CN107002049A - 具有n‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有N‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽

对序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。最后，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包含此类多肽并且能够杀死或抑制存在于衣物、硬表面、皮肤、牙齿或粘膜上的微生物细胞；并用于保存食品、化妆品、油漆、涂料。

相关领域说明

现代社会高度关注抗生素的过度使用以及由此导致对此类抗生素有抗性的微生物的出现。抗微生物剂耐药性威胁着对由细菌、寄生虫、病毒和真菌引起的感染的有效预防和治疗，而这些感染的范围正日益扩大。因此，对杀死细菌或真菌微生物的新方法的鉴别越来越受到关注。本发明提供了此类方法。

过氧化氢是一种充分描述的抗微生物剂。长期以来已经认识到，一些氧化酶产生过氧化氢作为其氧化反应的副产物。

Zia等人2013年(巴西生物学与技术档案(Brazilian Archives of Biology andTechnology)56,6:956-961)已经示出，过氧化物产生酶——葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)具有作为抗微生物剂的作用，能对抗细菌(如金黄色葡萄球菌和多杀巴斯德杆菌)，但不对抗大肠杆菌也不对抗所测试的真菌(黑曲霉或特异青霉)。

专利US 2001009664 A描述了卤代过氧化物酶系统作为在过氧化物和卤化物存在下使用卤代过氧化物酶杀死微生物的有效方法的用途。过氧化物可以直接供给或由过氧化物产生酶(如上述葡萄糖氧化酶或乳糖氧化酶(EC 1.1.3x))产生。专利US 2005079165 A描述了卤代过氧化物酶系统用于杀死芽孢杆菌孢子(高度耐受其他抗微生物剂的微生物靶)的用途。这种卤代过氧化物酶系统依赖于独立供应过氧化氢或产生过氧化物的酶，以及卤化物(例如卤化钒)。

比较性成对地总体比对显示，本发明的多肽与来自小麦核腔菌(Pyrenophoratritici)(检索号SWISSPROT：B2W0N02)的推定的非特征性蛋白质的推导氨基酸序列具有72.4％一致性。

本发明的多肽与来自禾谷镰孢菌的碳水化合物氧化酶的氨基酸序列(Heuts等人，2007，欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett.)581,4905-4909)具有25.5％一致性。

发明内容

本发明提供了具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。这些多肽具有杀细菌和杀真菌作用，并可以在以下项中具有应用：消毒和/或清洁组合物，例如用于就地清洁(cleaning-in-place(CIP))程序的组合物，例如通常用于清洁储罐、生物反应器、发酵罐、混合容器、管道以及在生物技术制造、药品制造以及食品和饮料制造中使用的其他设备。此外，根据所使用的酶或底物的浓度，观察到差异效果，其中如罗伊氏乳杆菌的细菌被杀死，但啤酒酵母(酿酒酵母)不受影响。因此，本发明的多肽(即本发明的酶)可用于控制酵母发酵中的某些细菌。

本发明的酶的应用以及在此所述的其杀细菌和杀真菌作用的优点在于，其不需要卤化物也不需要外源过氧化物或产生额外过氧化物的额外的酶。本发明的酶利用N-乙酰基-葡萄糖胺作为底物。在这个方面中，本发明的酶类似于来自禾谷镰孢菌的碳水化合物氧化酶(Heuts等人，2007，欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett.)，581,4905-4909)，除了禾谷镰孢菌碳水化合物氧化酶似乎同等地利用N-乙酰基葡萄糖胺或N-葡萄糖胺，而本发明的多肽似乎对N-乙酰基葡萄糖胺的利用更多。本研究(实例6)表明，本发明的多肽(DeCOx)在使用N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)方面比禾谷镰孢菌碳水化合物氧化酶(FgCOx)要有效得多。此外，本发明的多肽除了GlcNAc之外还可以利用N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)，这是对于任何其他已报道的碳水化合物氧化酶而言尚未描述的特征。

因此，本发明涉及具有选自下组的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

本发明还涉及包含选自下组的催化结构域的多肽，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸154至632具有至少75％序列一致性的催化结构域；

(b)由多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸509至1945、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸509至1945或其cDNA序列具有至少75％序列一致性的多核苷酸编码的催化结构域；

(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸20至632的变体；以及

(e)具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的片段。

本发明还涉及包含选自下组的结合结构域的多肽，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或101至144具有至少75％序列一致性的结合结构域；

