BR112020021692A2

BR112020021692A2 - polipeptídeo tendo atividade de lipase, polipeptídeo híbrido, composição, polinucleotídeo variante, método para fabricar a variante de polipeptídeo, e, uso do polipeptídeo

Info

Publication number: BR112020021692A2
Application number: BR112020021692-5A
Authority: BR
Inventors: Katie Kline; Adrienne Huston Davenport; Xuqiu Tan; Oliver Spangenberg; Claudia Esper; Amy Migliori
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2021-01-26
Also published as: US20210095266A1; EP3784779A1; US11732250B2; CN112368375A; WO2019206994A1

Abstract

variantes de polipeptídeo engenheiradas tendo atividade enzimática de lipase, composições compreendendo as enzimas e métodos de fabricar e usar as enzimas. as enzimas de lipase geneticamente engenheiradas são úteis em muitas aplicações diferentes, tais como detergentes para lavar roupas, detergentes para lavar louças e produtos de limpeza para lares, indústria, cuidados com veículos, panificação, ração animal, processamento de polpa e papel, processamento de amido, produção de biodiesel e etanol.

Description

1 / 95 POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE LIPASE, POLIPEPTÍDEO HÍBRIDO, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO VARIANTE, MÉTODO PARA FABRICAR A VARIANTE DE POLIPEPTÍDEO, E, USO DO

POLIPEPTÍDEO

[001] Este pedido inclui uma listagem de sequências de nucleotídeo e aminoácido na forma legível por computador (CRF) como um arquivo de texto ASC II (.txt) de acordo com o “Standard for the Presentation of Nucleotide and Aminoacid Sequence Listings in International Patent Applications Under the Patent Cooperation Treaty (PCT)” ST,25. As listagens de sequências são identificadas abaixo e são deste modo, incorporadas por referência no relatório descritivo deste pedido na sua totalidade e para todos os propósitos. Nome do Arquivo Data de Criação Tamanho 161154_SequenceListing_ST25.txt 20 de março de 2018 5,66 KB (5,801 bytes)

[002] Enzimas de lipase geneticamente engenheiradas, as composições compreendendo as enzimas e os métodos usando as enzimas ou composições compreendendo as enzimas. As enzimas de lipase geneticamente engenheiradas são úteis em muitas aplicações diferentes tais como detergentes para roupas, detergentes para lavagem de louças e produtos de limpeza para casas, indústrias, cuidados veiculares, panificação, alimentação animal, processamento de papel e polpa, processamento de amido e produção de etanol. As lipases foram utilizadas na remoção das cepas lipídicas e foram adicionadas às várias composições tais como produtos de limpeza. As presentes composições de limpeza e/ou tecido compreendem as formulações de muitos ingredientes ativos impactam a capacidade das lipases de remover as cepas lipídicas. Deste modo, existe a necessidade quanto enzimas de lipase geneticamente engenheiradas que podem funcionar no ambiente severo das composições usadas para limpeza. Descrição Resumida das Diversas Vistas dos Desenhos

[003] A Figura 1 mostra que a seletividade de ácido graxo pelas enzimas de lipase é através dos diferentes substratos de pNP.

2 / 95

[004] A Figura 2 mostra a atividade de estabilidade das enzimas de lipase na presença de protease. Descrição Detalhada da Invenção

[005] Uma enzima é uma molécula biológica (polipeptídeo) compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácido, em que a enzima pode catalisar uma reação. Os nomes de enzimas são determinados com base nas recomendações da Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). As enzimas são definidas por um número EC (Enzyme Commission), nome recomendado, os nomes alternativos (se aplicável), atividade catalítica e outros fatores. As enzimas também são conhecidas como um polipeptídeo, uma proteína, um peptídeo, ou são descritas nas patentes e pedidos de patente por um número de identificação de sequência (SEQ ID NO.). Os nomes alternativos para enzimas podem ser usados intercambiavelmente.

[006] As enzimas são obtidas a partir de ou derivadas das muitas fontes diferentes incluindo: plantas; animais; bactérias, arqueia, fungos, levedura, amostras ambientais contendo DNA que codifica uma enzima, ou as enzimas podem ser sintéticas geradas em um laboratório. Por exemplo, as fontes bacterianas das enzimas incluem as enzimas derivadas da Bacillus, Streptomyces, E. coli e Pseudomonas; fontes fúngicas das enzimas incluem as enzimas derivadas da Aspergillus, Fusarium, Thermomyces e Trichoderma; fontes de levedura das enzimas incluem as enzimas derivadas da Pichia e Saccharomyces.

[007] É conhecido que classes diferentes de enzimas são úteis nos detergentes e produtos de limpeza, incluindo: lipase, amilase, protease, celulase, mananase, pectato liase e nuclease; entretanto, existe uma necessidade na indústria para prover uma lipase que tenha mais atividade, perfil de temperatura, perfil de pH, tenha desempenho melhorado (remoção de mancha), estabilidade na presença de protease, reduza a quantidade de tensoativo em uma

3 / 95 formulação detergente, nenhum odor, ou uma combinação dos mesmos. As enzimas de lipase de polipeptídeo variantes tratam destas necessidades industriais.

[008] A Norma ST.25 do World Intellectual Property Office (WIPO) (1998) provê que os resíduos de aminoácido devem ser representados na listagem de sequência usando os seguintes símbolos de três letras com a primeira letra como uma maiúscula. A Tabela abaixo provê uma vista geral dos identificadores do aminoácido assim como os códons de DNA correspondentes que codificam o aminoácido usando o padrão do padrão genético. Os códons de DNA que codificam resíduos de aminoácido podem ser diferentes dependendo do organismo que é usado e tabelas levemente diferentes para a tradução do código genético podem ser aplicadas. Uma compilação código não padrão as tabelas de tradução são mantidas na NCBI. Para referência visite, por exemplo, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi.

[009] Uma sequência de aminoácido de polipeptídeo “precursora” é a sequência de partida para a introdução de mutações (por exemplo, pela introdução de uma ou mais substituições, inserções, exclusões de aminoácido, ou uma combinação das mesmas) para a sequência, resultando em “variantes” das sequências de aminoácido de polipeptídeo precursoras. Um precursor inclui: Uma sequência de aminoácido de polipeptídeo tipo selvagem ou sequência de aminoácido de polipeptídeo sinteticamente gerada que são usadas como sequência de partida para a introdução de mudanças (adicionais). O polipeptídeo precursor aqui é um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0010] Um “polipeptídeo variante” se refere a uma enzima que difere do seu precursor na sua sequência de aminoácido. Embora a definição abaixo descreva variantes no contexto de mudanças de aminoácido, ácidos nucléicos podem ser similarmente modificados, por exemplo, pelas substituições.

[0011] A invenção se refere a um polipeptídeo variante tendo atividade

4 / 95 de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o dito polipeptídeo variante tem um aumento em pelo menos uma característica selecionada de atividade enzimática, estabilidade em pH, estabilidade contra degradação proteolítica e estabilidade em formulação detergente, ou qualquer combinação dos mesmos quando comparada a uma lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com a aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e/ou quando comparado a uma lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R.

[0012] Em uma modalidade, o polipeptídeo variante tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 tem um aumento em pelo menos uma característica selecionada de atividade enzimática, estabilidade em pH, estabilidade contra degradação proteolítica e estabilidade em formulação detergente, ou qualquer combinação dos mesmos quando comparada a uma lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0013] O polipeptídeo variante da invenção pode compreender mudanças selecionadas de inserção, deleção, ou substituição de resíduos de

5 / 95 aminoácido. O dito polipeptídeo variante pode compreender pelo menos uma substituição de pelo menos uma das seguintes posições de resíduo de aminoácido: 14, 64, 67, 79, 145, 263, 265, 266, 272, 275, 291, 293, 297, 298, 303, 307, 308, 310, 340, 347, 375, 377, 405, 407, ou qualquer combinação dos mesmos para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. O número de está fundamentado na sequência de aminoácido provida como SEQ ID NO: 1.

[0014] Especificamente, o polipeptídeo variante da invenção pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada dentre K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, e L407G. Em uma modalidade, o polipeptídeo variante compreende mais do que uma das ditas substituições.

[0015] A invenção se refere a um polipeptídeo variante tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo variante é uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo como apresentado na SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo variante tem uma combinação de modificações de aminoácido para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo consistindo em: (a1) N291A, 405L; (b1) W79F, I265L, N291L; (c1) E263L, T310Q; (d1) T310Q, L407A; (e1) K145E, L407A; (f1) K64V, L407A; (g1) M298F, L407A; (h1) K145E, Y340F; (i1) T310Q, L407A; (j1) T310Q, L407A; (k1) K14E, K64V, K145E, T310Q, L407A; (l1) K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A;(m1) E263L, F297L, T310Q, L407A; (n1) E263L,

6 / 95 F297L, T310Q, L407G; (o1) P67L, E263L, F297L, T310Q; (p1) F297L, T310Q; (q1) E263L, F297L; (r1) E263L, Q377K, T310Q, L407A; (s1) E263L, Q377K, T310Q, L407G; (t1) K14E, E2363L, I265T, A303Q, T310Q; (u1) E263L, T310Q, L407A; (v1) E263L, T310Q, L407G; (w1) E263L, M298F, T310Q; (x1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (y1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407G; (z1) K64V, K145E, E263L, A303Q, T310Q; (a2) K145E, E263L, A303Q; (b2) K145E, A303Q; (c2) K145E, Y340F, Y347K, L407A; (d2) K145E, T310Q; (e2) K145E, E263L; (f2) K145E, Y347K; (g2) K145E, K64V; (h2) K145E, Y266L, A303Q; (i2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407A; (j2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407G; (k2) K145E, E263L, T310Q, L407A; (l2) K145E, E263L, T310Q, L407G; (m2) K14E, A303Q, L407A; (n2) K14E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (o2) K145W, E263L, I265T, A303Q, T310Q, L407A; (p2) K145W, I265T, A303Q, L407A; (q2) K64V, K145W, E263L, T310Q, L407A; (r2) K64V, K145W, E263L, M298F, T310Q; (s2) K64V, K145W, E263L, Y266L, T310Q; (t2) A303Q, L407A; (u2) M298F, L407G; (v2) I265T, M298F, L407A; (w2) I265T, M298F, L407G; (x2) Y266L, M298F, L407A; (y2) Y266L, M298F, L407G; (z2) P67L, F297L, L407A; (a3) P67L, F297L, L407G; (b3) I265T, L407A; (c3) Y266L, L407G; (d3) E263L, L407A; (e3) K145E, Y340F; (f3) K145E, Y340F; (g3) K145E, Y340F; (h3) K14E, A303Q, L407A; (i3) K14E, A303Q, L407A; (j3) K14E, A303Q, L407A; e (k3) K14E, K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A.

[0016] A invenção se refere a um polipeptídeo variante tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo variante é uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à

7 / 95 sequência de aminoácido de tamanho completo como apresentado na SEQ ID NO: 1 e o polipeptídeo variante tem um aumento na atividade enzimática, estabilidade em pH, estabilidade contra degradação proteolítica e estabilidade em formulação detergente, ou qualquer combinação dos mesmos quando comparada à lipase da SEQ ID NO: 1.

[0017] “Substituições” são descritas provendo-se o aminoácido original seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido pelo aminoácido substituído. Um resíduo de aminoácido específico pode ser substituído com qualquer um dos 19 resíduos de aminoácido diferentes do original. Por exemplo, a substituição de histidina na posição 120 com alanina é indicada como “His120Ala” ou “H120A”.

[0018] As exclusões de aminoácido são descritas provendo-se o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido por *.

[0019] As inserções de aminoácido são descritas provendo-se o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido pelo aminoácido original e o aminoácido adicional. Por exemplo, uma inserção na posição 180 da lisina próximo à glicina é indicada como “Gly180GlyLys” ou “G180GK”.

[0020] A invenção se refere aos fragmentos dos polipeptídeos variantes, em que os ditos fragmentos de polipeptídeo têm atividade de lipase.

[0021] Um “fragmento”, ou “subsequência” como aqui usado é uma porção de uma sequência de aminoácido, em que os fragmentos ou subsequências retêm pelo menos uma atividade funcional da sequência à qual está relacionada.

[0032] Em uma modalidade, o termo “fragmento funcional” se refere a qualquer sequência de aminoácido que compreende meramente uma parte da sequência de aminoácido de comprimento total do polipeptídeo variante da invenção, mas ainda tem atividade e/ou função iguais ou similares. O

8 / 95 fragmento compreende pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% da sequência original. O fragmento funcional compreende aminoácidos contíguos comparados à sequência de aminoácido original.

[0022] A invenção se refere a um polipeptídeo variante tendo atividade de lipase, em que a variante compreende um híbrido de pelo menos um polipeptídeo variante da invenção e um segundo polipeptídeo tendo atividade de lipase, em que o híbrido tem atividade de lipase. Um “híbrido” ou “quimérico” ou “proteína de fusão” significa que um fragmento da sequência de aminoácido de uma primeira enzima é combinado com um fragmento da sequência de aminoácido de uma segunda enzima para formar uma enzima híbrida em que o híbrido tem uma atividade enzimática.

[0023] As enzimas híbridas podem ser engenheiradas com fragmentos funcionais da sequência de aminoácidos de mais do que duas enzimas. O híbrido pode compreender um domínio catalítico de uma lipase desta invenção e um ou mais domínio catalíticos de lipases comercialmente disponíveis tais como: LipolaseTM, LipexTM, LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (Gist-Brocades/ agora DSM), em que o híbrido tem atividade de lipase.

[0024] Em uma modalidade, pelo menos um fragmento funcional de uma lipase inventiva é combinado com pelo menos um fragmento funcional de uma lipase selecionada de lipase de triacilglicerol fúngico (EC classe 3,1,1,3). A lipase de triacilglicerol fúngico pode ser selecionada de uma lipase de Thermomyces lanuginosa. Em uma modalidade, a lipase de Thermomyces lanuginosa é selecionada da lipase de triacilglicerol de acordo com a os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma.

[0025] A lipase de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada de

9 / 95 variantes compreendendo pelo menos as seguintes substituições de aminoácido se comparado aos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438: T231R e N233R. As ditas variantes da lipase de Thermomyces lanuginosa também podem compreender uma ou mais das seguintes trocas de aminoácido se comparado aos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438: Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.

[0026] A lipase de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada de variantes compreendendo pelo menos as substituições de aminoácido T231R, N233R, Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K dentro da sequência de polipeptídeos dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438.

[0027] A lipase de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada de variantes compreendendo as substituições de aminoácido T231R e N233R dentro dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e são pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% similares se comparado à sequência de polipeptídeos de comprimento total dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US

5869438. A lipase de Thermomyces lanuginosa pode ser uma lipase de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R.

[0028] O polipeptídeo variante da invenção é um “polipeptídeo maduro” significando uma enzima na sua forma final incluindo qualquer modificação, glicosilação, fosforilação, truncagem, modificações de N- terminal, modificações de C-terminal e exclusão de sequência de sinal, pós- translacionais. Um polipeptídeo maduro pode variar dependendo do sistema de expressão, vetor, promotor, e/ou processo de produção.

[0029] A “atividade enzimática” significa pelo menos um efeito catalítico exercido por uma enzima. A atividade enzimática é expressada como unidades por miligrama da enzima (atividade específica) ou moléculas de substrato transformadas por minuto por molécula de enzima (atividade

10 / 95 molecular). A atividade enzimática pode ser especificada pela função real da enzima, por exemplo, proteases exercendo atividade proteolítica catalisando-se a clivagem hidrolítica das ligações de peptídeo, lipases exercendo atividade lipolítica através da clivagem hidrolítica das ligações de éster, etc.

[0030] O polipeptídeo variante da invenção exerce atividade lipolítica ou atividade de lipase, que pode ser provida em unidades lipolíticas (LU). Por exemplo, 1 LU pode corresponder à quantidade de lipase que produz 1 μmol de ácido graxo titulável por minuto em um stat. de pH sob as seguintes condições: temperatura 30°C.; pH = 9,0; o substrato pode ser uma emulsão de 3,3% em peso de azeite de oliva e 3,3% de goma arábica, na presença de 13 mmol/l de Ca2+ e 20 mmol/l de NaCl em 5 mmol/l de tampão Tris.

[0031] Os métodos para determinar a atividade lipolítica são bem conhecidos na literatura (ver, por exemplo, Gupta et al. (2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71). Por exemplo, a atividade de lipase pode ser medida pela hidrólise da ligação de éster no substrato palmitato de para- nitrofenila (pNP-Palmitato, C:16) e libera pNP que é amarelo e pode ser detectado a 405 nm.

[0032] A atividade enzimática pode mudar durante o armazenamento ou uso operacional da enzima. O termo “estabilidade enzimática” se refere à retenção da atividade enzimática como uma função do tempo durante o armazenamento ou operação. O termo “armazenamento” aqui intenciona indicar o fato dos produtos, composições ou formulações serem armazenados na hora em que são fabricados no ponto de tempo se serem usados na aplicação final. A retenção da atividade enzimática como uma função de tempo durante o armazenamento em detergente pode ser aqui chamada de “estabilidade no armazenamento”. O armazenamento pode significar o armazenamento por pelo menos dois, pelo menos 7, pelo menos 14, pelo menos 21, ou pelo menos 28 dias em uma temperatura de armazenamento de 37°C. Em uma modalidade, armazenamento significa o armazenamento de uma formulação detergente

11 / 95 compreendendo pelo menos uma enzima selecionada do polipeptídeo da invenção.

[0033] Em um aspecto da invenção, armazenamento significa o armazenamento de uma formulação detergente compreendendo pelo menos duas enzimas, em que uma enzima é selecionada do polipeptídeo da invenção e a segunda enzima é selecionada de pelo menos uma protease. Em uma modalidade pelo menos uma protease é uma subtilisina que é selecionada da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP1921147 e variantes destes tendo atividade proteolítica. A variante da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP1921147 pode ser uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter o aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), ou asparagina (N), ou glutamina (Q), ou alanina (A), ou glicina (G), ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração de BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter o aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais substituições nas posições 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e/ou 274 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade

12 / 95 proteolítica. Em uma modalidade, a variante de subtilisina compreende uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D e uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h).

[0034] Para determinar e quantificar as mudanças na atividade catalítica das enzimas armazenadas ou usadas sob certas condições com o tempo, a “atividade enzimática inicial” é medida sob condições definidas no tempo zero (100%) e em um certo ponto de tempo posterior (x%). por comparação dos valores medidos, uma perda potencial da atividade enzimática pode ser determinada em seu grau. O grau da perda de atividade enzimática determina uma estabilidade ou não estabilidade enzimática.

[0035] Os parâmetros que influenciam a atividade enzimática de uma enzima e/ou estabilidade no armazenamento e/ou estabilidade operacional, são por exemplo, pH, temperatura e presença de substâncias oxidativas: Um polipeptídeo variante é ativo em um pH amplo em qualquer ponto único dentro da faixa de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 12,0. As enzimas de polipeptídeos variantes podem ser ativas em uma faixa de pH de 4,0 a pH 11,0, pH 4,0 ao pH 10,0, pH 4,0 ao pH 9,0, pH 4,0 ao pH 8,0, pH 4,0 ao pH 7,0, pH 4,0 ao pH 6,0, ou pH 4,0 ao pH 5,0. Os polipeptídeos variantes podem ser ativos no pH 4,0, pH 4,1, pH 4,2, pH 4,3, pH 4,4, pH 4,5, pH 4,6, pH 4,7, pH 4,8, pH 4,9, pH 5,0, pH 5,1, pH 5,2, pH 5,3, pH 5,4, pH 5,5, pH 5,6, pH 5,7, pH 5,8, pH 5,9, pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5, pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9, pH 8,0, pH 8,1, pH 8,2, pH 8,3, pH 8,4, pH 8,5, pH 8,6 pH 8,7,

13 / 95 pH 8,8 pH 8,9, pH 9,0, pH 9,1, pH 9,2, pH 9,3, pH 9,4, pH 9,5, pH 9,6, pH 9,7, pH 9,8, pH 9,9, pH 10,0, pH 10,1, pH 10,2, pH 10,3, pH 10,4, pH 10,5, pH 10,6, pH 10,7, pH 10,8, pH 10,9, pH 11,0, pH 11,1, pH 11,2, pH 11,3, pH 11,4, pH 11,5, pH 11,6, pH 11,7, pH 11,8, pH 11,9, pH 12,0, pH 12,1, pH 12,2, pH 12,3, pH 12,4 e pH 12,5, pH 12,6, pH 12,7, pH 12,8, pH 12,9 e maiores.

