DE68926163T2

DE68926163T2 - Mutierte subtilisingene

Info

Publication number: DE68926163T2
Application number: DE68926163T
Authority: DE
Inventors: Dorrit Aaslyng; Sven Branner; Sven Hastrup; Villy Jensen; Fanny Norris; Leif Norskov Norskov-Lauridsen; Steffen Petersen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1988-01-07
Filing date: 1989-01-06
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2009-01-07
Also published as: WO1989006279A1; JPH03503477A; JPH10113179A; EP0396608B1; EP1538204A2; EP0675196A3; US5741694A; DK176102B1; US6808913B2; DK175697B1; DE68926163D1; US20030175933A1; JP2726799B2; US6908991B2; EP0396608A1; EP1538204A3; EP1498481A1; JPH0675504B2; ATE136329T1; US20030186378A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, das Änderungen in den chemischen Eigenschaften des Enzyms Subtilisin ergibt. Mutationen an spezifischen Nucleinsäuren des Subtilisin-Gens führen zu Aminosäuresubstitutionen und infolgedessen zu einer veränderten Enzymfunktion. Einige dieser mutanten Enzyme weisen physikalische Eigenschaften auf, die für gewerbliche Anwendungen, insbesondere in der Waschmittelindustrie, wertvoll sind, da sie Subtilisin liefern, das stabiler gegenüber einer Oxidation ist, eine stärkere Protease-Aktivität besitzt und ein verbessertes Waschvermögen aufweist.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1. Bacillus-Proteasen

Enzyme, die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen oder (gleichwertig) Peptidasen bezeichnet (vgl. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, W. H. Freeman and Company, San Francisco, Kapitel 3). Bakterien der Spezies Bacillus sezernieren zwei extrazelluläre Protease-Spezies, eine neutrale oder Metalloprotease und eine alkalische Protease, die als Serin-endopeptidase wirkt und als Subtilisin bezeichnet wird. Die Sekretion dieser Proteasen ist mit dem bakteriellen Wachstumszyklus verbunden, wobei die stärkste Expression der Protease während der stationären Phase, in der auch die Sporulation stattfindet, erfolgt. Joliffe et al. (J. Bacteriol, Bd. 141 (1980), S. 1199-1208) weisen darauf hin, daß Bacillus-Proteasen eine Funktion im Zellwand-Turnover besitzen.

2.2. Subtilisin

Bei einer Serin-protease handelt es sich um ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, wobei sich ein essentieller Serinrest am aktiven Zentrum befindet (White, Handler und Smith, 1973, "Principles of Biochemistry", 5. Aufl., McGraw-Hill Book Company, NY, S. 271-272).
Die Serin-proteasen weisen Molekulargewichte im Bereich von 25 000 bis 30 000 auf. Sie werden durch Diisopropylfluorophosphat gehemmt, sind aber im Gegensatz zu Metalloproteasen resistent gegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (obgleich sie bei hohen Temperaturen durch Calciumionen stabilisiert werden). Sie hydrolysieren einfache terminale Ester und besitzen eine ähnliche Aktivität wie eukaryontisches Chymotrypsin, das ebenfalls eine Serin-protease ist. Der alternative Ausdruck "alkalische Protease" bezieht sich auf das hohe pH-Optimum der Serin-protease vom pH- Wert 9,0 bis 11,0 (bezüglich eines Übersichtsartikels wird auf Priest, Bacteriological Rev., Bd. 41 (1977), S. 711-753 verwiesen).
Ein Subtilisin ist eine durch gram-positive Bakterien oder Pilze gebildete Serin-protease. Eine große Vielzahl von Subtilisinen wurde identifiziert. Die Aminosäuresequenzen von mindestens acht Subtilisinen wurden bestimmt. Dazu gehören sechs Subtilisine aus Bacillus-Stämmen, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus und Mesenterico-peptidase (Kurihara et al., J. Biol. Chem., Bd. 247 (1972), S. 5629-5631; Stahl und Ferrari, J. Bacteriol., Bd. 158 (1984), S. 411-418; Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811-819; Jacobs et al., Nucl. Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 8913-8926; Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 421-430; Svendsen et al., FEBS Lett., Bd. 196 (1986), S. 228- 232) und zwei Pilz-Subtilisine, nämlich Subtilisin-thermitase aus Thermoactinymyces vulgaris (Meloun et al., FEBS. Lett., Bd. 183 (1985), S. 195-200) und Proteinase K aus Tritirachium album (Jany und Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 485-492).
Subtilisine sind physikalisch und chemisch gut charakterisiert. Außer der Kenntnis der Primärstruktur (Aminosäuresequenz) dieser Enzyme wurden mehr als 50 Röntgenstrukturanalysen mit hoher Auflösung von Subtilisin durchgeführt, die die Substratbindung, den Übergangszustand, die Produkte und drei unterschiedliche Protease-Inhibitoren beschreiben und die strukturellen Konsequenzen natürlicher Variationen definieren (Kraut, Ann. Rev. Biochem., Bd. 46 (1971), S. 331-358). Willkürliche und positionsgerichtete Mutationen des Subtilisin-Gens ergaben sich aus der Kenntnis der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Enzyms und haben zu den Informationen über die katalytische Aktivität von Subtilisin, über dessen Substratspezifität und über dessen tertiäre Struktur und dergl. beigetragen (Wells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1981), S. 1219- 1223; Wells et al., Phil. Trans, R. Soc. Lond. A., Bd. 317 (1986), S. 415-423; Hwang und Warshel, Biochem., Bd. 26 (1987), S. 266-2673; Rao et al., Nature, Bd. 328 (1987), S. 551-554).
Eine Veröffentlichung (Estell et al., J. Biol. Chem., Bd. 260 (1985), S. 6518-6521) beschreibt die positionsgerichtete Mutagenese, die zur Substitution des Methionins in der 222-Position von Subtilisin BPN' durch sämtliche 19 Aminosäuren verwendet wird. Es wurde festgestellt, daß bei der Substitution die relativen spezifischen Aktivitäten gegenüber dem Substrat N-Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid unterschiedliche Werte von 138% bis 0,3% in bezug zu Wildtyp-Subtilisin BPN' aufweisen, wobei die Cys-Substitution die höchste Aktivität zeigte. Die Ala- und Ser-Substitutionen ergaben eine Aktivität von 53% bzw. 35% in bezug auf das Wildtyp-Enzym. Zum gleichen Zeitpunkt wurde festgestellt, daß Ala- und Ser-Substituenten eine verbesserte Beständigkeit gegen eine Oxidation durch H&sub2;O&sub2; aufweisen.

2.3. Gewerbliche Anwendungen von Subtilisinen

Subtilisine werden in der Industrie im großen Umfang eingesetzt, insbesondere in Waschmittelpräparaten, da sie sich zur Entfernung von proteinartigen Flecken eignen. Um wirksam zu sein, müssen diese Enzyme nicht nur unter Waschbedingungen Aktivität besitzen, sondern sie müssen bei der Lagerung auch mit den übrigen Waschmittelbestandteilen verträglich sein. Beispielsweise kann Subtilisin in Kombination eingesetzt werden mit Amylasen, die gegen Stärken aktiv sind; Cellulasen, die Cellulosematerialien abbauen; Lipasen, die gegenüber Fetten aktiv sind; Peptidasen, die gegenüber Peptiden aktiv sind; und Ureasen, die gegenüber Urinflecken wirksam sind. Es muß nicht nur gewährleistet sein, daß die Formulierung die übrigen Enzyme vor einem Abbau durch Subtilisin schützt, sondern das Subtilisin muß auch in bezug auf Oxidationsvermögen, Calcium-Bindungseigenschaften, Waschwirkung und hohem pH-Wert von nicht-enzymatischen Waschmittelbestandteilen stabil sein. Die Fähigkeit des Enzyms, in Gegenwart dieser Bestandteile seine Stabilität zu erhalten, wird häufig als Wascheignung bezeichnet.
US-3 770 587 betrifft chemische Modifikationen von proteolytischen Enzymen und stellt Vergleiche zwischen Ausgangsenzymen und modifizierten Enzymen in Waschmitteln an, um die Brauchbarkeit der modifizierten proteolytischen Enzyme zu ermitteln.

3. Zusamenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, von denen einige zu Veränderungen der chemischen Eigenschaften des Enzyms Subtilisin führen. Mutationen werden an bestimmten Nucleinsäuren des Subtilisin-Gens erzeugt. In verschiedenen speziellen Ausführungsformen besitzen die mutanten Enzyme veränderte chemische Eigenschaften, zu denen (ohne Beschränkung hierauf) eine erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation, ein erhöhtes proteolytisches Wirkungsvermögen und eine verbesserte Wascheignung gehören.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch (ohne Beschränkung hierauf) die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für Protease-Mutanten, die sich von der Bacillus lentus-Variante Subtilisin 309 ableiten.
Eine positionsgerichtete Mutation kann in wirksamer Weise mutante Subtilisin-Enzyme erzeugen, die für eine Vielzahl von gewerblichen Anwendungen, insbesondere auf dem Gebiet der Waschmittel- und Nahrungsmitteltechnologie, maßgeschneidert werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil (ohne Beschränkung hierauf) Mutanten des Subtilisin 309- Gene, wobei eine verbesserte Stabilität gegenüber Oxidation, eine erhöhte Protease-Aktivität und/oder eine verbesserte Wascheignung gewährleistet sind.

