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CN112423845B - 结合pd-l1和cd137的抗体分子 - Google Patents

结合pd-l1和cd137的抗体分子 Download PDF

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CN112423845B CN201980046597.4A CN201980046597A CN112423845B CN 112423845 B CN112423845 B CN 112423845B CN 201980046597 A CN201980046597 A CN 201980046597A CN 112423845 B CN112423845 B CN 112423845B
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Abstract

本申请涉及结合PD‑L1和CD137并且能够诱导CD137激动作用的抗体分子。所述抗体分子包含基于CDR的PD‑L1结合位点，和位于抗体分子的恒定域中的CD137抗原结合位点。本发明的抗体分子可用于例如疾病(如癌症)的治疗。

Description

结合PD-L1和CD137的抗体分子
发明领域
本发明涉及结合PD-L1和CD137并且能够诱导CD137激动的抗体分子。抗体分子包含基于CDR的PD-L1结合位点，和位于抗体分子的恒定域中的CD137抗原结合位点。本发明的抗体分子可用于例如疾病(例如癌症)的治疗。
发明背景
程序性细胞死亡1(PD-1)及其配体PD-L1(CD274，B7-H1)和PD-L2(B7-DC)提供抑制信号以调节T细胞活化、耐受性和免疫病理之间的平衡。PD-L1在所有免疫细胞和某些肿瘤细胞上瞬时表达。PD-L1是B7蛋白家族的成员，与B7.1和B7.2有大约20％的氨基酸序列同一性。人PD-L1与PD-L1的鼠类和猕猴直系同源物分别具有70％和93％的氨基酸同一性。
PD-L1与其受体PD-1结合的亲和力(KD)为770nM。PD-1在活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达，并调节细胞免疫应答的激活或抑制。PD-L1与PD-1的结合可提供抑制信号，从而减少细胞因子的产生和T细胞的增殖。因此，细胞中PD-L1的表达可以介导针对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤的保护作用，并且是抑制病毒感染过程中慢性免疫应答的调节机制。癌症是一种慢性和促炎性疾病，它通过上调PD-L1表达来破坏这种免疫保护途径，从而逃避宿主的免疫反应。在主动免疫反应的情况下，干扰素-γ(IFN-γ)也上调了PD-L1的表达。
PD-L1还通过与另一种蛋白质B7.1(也称为CD80)相互作用来介导免疫抑制，从而阻止其通过CD28在T细胞上传递激活的次级信号之一的能力。就PD-L1在肿瘤细胞上的表达及其与B7.1的结合而言，这种特异性相互作用与肿瘤免疫抵抗的相关性仍不清楚。
PD-L1表达已在多种实体瘤中显示。在一项研究中检查的654个样本中，跨越不同部位的19个肿瘤中，有89个(14％)为PD-L1阳性(频率≥5％)。在头颈部(17/54；31％)、宫颈(10/34；29％)、未知的原发性癌症(CUP；8/29；28％)、多形胶质母细胞瘤(GBM；5/20；25％)、膀胱(8/37；21％)、食道(16/80；20％)、三阴性(TN)乳腺癌(6/33；18％)和肝癌(6/41；15％)中，PD-L1阳性率最高(Grosso等人，2013)。肿瘤相关的PD-L1的表达已显示出赋予免疫抗性，并可能保护肿瘤细胞免受T细胞介导的细胞凋亡。
临床试验表明，靶向PD-L1在患者中的临床益处使得迄今为止批准了三种抗PD-L1靶向单克隆抗体。结合PD-L1的人源化IgG1抗体，阿特珠单抗(Atezolizumab)(MPDL3280A，RG7466，TecentriqTM)，在临床试验显示PD-L1阳性肿瘤患者的客观缓解率(ORR)分别为38％和43％(Iwai等人，2017)后，被批准用于非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗以及膀胱癌的一线和二线治疗。阿维单抗(Avelumab)(MSB0010718C，BavencioTM)是与PD-L1结合的完全人IgG1抗体，已被批准用于治疗默克尔细胞癌和膀胱癌的二线治疗，而完全人IgG1抗体德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736，ImfinziTM)被批准用于治疗二线膀胱癌。这些抗体和其他抗PD-L1治疗剂的其他试验正在进行中，其重点是扩大可以治疗的实体癌的范围，包括结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、卵巢癌和肾细胞癌。
CD137(4-1BB；TNFRSF9)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的共刺激分子。众所周知，CD137在激活后会在CD8+T细胞上被上调，并且还可以在激活的CD4+辅助T细胞、B细胞、调节性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和树突状细胞(DC)中表达(Bartkowiak和Curran，2015)。在1997年首次描述了CD137在增强T细胞细胞毒性中的主要功能作用(Shuford等人，1997)，此后不久就提出了抗CD137单抗作为抗癌治疗剂。
CD137是一种跨膜蛋白，具有四个胞外富含半胱氨酸的结构域，称为CRD1-4，并具有负责CD137信号传导的胞质区域。CD137的配体是CD137L。尽管不存在CD137/CD137L复合物的晶体结构，但可以预测CD137与CD137L形成三聚体/三聚体复合物(Won等人，2010)。CD137L的结合导致受体三聚体的形成和随后多个受体三聚体的聚集，并导致CD137信号级联的激活。该信号级联反应为T细胞提供了针对激活诱导的细胞死亡的生存信号(Hurtado等人，1997)，从而在维持有效的T细胞免疫应答和产生免疫记忆中起着至关重要的作用(Bartkowiak和Curran，2015)。
CD137由活化的T细胞表达，并且已经用作鉴定抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的标志物(Wolfl等人，2007；Ye等人，2014)。通常，CD137在CD8+T细胞上的表达高于CD4+T细胞(Wen等人，2002)。在CD8+T细胞的情况下，通过产生干扰素γ和白介素2的增殖、存活和细胞毒性效应功能归因于CD137交联。CD137交联还有助于记忆CD8+T细胞的分化和维持(Chacon等人，2013)。在CD4+T细胞的某些子集中，CD137交联类似地导致增殖和活化，并导致细胞因子如白介素2的释放(Makkouk等人，2016)。还已经证明CD137在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的肿瘤反应性亚型上表达。已证明CD137单一疗法在几种临床前免疫原性肿瘤模型(例如MC38、CT26和B细胞淋巴瘤)中有效。
由于与CD137激动剂抗体治疗相关的剂量限制性高度肝脏炎症，CD137单抗的临床开发进展缓慢。乌鲁单抗(Urelumab，BMS-663513)是一种非配体封闭性人IgG4同种型抗体(Chester等人，2018年)，是首个进入临床试验的抗CD137抗体，但在观察到显著的靶向性、剂量依赖性肝毒性后，这些药物被停用(Chester等人，2018；Segal等人，2017；和Segal等人，2018)。最近，治疗实体癌的临床试验建议使用乌鲁单抗，其中将乌鲁单抗治疗与放疗(NCT03431948)或其他治疗性抗体，如利妥昔单抗(NCT01775631)、西妥昔单抗(NCT02110082)、抗PD-1抗体纳武单抗(NCT02253992、NCT02534506、NCT02845323)、以及纳武单抗和抗LAG-3抗体BMS986016(NCT02658981)的组合联合使用。但是，为减少与urelumab治疗相关的肝毒性，在这些试验中必须限制乌鲁单抗的剂量，且疗效令人失望(Chester等人，2018)。
辉瑞抗CD137抗体埃托米鲁单抗(utomilumab，PF-05082566)是人IgG2同种型抗体，在晚期癌症的I期临床试验中剂量范围为0.03mg/kg至10mg/kg，未观察到剂量限制性毒性(Chester等人，2016；Segal等人，2018)。但是，在实体瘤患者中，使用该抗体的总体客观应答率仅为3.8％，这可能表明埃托米鲁单抗的药效和临床疗效比乌鲁单抗弱，同时具有更有利的安全性(Chester等人，2018；Segal等人，2018)。已将埃托米鲁单抗与放射疗法(NCT03217747)或化学疗法结合进行测试，并与其他抗体疗法(包括抗PD-L1抗体阿维单抗(NCT02554812)和抗PD-1抗体派姆单抗(NCT02179918))结合进行测试，以评估不同治疗组合的安全性、耐受性、剂量限制性毒性(DLT)、最大耐受剂量(MTD)和功效。这些试验正在进行中，早期结果表明，剂量达到5mg/kg无DLT，且埃托米鲁单抗和派姆单抗联合用药的患者反应率为26％。(Tolcher等人，2016)(Pérez-Ruiz等人，2017)。
正在进行临床试验以测试抗CD137抗体埃托米鲁单抗与抗PD-L1抗体阿维单抗(NCT02554812、NCT3390296)的组合。埃托米鲁单抗与阿维单抗的三联组合以及其他疗法也正在测试中(NCT02554812、NCT03217747、NCT03440567、NCT03414658)。
许多靶向CD137的双特异性分子也处于早期开发阶段，例如那些靶向CD137以及FAP-α(Link等人，2018；Reichen等人，2018)，HER2(Hinner等人，2015和WO 2016/177802A1)或EphA2(Liu等人，2017)的分子。例如通过FAP-α靶向肿瘤的CD137L融合蛋白(Claus等人，2017)也正在开发。临床上最先进的CD137双特异性分子是PRS-343，这是一种CD137/HER2双特异性分子，最近已进入I期临床试验，用于治疗一系列实体瘤，以评估其安全性、耐受性和功效(NCT03330561)。
还有其他方法可以将抗CD137活性和抗PD-L1活性组合到双特异性疗法中。一种方法是利用biclonics技术产生与CD137和PD-L1单价结合的全长异源二聚体人IgG(WO2018056821)，从而产生一种分子，该分子可以与CD137和PD-L1结合并在高PD-L1水平存在下诱导CD137激动。第二种方法已经描述了使用sdAb-Fc融合物靶向CD137和PD-L1两者(WO2017123650)。两种方法都能够在不存在PD-L1结合的情况下结合CD137，并在不存在PD-L1的情况下诱导低水平的CD137激动作用，在高水平的PD-L1的存在下这种激动作用会增加。已经描述了另外的异二聚体双特异性抗体，其与CD137和PD-L1二者均单价结合(WO2019/025545A1)，其包含人源化的抗CD137结合区和在存在PD-L1的水平的情况下诱导CD137激动的人抗PD-L1区。
当前数据显示，使用抗PD-L1单药进行整体治疗导致不到50％的癌症患者有反应。因此，在本领域中仍然需要可以靶向PD-L1并且可以在癌症治疗中应用的其他分子。
PD-1/PD-L1阻滞剂具有很强的临床验证性，但是在单药治疗中只有不到50％的患者对此有反应。PD-L1和其他免疫调节剂的组合有望表现出更高的功效。但是，此类组合可能与治疗相关不良事件的增加有关，因此疗效可能会受到有限的治疗窗口的限制靶向CD137的激动分子尚未在癌症患者中显示出明显的反应，这可能部分是由于有限的治疗指数导致剂量水平相对较低。因此，本领域仍然需要开发在安全和有效的疗法中结合PD-L1阻滞和引起CD137激动作用的治疗。
发明说明
如上文背景部分所述，由于治疗与剂量限制的高度肝炎(乌鲁单抗)或低临床疗效(埃托米鲁单抗)有关，CD137激动剂分子的临床发展受到了阻碍。
本发明人认识到，本领域需要表现出高活性并且激动作用可定位于肿瘤微环境的CD137激动剂分子。这样的分子可以以该分子最优的效力和功效的剂量施用于个体，并且可以例如作为免疫治疗剂用于癌症的治疗。
本发明的抗体分子包含位于抗体分子的恒定域中的CD137抗原结合位点。本发明人进行了广泛的选择和亲和力成熟程序，以分离出一组包含CD137抗原结合位点的分子(在本文中也称为“Fcabs”)，其以比单体CD137更高的亲和力与二聚CD137结合。
如本文所述，“亲和力”可以指抗体分子与其同源抗原之间的结合相互作用的强度，通过KD测量。对于本领域技术人员显而易见的是，其中抗体分子能够与抗原形成多重结合相互作用(例如，其中抗体分子能够与抗原二价结合并且任选地抗原是二聚体)，通过KD测得的亲和力也可能受亲合力影响，其中亲合力是指抗体-抗原复合物的整体强度。
T细胞激活时CD137的表达上调。不希望受理论的束缚，据认为由于CD137在活化的T细胞上的高表达，CD137在此类细胞表面上将以二聚体、三聚体和更高阶多聚体的形式存在。相反，幼稚的免疫细胞，例如幼稚的T细胞，在其细胞表面表达低水平或可忽略的CD137，因此存在的任何CD137都可能是单体形式。因此，预期包含具有高亲和力的与二聚或多聚CD137结合的CD137抗原结合位点的抗体分子将优先与活化的免疫细胞结合，例如活化的T细胞，而不是幼稚的免疫细胞。
相信CD137抗原结合位点的这些特征使本发明的抗体分子与结合CD137的已知抗体，例如WO2018056821中描述的抗体区别开。WO2018056821描述了包含以高亲和力(低nM范围，参见WO2018056821的表6)结合CD137的单价CD137结合结构域的抗体。由于这些抗体不能区分单体CD137和二聚体CD137或多聚体CD137，因此不能预期这些现有技术抗体会显示出相同的与活化免疫细胞的优先结合。
如上文背景部分所述，认为CD137配体与CD137的初始连接引发了一系列事件，导致受体三聚化，随后是受体聚集、激活和随后的有效抗肿瘤T细胞活性的启动。因此，对于有效地实现CD137活化的治疗剂，预期需要以模仿三聚体配体桥接的方式将几种受体单体桥接在一起。
埃托米鲁单抗是IgG2分子，其激动剂活性依赖于通过Fcγ受体的交联。乌鲁单抗是具有组成性活性的IgG4分子，因此它的活性不需要通过Fcγ受体的交联，尽管它的激动剂活性在某些Fcγ受体交联时会增强。Fcγ受体遍布整个人体。因此，埃托米鲁单抗和乌鲁单抗的免疫细胞激活活性不仅限于体内的特定部位，从而可能发生在肿瘤微环境以外的其他部位，例如肝脏。
本发明人已经表明存在于本发明的抗体分子中的CD137抗原结合位点需要交联以聚集和激活CD137。但是，应该注意这不是CD137结合剂的固有特征。而是，在筛选程序期间分离出的许多CD137结合剂都与CD137结合，但不需要交联进行CD137聚集和活化，或者在没有交联的情况下诱导有限的CD137聚集和活化。
如上所述，Fcγ受体介导的交联具有在整个人体中发现Fcγ受体的缺点，因此CD137活化不限于特定部位。因此，本发明人将突变引入Fcab的CH2结构域中以减少或消除Fcγ受体结合。因此，在没有通过除Fcγ受体以外的试剂的交联的情况下，本发明的抗体分子不表现出CD137激动剂活性。此外，预期这些突变将导致本发明的抗体分子不能诱导抗体细胞的细胞毒性，因此抗体分子将不会引起它们激活的免疫细胞的杀伤。
本发明人已经证明，包含上述CD137抗原结合位点和基于CDR的PD-L1结合位点的抗体分子对于活化CD137和PD-L1共表达的位置，例如肿瘤微环境中的免疫细胞是非常有效的。从这个意义上讲，共表达涵盖了CD137和PD-L1在相同细胞(例如T细胞)上表达的情况，以及CD137和PD-L1分别在不同的细胞(例如T细胞和肿瘤细胞)上表达的情况。
抗体分子能够同时结合CD137和PD-L1。因此，认为在PD-L1和CD137共表达的位置，抗体分子与PD-L1的结合引起抗体分子的交联，进而导致T细胞表面上结合的CD137的聚集和活化。
如本发明人所证明的，通过减少或消除Fcγ受体的结合，抗体分子的激动活性取决于存在的PD-L1和CD137。换句话说，激动活性是条件性的，因此预期抗体分子仅能够激活存在PD-L1的位置，例如肿瘤微环境中的免疫细胞。例如，预期免疫细胞的这种靶向活化将有利于避免用乌鲁单抗治疗所见的肝脏炎症。
实际上，本发明人证明了具有上述特征的抗体分子在小鼠模型中以治疗剂量给药时未显示出严重的肝毒性。在已给药这些抗体分子的小鼠中，仅观察到微小的肝脏病理，这不被认为代表先前报道的其他抗CD137激动剂抗体的严重肝毒性。对食蟹猴的初步研究还显示，该抗体分子是安全的，耐受性高达30mg/kg。不希望受到理论的束缚，预期这些动物模型的结果将转化到临床，以预测人类患者的肝毒性风险，因此本发明的抗体分子在以治疗剂量治疗的人类患者中诱导肝毒性的风险较低。
本发明人还提供了体外证据，即由抗体分子诱导的CD137激动活性水平与细胞表面上PD-L1表达的量相关。发明人证明，即使在PD-L1表达水平低的情况下，抗体分子也能够激动CD137，并且随着系统中PD-L1水平的增加，CD137激动活性也增加。该结果进一步支持了CD137激动活性取决于PD-L1表达的证据，并表明本发明的抗体分子将对肿瘤细胞表面上表达不同水平的PD-L1的肿瘤具有广泛活性。
上述基于CDR的PD-L1结合位点能够有效地阻止PD-L1与其受体PD-1的结合。PD-1在活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达，并调节细胞免疫应答的激活或抑制。PD-L1与PD-1的结合会传递抑制信号，从而减少细胞因子的产生和T细胞的增殖，从而减弱免疫反应。在癌症中，肿瘤细胞上PD-L1与T细胞上PD-1的相互作用降低了T细胞活性，从而阻止了免疫系统攻击肿瘤细胞。因此，预期通过阻断PD-L1与PD-1的结合，本发明的抗体分子可以以这种方式防止肿瘤细胞逃避免疫系统。不希望受到理论的束缚，相信PD-L1与PD-1结合的这种有效阻断与上述CD137激动活性一起发挥作用，以增加抗体分子的抗肿瘤效力。
本发明人还表明，包含上述CD137抗原结合位点和基于CDR的PD-L1结合位点的这种双特异性抗体分子能够在体内抑制肿瘤的生长。此外，与两个单特异性抗体分子的组合相比，其中两个抗体分子之一包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点，而另一个分子则包含基于CDR的CD137抗原结合位点，双特异性抗体分子观察到更有效的肿瘤生长抑制，表明用本发明的抗体分子可见CD137增强的聚集和信号传导，以及由此的T细胞活化和相应的抗肿瘤作用。
包含本发明的CD137抗原结合位点的抗体分子可能还能够双价结合PD-L1，使得抗体分子双价结合CD137和PD-L1。预期这是有利的，因为预期两个靶标的二价结合将使表达CD137的T细胞与表达PD-L1的细胞之间的桥联更稳定，从而延长T细胞位于PD-L1与CD137共表达位置(例如在肿瘤微环境中)的时间，并且可以对疾病(例如肿瘤)发挥作用。这与绝大多数常规的双特异性抗体形式不同，后者是异二聚体并通过一个Fab臂单价结合每个靶抗原。预期这种单价相互作用不仅不稳定，而且在诱导TNF受体例如CD137的聚集方面效率较低，和/或需要一个或两个靶标的更高表达以诱导这种聚集，从而激活T细胞。本发明人进行的实验证明了这一点，该实验表明，与双价结合两个靶标的mAb2相比，通过IFN-γ释放检测到在分子的一个CH3域中包含CD137的单价结合位点和PD-L1的二价Fab结合位点的mAb2分子诱导了较低水平的T细胞活化。
本发明人鉴定的抗体分子的另一个特征是CD137的抗原结合位点和基于CDR的PD-L1结合位点都包含在抗体结构本身内。特别地，所述抗体分子不需要将其他蛋白质经由接头或其他手段与抗体分子融合以产生与它的两种靶标二价结合的分子。这具有许多优点。具体地，可以使用与用于产生标准抗体的方法相似的方法来产生抗体分子，因为它们不包含任何额外的融合部分。由于接头可能随时间降解，导致抗体分子的异质群体，因此该结构也有望提高抗体的稳定性。在这种异质群体中，预计在群体中只有一个蛋白被融合，并因此仅单价结合一个靶标的那些抗体不会像有两个蛋白被融合并因此能够双价结合两个靶标的那些抗体一样，有效诱导TNF受体(如CD137)的条件性激动。接头的裂解/降解可以在向患者施用治疗剂之前或之后发生(例如，通过酶促裂解或患者的体内pH)，从而导致其有效性降低，同时在患者体内循环。由于本发明的抗体分子中没有接头，因此预期抗体分子在给药之前和之后都保留相同数目的结合位点。此外，从分子的免疫原性的观点来看，抗体分子的结构也是优选的，因为当将分子施用于患者时，引入融合蛋白或接头或两者可诱导免疫原性，导致治疗效果降低。
因此，本发明提供了：
[1]与程序性死亡配体1(PD-L1)和CD137结合的抗体分子，其包含：
(a)基于互补决定区(CDR)的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中基于CDR的抗原结合位点包含以下所示的CDR 1-6：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6[E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：1、2、3、18、19和20[E05v2]；或
(iii)分别为SEQ ID NO：1、2、3、18、19和29[G12v2]；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列，其中第一和第二序列分别具有SEQ ID NO:113和114[FS22-172-003]或79和80[FS22-53-008]所示序列。
[2]与程序性死亡配体1(PD-L1)和CD137结合的抗体分子，其包含：
(a)基于互补决定区(CDR)的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中基于CDR的抗原结合位点包含根据IMGT]的以下所示CDR 1-6：
(i)分别为SEQ ID NO：7、8、9、10、11和6[E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：21、8、9、22、11和20[E05v2]；或
(iii)分别为SEQ ID NO：21、8、9、22、11和29[G12v2]；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列，其中第一和第二序列分别具有SEQ ID NO:113和114[FS22-172-003]或79和80[FS22-53-008]所示序列。
[3]根据[1]或[2]的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[1]或[2]的(i)或(ii)中列出的CDR 1-6。
[4]根据[1]或[2]的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[1]或[2]的(i)中列出的CDR 1-6。
[5]根据[1]至[4]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，优选VH结构域和VL结构域。
[6]根据[1]至[5]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链，优选免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
[7]根据[5]至[6]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含VH结构域和/或VL结构域，优选地，VH结构域和VL结构域如下所示：
(i)分别为SEQ ID NO：12和14[E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：23和25[E05v2]；或
(Iii)分别为SEQ ID NO：23和30[G12v2]。
[8]根据[7]的抗体分子，其中所述抗体分子包含在(i)或(ii)中列出的VH结构域和VL结构域。
[9]根据[8]的抗体分子，其中所述抗体分子包含(i)中列出的VH结构域和VL结构域。
[10]根据[1]至[9]中任一项的抗体分子，其中所述第一序列位于所述抗体分子的CH3结构域的14和17位之间，其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
[11]根据[10]的抗体分子，其中所述第一序列位于所述抗体分子的CH3结构域的15、16、16.5、16.4、16.3、16.2和16.1位，其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
[12]根据[1]至[11]中任一项的抗体分子，其中所述第二序列位于所述抗体分子的CH3结构域的92至98位，其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
[13]根据[1]至[12]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子进一步包含位于CH3结构域的CD结构环中的第三序列。
[14]根据[13]的抗体分子，其中所述第三序列位于所述抗体分子的CH3结构域的43至78位，其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
[15]根据[13]至[14]中任一项的抗体分子，其中所述第三序列具有SEQ ID NO：73所示的序列。
[16]根据[1]至[15]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含以下所示的CH3结构域序列：
(i)SEQ ID NO：115[FS22-172-003]；或
(ii)SEQ ID NO：81[FS22-53-008]。
[17]根据[1]至[15]中任一项的抗体分子，其中所述第一和第二序列分别具有SEQID NO：113和114[FS22-172-003]中所示的序列。
[18]根据[1]至[15]和[17]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含SEQ IDNO：115[FS22-172-003]所示的CH3结构域序列。
[19]根据[1]至[18]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子是人IgG1分子。
[20]根据[1]至[19]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含抗体的重链和轻链：
(i)分别在SEQ ID NO：134和17中列出的FS22-172-003-AA/E12v2；
(ii)分别在SEQ ID NO：137和28中列出的FS22-172-003-AA/E05v2；
(iii)分别在SEQ ID NO：140和33中列出的FS22-172-003-AA/G12v2；
(iv)分别在SEQ ID NO：143和17中列出的FS22-053-008-AA/E12v2；
(v)分别在SEQ ID NO：146和28中列出的FS22-053-008-AA/E05v2；或
(vi)分别在SEQ ID NO：149和33中列出的FS22-053-008-AA/G12v2。
[21]根据[20]的抗体分子，其中所述抗体分子包含[20]的(i)-(iv)中任一项中列出的轻链和重链。
[22]根据[20]的抗体分子，其中所述抗体分子包含[20]的(i)中列出的轻链和重链。
[23]根据[20]至[22]中任一项的抗体分子，其中所述抗体的CH2结构域的114位上的脯氨酸(P)被丙氨酸(A)取代，并且其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
[24]根据[1]至[23]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子结合人PD-L1和人CD137。
[25]根据[24]的抗体分子，其中所述PD-L1包含SEQ ID NO：180所示的序列或由其组成。
[26]根据[24]或[25]的抗体分子，其中所述人CD137包含SEQ ID NO:186所示的序列或由其组成。
[27]根据[1]至[26]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子在存在肿瘤细胞表面结合的PD-L1的情况下能够活化免疫细胞上的CD137。
[28]根据[1]至[26]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子与免疫细胞上的CD137和与肿瘤细胞表面结合的PD-L1的结合引起免疫细胞上CD137的聚集。
[29]根据[27]或[28]的抗体分子，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或树突状细胞(DC)。
[30]根据[29]的抗体分子，其中所述免疫细胞是T细胞。
[31]根据[1]至[30]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子已被修饰以减少或消除抗体分子的CH2结构域与一种或多种Fcγ受体的结合。
[32]根据[1]至[31]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子不结合一个或多个Fcγ受体。
[33]根据[31]或[32]的抗体分子，其中所述Fcγ受体选自下组：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII。
[34]一种缀合物，其包含[1]至[33]中任一项所述的抗体分子和生物活性分子。
[35]一种缀合物，其包含[1]至[33]中任一项的抗体分子和可检测的标记。
[36]编码根据[1]至[33]中任一项的抗体分子的一种或多种核酸分子。
[37]编码根据[1]至[2]，[5]至[7]，[10]至[16]，[19]至[20]和[23]至[33]中任一项的抗体分子的一种或多种核酸分子，其中所述核酸分子包含以下的重链核酸序列和/或轻链核酸序列：
(i)分别在SEQ ID NO：32和39或135和136中列出的FS22-172-003-AA/E12v2，优选地分别在SEQ ID NO：32和39中列出；
(ii)分别在SEQ ID NO：138和139中列出的FS22-172-003-AA/E05v2；
(iii)分别在SEQ ID NO：141和142中列出的FS22-172-003-AA/G12v2；
(iv)分别在SEQ ID NO：144和145中列出的FS22-053-008-AA/E12v2；
(v)分别在SEQ ID NO：147和148中列出的FS22-053-008-AA/E05v2；或
(vi)分别在SEQ ID NO：150和151中列出的FS22-053-008-AA/G12v2。
[38]一种或多种载体，其包含根据[36]至[37]中任一项的一种或多种核酸分子。
[39]一种重组宿主细胞，其包含根据[36]至[37]中任一项的一种或多种核酸分子或根据[38]的一种或多种载体。
[40]根据[1]至[33]中任一项的抗体分子的制备方法，其包括在所述抗体分子的制备条件下培养[39]的重组宿主细胞。
[41]根据[40]的方法，其进一步包括分离和/或纯化抗体分子。
[42]一种药物组合物，其包含根据[1]至[35]中任一项的抗体分子或缀合物和药学上可接受的赋形剂。
[43]根据[1]至[35]中任一项的抗体分子或缀合物，其用于在个体中治疗癌症的方法。
[44]一种治疗个体癌症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的根据[1]至[35]中任一项的抗体分子或缀合物。
[45]根据[1]至[35]中任一项的抗体分子或缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[46]根据[43]至[45]中任一项使用的抗体分子或缀合物、方法或用途，其中所述癌症选自：黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和胃肠道间质瘤(GIST)。
[47]根据[43]使用的抗体分子或缀合物，其中所述治疗包括与所述第二治疗剂组合向所述个体施用所述抗体分子或缀合物。
[48]根据[44]的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体施用治疗有效量的第二治疗剂。
附图简要说明
图1：图1A、B和C显示了Fcabs FS22-053、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-014、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053-017、FS22-172、FS22-172-001、FS22-172-002、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005和FS22-172-006以及野生型(WT)Fcab的CH3结构域序列的比对。根据IMGT，IMGT外显子(连续编号)，EU和Kabat编号系统给出残基编号。
图2显示了CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2能够结合活化的CD4+(图2A)和CD8+(图2B)T细胞。抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2结合的活化T细胞的EC50值在CD4+T细胞中为0.8nM，在CD8+T细胞中为0.9nM。阳性对照抗人PD-L1抗体(G1-AA/E12v2)与mAb2的亲和力非常相似，两种细胞类型的EC50值均为0.8nM。阳性对照抗人CD137抗体(G1-AA/MOR7480.1)显示与CD4+和CD8+细胞的结合力低，表明在这些细胞类型上CD137表达水平低。
图3显示了抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2不与过量表达Fcγ受体的CHO细胞结合。抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2，Fcγ受体结合的阳性对照抗体G1/4420，和无Fcγ受体结合的阴性对照抗体G1-AA/4420，在细胞结合试验中检测了针对五种不同的Fcγ受体过表达的CHO细胞系：(A)FcgRIIA 131H，(B)FcgRIIA 131E，(C)FcgRIIB，(D)FcgRIIIA 158F，(E)FcgRIIIA 158V和(F)用作阴性对照的CHO WT细胞系。在CH2区包含LALA突变的抗人CD137/PD-L1 mAb2不结合任何测试的Fcγ受体，也不与CHO WT细胞非特异性结合(黑色实心三角)。如所预期的，阳性对照抗体结合Fcγ受体(黑色实心圆圈)，在CH2区域中包含LALA突变的阴性对照抗体G1-AA/4420未结合Fcγ受体(灰色空心方块)。
图4显示了在存在抗人CD137/PD-L1 mAb2或阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/20H4.9的情况下，在人原代CD8+T细胞活化试验中人IL-2(hIL-2)的释放。仅当mAb2被过表达人PD-L1的HEK细胞交联导致人IL-2释放时，所有测试的mAb2才驱动CD137聚集和CD8+T细胞活化。当与抗人CH2二抗交联时，抗人CD137/PD-L1 mAb2的EC50值小于阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/20H4.9的EC50值(黑色实心圆圈，虚线)，表明使用mAb2可以促进T细胞活化。所有均显示hIL-2释放增加，阳性对照抗体的IL-2释放(Emax)高于抗人CD137/PD-L1 mAb2。
图5显示了在存在抗人CD137/PD-L1 mAb2或阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/20H4.9的情况下，在人原代CD8+T细胞活化试验中人IL-2(hIL-2)的释放。仅当mAb2被内源性表达人PD-L1的MDA-MD-231细胞交联导致人IL-2释放时，所有测试的mAb2才驱动CD137聚集和CD8+T细胞活化。当与抗人CH2二抗交联时，抗人CD137/PD-L1 mAb2的EC50值小于阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/20H4.9的EC50值(黑色实心圆圈，虚线)，表明使用mAb2可获得更好的活性。所有均显示hIL-2释放增加，阳性对照抗体的IL-2释放(Emax)高于抗人CD137/PD-L1mAb2。
图6显示了在存在抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2或阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/20H4.9的情况下，在人原代CD8+T细胞活化试验中人IL-2(hIL-2)的释放。仅当mAb2被至少占总HEK细胞群体的6.5％的HEK.hPD-L1细胞交联时，所有测试的mAb2才驱动CD137聚集和CD8+T细胞活化，导致人IL-2释放。当调节测定中存在的HEK.hPD-L1细胞的百分比时，抗人CD137/PD-L1 mAb2的EC50值保持相似，但最大激活(Emax)随测定中的HEK.hPD-L1交联细胞百分比的增加而增加。这表明，当100％的HEK细胞表达PD-L1时，总体使用mAb2可获得更好的最大活性。
图7显示抗人CD137/PD-L1 mAb2能够激活T细胞。(A)和(B)：在存在抗人CD137/PD-L1 mAb2，抗人PD-L1阳性对照抗体G1/S70或抗人CD137阳性对照抗体G1-AA/20H4.9(与抗人CH2抗体交联)的情况下测试了主要人混合淋巴细胞反应(MLR)分析中IFN-γ的释放。(A)FS22-053-008基于Fcab的mAb2和(B)FS22-172-003基于Fcab的mAb2在该试验中显示出比任一种阳性对照抗体更高的活性，表明同一分子中PD-L1阻断和的CD137激动引起更强烈的T细胞活化，大概是通过基于PD-L1的聚集和CD137活化。(C)在抗人CD137/PD-L1 mAb2，抗人PD-L1抗体G1-AA/E12v2，抗人CD137阳性对照抗体G1-AA/20H4.9(与抗人CH2抗体交联)或模拟mAb2形式的抗人CD137 Fcab(FS22-172-003-AA/D1.3)的存在下测试了主要人MLR分析中IFN-γ的释放。FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2在该试验中显示出比阳性对照抗体或其模拟mAb2形式的组分Fcab更高的T细胞活化活性，表明同一分子中的PD-L1阻滞和CD137激动引起更强烈的T细胞活化，大概是通过基于PD-L1的交联导致CD137聚集和活化。
图8显示了在抗人CD137/PD-L1 mAb2和阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/MOR7480.1存在下，T细胞活化试验中IL-2的释放，其中T细胞已被改造以过量表达食蟹猴CD137。仅当与过表达食蟹猴PD-L1的HEK细胞交联时，所有测试的mAb2才驱动CD137聚集和激活(带有实心连接线的空心和实心的黑色和灰色符号)，导致在DO11.10 T细胞活化试验中小鼠白介素2(mIL-2)的释放。在浓度增加的情况下，阳性对照抗人CD137抗体G1-AA/MOR7480.1(先前已被其他人通过食蟹猴证明与食蟹猕猴CD137有交叉反应)，显示mIL-2释放增加(黑色实心圆圈，虚线)，但是最大释放量明显小于所有抗人CD137/PD-L1 mAb2的释放量。没有过表达PD-L1的HEK细胞交联的所有抗人CD137/PD-L1 mAb2都显示出比交联时更低的mIL-2释放(数据未显示)。
图9显示了在存在滴定的抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-053-008-AA/E12v2或172-003-AA/E12v2或抗人PD-L1阳性对照抗体G1-AA/E12v2或同种型对照抗体G1-AA/HelD1.3情况下，用同种异体食蟹猴单核细胞培养的食蟹猴CD4+T细胞在第2天的IL-2释放(图9A)或在第6天的IFN-γ释放(图9B)。
图10显示了DO11.10小鼠CD137 T细胞活化试验中的小鼠IL-2释放，测试了与蛋白L交联时小鼠和人可交叉反应的CD137 Fcab FS22-053-014和FS22-053-017模拟mAb2形式。FS22-053-014和FS22-053-017，以及抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063，均以HelD1.3模拟mAb2形式与蛋白L交联时激活了CD137，从而释放了mIL-2。阳性对照抗小鼠CD137 mAb Lob12.3显示mIL-2释放如预期增加。与交联时相比，未经蛋白L交联(虚线)的所有模拟mAb2形式的抗CD137 Fcab均显示mIL-2释放大大降低。FS22-053-017在此测定中的活性较低(EC50比FS22-053-014低8倍)，但在测定中仍显示出活性。
图11显示了小鼠IFNγ的释放，其指示CD8+T细胞活化。抗小鼠CD137/PD-L1mAb2在该测定法中显示出最大的效价，高于抗人CD137和PD-L1的阳性对照抗体或两者的组合。不出所料，模拟mAb2形式(FS22m-063-AA/HelD1.3)的FS22m-063-AA Fcab没有显示任何活性。
图12显示了在用G1-AA/4420(IgG对照)，G1/S70(PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3和G1/Lob12.3(具有LALA突变和无突变的CD137阳性对照)，G1/S70加G1-AA/Lob12.3的组合和FS22m-063-AA/S70(模拟小鼠PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab Fs22m-063)处理的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的肿瘤体积测量。绘制了平均肿瘤体积加减95％置信区间。与IgG对照治疗的小鼠和抗PD-L1阳性对照mAb相比，FS22m-063-AA/S70能够显著降低CT26同系肿瘤模型中的肿瘤生长。使用混合模型分析，在整个研究时间内增长率的统计显著性成对显示。平均肿瘤体积显示为几何或算术平均数作为适当的基于数据正态性测试。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。
图13显示了在CT26同基因小鼠肿瘤模型中抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的剂量反应研究结果。A：显示了在用3剂G1-AA/4420(IgG对照，10mg/kg)，G1/Lob12.3(CD137阳性对照，1mg/kg)和抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70的4种不同剂量(0.1mg/kg，0.3mg/kg，1.0mg/kg和10.0mg/kg)治疗的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的肿瘤体积测量。每个剂量由x轴上的垂直黑色箭头指示。绘制了平均肿瘤体积加或减95％置信区间。与IgG对照治疗的小鼠和抗PD-L1阳性对照mAb相比，FS22m-063-AA/S70能够显著降低CT26同系肿瘤模型中的肿瘤生长。使用混合模型分析，在整个研究时间内增长率的统计显著性成对显示。平均肿瘤体积显示为几何或算术平均数作为适当的基于数据正态性测试。**P≤0.01；*******P≤0.0001。B：显示了在用3剂G1-AA/4420(IgG对照，～10mg/kg)和抗小鼠CD137/PD-L1mAb2 FS22m-063-AA/S70的4种不同剂量2μg、6μg、20μg和200μg(相当于约0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg和10.0mg/kg)处理的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的Kaplan Meier图。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导了剂量依赖性的存活增加。
图14显示了在用四个不同剂量水平的抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2FS22m-063-AA/S70，q4dx3给药的小鼠的肿瘤和血液中CD8+：CD4+百分比比例有剂量依赖性增加，显示在图A和8中，CD8+T细胞上的Ki67表达显示在图C和D中。
图15显示了在用G1-AA/4420(同种型对照)，G1-AA/S70(PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3(CD137阳性对照)，G1-AA/S70加G1-AA/Lob12.3的组合，和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab Fs22m-063)处理的C57BL/6小鼠中皮下生长的MC38同系肿瘤模型的肿瘤体积测量。绘制了平均肿瘤体积[mm3]加或减95％置信区间。与IgG对照治疗的小鼠，抗PD-L1阳性对照mAb治疗的小鼠，抗CD137阳性对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70能够在MC38同系肿瘤模型中显著降低肿瘤生长。使用混合模型分析，在整个研究时间内增长率的统计显著性成对显示。****≤0.0001p值。
图16显示了在用G1-AA/4420(同种型对照)和抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2FS22m-063-AA/S70治疗的C57BL/6小鼠中皮下生长的B16.F10同系肿瘤模型的肿瘤体积测量。两种组合物的剂量均为1mg/kg。绘制了平均肿瘤体积[mm3]加或减95％置信区间。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70处理显著降低了B16.F10同系肿瘤模型中的肿瘤生长。使用混合模型分析，在整个研究时间内增长率的统计显著性成对显示。平均肿瘤体积显示为几何或算术平均数作为适当的基于数据正态性测试。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。
图17显示了在用(A)G1-AA/4420(IgG对照)，(C)G1/S70(抗-PD-L1阳性对照)，(B)G1-AA/Lob12.3和(D)G1/Lob12.3(具有和不具有LALA突变的抗CD137阳性对照)，或(E)G1/S70加G1-AA/Lob12.3的组合和(F)FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的单个小鼠的spaghetti图。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导显著的肿瘤生长抑制。
图18显示了在用均为1mg/kg的G1-AA/4420(IgG对照)，G1/S70加G1-AA/Lob12.3的组合，FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的Kaplan Meier图。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导了显著的存活。
图19显示了在用G1-AA/HelD1.3(IgG对照)，G1/S70(抗PD-L1阳性对照)，G1-G1AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2型式的抗小鼠CD137Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的肿瘤体积测量。绘制了平均肿瘤体积加减95％置信区间。与IgG对照治疗的小鼠，抗PD-L1阳性对照mAb治疗的小鼠和抗CD137阳性对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70能够在CT26同系肿瘤模型中显著降低肿瘤生长。使用混合模型分析，在整个研究时间内增长率的统计显著性成对显示。平均肿瘤体积显示为几何或算术平均数作为适当的基于数据正态性测试。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。
图20显示了在用G1-AA/HelD1.3(IgG对照)，G1/S70(抗PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2型式的抗小鼠CD137Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠中皮下生长的CT26同系肿瘤模型的Kaplan Meier图。与IgG对照治疗的小鼠和CD137阳性对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导显著的存活。
图21显示了在用3剂(A)G1-AA/4420(同种型对照)，(B)G1-AA/S70(抗PD-L1阳性对照)，(C)G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)，(D)G1-AA/S70加G1-AA/Lob12.3的组合，和(E)FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的C57BL/6小鼠中皮下生长的MC38同系肿瘤模型中单个小鼠的spaghetti图。与IgG对照治疗的小鼠相比，在MC38同系肿瘤模型中，FS22m-063-AA/S70诱导完全的肿瘤生长抑制，从而导致100％无肿瘤的小鼠。