[0036] Uma “estabilidade de pH”, se refere à capacidade de uma enzima exercer atividade enzimática em uma faixa de pH específica.

[0037] Os polipeptídeos variantes são ativos em uma temperatura ampla, em que a temperatura é qualquer ponto na faixa de cerca de 10°C a cerca de 60°C. Os polipeptídeos variantes podem ser ativos em uma faixa de temperatura de 10°C a 55°C, 10°C a 50°C, 10°C a 45°C, 10°C a 40°C, 10°C a 35°C, 10°C a 30°C, ou 10°C a 25°C Os polipeptídeos variantes podem ser ativos em uma faixa de temperatura de 20°C a 55°C, 20°C a 50°C, 20°C a 45°C, 20°C a 40°C, 20°C a 35°C, 20°C a 30°C, ou 20°C a 25°C. Os polipeptídeos variantes podem ser ativos em uma temperatura de pelo menos 10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, ou temperaturas mais elevadas.

[0038] Os termos “estabilidade térmica” e “termoestabilidade” se referem à capacidade de uma proteína de exercer atividade catalítica em uma temperatura específica, ou dentro de uma faixa de temperatura. As enzimas geralmente têm uma faixa finita de temperaturas na qual estas exercem atividade catalítica. Além das enzimas que exercem atividade catalítica em temperaturas de faixa média (por exemplo, temperatura ambiente), existem enzimas que são capazes de exercer atividade catalítica em temperaturas muito altas ou muito baixas. A termoestabilidade pode ser distinguida pelo o que é conhecido como o valor T50 (também chamado de meia vida, ver acima). A T50

14 / 95 indica a temperatura na qual 50% de atividade enzimática residual ainda está presente depois da inativação térmica por um certo tempo quando comparado com uma amostra de referência que não foi submetida ao tratamento térmico.

[0039] Os termos “tolerância térmica” e “termotolerância” se referem à capacidade de uma proteína exercer a atividade catalítica depois da exposição a uma temperatura particular, tal como uma temperatura muito alta ou muito baixa. Uma proteína termotolerante pode não exercer atividade catalítica na temperatura de exposição, mas exerce atividade catalítica uma vez retornada a uma temperatura favorável.

[0040] A invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos variantes da invenção. Os termos “polinucleotídeo(s)”, “sequência(s) de ácido nucléico”, “sequência(s) de nucleotídeo”, “ácido(s) nucléico(s)”, “molécula de ácido nucléico” são aqui usados intercambiavelmente e se referem aos nucleotídeos, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento. Um “gene” é um segmento de DNA que carrega uma certa informação genética.

[0041] Uma sequência de polinucleotídeos “precursora” é a sequência de partida para a introdução de mutações à sequência, resultando em “variantes” da dita sequência de polinucleotídeos precursora. A sequência de polinucleotídeos precursora é uma sequência de polinucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 2. Um “polinucleotídeo variante” se refere a um polinucleotídeo que codifica a mesma enzima como faz o polinucleotídeo precursor. O polinucleotídeo variante neste caso difere do seu polinucleotídeo precursor na sua sequência de ácido nucléico, entretanto o polipeptídeo codificado permanece inalterado.

[0042] O polinucleotídeo variante da invenção, em um aspecto, tem uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos 80% idêntica ou similar se comparada à sequência de polinucleotídeos de comprimento total da SEQ ID

15 / 95 NO:2. O polinucleotídeo variante da invenção pode ter uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar se comparada à sequência de polinucleotídeos de comprimento total da SEQ ID NO:2.

[0043] Em uma modalidade, o polinucleotídeo variante que é pelo menos 80% idêntico ou similar se comparado à sequência de polinucleotídeos de comprimento total da SEQ ID NO:2, codifica uma sequência de polipeptídeos tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1.

[0044] Um polinucleotídeo variante de acordo com a invenção codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1. O polinucleotídeo da invenção pode codificar um polipeptídeo tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1.

[0045] Em uma modalidade, o polinucleotídeo variante da invenção codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 que compreende uma

16 / 95 inserção, exclusão, ou substituição de resíduos de aminoácido para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. A inserção, exclusão, ou substituição de resíduos de aminoácido pode ser na posição de resíduo de aminoácido número 14, 64, 67, 79, 145, 263, 265, 266, 272, 275, 291, 293, 297, 298, 303, 307, 308, 310, 340, 347, 375, 377, 405, 407, ou qualquer combinação dos mesmos. Uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada de K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, L407G, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0046] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polinucleotídeo variante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo como apresentado na SEQ ID NO: 1, em que a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 compreende pelo menos uma substituição selecionada de K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, L407G.

[0047] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polinucleotídeo variante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo

17 / 95 menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo como apresentado na SEQ ID NO: 1, em que a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 compreende mais do que uma substituição selecionada de K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, L407G.

A sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 pode compreender uma combinação selecionada de (a1) N291A, 405L; (b1) W79F, I265L, N291L; (c1) E263L, T310Q; (d1) T310Q, L407A; (e1) K145E, L407A; (f1) K64V, L407A; (g1) M298F, L407A; (h1) K145E, Y340F; (i1) T310Q, L407A; (j1) T310Q, L407A; (k1) K14E, K64V, K145E, T310Q, L407A; (l1) K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A;(m1) E263L, F297L, T310Q, L407A; (n1) E263L, F297L, T310Q, L407G; (o1) P67L, E263L, F297L, T310Q; (p1) F297L, T310Q; (q1) E263L, F297L; (r1) E263L, Q377K, T310Q, L407A; (s1) E263L, Q377K, T310Q, L407G; (t1) K14E, E2363L, I265T, A303Q, T310Q; (u1) E263L, T310Q, L407A; (v1) E263L, T310Q, L407G; (w1) E263L, M298F, T310Q; (x1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (y1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407G; (z1) K64V, K145E, E263L, A303Q, T310Q; (a2) K145E, E263L, A303Q; (b2) K145E, A303Q; (c2) K145E, Y340F, Y347K, L407A; (d2) K145E, T310Q; (e2) K145E, E263L; (f2) K145E, Y347K; (g2) K145E, K64V; (h2) K145E, Y266L, A303Q; (i2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407A; (j2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407G; (k2) K145E, E263L, T310Q, L407A; (l2) K145E, E263L, T310Q, L407G; (m2) K14E, A303Q, L407A; (n2) K14E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (o2) K145W, E263L, I265T, A303Q, T310Q, L407A; (p2) K145W, I265T, A303Q, L407A; (q2) K64V, K145W, E263L, T310Q, L407A; (r2) K64V, K145W, E263L, M298F, T310Q; (s2) K64V, K145W, E263L, Y266L, T310Q; (t2) A303Q,

18 / 95 L407A; (u2) M298F, L407G; (v2) I265T, M298F, L407A; (w2) I265T, M298F, L407G; (x2) Y266L, M298F, L407A; (y2) Y266L, M298F, L407G; (z2) P67L, F297L, L407A; (a3) P67L, F297L, L407G; (b3) I265T, L407A; (c3) Y266L, L407G; (d3) E263L, L407A; (e3) K145E, Y340F; (f3) K145E, Y340F; (g3) K145E, Y340F; (h3) K14E, A303Q, L407A; (i3) K14E, A303Q, L407A; (j3) K14E, A303Q, L407A; e (k3) K14E, K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A.

[0048] O polinucleotídeo da invenção, em um aspecto, codifica um polipeptídeo variante tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo variante é uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo como apresentado na SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo variante exerce atividade enzimática, estabilidade em pH e estabilidade contra degradação proteolítica aumentadas, ou qualquer combinação dos mesmos se comparado à lipase da SEQ ID NO: 1.

[0049] O polinucleotídeo variante da invenção, em um aspecto, codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 tem um aumento em pelo menos uma característica selecionada de atividade enzimática, estabilidade em pH, estabilidade contra degradação

19 / 95 proteolítica e estabilidade em formulação detergente e qualquer combinação dos mesmos quando comparado a uma lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e/ou quando comparado a uma lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R.

[0050] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo é um fragmento da sequência de aminoácido de comprimento total inventivo como descrito acima.

[0051] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo é um híbrido de pelo menos um polipeptídeo inventivo e pelo menos um polipeptídeo diferente do polipeptídeo inventivo Em uma modalidade, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo é um híbrido de pelo menos um polipeptídeo inventivo e pelo menos uma lipase diferente do polipeptídeo inventivo

[0052] O polinucleotídeo variante e as sequências de polipeptídeo variante pode ser definido por sua “identidade de sequência” quando comparado a uma sequência precursora. A identidade de sequência é geralmente provida como “% identidade de sequência” ou “% de identidade”. Para o cálculo das Identidades de Sequência, em uma primeira etapa, um alinhamento de sequência deve ser produzido. De acordo com esta invenção, um alinhamento global aos pares deve ser produzido, significando que as ditas sequências devem ser alinhadas sobre seu comprimento completo, que é geralmente produzido usando-se um método matemático, chamado de algoritmo de alinhamento.

[0053] De acordo com a invenção, o alinhamento é gerado usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453).

20 / 95 Preferivelmente, o programa “NEEDLE” (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) é usado para os propósitos da presente invenção, com o uso do parâmetro padrão dos programas (polinucleotídeos: abertura de interstício = 10,0, extensão de interstício = 0,5 e matriz = EDNAFULL; polipeptídeos: abertura de interstício = 10,0, extensão de interstício = 0,5 e matriz = EBLOSA62).

[0054] Depois de alinhar as duas sequências, em uma segunda etapa, um valor de identidade é determinado a partir do alinhamento produzido.

[0055] Em uma modalidade, a identidade em % é calculada dividindo- se o número de resíduos idênticos pelo comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção sobre seu comprimento completo multiplicado com 100:%-identidade = (resíduos idênticos/ comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção sobre seu comprimento completo) *100.

[0056] Em uma modalidade preferida, a identidade em % é calculada dividindo-se o número de resíduos idênticos pelo comprimento da região de alinhamento que está mostrando as duas sequências alinhadas sobre seu comprimento completo multiplicado com 100: identidade em % = (resíduos idênticos/comprimento da região de alinhamento que está mostrando as duas sequências alinhadas sobre seu comprimento completo) *100.

[0057] Os polipeptídeo variantes podem ser definidos pela sua “semelhança de sequência” quando comparado a uma sequência precursora. A semelhança de sequência é geralmente provida como “% de semelhança de sequência” ou “semelhança em %”. A % de semelhança de sequência leva em consideração que os conjuntos definidos dos aminoácidos compartilham propriedades similares, por exemplo, por seu tamanho, por sua hidrofobicidade, por sua carga, ou por outras características. Aqui, a troca de um aminoácido com um aminoácido similar pode ser chamado “mutação conservativa”. Os aminoácidos similares de acordo com a invenção são definidos como segue: o

21 / 95 aminoácido A é similar ao aminoácido S; o aminoácido D é similar aos aminoácidos E e N; o aminoácido E é similar aos aminoácidos D, K e Q; o aminoácido F é similar aos aminoácidos W e Y; o aminoácido H é similar aos aminoácidos N e Y; o aminoácido I é similar aos aminoácidos L, M e V; o aminoácido K é similar aos aminoácidos E, Q e R; o aminoácido L é similar aos aminoácidos I, M e V; o aminoácido M é similar aos aminoácidos I, L e V; o aminoácido N é similar aos aminoácidos D, H e S; o aminoácido Q é similar aos aminoácidos E, K e R; o aminoácido R é similar aos aminoácidos K e Q; o aminoácido S é similar aos aminoácidos A, N e T; o aminoácido T é similar aos aminoácidos S; o aminoácido V é similar aos aminoácidos I, L e M; o aminoácido W é similar aos aminoácidos F e Y; o aminoácido Y é similar aos aminoácidos F, H e W.

[0058] As substituições conservativas de aminoácido podem ocorrer sobre o comprimento total da sequência de uma sequência de polipeptídeos de uma proteína funcional tal como uma enzima. Em uma modalidade, tais mutações não são pertencentes aos domínios funcionais de uma enzima. Em uma modalidade, as mutações conservativas não são pertencentes aos centros catalíticos de uma enzima.

[0059] Para o cálculo da semelhança de sequência, em uma primeira etapa um alinhamento de sequência deve ser produzido como descrito acima.

[0060] Em uma modalidade, a semelhança em % é calculada dividindo- se o número de resíduos idênticos mais o número de resíduos similares pelo comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção sobre seu comprimento completo multiplicado por 100: semelhança em % = [(resíduos idênticos + resíduos similares)/comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção sobre seu comprimento completo] *100.

[0061] Em uma modalidade preferida, a semelhança em % é calculada dividindo-se o número de resíduos idênticos mais o número de resíduos

22 / 95 similares pelo comprimento da região de alinhamento que está mostrando as duas sequências alinhadas sobre seu comprimento completo multiplicado com 100: semelhança em % = [(resíduos idênticos + resíduos similares)/comprimento da região de alinhamento que está mostrando as duas sequências alinhadas sobre seu comprimento completo] *100.

[0062] Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pode ser “expressado”. A “expressão” geralmente descreve o processo sofrido por uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo para realmente produzir o dito polipeptídeo em um organismo.

[0063] A produção industrial das enzimas é geralmente realizada usando-se os sistemas de expressão. As “células do tipo selvagem” aqui significam as células antes de uma certa modificação. O termo “célula recombinante” (também aqui chamado de “célula geneticamente modificada”) se refere a uma célula que foi geneticamente alterada, modificada ou engenheiradas tal que esta apresenta um genótipo alterado, modificado ou diferente se comparado à célula do tipo selvagem da qual esta foi derivada. A “célula recombinante” pode compreender um polinucleotídeo exógeno que codifica uma certa proteína ou enzima e, portanto, pode expressar a dita proteína ou enzima.

[0064] O “sistema de expressão” pode significar um microrganismo hospedeiro, hospedeiros de expressão, célula hospedeira, organismo de produção, ou cepa de produção e cada um destes termos pode ser usado intercambiavelmente. Os exemplos de sistemas de expressão incluem, mas não são limitados a: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Hansenula polimorpha, Thermomyces lanuginosus, fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Escherichia coli, Bacillus, preferivelmente Bacillus subtilis, ou Bacillus licheniformis, Pseudomonas, preferivelmente Pseudomonas fluorescens, Pichia pastoris (também conhecido como Komagataella phaffii), Myceliopthora thermophile (C1), Thermothelomyces thermophila,

23 / 95 Schizosaccharomyces pombe, Trichoderma, preferivelmente Trichoderma reesei e Saccharomyces, preferivelmente Saccharomyces cerevisiae. Os polipeptídeos variantes são produzidos usando o sistema de expressão listado acima.

[0065] O termo “que não de ocorrência natural” se refere a um (poli)nucleotídeo, aminoácido, (poli)peptídeo, enzima, proteína, célula, organismo, ou outro material que não está presente no seu ambiente ou fonte de ocorrência natural original.

[0066] O termo “heterólogo” (ou exógeno, externo ou recombinante) no contexto dos polinucleotídeos e polipeptídeos é aqui definido como: (a) não nativo à célula hospedeira; (b) nativo à célula hospedeira; entretanto, as modificações estruturais, por exemplo, exclusões, substituições, e/ou inserções, são incluídas como um resultado da manipulação do DNA da célula hospedeira através das técnicas de DNA recombinante para alterar a sequência nativa; ou (c) nativo à célula hospedeira, mas a expressão é quantitativamente alterada ou a expressão é direcionada de um local genômico diferente da célula hospedeira nativa como um resultado da manipulação do DNA da célula hospedeira através de técnicas de DNA recombinante, por exemplo, um promotor mais forte.

[0067] Com relação às duas ou mais sequências de polinucleotídeos ou duas ou mais sequências de aminoácidos, o termo “heterólogo” é usado para caracterizar que as duas ou mais sequências de polinucleotídeos ou duas ou mais sequências de aminoácidos não ocorrem naturalmente na combinação específica uns com os outros.

[0068] “Construto Genético” ou “cassete de expressão” como aqui usados, é uma molécula de DNA composta de pelo menos uma sequência de interesse a ser expressada, operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle (pelo menos a um promotor) como aqui descrito. Tipicamente, o

24 / 95 cassete de expressão compreende três elementos: uma sequência promotora, um quadro de leitura aberto e uma região 3’ não traduzida que, nos eucariotas, geralmente contém um sítio de poliadenilação. Os elementos reguladores adicionais podem incluir realçadores transcricionais assim como traducionais. Uma sequência de íntrons também pode ser adicionada à região 5’ não traduzida (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que acumula no citosol. O cassete de expressão pode ser parte de um vetor ou pode ser integrado ao genoma de uma célula hospedeira e replicado junto com o genoma de sua célula hospedeira. O cassete de expressão é geralmente capaz de aumentar ou diminuir a expressão.

[0069] O termo “vetor” como aqui usado compreende qualquer tipo de construto adequado para realizar as sequências externas de polinucleotídeos para transferir para uma outra célula, ou para expressão estável ou transitória dentro de uma dada célula. O termo “vetor” como aqui usado abrange qualquer tipo de veículos de clonagem, tal como, mas não limitado aos plasmídeos, fagomídeos, vetores virais (por exemplo, fagos), bacteriofago, baculovírus, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos artificiais e/ou quaisquer outros vetores específicos para os hospedeiros específicos de interesse. Os vetores com baixo número de cópias ou alto número de cópias também estão incluídos. As sequências externas de polinucleotídeos geralmente compreendem uma sequência de codificação que pode ser aqui indicada como “gene de interesse”. O gene de interesse pode compreender íntrons e éxons, dependendo do tipo de origem ou destino da célula hospedeira.

[0070] Um vetor como aqui usado pode prover segmentos para a transcrição e a tradução de um polinucleotídeo externo na transformação em uma célula hospedeira ou organelas de célula hospedeira. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências de nucleotídeo reguladoras, uma ou mais origens de replicação que são necessárias para sua manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico, um ou mais marcadores selecionáveis, um

25 / 95 sinal poliadenilação, um sítio adequado para a inserção das sequências de codificação externas tal como um sítio de clonagem múltipla, etc. Um exemplo é quando um vetor é necessário ser mantido em uma célula bacteriana como um elemento genético epissômico (por exemplo, molécula de plasmídeo ou cosmídeo). Os exemplos não limitantes de origens adequadas de replicação incluem o f1-ori e colE1.

[0071] Um vetor pode replicar sem integrar no genoma de uma célula hospedeira, por exemplo, como um plasmídeo em uma célula bacteriana hospedeira, ou pode integrar parte ou todo seu DNA no genoma da célula hospedeira e deste modo levar à replicação e expressão de seu DNA.