3.1. Abkürzungen

A = Ala = Alanin
V = Val = Valin
L = Leu = Leucin
I = Ile = Isoleucin
P = Pro = Prolin
F = Phe = Phenylalanin
W = Trp = Tryptophan
M = Met = Methionin
G = Gly = Glycin
S = Ser = Serin
T = Thr = Threonin
C = Cys = Cystein
Y = Tyr = Tyrosin
N = Asn = Asparagin
Q = Gln = Glutamin
D = Asp = Asparaginsäure
E = Glu = Glutaminsäure
K = Lys = Lysin
R = Arg = Arginin
H = His = Histidin

4. Beschreibung der Figuren

Fig. 1 erläutert die Insertion einer Untergruppe von Fragmenten mit einem Längenbereich von 1,5 kb bis 6,5 kb, erzeugt durch partiellen Verdau von Bacillus lentus-Stamm 309-DNA mit Sau 3A-Restriktionsendonuclease, in das mit BamHI geschnittene Plasmid pSX50. Die beiden erhaltenen Plasmide, nämlich pSX86 und pSX88, die das Subtilisin 309-Gen in entgegengesetzten Orientierungen enthalten, sind ebenfalls abgebildet.
Fig. 2 erläutert die Insertion von Bacillus lentus-Stamm 147-DNA- Fragmenten in das Plasmid pSX56. Ein partieller Verdau der Stamm 147-DNA- wurde unter Verwendung von Sau 3A-Restriktionsendonuclease durchgeführt. Fragmente im Größenbereich von 1,5 bis 6,5 kb wurden sodann in das mit BamHI gespaltene Plasmid pSX56 eingebunden. Das Produkt pSX94 enthält das Subtilisin 147-Gen.
Fig. 3 erläutert eine Lücken-Duplex-Mutagenese unter Anwendung des Verfahrens von Morinaga et al. (Biotechnology, Bd. 2 (1984), S. 636-639). Es ergeben sich zwei Plasmide, nämlich pSX93 und pSX119, die beide von pUC13 abgeleitet sind. pSX93 enthält ein XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens, und pSX119 enthält den Rest des Subtilisin 309-Gens in einem EcoRI-XbaI-Fragment.
In (A) wird das Plasmid pSX93 mit XbaI und ClaI gespalten. Die mit Lücken versehenen Moleküle werden mit pSX93, das mit ScaI geschnitten ist, vermischt, denaturiert und der Reanelierung überlassen, so daß Plasmide mit einer Region aus einer einzelsträngigen DNA, die sich innerhalb der Subtilisin 309-Kodierungssequenz erstreckt, entstehen. Ein synthetisches Oligonucleotid, das homolog zum Subtilisin 309-Gen ist, aber eine Mutation enthält, läßt man mit der einzelsträngigen Lücke anelieren, die sodann unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und T4- DNA-Ligase aufgefüllt wird. Nach Replikation des Plasmids werden doppelsträngige Mutanten des Subtilisin 309-Gens erzeugt. Das gleiche Verfahren wird in (B) unter Verwendung des Plasmids pSX119 und von EcoRI und XbaI- Enzymen durchgeführt, wobei Mutationen im entsprechenden Bereich des subtilisin 309-Gens entstehen.
Fig. 4 zeigt das Plasmid pSX92, bei dem es sich um ein Derivat des Plasmids pSX62 handelt und das das Subtilisin 309-Gen trägt. Mutierte Fragmente (d. h. XbaI-ClaI, XbaI-HindIII oder EcoRI-XbaI), die aus dem Mutationsplasmid pSX93 oder pSX119 (vgl. Fig. 3) unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten worden waren, wurden in das Plasmid pSX92 zur Expression in B. subtilis Stamm DN 497 inseriert.
Fig. 5 zeigt das Plasmid pSX143, das verkürzte Formen von Subtilisin 309-Gen und Subtilisin 147-Gen enthält. Eine in vivo-Rekombination zwischen homologen Bereichen der beiden Gene kann zu einer aktiven Protease führen.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Mutationen des Subtilisin-Gens, von denen einige zu Änderungen der chemischen Eigenschaften des Subtilisin-Enzyme führen. Mutationen an speziellen Nucleinsäuren können erzeugt werden. Auf diese Weise läßt sich Subtilisin so ausgestalten, daß es den Bedürfnissen einer gewerblichen Anwendung genügt.
Die Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, daß Mutationen von speziellen Nucleinsäuren im Subtilisin-Gen zu Enzymen mit veränderten Eigenschaften führen können. In verschiedenen Ausführungsformen lassen sich Enzyme mit verbesserter Stabilität gegenüber Oxidation, mit erhöhter Protease-Aktivität oder mit verbesserter Wascheignung erzeugen.
Nachstehend wird die Erfindung aus Gründen der Klarheit in vier Abschnitten beschrieben, die aber keine Beschränkung beinhalten sollen: (a) Chemische Struktur von bekannten Subtilisinen und von Subtilisin 147 und 309; (b) Verfahren zur Erzeugung von Mutationen im Subtilisin-Gen; (c) Expression von Mutanten von Subtilisin; und (d) Screening von Subtilisin- Mutanten auf erwünschte chemische Eigenschaften.

