌 그 실질적으로 온전한 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
본원의 목적을 위한 용어 "네이키드 항체(naked antibody)"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 이들의 항원-결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(linear antibodies); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 분해는, 각각이 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 가지고, 그의 명칭이 쉽게 결정화하는 이들의 능력을 반영한 것으로, "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편을 산출하는데, 이것은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2-쇄 Fv 종은 밀접한 비-공유 결합으로 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-쇄 Fv(scFv) 종에서, 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 비슷한 "이량체" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이는 상기 입체배지에서 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 정의하도록 상호작용한다. 총괄적으로, 6 개의 HVR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화도에서지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3 개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 초과의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 예를 들어, 하기를 참고한다:
Figure pct00001
, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.
용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2 개의 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 하나의 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 생성하도록 유도된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 하기에 더욱 충분히 기술된다: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디가 또한 하기에 기술된다: Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)).
용어 "단클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 실질적으로 균질한 항체 집단에서 수득된 항체를 나타낸다, 예컨대 집단을 이루는 개체 항체는 가능한 돌연변이, 예를 들면 소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 구별되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 그와 같은 단클론성 항체에는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 포함되며, 여기서 상기 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택이 포함되는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열이, 예를 들면 표적에 대한 친화도를 증진하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양에서 그 생성을 증진하기 위해, 생체내 그 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해 등등 추가 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단클론성 항체라는 것이 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체가 포함되는 다클론성 항체 제조물과는 대조적으로, 단클론성-항체 제조물의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 이들의 특이성에 부가하여, 단클론성-항체 제조물은 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 시사하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들면 혼성세포 방법을 포함하는 다양한 기술 (예컨대, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (참고: 예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567), 파지-디스플레이 기술 (참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), 및 인간 면역글로불린 유전자좌(locus) 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (참고: 예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
본원의 단클론성 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 “키메라” 항체, 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편들을 포함한다 (참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 키메라성 항체에는 PRIMATTZED® 항체가 포함되며, 여기서 항체의 상기 항원-결합 영역은, 예를 들면 관심 항원으로 마카크 원숭이를 면역화하여 생성된 항체로부터 유도된다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수령체의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 래빗, 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수령체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 상기 인간화된 항체는 임의로 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc) 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는, 예를 들면 하기를 참고한다: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). 또한, 예를 들어 하기를 참고한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 6,982,321 및 7,087,409.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 하기에 기재된 방법이 이용 가능하다: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). 또한 하기를 참고한다: van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). 인간 항체는 항원 유발접종에 반응하여 그와 같은 항체를 생성하기 위해 개질되었지만, 그 내인성 유전자위가 불활성화된 형질전환(transgenic) 동물, 예를 들면 면역화된 제노마우스(예를 들면, 참고: XENOMOUSE™ 기술에 관한 미국 특허 6,075,181 및 6,150,584). 또한 예를 들어, 참고: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) (인간 B-세포 혼성세포 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관함).
"종-의존성 항체"는 이것이 제2 포유동물 종 유래의 상기 항원의 상동체에 대해 갖는 것보다 제1 포유동물 종 유래의 항원에 대해 보다 강한 결합 친화성을 갖는 항체이다. 정상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원(예를 들어, 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는, 약 1 x 10-8 M 이하 및 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화성(Kd) 값을 갖는다)에 "특이적으로 결합"하지만 인간 항원에 대한 이의 결합 친화성 보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 약한 제2 비인간 포유동물 종 유래의 항원의 상동체에 대해 결합 친화성을 갖는다. 종 의존성 항체는 상기 정의된 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만 바람직하게 인간화된 또는 인간 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변성 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR; VH에 3 개(H1, H2, H3), 및 VL에 3 개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6 개 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내며, H3은 특히 항체에 대해 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 참고: 예를 들면, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). 사실상, 중쇄만으로 구성된 천연 발생 낙타과(camelid) 항체는 경쇄의 부재 하에서 작용적이고 안정하다. 참고: 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)).
수많은 HVR 묘사가 사용되며, 본원에서 포괄된다. 카밧 상보성-결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 일반적으로 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 초티아는 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카밧 CDR 및 초티아 구조적 루프 간 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 이용된다. "접촉" HVR은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 아래에 주지된다.
루프 카밧 AbM 초티아 접촉점
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (카밧 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (초티아 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVR은 하기와 같이 “연장된 HVR”을 포함할 수 있다: 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) (VL 중) 및 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3) (VH 중). 초가변 도메인 잔기들은 이들 정의의 각각에 대해 문헌(Kabat et al., 상기)에 따라 넘버링한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "카밧에서의 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "카밧에서의 아미노산-위치 넘버링" 및 이들의 변형은 [Kabat et al.,상기]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들면, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 대해 언급할 때 일반적으로 사용된다(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). “EU 넘버링 시스템” 또는 “EU 지수” 는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 경우 사용된다 (예컨대, 상기 Kabat et al. 에 보고된 EU 지수). "Kabat에서의 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.
어구 "선형 항체"는 하기에 기재된 항체를 지칭한다: Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). 간단히, 이들 항체는, 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “결합하는”, “이에 특이적으로 결합하는” 또는 “이에 특이적인”은, 표적 및 항체 간의 결합과 같은 계측이능하고 재생가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종성 집단의 존재 하에서의 표적의 존재에 대한 계측요인이다. 예를 들면, 표적 (에피토프일 수 있음)에 결합하거나, 또는 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능으로, 더욱 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 상기 표적에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 비관련 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정법(RIA)으로 계측 시, 약 10% 미만의 항체의 결합이다. 특정 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존된 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 필연적으로 (비록 포함할 수 있어도) 배타적인 결합을 요구하지 않는다.
용어 “검출”은 직접 및 간접 검출을 포함하는, 검출의 임의의 수단을 포함한다.
용어 “바이오마커”는, 본원에 사용된 바와 같이, 예컨대, 예측성, 진단성, 및/또는 예후성인 표지자를 지칭하며, 이는 샘플 내에서 검출될 수 있다. 바이오마커는, 분자적, 병리학적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의하여 특성화된, 질환 또는 장애 (예컨대, 암)의 특정 하위유형의 표지자로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 유전자이다. 바이오마커는 비제한적으로 하기를 포함한다: 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA 및/또는 RNA), 폴리뉴클레오티드 카피 수 변경 (예컨대, DNA 카피 수), 폴리펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 변형 (예컨대, 번역 후 변형), 탄수화물, 및/또는 당지질-계 분자 마커.
용어들 "바이오마커 표지", "표지", "바이오마커 발현 표지", 또는 "발현 표지"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 그리고 그 발현이 지표, 예를 들면, 예측, 진단, 및/또는 예후인 바이오마커의 하나 또는 조합을 지칭한다. 바이오마커 표지는, 분자적, 병리학적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의하여 특성화된, 질환 또는 장애 (예컨대, 암)의 특정 하위유형의 표지자로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커 표지는 "유전자 표지"이다. 용어 "유전자 표지"는 "유전자 발현 표지"와 상호교환적으로 사용되고 그리고 그 발현이 지표, 예를 들면, 예측, 진단, 및/또는 예후인 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 조합을 지칭한다. 일부 구현예에서, 바이오마커 표지는 "단백질 표지"이다. 용어 "단백질 표지"는 "단백질 발현 표지"와 상호교환적으로 사용되고 그리고 그 발현이 지표, 예를 들면, 예측, 진단, 및/또는 예후인 폴리펩티드의 하나 또는 조합을 지칭한다.
개체에 증가된 임상 이득과 관련된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플에서 검출가능한 수준이다. 이들은 당해 기술의 숙련가에게 알려지고 본원에 의해 개시된 방법들에 의해 계측될 수 있다. 평가된 바이오마커의 발현 수치 또는 양은 상기 치료에 대한 반응을 확인하는 데 사용될 수 있다.
일반적으로 용어 "발현의 수치" 또는 "발현 수치"는 상호교환하여 사용가능하고, 일반적으로 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 양을 가리킨다. “발현"은 일반적으로 정보(예컨대, 유전자-암호화 및/또는 후성적)가 상기 세포에 존재하고 작동하는 구조체로 전환되는 과정을 가리킨다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드로 전사, 폴리펩티드, 또는 더욱이 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 변형으로 번역 (예를 들면, 폴리펩티드의 후번역 변형)을 지칭한다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 변형 (예컨대, 폴리펩티드의 변역 후 변형)의 단편 또한 이들이 대안적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된 전사물 또는 분해된 전사물에서 유래되든지, 또는 예컨대, 단백질 가수분해에 의한 상기 폴리펩티드의 번역후 과정에서 유래되든, 발현된 것으로 간주되어야 한다. "발현된 유전자"는 mRNA로 폴리뉴클레오티드로 전사되고 그리고 그 다음 폴리펩티드로 번역된 것 및 또한 RNA로 전사되었지만 폴리펩티드로 번역되지 않은 것 (예를 들면, 이동 및 리보솜 RNA들)을 포함한다.
“상승된 발현,” “상승된 발현 수준,” 또는 “상승된 수준”은, 질환 또는 장애 (예컨대, 암) 또는 내부 대조군 (예컨대, 하우스키핑 바이오마커)을 앓는 개체 또는 개체군과 같은 대조군과 비교하여, 개체에서의 바이오마커의 증가된 발현 또는 증가된 수준을 지칭한다.
“감소된 발현,” “감소된 발현 수준,” 또는 “감소된 수준”은, 질환 또는 장애 (예컨대, 암) 또는 내부 대조군 (예컨대, 하우스키핑 바이오마커)을 앓는 개체 또는 개체군과 같은 대조군과 비교하여, 개체에서의 바이오마커의 감소된 발현 또는 감소된 수준을 지칭한다. 일부 구현예에서, 저하된 발현은 발현이 거의 없거나 아예 없는 것이다.
용어 "하우스키핑(housekeeping) 바이오마커"는 모든 세포 유형에 전형적으로 유사하게 존재하는 바이오마커 또는 일단의 바이오마커(예컨대, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)를 가리킨다. 일부 구현예에서, 하우스키핑 바이오마커는 "하우스키핑 유전자"이다. "하우스키핑 유전자"는 본원에서 세포 작용의 유지를 위해 필수적인 활성을 갖는 단백질을 암호화하고 전형적으로 모든 세포 유형에 유사하게 존재하는 유전자 또는 일단의 유전자를 가리킨다.
본원에 사용되는 "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다수의 복사본을 생성하는 과정을 가리킨다. "다수의 복사본"은 적어도 2개의 복사본을 의미한다. "복사본"은 반드시 상기 템플레이트 서열에 대한 완전한 서열 보완성 또는 동일성을 의미하지 않는다. 예를 들어, 복사본에는 뉴클레오티드 유사체 예컨대 데옥시이노신, 의도적 서열 변형(예컨대 혼성가능하나 상기 템플레이트에 보완적이지 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 유도되는 서열 변형), 및/또는 증폭 중에 발생하는 서열 오류가 포함된다.
용어 "다중-PCR"은 단일 반응에서 둘 이상의 DNA 서열을 증폭할 목적으로 설정된 둘 이상의 프라이머를 사용하여 단일 공급원(예컨대, 개체)에서 수득된 핵산에서 수행된 단일 PCR를 가리킨다.
혼성화 반응의 "엄격함(Stringency)"은 당해기술의 숙련가에 의해 손쉽게 확인될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따른 경험적 계산이다. 일반적으로, 더 킨 프로브는 적절한 어닐링(annealing)을 위해 더 높은 온도가 필요한 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 보완적 가닥이 이것의 녹는점보다 낮은 환경에 존재할 경우 변성 DNA의 재-어닐링 능력에 의존한다. 프로브와 혼성가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용될 수 있는 상대 온도가 더 높다. 결과적으로, 더 높은 상대 온도가 상기 반응의 조건을 좀 더 엄격하게 만드는 반면, 더 낮은 온도는 덜 엄격하게 만든다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가적인 상세 설명에 대해서는 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)를 참조한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 다음의 것에 의해 확인될 수 있다: (1) 세정용 낮은 이온 강도 및 고온 사용, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 나트륨 클로라이드/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트; (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들면, pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐비닐피롤리돈/50mM 나트륨 인산염 버퍼와 42 ℃에서 50 mM 나트륨 클로라이드, 75 mM 나트륨 시트레이트를 갖는 50% (v/v) 포름아미드 사용; 또는 (3) 하기를 채용하는 용액 내 밤새 혼성화: 42 ℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 6.8), 0.1% 나트륨 파이로포스페이트, 5 x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트 사용과, 42 ℃에서의 0.2 x SSC (나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트) 중 10분간 세정, 그 다음 55 ℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 10분간의 높은-엄중 세정.
"중간 정도로 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 확인될 수 있고, 그리고 상기에서 기재된 것들보다 덜 엄격한 수세 용액 및 하이브리드화 조건 (예를 들면, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도로 엄격한 조건의 예는: 20% 포름아미드, 5 x SSC (150mM NaCl, 15mM 트리소디움 시트레이트), 50mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20mg/ml 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 밤새 항온처리하고, 그 다음 약 37-50℃에서 1 x SSC에서 필터를 세척한다. 숙련가는 인자 예컨대 프로브 길이 등을 축적하기 위해 필요에 따라 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
본원에 사용되는 "중합효소 연쇄반응" 즉 "PCR" 기법은 일반적으로 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각의 소량이 하기에 기술된 바와 같이 증폭되는 절차를 지칭한다: 미국 특허 번호 4,683,195 (1987년 7월 28일 허여됨). 일반적으로, 관심대상의 영역의 말단 또는 그것을 초과하는 것에서 유래된 서열 정보가 확보가능하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있어야 한다; 이와 같은 프라이머는 증폭될 템플레이트의 반대 가닥에 대해 서열에서 동일하거나 또는 유사하다. 상기 두 개 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 재료의 말단과 동일할 수 있다. PCR이 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA 유래 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA에서 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 하기 참고: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). 본원에 사용되는 PCR는 핵산 검사 샘플을 증폭하기 위한 핵산 중합효소 반응 방법의 하나의 예(그러나 유일하지 않음)로 간주되고(여기에는 알려진 핵산(DNA 또는 RNA)을 프라이머로 사용하는 것이 포함됨), 핵산 중합효소를 활용하여 핵산의 특정 조각을 증폭 또는 생성하거나 또는 특정 핵산에 보완적인 핵산의 특정 조각을 증폭 또는 생성한다.
"정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "qRT-PCR"은 PCR 생성물의 양이 PCR 반응에서 각 단계에서 계측되는 PCR의 형태를 지칭한다. 이 기술은 하기 문헌을 포함하는 다양한 공보에 기재되었다: Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); 및 Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004).
용어 "미세유전자배열"은 기질 상에서의 혼성화 가능한 배열 요소들, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브의 순서상 배열을 가리킨다.
단수 또는 복수로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 미변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 모든 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 가리킨다. 따라서, 예를 들어, 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드에는, 비제한적으로, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥, 또는 좀 더 전형적으로, 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 하이브리드 분자가 포함된다. 뿐만 아니라, 본원에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA를 포함하거나 또는 RNA 및 DNA를 모두 포함하는 삼중-가닥 영역를 포함한다. 이와 같은 영역에서의 가닥은 동일한 분자에서 유래되거나 또는 상이한 분자에서 유래된 것일 수 있다. 상기 영역에는 상기 분자들 중 하나 이상의 모두가 포함될 수 있으나, 좀 더 전형적으로 상기 분자들의 일부의 한 영역만이 수반된다. 삼중-나선 영역의 분자들 중 하나는 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"에는 구체적으로 cDNA가 포함된다. 상기 용어에는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA(cDNA 포함)와 RNA가 포함된다. 따라서, 안정성을 위해 또는 그 밖의 다른 이유 때문에 변형된 기틀을 갖는 DNA 또는 RNA는, 본 용어가 본원에 의도된 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 게다가 이례적인 염기들, 예컨대 이노신 또는 변형된 염기, 예컨대 삼중(tritiated) 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 용어 "폴리뉴클레오티드"에 속한다. 일반적으로, 상기 용어 "폴리뉴클레오티드"는 모든 미변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태를 아우를 뿐만 아니라, 바이러스 및 세포, 예를 들면 단일 및 복합 세포의 특징인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 비제한적으로, 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일- 또는 이중-가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중- 가닥 DNA를 가리킨다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 단일-가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 화학적 방법, 상용화된 자동화 올리고뉴클레오티드 합성장치를 사용하여 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 다양한 기타 방법들, 예를 들면 체외 재조합 DNA-매개 기법에 의해, 그리고 세포와 유기체 내에서의 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.
용어 “진단”은, 본원에서 분자적 또는 병리학적 상태, 질환 또는 병태 (예컨대, 암)의 식별 또는 분류를 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, “진단”은 암의 특정 유형의 식별을 지칭할 수 있다. “진단”은, 또한, 예를 들어 조직병리학적 기준에 의한, 또는 분자적 특징 (예컨대, 일 바이오마커 또는 이의 조합의 발현에 의해 특성화된 하위유형 (예컨대, 상기 유전자에 의하여 암호화된 특정 유전자 또는 단백질))에 의한 암의 특정 하위유형의 분류를 지칭할 수 있다.
용어 "진단 보조"는 질환 또는 장애 (예를 들면, 암)의 증상 또는 병태의 특정한 유형의 존재, 또는 성질에 관하여 임상 계측에 보조하는 방법을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 질환 또는 병태 (예를 들면, 암)의 진단 보조 방법은 개체로부터 생물학적 샘플에서 특정 바이오마커 평가를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “샘플,”은 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특성을 기준으로 특성 분석되고/되거나 식별되어야만 하는 세포 및/또는 다른 분자 실체를 함유하는 목적하는 대상체 및/또는 개체로부터 수득되거나 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 이의 변화는 특성화되는 세포성 및/또는 분자 독립체를 함유하기 위해 공지된 또는 예상될 해당 대상체로부터 수득된 임의의 샘플을 지칭한다. 샘플은 하기를, 비제한적으로, 포함한다: 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체 유체, 림프액, 활막 유체, 여포성 유체, 정액, 양수, 밀크, 전체의 혈액, 혈액-유도된 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물 예컨대 균질화된 조직, 종양 조직, 세포성 추출물, 및 이들의 조합.
"조직 샘플" 또는 "세포 샘플"은 대상체 또는 개체의 조직으로부터 수득된 유사한 세포의 수집을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선, 냉동 및/또는 보존 장기, 조직 샘플, 생검 또는 흡입액에서 유래된 것과 같은 고체 조직; 혈액 또는 모든 혈액 구성성분 예컨대 혈장; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 세포간질액; 개체의 임신 또는 발달 중 어느 시점에서 유래된 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 원발성 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 질환 조직/장기로부터 수득된다. 상기 조직 샘플은 자연적으로 상기 조직과 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충용액, 고정액, 영양분, 항생제 등을 함유할 수 있다.
“참조 샘플,” “참조 세포,” “참조 조직,” “대조군 샘플,” “대조군 세포,” 또는 “대조군 조직”은, 본원에 사용된 바와 같이, 비교 목적으로 사용되는 샘플, 세포, 조직, 표준, 또는 수준을 지칭한다. 일 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은, 동일한 대상체 또는 개체의 신체(예를 들어, 조직 또는 세포)의 건강하고/하거나 비-질환 부분으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 질환 세포 또는 조직에 인접한 건강한 및/또는 비-질환 세포 또는 조직 (예를 들면, 종양에 인접한 세포 또는 조직). 또 다른 양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 개체의 신체의 비처리된 조직 및/또는 세포로부터 수득된다. 또한 또 다른 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은, 상기 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 신체(예를 들어, 조직 또는 세포)의 건강하고/하거나 비-질환 부분으로부터 수득될 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은, 상기 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 신체의 비처리된 조직 및/또는 세포로부터 수득될 수 있다.
본원에서의 목적을 위해, 조직 샘플의 “분획”은 조직 샘플의 단일부 또는 조각, 예를 들어, 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 하기가 이해된다: 조직 샘플의 다중 절편이 수행 및 분석될 수 있으며, 단, 하기가 이해된다: 조직 샘플의 상동한 절편은 형태학적 수준 및 분자 수준 둘 모두에서 분석될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 둘 모두에 대해 분석될 수 있다.
"상관관계가 있다" 또는 "상관관계가 있는"은 모든 방식으로 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 두 번째 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 두 번째 프로토콜을 수행할 때 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용하거나 및/또는 두 번째 분석 또는 프로토콜이 수행되어야 하는지 여부를 계측하기 위해 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 폴리펩티드 분석 또는 프로토콜의 구현예와 관련하여, 특정 치료 요법이 수행되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 폴리펩티드 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분석 또는 프로토콜의 구현예와 관련하여, 특정 치료 요법이 수행되어야 하는지 여부를 계측하기 위해 폴리뉴클레오티드 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다.
본원에 사용되는 단어 "표지"는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 상기 표지은 전형적으로 시약, 예컨대 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합 또는 융합되어, 이것이 접합 또는 융합되는 상기 시약의 검출을 용이하게 한다. 상기 표지은 그 자체로 검출가능하거나(예컨대 , 방사선 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우, 검출가능한 생성물을 초래하는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
약제로의 치료에 환자의 "효과적인 반응" 또는 환자의 "반응성" 및 유사한 문구는 질환 또는 장애 예컨대 암 발병 위험이 있거나 또는 암을 앓는 환자에게 주어진 임상적 또는 치료적 이점을 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 이점에는 하기 중 하나 이상이 포함된다: 연장된 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함); 객관적 반응의 유발 (완전한 반응 또는 부분적 반응 포함); 또는 암의 징후 또는 증상의 개선.
치료에 "유효한 반응을 가지지 않는" 환자는 (전체 생존율 및 무진행 생존을 포함하는) 생존을 연장하는 것; (완벽한 반응 또는 부분 반응을 포함하는) 객관적인 반응을 초래하는 것; 또는 암의 징후 또는 증상을 개선하는 것 중 임의의 하나를 가지지 않는 환자를 지칭한다.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들면 NK 세포, 중성구, 및 대식세포)에 존재한 Fc 수용체 (FcR) 상에서 결합된 분비된 면역글로불린이 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시킬 수 있고 그 뒤에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된, 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 상기 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). ADCC 활성 평가를 위한 예시적 검정은 본원에서 실시예에 제공된다.
"보체의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는, 그의 동족 항원에 결합되는, (적절한 하위부류의) 항체에 보체 시스템 (C1q)의 제1 구성요소의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가된 또는 감소된 C1q 결합 능력은, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재된다. 참고: 또한, 예를 들면, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
"항-OX40 항체 고갈"은 OX40-발현 세포를 사멸 또는 고갈시키는 항-OX40 항체이다. OX40 발현 세포의 고갈은 다양한 기전, 예컨대 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 및/또는 식균작용에 의해 달성될 수 있다. OX40-발현 세포의 고갈은 시험관내 분석될 수 있고, 시험관내 ADCC 및 식균작용 검정을 위한 예시적 방법은 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, OX40-발현 세포는 인간 CD4+ 효과기 T 세포이다. 일부 구현예에서, OX40-발현 세포는 인간 OX40을 발현시키는 형질전환 BT474 세포이다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 나타내며, 이것은 항체 이소형에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예를 들면, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 구현예에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 구현예에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)를 결합하고 대립유전자 변이체를 포함한 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 및 대안적으로 상기 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA (“활성화 수용체”) 및 FcγRIIB (“억제 수용체”)를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인 내에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. (참고: 예를 들면,
Figure pct00002
, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR은 하기에 검토된다: 예를 들어, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)). 향후 확인될 것들을 포함하는 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포괄된다. 용어 “ Fc 수용체” 또는 "FcR"에는 또한 신생아 수용체, FcRn이 포함되며, 이는 하기에 관여한다: 친계 IgG의 태아로의 전달 (Guyer et al., J. Immunol. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성 조절. FcRn로의 결합을 계측하는 방법이 공지된다 (예를 들어, 참고: Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.). 생체내 인간 FcRn로의 결합 및 인간 FcRn 고-친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기가 하기에서 검정될 수 있다: 예컨대, 인간 FcRn를 발현하는 형질전환 마우스 또는 형질감염 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에서. WO 2000/42072 (Presta)는 FcR로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 항체 변이체를 기술한다. 참고: 또한, 예를 들면, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적 “효과기 작용”은 하기를 포함한다: C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예컨대 B 세포 수용체; BCR), 등. 상기 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인 (예를 들면, 항체 가변 도메인)과 조합되는 Fc 영역을 필요로 하고, 예를 들어, 본원에서의 정의에 개시된 바와 같이 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구를 지칭한다. 특정 구현예에서, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵구(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함된다. 효과기 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들면, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"인간 효과기 세포를 갖는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 샘플에 존재하는 인간 효과기 세포 (예를 들면, 침윤하는 인간 효과기 세포)를 갖는 것이다.
"FcR-발현 세포를 갖는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 샘플에서 존재하는 FcR-발현 (예를 들면, 침윤하는 FcR-발현 세포)를 갖는 것이다. 일부 구현예에서, FcR 은 FcγR이다. 일부 구현예에서, FcR 은 활성화 FcγR이다.
II.PD-1 축 결합 길항제
유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에 투여하는 것을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이 본 명세서에서 제공된다. 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.
예를 들어, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PDL1 결합 길항제, 및 PDL2 결합 길항제를 포함한다. "PD-1"에 대한 대안적인 명칭은 CD279 및 SLEB2를 포함한다. "PDL1"에 대한 대안적인 명칭은 하기를 포함한다: B7-H1, B7-4, CD274, 및 B7-H. "PDL2"에 대한 대안적인 명칭은 하기를 포함한다: B7-DC, Btdc, 및 CD273. 일부 구현예에서, PD-1, PDL1, 및 PDL2 는 인간 PD-1, PDL1 및 PDL2 이다.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 이의 리간드 결합 상대로의 PD-1 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 상대는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 이의 결합 상대로의 PDL1 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 상대는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 이의 결합 상대로의 PDL2 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 상대는 PD-1 이다. 길항제는 하기일 수 있다: 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역콘주게이트, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예컨대, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106 (니볼루맙, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, 펨브롤리주맙, KEYTRUDA), CT-011 (피딜리주맙), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108, 및 BGB-A317로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는, 면역접합체 (예컨대, 불변 영역 (예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합부를 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로도 공지된, 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로도 공지된, 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. CT-011 (또한 hBAT, hBAT-1 또는 피딜리주맙으로 공지됨)은 WO2009/101611에 기술된 항-PD-1 항체이다. AMP-224 (또한 B7-DCIg 로 공지됨)은 WO2010/027827 및 WO2011/066342 에 기술된 PDL2 Fc 융합 가용성 수용체이다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 하기이다: 니볼루맙 (CAS 등록 번호: 946414-94-4). 또 추가의 구현예에서, 서열 번호: 10으로부터 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 11로부터 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 제공된다. 또한 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은, 상기 중쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWY DGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열 번호:10), 또는
(b) 경쇄 서열은, 상기 경쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 11).
