DE69033388T2

DE69033388T2 - Alkalisches proteolytisches enzym und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE69033388T2
Application number: DE69033388T
Authority: DE
Inventors: Michael Bahn; Dieter Hansen; Sherman Hom; Nicholas Kennedy; Beth Ladin; Martina Markgraf; Jonathan Mielenz; Christian Paech; Robert Reynolds; Joachim Schindler; Rolf Schmid; Charles Wilson
Original assignee: Henkel Research Corp
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1989-08-25
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2010-08-18
Also published as: US5352604A; ES2144990T3; WO1991002792A1; KR920701425A; ATE187490T1; JPH04507346A; KR100200166B1; DE69033388D1; DK0493398T3; JP3220137B2; EP0493398A1; EP0493398B1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die ein im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 sowie ein proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926 umfaßt, die Herstellung des im Alkalischen wirkenden proteolytischen Enzyms durch Kultivieren genetisch modifizierter Bacillus-Stämme sowie die genetischen Konstrukte innerhalb der Bacillus-Stämme, die für das im Alkalischen wirkende proteolytische Enzym codieren.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Proteolytische Enzyme werden in Haushaltswaschmittelzubereitungen häufig verwendet, um auf Proteinen beruhende Flecken aus Kleidungsstücken und dergleichen zu entfernen. Diese Enzyme sind Vertreter der als Serin-Proteasen bekannten Klasse, Enzyme, die die Spaltung von Peptidbindungen katalysieren. Um für wäßrige Waschmittellösungen geeignet zu sein, müssen diese Enzyme bei pH-Werten im Bereich von 7 bis 10 aktiv sein. Sie müssen außerdem stabil gegenüber Oxidation sowie enzymatische und nichtenzymatische Hydrolyse sein, um für Waschmittelanwendungen geeignet zu sein. Verschiedene Bacillus-Stämme erzeugen Serin-Proteasen unter geeigneten aeroben Fermentierungsbedingungen. Die Menge der von den Wildtypstämmen erzeugten Protease und die Produktionsgeschwindigkeit der Protease sind jedoch gewöhnlich für die kommerzielle Produktion unzureichend. Ein Verfahren zur Erhöhung der Proteaseausbeute besteht darin, durch Einwirkung von Strahlung oder chemischer Mutagene mutante Stämme zu erzeugen. Diese klassischen Mutationsvorgänge leiden jedoch unter dem Nachteil, daß sie nur eine statistische Verteilung der gewünschten Mutation erzeugen und/oder daß ein wesentlicher Anteil der Population zum Wildtyp rückmutiert. In den letzten Jahren haben sich Bemühungen zur Überwindung dieser Probleme auf die gezielte genetische Modifikation von Bakterienstämmen konzentriert. Dies erreicht man durch die Einführung von rekombinanter DNA in Wirtszellen unter Bedingungen, die garantieren, daß die Wirtszellen die rekombinante DNA mit einer erhöhten Kopienzahl replizieren. Außerdem müssen die Gene, die die Fremd-DNA trägt, exprimiert werden können. Die gentechnisch veränderten Organismen leiden nicht unter den Nachteilen, die bei klassisch mutierten Bakterien häufig auftreten und eignen sich daher häufig für die kommerzielle Enzymproduktion.
Verfahren zur Herstellung von Proteasen unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnik sind bekannt. Zum Beispiel offenbart EP-A-0 130 756 ein Verfahren zur Herstellung von Carbonyl- Hydrolase (einer Protease), und das US-Patent Nr. 4,760,025 offenbart eine Subtilisinform mit einer veränderten Aminosäuresequenz gegenüber der, die von dem natürlich vorkommenden Stamm erzeugt wird. DE-A-29 25 427 offenbart eine Bacillus- Alkalische-Protease, die gegenüber Chelatisierungsmitteln und Tensiden in hohem Maße stabil ist und durch Fermentation eines Bacillus licheniformis-Stammes erzeugt wird. Die Erzeugung eines im Alkalischen wirkenden proteolytischen Enzyms durch Kultivierung von B. licheniformis wurde beschrieben in GB-A- 1,263,765, DE-A-19 40 488, im Russischen Patent Nr. 400,116 und in den US-Patenten Nr. 3,623,956 und 3,623,957.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein proteolytisches Enzym zur Verwendung in Waschmittelzubereitungen bereit zustellen, das unter Bedingungen von pH 7-10 und bei Temperaturen von 10-60ºC in wäßrigen Lösungen eine erhöhte Protease- und oxidative Stabilität aufweist. Es ist außerdem ein Ziel der vorliegenden Erfindung, mutante Bacillus-Stämme zur Verwendung bei der kommerziellen Herstellung proteolytischer Enzyme, die für Waschmittelzubereitungen geeignet sind, bereitzustellen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Expressionsvektoren, die Sequenzen enthalten, welche das gewünschte proteolytische Enzym codieren, zum Transformieren von Bacillus-Wirtszellen bereitzustellen. Diese Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit:
(1) eine Zusammensetzung, die ein reifes, im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 mit der Aminosäuresequenz von Aminosäurerest 112 bis Aminosäurerest 380, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, sowie wenigstens ein proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926 umfaßt;
(2) ein Hybrid-Plasmid, das in Bacillus repliziert werden kann und das eine DNA-Sequenz enthält, die in der Richtung der Transcription einen regulatorischen Bereich umfaßt, wobei der regulatorische Bereich in der Reihenfolge der Transcription einen Promotor der Alkalischen Protease von Bacillus licheniformis ATCC 53926, eine Ribosomenbindungsstelle sowie ein operabel mit einem pre-pro-Bereich verknüpftes Startcodon umfaßt, wobei der pre-pro-Bereich operabel mit einem reifen Bereich verknüpft ist, der für das proteolytische Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1, wie es oben in (1) definiert ist, codiert;
(3) eine isolierte DNA-Sequenz, die für die pre-pro-reife Form des proteolytischen Enzyms von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1, wie es oben in (1) definiert ist, codiert;
(4) Plasmide mit einer Restriktionskarte, wie sie in den Fig. 13 bis 22 gezeigt ist;
(5) eine transformierte Bacillus-Wirtszelle, die ein Plasmid umfaßt, wie es oben in (4) definiert ist;
(6) ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms gemäß Anspruch 1, das das Kultivieren eines Bacillus-licheniformis-ATCC- 53926-Stammes, der mit einem Plasmid transformiert ist, wie es oben in (4) definiert ist, in einem Nährmedium und das Gewinnen des Enzyms umfaßt;
(7) eine Zusammensetzung, die ein reifes, im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym mit der in Fig. 29 gezeigten Aminosäuresequenz sowie wenigstens ein proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926 umfaßt;
(8) eine biologisch reine Kultur von Bacillus licheniformis, der alle Merkmale des unter der Zugriffsnummer ATCC 53926 hinterlegten Stammes aufweist; und
(9) eine biologisch reine Kultur eines Bacillus-lentus-Stammes, der alle Merkmale des unter der Zugriffsnummer DSM 5483 hinterlegten Stammes aufweist.
Das oben in (6) definierte Verfahren umfaßt also das Kultivieren eines B.-licheniformis-ATCC-53926-Stammes, der mit einem Plasmid transformiert ist, das eine DNA-Sequenz enthält, die in der Richtung der Transcription einen regulatorischen Bereich umfaßt, wobei der regulatorische Bereich in der Reihenfolge der Transcription einen Promotor des Alkalische-Protease-Gens von B. licheniformis ATCC 53926, eine Ribosomenbin dungsstelle sowie ein operabel mit einem pre-pro-Bereich verknüpftes Startcodon umfaßt, wobei der pre-pro-Bereich operabel mit einem reifen Bereich verknüpft ist, der für das Alkalische-Protease-Enzym von Bacillus lentus codiert.
Der Stamm Bacillus licheniformis ATCC 53926 wird im folgenden als ATCC 53926 bezeichnet. Der Stamm Bacillus licheniformis DSM 641 wird im folgenden als DSM 641 bezeichnet. Die Polymerase-Kettenreaktion, die in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben ist, wird im folgenden als PCR bezeichnet. Das in Fig. 27 gezeigte Alkalische-Protease-Gen von Bacillus licheniformis ATCC 53926 wird im folgenden als ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gen bezeichnet. Alkalische Protease von Bacillus lentus wird im folgenden als BLAP bezeichnet. Der Promotor des Alkalische-Protease-Gens von Bacillus licheniformis ATCC 53926 ist der Promotor des ATCC-53926-Alkalische- Protease-Gens und wird im folgenden als der ATCC-53926- Alkalische-Protease-Gen-Promotor bezeichnet. Die Abkürzung kb wird im folgenden anstelle von 1000 Basenpaaren verwendet.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz für den pre-, den pro- und den reifen Bereich des BLAP-Proteins.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz für das 3,4-kb-HindIII-Fragment von Bacillus lentus, das das BLAP-Gen umfaßt.
Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pGM15.
Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB11C.
Fig. 5 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB1N.
Fig. 6 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB13C.
Fig. 7 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB2N.
Fig. 8 zeigt die Oligonucleotide 1-3. Die Positionen entsprechen den Positionen der Nucleotidsequenzen innerhalb des ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gens. Fehlpaarungspositionen sind durch die Verwendung kleiner Buchstaben angezeigt. Restriktionsstellen sind unterstrichen und angezeigt.
Fig. 9 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB15C.
Fig. 10 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB4N.
Fig. 11 zeigt ein Schema für die Konstruktion des Plasmids pCB11N.
Fig. 12 zeigt ein Schema für die Konstruktion des Plasmids pCB11C.
Fig. 13 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB55C.
Fig. 14 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB56C.
Fig. 15 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB58C.
Fig. 16 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB75C.
Fig. 17 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB78C.
Fig. 18 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB50N.
Fig. 19 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB51N.
Fig. 20 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB53N.
Fig. 21 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB70N.
Fig. 22 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pCB73N.
Fig. 23 zeigt ein Schema für die Konstruktion der ClaI- Fusionsplasmid-Konstrukte in Escherichia coli und Bacillus.
Fig. 24 zeigt ein schematisches Diagramm für die Savinase- Oligonucleotidsonden. Diese Sonden wurden auf der Grundlage der bekannten Savinase-Aminosäuresequenz gestaltet, um die Bacillus-lentus-Genbanken zu sondieren und in der PCR-Reaktion als Primer zu dienen.
Fig. 25 zeigt die spezifische Sequenz von Oligonucleotidsonden und Primern.
Fig. 26 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pMG108.2.
Die Fig. 27 und 27a zeigen die Einführung von Restriktionsstellen in das Gen, das die ATCC-53926-Alkalische-Protease codiert.
Fig. 28 zeigt einen Vergleich der relativen Proteaseausbeuten der verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte im ATCC-53926-Produktionsstamm.
Fig. 29 zeigt die Aminosäuresequenz der reifen Protease, die aus den ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-NcoI-Genfusionskonstrukten hergestellt wurde.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Bereitgestellt wird ein von B. lentus erzeugtes proteolytisches Enzym (BLAP), das in wäßrigen Lösungen von pH 7-10 und bei Temperaturen von 10&supmin;60ºC eine erhöhte Protease- und oxidative Stabilität aufweist. Das reife BLAP-Enzym ist ein Polypeptid mit 269 Aminosäureresten, einem Molekulargewicht von 26823 Dalton und einem berechneten isoelektrischen Punkt von 9,7. Es wurde zuerst von B. lentus DSM 5483 erhalten, einem Organismus, der aus Bodenproben isoliert wurde und die in Tabelle I aufgeführten Eigenschaften hat. Tabelle I. Eigenschaften von B. lentus DSM 5483
Die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz wurde zum Teil durch Standard-Aminosäuresequenzierungstechniken bestimmt, und der Rest wurde aus der Nucleinsäuresequenz abgeleitet.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung des BLAP-Enzyms vorgestellt, das das Kultivieren einer Bacillus-Wirtszelle umfaßt, die ein Hybrid-Plasmid enthält, das eine DNA-Sequenz enthält, die für das BLAP-Enzym codiert und in der Richtung der Transcription einen regulatorischen Bereich umfaßt, wobei der regulatorische Bereich in der Reihenfolge der Transcription einen ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen-Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle sowie ein operabel mit einem pre-pro- Bereich verknüpftes Startcodon umfaßt, wobei der pre-pro- Bereich operabel mit einem reifen Bereich verknüpft ist, der für das BLAP-Enzym codiert. Alle obigen Elemente können mit einer carboxyterminalen (C-terminalen) DNA-Sequenz aus dem ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen verknüpft sein. Die C-terminale DNA-Sequenz ist eine DNA-Sequenz zwischen ungefähr der SalI- und ungefähr der SstI-Restriktionsstelle des ATCC-53926- Alkalische-Protease-Gens. Sie kann verwendet werden, um chromosomencodierte Protease zu unterdrücken, wie es in einer gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung offenbart ist. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung des BLAP-Enzyms kann jeder Bacillus-Stamm verwendet werden. B. licheniformis ist der bevorzugte Stamm. ATCC 53926 ist der am meisten bevorzugte Stamm. ATCC 53926 ist ein mutanter Stamm, der durch klassische Mutagenese von B. licheniformis DSM 641 erhalten wurde und die in Tabelle II aufgeführten Eigenschaften hat. Tabelle II. Eigenschaften von B. licheniformis ATCC 53926
Das Gen, das für das BLAP-Enzym codiert, kann erhalten werden, indem man die chromosomale DNA aus dem B.-lentus-Stamm DSM 5483 isoliert, DNA-Sonden konstruiert, die eine Homologie zu vermuteten DNA-Sequenzen aufweisen, die Bereiche der B.- lentus-Protease codieren, Genombibliotheken aus der isolierten chromosomalen DNA herstellt und die Bibliotheken durch Hybridisierung an die Sonden nach dem interessierenden Gen durchmustert. Die genomischen Bibliotheken können in E. coli aufgebaut werden, indem man das Plasmid pBR322, die Bakteriophagen Lambda EMBL3 und EMBL4 sowie das Cosmid pCP13 als Klonierungsvektoren verwendet. Vorzugsweise wird die Genbank von chromosomaler DNA von B. lentus DSM 5483 in E. coli mit dem Cosmid pCP13 aufgebaut.
Oligonucleotidsonden mit DNA-Sequenzen, die denen des Savinase-Gens (eines Gens, das für Savinase codiert, eine kommerzielle Serin-Protease, die von Novo Industri A/S vertrieben wird) ähnlich sind, kann verwendet werden, um nach savinase- ähnlichen Genen zu sondieren. Vorzugsweise kann eine BLAP- Sequenz verwendet werden. Diese Oligonucleotide können verwendet werden, um Southern-Blots von mit Restriktionsenzymen abgebauten chromosomalen DNAs von E. coli HB101, B. subtilis DB104, B. licheniformis und dem B.-lentus-Stamm zu durchmustern. Die in den Fig. 24 und 25 gezeigten N-terminalen und internen Oligonucleotide können ebenfalls als Primer in der PCR verwendet werden, um den Bereich der chromosomalen DNA von B. lentus zu amplifizieren, der sich vom N-Terminus der reifen Alkalischen Protease zum N-Terminus des C-terminalen Bromcyanfragments erstreckt.