5.1. Chemische Struktur von bekannten Subtilisinen und von Subtilisin 147 und 309

Die Sequenzanalyse von Subtilisin aus verschiedenen Quellen kann die funktionelle Bedeutung der primären Aminosäuresequenz erhellen und kann Direktiven zur Erzeugung neuer Mutanten mit gezielt modifizierten Funktionen geben. Vergleicht man die Aminosäuresequenz von unterschiedlichen Subtilisinformen unter Unterscheidung ihrer physikalischen oder chemischen Eigenschaften, so kann man spezielle Zielregionen auffinden, die vermutlicherweise wertvolle mutante Enzyme bilden.
Die Aminosäuresequenzen von mindestens acht Subtilisinen sind bekannt. Hierzu gehören sechs Subtilisine von Bacillus-Stämmen, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlserg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus und Mesenticopeptidase (Kurihara et al., J. Biol. Chem., Bd. 247 (1972), S. 5629-5631; Stahl und Ferran, J. Bacteriol., Bd. 158 (1984), S. 411-418; Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811-819; Jacobs et al., Nucl. Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 8913-8926; Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 421-430; Svendsen et al., FEBS Lett., Bd. 196 (1986), S. 228-232) und zwei Pilz-Subtilisine, nämlich Subtilisin-thermitase aus Thermoactinymyces vulgaris (Meloun et al., FEBS. Lett., Bd. 183 (1985), S. 195-200) und Proteinase K aus Tritirichium album limber (Jany und Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 485-492).
In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäureund DNA-Sequenzen für zwei weitere Serin-proteasen aufgeklärt. Diese Proteasen leiten sich von den zwei Bacillus lentus-Varianten C303 und C360 ab, die beim NCIB hinterlegt wurden und die Hinterlegungsnummern NCIB 10147 und NCIB 10309 erhalten haben.
Die Hinterlegungen wurden am 26. Januar 1968 bzw. 9. September 1968 vorgenommen. In bezug auf den Budapester Vertrag gilt als Hinterlegungstag der 31. März 1982.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen erhalten die von diesen Stämmen gebildeten Proteasen die Bezeichnungen Subtilisin 147 bzw. Subtilisin 309. Die für diese Proteine kodierenden Gene werden als Subtilisin 147-Gen bzw. Subtihein 309-Gen bezeichnet.
Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck "Subtilisin-Material" bezieht sich auf ein proteinartiges Material, das ein Subtilisin als Wirkstoff enthält. Gemäß dem hier verwendeten Sprachgebrauch und unter der gegebenen Definition von Subtilisin-Material handelt es sich bei einer beliebigen Serin-protease um ein Subtilisin, wenn mindestens zu 30%, vorzugsweise zu 50% und insbesondere zu 80% eine Aminosäuresequenz-Homologie mit den vorstehend angegebenen Sequenzen für Subtilisin 147, Subtilisin 309, Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus, Mesentericopeptidase, Thermitase, Proteinase K und Thermomycolase vorliegt. Diese Serinproteasen werden hier auch als "homologe Serin-Proteasen" bezeichnet.
In Tabelle 1 sind die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Subtilisin 309, Subtilisin 147, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg und Subtilisin 168 gegenübergestellt (Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 44 (1958), S. 1012-1078). In Tabelle II ist die Nucleinsäuresequenz des Subtilisin 309-Gens und in Tabelle III die Nucleinsäuresequenz des Subtilisin 147-Gens aufgeführt. Die Sequenzen von Subtilisin 309 oder 147 oder von deren funktionellen Aquivalenten können erfindungsgemäß herangezogen werden. Beispielsweise können die in den Tabellen I, II oder III dargestellten Sequenzen von Subtilisin 309 oder 147 durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die zu funktionell äquivalenten Molekülen führen, verändert werden. Beispielsweise können in der erfindungsgemäßen Praxis aufgrund der Degeneration von Nucleotid-Kodierungssequenzen andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie in Tabelle I kodieren, herangezogen werden. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) Nucleotidsequenzen, die die Gesamtheit oder Teile der in den Tabellen II oder III dargestellten Subtilisin 309- oder Subtilisin 147-Sequenzen umfassen, die durch die Substitution von verschiedenen Codons, die für gleiche oder funktionell äquivalente Aminosäurereste innerhalb der Sequenz kodieren, verändert sind, wodurch man eine stille Veränderung erzeugt. Beispielsweise können einer oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität, die als funktionelles Aquivalent wirkt, substituiert werden. Ein Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann unter anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise gehören zu den nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Der Verwandtschaftsgrad läßt sich durch Vergleich der Aminosäuresequenzen messen. Es gibt zahlreiche Verfahren zur gegenseitigen Ausrichtung von Proteinsequenzen, wobei sich die Unterschiede aber erst zeigen, wenn der Verwandtschaftsgrad recht gering ist. Die im Atlas of Protein Sequence and Structure, Hrsg. Margaret O. Dayhoff, Bd. 5, Ergänzungsband 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D. C., S. 3 ff. unter dem Titel "SEARCH and ALIGN" beschriebenen Verfahren definieren den Verwandtschaftsgrad. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß verwandte Proteine in bezug auf die Zahl von Aminosäuren sowie in bezug auf die Identität der einzelnen Aminosäuren entlang der Kette differieren können. Dies bedeutet, daß es Deletionen oder Insertionen geben kann, wenn zwei Strukturen so aufeinander ausgerichtet werden, daß eine maximale Identität besteht. Beispielsweise weist Subtilisin Carlsberg nur 274 Aminosäuren auf, während Subtilisin BPN' 275 Aminosäuren aufweist. Die Ausrichtung der beiden Sequenzen zeigt, daß Carlsberg keinen Rest aufweist, der Asn56 von Subtilisin BPN' entspricht. Somit würde die Carlsberg-Aminosäuresequenz sich von BPN' sehr stark unterscheiden, wenn nicht die Lücke in der Position 56 berücksichtigt wird. Daher kann man mit einem hohen Konfidenzgrad vorhersagen, daß ein Ersatz von Asn durch Ser in der Position 218 von Subtilisin Carlsberg die thermische Stabilität erhöht, vorausgesetzt, daß die Reste im Carlsberg-Enzym homolog zum BPN'-Enzym numeriert werden.
Erfindungsgemäß können die für Subtilisin 309 und Subtilisin 147 bestimmten Sequenzen mit Sequenzen bekannter Subtilisine (Tabelle I) oder mit neu entdeckten Subtilisinen verglichen werden, um Stellen für wunschenswerte Mutationen aufzufinden. Um dies zu tun, muß die Nähe des Verwandtschaftsgrads der zu vergleichenden Subtilisine bestimmt werden.
Versuche zur Bestimmung der Beziehung zwischen der Primärstruktur von Subtilisin und von dessen physikalischen Eigenschaften haben die Bedeutung des Methioninrestes 222 sowie der funktionellen Aminosäuren im aktiven Zentrum, nämlich Asparaginsäure 32, Histidin 64 und Serin 221, ergeben. Asparagin 155 und Serin 221 liegen innerhalb der Oxyanion-Bindungsstelle. Für Mutationen an diesen Positionen besteht die Wahrscheinlichkeit, daß sie die proteolytische Aktivität verringern. Erfindungsgemäß wurden die Aminosäuresequenzen von Subtilisin 309 und Subtilisin 147 miteinander und mit den Sequenzen anderer Subtilisine verglichen (vgl. Tabelle II). Reste, die zwischen Subtilisin 309 oder Subtilisin 147 und anderen Subtilisinen variierten, wurden identifiziert. Beispielsweise enthält Subtilisin 309 am Rest 153 einen Serinrest, während Subtilisin 147, BPN', Carlsberg und 168 einen Alaninrest enthalten. Würde daher der Serinrest 153 von Subtilisin 309 durch einen Alaninrest ersetzt, könnten sich die physikalischen Eigenschaften von Subtilisin 309 in einer gewunschten Richtung verändern. In ähnlicher Weise enthält Subtilisin 147 einen Serinrest in Position 218, während bei den übrigen Subtilisinen ein Asparaginrest exprimiert ist. Da Subtilisin 147 eine im Vergleich zu anderen Subtilisinen verbesserte thermische Stabilität aufweist, könnte eine Mutation von Asparagin 218 von Subtilisin 309 in einen Serinrest die thermische Stabilität von Subtilisin 309 verbessern. Als ein weiteres Beispiel wurde aufgrund der Tatsache, daß Thr 71 sich nahe am aktiven Zentrum befindet, darauf geschlossen, daß die Einführung einer negativ geladenen Aminosäure, wie Asparaginsäure den oxidativen Angriff durch elektrostatische Abstoßung unterdrücken könnte. Die Stellen, die vermutlich besonders wichtig für die physikalischen Eigenschaften von Subtilisin sind, sind die, bei denen eine Konservierung von Aminosäureresten zwischen den meisten Subtilisinen vorliegt, beispielsweise die vorstehend erörterten Asp-153 und Asn-218 sowie Trp-6, Arg-170, Pro-166, His-67, Met-175, Gly-219 und Arg-275. Durch Mutation der Nucleinsäuresequenz in der Weise, daß eine Aminosäure, die im Vergleich zu anderen Subtilisinen unterschiedlich ist, durch eine entsprechende Aminosäure substituiert ist, kann eine stabilere Form von Subtilisin erhalten werden.
Wells et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 1219- 1223) haben den Vergleich von Aminosäuresequenzen und eine positionsgerichtete Mutation zur Manipulation der Subtilisin-Substratspezifität herangezogen. Die katalytischen Aktivitäten von verschiedenen Subtilisinen gegenüber ausgewählten Substraten können sich erheblich unterscheiden. Wells hat gezeigt, daß nur drei Aminosäuresubstitutionen bewirken können, daß die Substratspezifität von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sich der von B. lichenformis-Subtilisin nähert, wobei es sich um Enzyme handelt, die sich in ihrem nativen Zustand in bezug auf die katalytische Wirksamkeit um Faktoren von 10-50 unterscheiden. Ein Vergleich der Analyse zwischen Subtilisin 147 und Subtilisin 309 und anderen Subtilisinen hat ergeben, daß eine Mutation folgender Stellen die physikalischen oder chemischen Eigenschaften von Subtilisin verändern kann: 6, 9, 11-12, 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268 oder 275. Deletionen erfolgen an folgenden Stellen in Subtilisin 147 und/oder Subtilisin 309, wobei eine Insertion von geeigneten Aminosäureresten an diesen Stellen die Stabilität der Ausgangsenzyme erhöhen kann: 1, 36, 56, 159, 164-166. Gemäß dem in diesen Beispielen (die keine Beschränkung darstellen) erläuterten Verfahren ergibt sich eine Anzahl von möglichen Mutationsstellen. Tabelle I Vergleich der Aminosäuresequenzen für verschiedene Proteasen
a = Subtilisin 309
b = Subtilisin 147
c = Subtilisin BPN'
d = Subtilisin Carlsberg
e = Subtilisin 168
º = zugeordnete Deletion

5.2. Verfahren zur Erzeugung von Mutationen im Subtilisin-Gen

Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur Einführung von Mutationen in Gene bekannt. Nach einer kurzen Erörterung der Klonierung von Subtilisin-Genen werden Verfahren zur Erzeugung von Mutationen sowohl an willkürlichen als auch an spezifischen Stellen innerhalb des Subtilisin-Gens erörtert.

5.2.1. Klonierung eines Subtilisin-Gens

Das für Subtilisin kodierende Gen kann aus beliebigen gram-positiven Bakterien oder Pilzen nach verschiedenen bekannten Verfahren geklont werden. Zunächst muß eine genomische und/oder cDNA-Bibliothek von DNA unter Verwendung von chromosomaler DNA oder Messenger-RNA aus dem Organismus, der das zu untersuchende Subtilisin bildet, konstruiert werden. Wenn die Aminosäuresequenz des Subtilisins bekannt ist, können homologe, markierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert und zur Identifizierung von für Subtilisin kodierenden Klonen aus einer genomischen Bibliothek von bakterieller DNA oder aus einer Pilz-CDNA-Bibliothek verwendet werden. Alternativ könnte eine markierte Oligonucleotid-sonde mit einem Gehalt an für Subtilisin aus einem anderen Stamm von Bakterien oder Pilzen homologen Sequenzen als Sonde verwendet werden, um für Subtilisin kodierende Klone zu identifizieren, wobei man Hybridisierungs- und Waschbedingungen von geringerer Stringenz anwendet.
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Subtilisin erzeugenden Klonen würde darin bestehen, Fragmente von genomischer DNA in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, zu inserieren, Protease-negative Bakterien mit der erhaltenen genomischen DNA-Bibliothek zu transformieren und sodann die transformierten Bakterien auf Agar mit einem Gehalt an einem Substrat für Subtilisin, wie Magermilch, auszustreichen. Bakterien, die ein Subtilisin tragendes Plasmid enthalten, erzeugen Kolonien, die von einem Hof aus klarem Agar umgeben sind, und zwar aufgrund der Verdauung der Magermilch durch ausgeschiedenes Subtilisin.