图22显示了在用3剂G1-AA/4420(同种型对照)，G1-AA/S70(抗PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)，G1-AA/S70加G1-AA/Lob12.3的组合，和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的C57BL/6小鼠中皮下生长的MC38同系肿瘤模型的Kaplan Meier图。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在MC38同系肿瘤模型中诱导了完全存活。
图23显示了在用G1-AA/4420(同种型对照)(图23A)和抗小鼠CD137/PD-L1mAb2FS22m-063-AA/S70(图23B)治疗的C57BL/6小鼠中皮下生长的B16.F10同系肿瘤模型中单个小鼠的spaghetti图。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在B16.F10同系肿瘤模型中诱导了部分肿瘤生长抑制。
图24显示了通过流式细胞术测定的抗mCD137/PD-L1 mAb2与T细胞的离体结合数据。从与Alexa Fluor 488(该抗体检测了与细胞结合的抗mCD137/PD1-L1 mAb2的人Fc区)缀合的抗人Fc二抗测量了平均荧光强度(MFI)值。MFI大于未染色对照样品的MFI阳性细胞被鉴定为抗mCD137/PD-L1阳性，并且呈现的数据显示了阳性细胞占来自血液的(A)所有CD8+或(B)所有CD4+T细胞，或来自肿瘤的(C)所有CD8+或(D)所有CD4+T细胞的百分比。这些结果表明，抗mCD137/PD-L1 mAb2快速结合肿瘤和血液中都存在的CD8+和CD4+T细胞，并且阳性T细胞群的百分比随时间降低取决于剂量水平。
图25显示了通过流式细胞术测定的离体T细胞的Ki67表达数据。通过与结合到细胞的PE-Cy7缀合的抗Ki67抗体测量平均荧光强度(MFI)值。MFI大于未染色对照样品的MFI阳性细胞被鉴定为Ki67表达阳性，并且呈现的数据显示了阳性细胞占来自血液的(A)所有CD8+或(B)所有CD4+T细胞，或来自肿瘤的(C)所有CD8+或(D)所有CD4+T细胞的百分比。这些结果表明，用抗mCD137/PD-L1 mAb2给药的小鼠中的T细胞在血液中的CD8+和CD4+T细胞上均快速表达Ki67，并且来自肿瘤微环境的样品中已经存在高百分比的Ki67阳性T细胞。观察到Ki67表达随时间增加取决于剂量水平。
图26显示了相对于时间匹配的样品的PD-L1受体占有率，该样品来自于给药了对照抗体G1-AA/4420小鼠，然后体外掺入了100nM抗mCD137/PD-L1 mAb2以饱和所有PD-L1受体，因此指示100％PD-L1受体占用水平(带虚线的三角形符号)。使用与Bv605缀合的竞争性抗mPD-L1抗体的平均荧光强度(MFI)值检测游离的PD-L1受体。MFI大于未染色对照样品的MFI阳性细胞被鉴定为游离PD-L1阳性。结果显示，与血液中(A)CD8+或(B)CD4+T细胞，或肿瘤中(C)CD8+或(D)CD4+T细胞的100％饱和样品相比，阳性群PD-L1受体占有率的百分比。这些结果表明，PD-L1受体占有率在血液中迅速达到100％，然后随时间的推移随剂量水平的降低而下降。在肿瘤微环境中，T细胞上PD-L1受体占有比血液中的持续地更长。
图27显示了在对C57BL/6幼年小鼠进行单次静脉单剂量给药后，抗CD137/PD-L1mAb2在25、10、3和1mg/kg时的药代动力学曲线。显示了随时间推移小鼠中CD137/PD-L1 mAb2的浓度。图27证明了在每个剂量下抗CD137/PD-L1 mAb2的清除率与小鼠中标准人IgG的清除率相当。
图28显示抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2能够在使用(A)食蟹猴PBMC或(B)人PBMC在PBMC T细胞活化实验中激活T细胞。在抗人CD137/PD-L1 mAb2，抗人CD137阳性对照抗体G1-AA/MOR7480.1(与抗人CH2抗体交联)存在下，测试PBMC分析中IFN-γ的释放。mAb2在两种测定法中均显示活性，并显示出高于阳性对照抗体的活化水平，表明同一分子对PD-L1的阻滞和CD137激动引起更强的T细胞活化，大概是通过基于PD-L1的聚集和CD137的活化，在食蟹猴和人类中。
详细说明
现在将参考附图讨论本发明的方面和实施例。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施例将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
本发明涉及与PD-L1和CD137均结合的抗体分子。具体地，本发明的抗体分子包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点和位于抗体分子的恒定域中的CD137抗原结合位点。除非上下文另外要求，否则术语“PD-L1”和“CD137”可以指人PD-L1和人CD137，鼠PD-L1和鼠CD137和/或食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137。优选地，除非上下文另外要求，否则术语“PD-L1”和“CD137”是指人PD-L1和人CD137。
术语“抗体分子”描述了天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。抗体分子可以是人的或人源化的，优选是人的。抗体分子优选是单克隆抗体分子。抗体的实例是免疫球蛋白同种型，例如免疫球蛋白G，及其同型亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，及其片段。抗体分子可以被分离，在没有污染物的意义上，如抗体能够结合其他多肽和/或血清成分。
因此，如本文所用，术语“抗体分子”包括抗体片段，条件是所述片段包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点和位于恒定域的CD137抗原结合位点。因此，除非上下文另外要求，否则本文所用的术语“抗体分子”等同于“抗体分子或其片段”。
可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术的技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将CDR或可变区和/或提供CD137抗原结合位点的恒定域序列引入不同的免疫球蛋白中。例如在EP-A-184187，GB 2188638A或EP-A-239400中描述了将一种免疫球蛋白的CDR引入另一种免疫球蛋白的方法。类似的技术可以用于相关的恒定域序列。或者，可以使产生抗体分子的杂交瘤或其他细胞发生基因突变或其他改变，这可以改变或可以不改变产生的抗体的结合特异性。
由于抗体可以以多种方式修饰，因此术语“抗体分子”应解释为涵盖抗体片段、衍生物、功能性等价物和抗体的同源物，包括任何包含免疫球蛋白结合域的多肽，无论是天然的还是全部或部分合成的。因此，包括与另一种多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023中。
包含CDR序列和CH3结构域的抗体片段的实例是微抗体，其包含连接至CH3结构域的scFv(Hu等人，(1996)，Cancer Res.，56(13)：3055-61)。
本发明的抗体分子与PD-L1和CD137结合。在这种情况下，结合可以指特定的结合。术语“特异性”可以指这样的情况，其中抗体分子除了其特异性结合配偶体(此处为PD-L1和CD137)以外将不显示与任何分子的任何显著结合。术语“特异性”也适用于抗体分子对特定抗原决定簇具有特异性，例如PD-L1和CD137上的抗原决定簇，这些抗原由多种抗原携带，在这种情况下，抗体分子将能够与多种携带表位的抗原结合。
本发明人证明了本文所述的抗体分子对人PD-L1显示出高水平的特异性，并且与其他T细胞靶标PD-L1、CD80、PD-1或B7-H3未显示出任何显著结合。参见实施例9.3。因此，在一个优选的实施方式中，抗体分子与PD-L2、CD80、PD-1和B7-H3中的任何一种，优选全部不结合或不显示出任何显著结合。本发明人还证明了CD137抗原结合位点没有与人TNFRSF受体CD40、OX40和GITR显示出任何显著结合。参见实施例3.6。因此，在一个更优选的实施方式中，抗体分子与PD-L2、CD80、PD-1、B7-H3、CD40、OX40和GITR中的任何一个，优选全部不结合或确实显示出任何显著结合。
用于构建和使用的抗体及其方法在本领域中是众所周知的，并且在例如Holliger和Hudson(2005)中进行了描述。可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术的技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可能涉及将一个抗体分子的CDR或可变区引入不同的抗体分子(EP-A-184187，GB 2188638A和EP-A-239400)。
基于CDR的抗原结合位点是抗体可变区中的抗原结合位点。基于CDR的抗原结合位点可以由三个CDR形成，例如三个轻链可变域(VL)CDR或三个重链可变域(VH)CDR。优选地，基于CDR的抗原结合位点由六个CDR，三个VL CDR和三个VH CDR形成。不同的CDR对抗原结合的贡献可以在不同的抗原结合位点变化。
抗原结合位点的三个VH结构域CDR可以位于免疫球蛋白VH结构域内，并且三个VL结构域CDR可以位于免疫球蛋白VL结构域内。例如，基于CDR的抗原结合位点可以位于抗体可变区中。
抗体分子可具有针对第一抗原的一个或优选多于一个，例如两个，基于CDR的抗原结合位点。因此，抗体分子可包含一个VH和一个VL结构域，但优选包含两个VH和两个VL结构域，即两个VH/VL结构域对，例如像在天然存在的IgG分子中的情况。
基于CDR的抗原结合位点可以包含三个VH CDR或三个VL CDR，优选抗体E12v2、E05v2、G12v2或lam-G02v3，优选抗体E12v2、E05v2或G12v2，更优选E12v2或E05v2，最优选E12v2的三个VH CDR和三个VL CDR。
这些抗体的VH和VL结构域序列如下所示：
(i)抗体E12v2的VH和VL结构域序列分别显示于SEQ ID NO：12和14中；
(ii)抗体E05v2的VH和VL结构域序列分别显示于SEQ ID NO：23和25中；
(iii)抗体G12v2的VH和VL结构域序列分别显示于SEQ ID NO：23和30中；和
(iv)抗体lam-G02v3的VH和VL结构域序列分别显示于SEQ ID NO：23和41中。
技术人员可以毫无困难地从上面所列出的抗体的VH和VL结构域序列中确定CDRs的序列。CDR序列可以例如根据Kabat(Kabat，E.A等人，(1991):《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第5版，美国国立卫生研究院出版，第91-3242号，美国卫生与公共服务部)或国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT：Lefranc，M.-P等人，Nucleic Acids Res.43，D413-22(2015))。
根据Kabat编号的抗体分子的VH结构域CDR1，CDR2和CDR3序列可以分别是位于VH结构域的31-35、50-65和95-102位的序列。
根据IMGT编号的抗体分子的VH结构域CDR1，CDR2和CDR3序列可以分别是位于抗体分子的VH结构域的27-38、56-65和105-117位的序列。
根据Kabat编号的抗体分子的VL结构域CDR1，CDR2和CDR3序列可以分别是位于VL结构域的24-34、50-56和89-97位的序列。
根据IMGT编号的抗体分子的VL结构域CDR1，CDR2和CDR3序列可以分别是位于VL结构域的27-38、56-65和105-117位的序列。
抗体分子可包含VH结构域CDR1序列SYGIS(SEQ ID NO：1)，VH结构域CDR2序列WISAYSGGTNYAQKLQG(SEQ ID NO：2)，以及VH结构域CDR3序列DLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：3)，其中CDR序列是根据Kabat编号方案定义的。
在优选的实施方式中，根据Kabat编号方案，抗体分子在28位处包含脯氨酸。
抗体分子可以包含VH结构域CDR1序列GYX1FTSYG(SEQ ID NO：45)，VH机构域CDR2序列ISAYSGGT(SEQ ID NO：8)和VH结构域CDR3序列ARDLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：9)；
其中X1为P或T，优选地其中X1为P；
并且其中CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。
抗体分子可包含以下的VH结构域CDR1，CDR2和CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO：7、8和9[E12v2]；或
(Ii)分别为SEQ ID NO：21、8和9[E05v2、G12v2或lam-G02v3]，
其中，CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。
VH结构域的CDR可以位于框架(FW)序列(HFW1、HFW2、HFW3和HFW4)的两侧。VH结构域可以包含分别为SEQ ID NO：51、52、53和54的HFW1、HFW2、HFW3和HFW4序列，其中FW和CDR序列是根据Kabat编号方案定义的。或者，VH结构域可包含分别为SEQ ID NO：55、56、57和54的HFW1、HFW2、HFW3和HFW4序列，其中FW和CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。
抗体分子可以包含VL结构域CDR1序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：34)，VL CDR2序列EVTNRPS(SEQ ID NO：35)和VL CDR3序列SSFKRGSTLVV(SEQ ID NO：36)；其中CDR序列是根据Kabat编号方案定义的。VL结构域可以衍生自λVL结构域。例如，每个VL结构域CDR可以位于衍生自λVL结构域的框架(FW)序列(LFW1、LFW2、LFW3和LFW4)的两侧。具体地，VL结构域可分别包含SEQ ID NO：65、66、67和68的LFW1、LFW2、LFW3和LFW4序列，其中FW序列是根据Kabat编号方案定义的。
抗体分子可以包含VL结构域CDR1序列RASQSIX2X3RLA(SEQ ID NO：46)，VL CDR2序列EASX4X5EX6(SEQ ID NO：47)和VL CDR3序列QQSYSX7PX8X9T(SEQ ID NO：48)；
其中X2为S或G，X3为N或G；X4为T或N；X5为S或L；X6为T或S；X7为T或W；X8不存在或为R；X9是Y，R或V；和
其中CDR序列和位置编号是根据Kabat编号方案定义的。
优选地，抗体分子包含VH结构域CDR1序列RASQSIGNRLA(SEQ ID NO：4)，VL CDR2序列EASTSET(SEQ ID NO：5)和VL CDR3序列QQSYSTPYT(SEQ ID NO：6)，其中CDR序列是根据Kabat编号方案定义的。VL结构域可以衍生自κVL结构域。例如，每个VL结构域CDR可以位于衍生自κVL结构域的框架(FW)序列(LFW1、LFW2、LFW3和LFW4)两侧。具体地，VL结构域可分别包含SEQ ID NO：58，59，60和61的LFW1、LFW2、LFW3和LFW4序列，其中FW序列是根据Kabat编号方案定义的。
例如，抗体分子可以包含以下VL结构域的CDR1，CDR2和CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO：4、5和6[E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：18、19和20[E05v2]；
(iii)分别为SEQ ID NO 18、19和29[G12v2]；或
(iv)分别为SEQ ID NO：34、35和36[lam-G02v3]，
其中CDR序列是根据Kabat编号方案定义的。
所述抗体分子可包含VL结构域CDR1序列SSDVGGYNY(SEQ ID NO：37)，VL CDR2序列EVT(SEQ ID NO：38)和VL CDR3序列SSFKRGSTLVV(SEQ ID NO：36)，其中CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。VL结构域可以衍生自λVL结构域。例如，每个VL结构域CDR可以位于衍生自λVL结构域的框架(FW)序列(LFW1、LFW2、LFW3和LFW4)的两侧。具体地，VL结构域可分别包含SEQ ID NO：69，70，71和68的LFW1、LFW2、LFW3和LFW4序列，其中FW序列是根据IMGT编号方案定义的。
或者，抗体分子可以包含VL结构域CDR1序列QSIX10X11R(SEQ ID NO：49)，VL CDR2序列EAS(SEQ ID NO：11)和VL CDR3序列QQSYSX12X13X14X15T(SEQ ID NO：50)；
其中X10为G或S；X11为N或G；X12不存在或为T；X13为T，W或P；X14为P或R；X15为Y或R；和
其中，CDR序列和位置编号是根据IMGT编号方案定义的。
优选地，抗体分子包含VH结构域CDR1序列QSIGNR(SEQ ID NO：10)，VL CDR2序列EAS(SEQ ID NO：11)和VL CDR3序列QQSYSTPYT(SEQ ID NO：6)，其中CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。VL结构域可以衍生自κVL结构域。例如，每个VL结构域CDR可以位于衍生自κVL结构域的框架(FW)序列(LFW1、LFW2、LFW3和LFW4)两侧。具体地，VL结构域可包含分别为SEQ ID NO：62、63、64和61的LFW1、LFW2、LFW3和LFW4序列，其中FW序列是根据IMGT编号方案定义的。
例如，抗体分子可以包含以下VL结构域的CDR1，CDR2和CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO 10、11和6[E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO 22、11和20[E05v2]；
(iii)分别为SEQ ID NO 22、11和29[G12v2]；或
(iv)分别为SEQ ID NO：37、38和36[lam-G02v3]，
其中，CDR序列是根据IMGT编号方案定义的。
基于CDR的抗原结合位点可包含VH或VL结构域，优选抗体E12v2、E05v2、G12v2或lam-G02v3，优选抗体E12v2、E05v2或lam G12v2，更优选E12v2或E05v2，最优选E12v2的VH和VL结构域。
抗体E12v2、E05v2、G12v2和lam-G02v3的VH结构域可以分别具有SEQ ID NO：12、23、23和23中列出的序列。抗体E12v2、E05v2、G12v2和lam-G02v3的VL结构域可以分别具有SEQ ID NO：14、25、30和41中列出的序列。
本发明的抗体分子包含位于抗体分子恒定域中的CD137抗原结合位点。所述恒定域可以是CL、CH1、CH2、CH3或CH4结构域，所述恒定域优选是CH1、CH2或CH3结构域，更优选CH2或CH3结构域，最优选CH3结构域。CD137抗原结合位点在抗体分子的恒定域中包含一个或多个修饰的结构环。用于产生靶抗原的抗原结合位点的工程抗体恒定域结构环是本领域已知的，并且例如描述于Wozniak-Knopp G等人，(2010)；WO2006/072620和WO2009/132876。
抗体分子的CD137抗原结合位点可包含第一和第二序列，优选第一和第二序列，其中第一和第二序列分别位于抗体分子恒定结构域，优选CH3结构域的AB和EF结构环中。
在一个优选的实施方式中，抗体分子的CH3结构域的95和96位的残基是野生型的，即分别优选为精氨酸(R)和色氨酸(W)。这两个残基都位于EF结构环中。除非另有说明，否则本文中的氨基酸残基位置根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案编号。IMGT编号方案在Lefranc等人，2005年中有描述。
第一序列优选包含序列PPY(SEQ ID NO：78)。
所述PPY序列可以位于抗体分子的CH3结构域的10和19位之间，优选位于15和17位之间。在一个优选的实施方式中，所述PPY序列位于CH3结构域的16、16.5和16.4位。或者，所述PPY序列可以位于CH3结构域的16和17位之间。在另一个优选的实施方式中，所述PPY序列位于CH3结构域的16.3、16.2和16.1位。在IMGT编号方案中，插入的残基根据其所在环的方向进行编号。如果环方向“向上”，则插入的残基取紧接插入前的残基数，并按升序十进制数表示序列中插入的残基数，例如16、16.1、16.2、16.3，其中残基16之后有三个突变。如果环方向“向下”，则插入的残基取紧接插入前的残基数，并按降序十进制数表示序列中插入的残基数，例如16、16.3、16.2、16.1，其中在残基16之后又有三个突变(LeFranc等人，2005；LeFranc等人，2015)。
在一个优选的实施方式中，所述AB结构环包含氨基酸插入。插入长度可以是1至10、2至9、3至7、4至6或5个氨基酸。优选地，插入长度为5个氨基酸。
插入可位于抗体分子的CH3结构域的10和19位之间，优选在14和17位之间，更优选在16和17位之间。在一个优选的实施方式中，插入位于抗体分子的CH3结构域的16.5至16.1位。图1显示了包含CH3结构域的Fcab，其中插入位于CH3结构域的16.5至16.1位。
亲和力成熟后鉴定的大多数Fcab均在CH3域的97位上包含一个亮氨酸(L)残基。这些Fcab中有许多在CH3结构域的98位还包含天冬氨酸(D)残基或谷氨酸(E)残基。这两个氨基酸变化都位于EF结构环中。这些结果表明，这些残基中的一个或两个对于CD137结合可能很重要。因此，第二序列优选包含序列LD或LE，其中LD或LE序列优选位于抗体分子的CH3结构域的97和98位。
第一序列和第二序列可以是以下的CH3结构域的第一和第二序列：FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，优选FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017或FS22-053-014，更优选FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011或FS22-053-017，还更优选特异性结合成员FS22-053-008。
第一序列和第二序列可以是以下的CH3结构域的第一和第二序列：FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006或FS22-172，优选FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005或FS22-172-006，更优选FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-172-003，FS22-172-002或FS22-172-004，甚至更优选为FS22-053-008或FS22-172-003，再更优选为FS22-172-003。在另一个优选的实施方式中，第一序列和第二序列可以是FS22-053-017的CH3结构域的第一和第二序列。
CH3结构域序列FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006和FS22-172，分别在SEQ ID NO:81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、115、118、121、124、127、130和132中列出。
FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006和FS22-172的第一和第二序列可以分别是FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006和FS22-172的CH3结构域的14和17位以及91和99位之间的序列。
或者，FS22-053-008，FS22-053-010，FS22-053-011，FS22-053-012和FS22-053-016的第一和第二序列可以分别是FS22-053-008，FS22-053-010，FS22-053-011，FS22-053-012和FS22-053-016的CH3结构域的14和17位以及92和99位之间的序列。
或者，FS22-053-015的第一和第二序列可以分别是FS22-053-015的CH3结构域的14和17位以及92和98位之间的序列。
抗体分子的CD环序列优选是未修饰的，即野生型。因此，CD环序列优选具有SEQ IDNO：73所示的序列。所述CD环序列优选位于CH3结构域的43至78位。
第一和第二序列可以是分别为FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006或FS22-172的完整的AB和EF结构环序列。例如根据IMGT，IMGT外显子，EU或Kabat编号系统，确定CH3结构域序列中AB，CD和EF结构环的位置在技术人员的能力范围内，并在Hasenhindl等人，(2013)中进行了描述。在一个优选的实施方式中，根据IMGT编号系统的AB，CD和EF结构环分别位于CH3结构域的10和19、42和79以及91和102位之间。因此，在优选的实施方案中，第一，第二和第三序列分别是FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006或FS22-172的CH3结构域的10和19、42和79以及91和102位之间的序列。
因此，在一个优选的实施方式中，CD137抗原结合位点的第一和第二序列包含分别在SEQ ID NO：171和172中列出的AB和EF环序列[FS22-172-003]，或分别在SEQ ID NO：173和174中列出的AB和EF结构环序列[FS22-53-008]。在一个更优选的实施方式中，CD137抗原结合位点的第一和第二序列分别包含SEQ ID NO：171和172中列出的AB和EF结构环[FS22-172-003]。
在另一个优选的实施方式中，CD137抗原结合位点的第一和第二序列分别包含SEQID NO：173和175中列出的AB和EF结构环序列[FS22-053-017]。
在一个优选的实施方式中，CD137抗原结合位点包含第一和/或第二序列，优选以下所列的第一和第二序列：
(i)分别为SEQ ID NO：79和80[FS22-053-008]；
(ii)分别为SEQ ID NO：79和83[FS22-053-009]；
(iii)分别为SEQ ID NO：79和86[FS22-053-011]；
(iv)分别为SEQ ID NO：79和89[FS22-053-017]；
(v)分别为SEQ ID NO：79和92[FS22-053-014]；
(vi)分别为SEQ ID NO：79和95[FS22-053-010]；
(vii)分别为SEQ ID NO：79和98[FS22-053-012]；
(viii)分别为SEQ ID NO：79和101[FS22-053-013]；
(ix)分别为SEQ ID No：79和104[FS22-053-015]；
(x)分别为SEQ ID NO：79和107[FS22-053-016]；
(xi)分别为SEQ ID NO：79和110[FS22-053]；
(xii)分别为SEQ ID No：113和114[FS22-172-003]；
(xiii)分别为SEQ ID No：117和114[FS22-172-002]；
(xiv)分别为SEQ ID NOs120和114[FS22-172-004]；
(xv)分别为SEQ ID No：123和114[FS22-172-001]；
(xvi)分别为SEQ ID NO：126和114[FS22-172-005]；
(xvii)分别为SEQ ID NO：129和114[FS22-172-006]；或者
(xviii)分别为SEQ ID NO：129和114[FS22-172]；其中第一和第二序列优选分别位于抗体分子的CH3结构域的14和17以及91和99位之间。
在又一个更优选的实施方式中，抗体分子包含第一和/或第二序列，优选以下所列的第一和第二序列：
(i)分别为SEQ ID NO：79和80[FS22-053-008]；
(ii)分别为SEQ ID NO：79和83[FS22-053-009]；
(iii)分别为SEQ ID NO：79和86[FS22-053-011]；
(iv)分别为SEQ ID NO：79和89[FS22-053-017]；
(v)分别为SEQ ID NO：113和114[FS22-172-003]；
(vi)分别为SEQ ID NO 117和114[FS22-172-002]；或者
(vii)分别为SEQ ID NO：120和114[FS22-172-004]。
在一个甚至更优选的实施方式中，抗体分子的CD137抗原结合位点分别包含SEQID NO：113和114中列出的第一和第二序列[FS22-172-003]，或SEQ ID NO：79和80中列出的第一和第二序列[FS22-53-008]。在另一个更优选的实施方式中，抗体分子的CD137抗原结合位点分别包含SEQ ID NO：113和114中列出的第一和第二序列[FS22-172-003]。例如，CD137抗原结合位点可以分别包含SEQ ID NO：171和172中列出的AB和EF结构环序列[FS22-172-003]。
在一个实施方式中，所述抗体分子，特别是包含第一和/或第二，优选SEQ ID NO：129和114所示的第一和第二序列的抗体分子[FS22-172-006]，可以在抗体分子CH3结构域的19位上包含亮氨酸(L)。
作为IMGT编号的替代方法，可以根据IMGT外显子编号(也称为连续编号)、EU编号或Kabat编号，对氨基酸残基位置，包括本文所述的氨基酸序列、取代、缺失和插入位置进行编号。CH3结构域残基位置的IMGT编号，IMGT外显子编号，EU编号和Kabat编号之间的一致性显示在图1中。因此，例如，在本申请中涉及第一序列分别位于克隆的CH3结构域的14和17位之间，其中残基位置根据IMGT编号方案进行编号的，第一序列位于CH3结构域的18和21位之间，其中残基位置根据IMGT外显子编号方案编号，如图1所示。或者，如本文所述，CH3结构域中氨基酸残基的位置，包括氨基酸序列的位置，取代、缺失和插入的位置，可以参考它们在SEQ ID NO：75所列出的野生型CH3结构域序列中的位置来定义。IMGT编号与野生型CH3结构域序列之间的一致性也显示在图1中。
在一个实施方式中，抗体分子包含CH3结构域，该CH3结构域包含，具有或由以下的CH3结构域序列组成：FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006或FS22-172，其中FS22-053-008，FS22-053-009，FS22-053-011，FS22-053-017，FS22-053-014，FS22-053-010，FS22-053-012，FS22-053-013，FS22-053-015，FS22-053-016，FS22-053，FS22-172-003，FS22-172-002，FS22-172-004，FS22-172-001，FS22-172-005，FS22-172-006和FS22-172的CH3结构域序列分别列于SEQ ID No：81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、115、118、121、124、127、130和132。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子包含CH3结构域，该CH3结构域包含，具有或由分别为SEQ ID NO：115和81所示的FS22-172-003或FS22-053-008的CH3结构域序列组成。在更优选的实施方式中，抗体分子包含CH3结构域，其包含，具有或由SEQ ID NO：115所示的FS22-172-003的CH3结构域序列组成。
在另一个优选的实施方式中，抗体分子包含CH3结构域，其分别包含，具有或由SEQID NO：90所示的FS22-053-017的CH3结构域序列组成。
抗体分子的CH3结构域可任选地在CH3结构域序列的直接C末端包含另外的赖氨酸残基(K)。
另外，本发明的抗体分子可以包含免疫球蛋白G分子的CH2结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2结构域。优选地，本发明的抗体分子包含IgG1分子的CH2结构域。CH2结构域可以具有SEQ ID NO：76所示的序列。
已知CH2结构域结合Fcγ受体和补体。CH2结构域与Fcγ受体的结合抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)所需，而与补体的结合是补体依赖性细胞毒性(CDC)所需。所述抗体分子的CH2结构域优选地包含减少或消除CH2结构域与一种或多种Fcγ受体，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII，和/或补体的结合的一种或多种突变。发明人假定减少或消除与Fcγ受体的结合将减少或消除抗体分子介导的ADCC。类似地，预期减少或消除与补体的结合将减少或消除抗体分子介导的CDC。不希望受到理论的束缚，当将所述抗体分子施用于患者时，预期将减少或避免肝毒性。另外，在所述抗体分子包含免疫细胞抗原的第二抗原结合位点的情况下，减少或消除与Fcγ受体的结合被认为是有用的，其中ADCC和/或CDC介导的由抗体分子结合的免疫细胞的杀伤应被避免。减少或消除CH2结构域与一种或多种Fcγ受体和/或补体结合的突变是本领域已知的(Wang等人，2018)。这些突变包括在Bruhns等人，2009和Hezareh等人，2001中描述的“LALA突变”，该突变涉及用丙氨酸取代CH2结构域1.3和1.2位的亮氨酸残基(L1.3A和L1.2A)。或者，通过保守的N-联糖基化位点的突变产生无糖基抗体(通过将CH2结构域84.4位的天冬酰胺(N)突变为丙氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺(N84.4A、N84.4G或N84.4Q))以降低IgG1效应子功能也是已知的(Wang等人，2018)。作为另一种选择，已知补体激活(C1q结合)和ADCC可通过将CH2结构域的114位脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸(P114A或P114G)而降低(Idusogie等人，2000；Klein等人，2016)。也可以组合这些突变以产生具有进一步降低的或没有ADCC或CDC活性的抗体分子。
因此，所述抗体分子可包含CH2结构域，其中CH2结构域优选地包含：
(i)1.3和1.2位的丙氨酸残基；和/或
(ii)114位的丙氨酸或甘氨酸；和/或
(iii)84.4位的丙氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸；
其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子包含CH2结构域，其中CH2结构域包含：
(i)1.3位的丙氨酸残基；和
(ii)1.2位的丙氨酸残基；
其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
例如，CH2结构域可以具有SEQ ID NO：77所列出的序列。
在另一个优选的实施方式中，抗体分子包含CH2结构域，其中CH2结构域包含：
(i)1.3位的丙氨酸残基；
(ii)1.2位的丙氨酸残基；和
(iii)114位的丙氨酸；
其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
例如，CH2结构域可以具有SEQ ID NO：176所列出的序列。
在一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)基于CDR的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中基于CDR的抗原结合位点包含抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的三个VHCDR和三个VL CDR(CDR 1-6)；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列；其中第一和第二序列分别具有SEQ ID NOs113和114[FS22-172-003]或79和80[FS22-53-008]中列出的序列，优选地其中第一和第二序列具有SEQ ID NOs 113和114[FS22-172-003]中列出的序列。
如实施例中所述，具有CD137抗原结合位点的抗体分子分别包含SEQ ID NO：79和89[FS22-053-017]中列出的第一序列和第二序列，能够结合人、食蟹猴和，出乎意料地，鼠CD137。本发明人证明了所述抗体分子在交联时在人、食蟹猴和小鼠T细胞活化试验中具有活性。
在另一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)基于CDR的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中基于CDR的抗原结合位点包含抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的三个VHCDR和三个VL CDR(CDR 1-6)；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列，其中第一和第二序列具有SEQ ID NO：79和89[FS22-053-017]所列出的序列。
在一些实施方式中，所述抗体分子包含
(a)基于CDR的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中基于CDR的抗原结合位点包含抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的三个VHCDR和三个VL CDR(CDR 1-6)；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列，其中第一和第二序列具有SEQ ID NOs 113和114[FS22-172-003]，或79和80[FS22-53-008]所列出的序列，优选地，其中第一和第二序列具有SEQ ID NOs 113和114[FS22-172-003]中列出的序列，前提是该抗体分子不包含与具有SEQ ID Nos 79和80[FS22-053-008]所列出的第一和第二序列的CD137抗原结合位点配对的抗体G12v2的CDR1-6。
在另一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)基于CDR的PD-L1抗原结合位点；和
(b)CH3结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：115[FS22-172-003]或81[FS22-53-008]，优选SEQ ID NO：115[FS22-172-003]中列出的序列组成；
其中基于CDR的抗原结合位点包含抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的三个VHCDR和三个VL CDR(CDR 1-6)。
在另一个可选的优选实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)基于CDR的PD-L1抗原结合位点；和
(b)CH3结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：90[FS22-053-017]中列出的序列组成；
其中基于CDR的抗原结合位点包含抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的三个VHCDR和三个VL CDR(CDR 1-6)。
在又一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点的VH结构域和VL结构域；和
(b)CH3结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：115[FS22-172-003]或81[FS22-53-008]，优选SEQ ID NO：115[FS22-172-003]中列出的序列组成；
其中VH和VL结构域包含、具有或由抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的VH和VL组成。
在又一个可选的优选实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含
(a)包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点的VH结构域和VL结构域；和
(b)CH3结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：90[FS22-053-017]中列出的序列组成；
其中VH和VL结构域包含、具有或由抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的VH和VL组成。
在又一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含-
(a)包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点的VH结构域和VL结构域；
(b)CH3结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：115[FS22-172-003]或81[FS22-53-008]，优选SEQ ID NO：115[FS22-172-003]中列出的序列组成；
(c)CH2结构域，其包含、具有或由SEQ ID NO：76中列出的序列组成,其中CH2域包括：
(i)1.3位的丙氨酸残基；
(ii)1.2位的丙氨酸残基；
其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案；和
其中VH和VL结构域包含、具有或由抗体E12v2、E05v2或G12v2，优选E12v2的VH和VL组成。
在另一个实施方式中，与PD-L1和CD137结合的抗体分子包括：
(a)VH和VL结构域，其包含基于CDR的PD-L1抗原结合位点，其中基于CDR的抗原结合位点包含CDR 1-6；和
(b)位于抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点，所述CD137抗原结合位点包含位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列；
其中CDR 1-6，第一序列和第二序列具有以下列出的序列：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、113和114，[FS22-172-003-AA/E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：1、2、3、18、19、20、113和114，[FS22-172-003-AA/E05v2]；
(iii)分别为SEQ ID NO：1、2、3、18、19、29、113和114，[FS22-172-003-AA/G12v2]；
(iv)分别为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、79和80，[FS22-053-008-AA/E12v2]；或
(v)分别为SEQ ID NO：1、2、3、18、19、20、79和80，[FS22-053-008-AA/E05v2]，或
其中VH结构域，VL结构域，第一序列和第二序列具有在以下列出的序列：
(i)分别为SEQ ID NO：12、14、113和114，[FS22-172-003-AA/E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：23、25、113和114，[FS22-172-003-AA/E05v2]；
(iii)分别为SEQ ID NO：23、30、113和114，[FS22-172-003-AA/G12v2]；
(iv)SEQ ID NO：12、14、79和80，[FS22-053-008-AA/E12v2]；或
(v)分别为SEQ ID NO：23、25、79和80，[FS22-053-008-AA/E05v2]；或
其中VH结构域，VL结构域和CH3结构域具有以下列出的序列：
(i)分别为SEQ ID NO：12、14、和115，[FS22-172-003-AA/E12v2]；
(ii)分别为SEQ ID NO：23、25、和115，[FS22-172-003-AA/E05v2]
(iii)分别为SEQ ID NO：23、30、和115，[FS22-172-003-AA/G12v2]
(iv)分别为SEQ ID NO：12、14、和81，[FS22-053-008-AA/E12v2]；或
(v)分别为SEQ ID NO：23、25、和81，[FS22-053-008-AA/E05v2]。
在又一个优选的实施方式中，所述结合PD-L1和CD137的抗体分子包含重链，其包含、具有或由抗体的重链和轻链组成：
(i)分别在SEQ ID NO：134和17中列出的FS22-172-003-AA/E12v2；
(ii)分别在SEQ ID NO：137和28中列出的FS22-172-003-AA/E05v2；
(iii)分别在SEQ ID NO：140和33中列出的FS22-172-003-AA/G12v2；
(iv)分别在SEQ ID NO：143和17中列出的FS22-053-008-AA/E12v2；
(v)分别在SEQ ID NO：146和28中列出的FS22-053-008-AA/E05v2；或
(vi)分别在SEQ ID NO：149和33中列出的FS22-053-008-AA/G12v2。
在一个甚至更优选的实施方式中，所述与PD-L1和CD137结合的抗体分子包含重链，其包含、具有或由抗体的重链和轻链组成：
(i)分别在SEQ ID NO：134和17中列出的FS22-172-003-AA/E12v2；
(ii)分别在SEQ ID NO：137和28中列出的FS22-172-003-AA/E05v2；
(iii)分别在SEQ ID NO：140和33中列出的FS22-172-003-AA/G12v2；
(iv)分别在SEQ ID NO：143和17中列出的FS22-053-008-AA/E12v2；或
(v)分别在SEQ ID NO：146和28中列出的FS22-053-008-AA/E05v2。
在一个更优选的实施方式中，所述与PD-L1和CD137结合的抗体分子包含重链，其包含，具有或由抗体的重链和轻链组成：
(i)分别在SEQ ID NO：134和17中列出的FS22-172-003-AA/E12v2；或
(iv)分别在SEQ ID NO：143和17中列出的FS22-053-008-AA/E12v2。
在又一个更优选的实施方式中，所述与PD-L1和CD137结合的抗体分子包含重链，其包含，具有或由分别在SEQ ID NO：134和17中列出的抗体FS22-172-003-AA/E12v2的重链和轻链组成。。
在又一个可选的优选实施方式中，所述与PD-L1和CD137结合的抗体分子包含重链，其包含，具有或由抗体的重链和轻链组成：
(i)分别在SEQ ID NO：152和17中列出的FS22-053-017-AA/E12v2；
(ii)分别在SEQ ID NO：153和28中列出的FS22-053-017-AA/E05v2；或
(iii)分别在SEQ ID NO：154和33中列出的FS22-053-017-AA/G12v2。
本发明的抗体分子还可包含第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列，CH3结构域，CH2结构域，CH2和CH3结构域，CDR，FW，VH结构域，VL结构域，本文公开的轻链和/或重链序列的变体。合适的变体可以通过序列改变或突变以及筛选的方法获得。在一个优选的实施方式中，包含一个或多个变体序列的抗体分子保留了亲本抗体分子的一个或多个功能特征，例如对PD-L1和CD137的结合特异性和/或结合亲和力。例如，包含一个或多个变体序列的抗体分子优选以与(亲本)抗体分子相同的亲和力或更高的亲和力结合PD-L1和/或CD137。亲本抗体分子是不包含已整合进入变体抗体分子中的氨基酸取代、缺失和/或插入的抗体分子。
