ES2808654T3 - Proteínas de unión anti-LAG-3 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo capaz de unirse al gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) y que comprende a) la cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO. 4 y b) la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO. 9.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión anti-LAG-3

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno, en particular a anticuerpos que se unen al gen de activación de linfocitos (LAG-3) y producen reducción de linfocitos T activados que expresan LAG-3, a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de unión a antígeno, a composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de unión a antígeno y al uso de dichas proteínas de unión a antígeno en el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas con la implicación de linfocitos T patógenos.

Antecedentes de la invención

El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) es un receptor coestimulador negativo que modula la homeostasis, proliferación y activación de los linfocitos T (Sierro S et al; Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101). Un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, LAG-3, es una proteína de tipo CD4 que, como el CD4, se une a las moléculas de MHC de clase II pero con una afinidad dos veces mayor y en un sitio distinto del CD4 (Huard B et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9). Además de ejercer funciones muy distintas (el CD4 es una molécula coestimuladora positiva), los dos receptores también están regulados de forma diferente. El CD4 se expresa de forma constitutiva en la superficie de todos los linfocitos T CD4+ maduros y únicamente una fracción pequeña reside en el interior de la célula, mientras que una gran proporción de moléculas LAG-3 quedan retenidas en la célula cerca del centro organizador de microtúbulos y solo se inducen después de la activación de los linfocitos T específicos de antígeno (Woo SR et al., (2010) Eur J Immunol 40: 1768-77). El papel de LAG-3 como regulador negativo de las respuestas de los linfocitos T se basa en estudios con ratones defectivos en LAG-3 y el uso de anticuerpos anti-LAG-3 de bloqueo en modelos en sistemas in vitro e in vivo (Sierro S et al., Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Hannier S et al (1998), J Immunol 161: 4058-65; Macon-Lemaitre L et al (2005), Immunology 115: 170-8; Workman CJ et al (2003), Eur J Immunol 33:970-9).

En la superficie de la célula, LAG-3 se expresa como un dímero, que es necesario para la formación de sitios estables de unión al MHC de clase II (Huard B et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9). LAG-3, en forma soluble, también se encuentra en el suero de donantes sanos y pacientes con tuberculosis y cáncer (Lienhardt C et al. (2002), Eur J Immunol 32: 1605-13; Triebel F et al (2006). Cancer Lett 235: 147-53), y esta forma se puede correlacionar con el número de linfocitos T LAG-3+ (Siawaya J et al. (2008). J of Infection 56: 340-7). La característica principal de LAG-3 como antígeno diana de un agente de reducción potenciada de linfocitos es un perfil de expresión relativamente selectivo cuando se compara con otros agentes actualmente en clínica, es decir as Campath™ (linfocitos T/B), Amevive (la mayoría de los linfocitos T CD45RO+) o Rituxan (linfocitos B). Se han identificado algunas moléculas que son marcadores sostenidos de la activación de linfocitos T in vivo en seres humanos. Estas incluyen LAG-3, OX40, MHC class II, CD69, CD38, ICOS y CD40L. No obstante, aparte de LAG-3 y OX40, la mayoría de estas moléculas también se expresan de forma constitutiva en linfocitos T reguladores naturales humanos o en otros tipos de células. LAG-3 se expresa en una pequeña proporción de linfocitos T en seres humanos sanos (aproximadamente 1-4%) y en una proporción similar de linfocitos NK (Baixeras E et al. (1992), J Exp Med 176: 327-37; Huard B et al (1994), Immunogenetics 39: 213-7). Tras la activación con anti-CD3 ca. 30-80 % de los linfocitos T CD4+ y CD8+ T expresan LAG-3 en 24 a 48 h; este porcentaje aumenta en presencia de IL2, IL7 e IL12 (Sierro S et al, Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Bruniquel D et al (1998), Immunogenetics 48: 116-24). Tras la estimulación específica de antígeno con un antígeno de memoria (es decir, CMV o toxoide del tétanos), la mayoría de los linfocitos T activados son LAG-3+. Además, en seres humanos, LAG-3 se expresa en una subpoblación (1-10%) de linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ FoxP3+ en sangre humana sana. Esta población parece ser funcionalmente supresora in vitro por contacto celular y mecanismos dependientes de la IL10 y, por tanto, puede representar una población de linfocitos T reguladores naturales recientemente activados o inducidos [Camisaschi C, Casati C, Rini F et al. (2010). La expresión de LAG-3 define una subpoblación de linfocitos T reguladores CD4+CD25highFox3P que se expanden a sitios tumorales. J. Immunol 184: 6545-51). Se ha detectado LAG-3 en otros tipos de células de linaje hematopoyético, tal como células dendríticas plasmacitoides, linfocitos B y células NK, pero solo en ratón y principalmente después de la activación (Sierro S, Romero P & Speiser D; Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101).

La reducción de linfocitos T LAG-3+ se puede usar para tratar o prevenir los trastornos inmunoinflamatorios dirigidos por linfocitos T. En las enfermedades autoinmunitarias, en las que la mayoría de las células autorreactivas están activadas crónicamente por autoantígenos en el lugar de la enfermedad y/o recirculan en la periferia, un ciclo corto de una proteína de unión a antígeno de reducción puede reducir de forma selectiva este repertorio de linfocitos T autoinmunitarios y proporcionar remisión a largo plazo. La superioridad de este abordaje se ha demostrado con el anticuerpo de reducción de panlinfocitos Campath™, en el que una única inyección de 12 mg redujo la tasa de recaídas en un 74% en comparación con el tratamiento estándar en un ensayo de esclerosis múltiple (The CAMMS223 Trial Investigators (2008), N Engl J Med. 359:1786-801). Debido a la expresión más selectiva de LAG-3 en comparación con CD52, la diana de Campath™, el impacto sobre los linfocitos T de memoria en reposo y no expuestos previamente y el repertorio de linfocitos T reguladores naturales debería reducirse. Cabe esperar que esto conduzca a una mejora del índice terapéutico, manteniendo la eficacia pero con un menor riesgo de infección y neoplasia maligna así como el inicio de la autoinmunidad asociada con Campath™. Adicionalmente, en un modelo de exposición cutánea a tuberculina de babuino, el anticuerpo quimérico dirigido a LAG-3 IMP731 participó en la reducción de linfocitos T LAG-3+, tanto en la periferia como en el punto de exposición de la piel, lo que tiene como resultado una reducción en la respuesta a la exposición cutánea a la tuberculina (Poirier N et al. (2011), Clin Exp Immunol 164: 265-74). En otro estudio, un anticuerpo policlonal LAG-3 redujo los linfocitos T infiltrantes LAG-3+ de un aloinjerto cardiaco de rata y prolongó la supervivencia de estos injertos (Haudebourg T et al. (2007), Transplantation 84: 1500-1506).

El documento WO 2008/132601 desvela anticuerpos anti-LAG-3 y su uso en el tratamiento o la prevención de rechazo al trasplante de órganos y enfermedad autoinmune.

En la técnica existe la necesidad de proteínas de unión a antígeno, en particular anticuerpos humanizados, que se unan a LAG-3 y produzcan eliminación de linfocitos T activados LAG-3+ y que puedan tener utilidad en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa y hepatitis autoinmune; enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas y cáncer.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se dirige a un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo, que es capaz de unirse al gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) y que comprende a) la cadena ligera variable (VL) de la SEQ ID NO:4 y b) la cadena pesada variable (VH) de la Se Q ID NO: 9.

Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con la implicación de linfocitos T patógenos, por ejemplo enfermedades autoinmunitarias, tales como psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa y hepatitis autoinmune; enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas y cáncer. De acuerdo con esto, la invención también está dirigida a un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención para su uso en terapia y a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención y, opcionalmente, uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Descripción de las figuras

Figura 1: Unión del anticuerpo a LAG-3 que expresa EL4 (A) y linfocitos T CD3+ humanos activados (B). Synagis, un anticuerpo monoclonal contra una diana no relacionada, se usó como control negativo.

Figura 2: Efecto del anticuerpo afucosilado H5L7BW administrado por vía intraperitoneal sobre PBMC humanos activados coadministrados recuperados de la cavidad peritoneal 24 horas después de la inyección. A) Cuantificación de linfocitos T CD4+LAG-3+ y CD8+LAG-3+ 24 horas después de la coadministración de 1 x 107 PBMC humanas activadas y 5 mg/kg de anticuerpo control, H5L7BW o Campath™ (Donante A: Control n=2; H5L7BW n=2, MabCampath n=1; Donante B: Control n=2; H5L7BW n=3, Campath™ n=2). B) Cuantificación de linfocitos T CD4+ y CD8+ T totales. (*p<0,001).

Figura 3: Efecto del anticuerpo afucosilado H5L7BW y su variante potenciada no ADCC H5L7 sobre PBMC humanas activadas coadministradas por vía intraperitoneal y recuperadas de la cavidad peritoneal 5 horas después de la inyección. A) Cuantificación de linfocitos T CD4+LAG-3+ y CD8+LAG-3+ 5 horas después de la coadministración de 1 x 107 PBMC humanas activadas y 5 mg/kg de anticuerpo control, H5L7BW o H5L7 (n=3 por grupo). B) Cuantificación de linfocitos T CD4+ y CD8+ T totales. (*p<0,001).

Figura 4: Efecto del anticuerpo afucosilado H5L7BW administrado por vía intravenosa 18 horas antes de la administración de PBMC humanas activadas en el peritoneo de ratones SCID. A) Cuantificación de linfocitos T CD4+LAG-3+ y CD8+LAG-3+ 5 horas después de la inyección i.p. de 5 x 106 (n=1 por grupo) o 1 x 107 O/N (n=4 por grupo) PBMC humanas activadas. B) Cuantificación de linfocitos T CD4+ y CD8+ T totales. Se se inyectaron por vía intravenosa 5 mg/kg de H5L7BW o anticuerpo control 18 horas antes de la inyección de PBMC humanas activadas. (*p<0,001, # p=0,0052).

Figura 5: Efecto de H5L7BW, H5L7 o IMP731 (5 mg/kg) administrados por vía intravenosa 18 horas antes de la administración de PBMC humanas activadas en el peritoneo de ratones SCID. A) Cuantificación de linfocitos T CD4+LAG-3+ y CD8+LAG-3+ 5 horas después de la inyección i.p. de 1 x 107 (n=4 por grupo) PBMC humanas activadas. Se inyectaron por vía intravenosa 5 mg/kg de H5L7BW, H5L7, IMP731 o anticuerpo control 18 horas antes de la inyección de PBMC humanas. B) Cuantificación de linfocitos T CD4+ y CD8+ T totales. Se inyectaron por vía intravenosa 5 mg/kg de anticuerpos de reducción de LAG-3 o anticuerpo control 18 horas antes de la inyección de PBMC humanas activadas. (*p<0,001).

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se desvelan proteínas de unión a antígeno que se unen al gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) y, más particularmente a proteínas de unión a antígeno que pueden producir reducción de linfocitos T activados LAG-3+.

La expresión “proteína de unión a antígeno”, como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que son capaces de unirse a LAG-3. A menos que se especifique lo contrario, el término “LAG-3”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen de activación de linfocitos 3. El término “LAG-3” incluye, dentro de su alcance, pero no se limita a LAG-3 expresado como un dímero sobre la superficie de, por ejemplo, linfocitos T activados, células NK y linfocitos B (también conocidos en la técnica como, por ejemplo, CD223) y una forma soluble de LAG-3 hallada, por ejemplo, en suero humano, que en el presente documento se denomina "sLAG-3". A menos que se especifique lo contrario, las referencias en el presente documento a “sLAG-3” y “LAG-3” son a polipéptidos humano. En una realización concreta, en el presente documento se desvelan proteínas de unión a antígeno capaces de unirse a la forma de LAG-3 expresada como un dímero sobre la superficie de, por ejemplo, linfocitos T activados, células NK y linfocitos B (también conocido en la técnica como, por ejemplo, CD223). Más particularmente, en el presente documento se desvelan proteínas de unión a antígeno que se pueden unir a LAG-3 expresado sobre linfocitos T activados y pueden producir reducción de dichos linfocitos T activados.

En el presente documento se desvela una proteína de unión a antígeno capaz de unirse a LAG-3 y que comprende CDRL1 de la SEQ ID NO. 5, en la que la posición 27E es prolina.

En el presente documento se desvela además una proteína de unión a antígeno, que comprende CDRL1 de SEQ ID NO. 1.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno capaz de unirse a LAG-3 y que comprende CDRL1 de la SEQ ID NO. 5, comprendiendo la proteína de unión a antígeno además CDRL2 y/o CDRL3 de la SEQ ID NO. 6 o una variante CDR de las mismas.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno que comprende CDRL1 de SEQ ID NO. 2 y/o CDRL3 de SEQ ID NO. 3 o una variante CDR de las mismas.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno capaz de unirse a LAG-3 y que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de SEQ ID NO. 5.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno que comprende una o más de CDRH1, CDRH2 y CDRH3, o una variante de CDR de las mismas, de SEQ ID NO. 10.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de SEQ ID NO. 5 y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de SEQ ID NO. 10.

En el presente documento se desvela también una proteína de unión a antígeno que comprende una o más CDR, o una variante de CDR de las mismas, seleccionada del grupo que comprende CDRH1 de SEQ ID NO. 6, CDRH2 de SEQ ID NO. 7 y CDRH3 de SEQ ID NO. 8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende las siguientes CDR:

CDRL1: SEQ ID NO. 1

CDRL2: SEQ ID NO. 2

CDRL3: SEQ ID NO. 3

CDRH1: SEQ ID NO. 6

CDRH2: SEQ ID NO. 7

CDRH3: SEQ ID NO. 8.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a antígeno que comprende una cadena ligera variable que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de SEQ ID NO. 5 y una cadena pesada variable que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de SEQ ID NO. 10.