Ein Teil des reifen Bereichs des Alkalische-Protease-Gens kann isoliert werden, indem man unter Verwendung der PCR eine größere, doppelsträngige DNA-Sonde konstruiert, die spezifisch für die Alkalische Protease von B. lentus ist. Eine Analyse auf der Basis der Aminosäuresequenz für das C-terminale Bromcyanfragment von der Savinase genannten Protease zeigt, daß diese Sequenz eine Homologie mit der Aminosäuresequenz um das Serin des aktiven Zentrums von Savinase sowie anderer Serin- Proteasen des Subtilisin-Typs herum aufweist. Das amplifizierte Fragment hat eine Länge von ungefähr 650 Basenpaaren (bp), im Einklang mit der erwarteten Größe, die man anhand von Sequenzdaten schätzt, die für andere Bacillus-Alkalische-Proteasen verfügbar sind. Das 650-bp-PCR-Fragment stellt einen Teil eines Gens dar, das eine Alkalische Protease codiert und unmittelbar hinter dem N-Terminus der reifen Protease beginnt und sich in den proteincodierenden Bereich hinein fortsetzt.
Das 650-bp-Fragment kann verwendet werden, um das BLAP-Gen in der genomischen Bibliothek zu identifizieren. Nach der Reinigung kann das 650-bp-Fragment zum Beispiel durch Nick-Translation markiert und zum Sondieren von Genbanken von B.-lentus- DSM-5483-DNA verwendet werden, die unter Verwendung des Cosmids pCP13 bzw. EMBL-λ-Vektoren aufgebaut werden können. Dann können mehrere Cosmid-Klone identifiziert werden, die DNA tragen, die zu dem 650-bp-PCR-Fragment und zu selektiven Oligonucleotidsonden homolog ist. Plasmid-DNA von einem dieser Cosmide, pHSH44, wurde gereinigt und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Ergebnisse einer Southern-Analyse zeigen, daß ein B.-lentus-DSM-5483-HindIII-Fragment von ungefähr 3,4 kb an die radioaktiv markierten Sonden das 650-bp- PCR-Fragment hybridisieren kann. Die Hybridisierung, die Restriktionsanalysen und die DNA-Sequenz (Fig. 2) zeigen, daß das 3,4-kb-HindIII-Fragment, das zu dem 650-bp-PCR-Fragment homolog ist, das BLAP-Gen codiert.
Bei dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von BLAP im großen Produktionsmaßstab verwendet man die Fermentation von ATCC 53926, das eine Expressionscassette enthält, die auf Genfusionen beruht, die Teile des ATCC-53926-Alkalische- Protease-Gens und Teile des BLAP-Gens umfassen. Eine solche Cassette besteht aus einem regulatorischen Bereich vom ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gen, der einen Promotor, eine Ribo somenbindungsstelle und ein Startcodon umfaßt, das für die effiziente Transcription und Translation des entsprechenden Gens verantwortlich ist. Dem regulatorischen Bereich folgt eine DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid (pre) codiert, und dann folgen Sequenzen, die das pro-Peptid und die reife Protease codieren. Nach der Transcription der DNA-Sequenz hinter dem Promotor wird die Messenger-RNA (mRNA) in die pre-pro- reife Protease translatiert, die aus dem Signalpeptid, dem pro-Peptid und der reifen Protease besteht. Die Signalsequenz leitet die unreife Protease durch die cytoplasmatische Membran, wo das Signalpeptid von einer Signalpeptidase enzymatisch abgespalten wird. Die pro-Sequenz scheint eine korrekte Faltung und Prozessierung der pro-Protease während oder nach der Translokation durch die cytoplasmatische Membran und die Zellwand zu gewährleisten, wobei die reife Protease freigesetzt wird (S. D. Power et al. (1986), PNAS (USA), 83, 3096; H. Ikemura et al. (1987), J. Biol. Chem. 262, 7859; H. Ikemura et al. (1988), J. Biol. Chem. 263, 12959).
Zwei Fusionstypen, die anhand der Restriktionsenzymstellen identifiziert werden, die zur Verknüpfung verschiedener Teile des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens und von BLAP-Genen verwendet wurden, können verwendet werden, um die zuvor beschriebenen Expressionscassetten herzustellen, mit denen sich BLAP-Enzym im kommerziellen Maßstab herstellen läßt, wenn sie zum Transformieren von ATCC 53926 verwendet werden. Diese Cassetten sind aus ClaI- und NcoI-Fusionen hergestellt.
Die ClaI-Fusion kombiniert den ATCC-53926-Alkalische-Protease- Gen-Promotor und die pre-Sequenz mit einem DNA-Fragment, das die pro- und die reife Sequenz von BLAP codiert. Eine ClaI- Restriktionsstelle kann mehrere Codons vor der Verbindung zwischen der pre- und der pro-Sequenz der Alkalischen Protease von ATCC 53926 in das ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen eingeführt werden. Das BLAP-Gen enthält an dieser Stelle eine natürlich vorkommende ClaI-Stelle. Der Promotor und der größte Teil des pre-Bereichs des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens (AvaI/ClaI-DNA-Fragment) kann mit dem ClaI/SstI-Fragment des BLAP-Gens fusioniert werden, das einen Teil des pre-Bereichs und die gesamte pro- und reife BLAP-Sequenz enthält. Die NcoI- und die ClaI-Fusion können in E. coli erfolgen und auf einem AvaI/SstI-DNA-Fragment in zwei verschiedene Bacillus-Vektoren subkloniert werden.
Die NcoI-Fusion erzeugt eine reife Protease, die vom BLAP leicht verschieden ist. Das aus der NcoI-Fusion hergestellte Protein enthält Threonin auf Position 3 ab dem N-Terminus der reifen Protease, während das BLAP auf derselben Position Serin enthält (Fig. 29). Die NcoT-Fusion kann konstruiert werden, indem man den Promotor, die pre- und die pro-Sequenz des ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gens mit der reifen Sequenz des BLAP-Gens kombiniert. Eine NcoI-Restriktionsstelle kann mehrere Codons hinter der Verbindung zwischen der pro- und der reifen Sequenz in das ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen eingeführt werden. Eine natürlich vorkommende NcoI-Stelle ist im BLAP-Gen auf einer ähnlichen Position vorhanden. Dann können der Promotor, pre, pro und vier Codons der reifen ATCC-53926- Sequenz (AvaI/NcoI-DNA-Fragment) mit einer reifen BLAP-Sequenz fusioniert werden, der die ersten vier Codons fehlen (NcoI/SstI-DNA-Fragment). Die NcoI- und die CIaI-Fusion können in E. coli erfolgen und auf einem AvaI/SstT-DNA-Fragment in zwei verschiedene Bacillus-Vektoren subkloniert werden.
Um die Enzymerzeugung weiter zu erhöhen, können die ClaI- und die NcoI-Fusion entweder mit einer ATCC-53926-Alkalische-Protease-Transcriptionsterminatorcassette, bei der es sich um ein 164-bp-DNA-Fragment handelt, oder mit einem C-terminalen 608- bp-Fragment des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens kloniert werden, was unten näher diskutiert wird.
Die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgene können im E.-coli-Vektor pGM15 (Fig. 3), einem pTZ19R-Derivat, das das 3,4-kb-HindIII/KpnI-Fragment enthält, welches das BLAP-Gen enthält, konstruiert und dann in die Bacillus-Vektoren pBC16 und pUB110 subkloniert werden. Der Bacillus-Fusionsgen-Vektor pCB1N (Fig. 5) wird so konstruiert, wie es in Fig. 11 gezeigt ist. Der Bacillus-Fusionsgen-Vektor pCB11C (Fig. 4) kann so konstruiert werden, wie es in Fig. 12 gezeigt ist. Variationen von jeder der oben beschriebenen Genfusionen können hergestellt werden, um: (a) eine effektivere Expression des BLAP-Protease-Gens zu erhalten und (b) die Unterdrückung der Expression des chromosomencodierten ATCC-53926-Alkalische- Protease-Gens zu gewährleisten. Um eine effektive Terminierung der Transcription des BLAP-Protease-Gens zu erhalten, kann der Transcriptionsterminator der Alkalischen Protease von ATCC 53926 in jede der oben beschriebenen Genfusionen als 164-bp- DNA-Fragment hinter dem BLAP-Terminator kloniert werden. Konstrukte, die die ATCC-53926-Alkalische-Protease-Transcriptionsterminatorcassette in derselben Orientierung relativ zur Transcription des ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgens in den Plasmiden pCB11C und pCB1N tragen, werden als pCB13C bzw. pCB2N bezeichnet (Fig. 6 bzw. 7). Um die Expression des chromosomencodierten ATCC-53926-Protease-Gens zu unterdrücken, können zwei zusätzliche Bacillus-BLAP-Fusionsgen-Vektoren, die ein C-terminales Fragment des ATCC-53926- Alkalische-Protease-Gens enthalten, in den Plasmiden pCB11C und pCB1N aufgebaut werden, indem man ein 608-bp-Fragment des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens ligasiert, das durch PCR synthetisiert wurde, wobei man das Plasmid pC51 als Matrize verwendet. Das 608-bp-DNA-Fragment kann in die einzige KpnI- Stelle ligasiert werden, die auf den Vektoren pCB11C und pCB1N vorhanden ist, und die neuen Konstrukte, die das C-Terminale ATCC-53926-608-bp-Fragment in derselben Orientierung relativ zur Richtung der Transcription der ATCC-53926-Alkalische- Protease-BLAP-Fusionsgene in pCB11C und pCB1N enthalten, werden als pCB15C bzw. pCB4N bezeichnet. Restriktionskarten dieser Plasmide sind in den Fig. 9 bzw. 10 angegeben.
Die sechs oben beschriebenen und unten aufgeführten ATCC- 53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgene können in Bacillus- Vektoren subkloniert und in B. subtilis DB104 transformiert werden. Die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgene können als AvaI/SstI-DNA-Fragmente in pBC16- und pUB110-Derivate subkloniert werden, indem man die E.-coli-Vektoren, die die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgene enthalten (pCB1N, pCB11C, pCB2N, pCB13C, pCB4N und pCB15C) mit AvaI und SstI spaltet und sie an die Bacillus-Plasmide pC51 und pH70 ligasiert, die mit AvaI, SstI, PstI und SalI gespalten wurden. Die Plasmide pC51 und pH70 wurden mit AvaI/SstI geschnitten, so daß man das große AvaI/SstI-Vektorfragment erhielt, das den notwendigen Replikationsstartpunkt und ein Antibiotikum- Resistenz-Gen (Tetracyclin-Resistenz bei pC51, Kanamycin- Resistenz bei pH70) für die Selektion enthielt. SalI und PstI können verwendet werden, um das kleine AvaI/SstI-Fragment, das das gesamte auf pC51 und pH70 vorhandene ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen enthält, in drei kleinere DNA-Fragmente zu spalten. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, daß das ATCC-53926-Alkälische-Protease-Gen erneut in die Bacillus- Vektoren ligasiert wird.
Insgesamt zehn ATCC-53926-Alkalische-Protease-BhAP-Gen-Fusionsplasmide, die so aufgebaut werden, wie es oben beschrieben ist, und von den ClaI- und NcoI-Fusionen abgeleitet sind, können in ATCC 53926 realisiert werden. Fünf Bacillus-Plasmidkonstrukte, die von den sechs ClaI-Fusionen abgeleitet sind, können in den Stamm ATCC 53926 transformiert werden. Diese Bacillus-Plasmide sind pCB55C, pCB56C, pCB58C, pCB75C und pCB78C (Fig. 13, 14, 15, 16 bzw. 17). Fünf Bacillus- Plasmidkonstrukte. die von den sechs NcoI-Fusionen abgeleitet sind, können in den Stamm ATCC 53926 transformiert werden. Diese Bacillus-Plasmide sind pCB50NC, pCB51N, pCB53N, pCB70N und pCB73N (Fig. 18, 19, 20, 21 bzw. 22).
Für die Erzeugung der größten Proteaseausbeuten wird der Stamm ATCC 53926 bevorzugt, der die ClaI-Fusionskonstrukte (Fig. 23) trägt, die in ein pC51-Derivat eingesetzt wurden. Das Konstrukt pCB58C (Fig. 15) in dem Stamm ATCC 53926 ist die am meisten bevorzugte Ausführungsform zur Erzeugung der größten Proteaseausbeuten.
Die Fermentationen können in komplexen Nährmedien durchgeführt werden, die dem Fachmann im allgemeinen bekannt sind. Diese Medien können Kohlenstoffquellen wie Glucose, Sucrose und/oder Maisstärke enthalten. Die Medien können auch Stickstoffquellen wie Sojamehl, Baumwollsaatmehl, Casein und Kartoffelextrakt enthalten. Weitere wachstumsfördernde Bestandteile sind Braurückstände und Maisquellwasser sowie anorganische Materialien, wie anorganische Phosphate. Die Medien können auch Schaumverhütungsmittel enthalten.
Ein Vergleich der relativen Proteaseausbeuten der verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte im ATCC- 53926-Produktionsstamm ist in Fig. 28 gezeigt. Diese Fermentationen wurden mit Antibiotikumselektion durchgeführt, wobei ein komplexes Produktionsmedium verwendet wurde, das 0,5% Stickstoff enthielt. Proteaseausbeuten der ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte sind relativ zu ATCC 53926, das das Plasmid pAM2.3 enthält, angegeben. Dieses Plasmid enthält den nativen BLAP-Promotor und ein Struktur-Gen auf einem NruI/SalI-Restriktionsfragment, das zwischen den StuI/SalI- Stellen in das Plasmid pC51 eingesetzt wurde.
Die Fermentationsflüssigkeiten, die man durch Kultivieren der verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte im ATCC-53926-Produktionsstamm typischerweise erhält, enthalten noch andere proteolytische Enzyme. Die BLAP-Protease in den Fermentationsflüssigkeiten, die man durch Fermentation der verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte im ATCC-53926-Produktionsstamm erhält, ist jedoch das vorherr schende proteolytische Enzym in den Flüssigkeiten. Diese Fermentationsflüssigkeiten enthalten proteolytische Enzyme, die in durch Kultivieren von Bacillus lentus DSM 5483 erhaltenen Flüssigkeiten nicht vorhanden sind. Insbesondere enthalten Fermentationsflüssigkeiten, die man durch Fermentation der verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Konstrukte im ATCC-53926-Produktionsstamm erhält, die BLAP-Protease sowie wenigstens ein weiteres proteolytisches Enzym, das von dem Stamm ATCC 53926 erzeugt wird. Vorzugsweise erhält man das BLAP-Enzym als Zusammensetzung, die das BLAP-Enzym, bei dem es sich um ein reifes, im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 handelt, das die Aminosäuresequenz von etwa Aminosäurerest 112 bis etwa Aminosäurerest 380 enthält, wie es im wesentlichen in Fig. 1 gezeigt ist, sowie wenigstens ein weiteres proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926 umfaßt.
Die Proteasen, die durch Kultivieren des Stammes ATCC 53926, der die verschiedenen rekombinanten Plasmide enthält, erzeugt werden, eignen sich besonders gut für Waschmittelzubereitungen. Sie können nach Verfahren, die in der Technik zum Zubereiten von Wasch- und Reinigungszusammensetzungen, insbesondere Waschmittelzusammensetzungen, bekannt sind, mit Tensiden zubereitet werden. Ein Tensid ist eine Substanz, die die Freie Oberflächenenergie von Wasser reduziert; dazu gehören Seifen, nichtionische Tenside, anionische Tenside und kationische Tenside. Im Falle von Waschmittelzubereitungen können die Enzyme mit so gut geeigneten Tensiden wie linearen Alkylbenzolsulfonaten, ethoxylierten linearen Alkoholen, ethoxyliertem Alkylsulfat oder sulfatiertem linearem Alkohol kombiniert werden. Die Zubereitung kann auch Builder (Gerüstsubstanzen), optische Aufheller, Bleichmittel sowie weitere Komponenten, die in der Technik normalerweise verwendet werden, enthalten.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Lebende Kulturen von ATCC 53926 und Plasmid pCB58C in ATCC 53926, dem die ATCC-Bezeichnung 68032 zugeordnet wurde, wurden zur Hinterlegung unter dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren durch die American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, angenommen. Eine lebende Kultur von B. lentus DSM 5483 wurde zur Hinterlegung in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstr. 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, unter dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren angenommen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese jedoch nicht einschränken.