例如，本发明的抗体分子可包含第一，第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列，CH3结构域，CH2结构域，CH2和CH3结构域，CDR，FW，VH结构域，VL结构域，轻链和/或重链序列，其与本文公开的结构环，CH3结构域，CH2结构域，CH2和CH3结构域，CDR，FW，VH结构域，VL结构域，轻链或重链序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.1％，至少99.2％，至少99.3％，至少99.4％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体分子包含CH3结构域序列，其与SEQ IDNO：115[FS22-172-003]或81[FS22-053-008]，优选SEQ ID NO：115[FS22-172-003]中列出的CH3结构域序列具有至少97％，至少98％，至少99％，至少99.1％，至少99.2％，至少99.3％，至少99.4％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中，抗体分子具有或包含CH2结构域序列，其与SEQ IDNO：76或77中列出的CH2结构域序列具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.1％，至少99.2％，至少99.3％，至少99.4％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
通常参考算法GAP(威斯康星州GCG软件包，Accelerys公司，美国圣地亚哥)来定义序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch算法比对两个完整序列，从而最大程度地增加匹配数并最大程度地减少缺口数。通常，使用缺口创建罚分等于12，缺口延伸罚分等于4的默认参数。可以优选使用GAP，但是可以使用其他算法，例如BLAST(使用Altschul等人，1990的方法)，FASTA(使用Pearson和Lipman，1988的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或TBLASTN程序，参见Altschul等人，1990，同上，通常采用默认参数。特别地，可以使用psi-Blast算法(Altschul等人，1997)。
本发明的抗体分子还可包含第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列，CH3结构域，CH2结构域，CH2和CH3结构域，CDR，FW，VH结构域，VL结构域，轻链和/或重链，其与本文公开的第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列，CH3结构域，CH2结构域，CH2和CH3结构域，CDR，FW，VH结构域，VL结构域，轻链或重链序列相比，具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个的改变。特别地，可以在VH和VL结构域序列之外的抗体分子的一个或多个框架区域和/或在CH3结构域的一个或多个框架区域中进行改变。例如，所述改变可以在本文所述序列之外的CH3结构域中，作为第一、第二和第三序列，或作为AB、CD或EF结构环序列。
在一个优选的实施方式中，与SEQ ID NO：81、84、87，90、93、96、99、102、105、108、111、115、118、121、124、127、130或132列出的CH3结构域序列相比，本发明的抗体分子可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个的改变的CH3结构域序列。在一个更优选的实施方式中，与SEQ ID NO：115[FS22-172-003]或81[FS22-053-008]，优选SEQ ID NO：115[FS22-172-003]列出的CH3结构域相比，本发明的抗体分子可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个的改变的CH3结构域序列。
在另一个优选的实施方式中，与SEQ ID NO：76或77列出的CH2结构域相比，所述抗体分子包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个的改变的CH2结构域序列。
在一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的优选实施方式中，取代可以是保守取代，例如根据下表的取代。在一些实施方式中，中间列中相同类别的氨基酸被彼此取代，即例如非极性氨基酸被另一非极性氨基酸取代。在一些实施方式中，最右边一列中同一行中的氨基酸被彼此取代。
在一些实施方式中，取代在功能上可以是保守的。即，在一些实施方式中，与等效的未取代的抗体分子相比，该取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含该取代的抗体分子的一种或多种功能性质(例如结合亲和力)。
当抗体分子包含本文公开的第一序列，AB结构环序列，CH3结构域或重链序列的变体时，抗体分子优选将序列PPY保留在抗体分子的CH3结构域的11和19位之间，优选在15和17位之间。另外，抗体分子优选在抗体分子的CH3结构域的16和17位之间保留插入，优选5个氨基酸的插入。在另一个优选的实施方式中，抗体分子优选将该序列保留在抗体分子的CH3结构域的97和98位处。
另外，或可替代地，在抗体分子包含本文公开的CH3结构域，CH2和CH3结构域，轻链或重链序列的变体的情况下，所述变体优选在抗体分子CH3结构域的AB和EF结构环中的第一和第二位不包含任何氨基酸改变。例如，所述变体在抗体分子的CH3结构域的AB和EF结构环中可以不包含任何氨基酸改变。另外，所述变体在抗体分子的CH3结构域的CD结构环中可以不包含任何氨基酸改变。即，所述变体在抗体分子的CH3结构域的AB和EF结构环中可以不包含任何氨基酸改变。
当抗体分子包含本文公开的VH结构域，VL结构域，轻链或重链序列的变体时，抗体分子优选地在CDR序列中不包含任何氨基酸改变。即，任何氨基酸改变都可以存在于FW序列中，例如HFW1、HFW2、HFW3、HFW4、LFW1、LFW2、LFW3和/或LFW4。例如，所述变体可以在CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5和/或CDR6序列中不包含任何氨基酸改变。
所述抗体分子优选地结合人PD-L1和人CD137。优选地，所述抗体分子能够同时结合人PD-L1和人CD137，其中人CD137和人PD-L1是共表达的。如本文所用，共表达是指两个靶标在单个细胞的表面上或在两个分离的细胞的表面上表达。例如，当人PD-L1和人CD137在单个细胞例如免疫细胞上共表达时，所述抗体分子可能能够结合人PD-L1和人CD137；以及当人PD-L1和人CD137在两个独立的细胞，例如在肿瘤微环境中表达CD137的免疫细胞和表达PD-L1的单个肿瘤细胞上共表达时，能够与人PD-L1和人CD137结合。
所述抗体分子优选以8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.4nM、或0.3nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合人PD-L1。优选地，所述抗体分子以0.3nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合人PD-L1。
所述人PD-L1可以具有例如SEQ ID NO：180所示的序列。所述人PD-L1可以是例如具有Avi标签的重组人PD-L1(hPD-L1-Avi-His)，可获自Acro生物系统(货号：PD1-H82E5)。所述重组人PD-L1可以被生物素化。
所述抗体分子优选以60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM或2nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合二聚人CD137。优选地，所述抗体分子以2nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合二聚人CD137。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子结合二聚CD137的亲和力比单体CD137更高。在一个优选的实施方式中，所述抗体分子结合二聚CD137的亲和力比抗体分子对单体CD137的亲和力高至少50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍或200倍。
所述人CD137可以例如具有SEQ ID NO：186所列出的序列。实施例中描述了产生二聚和单体CD137抗原的方法。
抗体分子优选与食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137结合。优选地，抗体分子能够同时结合食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137，其中食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137在单个细胞的表面或两个独立的细胞表面上表达。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子可以以8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.4nM或0.3nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合食蟹猴PD-L1。优选地，所述抗体分子以1nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合食蟹猕猴PD-L1。
食蟹猴PD-L1可以具有例如SEQ ID NO：184所列出的序列。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子可以60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM、或2nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合二聚体食蟹猴CD137。优选地，所述抗体分子以2nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合二聚体食蟹猴CD137。
所述抗体分子可以以相似的亲和力结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1，和/或以相似的亲和力结合二聚人CD137和二聚食蟹猴CD137。这被认为对于确保用食蟹猴中的抗体分子进行的功效和毒性研究预测人体内抗体分子的功效和毒性是有益的。
因此，在一个优选的实施方式中，所述抗体分子与食蟹猴PD-L1结合的亲和力高于或低于该抗体分子与人PD-L1结合的亲和力不超过10倍，优选不超过5倍。在一个优选的实施方式中，所述抗体分子结合二聚食蟹猴CD137的亲和力高于或低于该抗体分子结合二聚人CD137的亲和力不超过10倍，优选不超过5倍。
所述抗体分子与同源抗原例如人PD-L1、人CD137、食蟹猴PD-L1或食蟹猴CD137的结合亲和力可以通过表面等离振子共振(SPR)例如Biacore确定。合适的方法的进一步细节在实施例中描述。
抗体分子同时结合两个同源抗原的能力，例如人PD-L1和人CD137，或食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137，可以通过SPR例如Biacore确定。合适的方法的进一步细节在实施例中描述。
抗体分子可能能够阻断PD-L1与其受体PD-1之间，优选地，人PD-L1与人PD-1之间的相互作用。
已知PD-1/PD-L1信号通路在介导免疫抑制中很重要。因此，预期能够阻断该途径的抗体分子是有利的，因为它们可以减少免疫抑制并有助于增加抗肿瘤反应。PD-1/PD-L1信号传导抑制和CD137激活可能共同起作用，以增加抗肿瘤效力。
抗体分子阻断PD-L1与PD-1结合的能力可以使用基于生物发光细胞的测定法来确定，例如使用PD-1/PD-L1阻断生物测定产品，例如来自Promega。可以使用ELISA确定抗体分子阻断PD-L1与PD-1结合的能力。这些测定法的进一步细节在实施例中描述。
抗体分子阻断PD-L1与PD-1结合的能力，在本文中也称为PD-1/PD-L1阻断活性，可通过参考包含在WO2011/066389A1中列出的抗体2.14H9OPT的重链和轻链，或分别在SEQ IDNOs 177和178中列出的抗体G1/280_02_G02的重链和轻链或由其组成的抗体分子来确定。
例如，抗体分子可以具有与包含或由WO2011/066389 A1中列出的抗体2.14H9OPT的重链和轻链，或分别在SEQ ID NO:177和178中列出的抗体G1/280_02_G02的重链和轻链组成的抗体分子相似或更高水平的PD-1/PD-L1阻断活性。
抗体分子的PD-1/PD-L1阻断活性可以是包含或由WO2011/066389 A1中列出的抗体2.14H9OPT的重链序列和轻链序列，或分别在SEQ ID NO:177和178中列出的抗体G1/280_02_G02的重链和轻链组成的抗体分子的PD-1/PD-L1阻断活性的至少70％、80％或90％。
抗体分子的PD-1/PD-L1阻断活性可介于包含或由WO2011/066389 A1中列出的抗体2.14H9OPT的重链序列和轻链序列，或分别在SEQ ID NO:177和178中列出的抗体G1/280_02_G02的重链和轻链组成的抗体分子的PD-1/PD-L1阻断活性的70％至130％，80％至120％或90％至110％之间。
如上所述，本发明的抗体分子能够同时结合PD-L1和CD137，这导致CD137的活化(激动)。在优选的实施方式中，所述抗体分子能够同时结合人PD-L1和人CD137，其中这种结合引起人CD137的活化。在另一个优选的实施方式中，所述抗体分子能够同时结合食蟹猴PD-L1和食蟹猴CD137，其中这种结合引起食蟹猴CD137的活化。测试同时结合和激活的示例性方法包括T细胞活化实验，如下文更详细的所述。
抗体分子激活T细胞的能力可以使用T细胞活化实验来测量。T细胞在激活时释放IL-2。因此，T细胞活化实验可以测量IL-2的释放，以确定抗体分子诱导的T细胞活化的水平。
例如，通过在T细胞活化实验中测量通过T细胞实现IL-2的一半最大释放所需的抗体分子的浓度，来确定抗体分子活化T细胞的能力。以下将其称为EC50。
在一个优选的实施方式中，所述抗体分子在T细胞活化实验中的EC50是在同一测定法中FS22-172-003-AA/E12v2的EC50的50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内，其中FS22-172-003-AA/E12v2由SEQ ID NO：134的重链和SEQ ID NO：17的轻链组成。
例如，当抗体分子交联时，所述抗体分子在T细胞活化实验中的EC50可以为30nM或更小、25nM或更小、20nM或更小、14nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1.5nM或更小、1nM或更小、0.4nM或更小、0.4nM或更小、或0.3nM或更小，优选地1nM或更小、更优选地1.5nM或更小。
另外或可替代地，抗体分子激活T细胞的能力可以通过在存在抗体分子的情况下通过在T细胞活化实验中测量T细胞释放的最大IL-2浓度来确定(Emax)。
在存在抗体分子的情况下，在T细胞活化实验中，抗体分子可具有的T细胞释放的最大IL-2浓度为至少1500pg/ml、2000pg/ml、2500pg/ml、3000pg/ml、或3250pg/ml或更高，优选2500pg/ml或更高。
在一个优选的实施方式中，在存在抗体分子的情况下，在T细胞活化实验中由T细胞释放的IL-2最大浓度是在同一测定中在存在的FS22-172-003-AA/E12v2的情况下，由T细胞释放的IL-2最大浓度的20％或10％以内，其中FS22-172-003-AA/E12v2的细胞由SEQ IDNO：134和SEQ ID NO：17的轻链。
T细胞活化实验优选包含表达CD137的T细胞和表达PD-L1的细胞，例如，可以如实施例中所述制备和使用的过表达人PD-L1的HEK293细胞(HEK.hPD-L1)。备选地或另外地，可以使用表达不同水平的PD-L1的细胞，例如人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26)细胞和/或SKBR3细胞。如实施例中所述，HEK.hPD-L1表达高水平的人PD-L1，MDA-MB-231细胞表达中等水平的人PD-L1，而SKBR3细胞表达低水平的PD-L1。
在一个优选的实施方式中，除了表达CD137和PD-L1的细胞外，T细胞活化实验不包含任何能够使抗体分子交联的试剂。如实施例中所述，能够交联抗体分子的试剂的实例包括抗人CH2抗体。
T细胞活化实验可以是本文所述的T细胞实验，例如本实施例中所述的pan-T细胞实验。
例如，T细胞活化实验可以是基于从人外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞的IL-2释放测定。例如，T细胞活化实验可包括从白细胞耗竭锥分离人PBMC。分离PBMC的方法是本领域已知的，并在本实施例中描述。然后可以从PBMC中分离T细胞。从PBMC中分离T细胞(所有T细胞)的方法是本领域已知的，并在本实施例中描述。
活化实验可涉及例如在实验培养基如T细胞培养基中制备所需数目的T细胞。可以以1.0x 106细胞/ml的浓度制备所需数量的T细胞。然后可以使用合适的T细胞活化试剂刺激T细胞，该试剂提供T细胞活化所需的信号。例如，T细胞活化试剂可以是包含CD3和CD28的试剂，例如包含CD3和CD28的珠子。分离的T细胞可以与T细胞活化试剂一起孵育过夜以活化T细胞。之后，可以洗涤活化的T细胞将T细胞与T细胞活化试剂分离，并以合适的浓度，例如2.0×106细胞/ml，重悬于T细胞培养基中。然后可以将活化的T细胞添加到包被有抗人CD3抗体的板上。
可以将细胞(例如HEK.hPD-L1细胞)以例如2x 105细胞每孔铺到抗CD3抗体包被的组织培养板上的T细胞培养基中。之后，例如孵育4小时，可除去所有T细胞培养基，并用100μl含T细胞的T细胞培养基重悬，例如浓度为5.0x 105细胞/ml，结果为5.0x 104细胞/孔。
可以制备每种测试抗体分子的合适稀释液并将其添加到孔中。然后可以将T细胞与测试抗体在37℃，5％CO2中孵育24小时。可以收集上清液并进行测定以确定上清液中IL-2的浓度。用于确定溶液中IL-2浓度的方法是本领域已知的，并且在本实施例中进行了描述。可以将人IL-2的浓度相对抗体分子的对数浓度作图。可以使用对数(激动剂)相对对响应方程拟合得到结果曲线。
抗体分子可以与生物活性分子或可检测标记物缀合。在这种情况下，抗体分子可以称为缀合物。此类缀合物可用于治疗本文所述的疾病。
例如，生物活性分子可以是免疫系统调节剂，例如细胞因子，优选人细胞因子。例如，细胞因子可以是刺激T细胞活化和/或增殖的细胞因子。与抗体分子缀合的细胞因子的实例包括IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF和IFN-γ。
或者，生物活性分子可以是配体陷阱，例如细胞因子(例如TGF-β或IL-6)的配体陷阱。
或者，生物活性分子可以是治疗性放射性同位素。
放射免疫疗法例如用于癌症治疗。适用于放射免疫疗法的治疗性放射性同位素是本领域已知的，包括钇-90、碘-131、铋-213、砹-211、镥-177、铼-188、铜-67、锕-225和碘-125和铽-161。
可以与抗体分子偶联的合适的可检测标记在本领域中是已知的，包括放射性同位素，例如碘-125、碘-131、钇-90、铟-111和锝-99；以及荧光染料，例如荧光素、若丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和花青染料衍生物，例如Cy7和Alexa750；发色染料，例如二氨基联苯胺；乳胶微球；酶标记，例如辣根过氧化物酶；具有光谱隔离吸收或发射特性的荧光粉或激光染料；和化学发光，例如生物素，可以通过与特定的同源可检测部分结合来检测，例如标记地抗生物素蛋白。
抗体分子可通过任何合适的共价或非共价键，例如二硫键或肽键，与生物活性分子或可检测标记缀合。当生物活性分子是细胞因子时，细胞因子可以通过肽接头与抗体分子连接。合适的肽接头是本领域已知的，并且长度可以是5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15个氨基酸。
在一些实施方式中，生物活性分子可以通过可裂解的接头与抗体分子缀合。接头可允许在治疗部位从抗体分子释放生物活性分子。接头可包括酰胺键(例如肽接头)，二硫键或腙。例如，肽接头可被位点特异性蛋白酶切割，二硫键可被胞浆的还原环境切割，而腙可被酸介导的水解切割。
本发明还提供了分离的核酸分子或编码本发明的抗体分子的分子。技术人员不难使用本领域众所周知的方法来制备这种核酸分子。
所述一个或多个核酸分子可以例如包含SEQ ID NO：82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、116、119、122、125、128、131、或133所示的序列，它们分别编码FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、和FS22-172的CH3结构域。优选地，所述一个或多个核酸分子包含SEQ ID NO：116或82所示的序列，分别编码FS22-172-003或FS22-053-008的CH3结构域。更优选地，一个或多个核酸分子包含SEQ IDNO：116所示的序列，编码FS22-172-003的CH3结构域。
所述一个或多个核酸分子可以编码VH结构域和/或VL结构域，优选抗体E12v2、E05v2、G12v2或lam-G02v3，优选抗体E12v2、E05v2或G12v2，更优选E12v2或E05v2，最优选E12v2的VH结构域和VL结构域。这些抗体的VH和VL结构域序列在本文中描述。
例如，所述核酸分子可包含：
(i)如SEQ ID NO：13所示的抗体E12v2的VH结构域核酸序列，和/或如SEQ ID NO：15所示的抗体E12v2的VL结构域核酸序列；或
(ii)如SEQ ID NO：24所示的抗体E05v2的VH结构域核酸序列，和/或如SEQ ID NO：26所示的抗体E05v2的VL结构域核酸序列；
(iii)如SEQ ID NO：24所示的抗体G12v2的VH结构域核酸序列，和/或如SEQ IDNO：31所示的抗体G12v2的VL结构域核酸序列；或
(v)如SEQ ID NO：24所示的抗体lam-G02v3的VH结构域核酸序列，和/或如SEQ IDNO：42所示的抗体lam-G02v3的VL结构域核酸序列。
一个或多个核酸分子可以编码重链和/或轻链，优选抗体FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/G12v2、FS22-053-008-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E05v2、或FS22-053-008-AA/G12v2的重链和/或轻链，优选抗体FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/G12v2、FS22-053-008-AA/E12v2、或FS22-053-008-AA/E05v2，甚至更优选抗体FS22-172-003-AA/E12v2。这些抗体的重链和轻链序列在本文中描述。
例如，所述核酸分子可包含：
(i)如SEQ ID NO：32或135所示的抗体FS22-172-003-AA/E12v2的重链核酸序列，和/或如SEQ ID NO：39或136所示的抗体FS22-172-003-AA/E12v2的轻链核酸序列；或
(ii)如SEQ ID NO：138所示的抗体FS22-172-003-AA/E05v2的重链核酸序列，和/或如SEQ ID NO：139所示的抗体FS22-172-003-AA/E05v2的轻链核酸序列；
(iii)如SEQ ID NO：141所示的抗体FS22-172-003-AA/G12v2的重链核酸序列，和/或如SEQ ID NO：142所示的抗体FS22-172-003-AA/G12v2的轻链核酸序列；
(iv)如SEQ ID NO：144所示的抗体FS22-053-008-AA/E12v2的重链核酸序列,和/或如SEQ ID NO：145所示的抗体FS22-053-008-AA/E12v2的轻链核酸序列；
(v)如SEQ ID NO：147所示的抗体FS22-053-008-AA/E05v2的重链核酸序列，和/或如SEQ ID NO：148所示的抗体FS22-053-008-AA/E05v2的轻链核酸序列；或
(vi)如SEQ ID NO：150所示的抗体FS22-053-008-AA/G12v2的重链核酸序列,和/或如SEQ ID NO：151所示的抗体FS22-053-008-AA/G12v2的轻链核酸序列。
当核酸编码本发明的抗体分子的VH和VL结构域，或重链和轻链时，两个结构域或链可以被编码在两个独立的核酸分子上。
分离的核酸分子可以用于表达本发明的抗体分子。核酸通常将以重组载体的形式提供用于表达。因此，本发明的另一方面提供了一种包含如上所述的核酸的载体。可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。优选地，所述载体包含合适的调控序列以驱动核酸在宿主细胞中的表达。载体可以是质粒，病毒例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。
如本文所述的核酸分子或载体可以被引入宿主细胞。将核酸或载体引入宿主细胞的技术在本领域中是已经建立的，并且可以采用任何合适的技术。适用于产生重组抗体分子的一系列宿主细胞是本领域已知的，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO、NS0或HEK细胞，例如HEK293细胞。
本发明的另一方面提供了一种生产本发明的抗体分子的方法，包括在宿主细胞中表达编码该抗体分子的核酸，并任选地分离和/或纯化由此产生的抗体分子。培养宿主细胞的方法是本领域众所周知的。所述方法可以进一步包括分离和/或纯化抗体分子。纯化重组抗体分子的技术是本领域公知的，包括例如HPLC、FPLC或亲和色谱，例如使用蛋白A或蛋白L。在一些实施方式中，可以使用抗体分子上的亲和标签进行纯化。所述方法还可包括将抗体分子配制成药物组合物，任选地与如下所述的药学上可接受的赋形剂或其他物质一起。
已知PD-L1在许多癌细胞上表达并且在免疫系统的细胞上表达。CD137在免疫系统的细胞上表达，包括T细胞，特别是CD8+T细胞，B细胞，NK细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。CD137在CD4+T细胞上的表达水平比CD8+T细胞较低，但也已被证明与诱导CD4+T细胞的某些子集的增殖和活化有关。
已经显示CD137活化在增强CD8+T细胞的增殖、存活和细胞毒性效应子功能以及CD8+T细胞分化和记忆CD8+T细胞的维持中起作用。还证明了CD137的激活可增强NK细胞介导的ADCC以及B细胞的增殖、存活和细胞因子的产生。
如本文中详细描述的，本发明人已经证明本发明的抗体分子能够同时结合PD-L1和CD137以诱导CD137的激动作用。以这种方式，抗体分子基于PD-L1和CD137的表达自主驱动激动作用，而无需其他交联剂。由于PD-L1在许多癌细胞上表达，而CD137在免疫细胞上表达，其在增强免疫细胞的增殖和存活中起着已知作用，因此预期本发明的抗体分子将能够增强PD-L1表达位置(例如在肿瘤微环境中)的免疫应答。此外，本发明人已经表明，使用具有这些特性的抗体分子可有效地抑制癌症的同系小鼠模型中的肿瘤生长，并且这种抗体分子比分别施用两个结合PD-L1和CD137的结合分子更有效。
因此，本文所述的抗体分子可用于治疗应用，特别是在癌症的治疗中。
本文所述的抗体分子可用于人体或动物体治疗的方法。本发明的相关方面提供了：
(i)本文所述的用作药物的抗体分子，
(ii)本文所述的抗体分子，用于治疗疾病或病症的方法，
(iii)本文所述的抗体分子在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途；和，
(iv)治疗个体疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本文所述的抗体分子。
所述个体可以是患者，优选人类患者。
治疗可以是达到某种期望的治疗效果的任何治疗或疗法，例如，抑制或延缓病情进展，并且包括进展速度的降低，进展速度的停滞，病情的改善，病情的治愈或缓解(无论是部分还是全部)，预防、改善、延迟、减轻或阻止一种或多种病状和/或症状，或延长个体或患者的生存期，超出了在没有治疗的情况下的预期。
还包括作为预防措施(即预防)的治疗。例如，对于易患或有可能发生或再次发生疾病(如癌症)的个体，可按本文所述进行治疗。这种治疗可以预防或延迟个体中疾病的发生或再发生。
所描述的治疗方法可以包括除抗体分子之外对个体施用至少一种其他治疗。因此，本文所述的抗体分子可以单独或与一种或多种其他治疗组合地施用于个体。当抗体分子与另一种治疗组合施用于个体时，附加治疗可以与抗体分子施用的同时，相继或分开地施用于个体。在与抗体分子与附加治疗同时施用的情况下，可以将抗体分子和附加治疗作为组合制剂施用于个体。例如，附加疗法可以是用于待治疗疾病的已知疗法或治疗剂。
尽管可以单独施用抗体分子，但是抗体分子通常将以药物组合物的形式施用，该药物组合物除了抗体分子之外还可以包含至少一种组分。因此，本发明的另一方面提供了包含如本文所述的抗体分子的药物组合物。还提供了一种包括将抗体分子配制成药物组合物的方法。
除抗体分子外，药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如，人)的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并与合理的获益/风险比相称。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体，赋形剂等也必须是“可接受的”。载体或其他材料的确切性质将取决于给药途径，这可以通过输注、注射或任何其他合适的途径进行，如下所述。
对于肠胃外，例如皮下或静脉内给药，例如通过注射，包含抗体分子的药物组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其不含热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。可以根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方式中，可以以冻干形式提供抗体分子以在施用之前重建。例如，冻干的抗体分子可在施用给个体之前在无菌水中重构并与盐水混合。
给药可以以“治疗有效量”，这足以显示出对个体的益处。实际给药的量以及给药的速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度，所治疗的特定个体，个体的临床状况，疾病原因，组合物递送部位，抗体分子的类型，给药方法，给药时间表和医生已知的其他因素。治疗处方，例如剂量等的决定属于全科医生和其他医生的责任，并且可能取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。适当剂量的抗体分子在本领域中是众所周知的(Ledermann等人，(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；和Bagshawe等人，(1991)抗体、免疫缀合物和放射药物4：915-922)。可以使用本文所述的具体剂量，或在Physician's DeskReference(2003)中指出的适用于所施用抗体分子的剂量。抗体分子的治疗有效量或合适剂量可以通过比较体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括待治疗区域的大小和位置以及抗体分子的精确性质。
对于全身性应用，典型的抗体剂量范围为100μg至1g，对于局部应用，典型的抗体剂量范围为1μg至1mg。可以开始施用较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。这是成年个体单次治疗的剂量，可以针对儿童和婴儿按比例调整剂量，也可以针对其他抗体形式按分子量调整剂量。
根据医生的判断，可以每天，每周两次，每周或每月间隔重复治疗。个体的治疗方案可能取决于抗体组合物的药代动力学和药效学性质，给药途径和所治疗疾病的性质。
治疗可以是周期性的，并且两次给药之间的时间可以是大约两周或更长时间，例如大约三周或更长时间，大约四周或更长时间，大约每月一次或更长时间，大约五周或更长时间，或者大约六周或更长时间。例如，治疗可以是每两到四周或每四到八周。合适的制剂和给药途径如上所述。
在一个优选的实施方式中，本文所述的抗体分子可用于治疗癌症的方法。
癌症的特征可能是恶性癌细胞的异常增殖。当提到特定类型的癌症，例如乳腺癌时，这是指相关组织例如乳房组织的恶性细胞的异常增殖。位于乳房中但是另一组织例如卵巢组织的恶性细胞异常增殖的结果的继发性癌症不是本文所指的乳腺癌，而是卵巢癌。
所述癌症可以是原发性或继发性癌症。因此，本文所述的抗体分子可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤和/或肿瘤转移。
使用本文所述的抗体分子治疗的癌症的肿瘤可以包含表达CD137的TIL，例如在他们的细胞表面。在一个实施方式中，可能已经确定肿瘤包含表达CD137的TIL。用于确定抗原在细胞表面上表达的方法是本领域已知的，并且包括例如流式细胞术。
例如，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以选自下组：白血病，例如急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；实体癌，例如肉瘤(例如软组织肉瘤)、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、黑色素瘤、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、大脑癌(例如多形胶质母细胞瘤)、乳腺癌、子宫/子宫内膜癌、卵巢癌(例如卵巢浆液性囊腺瘤)、前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、大肠癌(例如大肠腺癌)、子宫颈癌(例如子宫颈鳞状细胞癌和子宫颈腺癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、食道癌、胰腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肾上腺癌、胃癌(例如胃腺癌)、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌(例如胆管癌)、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌。
在一个优选的实施方式中，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症是实体癌。
更优选地，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症是选自下组：黑色素瘤、膀胱癌、大脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肝癌的实体癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和胃肠道间质瘤(GIST)。
在另一个优选的实施方式中，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以是对用一种或多种检查点抑制剂(例如结合PD-1、PD-L1或CTLA4的抗体)的治疗有反应的癌症。与对检查点抑制剂疗法无反应的肿瘤相比，此类肿瘤被认为具有更高的TIL水平和/或更高的肿瘤突变负担。此类肿瘤也称为温或热肿瘤。
这样的肿瘤的例子包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、黑色素瘤、肺癌(例如鳞状肺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌[NSCLC]或小细胞肺癌[SCLC])、前列腺癌、子宫颈癌(例如子宫颈鳞状细胞癌或子宫颈腺癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、肾癌、大肠癌(MSI或MSS；例如大肠腺癌)、食道癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、间皮瘤、尿路上皮癌、默克尔细胞癌和胃腺癌。在一个优选的实施方式中，所述癌症是HNSCC。所述癌症还可以是先前尚未用化学治疗或放射治疗剂治疗的癌症，即，待治疗的个体可以是未接受针对所述癌症的化学治疗或放射治疗剂治疗的癌症患者。
或者，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以是对一种或多种检查点抑制剂(例如结合PD-1、PD-L1或CTLA4的抗体)的治疗无反应的癌症，例如胰腺癌或前列腺癌。因此，用本发明的抗体治疗的个体可以是癌症患者，例如先前对一种或多种检查点抑制剂例如抗PD-L1或抗PD-1抗体的反应不足的胰腺癌或前列腺癌患者。
对使用一种或多种检查点抑制剂治疗无反应的肿瘤也称为冷肿瘤。不希望受到理论的束缚，认为对单独使用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应的癌症的治疗，使用化学疗法、放射疗法、免疫治疗剂例如免疫刺激剂，或抗肿瘤疫苗将导致癌细胞死亡，继而导致肿瘤中TIL的增加和免疫抑制受体的更高表达，继而使癌症对检查点抑制剂的治疗产生反应，即冷肿瘤变成温肿瘤。因此，本发明的抗体分子可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对仅用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，并且其中所述方法包括将抗体分子与化学治疗剂、放射治疗剂或免疫刺激剂或抗癌疫苗联合施用于个体。一种治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对仅使用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，并且其中所述方法包括将抗体分子与化学疗法联合施用于个体，还考虑了放射治疗剂或免疫刺激剂或抗癌疫苗。
在癌症的情况下，所述治疗可以包括抑制癌症的生长，包括完全的癌症缓解，和/或抑制癌症的转移，以及抑制癌症的复发。癌症生长通常是指许多指标中的任何一个，这些指标表明癌症内的状态已发展为更发展的形式。因此，用于测量对癌症生长的抑制的指标包括癌细胞存活率的降低，肿瘤体积或形态的降低(例如，如使用计算机断层摄影(CT)，超声检查或其他成像方法所确定的)，肿瘤生长延迟，肿瘤脉管系统的破坏，迟发型超敏性皮肤测试性能的改善，抗癌免疫细胞或其他抗癌免疫反应活性的增加，以及肿瘤特异性抗原水平的降低。在个体中激活或增强对癌性肿瘤的免疫应答可以改善个体抵抗癌症生长的能力，特别是已经在受试者中存在的癌症的生长和/或降低个体中癌症生长的倾向。
在癌症治疗的背景下，本文所述的抗体分子可以与另一种抗癌疗法或治疗剂(例如已证明是合适的抗癌疗法或治疗剂，或潜在地适合于治疗所讨论的癌症)联合施用给个体。例如，可以将抗体分子与化学治疗剂、放射疗法、放射性核素、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、过继性细胞转移(ACT)疗法(例如过继性NK细胞疗法)或嵌合抗原受体(CAR)T细胞，自体TIL或γ/δT细胞疗法，或激素治疗剂联合施用于个体。
不希望被理论所束缚，认为本文所述的抗体分子可以充当抗癌疗法中的佐剂。具体地，认为与例如单独使用化学疗法或放射疗法相比，将抗体分子与化学疗法或放射疗法组合地施用于个体将引发针对癌症的更强烈的免疫应答。
与本文所述的抗体分子组合施用的一种或多种化学治疗剂可以选自下组：紫杉烷类、细胞毒性抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、B-Raf酶抑制剂、MEK抑制剂、c-MET抑制剂、VEGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、烷基化剂、铂类似物、核苷类似物、抗叶酸剂、沙利度胺衍生物、抗肿瘤化学治疗剂等。紫杉烷类包括多西紫杉醇、紫杉醇和纳布紫杉醇；细胞毒性抗生素包括放线菌素、博来霉素和蒽环类药物，如阿霉素、米托蒽醌和缬卢比；酪氨酸激酶抑制剂包括厄洛替尼、吉非替尼、阿西替尼、PLX3397、伊马替尼、可比替尼(cobemitinib)和曲美替尼；PARP抑制剂包括吡拉帕尼；B-Raf酶抑制剂包括维罗非尼和达布拉非尼；烷基化剂包括达卡巴嗪、环磷酰胺和替莫唑胺；铂类似物包括卡铂、顺铂和奥沙利铂；核苷类似物包括阿扎胞苷、卡培他滨、氟达拉滨、氟尿嘧啶和吉西他滨以及；抗叶酸药物包括甲氨蝶呤和培美曲塞。适用于本发明的其他化学治疗剂包括达法替尼(Defactinib)、恩替司他、艾瑞布林、伊立替康和长春碱。
与本文所述的抗体分子一起给药的优选治疗剂是阿霉素、米托蒽醌、环磷酰胺、顺铂和奥沙利铂。
与本文所述的抗体分子联合给药的放射疗法可以是外部束放射疗法或近距离放射疗法。
与本文所述的抗体分子一起给药的放射性核素可以选自下组：钇-90、碘-131、铋-213、砹-211、镥-177、铼-188、铜-67、锕-225、碘-125和铽-161。
与本文所述的抗体分子组合施用的免疫治疗剂可以是治疗性抗体分子、核苷酸、细胞因子或基于细胞因子的疗法。例如，治疗性抗体分子可以结合免疫调节分子，例如抑制性检查点分子或免疫共刺激分子，先天免疫系统的受体或肿瘤抗原，例如细胞表面肿瘤抗原或可溶性肿瘤抗原。治疗性抗体分子可以结合的免疫调节分子的实例包括CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、PD-L1、PD-1、CD47、CD73、CSF-1R、KIR、CD40、HVEM、IL-10和CSF-1。治疗性抗体分子可以结合的先天免疫系统的受体的实例包括TLR4、TLR7、TLR9、RIG-1样受体(例如RIG-1和MDA-5)和STING。治疗性抗体分子可以结合的肿瘤抗原的实例包括HER2、EGFW、CD20和TGF-β。
与本文所述的抗体分子组合施用的核苷酸可以是siRNA。
细胞因子或基于细胞因子的疗法可以选自下组：IL-2、缀合IL-2的前药、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21和I型干扰素。
用于治疗癌症的抗肿瘤疫苗已在临床中实施，并在科学文献中进行了详细讨论(例如Rosenberg，S.2000癌症疫苗的发展)。这主要涉及通过使用这些细胞作为疫苗接种方法来提示免疫系统对自体或同种异体癌细胞表达的各种细胞标记物作出反应的策略，无论是否带有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF在抗原呈递方面引起强烈反应，与上述策略一起使用时效果特别好。
上述描述、或以下权利要求或附图中公开的特征，以其特定形式或者以执行所公开功能的手段、或者用于获得所公开结果的方法或过程(视情况而定)表示的特征可以单独地或者以这些特征的任何组合表示，用于以各种形式实现本发明。
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实施例
实施例1：抗原选择和表征
用于鉴定能够结合PD-L1和CD137并激动CD137的mAb2的选择和筛选方法需要使用各种PD-L1和CD137抗原。这些抗原的产生在下面更详细地描述。
1.1重组CD137抗原
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员，例如CD137，以形成多聚体的趋势而闻名，这些多聚体在与它们的同源配体结合时会聚集在一起(Croft，M.2003)。这种由于其功能而聚集的倾向使生产在溶液中不聚集的可溶性重组蛋白以用于体外选择，例如噬菌体和酵母菌展示以及所选蛋白的表征具有挑战性。
测试了几种商购可得的重组抗原，由于存在的聚集体水平，发现大多数不适用于这些选择。在测试的那些中，只有生物素化的，人类分泌的CD137，hFc融合蛋白(BPSBiosciences，货号71171)(以下称为hCD137-hFc-Avi-BPS)具有足够低的聚集度以适合并在这些选择中使用，尽管成功有限(参见实施例2)。
由于大多数商用抗原被认为不适合，因此，内部产生了以下重组二聚体和单体CD137抗原(参见表1)以供选择：
表格1：CD137抗原
类型 名称 物种 可溶性或细胞 生物素化 抗原形式
重组体 mCD137-mFc-Avi 小鼠 可溶 是 二聚体
重组体 mCD137-Avi-His 小鼠 可溶 是 单体
重组体 hCD137-mFc-Avi 人 可溶 是 二聚体
重组体 hCD137-Avi-His 人 可溶 是 单体
重组体 cCD137-mFc-Avi 食蟹猴 可溶 是 二聚体
单体抗原是通过将带有Avi序列和6个C末端组氨酸残基的编码人(SEQ ID NO：186)或小鼠CD137(SEQ ID NO：188)的胞外域的DNA克隆入使用EcoRI-HF和BamHI-HF限制酶修饰的pFUSE载体(Invivogen序列号pfuse-mg2afc2)产生。将载体转染到HEK293-6E细胞(加拿大国家研究委员会)中，并使用HisTrapTMexcel镍柱(GE生命科学29048586)和尺寸排阻色谱法(SEC)纯化表达的CD137，以确保抗原是单一物种，并且不包含聚集体。
为了产生二聚体抗原，将编码与mIgG2a Fc结构域融合的带有Avi序列的人、小鼠或食蟹猴CD137的胞外结构域的DNA构建体克隆到修饰的pFUSE载体中，并转染到HEK293-6E细胞中。使用MabSelect SuReTM蛋白A柱(GE保健公司，11003494)和尺寸排阻色谱法(SEC)纯化重组CD137，以确保抗原是单一物种且不包含聚集体。
使用BirA生物素-生物素蛋白连接酶反应试剂盒(Avidity有限责任公司，BirA500)对每种二聚和单体抗原进行生物素化处理，以产生标记有单个生物素分子的单体CD137抗原和标记有两个生物素分子的二聚CD137抗原，两个单体各有一个。将3mg抗原与7.8μl BirA酶混合物混合，使酶与底物的摩尔比为1:50。然后按照制造商的建议添加添加剂(142μl Biomix A，142μl Biomix B，142μBiotin)，并将反应混合物在室温下孵育2小时。为了维持生物素化蛋白质的完整性，立即使用Amicon 30μm过滤器(默克密理博UFC503096)将反应混合物缓冲液置换为DPBS(生命技术14190-169)。
蛋白质通过SEC进一步纯化，以确保去除BirA酶并生产最终的高质量单分散蛋白质制剂，且无高分子量聚集体。更详细地，将来自同一生产批次的物料混合在一起，并通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)以分析稳定性和纯度。在链霉亲和素转移的SDS-PAGE凝胶中确认了蛋白质的完全生物素化。通过表面等离子体共振(SPR)证实重组人和小鼠抗原体外结合抗CD137阳性对照抗体(分别为20H4.9(美国专利号7288638)和Lob12.3(南安普敦大学))，和通过流式细胞术证实结合表达人和小鼠CD137配体的DO11.10细胞。将细胞与CD137抗原孵育1小时，然后使用荧光标记的抗小鼠Fc片段抗体检测细胞结合。如上所述，通过流式细胞术确认重组食蟹猴抗原结合表达食蟹猴CD137配体的DO11.10细胞(国立犹太医学中心)。为确保选择方案中使用的材料具有尽可能高的纯度，对抗原进行了彻底的蛋白质表征，以确保蛋白质聚集体的存在不超过2％。
1.2细胞表达的CD137抗原
产生表达全长小鼠CD137(SEQ ID NO：187)或人CD137(SEQ ID NO：185)的DO11.10细胞(国立犹太医学中心)，分别命名为DO11.10.mCD137和DO11.10.hCD137，是为了以膜结合构象呈递抗原，最类似于其天然形式，用于选择和进一步表征选定的Fcab，如表2中所列。
慢病毒转导被用于生成这些过表达人或小鼠CD137受体的DO11.10细胞，使用慢病毒X HTX包装系统(Clontech，货号631249)。包含编码人CD137(SEQ ID NO：185)或编码小鼠CD137(SEQ ID NO：187)的Lenti-X表达载体(pLVX)(Clontech，货号631253)与Lenti-X HTX包装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系(Clontech，货号632180)中以产生病毒。然后用这些慢病毒载体转导DO11.10细胞系。
使用流式细胞术通过20H4.9和Lob12.3抗CD137阳性对照抗体与细胞结合，证实了人CD137或小鼠CD137在这些细胞上的表达。将细胞与人或小鼠阳性对照抗体孵育1小时，然后使用荧光标记的抗人Fc检测抗体(Stratech科学有限公司，货号109-546-098-JIR)检测细胞结合。
表达食蟹猕猴CD137(SEQ ID NO：189)的DO11.10细胞，命名为“DO11.10.cCD137”，也使用相同的慢病毒转导方法生成，并用于测试抗人CD137 Fcab与食蟹猕猴CD137的交叉反应性。如前所述，使用流式细胞术通过抗CD137阳性对照抗体(MOR7480.1，US 2012/0237498A1)与细胞结合来确认食蟹猴CD137的表达。
表2：细胞表达的CD137
类型 名称 物种 描述
细胞 DO11.10.hCD137 人 细胞表达
细胞 DO11.10.mCD137 小鼠 细胞表达
细胞 DO11.10.cCD137 食蟹猴 细胞表达
1.3CD4+和Fc标签的小鼠和人类PD-L1