5.2.2. Erzeugung von willkürlichen Mutationen im Subtilisin-Gen

Nachdem das Subtilisin-Gen in einen geeigneten Vektor, wie ein Plasmid, geklont worden ist, können verschiedene Verfahren herangezogen werden, um in das Gen willkürliche Mutationen einzuführen. Ein Verfahren besteht in der Einverleibung des klonierten Subtilisin-Gens als Teil eines wiedergewinnbaren Vektors in einen Mutatorstamm von Escherichia coli.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Erzeugung einer einzelsträngigen Form des Subtilisin-Gens und das anschließende Anelieren des DNA- Fragments mit einem Gehalt an dem Subtilisin-Gen mit einem weiteren DNA- Fragment, so daß ein Teil des Subtilisin-Gens einzelsträngig bleibt. Diese diskrete, einzelsträngige Region kann sodann einer Anzahl von Mutagenisierungsmitteln ausgesetzt werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Natriumbisulfit, Hydroxylamin, salpetrige Säure, Ameisensäure oder Hydralazin gehören. Ein spezielles Beispiel für dieses Verfahren zur Erzeugung von willkürlichen Mutationen wird von Shortle und Nathans (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 2170-2174) beschrieben. Gemäß dem Verfahren von Shortle und Nathans wird das das Subtilisin-Gen tragende Plasmid durch ein Restriktionsenzym, das eine Spaltung innerhalb des Gens vornimmt, gebrochen. Dieses Bruchstück wird sodann unter der Exonuclease- Einwirkung von DNA-Polymerase I zu einer Lücke erweitert. Die erhaltene einzelsträngige Lücke kann sodann unter Verwendung von einem der vorstehend erwähnten Mutagenisierungsmittel mutagenisiert werden.
Alternativ kann das Subtilisin-Gen aus einer Bacillus-Spezies, das die natürlichen Promotor- und andere Steuersequenzen einschließt, in einen Plasmidvektor mit einem Gehalt an Replicons sowohl für E. coli als auch B. subtilis, einem selektierbaren, phänotypischen Marker und der M13-Replikationsursprungsstelle für die Erzeugung einer einzelsträngigen Plasmid-DNA bei Superinfektion mit dem Helferphagen IR1 geklont werden. Einzelsträngige Plasmid-DNA mit einem Gehalt an dem geklonten Subtilisin- Gen wird isoliert und mit einem DNA-Fragment, das Vektor-Sequenzen aber nicht die Kodierungsregion für Subtilisin enthält, aneliert, wodurch man ein Duplex-Molekül mit einer Lücke erhält. Mutationen werden in das subtilisin-Gen entweder mit Natriumbisulfit, salpetriger Säure oder Ameisensäure oder durch Replikation in einem Mutatorstamm von E. coli gemäß den vorstehenden Angaben eingeführt. Da Natriumbisulfit ausschließlich mit Cytosin in einer einzelsträngigen DNA reagiert, sind die mit diesem Mutagen erzeugten Mutationen nur auf die Kodierungsbereiche beschränkt. Die Reaktionszeit und die Bisulfitkonzentration werden in verschiedenen Experimenten variiert, so daß durchschnittlich pro Subtilisin-Gen 1 bis 5 Mutationen erzeugt werden. Durch Inkubation von 10 µg einer mit einer Lücke versehenden Duplex-DNA in 4 M Na-bisulfit, pH-Wert 6,0, für 9 Minuten bei 37ºC in einem Reaktionvolumen von 400 µl werden etwa 1% Cytosine in der einzeisträngigen Region desaminiert. Die Kodierungsregion von reifem subtilisin enthält etwa 200 Cytosine, je nach dem DNA-Strang. Vorteilhafterweise wird die Reaktionszeit von etwa 4 Minuten (zur Erzeugung einer Mutationsfrequenz von etwa 1 bei 200) bis etwa 20 Minuten (etwa 5 bei 200) variiert.
Nach der Mutagenese werden die mit einer Lücke versehenen Moleküle in vitro mit DNA-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) behandelt, um vollständige doppelsträngige Moleküle zu bilden und um die Mutationen zu fixieren. Kompetente E. coli-Zellen werden sodann mit der mutagenisierten DNA unter Bildung einer amplifizierten Bibliothek von mutanten Subtilisinen transformiert. Amplifizierte mutante Bibliotheken können auch durch Züchten der Plasmid-DNA in einem Mut D-Stamm von E. coli erzeugt werden, was den Bereich der Mutationen aufgrund von dessen fehleranfälliger DNA-Polymerase erhöht.
Die Mutagene salpetrige Säure und Ameisensäure können ebenfalls zur Erzeugung von mutanten Bibliotheken verwendet werden. Da diese Chemikalien nicht wie Natriumbisulfit für einzelsträngige DNA spezifisch sind, werden die Mutagenesereaktionen folgendermaßen durchgeführt. Der Kodierungsbereich des Subtilisin-Gens wird nach üblichen Verfahren in den M13- Phagen geklont, und einzelsträngige Phagen-DNA wird hergestellt. Die einzeisträngige DNA wird sodann mit 1 M salpetriger Säure vom pH-Wert 4,3 15-60 Minuten bei 23ºC oder mit 2,4 M Ameisensäure 1-5 Minuten bei 23ºC umgesetzt. Diese Bereiche von Reaktionszeiten erzeugen eine Mutationsfrequenz von 1 bei 1000 bis 5 bei 1000. Nach der Mutagenese wird ein universeller Primer mit der M13-DNA aneliert, und Duplex-DNA wird unter Verwendung der mutagenisierten, einzeisträngigen DNA als Matrize synthetisiert, so daß der Kodierungsbereich des Subtilisin-Gens vollständig doppelsträngig wird. An dieser Stelle kann der Kodierungsbereich aus dem M13-Vektor mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten und in einen nicht-mutagenisierten Expressionsvektor ligiert werden, so daß Mutationen nur im Restriktionsfragment auftreten (Myers et al., Science, Bd. 229 (1985), S. 242-257).
Nach einem weiteren Verfahren können Mutationen erzeugt werden, indem man zwei unterschiedliche Formen von Subtilisin einer in vivo-Rekombination unterwirft. Gemäß diesem Verfahren führen homologe Regionen innerhalb der beiden Gene zu einem Cross-over der entsprechenden Regionen, was zu einem Austausch von genetischer Information führt. Die Erzeugung von hybriden Amylase-Molekülen nach dieser Technik ist in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 67 992 (eingereicht am 29.06.1987) ausführlich beschrieben (auf diese Druckschrift wird in ihrer Gesamtheit durch Verweis Bezug genommen). Ein Beispiel für ein Plasmid, das hybride Formen von Subtilisin erzeugen kann, ist in Fig. 5 dargestellt. Sowohl das subtilisin 309-Gen als auch das Subtilisin 147-Gen, die in das Plasmid pSX143 eingebaut sind, sind verkürzt und können daher selbst nicht zur Subtilisin-Expression führen. Wenn jedoch eine Rekombiantion zwischen den beiden Genen so erfolgt, daß der durch die Verkürzung erzeugte Defekt korrigiert wird, d.h. daß die N-terminale Region des Subtilisin 309-Gens mit der C-terminalen Region des Subtilisin 147-Gens verknüpft wird, so läßt sich aktives, mutantes Subtilisin erzeugen. Wird pSX143 in einen Protease-negativen Stamm von Bakterien eingebaut und werden anschließend Bakterien, die einen Protease-positiven Phänotyp entwickeln, ausgewählt, so lassen sich verschiedene Mutanten, Subtilisin 309/147-Chimäre, identifizieren.

5.2.3. Erzeugung von positionsgerichteten Mutationen im Subtilisin- Gen

Nachdem das Subtilisin-Gen geklont worden ist und erwünschte Stellen für die Mutation identifiziert worden sind, können diese Mutationen unter Verwendung von synthetischen Oligonudeotiden eingeführt werden. Diese Oligonudeotide enthalten die die gewünschten Mutationsstellen flankierenden Nucleotidsequenzen. Mutante Nucleotide werden während der Oligonucleotidsynthese inseriert. In einem bevorzugten Verfahren wird eine einzelsträngige Lücke von DNA, die das Subtilisin-Gen überbrückt, in einem das Subtuisin-Gen tragenden Vektor erzeugt. Anschließend wird das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation trägt, zu einem homologen Bereich der einzelsträngigen DNA aneliert. Die verbleibende Lücke wird sodann durch DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, und das Konstrukt wird unter Verwendung von T4-Ligase verknüpft. Ein spezielles Beispiel für dieses Verfahren wird von Morinaga et al. beschrieben (Biotechnology, Bd. 2 (1984), S. 636-639). Gemäß Morinaga et al. wird ein Fragment innerhalb des Gens unter Verwendung von Restriktionsendonuclease entfernt. Das Vektor/Gen das nunmehr eine Lücke enthält, wird sodann denaturiert und zum Vektor/Gen hybridisiert, das, statt eine Lücke zu enthalten, mit einer anderen Restriktionsendonuclease an einer Stelle außerhalb des Lückenbereichs gespalten worden ist. Eine einzelsträngige Region des Gens steht sodann für die Hybridisierung mit mutierten Oligonucleotiden bereit, wobei die restliche Lücke durch Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt wird, wobei die Insertionen mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Nach einem Replikationszyklus entsteht ein doppelsträngiges Plasmid, das die gewünschte Mutation trägt. Das Morinaga-Verfahren vermeidet die zusätzliche Manipulation bei der Konstruktion von neuen Restriktionsstellen und erleichtert somit die Erzeugung von Mutationen an mehreren Stellen. Das US-Patent 4 760 025 (Estelle et al., Ausgabetag 26. Juli 1988) ermöglicht die Einführung von Mehrfachmutationen tragenden Oligonudeotiden durch Vornahme von geringeren Veränderungen an der Kassette, wobei jedoch eine noch größere Vielzahl von Mutationen bei einem Vorgang nach dem Morinaga-Verfahren eingeführt werden kann, da eine große Vielzahl von Oligonudeotiden unterschiedlicher Längen eingeführt werden kann.