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 하기이다: 펨브로리주맙 (CAS 등록 번호: 1374853-91-4). 또 추가의 구현예에서, 서열 번호: 12으로부터 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 13로부터 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 제공된다. 또한 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은, 상기 중쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고:
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRDYRFDMGFDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK (서열 번호: 12), 또는
(b) 경쇄 서열은, 상기 경쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고:
EIVLTQSPAT LSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRL LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC (서열 번호: 13).
일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 항-PDL1 항체이다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: YW243.55.S70, MPDL3280A (아테졸리주맙), MDX-1105, MEDI4736 (두르발루맙), 및 MSB0010718C (아벨루맙). MDX-1105 (또한 BMS-936559로 공지됨)은 WO2007/005874 에 기술된 항-PDL1 항체이다. 항체 YW243.55.S70 (서열 번호. 20 및 21, 각각에서 보여진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)은 WO 2010/077634 A1에 기재된 항-PDL1이다. MEDI4736은 하기에 기술된 항-PDL1 항체이다: WO2011/066389 및 US2013/034559.
본 발명의 방법에 유용한 항-PDL1 항체 및 이를 제조하기 위한 방법의 예시는 하기에 기술된다: PCT 특허 출원 WO 2010/077634 A1 및 미국 특허 번호 8,217,149 (이의 각각의 전체내용이 본 출원에 참조로서 편입됨).
일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 항-PDL1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 PDL1 및 PD-1 사이의 및/또는 PDL1 및 B7-1 사이의 결합을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 인간 항체이다.
상기 항체, 예컨대 WO 2010/077634 A1에 기술된 것들과 같은 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 본 발명에서 유용한 항-PDL1 항체는 암 치료를 위하여 OX40 결합 효능제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PDL1 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일 구현예에서, 상기 항-PDL1 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 함유하고, 여기서:
(a)HVR-H1 서열은 하기이다: GFTFSX1SWIH (서열 번호: 14);
(b)HVR-H2 서열은 하기이다: AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (서열 번호: 15);
(c)HVR-H3 서열은 하기이다: RHWPGGFDY (서열 번호: 3);
추가로, 상기 식 중에서, X1 은 D 또는 G이며; X2 는 S 또는 L이며; X3 은 T 또는 S이다.
일 특정 양태에서, X1 은 D이며; X2 는 S이며, 그리고 X3 은 T이다. 또 다른 측면에서, 상기 폴리펩티드는 다음 구조식에 따른 HVR들 사이에 나란히 놓인 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). 또 다른 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 추가 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 추가의 측면에서, 상기 프레임워크 서열 중 적어도 1종은 하기와 같다:
HC-FR1 은 하기임: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2 은 하기임: WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3 은 하기임: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4 은 하기임: WGQGTLVTVSA(서열 번호: 19).
또 추가의 측면에서, 중쇄 폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하는 가변 영역 경쇄와 추가로 조합되고, 여기서:
(a) HVR-L1 서열은 하기이다: RASQX4X5X6TX7X8A(서열 번호: 20);
(b) HVR-L2 서열은 하기이다: SASX9LX10S, (서열 번호: 21);
(c) HVR-L3 서열은 하기이다: QQX11X12X13X14PX15T (서열 번호: 22);
추가로, 상기 식 중에서, X4 는 D 또는 V이며; X5 는 V 또는 I이며; X6 은 S 또는 N이며; X7 은 A 또는 F이며; X8 은 V 또는 L이며; X9 는 F 또는 T이며; X10 은 Y 또는 A이며; X11 은 Y, G, F, 또는 S이며; X12 는 L, Y, F 또는 W이며; X13 은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이며; X14 는 H, V, P, T 또는 I이며; X15 는 A, W, R, P 또는 T이다.
또 다른 추가의 양태에서, X4 는 D이며; X5 는 V이며; X6 은 S이며; X7 은 A이며; X8 은 V이며; X9 는 F이며; X10 은 Y이며; X11 은 Y이며; X12 는 L이며; X13 은 Y이며; X14 는 H이며; X15 는 A이다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄는 하기 화학식에 따라 HVR들 사이에 병치된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열을 포함한다. (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 추가의 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 추가의 측면에서, 상기 프레임워크 서열 중 적어도 1종은 하기와 같다:
LC-FR1 은 하기임: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호:23)
LC-FR2 은 하기임: WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3 은 하기임: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4 은 하기임: FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
또 다른 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서:
(a) 상기 중쇄는 그리고 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3를 포함하고, 여기서 더욱이:
(i)HVR-H1 서열은 하기이다: GFTFSX1SWIH (서열 번호: 14);
(ii)HVR-H2 서열은 하기이다: AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (서열 번호: 15);
(iii)HVR-H3 서열은 하기이다: RHWPGGFDY (서열 번호: 3); 그리고
(b) 상기 경쇄는 그리고 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3를 포함하고, 여기서 더욱이:
(i) HVR-L1 서열은 하기이다: RASQX4X5X6TX7X8A(서열 번호: 20);
(ii) HVR-L2 서열은 하기이다: SASX9LX10S, (서열 번호: 21); 그리고
(iii) HVR-L3 서열은 하기이다: QQX11X12X13X14PX15T (서열 번호: 22);
추가로, 상기 식 중에서, X1 은 D 또는 G이며; X2 는 S 또는 L이며; X3 은 T 또는 S이며; X4 는 D 또는 V이며; X5 는 V 또는 I이며; X6 은 S 또는 N이며; X7 은 A 또는 F이며; X8 은 V 또는 L이며; X9 는 F 또는 T이며; X10 은 Y 또는 A이며; X11 은 Y, G, F, 또는 S이며; X12 는 L, Y, F 또는 W이며; X13 은 Y, N, A, T, G, F 또는 I이며; X14 는 H, V, P, T 또는 I이며; X15 는 A, W, R, P 또는 T이다.
특정 양태에서, X1 은 D이며; X2 는 S이고 X3 은 T이다. 또 다른 양태에서, X4 는 D이며; X5 는 V이며; X6 은 S이며; X7 은 A이며; X8 은 V이며; X9 는 F이며; X10 은 Y이며; X11 은 Y이며; X12 는 L이며; X13 은 Y이며; X14 는 H이며; X15 는 A이다. 또 다른 양태에서, X1 은 D이며; X2 는 S이고 X3 은 T이며, X4 는 D이며; X5 는 V이며; X6 은 S이며; X7 은 A이며; X8 은 V이며; X9 는 F이며; X10 은 Y이며; X11 은 Y이며; X12 는 L이며; X13 은 Y이며; X14 는 H이고 X15 는 A이다.
추가 양태에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),그리고 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 추가의 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카밧 하위그룹 I, II, 또는 III 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4WGQGTLVTVSA(서열 번호: 19).
또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카밧 카파 I, II, III, 또는 IV 하위그룹 서열로부터 유도된다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 23)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
추가의 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 또다른 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 항체는 감소되거나 최소의 효과기 작용을 갖는다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 최소의 효과기 작용은 "효과기-미만(effector-less) Fc 변형" 또는 탈글리코실화로부터 초래된다. 또 다른 추가 구현예에서, 효과기-없는 Fc 돌연변이는 불변 영역에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
추가의 또 다른 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PDL1 항체가 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄는 GFTFSDSWIH (서열 번호: 1), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호: 2) 및 RHWPGGFDY (서열 번호: 3), 각각에 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하고/하거나,
(b) 경쇄는 RASQDVSTAVA (서열 번호: 4), SASFLYS (서열 번호: 5) 및 QQYLYHPAT (서열 번호: 6), 각각에 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 추가로 포함하고/하거나,
특정 양태에서, 서열 상동성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),그리고 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카밧 하위그룹 I, II, 또는 III 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4WGQGTLVTVSA(서열 번호: 19).
또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카밧 카파 I, II, III, 또는 IV 하위그룹 서열로부터 유도된다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 23)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
추가의 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 또다른 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 항체는 감소되거나 최소의 효과기 작용을 갖는다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 최소의 효과기 작용은 "효과기-미만(effector-less) Fc 변형" 또는 탈글리코실화로부터 초래된다. 또 다른 추가 구현예에서, 효과기-없는 Fc 돌연변이는 불변 영역에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또한 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWIS PYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (서열 번호: 28), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호: 9).
특정 양태에서, 서열 상동성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),그리고 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 추가 양태에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카밧 하위그룹 I, II, 또는 III 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4WGQGTLVTVSA(서열 번호: 19).
또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카밧 카파 I, II, III, 또는 IV 하위그룹 서열로부터 유도된다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 23)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
추가의 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 또다른 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 항체는 감소되거나 최소의 효과기 작용을 갖는다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 최소의 효과기 작용은 진핵세포 생산으로부터 초래된다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 최소의 효과기 작용은 "효과기-미만(effector-less) Fc 변형" 또는 탈글리코실화로부터 초래된다. 또 다른 추가 구현예에서, 효과기-없는 Fc 돌연변이는 불변 영역에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 7), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호: 9).
또한 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호: 8), 또는
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호: 9).
특정 양태에서, 서열 상동성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),그리고 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 추가 양태에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카밧 하위그룹 I, II, 또는 III 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4WGQGTLVTVSS(서열 번호: 27).
또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카밧 카파 I, II, III, 또는 IV 하위그룹 서열로부터 유도된다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 23)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
추가의 특정 양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다. 또다른 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 항체는 감소되거나 최소의 효과기 작용을 갖는다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 최소의 효과기 작용은 진핵세포 생산으로부터 초래된다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 최소의 효과기 작용은 "효과기-미만(effector-less) Fc 변형" 또는 탈글리코실화로부터 초래된다. 또 다른 추가 구현예에서, 효과기-없는 Fc 돌연변이는 불변 영역에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 추가 구현예에서, 항-PDL1 항체는 하기이다: MPDL3280A (CAS 등록 번호: 1422185-06-5). 또 다른 추가 구현예에서, 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 제공된다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:7) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호:9)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. 또한 추가의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-PDL1 항체가 본원에서 제공되고, 여기서:
(a) 중쇄 서열은, 상기 중쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열 번호: 29), 및/또는
(b) 경쇄 서열은, 상기 경쇄 서열에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 30).
또 다른 추가 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 담체와 조합된, 상기 기술된 항-PDL1 항체 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 추가 구현예에서, 항-PDL1 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서:
(a) 중쇄는 GFTFSDSWIH (서열 번호: 1), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호: 2) 및 RHWPGGFDY (서열 번호: 3), 각각에 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 추가로 포함하고, 그리고
(b) 경쇄는 RASQDVSTAVA (서열 번호: 4), SASFLYS (서열 번호: 5) 및 QQYLYHPAT (서열 번호: 6), 각각에 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 서열 상동성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 측면에서, 중쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),그리고 경쇄 가변 영역은 다음과 같이 HVR들 사이에 나란히 놓인 1종 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). 또 다른 측면에서, 상기 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유도된다. 추가 양태에서, 중쇄 프레임워크 서열은 카밧 하위그룹 I, II, 또는 III 서열로부터 유도된다. 또 추가의 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열은 VH 하위그룹 III 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 16)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(서열 번호: 17)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 18)
HC-FR4WGQGTLVTVSA(서열 번호: 19).
또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 카밧 카파 I, II, III, 또는 IV 하위그룹 서열로부터 유도된다. 또 다른 추가 양태에서, 경쇄 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 또 다른 추가 양태에서, 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열은 하기이다:
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 23)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 24)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 25)
LC-FR4FGQGTKVEIKR(서열 번호: 26).
또 추가의 특정 측면에서, 본 명세서에서 기재된 항체 (예컨대 항-PD-1 항체, 항-PDL1 항체, 또는 항-PDL2 항체)는 추가로 인간 또는 뮤린 불변 영역을 포함한다. 또다른 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 양태에서, 뮤린 불변 영역은 IgG2A이다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 항체는 감소되거나 최소의 효과기 작용을 갖는다. 또 다른 추가의 특정 양태에서, 최소의 효과기 작용은 진핵세포 생산으로부터 초래된다. 또 다른 추가의 특이적 양태에서, 최소의 효과기 작용은 "효과기-미만(effector-less) Fc 변형" 또는 탈글리코실화로부터 초래된다. 더욱 추가 측면에서, 효과기-없는 Fc 돌연변이는 불변 영역에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 추가의 양태에서, 본원에 기술된 항체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 추가로 하기를 포함한다: 이전에 기술된 항-PDL1, 항-PD-1, 또는 항-PDL2 항체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산의 발현에 적절한 벡터. 또 다른 추가 특정 양태에서, 벡터는 핵산의 발현에 적절한 숙주 세포를 추가로 포함한다. 또 다른 추가 특정 양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포이다. 또 다른 추가 특정 양태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들면, 하기 단계를 포함하는 공정에 의하여 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다: 상기 항체 또는 단편을 생산하기에 적절한 조건 하에서 발현에 적절한 형태의, 이전에 기술된 항-PDL1, 항-PD-1, 또는 항-PDL2 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 단편을 회수하는 단계.
일부 구현예에서, 단리된 항-PDL1 항체는 탈글리코실화된다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. “N-연결됨”은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합하는 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드내 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로스의 부착을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다. 항체에 글리코실화 부위 형태의 제거는, 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성되고 이로써 (N-연결 글리코실화 부위에 대한) 상기-기재된 트리펩티드 서열 중 하나가 제거된다. 글리코실화 부위 내에 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기 또 다른 아미노산 잔기 (예를 들면, 글리신, 알라닌 또는 보존적 치환)의 치환에 의한 변경이 있을 수 있다.
본원에서의 구현예 중 임의의 것에서, 상기 단리된 항-PDL1 항체는 인간 PDL1, 하기에 나타난 바와 같은 인간 PDL1 또는 이의 변이체에 결합할 수 있다: UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 Q9NZQ7.1.
또 추가의 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 항-PDL1, 항-PD-1, 또는 항-PDL2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 대해 제공한다. 일부 구현예에서, 개체에 투여된 항-PDL1, 항-PD-1, 또는 항-PDL2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이다. 본 명세서에 기재된 또는 당해 기술에 공지된 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항-PDL1 항체는 약 60mg/mL의 양으로 상기 항체, 약 20mM의 농도로 히스티딘 아세테이트, 약 120mM의 농도로 수크로오스 및 0.04% (w/v)의 농도로 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제형으로 되고, 그리고 상기 제형은 약 5.8의 pH를 가진다.　 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항-PDL1 항체는 약 125mg/mL의 양으로 상기 항체, 약 20mM의 농도로 히스티딘 아세테이트, 약 240mM의 농도로 수크로오스 및 0.02% (w/v)의 농도로 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제형으로 되고, 그리고 상기 제형은 약 5.5의 pH를 가진다.
III. OX40 결합 효능제
유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에 투여하는 것을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이 본 명세서에서 제공된다. 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.
OX40 결합 효능제는, 예를 들면, OX40 효능제 항체 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체), OX40L 효능제 단편, OX40 올리고머성 수용체, 및 OX40 면역접합체를 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 OX40 효능제 항체로 치료 전에 증식 및/또는 사이토카인 생산에 비교하여 CD4+ 효과기 T 세포 증식을 증가하고 및/또는 CD4+ 효과기 T 세포에 의해 사이토카인 생산을 증가한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN- γ이다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 기억 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나, 기억 세포에 의한 사이토카인 생산을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN- γ이다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 효과기 T 세포 작용의 Treg 억제를 억제한다. 일부 구현예에서, 효과기 T 세포 작용은 효과기 T 세포 증식 및/또는 사이토카인 생산이다. 일부 구현예에서, 효과기 T 세포는 CD4+ 효과기 T 세포이다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 OX40을 발현하는 표적 세포에서 OX40 신호 형질도입을 증가시킨다. 일부 구현예에서, OX40 신호 형질도입은 NFkB 다운스트림 신호전달의 모니터링에 의해 검출된다.
일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 (예를 들면, 인간 OX40을 발현하는 세포를 고갈시키는) 고갈(depleting) 항-인간 OX40 항체이다. 일부 구현예에서, 인간 OX40 발현 세포는 CD4+ 효과기 T 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 OX40 발현 세포는 Treg 세포이다. 일부 구현예에서, 고갈은 ADCC 및/또는 식균작용이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 효과기 세포에 의해 발현된 FcγR의 결합 및 인간 효과기 세포 기능의 활성화에 의해 ADCC를 매개한다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 효과기 세포에 의해 발현된 FcγR의 결합 및 인간 효과기 세포 기능의 활성화에 의해 식균작용을 매개한다. 예시적 인간 효과기 세포는, 예를 들면, 대식세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 중성구를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 효과기 세포는 대식세포이다.
일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 기능성 Fc 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 ADCC이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 식균작용이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 ADCC 및 식균작용이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4이다.
일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 MEDI6383이 아니다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, OX40 효능제 항체)는 MEDI0562가 아니다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: 미국 특허 번호 7,550,140 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYTMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRYSQVHYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 31) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄: DIVMTQSPDSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKAGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYNHPTTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 32). 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기재된 바와 같이 항체 008의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기술된 항체 008의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: 미국 특허 번호 7,550,140. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열: DIQMTQSPDSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKAGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYNHPTTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 33). 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기재된 바와 같이 항체 SC02008의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기술된 항체 SC02008의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: 미국 특허 번호 7,550,140. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDNVMGLYWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 34) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 35). 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기재된 바와 같이 항체 023의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,550,140에 기술된 항체 023의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: 미국 특허 번호 7,960,515 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 36) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (서열 번호: 37). 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,960,515에 기재된 바와 같이 항체 11D4의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,960,515에 기술된 항체 11D4의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: 미국 특허 번호 7,960,515. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 38) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (서열 번호: 39). 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,960,515에 기재된 바와 같이 항체 18D8의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 번호 7,960,515에 기술된 항체 18D8의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2012/027328 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호: 40) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (서열 번호: 41). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2012/027328에 기재된 바와 같이 항체 hu106-222의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2012/027328에 기술된 항체 hu106-222의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2012/027328. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGTMVTVSS (서열 번호: 42) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (서열 번호: 43). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2012/027328에 기재된 바와 같이 항체 Hu119-122의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2012/027328에 기술된 항체 Hu119-122의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2013/028231 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄: MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVNGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTWGEVFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYITCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 44) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄: MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKSSQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 45). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVNGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTWGEVFYFDYWGQGTTLTVSS (서열 번호: 61) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKSSQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLTFGAGTKLELK (서열 번호: 62). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/028231에 기재된 바와 같이 항체 Mab CH 119-43-1의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/028231에 기술된 항체 Mab CH 119-43-1의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2013/038191 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTSVTVSS (서열 번호: 46) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKR (서열 번호: 47). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/038191에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/038191에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2013/038191. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFKDYTMHWVKQSHGKSLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDKATLTVDKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGAGTTVTVSP (서열 번호: 48) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIVMTQSHKFMSTSLGDRVSITCKASQDVGAAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGGGSGTDFTLTISNVQSEDLTDYFCQQYINYPLTFGGGTKLEIKR (서열 번호: 49). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/038191에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2013/038191에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 50) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 51). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 50) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 52). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 53) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 51). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 53) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 52). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 54) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 51). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 54) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR (서열 번호: 52). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 20E5의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 20E5의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 55) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 56). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 55) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 57). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 58) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 56). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 58) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 57). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 59) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 56). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 하기에 기술된 항-인간 OX40 효능제 항체이다: WO 2014/148895A1. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 하기를 포함한다: 하기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS (서열 번호: 59) 및/또는 하기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR (서열 번호: 57). 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기재된 바와 같이 항체 클론 12H3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 WO 2014/148895A1에 기술된 항체 클론 12H3의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효능제 항-인간 OX40 항체는 L106 BD이다 (Pharmingen 제품 # 340420). 일부 구현예에서, 항체는 항체 L106 (BD Pharmingen 제품 # 340420)의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 L106 (BD Pharmingen 제품 # 340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 효능제 항-인간 OX40 항체는 ACT35이다 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 # 20073). 일부 구현예에서, 항체는 항체 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 # 20073)의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 # 20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469이다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 MEDI6469의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 MEDI0562이다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 MEDI0562의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 초가변성 영역 (HVR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 MEDI0562의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 상기 제시된 임의의 하나의 OX40 효능제 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 효능제 항체이다.
일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 기능성 Fc 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4이다. 일부 구현예에서, 항-인간 OX40 효능제 항체는 효과기 작용을 증가시키도록 가공된다 (예컨대, 야생형 IgG1 내 효과기 작용과 비교하여). 일부 구현예에서, 항체는 Fcγ 수용체에 증가된 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 부족하다. 예를 들면, 이러한 항체 중의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 이등분한 올리고당을 포함하고, 예를 들면, 여기에서 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 일부 구현예에서, 항체는 ADCC를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다 (잔기의 EU 넘버링).
본원에서 기재된 방법에 유용한 OX40 효능제는 항체에 제한된 의도는 결코 아니다. 비-항체 OX40 효능제는 본 분야에 잘 알려져 있고 고려된다.
상기 기재된 바와 같이, (또한 CD134L로서 공지된) OX40L는 OX40에 대한 리간드로서 작용한다. 이와 같이, OX40L의 일부 또는 전부를 나타내는 효능제는 OX40 효능제로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. OX40L의 세포외 도메인의 예는 OX40-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는 OX40L의 가용성 형태일 수 있지만 단백질의 다른, 불용성 도메인, 예를 들면, 막통과 도메인이 부족하다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 OX40L를 결합시킬 수 있는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 단백질이다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는, 예를 들면, 그의 유효성, 반감기, 또는 다른 원하는 특징을 증가시키기 위해 또 다른 단백질 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 면역글로불린 Fc 도메인에 연결된 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, OX40 효능제는 미국 특허 번호 7,696,175에 기재된 OX40 효능제의 임의의 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, OX40 효능제는 올리고머성 또는 다량체 분자일 수 있다. 예를 들어, OX40 효능제는 단백질을 올리고머화시키는 하나 이상의 도메인 (예를 들면, 류신 지퍼 도메인)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 하나 이상의 류신 지퍼 도메인에 연결된 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, OX40 효능제는 유럽 특허 번호 EP0672141 B1에 기재된 OX40 효능제의 임의의 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, OX40 효능제는 삼량체 OX40L 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, OX40 효능제는 (제한 없이 이소류신 지퍼 도메인을 포함한) 면역글로불린 Fc 도메인 및 삼량체화 도메인에 연결된 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, OX40 효능제는 국제 공보 번호 WO2006/121810에 기재된 OX40 효능제, 예컨대 OX40 면역접합체 중 임의의 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 면역접합체는 삼량체 OX40-Fc 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 효능제는 MEDI6383이다.
IV.항체 조제
본원에 기술된 항체는 항체 생성을 위한 당해 기술에서 이용가능한 기술을 이용하여 제조되고, 이의 예시적 방법은 하기 섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
본 항체는 관심 있는 항원 (즉, PD-L1 (예컨대 인간 PD-L1), OX40 (예컨대 인간 OX40))에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 장애를 앓는 포유동물에 항체의 투여는 그 포유동물에서 치료적 이점을 유발할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤　1μM, ≤　150 nM, ≤　100 nM, ≤　50 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예컨대 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
일 양태에서, Kd는 하기의 검정에 의해 기재된 바와 같은 목적하는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원과 함께 수행된 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 계측된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 일련의 적정된 비표지된 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체 코팅된 플레이트로 포획함에 의해 계측된다 (예를 들어, 참고: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정용 조건을 수립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml로 밤새 코팅되고, 그리고 그 뒤에 2 내지 5 시간동안 실온 (대략 23℃)에서 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 해당 Fab의 연속 희석액과 혼합된다. 그 다음 해당 Fab는 밤새 항온처리되지만; 그러나, 항온처리는 평형이 달성됨을 확인하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들면, 약 65 시간)동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 (예를 들면, 1 시간 동안) 항온처리를 위해 포착 플레이트로 이동된다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시키는 경우, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20 TM; Packard)를 첨가하고 플레이트는 10분 동안 TOPCOUNT TM 감마 카운터 (Packard) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 구현예에 따라서, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정은 ~10 반응 유니트 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행된다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 이의 공급업체의 설명서에 따라 N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (0.2 μΜ) 까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트 (RU)를 달성한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 계측을 위해, 2배 연속 희석된 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 μl/min의 유속으로 25°C 에서 PBS 중에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)와 함께 사용한다. 결합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델 (BIACORE ® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 참고: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS 내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 계측하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 계측될 수 있다.
(i) 항원 제조
다른 분자에 선택적으로 콘주게이트된, 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체 생성용 면역원으로서 사용될 수 있다. 막투과성 분자, 예컨대 수용체에 대하여, 이들의 단편 (예를 들면 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막투과성 분자를 발현한 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 천연 공급원 (예를 들면 암 세포주)으로부터 유도될 수 있거나 또는 막투과성 분자를 발현시키기 위해 재조합 기술로 형질전환되는 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당해 기술의 숙련가에 명백할 것이다.
(ii) 특정 항체-기반 방법
다클론성 항체는 관련된 항원 및 보조제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게는 상승된다. 면역화되기 위해 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 열쇠구멍 삿갓조개헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이중작용성을 갖는 대두 트립신 억제제 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 콘주게이션), N-하이드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다)에 관련된 항원을 콘쥬게이션하는 것이 유용할 수 있다.
동물은, 예를 들면, (래빗 또는 마우스, 각각용) 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 콘주게이트를 3 용적의 프로인트 완전 보조제와 조합 및 다중 부위에서 진피내로 용액 주사에 의해 항원, 면역원성 콘주게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1 개월 후 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제에서 펩티드 또는 콘주게이트의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 7 내지 14 일 후 동물은 채혈되고 혈청은 항체 역가에 대하여 분석된다. 동물은 역가 안정기까지 부스팅된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 콘주게이트로 부스팅되지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 콘주게이션된다. 콘주게이트는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 응집화 제제 예컨대 명반은 면역 반응을 증진시키기 위해 적합하게 사용된다.