产生人和小鼠PD-L1抗原及融合蛋白，用于抗体选择和筛选。抗原与C末端的His标签以及单体大鼠CD4+结构域3和4(rCD4)标签(Brown和Barclay，1994)，二聚体人IgG1 Fc结构域或，仅针对人PD-L1的Avi标签表达，产生hPD-L1-rCD4-His(SEQ ID NO：195)，hPD-L1-Fc-His(SEQ ID NO：196)，mPD-L1-rCD4-His(SEQ ID NO：197)，mPD-L1-Fc-His(SEQ ID NO：198)和hPD-L1-His-Avi(SEQ ID NO：199)。在抗体噬菌体展示淘选的连续轮次中，以不同形式产生的抗原能够消除标签结合物。如Chapple等人，2006所述，将编码抗原的表达质粒转染到HEK293细胞中。转染5天后收集上清液，并通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化分泌的抗原(Schofield等人，2007)。遵循制造商的建议，使用EZ-link Sulfo-NHS-Biotin试剂(赛默飞世尔科技，产品代码21326)对含有rCD4和Fc的PD-L1抗原进行生物素化。将生物素化反应产物进行凝胶过滤，并收集单体级分。单体级分用于所有溶液相噬菌体展示选择。使用荧光生物素定量试剂盒(赛默飞世尔科技，产品代码46610)测定，每个分子的平均生物素数量为每个PD-L1单体1-3个生物素。
实施例2：抗人CD137 Fcab的选择和表征
2.1抗人CD137Fcab的初步选择
为了选择与人CD137结合的Fcab，采用了酵母和噬菌体展示选择活动，以使鉴定出的Fcab的多样性最大化。细胞表面均展示人CD137和重组二聚体人CD137，并用于提供多种抗原形式，以对二聚或多聚CD137蛋白施加亲和力驱动的选择压力。获得CD137复合物结合而不是对单体CD137具有高亲和力的Fcab被认为是有益的，因为这样的Fccab将仅优先靶向活化的和初免的T细胞，其中T细胞刺激后发生CD137的上调。不希望受到理论的束缚，假设CD137膜表达水平非常低或可忽略的T细胞更有可能以单体状态存在CD137，这与其中大多数蛋白质是处于二聚体、三聚体或更高的多聚体状态的活化T细胞CD137高度上调不同。由于亲和力驱动的选择，Fcab会优先结合活化的T细胞，而不能与仅显示单体CD137的幼稚T细胞很好地结合。通过选择活跃的CD137 Fcab，潜在的脱靶T细胞活化将被降低，同时毒性降低。
展示人IgG1 CH3结构域的六个单纯噬菌体文库用于通过噬菌体展示进行选择。所有六个文库均包含随机的AB环(包含根据IMGT编号的在14-18位的残基)和随机的EF环(包含根据IMGT编号的在92-101位的残基)。其中一个文库包含在EF环的101位上插入了两个或四个氨基酸(由两个或四个NNK密码子编码)(根据IMGT编号，插入的残基位于101.4–01.1位)的克隆。
通过噬菌体ELISA筛选3230个噬菌体克隆与二聚体重组hCD137抗原的结合，并将重组Fc用作阴性对照。通过噬菌体FACS筛选了1140个噬菌体克隆与DO11.10.hCD137细胞的特异性结合。然后对单个命中进行测序，并为所得的76个独特序列分配Fcab克隆标识符，并将其亚克隆到含有HelD1.3 IgG1重链表达盒的pTT5表达载体(加拿大国家研究委员会)中，以在体内以mAb2形式表达Fcab克隆(参见实施例3.2)。
展示人IgG1的CH1至CH3结构域的四个单纯天然酵母文库用于通过酵母展示进行选择。所有四个文库在CH3结构域中包含随机的AB环(包含根据IMGT编号的在14至18位的残基)和随机的EF环(包含根据IMGT编号的在92至101位的残基)。其中两个文库进一步包含在CH3结构域AB环的16位上插入五个氨基酸残基(根据IMGT编号，在16.5至16.1位上的残基)。
使用流式细胞抗原结合测定法筛选从文库选择中鉴定的2784个酵母单克隆的抗原结合，该测定涉及将细胞与生物素化的重组二聚人抗原或小鼠Fc片段一起孵育，以区分与重组hCD137抗原的Fc部分结合的酵母克隆。在不同的抗原浓度和条件下重复选择，例如增加诱导温度，降低选择严格性或减少轮数，以增加命中数。命中测序显示相当低的输出多样性，只有9个Fcab克隆具有独特的序列：FS22-053、FS22-172、FS22-173、FS22-174、FS22-175、FS22-176、FS22-177、FS22-178和FS22-179。
2.2以“模拟”mAb2形式制备抗人CD137 Fcab
产生了由IgG1分子组成的“模拟”mAb2抗体以允许以mAb2格式表征Fcab，该IgG1分子包含从噬菌体分离的76个抗人CD137 Fcab克隆和从酵母选择分离出的9个克隆。通过将包含AB、CD和EF环的部分CH3结构域Fcab替换为抗鸡卵溶菌酶抗体HelD1.3的CH3域的相应区域来制备模拟mAb2。在Tello等人，1993中描述了HelD1.3抗体的产生。抗体HelD1.3的重链和轻链序列分别显示在SEQ ID 191和159中。模拟的mAb2分子是通过在HEK293-6E细胞中瞬时表达而产生的。为了评估产生的蛋白数量，使用具有蛋白A定量生物传感器的OctallQKe平台和PALL(18-5021)，通过BioLayer干涉术对IgG蛋白质含量进行了定量。使用mAbSelectSure色谱柱通过蛋白A亲和色谱法纯化蛋白。53种噬菌体来源的CD137 mAb2蛋白的检测结果低于检测阈值，因此被确定为不适合进一步分析。使用mAb Select SuRe蛋白A柱(GE保健公司，11003494)纯化32个mAb2。
然后，使用Octet QKe平台，通过BioLayer干涉测量法(BLI)，测试了这些mAb2的选择与人重组抗原(生物素化的hCD137-mFc-Avi)的结合。12个mAb2未结合，而19个结合了CD137包被的传感器(FS22-007、FS22-033、FS22-042、FS22-049、FS22-050、FS22-052、FS22-053、FS22-054、FS22-169、FS22-172、FS22-173、FS22-174、FS22-179、FS22-180、FS22-181、FS22-183、FS22-187、FS22-194、FS22-195)。
2.3所选抗CD137模拟mAb2在人NF-κB报告基因分析中的活性
TNFR信号传导需要多聚化和聚集(Bitra等人，2017)。当CD137与同源配体CD137L相互作用时，它会聚集并激活NF-κB信号传导途径。激动剂分子在驱动CD137聚集和激活中模拟配体，从而激活NF-κB信号通路。已知一些激动性抗体可以在结合后固有地引起CD137聚集，例如，乌鲁单抗，而其他激动剂则需要抗体本身的额外交联以诱导CD137聚集，例如埃托米鲁单抗(Fisher等人，2012)。已知效应细胞上的Fcγ受体可在体内诱导这种交联，尽管这种交联效率低下并且可能在治疗目的部位之外发生。由于剂量限制性毒性已与乌鲁单抗有关，而与utolimumab无关，因此决定选择不具有固有激动能力的抗CD137结合性Fcab，而仅选择那些需要额外交联的以诱导CD137聚集。因此，开发了一种能够通过交联抗体在细胞表面表达的CD137聚集时检测细胞中NF-κB信号传导途径的激活的测定法，但是当抗体未交联时其活性很小。然后，该方法用于测试模拟mAb2形式的27个抗CD137 Fcab克隆和6个抗CD20 mAb2形式的抗CD137 Fcab克隆的激动功能活性，而不考虑是否通过BLI发现Fcab结合重组抗原。
这可以通过测定中NF-κB信号通路的激活来测量。蛋白L被用作交联剂，以驱动测定中的模拟mAb2通过Fab部分进行交联，并测量了NF-κB的活化。
编码人CD137的cDNA(SEQ ID NO：185)被亚克隆到pMSCV-neomycin载体(TakaraClontech，货号634401)使用EcoRI-HF和XhoI限制酶。RetroPack PT67细胞系(Clontech，货号631510)用于按照制造商的方案生产逆转录病毒颗粒。该逆转录病毒随后被用于转导先前通过用Qiagen Cignal Lenti NFkB Reporter(luc)(凯杰公司，336851)慢病毒，其包含控制荧光素酶表达的NF-κB敏感启动子，转导Flp-In T-REx 293HEK细胞系(美国生命技术公司，R780-07)产生的HEK.FRT.luc细胞。这些HEK.FRT.luc.hCD137细胞用于筛选在选择中鉴定出的含有CD137结合物的模拟mAb2。
在DPBS(美国生命技术公司，14190169)中制备每种模拟mAb2的2μM稀释液，并进一步1:3稀释于报告细胞培养基(DMEM(Gibco，货号61965-026)；10％FCS(Gibco，货号10270-106)；1x PennStrep(Gibco，货号15140-122)；弹性蛋白15μg/ml(Melford实验室有限公司，货号B1105)；嘌呤霉素5μg/ml(美国生命技术公司，货号A11113803)；博莱霉素100μg/ml(InvivoGen，货号11006-33-0)；遗传霉素500μg/ml(美国生命技术公司，货号10131-027)。蛋白L(美国生命技术公司，21189)被用作人工交联剂，并以1：4的摩尔比与mAb2分子混合。孵育24小时后，根据制造商的说明，用100μl Promega Bio-GloTM荧光素酶测定试剂(Promega货号G7941)处理细胞，并在酶标仪上使用Gen5软件(BioTek)以0.5秒的积分时间测量发光。发光值是响应交联的Fcab诱导的CD137的聚集而激活NF-κB信号通路而产生的荧光素酶的量度。将发光值相对于Fcab的对数浓度作图，并在GraphPad Prism中使用log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
与未交联时相比，与蛋白L交联时荧光素酶信号至少增加了10倍，从而确定了命中。确定这些克隆能够诱导CD137聚集并随后激活下游信号传导途径。在所有测试的克隆中，有两种能够在交联时诱导萤光素酶增加10倍，FS22-053和FS22-172，尽管两者均无法确定EC50。两者都被选择用于DO11.10 T细胞活化试验中的进一步表征。出乎意料的是，尽管通过BLI与CD137靶标结合，但是在交联条件下未观察到剩余克隆的活性，这可能表明它们结合在CD137上无关的表位上，或者这些克隆的亲和力不足以强烈地结合CD137以引发NF-κB信号级联。
总体而言，虽然测试了30种以上的Fcab，但从初步选择中仅鉴定出两种Fcab(FS22-053和FS22-172)，它们在交联时在NF-κB报告基因分析中表现出所需的功能，而在未交联时几乎没有活性。
2.4所选抗CD137模拟mAb2在DO11.10 T细胞活化试验中的活性
通过活化的T细胞上的激动剂分子聚集的CD137引起T细胞活化和下游信号传导，导致但不限于IL-2产生。由于FS22-053和FS22-172在NF-κB报告基因分析中被鉴定为具有活性，因此在T细胞激活检测中测试了它们激活CD137的能力。开发了使用经工程改造的表达人CD137的DO11.10 T细胞的DO11.10 T细胞活化试验，并通过测量IL-2释放来评估T细胞活化。
如前所述，用设计的慢病毒载体转导DO11.10 T细胞(国立犹太医学中心)以过表达小鼠或人的CD137。除了FS22-053和FS22-172，在此DO11.10 T细胞活化试验中还测试了以下克隆：FS22-007、FS22-033、FS22-042、FS22-049、FS22-050、FS22-052、FS22-054(均采用“模拟”HelD1.3 mAb2形式)。制备具有或不具有重组蛋白L(美国生命技术公司，21189)交联剂的mAb2或20H4.9阳性对照mAb的稀释液，并将其添加到96孔圆底板中的DO11.10.hCD137细胞中，该板已用0.1μg/ml抗CD3抗体(克隆17A2，BioLegend，100208)过夜包被。孵育18小时后，按照制造商的说明收集上清液，并用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-86)进行分析。使用带有Gens软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gens软件，BioTek)。将mlL-2的浓度相对mAb2或基准mAb的对数浓度作图，并在GraphPad Prism中使用log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
当在该测定中与蛋白L交联时，克隆FS22-053和FS22-172显示出显著增强的活性。FS22-053未交联时的活性为126nM，交联时的活性为21nM(提高了6倍)，而未交联时FS22-172的活性为950nM，交联时的活性为44nM(提高了22倍)。因此，两个克隆均被选择进行亲和力成熟。
实施例2.4表明FS22-053和FS22-172在被测试的mAb 2形式中被蛋白L交联时可以驱动DO11.10 T细胞表面上的CD137的聚集和活化。
实施例3：抗人CD137 Fcab的亲和力成熟及其后续表征
如前所述，根据两个克隆在NF-κB报告基因分析，DO11.10 T细胞活化试验中的功能特性，选择了两个克隆进行亲和力成熟(FS22-053和FS22-172)。
3.1FS22-053和FS22-172的亲和力成熟度
从FS22-053和FS22-172 Fcab克隆构建了四个酵母展示文库。使用ELLA引物在每个克隆的CH3结构域的AB环中随机分配七个残基(根据IMGT，在15-16.1位)，以制备文库FS22-053 AB和FS22-172 AB。使用ELLA引物在CH3结构域的EF环中随机分配五个残基(根据IMGT，在92-94和97-98位)，得到文库FS22-053 EF和FS22-172 EF。
对于文库FS22-053 AB和FS22-053 EF，以及FS22-172 AB和FS22-172 EF，使用二聚体hCD137-mFc-Avi抗原或hCD137-Avi-His单体抗原在酵母文库中进行了三轮或四轮选择，以选择亲和力成熟的克隆。单体抗原与二聚体抗原交替使用，以确保克隆保留对抗原的亲和力，并且不通过亲和力专门结合。单体或二聚体抗原的使用以及所使用的浓度在每轮中通过流式细胞术根据经验确定，根据在上一轮中是否观察到针对单体或二聚体抗原的富集来确定。与亲本分子相比，尽可能使用亲本上方的分选门来分离亲和力成熟的克隆。选择压力增加到1nM的二聚抗原。在每个选择轮次中，将单个克隆点在琼脂平板上，以评估选择进度。每个克隆分别生长和诱导，然后如前所述，使用生物素化的二聚体抗原以及抗CH2结构标记，通过流式细胞术确定其结合和结构参数。遵循该筛选级联以允许基于来自选择输出的克隆样品确定选择成功，并允许早期筛选可以随后产生为可溶性蛋白质的单个克隆。
如前所述，在抗原结合流式细胞术中筛选了总共1152个酵母单克隆与生物素化重组抗原的结合。FS22-053 EF文库的选择导致138个独特环序列的富集。同样，从FS22-172AB文库中分离出30个独特的环序列。文库FS22-053 AB和FS22-172 EF不包含任何与亲本克隆相比有任何结合改进的克隆。来自FS22-053 EF和FS22-172 AB文库的最佳结合克隆的序列分析揭示了AB环中保守的PPY序列模式。
保守的PPY基序的存在可以基于脯氨酸残基的有限的柔性通过引入更刚性的或暴露的环来促进延伸的结合区域的形成。或者，PPY序列可以代表参与这些克隆结合的特异性保守基序，因为富含脯氨酸的序列已被证明与SH3结构域蛋白中的芳族序列结合。此外，由于已在两个独立的Fcab谱系中独立选择了PPY保守序列，因此对于CD137上的表位结合可能很重要。此外，FS22-053和FS22-172谱系克隆的CH3结构域的EF环中存在保守的LE或LD序列模式，这表明EF环中的这种氨基酸基序对于改善结合是必需的。
为了评估选择的进度以及是否有必要在亲和力成熟的克隆之间重组突变的AB和EF环，来自FS22-053 EF文库的前五株特异的克隆(FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012)根据与10nM二聚体人类抗原特异性结合排名(在流式细胞术结合测定中高于30％APC阳性细胞)，来自FS22-172 AB文库的前6株特异的克隆(FS22-172-001、FS22-172-002、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005、FS22-172-006，在相同实验中用10nM二聚体人类抗原筛选时，全部显示出超过10％的APC阳性细胞)是以模拟mAb2(HelD1.3)和模型mAb2(PD-L1)产生来评估随机环的功能和动力学改进。
3.2以“模拟”和“模型”mAb2形式构建抗人CD137 Fcab
衍生自亲本FS22-053克隆(FS22-053-001至FS22-053-016)的16个亲和力成熟的克隆，以及衍生自亲本FS22-172克隆(FS22-172-001至FS22-172-006)的6个亲和力成熟的克隆以“模拟”和“模型”mAb2形式制备。克隆FS22-053-001至FS22-053-007不做进一步的研究，因为它们不以mAb2形式表达，其表达水平不允许下游纯化用于进一步的测试和表征。
制备了在HelD1.3中包含抗人CD137 Fcab的“模拟”mAb 2抗体，以进一步表征mAb2形式的亲和力成熟的Fcab。如实施例2.2中所述制备这些mAb2。
还产生了“模型”mAb2，其包含抗人CD137 Fcab以及PD-L1结合Fab区(来自US 8,217,149B2的克隆YW243.55.S70)。采用与实施例2.2相似的方法制备，将含有AB、CD和EF环的抗PD-L1结合抗体的部分CH3替换到Fcab的相应区域。这些PD-L1模型mAb2在CH2结构域(AA)中包含LALA突变。已知在人IgG1的CH2结构域中引入LALA突变会减少Fcγ受体结合(Bruhns，P，等人，(2009)和Hezareh M.，等人(2001))。
CD137/HelD1.3“模拟物”和CD137-AA/PD-L1“模型”mAb2通过在HEK293-6E细胞中瞬时表达而产生，并使用mAb Select SuRe蛋白A柱进行纯化。
3.3在人类NF-κB报告基因细胞测定中模拟mAb2形式的人Fcab活性
使用与实施例2.3中所述的相同的NF-κB荧光素酶测定法中测试了列出的模拟mAb2(HelD1.3)形式的亲和力成熟的抗人CD137 Fcab的功能活性。使用Gen5软件，BioTek，在酶标仪中以0.5秒的积分时间测量发光。与预期的相同，没有蛋白L交联(-XL)的Fcab均未表现出活性。与亲本的CD137 Fcab相比，所有亲和力成熟的CD137 Fcabs均显示出巨大的改善，而亲本的CD137 Fcab虽然在此测定中为阳性，但无法计算EC50值(参见实施例2.3)。当与蛋白L(+XL)交联时，FS22-053-008和FS22-172-003在每个家族中表现出最好的活性，且EC50最低(分别为26.34nM和32.64nM)。
3.4在人DO11.10 T细胞活化试验中，mAb2模型形式的亲和力成熟的人Fcab的活性
mAb2模型形式的亲和力成熟的人Fcab(PD-L1 LALA)的活性在DO11.10 T细胞活化试验中测定，类似于实施例2.4所述的试验。
HEK.mPD-L1细胞是通过亚克隆编码小鼠PD-L1的cDNA(SEQ ID NO：187)进入使用KpnI和NotI限制性位点的pcDNA5FRT载体(美国生命技术公司)，并使用Lipofectamine2000(美国生命技术公司，11668-019)将载体转化进入Flp-In T-REx 293细胞系(美国生命技术公司，R780-07)。细胞在含有10％FBS，100μg/ml潮霉素B(Melford实验室有限公司，Z2475)和15μg/ml灰瘟素(Melford实验室有限公司，B1105)的DMEM中生长3-4周，直到形成稳定转化的细胞集落为止。这些集落在存在1μg/ml强力霉素(西格玛奥德里奇，D9891)的情况下扩增，并使用PE偶联的抗小鼠PD-L1(MIH5)抗体(BD生物科学，558091)测试PD-L1的表达。
使用细胞解离缓冲液分离细胞，用PBS洗涤一次，并将2×105细胞铺板在96孔板的孔中，然后与在PBS中以1:20稀释的抗体一起在4℃下孵育1小时。细胞在PBS中洗涤一次，然后在Accuri C6细胞仪(BD生命科学)上测量，并使用FlowJoX分析数据。再次证实了小鼠PD-L1的表达。
在该DO11.10 T细胞活化试验中测试了以CD137/PD-L1 mAb 2的实施例3.2中产生的15个克隆。制备mAb2或阳性对照mAb的稀释液，并添加至DO11.10.hCD137(每孔7.5x103细胞)和HEK.mPD-L1细胞(每孔2×104细胞)或DO11.10.hCD137(每孔7.5×103细胞)和未转导以表达mPD-L1的HEK细胞(每孔2×104细胞)在96孔平底板中，其已被0.1μg/ml抗CD3抗体包被过夜(克隆17A2，BioLegend，100208)。孵育18小时后，按照制造商的说明收集上清液，并用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-86)进行分析。使用带有Gens软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gens软件，BioTek)。将mlL-2的浓度相对mAb2或基准mAb的对数浓度作图，并在GraphPad Prism中使用log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。通过测量mIL-2的释放来检测T细胞活化。
不与表达PD-L1的细胞进行交联，则观察不到T细胞的活性。交联后，通过释放高水平的mIL-2和亚纳摩尔EC50值可以看出，所有mAb2均具有有效的T细胞活性。除FS22-053-009和FS22-172-005以外的所有克隆的EC50均小于0.3nM，因此与阳性对照(抗人CD137 mAb，G1-AA/20H4.9)一样好，甚至更好。最低的Emax是最大T细胞活化的量度，可能与体内更大的T细胞抗肿瘤活性有关，观察到的值为7758pg/ml，高于阳性对照(抗-人CD137 mAb，G1-AA/20H4.9)。
3.5原代人CD8+T细胞活化试验
Fcab激活在过表达CD137T细胞上的CD137的能力在实施例3.3中显示。为了测试Fcabs在尚未经过工程改造以过表达CD137的细胞上的活性，需要主要的人类T细胞测定。活化的细胞毒性CD8+T细胞负责直接杀伤癌细胞，并在其细胞表面表达CD137(Ye等人，2014)。已知CD137的聚集对于诱导下游信号传导和进一步的CD8+T细胞活化至关重要。因此，将CD8+T细胞活化试验法用于评估Fcab(如下文详述的mAb2形式)驱动CD137聚集和后续下游信号传导的能力。CD8+T细胞活化是通过hIL-2的释放来确定的。
为了分离T细胞，从白细胞耗竭锥(leucocyte depletion cone)中收集了外周血单核细胞(PBMC)，白细胞耗竭锥是血小板捐赠的副产物。简而言之，用PBS冲洗白细胞锥内容物，并覆盖在Ficoll(西格玛奥德里奇，1440-02)梯度上。通过离心收集PBMC，并回收未穿过Ficoll梯度的细胞。用PBS进一步洗涤PBMC，并根据制造商的说明通过添加10ml 1×红细胞裂解缓冲液(eBioscience，00-4300-54)裂解剩余的红细胞。根据制造商的说明，使用CD8+T细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术公司，130-096-495)从洗脱液中存在的PBMC中分离出CD8+T细胞。
与抗CD3抗体一起孵育用作驱动T细胞初始激活的第一信号。将96孔平底组织培养板用在PBS中的8μg/ml抗CD3抗体(克隆UCHT1，安迪生物，MAB100-SP)于4℃包被过夜。然后将板用200μl PBS洗涤3次。
对于PD-L1模型mAb2形式的亲和力成熟的人CD137 Fcab的基于细胞的交联，基本上如实施例5.3中所述生产了过表达人PD-L1(HEK.hPD-L1)的HEK293细胞，但是通过亚克隆编码人cDNA PD-L1序列(SEQ ID NO：185)，而不是鼠PD-L1。将HEK.hPD-L1细胞以每孔2x105细胞接种在包被有抗CD3抗体(8μg/ml)的96孔平板的100μl T细胞培养基中(RPMI培养基(美国生命技术公司，61870-044)，含有10％FBS(美国生命技术公司)，1X青霉素链霉素(美国生命技术公司，15140122)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)，10mM Hepes(西格玛奥德里奇，H0887)，2mM L-谷氨酰胺(西格玛奥德里奇，G7513)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco，M6250))。孵育4小时后，一旦HEK.hPD-L1细胞或未转导以表达hPD-L1的HEK细胞粘附，则应除去所有T细胞培养基，并用包含浓度为5.0×105细胞/ml的T细胞的100μl T细胞培养基替换，结果为5.0×104细胞/孔。
mAb2在T细胞培养基中以2×终浓度从500nM开始稀释，并进行1:3滴定。将100μl的mAb2滴定液添加到细胞中，测定总体积为200μl，抗体浓度为1×。
将阳性对照抗CD137抗体(G1-AA/20H4.9)和阴性对照同型IgG抗体(G1-AA/HelD1.3)分别在T细胞培养基中以2×终浓度从500nM开始稀释稀释(含500nM交联剂)(在室内产生的抗人CH2(Jefferis等人，1985和Jefferis等人，1992年)(mG1/MK1A6)，并进行了1：3滴定。将100μl稀释的阳性对照抗体/交联剂混合物或阴性对照IgG抗体/交联剂混合物添加到细胞中，测定总体积为200μl，抗体浓度为1×。
该测定在37℃，5％CO2下孵育72小时。收集上清液并用人IL-2ELISA Ready-SET-Go！试剂盒(eBioscience，货号88-7025-88)根据制造商的说明测定。使用带有Gen5软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gen5 Software，BioTek)。将人IL-2(hIL-2)的浓度相对对抗体的对数浓度作图，并在GraphPad Prism中的使用log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
阳性对照抗人CD137 mAb 20H4.9与抗hCH2抗体(mG1/MK1A6)交联时，hIL-2释放增加，EC50为0.5nM。所有克隆在测定中均具有活性，大多数克隆对亚纳摩尔的EC50均显示出良好的效价。包含Fcab的mAb2 FS22-053-007、FS22-053-008、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005在0.19-0.49nM的范围内，以最低的EC50引起最大的T细胞反应。还测试了mAb2的子集(包含Fcab FS22-053-008、FS22-053-011、FS22-053-014、FS22-173-003和FS22-172-004)，未通过HEK上表达的PD-L1交联，如预期的那样，在该测定中没有活性。这证实了在NF-kB测定和DO11.10 T细胞活化试验中看到的活性。
3.6通过表面等离子体共振(SPR)确定抗人CD137 Fcab的特异性
测试了抗人CD137 Fcab对人CD137与其他相关TNFSFR家族成员相比的特异性。以模拟mAb2(HelD1.3)形式测试了8个Fcab，并在Biacore T200(GE保健公司)中用SPR通过测试与其他人TNFRSF受体的结合来进行测量：CD40、OX40和GITR。使用胺偶联剂(胺偶联试剂盒，GE保健公司，BR-1000-50)在Biacore CM5芯片(GE保健公司，货号29149603)中将人CD40、GITR和OX40包被至约1000RU。模拟mAb2形式的抗人CD137 Fcab(FS22-053-008/HelD1.3、FS22-053-009/HelD1.3、FS22-053-010/HelD1.3、FS22-053-011/HelD1、FS22-053-012/HelD1.3、FS22-053-014/HelD1.3、FS22-172-003/HelD1.3、FS22-172-004/HelD1.3)稀释液从1μM开始在HBS-EP+缓冲液(BR100669)中制备，并以30μl/min的速度注射3分钟，然后在缓冲液中解离4分钟。通过以30μl/min的速度注入10mM甘氨酸pH 2.5持续12s来再生芯片。将针对不同TNFRSF成员的特异性抗体用作阳性对照，以验证Biacore芯片包被。使用BIAevaluation 3.2软件减去双参考数据并进行分析。Fcabs不结合任何测试的TNFRSF受体，表明它们对CD137的特异性。因此，包含来自这些Fcab的抗原结合位点的Fcab或mAb2不会引发除CD137以外的任何物质的脱靶结合。
3.7通过SPR的模拟mAb2形式的抗人CD137 Fcab对人、食蟹猴和小鼠CD137的结合亲和力和FS22-053-017的产生
模拟mAb2形式的抗人CD137 Fcab(FS22-053-008、FS22-053-011、FS22-053-014、FS22-172-004、FS22-172-004)(参见实施例3.2)对人、食蟹猴(cyno)和小鼠CD137的亲和力通过SPR进行了测定，以确定Fcab是否可用于动物研究的检测。按照制造商的建议(GE保健公司，人Fab捕获试剂盒，#28958325)，将抗人Fab捕获抗体固定在CM5系列S芯片(GE保健公司#BR-1005-30)的所有四个流通池上，平均表面密度为6000RUs。在25℃和10μl/min的流速下固定化，达到6000RUs的平均最终响应。通过以30μl/min的速度注入在HBS-EP+缓冲液(GE保健公司#BR1006-69)中稀释的3μg/ml的mAb2溶液60秒，将每个mAb2捕获至约150RU。然后将HBS-EP+缓冲液中不同浓度的人、食蟹猴或小鼠CD137抗原(未生物素化的人，食蟹猴或小鼠CD137-mFc-Avi或人CD137-Avi-His)以60μl/min的流速流过芯片3分钟，然后然后解离10分钟。在每种抗原浓度后，通过以30μl/min的流速感染30 10mM甘氨酸pH 2.1 30秒来再生芯片。在最高浓度的抗原之前和最低浓度的抗原之后注射缓冲液HBS-EP+，以进行参考扣除，并随机重复其中一种浓度两次。用1：1Langmuir模型拟合结合动力学，以生成每个样品的平衡结合常数(KD)。数据分析使用BiaEvaluation软件3.2版进行。结果显示在表3中。
结果分析表明，与各个亲本分子相比，所有亲和力成熟的克隆对人和食蟹猴CD137的结合都有提高。对单体人CD137抗原的结合亲和力比对二聚体人和食蟹猴Fc融合抗原弱(至少100倍)。如实施例2.1中所述，选择Fcab使其优先结合于二聚体而不是单体形式的CD137，并且该数据证实选择策略是成功的。这种动力学行为使得它们不太可能与未刺激的T细胞上以最低水平表达的单体CD137结合，从而降低了与某些抗CD137单克隆抗体疗法相关的肝脏或全身毒性的风险。
数据还表明，抗人CD137 Fcab结合食蟹猴二聚体CD137的亲和力与人二聚体CD137的相当。
表3
N/A–不适用，因为低信号无法确定KD
还测试了模拟mAb2形式的Fcab与小鼠二聚体CD137结合的能力。没有一个克隆显示出与小鼠抗原的强结合(如表中所示，其中N/A表示无法计算出KD)，除克隆了FS22-053-014，其被意外地发现针对小鼠抗原的KD为24nM。这是出乎意料的，因为小鼠CD137和人CD137共享少于57％的序列同源性。
FS22-053-014的序列分析显示潜在的序列缺陷，可能导致其CH3结构域EF环中98位的翻译后天冬氨酸异构化。根据制造商的建议，使用QuickChange II诱变试剂盒(安捷伦，货号200523)，通过定点诱变将第98位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)，得到克隆FS22-053-017。
然后进行实验以证实与FS22-053-014克隆相比，该突变不会负面影响FS22-053-017克隆的结合亲和力或功能活性。
分别使用人CD137-mFc-Avi抗原和小鼠PD-L1-mFc-Avi在Biacore T200系统上通过SPR将Fcab克隆FS22-053-017的平衡解离常数(K D)与FS22-053-014的平衡解离常数进行了比较。结果显示，两个Fcab克隆的动力学特征都与人抗原非常相似，从而证明将98位天冬氨酸突变为谷氨酸对结合人抗原没有负面影响。结果还表明，FS22-053-017与小鼠CD137抗原的结合强度降低了2倍。
将Fcab克隆FS22-053-017亚克隆并表达为HelD1.3模拟mAb2(参见实施例2.2)，然后与也以HelD1.3 mAb 2形式的FS22-053-014克隆在如实施例2.4所述的人CD137 DO11.10T细胞活化试验中进行比较。G1-AA/20H4.9用作抗CD137阳性对照，G1-AA/HelD1.3用作IgG对照。测试的mAb2可以不进行蛋白L交联，也可以与蛋白L以1：4的比例进行交联。
结果显示，模拟mAb2形式的FS22-053-17Fcab和模拟mAb2形式的FS22-053-014Fcab在同一DO11.10 T细胞活化试验中被蛋白L交联时具有相当的活性。因此，进行诱变不会对功能活性产生负面影响。模拟mAb2形式的两个克隆在没有交联时都没有活性。
3.8抗人CD137 Fcab亲和力成熟和表征总结
总之，生成了亲和力成熟的抗CD137 Fcab，并以mAb2形式制备，然后对其进行了表征。CH3结构域中包含这些CD137抗原结合结构域的mAb2在人NF-κB报告基因细胞分析中显示出高水平的活性，并且该活性显示为交联依赖性。包含来自FS22-053-008和FS22-172-003Fcab的抗原结合结构域的mAb2在此分析中显示出最佳活性。
此外，还显示了从这些Fcab制备mAb2时，它们包含CD137抗原结合结构域和PD-L1结合Fab区以及它们的CH2结构域中的LALA突变，以减少或消除与Fcγ的结合，然后mAb2在人DO11.10 T细胞活化试验中具有强大的T细胞活性，并且显示该活性依赖于通过与PD-L1表达细胞结合而交联。还显示了mAb2在主要的人CD8+T细胞活化试验中具有交联依赖活性，提供了进一步的证据表明含有这些亲和力成熟的CD137抗原结合域的mAb2能够有效诱导CD137的激动作用，并且这种激动作用是以交联为条件。
还显示了含有抗人CD137抗原结合结构域的mAb2对CD137具有特异性，并且不与其他TNFRSF成员结合。已显示mAb2优先结合人二聚体CD137抗原，而不是单体人CD137抗原。最后，显示这些mAb2与二聚体食蟹猴CD137结合的亲和力与二聚体人CD137相当。
令人惊讶地发现，一种Fcab克隆，FS22-053-014，也能够结合小鼠CD137。FS22-053-014的序列分析显示了潜在的序列缺陷，可通过定向诱变予以纠正，产生FS22-053-017克隆。FS22-053-017的表征表明，它在人CD137 DO11.10 T细胞活化试验中保留了与FS22-053-014相似的结合特性，并显示了相似的功能活性。
已经证明含有抗人CD137抗原结合结构域的mAb2需要交联才能聚集并激活CD137，下一个目标是制备除结合CD137之外还结合人PD-L1的mAb2。假设mAb2通过Fab臂与人PD-L1结合会引起抗体分子的交联，进而导致CD137聚集和激活，并且这种激活取决于人PD-L1表达的存在。
为了制备除结合CD137之外还结合人PD-L1的mAb2，首先必须生成能够结合PD-L1的mAb。这些mAb的生成如下所述。
实施例4：初始抗PD-L1 mAb 280_02_G02的分离
4.1选择
使用“IONTAS 1”人抗体噬菌体展示文库(IONTAS股份有限公司)选择抗PD-L1克隆。用于构建IONTAS 1文库的抗体基因来自人淋巴细胞(42例血沉棕黄层捐赠)和一个扁桃体组织样品。血沉棕黄层和扁桃体组织均在当地研究伦理委员会的批准下获得。
使用直接包被在聚苯乙烯Nunc管上的抗原(如Schofield等人，2007年所述)，用IONTAS 1抗体噬菌体展示文库进行三轮固相选择。第一轮、第二轮和第三轮选择分别使用人PD-L1-Fc-His、小鼠PD-L1-rCD4-His和人PD-L1-Fc-His(有关抗原的详细信息，参见实施例1.3)。
如Dyson等人，2011所述，将所选的可变重(VH)抗PD-L1抗体群与初始的可变轻(VL)抗体群一起重组，然后将这种重组的、拯救的抗体噬菌体展示群用于溶液相的选择。简而言之，在第1、2和3轮分别以人PD-L1-rCD4-His(10nM)、人PD-L1-rCD4-His(200pM)和小鼠PD-L1-rCD4-His(10nM)进行淘选，这导致输出称为“选择280”的抗PD-L1 scFv群。该scFv群包含人和小鼠抗PD-L1结合scFv，通过如Dyson等人，2011所述的噬菌体多克隆ELISA确定，并展示了与人PD-1或与rCD4或Fc标签最小的交叉反应性。
4.2筛选：ELISA，重组阻断测定，基于细胞的阻断测定
4.2.1单克隆scFv ELISA
通过ELISA筛选来自实施例4.1的选择280scFv群，以鉴定与人PD-L1最佳结合的克隆。将scFv群体亚克隆到可溶性scFv载体pSANG10中，并且制备包含可溶性scFv的大肠杆菌培养物，如(Martin等人，2006；Studier，2005)所述。然后将可溶性scFv用于固定化人PD-L1-rCD4-His的单克隆ELISA中，如Schofield等人，2007所述。将Nunc Maxisorp平板(赛默飞世尔科技，437111)用人PD-L1-rCD4-His(5μg/ml，PBS)包被过夜，用2％MPBS封闭1小时，然后加入大肠杆菌培养上清液(用2×2％MPBS以1：2稀释)并在室温下将scFv结合1小时。用铕标记的抗FLAG M2抗体(西格玛，F1804)检测结合的scFv。筛选了总共470个克隆，鉴定出346个抗PD-L1克隆，与不含抗原的“空”封闭孔相比，其与PD-L1的结合信号至少比背景高10倍。选择通过主要ELISA信号评估的192个最佳抗人PD-L1克隆进行进一步分析。
4.2.2在基于ELISA的PD-L1/PD-1阻断试验中筛选scFv
为了鉴定阻断PD-L1和PD-1之间相互作用的克隆，进行了ELISA筛选以阻断scFv。简而言之，将nunc maxisorp板(437111，赛默飞世尔科技)用抗rCD4(结构域3和4)抗体(MCA1022，OX-68，伯乐)包被过夜，用3％MPBS封闭并与人PD-1-rCD4-His(在3％MPBS中为5μg/ml)在室温下孵育1小时。将人PD-L1-Fc-His(50μl，0.2nM)与含有scFv的大肠杆菌培养上清液预混。将Nunc 96孔板用PBS，0.1％TweenTM-20(PBS-T)洗涤3次，再用PBS洗涤3次，然后加入人PD-L1-Fc-His/scFv混合物，并在室温下孵育1小时。洗涤板并用山羊抗Fc生物素(Jackson免疫研究，109-065-098，实验室，0.1μg/ml，3％MPBS)和链霉亲和素-Europeium(珀金埃尔默，1244-360)和DELFIA增强溶液(珀金埃尔默，4001-0010)检测结合的人PD-L1-Fc-His。与培养基对照相比，筛选出的192个克隆中，有183个显示出至少90％的阻断活性。在一级ELISA中进一步筛选鉴定的183个抗PD-L1 scFv克隆的小鼠PD-L1交叉反应性，如上文实施例4.2.1中所述，但是使用固定化的小鼠PD-L1-rCD4-His而不是人PD-L1。这确定了50个小鼠交叉反应性抗PD-L1克隆，它们是转化为IgG1形式的候选基因。
4.2.3将抗PD-L1 scFv阻断克隆转换为IgG1形式
通过将VL和VH基因亚克隆到IgG1表达质粒pINT3-IgG1中，将阻断PD-L1和PD-1相互作用的抗PD-L1 scFv克隆转化为IgG1形式，并在4ml规模的HEK293中表达，如Chapple等人，2006所述。按照制造商的说明，分别用蛋白A琼脂糖珠子(PC-A100)和Proteus“1步批”midi-spin柱(Generon，GEN-1SB08)分批亲和纯化抗体。用GeBAflex maxi管(截留值为8kDa)进行纯化抗体的透析(Generon，D045)。如有必要，通过超滤将抗体浓缩至2μM。
4.2.4在Jurkat-NFAT报告基因共培养试验中筛选PD-L1-PD-1阻断活性
然后在共培养报告基因检测筛选中评估纯化的抗PD-L1 mAb的功能活性。根据制造商的说明，使用GloResponse NFAT-luc2/PD-1稳定的Jurkat细胞系(Promega，CS187102)和Thaw-and-Use PD-L1细胞(Promega，CS178103)进行此筛选。将PD-L1细胞接种在含10％FBS的HAM'S-F12培养基中。第二天，除去培养基，同时将PD-1Jurkat报告细胞(Promega，CS187102)重悬于测定培养基(90％RPMI1640，1％FBS)中。向含有粘附的PD-L1细胞的平板中加入40μl含有2×浓度(200nM)不同抗体的测定培养基，然后加入40μl PD-1细胞混合物。将板在37℃，5％CO2下孵育6小时。将BioGlo试剂(Promega，G7940，80μl)添加到每个孔中，并使用BMG pherastar酶标仪读取荧光素酶的输出。该抗体G1/280_02_G02被鉴定为能够在共培养测定中阻断PD-L1与PD-1的相互作用，这是通过与没有抗体的对照相比荧光素酶活性增加而确定的。该活性是通过剂量反应共培养测定法(浓度范围加倍：200至1.56nM)计算得出的半数最大有效浓度(EC50)为4.2nM确定。
4.3序列优化
G1/280_02_G02抗体的序列的初步分析鉴定出VH-CDR2中潜在的脱氨基位点，特别是在Kabat 54至55位的NG基序。由于该位点的脱氨基可能会影响结合，因此产生了变体克隆，其中NG基序更改变为NA、NS、SG或GG。这些修饰没有导致对重组PD-L1的亲和力或PD-L1阻断活性的任何显著降低，并且选择了包含NS修饰的变体克隆，命名为G1/280_02_G02_NS，用于轻链重组。
4.4初始选择总结
噬菌体选择策略鉴定了50多个具有有效的体外PD-1/PD-L1阻断活性以及小鼠PD-L1交叉反应性的抗人PD-L1结合克隆。特别是，G1/280_02_G02在基于细胞的PD-L1报告基因分析中显示出有效的激活作用，因此被选择用于进一步优化。
实施例5：生成和表征含κ轻链的抗PD-L1克隆
G1/280_02_G02_NS抗体具有λ轻链。由于临床上使用的大多数单克隆抗体均具有κ轻链(Jain等人，2017)，因此通过使用链重组运动寻求产生包含G1/280_02_G02_NS重链但与κ轻链配对的克隆抗体，其保留了对人PD-L1的亲和力和小鼠交叉反应性。噬菌体展示质粒pIONTAS-1(κ文库)中的IONTASTMκ轻链文库用于制备包含G1/280_02_G02_NS抗体的重链偶联轻链变体的scFv克隆的轻链重组文库。
5.1噬菌体的选择和筛选策略
使用生物素化的人PD-L1-rCD4-His和小鼠PD-L1-rCD4-His抗原(有关抗原的详细信息，参见实施例1.3)进行了三轮噬菌体展示溶液选择。通过在每一轮中降低抗原浓度(从100降至0.02nM)来进行选择，对于每一轮选择，均使用“无抗原”对照。
选择了六个选择输出进行筛选，从第二轮中选择了两个(编号871和872)以及从第3轮中选择了四个(编号887、890、891和894)，使用如第1.3.1节所述的可溶性scFv表达系统。使用上述实施例4.2.1中所述的采用DELFIA增强溶液的方法，在ELISA中共筛选了1692个可溶性scFv克隆与固定化抗原结合(hu-PD-L1-rCD4-His抗原以3μg/mL的浓度配制在50μl Dulbecco PBS中，包被在Maxisorb板上)。
筛选的1692个克隆中，有1029个克隆在DELFIA分析中产生的信号超过2000RFU，成功率约为61％。然后选择前736个克隆，并使用二次检测(亲和力排名)进行分析，该方法采用三种浓度的hPD-L1-rCD4-His抗原(1.0nM，0.2nM和0.04nM)。从筛选的736个克隆中，选择显示最大信号的48个克隆进行克隆并以IgG1形式表达。克隆以800μl的规模在Expi293FTM(飞世尔科技，货号13479756)细胞中表达，转染后第5天收获培养上清液，以IgG1形式进一步筛选。
5.2SPR筛选
使用SPR(Biacore T200仪器)按亲和力对所有48种抗体进行排名。为了进行排名，将稀释的上清液(在由1×PBS和0.002％TweenTM-20制成的运行缓冲液中以1:10的比例)固定在蛋白-A芯片上(GE保健公司，产品代码：29127556)，人PD-L1-rCD4-His以50nM的浓度流过制备好的表面。使用该单次进样产生的缔合(ka)和解离(kd)速率常数用于确定解离常数(KD)。将克隆的KD值与Ig1形式的克隆G1/280_02_G02_NS(G1/280_02_G02_NS)进行比较。鉴定出十个独特序列的克隆，它们显示出比克隆G1/280_02_G02_NS对人PD-L1更高的亲和力，因此与克隆G1/280_02_G02_NS一起进行了完整的动力学分析。
简而言之，使用BIAcore T200仪器进行了SPR实验。来自稀释的培养上清液的抗体在FC2上以10μl/min的流速和60秒的接触时间捕获在蛋白A芯片(GE保健公司，29127556)上。通常，这导致捕获500-800RU的抗体。在FC1和FC2上以30μl/min的流速注入从50nM开始的PD-L1-rCD4-His的双倍稀释液(浓度范围：50nM-0.05nM)。在180秒内测量缔合，在300秒内测量解离。所有测量均在25℃的PBS(pH 7.4、0.05％TweenTM-20)中进行。动力学参数是通过参比细胞减法并使用BIAevaluation软件(GE，BR-1005-97)以1：1相互作用拟合感官图实验数据确定的。使用BIAevaluation软件对所得数据进行拟合，并计算出相应的ka，kd和KD值。在测试的十个克隆中，四种抗体分别命名为“G1/887_04_E12”、“894_08_A05”、“G1/894_08_E05”和“G1/887_04_G12”，表现出低于纳摩尔的KD值，其低于G1/280_02_G02_NS的KD值。在所述筛选条件下获得的亲和力数据表明，实施例5.1中所述的κ轻链重组使得G1/280_02_G02_NS抗体的重链不仅与λ轻链配对，而且与κ轻链配对，产生了对重组人PD-L1具有良好(实际上提高了)亲和力的抗体。
5.3IgG1形式的kappa克隆的表征
5.3.1基于细胞的PD-1/PD-L1阻断测定
在基于生物发光细胞的分析中，根据制造商的建议，使用PD-1/PD-L1封锁生物测定产品(Promega，J1250/J1255)评估了含有κ轻链G1/887_04_E12、G1/894_08_E05和G1/887_04_G12的抗PD-L1克隆阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的能力。将阻断活性与G1/280_02_G02_NS克隆进行比较。
简而言之，按照实施例4.2.3中所述纯化所有抗体，并以从100nM至35pM(8个浓度)的3倍稀释度进行重复测试。已证明所有测试的克隆均是PD-1/PD-L1相互作用的有效抑制剂，三个含κ轻链的克隆G1/887_04_E12，G1/894_08_E05和G1/884_04_G12的IC50值甚至比包含λ轻链的克隆G1/280_02_G02_NS更好。
5.3.2亲和力
然后使用Biacore T200处理单元(GE保健公司)通过SPR对抗PD-L1单抗G1/887_04_E12、G1/887_04_G12和G1/894_08_E05与重组人(生物素化的hPD-L1-Avi-His，Acro生物系统，PD1-H82E5)、食蟹猴(cPD-L1-His，Acro Biosystems，PD1-C52H4)和小鼠PD-L1(mPD-L1-His，Acro Biosystems，PD1-M5220)的结合进行测量。将亲和力与IgG1形式的280_02_G02_NS克隆(G1-AA/280_02_G02_NS；此克隆名称中的“AA”表示该克隆在CH2结构域中也包含“LALA”突变)进行了比较。
简而言之，将在HBS-EP缓冲液(GE保健公司，BR100188)中稀释的2μg/ml的抗PD-L1mAb以30μl/min的速度分别注射到A蛋白芯片(GE保健公司，29127556)的流通池2、3和4上，以达到约110RU的最终响应。将在HBS-EP缓冲液中稀释的重组人、食蟹猴和小鼠PD-L1-His抗原以3倍稀释的81nM至0.037nM的适当浓度范围注入流通池1、2、3或4中，以75μl/min的速度持续4分钟，然后在缓冲液中解离10分钟。通过以30μl/min的速率注射10mM甘氨酸-HClpH 1.5(GE保健公司，人抗体捕获试剂盒，BR00356)30秒钟来实现再生。使用BIAevaluation3.2软件(GE保健公司)分析减去后的数据(流通池2–流通池1，流通池3–流通池1或流通池4–流通池1)以使用模型1：1结合与质量转移，折射率(RI)恒定为0来分析。为了确定小鼠PD-L1结合曲线的亲和力，使用了相应的人结合谱的Rmax。
结合数据表明，G1-AA/280_02_G02_NS克隆以及G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12克隆与人和食蟹猴PD-L1结合，具有低个位数的纳摩尔或亚纳摩尔亲和力，并且完全是人/食蟹猴杂交-反应的。与G1-AA/280_02_G02_NS克隆相比，G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12克隆对人的结合亲和力高约1.8至4.8倍，对食蟹猴PD-L1则高2.7至4.7倍。克隆对重组小鼠PD-L1的亲和力较低，KD值范围为38至225nM，其中观察到对G1/887_04_E12克隆的亲和力最高。这些数据表明，G1-AA/280_02_G02_NS抗体的重链可与λ和κ轻链配对，以产生对重组人和食蟹猴PD-L1具有良好亲和力的抗体(在κ轻链配对的情况下，亚纳摩尔级)，以及一些对重组小鼠PD-L1具有尽管较低的亲和力的抗体。
5.3.3抗PD-L1单克隆抗体与细胞表达的PD-L1的结合
然后使用流式细胞仪检测抗人PD-L1单抗、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12与表达人PD-L1的HEK293细胞(HEK.hPD-L1细胞)的结合情况。还通过测试与缺乏人PD-L1的HEK293亲代细胞的结合来评估非特异性结合(Flp-In T-Rex 293细胞系，美国生命技术公司，R780-07)。