[0072] O ácido nucléico externo pode ser introduzido em um vetor por intermédio da clonagem. A clonagem pode significar que através da clivagem do vetor (por exemplo, dentro do sítio de clonagem múltipla) e o polinucleotídeo externo por meios e métodos adequados (por exemplo, enzimas de restrição), o ajuste das estruturas dentro dos ácidos nucléicos individuais pode ser criado o qual permite a fusão controlada do dito ácido nucléico externo e do vetor.

[0073] Uma vez introduzido no vetor, o ácido nucléico externo compreendendo uma sequência de codificação pode ser adequado para ser introduzido (transformado, transduzido, tansfectado, etc.) em uma célula hospedeira ou organelas de célula hospedeira. Um vetor de clonagem pode ser escolhido adequadamente para expressão da sequência externa de polinucleotídeos na célula hospedeira ou organelas de célula hospedeira.

[0074] O termo “introdução” ou “transformação” como aqui indicado abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método usado para transferir. Isto é, o termo “transformação” como aqui usado é independente do vetor, sistema de transporte, ou célula hospedeira e este não se refere apenas ao método de transferência de polinucleotídeo da transformação como conhecido na técnica

26 / 95 (conforme, por exemplo, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), mas este abrange qualquer outro tipo de método de transferência de polinucleotídeos, tais como, mas não limitados a, transdução ou transfecção. O tecido vegetal passível da propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um Construto Genético e uma planta integral regenerada a partir deste. O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonais disponíveis e melhor adequado, para as espécies particulares sendo transformadas.

[0075] Em uma modalidade da invenção, um vetor é usado para a transformação de uma célula hospedeira.

[0076] O polinucleotídeo pode ser transitoriamente ou estavelmente introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. A “transformação estável” pode significar que a célula transformada ou a organela celular passa o ácido nucléico compreendendo a sequência externa de codificação nas próximas gerações da célula ou organelas celulares. Geralmente, a transformação estável é devido à integração do ácido nucléico compreendendo uma sequência externa de codificação nos cromossomos ou como um epissoma (parte separada do DNA nuclear).

[0077] “Transformação transitória” pode significar que a célula ou organela celular uma vez transformada expressa a sequência externa de ácido nucléico por um certo tempo – principalmente dentro de uma geração. A transformação geralmente transitória é devido ao ácido nucléico compreendendo uma sequência externa de ácido nucléico não integrada aos cromossomos ou como um epissoma.

[0078] Alternativamente, esta pode ser integrada no genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode ser então usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida às pessoas

27 / 95 habilitadas na técnica.

[0079] As células recombinantes podem apresentar uma expressão “aumentada” ou “diminuída” se comparado à respectiva célula do tipo selvagem.

[0080] O termo “expressão aumentada”, “expressão aumentada” ou “sobre-expressão” como aqui usado significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão do tipo selvagem original (que pode ser a ausência de expressão ou também a expressão imensurável). Aqui, a referência à “expressão aumentada”, “expressão aumentada” ou “sobre-expressão” é intencionada significar a um aumento na expressão genética e/ou, contanto que se referindo aos polipeptídeos, os níveis de polipeptídeo aumentados e/ou atividade de polipeptídeo aumentada, com relação aos organismos de controle. O aumento na expressão pode estar na ordem crescente de preferência, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou 100% ou ainda mais comparado àquele dos organismos de controle.

[0081] Os métodos para a expressão crescente dos genes ou produtos genéticos, por exemplo, sobre-expressão conduzida através dos promotores apropriados, o uso de potenciadores de transcrição ou a potenciadores de tradução. Os ácidos nucléicos isolados que servem como elementos promotores ou potenciadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente à montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a aumentar a expressão de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo através da mutação, exclusão, e/ou substituição (ver, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., WO 93/22443), ou promotores isolados podem ser introduzidos em um organismo na orientação e distância apropriadas de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene.

28 / 95

[0082] Uma sequência de íntrons também pode ser adicionada à região 5’ não traduzida (UTR) ou à sequência de codificação da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que acumula no citosol. A inclusão de um intron emendável na unidade de transcrição nos construtos de expressão foi mostrada aumentar a expressão genética tanto no mRNA quanto os níveis de proteína até 1000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Tal aprimoramento de íntrons da expressão genética é tipicamente maior quando colocado próximo à terminação 5’ da unidade de transcrição.

[0083] Para obter a expressão aumentada ou sobre-expressão de um polipeptídeo, mais comumente, o ácido nucléico que codifica seu polipeptídeo é sobre-expressado na orientação de sentido com um sinal de poliadenilação. Os íntrons ou outros elementos de aprimoramento podem ser usados além de um promotor adequado para conduzir a expressão com o padrão de expressão intencionado.

[0084] As enzimas são geralmente produzidas de modo comercial usando-se as células recombinantes que expressam a enzima desejada através do cultivo desta sob condições adequadas para expressão da enzima desejada.

[0085] O cultivo normalmente ocorre em um meio de nutriente adequado permitindo que as células recombinantes cresçam (este processo pode ser chamado de fermentação) e expressa a proteína desejada. No final da fermentação, o caldo de fermentação é coletado e pode ser novamente processado, em que o caldo de fermentação compreende uma fração líquida e uma fração sólida.

[0086] A enzima de interesse pode ser secretada (na fração líquida do caldo de fermentação) ou pode não ser secretada das células hospedeiras (e, portanto, é compreendida nas células do caldo de fermentação). Dependendo disto, a proteína ou enzima desejadas podem ser recuperadas da fração líquida

29 / 95 do caldo de fermentação ou dos lisados celulares. A recuperação da enzima desejada usa métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica. Os métodos adequados para a recuperação das proteínas ou as enzimas do caldo de fermentação incluem, mas não são limitados à coleção, centrifugação, filtração, extração e precipitação. Se a enzima de interesse precipita ou cristaliza no caldo de fermentação ou liga pelo menos em parte à matéria particulada do caldo de fermentação, etapas de tratamento adicional podem ser necessárias para liberar a enzima da biomassa ou solubilizar os cristais e precipitados enzimáticos. A US6316240B1 descreve um método para recuperar uma enzima, que precipita e/ou cristaliza durante a fermentação, do caldo de fermentação. No caso de a enzima desejada estar comprometida nas células do caldo de fermentação, a liberação da enzima das células pode ser necessária. A liberação das células pode ser obtida, por exemplo, mas não sendo limitada a, através da lise celular com técnicas bem conhecidas ao técnico habilitado.

[0087] A enzima de interesse pode ser novamente purificada do caldo de fermentação. O produto resultante pode ser chamado “produto de polipeptídeo isolado” aqui ou “produto de lipase isolado”, em que o polipeptídeo ou lipase neste contexto significam o polipeptídeo ou lipase da invenção. Os termos “purificação” ou “purificando” se referem a um processo em que pelo menos um componente, por exemplo, uma proteína de interesse, é separada de pelo menos um outro componente, por exemplo, uma matéria particulada de um caldo de fermentação e transferida em um compartimento ou fase diferente, em que os compartimentos ou fases diferentes não precisam ser necessariamente separados por uma barreira física. Os exemplos de tais compartimentos diferentes são dois compartimentos separados por uma membrana ou pano de filtração, isto é, filtrado e retentado; os exemplos de tais fases diferentes são pelota e sobrenadante ou torta e filtrado, respectivamente.

[0088] “Polipeptídeo puro tendo atividade de lipase” significa que o polipeptídeo da invenção é compreendido no produto de polipeptídeo isolado

30 / 95 em quantidades de pelo menos cerca de 80% em peso, com relação ao peso total do produto de polipeptídeo isolado.

O “polipeptídeo puro tendo atividade de lipase” pode significar que o polipeptídeo da invenção é compreendido no produto de polipeptídeo isolado em quantidades de pelo menos cerca de 81% em peso, pelo menos cerca de 82% em peso, pelo menos cerca de 83% em peso, pelo menos cerca de 84% em peso, pelo menos cerca de 85% em peso, pelo menos cerca de 86% em peso, pelo menos cerca de 87% em peso, pelo menos cerca de 88% em peso, pelo menos cerca de 89% em peso, pelo menos cerca de 90% em peso, pelo menos cerca de 91% em peso, pelo menos cerca de 92% em peso, pelo menos cerca de 93% em peso, pelo menos cerca de 94% em peso, pelo menos cerca de 95% em peso, pelo menos cerca de 96% em peso, pelo menos cerca de 97% em peso, pelo menos cerca de 98% em peso, pelo menos cerca de 99% em peso, ou 100% em peso, todos com relação ao peso total do produto de polipeptídeo.

Preferivelmente “purificado” significa que o material está em um estado puro de 100%. O “polipeptídeo puro tendo atividade de lipase” pode significar que a quantidade de compostos diferentes do polipeptídeo da invenção compreendida no produto de polipeptídeo isolado é de menos do que 20% em peso, menos do que 19% em peso, menos do que 18% em peso, menos do que 17% em peso, menos do que 16% em peso, menos do que 15% em peso, menos do que 14% em peso, menos do que 13% em peso, menos do que 12% em peso, menos do que 11% em peso, menos do que 10% em peso, menos do que 9% em peso, menos do que 8% em peso, menos do que 7% em peso, menos do que 6% em peso, menos do que 5% em peso, menos do que 4% em peso, menos do que 3% em peso, menos do que 2% em peso, ou menos do que 1% em peso, todos com relação ao peso total do produto de polipeptídeo.

Os compostos diferentes do polipeptídeo da invenção compreendidos no produto de polipeptídeo isolado podem ser, por exemplo, componentes tais como sais que se originam do meio de fermentação, detritos celulares que se originam das células hospedeiras de produção, metabólitos

31 / 95 produzidos pelas células hospedeiras de produção durante a fermentação.

[0089] A enzima produzida pela fermentação e purificada até um certo grau pode estar na forma líquida. “Líquido” é relacionado à aparência física a 20°C e 101,3 kPa.

[0090] O produto de polipeptídeo isolado pode ser novamente processado para formar uma “formulação enzimática”.

[0091] A “formulação enzimática” significa qualquer formulação não complexa compreendendo um pequeno número de ingredientes, em que os ingredientes servem ao propósito desestabilizar as enzimas compreendidas na formulação enzimática e/ou a estabilização da formulação enzimática por si. O termo “estabilidade enzimática” se refere à retenção da atividade enzimática como uma função de tempo durante o armazenamento ou operação. O termo “estabilidade da formulação enzimática” se refere à manutenção da aparência física da formulação enzimática durante o armazenamento ou operação, assim como para evitar a contaminação microbiana durante o armazenamento ou operação.

[0092] Uma “formulação enzimática” é uma composição que é intencionada ser formulada em uma formulação complexa que por si pode ser determinada para o uso final. Uma “formulação enzimática” de acordo com a invenção não é uma formulação complexa compreendendo diversos componentes, em que os componentes são formulados na formulação complexa para exercer, cada um individualmente, uma ação específica em uma aplicação final. Uma formulação complexa pode ser, sem ser limitada a estas, uma formulação detergente, em que os componentes de detergente individuais são formulados em quantidades eficazes no desempenho de lavagem da formulação detergente.

[0093] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma variante de amilase da invenção é compreendida em uma formulação enzimática.

[0094] A formulação enzimática pode ser sólida ou líquida. As

32 / 95 formulações enzimáticas podem ser obtidas usando-se técnicas conhecidas na prática. Por exemplo, sem ser limitadas a estas, as formulações enzimáticas sólidas podem ser obtidas através da extrusão ou granulação. As técnicas de extrusão e granulação adequadas são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na WO 94/19444A1 e WO 97/43482A1.

[0095] As formulações enzimáticas líquidas podem compreender quantidades de enzima na faixa de 0,1% a 40% em peso, ou 0,5% a 30% em peso, ou 1% a 25% em peso, ou 3% a 10% em peso, todos com relação ao peso total da enzima concentrada.

[0096] A formulação enzimática líquida pode compreender mais do que um tipo de enzima. Em uma modalidade, a formulação enzimática compreende uma ou mais lipases de acordo com a desestabilizar presente invenção. Em uma modalidade, a formulação enzimática compreende uma ou mais lipases de acordo com a presente invenção e pelo menos uma enzima adicional selecionada do grupo de uma lipase diferente das lipases inventivas, uma protease, uma celulase, uma amilase, um lacase, uma pectinase, uma nuclease e qualquer combinação destas. As Formulações enzimáticas aquosas da invenção podem compreender água em quantidades de mais do que cerca de 50% em peso, mais do que cerca de 60% em peso, mais do que cerca de 70% em peso, ou mais do que cerca de 80% em peso, todos com relação ao peso total da formulação enzimática.

[0097] Em uma modalidade, a formulação enzimática compreende, além de pelo menos um polipeptídeo da invenção, um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em outras enzimas, conservantes e estabilizantes.

[0098] Em uma modalidade, uma formulação enzimática líquida compreende pelo menos uma variante de polipeptídeo da invenção e pelo menos um conservante. Os exemplos não limitantes de conservantes adequados incluem compostos de amônio (quaternário), isotiazolinonas, ácidos orgânicos

33 / 95 e agentes de liberação de formaldeído. Os exemplos não limitantes de compostos de amônio (quaternário) adequados incluem cloretos de benzalcônio, polihexametileno biguanida (PHMB), Cloreto de didecildimetilamônio (DDAC) e N-(3-aminopropil)-N-dodecilpropano-1,3- diamina (Diamina). Os exemplos não limitantes de isotiazolinonas adequadas incluem 1,2-benzisotiazolin-3-ona (BIT), 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (MIT), 5- cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona (CIT), 2-octil-2H-isotiazol-3-ona (OIT) e 2- butil-benzo[d]isotiazol-3-ona (BBIT). Os exemplos não limitantes de ácidos orgânicos adequados incluem ácido benzóico, ácido sórbico, ácido L-(+)-lático, ácido fórmico e ácido salicílico. Os exemplos não limitantes de agente de liberação de formaldeído adequado incluem N,N’-metilenobismorfolina (MBM), 2,2’,2’’-(hexahidro-1,3,5-triazina-1,3,5-triil)trietanol (HHT), (etilenodióxi)di-metanol, .alpha.,.alpha.’,.alpha.’’-trimetil-1,3,5-triazina- 1,3,5(2H,4H,6H)-trietanol (HPT), 3,3’-metilenobis[5-metiloxazolidina] (MBO) e cloreto de cis-1-(3-cloroallil)-3,5,7-triaza-1- azoniaadamantano (CTAC).

[0099] Além disso, os conservantes úteis incluem butilcarbamato de iodopropinila (IPBC), compostos de liberação de halógeno tal como dicloro- dimetil-hidantoína (DCDMH), bromo-cloro-dimetil-hidantoína (BCDMH) e dibromo-dimetil-hidantoína (DBDMH); compostos bromo-nitro tais como Bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol), 2,2-dibromo-2-cianoacetamida (DBNPA); aldeídos tal como glutaraldeído; fenoxietanol; Bifenil-2-ol; e piritiona de zinco ou sódio.

[00100] Em uma modalidade, uma formulação enzimática líquida compreende pelo menos uma variante de polipeptídeo da invenção e pelo menos uma estabilizante enzimático. Um estabilizante enzimático é selecionado dentre substâncias que são capazes de reduzir a perda da atividade enzimática durante o armazenamento de pelo menos uma enzima compreendida em uma enzima líquida concentrada. A perda reduzida da

34 / 95 atividade enzimática dentro desta invenção pode significar que a perda da atividade enzimática é reduzida em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 40%, em pelo menos 50%, em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,5% se comparado à atividade enzimática inicial antes do armazenamento.

[00101] Em uma modalidade, pelo menos um estabilizante enzimático é selecionado dentre compostos estabilizantes de lipase. Uma lipase é estável de acordo com a invenção, quando sua atividade lipolítica “disponível na aplicação” é igual a 100% se comparado à atividade lipolítica inicial antes do armazenamento. Uma lipase pode ser chamada de estável dentro desta invenção se sua atividade lipolítica disponível na aplicação for de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,5% se comparado à atividade lipolítica inicial antes do armazenamento.

[00102] A lipase pode ser estabilizada na presença de pelo menos um composto selecionado dentre sais como NaCl ou KCl, ou sais alcalinos do ácido lático e ácido fórmico.

[00103] A invenção se refere a uma combinação de pelo menos um polipeptídeo variante da invenção e pelo menos uma outra enzima. Em um aspecto, tal combinação é parte de uma formulação enzimática líquida a 20°C e 101,3 kPa.

[00104] A combinação das enzimas pode ser da mesma classe, por exemplo, uma composição compreendendo uma primeira lipase e uma segunda

35 / 95 lipase. As combinações das enzimas podem ser de uma classe das enzimas diferente, por exemplo, uma composição compreendendo uma lipase e uma amilase. As combinações das enzimas podem compreender pelo menos uma lipase variante da invenção e uma outra enzima. As combinações podem compreender três enzimas, quatro enzimas, ou mais do que quatro enzimas.

[00105] “Outra enzima” significa qualquer enzima diferente das variantes de lipase da invenção. Pelo menos uma “outra enzima” pode ser selecionada de lipases, amilases, proteases, celulases, mananases, pectato liases e nucleases.

[00106] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de lipases que são diferentes dos polipeptídeos inventivos. As “lipases”, “enzima lipolítica”, “esterase lipídica”, todas se referem a uma enzima da classe EC 3,1,1 (“hidrolase do éster carboxílico”). As lipases (E.C. 3,1,1,3, Triacilglicerol lipase) geralmente hidrolisa os triglicerídeos para mono- e diglicerídeos mais hidrofílicos, ácido graxos livres e glicerol. As enzimas de lipase geralmente também incluem as enzimas que são ativas nos substratos diferentes dos triglicerídeos ou clivam os ácido graxos específicos, tais como Fosfolipase A (E.C. 3,1,1,4), Galactolipase (E.C. 3,1,1,26), cutinase (EC 3,1,1,74) e as enzimas tendo atividade de esterol esterase (EC 3,1,1,13) e/ou atividade de hidrolase de cera-éster (EC 3,1,1,50).

[00107] Muitas enzimas de lipase foram descritas nas patentes e pedidos de patente publicados incluindo, mas não limitados a: WO 2000/032758, WO 2003/089620, WO 2005/032496, WO 2005/086900, WO 2006/00976, WO 2006/031699, WO 2008/036863, WO 2011/046812 e WO 2014/059360.

[00108] As lipases são usadas em detergentes e produtos de limpeza para remover graxa, gordura, óleo e manchas de leite.

[00109] Em uma modalidade, a lipase é selecionada de lipase de triacilglicerol fúngico (EC classe 3,1,1,3). A lipase de triacilglicerol fúngico pode ser selecionada de lipases de Thermomyces lanuginosa tal como

36 / 95 triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 (pode ser aqui chamada de Lipolase) e variantes destes tendo atividade lipolítica.

[00110] As variantes da lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 podem ser selecionadas das variantes tendo atividade lipolítica que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares se comparadas à sequência de polipeptídeos de comprimento total dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US

5869438. As variantes podem ser selecionadas das sequência de polipeptídeos sendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares se comparadas à sequência de polipeptídeos de comprimento total dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438.

[00111] A lipase de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada de variantes selecionadas da sequência de polipeptídeos sendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar se comparada à sequência de polipeptídeos de comprimento total dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 tendo atividade lipolítica compreendendo pelo menos as seguintes substituições de aminoácido quando comparado aos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438: T231R e N233R (enzima tendo aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 T231R e N233R pode ser aqui chamada de Letra Lip). As ditas variantes de lipase também podem compreender uma ou mais das seguintes trocas de aminoácido quando comparadas aos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438:

37 / 95 Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.