En un aspecto concreto, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo humanizado, opcionalmente una IgG.

El término "CDR”, como se usa en el presente documento, hace referencia a las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de una proteína de unión al antígeno. Estas son regiones hipervariables de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina. Hay tres CDR (o regiones CDR) de cadena pesada y tres de cadena ligera en la porción variable de una inmunoglobulina.

Será evidente para los expertos en la técnica que hay varios consensos para numerar las secuencias CDR; Chothia (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883), Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (University of Bath) and Contact (University College London). La región mínima solapante que usa al menos dos de los procedimientos de contacto Kabat, Chothia, AbM se puede determinar proporcionando la “unidad mínima de unión" La unidad de unión mínima puede ser una subporción de una CDR. La estructura y el plegamiento proteico del anticuerpo pueden significar que otros residuos se consideran parte de la secuencia de c Dr y así lo entendería un experto en la técnica.

A menos que se indique lo contrario y/o en ausencia de una secuencia identificada específicamente, en el presente documento las menciones a “CDR”, “CDRL1”, “CDRL2”, “CDRL3”, “CDRH1”, “CDRH2”, “CDRH3” hacen referencia a secuencias de aminoácidos numeradas de acuerdo con los consensos conocidos identificados en la Tabla 1. En una realización concreta, el consenso de numeración usado es el consenso de Kabat. En el presente documento, las menciones a la “posición 27E" hacen referencia al aminoácido presente en la posición 27E en el dominio variable de la cadena ligera definido usando el consenso de numeración de Kabat. El experto en la técnica entenderá que esta posición tiene un equivalente en otros consensos conocidos, tales como, por ejemplo, Chothia, en la que la posición 27E es equivalente a la posición 30B.

La Tabla 1 a continuación representa una definición que usa cada convención de numeración para cada CDR o unidad de unión. Debe destacarse que algunas de las definiciones de CDR pueden variar dependiendo de la publicación individual usada.

Tabla 1

La expresión “variante de CDR” como se usa en el presente documento hace referencia a una CDR que se ha modificado en al menos una, por ejemplo, 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido, con lo que la proteína de unión a antígeno modificada que comprende la variante de CDR conserva sustancialmente las características biológicas de la proteína de unión a antígeno previa a la modificación. Se apreciará que cada CDR que se puede modificar puede modificarse sola o en combinación con otra CDR. En un aspecto, la modificación es una sustitución, en particular una sustitución conservadora, por ejemplo como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Por ejemplo, en una CDR variante, los residuos de aminoácidos de la unidad mínima de unión pueden permanecer iguales pero los residuos flanqueantes que comprenden la CDR como parte de la o las definiciones de Kabat o Chothia pueden estar sustituidos con un residuo de aminoácido conservador.

Dichas proteínas de unión a antígeno que comprenden CDR modificadas o unidades mínimas de unión como se ha descrito anteriormente pueden denominarse, en el presente documento, como “variantes de CDR funcionales” o variantes de unidades de unión funcionales”.

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento pueden ser capaces de unirse a sLAG-3. En un aspecto, la constante de disociación en equilibrio (KD) de la interacción proteína de unión a antígeno-sLAG-3 es 10nM o menor, tal como 1 nM o menor, por ejemplo entre 1pM y 300, 400, 500pM o entre 500pM y 1nM. Un experto en la técnica apreciará que cuando menor es el valor numérico de KD, más fuerte es la unión. El recíproco de la KD (es decir 1/KD) es la constante de asociación en equilibrio (KA) cuyas unidades son M-1. Un experto apreciará que cuando mayor es el valor numérico de KA, más fuerte es la unión.

En el presente documento se desvelan proteínas de unión a antígeno que son capaces de unirse a LAG-3 recombinante con una KD inferior a 1 nM, por ejemplo entre 1 pM y 300 pM, cuando se determina mediante análisis de resonancia en plasmón superficial Biacore™ usando dominios extracelulares de LAG-3 recombinante (ECD) de macaco de Java o ser humano de las SEQ ID NO. 51 y 52, respectivamente.

Adicionalmente, las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento también pueden ser capaces de unirse a LAG-3 expresado en, por ejemplo, células EL4 o linfocitos T CD3+ humanos activados.

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento también pueden ser capaces de reducir linfocitos T LAG-3+ activados, en particular linfocitos T CD4+LAG-3+ y CD8+LAG-3+. La reducción de linfocitos T LAG-3+ se puede producir mediante, por ejemplo, actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC).

En el presente documento se desvelan además proteínas de unión a antígeno que son capaces de producir una reducción superior al 40% de linfocitos T humanos CD4 y/o CD8 LAG-3+ específicos de antígeno mediante ADCC en un ensayo in vitro usando linfocitos T humanos primarios.

En el presente documento se desvelan también proteínas de unión a antígeno que, a una concentración de 0,1 |jg/ml, son capaces de producir reducción superior al 50% en un ensayo ADCC in vitro usando células EL4 que expresan LAG-3 marcadas con europio como células diana y PBMC humanas como células efectoras, en las que la proporción efector:diana no es superior a 50:1 y el ensayo se realiza durante un periodo de 2 horas. El % de lisis celular se calcula en base a la liberación de europio de las células EL4 que expresan LAG-3.

Se cree que la interacción entre la región constante de una proteína de unión a antígeno y varios receptores Fc (FcR), incluyendo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), interviene en las funciones efectoras, tales como a Dc C y CDC, de la proteína de unión a antígeno. Efectos biológicos significativos pueden ser una consecuencia de la funcionalidad efectora. Normalmente, la capacidad para participar en la función efectora requiere la unión de la proteína de unión a antígeno a un antígeno y no todas las proteínas de unión a antígeno participarán en cada función efectora.

La función efectora se puede medir de numerosas formas, incluyendo, por ejemplo, mediante la unión de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo anticuerpo, de la presente invención a través de FcyRIII a las células asesinas naturales o a través de FcyRI a monocitos/macrófagos para medir la función efectora ADCC. Por ejemplo, en una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento se puede evaluar la función efectora ADCC en un ensayo de células Asesinas Naturales. Ejemplos de dichos ensayos se pueden encontrar en Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.

Ejemplos de ensayos para determinar la función CDC incluyen los descritos en 1995 J Imm Meth 184:29-38.

En un aspecto de la presente divulgación, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo.

El término "anticuerpo”, como se usa en el presente documento, hace referencia a moléculas con un dominio de tipo inmunoglobulina e incluye anticuerpos monoclonales (p. ej., IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados; un dominio variable sencillo (p. ej., VL), un anticuerpo de dominio (dAb®), fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunológicamente eficaces, Fab, F(ab')2, Fv, Fv unida por puentes disulfuro, Fv de cadena sencilla, anticuerpos multiespecíficos de conformación cerrada, scFv unidos por puentes disulfuro, diacuerpos, Tandabs™, etc. y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores, (para un resumen de los formatos alternativos de “anticuerpo” véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136). Formatos de anticuerpos alternativos incluyen armazones alternativos en los que una o más CDR de cualquier molécula de acuerdo con la divulgación se pueden disponer sobre un armazón o esqueleto proteico no inmunoglobulínico adecuado, tal como un affibody, un armazón de SpA, un dominio de clase A del receptor de LDL, un avímero (véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N° 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301) o un dominio de EGF.

En un aspecto adicional, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo humanizado.

Un “anticuerpo humanizado” se refiere a un tipo de anticuerpo modificado por ingeniería que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina donante no humana, derivando el resto de partes de la inmunoglobulina de la molécula de una o más inmunoglobulinas humanas. Además, los residuos del soporte de marco conservado pueden alterarse para conservar la afinidad de unión (Véase, por ejemplo, Queen y col. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo la base de datos KABAT®, la base de datos Los Alamos y la base de datos Swiss Protein por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco conservadas del anticuerpo donante (en base a los aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de la cadena pesada y/o una región estructural variable de la cadena pesada para la inserción de las CDR del donante. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar las regiones marco conservadas variables o constantes de la cadena ligera se puede seleccionar de un modo similar. Cabe destacar que las cadenas ligera y pesada del anticuerpo aceptor no se requieren para originarse del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varios modos de producir dichos anticuerpos humanizados, véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.

En otro aspecto más, el anticuerpo humanizado tiene una región constante del anticuerpo humano que es una IgG1, por ejemplo la región constante de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 46.

En el presente documento se desvelan anticuerpos humanizados que comprenden a) una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO. 5 o una secuencia de cadena ligera con al menos una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con cualquiera de las SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO.

10 o una secuencia de cadena pesada con al menos una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con cualquiera de la SEQ ID NO. 10.

En el presente documento se desvela un anticuerpo humanizado, que comprende a) una secuencia de cadena ligera con una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada con una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID NO. 10.

En el presente documento se desvela un anticuerpo humanizado, que comprende a) una secuencia de cadena ligera con una identidad de al menos un 95 % con la SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada con una identidad de al menos un 95 % con la SEQ ID NO. 10.

En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado, que comprende a) una secuencia de cadena ligera con una identidad de al menos un 97 % con la SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada con una identidad de al menos un 97 % con la SEQ ID NO. 10.

En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado, que comprende a) una secuencia de cadena ligera de s Eq ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO. 10.

En el presente documento se desvelan además anticuerpos humanizados que comprenden a) una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO. 35 o una secuencia de cadena ligera con al menos una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con cualquiera de las SEQ ID NO. 35 y b) una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO. 36 o una secuencia de cadena pesada con al menos una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con cualquiera de la SEC ID N 36.

En el presente documento se desvelan también proteínas de unión a antígeno que comprenden CDRL1-L3 y CDRH1-H3 de SEQ ID NO. 35 y 36, respectivamente.

Para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, el término “idéntica” o “identidad” indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o dos secuencias de aminoácidos cuando se alinean y comparan óptimamente con las inserciones o deleciones adecuadas.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad= n° de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se han de introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático, como se describe más adelante.

El porcentaje de identidad entre una secuencia de ácido nucleico problema y una secuencia de ácido nucleico sujeto es el valor de las “ identidades”, expresado como un porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTN cuando la secuencia de ácido nucleico sujeto tiene una cobertura problema del 100% con una secuencia de ácido nucleico problema tras una alineación apareada BLASTN. Dichas alineaciones apareadas BLASTN entre una secuencia de ácido nucleico problema y una secuencia de ácido nucleico sujeto se realizan usando los conjuntos por defecto del algoritmo BLASTN disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad inactivado. Es importante el hecho de que una secuencia de ácido nucleico problema se puede describir mediante una secuencia de ácido nucleico identificada en una o más reivindicaciones en el presente documento.

El porcentaje de identidad entre una secuencia de aminoácidos problema y una secuencia de aminoácidos sujeto es el valor de las “identidades”, expresado como un porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTP cuando la secuencia de aminoácidos sujeto tiene una cobertura problema del 100% con una secuencia de ácido nucleico problema tras una alineación apareada BLASTP. Dichas alineaciones apareadas BLASTP entre una secuencia de aminoácidos problema y una secuencia de aminoácidos sujeto se realizan usando los conjuntos por defecto del algoritmo BLASTP disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad inactivado. Es importante el hecho de que una secuencia de aminoácidos problema se puede describir mediante una secuencia de aminoácidos identificada en una o más reivindicaciones en el presente documento.

Producción

Las proteínas de unión a antígeno, por ejemplo anticuerpos, tales como anticuerpos humanizados desvelados en el presente documento pueden producirse mediante transfección de una célula huésped con un vector de expresión que comprenda la o las secuencias codificadoras de la proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento. Un vector de expresión o plásmido recombinante se produce introduciendo estas secuencias de codificación de la proteína de unión a antígeno en asociación operativa con secuencias de control de la regulación convencionales capaces de controlar la replicación y la expresión en una célula huésped, y/o la secreción de una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, por ejemplo un promotor de CMV, y secuencias señal que pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. De forma similar, se puede producir un segundo vector de expresión que tiene una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera o pesada complementaria de la proteína de unión a antígeno. En ciertas formas de realización, este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en lo que respecta a las secuencias codificadoras y los marcadores seleccionables, para asegurar en la medida de lo posible que cada cadena polipeptídica se expresa funcionalmente. Como alternativa, las secuencias codificadoras de la cadena pesada y ligera para la proteína de unión a antígeno pueden residir en un único vector.

Una célula huésped seleccionada se co-transfecta mediante técnicas convencionales con los vectores primero y segundo (o simplemente se transfectan con un único vector) para crear la célula huésped transfectada de la invención, que comprende las cadenas ligeras y pesadas recombinantes o sintéticas. Después, la célula transfectada se cultiva mediante técnicas convencionales para producir la proteína de unión a antígeno sometida a ingeniería de la invención. La proteína de unión a antígeno que incluye la asociación de la cadena recombinante tanto pesada como ligera se selecciona del cultivo mediante el ensayo asociado, tal como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas convencionales similares para construir otras proteínas de unión a antígeno.

Un experto en la técnica puede seleccionar vectores adecuados para las etapas de clonación y subclonación empleadas en los procedimientos y la construcción de las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede usar la serie convencional pUC de vectores de clonación. Un vector, pUC19, está disponible en casas de suministros, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Además, para la clonación se puede usar cualquier vector que sea capaz de replicarse con facilidad, tenga abundantes sitios de clonación y genes seleccionables (p. ej., resistencia a antibióticos) y se pueda manipular fácilmente. Por tanto, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en la presente invención.

Los vectores de expresión también se pueden caracterizar mediante genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogo, por ejemplo el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de mamífero. Otras secuencias vector preferibles incluyen una secuencia señal de poliA, tal como de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia promotora de beta-globina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en la presente memoria descriptiva se pueden sintetizar mediante técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica.