编码人PD-L1的cNDA(SEQ ID NO：185)被亚克隆到使用KpnI和NotI限制性位点的pcDNATM5/FRT载体中(赛默飞世尔科技，货号V601020)，然后使用Lipofectamine 2000(美国生命技术公司，11668-019)将载体转化进入Flp-In T-REx 293细胞系(美国生命技术公司，R780-07)。细胞在含有10％FBS，100μg/ml潮霉素B(Melford实验室有限公司，Z2475)和15μg/ml灭瘟素(Melford实验室有限公司，B1105)的DMEM中生长3-4周，直到形成稳定转化的细胞集落为止。在1μg/ml强力霉素(西格玛奥德里奇，D9891)存在下扩增这些集落，并使用PE偶联的抗人PD-L1(MIH1)抗体(BD生物科学，557924)测试PD-L1的表达。使用细胞解离缓冲液分离细胞，用PBS洗涤一次，在96孔板的孔中铺2×105细胞，然后与在PBS中以1:20稀释的抗体在4℃下孵育1小时，然后再次在PBS中洗涤并使用Accuri C6细胞仪(BD生命科学)进行测量。使用FlowJoX软件分析数据。在细胞系中检测到人PD-L1的表达。
发现G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12克隆以0.26-0.29nM的EC50值结合至细胞表面人PD-L1。没有观察到与亲本HEK293细胞的结合，显示了结合的特异性。因此，所有测试的mAb克隆都与PD-L1特异性结合，没有观察到非特异性结合。
5.3.4抗PD-L1单抗在混合淋巴细胞反应测定中的活性
抗PD-L1 mAb的活性在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中进行了测试。MLR分析可测量在两个异源淋巴细胞群体(相同物种，但遗传上不同)之间发生的细胞免疫反应。该测定使用来自一个供体的CD4+T细胞和另一供体的单核细胞衍生树突细胞(iDC)。因为免疫细胞含有生理水平的免疫检查点调节剂，所以MLR分析可用于确认人系统中的单抗增强了T细胞的活化。
产生扩增的CD4+T细胞
通过Ficoll梯度分离从白细胞锥中分离出PBMC。根据制造商的说明，使用人类CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi生物科技有限公司，130-096-533)分离CD4+T细胞。通过涡旋重悬人T-活化剂CD3/CD28 Dynabeads(美国生命技术公司，11131D)。将珠子转移到无菌的15ml试管中，并加入10ml含10％FBS(美国生命技术公司，10270106)和1×青霉素链霉素(美国生命技术公司，15140122)的RPMI(美国生命技术公司，61870044)，以洗涤Dynabeads。弃去上清液。将所需要量的CD4+T细胞以1.0×106细胞/ml含有10％FBS和1×青霉素链霉素溶液和50IU/ml重组人IL-2(Peprotech，200-02-50μg)的RPMI，珠子与细胞的比例为3:1的样品转移至T75烧瓶(Greiner Bio-one，690195)中，并在37℃±5％CO2 下孵育。3天后，将细胞轻轻重悬并计数。通过根据需要添加新鲜培养基(RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1×+50IU/ml rhuIL-2)，将细胞密度维持在0.8-1×106细胞/ml之间。在第7或8天，将CD3/28珠子移出，将CD4+T细胞以1×106细胞/ml新鲜培养基RPMI-10％FBS+青霉素链霉素溶液1×(减少的10IU/ml rhuIL-2)静置过夜。将细胞冷冻保存直至需要。
iDC的分化
按照生产商的说明，使用人泛单核细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司，130-096-537)从人PBMC中分离未接触的单核细胞。按照制造商的说明，使用人类Mo-DC分化培养基(美天旎生物技术有限公司，130-094-812)将单核细胞分化为iDC。
实验前一天将扩增的T细胞解冻，用AIM V培养基(Gibco，12055-091)洗涤，并在37℃，5％CO2的AIM V培养基中孵育过夜。将抗人PD-L1 mAb、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12一式三份以4X的终浓度稀释在在96孔圆形底板(VWR，734-1797)的50μlAIM V培养基中。包含LALA突变的抗FITC抗体，命名为4420(Bedzyk等人，1989；Bedzyk等人，1990)，作为阴性对照。测试了从30nM到0.002nM的3倍稀释系列。将悬浮在50μl AIM V培养基中的1×104iDC细胞和悬浮于100μl AIM V培养基中的1×105扩增的CD4+T细胞均添加到抗体稀释液中，并在37℃+5％CO2.下孵育5天。包括以下对照：仅CD4+T细胞，仅iDC，CD4+T细胞+iDC和仅AIM V培养基。收获上清液，将样品稀释(1:25)，并使用人IFNγELISA Ready-SET-Go！试剂盒(美国生命技术公司，88-7316-77)测定干扰素γ(IFN-γ)的浓度。使用带有Gen5软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gen5软件，BioTek)。将人IFN-γ的浓度相对抗体的对数浓度作图，并在GraphPad Prism中使用对数(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
抗人PD-L1单抗，G1/894_8_E05、G1/887_4_E12和G1/887_4_G12在MLR分析中显示有效活性，EC50值小于0.030nM，IFN-γ的最大水平(Emax)为大于10000pg/ml。EC50表示达到一半响应的mAb浓度，而Emax是表示测定中达到的IFN-γ最高浓度的绝对值。阴性对照G1-AA/4420mAb未观察到预期的活性。
5.4抗PD-L1单抗在小鼠DO11.10 T细胞活化试验中的活性
由于抗人PD-L1单克隆抗体G1/887_04_E12、G1/887_4_G12和G1/894_08_E05与小鼠PD-L1的交叉反应较弱(参见实施例5.3.2)，因此在基于DO11.10 OVA T淋巴细胞和LK35.2 B淋巴细胞杂交瘤细胞系的白介素2(IL-2)释放试验中检查了它们对小鼠PD-L1的功能活性。IL-2释放是T细胞活化的标志。用空载体(pLVX)转染表达内源鼠PD-1的T细胞。用小鼠PD-L1构建体转染B细胞。
5.4.1用空载体生产T细胞系
使用Lenti-X HTX包装系统(Clontech，631249)，利用慢病毒转导方法生成包含空的慢病毒载体pLVX的DO11.10细胞(国立犹太健康中心)。Lenti-X表达载体(pLVX)(序列号631253)与Lenti-X HTX包装混合物共转染到Lenti-X 293T细胞系中(序列号632180)产生病毒。使用Lenti-X HTX包装系统产生的慢病毒颗粒转导DO11.10细胞系。
5.4.2过表达PD-L1的抗原呈递细胞的产生
使用Lenti-X HTX包装系统(Clontech，631249)，利用慢病毒转导方法产生过表达小鼠PD-L1的LK35.2 B细胞淋巴瘤细胞(ATCC，HB-98)。631249)。将包含编码小鼠PD-L1(SEQID NO：187)的cDNA的Lenti-X表达载体(pLVX)(序列号631253)，与Lenti-X HTX包装混合物一起共转染到Lenti-X 293T细胞系中(序列号632180)产生病毒。使用由Lenti-X HTX包装系统生产的慢病毒载体转导LK35.2细胞系。
5.4.3小鼠DO11.10 T细胞活化试验
在实验培养基(DMEM(Gibco，61965-026)，10％FBS(Gibco，10270-106)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070))中制备了抗PD-L1单抗G1/887_04_E12、G1/887_4_G12和G1/894_08_E05或抗FITC阴性对照单抗(G1-AA/4420)的稀释液。在存在2.46μM OVA肽(H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(SEQ ID NO：192)(Pepscan))(在96圆底板中每孔100μL LK35.2mPD-L1细胞(用含有mPD-L1的慢病毒载体转导的B细胞杂交瘤以过表达小鼠PD-L1)/单抗混合物)的情况下，将单抗与4x105/ml LK35.2 mPD-L1细胞在实验培养基中1：1混合，并在37℃，5％CO2中孵育1小时。将100μl体积实验培养基中的2x105 DO11.10 pLVX细胞(用空的慢病毒载体转导的DO11.10 T细胞杂交瘤)/ml添加到100μl LK35.2 mPD-L1/(mAbs)混合物中。然后将细胞混合，然后在37℃，5％CO2中孵育24小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-88或R&D systems，SM2000)进行分析。使用带有Gen5软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gen5软件，BioTek)。绘制小鼠IL-2的浓度相对于单抗的对数浓度的关系图，并在GraphPad Prism中的使用log(激动剂)相对响应方程式拟合所得曲线。
抗人PD-L1单抗在小鼠T细胞活化试验中显示出显著的活性，效价(EC50)在1-4.4nM的范围内。如预期的那样，阴性对照mAb未观察到活性。在测试的三个克隆中，对重组小鼠PD-L1表现出最高亲和力的G1/887_04_E12也是T细胞活化试验中最有效的克隆。效价差异小于测得的亲和力，这可能是由于此测定中LK35.2细胞上小鼠PD-L1的高度过表达所致。
5.5表征IgG1形式的κ克隆的小结
包含所选κ轻链的抗PD-L1单克隆抗体G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12表现出食蟹猴和小鼠PD-L1交叉反应性，与细胞表面表达的PD-L1特异性结合，并且表现出比含有λ轻链的克隆G1/280_02_G02对重组人和食蟹猴PD-L1更高的亲和力。抗PD-L1单抗G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12被证明是体外人类T细胞的有效激活剂，并具有功能性的小鼠交叉反应性。
实施例6：PD-L1单抗的序列优化
6.1识别和去除潜在的蛋白质脱酰胺位点
对G1/280_02_G02_NS克隆的序列进行分析后，H-CDR2环(Kabat 54-57位)上的NSNT序列被鉴定为潜在的脱酰胺位点，如果其脱酰胺，则可能影响结合。该克隆的重链保留在通过实施例5中所述的链重组运动获得的所有含κ轻链的克隆中，因此该潜在的脱酰胺位点也存在于克隆G1/887_04_E12、G1/894_08_A05、G1/894_08_E05和G1/887_4_G12中。使用最接近种系序列的特异性引物，通过定点诱变将含有四个κ轻链的克隆中的NSNT序列改变为GGST、SGGT或SGNA，以产生已鉴定的变体克隆。在去除该潜在的脱酰胺位的同时，脯氨酸残基在G1/887_04_E12克隆的VH区Kabat 28位上(在κ轻链改组过程中被无意引入该抗体的序列)的作用，也通过将其还原为G1/280_02_G02_NS克隆中包含的苏氨酸残基进行了研究。以0.8ml规模转染亲本和所得变体克隆(均以IgG1形式)，并且在转染后五天收获的培养物上清液用于通过SPR确定克隆对人和食蟹猴PD-L1-rCD4-His的亲和力。如实施例1.3中所述产生食蟹猴PD-L1-rCD4-His。除了衍生自G1/887_04_E12克隆的变体克隆外，与各自的亲本克隆相比，所有变体克隆都保留了对人和食蟹猴PD-L1的亚纳摩尔亲和力。
源自G1/894_08_A05、G1/894_08_E05和G1/887_04_G12亲本克隆的修饰克隆均显示出对人和食蟹猴PD-L1的亚纳摩尔亲和力，与其各自亲本克隆的亲和力相当，表明GGST、SGGT和SGNA取代耐受性良好。G1/929_01_A01、G1/929_01_A02和G1/929_01_A03克隆与其亲本(G1/887_04_E12)相比，亲和力大大降低，这可能是由于去除了Kabat 28位VH区的脯氨酸而不是H-CDR2中存在GGST、SGGT和SGNA取代。令人惊讶的是，G1/887_04_E12克隆中的脯氨酸残基似乎对其与PD-L1的亲和力很重要。衍生自三个亲本克隆G1/887_04_E12，G1/894_08_E05和G1/887_04_G12的变体，它们在其H-CDR2中(位置54-57)包含SGGT取代，即克隆G1/929_01_A02，G1/929_01_A08和G1/929_01_A11，基于该SGGT取代最接近种系序列，被选择用于进一步表征。
使用定点诱变，还将G1/280_02_G02_NS克隆的H-CDR2环中潜在的脱酰胺位点(在Kabat 54位至57位的NSNT)修饰为SGGT。另外，通过将丝氨酸32(Kabat编号)突变为酪氨酸，在该克隆的λ轻链CDR1的Kabat 31至32位处鉴定出的另一个潜在的脱酰胺位点(NS基序)被修饰为NY，因为酪氨酸位于几个种系序列中的这个位置，例如IGLV2-8-01、IGLV2-8-02、IGLV2-8-03、IGLV2-11-01、IGLV2-11-02、IGLV2-11-03和IGLV2-14-01、IGLV2-14-02、IGLV2-14-03、IGLV2-14-04。这些修饰的组合产生了含有λ轻链的克隆G1/lam-G02v3，也被选择用于进一步表征。
实施例7：单克隆抗体的表征
7.1以单抗形式克隆和生产克隆
将实施例6中鉴定的G1/929_01_A02 SGGT变体克隆中VH区Kabat 28位的苏氨酸残基突变为脯氨酸，如在其亲本克隆G1/887_04_E12中的相同位置，为了改善其对人和食蟹猴PD-L1的亲和力。在HEK293-6E细胞中进行瞬时表达并使用mAb Select SuRe蛋白A柱进行纯化，以产生此修饰的变异体克隆和在实施例6中鉴定的，IgG1形式并具有LALA突变，可以在没有效应子功能的情况下测试其功能活性的其他三个SGGT变异体克隆(G1/929_01_A08、G1/929_01_A11和G1/lam-G02v3)。所得的单克隆抗体称为G1-AA/E12v2、G1-AA/E05v2，G1-AA/G12v2和G1-AA/lamG02v3(称为G1-AA/lamG02v3或G1-AA/lambdav3)。重链和轻链序列分别示于：G1-AA/E12v2的SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，G1-AA/E05v2的SEQ ID NO：27和SEQID NO：28，G1-AA/G12v2的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：33以及G1-AA/lam-G02v3的SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：44。
7.2单抗对人和食蟹猴PD-L1的亲和力
为了确定其他序列修饰是否存在于G1-AA/lam-G02v3(即VH-CDR2中从NSNT到SGGT，VL-CDR1中从NS到NY和LALA突变)和含κ轻链的mAb G1-AA/E12v2，G1-AA/E05v2和G1-AA/G12v2(即LALA突变，仅在G1-AA/E12v2中，在VH区Kabat 28位的苏氨酸成为脯氨酸)中，影响了结合动力学，如实施例5.3.2中所述测定了这些抗PD-L1单抗对人和食蟹猴PD-L1的亲和力。单克隆抗体mAb G1-AA/lam-G02v3、G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2对人和食蟹猴PD-L1的亲和力与实施例5.3中单克隆抗体G1-AA/280_02_G02_NS、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12和G1/887_04_G12的亲和力相似，表明测试的单克隆抗体和mAb2的结合亲和力不受潜在脱酰胺位点的修饰或LALA突变引入的影响。G1-AA/E12v2 mAb在所有测试的四个单克隆抗体中显示出最低的K D值(人PD-L1为0.21nM，食蟹猴PD-L1为0.37nM)。结果显示在表4中。
G1-AA/E12v2 mAb的VH与G1/929_01_A02区(实施例6)相差一个残基，E12v2在Kabat 28位具有脯氨酸，而G1/929_01_A02在此位置具有苏氨酸。与G1-AA/E12v2相比，G1/929_01_A02对人和猕猴PD-L1的亲和力低10倍以上，该数据表明克隆E12v2 VH中第28位脯氨酸残基(Kabat命名法)对于它与人和食蟹猴PD-L1的亲和力的重要性。
表4
7.3抗人PD-L1单抗在MLR中的活性
如实施例5.3.4中所述，在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中测试抗PD-L1单抗，G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G05v2。G1-AA/4420用作阴性对照。结果数据显示在表5中。单克隆抗体G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2在MLR分析中显示有效活性，EC50值小于0.054nM，最大IFN-γ(Emax)大于600pg/ml(表5)。EC50尤其是Emax值与实施例5.3.4中所述的值明显不同。认为这种差异是由于供体的可变性所致，因为响应取决于一个供体的T细胞与另一供体的单核细胞衍生的树突细胞之间的同种异基因反应。抗人PD-L1单抗的效价与实施例5.3.4中所述的数据一致，克隆的效价顺序也是如此。如预期那样，阴性对照G1-AA/4420mAb未观察到活性。
表5
7.4抗PD-L1单抗的表达，纯化和分析表征
单克隆抗体G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2在实验室规模生产，并通过SEC和差示扫描量热法(DSC)的标准分析方法进行了表征。
7.4.1抗PD-L1单抗的实验室规模表达和纯化
使用PEIpro(法国，Polyplus)将编码单克隆抗体G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2的DNA序列转染到HEK293 6E(加拿大国家研究委员会)细胞中。5天后，收获细胞培养液，并使用AKTAxpress仪器在MabSelect蛋白-A预装柱上纯化(均来自GE保健公司，瑞典，乌普萨拉)。在pH 7.0的50mM Tris，250mM NaCl中进行柱平衡，然后上样收获的细胞培养液。使用pH 7.0的50mM Tris，250mM NaCl洗涤树脂，然后使用pH小于3.5的缓冲液洗脱单克隆抗体。
7.4.2通过SE-UPLC分析
使用Acquity H-Class Bio UPLC(英国沃特世公司)在纯化的24小时内(材料存储在4℃下)进行SE-UPLC后纯化，以测量单体的百分比。使用Acquity UPLC BEH200 SEC1.7mm色谱柱(4.6x 150mm)，流动相由pH 6.8的250mM磷酸钠，100mM L-精氨酸组成。使用Empower软件(英国沃特世公司)对单体，低分子量和高分子量物质进行定量。
7.4.3热稳定性
使用Microcal VP毛细管差示扫描量热仪(DSC)测量G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2的熔融温度(T m)。包含G1-AA/lam-G02v3以评估含κ和λ轻链的单克隆抗体之间的差异。在样品缓冲液中以0.2mg/ml的浓度测量样品。扫描速率设置为60℃/小时，并在35℃和100℃之间收集数据。用Origin 7.0软件进行数据分析。由于Fab和CH3的DSC峰重叠，因此报告了一个值。
表6
单抗 蛋白A后单体纯度％ Fab/CH3的Tm
G1-AA/E05v2 99.48±0.01％ 80.4-82.8℃
G1-AA/E12v2 98.85±0.07％ 81.4-84.1℃
G1-AA/G12v2 99.83±0.11％ 78.1-81.3℃
G1-AA/lam-G02v3 99.75±0.25％ 68.1℃
结果小结显示在表6中。三个单克隆抗体：G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2和G1-AA/G12v2显示出良好的分析表征参数；蛋白A后单体纯度大于98％，并且发现Fab转变(Tm)的热稳定性处于通常报道的IgG1转变的高端，而G1-AA/E12v2似乎是最热稳定的(Fab/CH 3TM＝81.484.1℃)。λ轻链单克隆抗体G1-AA/lamG02v3的Tm低于三个含κ轻链的单克隆抗体。
实施例8：抗人CD137/PD-L1 mAb2的生产和表征
8.1抗人CD137/PD-L1 mAb2的生产
产生了由包含三个抗人CD137 Fcab克隆FS22-053-008、FS22-053-017和FS22-172-003的IgG1分子组成的CD137/PD-L1 mAb2抗体(参见实施例3)以表征mAb2形式的Fcab。CD137/PD-L1 mAb2是通过将包含AB、CD和EF环的部分CH3结构域Fcab替换为三种抗PD-L1结合抗体之一的CH3域的相应区域(G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、G1-AA/G12v2；参见实施例7.1)制备。所有产生的mAb2均包含LALA突变。CD137/PD-L1 mAb2使用PEIpro(法国，Polyplus)在HEK293 6E(加拿大，NRCC)细胞中瞬时表达。5天后，收获细胞培养液，并使用AKTAxpress仪器(GE保健公司，瑞典，乌普萨拉)在MabSelect蛋白-A预装柱上纯化。在pH7.0的50mM Tris-HCl，250mM NaCl中进行柱平衡，然后加样收获的细胞培养液。然后将树脂在pH 7.0的50mM Tris-HCl，250mM NaCl中洗涤，然后使用pH<3.5的缓冲液洗脱mAb2。
为了评估产生的蛋白质量，使用Octet QKe(ForteBio)平台和PALL的蛋白A定量生物传感器(18-5021)，通过生物层干涉术对IgG蛋白质含量进行定量。使用mAb SelectSure色谱柱通过蛋白质A亲和色谱法纯化蛋白质。使用mAb Select SuRe蛋白A色谱柱(GE保健公司，11003494)纯化九种mAb2。结果显示在表7中。
表7
所有9种CD137/PD-L1 mAb2抗体均通过在HEK 293 6E中进行瞬时表达而产生，并且在实验室规模的预期范围内获得的滴度和蛋白A纯化产率。FS22-172-003-AA-Iam/G02v3也被表达和纯化用于进一步测试。
8.2通过尺寸排阻色谱法(SEC)和SDS-PAGE进行mAb2的生物物理表征
8.2.1通过SE-HPLC分析
使用配备有TSK-GEL SUPERSW3000 4.6mm ID x 30.0cm色谱柱(Tosoh生物科学)的安捷伦1100系列HPLC(英国安捷伦)进行后纯化SE-HPLC，使用pH 6.8的20mM磷酸钠，200mM氯化钠作为流动相。使用Chemstation软件(英国安捷伦)对单体％进行定量。
8.2.2通过CE-SDS分析
根据制造商的说明，在2100Bioanalyzer毛细管电泳系统(英国安捷伦)上进行了CE-SDS分析。对于还原条件，添加DTT，并将样品在70℃下变性5分钟。
表8
分析结果的小结显示在表8中。除FS22-053-008-AA/G12v2外，所有mAb2使用蛋白A均显示出纯化后高纯度；蛋白质A后的单体百分比>95％时显示出低水平的可溶性聚集和断裂，而CE-SDS降低则显示出高纯度(>95％，重链和轻链的总和)。FS22-053-008-AA/G12v2在蛋白A纯化后显示出聚集现象，因此它没有进一步进行。
实施例9：mAb2结合的表征
9.1通过SPR测量抗人CD137/PD-L1 mAb2对人和食蟹猴PD-L1的结合亲和力
然后使用Biacore T200加工单元(GE保健公司)通过SPR测量抗人CD137/PD-L1mAb2，FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-FS22-053-008-AA/E12v2和FS22-172-003-AA/G12v2对重组人和食蟹猴PD-L1抗原的结合。
简而言之，将在HBS-EP缓冲液(GE保健公司，BR100188)中稀释的2μg/ml的抗人CD137/PD-L1 mAb2以30μl/min的速度分别注射到蛋白A芯片(GE保健公司，29127556)的流通池2、3和4上，获得约110RU的最终响应。使用了两种不同的重组人PD-L1抗原，即hPD-L1-His-Avi(有关抗原的详细信息，参见实施例1.3)和生物素化的hPD-L1-Avi-His(Acrobiosystems，PD-1-H82E5)。将在HBS-EP缓冲液中稀释的人和食蟹猴PD-L1-His(Acrobiosystems，PD-1-C52H4)抗原以3倍稀释的81nM至0.037nM的适当浓度范围注射到流通池1、2、3或4上，以75μl/min的速度持续4分钟，然后在缓冲液中解离10分钟。通过以30μl/min的速率注射10mM甘氨酸-HCl pH1.5(GE保健公司，人抗体捕获试剂盒，BR00356)30秒钟实现再生。使用BIAevaluation 3.2软件(GE保健公司)分析减法后的数据(流通池2–流通池1，流通池3–流通池1或流通池4–流通池1)以使用模型1：1结合与质量转移，折射率(RI)恒定为0来鉴定结合。
表9
结合数据表明，每种抗人CD137/PD-L1 mAb2结合至人和食蟹猴PD-L1的亲和力均低至亚纳摩尔，因此与人/食蟹猴具有交叉反应性(表9)。所有mAb2克隆均与人和猕猴PD-L1结合良好，每种抗原的KD值相等。
9.2通过SPR测量抗人CD137/PD-L1 mAb2对人和食蟹猴CD137的结合亲和力
还使用Biacore T200处理单元(GE保健公司)通过SPR测量了抗人CD137/PD-L1mAb2与重组二聚体人和猕猴CD137抗原的结合。
简要地说，将20μg/ml抗人Fab抗体(GE保健公司，人Fab捕获试剂盒28958325)包被在Biacore传感器S芯片CM5(GE保健公司，BR100530)的流通池1、2、3和4上，以实现最终反应大约5000RU。在HBS-EP缓冲液(GE保健公司，BR100188)中稀释的mAb2克隆以2-5μg/ml的浓度分别以30μl/min的流速注入流动池2、3和4中，以达到约70RU(FS 22-172-003-AA/E12v2为200RU)。在HBS-EP缓冲液中稀释的重组二聚体抗原，人CD137-mFc-Avi或食蟹猴CD137-mFc-Avi(有关抗原的详细信息，参见实施例1.1)以3倍稀释的81nM至0.037nM的适当浓度范围注射到流通池1、2、3或4上，以75μl/min的速度持续4分钟，然后在缓冲液中解离10分钟。通过以30μl/min的速率注入10mM甘氨酸pH 2.1(GE保健公司，人类Fab捕获试剂盒28958325)60秒实现再生。如实施例9.1中所述进行数据分析。
表10
结合数据表明，抗人CD137/PD-L1 mAb2克隆以低纳摩尔亲和力与二聚体人和猕猴CD137结合，并且完全与人/猕猴发生交叉反应(表10)。如预期的那样，这些结果类似于报告的以模拟mAb2形式这些Fcab克隆的结合数据(表3，实施例3.7)。对于FS22-172-003-AA/E12v2，观察到了对二聚体CD137的最高亲和力，随后也使用与上述相同的方法测试了对单体CD137-His-Avi的亲和力。未检测到高达81nM的FS22-172-003-AA/E12v2与单体CD137的结合，说明抗人CD137/PD-L1mAb2的Fcab结合区对单体CD137具有低亲和力。这些结果与FS22-053-008CD137 Fcab所观察到的结果相似，表明Fcab向mAb2形式的转化几乎不会改变与CD137的结合。
9.3通过SPR确定抗人CD137/PD-L1 mAb2的特异性
9.3.1对人PD-L1的特异性
为了分析抗人CD137/PD-L1 mAb2的特异性，使用SPR测试了六个mAb2(FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E12v2和FS22-172-003-AA/G12v2)对其他T细胞靶标的结合。目的是通过显示mAb2与浓度为1μM的抗原PD-L2、CD80、PD-1和B7-H3不结合来证明特异性。
CM5芯片上的流通池固定有约1000RU的人PD-L2-Fc(R&D Biosystems，1224-PL)、CD80-Fc(R&D Biosystems，140-B1)、PD-1-His(R&D Biosystems，8986-PD)、B7-H3-His(F星内部生产，SEQ ID NO：193)、PD-L1-Fc(R&D Biosystems，156-B7)和PD-L1-His(Acrobiosystems，PD-1-H83F3)。保留流通池1进行空白固定。在1x HBS-EP缓冲液(GE保健公司，产品代码BR100188)中将mAb2稀释至1μM和1nM，使其在芯片上流动3分钟，然后解离4分钟。注射pH 1.5的10mM甘氨酸30秒进行再生。阳性对照抗体以50-100nM的剂量注射以证明每种抗原的包被。在结合阶段结束时确定结合水平并进行比较。
测试的所有mAb2均显示出高水平的特异性，mAb2在1μM时检测到结合四种抗原少于10RU，在1nM时检测到的与人PD-L1-Fc或PD-L1-His结合的结合反应范围为105至570RU。这些结果证明了抗人CD137/PD-L1 mAb2对PD-L1的高度特异性，并且不与所列的其他T细胞靶标结合。
9.3.2对人CD137的特异性
预期与CD137/HelD1.3mAb2(参见实施例3.6)相比，CD137Fcab结合部分的特异性在CD137/PD-L1mAb2中得以保留。FS22-172-003-AA/E12v2对TNFR家族成员OX40、GITR、CD40和DR6(R&D Biosystems)的特异性通过SPR分析，与实施例9.3.1中所述类似。在浓度为1μM时，FS22-172-003-AA/E12v2与人OX40、GITR、CD40和DR6的结合少于7RU，而与人CD137-mFc的结合为278RU。该结果证明了FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2对CD137的高度特异性。
9.4通过SPR测定到抗人CD137/PD-L1 mAb2同时结合人PD-L1和人CD137
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2同时结合人CD137和人PD-L1-His Avi的能力(有关抗原的详细信息，参见实施例1.3)在Biacore T200上通过SPR测试。G1/S70用作对照。将在pH 5.0的乙酸钠缓冲液(GE保健公司，18-1069)中稀释至10μg/ml的人PD-L1 His，固定在CM5 Sensor S芯片(GE保健公司，BR100530)上，表面密度约为1100RU。一个没有固定任何蛋白质用于背景扣除的流通池被激活和失活。在HBS-EP缓冲液中稀释至5μg/ml的抗体以30μl/min的流速被捕获，以达到约200-300RU的密度。在0和100nM下，以30μl/min的速度测试人CD137-mFc-Avi的结合力5分钟，然后进行2.5分钟的解离步骤。每次循环后，用20mM NaOH以30μl/min的流速持续60秒再生传感器芯片。FS22-172-003-AA/E12v2能够同时与人PD-L1和人CD137结合，而对照G1/S70仅与人PD-L1结合。
9.5通过流式细胞仪检测抗人CD137/PD-L1 mAb2与细胞表面表达的人或食蟹猴PD-L1的结合亲和力
为了评估抗人CD137/PD-L1 mAb2与人和食蟹猕猴PD-L1细胞表面的结合，生成了过表达人PD-L1的HEK293细胞。如实施例5.3.3中所述产生过表达人PD-L1的HEK293细胞(HEK.hPD-L1)。如实施例5.3.3中所述，还产生过表达食蟹猴PD-L1的HEK293细胞(HEK.cPD-L1)，除了编码食蟹猴PD-L1(SEQ ID NO：189)的cDNA被亚克隆到pcDNATM 5/FRT载体中，而不是人PD-L1序列。
然后使用流式细胞仪测试抗人CD137/PD-L1 mAb2、FS22-172-003-AA/E12v2与表达人或食蟹猴PD-L1的HEK293细胞结合。还通过测试与缺乏人PD-L1的HEK293亲代细胞(Flp-In T-Rex 293细胞系，美国生命技术公司，R780-07)的结合来评估非特异性结合。将结合亲和力与阳性对照抗体G1-AA/E12v2(重链和轻链分别为SEQ ID NO：16和17)比较，其可变域被克隆并以在CH2结构域中包含LALA突变人IgG1形式表达(G1-AA形式)。
在FACS缓冲液(含0.5％BSA(西格玛，A7906)的DPBS(Gibco，14190-094))中制备HEK293、HEK.hPD-L1和HEK.cPD-L1悬浮液，并以1X 105细胞/孔接种100μl到圆底96孔板(VWR，734-1797)中。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次。将mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2，模拟mAb2 FS22-172-003-AA/HelD1.3，mAb G1-AA/E12v2和阴性对照mAb G1-AA/4420在100μlFACS缓冲液中进行稀释(400nM–0.005nM，5倍稀释液)。将洗涤后的细胞重悬于稀释的抗体混合物中，在4℃下孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤一次。然后加入在FACS缓冲液中1：1000稀释的100μl/孔的第二抗体(山羊抗人IgG Alexa Fluor 647标记的抗体，英杰公司，A21445)，在4℃孵育20分钟。用Canto II流式细胞仪(BD生物科学)分析之前，再用FACS洗涤细胞一次，并将其重悬于100μl含7AAD的PBS(1：1000，Biotium，40043)中。排除死细胞，并测量APC通道(638nm 660/20)中的荧光。绘制几何平均荧光强度(GMFI)值相对抗体的对数浓度的图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程式拟合所得曲线。
已发现FS22-172-003-AA细胞表面人PD-L1结合的EC50值在3.1-3.7nM范围内，与细胞表面食蟹猴PD-L1结合的EC50值在0.6-0.7nM范围内(参见表11)。未观察到与缺乏PD-L1过表达的HEK293细胞的结合，显示了结合的特异性。因此，测试的FS22-172-003-AA/E12v2mAb2与PD-L1特异性结合，未观察到非特异性结合。这些结果表明，观察到的PD-L1 mAb对人和食蟹猴PD-L1的特异性得以保留(参见实施例5.3.3)。
表11
9.6通过流式细胞仪检测抗人CD137/PD-L1 mAb2对细胞表面表达的人或食蟹猴CD137的结合亲和力
生产表达全长人类(SEQ ID NO：185)或食蟹猴CD137(SEQ ID NO：189)的DO11.10细胞(国立犹太健康中心)，分别命名为“DO11.10.hCD137”和“DO11.10.cCD137”，以便以膜结合构象呈递抗原，最类似于其天然形式，以进一步表征选定的抗人类CD137/PD-L1 mAb2。DO11.10.hCD137和DO11.10.cCD137细胞的产生和表达确认的细节在实施例1.2中描述。
使用流式细胞仪测试了抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2与表达人或猕猴CD137(DO11.10.hCD137或DO11.10.cCD137)的细胞的结合情况。还通过测试与缺乏CD137表达的DO11.10细胞的结合来评估非特异性结合。克隆MOR7480.1的可变结构域(美国专利号2012/0237498)，并以在CH2结构域中包含LALA突变的人IgG1形式(G1-AA形式)表达，并将其用作阳性对照。
简而言之，在FACS缓冲液(含有0.5％BSA(西格玛，A7906)的DPBS(Gibco，14190-094)中制备DO11.10、DO11.10.hCD137或DO11.10.cCD137悬浮液，并以1x 105细胞/孔接种100μl到圆底96孔板(VWR，734-1797)中。细胞在FACS缓冲液洗涤一次，并将mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2、模拟mAb2 FS22-172-003-AA/HelD1.3、抗体G1-AA/MOR7480.1和阴性对照mAb G1-AA/4420在100μl FACS缓冲液中稀释(400nM–0.005nM，5倍稀释)。将洗涤后的细胞重悬于稀释的抗体混合物中，在4℃下孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤一次。然后加入在FACS缓冲液中1：1000稀释的100μl/孔的第二抗体(山羊抗人IgG Alexa Fluor 647标记的抗体，英杰公司，A21445)，将细胞/抗体混合物在4℃孵育20分钟，然后用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并重悬于100μl含7AAD(1：1000，Biotium，40043)的PBS中，然后使用Canto II流式细胞仪(BD生命科学)进行分析。排除死细胞，并测量APC通道中的荧光(638nm 660/20)。绘制几何平均荧光强度(GMFI)值相对抗体的对数浓度的图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程式拟合所得曲线。
结果显示在表12中。发现FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2和FS22-172-003-AA/HelD1.3模拟mAb2与细胞表面表达的人和食蟹猴CD137受体结合的EC50值在4.8–9.1nM范围内，并且发现阳性对照mAb结合人和食蟹猴CD137受体的EC50值分别为1.45nM和4.4nM。未观察到与未过表达CD137的DO11.10或HEK293细胞的结合，证实了mAb2的结合特异性。
表12
9.7抗人CD137/PD-L1 mAb2与活化的原代人T细胞上内源表达的CD137和PD-L1的结合亲和力
使用流式细胞仪确定抗人CD137/PD-L1 mAb2对活化的原代人T细胞上内源表达的CD137和PD-L1的亲和力。为了分离T细胞，从血小板捐献的副产物白细胞耗竭锥中分离出外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，用PBS冲洗白细胞锥内容物，并覆盖在Ficoll(西格玛奥德里奇，1440-02)梯度上。通过离心分离PBMC，并回收未穿过Ficoll梯度的细胞。用PBS进一步洗涤PBMC，并根据制造商的说明通过添加10ml1X红细胞裂解缓冲液(eBioscience，00-4300-54)裂解剩余的红细胞。根据制造商的说明，使用泛T细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术有限公司，130-095-130)从存在于洗脱液中的PBMC中分离出泛T细胞。CD137在活化的CD8+T细胞上快速表达高水平，并且也在活化的CD4+T细胞上表达较低水平(Xue-Zhong Yu等人，2013)，因此根据制造商的说明使用DynabeadsTM人T-激活剂CD3/CD28珠(赛默，11132D)将泛T细胞刺激24小时。按照制造商的说明，使用DynaMagTM-15磁铁(赛默，12301D)从T细胞中洗去人T-激活剂珠子，然后使用细胞结合测定法测试FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2、FS22-172-003-AA/HelD1.3模拟mAb2、G1-AA/E12v2阳性对照抗人PD-L1抗体、G1-AA/MOR7480.1阳性对照抗人类CD137抗体、G1-AA/4420阴性对照抗体。
在FACS缓冲液(含0.5％BSA(西格玛，A7906)的DPBS(Gibco，14190-094))中制备刺激的泛人T细胞悬液，并以1x 105细胞/孔接种100μl到圆底96孔板中(VWR，734-1797)。在FACS缓冲液洗涤一次，并将mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2、模拟mAb2 FS22-172-003-AA/HelD1.3、阳性对照抗体G1-AA/E12v2、阳性对照抗体G1-AA/20H4.9和阴性对照抗体G1-AA/4420在100μl FACS缓冲液中稀释(80nM–0.005nM，5倍稀释)。将洗涤过的细胞重悬于稀释的抗体混合物中，其包含抗人CD4+FITC标记的抗体(BD生物科学，550628)和抗人CD8+eFluor450标记的抗体(英杰公司，48-0087-42)以区分CD4+和CD8+T细胞，在4℃下孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤一次。然后加入在FACS缓冲液中1：1000稀释的100μl/孔的第二抗体(山羊抗人IgG Alexa Fluor 647标记的抗体，英杰公司，A21445)稀释，将细胞/抗体混合物在4℃孵育20分钟，然后然后用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并重悬于100μl含7AAD(1：1000，Biotium，40043)的PBS中，然后使用Canto II流式细胞仪(BD Bioscience)进行分析。排除死细胞，并测量APC通道(638nm 660/20)中的荧光以显示测试抗体的结合。绘制几何平均荧光强度(GMFI)值相对抗体的对数浓度的图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程式拟合所得曲线。
发现FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2与受刺激的人原代CD4+T细胞和CD8+T细胞结合，如图2中的MFI值所示。PD-L1阳性对照抗体G1-AA/E12v2以与mAb2相似的MFI值与CD4+和CD8+T细胞结合，从而证实PD-L1在细胞上表达。
发现CD137阳性对照G1-AA/MOR7480.1与上述相同细胞结合，尽管MFI远低于FS22-172-003-AA/E12v2或G1-AA/E12v2所观察到的。这可能是由于与PD-L1表达相比，细胞上CD137表达水平较低。此外，G1-AA/MOR7480.1与CD8+T细胞结合的MFI值高于CD4+T细胞。如前所述，预期观察到受刺激的CD4+T细胞上的CD137表达低于在CD8+T细胞上的表达(Xue-ZhongYu等人，2013)，这可以解释与CD8+T细胞相反，CD137阳性对照抗体MOR7480.1对CD4+T细胞的结合水平低。原代T细胞，特别是CD4+T细胞上见到的低CD137表达也可能解释观察到模拟mAb2形式的Fcab(FS22-172-003-AA/HelD1.3)的结合没有或很少。
9.8通过SPR测定将抗人CD137/PD-L1 mAb2与FcRn结合
新生儿Fc受体(FcRn)的结合对于抗体回收至关重要(Martins等人，2016)。使用BIAcore T200(GE保健公司)通过SPR测量FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E12v2和FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2与人和小鼠FcRn的结合。G1-AA/HelD1.3作为CH3结构域无突变的IgG同型对照。
简而言之，将mAb2分别包被在系列S传感器芯片CM5(GE保健公司，BR100530)的流通池2、3和4上，以获得大约1000RU的响应。流通池1被激活/去激活，但留空作为参考。将人FcRn(Acro Biosystems，FCM-H5286)或小鼠FcRn(R&D systems，9114-Fc)透析并在pH 6.0或pH 7.4的MHBS-EP+B缓冲液(10mM MES，FortéBio，18-5026；1x HBS-EP，GE保健公司，BR100669；0.1mg/ml BSA，西格玛，A7906)中稀释，并以2000-3000nM的浓度将其与2倍稀释液以80μl/min的流速注入流动池1，2，3和4中1分钟，然后使其在缓冲液中解离3分钟。不需要再生。使用Biacore T200评估软件2.0分析减去的数据(流通池2–流通池1，流通池3–流通池1或流通池4–流通池1)，以使用模型稳态亲和力鉴定结合。结合数据显示在表13中，并证明FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E12v2和FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2在pH 6.0时与人或小鼠FcRn结合具有与对照抗体G1-AA/HelD1.3相似的亲和力。在pH7.4下未观察到与人或小鼠FcRn的结合。该数据表明FcRn结合被mAb2保留。
表13
9.9通过流式细胞仪检测抗人CD137/PD-L1 mAb2与表达Fcγ受体的细胞结合
靶向TNFRSF成员的激动性抗体需要通过Fcγ受体交联，以驱动靶标聚集和激活，以实现体内活性(Li等人，2013)。但是，为了消除潜在的脱靶效应(例如由于Fcγ交联引起的全身性CD137活化)，以及减少诱导免疫细胞(例如表达两个靶标的T细胞)的ADCC的可能性，决定通过在CH2结构域中引入LALA突变(关于LALA形式的细节，参见实施例3.2)来降低抗人CD137/PD-L1 mAb2的Fcγ受体结合能力。通过流式细胞仪与仅过表达FcγRIIA(ECACC货号：15042905)、FcγRIIA(ECACC货号：15042903)、FcγRIIIA(ECACC货号：15042902)、FcγRIIIA(ECACC货号：15042901)或FcγRIIB(ECACC货号：15042907)的CHO细胞被用于确认在抗人CD137/PD-L1 mAb2的CH2结构域中存在LALA突变，已降低了其与前面提到的Fcγ受体的结合能力。
简而言之，在FACS缓冲液(含0.5％BSA(西格玛，A7906)的DPBS(Gibco，14190-094))中制备CHO.FcγRIIA.131H、CHO.FcγRIIA.131E、CHO.FcγRIIIA.158F、CHO.FcγRIIIA.158V、CHO.FcγRIIB或CHO.WT悬浮液，以1x 105细胞/孔的密度接种100μl在圆底96孔板中(VWR，734-1797)。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，然后将mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2、Fc受体结合抗体G1γ/4420的阳性对照和Fc受体结合抗体G1-AA/γ4420的阴性对照在100μl FACS缓冲液中进行稀释(500nM–0.03nM，4倍稀释)。将洗涤后的细胞重悬于稀释的抗体混合物中，在4℃下孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤一次。然后加入在FACS缓冲液中1：1000稀释的100μl/孔的第二抗体(山羊抗人IgG Alexa Fluor 488标记抗体，Stratech科学技术有限公司，109-545-098-JIR)，将细胞/抗体混合物在4℃下孵育20分钟，然后将细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并重悬于100μl含7AAD(1：1000，Biotium，40043)的PBS中，然后使用CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特)进行分析。排除死细胞，并测量FITC通道(488nm 525/40)中的荧光。绘制几何平均荧光强度(GMFI)值相对抗体的对数浓度的图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程式拟合所得曲线。
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2显示与所有测试的表达Fcγ受体的细胞均不结合(或低于结合至阴性对照抗体G1-AA/4420的水平)(图3(A)FcgRIIA 131H，(B)FcgRIIA131E，(C)FcgRIIB，(D)FcgRIIIA 158F，(E)FcgRIIIA 158V)。这表明LALA突变会降低与FcγRIIA，FcγRIIIA或FγgRIIB的结合，这也会降低这些受体体内经mAb2的交联。
实施例10：mAb2功能的表征
10.1抗人类CD137/PD-L1 mAb2在人类原代CD8+T细胞测定中的活性
使用实施例3.5中描述的人原代T细胞测定法来测试mAb2的活性。
对于抗人CD137/PD-L1 mAb2基于细胞的交联，基本上如实施例3.5中所述产生了过表达hPD-L1的HEK293细胞(HEK.hPD-L1)。HEK.hPD-L1细胞经过工程改造，可以表达高水平的人PD-L1，并与表达中水平的人PD-L1的MDA-MB-231细胞以及表达低水平的人PD-L1的SKBR3细胞一起使用(表14)，按照制造商的说明，通过抗体结合力珠(Quantum SimplyCellular，Bans实验室有限公司，货号816A)进行定量。
表14