5.3. Expression von Subtilisin-Mutanten

Erfindungsgemäß kann ein mutiertes Subtilisin-Gen, das nach den vorstehend beschriebenen Verfahren oder nach beliebigen alternativen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt worden ist, in Enzymform unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden. Ein Expressionsvektor fällt allgemein unter die Definition eines Klonierungsvektors, da ein Expressionsvektor üblicherweise die Komponenten eines typischen Klonierungsvektors enthält, nämlich ein Element, das eine autonome Replikation des Vektors in Mikroorganismen unabhängig vom Genom des Mikroorganismus erlaubt, und einen oder mehrere phänotypische Marker für Selektionszwecke. Ein Expressionsvektor umfaßt für einen Promotor kodierende Steuersequenzen, einen Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitationssignal und ggf. ein Repressorgen. Um die Sekretion des exprimierten Proteins zu ermöglichen, können Nucleotide, die für eine "Signalsequenz" kodieren, vor der Kodierungssequenz des Gens inseriert werden. Für die Expression unter Steuerung der Steuersequenzen wird ein erfindungsgemäß zu behandelndes zielgen funktionell mit den Steuersequenzen im geeigneten Leseraster verknüpft. Promotorsequenzen, die Plasmidvektoren einverleibt werden können und die die Transkription des mutanten Subtilisin-Gens unterstützen können, umfassen (ohne Beschränkung hierauf) den prokaryontischen β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 3727-3731) und den tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1963), S. 21-25).
Weitere Hinweise finden sich in "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, Bd. 242 (1980), S. 74-94.
Gemäß einer Ausführungsform wird B. subtilis durch einen Expressionsvektor, der die mutierte DNA trägt, transformiert. Wenn die Expression in einem sezernierenden Mikroorganismus, wie B. subtilis, stattfinden soll, kann eine Signalsequenz dem Translationsinitiationssignal folgen und der DNA-Sequenz von Interesse vorhergehen. Die Signalsequenz bewirkt einen Transport des Expressionsprodukts zur Zellwand, wo es bei der Sekretion vom Produkt abgespalten wird. Der vorstehend definierte Ausdruck "Steuersequenzen" soll eine Signalsequenz, wenn diese vorhanden ist, umfassen.

5.4. Screening von mutanten Subtilisinen

Zum Sreening auf Mutanten kann transformierter B. subtilis in Gegenwart eines Filtermaterials (wie Nitrocellulose), mit dem das sezernierte Expressionsprodukt (z.B. Enzym) eine Bindung eingeht, gezüchtet werden. Um ein Screening auf ein Expressionsprodukt mit einer gewünschten Eigenschaft vorzunehmen, wird das an den Filter gebundene Expressionsprodukt Bedingungen unterworfen, die eine Unterscheidung zwischen dem in Frage stehenden Expressionsprodukt und dem Wild-Typ-Expressionsprodukt ermöglichen. Beispielsweise kann das an den Filter gebundene Expressionsprodukt Bedingungen unterworfen werden, die zu einer Inaktivierung eines Wild- Typ-Produkts führen. Eine nach dieser Inaktivierungsbehandlung konservierte Enzymaktivität läßt darauf schließen, daß die Mutation dem Enzym verstärkte Stabilität verleiht, so daß es sich um eine wertvolle Mutation handelt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Screening auf stabile Varianten unter Verwendung eines B. subtilis-Stammes mit einem Protease- Mangel, der mit dem varianten Plasmid transformiert und auf folgende Weise ausgestrichen worden ist, durchgeführt. Ein Nitrocellulose-Filter wird auf eine Nährbasis in einer Petri-Schale gelegt. Oben auf die Nitrocellulose wird ein Celluloseacetat-Filter gelegt. Kolonien werden auf dem Celluloseacetat gezüchtet. Protease von einzelnen Kolonien wird durch das Celluloseacetat auf den Nitrocellulose-Filter sezerniert, wo sie in stabiler Weise gebunden wird. Protease von Hunderten von Kolonien wird an einem einzelnen Filter gebunden, was das anschließende Screening von Tausenden unterschiedlicher Varianten durch Verarbeitung von mehreren Filtern ermöglicht.
Zur Identifizierung von Kolonien, die Subtilisin von erhöhter thermischer Stabilität erzeugen, können die Filter in Pufferlösungen bei Temperaturen, die im wesentlichen die gesamte Wild-Typ-Aktivität inaktivieren, inkubiert werden. Varianten von erhöhter Stabilität oder Aktivität behalten ihre Aktivität auch nach dieser Stufe. Der in geeigneter Weise behandelte Filter wird sodann in einer Lösung mit einem Gehalt an Tosyl-L-Argmethylester (TAME), Benzoyl-Arg-ethylester (BAEE), Acetyl-Tyr-ethylester (ATEE) (Sigma) oder ähnlichen Verbindungen eingeweicht. Da TAME, BAEE und ATEE Substrate für die Proteasen sind, werden sie in Zonen auf dem Filter mit einem Gehalt an Subtilisin-Varianten, die nach der Behandlung ihre Aktivität behalten, gespalten. Bei der Spaltung werden bei der Umsetzung Reaktionen freigesetzt, wodurch Phenolrot in den Bereichen, wo die Protease-Aktivität erhalten bleibt, sich von Rot nach Gelb verfärbt.
Dieses Verfahren kann zum Screening unterschiedlicher Klassen von Varianten mit nur geringfügigien Modifikationen herangezogen werden. Beispielsweise können die Filter bei hohen Temperaturen, einem hohen pH- Wert, mit Denaturierungsmitteln, mit Oxidationsmitteln oder unter Bedingungen, die normalerweise zur Inaktivierung eines Enzyms, beispielsweise einer Protease, führen, behandelt werden, um resistente Varianten aufzufinden. Varianten mit veränderter Substratspezifität können herausgefunden werden, indem man TAME, BAEE oder ATEE durch andere Substrate ersetzt, die normalerweise von Wild-Typ-Subtilisin nicht gespalten werden.
Nachdem durch das Screening eine Variante von erhöhter Stabilität identifiziert worden ist, wird die Kolonie, die sich von der Variante ableitet, isoliert, und das veränderte Subtilisin wird gereinigt. Es können Versuche mit dem gereinigten Enzym durchgeführt werden, um die Bedingungen bezüglich Oxidationsstabilität, thermischer Inaktivierung, Denaturierungstemperatur, kinetischen Parametern sowie anderen physikalischen Messungen zu bestimmen. Das veränderte Gen kann auch sequenziert werden, um die für die erhöhte Stabilität verantwortlichen Aminosäurenveränderungen festzustellen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden Varianten mit erhöhter Wascheignung isoliert.

6. Beispiel: Eine positionsspezifische Mutation des Subtilisin-Gens erzeugt Mutanten mit wertvollen chemischen Eigenschaften

6.1. Materialien und Methoden

6.1.1. Bakterienstämme

B. subtilis 309 und 147 sind Varianten von Bacillus lentus, die beim NCIB unter den Hinterlegungsnummern NCIB 10147 und NCIB 10309 hinterlegt worden sind und im US-Patent 3 723 250 (Ausgabetag 27. März 1973), das hier in seiner Gesamtheit durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird, beschrieben. B. subtilis DN 497 ist in der US-Anmeldung 039 298 (die ebenfalls durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird) beschrieben: es handelt sich um eine aro+-Transformante von RUB 200 mit chromosomaler DNA aus SL 438, einem von Dr. Kim Hardy von Biogen erhaltenen Stamm mit einem Mangel an Sporulation und Protease. E. coli MC 1000 r&supmin;m&spplus; (M. J. Casa-daban und S. N. Cohen, J. Mol. Biol., Bd. 138 (1980), S. 179-207) wurde gemäß herkömmlichen Verfahren mit dem Merkmal r&supmin;m&spplus; ausgestattet und ist ebenfalls in der US-Anmeldung 039 298 beschrieben.