본 발명의 단클론성 항체는 하기에 의하여 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), (그리고 추가로 하기에 기술됨: 예를 들어, Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마에 관한 것임). 추가의 방법은 예를 들어 다음의 문헌에 기재된 것들을 포함한다: 미국 특허 번호 7,189,826 (혼성세포 세포주 유래의 단클론성 인간 천연 IgM 항체에 관한 것임). 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 다음 문헌에 기재되어 있다: Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
다양한 기타 하이브리도마 기술에 대하여, 하기를 참고한다: 예를 들어, US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 7,078,492 및 7,153,507. 하이브리도마 방법을 사용하여 단클론성 항체를 생산하기 위한 예시적인 프로토콜은 아래와 같이 기재된다. 일 구현예에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터가 면역화되어 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편, 및 아쥬반트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로오스 디크리노미콜레이트 (TDM)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물 내에서 상승된다 (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들면, 항원) 또는 이의 단편은 당해 기술에서 잘 알려진 방법, 예컨대 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 이들의 일부는 본 명세서에서 추가로 기재된다. 면역화된 동물로부터의 혈청은 항-항원 항체에 대해 분석되고 그리고 부스터 면역화가 선택적으로 투여된다. 항-항원 항체를 생성하는 동물로부터 림프구가 단리된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.
림프구는 그런 다음 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합 제제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정한 고 수준의 항체 발현을 지지하고, 그리고 예컨대 HAT 배지와 같은 배지에 민감성인, 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포는, 비제한적으로, 뮤린 골수종 라인, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 솔크 연구소 세포 분배 센터로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 메릴랜드주 록빌 소재의 미국 종균 협회로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유도된 것들을 포함한다. USA. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종성골수종 세포주가 또한, 인간 단클론성 항체의 생산에 대해 하기와 같이 기술되었다: Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들면, 비융합된, 친계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 배지에 씨딩되고 성장된다. 예를 들어, 만약 친계 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)가 부재하다면, 혼성세포를 위한 배양 배지는 전형적으로 하기를 포함할 것이다: HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인, 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지). 바람직하게는, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같이, 동물-유도된 혈청 예컨대 우태 혈청의 사용을 줄이기 위해 무혈청 하이브리도마 세포 배양 방법이 사용된다: Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).
하이브리도마 세포 배양물의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩티드는 문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에 기재되어 있다. 특이적으로, 표준 배양 배지는 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린), 또는 단백질 가수분해물 분획이 풍부하고 그리고 세포자멸사는 셋 내지 여섯 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해 유의미하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 그보다 높은 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본 발명의 항체에 결합하는 단클론성 항체의 생산에 대해 분석되어 질 수 있다. 혼성세포에 의하여 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성은 하기에 의하여 계측될 수 있다: 면역 침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA). 단클론성 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 스캐차드 분석에 의해 계측될 수 있다. 참고: 예를 들면, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 절차를 제한함에 의해 아클론되고 그리고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 예를 들면, 하기를 참고한다: Goding, 상기. 이러한 목적을 위해 적합한 배양 배지는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의하여 분비된 단클론성 항체는 기존 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 단백질 A-세포라제(Sepharose), 하이드록실아퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질의 단리를 위한 하나의 절차는 US 2005/176122 및 미국 특허 번호 6,919,436에 기재되어 있다. 이 방법은 결합 과정에서 리오트로픽 염과 같은 최소 염을 사용하는 것 및 바람직하게는 또한 용출 공정에서 소량의 유기 용매를 사용하는 것을 포함한다.
(iii) 라이브러리-유도된 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리를 생산하고 목적하는 결합 특징 예컨대 실시예 3에 기술된 방법을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 각종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어, 하기에 검토되며: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 추가로 하기에 검토된다: 예를 들어, the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
일부 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). 파아지는 전형적으로 단일쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 단순 레퍼토리는 (예를 들면, 인간 유래) 클로닝되어 하기에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다: Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고 고도의 가변성 CDR3 영역을 암호하고 시험관내 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있고, 이는 다음 문헌에 기재된 바와 같다: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음의 문헌을 포함한다: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 또는 항체 절편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 절편으로 간주된다.
(iv) 키메라, 인간화, 및 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들면 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 일 예시에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 래빗, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 몽키로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 서브부류가 모 항체의 부류로부터 변화된 “부류 스위칭된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되어 있고 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR, (또는 그 일부)가 비인간 항체로부터 유도되고, FR (또는 그 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도되는 하나 또는 그 초과 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 양태에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복구하거나 개선시키기 위해 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 기원의 상응하는 잔기들로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, 하기에 고찰되고: Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)에서 검토되었고, 추가로 예컨대, 하기에 기재된다: Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (하기를 기술: SDR (a-CDR) 그래프팅); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재함).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: “베스트-피트” 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, 참고: Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
인간 항체 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 다음 문헌에 기재되어 있다: van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)).
인간 항체는 항원 시험(antigenic challenge)에 응답하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 제조하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌 모두 또는 일부를 함유한다. 상기 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 하기를 참조한다: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)). 참고: 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 VelociMouse® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900). 이와 같은 동물에 의해 생성된 무손상 항체의 인간 가변 영역은, 예컨대 상이한 인간 불변영역과 조합함으로써, 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다. (참고: 예를 들어, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 제조된 인간 항체가 또한 다음 문헌에 기재되어 있다: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 다음 문헌에 기재되어 있다: Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
인간 항체는 또한 인간 유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인서열을 단리시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적 수단, 예컨대 효소 소화로, 또는 재조합 기술로 생성될 수 있다. 특정 상황에서 전체의 항체보다는 항체 단편의 이점이 있다. 단편의 더 작은 크기는 급속 청소능을 허용하고, 고형 종양에 개선된 접근을 유발할 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 다음을 참고한다: Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다 (참고: 예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 이제 생산될 수 있다. Fab, Fv, 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 분비될 수 있으며, 이로써 이들의 단편들의 많은 양의 용이한 생산을 가능케한다. 항체 단편은 상기 고찰된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 항체 파지 라이브러리에서 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균에서 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab)2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 단리될 수 있다. 재이용 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,869,046. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 참고 WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 수득하기 위해 작제될 수 있다. 참고: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기. 항체 단편은 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,641,870에서, 예를 들어 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖고, 여기에서 에피토프는 보통 상이한 항원 출신이다. 상기 분자가 정상적으로 2개의 상이한 에피토프 (즉 이중특이적 항체, BsAbs)를 단지 결합하는 반면, 추가의 특이성을 갖는 항체 예컨대 삼중특이적 항체는 본원에서 사용될 때 상기 발현에 의해 포함된다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 절편 (예컨대, F(ab’)2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 일 측면에서, OX40 및 PD-1에 결합하는 이중특이적 항체가 제공된다. 일 측면에서, OX40 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체가 제공된다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 공동 발현에 근거하며, 여기서 두 사슬은 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 집합으로 인하여, 이러한 하이브리도마 (4혼성체(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의하여 수행되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시된다: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
이중특이적 항체 제조를 위한 당해 기술에 공지된 하나의 접근법은 "크놉-인투-홀" 또는 "돌출부-인투-공동" 접근법이다 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 상기 접근법에서, 2개의 면역글로불린 폴리펩티드 (예를 들면, 중쇄 폴리펩티드) 각각은 계면을 포함한다. 하나의 면역글로불린 폴리펩티드의 계면은 다른 면역글로불린 폴리펩티드 상에서 상응하는 계면와 상호작용하고, 그렇게 함으로써 2개 면역글로불린 폴리펩티드를 결합시킨다. 이들 계면은 하나의 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "크놉" 또는 "돌출부" (이들 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)가 다른 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "홀" 또는 "공동" (이들 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다)과 상응하도록 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 홀은 크놉와 동일한 또는 유사한 크기이고, 2개의 계면가 상호작용하는 경우, 하나의 계면의 크놉가 다른 계면의 상응하는 홀에 위치할 수 있는 정도로 적합하게 배치된다. 이론에 제한되도록 바램 없이, 이종다량체를 안정화시키고 다른 종, 예를 들어 동종다량체보다 이종다량체의 형성을 선호한다고 생각된다. 일부 구현예에서, 상기 접근법은, 상이한 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한 이중특이적 항체를 창출하는, 2개의 상이한 면역글로불린 폴리펩티드의 이종다량체화를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 크놉은 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 대체함으로써 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 홀은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 작제될 수 있다. 크놉 또는 홀은 최초 계면에 존재할 수 있거나, 또는 이들은 합성으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 크놉 또는 홀은 적어도 하나의 "최초" 아미노산 잔기를 적어도 하나의 "도입" 아미노산 잔기로 대체하기 위해 계면을 암호화한 핵산 서열을 변경함으로써 합성으로 도입될 수 있다. 핵산 서열의 변경 방법은 당해 기술에서 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술을 포함할 수 있다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적은 하기 표에 나타난다. 일부 구현예에서, 최초 잔기는 작은 측쇄 용적 (예를 들면, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린)을 갖고, 노브 형성용 도입 잔기는 천연 발생 아미노산이고 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최초 잔기는 큰 측쇄 용적 (예를 들면, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판)을 가질 수 있고, 홀 형성용 도입 잔기는 천연 발생 아미노산이고 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린을 포함할 수 있다.
아미노산 잔기의 특성
아미노산 1글자 축약 질량a
(달톤)		 용적b
(Å3)		 접근가능한 표면적c (Å2)
알라닌 (Ala) A 71.08 88.6 115
아르기닌 (Arg) R 156.20 173.4 225
아스파라긴 (Asn) N 114.11 117.7 160
아스파르트산 (Asp) D 115.09 111.1 150
시스테인 (Cys) C 103.14 108.5 135
글루타민 (Gln) Q 128.14 143.9 180
글루탐산 (Glu) E 129.12 138.4 190
글리신 (Gly) G 57.06 60.1 75
히스티딘 (His) H 137.15 153.2 195
이소류신 (Ile) I 113.17 166.7 175
류신 (Leu) L 113.17 166.7 170
라이신 (Lys) K 128.18 168.6 200
메티오닌 (Met) M 131.21 162.9 185
페닐알라닌 (Phe) F 147.18 189.9 210
프롤린 (Pro) P 97.12 122.7 145
세린 (Ser) S 87.08 89.0 115
트레오닌 (Thr) T 101.11 116.1 140
트립토판 (Trp) W 186.21 227.8 255
티로신 (Tyr) Y 163.18 193.6 230
발린 (Val) V 99.14 140.0 155
a아미노산 분자량 - 물 분자량 값은 하기에서 유래됨: Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.
b값은 하기에서 유래됨: A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972.
c값은 하기에서 유래됨: C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. 접근가능한 표면적은 이 참조문헌의 도 6 내지 20에서 정의된다.
일부 구현예에서, 크놉 또는 홀 형성용 최초 잔기는 이종다량체의 3-차원 구조에 기반하여 확인된다. 3-차원 구조를 수득하기 위하여 당해 기술에 공지된 기술은 X-선 계측학 및 NMR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 계면은 면역글로불린 불변 도메인의 CH3 도메인이다. 이들 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3/CH3 인터페이스는 4 항-평행한 β-가닥에 위치한 각 도메인 상에 16 잔기를 포함한다. 이론에 제한되도록 바램 없이, 돌연변이된 잔기는 2개의 중심 항-평행한 β-가닥에 바람직하게는 위치하여 크놉가 파트너 CH3 도메인에서 보상성 홀 보다는 주위의 용매에 의해 수용될 수 있는 위험을 최소화시킨다. 일부 구현예에서, 2개의 면역글로불린 폴리펩티드에서 상응하는 크놉 및 홀을 형성한 돌연변이는 하기 표에서 제공된 하나 이상의 쌍에 상응한다.
상응하는 크놉-및 홀-형성 돌연변이의 예시적 세트
제1 면역글로불린의 CH3 제2 면역글로불린의 CH3
T366Y Y407T
T366W Y407A
F405A T394W
Y407T T366Y
T366Y:F405A T394W:Y407T
T366W:F405W T394S: Y407A
F405W: Y407A T366W:T394S
F405W T394S
돌연변이는 최초 잔기, 그 다음 카밧 넘버링 시스템을 이용한 위치, 및 그 다음 도입 잔기에 의해 표시된다 (모든 잔기는 단일-문자 아미노산 코드로 주어진다). 다중 돌연변이는 결장(colon)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 폴리펩티드는 상기 표 2에서 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 표 2의 왼쪽 컬럼에서 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제1 면역글로불린 폴리펩티드, 및 표 2의 오른쪽 컬럼에서 열거된 하나 이상의 상응하는 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제2 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
상기에서 논의된 바와 같이 DNA의 돌연변이 이후, 하나 이상의 상응하는 크놉- 또는 홀-형성 돌연변이를 갖는 변형된 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드는 당해 기술에서 공지된 표준 재조합 기술 및 세포 시스템을 이용하여 발현 및 정제될 수 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 7,642,228; 7,695,936; 8,216,805; 미국 공보 No. 2013/0089553; 및 Spiess et al., Nature Biotechnology 31: 753-758, 2013. 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 원핵 숙주세포, 예컨대 이. 콜라이, 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포를 사용하여 생산될 수 있다. 상응하는 크놉- 및 홀-보유 면역글로불린 폴리펩티드는 공-배양물내 숙주 세포에서 발현될 수 있고 헤테로다량체로서 함께 정제될 수 있거나, 또는 이들은 단일 배양물에서 발현, 별도로 정제, 및 시험관내 조립될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아성 숙주 세포의 2개 균주 (하나는 크놉을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현하고, 다른 것은 홀을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현한다)는 당해 기술에서 공지된 표준 박테리아성 배양 기술을 이용하여 공-배양된다. 일부 구현예에서, 2개 균주는, 예를 들면, 배양물에서 동등한 발현 수준을 달성하기 위해 특이적 비로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 균주는 50:50, 60:40, 또는 70:30 비로 혼합될 수 있다. 폴리펩티드 발현 이후, 세포는 함께 용해될 수 있고, 단백질은 추출될 수 있다. 호모-다량체 대 헤테로-다량체 종의 존재도 계측을 허용하는 당해 기술에서 공지된 표준 기술은 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 표준 재조합 기술을 이용하여 별도로 발현되고, 이들은 시험관내 함께 조립될 수 있다. 조립은, 예를 들어, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩티드의 정제, 이들을 함께 동등한 질량으로 혼합 및 인큐베이팅, 디설파이드 환원 (예를 들면, 디티오트레이톨로 처리), 농축, 및 폴리펩티드의 재산화에 의해 달성될 수 있다. 형성된 이중특이적 항체는 양이온-교환 크로마토그래피를 포함한 표준 기술을 이용하여 정제될 수 있고 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 표준 기술을 이용하여 계측될 수 있다. 이들 방법의 더욱 상세한 설명에 대하여, 다음을 참고한다: Speiss et al., Nat Biotechnol 31:753-8, 2013. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 CHO 세포에서 분리하여 발현될 수 있고 그리고 상기 기재된 방법을 사용하여 시험관내에서 조립될 수 있다.
상이한 접근에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 융합은 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 융합의 적어도1종에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원할 시 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공-형질감염된다. 이것은 작제물에서 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 분율 조정에서 큰 가요성을 제공한다. 그러나, 균등 비에서 적어도 2 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 초래하는 경우 또는 비가 특정한 유의성이 없는 경우 한 발현 벡터에서 2 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 암호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성체 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암 내의 혼성체 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다. 이러한 접근은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
WO96/27011에 기술된 또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 조작될 수 있다. 일 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예로, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예로, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "내강"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 그러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하는데 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료에 대하여 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089). 이종콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합 제제 및 기술은 당해기술에서 잘 알려지고, 그리고 미국 특허 번호 4,676,980에 기재된다 (다수의 가교결합 기술과 함께).
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 하기 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 온전한 항체가 F(ab’)2 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 기술한다. 이러한 단편은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 복합화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab’ 단편은 이후 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab’-TNB 유도체 중 하나는 이후 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의하여 Fab’-티올로 재전환되고, 기타 Fab’-TNB 유도체의 등몰량으로 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근 발전은 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 하였고, 이는 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab’)2 분자의 생산을 기술한다. 각 Fab’ 단편은 이. 콜라이로부터 개별 분비되고, 시험관내에서 화학적으로 커플링 지시되어 이중특이적 항체를 형성하였다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의한 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법이 또한 항체 동종이량체의 생산을 위하여 이용될 수 있다. “디아바디” 기술은 하기에 의하여 기술되며: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인 간 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL) 과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 페어링하도록 유도되어 두 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의한, 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 기타 전략이 또한 보고되었다. 참고: Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).
2 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) 단일-도메인 항체
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-부위 항체는 인간 단일-부위 항체(Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 참고: 예컨대, 미국 특허 번호 6,248,516 B1). 하나의 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부로 이루어진다.
(viii) 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 항체의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 증진시키는 것이 바람직한 일일 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적절할 변화를 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 작제물은 목적하는 특징, 예컨대, 항원-결합을 가져야 한다. 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시간에서 대상체 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 목적하는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목하에 표 1에서 보여준다. 보다 실질적 변화는 "예시적 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 추가로 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 목적하는 활성, 예컨대, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 선별된 제품 및 관심 항체에 도입될 수 있다.
예시적인 치환
본래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상의 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
소수성 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
산성: Asp, Glu;
염기성: His, Lys, Arg;
쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 다른 부류로 교체함을 수반할 것이다.
치환형 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 초과 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로 추가의 연구를 위해 선택된 수득한 변이체(들)은 모 항체와 비교하여 특정 생물학적 성질 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나 상기 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 보유한다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 파아지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 통상적으로 생성될 수 있다. 간단히, 하나 또는 그 초과 HVR 잔기는 돌연변이되고 파아지에서 변이체 항체 표시되고 특정한 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)을 위해 스크리닝된다.
변형(예컨대, 치환)은 HVR에서, 예컨대, 항체 친화도를 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟," 즉, 체세포 성숙 공정 동안 높은 빈도로 돌연변이하는 코돈에 의해 암호화된 잔기 (참고, 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 SDR (a-CDR)에 의해 실시될 수 있고, 수득한 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) 친화도 성숙화의 일부 구현예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 발생 경향 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙화를 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이후 2차 라이브러리가 형성된다. 이후 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예컨대, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 특히, 예컨대, 알라닌 주사 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링을 사용하여 식별할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변형은 HVR “핫스팟” 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR는 변형되지 않거나, 또는 하나 이상, 두 개 또는 세 개의 아미노산 치환을 함유하지 않는다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 동정을 위해 유용한 방법은다음 문헌에 기재된 바와 같이 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 불리운다: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. 이 방법에서는, 표적 잔기들(예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 그룹을 동정하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 계측한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기가 치환을 위한 후보물질로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1 잔기 내지 100 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예컨대, ADEPT에 대한)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
(x) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있어서 하나 또는 그 초과 글리코실화 부위는 제조 또는 제거된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 원상태 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결부에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 바이안테너리 올리고당을 포함한다. 예를 들면, 참고: Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2분지형 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 실시될 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 항체 변이체가 제공되고 여기서 상기 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 감소된 푸코스를 가지거나 또는 푸코스를 결하여, ADCC 기능을 개선할 수 있다. 특이적으로, 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체에서 푸코스의 양에 비하여 감소된 푸소스를 가지는 항체가 본 명세서에서 고려된다. 즉, 이들은 이들이 그렇지 않으면 만일 생산된다면 원상태 CHO 세포 (예를 들면, 원상태 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포와 같이, 원상태 글리코실화 패턴을 생산하는 CHO 세포)에 의해 가지는 것보다 적은 양의 푸코스를 가지는 것으로 특성규명된다. 특정 구현예에서, 항체는 그 위에 N-연결된 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만이 푸코스를 포함하는 것이다. 예를 들면, 이러한 항체 중의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 그 위에 N-연결된 글리칸의 어느 것도 푸코스를 포함하지 않는 것, 즉, 상기 항체는 완전히 푸코스가 없거나, 또는 푸코스를 가지지 않거나 또는 탈푸고실화된 것이다. 푸코오스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광계에 의하여 계측 시, Asn 297에 부착된 모든 당구조(glycostructure) (예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 총합과 비교하여, Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코오스의 평균 양을 산출함으로써 계측될 수 있다. Asn297은 Fc 영역에서의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 배치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은, 항체내 작은 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 또한 배치될 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변종은 ADCC 작용을 증진시킬 가능성이 있다. 예를 들면, 미국 특허 공보 제US 2003/0157108호(Presta, L.); US 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. “탈푸코실화된” 또는 “푸코스-결핍” 항체 변이체와 관련된 공보의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참고: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107).
항체 변이체는 이등분한 올리고당으로 추가 제공되고, 예를 들면, 여기에서 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지형 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 상기 항체 변이체는 푸코실화를 감소시킬 수 있고/있거나 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는, 예를 들면, 하기에 기재된다: WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.), 및 Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006). Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 CDC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S..); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재된다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 FcRγIII에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 인간 효과기 세포의 존재에서 ADCC 활성을 가지거나 또는 인간 야생형 IgG1Fc 영역을 포함하는 그렇지 않은 동일한 항체에 비교될 때 인간 효과기 세포의 존재에서 증가된 ADCC 활성을 가진다.
(xi) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 1종 이상의 아미노산 변형은 본 명세서에서 제공된 항체의 Fc 영역 안으로 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 1종 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들면 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 생체내 항체의 반감기가 여전히 어떤 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 중요한 적용에 대해 바람직한 후보자에 불필요한 또는 유해하게 하는, 모든 효과기 기능은 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 경감/고갈을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족하지만 (따라서 유사하게 ADCC 활성 부족), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 Fc(RIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포상의 Fc 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에 기재된다: 미국 특허 번호 5,500,362 (참고, 예를 들면 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참고: Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). 대안적으로, 하기와 같은 비-방사능활성 검정 방법이 사용될 수 있다: 예를 들어, 유동 세포계측을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 그와 같은 분석을 위해 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al. Proc . Nat’l Acad. Sci . USA 95:652-656 (1998). C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없음에 따라서 CDC 활성이 부재임을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 참고: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참고: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 또한 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참고: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 2 또는 그 초과의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcRs로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 하기 참고: 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환(잔기들의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예시적 구현예에서, 이의 Fc 영역에서 하기 아미노산 치환을 포함한 항체: S298A, E333A, 및 K334A.
일부 구현예에서, 변경은 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역 내에서 제조된다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
증가된 반감기 및 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용하는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.))에 기재되어 있다.　 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 또는 그 초과 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 하기 참고: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.
(xii) 항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 기술에 공지되어 있고 및 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에톡시화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 만일 1 초과 폴리머가 부착되면, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은, 만일 항체 유도체가 한정된 조건하에서의 요법 등에서 사용된다면, 비제한적으로, 개선되는 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.
(xiii) 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
항체는 재조합 방법을 이용하여 또한 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 단리되고 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 종래의 절차를 사용하여 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 또는 그 초과를 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 초과의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열.
(a) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와 함께 융합 폴리펩티드로서 재조합으로 생산될 수 있으며, 상기 이종 펩티드는 바람직하게 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (예를 들면, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인지하고 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 그룹으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비의 경우, 원상태 신호 서열은, 예를 들면, 효모 인버타제 리더, 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더(viral secretory leaders), 예를 들면, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
(b) 복제 기점
모든 발현 및 클로닝 벡터는 벡터를 하나 이상의 선택된 숙주 세포를 복제하게 할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 백터를 숙주 염색체 DNA와 별개로 복제하게 할 수 있는 것이고, 복제의 기원 또는 자율적으로 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분 그램-음성 박테리아, 2μ에 대해 적합하고, 플라스미드 기원은 효모에 대해 적합하고 그리고 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 구성요소는 포유동물 발현 벡터에 요구되지 않는다 (SV40 기원은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다.
(c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자, 또한 일명 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는, (b) 영양요구성 결핍을 보완하는, 또는 (c) 복합체 배지, 예를 들면, 바실러스용 유전자 암호화 D-알라닌 라세마제로부터 이용불가능한 결정적 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 반응식의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 억제하기 위해 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 변형된 상기 세포는 약물 내성을 부여한 단백질을 생산하고 따라서 선택 레지멘을 견뎌낸다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 대한 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 항체-암호화 핵산, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈탄산효소, 등을 취할 능력이 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것들이다.
예를 들어, DHFR 유전자로 전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함에 의해 확인된다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자는 임의의 다른 함께-전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-9096)가 사용될 수 있다.
대안적으로, GS 유전자로 전환된 세포는 GS의 억제제인 L-메티오닌 설폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함에 의해 확인된다. 이들 조건 하에서, GS 유전자는 임의의 다른 함께-전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선택/증폭 시스템은 상기에 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 함께 사용될 수 있다.
대안적으로, 관심 있는 항체, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 다른 선별 마커 예컨대 아미노글리코시드 3'-인산전달효소 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 전환된 또는 함께-전환된 숙주세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 호스트)가 선별 마커 예컨대 아미노글리코시드 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 참고: 미국 특허 번호 4,965,199.
효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결하는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 효모 숙주세포 게놈에 trp1 병변의 존재는 그런 다음 트립토판의 부재에서 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 유효한 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍된 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6μm 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유도된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용된다. 대안적으로, 재조합 소 카이모신의 대규모 생산을 위한 발현계가 하기에 보고된다: K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 멀티-카피 발현 벡터가 또한 개시되었다. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 기술적으로 인식된 및 항체를 암호화한 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵생물 숙주와 함께 사용되기에 적절한 프로모터는, PhoA 프로모터, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터, 및 혼성체 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아성 프로모터가 적합하다. 박테리아성 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 암호화한 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되었다. 사실상 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 시작으로부터 70 내지 80 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주로 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포프룩토키나제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재된다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 또한 사용된다.
포유동물 숙주세포 내 벡터로부터 항체 전사는, 그러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립할 수 있다면, 예를 들면, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제약 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII E 제약 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서의 소 파필로마 바이러스를 사용한 포유동물 숙주 내 DNA를 발현하기 위한 시스템이 하기에 개시된다: 미국 특허 번호 4,419,446. 이러한 시스템에 대한 변형이 하기에 기술된다: 미국 특허 번호 4,601,978. 또한 참고: Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) (단순 포진 바이러스 유래의 티미딘 키나아제 프로모터의 제어 하에서의 마우스 세포 내 인간 β-인터페론 cDNA의 발현 상에서의). 대안적으로, 루 육종 바이러스 장 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.
(e) 인핸서 성분 구성요소
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린)로부터 공지되어 져 있다. 전형적으로, 그러나, 진핵생물 세포 바이러스로부터 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기원 (bp 100-270)의 후기 쪽 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵생물 프로모터의 활성화를 증진시키는 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 암호화 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 그러나 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
(f) 전사 종결 성분
진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다중세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종료 및 mRNA를 안정화하는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 가끔 3'의 미번역된 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역된 부분에 폴리아데닐레이트화된 단편으로 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 일 유용한 전사 종료 구성요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 거기에 개시된 발현 벡터 참고.