使用如实施例3.5中所述的抗CD3抗体分离并活化CD8+T细胞。将HEK.hPD-L1细胞以每孔2x 105细胞接种在包被有抗CD3抗体(8μg/ml)的96孔平板中100μl含10％FBS(美国生命技术公司)，1X青霉素链霉素(美国生命技术公司，15140122)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco，M6250)的T细胞培养基(RPMI培养基(美国生命技术公司，61870-044)中。温育4小时后，一旦用作对照的未转导表达hPD-L1的HEK.hPD-L1细胞或HEK细胞发生粘附，则将所有T细胞培养基移出并用100μl含有5.0×105细胞/ml浓度T细胞的T细胞培养基替换，得到5.0×104细胞/孔。
对于具有较低生理水平的PD-L1表达的基于细胞的交联，人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26)用与所述的HEK.hPD-L1基于细胞的交联相同方法。
将mAb2在T细胞培养基中从50nM开始以2X终浓度稀释，并进行1：5滴定。将100μl的mAb2滴定液添加到细胞中，以形成测定总体积为200μl，抗体浓度为1X。
将阳性对照抗CD137抗体(G1-AA/20H4.9)在T细胞培养基中以2X终浓度稀释，起始浓度为50nM，包含50nM交联剂(抗人CH2抗体(mG1/MK1A6))，并进行1：5滴定。将100μl稀释的阳性对照抗体/交联剂混合物添加到细胞中，以形成200μl的总测定体积和1X浓度的抗体。
该测定在37℃，5％CO2下孵育72小时。收集上清液并用人IL-2ELISA Ready-SET-Go！试剂盒(eBioscience，货号88-7025-88)测定。使用带有Gen5软件，BioTek的读板器在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gen5软件，BioTek)。将人IL-2(hIL-2)的浓度相对抗体的对数浓度作图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
表15显示在存在基于细胞交联测试的抗人CD137/PD-L1 mAb2的情况下，在T细胞活化试验中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。在任一方法中阳性对照抗人CD137 mAb(20H4.9)与抗hCH2抗体交联时，显示出hIL-2释放量增加，EC50为0.21至0.31nM。所有克隆在测定中均具有活性，每个克隆均具有亚纳摩尔EC50的效价。包含Fcab FS22-172-003的mAb2在基于HEK.hPD-L1的测定中引发的最大T细胞反应范围的EC50在0.19至0.31nM之间，而在基于MDA-MB-231的测定中在0.01-0.02nM范围内。还测试了mAb2的子集(包含Fcab FS22-053-008、FS22-053-011、FS22-053-014、FS22-173-003和FS22-172-004)，未与HEK细胞上表达的PD-L1交联，如预期的那样，在该测定中没有活性。图4和图5显示了针对表15中列出的mAb2的T细胞活化试验的IL-2释放的代表性图。
FS22-053和FS22-172 Fcab谱系也使用表达最低的PD-L1人乳腺腺癌细胞SK-BR-3(ATCC HTB-30)在该试验中进行了测试。如预期的那样，较低的PD-L1表达导致较低的CD8+T细胞活化，与之前的两种测定一致(数据未显示)。
表15
结果表明，mAb2可以与表达不同水平的PD-L1的细胞结合。与细胞表达的PD-L1结合导致mAb2交联，从而使它们能够结合，聚集并激活T细胞上的CD137(如通过IL-2产生所测量)。观察到的激活水平与通过结合PD-L1进行交联的水平有关，其中与表达高水平hPD-L1(HEK.hPD-L1)的细胞结合的mAb2的激活程度更高，而PD-L1表达的水平较低引起较少的激活。
10.2在人原代CD8+T细胞活化试验中，与不同种群的HEK.hPD-L1细胞交联的抗人CD137/PD-L1 mAb2的活性
由于观察到不同细胞系的PD-L1表达水平会影响CD137的激活，因此决定进一步探索PD-L1表达对测试的mAb2的功能活性的影响。进行与实施例10.1中描述的测定相似的测定，其中改变HEK.hPD-L1与HEK.WT细胞的比例，以便在基于群体的方法中调节人PD-L1表达的水平。
将HEK.hPD-L1细胞和未转导以表达hPD-L1(HEK.WT)的HEK细胞以不同比例铺板，以提供图6中列出的全部HEK细胞中HEK.hPD-L1细胞的百分比(100％、50％、25％、12.5％、6.5％或0％)。将.HEK细胞以每孔2x 105的总HEK细胞接种到包被有抗CD3抗体(8μg/ml)的96孔平底板中的含有10％FBS(美国生命技术公司)，1X青霉素链霉素(美国生命技术公司，15140122)，1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-070)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco，M6250))的100μlT细胞培养基(RPMI培养基(Life Technologies，61870-044)中。孵育4小时后，一旦所有HEK细胞均粘附，将所有T细胞培养基移出，并替换为100μl含有浓度为5.0x 105细胞/ml的T细胞的T细胞培养基，从而得到5.0x 104细胞/孔。
该测定用抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2进行，但除此之外遵循实施例10.1中所述的方案。抗CD137阳性对照抗体G1-AA/20H4.9包含通过抗CH2抗体进行的其他交联。抗体G1-AA/4420用作阴性对照。
图6中的结果表明，随着HEK.hPD-L1细胞数量的增加，mAb2的活性也增加，如观察到的最大hIL-2浓度增加所说明的。在100％的HEK细胞群体为HEK.hPD-L1的情况下，实现了最大的交联，并观察到最高的最大hIL-2浓度。当通过抗CH2抗体最大程度地人为交联时，阳性对照抗体G1-AA/20H4.9也达到了相似的最大hIL-2浓度。
数据支持观察到系统中存在的PD-L1数量(通过测试在其细胞表面表达不同水平的PD-L1的细胞系或通过调节显示PD-L1的群体中的细胞数量来表示)控制mAb2的交联，从而决定了mAb2诱导的CD137激动水平。然而，即使仅存在低水平的PD-L1，mAb2仍然能够激动CD137。因此，预计mAb2在系统中表达PD-L1，并且存在表达CD137的活化T细胞时具有活性。随着系统中PD-L1含量的增加，预期的激动作用也会增加。与在低水平的CD137存在下仍然能够诱导CD137激动的mAb2相反，预计在低水平的PD-L1存在下单价结合CD137的CD137/PD-L1分子的效率较低。因为与PD-L1结合的分子可能相距太远而无法驱动CD137聚集，这在分子可以双价结合CD137的情况下不会出现问题，就像本发明的mAb2一样。
10.3抗人CD137/PD-L1 mAb2在人原代混合淋巴细胞反应测定中的活性
抗人CD137/PD-L1 mAb2的活性在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中进行测试(参见实施例5.3.4)。MLR分析使用了来自一个供体的CD4+T细胞和来自另一个供体的单核细胞衍生树突细胞(iDC)。由于免疫细胞含有生理水平的免疫检查点调节剂，因此MLR分析可用于证实人系统中的mAb2增强了T细胞活化。
如实施例5.3.4中所述产生扩增的CD4+T细胞和iDC。
实验前一天将扩增的T细胞解冻，用AIM V培养基(Gibco，12055-091)洗涤，并在37℃，5％CO2的AIM V培养基中孵育过夜。将表16中列出的抗CD137和抗PD-L1抗体以及抗人CD137/PD-L1 mAb2以4X最终浓度一式三份稀释在96孔圆底板(VWR，734-1797)中的50μlAIMV培养基中。包含LALA突变的抗巨细胞病毒(CMV)gH糖蛋白抗体，命名为MSL109(描述于WO1994/016730A1)被包括作为阴性对照。测试了从30nM到0.002nM的3倍稀释系列。将悬浮于50μl AIM V培养基中的1x104 iDC细胞和悬浮于100μl AIM V培养基中的1x105扩增的CD4+T细胞均添加至抗体稀释液中，并在37℃+5％CO2下孵育5天。包括以下阴性对照：仅CD4+T细胞、仅iDC、CD4+T细胞+iDC和仅AIM V培养基。收获上清液，将样品稀释(1:25)，并使用人IFNγELISA Ready-SET-Go！试剂盒(美国生命技术公司，88-7316-77)测量干扰素γ(IFN-γ)的浓度。使用带有Gen5软件，BioTek的读板器在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gen5软件，BioTek)。将人IFN-γ的浓度相对于抗体的对数浓度作图，并使用GraphPadPrism中的log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
抗人PD-L1抗体G1/S70在MLR分析中显示有效活性，EC50值为0.06nM，IFN-γ最大水平(Emax)为1135pg/ml(表16，代表图7A和7B)。EC50表示达到一半激动反应的mAb浓度，而E max是一个绝对值，表示测定中达到的IFN-γ最大浓度。如预期的那样，阴性对照G1-AA/MSL109抗体未观察到活性。阳性抗人CD137抗体对照G1-AA/20H4.9与抗hCH2抗体交联时，未引发任何活性，表明CD137表达可能较低，并且PD-L1阻滞在该测定法中压倒了CD137信号，因为PD-L1阻滞非常强烈。令人惊讶地，在该测定法中测试的所有抗人CD137/PD-L1 mAb2均显示出小于0.04nM的非常有效的EC50值和2626至3327pg/ml的高E max值。这表明，与PD-L1和CD137单克隆抗体中的任一种相比，mAb2在该分析中的效力有所提高。
表16
分子 类型 EC50(nM) Emax(pg/ml)
FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2 0.03 2654
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2 0.02 2626
FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2 0.02 2797
FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2 0.04 3128
FS22-053-017-AA/E12v2 mAb2 0.04 3327
G1-AA/20H4.9+抗人CH2 CD137 mAb N/A N/A
G1/S70 PD-L1 mAb 0.06 1135
G1-AA/MSL109 同种型 N/A N/A
仅CD4+T细胞 细胞对照 N/A N/A
仅iDC 细胞对照 N/A N/A
CD4+T细胞+单独的iDC 细胞对照 N/A N/A
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
按照上述相同的方法，在MLR中再次测试了抗人CD137/PD-L1 mAb2FS22-172-003-AA/E12v2的活性，但这一次针对每个组成部分(模拟Mab2形式的抗人FS22-172-003Fcab和抗PD-L1抗体G1-AA/E12v2)，以及两者的组合。
抗人PD-L1成分抗体G1-AA/E12v2在MLR分析中显示有效活性，EC50值为0.08nM，最大IFN-γ最大水平(E max)为12421pg/ml(表17；代表图7C)。如预期的那样，阴性对照G1-AA/4420抗体未观察到活性，模拟mAb2格式的抗人Fcab FS22-173-003未观察到活性。阳性抗人CD137抗体对照G1-AA/20H4.9与抗hCH2抗体交联时，未引发任何活性，表明CD137表达可能较低，并且PD-L1阻滞在该测定法中压倒了CD137信号，因为PD-L1阻滞非常强烈，如上所见。如预期的那样，抗人CD137/PD-L1 FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2显示出0.07nM的非常强的EC50值和17874pg/ml的高Emax值。这表明，与单独使用抗PD-L1和抗CD137单克隆抗体或两者组合使用的抗PD-L1和抗CD137单克隆抗体相比，mAb2在该测定中的效力有所提高。数据还显示，mAb2的效力高于分别包含mAb2的Fcab和Fab结合位点的两种抗体的组合。
表17
分子 类型 EC50(nM) Emax(pg/ml)
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2 0.07 17874
FS22-172-003-AA/HelD1.3 mAb2 N/A 3574
G1-AA/E12v2 PD-L1 mAb 0.08 12421
FS22-172-003-AA/HelD1.3+G1-AA/E12v2 组分组合 0.06 12301
G1-AA/20H4.9+抗人CH2 CD137 mAb 1.9 4307
G1-AA/E12v2+G1-AA/20H4.9+抗人CH2 单抗组合 0.14 17525
G1-AA/4420 同种型 N/A N/A
仅CD4+T细胞 细胞对照 N/A N/A
仅iDC 细胞对照 N/A N/A
CD4+T细胞+单独的iDC 细胞对照 N/A N/A
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
10.4抗人CD137/PD-L1 mAb2在抗原回收T细胞活化试验中的活性
抗人CD137/PD-L1 mAb2的活性通过测量对两个包含生理相关抗原的不同肽库的免疫应答，在抗原回收T细胞活化试验中进行了测试。一类库包含来自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和流感病毒(CEF)的MHC I类限制性肽段，用于测试CD8+T细胞活化，第二类库包含来自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、流感病毒和破伤风毒素(CEFT)的MHC II类限制性肽段，用于测试CD4+T细胞活化。由于使用的是来自单个供体的人PBMC，并且免疫细胞包含生理水平的免疫检查点调节剂，并且受到抗原呈递而不是抗CD3抗体与T细胞受体交联的刺激，因此测定结果证实了在人体系统中，mAb2增强了抗原驱动的T细胞活化。
将冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)解冻并计数，并将每孔1.9x105个细胞接种到96孔平底板中的含有10％胎牛血清(FBS)+1ng/ml IL-2+5ng/ml IL-7和1μg/ml CEF肽库(Thinkpeptides，货号PX-CEF-G)或1μg/ml CEFT肽库(Thinkpeptides，货号PX-CEFT-G)的200μl罗斯威尔公园纪念学院(RPMI)培养基中。将细胞在37℃，5％CO2孵育3天。3天后，通过添加22.5μl含10％FBS的新鲜RPMI补充培养基，并保持1ng/ml IL-2和1ng/ml IL-7。将细胞在37℃，5％CO2再孵育4天。
收集细胞并合并在一起，然后以每孔1x105细胞的浓度分布在96孔圆底板中的150μl含10％FBS+1ng/ml IL-2+5ng/ml IL-7和1μg/ml的CEF肽库或1μg/ml CEFT肽库的RPMI中。将mAb2在与接种细胞并添加到细胞中的相同培养基中稀释。
将阳性对照抗CD137抗体(G1-AA/20H4.9)和阳性对照抗PD-L1抗体(G1-AA/E12v2)在与接种细胞相同的培养基中以2X最终浓度从400nM开始稀释，其中包含400nM交联剂(抗人CH2抗体(MK1A6))，并进行1：5滴定。将50μl稀释的阳性对照抗体/交联剂混合液添加到细胞中，以达到200μl总测定体积和1X浓度的抗体。
该测定在37℃，5％CO2下孵育72小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用MSDU-PLEX试剂盒(Meso Scale Discovery，货号K15067L-2)进行分析。在MESO QuickPlex SQ120电化学发光读板仪器上使用1：5的样品稀释度读取板。使用MSD Discovery Workbench4.0软件计算出用于计算细胞因子浓度的标准曲线，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对反应方程式拟合上清液中细胞因子的浓度。
如表18和表19所示，抗人PD-L1抗体G1-AA/E12v2对CD4+和CD8+T细胞激活均显示活性，EC50值分别为0.06nM和0.04nM(Emax分别为65840pg/ml和86613pg/ml)。EC50表示达到一半激动反应的mAb浓度，而Emax是表示测定中达到的最大IFN-γ浓度的绝对值。阳性抗人CD137抗体对照G1-AA/20H4.9与抗hCH2抗体交联时，显示出CD8+T细胞活化的活性，EC50值为0.33nM，Emax值为116204pg/ml，但未引起任何CD4+T细胞活化的活性，表明CD137在CD8+T细胞上的表达可能比CD4+T细胞高。如预期的那样，阴性对照G1-AA/4420抗体未观察到活性。令人惊讶的是，mAb2在CD4+T细胞活化和CD8+T细胞活化检测中均显示出活化，EC50的值分别为0.08nM和0.03nM。mAb2可以结合PBMC表达的PD-L1，并且在两种细胞类型上都具有同等的PD-L1活性。此外，与PBMC表达的PD-L1结合导致mAb2交联，从而使它们能够结合，聚集并激活两种T细胞亚型上的CD137(如通过IFN-γ释放所测量)。经mAb2处理的T细胞释放的最大IFN-γ浓度高于任何阳性对照抗体，其CD4+T细胞活化和CD8+T细胞活化的Emax值分别为86680pg/ml和188242pg/ml。这表明在该试验中，mAb2的活性高于PD-L1和CD137单克隆抗体中的任一种。
表18–CEFT肽库抗原回收测定值(CD4+T细胞活化)
分子 类型 EC50(nM) Emax(pg/ml)
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2 0.08 86680
G1-AA/20H4.9+抗人CH2 CD137 mAb N/A 12965
G1-AA/E12v2 PD-L1 mAb 0.06 65840
G1-AA/4420 同种型 N/A N/A
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
表19–CEF肽库抗原回收测定值(CD8+T细胞活化)
分子 类型 EC50(nM) Emax(pg/ml)
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2 0.03 188242
G1-AA/20H4.9+抗人CH2 CD137 mAb 0.33 116204
G1-AA/E12v2 PD-L1 mAb 0.04 86613
G1-AA/4420 同种型 N/A N/A
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
10.5抗人CD137/PD-L1 mAb2在PD-L1阻滞小鼠DO11.10 T细胞活化试验中的活性
在小鼠DO11.10 T细胞活化试验中测试了FS22-172-003-AA/E12v2的活性，以研究PD-L1检查点的阻断活性。如实施例5.4中所述，使用DO11.10 OVA T细胞和LK35.2 B细胞杂交瘤细胞在IL-2释放测定中检测了对人PD-L1的功能活性。
结果显示在表20中。抗人CD137/PD-L1 mAb2在小鼠DO11.10 T细胞活化试验中显示强效活性，EC50值为1.27nM，这证实FS22-172-003-AA/E12v2可以结合PD-L1并阻断PD-L1与PD-1的相互作用。它的活性与阳性对照抗人PD-L1抗体G1-AA/E12v2和G1-AA/S70相似，表明当G1-AA/E12v2掺入FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2分子时，抗人PD-L1活性没有丧失。
表20–DO11.10 T细胞活化试验值(小鼠IL-2释放)
分子 类型 EC50(nM) Emax(pg/ml)
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2 1.27 424
G1-AA/E12v2 PD-L1 mAb 1.19 480
G1-AA/S70 PD-L1 mAb 1.4 498
G1-AA/HelD1.3 人IgG1同种型对照单抗 N/A N/A
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
实施例11：抗人CD137/PD-L1 mAb2在食蟹猴功能测定中的功能性交叉反应
11.1抗人CD137/PD-L1 mAb2在食蟹猴DO11.10 T细胞活化试验中的活性
通过活化的T细胞上的激动剂分子聚集的CD137引起T细胞活化和下游信号传导，导致但不限于IL-2产生。在T细胞活化试验中测试了抗人CD137/PD-L1 mAb2激活表达食蟹猴CD137的DO11.10细胞的能力。开发了使用DO11.10 T细胞的DO11.10 T细胞活化测定法，所述DO11.10 T细胞经工程改造以过表达食蟹猴CD137，并通过测量IL-2释放来评估T细胞活化。
表达全长猕猴CD137(SEQ ID NO：189)的DO11.10细胞，命名为“DO11.10.cCD137”，被生产并证实了食蟹猴CD137的表达，如实施例1.2中所述。
在此DO11.10 T细胞活化试验中测试了以下抗人CD137/PD-L1 mAb2：FS22-172-003-AA/lamG02v3，FS22-053-008-AA/E05v2，FS22-053-008-AA/E12v2，FS22-053-008-AA/G12v2，FS22-053-017-AA/E05v2，FS22-053-017-AA/E12v2，FS22-053-017-AA/G12v2，FS22-172-003-AA/E05v2，FS22-172-003-AA/E12v2，FS22-172-003-AA//G12v2。制备具有或不具有抗hCH2抗体(mG1/MK1A6)交联剂的mAb2或G1-AA/MOR7480.1阳性对照mAb的稀释液，并将其添加至96孔圆形底板(用0.1μg/ml抗CD3抗体(克隆17A2，BioLegend，100208)包被过夜，并接种2x105 HEK.cyPD-L1细胞用作基于细胞的交联细胞，该细胞过度表达食蟹猴PD-L1)中的DO11.10.cCD137细胞中。如实施例5.3.3中所述制备过表达食蟹猴PD-L1的细胞，使用实施例9.5中所述的食蟹猴PD-L1。孵育18小时后，收集上清液，并按照制造商的说明用小鼠IL-2ELISA试剂盒(eBioscience，88-7024-86)进行分析。使用带有Gens软件，BioTek的酶标仪在450nm处读板。从450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值(校正)。用于计算细胞因子浓度的标准曲线基于四参数对数曲线拟合(Gens软件，BioTek)。将mlL-2的浓度相对mAb2或基准mAb的对数浓度作图，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对响应方程拟合所得曲线。
在此测定法中测试的所有抗人CD137/PD-L1 mAb2在存在过表达食蟹猴PD-L1的HEK细胞的情况下均显示出活性以交联mAb2，这表明所有mAb2均能够结合食蟹猴PD-L1并结合和聚集食蟹猴CD137引起DO11.10 T细胞活化，其通过IL-2产生而读出(参见表21和图8)。仅当通过细胞表达的食蟹猴PD-L1交联时，所有抗人CD137/PD-L1 mAb2才表现出相似的活性，EC50值在0.06至0.11nM范围内，Emax值在8060至12300pg/ml IL-2范围内。在不存在食蟹猴PD-L1的情况下，当使用不表达食蟹猴PD-L1的HEK细胞进行测定时，由于没有交联而没有活性。已证明是食蟹猴交叉反应的阳性对照CD137抗体G1-AA/MOR7480.1(Fisher等人，2012)与抗CH2交联时在该测定法中显示出活性，然而，当与抗CH2交联时，所有抗人CD137/PD-L1 mAb2的EC50值和Emax值都较低，表明在食蟹猴CD137表达系统中具有交叉反应性和更好的活性。
表21
11.2抗人CD137/PD-L1 mAb2在食蟹猴原代混合白细胞反应测定中的活性
抗人CD137/PD-L1 mAb2的活性在食蟹猴混合淋巴细胞反应(MLR)分析中进行了测试。与实施例10.3中描述的人MLR测定相似，该测定测量在两个同种异体淋巴细胞群(相同物种但遗传上不同)之间发生的细胞内免疫测定应答。该测定使用来自一个食蟹猴个体的CD4+T细胞和来自另一个体的CD14+单核细胞。由于免疫细胞包含生理水平的免疫检查点调节剂，因此MLR分析可用于确认食蟹猴系统中的mAb2增强了T细胞活化。
CD4+T细胞的分离
通过Ficoll梯度分离从食蟹猴血液样品中分离PBMC。根据制造商的说明，使用非人类灵长类CD4+分离试剂盒(Miltenyi生物技术有限公司，130-091-102)分离CD4+T细胞。细胞在MLR测定中新鲜使用。
CD14+单核细胞的分离
按照制造商的说明，使用非人类灵长类CD14分离试剂盒(Miltenyi生物技术有限公司，130-091-097)从食蟹猕猴PBMC中分离未接触的单核细胞。单核细胞在MLR分析中新鲜使用。
MLR测定
将抗人CD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2和抗人PD-L1抗体G1-AA/E12v2以及同种型对照抗体G1-AA/4420以4X终浓度，一式三份稀释于96孔圆形底板中(VWR，734-1797)的50μl AIM V培养基中。包含LALA突变的抗鸡卵溶菌酶(HEL)抗体，称为HelD1.3(在实施例2.2中描述)，被包括作为阴性对照。测试了从300nM到0.02nM的4倍稀释系列。将悬浮于50μl AIM V培养基中的7.5x104单核细胞和悬浮于100μl AIM V培养基中的7.5x105CD4+T细胞均添加至抗体稀释液中，并在37℃+5％CO2下孵育6天。包括以下阴性对照：仅CD4+T细胞，仅CD14+单核细胞，CD4+T细胞+iDC和仅AIM V培养基。在第2天收获上清液，并使用MILLIPLEX MAP非人类灵长类细胞因子磁珠板(默克密理博，货号PRCYTOMAG-40K-01)测量白细胞介素2(IL-2)的浓度，并在第6天收获上清液，使用同一试剂盒测量的干扰素γ(IFN-γ)的浓度。在伯乐的Bio Plex 200机器上分析样品。
两种抗人CD137/PD-L1 mAb2均在此测定法中显示活性，表明mAb2能够结合食蟹猕猴PD-L1，随后在新分离的食蟹免疫细胞内源性水平上结合并聚集食蟹CD137，导致细胞因子释放，从而导致T细胞活化(参见图9)。
11.3抗人CD137/PD-L1 mAb2在食蟹猕猴原代PBMC分析中的活性
抗人CD137/PD-L1 mAb2的活性在食蟹猴原代PBMC分析中进行了测试。该测定法测量在已被抗CD3 mAb刺激的PBMC混合群体中发生的细胞内免疫测定法应答。该测定法使用来自一个食蟹猴个体的整个PBMC，并且由于免疫细胞包含生理水平的免疫检查点调节剂，因此PBMC测定法可用于确认在食蟹猴系统中mAb2增强了T细胞的活化。
基本按照实施例3.5中所述进行实验，但有以下差异：将阳性对照抗CD137抗体(G1-AA/MOR7480.1)在接种细胞的相同培养基中稀释，终浓度为2X从含有40nM交联剂(抗人CH2抗体(MK1A6))的40nM开始，进行1：4滴定。在不使用交联剂的情况下，以相同的方式稀释mAb2(FS22-172-003-AA/E12v2)和阴性对照抗体(G1-AA/HelD1.3)。将100μl稀释的抗体/交联剂混合物添加到细胞中，以达到200μl的总测定体积和1X浓度的抗体。该测定在37℃与5％CO2°一起温育3天。收集上清液，并按照制造商的说明，使用MSD V-Plex ProflamePanel 1(NHP)试剂盒(Meso Scale Discovery，货号K15056D-2)进行测定。在MESOQuickPlex SQ 120电化学发光读板仪器上读取板。使用MSD Discovery Workbench 4.0软件计算出用于计算细胞因子浓度的标准曲线，并使用GraphPad Prism中的log(激动剂)相对反应方程式拟合上清液中细胞因子的浓度。
图28A显示了在食蟹猴PBMC测定中从T细胞活化释放的IFN-γ的代表性图，而图28B显示了人PBMC测定中从T细胞活化释放出的IFN-γ的代表性的图。
当与抗hCH2抗体交联时，抗人CD137抗体G1-AA/MOR7480.1在两种PBMC测定中均显示出活性。如预期的那样，阴性对照G1-AA/HelD1.3抗体未观察到活性。出人意料的是，mAb2在两种PBMC测定中均显示出相似的激活，其中EC50的值分别为0.08nM和0.03nM。EC50指示达到一半激动反应的mAb浓度。因此，mAb2可以与PBMC表达的PD-L1结合，从而导致mAb2交联，从而使它们能够结合，聚集和激活两种物种T细胞上的CD137(通过IFN-γ释放所测量)。用mAb2处理的T细胞释放的IFN-γ的最大浓度高于任何阳性对照抗体，这表明mAb2在该试验中的活性高于抗CD137单克隆抗体。
实施例12：生产抗小鼠CD137 Fcab
为在体内小鼠模型中测试包含CD137抗原结合区的mAb2的活性，因为小鼠和人类CD137序列之间的序列同源性低导致无法获得小鼠人类交叉反应性Fcab的风险，产生并表征了特异性结合于小鼠CD137的Fcab。令人惊奇地，在产生小鼠CD137结合性Fcab之后，随后发现FS22-053-14能够与小鼠和人发生交叉反应。
12.1初始选择抗小鼠CD137 Fcab
为了选择与人CD137结合的Fcab，采用了酵母和噬菌体展示选择运动，类似于先前所述的对与人CD137结合的Fcab的选择(参见实施例2.1)。重组小鼠二聚体CD137或表达全长小鼠CD137的细胞用作抗原(参见实施例1)。
使用六个噬菌体库，在筛选中使用了内部mCD137-mFc-Avi抗原和表达mCD137的DO11.10细胞(DO11.10.mCD137)。通过噬菌体ELISA筛选所有第3轮重组抗原输出(576个克隆)和所有第3轮细胞选择输出(576个克隆)，以及与DO11.10.mCD137细胞的细胞结合。如实施例2.2中所述，将34个Fcab克隆命中物亚克隆并产生为HelD1.3mAb2。
展示了先前用于选择与人CD137结合的Fcab的人IgG1的CH1至CH3结构域的四个纯酵母文库用于选择与小鼠CD137结合的Fcab。总共进行了53轮独立选择，以鉴定抗小鼠CD137结合剂。内部生产的重组二聚体生物素化小鼠CD137(mCD137-mFc-Avi)抗原用于从初始的酵母库中选择结合物。
12.2从初始选择中抗小鼠CD137 Fcab的表征
抗小鼠CD137 Fcab对小鼠CD137的特异性以HelD1.3“模拟”mAb2形式进行了测试，并通过Octali QKe系统中的BLI通过测试Fcab与其他小鼠TNFRSF受体(CD40、OX40、GITR)的结合力进行了测量。链霉亲和素生物传感器(PALL ForteBio 18-5021)包被10ng/μl小鼠CD40、GITR、OX40受体(均从R&D Systems获得并使用赛默飞科技#21328的EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin试剂盒进行生物素化)。将模拟mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab在动力缓冲液(PALL 18-1092)中以1：1稀释至最终浓度至少1μM。将包被有抗原的传感器浸入mAb2溶液中180秒，然后在1×动力缓冲液中浸180秒。将每种TNFRSF受体的抗体用作阳性对照。Fcab克隆FS22m-055，FS22m-063，FS22m-066，FS22m-075，FS22m-135，FS22m-055，FS22m-063，FS22m-066不与任何测试的TNFRSF受体结合，因此证明了它们对小鼠CD137的特异性。
表达小鼠CD137序列(SEQ ID NO：187)的HEK.FRT.luc细胞是按照与先前在实施例2.3中描述的相同方法制备的。根据实施例2.3中所述的方法，使用该细胞系HEK.FRT.luc.mCD137筛选含有先前选择的抗小鼠CD137 Fcab的mAb2。测试了56个mAb2，其中29个NF-κB活性呈阳性。含有带有LALA突变的人IgG1 Fc(G1-AA/Lob12.3)的Lob12.3被用作阳性对照抗小鼠CD137 mAb，并显示出增加的发光强度，从而证实了该测定的有效性。HelD1.3(也包含具有LALA突变的人IgG1 Fc)被用作阴性对照人IgG同种型，以排除此试验中来自人IgG模拟Fab的干扰。在可能的情况下计算EC50，而忽略活性未达到稳定水平的mAb2，而推荐表现出经典S型活性动力学的mAb2。按EC50的顺序并根据L交联后的活性倍数变化对mAb2进行排序。选择FS22m-063是基于它在交联时具有最佳的EC50(1.44nM)，在交联时具有最高的活性变化倍数(27倍)。
12.3模拟mAb2形式的FS22m-063，FS22-053-014和FS22-053-017 Fcab在小鼠CD137 DO11.10 T细胞活化试验中的活性
还将FS22-053-017克隆(以HelD1.3模拟mAb2形式)与鼠CD137结合的Fcab克隆FS22m-063(也以HelD1.3模拟mAb2形式)以及亲本FS22-053-014(HelD1.3模拟mAb2形式)如实施例2.4中所述，在小鼠CD137 DO11.10 T细胞活化试验中相比较。mAb2分子与蛋白质L以4：1的摩尔比(mAb2：蛋白质L)交联。结果显示在表22中。
如预期的那样，当通过蛋白L交联时，所有测试的分子显示出活性(通过IL-2释放测量)，但是当未交联时则没有活性。选择与小鼠CD137结合的FS22m-063在分析中具有最佳活性，交联时EC50为0.39nM。FS22-053-14和FS22-053-017在测定中均具有活性，表明功能并未因诱变而丧失，尽管FS22-053-017的EC50活性略有降低，当与蛋白L交联时，与FS22-053-14相比约差了8倍。图10显示亲和力成熟的人和鼠类交叉反应性CD137 Fcab FS22-053-014和FS22-053-017，以及抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063，以HelD1.3模拟的mAb2形式与蛋白L交联时会激活CD137，从而在DO11.10 T细胞激活测定中导致mIL-2的释放。
表22
N/A-不适用，因为低信号无法确定EC50
实施例13：抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的体外表征
为了在体内小鼠模型中测试含有CD137抗原结合区的mAb2的活性，选择FS22m-063作为Fcab，该Fcab在T细胞活化试验中显示出最佳活性，如实施例12.3所述。
13.1抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的构建，表达和纯化
产生了抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2，其包含抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063以及PD-L1结合Fab区(来自US 8,217,149B2的克隆YW243.55.S70)。通过将含有AB、CD和EF环的抗PD-L1结合抗体的CH3的一部分用Fcab的相应区域代替，类似于实施例3.2中所述的方法来制备它们。这些PD-L1型mAb2在CH2结构域(AA)中包含LALA突变。已知在人IgG1的CH2结构域中引入LALA突变可减少Fcγ受体结合(Bruhns，P.，等人，(2009)和Hezareh M.，等人，(2001))。
FS22m-063-AA/PD-L1mAb2通过在HEK293-6E细胞中瞬时表达而产生，并使用mAbSelect SuRe蛋白A柱进行纯化。
13.2抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在小鼠原代OT-1T细胞活化试验中的活性
为了测试抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在尚未经过工程改造以过表达CD137的细胞上的活性，需要进行小鼠原代T细胞测定。活化的细胞毒性CD8+T细胞负责直接杀死癌细胞，并在其细胞表面表达CD137(Ye等人，2014)。已知CD137的聚集对于诱导下游信号传导和进一步的CD8+T细胞活化至关重要。因此，CD8+T细胞活化试验用于评估mAb2驱动CD137聚集和随后的下游信号传导能力。尽管尝试相同地复制人CD8+T细胞活化试验，但从幼稚C57BL/6或Balb/c脾脏分离的鼠CD8+T细胞未显示出该试验所需的活化潜能。因此，开发了另一种抗原特异性CD8+T细胞活化试验。CD8+T细胞活化是通过抗原刺激遗传修饰的OT-1T细胞而实现，所述OT-1T细胞是从C57BL/6OT-1小鼠(杰克逊实验室，货号003831)分离的，其具有对卵白蛋白肽257-264特异的T细胞受体，并通过IL-2的释放确定。
为了分离CD8+T细胞，从新鲜的OT-1小鼠脾脏分离脾细胞。简而言之，收集来自C57BL/6OT-1小鼠的每个脾脏并将其存储在PBS中，然后转移到6孔组织培养板的孔中，并用2根针机械破坏。使破裂的脾脏通过70μm细胞过滤器，并用PBS冲洗过滤器。然后通过离心沉淀细胞悬浮液，除去上清液，并根据制造商的说明通过添加10ml 1X红细胞裂解缓冲液(eBioscience，00-4300-54)裂解红细胞。将脾细胞以每孔10x106细胞接种到含有10nMSIINFEKL肽段(SEQ ID NO：194)InvivoGen，货号vac-sin)的T细胞活化培养基(IMDM，5％FCS，50μM 2-巯基乙醇，1X Penstrep)的6孔板中。将板在37℃和5％CO2中孵育48小时。48小时后，按照制造商的说明，使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi生物技术，130-104-075)分离CD8+T细胞。将分离并活化的CD8+T细胞铺板于补充有30U/ml IL-2(Peprotech，AF-200-02)的培养基(IMDM，5％FCS，50μM 2-巯基乙醇，1X Penstrep)中，并保持在接下来的3天中，每天的用量都低于1x106每毫升。扩增三天后，将细胞用于以下测定中。
与B16.F10细胞孵育，该细胞在IFN-γ存在下培养以诱导PD-L1表达，然后用SIINFEKL肽致敏，作为第一个信号来驱动OT-1T细胞的初始激活，随后用于评估抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70的功效。
简而言之，首先在20ng/ml鼠IFN-γ(Peprotech，货号AF-315-05-100UG)存在下培养B16.F10细胞，以诱导PD-L1表达。然后将这些细胞与500nM SIINFEKL肽在37℃下孵育一小时，然后以每孔1.5x 104细胞的密度接种在平底96孔板中的100μl培养基中。将每孔2x104OT-1细胞添加到50μl培养基中的B16.F10细胞中。从160nM开始以1：4滴定(4X终浓度)制备测试抗体(FS22m-063-AA/S70，G1-AA/S70，G1-AA/Lob12.3，FS22m-063-AA/HelD1.3)，然后将50μl抗体混合物添加到每个孔中，从而最终测定体积为200μl。该测定在37℃，5％CO2孵育3天。3天后，收集上清液，并根据制造商的说明进行mIFN-γ的ELISA(eBioscience，货号88-7314-88)。
如图11和表23所示，抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的效能最高，EC50值为0.003nM。该测定法表明mAb2具有很强的效力，CD137聚集导致激动性和CD8+T细胞活化增加。
表23
N/A–不适用，因为低信号无法确定EC50
已显示体外活性和优于阳性抗体对照的活性，因此需要在合适的体内同系小鼠肿瘤模型中测试抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2。
实施例14：抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的体内表征
14.1抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在CT26同系小鼠肿瘤模型中的活性
已经显示FS22m-063Fcab能够在体外驱动CD137的聚集和激活，因此需要测试在体内激活CD137的能力。
制备mAb2形式的FS22m-063Fcab以在小鼠中进行体内测试
使用与实施例3.2中产生模拟mAb2类似的方法，制备了包含抗小鼠CD137 Fcab，FS22m-063和PD-L1特异性Fab区的mAb2，并测试了其在CT26同系小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性。
对照：G1/Lob12.3，G1-AA/Lob12.3，G1/S70，G1-AA/4420。
通过将抗PD-L1抗体S70的可变重区(来自US 8,217,149 B2的克隆YW243.55.S70)连接到包含LALA突变的人IgG1(G1m17)恒定区，并且将来自S70抗体的可变轻链区通过人κJ区与人恒定区(Lm1)连接来生产体内实验的对照抗体。具有恒定区中有和没有LALA突变的人IgG1形式的抗小鼠CD137抗体Lob12.3(Taraban等人，2002)被用作抗小鼠CD137阳性对照抗体。通过用FS22m-063替换上述重组过的构建体的CH3结构域来生成mAb2，并将其命名为“FS22m-063-AA/S70”。
同系小鼠模型被认为是合适的鼠类系统，用于测试抑制治疗靶点的抗肿瘤作用，并已广泛用于验证人类治疗剂的开发。此实验使用了CT26同系肿瘤模型，因为已知CT26肿瘤具有高度免疫原性(Lechner等人，2013)，并且对抗CD137抗体的单药治疗有部分反应(Kim等人，2009)并表达PD-L1(Kleinovink，2017)。
在研究开始前，将8-10周龄重20-25g的Balb/c雌性小鼠(查尔斯河)，休息一周。所有的动物都植入了微型芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有12只小鼠。首先扩增，储存CT26结肠癌细胞系(S.Rosenberg，NIH)，然后使用IMPACT I方案通过IDEXX Bioresearch对病原体进行预筛查，结果显示不含病原体。每只动物接受在左侧皮下注射100μl DMEM中的0.1x 106个细胞。接种肿瘤细胞后7天，将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
FS22m-063-AA/S70 mAb2和对照抗体(G1/Lob12.3，G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)，G1/S70(阳性对照抗PD-L1)，G1-AA/4420(同种型对照))在DPBS+1mM精氨酸+0.05Tween 80中以20μg每只小鼠(终浓度为～1mg/kg)腹膜内注射到小鼠中。在肿瘤接种后第7、9和11天，通过200μl腹膜内(IP)注射，每只小鼠接受mAb2分子或对照抗体或两种对照抗体的组合。进行了精确的肿瘤测量，在所述日期进行了任何药物剂量的给药，并且在剩余的研究中对小鼠进行了密切观察。用卡尺进行肿瘤体积测量，以确定肿瘤的最长轴和最短轴。以下公式用于计算肿瘤体积：
L X(S2)/2
其中L＝最长轴；S＝最短轴
如图12所示，与使用某些对照抗体治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70 mAb2表现出显著的肿瘤生长抑制作用。通过使用混合模型分析比较所有组，显示了在整个研究时间内生长率的统计显著性。没有小鼠显示出明显的毒性迹象，并且所有治疗均被良好耐受，表明双特异性靶向CD137和PD-L1不会诱导明显的毒性。
将所有含有等于或小于62.5mm3的肿瘤的动物计为完全应答动物(见表24)。在研究结束时，有28％接受G1/Lob12.3(无LALA突变的抗CD137阳性对照)治疗的动物被视为无肿瘤，而7％接受G1-AA/Lob12(具有LALA突变的抗CD137阳性对照)和0％接受FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的小鼠视为无肿瘤。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导显著的肿瘤生长抑制。到研究结束时，没有用G1-AA/4420(IgG对照)或G1/S70(PD-L1阳性对照)治疗的动物无肿瘤。图17中的图显示了随时间推移每只动物的肿瘤生长测量值(mm3)。
表24：研究结束时在CT26同系肿瘤研究中的无肿瘤小鼠的数量和百分比。
化合物 研究结束时无瘤小鼠
G1-AA/4420 0/13(0％
G1-AA/Lob12.3 1/14(7％)
G1/S70 0/14(0％)
G1/Lob12.3 4/14(28％)
G1-AA/Lob12.3+G1/S70 1/14(7％)
FS22m-063-AA/S70 0/14(0％)
研究表明，在具有完全免疫系统功能的小鼠中，在CT26同系小鼠肿瘤模型中，CD137激动可能是通过PD-L1交联的结果，导致肿瘤的生长减少，可能是由于在肿瘤中CD8+T细胞的细胞毒性增加。
生存分析(图18和表25)显示，与同种型对照(G1-AA/4420)相比，FS22m-063-AA/S70诱导了明显的生存优势。表25显示了在用G1-AA/4420(IgG对照)，G1/S70加G1-AA/Lob12.3和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠皮下生长的CT26同系肿瘤模型中，每组的平均存活天数和成对统计分析(对数秩)的汇总。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70可显著提高存活率。FS22m-063-AA/S70显示相对G1/S70+G1-AA/Lob12.3的组合没有明显的生存优势。
表25：用每种化合物处理的动物的中位生存时间。
已经表明，在具有完全正常免疫系统的小鼠中，在CT26同系小鼠肿瘤模型中，CD137激动可能是通过PD-L1交联的结果，导致肿瘤的生长减少，可能是由于在肿瘤中CD8+T细胞的细胞毒活性增强所致，该研究重复进行了以下改变。
FS22m-063-AA/S70 mAb2和对照抗体G1-AA/Lob12.3(阳性对照抗CD137)，G1/S70(阳性对照抗PD-L1)，G1-AA/HelD1.3(同种型对照)在DPBS+1mM精氨酸+0.05Tween 80中以200μg/只小鼠(终浓度为～10mg/kg)腹膜内注射到小鼠中。在肿瘤接种后第7、9和11天，通过200μl腹膜内(IP)注射，每只小鼠接受mAb2分子或对照抗体或两种对照抗体的组合。
与对照抗体相比，FS22m-063-AA/S70治疗可导致显著的肿瘤生长抑制(在图19中显示为肿瘤体积平均值)。
生存分析(图20和表26)显示，与同种型对照(G1-AA/HelD1.3)和G1/S70相比，FS22m-063-AA/S70导致显著的生存优势。与G1-AA/Lob12.3相比，没有明显的生存优势。
表26显示了在用G1-AA/HelD1.3(IgG对照)，G1/S70(抗PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)和FS22m-063-AA/S70(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137Fcab FS22m-063)治疗的Balb/c小鼠皮下生长的CT26同系肿瘤模型中，每组的平均存活天数和成对统计分析(对数秩)的汇总。与IgG对照治疗的小鼠和CD137阳性对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中诱导了显著的存活。
表26：每组的平均生存天数以及CT26同系肿瘤模型的成对统计分析(对数秩)汇总。
14.2在CT26同系小鼠肿瘤模型中抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的剂量反应活性
抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70在CT26同系肿瘤模型中以每只小鼠20μg(～1mg//kg)每两天三次(q2dx3)的剂量显示出抗肿瘤活性。为了研究体内FS22m-063-AA/S70 mAb2的最佳剂量，采用一系列剂量(2、6、20和200μg/小鼠，相当于约0.1、0.3、1和10mg/kg)在肿瘤细胞接种后7天开始，按照上述q2dx3给药计划在CT26模型中测试。阴性对照抗体G1-AA/4420的给药方案为每只小鼠200μg(约10mg/kg)，给药计划相同。阳性对照抗体G1/Lob12.3的次优剂量为每只小鼠20μg(～1mg/kg)，并且给药计划相同。
按照与实施例14.1中所述相同的方案，在研究开始前将8-10周龄且每只体重20-25g的Balb/c雌性小鼠(查尔斯河)休息一星期。所有的动物都植入了微型芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有12只小鼠。首先扩增，储存CT26结肠癌细胞系(ATCC CRL-2638)，然后使用IMPACT I方案通过IDEXX Bioresearch对病原体进行预筛查，结果显示不含病原体。每只动物接受在左侧皮下注射100μl DMEM中的0.1x 106个细胞。接种肿瘤细胞后7天，将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