Los componentes de dichos vectores, por ejemplo replicones, genes de selección, reforzadores, promotores, secuencias señal y similares, pueden obtenerse de fuentes comerciales o naturales o pueden sintetizarse mediante procedimientos conocidos para usar en la dirección de la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Para este fin también se pueden seleccionar otros vectores de expresión adecuados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica para expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos.

En el presente documento se desvela una línea celular transfecctada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificadoras de las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento. Las células huésped útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación son también convencionales. No obstante, se pueden usar células de varias cepas de E. coli para la replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento.

Las células o líneas celulares huésped adecuadas para la expresión de las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento incluyen células de mamífero tales como NS0, Sp2/0, CHO (p.ej. DG44), COS, HEK, una célula fibroblasto (p. ej., 3T3) y células de mieloma, por ejemplo se puede expresar en una célula CHO o de mieloma. Pueden usarse células humanas, lo que permite que la molécula se modifique con patrones de glicosilación humana. Como alternativa, se pueden emplear otras líneas celulares eucarióticas. En la técnica se conoce la selección de células huésped de mamífero adecuadas y procedimientos para transformación, cultivo, amplificación, detección selectiva y producción de producto y purificación. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., citado en lo que antecede.

Las células bacterianas pueden resultar útiles como células huésped para la expresión de las Fabs recombinantes u otras formas de realización desveladas en el presente documento (véase, por ejemplo, Plückthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). No obstante, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en las células bacterianas a estar en una forma no plegada o plegada inadecuadamente o en una forma no glicosilada, tendría que someterse a detección selectiva cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana para ver la retención de su capacidad de unión al antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produjo en una forma plegada adecuadamente, la célula bacteriana sería un huésped deseable o, en formas de realización alternativas, la molécula puede expresarse en el huésped bacteriano y, después, volver a plegarse. Por ejemplo, en el campo de la biotecnología se conocen muy bien varias cepas de E. coli usadas para la expresión. En este procedimiento también se pueden emplear varias cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares.

Cuando se desee, también se dispone como células huésped de cepas de células de levadura conocidas para los expertos en la técnica, así como células de insecto, por ejemplo Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión víricos. Véase, por ejemplo, Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y referencias citadas en dicho documento.

Los procedimientos generales mediante los que se pueden construir vectores, los procedimientos de transfección requeridos para producir las células huésped desveladas en el presente documento y los procedimientos de cultivo necesarios para producir la proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento a partir de dicha célula huésped pueden ser, todos ellos, técnicas convencionales. Tradicionalmente, el procedimiento de cultivo de la presente invención es un procedimiento de cultivo sin suero, normalmente mediante el cultivo de células sin suero en suspensión. Asimismo, una vez producidas, las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento pueden purificarse a partir del contenido del cultivo celular de acuerdo con procedimientos convencionales en la técnica, incluidos precipitación en sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Dichas técnicas están dentro de la experiencia en la técnica y no limitan la presente invención. Por ejemplo, en el documento WO 99/58679 y el documento WO 96/16990 se describen preparaciones de anticuerpos alterados.

Otro procedimiento más de expresión de las proteínas de unión a antígeno puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.873.316. Éste se refiere a un sistema de expresión usando el promotor de la caseína de animal que cuando se incorpora de forma transgénica en un mamífero permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de producir un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada o transfeccionada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo de la invención y la recuperación de la proteína de unión a antígeno producida de ese modo.

En el presente documento se desvela además un procedimiento de producción de una proteína de unión a antígeno anti-LÁG-3 (p. ej., un anticuerpo humanizado) desvelado en el presente documento que se une a LAG-3, procedimiento que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un primer vector que codifica una cadena pesada del anticuerpo;

(b) proporcionar un segundo vector que codifica una cadena ligera del anticuerpo;

(c) transformar una célula huésped de mamífero (p. ej., CHO) con dichos vectores primero y segundo;

(d) cultivar la célula huésped de la etapa (c) en condiciones que conducen a la secreción del anticuerpo por dicha célula huésped en dichos medios de cultivo;

(e) recuperar el anticuerpo secretado de la etapa (d).

Una vez expresado mediante el procedimiento deseado, puede investigarse después la actividad in vitro de la proteína de unión a antígeno mediante el uso de un ensayo adecuado, tal como análisis de resonancia en plasmón superficial Biacore™, para evaluar la unión de la proteína de unión a antígeno a LAG-3. Adicionalmente, también se pueden usar otros ensayos in vitro e in vivo para determinar la capacidad de una proteína de unión a antígeno para producir la reducción de células que expresan LAG-3, tales como poblaciones de linfocitos T humanos activados.

El experto apreciará que, tras la producción de una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo, en concreto dependiendo de la línea celular usada y de la secuencia de aminoácidos concreta de la proteína de unión a antígeno, se pueden producir modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, esto puede incluir la escisión de determinadas secuencias líder, la adición de varios restos de azúcar en varios patrones de glucosilación y fosforilación, desamidación, oxidación, mezcla de puentes disulfuro, isomerización, corte de lisina en C-terminal y ciclación de glutamina en N-terminal. En el presente documento se desvela el uso de proteínas de unión a antígeno que se han sometido, o han sufrido, a una o más modificaciones postraduccionales. Por tanto, una “proteína de unión a antígeno” o “anticuerpo” desvelado en el presente documento incluye una “proteína de unión a antígeno” o “anticuerpo”, respectivamente, como se ha definido anteriormente que ha sufrido una modificación postraduccional tal como se describe en el presente documento,

La glicosilación de los anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes se sabe que tiene un efecto profundo sobre la función del anticuerpo, particularmente la función efectora, véase, por ejemplo, Boyd y col. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Se contemplan las variantes de glicosilación de las proteínas de unión a antígeno de la invención, en las que se añaden, sustituyen, delecionan o modifican uno o más restos carbohidratos. La introducción de un motivo de asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina crea un posible sitio de unión enzimática de los restos carbohidratos y, por tanto, pueden usarse para manipular la glicosilación de un anticuerpo. En Raju y col. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876 la sialilación terminal de una inmunoadhesina TNFR-IgG se incrementó mediante un procedimiento de regalactosilación y/o resialilación usando beta-1, 4-galactositransferasa y/o alfa-2,3 sialiltransferasa. Se cree que el incremento de la sialilación terminal para incrementar la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, en común con la mayoría de las glicoproteínas, normalmente se producen como una mezcla de glicoformas. Esta mezcla es particularmente evidente cuando los anticuerpos se producen en células eucariotas, particularmente de mamífero. Se han desarrollado diversos procedimientos para fabricar glicoformas definidas, véase Zhang y col. (2004) Science 303: 371: Sears y col. (2001) Science 291: 2344; Wacker y col. (2002) Science 298: 1790; Davis y col. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang y col. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727. Los anticuerpos (por ejemplo del isotipo IgG, p. ej. IgG1) como se describe en el presente documento pueden comprender un número definido (p. ej., 7 o menos, por ejemplo 5 o menos, tal como dos o uno) de glicoforma(s).

La desamidación es una reacción enzimática que principalmente convierte asparagina (N) en ácido isoaspártico y ácido aspártico (D) en una proporción de aproximadamente 3:1. En un grado mucho menor, la desamidación se puede producir con residuos de glutamina de un modo similar. La desamidación en una CDR tiene como resultado un cambio en la carga de la molécula, pero normalmente no da lugar a un cambio en la unión a antígeno ni afecta a La FC/FD.

La oxidación se puede producir durante la producción y almacenamiento (es decir, en presencia de condiciones oxidantes) y tiene como resultado una modificación covalente de una proteína, inducida directamente por especies de oxígeno reactivas o indirectamente mediante reacción con subproductos secundarios de estrés oxidativo. La oxidación se produce principalmente con residuos de metionina, pero ocasionalmente se puede producir en residuos de triptófano y sin cisteína.

El desbarajuste de puentes disulfuro se puede producir durante la producción y en condiciones de almacenamiento básicas. En determinadas circunstancias, los puentes disulfuro pueden romperse o formarse de forma incorrecta, lo que tiene como resultado residuos de cisteína no apareados (-SH). Estos sulfhidrilos (-SH) libres (no apareados) pueden estimular el barajado.

La isomerización se produce típicamente durante la producción, purificación y almacenamiento (a pH ácido) y suele producirse cuando el ácido aspártico se convierte en ácido isoaspártico a través de un proceso químico.

La glutamina en N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es probable que forme piroglutamato (pGlu). La mayor parte de la formación de pGlu se produce en el biorreactor de producción, pero se puede formar no enzimáticamente en función del pH y a la temperatura de procesamiento y las condiciones de almacenamiento. La formación de pGlu se considera una de las vías de degradación principales para los mAb recombinantes.

El cierre sobre sí misma de la lisina en C-terminal es una reacción enzimática catalizada por carboxipeptidasas y normalmente se observa en mAb recombinantes. Variantes de este proceso incluyen la eliminación de lisina de una o ambas cadenas pesadas. El cierre sobre sí misma de la lisina no parece afectar a la bioactividad y no tiene efectos sobre la función efectora de mAb.

Potenciación de la función efectora

Se cree que la interacción entre la región constate de una proteína de unión a antígeno y varios receptores Fc (FcR), incluyendo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para participar en las funciones efectoras, tales como ADCC y CDC, de la proteína de unión a antígeno.

Con la expresión "función efectora", como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a una o más respuestas mediadas por actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), por actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC), fagocitosis mediada por Fc o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y reciclado de anticuerpos a través del receptor FcRn.

Las propiedades de ADCC o CDC de las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento se pueden potenciar de varias formas.

Se ha demostrado que las regiones constantes de la IgG1 humana que contienen mutaciones específicas o glucosilación alterada en el residuo Asn297 para potenciar la unión a receptores Fc. En algunos casos, también se ha demostrado que estas mutaciones potencian la ADCC y la CDC (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).

En una realización, dichas mutaciones están en una o más de las posiciones seleccionadas de 239, 332 y 330 (IgG1) o las posiciones equivalentes en otros isotipos de IgG. Ejemplos de mutaciones adecuadas son S239D y I332E y A330L. En una realización, la proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento está mutada en las posiciones 239 y 332, por ejemplo S239D e I332E o en una realización adicional está mutada en tres o más posiciones seleccionadas de 239 y 332 and 330, por ejemplo S239D e I332E and A330L. (numeración del índice de la UE).

En el presente documento se desvela una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica, por ejemplo una de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica con al menos un dominio CH2 de IgG3, de modo que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada, por ejemplo en la que posee una ADCC potenciada o una CDC potenciada, o funciones ADCC y CDC potenciadas. En una realización de este tipo, la proteína de unión a antígeno puede comprender un dominio CH2 de IgG3 o ambos dominios CH2 pueden ser de IgG3.

En el presente documento se desvela también un procedimiento para producir una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado como se describe en el presente documento, en el que el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región Fc que contiene dominios derivados de las secuencias de línea germinal humanas IgG1 e IgG3; y

b) recuperar la proteína de unión a antígeno.

Dichos procedimientos para la producción de las proteínas de unión a antígeno se pueden realizar, por ejemplo, usando el sistema de tecnología COMPLEGENT™ disponible en BioWa, Inc. (La Jolla, CA, EE.UU.) y Kyowa Hakko Kogyo (now, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd., en el que una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión en el que una secuencia de ácido nucleico que codifica una región Fc que contiene dominios derivados de las secuencias de la línea germinal humana de IgG1 e IgG3 se expresa para producir una proteína de unión a antígeno que tiene una actividad potenciada de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que aumenta en relación con otra proteína de unión a antígeno, por otro lado idéntica, que carece de dicho dominio Fc quimérico. Los aspectos del sistema de tecnología COMPLEGENT™ se describen en los documentos WO2007011041 y US20070148165, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia. En una realización alternativa, la actividad CDC puede aumentarse introduciendo mutaciones específicas en la secuencia en la región Fc de una cadena de IgG. Los expertos en la técnica también reconocerán otros sistemas adecuados.

También se desvela en el presente documento una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada con un perfil de glicosilación alterado de modo que la proteína de unión a antígeno tenga una función efectora potenciada. Por ejemplo, en la que la proteína de unión a antígeno tiene una ADCC potenciada o una CDC potenciada o en el que tiene una función efectora ADCC y CDC potenciada. Ejemplos de metodologías adecuadas para producir proteínas de unión a antígeno con un perfil de glicosilación alterado se describen en los documentos WO2003011878, WO2006014679 y EP1229125, todos los cueles se pueden aplicar a las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento.

La presente invención también proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo humanizado de acuerdo con la invención que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo humanizado, en el que el gen FUT8 que codifica la alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante; y

b) aislar el anticuerpo humanizado producido por la célula huésped recombinante.

En el presente documento también se desvela un procedimiento para producir una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento que comprende las etapas de:

a) expresar una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento en una célula huésped recombinante, en donde el gen FUT8 que codifica la alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante; y

b) aislar la proteína de unión a antígeno producida por la célula huésped recombinante.

Dichos procedimientos para la producción de proteínas de unión a antígeno se pueden realizar, por ejemplo, usando el sistema de tecnología POTELLIGENT™ disponible en BioWa, Inc. (La Jolla, CA, USA) y en las células CHOK1SV que carecen de una copia funcional del gen FUT8 producen anticuerpos monoclonales que tienen actividad potenciada de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) que está aumentada respecto a un anticuerpo monoclonal idéntico producido en una célula con un gen FUT8 funcional. Los aspectos del sistema de tecnología POTELLIGENT™ se describen en los documentos US7214775, US6946292, WO0061739 y WO0231240, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia. Los expertos en la técnica también reconocerán otros sistemas adecuados.