Beispiel 1

Aufbau einer B.-lentus-DSM-5483-Genbank

A. Unter Verwendung des Cosmid-Klonierungsvektors pCP13
Der Cosmid-Klonierungsvektor pCP13 wurde gewählt, um eine genomische Bibliothek aus B.-lentus-DSM-5483-DNA aufzubauen. Dieser Vektor mit einem breiten Wirtsspektrum, der von dem Plasmid pLAFR1 abgeleitet ist (Friedman et al., Gene (1982), 18, 289) wurde von F. Ausubel, Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, erhalten. Das Plasmid pCP13 hat eine Größe von 23 kb und codiert sowohl Tetracyclin- (TcR) als auch Kanamycin-Resistenz (KmR), enthält mehrere nur einmal vorhandene Endonuclease-Restriktionsstellen und ist mobilisierbar, aber nicht selbstübertragbar. Eine Klonierung in die BamHI-Stelle auf pCP13 führt zu einer insertionalen Inaktivierung der Km-Resistenz-Determinante, so daß Rekombinanten anhand ihres TcR,KmS-Phänotyps identifiziert werden können. Der Vektor enthält außerdem die λ-cos-Stellen, was es ermöglicht, concatemere Formen des Cosmids in λ-Phagenpartikel zu verpacken, wobei man kommerziell erhältliche Verpackungssysteme verwendet. Einschübe im Größenbereich von 12 bis 30 kb können in pCP13 einkloniert werden, so daß dieser Klonierungsvektor für den Aufbau von Genbanken sehr attraktiv ist. Gereinigte pCP13-DNA (20 jzg) wurde mit BamHI (3 Einheiten (E)/pg) abgebaut und anschließend dephosphoryliert, um eine Rezirkularisierung zu verhindern. Gereinigte chromosomale DNA (410 ug) aus dem B.-lentus-Stamm DSM 5483 wurde mit BclI (0,0625 E/ug DNA) 60 Minuten lang bei 50ºC partiell abgebaut und dann mit der BamHI-abgebauten pCP13-DNA ligasiert. Die Ligasierungsreaktion enthielt 150 ug/ml pCP13-Vektor und 50 ug/ml chromosomale DNA aus DSM 5483 in einem Endvolumen von 30 ul. Die Ligasierungen wurden 9 Stunden lang auf 14ºC gehalten. Die Ligasierungsgemische, die concatemere Einheiten mit pCP13 und Fragmenten der genomischen DNA von B. lentus enthielten, wurden in λ-Phagenköpfe verpackt, wobei man das von Promega, Madison, Wisconsin bezogene Packagene Lambda DNA Packaging System als Verpackungssystem verwendete. Die in Phagenpartikel verpackten rekombinanten Cosmidmoleküle wurden verwendet, um E. coli HB101 zu infizieren. E. coli HB101 wurde über Nacht bei 30ºC in einem Rotationsschüttler bei 175 U/min in 10 ml Trypton-Kulturflüssigkeit oder TB (pro Liter (1) 10 g Trypton, 5 g NaCl, 2 g Maltose und 2,46 g MgSO&sub4;, sterilisiert durch Behandlung im Autoklaven) gezüchtet. Die Zellen wurden sedimentiert und in 10 mM MgSO&sub4; resuspendiert. Das Verpackungsgemisch und die Zellen (50 ul bzw. 100 ul) wurden miteinander gemischt und 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurde 1 ml Luria-Kulturflüssigkeit (pro 1 10 g Bactotrypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt) hinzugefügt, und die Röhrchen wurden 60 Minuten lang bei 37ºC in einem Rotationsschüttler des Typs New Brunswick G24 bei 150 U/min inkubiert. Die infizierten HB101- Zellen wurden 5 min lang bei Raumtemperatur durch Zentrifugation (13000 · g) sedimentiert, in Luria-Kulturflüssigkeit re suspendiert und auf Luria-Agar, der 15 ug/ml Tc enthielt, ausgestrichen. Vierzehnhundert rekombinante Klone von TcR-KmS- HB101 wurden erhalten. Um die mittlere Einschubgröße zu bestimmen, wurde Plasmid-DNA von 14 zufällig ausgewählten potentiellen Klonen isoliert, mit EcoRI abgebaut und durch Agarose- Gel-Elektrophorese analysiert. Elf der vierzehn Klone enthielten Einschübe mit einer mittleren Einschubgröße von 25,9 kb (Bereich 21,7 bis 32,7 kb). Auf der Grundlage dieser großen mittleren Einschubgröße und der Annahme, daß das B.-lentus- Genom ungefähr so groß ist wie das E.-coli-Genom, sagten theoretische Berechnungen eine 99%ige Wahrscheinlichkeit voraus, das Savinase-ähnliche Gen bei einer Durchmusterung von 768 Cosmidklonen zu finden.
B. Unter Verwendung der Phagen-Klonierungsvektoren EMBL3 und EMBL4
Ein weiteres Verfahren der Klonierung von großen Stücken genomischer DNA (> 10 kb) besteht darin, Bakteriophage-λ-Klonierungsvektoren zu verwenden. Diese Insertionsvektoren können zwischen 9 kb und 23 kb heterologe DNA aufnehmen. Die heterologe DNA und die λ-DNA sind notwendig, um die rekombinante DNA in Phagenköpfe zu verpacken, die dann in einem E.-coli-Wirt vermehrt, werden können. Die Phagenvektoren EMBL3 und EMBL4 wurden von Stratagene in La Jolla, CA, bezogen. Diese Klonierungsvektoren wurden mit einem Polylinkerbereich konstruiert, der die interne Füll-DNA, die zur Replikation nicht benötigt wird, flankiert. Wenn die λ-DNA mit dem passenden Enzym gespalten wird, können die zurückbleibenden zwei DNA-Fragmente, die man den linken und den rechten Arm nennt und die für die Replikation benötigt werden, mit heterologer DNA ligasiert werden. Damit die rekombinante DNA effizient in die Phagenköpfe verpackt wird, müssen die Ligasierungen bei hohen DNA- Konzentrationen erfolgen, um die Bildung von Concatemeren zu begünstigen, und der heterologe Einschub muß eine Größe zwischen 9 kb und 23 kb haben. Diese letztere Voraussetzung be ruht auf der Beobachtung, daß die Länge der DNA, die verpackt werden kann, zwischen 70% und 10&sup5;% der Größe des Wildtyp-λ- Genoms beträgt. Weiterhin ziehen beide EMBL-Systeme einen Vorteil aus der spi-Selektion (empfindlich gegenüber Bakteriophagen-P2-Hemmung). EMBL-Arme, die mit dem Füllfragment ligasiert und in Phagenköpfe verpackt worden sind, können auf einem Wirtsstamm, der ein P2-Lysogen enthält, nicht wachsen. In diesem System ist es unwahrscheinlich, daß das Füllfragment und die EMBL-Arme religasieren. Falls dies eintritt, wird dieser Phage nicht repliziert, wenn er auf dem passenden E.- coli-Wirt ausgestrichen wird.
Um genomische Bibliotheken von DSM-5483-DNA entweder im EMBL3- oder im EMBL4-Vektor herzustellen, wurde DSM-5483-DNA entweder mit EcoRI oder mit BclI partiell abgebaut (das durch BclI erzeugte klebrige 5'-Ende ist komplementär zu den Enden des mit BamHI geschnittenen Vektors)-. In jedem Fall wurde die genomische DNA 60 Minuten lang mit weniger als 1 Einheit Enzym pro ug DNA abgebaut. Eine optimale Verpackungseffizienz erhält man mit λ-DNAs, die concatemer sind. Daher wurden die Ligasierungsreaktionen so eingestellt, daß man DNA-Konzentrationen von 200 ug/ml erreichte, was die Concatemerbildung begünstigt. In einer Standard-5-ul-Ligasierungsreaktion wurde 1 ug Vektorarme mit, 200 bis 400 ng genomischer DNA gemischt. Auf die Ligasierung während 1 Stunde bei Raumtemperatur folgte eine Inkubation über Nacht bei 4ºC. Concatemere DNA aus den Ligasierungsreaktionen wurde in Phagenköpfe verpackt, wobei man den in-vitro-Verpackungsextrakt GigaPack Plus, der von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) bezogen wurde, sowie die mit den Extrakten gelieferte Vorschrift verwendete. Nach der Verpackung wurden 0,5 ml Phagenverdünnungspuffer zu den Verpackungsreaktionen (pro Liter 5,0 g NaCl, 2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, und 5 ml 2%ige Gelatine) und 20 ul Chloroform gegeben. Die Verpackungsreaktionen wurden eingestellt und gemäß den von Stratagene gelieferten Vorschriften amplifiziert. Von jeder Phagenbibliothek wurden 5 · 10&sup5; rekombinante Phagen erhalten. Wenn ein ähnliches Experiment mit einem Testeinschub durchgeführt wurde, der im kommerziellen Klonierungskit mitgeliefert wird, wurden 3 · 10&sup6; rekombinante Phagen erhalten. Weniger als 5% der durch den Kontrolleinschub erzeugten Plaques waren auf Hintergrundphagen zurückzuführen. Die rekombinanten Phagen hatten eine mittlere Einschubgröße von 12-14 kb, wobei etwa 70% der Phagen tatsächlich Einschübe zeigten. Die Phagenbibliotheken wurden auf einen Titer von 108 Phagen/ml amplifiziert und über Chloroform bei 4ºC gelagert. Andere Vorratspräparate wurden für die längerfristige Lagerung bei -70ºC vorbereitet,
Um die EMBL-Bibliotheken zu charakterisieren und das Savinaseähnliche Gen zu finden, wurde folgendermaßen vorgegangen. Gruppen von Plaques wurden entweder aus der EMBL3- oder der EMBL4-Bibliothek isoliert, und ihre DNA wurde durch ein Phagenminipräparierverfahren isoliert (Maniatis et al. (1982), A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York). Die in den EMBL3- und EMBL4-Bibliotheken als Einschub vorhandene genomische DNA wurde mit SalI bzw. EcoRI abgebaut, und nach einer Agarose-Gel-Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente auf Gene Screen Plus übertragen. Die gesamte genomische DNA von DSM 5483 wurde einer Nick-Translation unterzogen und als Hybridisierungssonde verwendet, um zu bestätigen, daß es sich bei den in den EMBL-Bibliotheken vorhandenen Einschüben wirklich um DSM-5483-DNA handelt. Wie erwartet hybridisierten die klonierten Einschübe mit der markierten DSM-5483-DNA. In einem zweiten Experiment wurde genomische DSM-5483-DNA entweder mit EcoRI oder mit BclI geschnitten, einer Elektrophorese in einem Agarose-Gel unterzogen und dann auf Gene Screen übertragen. DNA, die aus Gruppen rekombinanter Phagen entweder von der EMBL3- oder der EMBL4-Bibliothek isoliert wurde, wurde einer Nick-Translation unterzogen und als Hybridisierungssonde verwendet. Wie erwartet erfolgte eine Hybridisierung an genomische DNA von DSM 5483, während nur wenig oder gar keine Hybridisierung an DNA von anderen Bacillus-Species nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse bestätigten die Bildung von Genbibliotheken von chromosomaler DNA von B. lentus DSM 5483 unter Verwendung der λ-EMBL-Klonierungsvektoren.