在研究的第7天，按照上述剂量范围，以最终浓度将FS22m-063-AA/S70 mAb2腹膜内注射到小鼠中。将对照抗体(G1/Lob12.3(CD137阳性对照抗体)，G1-AA/4420(同种型对照))腹膜内注射到小鼠体内，最终浓度分别为在DPBS+1mM精氨酸+0.05Tween 80中每只小鼠20μg(～1mg/kg)和每只小鼠200μg(～10mg/kg)。在接种肿瘤后第7、9和11天，每只小鼠通过200μl腹膜内(IP)注射接受mAb2分子或对照抗体(q2dx3)。进行了精确的肿瘤测量，在所述日期进行了任何药物剂量的给药，并且在剩余的研究中对小鼠进行了密切观察。用卡尺进行肿瘤体积测量，以确定肿瘤的最长轴和最短轴，如实施例14.1所述。
如图13A所示，当以～0.3mg/kg至最高～10mg/kg的剂量给药时，与同种型对照(G1-AA/4420)处理的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70 mAb2显示出显著的肿瘤生长抑制作用。使用混合模型分析比较所有组均显示统计学显著性。生存分析，图13B和表27，表明在CT26同系模型中，与同种型对照相比，FS22m-63-AA/S70 mAb2以高于0.3mg/kg的剂量给药时导致了具有统计学意义的生存优势。使用对数秩(Mantel Cox)检验进行统计显著性。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。没有小鼠表现出明显的毒性迹象，所有治疗均被良好耐受。
表27
NS表示无显著性
该研究表明，在具有完全免疫系统功能的小鼠中，在CT26同系小鼠肿瘤模型中，CD137激动可能是通过PD-L1交联的结果，导致肿瘤生长的剂量依赖性降低和生存期的剂量依赖性增加，可能是通过增加CD8+T细胞在肿瘤中的细胞毒活性。
14.3剂量反应作用机制
如实施例14.2中所述，在相同的CT26荷瘤小鼠模型中评估了抗小鼠CD137/PD-L1mAb2的作用机制。来自用FS22m-063-AA/S70以四种不同剂量(2、6、20和200μg/小鼠，相当于约0.1、0.3、1、10mg/kg)以及阴性对照抗体G1-AA/4420治疗的CT26荷瘤小鼠的血液、脾脏和肿瘤组织被测试了T细胞活化和增殖标志物，已知是CD137激动的下游作用(Fisher等人，2012)。
遵循与本实施例中所述相同的研究方案，在第9天(第一次给药后48小时)，第11天(第二次给药后48小时)和第15天(第三次和最后一次给药后96小时)通过心脏穿刺术将血液收集到含有EDTA的试管中，并通过解剖收集脾脏和肿瘤组织。通过标准的机械和酶法将脾脏和肿瘤组织分解成单细胞悬液。根据制造商的说明，将红细胞在红细胞裂解缓冲液(eBioscience，货号00-4300-54)中裂解一次。
根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(eBioscience货号00-4300-54)中裂解两次。
所有样品之后均进行相同处理。然后将细胞用PBS洗涤一次，并按照制造商的说明，用PBS以1：3000的稀释的可固定的存活力染料(英杰，货号65-0865-14)将样品染色。在存在Fc阻断剂(eBioscience货号14-0161-86，1：50)的情况下，使用抗体染色面板(除Ki67和FoxP3抗体以外的所有抗体)(下表28)在4℃下放置30分钟对细胞进行流式细胞术染色以检测细胞表面标记。然后根据制造商的说明将细胞固定并用eBioscience Foxp3染色试剂盒(eBioscience货号00-5523-00)透化。在Fc阻断剂(均以1：100稀释)存在的情况下，将细胞重悬于带有Ki67和Foxp3抗体的100μl通透缓冲液中，并在室温下于黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用通透缓冲液洗涤一次，并重悬于200μl PBS+0.5％BSA中。然后在BD Fortessa流式细胞仪中分析细胞。使用FlowJoX，Excel和GraphPad Prism分析数据。绘制的数据代表CD4+和CD8+T细胞亚群随时间观察到的T细胞丰度和增殖。根据Y轴上的群体描述，数据以亲本群体的百分比表示。
如图14B所示，在肿瘤和周围区域，CD8+：CD4+的百分比比率增加，有利于CD8+T细胞，这与抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2剂量的增加相一致，表明治疗导致的两个T细胞亚群平衡的变化可能是CD8+T细胞数量增加的结果。到第15天，CD8+T细胞上的增殖标志物随治疗剂量水平的增加而增加，在最高剂量水平下可见最高增殖。这将表明CD8+T细胞已经增殖，这是激活的迹象，并且可以解释增加的CD8+T细胞数量导致CD8+：CD4+T细胞比率增加。
总体而言，这项研究表明，增加抗小鼠CD137/PD-L1的剂量水平可导致肿瘤中更多的CD8+T细胞。CD8+T细胞(通常也称为细胞毒性淋巴细胞)的主要作用是通过以下三种主要机制杀死受感染或恶性的细胞：1)释放细胞因子，例如TNFα和IFN-γ，2)产生并释放细胞毒性颗粒，3)表达FasL。用抗小鼠CD137/PD-L1治疗后，肿瘤中更多CD8+T细胞的存在可能通过这些针对肿瘤的机制导致细胞毒活性，从而控制了肿瘤。
表28
靶标 抗体克隆 荧光团 公司 货号
CD45 30-F11 AF700 eBioscience 56-0451-82
CD3 145-2C11 PECy7 eBioscience 25-0031-82
CD4+ RM4-5 BUV395 BD生物科学 740208
CD8+ 53-6.7 BUV737 BD生物科学 564297
FoxP3 Fjk-16S PerCP-Cy5.5 英杰 45-5773-82
CD44 IM7 BV650 生物传奇 103049
CD62L MEL-14 Bv421 生物传奇 104435
CD69 H1.2F3 Bv510 生物传奇 104532
Ki67 16A8 647 生物传奇 652407
PD-L1 10F.9G2 Bv785 生物传奇 124331
IgG MK1A6 FITC 伯乐 MCA647F
活性 n/a 780 英杰 65-0865-14
n/a表示不适用
14.4抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在MC38同系小鼠肿瘤模型中的活性
同系小鼠模型被认为是用于测试抑制治疗靶点的抗肿瘤作用的合适的鼠类系统，并已广泛用于验证人类治疗剂的开发。此实验使用MC38同系肿瘤模型，因为已知MC38肿瘤具有高度免疫原性，并且对抗CD137抗体单一疗法有反应(Kocak等人，2006)，并表达PD-L1(Juneja等人，2017)。
在研究开始前，将9-10周龄，每只体重18至24g的C57BL/6雌性小鼠(杰克逊实验室)休息一星期。将所有动物植入微芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有12只小鼠。首先扩增，储存了MC38结肠癌细胞系(美国国家癌症研究所)，然后对病原体进行了预筛查，结果表明它们不含病原体。每只动物的右侧皮下注射在100μl无血清培养基(Dulbecco的改良伊格尔培养基)中的1x 106个细胞。接种肿瘤细胞后7天，将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
在DPBS+1mM精氨酸+0.05Tween 80中的FS22m-063-AA/S70 mAb2和对照抗体(G1-AA/Lob12.3(CD137阳性对照)，G1-AA/S70(阳性对照PD-L1)，G1-AA/4420(同种型对照))以每剂20μg的固定浓度腹膜内注射到小鼠体内。在肿瘤接种后第7、9和11天，每只小鼠通过200μl腹膜内(IP)注射接受mAb2分子或对照抗体。进行了精确的肿瘤测量，在所述日期进行了任何药物剂量的给药，并且在剩余的研究中对小鼠进行了密切观察。用卡尺进行肿瘤体积测量，以确定肿瘤的最长轴和最短轴。以下公式用于计算肿瘤体积：
L X(S2)/2
其中L＝最长轴；S＝最短轴
如图15所示，与用任何对照抗体处理的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70 mAb2表现出显著的肿瘤生长抑制作用。通过使用混合模型分析比较所有组，显示了在整个研究时间内增长率的统计显著性。如表29所示，出乎意料的是，在研究结束时，用FS22m-063-AA/S70mAb2治疗的所有小鼠均无肿瘤，相比之下，用抗PD-L1和CD137抗体组合(G1-AA/S70+G1-AA/Lob12.3)或仅PD-L1或CD137抗体治疗的12只小鼠中只有4只无肿瘤。图21中的图表显示了每只动物随时间推移的肿瘤生长测量值(mm3)。
表29
组 ％无肿瘤小鼠 无肿瘤小鼠数量
G1-AA/Lob12.3 16％ 2/12
G1-AA/4420 0％ 0/12
G1-AA/S70 16％ 2/12
G1-AA/S70+G1-AA/Lob12.3 33％ 4/12
FS22m-063-AA/S70 100％ 12/12
该研究表明，在具有完全免疫系统功能的小鼠中，在第二个同系肿瘤模型MC38中，该模型显示对1mg/kg的PD-L1 mAb的反应欠佳，而令人惊讶的是，1mg/kg的CD137/PD-L1mAb2诱导100％受治疗小鼠的肿瘤完全消退。
生存分析(图22和表30)显示了用3剂G1-AA/4420(同种型对照)，G1-AA/S70(抗PD-L1阳性对照)，G1-AA/Lob12.3(抗CD137阳性对照)，G1-AA/S70加G1-AA/Lob12.3和FS22m-063-AA/S70的组合(模拟PD-L1 mAb2形式的抗小鼠CD137 Fcab FS22m-063)治疗的每个治疗组中位生存期天数的汇总。表30还显示了成对统计分析(对数秩)。FS22m-063-AA/S70诱导了MC38同系肿瘤模型的完全存活，与IgG对照治疗的小鼠相比，研究结束时动物的存活率为100％(标记为“未确定”)。
表30：MC38肿瘤模型中位生存期
14.5抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在B16.F10同系小鼠肿瘤模型中的活性
使用B16.F10同系肿瘤模型测试抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2(FS22m-063-AA/S70)的体内抗肿瘤活性。这种模型被认为更难于使用治疗性抗体进行治疗(Baird，J.R.等人，2013)。抗体G1-AA/4420被用作研究的同种型对照。以前尚未显示B16.F10同系肿瘤模型对CD137激动剂抗体敏感。但是，从B16.F10肿瘤分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表达CD137(Curran.M.等人，2013)。
在研究开始前，将8-10周龄，每只体重20-25g的C57BL/6雌性小鼠(CharlesRiver)驯化1周。将所有动物植入微芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有10只小鼠。首先扩增，储存B16.F10黑色素瘤细胞系(ATCC货号CRL-6475)，然后使用IMPACT I方案通过IDEXXX Bioresearch对病原体进行预筛选，结果表明不含病原体。将B16.F10细胞从-150℃储存中解冻，并添加到T175组织培养瓶中含10％FCS(Gibco，10270-106)的20ml DMEM(Gibco，61965-026)中。每只动物的左侧皮下注射了1x106个细胞。
将200μl PBS中的20μg每种抗体注入小鼠(约1mg/kg)。每只小鼠从肿瘤细胞接种后第7天开始，每两天通过腹膜内(IP)注射接受3剂抗体。通过使用卡尺进行测量来确定肿瘤体积(如实施例14.1中所述)，并在所述当天进行任何药物给药，并且在试验的剩余部分中对小鼠进行密切观察。如实施例14.1中所述计算肿瘤体积。
当肿瘤的大小和状况达到人道终点时，该试验中止。使用混合模型分析在研究的整个过程中成对进行增长率的统计分析。
与同种型对照抗体G1-AA/4420相比，抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的肿瘤生长速度显著降低(图16)。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在B16.F10同系肿瘤模型中诱导了部分肿瘤生长抑制。图23中的图表显示了每只动物随时间推移的肿瘤生长测量值(mm3)。
生存分析(表31)显示了每组的中位生存期天数以及在用G1-AA/4420(同种型对照)和抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70治疗的C57BL/6小鼠中皮下生长的B16.F10同系肿瘤模型中的成对统计分析(对数秩)的汇总。与IgG对照治疗的小鼠相比，FS22m-063-AA/S70在B16.F10同系肿瘤模型中诱导生存期增加。
表31：B16.F10同系肿瘤模型中的中位生存期
这项研究表明，在具有完全正常免疫系统的小鼠中，众所周知难以治疗的B16.F10同系小鼠肿瘤模型中，CD137激动可能是通过PD-L1交联的结果，导致肿瘤的生长减少，可能是通过增加肿瘤中CD8+T细胞的细胞毒活性。
14.6抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在CT26同系小鼠荷瘤模型中的肝脏药理作用
在临床研究中，抗CD137 mAb对使用乌鲁单抗的实体瘤患者的治疗已导致与治疗相关的严重免疫事件，这已证明与所施用的乌鲁单抗的剂量有关。这些免疫事件的影响在肝脏表现为严重的肝毒性(Segal，N.H.等人，2017)。
在小鼠中进行的临床前机制工作显示出相似的肝毒性，其中使用CD137激动工具抗体对动物给药。这些研究表明，在产生的肝毒性中需要T细胞和CD137(Niu，L.等人，2007和Dubrot J等人，2010)。尽管知之甚少，但髓细胞与T细胞区室之间的相互作用也已被证明在引发导致肝损伤和肝毒性的炎症级联反应中起着重要作用(Bartkowiak，T等人，2018)。因此，这些动物模型对于临床在预测人类患者在施用其他CD137激动剂以及特别是CD137/PD-L1 mAb2后发生肝毒性的风险方面具有转化意义。
实施例14.1中所述的来自CT26同系肿瘤研究的小鼠在重复给药在PD-L1交联后具有CD137激动剂能力的FS22m-063-AA/S70 mAb2后未显示明显的毒性迹象。为了确定在这些动物中用～1mg/kg FS22m-063-AA/S70 mAb2(与抗肿瘤免疫活性相关)治疗后观察到的免疫激活是否与肝毒性相关，在尸检中取肝样本进行组织学评估。在最后一次给药后第4、7和14天对FS22m-063-AA/S70 mAb2和对照小鼠进行尸检(每组每个时间点三只小鼠)，肝脏样本用福尔马林固定并用石蜡包埋。然后切肝脏切片，并通过苏木精和曙红染色进行组织病理学评估，并由合格的病理学家对肝脏炎症和损伤的参数评分。组织制备和用苏木精和曙红进行组织病理学染色的方法是高度标准化的，并且是本领域众所周知的。
使用评分系统评估苏木精和曙红染色切片的肝脏病理。对肝脏进行病理学评分，其对应于肝细胞坏、门脉炎症、变性肝细胞和增加的有丝分裂。在每组中显示最小，轻度，中度和显著影响的小鼠的频率显示在表32中。
FS22m-063-AA/S70 mAb2处理的动物的肝脏病理最小。特别是：
·最小至轻度肝细胞坏死，实质内混合淋巴细胞浸润
·门静脉道中的混合炎症细胞极少至轻微
·最小变性肝细胞
·最小至显著的有丝分裂增加
表32：肝脏发现
如用抗CD137激动剂抗体的其他实例所观察到的，这些发现不被认为代表严重的肝毒性。
鉴于在小鼠中进行临床前研究与对用CD137激动剂治疗的人类患者进行严重肝毒性的风险评估具有相关性，这些结果表明，通过PD-L1结合的交联介导CD137激动的mAb2在以治疗剂量治疗的人类患者中诱导肝毒性的风险较低。
14.7抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2在CT26同系小鼠肿瘤模型中的肿瘤和外周受体占有率及药效学作用
在实施例14.3中，抗小鼠CD137-PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70在多次给药后显示出增加肿瘤中CD8+T细胞的能力。为了研究靶标在T细胞上的结合程度，PD-L1阻滞以及FS22m-063-AA/S70对T细胞增殖的影响，在相同的CT26同系肿瘤模型中进行了单剂量药效学研究，如实施例14.1所述。
抗体G1-AA/4420用作对照。如实施例14.1中所述产生用于体内实验的抗小鼠CD137/PD-L1mAb2和对照抗体。
按照与实施例14.1中所述相同的方案，在研究开始之前，将8-10周龄，每只体重20-25g的Balb/c雌性小鼠(查尔斯河)休息一星期。将所有动物植入微芯片，并赋予唯一的标识符。该研究包括3个给药组，分别在8个时间点(2h，6h，24h，48h，72h，96h，120h，192h)以两种剂量之一接受对照抗体或mAb2。每个给药组具有64只小鼠(每个时间点8只小鼠)。首先扩增，储存CT26结肠癌细胞系(S.Rosenberg，NIH)，然后使用IMPACT I方案通过IDEXXBioresearch对病原体进行预筛查，结果显示不含病原体。每只动物接受左侧皮下注射100μl DMEM的1x 105个细胞。接种肿瘤细胞后7天，将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
在肿瘤接种后第11天，每只小鼠通过100μl静脉内(IV)注射接受测试样品。在接受mAb2的组中，将FS22m-063-AA/S70 mAb2静脉注射到小鼠中，每只小鼠20μg或200μg(终浓度分别为～1mg/kg和～10mg/kg)，而在接受对照抗体的组中，将在DPBS+1mM精氨酸+0.05Tween 80中的G1-AA/4420(同种型对照)，以200μg/只小鼠(终浓度为～10mg/kg)静脉注射到小鼠中。
评估了抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2给药后肿瘤和外周血受体的结合以及药效学反应。测试了来自用每种剂量的FS22m-063-AA/S70(抗mCD137/PD-L1 mAb2)和阴性对照抗体G1-AA/4420处理的CT26荷瘤小鼠的肿瘤组织和血液的抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2结合的阳性T细胞、T细胞增殖和未被抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2结合的游离PD-L1。还评估了总CD137表达。
按照制造商的说明，通过尾静脉取血将血液(100μl)收集到EDTA包被的毛细管中，并在红细胞裂解缓冲液(eBioscience货号00-4300-54)中裂解两次。
通过解剖收集肿瘤组织，并通过标准机械和酶促方法将其分解成单细胞悬液。按照制造商的说明，将已分解的肿瘤组织中残留的任何红细胞在红细胞裂解缓冲液(eBioscience，货号00-4300-54)中裂解一次。
按照制造商的说明，将细胞用PBS洗涤一次，并用在PBS中以1：3000稀释的固定生存力染料(英杰，货号65-0865-14)对样品染色。在存在Fc阻断剂(eBioscience货号14-0161-86：1：50)的情况下，使用抗体染色板(除Ki67和FoxP3抗体以外的所有抗体)(下表33)在4℃下放置30分钟对细胞进行细胞表面标志物染色以进行流式细胞术。然后根据制造商的说明将细胞固定并用eBioscience Foxp3染色试剂盒(eBioscience货号00-5523-00)透化。在Fc封闭的情况下，将细胞重悬于含有Ki67和Foxp3抗体的100μl通透缓冲液中，并在室温黑暗中孵育30分钟。然后将细胞用通透缓冲液洗涤一次，并重悬于200μl PBS+0.5％BSA中。然后在BD Fortessa流式细胞仪中分析细胞。使用FlowJoX，Excel和GraphPad Prism分析数据。
图24显示了从血液或肿瘤中分离出的CD4+和CD8+T细胞的百分比，这些T细胞在样品中与mCD137/PD-L1 mAb2结合的抗IgG抗体呈阳性。如图24所示，静脉注射后2小时，T细胞对结合的抗mCD137/PD-L1 mAb2呈阳性。结合的时间存在剂量依赖性，在给予1mg/kg剂量96小时后，从血液和肿瘤分离的T细胞上不再检测到抗mCD137/PD-L1 mAb2，而施用10mg/kg剂量后120小时至192小时之间仍检测到抗mCD137/PD-L1 mAb2。如预期的那样，观察到对照抗体的最小背景染色。与从血液中分离的T细胞相比，从肿瘤中分离出的对mCD137/PD-L1mAb2呈阳性的T细胞群在开始时就更大。这可能表明从肿瘤中分离的T细胞上CD137或PD-L1的靶标表达水平更高，因此与血液中的T细胞相比，抗mCD137/PD-L1更有效地靶向肿瘤。
图25显示Ki67检测作为从血液和肿瘤分离的CD4+和CD8+T细胞上T细胞增殖的标记。如图25所示，当与对照抗体比较时，抗mCD137/PD-L1 mAb2导致Ki67阳性外周血T细胞的频率增加，表明其具有药效学(PD)响应，即在两种剂量水平下，两个靶点都在某个点参与或已经参与导致T细胞活化，如增殖反应所示。由于肿瘤浸润性T细胞暴露于炎性环境，因此从肿瘤分离的T细胞群显示出更高的Ki67阳性增殖性T细胞频率。相反，血液中Ki67阳性T细胞的基线频率要低得多。CD4+和CD8+T细胞似乎都对抗mCD137/PD-L1处理有反应，表明这两种细胞上的CD137都被mAb2结合，并通过结合PD-L1聚集在一起，导致CD137信号传导和T细胞活化，导致增殖增加。对于CD8+T细胞，该作用似乎更强，这与表达高于CD4+T细胞的CD137水平的CD8+T细胞一致。数据表明，在1mg/kg时可达到最大作用，尽管在10mg/kg时反应持续时间更长，这可能与更长的受体占用时间有关，因此在更高剂量水平下靶标结合时间更长。受体占用时间越长，PD反应越大。在肿瘤中，T细胞已经高度增殖，并且随着时间的推移，观察到CD4+和CD8+T细胞的增殖幅度呈剂量相关性增加。
将来自对照抗体G1-AA/4420处理的小鼠样品掺入100nM抗mCD137/PD-L1 mAb2，并作为100％PD-L1受体结合的对照。缺乏竞争性抗mPD-L1抗体(克隆10F.9G2，参见表33)的结合可以证明这一点。在整个研究过程中，以10mg/kg的剂量用抗mCD137/PD-L1治疗的小鼠的肿瘤和血液样本中显示出接近完全的PD-L1阻断作用，如图26所示显示100％PD-L1受体占用。在用1mg/kg抗mCD137/PD-L1治疗的小鼠的样本中，在约72h后血液和肿瘤中存在的T细胞上的PD-L1受体结合减少，血液中存在的T细胞上的PD-L1受体的结合降低比肿瘤中存在的T细胞更快。该数据表明，PD-L1的肿瘤特异性阻断作用具有抑制PD-1/PD-L1轴和在肿瘤中将抗mCD137/PD-L1 mAb2保留比在血液中更长的时间，有望使药物的全部作用持续存在于肿瘤中，同时限制外周非靶向作用的优点。
总体而言，这项研究表明，增加抗小鼠CD137/PD-L1的剂量可导致肿瘤中CD8+和CD4+T细胞的活化和增殖，通过与mAb2结合的细胞数量，通过mAb2的PD-L1受体结合以及增加的Ki67表达作为增殖的标志来衡量。在外周血中还观察到活化和增殖的CD8+和CD4+细胞，它们是抗小鼠CD137/PD-L1诱导的活性的进一步标记。这种剂量依赖性T细胞活化支持先前在实施例14中在施用抗小鼠CD137/PD-L1后观察到的肿瘤生长抑制。
CD8+T细胞(通常也称为细胞毒性淋巴细胞)的主要作用是通过以下三种主要机制杀死受感染或恶性的细胞：1)释放细胞因子(例α如TNF和IFN-γ)，2)产生并释放细胞毒性颗粒，以及3)Fas配体表达。用抗小鼠CD137/PD-L1治疗后，肿瘤中更多CD8+T细胞的存在有望通过这些针对肿瘤的机制导致细胞毒活性，从而控制肿瘤。尽管CD8+T细胞是导致肿瘤细胞杀伤的重要细胞毒性T细胞，但CD4+T细胞通过识别II类MHC分子呈递的肽，被激活并产生IFN-γ和TNF-α在适应性免疫中发挥关键作用，两者均可介导预防肿瘤(Zanetti，2015，JI，2015)。
表33
n/a表示不适用
实施例15：抗人CD137/PD-L1 mAb2在小鼠中的药代动力学特征
为了确定抗CD137/PD-L1 mAb2在小鼠中的药代动力学特征，向没有MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠(参见实施例14.4)(即无肿瘤的小鼠)以4种剂量(25mg/kg，10mg/kg，3mg/kg和1mg/kg)给药100μl抗CD137/PD-L1 mAb2并监测384小时。
在2、6、24、48、96和384小时进行约20μl全血的微量采样，并进行处理以分离出约5μl血清。使用Gyros蛋白质技术的Gyrolab xPlore系统确定每个时间点存在的抗CD137/PD-L1 mAb2的量。使用Gyrolab Bioaffy 1000CD(产品编号P0004253)和生物素化的山羊抗人IgG-(重链和轻链)猴吸附抗体(剑桥生物科学，产品编号A80-319B)作为捕获抗体，山羊抗人抗体647(剑桥生物科学，产品编号2040-31)作为检测抗体，进行三明治测定。使用在8000-0.07ng/ml范围内生成的标准曲线确定样品浓度，并根据需要在RexxipAN缓冲液中对样品进行稀释(Gyros产品编号P0004994)。根据制造商的建议使用其他缓冲液。绘制了每个时间点的单个小鼠(每个时间点三只小鼠)的平均样品浓度(图27)。
图27显示了抗CD137/PD-L1 mAb2的药代动力学特征，表明mAb2在小鼠中的末端清除率与标准人IgG相当(Bergman等人，1998)。
实施例16：抗人CD137/PD-L1 mAb2在食蟹猴中的药代动力学/药效学响应和耐受 性
进行了初步剂量范围研究，以评估在食蟹猴中对抗人CD137/PD-L2 mAb2的药代动力学/药效学(PK/PD)反应和耐受性。简而言之，FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2是通过静脉内(IV)输注以单剂量或重复剂量的方式向食蟹猴施用的。评估了标准毒理学参数，例如体重、食物消耗、临床观察、血液学和血液化学，以评估研究期间的耐受性。
根据临床化学和组织病理学结果确定，FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2的终末半衰期约为6天，一般每周耐受达30mg/kg。在第1天，在所有动物中观察到血清sPD-L1水平升高(指示直接的靶标结合和细胞活化)，在输注结束后168小时达到峰值，此后水平下降，与FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2全身性下降的水平一致。
与评估同系小鼠肿瘤模型中抗小鼠CD137/PD-L1 mAb2的PD反应的研究结果一致(实施例15)，在CD4+和CD8+中央记忆和效应记忆T细胞中也观察到药物相关的细胞增殖和活化增加，这是通过Ki67表达增加测量的。观察到NK细胞的动力学相似，并且CD4+调节性T细胞(CD4+ FoxP3+)的相对百分比和绝对计数有中等但短暂的增加。
综上所述，这些结果强烈表明，抗人FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2在食蟹猴中具有有效的体内药理活性，可耐受30mg/kg。此外，生成的PK/PD数据与替代分子(FS22m-063-AA/S70)数据一致，从而加强了在临床环境中使用FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2的理论依据。
序列表
E12v2 mAb(Kabat)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–SYGIS(SEQ ID NO：1)
VH CDR2–WISAYSGGTNYAQKLQG(SEQ ID NO：2)
VH CDR3–DLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：3)
VL CDR1–RASQSIGNRLA(SEQ ID NO：4)
VL CDR2–EASTSET(SEQ ID NO：5)
VL CDR3–QQSYSTPYT(SEQ ID NO：6)
E12v2(IMGT)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–GYPFTSYG(SEQ ID NO：7)
VH CDR2–ISAYSGGT(SEQ ID NO：8)
VH CDR3–ARDLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：9)
VL CDR1–QSIGNR(SEQ ID NO：10)
VL CDR2–EAS(SEQ ID NO：11)
VL CDR3–QQSYSTPYT(SEQ ID NO：6)
E12v2 mAb的VH结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
IMGT CDR(粗斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)。
E12v2 mAb的VH域核酸序列(SEQ ID NO：13)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACCCCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGC
E12v2 mAb的VL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：14)
IMGT CDR(粗斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)。
E12v2 mAb的VL结构域核酸序列(SEQ ID NO：15)
GACATCCAGATGACGCAGAGCCCGTCTACCCTGTCCGCCTCCGTGAGAGATCGCGTGATCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGTCCATCGGAAACCGCTTGGCGTGGTACCAGCACAAGCCTGGGAAGGCTCCGAAGCTGCTCATCTACGAAGCCTCGACTTCGGAGACTGGTGTCCCTAGCCGGTTCAGCGGATCGGGATCAGGGACCGATTTCACTCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCATATTCCACCCCGTACACCTTCGGACAAGGCACCAAGCTCGAAATCAAG
G1-AA/E12v2 mAb(带有LALA)的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)；LALA突变(粗体和下划线)
G1-AA/E12v2 mAb的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：17)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
E05v2 mAb(Kabat)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–SYGIS(SEQ ID NO：1)
VH CDR2–WISAYSGGTNYAQKLQG(SEQ ID NO：2)
VH CDR3–DLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：3)
VL CDR1–RASQSISGRLA(SEQ ID NO：18)
VL CDR2–EASNLES(SEQ ID NO：19)
VL CDR3–QQSYSTPRVT(SEQ ID NO：20)
E05v2(IMGT)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–GYTFTSYG(SEQ ID NO：21)
VH CDR2–ISAYSGGT(SEQ ID NO：8)
VH CDR3–ARDLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：9)
VL CDR1–QSISGR(SEQ ID NO：22)
VL CDR2–EAS(SEQ ID NO：11)
VL CDR3–QQSYSTPRVT(SEQ ID NO：20)
E05v2 mAb的VH结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：23)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
E05v2 mAb的VH域核酸序列(SEQ ID NO：24)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGC
E05v2 mAb的VL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：25)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
E05v2 mAb的VL结构域核酸序列(SEQ ID NO：26)
GACATTCAGATGACCCAATCCCCGTCCACGCTGAGCGCCTCCGTCGGTGATCGCGTGACAATCACTTGTCGGGCGTCGCAGTCCATCTCTGGAAGGCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCTCCCAACCTCCTTATCTACGAAGCCAGCAACCTGGAGTCCGGAGTGCCTAGCCGGTTCAGCGGATCAGGGTCCGGTACCGAGTTCACCCTGACCATTTCCTCGCTCCAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCCTATTCAACTCCGCGCGTGACCTTCGGCCAGGGCACTAAGGTCGAAATCAAA
G1-AA/E05v2 mAb(带有LALA)的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)；LALA突变(粗体和下划线)
G1-AA/E05v2 mAb和FS22-172-003-AA/E05v2和FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2的 轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：28)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
G12v2 mAb(Kabat)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–SYGIS(SEQ ID NO：1)
VH CDR2–WISAYSGGTNYAQKLQG(SEQ ID NO：2)
VH CDR3–DLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：3)
VL CDR1–RASQSISGRLA(SEQ ID NO：18)
VL CDR2–EASNLES(SEQ ID NO：19)
VL CDR3–QQSYSWPRT(SEQ ID NO：29)
G12v2(IMGT)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–GYTFTSYG(SEQ ID NO：21)
VH CDR2–ISAYSGGT(SEQ ID NO：8)
VH CDR3–ARDLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：9)
VL CDR1–QSISGR(SEQ ID NO：22)
VL CDR2–EAS(SEQ ID NO：11)
VL CDR3–QQSYSWPRT(SEQ ID NO：29)
G12v2 mAb的VH结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：23)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
G12v2 mAb的VH域核酸序列(SEQ ID NO：24)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGC
G12v2 mAb的VL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：30)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
G12v2 mAb的VL结构域核酸序列(SEQ ID NO：31)
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACGCTGTCCGCAAGCGTGGGGGACAGAGTGACCATCACTTGCCGCGCCTCACAATCCATCAGCGGACGCTTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAACCTTCTGATCTACGAAGCCTCGAACCTGGAGTCAGGCGTCCCTTCGCGGTTCTCTGGCTCCGGTTCCGGAACTGAGTTCACCCTCACCATCTCGTCCCTGCAACCGGAAGATTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCGTACTCCTGGCCCCGGACATTCGGACAGGGAACCAAAGTCGAGATTAAG
G1-AA/G12v2 mAb(带有LALA)的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)；LALA突变(粗体和下划线)
G1-AA/G12v2 mAb和FS22-172-003-AA/G12v2和FS22-053-008-AA/G12v2 mAb2的 轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：33)
VH域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
lambdav3/lam-G02v3 mAb(Kabat)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–SYGIS(SEQ ID NO：1)
VH CDR2–WISAYSGGTNYAQKLQG(SEQ ID NO：2)
VH CDR3–DLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：3)
VL CDR1–TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：34)
VL CDR2–EVTNRPS(SEQ ID NO：35)
VL CDR3–SSFKRGSTLVV(SEQ ID NO：36)
lambdav3/lam-G02v3(IMGT)的CDR氨基酸序列
VH CDR1–GYTFTSYG(SEQ ID NO：21)
VH CDR2–ISAYSGGT(SEQ ID NO：8)
VH CDR3–ARDLFPTIFGVSYYYY(SEQ ID NO：9)
VL CDR1–SSDVGGYNY(SEQ ID NO：37)
VL CDR2–EVT(SEQ ID NO：38)
VL CDR3–SSFKRGSTLVV(SEQ ID NO：36)
lambdav3/lam-G02v3 mAb的VH结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：23)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
lambdav3/lam-G02v3 mAb的VH结构域核酸序列(SEQ ID NO：24)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGC
lambdav3/lam-G02v3 mAb的VL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：41)
IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
lambdav3/lam-G02v3 mAb的VL结构域核酸序列(SEQ ID NO：42)
CAGTCGGCCCTTACTCAACCCGCGTCAGTCTCCGGTAGCCCCGGACAGTCCATCACGATTTCGTGCACCGGAACCAGCAGCGATGTCGGGGGATACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGTTCCCGGGAAAGGCCCCTAAGCTGATGATCTTCGAAGTCACTAACAGACCTTCCGGAGTGTCGGACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGACAACACTGCGAGCCTGACCATCTCGGGCCTGCAAGCCGAGGACGAAGCCGAGTACTACTGTAGCTCATTCAAGCGCGGTTCCACCCTCGTGGTGTTCGGCGGTGGCACTAAGCTCACCGTGCTGGGA
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAb(带有LALA)的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
VH结构域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)；LALA突变(粗体和下划线)
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAb的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：44)
VL域(斜体)；IMGT CDR(粗体和斜体)；Kabat CDR(斜体和下划线)
HCDR1(IMGT)的替代定义(SEQ ID NO：45)
GYX1FTSYG
其中X1为P或T
LCDR1(Kabat)的替代定义(SEQ ID NO：46)
RASQSIX2X3RLA
其中X2为S或G，X3是N或G
LCDR2(Kabat)的替代定义(SEQ ID NO：47)
EASX4X5EX6
其中X4为T或N；X5为S或L；X6为T或S
LCDR3(Kabat)的替代定义(SEQ ID NO：48)
QQSYSX7PX8X9T
其中X7为T或W；X8为缺失或R；X9为Y，R或V
LCDR1(IMGT)的替代定义(SEQ ID NO：49)
QSIX10X11R
其中X10为G或S；X11为N或G
LCDR3(IMGT)的替代定义(SEQ ID NO：50)
QQSYSX12X13X14X15T
其中X12为缺失或T；X13为T，W或P；X14为P或R；X15为Y或R
IgG1(Kabat)的HFW氨基酸序列
HFW1–EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYX16FT(SEQ ID NO：51)
其中X16为P或T
HFW2–WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO：52)
HFW3–RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO：53)
HFW4–WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：54)
IgG1(IMGT)的HFW氨基酸序列
HFW1–EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：55)
HFW2–ISWVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO：56)
HFW3–NYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYC(SEQ ID NO：57)
HFW4–WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：54)
κ轻链(Kabat)的LFW氨基酸序列
LFW1–DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITC(SEQ ID NO：58)
LFW2–WYQHKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：59)
LFW3–GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：60)
LFW4–FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：61)
κ轻链(IMGT)的LFW氨基酸序列
LFW1–DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRAS(SEQ ID NO：62)
LFW2–LAWYQHKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：63)
LFW3–TSETGVPSRFSGSGSGTGTTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：64)
LFW4–FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：61)
λ轻链(Kabat)的LFW氨基酸序列
LFW1–QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO：65)
LFW2–WYQQFPGKAPKLMIF(SEQ ID NO：66)
LFW3–GVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEAEYYC(SEQ ID NO：67)
LFW4–FGGGTKLTVL(SEQ ID NO：68)
λ轻链(IMGT)的LFW氨基酸序列
LFW1–QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT(SEQ ID NO：69)
LFW2–VSWYQQFPGKAPKLMIF(SEQ ID NO：70)
LFW3–NRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEAEYYC(SEQ ID NO：71)
LFW4–FGGGTKLTVL(SEQ ID NO：68)
WT CH3域结构环的氨基酸序列
WT AB环–RDELTKNQ(SEQ ID NO：72)
WT CD环–SNGQPENNY(SEQ ID NO：73)
WT EF环–DKSRWQQGNV(SEQ ID NO：74)
WT CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：75)
带下划线的为AB，CD和EF环
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：76)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
具有LALA突变的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：77)
下划线为LALA突变
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
具有LALA突变和P114A突变的CH结构2域的氨基酸序列(SEQ ID NO：176)
下划线为LALA突变；粗体和下划线为P114A突变
PPY基序的氨基酸序列(SEQ ID NO：78)
PPY
FS22-053-008CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-008第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-008第二序列–DYWRWLE(SEQ ID NO：80)
FS22-053-008 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
FS22-053-008 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：82)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTACTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-053-009CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-009第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-009第二序列–EHTRWLD(SEQ ID NO：83)
FS22-053-009CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