(b)由多核苷酸编码的结合结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸82至262以及350至481、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸82至262以及350至481或其cDNA序列具有至少75％序列一致性的多核苷酸编码的结合结构域；

(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸20至632的变体；以及

(e)具有壳多糖或肽聚糖结合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的结合结构域的片段。

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物并且涉及清洁和/或消毒方法，该方法包括施用该组合物。

序列简要说明

SEQ ID NO:1显示了致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)DeCOx基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。编码序列(包括终止密码子)是1948bp并且被一个49bp(核苷酸142至190)的内含子中断。

SEQ ID NO:2显示出致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶(DeCOx)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示出引物DeCOx-F

SEQ ID NO:4显示出引物DeCOx-R

SEQ ID NO:5显示出来自禾谷镰孢菌的碳水化合物氧化酶(FgCOx)的氨基酸序列

SEQ ID NO:6显示出引物FgCOx-F

SEQ ID NO:7显示出引物FgCOx-R

定义

N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶：术语“N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶”是指能够在1位氧化N-乙酰基-D-葡萄糖胺的碳水化合物氧化酶。该酶在结构上与氧化单糖和二糖、三糖、四糖和戊糖的末端糖的碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.x)有关，伴随着分子氧还原成过氧化氢。

出于本发明的目的，根据实例6中所述的程序确定N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“抗微生物活性”表示多肽杀死微生物或抑制其生长的能力^[1]。该抗微生物活性可用实例6、7、8或9中的任何方法进行评估。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ IDNO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的抗微生物活性。

生物膜：生物膜是其中细胞彼此粘附在一起或粘附至表面(例如纺织品、餐具或硬表面)或另一种表面的任何群组的微生物。这些粘附细胞经常包埋在胞外高聚物(EPS)的自身产生的基质内。生物膜EPS是一般由细胞外的DNA、蛋白、和多糖组成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一有机体的浮游细胞(相比之下，浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或浮游的单个细胞)是在生理上不同的。

生活在生物膜中的细菌通常与同一物种的浮游细菌具有显著不同的特性，因为被膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。这一环境的一个益处是增加对洗涤剂和抗生素的抗性，因为，密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。

结合结构域：在本发明上下文中的术语“结合结构域”是指CBM18结合结构域，其优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和101至144或其等位基因变体或由其组成；或者是其片段，该片段具有壳多糖或肽聚糖结合活性。

催化结构域：术语“催化结构域”是指酶的含有该酶的催化机制的区域，该酶具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺活性。本发明的催化结构域优选为AA7氧化酶结构域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

就地清洁：“就地清洁”或“CIP”是用于在不拆卸设备的情况下清洁工艺设备或罐的内表面的方法。工艺设备可以是处理罐、储罐、管道、管道系统、热交换器、均化器、离心机、蒸发器、挤出机、冷却器、储罐、筛子、水力旋流器、过滤器单元和过滤膜。CIP也可用于运输液体食品(如乳或啤酒)的公路液罐车或用于屠宰场的设备中。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列连接。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。在一方面，该片段包含至少310个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸20至329)、至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸20至319)、或至少290个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO:2的氨基酸20至309)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。该术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，由于复制期间发生的突变，该后代与其亲本细胞不完全相同。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如，可以将宿主细胞进行遗传修饰来表达本发明多肽。来自宿主细胞的发酵液将包括分离的多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至632。SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面,成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸58至1945，或其cDNA序列。SEQ ID NO:1的核苷酸1至57编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作一致性百分比并且计算如下：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作一致性百分比并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

表面：如本文所用的术语“表面”涉及可充当微生物(如细菌和真菌)生长的支持物的任何表面。该表面可以被生物膜层覆盖。表面的实例可以是任何硬表面，例如金属、塑料、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料，这些材料任选地涂覆有例如油漆、搪瓷等；或任何软表面，如任何种类的纤维(纱线、纺织品、植物纤维、岩棉、毛发等)；或多孔表面；皮肤(人或动物)；角质材料(指甲等)。该硬表面可以存在于冷却塔、水处理厂、乳品加工厂、食品加工厂、化学品或药物加工厂的工艺设备构件中。该多孔表面可以存在于过滤器(例如膜滤器)中。因此，根据本发明的组合物和方法也可用于常规就地清洁(CIP)系统中。

严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的片段。

具体实施方式

具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少70％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少75％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少80％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少85％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少90％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少95％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少100％的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性。