6.1.2. Plasmide

pSX50 (beschrieben in der US-Anmeldung 039 298, Anmeldetag 17. April 1987, die durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird) ist ein Derivat des Plasmide pDN 1050, das den Promotor-Operator P&sub1;O&sub1;, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl R-Gen umfaßt.
pSX65 (beschrieben in der vorgenannten US-Anmeldung 039 298) ist ein Derivat des Plasmids pDN 1050, das den Promotor-Operator P&sub2;O&sub2;, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl-R-Gen umfaßt.
pSX93, das in Fig. 3a dargestellt ist, ist pUC13 (Vieira und Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259-262), das ein 0,7 kb XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens unter Einschluß des in eine Polylinker-Sequenz inserierten Terminators umfaßt.
pSX119 ist pUC13 mit einem EcoRI-XbaI-Fragment des in den Polylinker inserierten Subtilisin 309-Gens.
pSX62 (beschrieben in der vorgenannten US-Anmeldung 039 298) ist ein Derivat von pSX52 (a. a. O.), das ein Fusionsgen zwischen dem Kälber-Prochymosin-Gen und dem B. pumilus xyn B-Gen, inseriert in pSX50 (vergl. oben), umfaßt. pSX62 wurde durch Inserieren von E. coli rrn B-Terminator in pSX52 hinter dem Prochymosin-Gen erzeugt.
pSX92 wurde durch Klonieren von Subtilisin 309 in das Plasmid pSX62 (vergl. oben), geschnitten an ClaI und HindIII und aufgefüllt vor der Insertion der Fragmente DraI-NheI und NheI-HindIII aus dem klonierten Subtilisin 309-Gen, erzeugt.

6.1.3. Reinigung von Subtilisinen

Das Verfahren betrifft eine typische Reinigung eines 10 Liter-Fermentationsansatzes des Subtilisin 147-Enzyms, des Subtilisin 309-Enzyms oder von Mutanten davon.
Etwa 8 Liter Fermentationsbrühe wurden 35 Minuten in 1 Liter fassenden Bechergläsern bei 5000 U/min zentrifugiert. Die überstände wurden unter Verwendung von 10% Essigsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und an Seitz Supra S100-Filterplatten filtriert.
Die Filtrate wurden unter Verwendung einer Amicon CH2A UF-Anlage, die mit einer Amicon S1Y10 UF-Patrone ausgerüstet war, auf etwa 400 ml eingeengt. Das UF-Konzentrat wurde vor der Adsorption an einer Bacitracin- Affinitätssäule beim pH-Wert 7 zentrifugiert und futriert. Die Protease wurde von der Bacitracin-Säule unter Verwendung von 25% 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf den pH- Wert 7 eingestellt war, eluiert. Die Fraktionen mit Protease-Aktivität aus der Bacitracin-Reinigungsstufe wurden vereinigt und auf eine mit 750 ml Sephadex G25-Säule (Durchmesser 5 cm) aufgesetzt, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf den pH-Wert 6,5 eingestellt war, äquilibriert worden war.
Fraktionen mit proteolytischer Aktivität aus der Sephadex G25-Säule wurden vereinigt und auf eine 150 ml CM Sepharose CL 68-Kationenaustauscher enthaltende Säule (5 cm Durchmesser) aufgesetzt, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, der auf dem pH-Wert 6,5 eingestellt worden war, äquilibriert worden war.
Die Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-0,1 M Natriumchlorid in 2 Liter des gleichen Puffers eluiert (0-0,2 M Natriumchlorid im Fall von sub 147).
In einer letzten Reinigungsstufe wurden Protease enthaltende Fraktionen von der CM Sepharose-Säule vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle, die mit einer GRBLP-Membran (von der Firma Danish Sugar Factones Inc.) ausgerüstet war, eingeengt.
Subtilisin 309 und die Mutanten
Met 222 für Ala
Gly 195 für Glu
Asn 218 für Ser
Arg 170 für Tyr
Gly 195 für Glu, Arg 170 für Tyr
Gly 195 für Glu, Met 222 für Ala wurden nach diesem Verfahren gereinigt.

6.1.4. Oligonucleotid-Synthese

Sämtliche Fehl-Primer wurden an einem Applied Biosystems 380 A DNA- synthesegerät synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt.

6.1.5. Bestimung der Oxidationsstabilität

Das gereinigte Enzym wurde auf einen Enzymgehalt von etwa 0,1 mg/ml in 0,01 M Dimethylglutarsäure, pH-Wert 7, und dem gleichen Puffer mit 0,01 M Peressigsäure (pH-Wert 7) verdünnt.
Beide Verdünnungsansätze wurden 20 Minuten auf 50ºC erwärmt. Die proteolytische Aktivität wurde in den Verdünnungen vor und nach der Wärmebehandlung gemessen.

6.1.6. Test auf proteolytische Aktivität

OPA-Casein-Verfahren

Die proteolytische Aktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat bestimmt. Eine Casein-Protease-Einheit (CPU) ist als die Enzymmenge definiert, die 1 mmol primäre Aminogruppen (bestimmt durch Vergleich mit einem Serin-Standard) pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. 30-minütige Inkubation bei 25ºC und bei pH-Wert 9,51 freisetzt.
Eine 2% (Gew.-/Vol.) Lösung von Casein (Hammarstein, Produkt der Fa. Merck AG, Deutschland) wurde mit Universalpuffer gemäß den Angaben von Britton und Robinson (Journ. Chem. Soc., (1931), S. 1451), eingestellt auf den pH-Wert 9,5, hergestellt.
2 ml Substratlösung wurden in einem Wasserbad 10 Minuten bei 25ºC vorinkubiert. 1 ml Enzymlösung mit einem Gehalt an etwa 0,2-0,3 CPU/ml Britton-Robinson-Puffer (pH-Wert 915) wurden zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25ºC wurde die Umsetzung durch Zugabe eines Stoppreagenz (5 ml einer Lösung mit einem Gehalt an Trichloressigsäure (17,9 g), Natriumacetat (29,9 g) und Essigsäure (19,8 g) mit 500 ml entionisiertem Wasser aufgefüllt) beendet. Ein Leerwert wurde auf die gleiche Weise wie die Testlösung hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Stoppreagenz vor der Enzymlösung zugegeben wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten auf dem Wasserbad gehalten, wonach es durch Whatrnan Nr. 42-Papierfilter futriert wurde.
Primäre Aminogruppen wurden durch ihre Farbentwicklung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) bestimmt.
Dinatriumtetraborat-decahydrat (7,62 g) und Natriumdodecylsulfat (2,0 g) wurden in 150 ml Wasser gelöst. OPA (160 mg), gelöst in 4 ml Methanol, wurde sodann zusammen mit 400 µl β-Mercaptoethanol gelöst, wonach die Lösung mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde. Das OPA-Reagenz (3 ml) wurde mit 40 µl der vorerwähnten Futrate unter Vermischen versetzt. Die optische Dichte (OD) bei 340 nm wurde nach etwa 5 Minuten gemessen.
Der OPA-Test wurde auch mit einem Serin-Standard mit einem Gehalt an 10 mg Serin in 100 ml Britton-Robinson-Puffer (pH-Wert 9,5) durchgeführt. Der Puffer wurde als Leerwert eingesetzt.
Die Protease-Aktivität wurde aus den Messungen der optischen Dichte gemäß folgender Formel berechnet:
CPU/ml Enzymlösung = (ODt - ODb) x Cser x Q/(ODser - ODB) x Mgser x ti
CPU/g Enzympräparat = CPU/ml: b
worin ODt, ODb, ODser und ODB die optische Dichte der Testlösung, des Leerwerte, des Serin-Standards bzw. des Puffers bedeuten, Cser die Serin- Konzentration in mg/ml im Standard bedeutet und MGser das Molekulargewicht von Serin bedeutet. Q bedeutet den Verdünnungsfaktor (in diesem Fall hat er den Wert 8) für die Enzymlösung und ti die Inkubationszeit in Minuten.
In der nachstehenden Tabelle V sind die Ergebnisse für den vorstehenden Test in bezug zum Ausgangsenzym aufgeführt.

6.1.7. Test auf wascheignung

Teststoffe (7 cm x 7 cm, etwa 1 g) wurden vorbereitet, indem man Stoff aus entschlichteter Baumwolle (100% Baumwolle, DS 71) durch das Gefäß in einer Mathis-Wasch- und Trockenanlage Typ TH (Werner Mathis AG, Zürich, Schweiz) mit einem Gehalt an Spinatsaft (hergestellt aus frischem Spinat) und anschließend durch die Preßwalze der Maschine führte, um überschüssigen Spinatsaft zu entfernen.
Schließlich wurde der Stoff in einem starken Luftstrom bei Raumtemperatur getrocknet, 3 Wochen bei Raumtemperatur belassen und anschließend bis zur Verwendung bei -18ºC aufbewahrt.
Die Tests wurden in einer Terg-O-tometer-Testwaschmaschine (beschrieben in Jay C. Harns "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd., 1954, S. 60-61) isothermisch 10 Minuten bei 100 U/min durchgeführt. Als Waschmittel wurde das folgende Standardwaschpulver verwendet:
LAS, Nansa 5 80 0,4 g/l
AE, Berol 0 65 0,15 g/l
Seife 0,15 g/l
STPP 1,75 g/1
Natriumsilicat 0,40 g/1
CMC 0,05 gil
EDTA 0,01 g/l
Na&sub2;SO&sub4; 2,10 gil
Perborat 1,00 g/l
TAED 0,10 g/l
TAED = N,N,N',N'-Tetraacetylethylendiamin; der pH-Wert wurde mit 4 N NaOH auf 9,5 eingestellt. Das verwendete Wasser wies eine Härte von 9º auf (Deutsche Härtegrade).
Die Tests wurden bei den Enzymkonzentrationen 0, 0,05 CPU/1 und 0,1 CPU/1 durchgeführt. Für jede der Mutanten wurden zwei unabhängige Sätze von Tests vorgenommen.
Acht Stoffe wurden für jeden Test unter Verwendung von 1 Becherglas (800 ml) Waschmittel verwendet. Von den Stoffen waren vier sauber und vier mit Spinatsaft verschmutzt. Nach dem Waschen wurden die Stoffe 25 Minuten in laufendem Wasser in einem Eimer gespült.
Sodann wurden die Stoffe über Nacht (gegen Tageslicht geschützt) an der Luft getrocknet. Die Remission R, bestimmt mit einem ELREPHO 2000- Spektrophotometer der Fa. Datacolor S. A., Dietikon, Schweiz, bei 460 nm wurde ermittelt.
Als ein Maß für die Wascheignung wurde die differentielle Remission, Δ R, herangezogen, wobei Δ R die Remission nach Waschen mit Enzymzusatz minus die Remission nach Waschen ohne Enzymzusatz bedeutet.