En un aspecto adicional, en el presente documento se desvelan anticuerpos no fucosilados. Las referencias en el presente documento a anticuerpos “no fucosilados” o “afucosilados” se refieren a anticuerpos que alojan una estructura nuclear de tri-manosilo de N -glicanos de tipo complejo de Fc sin residuos de mucosa. Los anticuerpos no fucosilados o afucosilados de la presente invención no comprenden mucosa en la estructura del hidrato de carbono del núcleo unida a Asn297. Estos anticuerpos modificados mediante glucoingeniería que carecen del residuo de mucosa en el núcleo de los N-glucanos de FC puede exhibir una ADCC más fuerte que los equivalentes fucosilados debido a la potenciación de la capacidad de unión a FcYRIIIa.

Será evidente para los expertos en la técnica que dichas modificaciones no solo se pueden usar solas sino que se pueden usar en combinación entre sí con el fin de potenciar además la función efectora.

En el presente documento se desvela una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada que comprende una región constante de la cadena pesada mutada y quimérica. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno que comprende al menos un dominio c H2 de IgG3 humana y un dominio CH2 de IgG1 humana, en la que el dominio CH2 de IgG1 tiene una o más mutaciones en las posiciones seleccionadas de 239 y 332 y 330 (por ejemplo, las mutaciones se pueden seleccionar de S239D y I332E y A330L) de forma que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada. En este contexto, la función efectora potenciada puede equivaler a, por ejemplo, tener una ADCC potenciada o CDC potenciada, por ejemplo en la que tiene una ADCC potenciada y una Cd C potenciada. En una realización, el dominio CH2 de IgG1 tiene las mutaciones S239D e I332E.

En el presente documento se desvela una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica y que tiene un perfil de glicosilación alterada. En una de estas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende al menos un dominio CH2 de IgG3 y un dominio CH2 de IgG1 y tiene un perfil de glicosilación alterado de un modo tal que la proporción entre fucosa y manosa es 0,8:3 o menor, por ejemplo proteína de unión a antígeno que está desfucosilada de modo que dicha proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada en comparación con una proteína de unión a antígeno equivalente con una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina que carece de dichas mutaciones y un perfil de glucosilación alterado, por ejemplo que tiene una o más de las funciones siguientes, ADCC potenciada o CDC potenciada, por ejemplo que tiene ADCC potenciada y CDC potenciada.

En una realización alternativa, la proteína de unión a antígeno tiene al menos un dominio CH2 de IgG3 humana y al menos un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana, en la que ambos dominios CH2 de IgG están mutados de acuerdo con las limitaciones descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvela un procedimiento de producir una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento, que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión que contiene un ácido nucleico aislado como se describe en el presente documento, comprendiendo dicho vector de expresión además una secuencia de ácido nucleico de Fc que codifica una región Fc que contiene dominios derivados de las secuencias de línea germinal humanas IgG1 e IgG3; y en la que el gen FUT8 que codifica alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante, y

b) recuperar la proteína de unión a antígeno.

Dichos procedimientos para la producción de proteínas de unión a antígeno se pueden realizar, por ejemplo, usando el sistema de tecnología AccretaMab™ disponible en BioWa, Inc. (La Jolla, CA, USA), que combina los sistemas de tecnología POTELLIGENT™ y COMPLEGENT™ para producir una proteína de unión a antígeno que tiene una actividad ADCC y CDC potenciada que ha aumentado con respecto a, por otro lado, anticuerpos monoclonales idénticos que carecen de un dominio Fc quimérico y que tiene fucosa en el oligosacárido.

En el presente documento se desvela una proteína de unión a antígeno que comprende una región constante de cadena pesada quimérica y mutada, teniendo dicha proteína de unión a antígeno un perfil de glicosilación alterado de modo tal la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada, por ejemplo que posee una o más de las siguientes funciones, ADCC potenciada o una CDC potenciada. En una realización, las mutaciones se seleccionan de las posiciones 239 y 332 y 330, por ejemplo las mutaciones se seleccionan de S239D e I332E y A330L. En una realización adicional, la región constante de la cadena pesada comprende al menos un dominio CH2 de IgG3 humana y dominio CH2 de IgG1 humana. En una realización, la región constante de la cadena pesada tiene un perfil de glicosilación alterado de forma que la proporción entre mucosa y manosa es 0,8:3 o inferior, por ejemplo la proteína de unión antígeno está desfucosilada de forma que dicha proteína de unión antígeno tiene una función efectora potenciada en comparación con una proteína de unión antígeno no quimérica equivalente o con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de dichas mutaciones y perfil de glucosilación alterado.

Extensión de la semivida

El incremento de la semivida, o extensión de la servida, puede ser útil en aplicaciones in vivo de proteínas de unión a antígeno, especialmente anticuerpos y, más especialmente, fragmentos de anticuerpos de tamaño pequeño. Dichos fragmentos (Fv, Fv unidos por puentes disulfuro, Fab, scFv, dAb) generalmente se eliminan rápidamente del cuerpo. Las proteínas de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se pueden adaptar o modificar para proporcionar un incremento de la semivida in vivo y, en consecuencia, tiempos de persistencia, o residencia, más prolongados, de la actividad funcional de la proteína de unión a antígeno en el cuerpo. Adecuadamente, dichas moléculas modificadas tienen un aclaramiento disminuido y un tiempo de residencia media aumentado en comparación con la molécula no adaptada. El incremento de la semivida puede mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de una molécula terapéutica también pueden ser importantes para mejorar el cumplimiento del paciente.

Las expresiones “semivida” (“W ) y “semivida en suero” hacen referencia al tiempo necesario para que la concentración en suero (o plasma) de una proteína de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se reduzca en un 50% in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la proteína de unión a antígeno y/o aclaramiento o secuestro de la proteína de unión a antígeno por mecanismos naturales.

Las proteínas unión a antígeno de la divulgación se pueden estabilizar in vivo e incrementar su semivida uniéndolas a moléculas que resisten la degradación y/o el aclaramiento o secuestro (“resto de extensión de la semivida” o “molécula de extensión de la semivida”). Las estrategias de extensión de la semivida se recapitulan en, por ejemplo, “Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives”, Editada por Roland Kontermann, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9. Estrategias de extensión de la semivida incluyen: PEGilación, polisialilación, HESilación, miméticos de PEG recombinante, N-glicosilación, O-glicosilación, fusión de Fc, Fc modificado por ingeniería, unión a IgG, fusión de albúmina, unión a albúmina, acoplamiento de albúmina y nanopartículas.

En una realización, el resto o molécula de extensión de la semivida es un resto de polietilenglicol o un mimético de PEG. En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende (opcionalmente está constituida por) un dominio variable único de la divulgación ligado a un resto de polietilenglicol (opcionalmente, teniendo dicho resto el tamaño de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 kDA, opcionalmente de aproximadamente 40 kDa de PEG lineal o modificado). Se hace referencia al documento WO04081026 para una información más detallada sobre la PEGilación de los anticuerpos de dominio y los restos de unión. En una realización, el antagonista está constituido por un monómero de anticuerpo de dominio unido a un PEG, siendo el monómero del anticuerpo de dominio un dominio variable único de acuerdo con la divulgación. Miméticos de PEG adecuados se recapitulan en, por ejemplo, el Capítulo 4, páginas 63-80 “Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives” Edited by Roland Kontermann, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9.

Se cree que la interacción entre la región Fc de un anticuerpo y varios receptores de Fc (FcyR) participa en la fagocitosis y la semivida/aclaramiento de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, Se cree que el receptor FcRn neonatal está implicado en el aclaramiento de los anticuerpos y la transcitosis a través de los tejidos (véase Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57; y Ghetie y col. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766). En una realización, el resto de extensión de la semivida puede ser una región Fc de un anticuerpo. Dicha región Fc puede incorporar varias modificaciones en función de la propiedad deseada. Por ejemplo, un epítopo del receptor de rescate se puede incorporar en el anticuerpo para aumentar la semivida en suero, véase el documento US 5,739,277.

Los residuos de IgG1 humana que se ha determinado que interaccionan directamente con los FcRn humanos incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435. De acuerdo con esto, las sustituciones en cualquiera de las posiciones descritas en esta sección pueden permitir un incremento de la semivida en suero y/o alteraciones en las propiedades efectoras de los anticuerpos.

La extensión de la semivida mediante fusión a la región Fc se recapitula en, por ejemplo, el Capítulo 9, páginas 157­ 188 “Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives” Edited by Roland Kontermann, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9.

Típicamente, un polipéptido que aumenta la semivida en suero in vivo, es decir una molécula de extensión de la semivida, es un polipéptido natural in vivo y que resiste la degradación o eliminación mediante mecanismos endógenos que eliminan el material no deseado del organismo (p. ej., ser humano). Normalmente, dichas moléculas son proteínas naturales que tienen una semivida prolongada in vivo.

Por ejemplo, un polipéptido que aumenta la semivida en suero in vivo se puede seleccionar de proteínas de la matriz extracelular, proteínas encontradas en sangre, proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejido neural, proteínas localizadas en el riñón, el hígado, los músculos, los pulmones, el corazón, la piel o los huesos, proteínas de estrés, proteínas específicas de enfermedad o proteínas implicadas en el transporte de Fc. Polipéptidos adecuados se describen en, por ejemplo, el documento WO2008/096158.

Dicho abordaje también se puede usar para la liberación dirigida de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo un dominio variable único, de acuerdo con la divulgación a un tejido de interés. En una realización, se proporciona la liberación dirigida de un dominio variable único de alta afinidad de acuerdo con la divulgación.

En una realización, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo un dominio variable único, de acuerdo con la divulgación, se puede unir, es decir conjugar o asociar, a seroalbúmina, fragmentos y análogos de la misma. La extensión de la semivida mediante fusión a la albúmina se revisa en, por ejemplo, el Capítulo 12, páginas 223-247 “Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives” Edited by Roland Kontermann, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9.

Ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina adecuadas se describen en, por ejemplo, los documentos WO2005077042 y WO2003076567.

En otra realización, un dominio variable único, polipéptido o ligando de acuerdo con la divulgación, se puede unir, es decir conjugar o asociar, a la transferrina, fragmentos y análogos de la misma.

En una realización, la extensión de la semivida se puede conseguir dirigiendo un antígeno o epítopo que incrementa la semivida in vivo. El tamaño hidrodinámico de una proteína de unión a antígeno y su semivida en suero se puede aumentar conjugando o asociando una proteína de unión a antígeno de la divulgación a un dominio de unión que se une a una molécula natural e incrementa la semivida in vivo.

Por ejemplo, la proteína de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se puede conjugar o unir a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-receptor de FC neonatal antiseroalbúmina, por ejemplo dAb receptor de Fc anti-SA o antineonatal, Fab, Fab' o scFv, o a un affibody anti-SA o affibody del receptor de Fc anti-neonatal o un avímero anti-SA o un dominio de unión anti-SA que comprende un armazón seleccionado de , entre otros, el grupo constituido por CTLA-4, lipocalina, SpA, un affibody, un avímer,o GroEl y fibronectina (véase el documento WO2008096158 para una divulgación de estos dominios de unión. Conjugación se refiere a una composición que comprende polipéptido, dAb o antagonista de la divulgación que está unido (de forma covalente o no covalente) a un dominio de unión tal como un dominio de unión que se une a seroalbúmina.

En otra realización, el dominio de unión puede ser un dominio polipeptídico tal como un dominio de unión a albúmina (DUA) o una pequeña molécula que se une a la albúmina (revisado, por ejemplo, en el Capítulo 14, páginas 269-283 y el Capítulo 15, páginas 285-296, “Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives” Edited by Roland Kontermann, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9).

En una realización se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de albúmina antisuero o del receptor Fc anti­ neonatal.

La semivida prolongada de los anticuerpos IgG se ha notificado que depende de su unión a FcRn. Por tanto, las sustituciones que aumentan la afinidad de unión de IgG a FcRn a pH 6,0 al tiempo que se mantiene la dependencia de pH de la interacción mediante ingeniería de la región constante se han estudiado ampliamente (Ghetie et al., Nature Biotech. 15: 637-640, 1997; Hinton et al., JBC 279: 6213-6216, 2004; Dall'Acqua et al., J Immunol 117: 1129-1138, 2006). Otro medio de modificación de las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento implica incrementar la semivida in vivo de dichas proteínas mediante la modificación del dominio constante de inmunoglobulina o dominio de unión a FcRn (receptor de Fc del neonato).

En mamíferos adultos, el FcRn, también conocido como receptor de Fc neonatal, desempeña un papel crucial en el mantenimiento de los niveles de anticuerpo en suero actuando como receptor protector que se une y rescata anticuerpos del isotipo IgG de la degradación. Las moléculas de IgG sufren endocitosis por las células endoteliales y si se unen a FcRn, se reciclan en la circulación. Por el contrario, las moléculas de IgG que no se unen a FcRn entran en las células y son dirigidas a la vía lisosómica, donde se degradan.

Se cree que el receptor de FcRn neonatal está implicado en el aclaramiento de los anticuerpos y la transcitosis a través de los tejidos (véase Junghans (1997) Immunol. Res 16. 29-57 y Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766). Los residuos de IgG1 humana que se ha determinado que interaccionan directamente con los FcRn humanos incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435. Los desplazamientos en cualquiera de las posiciones descritas en esta sección pueden permitir un incremento de a semivida en suero y/o alteraciones en las propiedades efectoras de las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento.

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento pueden tener modificaciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del dominio constante o fragmento del mismo por FcRn. El incremento de la semivida de las IgG terapéuticas y diagnósticas y otras moléculas bioactivas tiene muchos beneficios, incluida la reducción de la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación de estas moléculas. En una realización se proporciona una proteína de unión a antígeno en el presente documento o una proteína de fusión que comprende todo o una porción (una porción de unión a FcRn) de un dominio constante de IgG que tiene una o más de estas modificaciones de aminoácidos y una molécula proteica no IgG o no proteica conjugada con dicho dominio constante de IgG modificado, en el que la presencia del dominio constante de IgG modificado aumenta la semivida in vivo de la proteína de unión a antígeno.