在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的片段。在另一方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸？至？或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列]，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

可以根据本领域熟知的方法，使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针，以鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的、具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽进行编码的DNA。具体而言，此类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列，(iv)其全长互补体；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸所编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得分子的N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contractsite)氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；鲍依(Bowie)和萨奥尔(Sauer)，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所描述的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。

融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术(Biotechnology)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的来源

本发明的具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从…获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面中，从给定来源获得的多肽分泌至细胞外。

在一个方面中，该多肽是亚隔孢壳属(Didymella)多肽，例如从致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)获得的多肽。

应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，上文)。

催化结构域

在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸154至632具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的催化结构域。在一个方面中，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQID NO:2的氨基酸154至632相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。

该催化结构域优选地包括或其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸154到632或其等位基因变体；或是其具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的片段。

在另一个实施例中，本发明还涉及由在高严格条件(如以上所定义)下与(i)SEQID NO:1的核苷酸509到1945、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸所编码的催化结构域(萨姆布鲁克(Sambrook)等，1989，同上文)。

在另一个实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:1的核苷酸509到1945或其cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸所编码的催化结构域。

编码该催化结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸509至1945或由其组成。

在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸509至1945的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸154至632的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。

结合结构域

在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的结合结构域。在一个方面中，这些结合结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。

该结合结构域优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144或其等位基因变体，或者由其组成；或是其具有壳多糖或肽聚糖结合活性的片段。

在另一个实施例中，本发明还涉及由在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸82至262和/或350至481、(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的结合结构域(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

在另一个实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:1的核苷酸82至262和/或核苷酸350至481具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％，至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸所编码的结合结构域。

编码该结合结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸82至262和/或核苷酸350至481或由其组成。

在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或101至144的结合结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。

多核苷酸

本发明还涉及编码如在此所述的本发明的多肽、催化结构域或结合结构域的多核苷酸。在一个实施例中，编码本发明的多肽、催化结构域或结合结构域的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methodsand Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自亚隔孢壳属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及包含与一个或多个控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下的表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子包含介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其变体、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，从针对以下各项的基因获得有用的启动子：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。在罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488中描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。

控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子与编码该多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含相对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。

从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(Romanos)等人(1992，上文)描述。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母醹-因子的基因获得前肽编码序列。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

也可能令人希望的是添加调节序列，所述调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。在木霉属细胞中优选使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

优选地，宿主细胞是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫尔(Passmore)和达文波特(Davenport)编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

优选地，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

优选地，真菌细胞是曲霉菌细胞，并且更优选为黑曲霉或米曲霉细胞。

真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢菌属物种的适合方法在马拉迪耶(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及亨内恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一个方面中，该细胞是亚隔孢壳属细胞。在另一个方面中，该细胞是致命亚隔孢壳菌(Didymellaexitialis)细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地，(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一方面中，回收包含该多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种方法纯化多肽，所述方法包括但不限于色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，编者詹森(Janson)和赖登(Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达该多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括包含编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是包含一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

洗涤剂组合物

可以将本发明的多肽掺入洗涤剂组合物中用于在洗衣和餐具洗涤中应用。

本发明提供了一种用于抗微生物处理存在于衣物和/或用于浸泡、洗涤或漂洗衣物(例如，在洗衣机中)的液体中的微生物或病毒的方法。

在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括结合一种或多种额外的清洁组合物组分(例如像表面活性剂)的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。

对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

在一个实施例中，本发明针对ADW(自动餐具洗涤)组合物，该组合物包括结合一种或多种额外的ADW组合物组分(例如像表面活性剂)的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。

当应用于洗衣和/或ADW中时，用本发明的多肽的处理对洗衣机和ADW机器内的生物膜也具有抗微生物作用。因此，本发明的多肽可以应用于防止或减少洗衣机和/或ADW机器中生物膜形成的方法中。因此，本发明的多肽可以应用于防止或减少洗衣机和/或ADW机器中恶臭形成的方法中。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。合适的非离子表面活性剂可以是以下项中任一项：甘油衍生物、脱水山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖衍生物、脂肪酸乙氧基化物、脂肪酸乙氧基化物丙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物丙氧基化物、多元醇乙氧基化物的脂肪酸酯、封端的乙氧基化物、聚丙二醇和聚乙二醇。

该一种或多种表面活性剂典型地以按组合物的重量计从约0.1％至60％，例如按重量计约1％至约40％，如该组合物的从约5％至约30％，包括从约5％至约15％，或从约15％至约20％，或从约20％至约25％的水平存在。