[00112] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de amilases. As enzimas de alfa-amilase (E.C. 3,2,1,1) geralmente realizam a endo-hidrólise das ligações de (1->4)-alfa-D-glicosídicas nos polissacarídeos contendo três ou mais unidades de D-glicose ligadas a (1->4)-alfa. As enzimas de amilase agem no amido, glicogênio e polissacarídeos e oligossacarídeos relacionados de uma maneira aleatória; os grupos de redução são liberados na configuração alfa. Outros exemplos de enzimas amilase incluem Beta-amilase (E.C. 3,2,1,2), Glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolase (E.C. 3,2,1,60), Isoamilase (E.C. 3,2,1,68), Glucano 1,4-alfa-maltohexaosidase (E.C. 3,2,1,98) e Glucano 1,4-alfa-maltohidrolase (E.C. 3,2,1,133).

[00113] Muitas enzimas de amilase foram descritas nas patentes e pedidos de patente publicados incluindo, mas não limitados a: WO 2002/068589, WO 2002/068597, WO 2003/083054, WO 2004/091544 e WO 2008/080093.

[00114] As amilases são conhecidas ser derivadas da Bacillus licheniformis tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 95/10603. As variantes adequadas são aquelas que são pelo menos 90% idênticas ou similares à SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 95/10603 e/ou compreendendo uma ou mais substituições nas seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 e 444 que têm atividade milolítica. Tais variantes são descritas nas WO 94/02597, WO 94/018314, WO 97/043424 e SEQ ID NO:4 da WO 99/019467.

[00115] As amilases são conhecidas ser derivadas da B. stearothermophilus tendo a SEQ ID NO:6 como descrito na WO 02/10355 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica. As variantes adequadas da SEQ ID NO: 6 incluem aquelas que são pelo menos 90% idênticas ou similares a esta e/ou também compreendem uma

38 / 95 exclusão nas posições 181 e/ou 182 e/ou uma substituição na posição 193.

[00116] As amilases são conhecidas ser derivadas da Bacillus sp,707 tendo a SEQ ID NO:6 como descrito na WO 99/19467 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica.

[00117] As amilases são conhecidas do Bacillus halmapalus tendo a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 como descrito na WO 96/23872, também descrito como SP-722, ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a uma das sequências que tem atividade milolítica.

[00118] As amilases são conhecidas ser derivadas da Bacillus sp. DSM 12649 tendo a SEQ ID NO:4 como descrito na WO 00/22103 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica.

[00119] As amilases são conhecidas ser derivadas da cepa de Bacillus TS-23 tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 2009/061380 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica.

[00120] As amilases são conhecidas do Cytophaga sp. tendo a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2013/184577 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica.

[00121] As amilases são conhecidas do Bacillus megaterium DSM 90 tendo a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2010/104675 ou uma amilase que seja pelo menos 90% idêntica ou similar a essa tendo atividade milolítica.

[00122] As amilases são conhecidas tendo aminoácidos de 1 a 485 da SEQ ID NO:2 como descrito na WO 00/60060 ou amilases compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 96% idêntica ou similar com os aminoácidos de 1 a 485 da SEQ ID NO: 2 que têm atividade milolítica.

[00123] As amilases também são conhecidas tendo a SEQ ID NO: 12 como descrito na WO 2006/002643 ou amilases tendo pelo menos 80% de identidade com as mesmas e têm atividade milolítica. As amilases adequadas incluem aquelas tendo pelo menos 80% de identidade comparada com a SEQ

39 / 95 ID NO: 12 e/ou compreendendo as substituições nas posições Y295F e M202LITV e têm atividade milolítica.

[00124] As amilases também são conhecidas tendo a SEQ ID NO: 6 como descrito na WO 2011/098531 ou amilases tendo pelo menos 80% de identidade com as mesmas tendo atividade milolítica. As amilases adequadas incluem aquelas tendo pelo menos 80% de identidade comparada com a SEQ ID NO: 6 e/ou compreendendo uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 193 [G,A,S,T ou M], 195 [F,W,Y,L,I ou V], 197 [F,W,Y,L,I ou V], 198 [Q ou N], 200 [F,W,Y,L,I ou V], 203 [F,W,Y,L,I ou V], 206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D ou E], 210 [F,W,Y,L,I ou V], 212 [F,W,Y,L,I ou V], 213 [G,A,S,T ou M] e 243 [F,W,Y,L,I ou V] e têm atividade milolítica.

[00125] As amilases são conhecidas tendo a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2013/001078 ou amilases tendo pelo menos 85% de identidade com as mesmas tendo atividade milolítica. As amilases adequadas incluem aquelas tendo pelo menos 85% de identidade comparada com a SEQ ID NO: 1 e/ou compreendendo um alteração em duas ou mais (diversas) posições correspondentes às posições G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 e G477 e tendo atividade milolítica.

[00126] As amilases são conhecidas tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 2013/001087 ou amilases tendo pelo menos 85% de identidade com as mesmas e tendo atividade milolítica. As amilases adequadas incluem aquelas tendo pelo menos 85% de identidade comparada com a SEQ ID NO: 2 e/ou compreendendo uma exclusão das posições 181 + 182, ou 182 + 183, ou 183 + 184, que têm atividade milolítica. As amilases adequadas incluem aquelas tendo pelo menos 85% de identidade comparada com a SEQ ID NO: 2 e/ou compreendendo uma exclusão das posições 181 + 182, ou 182 + 183, ou 183 + 184, que compreendem uma ou duas ou mais modificações em qualquer uma das posições correspondentes às W140, W159, W167, Q169, W189, E194,

40 / 95 N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 e G477 e têm atividade milolítica.

[00127] As amilases também incluem α-amilase híbrida das amilases acima mencionadas como, por exemplo, como descrito na WO 2006/066594.

[00128] As amilases incluem amilases híbridas de acordo com a WO 2014/183920 com domínios A e B tendo pelo menos 90% de identidade à SEQ ID NO:2 da WO 2014/183920 e um domínio C tendo pelo menos 90% de identidade à SEQ ID NO:6 da WO 2014/183920, em que a amilase híbrida tem atividade milolítica; preferivelmente a alfa-amilase híbrida é pelo menos 95% idêntica ou similar à SEQ ID NO: 23 da WO 2014/183920 e tendo atividade milolítica.

[00129] As amilases incluem amilase híbrida de acordo com a WO 2014/183921 com domínios A e B tendo pelo menos 75% de identidade à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 39 como descrito na WO 2014/183921 e um domínio C tendo pelo menos 90% de identidade à SEQ ID NO: 6 da WO 2014/183921, em que a amilase híbrida tem atividade milolítica; preferivelmente, a alfa-amilase híbrida é pelo menos 95% idêntica ou similar à SEQ ID NO: 30 como descrito na WO 2014/183921 e tendo atividade milolítica.

[00130] Em uma modalidade, as variantes de amilase incluem polipeptídeos com pelo menos de 40 a 100% de identidade ou semelhança, se comparado à sequência de polipeptídeos de comprimento total da enzima precursora como descrito acima. Em uma modalidade, as variantes de amilase tendo atividade milolítica são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares à sequência de polipeptídeos de comprimento total da enzima precursora como

41 / 95 descrito acima.

[00131] As amilases de acordo com a invenção tendo “atividade milolítica” ou “atividade de amilase” de acordo com a invenção envolvem a (endo)hidrólise das ligações glicosídicas em polissacarídeos. A atividade de α- amilase pode ser determinada por ensaios para a medição da atividade de α- amilase. Os exemplos de ensaios que medem a atividade de α-amilase são: A atividade de α-amilase pode ser determinada através de um método utilizando Comprimidos Phadebas como substrato (Teste de Amilase Phadebas, provido pela Magle Life Science). O amido é hidrolisado pela α-amilase provendo fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente a 620 nm, é uma função da atividade de α-amilase. A absorbância medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de α-amilase pura) da α-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

[00132] A atividade de alfa-amilase também pode ser determinada através de um método utilizando etiliden-4-nitro-fenil-α-D-malto-heptaosídeo (EPS). D-malto-heptaosídeo é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase. Após a clivagem, a α-glicosidase foi incluída no kit para digerir o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e deste modo pode ser medida pela espectrofotometria visível a 405 nm. Os kits contendo substrato de EPS e α-glicosidase são fabricados pela Roche Costum Biotech (cat. No. 10880078103). A inclinação da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da α-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

[00133] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de celulases. As “celulases”, “enzimas de celulase” ou “enzimas celulolíticas” são as enzimas envolvidas na hidrólise da celulose. Três tipos principais de celulases são conhecidos, a saber, endo-ss-1,4-glucanase (endo-1,4-P-D-glucan

42 / 95 4-glucanohidrolase, E.C. 3,2,1,4; hidrolisando as ligações β-1,4-glicosídicas na celulose), celobio-hidrolase (1,4-P-D-glucano celobio-hidrolase, EC 3,2,1,91) e ss-glicosidase (EC 3,2,1,21).

[00134] As endoglicanases podem ser classificadas pelas semelhanças da sequência de aminoácido (Henrissat, B. Accessed at UniProt 10/26/2011) sob a família 5 contendo mais do que 20 endoglicanases de EC 3,2,1,4. Referência também é feita à T.-M. Enveri, “Microbial Celulases” em W.M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, p. 183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Vol. 160, p. 200-391 (editado por Wood, W.A. e Kellogg, S.T.); Béguin, P., “Molecular Biology of Cellulose Degradation”, Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44, pp. 219248; Begun, P. e Aubert, J-P., “The biological degradation of cellulose”, FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) p,25-58; Henrissat, B., “Cellulases and their interaction with cellulose”, Cellulose (1994), Vol. 1, pp. 169-196.

[00135] Preferivelmente, pelo menos uma celulase é selecionada da família 7 da glicosil hidrolase (GH7, pfam00840), preferivelmente selecionada de endoglucanases (EC 3,2,1,4).

[00136] As enzimas de celulase foram descritas nas patentes e pedidos de patente publicados incluindo, mas não limitados a: WO 1997/025417, WO 1998/024799, WO 2003/068910, WO 2005/003319 e WO 2009/020459.

[00137] Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada de celulases compreendendo um domínio de ligação à celulose. Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada de celulases compreendendo um domínio catalítico apenas, significando que a celulase não tem domínio de ligação à celulose.

[00138] Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada de Humicola, tal como Humicola insolens (DSM1800) como descrito na EP 0495257, EP 0531315, EP 0531372, US 4435307, US 5648263, US 5776757, WO 89/09259, WO 91/17244, WO 94/07998 (sequência apresentada na figura

43 / 95 1 “43kd variantes humana destes), WO 95/24471, WO 96/11262 e WO 98/12307.

[00139] Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum ou Trichoderma harzianum como descrito na EP 1305432, EP 1240525, WO 92/06165, WO 94/21801, WO 94/26880, WO 95/02043, WO 95/24471 e WO 02/099091.

[00140] As celulases adequadas incluem variantes celulase que têm atividade celulolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares se comparadas à sequência de polipeptídeos de comprimento total da respectiva enzima precursora.

[00141] As celulases de acordo com a invenção têm “atividade celulolítica” ou “atividade de celulase”. Os ensaios para a medição da atividade celulolítica incluem: atividade celulolítica pode ser determinada em virtude do fato de que a celulase hidrolisa a carboximetil celulose para reduzir os carboidratos, a capacidade de redução da qual é determinada colorimetricamente por intermédio da reação de ferricianida, de acordo com a Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937).

[00142] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de enzima que degrada manana. Pelo menos uma enzima que degrada manana pode ser selecionada de β-manosidase (EC 3,2,1,25), endo-1,4-β-manosidase (EC 3,2,1,78) e 1,4-β-manobiosidase (EC 3,2,1,100). Preferivelmente, pelo menos uma enzima que degrada manana é selecionada do grupo de endo-1,4-β-manosidase (EC 3,2,1,78), um grupo das enzimas que podem ser aqui chamadas de endo-β-1,4-D-mananase,

44 / 95 β-mananase, ou mananase.

[00143] Um polipeptídeo tendo atividade que degrada manana ou atividade de mananase pode ser testado de acordo com os procedimentos de teste padrão conhecidos na técnica, tal como aplicando-se uma solução a ser testada a orifícios de 4 mm de diâmetro perfurados em placas de ágar contendo 0,2% de AZCL galactomanana (carob), isto é, substrato para o ensaio de endo- 1,4-beta-D-mananase disponível como Cat No. I-AZGMA da empresa Megazyme (Endereço da Internet da Megazyme: http://www. megazyme. com/Purchase/index. html).

[00144] Pelo menos uma mananase pode ser selecionada de mananase alcalina da Família 5 ou 26. O termo “mananase alcalina” é intencionado abranger as mananases tendo uma atividade enzimática de pelo menos 40% da sua atividade máxima em um dado pH variando de 7 a 12, preferivelmente de 7,5 a 10,5.

[00145] Pelo menos uma mananase pode ser selecionada de mananases originadas dos organismos de Bacilo, tal como descrito na JP-0304706 [beta- mananase de Bacillus sp.], JP-63056289 [beta-mananase termoestável alcalina], JP-63036774 [microrganismo Bacillus FERM P-8856 que produz beta-mananase e beta-manosidase em um pH alcalino], JP-08051975 [beta- mananases alcalinas de Bacillus sp. alcalofílico AM-001], WO 97/11164 [mananase de Bacillus amyloliquefaciens], WO 91/18974 [ativos de mananase em um pH e temperatura extremos], WO 97/11164 [mananase de Bacillus amyloliquefaciens], WO 2014/100018 [endo-(3-mananase 1 clonado de um Bacillus circulans ou Bacillus lentus cepa CMG1240 (Bleman1; ver U.S.

5.476.775)]. As mananases adequadas são descritas na WO 99/064619].

[00146] Pelo menos uma mananase compreendida no componente (b) pode ser selecionada de mananases originadas de organismos de Trichoderma, tal como descrito na WO 93/24622 ou na WO 2011/085747.

[00147] As mananases adequadas também incluem aquelas que são

45 / 95 variantes das mananases descritas acima que têm atividade que degrada manana. Em uma modalidade, as variantes de mananase incluem variantes com pelo menos 40 a 100% de identidade ou semelhança se comparado à sequência de polipeptídeos de comprimento total da enzima precursora como descrito acima. Em uma modalidade, as variantes de mananase tendo atividade que degrada manana são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares à sequência de polipeptídeos de comprimento total da enzima precursora como descrito acima.

[00148] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada de pectato liases. Pectato liase (E.C. 4,2,2,2) clivagem eliminativa de enzimas de (1->4)-alfa-D- galacturonano para fornecer oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-alfa-D- galact-4-enuronosilas nas suas terminações que não de redução.

[00149] As enzimas pectato liase foram descritas nas patentes e pedidos de patente publicados incluindo, mas não limitados a: WO2004/090099. As pectato liase são conhecidas ser derivadas de Bacillus, particularmente B. licheniformis ou B. agaradhaerens, ou uma variante derivada de qualquer um destes, por exemplo, como descrito na US 6.124.127, WO 99/027083, WO 99/027084, WO 2002/006442, WO 2002/092741, WO 2003/095638.

[00150] As enzimas pectato liase comercialmente disponíveis incluem: XpectTM, PectawashTM e PectawayTM (Novozymes A/S); PrimaGreenTM, EcoScour (DuPont).

[00151] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de nucleases. A nuclease (EC 3,1,21,1) também conhecida como Desoxirribonuclease I, ou DNase realiza a clivagem endonucleolítica dos produtos finais de 5’-fosfodi-nucleotídeo e 5’-fosfooligonucleotídeo.

[00152] As enzimas de nuclease foram descritas nas patentes e pedidos de patente publicados incluindo, mas não limitados a: US 3451935,

46 / 95 GB 1300596, DE 10304331, WO 2015/155350, WO 2015/155351, WO 2015/166075, WO 2015/181287 e WO 2015/181286.

[00153] Pelo menos uma enzima pode ser selecionada do grupo de proteases. As enzimas tendo atividade proteolítica são chamadas de “proteases” ou “peptidases”. As proteases são proteínas ativas que exercem “atividade de protease” ou “atividade proteolítica”.

[00154] As proteases são membros da classe EC 3,4, as proteases incluem aminopeptidases (EC 3,4,11), dipeptidases (EC 3,4,13), dipeptidil- peptidases e tripeptidil-peptidases (EC 3,4,14), peptidil-dipeptidases (EC 3,4,15), carboxipeptidases do tipo serina (EC 3,4,16), metalocarboxipeptidases (EC 3,4,17), carboxipeptidases do tipo cisteína (EC 3,4,18), ômega peptidases (EC 3,4,19), serina endopeptidases (EC 3,4,21), cisteína endopeptidases (EC 3,4,22), endopeptidases aspárticas (EC 3,4,23), metaloendopeptidases (EC 3,4,24), treonina endopeptidases (EC 3,4,25), endopeptidases de mecanismo catalítico desconhecido (EC 3,4,99).

[00155] As enzimas de protease comercialmente disponíveis incluem, mas não são limitadas a: LavergyTM Pro (BASF); AlcalaseTM, BlazeTM, DuralaseTM, DurazymTM, RelaseTM, RelaseTM Ultra, SavinaseTM, SavinaseTM Ultra, PrimaseTM, PolarzymeTM, KannaseTM, LiquanaseTM, LiquanaseTM Ultra, OvozymeTM, CoronaseTM, CoronaseTM Ultra, NeutraseTM, EverlaseTM e EsperaseTM (Novozymes A/S), aquelas vendidas sob o nome comercial MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, PurafectTM, PurafectTM Prime, Purafect MATM, Purafect OxTM, Purafect OxPTM, PuramaxTM, ProperaseTM, FN2TM, FN3TM, FN4TM, ExcellaseTM, EraserTM, UltimaseTM, OpticleanTM, EffectenzTM, PreferenzTM e OptimaseTM (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocases N.V.), Alcalino Protease Bacillus lentus e KAP (subtilisina Bacillus alkalophilus) da Kao.

[00156] Pelo menos uma protease pode ser selecionada de serina proteases (EC 3,4,21). As serina proteases ou serina peptidases (EC 3,4,21) são

47 / 95 distinguidas por ter um serina no sítio cataliticamente ativo, que forma um aduto covalente com o substrato durante a reação catalítica. Uma serina protease pode ser selecionada do grupo consistindo em quimiotripsina (por exemplo, EC 3,4,21,1), elastase (por exemplo, EC 3,4,21,36), elastase (por exemplo, EC 3,4,21,37 ou EC 3,4,21,71), granzima (por exemplo, EC 3,4,21,78 ou EC 3,4,21,79), calicreína (por exemplo, EC 3,4,21,34, EC 3,4,21,35, EC 3,4,21,118, ou EC 3,4,21,119,) plasmina (por exemplo, EC 3,4,21,7), tripsina (por exemplo, EC 3,4,21,4), trombina (por exemplo, EC 3,4,21,5,) e subtilisina (também conhecida como subtilopeptidase, por exemplo, EC 3,4,21,62), a última em seguida também sendo indicada como “subtilisina”.

[00157] Um subgrupo das serina proteases provisoriamente chamado de subtilases foi proposto pela Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 e Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. Estas são definidas através da análise por homologia de mais do que 170 sequências de aminoácidos de serina proteases previamente referidas como proteases semelhantes à subtilisina. Uma subtilisina foi previamente muitas vezes definida como uma serina protease produzida por bactérias gram-positivas ou fungos e de acordo com a Siezen et al. Agora é um subgrupo de subtilases. Uma ampla variedade de subtilases foram identificadas e a partir da sequência de aminoácido, várias subtilases foram determinadas. Para uma descrição mais detalhada de tais subtilases e suas sequências de aminoácidos, referência é feita à Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, isto é, a família de subtilisina, família de termitase, a família de proteinase K, a família de peptidase lantibiótica, a família de quexina e a família pirolisina.