La publicación PCT N° WO 00/42072 divulga un polipéptido que comprenden una región Fc variante con alteración de la afinidad de unión a FcRn, en el que el polipéptido comprende una modificación de aminoácido en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácido 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 388, 400, 413, 415, 424.433, 433, 434.435, 435, 436, 439, y 447 de la región Fc, en el que la numeración de los residuos de la región Fc es la del índice de la UE (Kabat y coI., et al).

La publicación PCT n° WO 02/060919 A2 divulga una IgG modificada que comprende un dominio constante de IgG que comprende una o más modificaciones de aminoácidos respecto a un dominio constante de IgG salvaje, en el que la IgG modificada tiene una mayor semivida en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG salvaje, y en el que la una o más modificaciones de aminoácidos están en una o más de las posiciones 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 y 428-435.

Shields y col. (2001, J Biol Chem ; 276:6591-604) usaron mutagénesis de barrido con Alanina para alterar los residuos en la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano y, después, evaluaron la unión a FcRn humano. Las posiciones que anulan con eficacia la unión a FcRn cuando se cambian a alanina incluyen I253, S254, H435 y Y436. Otras posiciones mostraron una reducción más pronunciada de la unión del siguiente modo: E233-G236, R255, K288, L309, S415 y H433. Varias posiciones de aminoácidos exhibieron una mejora en la unión a FcRn cuando se cambian a alanina; notablemente entre estos se encuentran P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424 y N434. Muchas otras posiciones exhibieron una ligera mejora (D265, N286, V303, K360, Q362 y A378) o ningún cambio (S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444, and K447) en la unión a FcRn.

El efecto más pronunciado se observó en las variantes de combinación con mejor unión a FcRn. A pH 6,0, la variante E380A/N434A mostró una unión a FcRn, más de 8 veces mejor respecto a la IgG1 nativa, en comparación con 2 veces por E380A y 3,5 veces por N434A. La adición de T307A a esto efectuó una mejora por 12 veces de la unión respecto a la IgG1 nativa. En una forma de realización, la proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento comprende las mutaciones E380A/N434A y tiene una unión incrementada a FcRn.

Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.;169:5171-80) han descrito la mutagénesis aleatoria y detección selectiva de bibliotecas de expresión en fagos del fragmento Fc-bisagra de IgG1 humana frente al FcRn de ratón. Divulgaron la mutagénesis aleatoria de las posiciones 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, y 436. Las principales mejoras en la estabilidad del complejo IgG1-FcRn humano se produce al sustituir los residuos localizados en una banda a través de la interfaz Fc-FcRn (M252, S254, T256, H433, N434, y Y436) y, en menor medida, con las sustituciones de residuos en la periferia, como V308, L309, Q311, G385, Q386, P387 y N389. La variante con la afinidad más alta por FcRn humano se obtuvo combinando las mutaciones M252Y/S254T/T256E and H433K/N434F/Y436H y exhibió un incremento por 57 de la afinidad con respecto a la IgG1 natural. El comportamiento in vivo de dicha IgG1 humana mutada exhibió un incremento de casi 4 veces la semivida en suero en macaco de Java en comparación con la IgG1 natural.

En el presente documento se desvela una variante de una proteína de unión a antígeno con una unión a FcRn optimizada. En una realización preferida, dicha variante de una proteína de unión a antígeno comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc de dicha proteína de unión a antígeno, en la que dicha modificación se selecciona del grupo constituido por 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 y 447 de la región Fc en comparación con dicho polipéptido parental, siendo la numeración de los aminoácidos en la región Fc la del índice de la UE de Kabat,

En un aspecto adicional, las modificaciones son M252Y/S254T/T256E.

Adicionalmente, varias publicaciones describen procedimientos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas se modifican introduciendo un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas (documento WO 97/43316; patente de EE.UU. N° 5.869.046; patente de EE.UU. N° 5.747.035; documentos WO 96/32478; WO 91/14438) o fusionando las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión por FcRn están conservadas pero las afinidades por otros receptores Fc se han reducido considerablemente (documento (WO 99/43713) o fusionando con los dominios de unión a FcRn de los anticuerpos (documentos WO 00/09560; patente de EE.UU. N° 4.703.039).

Aunque las sustituciones en la región constante pueden mejorar significativamente las funciones de los anticuerpos IgG terapéuticos, las sustituciones en la región constante estrictamente conservada tienen el riesgo de inmunogenicidad en seres humanos (Presta, supra, 2008; De Groot and Martin, Clin Immunol 131: 189-201, 2009) y la sustitución en la secuencia de la región variable altamente diversa podría ser menos inmunogénica. Los informes concernientes a la región variante incluyen modificar mediante ingeniería los residuos de CDR para mejorar la afinidad de unión al antígeno (Rothe et al., Expert Opin Biol Ther 6: 177-187,2006; Bostrom et al., Methods Mol Bioi 525: 353­ 376,2009; Thie et al., Methods Mol Biol 525: 309-322, 2009) e ingeniería de los residuos CDR y del marco conservado para mejorar la estabilidad (Worn and Pluckthun, J Mol Biol 305: 989-1010, 2001; Ewert et al., Methods 34: 184-199, 2004) y disminuir el riesgo de inmunogenicidad (De Groot and Martin, supra, 2009; Jones et al., Methods Mol Biol 525: 405-423, xiv, 2009). Como se ha indicado, la mejor afinidad por el antígeno se puede conseguir mediante maduración por afinidad usando la expresión en fagos o ribosoma de una biblioteca aleatorizada.

La mejor estabilidad se puede obtener racionalmente a partir de un diseño racional en base a la secuencia y la estructura. El riesgo de inmunogenicidad disminuido (desinmunización) también se puede conseguir mediante varias metodologías de humanización y la eliminación de los epítopos de los linfocitos T, que se puede predecir usando tecnologías in silico o determinar mediante ensayos in vitro. Adicionalmente, las regiones variables se han modificado mediante ingeniería para disminuir el pl. Una semivida más larga se observó para estos anticuerpos en comparación con anticuerpos silvestres a pesar de la unión a FcRn comparable. La ingeniería o selección de anticuerpos con unión a antígeno dependiente de pH para modificar la semivida del anticuerpo y/o antígeno, por ejemplo la semivida del anticuerpo IgG2 se puede acortar si los mecanismos de aclaramiento mediados por antígeno normalmente degradan el anticuerpo cuando está unido al antígeno. De un modo similar, el complejo antígeno:anticuerpo puede afectar a la semivida del antígeno, extendiendo la semivida protegiendo al antígeno de los procesos de degradación típicos o acortando la semivida a través de una degradación mediada por anticuerpos. Una realización se refiere a anticuerpos con una afinidad más alta por el antígeno a pH 7,4 en comparación con el pH endosómico (es decir, pH 5,5-6,0) de forma que la proporción de KD a pH5,5/ pH 7,4 o a pH 6,0/ pH 7,4 es 2 o mayor. Por ejemplo, para potenciar las propiedades farmacocinéticas (FC) y farmacodinámicas (FD) del anticuerpo, es posible modificar por ingeniería la unión sensible al pH del anticuerpo introduciendo histidinas en los residuos de CDR.

Composiciones Farmacéuticas

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento normalmente, aunque no necesariamente, se formularán en composiciones farmacéuticas antes de la administración a un paciente. En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Los procedimientos para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas son bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co and Pharmaceutical Biotechnology; Plenum publishing corporation; Volumes 2, 5 y 9).

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento se pueden formular para la administración de cualquier modo conveniente. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse, por ejemplo, mediante inyección o infusión continua (ejemplos incluyen, entre otros, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraportal). En una realización, la composición es adecuada para inyección subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para administración tópica (que incluye, entre otras, administración epicutánea, inhalada, intranasal u ocular) o administración enteral (que incluye, entre otros, administración oral o rectal).

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 0,0001 mg/kg a 10 mg/kg de proteína de unión al antígeno, por ejemplo entre 0,1 mg/lg y 5 mg/kg de proteína de unión al antígeno. Como alternativa, la composición puede comprender entre 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además de una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento, uno o más de otros agentes terapéuticos. Agentes terapéuticos adicionales que se pueden combinar con una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento incluyen, entre otros, anticuerpos anti-CTLA-4 (p. ej., ipilimumab y tremelimumab), anti-TIM-3, anti-OX40, anti-OX40L, anti-PD1 (p. ej., nivolumab, lambrolizumab), anti-PD1L, anti-GITR, anti-IL-5 (p. ej., mepolizumab), anti-factor de activación de linfocitos B-(BLyS) (p. ej., belimumab), anti-GITRL, anti-IL-7, anti-IL-7R, anti-CD20, anti-CCL20, anti-TNFD, anti-OSM y anti-IL-6, así como inhibidores de JAK, CCR9, RIP quinasas, proteínas BET, RORy1 y tiopurinas.

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento y uno o más de otros agentes terapéuticas para terapia de combinación se pueden formular en la misma composición o presentar en composiciones separadas. Las composiciones presentadas por separado se pueden administrar de forma simultánea o secuencial.

Procedimientos de uso

Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse en terapia. Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento que se unen al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) y producen reducción de linfocitos T activados por LAG-3+ pueden tener uso en el tratamiento o prevención de las enfermedades asociadas con la implicación de linfocitos T patógenos, tales como enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas y cáncer.

Ejemplos de estados de enfermedad en los que la proteína de unión a antígeno tiene efectos potencialmente beneficiosos incluyen enfermedades autoinmunitarias, incluyendo, entre otras, psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerosa), artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, hepatitis autoinmune, uveítis, diabetes de tipo I, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, enfermedad de Grave, enfermedad del injerto contra el huésped, tratamiento y/o prevención del rechazo del transplante de órganos, por ejemplo rechazo de transplante renal o hepático, colangitis esclerosante primaria, sarcoidosis, vasculitis, nefritis, púrpura trombocitopénica autoinmune, esclerosis sistémica, enfermedad celíaca, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, alopecia areata y miastenia gravis, enfermedades infecciosas, incluyendo, entre otras, hepatitis C, hepatitis B, VIH, tuberculosis y malaria; y enfermedades alérgicas incluyendo, entre otras, asma, dermatitis atópica y EPOC.

Las proteínas de unión a antígeno desveladas en el presente documento también pueden tener uso en el tratamiento del cáncer, incluyendo, entre otros, cáncer de ovarios, melanoma (p. ej., melanoma maligna metastásica), cáncer de próstata, cáncer intestinal (p. ej., cáncer de colon y cáncer de intestino delgado), cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer de mama, cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer pancreático, cáncer de útero, cáncer de hígado, cáncer de vejiga urinaria, cáncer cervicouterino, cáncer oral, cáncer cerebral, cáncer testicular, cáncer de piel, cáncer de tiroides y neoplasias malignas hematológicas incluyendo mielomas y leucemias crónicas y agudas.

Los expertos en la técnica apreciarán que las referencias en el presente documento a “tratamiento” o “terapia” pueden, en función de la afección, extenderse a profilaxis además del tratamiento de una afección establecida.

Por tanto, se proporciona como aspecto adicional de la invención un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención para usar en terapia.

Por tanto, también se proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención para usar en el tratamiento de la psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, LES, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa o hepatitis autoinmune; una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o cáncer.

En una realización adicional se proporciona una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento para usar en el tratamiento de la psoriasis.

En una realización adicional se proporciona una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento para usar en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.

En una realización adicional se proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención para usar en el tratamiento de la colitis ulcerosa.

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, es una cantidad de una proteína de unión a antígeno desvelada en el presente documento requerida para mejorar o reducir uno o más síntomas o para prevenir o curar la enfermedad.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1: Análisis SPR de Biacore™ de anticuerpos humanizados anti -LAG-3 purificados

Se humanizó A9H12 (IMP731), como se divulga en el documento WO 2008/132601, injertando CDR murinos en dos estructuras aceptoras humanas de cadena pesada y dos de cadena ligera. Se preparó una serie de variantes anti-LAG-3 humanizadas de cadena pesada y ligera, que contienen mutaciones inversas de humano a murino y modificaciones de CDR. Las variantes de cadena pesada se numeraron de H0 a H8, y J0, J7 a J13 y las variantes de la cadena ligera se numeraron de L0 a L10 y M0 a M1 Se analizó la unión de los sobrenadantes de los cultivos que contenían todas las combinaciones de variantes anti-LAG-3 humanizadas de cadena pesada y ligera a LAG-3 soluble recombinante marcado en Fc (IMP321). Los datos se analizaron usando un modelo 1:1 inherente al software Biacore™ 4000. Los anticuerpos se seleccionaron en base a las afinidades calculadas y también mediante comparación visual de sensogramas de unión con el anticuerpo quimérico IMP731. Se identificó un total de 54 construcciones que exhibían una unión equivalente o mejorada de IMP321 para reanálisis usando Biacore™ 3000. Los datos se ajustaron a 1:1 y a modelos bivalentes, inherentes al software de análisis Biacore 3000 y los datos de unión se compararon normalizando las curvas de unión en asociación máxima y comparando las tasas de disociación frente a IMP731 visualmente. Estos activaron los anticuerpos que mostraron tasas de disociación mejoradas en comparación con IMP731 que se ha de distinguir. Se seleccionó un total de 18 anticuerpos anti-LAG-3 humanizados para su posterior análisis en base a una cinética de unión equivalente o mejorada a sLAG-3 recombinante en comparación con IMP731. Estos 18 anticuerpos humanizados se volvieron a expresar y analizar del siguiente modo:

Los anticuerpos humanizados anti-LAG-3 se expresaron en células HEK 293 6E y se purificaron mediante cromatografía de afinidad del siguiente modo:

Expresión en HEK 2936E a escala de 100 ml

Los plásmidos de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanizados identificados en la Tabla 3 se sometieron a co-transfección transitoria en células HEK 2936E y se expresaron a escala de 100 ml para producir el anticuerpo.