Beispiel 2

Konstruktion von DNA-Sonden, die spezifisch für das in B. lentus DSM 5483 vorhandene Gen für die Savinase-ähnliche Protease sind

A. Oligonucleotidsonden
Die in E. coli mit dem Cosmid pCP13 aufgebaute Genbank mit chromosomaler DNA von DSM 5483 wurde unter Verwendung von Oligonucleotidsonden durchmustert. Eine Serie von Sonden, die unterschiedlich stark degeneriert waren, wurde unter Verwendung eines Biosearch-DNA-Synthesizers synthetisiert. Die Sequenz dieser Oligonucleotide wurde von Aminosäuresequenzdaten abgeleitet, die vom N-Terminus der Savinase genannten Protease und von dem durch Spaltung mit Bromcyan abgeleiteten C-terminalen Fragment der Savinase erhalten wurden. Die Sequenz und der Ort dieser Sonden in bezug zur Savinase genannten Protease sind in den Fig. 24 und 25 abgebildet. Die Sondenserien NO2 und NO4 wurden beide auf der Grundlage von N-terminalen Aminosäuresequenzdaten entworfen. Die NO2-Serie hatte eine Länge von 23 Basen mit einer Homologie von 14 Basen und war 16fach degeneriert, während die NO4-Serie eine Länge von 17 Basen hatte und 48fach degeneriert war. Die Sondenserien NO4.1-4 wurden unter Verwendung des wahrscheinlichsten Codongebrauchs für B. subtilis entworfen. Die Oligonucleotidserie CO3 hatte jeweils eine Länge von 17 Basen und war 32fach degeneriert. Diese letzteren Sonden wurden anhand einer Aminosäuresequenz entworfen, die vom C-terminalen Bromcyanfragment von Savinase abgeleitet war. Diese Sonden wurden gereinigt, radioaktiv markiert und mit chromosomaler DNA von DSM 5483 hybridisiert, die mit Restriktionsenzym gespalten, einer Elektrophorese auf Agarose-Gelen unterzogen und nach dem Verfahren von Southern auf Nitrocellulose übertragen worden war. Zu den verwendeten Restriktionsenzymen gehörten EcoRI, HindIII, TaqI, Sau3A, SstI, XbaI und XhoI. Die stärksten Hybridisierungssignale wurden mit den Oligonucleotiden NO2.2, NO4.2 und CO3.3 (Fig. 25) erhalten. Die letzteren drei markierten Oligonucleotide wurden verwendet, um Southern-Blots von restriktionsgespaltener chromosomaler DNA von E. coli HB101, B. subtilis DB104, B. licheniformis und dem B.-lentus-Stamm zu durchmustern, und es erwies sich, daß sie nur mit DNA-Fragmenten vom B.-lentus- Stamm hybridisierten. Dieses Ergebnis bestätigte, daß diese drei Oligonucleotide spezifisch für DNA waren, die die Savinase-ähnliche Protease codiert.
B. Amplifikation eines Teils der Gensequenz der Alkalischen Protease
Obwohl drei der oben beschriebenen Oligonucleotidsonden für chromosomale DNA von DSM 5483 spezifisch waren, wurde noch ein weiterer Ansatz verfolgt, um eine größere doppelsträngige DNA- Sonde zu isolieren, die für die Savinase-ähnliche Alkalische Protease spezifisch ist. Die oben beschriebenen N-terminalen und internen Oligonucleotide wurden in der PCR als Primer verwendet, um denjenigen Bereich der chromosomalen DNA von DSM 5483 zu amplifizieren, der sich vom N-Terminus bis zu Aminosäurerest 222 der reifen Alkalischen Protease erstreckt (Fig. 24). Die aus dem C-terminalen Bromcyanfragment von Savinase erhaltene Aminosäuresequenz besaß eine Homologie zu der Aminosäuresequenz um den Bereich des aktiven Zentrums anderer Serin-Proteasen herum. Wenn der Abstand vom N-Terminus von Savinase zum Bereich des aktiven Zentrums ähnlich wäre wie bei anderen Serin-Proteasen, würde die erwartete Größe des amplifizierten Fragments ungefähr 650 bp betragen.
Die PCR wurde unter Verwendung eines kommerziellen GeneAmp- Kits durchgeführt, das von Perkin-Elmer Cetus Instruments bezogen wurde. Bei der PCR kann die Länge des zu amplifizierenden DNA-Segments in einem Bereich von wenigen hundert bp bis zu mehr als 5 kb liegen; es ist entweder in einem Plasmid oder in einer als Matrize dienenden chromosomalen DNA enthalten. Die Amplifikation erfordert die Synthese von zwei Oligonucleotidprimern mit einer Länge von ungefähr 15 bis 25 Basen, die so entworfen sind, daß sie Homologie zu jeweils entgegengesetzten DNA-Strängen an beiden Enden des DNA-Segments besitzen. Da die DNA-Synthese in 5'→3'-Richtung erfolgt, wird jeder Primer so entworfen, daß der entsprechende 5'→3'-Strang nachgebildet wird. Im ersten Experiment wurden 16 verschiedene PCRs durchgeführt, wobei alle möglichen Kombinationen der Sondenserien CO3 mit NO2 sowie chromosomale DNA von DSM 5483 als Matrize verwendet wurden. Die Konzentration der Matrize und der Primer war so, wie es in dem Kit beschrieben ist. Die PCRs wurden eingeleitet, indem man Matrize, Primer im Überschuß, dNTPs, hitzestabile DNA-Polymerase und Reaktionspuffer in Eppendorf-Röhrchen miteinander mischte, die einem Programm mit eingestellten Zeiten bei 94ºC, 37ºC und 72ºC unterworfen wurden. Bei jedem Durchlauf wurde die doppelsträngige DNA- Matrize durch Erhitzen auf 94ºC denaturiert und dann auf 37ºC abgekühlt, um eine Assoziierung der Primer an die geeigneten DNA-Sequenzen auf der einzelsträngigen Matrize zu ermöglichen. Dann wurden die Röhrchen auf 72ºC gebracht, und komplementäre DNA-Stränge wurden durch Verlängerung der assoziierten Primer mit einer hitzestabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) synthetisiert. Dieser Vorgang wurde 25mal wiederholt, wobei sich die Menge der amplifizierten DNA nach jedem Durchlauf verdoppelte. Eine der PCR-Reaktionen (Oligonucleotidpaar NO2.2 und CO3.3) führte zur Amplifikation eines einzigen DNA-Fragments mit einer Länge von ungefähr 650 bp. Ungefähr 3 ug des 650-bp- Fragments wurden durch die PCR erzeugt, was einer Amplifikation von etwa dem 5 · 10&sup4;-fachen entspricht. Die PCR wurde unter Verwendung aller Kombinationen aus den Sondenserien NO4 und CO3 wiederholt. Auf der Grundlage des vorigen Ergebnisses würde man erwarten, daß die Kombination von NO4.2 und CO3.3 das amplifizierte 650-bp-Fragment erzeugt, und dies war auch tatsächlich der Fall.

Beispiel 3

Identifizierung von Cosmidklonen, die das Gen für die Savinase-ähnliche Alkalische Protease aus B. lentus tragen

Zur Durchmusterung nach dem Savinase-ähnlichen Gen wurden 1400 TcR-Kms-HB101-Klone in 13 Pools von jeweils 100-150 Klonen aufgeteilt. Plasmid-DNA aus jedem Pool sowie aus einer Kultur, die die gesamte Genbank enthielt, wurde gereinigt und mit EcoRI abgebaut. Restriktionsfragmente wurden durch Agarose- Gel-Elektrophorese aufgetrennt und gemäß den vom Hersteller angegebenen Methoden auf eine Hybridisierungsmembran des Typs Gene Screen Plus (DuPont, Wilmington, Delaware) übertragen. Um das Savinase-ähnliche Gen innerhalb der Cosmidbank nachzuweisen, wurden Oligonucleotidsonden synthetisiert. Die vorausgesagte Sequenz der Sonden beruhte auf zuvor beschafften Aminosäuresequenzdaten für die Savinase genannte Protease. Diese Sonden dienten auch als Primer für die Synthese eines 650-bp- Teils des BLAP-Gens unter Verwendung der PCR (oben beschrieben). Das 650-bp-PCR-Fragment wurde in einer Nick-Translationsreaktion (Vorschrift erhalten von NEN, Wilmington, Delaware) mit 32P markiert und als Hybridisierungssonde verwendet. Es wurde gezeigt, daß dieses Fragment eine interne EcoRI- Stelle enthält. Daher würde man zwei Hybridisierungsbanden nachweisen, wenn innerhalb eines durch EcoRI abgebauten Cosmidpools ein vollständiges B.-lentus-Gen für eine Savinaseähnliche Protease vorhanden wäre. Als aus der Gesamtgenbank von DSM-5483-DNA isolierte Cosmid-DNA mit EcoRI abgebaut wurde, wurden zwei Fragmente von 6,35 bzw. 2,64 kb gefunden, die mit der markierten 650-bp-PCR-Sonde hybridisierten. In sechs der rekombinanten Cosmidpools (Nr. 3, Nr. 4, Nr. 8, Nr. 11, Nr. 12 und Nr. 13) wurden genau dieselben Hybridisierungsbanden gefunden, was darauf hinweist, daß das Savinaseähnliche Gen in wenigstens jeweils einem Cosmidklon innerhalb dieser sechs Pools vorhanden war. Pool Nr. 13, der 150 E.- coli-Transformanten besaß, wurde in 12 Teilpools mit jeweils 12 oder 13 Transformanten unterteilt. Plasmid-DNA aus jedem Teilpool wurde isoliert, mit EcoRI abgebaut, und die DNA-Fragmente wurden durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Nach der Übertragung auf eine Gene-Screen-Plus-Membran wurde das Filter mit dem markierten 650-bp-PCR-Fragment hybridisiert. Es wurde gefunden, daß zwei Teilpools (Nr. 7 und Nr. 9) dieselben Hybridisierungsbanden enthielten, wie sie zunächst in Pool Nr. 13 gefunden worden waren. Plasmid-DNA wurde aus jeder einzelnen Transformante in den Teilpools Nr. 7 und Nr. 9 isoliert, und die Plasmid-DNAs wurden in getrennten Reaktionen entweder mit EcoRI oder mit HindIII abgebaut. Nach Agarose-Gel-Elektrophorese und Übertragung auf Gene Screen Plus wurde das Hybridisierungsverfahren wiederholt. Cosmid-DNA aus Teilpool Nr. 9 Klon Nr. 5 zeigte dasselbe Hybridisierungsmuster, das man von einem Klon erwarten würde, der das Gen für die Savinaseähnliche Protease enthält. Als Cosmid-DNA aus Klon Nr. 5 und chromosomale DNA von DSM 5483 mit Hindill abgebaut und mit dem 650-bp-PCR-Fragment sondiert wurden, wurde für beide dieselbe Hybridisierungsbande gefunden. Aus dem Ort der Hybridisierungsbande relativ zu bekannten Molekulargewichtsstandards wurde eine Fragmentgröße von 3,4 kb berechnet. Das Cosmid aus Teilpool Nr. 9 Klon Nr. 5 wurde als pHSH44 bezeichnet.
Eine Herstellung des Cosmids pHSH44 in großem Maßstab wurde durch CsCI-Ethidiumbromid-Gradientenzentrifugation vorbereitet, und nach der Dialyse wurde mit HindIII abgebaut. Die HindIII-Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt, und das 3,4-kb-HindIII-Fragment, das mit dem 650-bp- PCR-Fragment hybridisierte, wurde gereinigt und in die häufig verwendeten E.-coli-Vektoren pUC19 und pBR322 subkloniert, um eine Restriktionsanalyse und eine weitere Subklonierung in Bacillus-Vektoren durchzuführen.