FS22-053-009CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：85)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAACATACTAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-011CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-011第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-011第二序列–DYWRWTD(SEQ ID NO：86)
Fcab FS22-053-011 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-011 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：88)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAGGTGGACTGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-017CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-017第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-017第二序列–YHWRWLE(SEQ ID NO：89)
Fcab FS22-053-017 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-017 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：91)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACTCTGCCCCCTTCACGCGACGAACTCAATCCGCCCTACCTGTTCTCCAACCAAGTCTCCCTGACCTGTCTTGTGAAGGGTTTCTACCCATCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAGAACAACTATAAGACTACCCCGCCTGTGCTGGACTCGGACGGCAGCTTCTTCTTGTACTCCAAACTGACCGTGTACCACTGGCGGTGGCTGGAAGGGAACGTGTTTAGCTGCTCCGTCATGCATGAAGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTCTCGCTCTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-014CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-014第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-014第二序列–YHWRWLD(SEQ ID NO：92)
Fcab FS22-053-014 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-014 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：94)
GGACAGCCTCGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTACCATTGGAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
Fcab FS22-053-010CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-010第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-010第二序列–DYMRWLD(SEQ ID NO：95)
Fcab FS22-053-010 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：96)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-010 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：97)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATGAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-012CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-012第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-012第二序列–DHMRWLE(SEQ ID NO：98)
Fcab FS22-053-012 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：99)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-012 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：100)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATATGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-013CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-013第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-013第二序列–GYERWLE(SEQ ID NO：101)
Fcab FS22-053-013 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-013 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：103)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGTTACGAAAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-015CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-015第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-015第二序列–DHWRWLQ(SEQ ID NO：104)
Fcab FS22-053-015 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：105)
下划线为第一和第二顺序
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-015 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：106)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATTGGAGGTGGCTGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-053-016CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-016第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-016第二序列–DYIRWLN(SEQ ID NO：107)
Fcab FS22-053-016 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：108)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053-016 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：109)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATCAGGTGGCTGAACGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
FS22-053“CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-053-008第一序列–NPPYLFS(SEQ ID NO：79)
FS22-053-008第二序列–YYNRWQD(SEQ ID NO：110)
FS22-053 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：111)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-053 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：112)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTATTATAACAGGTGGCAGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-172-003 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-003第一序列–PYIIPPY(SEQ ID NO：113)
FS22-172-003第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-003 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：115)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-003 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：116)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
Fcab FS22-172-002CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-002第一序列–PFQMPPY(SEQ ID NO：117)
FS22-172-002第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-002 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：118)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-002 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：119)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCCAGATGCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-172-004CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-004第一序列–NYIYPPY(SEQ ID NO：120)
FS22-172-004第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-004 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：121)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-004 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：122)
GGACAGCCTCGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACTACATCTACCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
Fcab FS22-172-001CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-001第一序列–PFVMPPY(SEQ ID NO：123)
FS22-172-001第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-001 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：124)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-001 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：125)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCGTTATGCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-172-005CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-005第一序列–QQVYPPY(SEQ ID NO：126)
FS22-172-005第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-005 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：127)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-005 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：128)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCAGCAGGTTTACCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-172-006CH3域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172-006第一序列–RKYYPPY(SEQ ID NO：129)
FS22-172-006第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172-006 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：130)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172-006 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：131)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTACCCGCCGTACAACCAGCTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Fcab FS22-172 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS22-172第一序列–RKYYPPY(SEQ ID NO：129)
FS22-172第二序列–GADRWLE(SEQ ID NO：114)
Fcab FS22-172 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：132)
下划线为第一和第二序列
GQPREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS22-172 CH3结构域的核酸序列(SEQ ID NO：133)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTACCCGCCGTACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：134)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：135)
GAAGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAAAGACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACCCCTTTACCTCCTACGGCATCTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCTGGATCTCCGCTTATTCCGGCGGCACCAATTACGCCCAGAAACTGCAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCTCCACCGCCTACATGGAACTGCGGTCCCTGAGATCTGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATCTGTTCCCCACCATCTTCGGCGTGTCCTACTACTACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGACCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGAACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACCTTGCCTCCATCTCGGGACGAGCTGCCCTACATCATCCCTCCATACAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTTCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGGCGCCGACAGATGGCTGGAAGGGAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGC
FS22-172-003-AA/E12v2和FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)
DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRASQSIGNRLAWYQHKPGKAPKLLIYEASTSETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：136)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCACACTGTCCGCCTCTGTGCGGGACAGAGTGATCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGTCCATCGGCAACAGACTGGCCTGGTATCAGCACAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACGAGGCCTCCACATCTGAGACAGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACAGCACCCCTTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCAAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO： 137)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：138)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGCGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：139)
GACATTCAGATGACCCAATCCCCGTCCACGCTGAGCGCCTCCGTCGGTGATCGCGTGACAATCACTTGTCGGGCGTCGCAGTCCATCTCTGGAAGGCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCTCCCAACCTCCTTATCTACGAAGCCAGCAACCTGGAGTCCGGAGTGCCTAGCCGGTTCAGCGGATCAGGGTCCGGTACCGAGTTCACCCTGACCATTTCCTCGCTCCAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCCTATTCAACTCCGCGCGTGACCTTCGGCCAGGGCACTAAGGTCGAAATCAAAAGAACCGTGGCAGCCCCATCGGTGTTTATCTTCCCGCCCTCGGACGAACAGCTGAAGTCAGGCACTGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAATTTCTACCCGCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTGCAGTCCGGAAACAGCCAGGAGTCAGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCCACTTATTCCCTGTCCTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGGCTTTCGTCGCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGC
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/G12v2 mAb2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：140)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-172-003-AA/G12v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：141)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGCGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-172-003-AA/G12v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：142)
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACGCTGTCCGCAAGCGTGGGGGACAGAGTGACCATCACTTGCCGCGCCTCACAATCCATCAGCGGACGCTTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAACCTTCTGATCTACGAAGCCTCGAACCTGGAGTCAGGCGTCCCTTCGCGGTTCTCTGGCTCCGGTTCCGGAACTGAGTTCACCCTCACCATCTCGTCCCTGCAACCGGAAGATTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCGTACTCCTGGCCCCGGACATTCGGACAGGGAACCAAAGTCGAGATTAAGCGGACTGTGGCGGCTCCTAGCGTGTTCATCTTTCCCCCGTCCGACGAACAGCTGAAGTCCGGTACCGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAATTTCTACCCGCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTGCAGTCCGGAAACAGCCAGGAGTCAGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCCACTTATTCCCTGTCCTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGGCTTTCGTCGCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGC
带有LALA突变的FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：143)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：144)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACCCCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGCGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTACTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：145)
GACATCCAGATGACGCAGAGCCCGTCTACCCTGTCCGCCTCCGTGAGAGATCGCGTGATCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGTCCATCGGAAACCGCTTGGCGTGGTACCAGCACAAGCCTGGGAAGGCTCCGAAGCTGCTCATCTACGAAGCCTCGACTTCGGAGACTGGTGTCCCTAGCCGGTTCAGCGGATCGGGATCAGGGACCGATTTCACTCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCATATTCCACCCCGTACACCTTCGGACAAGGCACCAAGCTCGAAATCAAGCGGACTGTCGCCGCACCTTCCGTGTTCATTTTCCCACCCTCCGACGAACAGCTGAAATCGGGTACAGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAATTTCTACCCGCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTGCAGTCCGGAAACAGCCAGGAGTCAGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCCACTTATTCCCTGTCCTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGGCTTTCGTCGCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGC
具有LALA突变的FS22-053-008-AA/E05v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：146)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：147)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGCGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTACTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：148)
GACATTCAGATGACCCAATCCCCGTCCACGCTGAGCGCCTCCGTCGGTGATCGCGTGACAATCACTTGTCGGGCGTCGCAGTCCATCTCTGGAAGGCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCTCCCAACCTCCTTATCTACGAAGCCAGCAACCTGGAGTCCGGAGTGCCTAGCCGGTTCAGCGGATCAGGGTCCGGTACCGAGTTCACCCTGACCATTTCCTCGCTCCAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCCTATTCAACTCCGCGCGTGACCTTCGGCCAGGGCACTAAGGTCGAAATCAAAAGAACCGTGGCAGCCCCATCGGTGTTTATCTTCCCGCCCTCGGACGAACAGCTGAAGTCAGGCACTGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAATTTCTACCCGCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTGCAGTCCGGAAACAGCCAGGAGTCAGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCCACTTATTCCCTGTCCTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGGCTTTCGTCGCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGC
具有LALA突变的FS22-053-008-AA/G12v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：149)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-053-008-AA/G12v2 mAb2重链的核酸序列(SEQ ID NO：150)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTCAAGAGGCCTGGAGCGTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCTCAGGATACACCTTCACTTCGTACGGGATTTCCTGGGTCCGCCAAGCACCGGGTCAAGGCTTGGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCGTATTCCGGGGGAACCAACTACGCTCAAAAGCTGCAGGGTCGCGTGACCATGACCACCGATACCTCCACCTCAACGGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGCGGAGCGACGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCCGGGACCTGTTCCCCACTATCTTCGGAGTGTCGTACTACTACTACTGGGGCCAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCGAGCGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTACTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT
FS22-053-008-AA/G12v2 mAb2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：151)
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCGAGCACGCTGTCCGCAAGCGTGGGGGACAGAGTGACCATCACTTGCCGCGCCTCACAATCCATCAGCGGACGCTTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAACCTTCTGATCTACGAAGCCTCGAACCTGGAGTCAGGCGTCCCTTCGCGGTTCTCTGGCTCCGGTTCCGGAACTGAGTTCACCCTCACCATCTCGTCCCTGCAACCGGAAGATTTCGCCACCTACTACTGCCAACAGTCGTACTCCTGGCCCCGGACATTCGGACAGGGAACCAAAGTCGAGATTAAGCGGACTGTGGCGGCTCCTAGCGTGTTCATCTTTCCCCCGTCCGACGAACAGCTGAAGTCCGGTACCGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAATTTCTACCCGCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTGCAGTCCGGAAACAGCCAGGAGTCAGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCCACTTATTCCCTGTCCTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAAGGGCTTTCGTCGCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGC
具有LALA突变的FS22-053-017AA/E12v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-053-017AA/E05v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：153)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-053-017AA/G12v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：154)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的FS22-172-003AA/lam-G02v3重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：155)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
带有LALA突变的FS22-172-003AA/S70重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：156)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
S70的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：157)
VL结构域(斜体)；
具有LALA突变的FS22-172-003AA/HelD1.3重链的AA序列(SEQ ID NO：158)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
HelD1.3的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：159)
VL结构域(斜体)
具有LALA突变的FS22m-063AA/S70重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：160)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
带有LALA突变的FS22m-063AA/HelD1.3重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：161)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的G1-AA/E12v2重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：162)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
G1/S70重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：163)
VH结构域(斜体)
具有LALA突变的G1-AA/S70重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：164)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
G1/4420重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：165)
VH结构域(斜体)
4420的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：166)
VL结构域(斜体)
具有LALA突变的G1-AA/4420重链的AA序列(SEQ ID NO：167)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的G1-AA/HelD1.3重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：168)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
具有LALA突变的G1-AA/MLS109重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：169)
VH结构域(斜体)；LALA突变(加粗下划线)
MLS109轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：170)
VL结构域(斜体)
FS22-172-003CH3结构域AB和EF环的氨基酸序列
AB环–RDELPYIIPPYNQ(SEQ ID NO：171)
EF环–GADRWLEGNV(SEQ ID NO：172)
FS22-53-008CH3结构域AB和EF环的氨基酸序列
AB环–RDELNPPYLFSNQ(SEQ ID NO：173)
EF环–DYWRWLEGNV(SEQ ID NO：174)
FS22-053-017CH3结构域AB和EF环的氨基酸序列
AB环–RDELNPPYLFSNQ(SEQ ID NO：173)
EF环–YHWRWLEGNV(SEQ ID NO：175)
G1/280_02_G02重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：177)
VH结构域(斜体)
G1/280_02_G02轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：178)
VL结构域(斜体)
人PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：179)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
人PD-L1细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：180)
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER
小鼠PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：181)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
小鼠PD-L1细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：182)
FTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTH
食蟹猴PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO：183)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
食蟹猴PD-L1细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：184)
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTH
人CD137的氨基酸序列(SEQ ID NO：185)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
人CD137细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：186)
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELQKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ
小鼠CD137的氨基酸序列(SEQ ID NO：187)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
小鼠CD137细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：188)
VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVL
食蟹猴CD137的氨基酸序列(SEQ ID NO：189)
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
食蟹猴CD137细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：190)
LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ
G1/HelD1.3重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：191)
VH结构域(斜体)
OVA肽(SEQ ID NO：192)
ISQAVHAAHAEINEAGR
人B7-H3细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：193)
ILEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMT
SIINFEKL肽(SEQ ID NO：194)
SIINFEKL
人PD-L1-rCD4-His的氨基酸序列(SEQ ID NO：195)
信号肽(下划线)；PD-L1的细胞外结构域(常规字体)；C末端大鼠CD4+(结构域3和4)(斜体)；抗原和编码NotI限制性酶切位点的C末端融合之间的连接点(粗体和下划线)；C端六组氨酸标签(粗体)
人PD-L1-Fc-His的氨基酸序列(SEQ ID NO：196)
信号肽(下划线)PD-L1的细胞外结构域(常规字体)人IgG1 Fc(斜体)抗原和编码NotI限制性位点的C末端融合之间的连接(粗体和下划线)C末端六组氨酸标签(粗体)
小鼠PD-L1-rCD4-His的氨基酸序列(SEQ ID NO：197)
信号肽(下划线)；PD-L1的细胞外结构域(常规字体)；C末端大鼠CD4+(结构域3和4)(斜体)；抗原和编码NotI限制性酶切位点的C末端融合之间的连接(粗体和下划线)；C末端六组氨酸标签(粗体)
小鼠PD-L1-Fc-His的氨基酸序列(SEQ ID NO：198)
信号肽(下划线)PD-L1的细胞外结构域(常规字体)人IgG1 Fc(斜体)抗原和编码NotI限制性位点的C末端融合之间的连接(粗体和下划线)C末端六组氨酸标签(粗体)
人PD-L1-His-Avi的氨基酸序列(SEQ ID NO：199)
PD-L1的细胞外结构域(常规字体)C末端六组氨酸标签(斜体)Avi标签(粗体)
密码子优化的编码FS22-172-003-AA/E12v2重链的核酸序列(SEQ ID NO：32)
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密码子优化的编码FS22-172-003-AA/E12v2轻链的核酸序列(SEQ ID NO：39)
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Claims (17)

1.与程序性死亡配体1(PD-L1)和CD137结合的抗体分子，其包含
(a)基于互补决定区(CDR)的PD-L1抗原结合位点；和
(b)位于所述抗体分子的CH3结构域中的CD137抗原结合位点；
其中所述抗体分子包含如下所示的VH结构域和VL结构域：
(i)分别为SEQ ID NO：12和14；
(ii)分别为SEQ ID NO：23和25；或
(iii)分别为SEQ ID NO：23和30；和
其中CD137抗原结合位点包含分别位于CH3结构域的AB和EF结构环中的第一序列和第二序列，其中第一和第二序列分别如SEQ ID NO：113和114，SEQ ID NO：79和80，或SEQ IDNO：79和89所示。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述抗体分子包含：
分别在SEQ ID NO：12和14中列出的VH结构域和VL结构域。
3.根据权利要求1所述的抗体分子，其中
(i)所述第一序列位于抗体分子的CH3结构域的14和17位之间；和/或
(ii)其中所述第二序列位于抗体分子的CH3结构域的91和99位之间；以及
其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案。
4.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述抗体分子包含如SEQ ID NO：115，SEQ IDNO：81或SEQ ID NO：90所示的CH3结构域。
5.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述抗体分子包含如下所示的重链和轻链：
(i)分别为SEQ ID NO：134和17；
(ii)分别为SEQ ID NO：137和28；
(iii)分别为SEQ ID NO：140和33；
(iv)分别为SEQ ID NO：143和17；
(v)分别为SEQ ID NO：146和28；
(vi)分别为SEQ ID NO：149和33；
(vii)分别为SEQ ID NO：152和17；
(viii)分别为SEQ ID NO：153和28；或
(ix)分别为SEQ ID NO：154和33。
6.根据权利要求5中所述的抗体分子，其中所述抗体分子分别包含在SEQ ID NO：134和17中列出的重链和轻链。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子的CH3结构域在CH3结构域序列的直接C末端还包含另外的赖氨酸残基(K)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子已经被修饰以减少或消除抗体分子的CH2结构域与一种或多种Fcγ受体的结合。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子不结合一个或多个Fcγ受体。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子与免疫细胞上的CD137和肿瘤细胞表面结合的PD-L1的结合导致所述免疫细胞上的CD137聚集。
11.一种或多种核酸分子，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体分子。
12.一种或多种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸分子。
13.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的载体。
14.一种根据权利要求1至10中任一项所述的抗体分子的制造方法，其包括在所述抗体分子的产生条件下培养根据权利要求13所述的重组宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括分离和/或纯化所述的抗体分子。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体分子和药学上可接受的赋形剂。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体分子在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途。
CN201980046597.4A 2018-07-12 2019-07-12 结合pd-l1和cd137的抗体分子 Active CN112423845B (zh)

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