助水溶物

该洗涤剂组合物可以含有助水溶物。助水溶剂是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。一般地，助水溶物具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲性质，如由表面活性剂已知的)。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶物。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

该洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地为40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂组合物中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。

漂白系统

洗涤剂组合物可以包含按重量计0-30％，例如约1％至约20％的漂白体系。可以使用本领域中已知用于洗涤剂组合物中使用的任何漂白体系。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―尿素(1:1)、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐、二过氧二羧酸、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白体系的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白体系，这些体系可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白体系可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白体系还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

其中每个R¹独立地是包含从9到24个碳的支链烷基或包含从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R¹独立地是包含从9到18个碳的支链烷基或包含从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。

优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

聚合物

本发明的洗涤剂组合物可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

甘露聚糖酶：适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶在WO1999/064619进行了描述。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、^*36D、V68A、N76D、N87S,R、^*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPurafectPurafectPurafect 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括如在EP 258068和EP 305216中所述的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些假单胞菌属中的一些现在重命名为伯克氏菌属)的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP 218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(WO 11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)的脂肪酶和始旋链霉菌(WO 12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，例如在EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508和WO 09/109500中所描述的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。

淀粉酶：可以与本发明的多肽一起使用的合适的淀粉酶可以是α淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌来源的或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

合适的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

另外的合适的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是那些在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2进行编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是那些在以下位置具有取代的变体：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181处具有缺失的那些。SEQ IDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

其中这些变体任选地进一步在位置241处包括取代和/或在位置178和/或位置179处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 10104675中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选变体是以下位置：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有取代N21D+D97N+V128I的那些，其中这些变体任选地进一步包括在位置200的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。

其他合适的淀粉酶是具有在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有90％序列一致性的其变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345及A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。

其他的实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

无尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚乙二醇(PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15个至80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪族醇，其中醇包含12个至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。

辅料

可以使用本领域中已知用于洗涤剂组合物中的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以使用本领域中已知用于洗涤剂组合物中的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。

分散剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker,Inc)。

染料转移抑制剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在受试组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从大约0.0001％至大约10％、从大约0.01％至大约5％或甚至从大约0.1％至大约3％的水平存在。

荧光增白剂

本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-GeigyAG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末洗涤剂(PowderedDetergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如修饰的纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

流变改性剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下各项组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如如在EP 2169040中所示。

其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，棒、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体。

洗衣皂条

本发明的酶组合物可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。

洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

共颗粒中酶的配制品

本发明的酶可以被配制为颗粒，例如，配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。

该多酶共颗粒可以包含本发明的酶和(a)一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：脂肪酶、纤维素酶、木葡聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、脂氧合酶、漆酶、半纤维素酶、蛋白酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、淀粉酶及其混合物。

底物来源

N-乙酰基-D-葡萄糖胺，本发明的酶的底物可以在若干来源中找到。当本发明的酶可以在例如发酵过程中或在食品生产中(例如在牛奶生产中)的就地清洗程序期间应用时，N-乙酰基-D-葡萄糖胺的合适来源通常将存在于环境中。

GlcNAc是聚合物壳多糖的单体单元，它形成昆虫和甲壳动物的外壳。壳多糖是一种多糖，它在自然界中十分丰富并且由β-1,4连接的N-乙酰基葡萄糖胺组成。它是软体动物的齿舌、头足类动物的喙的主要组分并且是大多数真菌和细菌的细胞壁的主要组分。外切壳多糖酶可用于从壳多糖中释放N-乙酰基葡萄糖胺。

此外，来自哺乳动物的乳(例如牛乳)含有毫摩尔浓度的N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸酯，该N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸酯在去磷酸化时产生N-乙酰基-D-葡萄糖胺(Belloque,J.，Villamiel,M.，López.A.，以及Olano,A(2001)Food Chemistry[食品化学]72:407-412)。乳还包含能够使N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸酯去磷酸化的磷酸酶。因此，暴露于使用本发明的多肽的清洁的存在于食物生产场所中的乳残留物(例如在牛奶场中)将给予底物(Burton等人(1988)在：Ultra-high-temperature processing of milk and milkproducts[乳和乳产品的超高温处理](第45-76页)，伦敦和纽约：Elsvier AppliedScience[爱思维尔应用科学]，Knight等人(1989)Journal of the Society of DairyTechnology[乳品技术学会期刊]，42,81-86)。