[00158] Um subgrupo das subtilases são as subtilisinas que são serina proteases da família S8 como definido pelo banco de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk). A família peptidase S8 contém a serina endopeptidase subtilisina e seus homólogos. A maioria dos membros da família

48 / 95 peptidase S8 são ativos no pH alcalino suavemente neutro. Muitas peptidases na família são termoestáveis.

[00159] As proteases precursoras do tipo subtilisina (EC 3,4,21,62) e variantes podem ser proteases bacterianas. As ditas proteases bacterianas podem ser um polipeptídeo de bactérias Gram-positivas tal como uma protease de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo de bactérias Gram-negativas tais como proteases de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma. Uma revisão desta família é provida, por exemplo, em “Subtilases: Subtilisin-like Proteases” por R. Siezen, páginas 75-95 em “Subtilisin Enzymes”, editado por R. Bott e C. Betzel, Nova Iorque, 1996.

[00160] Pelo menos uma protease pode ser selecionada do seguinte: subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens BPN’ (descrita por Vasantha et al. (1984) J. Bacteriol. Volume 159, p. 811-819 e JA Wells et al. (1983) em Nucleic Acids Research, Volume 11, p. 7911-7925); subtilisina de Bacillus licheniformis (subtilisina Carlsberg; descrito na EL Smith et al. (1968) in J. Biol Chem, Volume 243, pp. 2184-2191 e Jacobs et al. (1985) em Nucl. Acids Res, Vol 13, p. 8913-8926); subtilisina PB92 (sequência original da protease alcalina PB92 é descrita na EP 283075 A2); subtilisina 147 e/ou 309 (EsperaseTM, SavinaseTM, respectivamente) como descrito na WO 89/06279; subtilisina de Bacillus lentus como descrito na WO 91/02792, tal como de Bacillus lentus DSM 5483 ou as variantes de Bacillus lentus DSM 5483 como descrito na WO 95/23221; subtilisina de Bacillus alcalophilus (DSM 11233) descrito na DE 10064983; subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14391) como descrito na WO 2003/054184; subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14390) descrito na WO 2003/056017; subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14392) descrito na WO 2003/055974; subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14393) descrito na WO

49 / 95 2003/054184; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrito na WO 2005/063974; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrito na WO 2005/103244; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 7 como descrito na WO 2005/103244; e subtilisina tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito no pedido DE 102005028295,4.

[00161] Pelo menos uma subtilisina pode ser subtilisina 309 (que pode ser aqui chamada de SavinaseTM) como descrito como sequência a) na Tabela I da WO 89/06279 ou uma variante que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa e tem atividade proteolítica.

[00162] As proteases são conhecidas como compreendendo as variantes descritas em: WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264 e WO 2011/072099. Os exemplos adequados compreendem especialmente as variantes de protease de subtilisina protease derivadas da SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 (com substituições de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 que têm atividade proteolítica. Além disso, uma subtilisina protease não é mutada nas posições Asp32, His64 e Ser221.

[00163] As proteases adequadas incluem as variantes de protease tendo atividade proteolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas ou similares se comparadas à sequência de polipeptídeos de comprimento total da enzima precursora como descrito acima.

50 / 95

[00164] Pelo menos uma subtilisina pode ter a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147, ou é uma variante desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), ou asparagina (N), ou glutamina (Q), ou alanina (A), ou glicina (G), ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Tal variante de subtilisina pode compreender uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinho ou em combinação com uma ou mais substituições nas posições 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e/ou 274 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease compreende uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h).

[00165] Uma subtilisina adequada pode ser pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por compreender um aminoácido (de acordo com a (a)-(h)) ou combinações de acordo com a (i) junto com o aminoácido 101E, 101D, 101N, 101Q, 101A,

51 / 95 101G, ou 101S (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

[00166] Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por compreender a mutação (de acordo com a numeração BPN’) R101E, ou S3T + V4I + V205I, ou S3T + V4I + R101E + V205I ou S3T + V4I + V199M + V205I + L217D e tem atividade proteolítica.

[00167] Em uma outra modalidade, a subtilisina compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e sendo também distinguida por compreender S3T + V4I + S9R + A15T + V68A + D99S + R101S + A103S + I104V + N218D (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

[00168] Uma subtilisina pode ter uma sequência de aminoácido sendo pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e também sendo distinguida por compreender R101E e uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em S156D, L262E, Q137H, S3T, R45E,D,Q, P55N, T58W,Y,L, Q59D,M,N,T, G61 D,R, S87E, G97S, A98D,E,R, S106A,W, N117E, H120V,D,K,N, S125M, P129D, E136Q, S144W, S161T, S163A,G, Y171 L, A172S, N185Q, V199M, Y209W, M222Q, N238H, V244T, N261T,D e L262N,Q,D (como descrito na WO 2016/096711 e de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

[00169] As proteases de acordo com a invenção têm atividade proteolítica. Os métodos para determinar a atividade proteolítica são bem conhecidos na literatura (ver, por exemplo, Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395). A atividade proteolítica pode ser determinada usando-se Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida (Suc-AAPF- pNA, abreviado, AAPF; ver por exemplo, DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320) como substrato. O pNA é clivado da molécula de substrato através da clivagem proteolítica, resultando na liberação da cor

52 / 95 amarela de pNA livre que pode ser quantificado medindo OD405.

[00170] Em um aspecto da invenção, o polipeptídeo de acordo com a uma sequência de aminoácido é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 tendo atividade de lipase é provido em combinação com pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada de subtilisinas. Pelo menos uma subtilisina pode ser selecionada daquelas como aqui descrita. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 tendo atividade de lipase tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica na presença de uma protease, preferivelmente na presença de um subtilisina, quando comparado a uma lipase de Thermomyces lanuginosa. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% , pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1 tendo atividade de lipase tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica

53 / 95 na presença de uma protease, preferivelmente na presença de uma subtilisina, quando comparada a uma lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1. Pelo menos uma protease, preferivelmente subtilisina, pode por si, ser estabilizada por um estabilizante de protease ou a protease pode ser não estabilizada.

[00171] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma variante de lipase da invenção é provida em combinação com pelo menos uma subtilisina. Em uma modalidade, uma variante de lipase da invenção é estável contra a degradação proteolítica. Em uma modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica na presença de uma protease, preferivelmente na presença de uma subtilisina, se comparado à respectiva lipase precursora.

[00172] Em uma modalidade, pelo menos uma subtilisina é selecionada de subtilisina 309 como descrito como sequência a) na Tabela I da WO 89/06279 ou uma variante desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa e tem atividade proteolítica.

[00173] Em uma modalidade, a subtilisina é selecionada da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP1921147 e variantes destas tendo atividade proteolítica. A variante da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP1921147 pode ser uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), ou asparagina (N), ou glutamina (Q), ou alanina (A), ou glicina (G), ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é

54 / 95 distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais substituições nas posições 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e/ou 274 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a variante de subtilisina compreende uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D e uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h).

[00174] Em uma modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica na presença de subtilisina 309 ou uma variante desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1. A subtilisina 309 ou uma variante desta pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00175] Em uma modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica tal como subtilisina não estabilizada 309 ou uma variante não-estabilizada desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa, se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica na presença de

55 / 95 subtilisina estabilizada 309 ou na presença da variante estabilizada desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa, se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[00176] Em uma modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1, na presença de pelo menos uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e variantes destas tendo atividade proteolítica. A variante da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 pode ser uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), ou asparagina (N), ou glutamina (Q), ou alanina (A), ou glicina (G), ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais substituições nas posições 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e/ou 274 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a variante

56 / 95 de subtilisina compreende uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D e uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). A subtilisina de acordo com a SEQ ID NO:22 da EP 1921147 ou uma variante desta pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00177] Em uma outra modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica tal como subtilisina não estabilizada de acordo com a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 ou uma variante não estabilizada desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa, se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO:

1. Em uma outra modalidade, uma variante de lipase da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica na presença de subtilisina estabilizada de acordo com a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 ou uma variante não estabilizada desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa, se comparado à lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1. As variantes da dita SEQ ID NO: 22 são aquelas como aqui descritas, tal como a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 com a substituição de R101E.

[00178] Em uma modalidade, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ

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ID NO: 1 tendo atividade de lipase tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e ou quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R, na presença de pelo menos uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e variantes destas tendo atividade proteolítica.

A variante da SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 pode ser uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e tem atividade proteolítica.

Em uma modalidade, uma subtilisina é pelo menos 80% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), ou asparagina (N), ou glutamina (Q), ou alanina (A), ou glicina (G), ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

Em uma modalidade, a subtilisina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter aminoácido do ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais substituições nas posições 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e/ou 274 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica.

Em uma modalidade, a

58 / 95 variante de subtilisina compreende uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D e uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). A subtilisina de acordo com a SEQ ID NO:22 da EP 1921147 ou uma variante desta pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00179] Em uma modalidade, um polipeptídeo de acordo para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica quando comparado à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e ou quando comparado à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R, na presença de subtilisina 309 ou uma variante desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa, em que a subtilisina pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00180] Em uma modalidade, uma variante de lipase da SEQ ID NO: 1 como aqui descrito tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e ou quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R, na presença de subtilisina 309 ou uma variante desta que é pelo menos 80% idêntica ou similar a essa. A subtilisina 309 ou uma variante desta pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00181] Em uma modalidade, um polipeptídeo de acordo para a

59 / 95 sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica quando comparado à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e ou quando comparado à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R, na presença de uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E, em que a subtilisina pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00182] Em uma modalidade, uma variante de lipase da SEQ ID NO: 1 como aqui descrita tem estabilidade aumentada contra a degradação proteolítica quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e ou quando comparada à lipase de Thermomyces lanuginosa de acordo com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 com substituições de aminoácido T231R e N233R, na presença de uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E, em que a subtilisina pode ser estabilizada ou não estabilizada.

[00183] Os estabilizantes de protease podem ser selecionados de compostos contendo boro. Os compostos contendo boro são selecionados de ácido bórico ou seus derivados e de ácido borônico ou seus derivados tais como ácido aril borônico ou seus derivados, dos sais dos mesmos e de misturas dos mesmos. O ácido bórico aqui contido pode ser chamado de ácido ortobórico.

[00184] Em uma modalidade, o composto contendo boro é selecionado do grupo consistindo em ácido aril borônico e seus derivados. Em uma modalidade, o composto contendo boro é selecionado do grupo consistindo em ácido benzeno borônico (BBA) que também é chamado de ácido fenil borônico (PBA), derivados destes e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, os derivados do ácido fenil borônico são selecionados do grupo consistindo dos

60 / 95 derivados da fórmula (I) e fórmula (II): fórmula (I) fórmula (II)

[00185] Em que R1 é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituído ou substituído e alquenila C1-C6 não substituído ou substituído; em uma modalidade preferida, R é selecionado do grupo consistindo em hidróxi e alquila C1 não substituído.

[00186] Em que R2 é selecionado do grupo consistindo em hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituído ou substituído e alquenila C1-C6 não substituído ou substituído; em uma modalidade preferida, R é selecionado do grupo consistindo em H, hidróxi e alquila C1 substituído.

[00187] Em uma modalidade, os derivados do ácido fenil-borônico são selecionados do grupo consistindo em ácido 4-formil fenil borônico (4-FPBA), ácido 4-carbóxi fenil borônico (4-CPBA), ácido 4-(hidróxi-metil) fenil borônico (4-HMPBA) e ácido p-tolilborônico (p-TBA).

[00188] Outros derivados adequado incluem: ácido 2-tienil borônico, ácido 3-tienil borônico, ácido (2-acetamido-fenil) borônico, ácido 2- benzofuranil borônico, ácido 1-naftil borônico, ácido 2-naftil borônico, 2- FPBA, 3-FBPA, ácido 1-tiantrenil borônico, ácido 4-dibenzofuran borônico, ácido 5-metil-2-tienil borônico, ácido 1-benzotiofeno-2 borônico, ácido 2- furanil borônico, ácido 3-furanil borônico, ácido 4,4-bifenildiborônico, ácido 6-hidróxi-2-naftaleno borônico, ácido 4-(metiltio) fenil borônico, ácido 4- (trimetilsilil) fenil borônico, ácido 3-bromotiofeno borônico, ácido 4-metil-

61 / 95 tiofeno borônico, ácido 2-naftil borônico, ácido 5-bromotiofeno borônico, ácido 5-clorotiofeno borônico, ácido dimetiltiofeno borônico, ácido 2- bromofenil borônico, ácido 3-cloro-fenil borônico, ácido 3-metóxi- ácido 2- tiofeno borônico, ácido p-metil-feniletil borônico, ácido 2-tiantrenil borônico, ácido di-benzotiofeno borônico, ácido 9-antraceno borônico, ácido 3,5 di- clorofenil borônico, anidrido do ácido difenil borônico, ácido o-clorofenil borônico, ácido p-clorofenil borônico, ácido m-bromofenil borônico, ácido p- bromofenil borônico, ácido p-fluoro-fenil borônico, ácido octil borônico, ácido 1,3,5 trimetilfenil borônico, ácido 3-cloro-4-fluoro-fenil borônico, ácido 3- aminofenil borônico, ácido 3,5-bis-(trifluorometil) fenil borônico, ácido 2,4- diclorofenil borônico, ácido 4-metoxifenil borônico e misturas dos mesmos.

[00189] Em uma modalidade, pelo menos um composto contendo boro é usado junto com pelo menos um poliol contendo de 2 a 6 grupos hidroxila para estabilizar a protease. Os adequados exemplos incluem glicol, propileno glicol, 1,2-propano diol, 1,2-butano diol, etileno glicol, hexileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol, eritriol, glicose, frutose, lactose e eritritano.

[00190] Os polipeptídeos variantes da invenção podem ser usados em diversas indústrias onde as lipases são úteis nas aplicações de processamento e/ou onde as lipases são componentes úteis das formulações.

[00191] Em um aspecto, a invenção é relacionada ao uso dos polipeptídeos variantes da invenção no processamento de gorduras, óleos ou sementes oleaginosas em alimentos e/ou processos alimentícios, preferivelmente durante a limpeza ou lavagem de têxteis, superfícies duras, ou louças; durante o processamento de papel ou polpa; e/ou durante a produção de etanol:

[00192] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas nas formulações alimentícias, por exemplo, a enzima pode ser um aditivo para panificação (ver a WO 2017/142904). Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método de

62 / 95 preparar uma massa, ou em um produto cozido preparado a partir da massa, em que o método compreende as etapas de (a) adicionar os polipeptídeos tendo atividade de lipase à massa e (b) cozê-la.

[00193] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas nas indústrias de processamento de semente oleaginosa, por exemplo, a enzima é usada para processar óleos vegetais (soja, canola) (WO 2005/086900). Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método para o processamento de gorduras, óleos ou sementes oleaginosas; em que o método compreende (a) prover uma gordura, um óleo, ou uma semente oleaginosa; (b) provendo um polipeptídeo tendo atividade de lipase; e (c) comunicar o polipeptídeo com a gordura, o óleo, ou a semente oleaginosa, em que o polipeptídeo hidrolisa a gordura até um produto desejado.

[00194] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas nas formulações alimentícias (ver a Patente U.S. No.: 8.735.123). Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método para alimentar um animal; em que o método compreende (a) prover uma formulação ou pelota de alimentação, (b) prover a lipase na formulação ou pelota de alimentação e (c) alimentar o animal com a formulação de alimentação.

[00195] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas nas indústrias de processamento de amido, por exemplo, para processar subprodutos tais como óleo, no processo de conversão do amido para etanol ou açúcares com amilases (xarope de milho com alta frutose) (ver a WO 2004/029193). Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método para fabricar etanol, em que o método compreende, (a) prover um material da produção de etanol, em que o material tem um óleo, (b) prover uma lipase e (c) comunicar o material com a lipase, em que a lipase ajuda a melhorar a recuperação do óleo do material. Em uma outra modalidade, as variantes de lipase da invenção podem

63 / 95 ser usadas na produção de biodiesel (U.S. 7.550.278).

[00196] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas no processamento de papel e polpa, por exemplo, as enzimas (lipase) podem ser usadas para melhorar a resistência do papel (ver a WO 2006/031699) e controle de tom (ver a U.S. 2010/0269989). Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método para o processamento de polpa ou papel, em que o método compreende (a) prover uma polpa ou papel, (b) prover uma lipase e (c) comunicar a polpa ou papel com a lipase, em que a lipase melhora a resistência da polpa ou papel.

[00197] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas para serviços de mineração e poços de óleo, por exemplo, celulases, amilases, e/ou lipases podem ser usadas para quebrar guar durante a fratura do poço de óleo (US 5725771).

[00198] As variantes de lipase da invenção podem ser usadas e, formulações detergentes ou formulações de limpeza. Em uma modalidade, os polipeptídeos inventivos tendo atividade de lipase podem ser usados em um método de limpeza ou lavagem de têxteis, superfícies duras, ou louças, em que o método compreende, (a) prover um produto têxtil, superfícies duras, ou louças, (b) prover uma lipase e (c) comunicar os produtos têxteis, superfícies duras, ou louças e a lipase, em que a lipase remove uma mancha de gordura dos produtos têxteis, superfícies duras, ou louças.

[00199] A invenção se refere às formulações detergentes ou formulações de limpeza compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e pelo menos um componente detergente. A “formulação detergente” ou “formulação de limpeza” significa as composições indicadas para a limpeza de material sujo. A limpeza inclui a lavagem de roupas e limpeza de superfícies duras. O material sujo de acordo com a invenção inclui produtos têxteis e/ou superfícies duras.

[00200] O termo “lavagem de roupas” se refere tanto à lavagem de roupa

64 / 95 doméstica quanto a lavagem de roupas industrial e significa o processo de tratar têxteis com uma solução contendo uma composição detergente da presente invenção. O processo de lavagem de roupas pode ser realizado usando-se dispositivos técnicos tais como uma máquina de lavagem de roupas doméstica ou industrial. Alternativamente, o processo de lavagem pode ser realizado manualmente.

[00201] O termo “têxtil” significa qualquer material têxtil, incluindo fios (fio de fibras naturais ou sintéticas utilizado para tricô ou tecelagem), intermediários de fios, fibras, não materiais não tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, assim como tecidos (um produto têxtil feito através da tecelagem, tricô ou fibras de feltragem) feitos destes materiais tais como vestimentas (qualquer artigo de vestuário deito de um produto têxtil), panos e outros artigos.

[00202] O termo “fibras” inclui fibras naturais, fibras sintéticas e misturas dos mesmos. Os exemplos de fibras naturais são de origem vegetal (tal como linho, juta e algodão) ou origem animal, compreendendo proteínas como colágeno, queratina e fibrina (por exemplo, seda, lã de ovelha, angorá, mohair, cashmere). Os exemplos para as fibras de origem sintética são fibras de poliuretano tais como SpandexTM ou LycraTM, fibras de poliéster, poliolefinas tais como elastofina, ou fibras de poliamida tais como náilon. As fibras podem ser fibras únicas ou partes de produtos têxteis tais como malhas, tecidos, ou não tecidos.

[00203] O termo “limpeza de superfície dura” é aqui definido como a limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir qualquer superfície dura na casa, tal como o chão, móveis, paredes, cerâmicas sanitárias, vidro, superfícies metálicas incluindo talheres ou louças.

[00204] O termo “lavagem de louças” se refere a todas as formas de lavagem de louças, por exemplo, manualmente ou através de uma máquina. A lavagem de louças inclui, mas não é limitada a, a limpeza de todas as formas

65 / 95 de louças tais como pratos, canecas, copos, tigela, todas as formas de talheres tais como colheres, facas, garfos e utensílios para servir, assim como cerâmicas, plásticos, tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílico.