Purificación de anticuerpos humanizados

Las moléculas de anticuerpo expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad. A los sobrenadantes de los cultivos celulares se añadieron perlas de sefarosa proteína A (GE Healthcare N° de cat. 17 - 5280 - 04) y se mezclaron a temperatura ambiente durante 30-60 minutos. Las perlas de proteína A sefarosa se centrifugaron después y se lavaron en PBS. Después, la mezcla se añadió a una columna desechable de 10 ml (Pierce, n° de cat.: 29924) y se dejó drenar el PBS. La columna se lavó 3 veces con 10 ml de PBS antes de la elución del anticuerpo con tampón de elución de IgG (Pierce, n° de cat.: 21009). El anticuerpo eluido se neutralizó inmediatamente usando tampón clorhidrato Trizma® 1M (T2819) y después se intercambió con tampón en PBS con una columna Vivaspin 6 mwco 5000 (n° de cat.:FDP-875 - 105D). El rendimiento se determinó mediante medición de la absorbancia a 280 nm. El nivel de proteína agregada en la muestra purificada se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Cinética de unión

La cinética de unión de los anticuerpos purificados para una molécula de sLAG-3 se evaluó mediante SPR usando un Biacore™ 3000. Un anticuerpo kappa anti-humano de cabra (Southern Biotech, número de catálogo 2060 - 01) se inmovilizó en un circuito CM5 mediante acoplamiento de amina primaria. Los anticuerpos anti-LAG3 humanizados se capturaron sobre esta superficie y la molécula LAG3-Ig IMP321 (Chrystelle Brignone, Caroline Grygar, Manon Marcu, Knut Schakel, Frederic Triebel, The Journal of Immunology, 2007, 179: 4202 - 4211) usada como analito a 64 nM con una inyección de tampón (es decir, 0 nM) se usó como doble referencia de las curvas de unión. La regeneración se produjo con glicina 10 mM a pH 1,5. El recorrido se llevó a cabo en el Biacore™ 3000 usando HBS-EP como tampón de desarrollo y a 25°C. Los sensogramas se normalizaron según la unión a la máxima asociación y las tasas de disociación se compararon frente a IMP731 mediante inspección visual de los perfiles del sensograma.

Los resultados muestran que los anticuerpos anti-LAG-3 humanizados purificados se pueden clasificar en 3 grupos; el grupo 1 con variantes humanizadas que parecen ser mejores en la unión a IMP321 que IMP731 quimérico, el grupo 2 con variantes que parecen unirse de un modo muy similar a IMP731 y el grupo 3 con variantes que demuestran una unión peor que IMP731.

10 variantes humanizadas entran dentro del grupo 1 y demuestran tasas de disociación mejoradas (es decir, reducidas) en comparación con IMP731 mediante inspección visual de los sensogramas Biacore"™ Todas estas moléculas contenían la cadena ligera L7, que contiene una sustitución de glicina a prolina en la posición 27e en la CDR1 de la cadena ligera. Estos datos indican que la prolina en la posición 27e mejora la tasa de disociación para IMP321 de los anticuerpos anti-LAG-3 humanizados cuando se aparean con numerosas cadenas pesadas humanizadas.

De los anticuerpos restantes analizados, 4 moléculas entran dentro del grupo 2 y tenían tasas de disociación similares al anticuerpo IMP731 quimérico, mientras que otras 4 moléculas entran dentro del grupo 3 y exhiben peores tasas de disociación que IMP731. La tabla 3 proporciona una clasificación aproximada de dichas moléculas en comparación con IMP731. H5L7 exhibe la mejor tasa de disociación (es decir, la menor) en este experimento mediante inspección visual de los sensogramas Biacore™.

Tabla 3: Comparación de las tasas de disociación con IMP731

Ejemplo 2: Análisis de unión de anticuerpos anti-LAG-3 humanizados afucosilados y fucosilados naturales para determinar la unión a LAG-3-His humano recombinante usando el BiacoreTMT100

El anticuerpo afucosilado H5L7BW se generó mediante la expresión de plásmidos que codifican H5L7 en la línea celular BioWa POTELLIGENT® (CHO defectiva en FUT8). Se ha demostrado que los anticuerpos afucosilados producidos usando tecnología POTELLIGENT® exhiben un incremento de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en comparación con los anticuerpos convencionales altamente fucosilados equivalentes mediante un incremento de la afinidad por FcYRIIIa (CD16).

Los anticuerpos afucosilados y fucosilados naturales se compararon según su capacidad para unirse a LAG-3 ECD humano recombinante con una His6 en el extremo C (SEQ ID NO. 51) usando Biacore™ t 100 (GE Healthcare™). La proteína A se inmovilizó en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina primaria. Después, esta superficie se usó para capturar los anticuerpos humanizados. Después, LAG-3 ECD-His6 humano recombinante se pasó por los anticuerpos capturados a 32, 8, 2, 0,5 y 0,125 nM y la regeneración se llevó a cabo usando NaOH 50 mM. Las curvas de unión se comprobaron doblemente con inyección de tampón (es decir, 0 nM) y los datos se ajustaron al software de análisis T100 usando el modelo 1:1. El recorrido se llevó a cabo a 25°C usando HBS-EP como tampón de carrera.

Con el fin de investigar la significación estadística de estos datos cinéticos, este experimento se repitió 3 veces con el mismo lote de los cuatro anticuerpos y el control quimérico. Los parámetros KD, ka y kd se sometieron a transformación log (en base 10) antes de análisis estadísticos separados. Para cada parámetro se realizó un análisis de modelos mixtos de la varianza (“ANOVA”) con datos transformados, incluyendo términos para Run (Random Block Effect, efecto de bloqueo aleatorio) y Anticuerpo.

A partir del ANOVA se predijeron las medias geométricas para cada anticuerpo, además de intervalos estadísticamente plausibles (intervalos de confianza del 95%) para cada media. En el Anova se realizaron comparaciones planeadas de los anticuerpos. Las comparaciones se presentan como proporciones entre los dos anticuerpos comparados, de nuevo con intervalos de confianza del 95% y valores p. Las proporciones también se pueden interpretar como un número de cambios, por ejemplo una proporción de 0,1 corresponde a una disminución del 90%.

Se obtuvieron las medias geométricas para cada uno de los anticuerpos humanizados y el control quimérico IMP731 para la afinidad de unión (KD), mostrado en la Tabla 4. La KD media para H5L7 fue 0,2075 nM, una disminución significativa del 92 % (es decir, una disminución por 10) con p < 0,0001 cuando se comparó con IMP731. IMP731 exhibió una KD media de 2,76 nM. H5L7BW afucosilado exhibe una unión equivalente como H5L7 fucosilado, con una KD geométrica de 0,2179 nM, sin diferencias significativas (p = 0,1790).

La mejora de la afinidad observada para H5L7 en comparación con IMP731 está dirigida predominantemente por las diferencias en las tasas de disociación de los anticuerpos para LAG-3-ECD-His6, mostrado en la Tabla 5. Existe una disminución aproximada del 85% (es decir, una disminución casi de diez) en la KD para H5L7 en comparación con IMP731, que es altamente estadísticamente significativo. No existen diferencias significativas entre H5L7BW y H5L7 afucosilados (p = 0,4408).

Tabla 4: Evaluación estadística de la KD de variantes anti-LAG-3 fucosiladas y afucosiladas que se unen a LAG-3-His humano recombinante

Tabla 5: Evaluación estadística de la KD de variantes anti-LAG-3 fucosiladas y afucosiladas que se unen a LAG-3-His humano recombinante

continuación

Ejemplo 3: Evaluación del epítopo de unión LAG-3-His de variantes humanizadas anti-LAG-3 en comparación con anticuerpos quiméricos IMP731 usando ProteOn™

Se realizó un experimento de unión con H5L7 para evaluar si el epítopo LAG-3 dentro del cual se une IMP731 se conserva tras la humanización. Además, también se comparó el epítopo de unión de las variantes humanizadas fucosiladas y afucosiladas.

La unión del epítopo se evaluó usando la máquina biosensora ProteOn™ XPR36 (BioRadTM), evaluando si los anticuerpos anti-LAG-3 podían unirse de forma simultánea a LAG-3-His en complejo con el anticuerpo capturado sobre la superficie del chip ProteOn™ IMP731 y el anticuerpo murino no competitivo 17B4 se usaron como controles en este ensayo.

Los anticuerpos a analizar se biotinilaron usando el kit de biotinilación Ez-Link-sulfo-NHS. Cada anticuerpo biotinilado se capturó en una celda de flujo separada sobre un chip de NLC neutravidina usando una inyección vertical. Después de la captura de anticuerpos, la superficie se bloqueó con biocitina a 2,5 mg/ml. Usando un servicio de coinfección inherente al software de run ProteOn, se inyectó LAG-3 ECD-His6 sobre los anticuerpos acoplados a 100 nM, seguidos de los anticuerpos no biotinilados a 100 nM con ambas inyecciones horizontales de modo que LAG-3-His y los anticuerpos cruzaran los 6 anticuerpos capturados con neutravidina. El ensayo se realizó a 25°C y en HBS-EP en el sistema de matrices de interacción proteica ProteOn XPR36.

El análisis de datos se realizó usando puntos de informes tomados después de la inyección de LAG-3-His y puntos de informes tomados después de la inyección del analito del anticuerpo no biotinilado. La respuesta global se calculó restando la respuesta observada con la unión del anticuerpo de la respuesta observada con la unión de LAG-3 ECD-His6. Un valor de unidad de resonancia (UR) positiva significó que la inyección del analito anticuerpo se había unido a LAG-3 ECD-His6 en complejo con el anticuerpo biotinilado sobre la superficie de captura con neutravidina, indicativo de la unión a epítopos no competitivos. La falta de respuesta o una respuesta negativa significó que la inyección del analito anticuerpo no se había unido a LAG-3 ECD-His6 en complejo con el anticuerpo biotinilado sobre la superficie de captura con neutravidina, indicativo de que los anticuerpos se unen a epítopos competitivos.

Variantes humanizadas anti-LAG-3 (fucosiladas y afucosiladas) no pueden unirse a LAG-3 ECD-His6 humanos en complejo con IMP731, indicativo de que el epítopo para LAG-3 ECD-His6 se comparte y, por tanto, se conserva. El anticuerpo murino 17B4 puede unirse a LAG-3 ECD-His6 humanos en complejo con IMP731, lo que indica que este anticuerpo es no competitivo para la unión de LAG-3 ECD-His6 con IMP731. Por el contrario, los anticuerpos humanizados se pueden unir a LAG-3 ECD-His6 en complejo con 17B4.

Los resultados confirman que no ha habido alteraciones en el epítopo entre el IMP731 quimérico y la variante humanizada de IMP731 analizada en este experimento. El experimento también muestra que no hay diferencias entre los anticuerpos fucosilados y afucosilados con respecto a la unión.

Ejemplo 4: Análisis de unión de anticuerpos anti-LAG-3 humanizados a LAG-3 ECD-His6 recombinante de macaco de Java y de babuino usando Biacore™T100

La reactividad cruzada de unión de los anticuerpos anti-LAG-3 humanizados para LAG-3 ECD-His6 recombinante de macaco de Java y de babuino (SEQ ID NO. 52 y 53, respectivamente) se evaluó usando Biacore™T100 (GE Healthcare™).

La proteína A se inmovilizó en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina primaria. Después, esta superficie se usó para capturar los anticuerpos humanizados. Después, LAG-3 ECD-His6 recombinados de macaco de Java y de babuino generados internamente se pasaron por los anticuerpos capturados y la regeneración se llevó a cabo usando NaOH 50 mM. LAG-3 ECD-His6 se pasó a 16, 4, 1,0,25 y 0,0625 nM. Las curvas de unión se comprobaron doblemente con inyección de tampón (es decir, 0 nM) y los datos se ajustaron al software de análisis T100 usando el modelo 1:1.

El desarrollo se llevó a cabo 25°C usando HBS-EP como tampón de desarrollo.

H5L7, H5L7BW e IMP731 se unen con una afinidad comparable a LAG-3 ECD-His6 recombinante tanto de macaco de Java como de babuino. Los datos se generaron en experimentos separados, aunque se usó el anticuerpo quimérico IMP731 como control entre los experimentos.

Estos datos indican que ortólogos de LAG-3 recombinantes de primate no humano se unen a los anticuerpos derivados de H5L7 con una mejora por 10 en la afinidad en comparación con LAG-3 ECD-His6 recombinante humano (SEQ ID NO. 51) (H5L7: LAG-3 humano 0,208 nM, LAG-3 de macaco de Java 0,017 nM y LAG-3 de babuino 0,022 nM; H5L7BW LAG-3 humano 0,218 nM, LAG-3 de macaco de Java 0,021 nM y LAG-3 de babuino 0,024 nM). Mientras que los ortólogos de LAG-3 recombinantes de primate no humano se unen a los anticuerpos derivados de IMP731 con una mejora de la afinidad de aproximadamente 100 veces en comparación con LAG-3 ECD-His6 recombinante humano (s Eq ID NO. 51) (IMP731: LAG-3 humano 2,76 nM, LAG-3 de macaco de Java 0,021 nM y LAG-3 de babuino 0,019 nM).