包含本发明的酶的组合物(例如洗涤剂组合物、消毒组合物和/或清洁组合物)还可以包含N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基葡萄糖胺的来源。此外，可以包括能够使N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸酯去磷酸化的磷酸酶。

其他用途

治疗人或动物

本发明的多肽可以在用于抗微生物处理存在于人或动物皮肤、毛发、口腔、腺体、粘膜、牙齿、眼睛、伤口或瘀伤上或其中的微生物或病毒的组合物中使用。

因此，本发明的多肽可以在有用于消毒的组合物中使用，例如，对痤疮或其他皮肤感染，眼睛或口腔感染，脚上、腋窝中微生物生长；牙齿(口腔护理)、伤口、瘀伤等的治疗。本发明的多肽可用于控制家畜(如牛、水牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡、公鸡和鸭)中或其上的细菌和/或真菌生长。具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽可用于施用于家畜皮肤上的组合物中，例如用于控制动物疾病，例如乳腺炎和乳房的表皮感染。

该组合物可以通过使用包含本发明的酶的气溶胶、液体、乳液、凝胶、浆液、糊剂或固体来施用。

化妆品、食品或饮料或其他产品的处理

本发明可用于以下项的保存：食品，饮料，化妆品如洗剂、霜剂、凝胶、软膏、皂、洗发剂、护发剂、止汗剂、除臭剂、漱口剂、隐形眼镜产品、足浴产品；酶制剂或食品成分，以及食品产品，例如乳制品。本发明可以按获得期望的抗微生物效果的有效量应用于未防腐的食品、饮料、化妆品、食品成分。

硬表面和CIP的处理

本发明提供了多肽和使用该多肽的处理方法，该多肽可用于如前所定义的任何硬表面的抗微生物处理。该处理可以应用于一般消毒目的，例如，消毒医院病房、手术室、食品加工室或其他需要消毒的设施。该硬表面还可以是冷却塔、水处理厂、乳品加工厂、食品或食品添加剂加工厂、化学品或药物加工厂的工艺设备构件。该硬表面还可以是医疗装置或水卫生设备。可以通过培养基使该多肽与所考虑的表面接触，并且该多肽应该以具有抗微生物作用的量存在。

本发明的多肽可以在就地清洗程序中施用。就地清洗(CIP)通常用于清洁生物技术制造、药品制造以及食品和饮料制造中使用的储罐、生物反应器、发酵罐、混合容器、管道和其他设备中。因此，本发明提供了一种抗微生物方法，该方法在常规的就地清洗系统中是有用的。

可重复、可靠且有效的清洗在制造设施方面是极其重要的。清洗程序经过验证以证实它们是有效的、可重现的和受控制的。为了充分地清洗加工设备，设备必须设计有光滑的不锈钢表面和具有可清洗接头的互连管道。清洗剂的清洗特性必须与被除去的残留物的化学和物理特性适当地相互作用。典型的CIP循环由许多步骤组成，这些步骤通常包括：

·用清洗水通量(clean water flux)冲洗/预漂洗，该清洗水通量可以被加热至60℃-80℃并再循环持续一段时间。

·苛性钠溶液在约60℃-80℃的温度下循环持续一段时间。

·用清洗水通量进行中间漂洗。

·循环酸性溶液持续一段时间。

·用清洗水通量进行最终漂洗。

·最后鼓风。

在CIP中使用刺激性化学品是不希望的，并且会对环境造成问题。在过去的多年中，已经开发了包括使用酶的CIP方法。专利申请WO 97/02753涉及一种包含用于就地清洗的蛋白酶和脂肪酶的溶液。已经发现该溶液在清洗含有乳或烧糊的乳的残留物的工艺设备中是有效的。

本发明的多肽可以作为消毒剂应用于此类CIP方法中。该多肽特别适用于在乳制品的加工设备中应用，因为乳残留物将为该多肽提供底物。

发酵培养基的处理

发酵培养物中的细菌污染导致生物燃料生产中的损失，其中乳杆菌属物种是主要污染物。本发明的多肽可用于控制此种污染，例如酵母乙醇发酵中的真菌和/或细菌污染。在其中啤酒酵母不受显著影响的浓度下，还在有限氧条件下(如在发酵过程中)，乳酸细菌易受DeCOx酶影响。