[00205] A formulação detergente da invenção compreende um ou mais componente(s) detergente(s). O(s) componente(s) escolhido(s) depende(m) da aplicação de limpeza desejada e/ou a forma física de uma composição detergente.

[00206] O termo “componente detergente” é aqui definido para significar qualquer tipo de ingrediente, que é adequado para as composições detergentes, tais como tensoativos, agentes de construção, polímeros, sistemas de branqueamento. Qualquer componente(s) conhecido(s) na técnica, reconhecidas as suas características conhecidas, é/são componente(s) detergente(s) adequado(s) de acordo com a invenção. Os componentes de detergente em uma modalidade, significa os componentes que proveem um desempenho de lavagem ou limpeza ou que ajudam eficazmente no processamento (mantém as características físicas durante o processamento, armazenamento e uso; por exemplo, modificadores de reologia, hidrótropos, dessecantes) quando presentes em quantidades eficazes.

[00207] Geralmente, uma composição detergente é uma formulação complexa de mais do que dois componente detergentes.

[00208] Os componentes detergentes podem ter mais do que uma função na aplicação final de uma formulação detergente, portanto, qualquer componente detergente mencionado no contexto de uma função específica aqui contida, também pode ter uma outra função na aplicação final de uma formulação detergente. A função de um componente detergente específico na aplicação final de uma formulação detergente geralmente depende da sua quantidade dentro da formulação detergente, isto é, a quantidade eficaz de um componente detergente.

[00209] O termo “quantidade eficaz” inclui as quantidades de

66 / 95 componentes individuais para prover a remoção eficaz da mancha e condições de limpeza eficazes (por exemplo, pH, quantidade de espumação), quantidades de alguns componentes para eficazmente prover benefícios óticos (por exemplo, brilho ótico, inibição da transferência de tinta) e quantidades de alguns componentes para auxiliar eficazmente o processamento (manter as características físicas durante o processamento, armazenamento e uso; por exemplo, modificadores de reologia, hidrótropos, dessecantes).

[00210] Em uma modalidade, uma formulação detergente é uma formulação de mais do que dois componente detergentes, em que pelo menos um componente é eficaz na remoção de manchas, pelo menos um componente é eficaz em prover a condições de limpeza ótimas e pelo menos um componente é eficaz na manutenção das características físicas do detergente.

[00211] O desempenho da limpeza é avaliado sob condições de limpeza relevantes. O termo “condições de limpeza relevantes” aqui se refere às condições, particularmente temperatura de limpeza, tempo, mecânicas de limpeza, concentração de espuma, tipo de detergente e dureza da água, realmente usada nas máquinas para lavar roupas, lavadoras de louças automáticas ou em processos manuais de limpeza.

[00212] O desempenho da limpeza dos detergentes contendo lipase pode ser aqui chamado de desempenho de desengorduramento. O desempenho de desengorduramento pode ser relacionado à capacidade da formulação detergente de remover manchas de gordura depositadas em produtos têxteis.

[00213] As gorduras podem ser subclassificadas como gordura, graxa ou óleo dependendo da temperatura de fusão. O óleo é geralmente líquido na temperatura ambiente. A graxa tem uma viscosidade mais alta do que o óleo na temperatura ambiente e pode ser chamada de pastosa. A remoção das manchas de óleo e graxas depositadas em produtos têxteis, devido à temperatura de fusão relativamente baixa do óleo e graxa, é suportada pelas temperaturas de lavagem de roupas > 40°C. Os depósitos de gordura compreendendo os compostos

67 / 95 graxos tendo uma temperatura de fusão >30°C, significa as gorduras que permanecem sólidas em temperaturas ≤30°C.

[00214] As manchas graxas depositadas nos produtos têxteis podem ser aqui chamadas de depósitos graxos. Em uma modalidade, depósitos graxos compreendem compostos graxos tendo um ponto de fusão > 40°C, significando que tais compostos graxos permanecem sólidos nas temperaturas de lavagem de roupa ≤40°C. Em uma modalidade, os depósitos graxos compreendem compostos graxos tendo um ponto de fusão >30°C, significando que tais compostos graxos permanecem sólidos nas temperaturas de lavagem de roupas ≤30°C.

[00215] Em um aspecto, a invenção se refere uma formulação para lavagem de roupas sólida ou líquida para temperaturas de lavagem de roupas ≤40°C compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e o uso da dita formulação para remover depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >40°C nas temperaturas de lavagem de roupa ≤40°C. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida para a temperaturas de lavagem de roupas ≤30°C compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e o uso da dita formulação para remover os depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >40°C nas temperaturas de lavagem de roupa ≤30°C. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida para temperaturas de lavagens de roupa ≤30°C compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e o uso da dita formulação para remover os depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >30°C nas temperaturas de lavagem de roupas ≤30°C. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida para temperaturas de lavagem de roupas ≤25°C compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e o uso da dita formulação para remover os

68 / 95 depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >25°C nas temperaturas de lavagem de roupas ≤25°C. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida para a temperaturas de lavagem de roupa ≤25°C compreendendo pelo menos uma variante de lipase da invenção e o uso da dita formulação para remover os depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >30°C nas temperaturas de lavagem de roupas ≤25°C.

[00216] O desempenho de desengorduramento aqui é intencionado ser melhorado quando a remoção das manchas graxas é melhorada. Melhorado neste contexto pode significar que a lipase inventiva e/ou a formulação detergente compreendendo pelo menos uma lipase inventiva mostra um melhor desempenho de desengorduramento quando comparada à lipase não inventiva e/ou às formulações de lavagem de roupas sem as lipases inventivas e/ou formulações para lavagem de roupas compreendendo a lipase precursora. A remoção das manchas graxas pode ocorrer devido à degradação e/ou solubilização e/ou dispersão e/ou emulsificação enzimática dos compostos graxos depositados em produtos têxteis.

[00217] Em um aspecto, a invenção se refere a uma formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida compreendendo pelo menos uma lipase, em que pelo menos uma lipase é selecionada de um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1, pelo menos uma protease, em que pelo menos uma protease é

69 / 95 selecionada de subtilisina compreendendo uma sequência de polipeptídeos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou similar à SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por ter substituição de aminoácidos na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica, e pelo menos um componente detergente em quantidades eficazes.

[00218] Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). Em uma modalidade, subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E.

[00219] Em uma modalidade, a formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida compreende pelo menos uma lipase compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica

70 / 95 ou similar à sequência de aminoácido de tamanho completo da SEQ ID NO: 1, uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E, e pelo menos um componente detergente em quantidades eficazes.

[00220] Em uma modalidade, a formulação de lavagem de roupas sólida ou líquida compreende uma lipase de acordo para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, uma subtilisina de acordo com a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E, e pelo menos um componente detergente em quantidades eficazes.

[00221] Em uma modalidade, a subtilisina é a SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 distinguida por uma substituição de aminoácidos na posição 101, tal como R101E ou R101D, sozinha ou em combinação com uma ou mais uma ou mais outras substituições: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T, ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). Em uma modalidade subtilisina é SEQ ID NO:22 como descrito na EP 1921147 com substituição de aminoácidos R101E.

[00222] Em uma modalidade, a formulação para lavagem de roupas compreendendo (a) uma lipase, (b) uma subtilisina e (c) pelo menos um componente detergente como descrito acima, é usada para remover depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão

71 / 95 >40°C nas temperaturas de lavagem selecionadas de ≤40°C, ≤30°C e ≤25°C. Em uma modalidade, a formulação para lavagem de roupas compreendendo (a) uma lipase, (b) uma subtilisina e (c) pelo menos um componente detergente como descrito acima é usado para remover depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >30°C nas temperaturas de lavagem de roupas selecionadas de ≤30°C e ≤25°C. Em uma modalidade, a formulação para lavagem de roupas compreendendo (a) uma lipase, (b) uma subtilisina e (c) pelo menos um componente detergente como descrito acima é usada para remover depósitos graxos compreendendo compostos graxos tendo uma temperatura de fusão >25°C nas temperaturas de lavagem de roupas ≤25°C.

[00223] Os componentes de detergente individuais e seu uso nas composições detergentes são conhecidos àqueles habilitados na técnica. Os componentes de detergente adequados compreendem, inter alia, tensoativos, construtores, polímeros, alcalinos, sistemas de branqueamento, agentes de branqueamento fluorescentes, inibidores e estabilizantes de espuma, hidrótopos e inibidores de corrosão. Outros exemplos são descritos, por exemplo, em “Complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)”, Engineers India Research Institute (EIRI), 6a edição (2015). Um outro livro de referência para aqueles versados na técnica pode ser “Detergents Formulations Encyclopedia”, Solverchem Publications, 2016.

[00224] Os componentes detergentes variam em tipo e/ou quantidade em uma formulação detergente dependendo da aplicação desejada, tal como lavagem de têxteis brancos, têxteis coloridos e lã. O(s) componente(s) escolhido(s) também depende(m) da forma física de uma formulação detergente (liquida, sólida, gel, provida em bolsas ou como um tablete, etc). O(s) componente(s) escolhido(s), por exemplo, para as formulações de

72 / 95 lavagem de roupas também depende(m) das convenções regionais que por si são relacionadas aos aspectos como as temperaturas de lavagem usadas, mecânicas da máquina de lavar (máquinas de eixo vertical vs. horizontal), consumo de água por ciclo de lavagem etc. e características geográficas como a dureza média da água.

[00225] Por exemplo: Um sistema com baixa concentração de detergente inclui formulações de lavagem de roupas onde menos do que cerca de 800 ppm de componentes de detergente estão presentes na água de lavagem. Uma concentração média de detergente inclui as formulações de lavagem onde entre cerca de 800 ppm e cerca de 2.000 ppm de componentes de detergente estão presentes na água de lavagem. Uma alta concentração de detergente inclui as formulações de lavagem de roupas onde mais do que cerca de 2.000 ppm de componentes de detergente estão presentes na água de lavagem.

[00226] As faixas numéricas citadas para os componentes de detergente individuais provêm as quantidades compreendidas nas composições detergentes. Tais faixas devem ser entendidas ser inclusivas dos números que definem a faixa e incluem cada número inteiro dentro da faixa definida.

[00227] Se não descrito de outra forma, intenciona-se que “% em peso” ou “% p/p” seja relacionado com a composição detergente total. Neste caso “% em peso” ou “% p/p” é calculado como segue: concentração de uma substância como o peso daquela substância dividida pelo peso total da composição, multiplicado por 100.

[00228] As formulações detergentes da invenção podem compreender um ou mais tensoativo(s). O “tensoativo” (sinonimamente aqui usado com “agente de superfície ativa”) significa um produto químico orgânico que, quando adicionado a um líquido, muda as propriedades daquele líquido em uma interface. De acordo com a sua carga iônica, um tensoativo é chamado não iônico, aniônico, catiônico ou anfotérico.

[00229] Os exemplos não limitantes de tensoativos são descritos em

73 / 95 McCutcheon’s 2016 Detergents and Emulsifiers e McCutcheon’s 2016 Functional Materials, ambos da North American and International Edition, MC Publishing Co, edição de 2016. Outros exemplos úteis são descritos nas edições anteriores das mesmas publicações que são conhecidas àqueles habilitados na técnica.

[00230] O tensoativo não iônico significa um tensoativo que contém grupos funcionais não carregados positivamente nem negativamente (isto é, iônicos). Ao contrário dos tensoativos aniônicos e catiônicos, os tensoativos não iônicos não ionizam na solução.

[00231] Os exemplos providos abaixo para os tensoativos de qualquer tipo devem ser entendidos ser não limitantes.

[00232] Em uma modalidade, a formulação detergente da invenção compreende pelo menos um tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos podem ser compostos da general fórmula (III): (III)

[00233] As variáveis da fórmula geral (III) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre alquila C1-C23 e alquenila C2-C23, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados; os exemplos são n- C7H15, n-C9H19, n-C11H23, n-C13H27, n-C15H31, n-C17H35, i-C9H19, i-C12H25.

[00234] R2 é selecionado dentre H, alquila C1-C20 e alquenila C2-C20, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados.

[00235] R3 e R4 , cada um independentemente selecionado dentre alquila C1-C16, em que alquila é linear ou ramificado; exemplos são metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec-pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila,

74 / 95 isodecila.

[00236] R5 é selecionado dentre H e alquila C1-C18, em que alquila é linear ou ramificado.

[00237] Os números inteiros da fórmula geral (III) são definidos como segue: m é na faixa de zero a 200, preferivelmente de 1 a 80, mais preferivelmente de 3 a 20; n e o, cada um independentemente na faixa de zero a 100; n preferivelmente é na faixa de 1 a 10, mais preferivelmente de 1 a 6; o preferivelmente é na faixa de 1 a 50, mais preferivelmente de 4 a 25. A soma de m, n e o é pelo menos um, preferivelmente a soma de m, n e o é na faixa de 5 a 100, mais preferivelmente na faixa de 9 a 50.

[00238] Os tensoativos não iônicos da fórmula geral (III) podem ser de qualquer estrutura, sua estrutura é de bloco ou aleatória e não é limitada às sequências apresentadas.

[00239] Em uma modalidade, a formulação detergente compreende pelo menos um tensoativo não iônico selecionado da fórmula geral (III), em que m é na faixa de 3 a 11, preferivelmente não mais do que 7; n e o é 0, R1 éC12-C14, R5 é H. A formulação detergente pode compreender pelo menos dois tensoativos não iônico, selecionados dos compostos da fórmula geral (III), em que o dito tensoativos não iônico é distinguido em R1 sendoC12, R5 sendo H, m é 7, n e o = 0 e o outro tensoativo é distinguido em R1 sendoC14, R5 sendo H, m sendo 7, n e o = 0.

[00240] Os tensoativos não iônicos também podem ser compostos da fórmula geral (IV), que podem ser chamados de alquil-poliglicosídeos (APG): (IV)

[00241] As variáveis da fórmula geral (IV) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre alquila C1-C17 e alquenila C2-C17, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados; os exemplos são n-

75 / 95 C7H15, n-C9H19, n-C11H23, n-C13H27, n-C15H31, n-C17H35, i-C9H19, i-C12H25.

[00242] R2 é selecionado dentre H, alquila C1-C17 e alquenila C2-C17, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados.

[00243] G1 é selecionado dentre resíduos de monossacarídeos com 4 a 6 átomos de carbono, tais como glicose e xilose.

[00244] O número inteiro w da fórmula geral (IV) é na faixa de 1,1 a 4, w sendo um número médio.

[00245] Os tensoativos não iônicos também podem ser compostos da fórmula geral (V): (V)

[00246] As variáveis da fórmula geral (V) são definidas como segue: AO é selecionada de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), óxido de butileno (BO) e misturas dos mesmos.

[00247] R6 é selecionada de alquila C5-C17 e alquenila C5-C17, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados.

[00248] R7 é selecionado dentre H, alquila C1-C18, em que alquila é linear ou ramificado.

[00249] O número inteiro y da fórmula geral (V) é um número na faixa de 1 a 70, preferivelmente de 7 a 15.

[00250] Os tensoativos não iônicos também podem ser selecionados de ésteres de sorbitano e/ou ésteres de sorbitano etoxilados ou propoxilados. Os exemplos não limitantes são produtos vendidos sob os nomes comerciais SPAN e TWEEN.

[00251] Os tensoativos não iônicos também podem ser selecionados de mono- ou dialquilaminas alcoxiladas, monoetanolamidas do ácido graxo (FAMA), dietanolamidas do ácido graxo (FADA), monoetanolamidas etoxiladas do ácido graxo (EFAM), monoetanolamidas propoxiladas do ácido

76 / 95 graxo (PFAM), amidas do ácido graxo de poli-hidróxi alquila, ou derivados de N-acil N-alquila de glicosamina (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA) e combinações destes.

[00252] As misturas de dois ou mais tensoativos não iônicos diferentes também podem estar presentes nas formulações detergentes de acordo com a presente invenção.

[00253] Em uma modalidade, a formulação detergente da invenção compreende pelo menos um tensoativo selecionado dentre tensoativos anfotéricos. Os tensoativos anfotéricos são aqueles, dependendo do pH, que podem ser catiônicos, zwiteriônicos ou aniônicos; os tensoativos anfotéricos são conhecidos àqueles habilitados na técnica. Geralmente: os tensoativos anfotéricos podem ser compostos que são chamados aminoácidos modificados (proteinogênicos assim como não proteinogênicos). Os tensoativos anfotéricos também podem ser compostos chamados betaínas e/ou sulfobetaínas, anfocarboxilatos de alquila e óxidos de amina (AO).

[00254] As misturas de dois ou mais tensoativos anfotéricos diferentes podem estar presentes em composições detergentes de acordo com a presente invenção.

[00255] Tensoativo aniônico significa um tensoativo com um grupo iônico negativamente carregado. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não são limitados a, compostos de superfície ativa que contêm um grupo hidrofóbico e pelo menos um grupo aniônico de solubilização em água, geralmente selecionado dentre sulfatos, sulfonatos e carboxilatos para formar um composto solúvel em água.

[00256] Os tensoativos aniônicos podem ser compostos da fórmula geral (VI), que podem ser chamados de sulfatos de (etóxi/éter) de álcool/alquila (graxo) [(F)A(E)S] quando A- é SO3-, (graxo) carboxilato de álcool/alquila (etóxi/éter) [(F)A(E)C] quando A- é –RCOO-:

77 / 95 M+ (VI)

[00257] As variáveis na fórmula geral (VI) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre alquila C1-C23 (tal como 1-, 2-, 3-, 4- alquila C1-C23-) e alquenila C2-C23, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados e em que 2-, 3-, ou 4-aquila; exemplos são n-C7H15, n-C9H19, n- C11H23, n-C13H27, n-C15H31, n-C17H35, i-C9H19, i-C12H25.

[00258] R2 é selecionado dentre H, alquila C1-C20 e alquenila C2-C20, em que alquila e/ou alquenila são lineares ou ramificados.

[00259] R3 e R4, cada um independentemente selecionado dentre alquila C1-C16, em que alquila é linear ou ramificado; exemplos são metila, etila, n- propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, tern-butila, n-pentila, isopentila, sec-pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila, isodecila.

[00260] A- é selecionado dentre –RCOO-, -SO3- e RSO3-, em que R é selecionado dentre alquila C1-C8 e hidróxi-alquila C1-C4 lineares ou ramificados, em que alquila é.

[00261] M+ é selecionado dentre H e cátions de formação de sal. Os cátions de formação de sal podem ser monovalentes ou multivalentes; consequentemente, M+ se iguala a 1/v Mv+. Os exemplos incluem, mas não são limitados a sódio, potássio, magnésio, cálcio, amônio e o sal de amônio de mono-, di e trietanolamina.

[00262] Os números inteiros da fórmula geral (VI) são definidos como segue: m é na faixa de zero a 200, preferivelmente de 1 a 80, mais preferivelmente de 3 a 20; n e o, cada um independentemente na faixa de zero a 100; n é preferivelmente na faixa de 1 a 10, mais preferivelmente de 1 a 6; o preferivelmente é na faixa de 1 a 50, mais preferivelmente de 4 a 25. A soma

78 / 95 de m, n e o é pelo menos um, preferivelmente a soma de m, n e o é na faixa de 5 a 100, mais preferivelmente na faixa de 9 a 50.

[00263] Os tensoativo aniônicos da fórmula geral (VI) podem ser de qualquer estrutura, copolímeros de bloco ou copolímeros aleatórios.