Ejemplo 5: Perfiles de unión de H5L7BW, H5L7 e IMP731 a células EL4 que expresan LAG-3 humano y linfocitos T CD3+ primarios humanos activados

Se incubaron células EL4 que expresan LAG-3 humano con anticuerpos conjugados con IMP731, H5L7 o H5L7BW Alexa647 a concentraciones variables de hasta 50 pg/ml durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con tampón FACS (PBS 0,5 % de BSA) para eliminar el anticuerpo no unido.

Se prepararon linfocitos T CD3+ a partir de PBMC mediante selección negativa usando perlas Dynal de linfocitos T sin manipular. Los linfocitos T CD3+ se activaron mediante incubación con anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados e IL-12 humana recombinante soluble durante 3 días a 37oC. Las células activadas se incubaron con anticuerpos conjugados con Alexa 647 de concentraciones variables hasta 3 pg/ml durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con tampón FACS (PBS 0,5 % de BSA).

Las células EL4 y los linfocitos T CD3+ se analizaron mediante FACS usando un citómetro de flujo Beckman Coulter FC 500. Los datos brutos del FACS se analizaron usando el software de análisis CXP (Beckman Coulter). Los datos se representaron inicialmente en un gráfico de dispersión directa frente a dispersión lateral y se acotó la población de células de interés. Esta población acotada se representó después como un histograma mostrando la intensidad de la fluorescencia y la intensidad media de la fluorescencia (IMF) calculada. Los valores de la IMD se representaron después en un softWare GraphPad Prism 5 para generar curvas de respuesta a la dosis.

Los perfiles de unión de H5L7BW, H5L7 e IMP731 a células EL4 que expresan LAG-3 y los linfocitos T CD3+ humanos primarios activados se muestran en la Fig. 1. Los tres anticuerpos exhibieron características de unión similares a las células EL4 que expresan LAG-3 humano (Fig. 1A) y a los linfocitos T CD3+ humanos activados (Fig. 1B).

Ejemplo 6: Evaluación de la actividad de reducción de H5L7BW y H5L7 mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en linfocitos T humanos primarios.

Se realizó detección selectiva de los donantes usados en estos experimentos según las respuestas de memoria a los antígenos CD4 presentes en Revaxis, (difteria, tétanos y poliomielitis) y a un conjunto peptídico de CMVpp65 o a un conjunto peptídico de CD8, que contenían los epítopos peptídicos a CMV, EBV y gripe. El antígeno usado para realizar los estudios iniciales fue el conjunto peptídico CMVpp65. No obstante, debido al número limitado de donantes que demostraron una respuesta de memoria a este antígeno, Revaxis y el conjunto peptídico de CD8 fueron los antígenos usados para generar la mayor parte de los datos de potencia para los anticuerpos anti-LAG3.

Se recogió sangre periférica de voluntarios humanos sanos el día 0 (25 ml) y el día 5 (75 ml) del experimento y se usó para preparar células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad con ficoll. Las PBMC preparadas el día 0 se marcaron usando el kit CellTrace™ Violet Cell Proliferation de acuerdo con las instrucciones del fabricante, tras lo cual se lavaron, se sembraron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 24 pocillos a una densidad de 2 x 106/ml en medio y se estimularon con antígeno (Revaxis y el conjunto peptídico de CD8 se usaron a una dilución de 1:1000; el péptido CMVpp65 se usó a una dilución de 1:100). Las PBMC se incubaron durante 5 días a 37 °C en un incubador humidificado con CO2 al 5 %.

Se purificaron células NK donantes autólogas de las PBMC preparadas el día 5 del experimento mediante selección negativa usando kits de Invitrogen o Miltenyi Biotec de acuerdo con las instrucciones específicas de cada fabricante. Las células NK purificadas se contaron y se diluyeron a una densidad de 1,3 x 106/ml en medio.

Las células que se estimularon con antígeno durante 5 días se lavaron y se contaron y se diluyeron a una densidad de 2 x 106/células viables/ml en medio.

Las células NK donantes autólogas (80 pl) y las células activadas con antígeno (100 pl) se introdujeron con pipetas en tubos para FACS de 5 ml de poliestireno y de fondo redondo con el anticuerpo de ensayo o con medio (20 pl). Las concentraciones finales de los anticuerpos anti-LAG-3 analizados variaron de 1.000 a 0,015 ng/ml. Las muestras se incubaron durante 18 horas a 37 °C en un incubador humidificado con CO2 al 5 %. Tras 18 horas, en las muestras de ensayo ADCC se analizó la presencia de linfocitos T positivos para LAG-3 específicos de antígeno usando citometría de flujo. En resumen, las muestras se lavaron con tampón FACS, se bloquearon con Ig G humana (3 pg/tubo) y se incubaron con CD4, CD8, CD337, CD25 anti-humano de ratón y anticuerpos conjugados con fluorocromo anti-LAG-3 durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Después de una etapa adicional de lavado en PBS, las células se incubaron en presencia de una célula muerta fijable en verde durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Por último, las muestras se lavaron con PBS, se fijaron y se analizaron mediante citometría de flujo usando un tiempo de adquisición de 60 segundos a un caudal de 1 j l por segundo.

Todos los datos de la muestra se adquirieron usando el citómetro de flujo BD FACSCanto II con software FACS Diva, versión 6,1.3 (BD BioSciences). La tinción verde de células muertas fijables Vivas/Muertas se usó como marcador de exclusión de células muertas y se usaron el isotipo adecuado y controles de FMO-1 para definir las poblaciones negativas. En resumen, las células muertas se omitieron del análisis usando un gráfico de dispersión directa (FSC-A) contra fluorescencia en FL1 (tinción en verde de células muertas). Después, los dobletes se excluyeron del análisis usando un gráfico de FSC-W frente a FSC-H. Posteriormente se identificaron los linfocitos únicos viables y se acotaron usando una representación de dispersión directa (FSC-A) frente a dispersión lateral (SSC-A). Los linfocitos CD4 T específicos de antígeno se identificaron en esta población acotada de células usando representaciones de fluorescencia de CD4 frente a SSC-A y fluorescencia con pigmento violeta frente a fluorescencia CD4, respectivamente. Los linfocitos T CD4 específicos de antígeno se identificaron mediante una reducción de la fluorescencia con pigmento violeta. Se efectuó otra representación de la fluorescencia de CD25 contra la fluorescencia de LAG-3 para confirmar el estado de activación de esta población de células y que expresaban LAG-3. Se realizaron representaciones similares para identificar los linfocitos T CD8 específicos de antígeno.

Se registraron los porcentajes de los linfocitos T CD4 y CD8 específicos de antígeno presentes en cada muestra (como un porcentaje de la población de linfocitos viables). Se representaron los ajustes de curvas de pendiente variable no lineal de estos datos y se generaron los valores de CE50 usando el software GraphPad Prism (v5,03).

Para calcular el nivel máximo de reducción observado en un ensayo a la concentración más alta del anticuerpo analizado se usó la fórmula siguiente: (1-( % de linfocitos T específicos de antígeno restantes tras el tratamiento con anticuerpos)/( % de linfocitos T específicos de antígeno restantes en ausencia del anticuerpo))*100.

Se generaron datos de potencia para la reducción de linfocitos T CD8 y CD4 específicos de antígeno positivos para LAG3 mediante H5L7BW y H5L7 usando el sistema de ensayo in vitro detallado anteriormente. H5L7BW indujo la reducción de linfocitos T c D8 y CD4 específicos de antígeno positivos para LAG3 mediante ADCC en seis de los siete donantes estudiados por la desaparición de los respectivos tipos celulares. La potencia de H5L7BW en los linfocitos T CD4 específicos de antígeno, cuantificado por los valores de CD50, varió de 14 pg/ml a 3,4 ng/ml con unos niveles máximos de reducción que varían de 44 a 78 %. La potencia de este anticuerpo en los linfocitos T CD8 específicos de antígeno positivos para LAG-3 varió de 122 pg/ml a 17,5 ng/ml con unos niveles máximos de reducción que varían de 39 a 87 %. H5L7 medió en los niveles bajos de reducción o estaba inactivo en los donantes estudiados.

Ejemplo 7: Evaluación de la actividad de reducción de H5L7BW y H5L7 en un modelo de xenoinjerto SCID de PMBC/ratón humano in vivo

Este ensayo describe el uso de un modelo de xenoinjerto SCID de PBMC/ratón humano para evaluar la eficacia de la reducción in vivo de los anticuerpos monoclonales H5L7BW de reducción de LAG-3 afucosilados, completamente humanizados, sobre los linfocitos T humanos activados. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios sanos se aislaron y estimularon durante la noche (anti-CD3, IL-12) para inducir expresión de LAG-3 antes de la inyección en el peritoneo de ratones SCID inmunocomprometidos. Los anticuerpos de reducción de LAG-3 o control se coadministraron en el peritoneo o se inyectaron por vía intravenosa.

La reducción de células positivas para LAG-3 se evaluó mediante citometría de flujo en muestras de lavado peritoneal de 5 a 24 horas después de la inyección de las células.

Se se inyectaron en los ratones huPBMC activados (4 x 106 - 2 x 107 células en 0,4 ml de PBS) por vía intraperitoneal. Dependiendo de la vía de estudio concreta, los anticuerpos LAG-3 o los controles huIgG1 BioWa se coadministraron i.p. con las huPBMC o los ratones se pretrataron por vía intravenosa 18 horas antes de la inyección de huPBMC. 5 o 24 horas después de la inyección de las células se sacrificó a los ratones, se realizó un lavado peritoneal y el contenido celular del tampón de lavado se analizó mediante citometría de flujo. En resumen, el lavado peritoneal implicó 3 lavados de 5 ml de la cavidad peritoneal intacta usando PBS frío que contiene EDTA 3 mM.

Todos los datos de la muestra se adquirieron usando el citómetro de flujo BD FACSCanto II con software FACS Diva, versión 6,1.3 (BD BioSciences). Se añadieron aproximadamente 1 x 106 células (cuando fue posible) por tubo de FACS, las suspensiones celulares se centrifugaron a 1.500 rpm durante 10 minutos y el sedimento se resuspendió después en 3 ml de PBS. Después, los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 j l de tampón de lavado para FACS frío. Se añadieron 15 j l de reactivo de bloqueo FcR por tubo y las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después se añadieron 5 j l de cada anticuerpo de tinción (10 j l de anticuerpo de bloqueo/detección anti-LAG-3 prediluido a 1:100 17B4-PE) o el control del isotipo, respectivamente, y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Las células se lavaron después mediante la adición de 4 ml de tampón de FACS por tubo y centrifugación a 1.500 rpm durante 5 minutos, tras lo cual se decantó cuidadosamente el sobrenadante. Esta etapa de lavado se repitió. Por último, las células se resuspendieron en 300 j l de tampón para FACS y se analizaron mediante citometría de flujo. Además de la detección de LAG-3 mediante el uso del anticuerpo de bloqueo para LAG-3 marcado con fluorescencia 17B4-PE se usaron los siguientes marcadores de activación y linfocitos T para el fenotipado de los linfocitos T: CD45, CD4, CD8 y CD25. Los porcentajes de los linfocitos T CD4 y CD8 se expresaron como el porcentaje de células positivas para CD45. Las poblaciones de linfocitos T positivas para LAG-3 se expresaron como porcentajes de sus poblaciones parentales CD4 y CD8.

Se usó la versión 6.1.3 del software FACS Diva para generar análisis de los lotes de recuentos/acontecimientos celulares individuales y los porcentajes de poblaciones celulares. Los datos se analizaron con la versión 9,2.2 del software SAS usando un modelo lineal generalizado para datos binomiales. Este análisis modela directamente el recuento celular como una proporción de la población parental. De este modo, el tamaño de la población parental se tiene en cuenta durante el análisis. Se calcularon las medias para las proporciones del tipo celular diana para cada tratamiento junto con los intervalos de confianza del 95%. Estos se expresaron como porcentajes.

Las comparaciones planeadas de los tratamientos frente al control se realizaron usando cocientes de posibilidades. Esto expresa las posibilidades de tener un tipo de célula diana en un tratamiento como una proporción con la posibilidad de tener un tipo de célula diana en el tratamiento control. Un cociente de posibilidades < 1 indicaría unas posibilidades reducidas de tener el tipo celular en el tratamiento de interés en comparación con el control. Un cociente de posibilidades < 1 indicaría unas posibilidades reducidas de tener el tipo celular en el tratamiento de interés en comparación con el control.

Todos los experimentos se realizaron usando PBMC de donantes de sangre de individuos sanos y, debido a los grandes volúmenes de sangre requeridos por experimento, no se usó un donante más de una vez. Los niveles de expresión de LAG-3 tras la estimulación durante una noche variaron considerablemente entre donantes (variando de 2-73% de la expresión en la superficie celular), pero estas diferencias en los niveles de expresión no tuvieron ningún efecto sobre la eficacia de reducción altamente significativa de los anticuerpos analizados.

El modelo in vivo de PMMC humanas/SCID de ratón se usó con éxito para mostrar la reducción de linfocitos T que expresan LAG-3 humanos activados en el peritoneo de ratones SCID inmunocomprometidos. Dependiendo del donante, la vía de administración y el punto de tiempo del análisis, se deplecionaron entre 84,22 - 99,71 % de linfocitos T CD4 humanos positivos para LAG-3 y entre 84,64 - 99,62 % de linfocitos T CD8 humanos positivos para LAG-3. Como se muestra en la Figura 2, la coadministración de 5 mg/kg de H5L7BW a PBMC humanos activados en el peritoneo de ratones SCII condujo a una reducción altamente significativa de linfocitos T positivos para CD4 y CD8 positivos para LAG-324 horas después de la inyección en comparación con animales a los que se ha inyectado IgG control.