(g) 숙주 세포의 선택 및 변형
본 명세서에서 벡터에 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주세포는 상기에 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적을 위하여 적합한 원핵생물은 진정박테리아, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애 예컨대 에스케리치아, 예를 들면, 이. 콜라이, 엔테로박터, 어위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르체칸스, 및 시겔라, 뿐만 아니라 바실러스 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예를 들면, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 예컨대 P. 에어루기노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 일 바람직한 이.콜라이 클로닝 숙주는 이.콜라이 294 (ATCC 31,446)이며, 한편 기타 균주 예컨대 이.콜라이 B, 이.콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이.콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이러한 예시는 제한적이기 보다 예시적이다.
특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요없는 경우, 예컨대 치료적 항체가 종양 세포 파괴에서 그 자체로 유효성을 보이는 세포독성 약물 (예를 들면, 독소)에 콘주게이트된 경우, 전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 박테리아에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환에서 더 큰 반감기를 갖는다. 이. 콜라이에서 생산은 더 빠르고 더욱 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et. al.), 미국 특허 번호 5,789,199 (Joly et al.), 미국 특허 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하는 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.). 또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (이. 콜라이 내 항체 단편의 발현을 기술). 콜리 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 예를 들면, 이소형에 의존한 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체의 정제 방법과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물 예컨대 사상균 또는 효모가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아 에(Saccharomyces cerevisiae ), 또는 보통의 빵 효모(baker's yeast)가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 수많은 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe ); 클루이베로마이 세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 케이 . 락티스 (K. lactis ), 케이 . 프라질리 스(K. fragilis ) (ATCC 12,424), 케이 . 불가리커스(K. bulgaricus ) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii ) (ATCC 24,178), 케이 . 왈티이 (K. waltii ) (ATCC 56,500), 케이 . 드로소피라룸(K. drosophilarum ) (ATCC 36,906), 케이 . 테르모토레 란스(K. thermotolerans ), 및 케이 . 막시아누스 (K. marxianus ); 야로위 아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리초데르마 레에시아 ( Trichoderma reesia ) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa ); 스와니오마이세스 ( Schwanniomyces ) 예컨대 스와 니오마이세스 오시덴탈리스 ( Schwanniomyces occidentalis ); 및 섬사상 진균, 예컨대, 예를 들어 Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, 및 Aspergillus 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans ) 및 에이. 니게르(A. niger)와 같은 수많은 다른 속, 종, 및 균주가 본 명세서에서 통상적으로 이용가능하고 그리고 유용하다. 치료 단백질의 생산을 위한 효모 및 사상균의 사용을 논의하는 검토를 위해, 예를 들면, 하기를 참고한다: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)).
글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래하는 어떤 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 참고: 예를 들면, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (피치아 패스토리스에서 글리코실화 경로의 인간화를 기재함); 및 상기 Gerngross et al.을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 ( Spodoptera frugiperda ) (유충), 아에데스 아에집티 ( Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 ( Aedes albopictus ) (모기), 드로소필라 멜 라노가스테르(Drosophila melanogaster ) (초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 유래의 상응 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카 ( Autographa californica ) NPV의 L-1 변종 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공공연하게 이용가능하며, 그와 같은 바이러스는, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위한 본 발명에 따르는 바이러스로서 본원에 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 좀개구리밥(duckweed) (Leninaceae), 알팔파 (M. truncatula) 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체 생산용 PLANTIBODIESTM 기술 기재).
척추동물 세포가 숙주로서 사용될 수 있고, 배양 (조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, 293개 세포 또는 현탁 배양물 내 성장을 위하여 하위-클로닝된 293개 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2). 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하고, 이는 DHFR- CHO 세포 (참고: Urlaub et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, 하기를 참조한다: Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 변형되고, 프로모터를 유도하거나, 변형체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는데 적절한 것으로서 변형된 기존 영양 배지 내에서 배양된다.
(h) 숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지 예컨대 Ham's F10 (시그마), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형된 이글 배지 ((DMEM), 시그마)가 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 임의의 배지가 하기에 기술되며: Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985는 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 배지 중 임의의 것은 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항체 (예컨대 GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 상응하는 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수적인 보충물을 또한 당해기술의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 포함할 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 숙련가에게 분명할 것이다.
(xiv) 항체의 정제
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위 공간에서 생산되거나 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 특정한 파편은, 예를 들면, 원심분리 또는 초미세여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 이. 콜라이의 원형질막 주위 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 기재한다. 간략히, 세포 페효모를 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 그와 같은 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 우선 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초미세여과 유닛을 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 전술된 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 친화성 리간드로서 단백질 A 의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존적이다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 매우 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함한 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전법이 또한 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
일반적으로, 상기-기재된 방법론과 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당해기술의 숙련가에 의해 적절한 것으로 간주되는, 연구, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 다양한 방법론은 당해기술에 잘-확립되어 있다.
C.생물학적 활성 항체의 선택
상기에서 기재된 바와 같이 생산된 항체는 치료적 관점으로부터 유익한 특성을 갖는 항체를 선택하거나 또는 항체의 생물학적 활성을 보유하는 제형 및 조건을 선택하기 위해 하나 이상의 "생물학적 활성" 검정에 적용될 수 있다. 항체는 그것이 상승되어 지는 항원에 결합하는 그것의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 당해 분야에서 공지된 방법 (예컨대 ELISA, 웨스턴 블랏, 등)이 사용될 수 있다.
예를 들어, 항-PDL1 항체에 대해, 항체의 항원 결합 특성은 PDL1에 결합하는 능력을 검출하는 검정에서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 결합은 예를 들면 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 검정 (예를 들면 RIA's)에 의해 계측될 수 있다. 또한 상기 항체는 예컨대, 치료로서 효과성을 평가하기 위해 기타 생물학적 활성 분석을 받을 수 있다. 이와 같은 분석은 당해기술에 알려져 있고 표적 항원 및 상기 항체에 대한 의도된 사용에 의존한다. 예를 들어, 항체에 의한 PD-L1 봉쇄의 생물학적 효과는, 예를 들면 US 특허 8,217,149에 기재된 바와 같이 CD8+T 세포, 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV) 마우스 모델 및/또는 동계의 종양 모델에서 평가될 수 있다.
관심 있는 항원에 대한 특정한 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들면, PD-L1에 대한 실예의 항-PDL1 항체의 결합을 차단하는 것)를 스크린하기 위해, 예컨대 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 일상적인 교차-차단 검정이 수행될 수 있다. 대안적으로, 예를 들면 문헌 [Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑은 항체가 관심 있는 에피토프를 결합하는지 여부에 대해 결정하기 위해 수행될 수 있다.
일 양태에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-OX40 항체를 식별하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들면, 하기를 포함할 수 있다: OX40 결합 (예를 들면, 결합 인간 및/또는 시노몰구스 OX40), OX40-매개된 신호 형질도입 증가 (예를 들면, NFkB-매개된 전사 증가), 인간 OX40을 발현하는 세포 (예를 들면, T 세포) 고갈, 예컨대, 효과기 T 세포 증식 증가 및/또는 효과기 T 세포에 의한 사이토카인 생산 (예컨대, 감마 인터페론)의 증가에 의한, T 효과기 세포 작용 (예컨대, CD4+ 효과기 T 세포, CD8+ 효과기 T 세포)의 증진, 예를 들면, 기억 T 세포 증식 증가 및/또는 기억 T 세포 (예를 들면, 감마 인터페론)에 의한 시토카인 생산 증가에 의한, 기억 T 세포 기능 (예를 들면, CD4+ 기억 T 세포) 증진, (예를 들면, 효과기 T 세포 기능의 Treg 억제 감소에 의한 조절 T 세포 기능 (예를 들면, CD4+ 효과기 T 세포 기능, CD8+ 효과기 T 세포 기능) 억제. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 생물학적 활성에 대해 시험된다.
T 세포 상호자극은 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 분석될 수 있고 예시적 방법은 본원에서 개시된다. 예를 들어, T 세포 (예를 들면, 기억 또는 효과기 T 세포)는 말초 백색 혈액 세포로부터 수득될 수 있다 (예를 들면, 피콜 구배 원심단리를 이용하여 인간 전체의 혈액으로부터 단리될 수 있다). 기억 T 세포 (예를 들면, CD4+ 기억 T 세포) 또는 효과기 T 세포 (예를 들면 CD4+ Teff 세포)는 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 PBMC로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, Miltenyi CD4+ 기억 T 세포 단리 키트 또는 Miltenyi 비처리 CD4+ T 세포 단리 키트는 사용될 수 있다. 단리된 T 세포는 항원 제시 세포 (예를 들면, CD32 및 CD80을 발현시키는 조사된 L 세포)의 존재하에 배양되고, OX40 효능제 항체의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 항체의 부가로 활성화된다. T 세포 증식의 효능제 OX40 항체의 효과는 당해 기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여 계측될 수 있다. 예를 들어, CellTiter Glo 키트 (Promega)는 사용될 수 있고, 결과는 다중표지 계측장치 (Perkin Elmer) 상에서 판독한다. T 세포 기능에 관한 효능제 OX40 항체의 효과는 또한 T 세포에 의해 생산된 시토카인의 분석으로 계측될 수 있다. 일 구현예에서, CD4+ T 세포에 의한 인터페론 감마의 생산은, 예를 들면, 세포 배양 상청액에서 인터페론 감마의 계측으로 계측된다. 인터페론 감마의 계측 방법은 당해 기술에서 공지된다.
Treg 세포 기능은 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 분석될 수 있고 예시적 방법은 본원에서 개시된다. 하나의 예에서, 효과기 T 세포 증식을 억제하기 위한 Treg의 능력은 분석된다. T 세포는 당해 기술에서 공지된 방법 (예를 들면, 기억 T 세포 또는 비처리 T 세포의 단리)을 이용하여 인간 전체의 혈액으로부터 단리된다. 정제된 CD4+ 비처리 T 세포는 (예를 들면, CFSE로) 표지되고 정제된 Treg 세포는 상이한 시약으로 표지된다. 조사된 항원 제시 세포 (예를 들면, CD32 및 CD80을 발현시키는 L 세포)는 표지된 정제된 비처리 CD4+ T 세포 및 정제된 Tregs로 공-배양된다. 공-배양은 항-CD3 항체를 이용하여 활성화되고 효능제 OX40 항체의 존재 또는 부재하에 시험된다. 적합한 시간 (예를 들면, 공동배양의 6 일) 이후, CD4+ 비처리 T 세포 증식의 수준은 FACS 분석을 이용하여 감소된 표지 염색 (예를 들면, 감소된 CFSE 표지 염색)에서 염료 희석으로 추적된다.
OX40 신호전달은 당해 기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여 분석될 수 있고 예시적 방법은 본원에서 개시된다. 일 구현예에서, 리포터 유전자 (예를 들면, 베타 루시퍼라아제)에 융합된 NFkB 프로모터를 포함한 리포터 유전자 및 인간 OX40을 발현시키는 형질전환 세포는 생성된다. 세포에 OX40 효능제 항체의 부가는, 리포터 유전자에 대한 검정을 이용하여 검출되는, 증가된 NFkB 전사를 초래한다.
식균작용은, 예를 들면, 단핵구-유도된 대식세포, 또는 U937 세포 (성숙한 대식세포의 형태학 및 특징을 갖는 인간 조직구성 림프종 세포주)를 이용함으로써 분석될 수 있다. OX40 발현 세포는 항-OX40 효능제 항체의 존재 또는 부재하에 단핵구-유도된 대식세포 또는 U937 세포에 부가된다. 적합한 기간 동안 세포의 배양 이후, 식균작용의 백분율은 1) 대식세포 또는 U937 세포 및 2) OX40 발현 세포의 마커에 대하여 이중 염색하는 세포의 백분율 시험, 및 OX40 발현 세포 (예를 들면, GFP)의 마커를 보여주는 세포의 총 수로 이의 분할에 의해 계측된다. 분석은 유세포계측으로 실시될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분석은 형광성 현미경검사 분석으로 실시될 수 있다.
ADCC는, 예를 들면, 당해 기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 예시적 방법은 정의 섹션에서 기재되고 예시적 검정은 실시예에서 개시된다. 일부 구현예에서, OX40의 수준은 ADCC 검정에서 시험에 사용되는 OX40 발현 세포를 특징으로 한다. 세포는 검출가능하게 표지된 (예를 들면, PE 표지된) 항-OX40 항체로 염색될 수 있고, 그 다음 형광의 수준은 유세포계측을 이용하여 계측될 수 있고, 결과는 중앙 형광 세기 (MFI)로서 나타낼 수 있다. 또 다른 구현예에서, ADCC는 CellTiter 글로우 검정 키트로 분석될 수 있고 세포 생존력/세포독성은 화학발광으로 계측될 수 있다.
FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB에 대한 다양한 항체, 및 FcγRIIIA의 2개 동종이인자형 (F158 및 V158)의 결합 친화도는 각각의 재조합 Fcγ 수용체를 이용한 ELISA-기반 리간드-결합 검정에서 계측될 수 있다. 정제된 인간 Fcγ 수용체는 C-말단에서 Gly/6xHis/글루타티온 S-전달효소 (GST) 폴리펩티드 태그에 연결된 수용체 γ 사슬의 세포외 도메인을 함유한 융합 단백질로서 표현된다. 상기 인간 Fcγ 수용체에 대한 항체의 결합 친화도는 아래와 같이 분석된다. 낮은-친화도 수용체, 즉 FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), 및 FcγRIIIA (CD16), F-158 및 V-158의 2개 동종이인자형에 대하여, 항체는 1:3 항체:가교 F(ab')2 의 근사 몰비로 염소 항-인간 카파 사슬 (ICN Biomedical; Irvine, CA)의 F(ab')2 단편으로 가교에 의해 다량체로서 시험될 수 있다. 플레이트는 항-GST 항체 (Genentech)로 코팅되고 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단된다. ELx405™ 플레이트 세정기 (Biotek Instruments; Winooski, VT)를 이용하여 0.05% Tween-20을 함유한 포스페이트-완충된 염수 (PBS)로 세정 이후, Fcγ 수용체는 25 ng/웰로 플레이트에 부가되고 실온에서 1시간 동안 항온처리된다. 플레이트가 세정된 이후, 시험 항체의 연속 희석액은 다량체 복합체로서 부가되고 플레이트는 실온에서 2시간 동안 항온처리된다. 미결합된 항체를 제거하기 위해 플레이트 세정 이후, Fcγ 수용체에 결합된 항체는 염소 항-인간 F(ab')2의 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP)-접합된 F(ab')2 단편 (Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove, PA) 그 다음 기질, 테트라메틸벤지딘 (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)의 부가로 검출된다. 플레이트는 색상 발달을 허용하기 위해 시험된 Fcγ 수용체에 따라 5-20 분 동안 실온에서 항온처리된다. 반응은 1 M H3PO4로 종결되고 450 nm에서 흡광도는 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax®190, Molecular Devices; Sunnyvale, CA)로 계측되었다. 용량-반응 결합 곡선은 항체의 농도에 대한 항체 희석의 이중으로부터 평균 흡광도 값의 플롯팅에 의해 생성된다. Fcγ 수용체에 대한 결합으로부터 최대 반응의 50%가 검출되는 (EC50) 항체의 유효한 농도에 대한 값은 SoftMax Pro (Molecular Devices)를 이용하여 4-파라미터 방정식으로 결합 곡선 적합화 이후 계측되었다.
임의의 상기 시험관내 검정에서 사용을 위한 세포는 OX40을 자연적으로 발현시키는 또는 OX40을 발현시키기 위해 조작된 세포 또는 세포주를 포함한다. 상기 세포는 OX40을 자연적으로 발현시키는 활성화된 T 세포, Treg 세포 및 활성화된 기억 T 세포를 포함한다. 상기 세포는 또한 OX40을 발현시키는 세포주 및 OX40을 정상적으로 발현시키지 않지만 핵산 암호화 OX40으로 형질감염된 세포주를 포함한다. 임의의 상기 시험관내 검정에서 사용을 위한 본원에서 제공된 예시적 세포주는 인간 OX40을 발현시키는 형질전환 BT474 세포 (인간 유방암 세포주)를 포함한다.
임의의 검정이 항-OX40 항체 대신 또는 그 이외에 본 발명의 면역접합체를 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.
임의의 상기 검정은 항-OX40 항체 및 추가의 치료제 (예를 들면, PD-1 축 결합제 (예를 들면, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체)를 사용하여 수행될 수 있다고 이해된다.
D.약제학적 조성물 및 제형
또한 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 본 명세서에서 기재된 항체 (예컨대 항-PD-L1 항체, 또는 항-인간 OX40 효능제 항체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 본 명세서에서 제공된다.
본원에 기술된 것으로서의 약제학적 조성물 및 제형은, 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분과 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합함으로써 제조될 수 있다 (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))(동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로). 약제학적으로 허용가능한 담체는 이용된 복용량 및 농도에서 수령체에 일반적으로 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 버퍼 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적 약제학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다.　 rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재된다.　 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 부가의 글리코사미노글리카나제 (예: 콘드로이티나제)와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 버퍼를 포함한다.
본원의 조성물 및 제형은 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치는 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
활성 성분들은 예를 들어, 코나세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 나노입자 및 나노캡슐) 중에 또는 마크로에멀젼 중에 하이드록시메틸셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 중에 포집될 수 있다. 상기 기술은 하기에서 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
지속-방출 제제는 제조될 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 당해 매트릭스는 성형품, 예컨대, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 생체내 투여용으로 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
IV.치료의 방법
유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)를 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 치료는 치료의 중단 이후 개체에서 지속된 반응을 초래한다. 본원에 기술된 방법은, 암의 치료를 위하여 종양 면역원성을 증가시키는 것과 같은 증진된 면역원성이 바람직할 경우, 병태의 치료에 있어 용도를 발견할 수 있다. 또한 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 추가 측면에서, (예를 들면, 박테리아 또는 바이러스 또는 다른 병원체로) 감염을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 감염은 바이러스 및/또는 박테리아에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 감염은 병원체에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 감염은 급성 감염이다. 일부 구현예에서, 감염은 만성적 감염이다.
당해 기술에 공지된 또는 본 명세서에서 기재된 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제가 본 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 본 개체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 병용 치료 전에 OX40 결합 효능제 요법으로 치료되었다.
일부 구현예에서, 본 개체는 1종 이상의 PD-1 축 길항제에 대해 내성있는 (내성있는 것으로 입증되어 진) 암을 갖는다. 일부 구현예에서, PD-1 축 길항제에 대한 내성은 암 또는 난치성 암의 재발을 포함한다. 재발은 치료 후 최초 부위 또는 신규 부위에서 암의 재현을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 축 길항제에 대한 내성은 PD-1 축 길항제로 치료하는 동안 암의 진행을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 축 길항제에 대한 내성은 치료에 반응하지 않는 암을 포함한다. 암은 치료의 시점에서 내성일 수 있거나 또는 이것은 치료하는 동안 내성으로 될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암은 초기 단계 또는 후기 단계이다.
또 다른 측면에서, 본 개체는 PD-L1 바이오마커를 발현하는 (예를 들면, 진단 시험에서 발현하는 것으로 나타난) 암을 가진다. 일부 구현예에서, 환자의 암은 낮은 PD-L1 바이오마커를 발현한다. 일부 구현예에서, 환자의 암은 높은 PD-L1 바이오마커를 발현한다. 임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 이것이 0%의 샘플을 포함할 때 샘플로부터 존재하지 않는다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 이것이 0% 초과의 샘플을 포함할 때 샘플 내 존재한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 샘플의 적어도 1%에 존재한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 샘플의 적어도 5%에 존재한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 샘플의 적어도 10%에 존재한다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 FACS, 웨스턴 블랏, ELISA, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광, 방사선면역검정, 닷 블랏팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라즈몬 공명, 광학적 분광법, 질량 분광분석기, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스 어레이 기술, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨 방법을 사용하여 샘플에서 검출된다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 단백질 발현에 의해 샘플에서 검출된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현은 면역조직화학 (IHC)에 의해 계측된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 항-PD-L1 항체를 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 약한 염색 세기로 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 중간 염색 세기로 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 강한 염색 세기로 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 종양 세포, 종양 침윤하는 면역 세포, 기질 세포 및 그것의 임의의 조합에서 검출된다. 일부 구현예에서, 염색은 막 염색, 세포질 염색 또는 이들의 조합이다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 부재는 샘플에서 염색이 부재하거나 없는 것으로 검출된다. 임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는 샘플에서 임의의 염색으로 검출된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 병용 요법은 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 투여를 포함한다. PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제는 당해 기술에서 공지된 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제는 순차적으로 (상이한 시간에) 또는 동반하여 (동시에) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 OX40 결합 효능제와 별도의 조성물에 있다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 OX40 결합 효능제와 동일한 조성물에 있다.
PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)는 동일한 투여 경로로 또는 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제는 하기로 투여된다: 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의하여, 흡입으로, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제는 하기로 투여된다: 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의하여, 흡입으로, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로. 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제는 질환의 예방 또는 치료를 위해 투여될 수 있다. 적절한 복용량의 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)는 치료되는 질환의 유형, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 개체의 임상 조건, 치료에 대한 개체의 임상 이력 및 반응 및 주치의의 재량에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 및 PD-1 축 결합 길항제 (예를 들면, 항-PD-1 또는 항-PDL1 항체)로의 병용 치료는 상승작용을 나타내고, 이로써 조합에서 OX40 결합제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 유효한 용량은 단일 제제로서 OX40 결합제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)의 유효한 용량에 비해 감소된다.
일반적인 경우에서, 인간에게 투여된 항체의 치료적 유효량은, 1회 이상의 투여에 의해 환자 체중당 약 0.01 내지 약 50 mg/kg의 범위일 것이다. 일부 구현예에서, 사용된 항체는, 예를 들어, 매일 하기로 투여된다: 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg. 일부 구현예에서, 항체는 15 mg/kg 로 투여된다. 그러나, 다른 투약량 레지멘이 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 항-PDL1 항체는 21-일 주기의 1일에 약 100mg, 약 200mg, 약 300mg, 약 400mg, 약 500mg, 약 600mg, 약 700mg, 약 800mg, 약 900mg, 약 1000mg, 약 1100mg, 약 1200mg, 약 1300mg 또는 약 1400mg의 용량으로 인간에게 투여된다. 용량은 단회 용량 또는 다중 용량(예를 들면, 2 또는 3 개 용량)으로, 예컨대 주입(infusion)으로 투여될 수 있다. 병용 치료 중 투여된 항체의 투여는, 단일 치료와 비교하여, 감소될 수 있다. 이 치료법의 과정은 통상적인 기술에 의해 용이하게 관찰된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가의 요법을 추가로 포함할 수 있다. 본 추가의 요법은 방사선 요법, 수술 (예컨대, 종괴절제술 및 유방절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 골수 이식, 나노요법, 단클론성 항체 요법, 또는 전술한 것의 조합일 수 있다. 추가 요법은 보조 또는 선행보조(neoadjuvant) 요법의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 추가의 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 부작용 제한 제제 (예컨대, 치료 부작용의 발생 및/또는 중증도를 경감하도록 의도된 제제, 예컨대 항-어지럼증 제제 등)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 본 추가의 요법은 방사선 요법 및 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 본 추가의 요법은 감마 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 PI3K/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 세포자멸사 억제제, 및/또는 화학예방적 제제를 표적한 요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 요법은 CTLA-4 (CD152로도 공지됨), 예를 들면, 차단 항체, 이필리무맙 (MDX-010, MDX-101, 또는 Yervoy®로도 공지됨), 트레멜리무맙 (틸실리무맙 또는 CP-675,206으로도 공지됨), B7-H3 (CD276으로도 공지됨)에 대한 길항제, 예를 들면, 차단 항체, MGA271, TGF 베타에 대한 길항제, 예를 들면, 메텔리무맙 (CAT-192로도 공지됨), 프레솔리무맙 (GC1008로도 공지됨), 또는 LY2157299, 키메라성 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 T 세포의 입양 전달을 포함하는 치료 (예를 들면, 세포독성 T 세포 또는 CTL), 우세한-음성 TGF 베타 수용체, 예를 들면, 우세한-음성 TGF 베타 유형 II 수용체를 포함하는 T 세포의 입양 전달을 포함하는 치료, HERCREEM 프로토콜을 포함하는 치료 (예를 들면, ClinicalTrials.gov Identifier NCT00889954 참고), CD137에 대한 효능제 (TNFRSF9, 4-1BB, 또는 ILA로도 공지됨), 예를 들면, 활성화 항체, 우렐루맙 (BMS-663513으로도 공지됨), CD40에 대한 효능제, 예를 들면, 활성화 항체, CP-870893, OX40에 대한 효능제 (CD134로도 공지됨), 예를 들면, 활성화 항체로, 상이한 항-OX40 항체 (예를 들면, AgonOX)와 조합하여 투여되고, CD27에 대한 효능제, 예를 들면, 활성화 항체, CDX-1127, 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO), 1-메틸-D-트립토판 (1-D-MT로도 공지됨), 항체-약물 콘주게이트 (일부 구현예에서, 메르탄신 또는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)를 포함함), 항-NaPi2b 항체-MMAE 콘주게이트 (DNIB0600A 또는 RG7599로도 공지됨), 트라스투주맙 엠탄신 (T-DM1, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 또는 제네텍(Genentech)의 KADCYLA®로도 공지됨), DMUC5754A, 엔도텔린 B 수용체 (EDNBR)를 표적하는 항체-약물 콘주게이트, 예를 들면, MMAE와 접합된 EDNBR에 대한 항체, 혈관신생 억제제, VEGF에 대한 항체, 예를 들면, VEGF-A, 베바시주맙 (제네텍의 AVASTIN®으로도 공지됨), 안지오포이에틴 2 (Ang2로도 공지됨)에 대한 항체, MEDI3617, 항신생물성 제제, CSF-1R (M-CSFR 또는 CD115로도 공지됨)을 표적하는 제제, 항-CSF-1R (IMC-CS4로도 공지됨), 인터페론, 예를 들면 인터페론 알파 또는 인터페론 감마, 로페론-A, GM-CSF (재조합 인간 과립구 대식세포 집락 자극 인자, rhu GM-CSF, 사르그라모스팀, 또는 Leukine®으로도 공지됨), IL-2 (알데스류킨 또는 Proleukin®으로도 공지됨), IL-12, 항체 표적화 CD20 (일부 구현예에서, 상기 항체 표적화 CD20은 오비누투주맙 (GA101 또는 Gazyva®로도 공지됨) 또는 리툭시맙임), 항체 표적화 GITR (일부 구현예에서, 상기 항체 표적화 GITR은 TRX518임), 암 백신과 조합하여 (일부 구현예에서, 상기 암 백신은 펩티드 암 백신으로, 일부 구현예에서는 개인화된 펩티드 백신이고; 일부 구현예에서 펩티드 암 백신은 다가 장 펩티드, 다중-펩티드, 펩티드 칵테일, 하이브리드 펩티드, 또는 펩티드-펄스된 수지상 세포 백신임 (예를 들면, 문헌 [Yamada 등, Cancer Sci, 104:14-21, 2013)] 참고), 아쥬반트와 조합하여, TLR 효능제, 예를 들면, 폴리-ICLC (Hiltonol®로도 공지됨), LPS, MPL, 또는 CpG ODN, 종양 괴사 인자 (TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, HVEM 길항제, ICOS 효능제, 예를 들면, ICOS-L의 투여에 의해, 또는 ICOS에 대한 작용적 항체, 치료 표적화 CX3CL1, 치료 표적화 CXCL10, 치료 표적화 CCL5, LFA-1 또는 ICAM1 효능제, 셀렉틴 효능제, 표적 요법, B-Raf의 억제제, 베무라페닙 (Zelboraf®, 다브라페닙(Tafinlar®로도 공지됨)으로도 공지됨, 에를로티닙 (Tarceva®로도 공지됨), MEK의 억제제, 예컨대 MEK1 (MAP2K1로도 공지됨) 또는 MEK2 (MAP2K2로도 공지됨). 코비메티닙 (GDC-0973 또는 XL-518로도 공지됨), 트라메티닙 (Mekinist®로도 공지됨), K-Ras의 억제제, c-Met의 억제제, 오나투주맙 (MetMAb로도 공지됨), Alk의 억제제, AF802 (CH5424802 또는 알렉티닙으로도 공지됨), 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)의 억제제, BKM120, 이델랄리십 (GS-1101 또는 CAL-101로도 공지됨), 페리포신 (KRX-0401로도 공지됨), Akt, MK2206, GSK690693, GDC-0941, mTOR의 억제제, 시롤리무스 (라파마이신으로도 공지됨), 템시롤리무스 (CCI-779 또는 Torisel®로도 공지됨), 에버롤리무스 (RAD001로도 공지됨), 리다포롤리무스 (AP-23573, MK-8669, 또는 데포로리무스로도 공지됨), OSI-027, AZD8055, INK128, 이중 PI3K/mTOR 억제제, XL765, GDC-0980, BEZ235 (NVP-BEZ235로도 공지됨), BGT226, GSK2126458, PF-04691502, PF-05212384 (PKI-587로도 공지됨)이다. 추가의 요법은 본원에 기술된 하나 이상의 화학치료제일 수 있다.