Beispiel 4

Genetische Charakterisierung des B.-lentus-Gens für Alkalische Protease

A. Subklonierung und Charakterisierung eines Restriktionsfragments, das das B.-lentus-Gen für Alkalische Protease trägt
Nach der Reinigung wurde das 650-bp-Fragment durch Nick-Translation markiert und verwendet, um Genbanken von DSM-5483-DNA zu sondieren, die unter Verwendung des Cosmids pCP13 und von EMBL-λ-Vektoren aufgebaut worden sind. In beiden Fällen wurden bei Verwendung sehr stringenter Hybridisierungsbedingungen positive Klone identifiziert. Aus den Hybridisierungsdaten wurden mehrere Cosmidklone identifiziert, die DNA mit Homologie zu dem 650-bp-PCR-Fragment tragen, und selektive Oligonucleotidsonden wurden identifiziert. Plasmid-DNA von einem dieser Cosmide, pHSH44, wurde gereinigt und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Ergebnisse von Southern-Blots zeigten an, daß ein DSM-5483-HindIII-Fragment von ungefähr 3 bis 5 kb mit radioaktiven Sonden hybridisierte, die aus dem 650-bp-PCR-Fragment hergestellt worden waren. Das Cosmid pHSH44 trug drei HindIII-Restriktionsfragmente von 3,4 kb, 4,0 kb und 4,8 kb. Zunächst wurden alle diese Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt und sowohl in pUC19 als auch in pBR322 einkloniert. Die Ligasierungsreaktion enthielt in allen Fällen 100 ng dephosphorylierte Vektor-DNA und ungefähr 1000 ng des entsprechenden HindIII-Fragments in einem Volumen von 20 ul. Diese Ligasierungsgemische wurden in kompetente Zellen entweder von E. coli DHScc (für pUC19) oder E. coli HB101 (für pBR322) transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert und auf die korrekten Plasmidkonstrukte durchmustert. Alle HindIII-Fragmente wurden in beide Vektoren einkloniert. Die korrekten Konstrukte in pUC19 und pBR322 wurden als pMG102.2 bzw. pMG105.9 bezeichnet. Die Ergebnisse der Hybridisierungs- und Restriktionsanalyse identifizierten das 3,4-kb-HindIII-Fragment (vorhanden in den Plasmiden pMG102.2 und pMG105.9) als homolog zu dem 650-bp- PCR-Fragment. Das Plasmid pMG102.2 wurde gereinigt und durch Restriktionsanalyse mit 26 verschiedenen Enzymen charakterisiert. Um die vollständige Nucleotidsequenz des 3,4-kb- HindIII-Fragments zu erhalten, war es notwendig, Teile des Fragments in die pTZ-Sequenzierungsvektoren zu subklonieren. Alle Subklone wurden unter Verwendung von DNA-Fragmenten von pMG102.2 hergestellt, die nach der Gel-Elektrophorese aus Agarose mit niedriger Schmelztemperatur gereinigt worden waren. Die herausgeschnittenen DNA-Fragmente wurden mit Vektor-DNA ligasiert, die an den passenden Stellen geschnitten worden war, und in E.-coli-DHS -Zellen transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert, und die korrekten Klone wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Plasmid-DNAs aus den korrekten Konstrukten wurden aus dem DH5 -Stamm gereinigt und in E. coli NM522 transformiert, um die für die DNA-Sequenzierung notwendigen einzelsträngigen Matrizen zu erhalten.
B. Sequenzierung des 3,4-kb-HindIII-Fragments, das das Gen für Alkalische Protease von B. Ientus enthält
Das 650-bp-PCR-Fragment wurde ebenfalls in das E.-coli-Plasmid pUC19 einkloniert. Das PCR-Fragment wurde mit glattem Ende an pUC19 ligasiert, das vorher mit SmaI abgebaut worden war, und in E. coli DH5 , die von den Bethesda Research Labs (BRL) bezogen wurde, transformiert, wobei man das von den BRL angegebene Verfahren verwendete. Transformanten wurden auf X-gal- Platten selektiert, die 50 gg/ml Ampicillin enthielten (Maniatis et al., ibid.). Man würde erwarten, daß das Klonieren des 650-bp-Fragments in die SmaI-Stelle die lacZ-Komplementierung zerstört und daher auf den X-gal-Platten weiße Ko lonien erzeugt. Ungefähr 200 von 10000 Kolonien auf den X-gal- Platten waren weiß. Plasmid-DNA wurde aus 12 der 200 Transformanten hergestellt und auf die Anwesenheit des 650-bp-Fragments analysiert. Bei sieben der 12 war das PCR-Fragment in derselben Orientierung in pUC19 einkloniert. Dieses Plasmid wurde als pMG100.13 bezeichnet. Für die DNA-Sequenzierung wurde das 650-bp-Fragment durch doppelten Abbau mit BamHI und KpnI aus pMG100.13 entfernt. Erkennungsstellen für diese Enzyme sind in der ursprünglich aus pUC19 stammenden Polylinkersequenz enthalten, finden sich jedoch nicht innerhalb der DNA-Sequenz des 650-bp-PCR-Fragments. Das BamHI/KpnI-PCR-Fragment wurde mit den kommerziellen (Pharmacia) Sequenzierungsvektoren pTZ18R und pTZ19R ligasiert, mit denselben Enzymen abgebaut und in E. coli transformiert. Transformanten, die die korrekten Konstrukte enthielten, wurden durch Isolierung von Plasmid-DNA und Restriktionsanalyse identifiziert. Die zwei neuen Konstrukte vertraten beide Orientierungen des PCR- Fragments in bezug auf eine Sequenzierungsprimerstelle, die sich auf den pTZ-Vektoren befand. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Didesoxy-Verfahrens und eines kommerziell erhältlichen Seguenzierungsprimers aus dem M-13-System durchgeführt. Die ersten Sequenzierungsdaten bestanden aus ungefähr 220 Basen für jeden Strang; sie begannen an jedem Ende und erstreckten sich intern in das 650-bp-PCR-Fragment hinein. Diese erste Sequenz bestätigte, daß: das 650-bp-PCR- Fragment als Fragment mit glatten Enden in die SmaI-Stelle von pUC19 einkloniert worden war; die DNA-Sequenz, die im pTZ18- Klon unmittelbar auf die SmaI-Stelle folgt, mit dem NO2.2- Primer im Einklang steht; die 17 bp DNA-Sequenz unmittelbar nach der SmaI-Stelle im pTZ19-Klon (entgegengesetzte Orientierung zu pTZ18) mit dem CO3.3-Primer im Einklang stehen; und die Aminosäuresequenzen, die sowohl aus den DNA-Sequenzen, die sich innerhalb der NO2.2- und CO3.3-Primerbereiche befinden, als auch aus denen, die sich aus diesen heraus erstrecken, abgeleitet sind, im Einklang mit den aus Savinase bestimmten N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen stehen. Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse kann geschlossen werden, daß das aus B.-lentus-DSM-5483-DNA amplifizierte 650-bp-PCR-Fragment einen Teil eines Gens darstellt, das eine Alkalische Protease codiert, wobei der Teil unmittelbar hinter dem N- Terminus der reifen Protease beginnt und sich in den proteincodierenden Bereich hinein fortsetzt. Um die Sequenzierung des 650-bp-PCR-Fragments zu vervollständigen, wurden zwei Ansätze verfolgt. Erstens wurde der pTZ19R-Vektor, der das 650-bp-PCR- Fragment trägt, mit EcoRI abgebaut, so daß ein Teil des PCR- Fragments entfernt wurde, religasiert und in E. coli transformiert. Eine vorläufige Restriktionsanalyse des PCR-Fragments hatte eine interne EcoRI-Stelle ergeben, wobei sich eine zweite EcoRI-Stelle im Polylinkerbereich des Vektors befindet. Der aus diesem Experiment isolierte korrekte Subklon enthielt die EcoRI-Stelle neben der Primerstelle für die DNA-Sequenzierung, was die Bestimmung einer zusätzlichen internen DNA-Sequenz des PCR-Fragments ermöglichte. Gleichzeitig wurde das aus dem pTZ19R-PCR-Konstrukt entfernte kleine EcoRI- Fragment mit der entgegengesetzten Orientierung in pTZ18R einkloniert, was eine Bestimmung der DNA-Sequenz von der EcoRI- Stelle aus in der entgegengesetzten Richtung ermöglichte.
C. Bestimmung des Transcriptionsstartpunkts für das Gen der Alkalischen Protease von B. Ientus 5483
Ein notwendiger Schritt bei der genetischen Manipulation des klonierten BLAP-Gens ist die Bestimmung des Startpunkts der Transcription. Eine Primerverlängerungsvorschrift wurde verwendet, um diese Stelle zu identifizieren (Arnosti und Chamberlain (1989), PNAS (USA), 86, 830). Bei diesem Verfahren wurde ein Primer (Länge 20 bis 30 Basen) synthetisiert, der zu einer Sequenz auf der Matrizen-DNA homolog war, die sich 200 bis 300 bp in 3'-Richtung von dem vermuteten Transcriptionsstartpunkt befand. Der Primer wurde unter stringenten Bedingungen mit dem Messenger-RNA-Transcript hybridisiert, und dann wurde der Primer mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase verlängert. Die Größe des reversen Transcripts wurde in einem denaturierenden Polyacrylamidgel gemessen. Der verlängerte Primer wurde auch sequenziert, so daß die genaue Base der Transcriptionseinleitung von dem Sequenzierungsgel abgelesen werden konnte. Gesamt-RNA wurde gemäß der Beschreibung von Arnosti und Chamberlain (ibid.) aus DSM 5483 oder aus dem B.- subtilis-Stamm DB104, der das Plasmid pJWS enthält, isoliert. Das Plasmid pJW5 wurde durch Einklonieren des 3,4-kb-BLAP- HindIII-Fragments in die Hindill-Stelle des Plasmids pC194 gebildet. Eine Lysozymbehandlung mit anschließender Ultraschallbehandlung wurde verwendet, um Bacillus-Zellen aufzuschließen. Um die RNA von kontaminierenden Nucleasen zu reinigen, wurden wenigstens 4 bis 5 Phenolextraktionen durchgeführt. Die Größe des BLAP-Gen-Transcripts wurde durch Northern-Analyse bestimmt, wobei die von Thomas beschriebene Vorschrift verwendet wurde (1983, Methods in Enzymology 100, 255). Bei diesem Experiment wurde Bacillus-Gesamt-RNA denaturiert und dann durch Elektrophorese auf einem Agarose-Gel, das eine denaturierende Konzentration an Formaldehyd enthielt (BRL Focus 9 : 3,14), analysiert. Dann wurde die RNA von dem Gel auf ein Nitrocellulosefilter übertragen, das dann 2 Stunden lang bei 60ºC getrocknet wurde. Das Plasmid pMG109.3 (pUC19 + das 3,4-kb-HindIII-Fragment, das das BLAP-Gen enthält) wurde einer Nick-Translation unterzogen und verwendet, um den Northern- Blot zu sondieren. Das vom BLAP-Gen erzeugte Transcript hatte eine Länge von ungefähr 1200 bis 1400 Basen. Auf der Grundlage der BLAP-Nucleotidsequenz wurden zwei Oligonucleotidprimer entworfen. Diese Primer waren homolog zu BLAP-Sequenzen zwischen der NcoI- und der HpaI-Stelle und lagen in 5'-Richtung von der Sequenz, die das reife Proteasepeptid codiert. Primer A umspannt die in Fig. 2 gezeigte BLAP-Nucleotidsequenz zwischen den Basen 2056-2033, und Primer B befindet sich zwischen den Basen 2242-2222. Die Ergebnisse der Primerverlängerungsexperimente unter Verwendung jedes der beiden Primer sowie Messenger-RNA, die entweder aus B. lentus DSM 5483 oder aus B. subtilis DB104, der das Plasmid pJW5 trägt, hergestellt wurde, waren dieselben. In beiden Fällen wurde als Startpunkt der Transcription ein Adeninrest auf Position 1924 in der BLAP-Sequenz bestimmt. Dieses Adenin befindet sich 42 bp vor dem ATG-Translationsstartcodon am Anfang des BLAP-Signalpeptids. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses beträgt die Länge des BLAP-Transcripts 1210 Basen.

Beispiel 5

Konstruktion von Fusionen zwischen dem Gen für die Alkalische Protease von B. licheniformis ATCC 53926 und dem Gen für die Alkalische Protease von B. lentus (BLAP)

A. Experimenteller Ansatz
Für die Herstellung von BLAP im großen Maßstab wurde ein Expressionssystem entworfen, das -auf Genfusionen beruhte, die Teile des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens und Teile des BLAP-Gens umfassen. Der native Promotor des BLAP-Gens erwies sich als unzureichend für die effektive Produktion von BLAP in B. subtilis DB104 sowie DSM 5483. Aufgrund von Fermentierungsergebnissen war bekannt, daß der Promotor des ATCC-53926- Alkalische-Protease-Gens bei der Produktion von Protease des Carlsberg-Typs in ATCC 53926 in großem Maßstab gut funktionierte. Eine Fusion des Promotors des ATCC-53926-Alkalische- Protease-Gens mit dem Struktur-Gen von BLAP würde also möglicherweise ein effizientes Expressionssystem für Protease, die kommerziell erhältlichen Serin-Proteasen ähnlich ist, in ATCC 53926 ergeben. Gene, die für Alkalische Proteasen codieren, wie die von ATCC 53926 und BLAP, codieren typischerweise eine pre-pro-Form des Enzyms. Sie beginnen alle mit einem regulatorischen Bereich, der einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle und ein Startcodon umfaßt und für die effiziente Transcription und Translation des entsprechenden Gens verantwortlich ist. Auf den regulatorischen Bereich folgt eine DNA- Sequenz, die für das Signalpeptid codiert. Auf die Signalse quenz, die für die Sekretion der Protease aus der Zelle erforderlich ist, folgt ein codierender Bereich für das pro-Peptid und für die reife Protease. Nach der Transcription der hinter dem Promotor befindlichen DNA-Sequenz wird die Messenger-RNA (mRNA) in das endgültige Genprodukt translatiert. Die pre-pro- reife Protease besteht aus dem Signalpeptid, dem pro-Peptid und der reifen Protease. Die Signalsequenz steuert die unreife Protease durch die cytoplasmatische Membran, wo das Signalpeptid von einer Signalpeptidase enzymatisch abgespalten wird. Die pro-Sequenz scheint für eine korrekte Faltung und Prozessierung der pro-Protease während oder nach der Translokation durch die cytoplasmatische Membran und die Zellwand wesentlich zu sein. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zwischen dem BLAP- und dem ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen ergab 49% Homologie im pre-Bereich, 38% Homologie im pro-Bereich und 75% Homologie im reifen Bereich. Da die zum Erhalten einer korrekten Sekretion und Reifung einer Protease notwendige Wechselwirkung zwischen dem pre- und dem pro-Bereich nicht vollständig verstanden ist, wurden zwei verschiedene Fusionen zwischen Teilen des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gens und Teilen des BLAP-Gens konstruiert. Die zwei Grundfusionen wurden anhand der Restriktionsenzymstellen identifiziert, die verwendet wurden, um verschiedene Teile des ATCC-53926- und des BLAP- Gens miteinander zu verbinden.