[00264] Outros tensoativo aniônicos adequados incluem sais (M+) de ésteres sulfo alquílicos do ácido graxo C12-C18 (tal como ésteres sulfo metílicos do ácido graxo C12-C18), ácidos alquilarilsulfônico C10-C18 (tal como ácidos alquilbenzeno sulfônicos n-C10-C18) e carboxilatos de alcóxi alquila C10-C18.

[00265] M+ em todos os casos é selecionado dos cátions que formam sal. Os cátions que formam sal podem ser monovalentes ou multivalentes; consequentemente M+ se iguala a 1/v Mv+. Os exemplos incluem, mas não são limitados a sódio, potássio, magnésio, cálcio, amônio e o sal de amônio de mono-, di e trietanolamina.

[00266] Em uma modalidade, a formulação detergente compreende pelo menos um tensoativo aniônico selecionado dos compostos da fórmula geral (VI), em que R1 é C11-C13, R2 é H, m é 1-4, n e o = 0, A- é SO3-, M+ é Na+. A formulação detergente pode compreender pelo menos dois tensoativos aniônicos, selecionados dos compostos da fórmula geral (VI), em que um dos ditos tensoativos aniônicos são distinguidos em R1 sendo C11, R2 sendo H, m sendo 2, n e o = 0, A- sendo SO3-, M+ sendo Na+ e o outro tensoativo é distinguido em R1 sendo C13, R2 sendo H, m sendo 2, n e o = 0, A- sendo SO3-, M+ sendo Na+.

[00267] Os exemplos não limitantes de outros tensoativos aniônicos adequado incluem alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alceno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidróxi-alcanossulfonatos e dissulfonatos, alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), ésteres de glicerol de ácido graxo sulfonados, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, aminoácidos derivados de ácido graxo, diésteres e

79 / 95 monoésteres do ácido sulfossuccínico.

[00268] Em uma modalidade, a formulação detergente compreende pelo menos um tensoativo aniônico selecionado dos compostos da fórmula geral (VII): R1 H+ (VII) em que R1 na fórmula (VII) é alquila C10-C13. A formulação detergente pode compreender pelo menos dois tensoativo aniônicos, selecionados dos compostos da fórmula geral (VII), em que um dos ditos tensoativos aniônicos é distinguido em R1 sendo C10 e o outro tensoativo é distinguido em R1 sendo C13.

[00269] Os tensoativo aniônicos podem ser os compostos da fórmula geral (VIII), que podem ser chamados de tensoativos de aminoácido de N-acila: (VIII)

[00270] As variáveis na fórmula geral (VIII) são definidas como segue: R19 é selecionado dentre alquila C6-C22 linear ou ramificado e alquenila C6-C22 linear ou ramificado tal como oleíla.

[00271] R20 é selecionado dentre H e alquila C1-C4.

[00272] R21 é selecionado dentre H, metila, -(CH2)3NHC(NH)NH2, - CH2C(O)NH2, -CH2C(O)OH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)2C(O)OH, (imidazol-4- il)-metila, -CH(CH3)C2H5, -CH2CH(CH3)2, -(CH2)4NH2, benzila, hidroximetila, -CH(OH)CH3, (indol-3-il)-metila, (4-hidróxi-fenil)-metila, isopropila, -(CH2)2SCH3 e -CH2SH.

[00273] R22 é selecionado dentre –COOX e –CH2SO3X, em que X é

80 / 95 selecionado dentre Li+, Na+ e K+.

[00274] Os exemplos não limitantes de tensoativos do aminoácido de N- acila adequados são os sais de mono- e dicarboxilato (por exemplo, sal de sódio, potássio, amônio e amônio de mono-, di e trietanolamina) de ácido glutâmico N-acilado, por exemplo, cocoil glutamato de sódio, lauroil glutamato de sódio, miristoil glutamato de sódio, palmitoil glutamato de sódio, estearoil glutamato de sódio, cocoil glutamato de dissódio, estearoil glutamato de dissódio, cocoil glutamato de potássio, lauroil glutamato de potássio e miristoil glutamato de potássio; os sais de carboxilato (por exemplo, sal de dissídio sódio, potássio, amônio e amônio de mono-, di e trietanolamina) de alanina N-acilada, por exemplo, cocoil alaninato de sódio e lauroil alaninato de trietanolamina; os sais de carboxilato (por exemplo, sal de sódio, potássio, amônio e de amônio de mono-, di e trietanolamina) de glicina N-acilada, por exemplo, cocoil glicinato sódio e cocoil glicinato potássio; os sais de carboxilato (por exemplo, sal de sódio, potássio, amônio e de amônio de mono-, di e trietanolamina) de sarcosina N-acilada, por exemplo, lauroil sarcosinato sódio, cocoil sarcosinato de sódio, miristoil sarcosinato de sódio, oleoil sarcosinato de sódio e lauroil sarcosinato de amônio.

[00275] Os tensoativo aniônicos também podem ser selecionados do grupo de sabões. São adequados os sais (M+) de ácido graxos C12-C18 saturados e insaturados, tais como ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido beênico, ácido oléico, ácido erúcico (hidratado). M+ é selecionado dos cátions de formação de sal. Os cátions de formação de sal podem ser monovalentes ou multivalentes; consequentemente, M+ se iguala a 1/v Mv+. Os exemplos incluem, mas não são limitados ao sal de sódio, potássio, magnésio, cálcio, amônio e de amônio de mono-, di e trietanolamina.

[00276] Outros exemplos não limitantes de sabões adequados incluem: misturas de sabão derivadas de ácidos graxos naturais tais como sebo, óleo de coco, óleo de palmiste, óleo de louro, azeite de oliva, ou óleo de canola. Tais

81 / 95 misturas de sabão compreendem os sabões de ácido láurico e/ou ácido mirístico e/ou ácido palmítico e/ou ácido esteárico e/ou ácido oléico e/ou ácido linoléico em diferentes quantidades, dependendo dos ácidos graxos naturais a partir dos quais os sabões são derivados.

[00277] Outros exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos adequados incluem: sais (M+) de sulfatos, sulfonatos ou carboxilatos derivados de ácidos graxos naturais tais como sebo, óleo de coco, óleo de palmiste, óleo de louro, azeite de oliva, ou óleo de canola. Tais tensoativos aniônicos compreendem sulfatos, sulfonatos ou carboxilatos de ácido láurico e/ou ácido mirístico e/ou ácido palmítico e/ou ácido esteárico e/ou ácido oléico e/ou ácido linoléico em diferentes quantidades, dependendo dos ácidos graxos naturais a partir dos quais os sabões são derivados.

[00278] As misturas de dois ou mais tensoativos aniônicos diferentes também podem estar presentes em composições detergentes de acordo com a presente invenção.

[00279] As misturas de tensoativos não iônicos e/ou anfotéricos e/ou aniônicos também podem estar presentes nas composições detergentes de acordo com a presente invenção.

[00280] Em uma modalidade, a formulação detergente da invenção compreende pelo menos um tensoativo catiônico significando um tensoativo com um grupo iônico positivamente carregado. Tipicamente, estas porções catiônicas são grupos contendo nitrogênio tais como amônio quaternário ou grupos amino protonados. As aminas catiônicas protonadas podem ser aminas primárias, secundárias ou ternárias.

[00281] A formulação detergente pode compreender uma mistura de tensoativos selecionados de compostos da fórmula geral (III), compostos da fórmula geral (VI) e compostos da fórmula geral (VII). Exemplos Exemplo 1: Ensaio ELISA

82 / 95

[00282] O ensaio imunossorvente ligado à enzima ELISA) foi usado para determinar a quantidade de lipase expressa e secretada. Anticorpos policlonais foram gerados para a SEQ ID NO: 1 e purificados pelos métodos padrão (anticorpo primário). Um ELISA competitivo foi utilizado revestindo- se as placas com lipase purificada (SEQ ID NO: 1) depois bloqueio para minimizar a ligação não específica. Cada amostra foi misturada com anticorpo primário antes de incubar na placa para competir com a enzima pré-revestida. As placas foram lavadas antes da incubação com um anticorpo secundário adquirido. As placas foram lavadas depois e solução de desenvolvimento comercial foi usada e os dados finais lidos a 450 nm. Exemplo 2: Ensaio de pNPC8

[00283] A atividade de lipase foi medida seguindo-se a liberação de p- nitrofenol da hidrólise de octanoato de 4-nitrofenila (pNP-C8). Ligando-se um ácido graxo ao p-nitrofenol é possível seguir a atividade lipolítica pela detecção da liberação de p-nitrofenol a 405 nm. As lipases foram expressas e a lipase secretada separada das células pela centrifugação. Os sobrenadantes foram adicionados ao tampão de ensaio (pNP-C8, Hepes pH 7,5, Sorbitol, Triton X100 e BPER) no formato de placa de 96 poços. A absorbância a 405 nm foi detectada a cada 30 segundos durante 2 a 15 minutos. A inclinação foi usada para determinar a taxa de atividade. A atividade de cada variante foi normalizada para o controle de enzima precursora a partir de cada placa. Exemplo 3: C16

[00284] A atividade de lipase foi medida seguindo-se a liberação de p- nitrofenol a seguir da hidrólise de palmitato de 4-nitrofenila (pNP-C16). Ligando-se um ácido graxo ao p-nitrofenol é possível seguir a atividade lipolitica pela detecção da liberação de p-nitrofenol a 405 nm. As lipases foram expressas e a lipase secretada separada das células pela centrifugação. Os sobrenadantes foram adicionados ao tampão de ensaio (pNP-C16, Hepes pH 7,5, Sorbitol, Triton X100 e BPER) no formato de placa de 96 poços. A

83 / 95 absorbância a 405 nm foi detectada a cada 30 segundos durante 2 a 15 minutos. A inclinação foi usada para determinar a taxa de ativada. A atividade de cada variante foi normalizada para o controle de enzima precursora a partir de cada placa. Exemplo 4: Expressão da Variante Lipase

[00285] As enzimas de lipase variantes foram obtidas pela construção de plasmídeos de expressão contendo as sequências de polinucleotídeo codificadoras, transformando plasmídeos na Pichia pastoris (Komagataella phaffii) e cultivando as cepas de expressão resultantes do seguinte modo. Células frescas de Pichia pastoris das cepas de expressão foram obtidas espalhando-se os estoques de glicerol das cepas confirmadas na sequência sobre placas de ágar com extrato de levedura Peptona Dextrose (YPD) contendo Zeocina. Depois de 2 dias, culturas de semente iniciadoras das cepas de produção foram inoculadas em 100 mL de Meio Complexo de Glicerol Tamponado (BMGY) usando células destas placas e cultivadas por 20 a 24 horas a 30°C e 225 a 250 rpm. As culturas sementes foram ampliadas transferindo-se quantidades adequadas dentro de 2 a 4 L de meio BMMY em um Fermentador com defletor. As fermentações foram realizadas a 30°C e sob 1100 rpm de agitação, suprida por intermédio de hélices de lâmina plana, durante 48 a 72 horas. Depois da fase de lote inicial de fermentação, Metanol filtrado estéril foi adicionado como alimentado sempre que o nível de oxigênio dissolvido na cultura baixasse abaixo de 30%. Alternativamente, alimentação foi adicionada a cada 3 horas a 0,5% v/v da cultura de lote de partida. O caldo de fermentação final foi centrifugado a 7000xg durante 30 mins a 4°C para se obter o sobrenadante livre de células.

[00286] Os níveis de expressão da lipase variante foram determinados como segue: o sobrenadante foi ensaiado quanto a expressão da proteína de interesse pela SDS-PAGE ou eletroforese capilar e pela atividade enzimática usando PNP-octanoato como substrato.

84 / 95 Exemplo 5: Mutações Pontuais Únicas de Variantes de Lipase

[00287] Uma lipase precursora (SEQ ID NO: 1/2), foi selecionada e usada para gerar enzimas de lipase variantes de ocorrência não natural usando a Mutagênese de Saturação de Sítio de Gene (GSSM) como descrito pelo menos nas Patentes US: 6.171.820, 6.562.594 ou 6.764.835. As variantes de lipase incluem todas as 19 substituições de aminoácido em cada resíduo de aminoácido em relação ao comprimento completo da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1/2. Os sobrenadantes das enzimas de lipase variantes da biblioteca GSSM foram triados em formatos de 384 placas. As enzimas variantes no sobrenadante foram adicionadas a banha em combinação com 0,01% de tensoativo (2:5:3 de sulfonato de alquilbenzeno linear (Meranil DSB/ E): laureth sulfato de sódio 2EO (TexaponN70): éter alquílico de polietileno glicol (LutensolA07)) em 100 mM de Hepes pH 8. Acertos foram definidos como sobrenadantes que hidrolisaram mais banha do que o precursor medido pela OD600. As variantes de lipase que tiveram uma característica melhorada quando comparada com a lipase precursora foram identificadas e os resultados são mostrados na Tabela 1, abaixo. As variantes de lipase foram identificadas que tiveram características melhoradas tais como atividade mais alta, desempenho melhorado (remoção de mancha no pano), estabilidade contra degradação proteolítica, perfil de pH, expressão mais alta ou qualquer combinação dos mesmos quando comparadas com a enzima precursora. Os resultados listados abaixo descrevem as variantes de lipase tendo características melhoradas quando comparadas com a enzima de lipase precursora (SEQ ID NO: 1/2). As variantes de lipase também podem conter substituições de aminoácido diferentes no mesmo número de posição de resíduo de aminoácido. Por exemplo, as variantes de lipase na posição 64 podem ser: K64V, K64T ou K64E, em que cada variante de lipase tem uma característica melhorada quando comparada com a lipase precursora.

85 / 95 Tabela 1: Lipase No. Aminoácido Original Resíduo de Aminoácido Novo Aminoácido LV005 K 14 E LV074 F 56 C LV008 K 64 V LV075 K 64 T LV076 K 64 E LV077 P 67 L LV078 W 79 F LV079 W 79 i LV080 K 145 W LV081 K 145 E LV082 E 263 L LV083 I 265 T LV084 I 265 L LV085 Y 266 L LV086 Y 266 V LV087 N 272 P LV088 R 273 Q LV089 Y 275 F LV090 P 287 R LV091 N 291 UM LV092 N 291 L LV006 N 291 F LV007 UM 293 V LV093 F 297 L LV009 M 298 F LV012 UM 303 Q LV094 S 307 L LV095 L 308 S LV096 L 308 N LV097 T 310 Q LV098 Y 340 F LV099 Y 347 K LV100 V 375 G LV101 Q 377 K LV011 L 407 UM LV010 L 407 G Exemplo 6: Combinações de Variante Lipase de Mutações

[00288] As variantes de lipase que não ocorrem naturalmente adicionais foram geradas pela combinação das mutações pontuais únicas do exemplo anterior usando um método de Montagem Combinatória de Sítio Múltiplo Sob

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Medida (TMSCA) como descrito na WO2009/018449. As variantes da lipase foram identificadas que tiveram características melhoradas tais como atividade mais alta, desempenho melhorado (remoção de mancha no pano), expressão mais alta, estabilidade contra degradação proteolítica ou qualquer combinação dos mesmos quando comparada com a enzima precursora.

As combinações de mutações de aminoácido quando comparadas com a enzima precursora são mostradas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Enzima de Lipase Variante Polipeptídica Número da Lipase nenhuma – cadeia principal precursora SEQ ID NO: 1 N291A, 405L LV001 W79F, I265L, N291L LV002 E263L, T310Q LV003 T310Q, L407A LV013 K145E, L407A LV014 K64V, L407A LV015 M298F, L407A LV016 K145E, Y340F LV017 T310Q, L407A, K64V, K145E LV018 T310Q, L407A, K145E, M298F LV019 K14E, K64V, K145E, T310Q, L407A LV020 K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A LV021 E263L, F297L, T310Q, L407A LV022 E263L, F297L, T310Q, L407G LV023 P67L, E263L, F297L, T310Q, LV024 F297L, T310Q LV025 E263L, F297L LV026 E263L, Q377K, T310Q, L407A LV027 E263L, Q377K, T310Q, L407G LV028 K14E, E2363L, I265T, A303Q, T310Q LV029 E263L, T310Q, L407A LV030 E263L, T310Q, L407G LV031 E263L, M298F, T310Q LV032 K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407A LV033 K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407G LV034 K64V, K145E, E263L, A303Q, T310Q LV035 K145E, E263L, A303Q, LV036 K145E, A303Q LV037 K145E, Y340F, Y347K, L407A LV038 K145E, T310Q LV039 K145E, E263L LV040 K145E, Y347K LV041 K145E, K64V LV042 K145E, Y266L, A303Q LV043 K145E, E263L, M298F, T310Q, L407A LV044 K145E, E263L, M298F, T310Q, L407G LV045 K145E, E263L, T310Q, L407A LV046

87 / 95 Tabela 2: Enzima de Lipase Variante Polipeptídica Número da Lipase K145E, E263L, T310Q, L407G LV047 K14E, A303Q, L407A LV048 K14E, E263L, A303Q, T310Q, L407A LV049 K145W, E263L, I265T, A303Q, T310Q, L407A LV050 K145W, I265T, A303Q, L407A LV051 K64V, K145W, E263L, T310Q, L407A LV052 K64V, K145W, E263L, M298F, T310Q LV053 K64V, K145W, E263L, Y266L, T310Q LV054 A303Q, L407A LV055 M298F, L407G LV056 I265T, M298F, L407A LV057 I265T, M298F, L407G LV058 Y266L, M298F, L407A LV059 Y266L, M298F, L407G LV060 P67L, F297L, L407A LV061 P67L, F297L, L407G LV062 I265T, L407A LV063 Y266L, L407G LV064 E263L, L407A LV065 K145E, Y340F LV066 K145E, Y340F, M298F, L407A LV067 K145E, Y340F, K64V, L407A LV068 K14E, A303Q, L407A, K145E LV069 K14E, A303Q, L407A, K145E, Y340F LV070 K14E, A303Q, L407A, M298F LV071 K14E, K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A LV072 T312Q LV073

[00289] Os resultados para as características melhoradas das enzimas de variante de lipase polipeptídica são mostrados na Tabela 3, abaixo como uma porcentagem quando comparada com a enzima precursora (SEQ ID NO: 1/2). Tabela 3: Lipase ELISA pNPC8 C16 SEQ ID NO: 1 100% 100% 100% LV013 140% 37% 103% LV014 146% 93% 89% LV015 84% 53% 69% LV016 98% 100% 95% LV017 122% 91% 91% LV018 256% 30% 249% LV019 168% 32% 164% LV020 142% 25% 227% LV021 361% 28% 168% LV022 0% 0% 2% LV023 0% 0% 1% LV024 3% 2% 7% LV025 46% 25% 71% LV026 5% 20% 11% LV027 13% 1% 8%

88 / 95 Tabela 3: Lipase ELISA pNPC8 C16 LV028 5% 2% 5% LV029 22% 47% 40% LV030 8% 49% 12% LV031 6% 3% 17% LV032 14% 1% 5% LV033 9% 10% 18% LV034 5% 7% 15% LV035 15% 45% 27% LV036 22% 49% 18% LV037 147% 100% 89% LV038 41% 60% 41% LV039 89% 14% 45% LV040 32% 111% 97% LV041 14% 35% 20% LV042 97% 102% 110% LV043 142% 106% 124% LV044 39% 18% 48% LV045 34% 12% 40% LV046 29% 12% 51% LV047 15% 10% 47% LV048 130% 107% 63% LV049 10% 9% 14% LV050 1% 100% 100% LV051 47% 74% 67% LV052 19% 47% 47% LV053 27% 95% 114% LV054 15% 31% 20% LV055 110% 83% 76% LV056 107% 118% 90% LV057 51% 53% 48% LV058 180% 75% 71% LV060 150% 31% 25% LV061 0% 1% 3% LV062 0% 1% 2% LV063 31% 44% 49% LV064 54% 53% 75% LV065 16% 30% 19% LV066 112% 82% 65% LV068 153% 81% 103% LV069 126% 74% 68% LV070 141% 77% 65% LV071 92% 72% 38% LV072 188% 27% 158% Exemplo 7: Desempenho na remoção de gorduras

[00290] As variantes de lipase polipeptídicas foram testadas em uma escala pequena sobre as seguintes manchas: 1) C-S-61: gordura bovina sobre algodão, valores de Lab antes da lavagem; 2) EMPA112: banha sobre algodão,

89 / 95 valores de Lab antes da lavagem. Produtor: Center for Testmaterials (CFT) BV, NL-3130 AC Vlaardingen.