임의의 본 명세서에서 기재된 방법 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 유효량의 조합을 투여하는 것을 포함하는 병용 치료)의 효능은 당해 기술에서 공지된 다양한 모델, 예컨대 임상 또는 전-임상 모델에서 시험될 수 있다. 적합한 전-임상 모델은 본 명세서에서 예시되고 그리고 추가로 비제한적으로 ID8 난소암, GEM 모델, B16 흑색종, RENCA 신장 세포 암, CT26 결장직장암, MC38 결장직장암, 및 클라우드만 흑색종 모델의 암을 포함할 수 있다
임의의 본 명세서에서 기재된 방법 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 유효량의 조합을 투여하는 것을 포함하는 병용 치료)의 효능은 비제한적으로 비-소세포 폐암, 췌장 관상 선암종, 또는 흑색종의 GEM 모델을 포함하여, 종양을 전개하는 GEM 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 재조합효소 치료 후 p53null 백그라운드 내 KrasG12D를 발현하는 마우스 (하기에서 기술된 바와 같음: Jackson, E.L., et al. (2001) Genes Dev . 15(24):3243-8 (KrasG12D 의 기술) 및 Lee, C.L., et al. (2012) Dis . Model Mech . 5(3):397-402 (FRT-매개된 p53null 대립유전자)는 비-소세포 폐암에 대한 전-임삼 모델로서 사용될 수 있다. 또 다른 예시로서, p16/p19null 백그라운드 내 KrasG12D를 발현하는 마우스 (하기에서 기술된 바와 같음: Jackson, E.L., et al. (2001) Genes Dev . 15(24):3243-8 (KrasG12D 의 기술) 및 Aguirre, A.J., et al. (2003) Genes Dev . 17(24):3112-26 (p16/p19null 대립유전자)는 췌장 유관 선암종 (PDAC)에 대한 전-임삼 모델로서 사용될 수 있다. 추가 예시로서, 유도성 (예컨대, 4-OHT 치료) 재조합효소 치료 후 멜라닌효소-특이적 PTENnull 백그라운드 내 BrafV600E 를 발현하는 멜라닌세포를 갖는 마우스(하기에서 기술된 바와 같음: Dankort, D., et al. (2007) Genes Dev . 21(4):379-84 (BrafV600E 의 기술) 및 Trotman, L.C., et al. (2003) PLoS Biol . 1(3):E59 (PTENnull 대립유전자)는 흑색종에 대한 전-임삼 모델로서 사용될 수 있다. 임의의 이들 예시적인 모델에 대해, 종양을 발병시킨 후, 마우스를 조합 항-PDL1 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체) 치료 또는 대조군 치료를 받는 치료 그룹으로 무작위로 동원하였다. 종양 크기 (예를 들면, 종양 부피)는 치료의 과정 동안 계측되고, 그리고 전체 생존율 또한 모니터링된다.
또 다른 측면에서, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 유효량의 조합을 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 암 (일부 구현예에서, 진단 시험을 사용하여 조사된 것으로 환자의 암의 샘플)은 T 세포 침윤의 상승된 수준을 가진다. 본원에 사용된 바와 같이, 암의 T 세포 침윤은 하기를 지칭할 수 있다: 예컨대 종양-침윤 림프구 (TIL), 내에서 또는 달리 암조직과 연관된, T 세포의 존재. T 세포 침윤은 특정 암에서 개선된 임상적 결과와 연관될 수 있다는 것이 본 분야에 공지된다 (참고: 예를 들어, Zhang et al., N. Engl. J. Med. 348(3):203-213 (2003)).
그러나, T 세포 고갈은 또한 하기를 갖는 암의 주요 면역학적 특징이다: 효과기 시토카일을 생산하는 능력이 부재하고, 높은 수준의 억제성 공-수용체를 발현하는 다수의 종양-침윤 림프구 (TIL) (Wherry, E.J. Nature immunology 12: 492-499 (2011); Rabinovich, G.A., et al., Annual review of immunology 25:267-296 (2007)). 본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 개체는 T 세포 기능이상 장애를 갖는다. 본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 T 세포 기능이상 장애는 사이토카인을 분비하고, 세포용해 활성을 급증시키거나 실행시키기 위한 T 세포 무력증 또는 감소된 능력을 특징으로 한다. 본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 T 세포 기능이상 장애는 T 세포 고갈을 특징으로 한다. 본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 이론에 의한 구속됨 없이, OX40 결합 효능제 치료는 상기 조합의 투여 전에 비하여 T 세포 (예를 들면, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포) 프라이밍, 활성화 및/또는 증식을 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포이다.
본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 암 (일부 구현예에서, 진단 시험을 사용하여 조사된 것으로 환자의 암의 샘플)은 T 세포 침윤의 낮은 수준을 가진다. 일부 구현예에서, 암 (일부 구현예에서, 환자의 암의 샘플은 진단 시험을 사용하여 조사됨)은 검출가능한 T 세포 침윤물을 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 비-면역원성 암 (예를 들면, 비-면역원성 결장직장암 및/또는 난소암)이다. 이론에 의한 구속됨 없이, OX40 결합 효능제 치료는 상기 조합의 투여 전에 비하여 T 세포 (예를 들면, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 기억 T 세포) 프라이밍, 활성화 및/또는 증식을 증가할 수 있다.
본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 개체 중 활성화된 CD4 및/또는 CD8 T 세포는 γ-IFN+ 생산 CD4 및/또는 CD8 T 세포 및/또는 상기 조합물의 투여 전과 비교하여 증진된 세포용해 활성을 특징으로 한다. γ-IFN+ 은 본 분야에 공지된 임의의 수단 (예컨대, γ-IFN에 대한 항체로의 세포 고정화, 투과화, 및 염색을 수반하는 세포내 시토카인 염색 (ICS)을 포함)에 의하여 계측될 수 있다. 세포용해 활성은 본 분야에 공지된 임의의 수단에 의하여, 예컨대, 혼합 효과기 및 표적 세포를 갖는 세포 사멸 검정을 사용하여 계측될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는, 예를 들면, CD8b 발현 (예를 들면, 예컨대 플루이다임을 사용한 rtPCR에 의해)의 존재로 특성규명된다 (Cd8b는 T-세포 표면 당단백질 CD8 베타 사슬; CD8 항원, 알파 폴리펩티드 p37로도 공지되고; 수탁 번호는 NM_172213이다). 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 종양으로부터의 것이다.
일부 구현예에서, Treg 세포, 예를 들면, Fox3p 발현 (예를 들면, 플루이다임을 사용한 예를 들면 rtPCR에 의해)의 존재로 특성규명된다 (Foxp3는 포크헤드 박스 단백질 P3; scurfin; FOXP3델타7; 면역결핍, 다발성내분비병, 장 병증, X-연결된 것으로 공지되고; 수탁 번호는 NM_014009이다). 일부 구현예에서, Treg는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Treg 세포는 종양으로부터의 것이다.
일부 구현예에서, 염증성 T 세포는 예를 들면, Tbet 및/또는 CXCR3 발현 (예를 들면, 예를 들면, 플루이다임을 사용한 rtPCR에 의해)의 존재로 특성규명된다. 일부 구현예에서, 염증성 T 세포는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 염증성 T 세포는 종양으로부터의 것이다.
본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 CD4 및/또는 CD8 T 세포는 IFN- γ, TNF-α 및 인터류킨으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 증가된 방출을 보여준다. 시토카인 방출은 본 분야에 공지된 임의의 수단에 의하여, 예컨대, 웨스턴 블랏, ELISA, 또는 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 함유하는 샘플 내에서 방출된 시토카일의 존재를 검출하는 면역조직화학 검정을 사용하여 계측될 수 있다.
본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 CD4 및/또는 CD8 T 세포는 효과기 기억 T 세포이다. 본 개시내용의 방법 중 일부 구현예에서, 상기 CD4 및/또는 CD8 효과기 기억 T 세포는 CD44고 CD62L저의 발현을 갖는 것을 특징으로 한다. CD44고 CD62L저 의 발현은 본 분야에 공지된 임의의 수단에 의하여, 예컨대, 조직 (예컨대, 암 조직)의 단일 세포 현탁제의 제조 및 CD44 및 CD62L에 대한 상업적 항체를 사용한 표면 염색 및 유동 세포계측의 수행에 의하여 검출될 수 있다. 본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, CD4 및/또는 CD8 효과기 기억 T 세포는 CXCR3 (C-X-C 케모카인 수용체 유형 3; Mig 수용체; IP10 수용체; G 단백질-커플링된 수용체 9; 인터페론-유도성 단백질 10 수용체로도 공지됨; 수탁 번호 NM_001504)의 발현을 갖는 것으로 특성규명된다. 일부 구현예에서, CD4 및/또는 CD8 효과기 기억 T 세포는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, CD4 및/또는 CD8 효과기 기억 T 세포는 종양으로부터의 것이다.
본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 개체에 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 투여는 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 투여 전에 비하여 CD8 T 세포에 증가된 염증성 마커 (예를 들면, CXCR3)에 의해 특성규명된다. CXCR3/CD8 T 세포는 본 기술에 공지된 임의의 수단 및 실시예에 기재된 방법에 의해 계측될 수 있다. 일부 구현예에서, CXCR3/CD8 T 세포는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, CXCR3/CD8 T 세포는 종양으로부터의 것이다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, Treg 기능은 본 조합의 투여 전에 비하여 억제된다. 일부 구현예에서, T 세포 고갈은 상기 조합의 투여 전에 비하여 감소된다.
일부 구현예에서, Treg의 수는 본 조합의 투여 전에 비하여 감소된다. 일부 구현예에서, 혈장 인터페론 감마는 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가된다. Treg 수는 예를 들면, CD4+Fox3p+ CD45+ 세포의 백분율을 결정함에 의해 (예를 들면, FACS 분석에 의해) 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, 샘플에서 Treg의 절대 수가 결정된다. 일부 구현예에서, Treg는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Treg은 종양으로부터의 것이다.
일부 구현예에서, T 세포 프라이밍, 활성화 및/또는 증식은 본 조합의 투여 전에 비하여 증가된다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포이다. 일부 구현예에서, T 세포 증식은 Ki67+ CD8+ T 세포의 백분율을 결정함에 의해 (예를 들면, FACS 분석에 의해) 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 증식은 Ki67+ CD4+ T 세포의 백분율을 결정함에 의해 (예를 들면, FACS 분석에 의해) 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 말초 혈액으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, T 세포는 종양 유래의 것이다.
당해 기술에서 공지된 또는 본 명세서에서 기재된 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제가 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다.
VI.검출 및 진단의 방법
일부 구현예에서, 샘플은 PD-1 축 결합 길항제로 치료 전에 (일부 구현예에서, OX40 결합 효능제, 예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체, 예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합한 치료 전에) 수득된다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 포르말린 고정되고 그리고 파라핀 포매되고, 기록, 신선한 또는 냉동된다
일부 구현예에서, 샘플은 전혈이다. 일부 구현예에서, 전혈은 면역 세포, 순환하는 종양 세포 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
바이오마커 (예를 들면, PD-L1)의 존재 및/또는 발현 수준/양은, 비제한적으로 DNA, mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 복제수를 포함하여, 당해 기술에서 공지된 임의의 적합한 기준에 기반하여 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 제2 샘플에서 존재/부재 및/또는 발현 수준/양에 비교될 때 증가되거나 또는 상승되었다. 특정 구현예에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 존재/부재 및/또는 발현 수준/양은 제2 샘플에서 존재 및/또는 발현 수준/양에 비교될 때 감소되거나 또는 줄었다. 특정 구현예에서, 제2 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직이다. 유전자의 존재/부재 및/또는 발현 수준/양을 결정하기 위한 추가의 개시내용이 본 명세서에 기재되어 있다.
임의의 방법의 일부 구현예에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직에 비교될 때 본 명세서에서 기재된 것과 같은 공지된 방법의 표준 기술에 의해 검출된, 바이오마커 (예를 들면, 단백질 또는 핵산 (예를 들면, 유전자 또는 mRNA))의 수준에서 약 임의의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 전체 증가를 지칭한다. 특정 구현예에서, 상승된 발현은 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양에서의 증가를 지칭하고 여기서 상기 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직에서 각각의 바이오마커의 적어도 약 임의의 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X 발현 수준/양이다. 일부 구현예에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 대조군 조직, 또는 내부 대조군 (예를 들면, 하우스키핑 유전자)에 비교될 때 약 1.5 배, 약 1.75 배, 약 2 배, 약 2.25 배, 약 2.5 배, 약 2.75 배, 약 3.0 배, 또는 약 3.25 배보다 더 큰 전체 증가를 지칭한다.
임의의 방법의 일부 구현예에서, 감소된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직에 비교될 때 본 명세서에서 기재된 것과 같은 공지된 방법의 표준 기술에 의해 검출된, 바이오마커 (예를 들면, 단백질 또는 핵산 (예를 들면, 유전자 또는 mRNA))의 수준에서 약 임의의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 전체 감소를 지칭한다. 특정 구현예에서, 감소된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양에서의 감소를 지칭하고 여기서 상기 감소는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직에서 각각의 바이오마커의 적어도 약 임의의 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, 또는 0.01X 발현 수준/양이다.
샘플 내 다양한 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 비제한적으로 하기를 포함하는, 이의 다수가 본 분야에 알려져 있고, 숙련가에게 이해되는, 다양한 방법에 의하여 분석될 수 있다: 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블랏 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성 세포 분류 ("FACS"), 마이크로어레이, 프로테오믹스, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어 혈청 ELISA로서), 생화학 효소적 활성 검정, 원위치 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열분석, 폴리머라아제 쇄 반응 ("PCR") (정량적 실시간 PCR ("qRT-PCR") 및 기타 증폭 유형 검출 방법, 예컨대, 예를 들어 분지된 DNA, SISBA, TMA 등, RNA-서열(RNA-Seq), FISH, 마이크로어레이 분석, 유전 발현 프로파일링, 및/또는 유전자 발현의 일련 분석 ("SAGE"), 뿐만 아니라 단백질, 유전자, 및/또는 조직 어레이 분석에 의하여 수행될 수 있는 다양한 범위의 검정 중 임의의 것. 유전자 및 유전자 산물의 위치를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은, 예를 들어 하기에서 발견될 수 있다: Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, 유닛 2 (노던 블랏), 4 (서던 블랏), 15 (면역 블랏) 및 유닛 18 (PCR 분석). 멀티플렉스 면역검정, 예컨대 Rules Based Medicine 또는 Meso Scale Discovery ("MSD")에서 이용가능한 것들이 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은: (a) 샘플 (예컨대 대상체 암 샘플)에서 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대 rtPCR 또는 qRT-PCR), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스 어레이 기술, 또는 FISH를 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양을 결정하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 마이크로어레이 방법은 엄격한 조건 하에서 상기 언급된 유전자를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화 가능한 하나 이상의 핵산 분자를 갖거나 또는 상기 언급된 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 (예컨대 펩티드 또는 항체)를 갖는 마이크로어레이 칩의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, PCR 방법은 qRT-PCR이다. 일 구현예에서, PCR 방법은 멀티플렉스-PCR이다. 일부 구현예에서, 유전자 발현은 마이크로어레이에 의해 계측된다. 일부 구현예에서, 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 계측된다. 일부 구현예에서, 발현은 멀티플렉스-PCR에 의해 계측된다.
세포에서 mRNA의 평가를 위한 방법은 잘 알려져 있고 그리고, 예를 들면, 상보적 DNA 프로브를 사용한 하이브리드화 검정 (예컨대 1종 이상의 유전자에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용한 그 자리에서 하이브리드화, 노던 블랏 및 관련된 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대 유전자 중 1종 이상에 특이적인 상보적 프라이머를 사용한 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예컨대, 예를 들면, 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물로부터의 샘플은 노던, 닷 블랏 또는 PCR 분석을 사용하여 mRNA에 대해 편리하게 분석될 수 있다. 게다가, 이와 같은 방법에는 생물학적 샘플 내 표적 mRNA의 수준을 확인할 수 있게 해주는 하나 이상의 단계들(예컨대, 하우스키핑 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조군 mRNA 수준을 동시에 조사함으로써)이 포함될 수 있다. 임의로, 상기 증폭된 표적 cDNA의 서열이 계측될 수 있다.
임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 내에서 mRNA를 목표로 하는 것과 같이, mRNA를 조사하거나 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터 시험 및 대조군 mRNA 샘플이 역전사되고 그리고 표지되어 cDNA 프로브를 생성한다. 상기 프로브는 그런 다음 고형 지지체 상에 고정된 핵산의 배열에 혼성화된다. 상기 배열은 배열의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 그의 발현이 항-혈관신생 요법의 증가된 또는 감소된 임상 이득과 상관되는 유전자의 선택은 고형 지지체 상에 배열되어 질 수 있다. 특정 배열 구성원으로 표지된 프로브의 하이브리드화는 프로브가 유도된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 존재 및/또는 발현 수준/양은 상기 언급된 유전자의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 계측된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을, 바이오마커의 결합 및 복합체가 항체와 바이오마커 사이에 형성되는지 여부를 결정하기 위해 허용된 조건 하에서 본 명세서에서 기재된 바이오마커에 대한 항체(예를 들면, 항-PD-L1 항체)와 접촉하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 PD-L1 축 결합 길항제, 예를 들어 개체의 선택을 위한 바이오마커로 치료할 수 있는 대상체를 선택하기 위해 사용된다.
특정 구현예에서, 샘플 내 바이오마커 단백질의 존재 및/또는 발현 수준은 IHC 및 염색 프로토콜을 사용하여 계측될 수 있다. 조직 절편의 IHC 염색이 샘플에서 단백질의 존재를 계측하거나 검출하는 신뢰할 만한 방법임이 밝혀진 바 있다. 임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 PD-L1이다. 일부 구현예에서, PD-L1은 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 개체로부터 샘플에서 PD-L1 바이오마커의 상승된 발현은 상승된 단백질 발현이고 그리고, 추가 구현예에서, IHC를 사용하여 결정된다. 일 구현예에서, 바이오마커의 발현 수준은 하기 단계를 포함하는 방법을 사용하여 계측된다: (a) 항체를 갖는 샘플 (예컨대 대상체 암 샘플)의 IHC 분석을 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것. 일부 구현예에서, IHC 염색 강도는 참조와 비교하여 계측된다. 일부 구현예에서, 참조는 참조 값이다. 일부 구현예에서, 참조는 참조 샘플 (예를 들면, 비-암성 환자로부터 대조군 세포주 염색 샘플 또는 조직 샘플)이다.
IHC 는 추가의 기술, 예컨대 형태학적 염색 및/또는 형광 원위치 혼성화와 조합하여 수행될 수 있다. IHC 의 2개의 일반적인 방법이 이용가능하며; 이는 직접 검정 및 간접 검정이다. 제1 검정에 따라서, 항체의 표적 항원으로의 결합이 직접적으로 계측된다. 이와 같은 직접적인 분석법은 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소로 표지된 1차 항체(추가적인 항체 작용 없이 가시화될 수 있음)를 사용한다. 전형적인 간접적 분석법에서, 미접합된 1차 항체는 상기 항원에 결합하고, 이어서 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 상기 2차 항체가 효소 표지에 콘주게이트된 경우, 발색성 또는 형광성 기질이 첨가되어 항원의 가시화를 제공한다. 신호 증폭은 여러 2차 항체가 상기 1차 항체 상의 상이한 항원결정부들과 반응할 수 있기 때문에 발생한다.
IHC을 위해 사용되는 상기 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로 다음의 범주로 나뉠 수 있는 수많은 표지가 이용가능하다: (a) 방사선 동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I; (b) 콜로이드성 금 입자; (c) 형광 표지, 예컨대 비제한적으로, 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리스사민, 엄벨리페론, 파이코크리테린, 파이코시아닌 또는 상업적으로 사용가능한 형광단, 예컨대 SPECTRUM ORANGE7 및 SPECTRUM GREEN7 및/또는 상기의 것들 중 하나 이상의 유도체; (d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부의 고찰을 제공한다. 효소 표지의 예에는 루시퍼라아제(예컨대, 반딧불이 루시퍼라아제 및 세균성 루시퍼라아제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나아제, 우레아제, 과산화효소, 예컨대 겨자무과산화효소(HRPO), 알칼리성 인산가수 분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제(예컨대, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제), 헤테로시클 옥시다아제(예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼록시다아제, 마이크로퍼록시다아제 등이 포함된다.
효소-기질 조합의 예시는 하기를 포함한다: 예를 들어, 수소 퍼옥시다제를 기질로서 갖는 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO); 발색성 기질로서 니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리성 인산가수분해효소 (AP); 발색성 기질 (예컨대, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제) 또는 형광원성 기질 (예컨대, 4-메틸엄벨리페릴-β-D-갈락토시다아제)를 갖는 β-D-갈락토시다아제 (β-D-Gal). 이것에 대한 일반적인 내용은 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다.
임의의 방법의 일부 구현예에서, PD-L1는 항- PD-L1 진단 항체 (즉, 1차 항체)를 사용하여 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 진단성 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, PD-L1 진단성 항체는 비인간 항체이다. 일부 구현예에서, PD-L1 진단성 항체는 랫트, 마우스, 또는 래빗 항체이다. 일부 구현예에서, PD-L1 진단성 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, PD-L1 진단성 항체는 직접적으로 표지된다.
이렇게 제조된 시료는 장착되어 유리덮개로 덮일 수 있다. 슬라이드 평가가 이후 계측되며, 예를 들어, 본 분야에서 일상적으로 사용되는, 현미경 및 염색 강도 기준을 사용하는 것이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 하기가 이해된다: 종양 유래의 세포 및/또는 조직이 IHC 염색을 사용하여 계측될 경우, 염색은 일반적으로 종양 세포 및/또는 조직에서 계측 또는 평가된다 (샘플 내 존재할 수 있는 간질성 또는 주변 조직과 비교하여). 일부 구현예에서, 하기가 이해될 것이다: 종양 유래의 세포 및/또는 조직이 IHC 염색을 사용하여 계측될 경우, 염색은 종양내 또는 종양주변 면역 세포를 포함하는, 종양-침윤 면역 세포 내에서 계측 또는 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는, 하기 표 4에서 기술된 바와 같이, 샘플의 >0% , 샘플의 적어도 1% , 샘플의 적어도 5% , 또는 샘플의 적어도 10%로의 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는 <5%의 세포 내 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는 <1%의 세포 내 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는 0%의 세포 내 IHC에 의하여 검출된다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커의 존재는 임의의 세기의 PD-L1 염색으로의 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 약한 염색 세기로서 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 중간정도의 염색 세기로서 IHC에 의하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 강한 염색 세기로서 IHC에 의하여 검출된다.
일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 종양 세포, 종양 침윤 면역 세포 및 이의 조합 내에서 IHC에 의하여 검출된다.
IHC에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 항체는 당해 기술에 잘 알려져 있다. 당해기술의 숙련가는 추가적인 적합한 항-PD-L1 항체가 식별될 수 있고 IHC 프로토콜을 사용하여 항-PD-L1 항체와 비교함으로써 특징지을 수 있음을 이해한다 .
양성 조직 대조군은 태반 및 편도 조직 (강한 PD-L1 염색 세기); (PD-L1 염색 세기의 정도가 약한, 중간 정도 및 강한 세기로부터 가변하는) 재조합 인간 PD-L1로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용하여 예시된다. 예시적인 PD-L1 IHC 기준에 대해 하기가 참고될 수 있다.
PD-L1 상태 염색 기준
음성 0% 막 염색 또는 세포질 염색 또는 임의의 염색 세기에서 양자의 조합
양성 >0% 막 염색 또는 세포질 염색 또는 임의의 염색 세기에서 양자의 조합
≥1% 막 염색 또는 세포질 염색 또는 임의의 염색 세기에서 양자의 조합
≥5% 막 염색 또는 세포질 염색 또는 임의의 염색 세기에서 양자의 조합
≥10% 막 염색 또는 세포질 염색 또는 임의의 염색 세기에서 양자의 조합
일부 구현예에서, PDL1 상태는 상기 표 4에서 제공된 설명서에 따라 진단된다.