1. ClaI-Fusion

Um die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-ClaI-Genfusion zu konstruieren, mußte eine zusätzliche ClaI-Restriktionsstelle auf Position 376 direkt bei der Verbindung zwischen der ATCC- 53926-pre- und -pro-Sequenz in das ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen eingeführt werden (Fig. 27 und 27a). Am Basenpaar 2032 enthielt das BLAP-Gen bereits eine natürlich vorkommende ClaI-Stelle auf der entsprechenden Position. Die ClaI-Stelle wurde mit Hilfe der PCR in das ATCC-53926-Alkalische-Protease- Gen eingeführt. Das oben beschriebene Plasmid pGM15 wurde aus NM522, einem dam&spplus;-E.-coli-Stamm, isoliert und mit AvaI, ClaI und MTuI geschnitten, was vier DNA-Fragmente von 4330 bp, 1296 bp, 382 bp und 147 bp ergab. Die ClaI-Stellen auf den Positionen 1206 und 2032 in der BLAP-Sequenz (Fig. 2) wurden aufgrund einer dam-Methylierung an überlappenden GATC-Sequenzen nicht geschnitten. Die Restriktion mit MluI wurde verwendet, um aus dem 1825-bp-AvaI/ClaI-Fragment drei DNA-Fragmente zu erzeugen und eine Religasierung und Reklonierung dieser Fragmente an das 4330-bp-AvaI/ClaI-Fragment zu verhindern. Die DNA-Fragmente aus den pGM15-AvaI/ClaI/MluI-Spaltprodukten wurden mit einem DNA-Fragment ligasiert, das den Promotor und die pre-Sequenz der Alkalischen Protease von ATCC 53926 enthielt und mit Hilfe der PCR synthetisiert wurde. Dieses 292-bp- Fragment war an seinem 5'- und 3'-Ende von einer AvaI- bzw. ClaI-Restriktionsstelle flankiert und wurde unter Verwendung des Plasmids pC51 als Matrize mit den Primern Nr. 1 und Nr. 3 (Fig. 8) synthetisiert. Das PCR-Fragment enthielt Sequenzinformation aus dem N-terminalen Teil des ATCC-53926-Alkalische- Protease-Gens einschließlich des ATCC-53926-Alkalische-Protease-Promotors und des größten Teils der ATCC-53926-pre-Sequenz (von der AvaI-Stelle am Basenpaar 84 erstreckt er sich bis zur neu gebildeten ClaI-Stelle am Basenpaar 376). Das obige Ligasierungsprodukt wurde in E. coli NM522 transformiert, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. Plasmid-DNAs wurden hergestellt und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Ein korrektes Konstrukt wurde identifiziert und als pCB10C bezeichnet (Fig. 12). Das Plasmid pCB10C enthielt den Promotor der Alkalischen Protease von ATCC 53926 und den größten Teil der pre-Sequenz von ATCC 53926, die hinter der nativen ClaI-Stelle auf Position 2941 mit der BLAP- Sequenz fusioniert war. Das Plasmid pCB10C wurde zur Erzeugung des endgültigen ClaI-Fusionsgens verwendet, indem man es mit ClaI linearisierte und ein 909-bp-ClaI-Fragment aus dem BLAP- Gen einsetzte, das die Sequenz zwischen den ClaI-Stellen auf Position 2032 und Position 2941 enthielt. Das 909-bp-ClaI- Fragment wurde erzeugt, indem man das Plasmid pMG108.2 (Fig. 26) mit ClaI hydrolysierte. Das Plasmid pMG108.2 wurde aus E. coli GM33 (dam&supmin;) isoliert, um eine dam-Methylierung an Adeninresten im Erkennungstetranucleotid GATC zu verhindern. Das 909-bp-DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarose-Gel isoliert und in das Plasmid pCB10C einligasiert, das zuvor mit CIaI geschnitten und mit bakterieller Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden war. Das Ligasierungsgemisch wurde in E. coli NM522 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden herausgesucht, und das korrekte Konstrukt (pCB11C) wurde identifiziert. Eine Restriktionskarte von pCB11C ist in Fig. 4 angegeben, und ein Schema für seine Konstruktion ist in Fig. 12 angegeben. Eine Analyse der DNA- Sequenz über die im Plasmid pCB11C vorhandene Fusion des ATCC- 53926- und des BLAP-Gens hinweg bestätigte die erwartete DNA- und Aminosäuresequenz.

2. NcoI-Fusion

Um die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-NcoI-Genfusion zu konstruieren, mußte eine zusätzliche NcoI-Restriktionsstelle auf Position 638 in der Nähe der Verbindung zwischen der ATCC- 53926-pro- und der reifen Sequenz in das ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen eingeführt werden (Fig. 27 und 27a). Das BLAP-Gen enthielt eine natürlich vorkommende NcoI-Stelle auf Position 2311. Die NcoI-Stelle wurde mit Hilfe der PCR in die ATCC-53926-Sequenz eingeführt. Ein 554-bp-PCR-DNA-Fragment wurde synthetisiert, wobei das Plasmid pC51 als Matrize und die Oligonucleotide Nr. 1 und Nr. 2 (Fig. 8) als Primer verwendet wurden. Die Primer waren so gestaltet, daß eine AvaI- und eine NcoI-Stelle am 5'- bzw. 3'-Ende des Fragments eingeführt wurden. Das 554-bp-Fragment enthielt die Sequenzinformation für den Promotor, die pre- und die pro-Sequenz der Alkalischen Protease von ATCC 53926 sowie die ersten vier Aminosäuren des reifen ATCC-53926-Protease-Gens. Nach der Restriktion mit AvaI/NcoI wurde das PCR-Fragment mit dem 4958- bp-AvaI/NcoI-DNA-Fragment des Plasmids pGM15 ligasiert. Das Plasmid pGM15 (Fig. 3) wurde mit AvaI, NcoI und MluI geschnitten, was vier DNA-Fragmente von 4958 bp, 668 bp, 382 bp und 147 bp ergab. MluI wurde verwendet, um aus dem 1197-bp- AvaI/NcoI-Fragment drei Fragmente zu erzeugen und so eine Religasierung dieses Fragments an das 4958-bp-AvaI/NcoI-Fragment zu verhindern. Das Ligasierungsgemisch wurde in E. coli NM522 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden herausgesucht, und das korrekte Konstrukt (pCBIN) (Fig. 5) wurde identifiziert. Eine Analyse der DNA-Sequenz über die NcoI-Stelle des Plasmids pCB1N hinweg bestätigte die erwartete DNA- und Aminosäuresequenz. Das Alkalische-Protease-Gen in Form der NcoI-Fusion enthielt die gesamte Promotor-, pre- und pro-Sequenz des Enzyms aus ATCC 53926 und die gesamte Sequenz des reifen BLAP mit einer einzigen Aminosäuresubstitution am Aminosäurerest 3 der reifen BLAP-Sequenz, wo ein Threonin ein Serin ersetzte.

Beispiel 6

Subklonierung des B.-licheniformis-ATCC-53926-BLAP-Fusionsgens in Bacillus-Vektoren und Transformation in den ATCC-53926- Produktionsstamm

Nachdem die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsgene in E.-coli-Vektoren kloniert worden waren, wie es oben beschrieben wurde, wurden sie in Bacillus-Vektoren subkloniert und in B. subtilis DB104 transformiert. Die ATCC-53926-Alkalische- Protease-BLAP-Fusionsgene wurden als AvaI/SstI-DNA-Fragmente in pBC16- und pUB110-Derivate subkloniert, indem man die E.- coli-Vektoren, die die ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP- Fusionsgene enthielten (pCB1N, pCB11C, pCB2N, pCB13C, pCB4N und pCB15C), mit AvaI und SstI schnitt und sie mit den Bacillus-Plasmiden pC51 und pH70 ligasierte, die mit AvaI, SstI, PstI und SaII geschnitten worden waren. Die Plasmide pC51 und pH70 wurden mit AvaI/SstI geschnitten, um das große AvaI/SstI- Vektorfragment zu erhalten, das den notwendigen Replikations startpunkt und ein Antibiotikum-Resistenz-Gen (Tetracyclin-Resistenz bei pC51, Kanamycin-Resistenz bei pH70) für die Selektion enthielt. Eine Restriktion mit SalI und PstI wurde durchgeführt, um das kleine AvaI/SstI-Fragment, das das gesamte auf pC51 und pH70 vorhandene ATCC-53926-Alkalische-Protease-Gen enthält, in drei kleinere DNA-Fragmente zu hydrolysieren. Dadurch wurde die Wahrscheinlichkeit verringert, daß das ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gen erneut in die Bacillus-Vektoren ligasiert wird. Die ersten Experimente zur Klonierung in Bacillus wurden unter Verwendung von B. subtilis DB104 als Empfänger durchgeführt. Da DB104 ein Stamm mit reduzierter Proteasefunktion ist, bietet er eine direkte Selektionsmöglichkeit für die Anwesenheit und Expression des BLAP-Gens. Die Verwendung von pH70 und pC51 als Empfänger für das AvaI/SstI- Fragment von jedem der oben beschriebenen E.-coli-Plasmide mit dem ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsplasmid führte zu insgesamt 12 potentiellen Bacillus-Plasmidkonstrukten. Fig. 23 zeigt die sechs ATCC-53926-BLAP-Plasmide, die von den drei in den E.-coli-Plasmiden pCB11C, pCB13C und pCB15C vorhandenen ClaI-Fusionen abgeleitet sind. Detaillierte Restriktionskarten der Plasmide, die sich in den ATCC-53926-Produktionsstamm transformieren ließen, also der Plasmide pCB55C, pCB56C, pCB58C, pCB75C und pCB78C, sind in den Fig. 13, 14, 15, 16 bzw. 17. gezeigt. Alle diese fünf Konstrukte wurden in B. subtilis DB104 und in den ATCC-53926-Produktionsstamm transformiert. In ähnlicher Weise wurden die NcoI-ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionen aus pCB1N, pCB2N und pCB4N in pH70 und pC51 einkloniert. Fünf der sechs Plasmide aus dieser Klonierung (pCB50N, pCB51N, pCB53N, pCB70N und pCB73N) wurden in B. subtilis DB104 sowie in den ATCC-53926-Produktionsstamm transformiert. Die Restriktionskarten für diese Konstrukte sind in den Fig. 18, 19, 20, 21 bzw. 22 gezeigt.

Beispiel 7

Vorschrift für die Produktion von Alkalischer Protease von B. Ientus (BLAP) durch ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Stämme in Schüttelkolbenkulturen.

Zum Vergleich von Derivaten von B. licheniformis ATCC 53926, die die verschiedenen ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP- Plasmide tragen, wurde ein dreistufiges Schüttelkolbenverfahren verwendet. In diesen Experimenten war das Antibiotikum Tetracyclin oder Kanamycin stets in den Medien (unten beschrieben) vorhanden, um auf das gewünschte Plasmid zu selektieren. Der erste Vorkulturkolben wurde aus einem gefrorenen Vorratsgläschen beimpft, das auf Raumtemperatur aufgetaut worden war. Nach 7 Stunden Inkubation bei 39ºC und 200 U/min wurden 1,0% (v/v) dieser Kultur in einen frischen (zweiten) Vorkulturkolben übertragen, und die Inkubation wurde wiederaufgenommen. Zwischen der 13. und 15. Stunde wurde eine 1%- Überimpfung vorgenommen, um Hauptkulturkolben zu duplizieren. Kulturproben wurden zwischen der 27. und 50. Stunde regelmäßig aus den Hauptkulturkolben erhalten, um die Proteaseaktivität zu bestimmen. Bei den Schüttelkolbenexperimenten wurde ein komplexes Medium verwendet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen für den Mikroorganismus sowie weitere organische Materialien und anorganische Salze enthielt. Zu den Hauptkomponenten gehörten hydrolysierte Maisstärke, Natriumcaseinat, Sojamehl, ein Braurückstand sowie Maisquellwasser. Kleine Mengen an Schaumverhütungsmittel, anorganischen Salzen und den Vitaminen B1 und B6 waren ebenfalls vorhanden. Nach der Verteilung auf Erlenmeyer-Kolben mit Strombrechern wurde das Medium durch Erhitzen auf 121ºC bei 15 psi sterilisiert.

Beispiel 8

Vorschrift für die Fermentation von ATCC-53926-Derivaten, die BLAP erzeugen, im kleinen Maßstab.