[00291] Amostras de pano manchado foram colocadas dentro de vasos cilíndricos abertos [aço inoxidável] (razão de altura para diâmetro 1:1 a 3:1) de um tamanho < 2000 microL, taxa de enchimento <80% e contendo um dos seguintes tipos de líquido de lavagem: (a) Detergente em água (dureza 2,5 mmol/L; Ca²+ : Mg²+ : HCO3- = 4:1:8); (b) Detergente em água + lipase (concentrações diferentes em ppm).

[00292] As amostras de pano tingidas foram agitadas no líquido de lavagem em uma razão de tecido/ líquido de 1:35 sobre os dispositivos de mesa de agitação na temperatura selecionada durante 20 min. Depois da lavagem, as amostras de pano foram enxaguadas sob fluxo contínuo de água de torneira (12- 21°dH) (2 a 6 l/min) durante < 5 min. As amostras de pano enxaguadas foram secas sob corrente de ar contínua e armazenados em um quarto escuro fechado sob condição ambiente até que elas fossem medidas.

[00293] O desempenho de remoção de mancha foi determinado pelo uso da medição de cor de área múltipla MACH5 que dá valores LAB e ΔE calculados entre as manchas não lavadas e lavadas.

[00294] O brilho L *, o valor a* no eixo de cor vermelho - verde e o valor b* no eixo de cor amarelo - azul, foram medidos pelo uso da medição de cor de área múltipla MACH 5 (Center for Testmaterials (CFT) BV, NL-3130 AC Vlaardingen) antes e depois da lavagem. A mudança do valor de cor (ΔE) foi medida de acordo com a o espaço de cor CIELAB, definido e calculado automaticamente pelas ferramentas de avaliação de cor na seguinte equação: ΔE = raiz (Δ Delta a * 2 + Δ Delta b * 2 + Δ Delta L * 2). ΔE é uma medida do efeito de remoção de mancha obtido ou efeito da lavagem. Todas as medições foram repetidas 2 vezes para produzir um número médio. Observe que valores ΔE mais altos representam melhores efeitos de lavagem quando comparados aos valores ΔE mais baixos.

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[00295] Os resultados também estão resumidos abaixo na Tabela 4, testes 1 a 4. Exemplo 8: Remoção de mancha de gordura com Launder-o-meter (LOM)

[00296] As variantes de lipase polipeptídicas foram testadas com um LOM. Monitores de mancha selecionados foram lavados juntos com tecido de lastro de algodão e bolas de aço a 25°C no líquido de lavagem usando formulação base ES1 ou ES4 no launder-o-meter (LP2 Typ, SDL Atlas Inc., USA) sob as seguintes condições de lavagem: Formulação Detergente ES1: Componente Tipo Conc A [%] Lutensit A-LBS LAS 5,5 Ácido graxo de coco Edenor Ácido graxo de coco C12-C18 2,4 Lutensol AO7 AEO 5,5 Texapon N70 FAEO 5,5 1,2 propileno glicol 6,0 etanol 2,0 KOH 2,2 Formulação Detergente ES4: Componente Tipo Conc A [%] Lutensit A-LBS LAS 3,63 Ácido graxo de coco Edenor Ácido graxo de coco C12-C18 2,67 Lutensol AO 7 AEO 7,62 Texapon N70 FAEO 10,37 1,2 propileno glicol 4,45 etanol 1,48 KOH 2,45 Condições de teste Líquido de lavagem 250 ml # Bolas de aço* 20 Tempo/temperatura de lavagem 20 min a 25°C ou 40 °C Dosagem de Lipase 0 ppm, 0,2 ppm ou 1,5 ppm Dosagem de detergente 2g/L ou 5 g/L Ciclos de lavagem 1 Dureza da água 2,5 mmol/L;

91 / 95 Tecido de lastro 15 g de tecido de algodão 283 Soma de lastro + Tecido sujo 20 g Amostras de pano sujo 2 x 2,5 g C-S-61 ou C-S 62 Razão de tecido/líquido 1:12,5

[00297] Depois da lavagem, os tecidos foram enxaguados, secados por rotação e secados ao ar. O desempenho de lavagem para as manchas únicas é determinado medindo-se o valor de remissão do tecido sujo depois da lavagem com o espectrofotômetro da Fa. Datacolor (Elrepho 2000) a 460 nm. No geral, quanto mais alto o valor de remissão, melhor o desempenho. Para os monitores de sujeita múltipla o desempenho de remoção de mancha foi determinado usando-se a medição de cor de área múltipla MACH5 que dá valores LAB e ΔE calculados entre mancha não lavada e lavada (cálculo de acordo com o exemplo 7). Os resultados também estão resumidos abaixo na Tabela 4, testes 5 a 8. Testes únicos:

[00298] Teste 1: Algodão sujo com Gordura bovina (CFT-CS 61), 2 g/L de ES 4 (30%), 25 °C, escala pequena, ΔE a 1,5 ppm.

[00299] Teste 2: Algodão sujo com Gordura bovina (CFT-CS 61), 2 g/L de ES 4 (30%), 40 °C, escala pequena, ΔE a 1,5 ppm.

[00300] Teste 3: Gordura bovina (CFT-CS 61), 2 g/L de ES 1 (20%), 25 °C, escala pequena, ΔE a 1,5 ppm.

[00301] Teste 4: Gordura bovina (CFT-CS 61), 2 g/L de ES 1 (20%), 40 °C, escala pequena, ΔE a 1,5 ppm.

[00302] Teste 5: Chocolate (EMPA 112), 2 g/L de ES 4 (30%), 25 °C, LOM, ΔE a 1,5 ppm.

[00303] Teste 6: Poliéster/Algodão sujo w/ Pigmento/Sebo (wfk 20D), 2 g/L de ES 4 (30%), 25 °C, LOM, ΔE a 1,5 ppm.

[00304] Teste 7: Poliéster/Algodão sujo w/ Pigmento/Sebo (wfk 20D), 2 g/L de ES 1 (20%), 25 °C, LOM, ΔE a 1,5 ppm.

[00305] Teste 8: Algodão sujo com musse de chocolate (CFTCS-70), 2

92 / 95 g/L de ES 1 (20%), 25 °C, LOM, ΔE a 1,5 ppm. Tabela 4: Desempenho de lavagem (em ΔEE) de variantes de lipase sobre manchas de gordura (normalizadas) ND = nenhum dado gerado Lipase Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste 5 Teste 6 Teste 7 Teste 8 SEQ ID NO: 1/2 100 100 100 100 100 100 100 100 LV004 71 106 ND ND ND ND ND ND LV005 120 99 ND ND ND ND ND ND LV006 104 101 ND ND ND ND ND ND LV007 96 100 38 49 ND 120 ND ND LV008 228 205 110 113 ND 194 ND ND LV009 248 211 109 116 ND 180 ND ND LV010 195 206 107 110 ND 178 ND ND LV011 195 205 95 100 102 197 97 110 LV012 101 147 ND ND 92 188 107 100 LV013 77 99 ND ND 92 175 88 100 LV014 110 112 ND ND 93 186 88 101 LV015 95 106 ND ND 86 184 87 100 LV016 109 106 ND ND 90 193 96 93 LV017 116 133 123 105 ND ND ND ND LV018 111 116 111 91 ND ND ND ND LV019 102 115 117 97 ND ND ND ND LV020 94 101 107 94 ND ND ND ND LV021 83 109 107 92 ND ND ND ND Apenas Detergente 100 100 89 97 43 100 72 92

[00306] Testes 1 e 2: Variantes de lipase LV005, LV006, LV008, LV009, LV010, LV011, LV014, LV016, LV017, LV018, LV019 com aumento de desempenho significante sobre mancha de gordura bovina comparadas com a enzima lipase precursora (SEQ ID NO: 1/2). Variantes LV008, LV009, LV010, LV011 com duas vezes o desempenho da enzima de lipase precursora sobre mancha de gordura bovina a 25°C e 40°C em detergente ES4 (2 g/l), quando dosado a 1,5 ppm das enzimas em lavagem de alto rendimento.

[00307] Testes 3 e 4: Benefícios de desempenho confirmados em detergente ES1 sob as mesmas condições a 25°C e 40°C com 2 g/l de detergente de lavagem e 1,5 ppm de dosagem de enzima contra SEQ ID NO: 1.

[00308] Teste 6: Variantes LV008, LV009, LV010, LV011, LV012, LV013, LV014, LV015 e LV016 com benefícios de desempenho quando comparadas com a enzima de lipase precursora da SEQ ID NO: 1/2, sobre

93 / 95 mancha de pigmento/sebo sobre poliéster/algodão na temperatura de lavagem de 25°C em detergente ES 4 (2 g/l) em LOM. Exemplo 9: Seletividade de Ácido Graxo

[00309] A atividade de lipase foi medida seguindo-se a liberação de p- nitrofenol a seguir da hidrólise de butirato de 4-nitrofenila (pNP-C4), caprilato de 4-nitrofenila (pNP-C8), laurato de 4-nitrofenila (pNP-C12), miristato de 4- nitrofenila (pNP-C14), palmitato de 4-nitrofenila (pNP-C16) e estearato de 4- nitrofenila (pNP-C18). Pela ligação de um ácido graxo ao p-nitrofenol é possível seguir a atividade lipolitica pela detecção da liberação de p-nitrofenol a 405 nm. As lipases foram expressas e a lipase secretada separada das células pela centrifugação. Os sobrenadantes foram adicionados ao tampão de ensaio (substrato pNP, Hepes pH 7,5, Sorbitol, Triton X100 e BPER) no formato de placa de 96 poços. A absorbância a 405 nm foi detectada a cada 30 segundos durante 2 a 15 minutos. A inclinação foi usada para determinar a taxa de atividade. A seletividade é relatada como atividade através dos substratos de pNP diferentes e os resultados são mostrados na Figura 1. Exemplo 10: Estabilidade das variantes de lipase na presença de protease

[00310] As variantes de lipase foram testadas quanto à estabilidade na presença de protease.

[00311] A estabilidade da Lipase na presença de protease (Detralase) em Tampão Tris pH 8,6, amostras armazenadas a 37°C, Ensaio de lipase, Detralase 1% p/p. Os resultados mostrados na Figura 2, mostram que as variantes da lipase retêm atividade depois de 80 minutos quando comparadas com a lipase de acordo com a SEQ ID NO: 1. As variantes da lipase têm atividade diferente quando comparadas com a enzima de lipase precursora (SEQ ID NO.: 1/2) na presença de protease.

[00312] Adicionalmente, a estabilidade da Lipase da SEQ ID NO: 1 na presença de várias proteases foi testada em formulação detergente. Tabela Comp.:

94 / 95 Componente % p/p Lutensit A-LBS 5,7 1,2 Propileno glicol 6 Edenor ácido palmítico/oléico K12-18 2,4 KOH 3,1 Texapon N70 7,7 Lutensol AO 7 5,4 Etanol 2 Água 57,7 Total: 90 Estética, estabilidade física Clara, estável

[00313] A atividade da protease foi determinada usando Succinil – Ala – Ala – Pro – Phe – p-Nitroanilida (Suc-AAPF-pNA, resumidamente: AAPF; ver por exemplo, DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320) como substrato. pNA é clivada da molécula de substrato. A taxa de clivagem pode ser determinada pelo aumento da cor amarela de pNA livre na solução pela medição da OD405, a densidade óptica a 405 nm.

[00314] BLAP tipo selvagem (SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147) e variante BLAP (SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 tendo a substituição de aminoácido R99E) foram adicionadas à formulação detergente em uma dosagem de 1% p/p (ver TabelaComp. acima) e completamente misturados. Além disso, 0,3% da lipase foi adicionado. As amostras foram recolhidas nos pontos de tempo indicados e mantidas congeladas até que todas as amostras fossem recolhidas. Todas as amostras foram medidas no final do estudo com Ensaio AAPF.

[00315] A atividade de lipase foi testada usando um ensaio de lipase com base no substrato sintético Valerato de p-Nitrofenol.

[00316] As atividades enzimáticas em uma composição compreendendo Lipolase e protease: Dias 0 2 7 14 21 28 Atividade de lipolase depois de X dias de armazenagem [%] BLAP WT, R99 100 13 1 0 0 0 Variante BLAP, R99E 100 63 45 33 21 18 Atividades enzimáticas em uma composição compreendendo Letra Lip e protease:

95 / 95 Dias 0 2 7 14 21 28 Atividade de Letra Lip depois de X dias de armazenagem [%] BLAP WT, R99 100 11 1 1 0 0 Variante BLAP, R99E 100 81 47 27 16 12 Atividades enzimáticas em uma composição compreendendo Lipase (SEQ ID NO: 1) e protease: Dias 0 2 7 14 21 28 Atividade de lipase (SEQ ID NO: 1) depois de X dias de armazenagem [%] BLAP WT, R99 100 38 0 0 0 0 Variante BLAP, R99E 100 91 76 49 42 31

[00317] Os dados shop que a lipase de acordo com a SEQ ID NO: 3 é mais estável em uma formulação detergente compreendendo variante BLAP, protease R99E quando comparada com Lipolase e Letra Lip.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo tendo atividade de lipase, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica ou similar à sequência de aminoácido de comprimento completo da SEQ ID NO: 1, em que a uma ou mais inserções, deleções ou substituições de resíduos de aminoácido está(ão) no número de posição de resíduo de aminoácido 14, 64, 67, 79, 145, 263, 265, 266, 272, 275, 291, 293, 297, 298, 303, 307, 308, 310, 340, 347, 375, 377, 405, 407 para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais substituições de aminoácido é/são uma substituição de pelo menos uma dentre as seguintes: K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, L407G, para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais substituições de aminoácido único é/são selecionada(s) do grupo consistindo em: K14E, F56C, K64V, K64T, K64E, P67L, W79F, W79I, K145W, K145E, E263L, I265T, I265L, Y266L, Y266V, N272P, R273Q, Y275F, N291A, N291L, N291F, A293V, F297L, M298F, A303Q, S307L, L308S, L308N, T310Q, Y340F, Y347K, V375G, Q377K, L407A, e L407G, para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma combinação de modificações de aminoácido para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e a combinação é selecionada do grupo consistindo em: : (a1) N291A, 405L; (b1) W79F, I265L, N291L; (c1) E263L, T310Q; (d1) T310Q, L407A; (e1) K145E, L407A; (f1)

K64V, L407A; (g1) M298F, L407A; (h1) K145E, Y340F; (i1) T310Q, L407A; (j1) T310Q, L407A; (k1) K14E, K64V, K145E, T310Q, L407A; (l1) K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A;(m1) E263L, F297L, T310Q, L407A; (n1) E263L, F297L, T310Q, L407G; (o1) P67L, E263L, F297L, T310Q; (p1) F297L, T310Q; (q1) E263L, F297L; (r1) E263L, Q377K, T310Q, L407A; (s1) E263L, Q377K, T310Q, L407G; (t1) K14E, E2363L, I265T, A303Q, T310Q; (u1) E263L, T310Q, L407A; (v1) E263L, T310Q, L407G; (w1) E263L, M298F, T310Q; (x1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (y1) K145E, E263L, A303Q, T310Q, L407G; (z1) K64V, K145E, E263L, A303Q, T310Q; (a2) K145E, E263L, A303Q; (b2) K145E, A303Q; (c2) K145E, Y340F, Y347K, L407A; (d2) K145E, T310Q; (e2) K145E, E263L; (f2) K145E, Y347K; (g2) K145E, K64V; (h2) K145E, Y266L, A303Q; (i2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407A; (j2) K145E, E263L, M298F, T310Q, L407G; (k2) K145E, E263L, T310Q, L407A; (l2) K145E, E263L, T310Q, L407G; (m2) K14E, A303Q, L407A; (n2) K14E, E263L, A303Q, T310Q, L407A; (o2) K145W, E263L, I265T, A303Q, T310Q, L407A; (p2) K145W, I265T, A303Q, L407A; (q2) K64V, K145W, E263L, T310Q, L407A; (r2) K64V, K145W, E263L, M298F, T310Q; (s2) K64V, K145W, E263L, Y266L, T310Q; (t2) A303Q, L407A; (u2) M298F, L407G; (v2) I265T, M298F, L407A; (w2) I265T, M298F, L407G; (x2) Y266L, M298F, L407A; (y2) Y266L, M298F, L407G; (z2) P67L, F297L, L407A; (a3) P67L, F297L, L407G; (b3) I265T, L407A; (c3) Y266L, L407G; (d3) E263L, L407A; (e3) K145E, Y340F; (f3) K145E, Y340F; (g3) K145E, Y340F; (h3) K14E, A303Q, L407A; (i3) K14E, A303Q, L407A; (j3) K14E, A303Q, L407A; e (k3) K14E, K64V, K145E, M298F, T310Q, L407A.

5. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem um aumento na atividade enzimática, estabilidade em pH, estabilidade contra degradação proteolítica ou qualquer combinação dos mesmos quando comparado com a lipase da SEQ ID NO: 1.

6. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um fragmento da sequência de aminoácido de comprimento completo e o fragmento tem atividade de lipase.

7. Polipeptídeo híbrido, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento de pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um fragmento de um segundo polipeptídeo tendo atividade de lipase, em que o polipeptídeo híbrido tem atividade de lipase.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende uma segunda enzima selecionada dentre uma ou mais do grupo consistindo em: uma segunda lipase, uma amilase, uma protease, uma celulase, uma lacase, uma pectinase e uma nuclease.

10. Polinucleotídeo variante, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de ácido nucléico 90% idêntica ou similar quando comparada à sequência de polinucleotídeo de comprimento completo da SEQ ID NO: 2, em que os polinucleotídeos codificam um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

11. Método para fabricar a variante de polipeptídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende: prover um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácido nucléico como definida na reivindicação 10, transformar a dita sequência de ácido nucléico em um hospedeiro de expressão, cultivar o hospedeiro de expressão para produzir a variante de polipeptídeo, e purificar a variante de polipeptídeo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de expressão é selecionado do grupo consistindo em: um sistema de expressão bacteriana (preferivelmente selecionado a partir de uma E. coli, um Bacillus, uma Pseudomonas e uma Streptomyces), um sistema de expressão de levedura (preferivelmente selecionado a partir de uma Candida, uma Pichia, uma Saccharomyces, uma Schizosaccharomyces), um sistema de expressão fúngica (preferivelmente selecionado a partir selecionado a partir de um Penicillium, um Aspergillus, um Fusarium, um Myceliopthora, um Thermothelomyces, um Rhizomucor, um Rhizopus, um Thermomyces e um Trichoderma) e um sistema de expressão sintético.

13. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para processar gorduras, óleos ou sementes oleaginosas.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o processamento de gorduras, óleos ou sementes oleaginosas em processos alimentícios ou de ração ocorre durante a limpeza ou lavagem de produtos têxteis, superfícies duras ou louças; durante o processamento de polpa ou papel; e/ou durante a produção de etanol.