La Figura 3 destaca la comparación entre 5 mg/kg de H5L7BW y H5L75 horas después de la coadministración i.p. a PBMC humanos activados, como se ha descrito anteriormente. Ambos anticuerpos indujeron una reducción altamente significativa de linfocitos T CD4 y CD8 positivos para LAG-3 (Figura 3A).

Como se muestra en la Figura 4, la administración de 5 mg/kg de H5L7BW por vía intravenosa tuvo como resultado una reducción altamente estadísticamente significativa de linfocitos T positivos para LAG-3 tras 5 horas (Figura 4A), similar a lo observado en los experimentos con anticuerpos de reducción de lAG-3 coadministrados por vía i.p. La comparación entre H5L7BW, H5L7 e IMP731 administrados por vía i.v. (todos a 5 mg/kg) 5 horas después de la administración i.p. de PBMC humanas activadas reveló eficacias de reducción muy similares entre las 3 moléculas en comparación con los animales tratados con control (Figura 5). Cada uno de los 3 anticuerpos de reducción de LAG-3 analizados produjo una reducción muy significativa del número de linfocitos T CD4 y CD8 positivos para LAG-3 (Figura 5A) con H5L7BW, lo que demuestra una mayor capacidad de reducción en comparación con H5L7 o IMP731.

Ejemplo 8: Análisis de la unión de anticuerpos humanizados anti-LAG-3 a receptores gamma Fc humanos solubles recombinantes usando ProteOn™

La unión a FcYRIIIa humano se investigó con el fin de evaluar la capacidad de H5L7 y H5L7BW para inducir citotoxicidad mejorada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Se evaluó la unión de los anticuerpos anti-LAG-3 H5L7 y H5L7BW se evaluaron a FcYRIIIa humano soluble recombinante, además de a los receptores FcyRI y FcyRII usando la máquina biosensora ProteOn™ XPR36 (BioRadTM) y se compararon frente al anticuerpo quimérico IMP731.

Una IgG anti-poli-histidina de cabra se inmovilizó en un chip biosensor GLM mediante acoplamiento de amina primaria. Esta superficie se usó como superficie de captura para los receptores Fc gamma humanos marcados con polihistidina. Los anticuerpos que se iban a analizar se usaron como analito y se pasaron sobre 2048 nM, 512 nM, 128 nM, 32 nM y 8 nM con una inyección de 0 nM (es decir, tampón solo) usada para comprobar doblemente las curvas de unión. La superficie de IgG anti-polihistidina de cabra se regeneró con ácido fosfórico 100 mM entre interacciones. El desarrollo se llevó a cabo en el sistema ProteOn XPR36 Protein Array Interaction a 25°C y usando HBS-EP como tampón de desarrollo. Los datos se analizaron para cada receptor por separado, estableciendo una R-max global y usando el modelo de equilibrio inherente al software de análisis ProteOn. Las moléculas control se pasaron al principio y al final del conjunto de muestras a analizar para garantizar la comparabilidad de los resultados. Se compararon datos de dos experimentos y anticuerpos control híbridos se usaron como controles entre experimentos.

Los resultados muestran que H5L7BW se unió a ambos polimorfismos de FcYRIIIa (valina V158 y fenilalanina F158) con una afinidad mejorada de aproximadamente 10 veces en comparación con H5L7 (véase la Tabla 6). El anticuerpo fucosilado H5L7 se unió a FcYRIIIa con una afinidad similar a la del anticuerpo quimérico IMP731.

No se observaron cambios significativos entre la unión de los anticuerpos anti-LAG3 humanizados fucosilados y afucosilados a los receptores FcyRI o FcYRIIa.

Tabla 6: Unión de H5L7 y H5L7BW a los receptores Fc gamma humanos

Secuencias

Tabla 7: Resumen de las secuencias

continuación

SEQ ID NO. 1

KSSQSLLNPSNQKNYLA SEQ ID NO.2

FASTRDS SEQ ID NO.3

LQHFGTPPT

SEQ ID NO.4

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKR SEQ ID NO.5

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO. 6

AYGVN SEQ ID NO. 7

MIWDDGSTDYDSALKS

SEQ ID NO. 8

EGDVAFDY

SEQ ID NO. 9

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO. 10

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.11

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.12

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.13

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.14

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.15

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.16

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWDDGSTDYNSALKSRLTISKDNS KNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.17

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.18

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.19

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.20

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISKDNSKNQ VSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.21

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.22

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.23

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.24

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.25

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.26

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.27

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.28

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.29

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.30

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.31

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.32

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.33

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.34

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.35

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.36

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.37

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.38

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.39

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.40

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.41

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.42

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.43

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.44

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTSKNQ FSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.45

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.46

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.47

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWDDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKS QVFLKMNSLQTDDTARYYCAREGDVAFDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO.48

DIVMTQSPSSLAVSVGQKVTMSCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTD FTLTISSVQAEDLADYFCLQHFGTPPTFGGGTKLEIKR

SEQ ID NO.49 (Obsérvese secuencia líder diferente usada para anticuerpos quiméricos)

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWDDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKS QVFLKMNSLQTDDTARYYCAREGDVAFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.50

DIVMTQSPSSLAVSVGQKVTMSCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTD FTLTISSVQAEDLADYFCLQHFGTPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.51

LQPGAEVPWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRR YTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTA SPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGF NVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQA QAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRS FSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

SEQ ID NO.52

PQPGAEISWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAPAPGHPPAPGHRPAAPYSWGPRPRR YTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTA SPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGF NVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQA QAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQ LLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

SEQ ID NO.53

PQPGAEISWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAPAPGHPPAPGHRPAAPYSWGPRP RRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQAS MTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGQVPVQESPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILT YRDGFNVSIMYNLTVLGLEPTTPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLWGDNGNFTL RLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQERFVWSPLNTPSQRS FSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

SEQ ID NO.54

MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID NO.55

MESQTQVLMFLLLWVSGACA

SEQ ID NO.56

MPLLLLLPLL WAGALA

SEQ ID NO. 57

AAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC

SEQ ID NO. 58

TTCGCCTCTACCAGGGATTCC

SEQ ID NO. 59

CTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACT

SEQ ID NO. 60

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGT

SEQ ID NO. 61

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 62

GCCTACGGCGTCAAC

SEQ ID NO. 63

ATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGC

SEQ ID NO. 64

GAGGGCGACGTGGCCTTCGATTAC

SEQ ID NO. 65

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAG GGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC

SEQ ID NO. 66

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAG GGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT GAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGA GCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTT CCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGC CACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCA GGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 67

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 68

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAG GGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT GAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGA GCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTT CCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGC CACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCA GGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 69

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 70

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 71

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 72

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTG GGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCAGCAAGGAC AACAGCAAGAACCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 73

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 74

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 75

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 76

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCAAGGACAA CAGCAAGAACCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGG GAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGC CCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAG CTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCC ACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAG GGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGG CAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCC TGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGA ACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGAC AAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCC AGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 77

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 78

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 79

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 80

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATT GGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGAC ACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 81

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 82

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 83

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGC CCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTT CGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA GTGC

SEQ ID NO. 84

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATT GGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGAC ACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 85

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 86

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAG GGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT GAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGA GCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTT CCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGC CACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCA GGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 87

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 88

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTG GGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAG GGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT GAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGA GCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTT CCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGC CACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCA GGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 89

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 90

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 91

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 92

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 93

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 94

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 95

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 96

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATT GGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGAC ACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 97

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 98

CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCC AGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATG GGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGAC AAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 99

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGA GCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCAC TTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGT TCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAG CACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGC GAGTGC

SEQ ID NO. 100

CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTG AGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATT GGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGAC ACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCA GGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGG GCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGT TCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCC AGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAA GGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 101

ACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTG GTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCG GCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCC TGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGT GACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

SEQ ID NO. 102

GCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCC CTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC AGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA AGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCC CCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGT GGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAA CCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGA CCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTAC AGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

SEQ ID NO. 103

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGTCCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCT CAGGGTTCTCATTAACCGCCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGG AATGATATGGGATGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGTAAGGACAACTC CAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAAGG GGACGTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 104

GACATTGTGATGACACAGTCTCCCTCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTC CAGTCAGAGCCTTTTAAATGGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTC CTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCTGCAACATTTTGGCA CTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGG

SEQ ID NO. 105

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGTCCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCT CAGGGTTCTCATTAACCGCCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGG AATGATATGGGATGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGTAAGGACAACTC CAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAAGG GGACGTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCC TGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO. 106

GACATTGTGATGACACAGTCTCCCTCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTC CAGTCAGAGCCTTTTAAATGGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTC CTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCTGCAACATTTTGGCA CTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAG GCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

SEQ ID NO. 107

CTCCAGCCAGGGGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCC CACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGC CCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCC CAGGCCCCGCCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGC CCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGC GCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCG CCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGC TCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCC GGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCC CTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGA GCCCCCAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGGGCTGCCCTGCCGCCTGCCTGCTGGT GTGGGGACCCGGTCTTTCCTCACTGCCAAGTGGACTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGACTGGAG ACAATGGCGACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTGAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACACCTGCCATATCCAT CTGCAGGAACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCT GGATCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGTATCTGGACAAGAACGCTTTGTGTGGAGCTCTCTGGA CACCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCTTGGCTGGAGGCACAGGAGGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGG CAATGCCAGCTGTACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTGTACTTCACAGAGCTGTCTAGCCCACACC ACCATCATCACCAT

SEQ ID NO. 108

CCCCAGCCAGGGGCTGAGATCTCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCC ACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAACCAGACAGTGGCC CGCCCGCTCCCGCCCCCGGCCACCCCCCGGCCCCCGGCCATCGCCCGGCGGCGCCCTACTCTTGGGGGCCC AGGCCCCGCCGCTACACAGTGCTGAGCGTGGGTCCTGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCC CCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTGTGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCG CGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCACGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTTCGTCTGCGCG TGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGGTCTCTCAGGACCTCTGACTGGGTCATTTTGAACTGCTC CTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAGCCGTGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCAG GGGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCATGTCGGCCCCATGGACTCTGGGCTCTG GGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGAGCC CGCAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGAGCTGCCCTGCCGCCTGCCTCCTGCTGTG GGGACCCAGTCTTTCCTTACTGCCAAGTGGGCTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGGCTGGAGACA ATGGCGACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTAAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACATCTGCCATATCCGTCTA CAGGGACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCTGG CTCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGCATCTGGACAAGAACACTTTGTGTGGAGCCCCCTGAACA CCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCATGGCTGGAGGCCCAGGAAGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGGCA ATGCCAGCTGCACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTATACTTCACAGAACTGTCTAGCCCACACCAC CATCATCACCAT

SEQ ID NO. 109

CCCCAGCCAGGGGCTGAGATCTCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCC ACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAACCAGACAGTGGCC CGCCCGCTCCCGCCCCCGGCCACCCCCCGGCCCCCGGCCATCGCCCGGCGGCGCCCTACTCTTGGGGGCCC AGGCCCCGCCGCTACACAGTGCTGAGCGTGGGTCCTGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCC CCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTGTGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCG CGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCACGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTTCGTCTGCGCG TGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGGTCTCTCAGGACCTCTGACTGGGTCATTTTGAACTGCTC CTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAGCCGTGGCCAGGGCCAAGTCCCTGTCCAG GAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCATGTCGGCCCCATGGACTCTGGGCTCTG GGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGAGCC CACAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGAGCTGCCCTGCCGCCTGCCTCCTGCTGTG GGGACCCAGTCTTTCCTTACTGCCAAGTGGGCTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGGTTGGAGACA ATGGCAACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTAAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACATCTGCCATATCCGTCTA CAGGGACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCTGG CTCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGCATCTGGACAAGAACGCTTTGTGTGGAGCCCCCTGAACA CCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCGTGGCTGGAGGCCCAGGAAGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGGCA ATGCCAGCTGCACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTATACTTCACAGAACTGTCTAGCCCACACCAC CATCATCACCAT

SEQ ID NO. 110 ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCTACCGGAGTGCACAGC

SEQ ID NO. 111

ATGGAATCACAGACCCAGGTCCTCATGTTTCTTCTGCTCTGGGTATCTGGTGCCTGTGCA

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo capaz de unirse al gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) y que comprende a) la cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO. 4 y b) la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO. 9.

2. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al menos es capaz de unirse a LAG-3 expresado sobre linfocitos T activados.

3. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo es capaz de reducir los linfocitos T LAG-3+ humanos activados.

4. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el anticuerpo humanizado una región constante de IgG1 humana.

5. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende a) una secuencia de cadena ligera con una identidad de al menos un 97 % con la SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada con una identidad de al menos un 97 % con la SEQ ID NO. 10.

6. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende a) una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO. 5 y b) una secuencia de cadena pesada de SEQ iD NO. 10.

7. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que no está fucosilado.

8. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, no comprendiendo el anticuerpo humanizado fucosa en la estructura de hidrato de carbono del núcleo unida a la Asn297.

9. Una molécula de ácido nucleico aislado que a) codifica un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o b) comprende la SEQ ID NO. 61 que codifica la secuencia de la cadena ligera y la SEQ ID NO. 66 que codifica la secuencia de la cadena pesada.

10. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el gen FUT8 que codifica la alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped.

13. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 producida por la célula huésped de la reivindicación 11o 12.

14. Un procedimiento de producción de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo y b) aislar el anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo.

15. Un procedimiento de producción de un anticuerpo humanizado de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, que comprende a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 12 en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo humanizado, en el que el gen FUT8 que codifica la alfa-1,6-fucosiltransferasa se ha inactivado en la célula huésped recombinante, y b) aislar el anticuerpo humanizado.

16. Una composición farmacéutica, que comprende a) un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.

18. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo constituido por psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, cirrosis biliar primaria, lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa y hepatitis autoinmune; una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o cáncer.

19. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la enfermedad es colitis ulcerosa.