일부 구현예에서, PD-L1 IHC 진단 평가에 대한 기준은 아래와 같이 제공된다:
PD-L1 진단 평가
 IHC 스코어
임의의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 부재
또는
종양 세포, 관련된 종양내의, 및 인접하는 주위-종양의 결합조직형성 간질에 의해 점거된 종양 면적의 1%를 커버하는 종양 침윤하는 면역 세포에서 임의의 세기의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 존재		 IHC 0
종양 세포, 관련된 종양내의, 및 인접하는 주위-종양의 결합조직형성 간질에 의해 점거된 종양 면적의 1% 내지 5%를 커버하는 종양 침윤하는 면역 세포에서 임의의 세기의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 존재 IHC 1
종양 세포, 관련된 종양내의, 및 인접하는 주위-종양의 결합조직형성 간질에 의해 점거된 종양 면적의 5 % 내지 10%를 커버하는 종양 침윤하는 면역 세포에서 임의의 세기의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 존재 IHC 2
종양 세포, 관련된 종양내의, 및 인접하는 주위-종양의 결합조직형성 간질에 의해 점거된 종양 면적의 10%를 커버하는 종양 침윤하는 면역 세포에서 임의의 세기의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 존재 IHC 3
일부 구현예에서, PDL1 상태는 상기 표 5에서 제공된 설명서에 따라 진단된다. 일부 구현예에서, IHC 0 및/또는 IHC 1의 스코어를 갖는 샘플이 PDL1 바이오마커 음성으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, IHC 2 및/또는 IHC 3의 스코어를 갖는 샘플이 PDL1 바이오마커 양성으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 하기로서 진단된다: IHC 0, IHC 0 및/또는 1, IHC 1, IHC 1 및/또는 2, IHC 2, IHC 2 및/또는 3, 또는 IHC 3.
일부 구현예에서, PDL1 발현은 종양 또는 종양 샘플에 대해 평가된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 종양 또는 종양 샘플은 종양 세포에 의해 점거된 종양 면적의 일부 또는 모두를 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 또는 종양 샘플은 종양 관련 종양내의 세포 및/또는 종양 관련 간질 (예를 들면, 인접한 주변-종양의 결합조직형성 간질)에 의해 점거된 종양 영역을 추가로 포괄할 수 있다. 종양 관련된 종양내의 세포 및/또는 종양 관련된 간질은 주요 종양 덩어리에 바로 인접한 및/또는 이와 접하는 면역 침윤물 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이 종양 침윤하는 면역 세포)의 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PDL1 발현은 종양 세포에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, PDL1 발현은 상기에서 기재된 바와 같이 종양 영역, 예컨대 종양 침윤하는 면역 세포 내에서 면역 세포에 대해 평가된다.
대안적인 방법에서, 샘플은 항체-바이오마커 복합체가 형성되기에 충분한 조건하에 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉될 수 있고 그리고 그 다음 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 수많은 방식으로, 예컨대 혈장 또는 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 분석하기 위한 웨스턴 블랏팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 광범위한 상기 검정 형식을 사용한 면역검정 기술이 이용가능하며, 예를 들어, 하기를 참고한다: 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653. 이들은 전통적인 경쟁적 결합 검정에서뿐만 아니라 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 양자를 포함한다. 이들 검정은 또한 표적 바이오마커에 표지된 항체의 직접적인 결합을 포함한다.
조직 또는 세포 샘플에서 선택됨 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 작용성 또는 활성-기반 검정의 방법에 의해 조사될 수 있다. 예를 들면, 만일 바이오마커가 효소이면, 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출하기 위해 당해 기술에 공지된 검정을 수행할 수 있다.
특정 구현예에서, 샘플은 분석된 바이오마커의 양에서의 차이 및 사용된 샘플의 품질의 가변성 및 검정 실행 사이의 가변성 모두에 대해 정규화된다. 이러한 정규화는 잘 알려진 하우스키핑 유전자를 포함하여 특정 정규화 바이오마커의 발현을 검출하고 통합함에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 정규화는 모든 분석된 유전자 또는 이들의 큰 서브셋의 평균 또는 중간 신호에 기초될 수 있다 (전면적인 정규화 접근법). 유전자-별-유전자 기준으로, 대상체 종양 mRNA 또는 단백질의 계측된 정규화된 양은 참조 세트에서 발견된 양에 비교된다. 대상체 당 시험된 종양 당 각 mRNA 또는 단백질에 대한 정규화된 발현 수준은 참조 세트에서 계측된 발현 수준의 백분율로 표현될 수 있다. 분석된 특정한 대상체 샘플에서 계측된 존재 및/또는 발현 수준/양은 당해 기술에서 잘 알려진 방법에 의해 계측될 수 있는, 이 범위 내의 일부 백분위로 될 수 있다.
일 구현예에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 양태에서, 상기 샘플은 진단학적 검정에 사용된다. 일부 구현예에서, 샘플은 1차 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 생검은 때로는 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 있는 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되거나 또는 생각되는 조직 또는 체액의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들면, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지내시경, 미세 침상 흡인, 기관지 칫솔질에 의해, 또는 객담, 늑막 유체 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 유전자 또는 유전자 생성물은 암 또는 종양 조직으로부터 또는 다른 신체 샘플 예컨대 소변, 가래, 혈청 또는 혈장로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출을 위해 상기 논의된 동일한 기술이 다른 신체 샘플에 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 떨어져 나올 수 있으며 그러한 신체 샘플에 나타날 수 있다. 그러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써, 이들 암에 대한 간단한 조기 진단이 달성될 수 있다. 또한, 요법의 진행은 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대한 그러한 신체 샘플을 시험함에 의해 보다 쉽게 모니터링될 수 있다.
특정 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 시험 샘플이 수득될 때보다 하나 이상의 상이한 시점에서 수득된 동일한 대상체 또는 개체로부터 단일 샘플 또는 합치된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 시험 샘플이 수득될 때보다 동일한 대상체 또는 개체로부터 조기 시점에서 수득된다. 이러한 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 만일 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 그리고 시험 샘플은 암이 전이성이 된 때 나중에 수득되면 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 상기 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 건강한 개인으로부터 조합된 다중 샘플이다. 특정 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 상기 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들면, 암)를 갖는 하나 이상의 개인으로부터 조합된 다중 샘플이다. 특정 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 상기 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 개인으로부터 정상 조직 또는 풀링된 혈장 또는 혈청 샘플로부터 풀링된 RNA 샘플이다. 특정 구현예에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 상기 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들면, 암)를 갖는 하나 이상의 개인으로부터 종양 조직 또는 풀링된 혈장 또는 혈청 샘플로부터 풀링된 RNA 샘플이다.
일부 구현예에서, 샘플은 개체 유래의 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 종양 조직 샘플 (예를 들면, 생검 조직)이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 폐 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 신장 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 피부 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 췌장 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 위 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 방광 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 식도 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 중피 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 유방 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 갑상선 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 결장직장 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 두경부 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 골육종 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 전립선 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 난소 조직, HCC (간), 혈구, 림프절, 및/또는 골/골수 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 결장 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 자궁내막 조직이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 뇌 조직 (예를 들면, 교모세포종, 신경교세포종, 등)이다.
일부 구현예에서, 종양 조직 샘플 (용어 "종양 샘플"이 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)은 종양 세포에 의해 점거된 종양 면적의 일부 또는 모두를 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 또는 종양 샘플은 종양 관련 종양내의 세포 및/또는 종양 관련 간질 (예를 들면, 인접한 주변-종양의 결합조직형성 간질)에 의해 점거된 종양 영역을 추가로 포괄할 수 있다. 종양 관련된 종양내의 세포 및/또는 종양 관련된 간질은 주요 종양 덩어리에 바로 인접한 및/또는 이와 접하는 면역 침윤물 (예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이 종양 침윤하는 면역 세포)의 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 세포 염색은 임의의 세기의 막성 염색을 나타내는 모든 종양 세포의 퍼센트로 표현된다. 침윤하는 면역 세포 염색은 임의의 세기의 염색을 나타내는 면역 세포에 의해 점거된 총 종양 면적의 퍼센트로 표현될 수 있다. 총 종양 면적은 주요 종양 덩어리에 바로 인접하고 이와 접하는 면역-침윤물의 영역을 포함하여, 종양 관련 간질뿐만 아니라 악성 세포를 포함한다. 또한, 침윤하는 면역 세포 염색은 모든 종양 침윤하는 면역 세포의 퍼센트로 표현될 수 있다.
상기 방법들의 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 악성 암성 종양 (즉, 암)이다. 일부 구현예에서, 종양 및/또는 암은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연조직 종양이다. 연조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들면, 만성적 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙한 B-세포 급성 림프아구성 백혈병, 만성적 림프구성 백혈병, 다림프구 백혈병, 또는 모발 세포 백혈병) 또는 림프종 (예를 들면, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 또는 호지킨 질환)을 포함한다. 고형 종양은 혈액, 골수, 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 것 및 비-상피 세포 기원의 것으로 추가로 분화될 수 있다. 상피성 세포 고형물 종양의 예는 위장관, 결장, 결장직장 (예를 들면, 기저양 결장직장 암종), 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소 (예를 들면, 자궁내막모양 난소 암종), 두경부, 구강, 위, 십이지장, 작은 창자, 큰 창자, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식기 장기, 비뇨기 (예를 들면, 요로상피 암종, 형성이상 요로상피 암종, 이행 세포 암종), 방광, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피성 기원의 고형 종양은 육종, 뇌종양, 및 골 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 비-소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 2차 또는 3차 국소로 진전된 또는 전이성 비-소세포 폐암이다. 일부 구현예에서, 암은 선암종이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 편평상피 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 하기이다: 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 신경교세포종, 흑색종, 유방 암종 (예를 들면 삼중-음성 유방암), 위암, 대장암 (CRC), 또는 간세포 암종. 일부 구현예에서, 상기 암은 1차 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 암의 임의의 상기 유형으로부터 유도된 제2 부위에서 전이성 종양이다.
임의의 방법의 일부 구현예에서, 암은 인간 효과기 세포를 디스플레이한다 (예를 들면, 인간 효과기 세포에 의해 침윤된다). 인간 효과기 세포를 검출하는 방법은, 예를 들면 IHC에 의한 것을 포함하여, 당해 기술에서 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 인간 효과기 세포를 디스플레이한다. 일부 구현예에서, 인간 효과기 세포는 NK 세포, 대식세포, 단핵구 중 1종 이상이다. 일부 구현예에서, 암은 본원에 기술된 임의의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 하기이다: 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 신경교세포종, 흑색종, 유방 암종 (예를 들면 삼중-음성 유방암), 위암, 대장암 (CRC), 또는 간세포 암종.
임의의 방법의 일부 구현예에서, 암은 FcR을 발현하는 세포를 디스플레이한다 (예를 들면, FcR을 발현하는 세포에 의해 침윤된다). FcR를 검출하는 방법은, 예를 들면 IHC에 의한 것을 포함하여, 당해 기술에서 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 FcR을 발현하는 세포를 디스플레이한다 일부 구현예에서, FcR 은 FcγR이다. 일부 구현예에서, FcR 은 활성화 FcγR이다. 일부 구현예에서, 암은 하기이다: 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 신경교세포종, 흑색종, 유방 암종 (예를 들면 삼중-음성 유방암), 위암, 대장암 (CRC), 또는 간세포 암종.
일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 FACS, 웨스턴 블랏, ELISA, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광, 방사선면역검정, 닷 블랏팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라즈몬 공명, 광학적 분광법, 질량 분광분석기, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스 어레이 기술, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택됨 방법을 사용하여 샘플에서 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 FACS 분석을 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 바이오마커는 PD-L1이다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현은 혈액 샘플에서 검출된다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현은 혈액 샘플 내에서 순환하는 면역 세포에서 검출된다. 일부 구현예에서, 순환 면역 세포는 CD3+/CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 분석 전에, 면역 세포는 혈액 샘플로부터 단리된다. 이러한 세포의 집단을 단리/농축시키는 임의의 적합한 방법은 비제한적으로, 세포 분류를 포함하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현은 항-PD-L1 항체와 같은 PD-L1/PD-1 축 경로의 억제제로 치료에 반응하는 개체로부터의 샘플에서 상승된다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현은 혈액 샘플에서 CD3+/CD8+ T 세포와 같은 순환하는 면역 세포에서 상승된다.
대상체로부터 수득된 백혈구를 포함하는 샘플 내에 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) (예를 들면, 사이토카인, 예를 들면, 감마 인터페론) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준 (예를 들면, Treg의 백분율 및/또는 Treg의 절대 수; 예를 들면, CD8+ 효과기 T 세포의 수)을 계측함에 의해 OX40 효능제 치료의 약동학적 활성을 모니터링하는 방법으로, 여기서 상기 대상체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)으로 처리되었고, 그리고 상기 1종 이상의 마커 유전자는 T 세포 마커 유전자, 또는 기억 T 세포 마커 유전자 (예를 들면, T 효과기 기억 세포의 마커)로부터 선택되는 방법; 및 참조와 비교하여 대상체로부터 수득된 샘플에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준에 기초하여 약동학적 활성을 입증함으로서 치료를 결정하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조와 비교하여 1종 이상의 마커 유전자의 증가된 발현 수준은 OX40 효능제 치료에 대한 약동학적 활성을 나탄내다. 마커 유전자, 단백질 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준은 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 방법으로 계측될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약력학적 (PD) 활성"은 대상체에 대한 치료 (예를 들면, PD-1 축 길항제 치료와 조합된 OX40 효능제 치료)의 효과를 지칭할 수 있다. PD 활성의 예는 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 조절을 포함할 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, 예컨대 유전자 마커의 발현 평가에 의한, PD 활성 모니터링이 OX40 효능제 및 PD-1 축 길항제를 조사하는 임상시험 동안 유리할 수 있음이 고려된다. PD 활성 모니터링은, 예를 들어, 치료, 독성, 등등에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 마커 유전자, 단백질 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준은 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받지 않는 대상체 유래의 샘플을 포함할 수 있는 참조에 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, 참조는 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받기 전에 동일한 대상체 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 참조는 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받는 다른 대상체의 하나 이상의 샘플로부터 참조 값을 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자의 집단은 치료될 수 있고, 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 대한 중간, 평균, 또는 중앙값은 전체적으로 집단으로부터 생성될 수 있다. 공유된 특징 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된, 동일한 암 유형 및/또는 단계, 또는 공통의 치료 예컨대 OX40 효능제에 대한 노출)을 갖는 암으로부터 수득된 샘플의 세트는 예컨대 임상 결과 연구를 이용한 집단으로부터 연구될 수 있다. 상기 세트는, 대상체의 샘플이 비교될 수 있는, 참조, 예를 들면, 참조 번호를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 임의의 참조는 PD 활성 모니터링을 위하여 참조로서 사용될 수 있다.
대상체로부터 수득된 백혈구를 포함하는 샘플 내에 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) (예를 들면, 사이토카인, 예를 들면, 감마 인터페론) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준 (예를 들면, Treg의 백분율 및/또는 Treg의 절대 수; 예를 들면, 말초 혈액 샘플 내 CD8+ 효과기 T 세포의 수)을 계측함에 의해 OX40 효능제 치료에 대한 대상체의 반응성을 모니터링하는 방법으로, 여기서 상기 대상체는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)으로 처리되었고, 그리고 상기 1종 이상의 마커 유전자는 T 세포 마커 유전자, 또는 기억 T 세포 마커 유전자 (예를 들면, T 효과기 기억 세포의 마커)로부터 선택되는 방법; 및 참조와 비교하여 대상체로부터 수득된 샘플에서 1종 이상의 마커 유전자, 단백질(들) 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준에 기초하여 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성으로 상기 대상체를 분류하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 참조와 비교하여 1종 이상의 마커 유전자의 증가된 발현 수준은 OX40 효능제 치료에 대한 반응성 또는 반응성의 결여를 나탄내다. 마커 유전자, 단백질 및/또는 세포성 조성물의 발현 수준은 본원에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 방법으로 계측될 수 있다.
일부 구현예에서, 반응성 모니터링을 위한 참조는 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받지 않는 대상체 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성 모니터링을 위한 참조는 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받기 전 동일한 대상체 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성 모니터링을 위한 참조는 치료 (예를 들면, PD-1 축 결합 길항제와 조합된 OX40 효능제 치료)를 받는 다른 환자의 하나 이상의 샘플로부터 참조 값을 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자의 집단은 치료될 수 있고, 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 대한 중간, 평균, 또는 중앙값은 전체적으로 집단으로부터 생성될 수 있다. 공유된 특징 (예를 들면, 동일한 암 유형 및/또는 단계, 또는 공통의 치료 예컨대 OX40 효능제에 대한 노출)을 갖는 암으로부터 수득된 샘플의 세트는 예컨대 임상 결과 연구를 이용한 집단으로부터 연구될 수 있다. 상기 세트는, 대상체의 샘플이 비교될 수 있는, 참조, 예를 들면, 참조 번호를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 임의의 참조는 PD 활성 모니터링을 위하여 참조로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 양태는 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 계측에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 샘플은 백혈구를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 (예를 들면, 종양이 있는 환자로부터) 말초 혈액 샘플 일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 종양 샘플에는 암 세포, 림프구, 백혈구, 기질, 혈관, 연결조직, 기저판, 및 상기 종양과 관련된 기타 모든 세포 유형이 포함된다. 일부 구현예에서, 샘플은 종양-침윤 백혈구를 함유한 종양 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 세포 유형 (예를 들면, 백혈구)을 단리 또는 단리시키기 위해 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 유형의 단리 또는 단리 없이 사용될 수 있다.
종양 샘플은, 제한 없이 생검, 내시경술, 또는 수술 과정을 포함하여, 당해 기술에서 공지된 임의의 방법으로 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 방법 예컨대 냉동, (예를 들면, 포르말린 또는 유사한 고정제 이용에 의한) 고착, 및/또는 파라핀 왁스에서 포매에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 신선한 종양 샘플 (즉, 상기 기재된 방법에 의해 제조되지 않은 것)은 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 mRNA 및/또는 단백질 완전성을 보전하기 위해 용액에서 항온처리에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 말초 혈액 샘플일 수 있다. 말초 혈액 샘플은 백혈구, PBMC, 등등을 포함할 수 있다. 말초 혈액 샘플로부터 백혈구 단리를 위하여 당해 기술에서 공지된 임의의 기술은 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 뽑혀질 수 있고, 적혈구는 용해될 수 있고, 백혈구 펠렛은 단리될 수 있고 샘플로 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 밀도 구배 단리는 적혈구로부터 백혈구 (예를 들면, PBMC)를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 신선한 말초 혈액 샘플 (즉, 상기 기재된 방법에 의해 제조되지 않았던 것)은 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 말초 혈액 샘플은 mRNA 및/또는 단백질 완전성을 보전하기 위해 용액에서 항온처리에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료에 대한 반응성은 하기 중 하나 이상을 지칭할 수 있다: 연장된 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함); 객관적 반응의 유발 (완전한 반응 또는 부분적 반응 포함); 또는 암의 징후 또는 증상의 개선. 일부 구현예에서, 반응성은 암 환자에서 종양의 상태, 즉, 반응, 안정, 또는 진행 결정을 위한 RECIST 설명서의 공개된 세트에 따라 하나 이상의 인자의 개선을 지칭할 수 있다. 이러한 가이드라인의 더욱 상세한 검토에 대하여, 다음을 참고한다: Eisenhauer et al., Eur J Cancer 2009;45: 22847; Topalian et al., N Engl J Med 2012;366:244354; Wolchok et al., Clin Can Res 2009;15:741220; and Therasse, P., et al. Natl. Cancer Inst. 92:205-16 (2000). 반응성 대상체는 암(들)이, 예를 들면, RECIST 기준에 기반한 하나 이상의 인자에 따라 개선을 보이는 대상체를 지칭할 수 있다. 비-반응성 대상체는 암(들)이, 예를 들면, RECIST 기준에 기반한 하나 이상의 인자에 따라 개선을 보이지 않는 대상체를 지칭할 수 있다.
종래의 반응 기준은, 신규 병변의 외관을 포함한, 초기 명백한 방사선학적 진행에 의해 선행될 수 있는 지연된 반응을 생산할 수 있는, 면역치료제의 항-종양 활성을 특징으로 하는데 적절하지 않을 수 있다. 그러므로, 신규 병변의 가능한 외관을 설명하는 및 후속의 평가에서 방사선학적 진행이 확인되게 하는 변형된 반응 기준이 개발되었다. 따라서, 일부 구현예에서, 반응성은 면역-관련된 반응 기준2(irRC)에 따라 더 많은 인자 중 하나의 개선을 지칭할 수 있다. 참고: 예를 들면, Wolchok et al., Clin Can Res 2009;15:7412 - 20. 일부 구현예에서, 신규 병변은 정의된 종양 부하에 부가되고, 예를 들면, 후속의 평가에서 방사선학적 진행을 뒤따른다. 일부 구현예에서, 비-표적 병변의 존재는 완벽한 반응의 평가에서 포함되고 방사선학적 진행의 평가에서 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 방사선학적 진행은 계측이능한 질환의 기준으로만 계측될 수 있고/있거나 최초 문서로 기록된 일자로부터 ≥ 4 주 연속적인 평가로 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 반응성은 면역 활성화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성은 치료 효능을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성은 면역 활성화 및 치료 효능을 포함할 수 있다.
VI.제조 물품 또는 키트
본 발명의 또 다른 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품 또는 키트는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연하거나 또는 암이 있는 개체의 면역 기능을 증진하기 위해 OX40 결합 효능제와 병용으로 PD-1 축 결합 길항제를 사용하는 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 기재된 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 OX40 결합 효능제가 상기 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)는 동일한 용기 또는 별도의 용기 내에 있다. 적합한 용기로는 예를 들면, 병, 바이알, 백(bag) 및 주사기가 포함된다. 상기 용기는 다양한 물질 예컨대 유리, 플라스틱 (예컨대 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금 (예컨대 스테인레스강 또는 하스텔로이)로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 제제를 보유하고, 상기 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 사용상의 주의사항을 나타낼 수 있다. 제조물품 또는 키트는 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품은 하나 이상의 또 다른 제제 (예를 들면, 화학치료제, 및 항-신생물성 제제)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 제제에 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 봉지 및 주사기를 포함한다.
명세서는 당업계의 숙련자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 본원에 도시되고 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형들이 상기 설명으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백하고, 첨부된 청구항의 범위 내에 속할 것이다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이들의 견지에서 다양한 변형 또는 변화가 당해기술의 숙련가에게 제시될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함될 것임이 이해된다.
재료 및 방법
생체 내 종양 모델: CT26 및 MC38 결장장 세포주는 제네텍에서 유지되었다. CT26 연구를 위해, 8-10 주령 암컷 Balb/c 마우스 (찰스 리버 래보라토리스; 캘리포니아주 홀리스터 소재)를 우측 편측성 옆구리에 0.1백만 CT26 세포로 피하로 접종하였다. MC38 연구를 위해, 8-10 주령 암컷 C57BL/6 마우스 (Charles River Laboratories)를 우측 편측성 옆구리에 0.1백만 MC38 세포로 피하로 접종하였다. 종양은 대략 150mm3의 평균 종양 부피가 달성될 때, 마우스가 동원되고 치료 그룹으로 무작위화되고 그리고 다음 1일에 항체 치료가 시작되었다. 모든 동물 연구는 동물 복지법 및 실험실 동물의 관리 및 사용 안내 및 IACUC 설명서에 언급된 설명서 및 규정에 따라 수행되었다. 치료 그룹은 다음과 같다: 1) 대조군 항체, 10 mg/kg IV 제1 용량, 그 다음 5mg/kg IP, BIWx2, n=5; 2) 뮤린 항-마우스 OX40 효능제 단클론성 항체 (OX86 항체 및 마우스 IgG2a Fc로부터 유도된 랫트 항-마우스 OX40 가변 영역을 갖는 키메라 항체). 이와 같이, 이 뮤린 항체는, 비제한적으로 ADCC), 0.1mg/kg IV 제1 용량, 그 다음 IP, TIWx2, n=5; 3) 뮤린 항-PD-L1, 10mg/kg IV 제1 용량, 그 다음 5mg/kg IP, TIWx2, n=5; 및 4) 뮤린 항-마우스 OX40 단클론성 항체, 0.1mg/kg IV 제1 용량, 그 다음 IP, TIWx2 및 뮤린 항-PD-L1, 10mg/kg IV 제1 용량, 그 다음 5mg/kg IP TIWx2, n=5를 포함하여, 효과기 기능을 할 수 있다. 마우스는 희생되고 그리고 말초 혈액이 제1 용량 후 9일째에 수확되었다.
항체: 모든 치료 항체는 제네텍에서 생성되었다 대조군 항체는 항-gp120 마우스 IgG1, 클론 10E7.1D2였다. 항-OX40 항체는 클론 OX-86 마우스-IgG2a (뮤린 IgG2a 골격 상에 랫트 항-마우스 OX40 효능제 항체 OX-86을 클로닝함에 의해 생성됨)이었고 그리고 항-PDL1은 클론 6E11.1.9 마우스 IgG1이었다. 복용 계획은 정맥내로 (IV) 투여된 제1 또는 단회 용량 및 복강내로 (IP) 제공된 후속의 용량으로 도면 범례에 표시된 것과 같다. 항체는 PBS 또는 20mM 히스티딘 아세테이트, 240mM 수크로오스, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 5.5 중 어느 것에서 희석되었다. TIW는 주 3회 투여를 나타내고, BIW는 주 2회 투여를 나타낸다.
종양 가공 및 유세포계측: 종양을 수확하고 0.25mg/ml로 5% 우태 혈청 플러스 콜라겐분해효소 D (로슈; 인디애나주 인디아나폴리스 소재) 및 0.1mg/ml로 DNAe I (로슈)을 갖는 RPMI-1640 배지에서 C-튜브 (밀테니이 바이오텍; 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에서 요동 플랫폼 상에서 37℃에서 15분 동안 소화하기 면도날로 절단하였다. 배양 후, 종양을 gentleMACS (밀테니이 바이오텍) 상에서 가공하고, 여과하고, 세척하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포는 Vi-셀 카운터 (벡크만 쿨터; 캘리포니아주 브레이아 소재) 상에서 계수되었다.