如实例中所示，本发明的多肽可应用于控制在发酵过程期间(例如淀粉源和/或其他可发酵糖的发酵过程期间)乳酸杆菌生长，这些其他可发酵糖例如来自甘蔗、玉米、高粱、小麦、大麦、马铃薯、木薯、稻、麦芽、葡萄、果汁和各种水果，以及来自木质纤维素来源，例如叶、木、甘蔗渣、麸、草、壳和种子。如在此所要求保护的发酵方法中使用本发明的多肽作为天然杀生物剂涉及用于生产第一和/或第二代燃料乙醇以及用于人类消费的乙醇(例如来自谷物和玉米的蒸馏醇，以及饮料如啤酒、葡萄酒等)的发酵方法。

在生产糖期间、在对淀粉源和/或木质纤维素源进行化学和/或酶水解期间，本发明的多肽也可用于控制微生物。糖可以用于例如发酵，用作甜味剂或用作生化工业的原料。

本发明进一步由以下段落描述。

1.一种具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及

(e)具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

2.如段落1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。

3.如段落1或2中任一段所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至632。

4.如段落1-3中任一段所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入。

5.如段落1-4中任一段所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中该片段具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性。

6.如段落1-5所述的多肽，其中该多肽另外具有N-乙酰基-D-半乳糖胺活性。

7.一种包括催化结构域的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸154至632具有至少75％序列一致性的催化结构域；

(b)由以下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的核苷酸509至1945、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域或其cDNA序列具有至少75％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸20至632的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及

(e)具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的片段。

8.如段落7所述的多肽，进一步包括结合结构域。

9.一种包括可操作地连接至催化结构域的结合结构域的多肽，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144具有至少75％序列一致性的结合结构域；

(b)由以下多核苷酸编码的结合结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的核苷酸82至262和/或核苷酸350至481、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的结合结构域，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸82至262和/或核苷酸350至481或其cDNA序列具有至少75％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸28至71和/或氨基酸101至144的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段，该片段具有壳多糖或肽聚糖结合活性。

10.如段落9所述的多肽，其中该催化结构域获自N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶、碳水化合物氧化酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、非水溶性葡聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

11.如段落1-10中任一段所述的多肽，该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的抗微生物活性。

12.如段落11所述的多肽，其中使用选自实例6、7、8或9中的方法的方法来评估该抗微生物活性。

13.如段落11-12所述的多肽，其中该抗微生物活性被评估为对真菌菌株炭黑曲霉BR00732(CBS 139193)和/或黑曲霉菌株BR00883(检索号CBS139194)中任一种的杀真菌或杀芽孢作用。

14.一种编码如段落1-13中任一段所述的多肽的多核苷酸。

15.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如段落14所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

16.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落14所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。

17.一种产生如段落1-14中任一段所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。

18.如段落17所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

19.一种产生具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落16所述的宿主细胞。

20.如段落19所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

21.一种用编码如段落1-13中任一段所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

22.一种产生具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落21所述的转基因植物或植物细胞。

23.如段落22所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

24.一种包括如段落1-13中任一段所述的多肽的组合物。

25.如前述段落所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。

26.如前述段落中任一段所述的组合物，该组合物是或包括以下发酵液配制品，该发酵液配制品包含如段落1-13中任一段所述的多肽。

27.一种清洗和/或消毒组合物，该组合物包含一种或多种具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽和表面活性剂。

28.根据段落27所述的组合物，其中该表面活性剂是一种或多种非离子表面活性剂。

29.根据段落28所述的组合物，其中该非离子表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：甘油衍生物、脱水山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖衍生物、脂肪酸乙氧基化物、脂肪酸乙氧基化物丙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物丙氧基化物、多元醇乙氧基化物的脂肪酸酯、封端的乙氧基化物、聚丙二醇和聚乙二醇。

30.根据段落24-29中任一段所述的组合物，其中该表面活性剂按重量计以该组合物的从约1％至约40％，如该组合物的从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约15％至约20％、或从约20％至约25％的量存在。

31.根据段落24-30中任一段所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种能够使N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸酯去磷酸化的酶。

32.根据段落24-31中任一段所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种N-乙酰基-D-葡萄糖胺的来源。

33.根据段落24-32中任一段所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种N-乙酰基-D-半乳糖胺的来源。