Die Fermentationen wurden in zwei Schritten durchgeführt, wobei der Organismus zuerst in einem Schüttelkolben herangezüchtet wurde, der ein komplexes Medium mit Antibiotikum zur Selektion auf die endogene Plasmid-DNA enthielt. Nachdem eine hohe Zelldichte erreicht war, wurde ein Teil der Kolbenkultur für fortgesetztes Wachstum und die Erzeugung von Protease auf das Hauptfermentergefäß übertragen. Die Gefäße waren Biostat E oder Es, hergestellt von B. Braun, Inc. Alle Fermentationen enthielten weniger als 10 Liter Kultur und wurden mit BL1- Sicherheitseinschlußvorkehrungen (BLl Biosafety Level 1) und mit guten Laborpraktiken durchgeführt, wie es in den National Institutes of Health Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules (NIH Guidelines, 7. Mai 1986) spezifiziert ist.
Die Schüttelkolben- und Fermentermedien waren sehr ähnliche komplexe Medien mit einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle, assimilierbaren Stickstoffquelle, organischen Nährstoffen und anorganischen Salzen, die ein kräftiges Wachstum des Mikroorganismus sowie die Erzeugung von Protease ermöglichten. Zu den Hauptkomponenten des Mediums gehörten entionisiertes Wasser, Maisstärke, Sojamehl, Natriumcaseinat, ein Braurückstand sowie Maisquellwasser. Weitere Komponenten waren (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; und Na&sub2;HPO&sub4;. Ein kommerzielles Schaumverhütungsmittel war ebenfalls in den Fermentermedien vorhanden. Das Medium wurde durch Erhitzen auf 121ºC bei 15 psi sterilisiert. Die beschriebenen Medien in einem Zwei-Liter-Kolben mit Strombrechern wurden aus 1,0 ml gefrorener Glycerin-Stammkultur (siehe Herstellung der Stammkultur) beimpft, die auf Raumtemperatur aufgetaut worden war. Entweder Tetracyclin oder Kanamycin wurde als Antibiotikum zu der Schüttelkolbenkultur gegeben, um auf die Zellen zu selektieren, die das gewünschte Plasmid trugen. Die Schüttelkolben wurden unter langsamem Schütteln bei 39ºC inkubiert, um die Kultur wachsen zu lassen. Die Fermentermedien wurden schließlich mit einer 1,5%-Übertragung (v/v) der Schüttelkolbenkultur beimpft. In den Fermentermedien war auch ein Antibiotikum vorhanden. Die Schüttelgeschwindigkeit und der Luftstrom wurden auf 1300 U/min bzw. 1 vvm (Liter/min) gehalten. Bei einigen Experimenten mußten die Schüttel- und die Luftstromgeschwindigkeit während der exponentiellen Wachstumsphase kurzfristig erhöht werden, um einen Sauerstoffpartialdruck (pO&sub2;) von über 20% in der Kultur aufrechtzuerhalten.
Während der Kultivierung des Produktionsstammes wurden der pH- Wert und die Temperatur der Kultur zu festgelegten Zeiten geändert. Insbesondere wurde gefunden, daß die Kontrolle des pH-Werts der Kultur eine erhebliche Auswirkung auf die Erzeugung von Protease hatte. Der pH-Wert der Kultur wurde von 0- 13,5 Stunden auf 6,8 reguliert und dann von 18 bis 35 Stunden auf pH 7,5 reguliert. Sterile Lösungen von KOH und H&sub2;SO&sub4; wurden nach Bedarf zu den Medien gegeben, um den pH-Wert zu regulieren. Vom Anfang der Fermentation an betrug die Kulturtemperatur 39ºC. Die Temperatur wurde nach 14,5 Stunden Inkubation auf 34ºC gesenkt.

Beispiel 9

Assays für die Alkalische Protease von B. lentus

Für Assays von Proben aus Schüttelkolben oder Fermentationen wurde die Protease durch Zentrifugation von den Zellen und Medien abgetrennt. Die Protease wurde in diesen Rohpräparaten so quantifiziert, wie es unten beschrieben ist.
Das HPE-Verfahren (Henkel-Protease-Einheit) beruhte auf einem diskontinuierlichen Assay der Freisetzung von säurelöslichen Fragmenten aus Proteaseaufschlüssen von Casein. Etwa 50 ul Proteaselösung wurden mit 750 ul einer Caseinlösung kombiniert, die durch Erhitzen von Hammarsten-Casein in Tripolyphosphat-Tris-Pufferlösung bei pH 8,5 hergestellt wurde. Nach 15 Minuten Inkubation in einem 2,2-ml-Eppendorf-Röhrchen bei 50ºC wurden 600 pl einer 0,44 M Trichloressigsäurelösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang auf Eis abgekühlt, bevor der Niederschlag durch Zentrifugation entfernt wurde. Säurelösliche Peptide wurden in einem Spektrophotometer bei 290 nm gemessen. Zwei HPE-Einheiten wurden so definiert, daß sie gleich einer Änderung der Extinktion von 0,500 OD bei 290 nm sind.
Das EPE-Verfahren (Esterolytische Protease-Einheit) war in erster Linie für den Nachweis von Aktivität aus dem ATCC- 53926-Produktionsstamm geeignet. Der kinetische Assay wurde begonnen, indem man 100 ul einer Probe oder eines bekannten Standards einer kommerziellen Protease (Maxatase, Novo A/S) mit einem Acetonpuffer mischte, der CBZ-Valin-p-nitrophenylester enthielt. Die Geschwindigkeit, mit der p-Nitrophenol durch esterolytische Spaltung des CBZ-Esters freigesetzt wurde, wurde spektrophotometrisch bei A&sub3;&sub4;&sub0; überwacht und durch lineare Regressionsanalyse bestimmt. Einheiten der EPE-Aktivität für eine Probe wurden durch Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit der Probe mit der des Maxatase-Standards bestimmt.

Beispiel 10

Unterscheidung zwischen BLAP und B.-licheniformis-ATCC-53926- Protease durch Gel-Elektrophorese

Die von den ATCC-53926-Alkalische-Protease-BLAP-Fusionsstämmen erzeugte Alkalische Protease von B. lentus konnte durch Elektrophorese in homogenen, nichtdenaturierenden ("nativen") 12,5%igen Polyacrylamid-(PA)-Gelen mit pH-6,0-Puffer von den nativen extrazellulären proteolytischen Enzymen von ATCC 53926 unterschieden werden. Rohe Proben, die durch Zentrifugation der Fermenterflüssigkeit erhalten wurden, wurden nach diesem Verfahren auf der von Pharmacia, Inc., hergestellten PhastSystem-Apparatur aufgelöst. Die Proteinspezies wurden sichtbar gemacht, indem man das PA-Gel in Coomassie-Blau anfärbte.

Beispiel 11

Herstellung von B. licheniformis ATCC 53926

Zellmaterial von Agar-Schrägkulturen, die den Stamm B. licheniformis DSM641 enthielten, wurde mit einer Öse übertragen und in 5 ml Medium A suspendiert (Medium A: Nährbouillon von Merck, präpariert nach den Anweisungen des Herstellers). Nach intensivem Schütteln in einem Vibrox wurde die Suspension in einem zirkulären Schüttler (150 U/min. Amplitude 2,5 cm; 24 h) bei 30ºC geschüttelt. Nach 24 Stunden wurde 1 ml der Suspension (optische Dichte = 1 bei 640 nm) in 100 ml Medium A weitere 24 Stunden in einem 500-ml-Erlenmeyer-Schüttelkolben inkubiert. Dann wurde bei 6500 U/min abzentrifugiert. Das Zentrifugat wurde zweimal mit einer isotonischen NaCl-Lösung gewaschen und in genügend Salzwasser gegeben, so daß man eine Zelldichte von etwa 109/ml erhielt.
Etwa 8 ml der Suspension wurden auf eine Petri-Schale mit 9 cm Durchmesser übertragen, um sie in einem Abstand von 27 cm von der UV-Lampe (Schutt/Göttingen) mit UV-Licht zu bestrahlen (5- 60 Minuten), während mit 100 U/min gerührt wurde. Das Rühren wurde während der Bestrahlung fortgesetzt, um ein Absetzen der Zellen zu verhindern. Nach der gewünschten Bestrahlungszeit, vorzugsweise 6 Minuten, wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, und diese Verdünnungen wurden auf Medium-A-Agarplatten mit und ohne Antibiotikum ausgestrichen. Anhand der Bestimmung der CFU (koloniebildenden Einheiten) vor und nach mutagenen Behandlungen, mit und ohne Antibiotika, kann die Mortalitätsrate sowie Änderungen in der Reversionsrate, die als Maß für die Mutationsbildung dient, bestimmt werden. Im Falle von DSM 641 wurde eine Mortalitätsrate von > 95% als besonders wünschenswert angesehen.
Unter Verwendung einer Replika-Plattierungstechnik wurden die Kolonien auf Ca-caseinat-Agar übertragen. Die Platten wurden 72 Stunden bei 39ºC inkubiert. Dann wurde nach 24, 48 und 72 Stunden die Bildung von gelichteten Zonen um die Kolonien herum gemessen. Nach dem Messen der Kolonien und der gelichteten Zonen wurden die Stämme ausgewählt, die einen großen Lysebereich im Vergleich zum Durchmesser der Kolonie zeigten. Dann wurden unter Verwendung der mikrobiologischen Standardverfahren (Kochs Agarplattenverfahren, Lindners Tropfenverfahren, Verfahren des mehrfachen Ausstreichens) einzelne Kulturen dieser Kolonien erzeugt. Mit diesen Isolaten wurden Schüttelkolbenexperimente unternommen, um die Proteaseproduktivität zu bestimmen.

Beispiel 12

Vergleich der Proteaseproduktion durch DSM641 und ATCC 53926

Die Stämme wurden 96 Stunden bei 39ºC und mit 150 U/min (Amplitude 5 cm) in Schüttelkolben mit 50 ml Medium B (siehe Fußnote 1 zu Tabelle III) in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde alle 24 Stunden bestimmt. Die relative Proteaseproduktion ist in Tabelle III zusammengefaßt. Tabelle III
¹ Medium B: KH&sub2;PO&sub4; 2,5 g/l
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1,0 g/l
MnSO&sub4;·2H&sub2;O 0,5 g/l
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,2 g/l
Sojamehl 3,0 g/l
Casein nach Hammersten 15,0 g/l
Kartoffelstärke 120,0 g/l
Amylase 0,6 g/l
Die Kartoffelstärke, die in 1/3 des Endvolumens suspendiert war, wurde enzymatisch hydrolysiert. Getrennt davon wurde das Casein bei 75ºC durch Zugabe der KOH-Lösung in Wasser (etwa 1/3 des Gesamtvolumens) gelöst. Diese beiden Lösungen wurden mit den Salzen kombiniert, und das Gesamtvolumen wurde mit Wasser eingestellt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und dann wurde die Lösung sterilisiert.
² Die Fermentationen wurden doppelt durchgeführt.
³ Die Eintragungen 72 und 96 beziehen sich auf die Inkubationszeit in Stunden.
Tabelle III zeigt, daß der Stamm ATCC 53926 etwa 30% mehr Protease erzeugt als der Stamm DSM641.

Verschiedene experimentelle Operationen

1. Herstellung von Plasmid-DNA

Die Plasmidpräparation (gereinigt mit Mini-Prep und CsCl/Ethidiumbromid-Dichtegradient), Agarose- und Acrylamid-Gel-Elektrophorese und die Herstellung der Puffer (TE: Tris-EDTA, TAE: Tris-Acetat-EDTA, TBE: Tris-Borat-EDTA) und Medien erfolgten im wesentlichen, wie es von Maniatis et al. (ibid.) beschrieben wird. Phenol p.a. wurde von IBI bezogen und vor der Verwendung mit TE-Puffer äquilibriert. Agarose (SeaKem GTG) und Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (SeaPlaque) wurden von der FMC Corp., Rockland, ME, bezogen.

2. Reinigung von Restriktionsfragmenten

Restriktionsfragmente wurden isoliert, indem man die Probe auf einem präparativen Agarose-Gel laufen ließ. DNA wurde durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und die Bande mit dem zu isolierenden DNA-Fragment wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten. Die DNA wurde mit Hilfe eines IBI Electroeluter elektroeluiert, einmal phenolisiert und mit Ethanol gefällt.

3. Polymerase-Kettenreaktion

Die PCR wurde genauso durchgeführt, wie es vom Hersteller (Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornien) beschrieben wird. Die Lösung, die die durch PCR erzeugte DNA enthielt, wurde mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und zur Hydrolyse mit Restriktionsenzymen in einem geeigneten Puffer resuspendiert. Nach der Hydrolyse mit dem geeigneten Restriktionsenzym wurde die Lösung mit Phenol extrahiert, und die DNA wurde mit Ethanol gefällt. In dieser Weise hergestellte DNA war für die Ligasierung geeignet. In diesem Bericht entsprach die erwartete Länge aller PCR-erzeugten DNA-Fragmente der beobachteten Größe der DNA-Fragmente nach der Restriktion mit den geeigneten Restriktionsenzymen.

4. Restriktionsanalyse

Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase und bakterielle Alkalische Phosphatase wurden so verwendet, wie es von den Herstellern (NEB, BRL, IBI, Boehringer) beschrieben wird.