말초 혈액은 유세포계측에 의해 T 세포의 활성화 및 증식에 대해 평가되었다. 50 uL 혈액은 제조자 설명서에 따라 CD45, CD3, CD4, CD8, CXCR3, (모두 BD Biosciences) 및 Ki67 (eBiosciences)에 대한 상업적 항체로 염색되었다. 세포는 먼저 얼음 상에서 30분 동안 PBS에서 라이브/데드 근적외선 생존력 염료 (라이프 테크놀로지스; 네브래스카주 그랜드아일랜드 소재)으로 염색되고 그런 다음 세정된다. 세포는 그런 다음 PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA 완충액에서 얼음 상에서 30분 동안 후속의 표면 염색 전에 Fc 수용체가 정제된 항-CD16/-CD32 (BD 바이오사이언스스; 캘리포니아주 산호세 소재)로 차단된다. PD-1, 및 T 세포의 OX40 발현을 평가하기 위해, 세포는 아래와 같이 염색된다: PD1-FITC, CD3-PerCp.Cy5.5, CD4-PE-Cy7, CD8 퍼시픽 블루, CD45 v500, (BD 바이오사이언스스); OX40 알렉사 플루오르 647 (제네텍, 클론 1H1). 다양한 세포 유형의 PDL1 발현을 평가하기 위해, 염색은 아래와 같다: CD11b-FITC, Gr-1 PE-Cy7, CD8 알렉사 700, CD45 v500, CD4-PerCp.Cy5.5 (BD 바이오사이언스스); PDL1-바이오틴 (제네텍, 클론 6F8.2.5) 그 다음 스트렙타비딘-PE (BD 바이오사이언스). Foxp3+ T 조절 세포 집단을 평가하기 위해, 세포는: CD45-PE-Cy7, CD4 PerCp-Cy5.5 (BD 바이오사이언스스)으로 먼저 표면 염색되고, 그리고 그 다음 1x foxp3 고정/투과화 완충액 (이바이오사이언스; 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 내에서 4C에서 밤새 고정된다. 세포는 그런 다음 1x foxp3 투과화 완충액 (이바이오사이언스)에서 투과되고 그리고 Foxp3-FITC (이바이오사이언스)로 염색된다. 염색된 세포는 Fortessa 또는 FACS Canto II (BD 바이오사이언스스) 상에서 FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 획득되고 그 다음 FlowJo 소프트웨어 상에서 분석되었다.
종양 해부 및 플루이다임 발현 분석: RNA는 하기에 기재된 바와 같이 UBC 또는 NSCLC에 대한 FFPE 유도된 기록 종양으로부터 추출되었다: Powles, T., et al. (2014) Nature 515:558-62; Herbst, R.S., et al (2014) Nature 515:563-7). 간단히, 종양 FFPE 섹션은 신생물성 조직에 대해 풍부하도록 매크로-해부되고 그리고 조직은 종양 세포용해 버퍼 및 프로테이나제 K를 사용하여 용해되어 완벽한 소화 및 핵산의 방출을 허용하였다. RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 하이 퓨어 FFPE RNA 마이크로 키트 (로슈 어플라이드 사이언스스, 인디애나주 인디아나폴리스 소재)를 사용하여 단리되었다.
유전자-발현 분석은 이전에 기재된 바와 같이 바이오마크(BioMark) HD 실시간 PCR 플랫폼 (플루이다임)을 사용하여 수행되었다(Shames, D.S., et al. (2013) PLoS ONE 8:e56765). 발현 패널 내 모든 Taq-man 검정은 FAM-MGB이었고 그리고 네 개의 참조 유전자를 포함하여, 주문자-제작 또는 맞춤-설계된 라이프 테크놀로지스를 통해 정돈되었다: SP2, GUSB, TMEM55B 및 VPS33B. 네 개의 참조 유전자 (SP2, GUSB, TMEM55B 및 VPS33B)에 대한 Ct 값의 기하학적 중앙이 각 샘플에 대해 계산되었고 그리고 발현 수준은 아래와 같이 델타 Ct (DCt) 방법을 사용하여 결정되었다: Ct (표적 유전자) 2 지오메디안(GeoMedian) Ct (참조 유전자). 연구 대상 환자 전체의 (면역칩 (iChip)에 의해 계측된) 중앙 mRNA 발현 수준은 높은-발현 대 낮은-발현 범주화를 도출하기 위한 컷오프로 사용되었다. P 값은 t 시험에 의해 계측되었다.
PD-L1 면역조직화학 (IHC): 종양 샘플 또는 암 세포주의 포르말린-고정 파라핀-포매된 (FFPE) 섹션이 분석되었다.
포르말린-고정된, 파라핀-포매된 조직 섹션은 항원 회수, 차단 및 1차 항 PD-L1 항체로 항온처리 전에 탈파라핀화되었다. 2차 항체로 항온처리 및 효소 색상 전개에 따라, 섹션은 대조염색되고 그리고 커버슬립핑 전에 알코올 및 자일렌의 연속적으로 탈수된다.
하기 프로토콜이 IHC에 대해 사용되었다. 4-mm 두께의 포르말린-고정된, 파라핀- 포매된 (FFPE) 조직 절편이 디아미노벤지딘에 의한 신호 가시화로, 4.3mg/ml의 농도를 사용하는 자동화된 염색 플랫폼에서 항-인간 PD-L1 래빗 단클론성 항체로 PD-L1에 대해 염색되었고; 절편은 하에마톡실린으로 대조-염색되었다. PD-L1 발현은 하기 평점 반응식을 사용하여 종양-침윤하는 면역 세포에 대해 평가되었다:
Figure pct00003
벤타나 벤치마크 XT 또는 벤치마크 울트라 시스템이 하기 시약 및 물질을 사용하여 PD-L1 IHC 염색을 수행하기 위해 사용되었다:
1차 항체: 항- PD-L1 래빗 단클론성 1차 항체
시료 유형: 염색 세기가 변하는 조직 샘플 및 대조군 세포 펠렛의 포르말린-고정 파라핀 포매된 (FFPE) 섹션
절차 종류: 인간
기구: 벤치마크 XT 또는 벤치마크 울트라
에피토프 회수 조건: 세포 컨디셔닝, 표준 1 (CC1, 벤타나, cat # 950-124)
1차 항체 조건: 1/100, 36℃에서 6.5μg/ml/16분
희석제: 항체 희석 완충액 (운반 단백질 및 Brig-35를 함유하는 트리스-완충된 염수)
음성 대조군: 6.5μg/ml (셀 시그날링) 또는 희석제 단독으로 순수 래빗 IgG
검출: 옵티뷰 또는 울트라뷰 유니버셜 DAB 검출 키트 (벤타나), 및 증폭 키트 (적용 가능하면)가 제조자의 설명서 (벤타나)에 따라 사용되었다.
대조염색: 벤타나 헤마톡실린 II (cat # 790-2208)/청분 시약 (Cat # 760-2037)을 가짐 (각각 4분 및 4분)
벤치마크 프로토콜은 아래와 같다:
1. 파라핀 ( 선택됨 )
2. 탈파라핀화 ( 선택됨 )
3. 세포 컨디셔닝 ( 선택됨 )
4. 컨디셔너 #1 ( 선택됨 )
5. 표준 CC1( 선택됨 )
6. Ab 항온처리 온도 ( 선택됨 )
7. 36C Ab Inc. ( 선택됨 )
8. 적정 ( 선택됨 )
9. 오토-분배하고 ( 1차 항체 ), 그리고 ( 16분) 동안 배양한다
10. 반대염색 (선택된 )
11. 1 방울의 (헤마톡실린 II ) ( 반대염색 )을 적용하고, 커서슬립을 적용하고, 그리고 (4분) 동안 배양한다
12. 후 대조염색 (선택된 )
13. 1방울의 ( 청분 시약 ) ( 후 반대염색 )을 적용하고, 커서슬립을 적용하고, 그리고 (4분) 동안 배양한다
14. 비눗물로 슬라이드를 세척하여 오일을 제거한다
15. 물로 슬라이드를 헹군다
16. 95% 에탄올, 100% 에탄올에서 자일렌 (레이카 자동염색기 프로그램 # 9)을 통해 슬라이드를 탈수한다
17. 슬립을 덮는다.
결과
OX40은 활성화된 CD4 T 세포 (Teff) 및 T 조절 (Treg) 세포 상에서 발현된 공통자극 분자가 되는 것으로 공지된다. OX40은 비처리 T 세포에서 구성적으로 발현되지 않지만, T 세포 수용체 (TCR)의 참여 이후 유도된다. TCR 자극의 존재하에 OX40의 결찰은 Teff 세포의 활성화 효력증강 및 Treg 세포 억제의 이중 기전을 통해 T 효과기 세포 기능을 증진시키는 것으로 공지된다. 항-OX40 치료는 시험관내 Treg 억제 검정에서 Treg 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 결과는 OX40 효능제 치료가 몇 개의 계측적 T 세포 기능을 조절할 수 있음을 입증한다.
PD-L1 신호전달의 억제는 급성 및 만성적 (예를 들면, 지속적) 감염 모두를 포함하는 암 (예를 들면, 종양 면역력) 및 감염의 치료를 위한 T 세포 면역력을 증진시키는 수단으로서 제안되어 왔다.
본 발명자들은 종양내의 T 세포가 PD-1 및 OX40을 발현하는지 여부를 조사하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 종양내의 CD8+ T 세포는 PD-1과 같은 억제성 수용체를 발현하였지만, 이들 세포의 많은 부분이 또한 OX40을 발현하였다. 이 결과는 T효과기 세포의 OX40 자극이 T 세포에서 발현되는 PD-1 및 다른 억제성 수용체의 효과를 방해할 수 있음을 시사한다.
항-OX40 효능제 항체 (단일 제제)로의 치료는 CD45+ 세포 (CD45는 모든 조혈 세포, 예컨대 백혈구를 정의한다; 도 2A)의 총 수에 대한 종양내의 Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 유의미하게 감소하였을 뿐만 아니라 종양내의 Foxp3+ Treg의 절대 수를 유의미하게 감소하였다 (도 2B). 또한, 항-OX40 효능제 항체 및 항-PDL1 길항제 항체의 조합으로의 치료는 CD45+ 세포의 총 수에 대한 종양내의 Foxp3+ 조절 T 세포의 비율 (도 2A) 뿐만 아니라 종양내의 Foxp3+ Treg의 절대 수를 유의미하게 감소시켰다 (도 2B). 이들 결과는 OX40 효능제가 항-PDL1 길항제와 조합하여 투여될 때 종양내의 Foxp3+ Treg의 OX40 효능제-매개된 감소가 유지되었다는 것을 입증했다.
본 발명자들은 PD-L1 발현에 대한 OX40 효능제 치료의 효과를 조사하였다. 항-OX40 효능제로의 치료는 종양 세포 및 종양내의 골수 세포에서 PD-L1 발현을 유의미하게 증가하여, PD-L1이 음성 피드백 방식으로 항-OX40 효능을 제한할 수 있다는 것을 시사한다 (도 3A&B). 이론에 의한 구속됨 없이, 이들 결과는 OX40 효능제로의 치료는 PD-L1 발현을 증가하였기 때문에, OX40 효능제로 치료는 PD-1 축 억제제로의 치료를 증진할 수 있다는 것을 시사한다. 임상 데이터는 증가된 PDL1 발현을 PD1 축 길항제 (예를 들면, 항-PD-L1 길항제 항체)에 대한 반응을 풍부하게 하는 것으로 연관시킨다.
항-OX40 효능제 항체 및 항-PDL1 길항제 항체로 치료는 CT26 및 MC38 결장직장암 동계의 종양 모델에서 상승작용적 조합 효능을 입증한다 (도 4A&B, 5A&B). (각 실험; 도 4B, 5B에서 개별적인 마우스로부터) 개별적인 종양 부피 측정의 분석은 조합 치료된 동물은 어느 하나 제제 (OX40 효능제, PDL1 길항제) 단독으로 치료된 동물과 비교하여 더 높은 빈도로 유의미한 종양-크기 감소를 나타냈다는 것을 드러냈다. 또 다른 방법으로, 부분 및 경쟁 반응을 갖는 동물의 빈도는 어느 하나의 제제 단독으로 치료된 동물과 비교하여 조합 치료된 동물에서 유의미하게 높다.
조합 치료된 CT26 마우스로부터 취해진 말초 혈액의 분석은 효과기 세포 증식 및 염증성 T 세포 마커의 증가를 드러냈다 (도 9A, B, C, &D). CD8+ T 세포의 증식 수준(도 9A), Treg 세포 (도 9B), 혈장 인터페론 감마 수준 (도 9C) 및 활성화 T 세포 (도 9D)를 측정하였다. (어느 하나의 단일 제제 군에 비해) 조합 군에서 증식 (Ki67), 혈장 인터페론 감마, 및 염증성 마커 (Tbet, CXCR3)에서의 증가는 aPDL1 (관문 봉쇄) 및 aOX40 (공동-자극) 활성의 상승작용을 드러냈다.
특이적으로, (ki67+/총 CD8+ T 세포의 백분율로 표현된) 증식한 CD8+ T 세포의 수준은 OX40 효능제 또는 PDL1 길항제 단독으로 치료 대비 OX40 효능제 및 PD-L1 길항제의 조합으로 치료된 동물에서 유의미하게 증가되었다 (도 9A). 조합-치료된 동물에서 증식한 CD8+ T 세포의 수준은, PD-1 축 억제와 조합한 OX40 효능제 치료의 상승작용 효과는 말초 혈액 마커 및 세포의 분석에 의해 검출될 수 있다는 것을 입증하는, 단일-제제 치료된 집단의 부가적 효과보다 더 컸다.
또한, 감소된 말초 혈액 Tregs는 OX40 효능제 단일 제제로 치료에서 관측되었고 그리고 말초 혈액 Tregs에서 감소는 (OX40 효능제 및 PDL1 길항제)의 병용 요법 군에서 유지되었다 (도 9B). 증가된 혈장 감마 인터페론은 OX40 효능제 및 PDL1 길항제의 조합으로 관측되었다 (도 9C).
케모카인 수용체 CXCR3는 CXC 케모카인 수용체 계열에서 Gαi 단백질-커플링된 수용체이다. CXCR3의 두 변이체가 있다:　CXCR3-A는 CXC 케모카인 CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), 및 CXCL11 (I-TAC)에 결합하고, 반면에 CXCR3-B는 또한 CXCL9, CXCL10, 및 CXCL11에 부가하여 CXCL4에 결합할 수 있다 (Clark-Lewis, I., et al. (2003) J. Biol . Chem . 278(1):289-95). CXCR3는 활성화된 T 림프구 및 NK 세포, 및 일부 상피 세포 상에서 주로 발현된다. CXCR3 및　CCR5는 Th1 세포 상에서 우선적으로로 발현되고, 효과기 기억 CD8 T 세포 상에서 상향조절된다 (Groom, J.R. and Luster, A.D. (2011) Exp . Cell Res.317(5):620-31). CXCR3는 백혈구 추적를 조절할 수 있다. CXCR3에 대한 케모카인의 결합은 다양한 세포성 반응, 무엇보다도 염증성 세포의 인테그린 활성화, 세포골격 변화 및 화학 주성 이동을 유도한다 (Groom, J.R. and Luster, A.D. (2011) Exp. Cell Res.317(5):620-31).
활성화된 T 세포 (특이적으로, CXCR3 마커를 사용하여 결정된, 활성화된 기억 Teff 세포)의 수준이 OX40 효능제 또는 PDL1 길항제 단독으로 치료 대비 OX40 효능제 및 PD-L1 길항제의 조합으로 치료된 동물에서 유의미하게 증가되었다 (도 9D). 조합-치료된 동물에서 T 기억 효과기 세포 (CXCR3+)의 수준은, PD-1 축 억제와 조합한 OX40 효능제 치료의 상승작용 효과는 말초 혈액 마커 및 세포의 분석에 의해 검출될 수 있다는 것을 입증하는, 단일-제제 치료된 집단의 부가적 효과보다 더 컸다. 병용 치료 군에서 CD8 T 세포에서 증식 (Ki67) 및 염증성 마커 (CXCR3)에서의 증가는 항-PDL1 (관문 봉쇄) 및 항-OX40 (공동-자극) 활성의 상승작용을 통해 세포독성의 증진을 시사할 수 있다.
또한, 병용 치료 효과는 (예를 들면, 어느 하나 제제 단독으로 치료된 샘플 대비 조합 치료된 종양 샘플에서 분석된 rtPCR (플루이다임)에 의해, 효과기 및 염증성 T 세포 마커에서 증가에 의해 검지되었다. 예를 들어, Treg (Fox3p), CD8+ Teffs (CD8b), 및 활성화된 T 세포 (예를 들면, Tbet, CXCR3, 예를 들면, 인터페론 감마 반응-관련된 유전자)에 대한 마커가 분석될 수 있다.
실험은 CT26 결장직장암 동계의 종양 모델에서 OX40 효능제 항체 치료의 용량- 반응 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 항-OX40 효능제 항체 단일 제제 치료는 용량 반응성을 나타낸다 (도 6A, B). 0.1mg/ml 용량은 하위-최대 효능을 보였고, 그리고 추가의 병용 치료 실험을 위해 선택되었다.
도 7A 및 B는 어느 하나 제제 단독으로 치료에 비교하여, 항-PDL1 길항제 항체와 조합한 항-OX40 효능제 항체의 치료-이하 용량으로 치료의 결과를 나타낸다. 상승작용 조합 효능이 관측되어, OX40 효능제 항체 최대 유효한 용량이 PD-1 축 길항제와 조합하여 치료될 때 낮아질 수 있다는 것을 시사한다.
도 8A 및 B는 어느 하나 제제 단독으로 치료에 비교하여, 항-PDL1 길항제 항체와 조합한 항-OX40 효능제 항체의 치료-이하 수준의 단회 용량으로 치료의 결과를 나타낸다. 상승작용 조합 효능이 관측되어, OX40 효능제 항체 최대 유효한 용량은 OX40 효능제 항체가 PD-1 축 길항제와 조합하여 제공될 때 낮아질 수 있다는 것을 시사한다.
도 10은 요상피 방광암 (UBC) 및 비-소세포 폐암 (NSCLC)이 있는 인간 환자로부터 암 샘플에서 PDL1 진단 상태와 OX40 발현의 연관을 도시한다. 조직 샘플은, 항-PD-L1 항체, MPDL3280A로의 1상 임상 시험에 참여한 환자 유래의 것이다. 종양 침윤 면역 세포 (IC)의 PD-L1 바이오마커 상태를 본원에 개시된 IHC를 사용하여 계측하였다. OX40 발현 수준을, rtPCR 분석 (Fluidigm)을 사용하여 계측하였다. UBC에서, OX40 발현이 0 또는 1의 PDL1 IHC 상태를 갖는 환자에서 관측되었다. OX40 발현의 수준은 PDL1 IHC 상태와 상관관계가 있었고, 증가된 OX40 발현과 상관관계가 있는 증가된 PDL1 발현과 상관관계가 있었다. NSCLC에서, OX40의 발현은 (2 및 3의 PDL1 IHC 상태를 갖는 샘플에서뿐만 아니라) IHC에 의한 낮은 또는 무 PDL1 발현을 갖는 환자에서 관측되었다. 이들 결과는 (a) PDL1 IHC 0 및/또는 1 상태를 갖는 환자에서 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 병용 치료로 개선된 반응에 대한 포텐셜; (b) PD-1 축 결합 길항제 치료 전에 반응하지 않는 환자에서 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 병용 치료로 개선된 반응에 대한 포텐셜; 및 (c) PDL1 IHC 2 및/또는 3 상태를 갖는 환자에서 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제 (예를 들면, 항-인간 OX40 효능제 항체)로 병용 치료로 개선된 반응에 대한 포텐셜을 시사한다.
암의 치료에서 사용하기 위한 항-PD-L1 항체 MPDL3280A를 평가하는 임상 연구의 결과는 PD-L1 발현이 MPDL3280A에 대한 임상 반응과 관련되었다는 것을 시사했다. 치료 반응과 종양 침윤하는 면역 세포 PDL1 발현의 연관은 종양 세포 PDL1 발현과의 연관보다 강력하게 나타났다는 것이 발견되었다. 종양 침윤하는 면역 세포는 IFNg 발현에 보다 감수성일 수 있고 그리고 요법 전에 기존의 T 세포 반응을 억제하기 위해 우선적으로 작용할 수 있다 (Herbst, R.S., et al (2014) Nature 515:563-7). 이론에 의한 구속됨 없이, OX40 효능제 치료는 IFNg 발현을 증가할 수 있어, 종양 침윤하는 면역 세포에서 증진된 PDL1 발현 및 PD-1 축 결합 길항제 치료에 대한 수반되는 증가된 반응성을 유도하는 것으로 생각된다. OX40 결합 효능제 및 PD-1 축 결합 길항제를 포함하는 병용 치료는 따라서 보다 낮은 PDL1 바이오마커 상태를 갖는 환자의 치료에 유용할 수 있다.
IHC에 의한 PD-L1 발현 평점: 종양 시료에 PD-L1 발현의 존재 또는 부재는 IHC에 의해 인간 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 (FFPE) 조직에서 PD-L1을 검출할 수 있는 항-PD-L1 특이적 항체를 사용하여 평가되었다. 종양 샘플 내 PD-L1의 상대적인 발현을 측정하고 정량하기 위해, PD-L1 IHC 평점 체계가 발전되어 종양 세포 및 종양 침윤하는 면역 세포에서 PD-L1 특이적 신호를 측정하였다. 면역 세포는 림프양 및/또는 대식세포/조직구 형태학을 갖는 세포로 정의된다.
종양 세포 염색은 임의의 세기의 막성 염색을 나타내는 모든 종양 세포의 퍼센트로 표현된다. 침윤하는 면역 세포 염색은 임의의 세기의 염색을 나타내는 면역 세포에 의해 점거된 총 종양 면적의 퍼센트로 정의된다. 총 종양 면적은 주요 종양 덩어리에 바로 인접하고 이와 접하는 면역-침윤물의 영역을 포함하여, 종양 관련 간질뿐만 아니라 악성 세포를 포함한다. 또한, 침윤하는 면역 세포 염색은 모든 종양 침윤하는 면역 세포의 퍼센트로 정의된다.
종양 조직에서 PD-L1 염색 세기의 다양한 동적 범위가 있었다. 세포 이하의 국재화에 무관하게, 신호는 또한 강한, 중간 정도, 약한, 또는 음성 염색으로 분류되었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 음성 신호 세기는 HEK-293 세포를 사용하여 예시된 바와 같이, 임의의 검출가능한 신호의 부재에 의해 특성규명되었다 (도 11A). 그에 반해서, 양성 신호 세기는 재조합 인간 PD-L1으로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용하여 예시된 바와 같이, 금색에서 진한 갈색 막 염색에 의해 특성규명되었다(참고 도 11B-D). 마지막으로, 양성 신호 세기는 또한 태반 영양막의 염색 (도 11E) 및 편도선의 영역에서 강한 염색 (도 11F)에 의해 예시되고 그리고 때로는 금색에서 진한 갈색 막 염색에 의해 특성규명된 막성 패턴에서 예시된다. 종양 조직, PD-L1 음성 샘플은 20 × 객관적인 것을 사용하여 평가될 때 검출가능하지 않은 신호 또는 단지 약한 세포질 배경 염색만을 갖는 것으로 자격이 부여되었다. 그에 반해서, PD-L1 양성 샘플은 주로 종양 세포 및/또는 침윤하는 면역 세포에서 막성 염색을 입증하였다. PD-L1 염색은 미세한, 밝은-갈색 막으로 된 약한 것에서부터 낮은 배율에서도 쉽게 기술적으로 인식되는 진한-갈색 두꺼운 막으로 된 강한 것으로의 가변 세기로 관측되었다.
세 가지 대표적인 PD-L1 양성 종양 샘플이 도면에 도시되었다. 12. 삼중-음성 유방암에 대해, 대부분의 종양 세포는 막성 및 세포질 염색의 조합을 나타내는 PD-L1에 대해 강력하게 양성이었다는 것이 관측되었다 (100x 배율) (도 12A). 악성 흑색종에 대해, PD-L1에 대한 막성 염색이 있는 이들의 일부 및 PD-L1에 대한 막성 염색이 있는 희귀 종양 세포 (화살표)로, 면역 세포의 클러스터가 관측되었다 (400x 배율) (도 12B). NSCLC, 선암종에 대해, PD-L1에 대해 강한 염색을 갖는 면역 세포의 클러스터가, PD-L1에 대해 막성 및/또는 세포질 염색을 갖는 몇 개의 종양 세포 (화살표)로 관측되었다 (400x 배율) (도 12C).
양성인 경우에서의 염색은 공간적 분포 및 세기에 관해 초점이 있는 경향이 있었다. 임의의 세기의 염색을 나타내는 종양 또는 면역 세포의 백분율은 PD-L1 상태를 결정하기 위해 시각적으로 추정되고 사용된다. 이소형 음성 대조군은 시험 샘플에서 배경의 존재를 평가하기 위해 사용되었다.
염색은 H&E에 대한 하나의 시리즈 조직 절편, 항- PD-L1에 대한 제2 시리즈 조직 절편 및 이소형 음성 대조군에 대한 제3 시리즈 조직 절편을 필요로 했다. PD-L1-형질감염된 HEK-293 세포주 대조군 또는 편도 슬라이드는 시험 대조군 및 검정 특이성을 위한 참조로 사용되었다.
PDL-1 상태 기준
Figure pct00004
상기에 나타난 표는 PDL1 상태를 결정하기 위해 PDL1 염색 기준을 사용하는 하나의 구현예를 기술한다. 또 다른 구현예에서, IHC 0 및/또는 1의 IHC 스코어를 갖는 샘플은 PDL1 음성으로 고려될 수 있으며, 반면 IHC 2 및/또는 3의 IHC 스코어를 갖는 샘플은 PDL1 양성으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 자체에서 PDL1 발현 (예를 들면, PDL1 염색)이 평가되었다.
일부 경우에서, PD-L1 양성 상태는 종양 세포, 관련된 종양내의, 및 인접 주위-종양의 결합조직형성 간질에 의해 점거된 종양 면적의 최대 50%에서 종양 세포 또는 종양 침윤하는 면역 세포 중 어느 하나에서 임의의 세기의 인식할 수 있는 PD-L1 염색의 존재를 포함할 수 있다. 따라서, PD-L1 양성 염색은 임의의 세기의 염색을 나타내는 종양 세포 또는 종양 침윤하는 면역 세포의 50%로 높이 포함한다.
항-PD-L1로 염색된 평가가능한 슬라이드는 상기에서 기재된 바와 같이 평가되었다. 음성 염색 세기는 (갈색 또는 황갈색 이외의) 옅은 회색에서 청색으로 특성규명된 신호 또는 임의의 검출가능한 신호의 부재 및 막 증진의 부재에 의해 특성규명되었다. 만일 막 염색이 없는 (예를 들면, 부재인) 경우 음성이었다.
비록 전술한 발명이 이해의 명확함을 위해 설명 및 실시예로서 일부 상세히 기재되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시내용은 명확히 그 전체가 참고로 편입된다.