34.根据段落24-33中任一段所述的组合物，其中该组合物是液体组合物。

35.根据段落24-34中任一段所述的组合物，该组合物是衣物洗涤剂组合物。

36.根据段落24-35中任一段所述的组合物，该组合物包含如段落1-13中任一段所述的多肽。

37.一种清洗和/或消毒的方法，该方法包括应用如段落24-35中任一段所述的组合物。

38.根据段落37所述的方法，该方法是控制细菌和/或真菌生长的方法。

39.根据段落37或38所述的方法，该方法是控制发酵过程中细菌和/或真菌生长的方法。

40.根据段落37-39中任一段所述的方法，该方法是控制在酵母发酵中细菌和/或真菌生长的方法。

41.根据段落37-40中任一段所述的方法，该方法是控制在酵母发酵中乳酸杆菌生长的方法。

42.根据段落37-41中任一段所述的方法，其中该酵母发酵是用于醇生产的酵母发酵。

43.根据段落37所述的方法，用于抗微生物处理硬表面。

44.根据段落43所述的方法，其中该硬表面是需要消毒的设施。

45.根据段落44所述的方法，其中该设施是医院病房、用于加工食品或食品添加剂的室、水处理室、纸和/或纸浆加工室或用于化学品或药物加工的室。

46.根据段落45所述的方法，其中该硬表面是冷却塔、水处理厂、乳品加工设备、食品或食品添加剂加工厂、纸和/或纸浆加工厂、化学品或药物加工厂内的工艺设备。

47.根据段落46所述的方法，其中该硬表面是水卫生设备的表面。

48.根据段落47所述的方法，其中该硬表面是医疗装置的表面。

49.一种控制细菌和/或真菌生长的方法，所述方法包括应用具有酶活性并能够利用氨基酰基取代的糖作为氧化底物的多肽。

50.一种控制细菌和/或真菌生长的方法，所述方法包括应用具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽。

51.如段落50所述的方法，其中所述多肽进一步具有N-乙酰基-D-半乳糖胺氧化酶活性。

52.如段落50-51中任一段所述的方法，该方法包括加入N-乙酰基-D-葡萄糖胺的来源。

53.如段落50-52中任一段所述的方法，该方法包括加入N-乙酰基-D-半乳糖胺的来源。

54.如段落50-53中任一段所述的方法，该方法是控制在酵母发酵中细菌和/或真菌生长的方法。

55.如段落50-54中任一段所述的方法，其中该酵母发酵是酵母醇发酵。

56.如段落50-55中任一段所述的方法，该方法是控制在乳品工业中细菌和/或真菌生长的方法。

57.如段落50-56中任一段所述的方法，该方法是控制家畜，例如选自下组的动物中或其上的细菌和/或真菌生长的方法，该组由以下各项组成：牛、水牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡、公鸡和鸭子。

58.如段落50-57中任一段所述的方法，该方法包括将具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的该多肽应用于该家畜的皮肤上。

59.如段落50-58中任一段所述的方法，该方法是控制家畜疾病的方法，如选自下组的疾病，该组由以下各项组成：乳腺炎和乳房表皮感染。

60.如段落50-59中任一段所述的方法，该方法是用于预防、减少或除去表面上生物膜的方法。

61.如段落50-60中任一段所述的方法，其中该表面包括选自下组的材料，该组由以下各项组成：金属、玻璃、橡胶(天然橡胶或合成橡胶)、棉、塑料、PVC、丙烯酸树脂、尼龙、木材、棉、丙烯醛基、聚碳酸酯、pvc、聚丙烯、搪瓷、陶瓷、陶器、瓷器或瓷料。

62.如段落50-61中任一段所述的方法，其中该表面包括选自下组的材料，该组由以下各项组成：不锈钢、铁、铜、镁、铬、镍、铝、钛、钼铅、黄铜、锡、镀锌材料、锌、或其合金。

63.如段落50-62中任一段所述的方法，其中该表面是织物和/或纺织品。

64.一种用于清洗和消毒至少部分被生物膜层覆盖的表面的方法，该方法包括使该生物膜与包含一种或多种具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的组合物接触。

65.一种碳水化合物氧化酶用于清洗或消毒表面的用途，所述碳水化合物氧化酶对N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-半乳糖胺具有活性。

66.一种具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性和N-乙酰基-D-半乳糖胺的多肽用于清洗或消毒表面的用途。

67.根据段落65或66中任一段所述的用途，用于进行CIP。

68.根据段落51-67中任一段所述的方法、组合物或用途，其中具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的该多肽是与SEQ ID NO:2的成熟多肽和/或与SEQ ID NO:2的氨基酸154至632具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽。