6.1.6. Test auf Thermostabilität

Das gleiche Verfahren wie für die Wascheignung wurde auch zur Ermittlung der Thermostabilität der gebildeten Mutanten herangezogen, indem man den Test bei Temperaturen von 40 bzw. 60ºC durchführte.

6.2. Ergebnisse

6.2.1. Klonierung der Subtilisin 309- und 147-Gene

Chromosomale DNA des Stammes "309" wurde durch 30-minütige Behandlung einer Zellsuspension mit Lysozym bei 37ºC und sodann durch 5-minütige Behandlung mit SDS bei 60ºC isoliert. Anschließend wurde die Suspension mit Phenol-Chloroform (50:50) extrahiert, mit Ethanol gefällt, und der Niederschlag wurde in TE erneut gelöst. Diese Lösung wurde 1 Stunde bei 37ºC mit RNase behandelt.
Etwa 30 µg der chromosomalen DNA wurden partiell mit dem Restriktionsenzym Sau 3A (New England Biolabs) verdaut, und Fragmente von etwa 1,5 kb bis etwa 6,5 kb wurden an DEAE-Cellulosepapier von einem 1% Agarosegel isoliert (das Subtilisin-Gen in anderen Spezies weist eine Länge von etwa 1,2 kb auf).
Wie in Fig. 1 dargestellt, wurden die Fragmente aneliert und an mit BamHI geschnittenes Plasmid pSX50 (beschrieben in der US-Anmeldung 039 298, Einreichungstag 17. April 1987; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) ligiert. Die Plasmide wurden sodann in kompetente B. subtilis DN 497-Zellen transformiert.
Die Zellen wurden sodann auf LB-Agarplatten mit 10 mM Phosphat vom pH-Wert 7, mit 6 µg/ml Chloramphenicol und 0,2% Xylose ausgestrichen, um den xyn-Promotor im Plasmid zu induzieren. Die Platten enthielten ferner 1% Magermilch, so daß die Protease bildenden Transformanten durch den klaren Hof an der Stelle, wo die Magermilch abgebaut worden war, nachgewiesen werden konnten.
Protease exprimierende Klone wurden in einer Häufigkeit von 10&supmin;&sup4; gebildet. Von zwei Klonen wurde festgestellt, daß sie Plasmide für das Gen Subtilisin 309 trugen, nämlich pSX86 und pSX88. Das Gen wurde sodann gemäß dem Verfahren von Maxarn und Gilbert sequenziert. Die abgeleitete Nucleotidsequenz von Subtilisin 309 ist in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Das Subtilisin 309-Gen Signal
Das vorstehende Verfahren wurde zur Klonierung des Subtilisin 147- Gens angewandt, mit der Ausnahme, daß die DNA-Fragmente in das Plasmid pSX56 (ebenfalls in der vorstehenden US-Anmeldung 039 298 beschrieben), das, wie in Fig. 2 angegeben, anstelle des xyn-Promotors den xyl-Promotor enthält, ligiert wurden. Von einem Klon wurde festgestellt, daß er ein das Gen für Subtilisin 147 tragendes Plasmid, pSX94, enthält. Die Sequenz für dieses Gen ist in der nachstehenden Tabelle III aufgeführt. Tabelle III Das Subtilisin 147-Gen Signal

6.2.2. Erzeugung von positionsspezifischen Mutationen des Subtilisin 309-Gens

Positionsepezifische Mutationen wurden gemäß dem Verfahren von Monnaga et al. (Biotechnology, a. a. O.) durchgeführt. Die folgenden Oligonudeotide wurden zur Einführung der Mutationen verwendet:
a) Gly-195 Glu:
Ein 27-mer-Fehl-Primer, NOR-237, der auch eine neue SacI-Restriktionsstelle erzeugt
b) Gly-195 Asp:
Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-323, der auch eine neue BglII-Stelle erzeugt
c) Met-222 Cys:
Ein 24-mer Fehl-Primer, NOR-236
d) Met-222 Ala:
Ein 22-mer Fehl-Primer, NOR-235
Diese beiden Primer zerstören die einzige ClaI-Stelle.
e) Ser-153 Äla:
Ein 18-mer Fehl-Primer, NOR-324, der auch eine neue PvuII-Stelle erzeugt
f) Aun-218 9er:
Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-325, der auch eine neue MspI-Stelle erzeugt
g) Thr-71 Aup:
Ein 23-mer Fehl-Primer, NOR-463,
h) Met-222 Cys und Gly-219 Cys: Ein 32-mer Fehl-Primer, NOR-494,
i + j) Gly-195 Glu und Met-222 Ala oder Met-222 Cys:
Diese doppelten Mutantenkombinationen von NOR-237 und NOR-235 oder NOR-236 wurden durch Verbinden der einzelnen mutanten DNA-Fragmente erzeugt.
k) Ser-153 Ala und ABN-216 Ser:
Eine Kombination von NOR-324 und NOR-325 wurde in Analogie zu den vorstehenden Ausführungen erzeugt.
Eine Lücken-Duplex-Mutagenese wurde unter Verwendung des Plasmids pSX93 als Schablone durchgeführt. pSX93 ist in Fig. 3a und 3b dargestellt. Es handelt sich um pUC13 (J. Vieira und J. Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259-268) mit einem 0,7 kb-XbaI-HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens unter Einschluß des in den Polylinker inserierten Terminators. Der Terminator und die HindIII-Stelle sind in Tabelle II nicht aufgeführt.
Zur Einführung von Mutationen in den N-terminalen Teil des Enzyms wurde das Plasmid pSX119 verwendet. Bei pSX119 handelt es sich um pUC13 mit einem EcoRI-XbaI-Fragment des in den Polylinker eingesetzten Subtilisin 309-Gens. Die Matrizen pSX93 und pSX119 decken somit das gesamte Subtilisin 309-Gen ab.
Die Mutationen a), b) und e) wurden durch Schneiden von pSX93 mit XbaI und ClaI gemäß den Angaben in Fig. 3a durchgeführt. Die Mutationen c), d), f) und h) wurden durch Schneiden von pSX93 mit XbaI und HindIII gemäß den Angaben in Fig. 3b durchgeführt.
Die Mutation g) wurde in entsprechender Weise in pSX119 durch Schneiden mit EcoRI und XbaI durchgeführt.
Die Doppelmutanten i) und j) wurden durch Schneiden des 0,7 kb-Xba- HindIII-Fragments aus a) partiell mit HgiAI (HgiAI schneidet auch in SacI, das durch die Mutation eingeführt wurde) erzeugt. Dieses 180 bp-XbaI-HgiAI-Fragment und das 0,5 kb HgiAI-Fragment der c)- bzw. d)-Mutanten wurden in das große HindIII-XbaI-Fragment von pSX93 ligiert.
Die Doppelmutante k) wurde auf die vorstehend angegebene Weise durch Kombination der Mutanten e) und f) erzeugt.
Anschließend an das Anelieren, Auffüllen und Ligieren wurde das Gemisch zur Transformation von E. coli MC 1000 r&supmin;m&spplus; verwendet. Mutanten unter den Transformanten wurden durch Kolonienhybridisierung gemäß den Angaben von Vlasuk et al. (J. Biol. Chem., Bd. 258 (1983), S. 7141-7148) und von G. P. Vlasuk und S. Inouye ("Experimental Manipulation of Gene Expression", M. Inouye (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 292-303) abgesucht. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

6.2.3. Expression von mutanten Subtilisinen

Anschließend an die Sequenzbestätigung der korrekten Mutation wurden die mutierten DNA-Fragmente in das Plasmid pSX92, das zur Erzeugung der Mutanten verwendet wurde, inseriert.
Das Plasmid pSX92 ist in Fig. 4 dargestellt und wurde hergestellt, indem man das Sub 309-Gen in bei ClaI geschnittenes Plasmid pSX62 inserierte, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 auffüllte und vor der Insertion der Fragmente Drai-NheI und NheI-HindIII aus dem klonierten Sub 309-Gen schnitt.
Zur Expression der Mutanten wurden die mutierten Fragmente (XbaI- ClaI, XbaI-HindIII oder EcoRI-XbaI) aus dem entsprechenden Mutationsplasmid pSX93 bzw. pSX119 ausgeschnitten und in pSX92 inseriert.
Das mutierte pSX92 wurde sodann zur Transformation des Stammes B. subtilis DN 497 verwendet, der im gleichen Medium, das zum Klonieren des Ausgangsgens herangezogen wurde, gezüchtet wurde.
Nach entsprechendem Wachstum wurden die mutierten Enzyme gewonnen und gereinigt.