<110> Genentech, Inc. Cheung, Jeanne Huseni, Mahrukh Kim, Jeong <120> COMBINATION THERAPY COMPRISING OX40 BINDING AGONISTS AND PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS <130> 146392630640 <150> US 62/093,400 <151> 2014-12-17 <150> US 62/080,991 <151> 2014-11-17 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 115 120 125 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 13 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = Asp or Gly <400> 14 Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Ser or Leu <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa = Thr or Ser <400> 15 Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 16 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa = Asp or Val <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa = Ala or Phe <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa = Val or Leu <400> 20 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Phe or Thr <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = Tyr or Ala <400> 21 Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa = Tyr, Gly, Phe or Ser <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Leu, Tyr, Phe or Trp <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa = Tyr, Asn, Ala, Thr, Gly, Phe or Ile <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = His, Val, Pro, Thr or Ile <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Xaa = Ala, Trp, Arg, Pro or Thr <400> 22 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 25 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 29 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 30 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 31 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 32 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 33 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 34 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 35 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 44 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 45 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 48 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro 115 120 <210> 49 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 50 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 1 5 10 15 Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln 20 25 30 Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val 35 40 45 Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp 85 90 95 Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala 100 105 110 Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln 115 120 125 Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro 130 135 140 Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr 145 150 155 160 Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr 165 170 175 Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly 180 185 190 Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala 195 200 205 Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys 210 215 220 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala 225 230 235 240 Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 245 <210> 61 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 62 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125

Claims (124)

  1. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법으로서,
    유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 개체는 암을 가지거나 또는 암으로 진단되었고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플 내 상기 암 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는, 이것이 상기 샘플 중 0%를 포함할 경우, 상기 샘플 내 부재인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 측정된 단백질 발현에 의해 계측되는, 방법.
  4. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법으로서,
    유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 개체는 암을 가지거나 또는 암으로 진단되었고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플 내 상기 암 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는, 이것이 상기 샘플 중 0%보다 많이 포함할 경우, 상기 샘플 내 존재하는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 상기 샘플 중에 0% 내지 1%로 검출되는, 방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 샘플 중에 0% 내지 5%로 검출되는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 계측된 단백질 발현에 의하여 상기 샘플 내 검출되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 항-PDL1 항체를 사용하여 검출되고, 그리고 상기 PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 약한 염색 세기로서, IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기로서, 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로서 검출되는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 항-PDL1 항체를 사용하여 검출되고, 그리고 상기 PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기로서 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로서 검출되는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 IHC 0 또는 IHC1의 IHC 스코어를 가지는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 내성인 암을 갖는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 난치성인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PDL1 결합 길항제, 및 PDL2 결합 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 이의 리간드 결합 상대로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL1으로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL2로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL1 및 PDL2 둘 모두로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제가 항체인, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 니볼루맙인, 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 펨브로리주맙인, 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 CT-011인, 방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 AMP-224인, 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PDL1 결합 길항제인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 PD-1으로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 B7-1으로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 PD-1 및 B7-1 둘 모두로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제가 항-PDL1 항체인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체가 단클론성 항체인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 항-PDL1 항체는 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편인, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI4736.
  34. 제25항에 있어서, 상기 항체는 GFTFSDSWIH (서열 번호:1)의 HVR-H1 서열, AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:2)의 HVR-H2 서열, 및 RHWPGGFDY (서열 번호:3)의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 RASQDVSTAVA (서열 번호:4)의 HVR-L1 서열, SASFLYS (서열 번호:5)의 HVR-L2 서열, 및 QQYLYHPAT (서열 번호:6)의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 항체는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 7) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  36. 제14항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PDL2 결합 길항제인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 PDL2 결합 길항제는 항체인, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 PDL2 결합 길항제는 면역접합체인, 방법.
  39. 제20항, 제29항 내지 제35항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 EU 넘버링에 따른 위치 297에 Asn 내지 Ala 치환을 갖는 인간 IgG1인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 OX40 효능제 항체, OX40L 효능제 단편, OX40 올리고머성 수용체, 및 OX40 면역접합체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 인간 OX40에 결합하는 OX40 효능제 항체인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 OX40 효능제 항체가 MEDI6469, MEDI0562, 또는 MEDI6383인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 OX40 효능제 항체는 전장 인간 IgG1 항체인, 방법.
  44. 제1항 내지 제40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 길항제가 삼량체 OX40L-Fc 단백질인, 방법.
  45. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는 OX40L 효능제 단편인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막 암, 결장암, 신장암, 식도암, 전립선암, 결장직장암, 교모세포종, 신경교세포종, 또는 간세포 암종인, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 치료의 중단 후에 상기 개체에서 지속된 반응을 유발하는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 상기 PD-1 축 결합 길항제 전에, 상기 PD-1 축 결합 길항제와 동시에, 또는 상기 PD-1 축 결합 길항제 후에 투여되는, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  50. 암을 갖는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법으로서,
    유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 개체는 암이 있는 것으로 진단되었고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 상기 암 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는, 이것이 상기 샘플 중 0%를 포함할 경우, 상기 샘플 내 부재하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 측정된 단백질 발현에 의해 계측되는, 방법.
  53. 암을 갖는 개체에서 면역 기능을 증진시키는 방법으로서,
    유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제를 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 개체는 암이 있는 것으로 진단되었고, 그리고 상기 개체 유래 암의 종양 샘플 내 상기 암 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는, 이것이 샘플 중 0%보다 많이 포함할 경우, 상기 샘플 내 존재하는, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 상기 샘플 중에 0% 내지 1%로 검출되는, 방법.
  56. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 상기 샘플 중에 0% 내지 5%로 검출되는, 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 계측된 단백질 발현에 의한 상기 샘플 내 검출되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 항-PDL1 항체를 사용하여 검출되고, 그리고 상기 PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 약한 염색 세기로서, IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기로서, 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로서 검출되는, 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 PD-L1 바이오마커는 항-PDL1 항체를 사용하여 검출되고, 그리고 상기 PD-L1 바이오마커는 IHC에 의해 중간 정도의 염색 세기로서 또는 IHC에 의해 강한 염색 세기로서 검출되는, 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 IHC 0 또는 IHC1의 IHC 스코어를 가지는, 방법.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 내성인 암을 갖는, 방법.
  62. 제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 PD-1 축 결합 길항제에 난치성인, 방법.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체 내 CD8 T 세포는 PD-1 축 결합 길항제 및 OX40 결합 효능제의 투여 전에 비하여, 증진된 프라이밍, 활성화, 증식 및/또는 세포용해 활성을 가지는, 방법.
  64. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD8 T 세포의 수는 상기 조합의 투여 전에 비하여 상승되는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 CD8 T 세포는 항원-특이적 CD8 T 세포인, 방법.
  66. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 기능은 상기 조합의 투여 전에 비하여 억제되는, 방법.
  67. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 고갈은 상기 조합의 투여 전에 비하여 감소되는, 방법.
  68. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, Treg의 수는 상기 조합의 투여 전에 비하여 감소되는, 방법.
  69. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 인터페론 감마는 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가되는, 방법.
  70. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 기억 T 효과기 세포의 수준은 상기 조합의 투여 전에 비하여 증가되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 기억 T 효과기 세포의 수준의 상기 증가는 말초 혈액에서 검출되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 기억 T 효과기 세포의 상기 수준 증가의 검출은 CXCR3 발현 세포의 검출에 의한 것인, 방법.
  73. 제50항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제, PDL1 결합 길항제, 및 PDL2 결합 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PD-1 결합 길항제인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 이의 리간드 결합 상대로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL1으로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL2으로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PDL1 및 PDL2 둘 모두로의 PD-1의 결합을 억제하는, 방법.
  79. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제가 항체인, 방법.
  80. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 니볼루맙인, 방법.
  81. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 펨브로리주맙인, 방법.
  82. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 CT-011인, 방법.
  83. 제74항에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 AMP-224인, 방법.
  84. 제73항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PDL1 결합 길항제인, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 PD-1으로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 B7-1으로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  87. 제84항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 PD-1 및 B7-1 둘 모두로의 PDL1의 결합을 억제하는, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제가 항-PDL1 항체인, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체가 단클론성 항체인, 방법.
  90. 제88항에 있어서, 항-PDL1 항체는 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편인, 방법.
  91. 제88항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, 방법.
  92. 제84항에 있어서, 상기 PDL1 결합 길항제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI4736.
  93. 제88항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체는 GFTFSDSWIH (서열 번호:1)의 HVR-H1 서열, AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:2)의 HVR-H2 서열, 및 RHWPGGFDY (서열 번호:3)의 HVR-H3 서열을 포함하는 중쇄; 및 RASQDVSTAVA (서열 번호:4)의 HVR-L1 서열, SASFLYS (서열 번호:5)의 HVR-L2 서열, 및 QQYLYHPAT (서열 번호:6)의 HVR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
  94. 제88항에 있어서, 상기 항-PDL1 항체는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:7) 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (서열 번호:8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열 번호:9)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  95. 제79항, 제88항 내지 제91항, 제93항 및 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 EU 넘버링에 따른 위치 297에 Asn 내지 Ala 치환을 갖는 인간 IgG1인, 방법.
  96. 제73항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제가 PDL2 결합 길항제인, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 PDL2 결합 길항제는 항체인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 PDL2 결합 길항제는 면역접합체인, 방법.
  99. 제50항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 OX40 효능제 항체, OX40L 효능제 단편, OX40 올리고머성 수용체, 및 OX40 면역접합체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 인간 OX40에 결합하는 OX40 효능제 항체인, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 OX40 효능제 항체가 MEDI6469, MEDI0562, 또는 MEDI6383인, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 OX40 효능제 항체는 전장 IgG1 항체인, 방법.
  103. 제50항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 길항제가 삼량체 OX40L-Fc 단백질인, 방법.
  104. 제50항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 OX40L의 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는 OX40L 효능제 단편인, 방법.
  105. 제50항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 난소암, 위암, 방광암, 췌장암, 자궁내막 암, 결장암, 신장암, 식도암, 전립선암, 결장직장암, 교모세포종, 신경교세포종, 또는 간세포 암종인, 방법.
  106. 제50항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 치료의 중단 후에 상기 개체에서 지속된 반응을 유발하는, 방법.
  107. 제50항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OX40 결합 효능제는 상기 PD-1 축 결합 길항제 전에, 상기 PD-1 축 결합 길항제와 동시에, 또는 상기 PD-1 축 결합 길항제 후에 투여되는, 방법.
  108. 제50항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 상기 OX40 결합 효능제는 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입으로, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여되는, 방법.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  111. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서의, 인간 PD-1 축 결합 길항제의 용도로서,
    상기 약제는 상기 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료는 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 상기 약제의 투여를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 용도.
  112. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서의, 인간 PD-1 축 결합 길항제의 용도로서,
    상기 약제는 상기 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료는 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 상기 약제의 투여를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 용도.
  113. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서의, OX40 결합 효능제의 용도로서,
    상기 약제는 상기 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료는 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 상기 약제의 투여를 포함하고 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 용도.
  114. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서의, OX40 결합 효능제의 용도로서,
    상기 약제는 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 치료는 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합된, 상기 약제의 투여를 포함하고 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 용도.
  115. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서,
    상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 상기 제2 조성물은 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인 조성물.
  116. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서,
    상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 상기 제2 조성물은 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 조성물.
  117. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서,
    상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 상기 제2 조성물은 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 조성물.
  118. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서,
    상기 치료는 제2 조성물과 조합하여 상기 조성물의 투여를 포함하고, 상기 제2 조성물은 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 그리고 상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 조성물.
  119. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 및 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 상기 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트로서,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 키트.
  120. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 및 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 상기 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트로서,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 키트.
  121. PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제1 약제 및 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제2 약제를 포함하는 키트로서,
    상기 키트는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 상기 제1 약제 및 상기 제2 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 추가로 포함하고,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 키트.
  122. PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제1 약제 및 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제2 약제를 포함하는 키트로서,
    상기 키트는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 상기 제1 약제 및 상기 제2 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 추가로 포함하고,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 키트.
  123. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 및 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 상기 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트로서,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하지 않는 것인, 키트.
  124. 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 OX40 결합 효능제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 및 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 상기 약제의 투여를 위한 설명서를 포함하는 포장 삽입물을 포함하는 키트로서,
    상기 개체 유래 상기 암의 종양 샘플 내 세포는 PD-L1을 발현하는 것인, 키트.
KR1020177016253A 2014-11-17 2015-11-16 Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법 Withdrawn KR20170096112A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462080991P 2014-11-17 2014-11-17
US62/080,991 2014-11-17
US201462093400P 2014-12-17 2014-12-17
US62/093,400 2014-12-17
PCT/US2015/060941 WO2016081384A1 (en) 2014-11-17 2015-11-16 Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170096112A true KR20170096112A (ko) 2017-08-23

Family

ID=54754793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177016253A Withdrawn KR20170096112A (ko) 2014-11-17 2015-11-16 Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20160166685A1 (ko)
EP (1) EP3221360A1 (ko)
JP (1) JP2017537090A (ko)
KR (1) KR20170096112A (ko)
CN (1) CN106999583A (ko)
AU (1) AU2015350242A1 (ko)
BR (1) BR112017010198A2 (ko)
CA (1) CA2967368A1 (ko)
IL (1) IL252251A0 (ko)
MX (1) MX2017006320A (ko)
RU (1) RU2017121096A (ko)
SG (2) SG11201703605QA (ko)
WO (1) WO2016081384A1 (ko)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI4209510T3 (fi) 2008-12-09 2024-03-22 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1-vasta-aineita ja niiden käyttö T-solutoiminnan tehostamiseksi
AU2014238546C1 (en) 2013-03-18 2019-01-17 Biocerox Products B.V. Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
EA035037B1 (ru) 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
AU2015241038A1 (en) 2014-03-31 2016-10-13 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and OX40 binding agonists
JP6702991B2 (ja) 2014-11-03 2020-06-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔ細胞免疫サブセットを検出するためのアッセイ及びその使用の方法
CN107109484B (zh) 2014-11-03 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 用于ox40激动剂治疗的功效预测和评估的方法和生物标志物
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
MX393976B (es) 2015-02-26 2025-03-21 Merck Patent Gmbh Inhibidores de muerte programada 1 (pd-19) /ligando de muerte programada 1 (pd-l1) para el tratamiento de cáncer.
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MY188049A (en) 2015-05-29 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof
HK1251474A1 (zh) * 2015-06-08 2019-02-01 豪夫迈‧罗氏有限公司 使用抗ox40抗體和pd-1軸結合拮抗劑治療癌症的方法
WO2016205277A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Merck Patent Gmbh Pd-l1 antagonist combination treatments
MX383464B (es) 2015-07-13 2025-03-14 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos anti-pd-1, anticuerpos anti-pd-1 activables, y métodos de uso de los mismos.
WO2017059168A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Heat Biologics, Inc. Compositions and methods for adjoining type i and type ii extracellular domains as heterologous chimeric proteins
RU2761115C1 (ru) 2015-10-02 2021-12-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела, специфические в отношении костимуляторного tnf-рецептора
WO2017118675A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7022993B2 (ja) 2016-01-11 2022-02-21 インヒブルクス インコーポレイテッド 多価かつ多重特異性の４１ｂｂ結合融合タンパク質
CN108883153A (zh) 2016-01-11 2018-11-23 印希比股份有限公司 多价和多特异性ox40结合融合蛋白
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) * 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
JP2019517511A (ja) * 2016-06-03 2019-06-24 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍を処置する方法において使用するための抗ｐｄ−１抗体
WO2018014260A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
JP7138094B2 (ja) 2016-08-25 2022-09-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト マクロファージ活性化剤と組み合わせた抗ｃｓｆ－１ｒ抗体の間欠投与
IL265762B2 (en) 2016-10-06 2024-04-01 Merck Patent Gmbh Dosing regimen of avelumab for the treatment of cancer
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
WO2018115051A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
US11332509B2 (en) 2017-02-27 2022-05-17 Shattuck Labs, Inc. Methods of making and using extracellular domain-based chimeric proteins
CN110290798B (zh) 2017-02-27 2024-04-05 沙塔克实验室有限公司 基于vsig8的嵌合蛋白
AU2018223822A1 (en) 2017-02-27 2019-07-11 Shattuck Labs, Inc. CSF1R-based chimeric proteins
CN108623686A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
MX2019012465A (es) 2017-04-20 2020-07-27 Adc Therapeutics Sa Terapia combinada con un conjugado de anticuerpo y farmaco anti-cd25.
CA3057748A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
SG11201909955XA (en) * 2017-05-02 2019-11-28 Merck Sharp & Dohme Formulations of anti-lag3 antibodies and co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
KR102442736B1 (ko) 2017-06-14 2022-09-16 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항-cd19 adc의 투여를 위한 투약량 체제
EP3704159A1 (en) * 2017-11-01 2020-09-09 Bristol-Myers Squibb Company Immunostimulatory agonistic antibodies for use in treating cancer
SG11202004158QA (en) 2017-12-28 2020-06-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
MY195411A (en) * 2017-12-29 2023-01-19 Ap Biosciences Inc Monospecific and Bispecific Proteins With Immune Checkpoint Regulation for Cancer Therapy
CN108218990B (zh) * 2017-12-29 2021-03-02 南京优迈生物科技有限公司 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用
TWI802633B (zh) 2018-01-15 2023-05-21 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對pd-1之單域抗體及其變異體
JP2021524449A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 分子アジュバント
JP7489922B2 (ja) 2018-05-23 2024-05-24 ベイジーン リミテッド 抗ｏｘ４０抗体及び使用方法
EP3837285A1 (en) 2018-08-13 2021-06-23 Inhibrx, Inc. Ox40-binding polypeptides and uses thereof
US10780121B2 (en) 2018-08-29 2020-09-22 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-based chimeric proteins
WO2020047322A1 (en) * 2018-08-29 2020-03-05 Shattuck Labs, Inc. Combination therapies comprising tim-3-based chimeric proteins
CN109053891B (zh) * 2018-09-17 2021-12-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用
WO2020081783A2 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 Medimmune, Llc Anti-ox40, anti-pd-l1 and anti-ctla-4 antibodies for treating tumors
WO2020084347A2 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Auckland Uniservices Combination of a kinase inhibitor and an immunotherapeutic agent, compositions and methods comprising the same
AU2019377456A1 (en) 2018-11-07 2021-05-27 Merck Sharp & Dohme Llc Co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies
EP3962947A2 (en) * 2019-05-03 2022-03-09 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancer with an anti-pd-l1 antibody
US20210030868A1 (en) * 2019-07-29 2021-02-04 Cai Gu Huang Formulation of antibody based drugs for treating lung cancer by inhalation
US20220390433A1 (en) * 2019-09-12 2022-12-08 Providence Health & Services - Oregon Methods of treatment with cd8 t cell-mediated immune therapy
WO2021062184A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Orionis Biosciences, Inc. Pd-l1 targeted chimeric proteins and uses thereof
WO2021098750A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Beigene (Beijing) Co., Ltd. Methods of cancer treatment with anti-ox40 antibody in comibinaiton with tlr agonists
GB201917254D0 (en) 2019-11-27 2020-01-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
CN113045655A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
SE544000C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequence, signal peptide sequence and nucleic acid sequence encoding a recombinant protein
SE544001C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequences, signal peptide sequences and nucleic acid sequences encoding heavy and light chains of an antibody
US20230277624A1 (en) * 2020-06-19 2023-09-07 Oncosec Medical Incorporated Methods of determining responsiveness to cancer immunotherapy
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
CN113999320B (zh) * 2021-11-02 2022-09-27 深圳先进技术研究院 以cd28和4-1bb为共刺激结构域的靶向cd276的嵌合抗原受体及其应用
AU2023375420A1 (en) * 2022-11-09 2025-06-19 Gmp Biotechnology Limited Anti-cancer agents
WO2025048887A1 (en) * 2023-09-01 2025-03-06 Inhibrx Biosciences, Inc. Ox40 agonist therapy
WO2025048860A1 (en) * 2023-09-01 2025-03-06 Inhibrx Biosciences, Inc. Ox40 agonist therapy

Family Cites Families (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH119431A (de) 1926-04-21 1927-03-16 Beck Sigmund Malerbürste.
US4018653A (en) 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4424279A (en) 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
EP0491007B1 (en) 1989-09-08 1996-03-13 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
ES2091684T3 (es) 1992-11-13 1996-11-01 Idec Pharma Corp Aplicacion terapeutica de anticuerpos quimericos y radiomarcados contra el antigeno de diferenciacion restringida de los linfocitos b humanos para el tratamiento del linfoma de las celulas b.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
DK0659439T3 (da) 1993-12-24 2002-01-14 Merck Patent Gmbh Immunkonjugater
IL112249A (en) 1994-01-25 2001-11-25 Warner Lambert Co Pharmaceutical compositions containing di and tricyclic pyrimidine derivatives for inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family and some new such compounds
US5654307A (en) 1994-01-25 1997-08-05 Warner-Lambert Company Bicyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
WO1996003397A1 (en) 1994-07-21 1996-02-08 Akzo Nobel N.V. Cyclic ketone peroxide formulations
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0817775B1 (en) 1995-03-30 2001-09-12 Pfizer Inc. Quinazoline derivatives
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
EP0831880A4 (en) 1995-06-07 2004-12-01 Imclone Systems Inc ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH
US6140332A (en) 1995-07-06 2000-10-31 Novartis Ag Pyrrolopyrimidines and processes for the preparation thereof
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
GB9603095D0 (en) 1996-02-14 1996-04-10 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997038983A1 (en) 1996-04-12 1997-10-23 Warner-Lambert Company Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
ATE227283T1 (de) 1996-07-13 2002-11-15 Glaxo Group Ltd Kondensierte heterozyklische verbindungen als protein kinase inhibitoren
EP2095873A1 (en) 1996-08-30 2009-09-02 Upfront Chromatography A/S Isolation of immunoglobulins
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
ATE549918T1 (de) 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
US20080318254A9 (en) 1997-03-10 2008-12-25 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US6002008A (en) 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1998050038A1 (en) 1997-05-06 1998-11-12 American Cyanamid Company Use of quinazoline compounds for the treatment of polycystic kidney disease
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
IL135622A0 (en) 1997-11-06 2001-05-20 American Cyanamid Co Use of quinazoline derivatives as tyrosine kinase inhibitors for treating colonic polyps
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
EP1068241B1 (en) 1998-04-02 2007-10-10 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
EA003786B1 (ru) 1998-11-19 2003-10-30 Варнер Ламберт Компани N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид - необратимый ингибитор тирозинкиназ
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK1167537T3 (da) 1999-03-30 2008-11-10 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP3690043A1 (en) 2000-10-06 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DK1354034T3 (da) 2000-11-30 2008-03-25 Medarex Inc Transgene transchromosomale gnavere til fremstilling af humane antistoffer
EP1463522A4 (en) 2001-05-16 2005-04-13 Einstein Coll Med HUMAN ANTIPNEUMOKOKKEN ANTIBODIES OF NON-THUMBAN ANIMALS
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
ES2375271T3 (es) 2001-08-23 2012-02-28 Genmab A/S Anticuerpos humanos espec�?ficos para interleuquina 15 (il-15).
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
WO2003106498A2 (en) 2002-06-13 2003-12-24 Crucell Holland, B.V. Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
RS51318B (sr) 2002-12-16 2010-12-31 Genentech Inc. Varijante imunoglobulina i njihova upotreba
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2004205898B2 (en) 2003-01-17 2009-11-19 The Research Foundation Of State University Of New York Pancreatic cancer associated antigen, antibody thereto, and diagnostic and treatment methods
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2005023177A2 (en) 2003-05-21 2005-03-17 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against bacillusanthracis protective antigen
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
MX337587B (es) 2003-11-05 2016-03-11 Glycart Biotechnology Ag Anticuerpos cd20 con funcion del efector y afinidad de enlace al receptor fc mejoradas.
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP2366717A3 (en) 2004-10-29 2011-12-14 University of Southern California Combination Cancer Immunotherapy with Co-Stimulatory Molecules
SI1877090T1 (sl) 2005-05-06 2014-12-31 Providence Health System Trimerni fuzijski protein OY40-imunoglobulina in postopki uporabe
EP3530736A3 (en) 2005-05-09 2019-11-06 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP2982379A1 (en) 2005-07-01 2016-02-10 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA2949772A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Pfizer Inc. Binding molecules to the human ox40 receptor
PT2242773T (pt) 2008-02-11 2017-09-15 Cure Tech Ltd Anticorpos monoclonais para o tratamento de tumores
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
CA2735006A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
FI4209510T3 (fi) 2008-12-09 2024-03-22 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1-vasta-aineita ja niiden käyttö T-solutoiminnan tehostamiseksi
RU2706200C2 (ru) 2009-11-24 2019-11-14 Медиммьюн Лимитед Специфические связывающие агенты против в7-н1
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
KR101719118B1 (ko) 2010-08-23 2017-03-22 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ox40 항체 및 그의 용도
PE20190262A1 (es) * 2011-08-01 2019-02-25 Genentech Inc Metodos para tratar el cancer por el uso de antagonistas de union al eje pd-1 e inhibidores de mek
RU2562874C1 (ru) 2011-08-23 2015-09-10 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Антитела против ох40 и способы их применения
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
CN103768596B (zh) * 2012-10-17 2016-06-22 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 用于肿瘤治疗的组合产品、其用途及相关方法
AU2014238546C1 (en) 2013-03-18 2019-01-17 Biocerox Products B.V. Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2967368A1 (en) 2016-05-26
MX2017006320A (es) 2017-08-10
EP3221360A1 (en) 2017-09-27
RU2017121096A (ru) 2018-12-19
US20170290913A1 (en) 2017-10-12
AU2015350242A1 (en) 2017-06-29
RU2017121096A3 (ko) 2019-10-17
WO2016081384A1 (en) 2016-05-26
US20160166685A1 (en) 2016-06-16
BR112017010198A2 (pt) 2017-12-26
IL252251A0 (en) 2017-07-31
SG11201703605QA (en) 2017-06-29
SG10201807625PA (en) 2018-10-30
CN106999583A (zh) 2017-08-01
JP2017537090A (ja) 2017-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20170096112A (ko) Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법
US20180303936A1 (en) Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
KR102447878B1 (ko) Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법
US12030946B2 (en) Therapeutic and diagnostic methods for cancer
CN106796235A (zh) 用于检测t细胞免疫子集的测定法及其使用方法
CN112585166A (zh) 用pd-1轴结合拮抗剂、铂剂和拓扑异构酶ii抑制剂治疗肺癌的方法
US20210208145A1 (en) Diagnostic and therapeutic methods for triple-negative breast cancer
KR20230025691A (ko) 삼중 음성 유방암을 치료하기 위한 방법과 조성물
HK40050244A (en) Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
HK1241729A1 (en) Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
HK1230525A1 (en) Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
HK1238715B (zh) 用於檢測t細胞免疫子集的測定法及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170614

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PC1203 Withdrawal of no request for examination