5. Protoplastentransformation

Das Verfahren der Protoplastentransformation, das ursprünglich für B. subtilis optimiert worden war, wurde für andere Bacillus-Species angepaßt (Chang und Cohen (1979), Mol. Gen. Genetics 168, 111). Eine Kolonie von B. subtilis, B. lentus oder B. licheniformis wurde in 30 ml 416-Medium eingeimpft (416- Medium: 2% Bactotrypton, 1% Hefeextrakt, 1% NaCl, sterilisiert durch Autoklavenbehandlung) und über Nacht bei 37ºC in einem Tischschüttelgerät des Typs New Brunswick G24 bei 225 U/min gezüchtet. Am nächsten Morgen wurde ein geeignetes Volumen von jeder Kultur verwendet, um 40 ml 416-Medium (vorgewärmt) in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben einzuimpfen. Die Inkubation bei 37ºC wurde unter Schütteln fortgesetzt, bis eine OD&sub6;&sub5;&sub0; zwischen 0,4 und 0,5 erreicht war. Dann wurden die Zellen 10 min bei 4ºC in einem sterilen 35-ml-Polypropylenröhrchen des Oakridge-Typs, 3000 U/min. sedimentiert. Der Überstand wurde abgegossen, und das Zellsediment wurde durch Umdrehen sachte in 5 ml SMMP resuspendiert. SMMP wurde stets frisch hergestellt, indem man gleiche Volumina 2x SMM und 4x PAB miteinander mischte (2x SSM enthielt: 1,0 M Sucrose, 0,04 M Maleinsäure, 0,04 M MgCl&sub2;·6H&sub2;O, pH 6,5, eingestellt mit 10% NaOH, sterilisiert durch Autoklavenbehandlung; 4x PAB enthielt: 70 g Difco-Antibiotikum-Medium Nr. 3, gelöst in einem Liter entionisiertem Wasser und sterilisiert durch Autoklavenbehandlung). Die Zellsuspension wurde übertragen, indem man sie in ein steriles Kulturröhrchen von 16 · 125 mm mit rundem Boden und Schraubverschluß (Corning Nr. 25760) goß. Eine Lysozymlösung, 10 mg/ml in SMMP, wurde frisch hergestellt, und 200 ul davon wurden zu der Zellsuspension gegeben. Die Röhrchen wurden auf die Plattform eines Schüttlers des Typs G24 New Brunswick gebracht und unter leichtem Schütteln (25-30 U/min) bei 37ºC inkubiert. Die Protoplastenbildung dauerte im allgemeinen 40- 60 Minuten bei B. licheniformis und 20-40 Minuten bei B. lentus und B. subtilis. Um den Grad der Protoplastenbildung zu bestimmen, wurde eine Probe der Zellsuspension mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops untersucht. Nach der Lysozymbehandlung wurden 10 ml SMMP zu der Protoplastensuspension gegeben, und die Protoplasten wurden durch Zentrifugation mit 2000 U/min während 10 Minuten bei Raumtemperatur sedimentiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, bevor man das Protoplastensediment in SMMP resuspendierte (jeweils 3 ml SMMP für 40 ml ursprüngliche Zellkultur). Bei jeder Transformationsreaktion wurden 0,5 ml protoplasti-erte Zellen in ein steriles Kunststoff-Kulturröhrchen von 16 · 125 mm mit rundem Boden (Corning Nr. 256760) übertragen, und anschließend wurden 1 bis 4 ug DNA in einem Volumen von 60 ul oder weniger sowie 1,5 ml 40%iges Polyethylenglycol (PEG, Sigma Chemical Company, Produkt-Nr. P-3640) zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen durch Umdrehen der Röhrchen ließ man sie 3-4 Minuten lang bei Raumtemperatur absitzen, und dann wurde das PEG durch die Zugabe von 5 ml SMMP + 2% BSA (Rinderserumalbumin) verdünnt. Nach dem Mischen durch Umdrehen wurden die Protoplasten durch Zentrifugation mit 2000 U/min während 10 Minuten bei Raumtemperatur sedimentiert, und der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, bevor man das Sediment in 1,0 ml SMMP + BSA resuspendierte. Dann wurden die Zellen 90 Minuten lang unter Schütteln bei 37ºC inkubiert (Tischschüttelgerät des Typs New Brunswick G24, 150 U/min), um eine Expression der im Plasmid codierten Gene zu ermöglichen und um Zellwände partiell zu regenerieren. Mit dem geeigneten Antibiotikum wurden selektive Regenerationsmedien hergestellt. Das CR5-Regenerationsmedium wurde für alle Bacillus-Stämme verwendet, wenn auf Transformanten selektiert wurde, die Plasmide enthalten, welche KmR codieren (Puyet et al. (1987), FEMS Microbiology Letters 40, 1). Das DM3-Regenerationsmedium wurde ursprünglich verwendet, um alle Bacillus- Stämme zu selektieren, die durch Plasmide transformiert waren, welche TcR codieren (Chang und Cohen (ibid.)). Es wurde jedoch entdeckt, daß B.-lentus-Protoplasten auf diesen Medien auf Succinatbasis nur ineffizient regenerieren. Daher wurde das Regenerationsmedium Nr. 451 getestet, das Mannit als osmotischen Stabilisator verwendet (Bourne und Dancer (1986), J. of Gen. Micro. 132, 251). Es wurde gefunden, daß alle Bacillus- Stämme gut auf den Mannitmedien regenerieren, obwohl die für jeden Stamm benötigte Menge an Tetracyclin unterschiedlich war. Die selektiven Mengen an Tetracyclin für B. subtilis, B. lentus und ATCC 53926 betrugen 65 xg/ml, 15 ug/ml bzw. 25 ug/ml. Jede Transformationsreaktion wurde auf 5 Regenerationsplatten ausgestrichen und 1-2 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Potentielle Transformanten wurden auf Luria-Agar aussortiert, der das geeignete Antibiotikum sowie gegebenenfalls zum Nachweis der Proteaseaktivität 1% Magermilch enthielt. Um die Identität des Stammes zu überprüfen, wurde Spizizens Minimalsalzmedium mit und ohne die richtigen Nährzusätze verwendet.

6. Bakterienstämme

Escherichia coli-Stämme:
1. E. coli NM522 ist hsdΔ5,Δ(lac-pro), [F', pro+, lacIqZΔM15]. NM522 ist restriktions-minus und modifikations-minus (Pharmacia, Piscataway, N. J.).
2. E. coli GM33 (dam3) ist dam-Methylase-minus (M. G. Marinus und N. R. Morris (1974), J. Mol. Biol. 85, 309).
3. E. coli DH5 ist F-φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, recA1, endA1, hsdR17(rk&supmin;,mk&spplus;), supE44, lambda-, thi-1, gyrA, relA1 (kompetente gefrorene Zellen, BRL, Gaithersburg, MD).
4. E. coli HB101 ist F-, hsdS20 (rB&supmin;, mB&supmin;), supE44, ara14, glaK2, lacYi, proA2, rpsL20(str), xyl15, leu, mtl1, lambda-, recA13.

7. Bacillus-Stämme

1. B. subtilis DB104 hat den Genotyp: his, nprR2, nprE18 und aprA3. Dieser Stamm wurde von Dr. Roy Doi an der University of California at Davis durch eine Lizenzvereinbarung erhalten und wird nur zu Forschungszwecken verwendet. Dieser Stamm ist defizient in bezug auf die Herstellung von Neutraler und Alkalischer Protease.
2. B. licheniformis ATCC 53926 ist ein industrieller Produktionsstamm, der von der Henkel KGaA, Düsseldorf, Bundesrepublik Deutschland, entwickelt wurde.
3. B. lentus DSM 5483 ist ein natürliches Isolat aus einer Bodenprobe aus der Bundesrepublik Deutschland.

8. Klonierungsvektoren

1. pUC19: pUC19 ist ein kleines E.-coli-Plasmid (2686 bp), das Teile von pBR322 und M13mp19 enthält. Es trägt eine 54 bp große multiple Klonierungsstelle mit Erkennungsstellen für 13 verschiedene Restriktionsendonucleasen. Es wurde konstruiert von C. Yanisch-Perron et al. (1985, Gene 33, 103) und kann von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, bezogen werden.
2. pTZ18R: pTZ18R (D. A. Mead et al. (1986), Protein Engineering, 1, 67) ist ein multifunktioneller Phagen-Plasmid- (Phasmid)-Vektor. Es enthält Replikationsstartpunkte des E.- coli-Vektors pBR322 und des E.-coli-Phagen f1, was die Erzeugung von einzelsträngiger DNA erlaubt. Es enthält die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pUC18. Es kann von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ, bezogen werden.
3. pTZ19R: pTZ19R ist homolog zu pTZ18R, enthält jedoch die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pUC19.
4. pCP13: pCP13 ist ein Cosmidvektor mit einem breiten Wirtsspektrum, der von dem Plasmid pLAFR1 abgeleitet ist, das schon früher charakterisiert wurde (Friedman et al. (1982), Gene 18, 289). Das Plasmid pCP13 hat eine Größe von 23 kb und codiert Resistenz gegen Tetracyclin und Kanamycin. Es enthält mehrere nur einmal vorhandene Restriktionsstellen, die für die Klonierung geeignet sind, kann mobilisiert werden, ist aber nicht selbstübertragbar.
5. pC50: pC50 ist ein Derivat des Bacillus-Plasmids pBC16. Es enthält ein 2-kb-DNA-Fragment, das die in die BamHI-Stelle von pBCl6 einklonierte DSM641-Protease codiert.
6. pC51: pC51 ist ein Derivat des Plasmids pC50 der zweiten Generation. Das 1540-bp-AvaI/SstI-Fragment von pC50, das eine Alkalische Protease von ATCC 53926 codiert, wurde zuerst zwischen der XmaI- und der SstI-Stelle in das E.-coli-Plasmid pUC19 einkloniert, wobei das Plasmid pH9 entstand. Dann wurde das ATCC-53926-Protease-Gen auf einem EcoRI/BamHI-Fragment aus pH9 entfernt und zwischen der EcoRI- und der BamHI-Stelle in das Plasmid pBC16 einkloniert, wobei das Plasmid pC51 entstand.
7. pUB110: pUB110 ist ein 4548-bp-Plasmid, das Resistenz gegen Kanamycin codiert und das ursprünglich von R. W. Lacey aus Staphylococcus aureus isoliert wurde (1974, J. Med. Microbiol., 7, 285).
8. pK0110: pK0110 ist ein Derivat von pUB110, bei dem das 788- bp-EcoRI/BamHI-Fragment entfernt und durch ein Fragment aus pUC19, das den Polylinkerbereich enthält, ersetzt wurde.
9. pBC16: pBC16 hat eine ungefähre Größe von 4250 bp und codiert Resistenz gegen Tetracyclin. Dieses Plasmid wurde ursprünglich aus Bacillus cereus isoliert und in B. subtilis transformiert (K. Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol. 133: 897).
10. pC194: pC194 ist ein Plasmid mit 2910 Basenpaaren, das Resistenz gegen Chloramphenicol codiert und aus S. aureus isoliert und in B. subtilis transformiert wurde (S. Iordanescu et al. (1978), Plasmid 1: 468; und S. D. Erlich (1977), PNAS USA 74: 1680).
11. pH70: pH70 ist ein Derivat des Plasmids pUB110. Das ATCC- 53926-Alkalische-Protease-Gen wurde auf einem EcoRI/BamHI-DNA- Fragment aus dem Plasmid pH9 (siehe Plasmid pC51) entfernt und zwischen der EcoRI- und der BamHI-Stelle in das Plasmid pUB110 einkloniert, wobei das Plasmid pH70 entstand.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein reifes, im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 mit der Aminosäuresequenz von Aminosäurerest 112 bis Aminosäurerest 380, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, sowie wenigstens ein proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926.

2. Hybrid-Plasmid, das in Bacillus repliziert werden kann und das eine DNA-Sequenz enthält, die in der Richtung der Transcription einen regulatorischen Bereich umfaßt, wobei der regulatorische Bereich in der Reihenfolge der Transcription einen Promotor der Alkalischen Protease von Bacillus licheniformis ATCC 53926, eine Ribosomenbindungsstelle sowie ein operabel mit einem pre-pro-Bereich verknüpftes Startcodon umfaßt, wobei der pre-pro-Bereich operabel mit einem reifen Bereich verknüpft ist, der für das proteolytische Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1 codiert.

3. Hybrid-Plasmid gemäß Anspruch 2, das weiterhin einen Transcriptionsterminator der Alkalischen Protease von Bacillus licheniformis ATCC 53926 umfaßt, der operabel mit dem reifen Bereich verknüpft ist, der für das proteolytische Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1 codiert.

4. Hybrid-Plasmid gemäß Anspruch 2, das weiterhin einen carboxyterminalen Teil des Gens für die Alkalische Pro tease von Bacillus licheniformis ATCC 53926 sowie dessen Transcriptionsterminator umfaßt, der operabel mit dem reifen Bereich verknüpft ist, der für das proteolytische Enzym von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1 codiert.

5. Isolierte DNA-Sequenz, die für die pre-pro-reife Form des proteolytischen Enzyms von Bacillus lentus DSM 5483 gemäß Anspruch 1 codiert.

6. Hybrid-Plasmid pCB55C mit der in Fig. 13 gezeigten Restriktionskarte.

7. Hybrid-Plasmid pCB56C mit der in Fig. 14 gezeigten Restriktionskarte.

8. Hybrid-Plasmid pCB58C mit der in Fig. 15 gezeigten Restriktionskarte.

9. Hybrid-Plasmid pCB75C mit der in Fig. 16 gezeigten Restriktionskarte.

10. Hybrid-Plasmid pCB78C mit der in Fig. 17 gezeigten Restriktionskarte.

11. Hybrid-Plasmid pCB50N mit der in Fig. 18 gezeigten Restriktionskarte.

12. Hybrid-Plasmid pCB51N mit der in Fig. 19 gezeigten Restriktionskarte.

13. Hybrid-Plasmid pCB53N mit der in Fig. 20 gezeigten Restriktionskarte.

14. Hybrid-Plasmid pCB70N mit der in Fig. 21 gezeigten Restriktionskarte.

15. Hybrid-Plasmid pCB73N mit der in Fig. 22 gezeigten Restriktionskarte.

16. Transformierte Bacillus-Wirtszelle, die ein Hybrid-Plasmid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15 umfaßt.

17. Transformierte Bacillus-Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei der Wirtszelle um Bacillus licheniformis ATCC 53926 handelt.

18. Verfahren zur Herstellung des Enzyms gemäß Anspruch 1, umfassend das Kultivieren eines Bacillus-licheniformis- ATCC-53926-Stammes, der mit einem Plasmid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15 transformiert ist, in einem Nährmedium und das Gewinnen des Enzyms.

19. Zusammensetzung, umfassend ein reifes, im Alkalischen wirkendes proteolytisches Enzym mit der in Fig. 29 gezeigten Aminosäuresequenz sowie wenigstens ein proteolytisches Enzym von Bacillus licheniformis ATCC 53926.

20. Biologisch reine Kultur von Bacillus licheniformis, der alle Merkmale des unter der Zugriffsnummer ATCC 53926 hinterlegten Stammes aufweist.

21. Biologisch reine Kultur eines Bacillus-lentus-Stammes, der alle Merkmale des unter der Zugriffsnummer DSM 5483 hinterlegten Stammes aufweist.

22. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die weiterhin ein Tensid umfaßt.

23. Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei das Tensid aus einem linearen Alkylbenzolsulfonat, einem ethoxylierten linearen Alkohol, einem alkylethoxylierten Sulfat, einem sulfatierten linearen Alkohol oder Kombinationen davon ausgewählt ist.