6.2.4. Oxidationstabilität von mutanten Subtilisinen

Die Mutanten a) und d) wurden auf ihre Oxidationsstabilität in 0,01 M Peressigsäure nach 20 Minuten bei 50ºC und beim pH-Wert 7 getestet. Die Protease des Ausgangsetammes NCIB 10309 wurde als Vergleich verwendet.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführt. Dort ist die restliche proteolytische Aktivität in den wärmebehandelten Proben im Vergleich zu nicht durch Oxidationsmittel oder Wärme behandelten Proben angegeben. Tabelle IV Oxidationuatabilität gegenüber Peressigsäure Restaktivität nach 20 min bei 50ºC Enzym ohne Oxidationsmittel mit Oxidationsmittel sub 309 Mutante a Mutante d
Es läßt sich der Schluß ziehen, daß die Mutante d (Met 222 für Ala) eine überlegene Oxidationsstabilität im Vergleich zum Ausgangsenzym und Mutante a aufweist.
Sämtliche Mutanten mit Ausnahme von g) und h) wurden auch qualitativ in 100-500 ppm Hypochlorit bei Raumtemperatur von 35ºC bei den pH-Werten 6,5 und 9,0 15 Minuten bis 2 Stunden getestet.
Diese Tests ergaben, daß die Mutanten c), d), i) und j) (alle Met-222) gegen Hypochlorit 3- bis 5-fach beständiger als die übrigen Mutanten waren.
Bei Test in einem flüssigen Waschmittel von üblichem Aufbau wurde festgestellt, daß die Mutante f) eine überlegene Stabilität im Vergleich zu den beiden übrigen Mutanten und dem "parentalen" Enzym aufwies.

6.2.5. Proteolytische Aktivität von mutanten Subtilisinen

Die proteolytische Aktivität von verschiedenen Mutanten wurde gegen Casein als Proteinsubstrat gemäß den oben angegebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutante a) eine erhöhte Aktivität gegenüber dem parentalen Produkt zeigt. Es ist ferner ersichtlich, daß die Met-222-Mutanten eine geringere Aktivität als das Ausgangsprodukt aufweisen, daß aber aufgrund ihrer verbesserten Oxidationsstabilität ihre Anwendung in Waschmittelzusammensetzungen mit einem Gehalt an Oxidationsmitteln nicht ausgeschlossen ist. Tabelle V Proteolytische Ativität von mutanten Subtilisinen Mutante relative Aktivität keine

6.2.6. Wascheignung von mutanten Subtilisinen

Die Wascheignung von verschiedenen Mutanten wurde gegen Spinatsaft gemäß den vorstehend angegebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß sämtliche getesteten Mutanten eine verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Ausgangsenzym aufwiesen, und daß die Mutanten c), d), i) und j) erheblich besser waren. Tabelle VI Wascheignung der Mutante Mutante ΔR Konzentration (CPU/1) keine 95%-Vertrauensbereich: ±0,9

6.2.7. Thermostabilität von mutanten Subtilisinen

Die Thermostabilität der Mutante f) wurde gegen das Wildtyp-Enzym unter Anwendung des Wascheignungstests bei 40ºC bzw. 60ºC getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgeführt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutante f) bei 60ºC eine erheblich verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zeigt, während bei 40ºC die Wascheignung der Mutante f) nur geringfügig besser als die des Wildtyp-Enzyms ist. Tabelle VII Wascheignung bei unterschiedlichen Temperaturen Mutante ΔR Konzentration (CPU/1) keine 95%-Vertrauensbereich: ±0,9 (40ºC) und ±0,7 (60ºC)

6.3. Diskussion

Subtilisin-Gene wurden aus den Varianten 147 und 309 des Bacteriums Bacillus lentus geklont. Die geklonten Gene wurden sequenziert. Durch Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Subtilisine 147 und 309 miteinander und mit den Sequenzen von anderen Subtilisinen wurden Stellen, die nach Mutation die physikalischen Eigenschaften des Ausgangsenzyme verändern können, identifiziert. Eine positionsgerichtete Mutagenese wurde zur Erzeugung von Mutationen an mehreren dieser Stellen im Subtilisin 309-Gen herangezogen. Die erhaltenen mutanten Enzyme wurden sodann in einem Bacillus-Stamm exprimiert und auf verschiedene physikalische und chemische Parameter getestet. Von einigen der Mutanten wurde gezeigt, daß sie eine verbesserte Oxidationsstabilität, eine erhöhte proteolytische Aktivität oder eine verbesserte Wascheignung im Vergleich zum Ausgangsenzym Subtilisin 309 aufweisen. Diese Mutanten besitzen Eigenschaften, die für Enzyme in Waschmittelzusammensetzungen wünschenswert sind.

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Gebiet der Erfindung 3
2. Hintergrund der Erfindung 3
2.1. Bacillus-Proteasen 3
2.2. Subtilisin 3
2.3. Gewerbliche Anwendungen von Subtilisinen 5
3. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung 5
3.1. Abkürzungen 6
4. Beschreibung der Figuren 6
5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung 8
5.1. Chemische Struktur von bekannten 8 Subtilisinen und von Subtilisin 147 und 309 8
5.2. Verfahren zur Erzeugung von Mutationen im Subtilisin-Gen 15
5.2.1. Klonierung eines Subtilisin-Gens 15
5.2.2. Erzeugung von willkürlichen Mutationen im Subtilisin-Gen 16
5.2.3. Erzeugung von positionsgerichteten Mutationen im Subtilisin-Gen 18
5.3. Expression von Subtilisin-Mutanten 19 5.4. Screening von mutanten Subtilisinen 20
6. Beispiel: Eine positionspezifische Mutation des Subtilisin-Gens erzeugt Mutanten mit wertvollen chemischen Eigenschaften 21
6.1. Materialien und Methoden 21
6.1.1. Bakterienstämme 21
6.1.2. Plasmide 22
6.1.3. Reinigung von Subtilisinen 22
6.1.4. Oligonucleotid-Synthese 24
6.1.5. Bestimmung der Oxidationsstabilität 24
6.1.6. Test auf proteolytische Aktivität 24
6.1.7. Test auf Wascheignung 25
6.1.8. Test auf Thermostabilität 26
6.2. Ergebnisse 26
6.2.1. Klonierung der Subtilisin 309- und 147-Gene 26
6.2.2. Erzeugung von positionsspezifischen Mutationen des Subtilisin 309-Gens 30
6.2.3. Expression von mutanten Subtilisinen 32
6.2.4. Oxidationsstabilität von mutanten Subtilisinen 33
6.2.5. Proteolytische Aktivität von mutanten Subtil isinen 33
6.2.6. Waschvermögen von mutanten Subtilisinen 34
6.2.7. Thermostabilität von mutanten Subtilisinen 34
6.3. Diskussion 35

Claims

1. Detergens-Zusammensetzung umfassend ein Oxidationsmittel und eine Mutante eines Subtilisin-Enzyms mit einer Aminosäuresequenz, die Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309, wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360 (NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Methioninrest in Position 222 durch Substitution mit einem anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist.

2. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei auch der Aminosäurerest in Position 195 des mutanten Subtilisin-Enzytris durch Substitution mit einem anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist.

3. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Methioninrest an Position 222 durch Cystein oder Alanin substituiert ist.

4. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Glycinrest an Position 195 durch Glutaminsäure und der Methioninrest an Position 222 durch Alanin oder Cystein substituiert ist.

5. Mutantes Subtilisin-Enzym umfassend eine Aminosäuresequenz, die Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309, wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360 (NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Methioninrest in Position 222 durch Cystein oder Alanin substituiert ist.

6. Mutantes Subhhsin-Enzym umfassend eine Aminosäuresequenz, die Zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309, wie in Tabelle I(a) dargestellt, homolog ist, und von B. lentus C360 (NCIB 10309) erhältlich ist, und wobei der Glycinrest in Position 195 durch Glutaminsäure und der Methioninrest in Position 222 durch Alanin oder Cystein substituiert ist.

7. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Subtilisin-Enzym codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt mit mindestens 80 % Homologie mit der Aminosäuresequenz wie in Tabelle I(a) dargestellt, in dem die Nukleinsäuresequenz derart geändert worden ist, daß die codierte Aminosäuresequenz dadurch einem mutanten Subtilisin-Enzym nach Anspruch 5 oder 6 entspricht.

8. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die fur das Subtilisin 309-Enzym codiert, im wesentlichen wie in Tabelle II dargestellt, in dem die Nukleinsäuresequenz derart geändert worden ist, daß die codierte Aminosäuresequenz dadurch einem mutanten Subtilisin 309-Enzym nach Anspruch 5 oder 6 entspricht.

9. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 7 oder 8 Zur Herstellung eines Subtilisin-Enzyms.