实例

菌株

2011年在丹麦洛兰岛上的卡尔斯科夫(Keldskov)森林中分离出致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)真菌菌株。

培养基和溶液

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

培养基和溶液

YP+2％葡萄糖培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨以及2％葡萄糖构成。

PDA琼脂板由马铃薯浸出液(马铃薯浸出液是通过将300g切片的(经过洗涤但未削皮)的马铃薯在水中煮沸30分钟，并且然后将该培养液倾析或滤过粗滤布而制成)组成。然后添加蒸馏水，直到悬浮液的总体积为一升，随后添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(BacteriologicalAnalytical Manual)，第8版，修订A，1998)。

LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。

LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、和10g的氯化钠及补足至1升的去离子水构成。

COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM的乙酰胺、15mM的CsCl、曲通X-100(50μl/500ml)。

COVE盐溶液由26g的MgSO₄·7H₂O、26g的KCl、26g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水构成。

COVE痕量金属溶液由0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₄·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O、以及补足至1升的去离子水构成。

Dap-2C培养基由以下项构成：20g麦芽糖糊精、11g MgSO4.7H2O、1g KH2PO4、2g柠檬酸、5.2g K3PO4.H2O、0.5g酵母提取物(Difco)、1ml Dowfax 63N10(陶氏化学公司(DowChemical Company))、0.5ml KU6痕量金属溶液、2.5g CaCO3、以及补足到1升的去离子水。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological AnalyticalManual[细菌学分析手册]，第8版，修订A，1998)。使用之前，Dap-4C培养基中添加3.5ml无菌的50％(NH4)2HPO4和5ml无菌的20％乳酸/150ml培养基。

KU6痕量金属溶液由以下各项构成：0.13g NiCl2、2.5g CuSO4.5H2O、13.9gFeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、6.8g ZnCl2、3g柠檬酸、以及去离子水补足至1升。

用于使微生物测试菌株生长的MCS培养基：

1.0％蛋白胨、0.8％蛋提取物、0.4％酵母提取物、2.0％葡萄糖、0.5％乙酸钠三水合物、0.1％Tween 80、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.02％硫酸镁七水合物、0.005％硫酸锰四水合物

pH调至6.2，加入去离子水至1升。

通过向上述配制品中加入1.0％琼脂并在121℃下高压灭菌20分钟，然后冷却并倾倒培养基来制备MCS固体板。

实例1：鉴别致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)碳水化合物氧化酶编码基因

根据标准程序进行致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)的亿明达(Illumina)基因组测序。简言之，将基因组DNA分离为200bp-500bp的片段，并使用标准的亿明达(Illumina)程序产生100bp的配对末端读取。获得86,610,166个读取，共计产生7,868,752,110bp。然后使用GeneMark v2.3c来鉴别11344个基因。通过使用若干已知的PFAM蛋白序列作为查询序列(query)针对核酸序列进行TFasty搜索来鉴别DeCOx序列。Tfasty将蛋白质序列与DNA序列数据库进行比较，用正向和反向移码计算类似性，并允许密码子内的移码。Tfasty是FASTA3程序套组(Pearson，2000，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]132:185-219)的一部分。在蛋白质DeCOx上鉴别了多个结构域。通过与由NCBI，CDD(保守结构域(Conserved Domains)，Marchler-Bauer A等人(2013)，“CDD:conserved domains andprotein three-dimensional structure[CDD：保守结构域和蛋白质三维结构}”，NucleicAcids Res.[核酸研究]41(D1):D384-52提供的“COG0277”模块的同源性来鉴别DeCOx的催化结构域。OR_GMC N和C结构域由葡萄糖、甲醇和胆碱上的氧化还原酶活性限定(Pfam；PF00732和PF05199，在SEQ ID NO 1中)。这些结构域包括参与氧化还原反应的酶的催化区域(Pfam蛋白质家族数据库：R.D.Finn，A.Bateman，J.Clements，P.Coggill，R.Y.Eberhardt，S.R.Eddy，A.Heger，K.Hetherington，L.Holm，J.Mistry，E.L.L.Sonnhammer，J.Tate，M.Punta，Nucleic Acids Research[核酸研究](2014)。含COG0277FAD/FMN的脱氢酶。朝向氧化还原酶结构域的肽N端的区域含有属于CBM18家族的两个碳水化合物结合结构域(Boraston AB，Bolam DN，Gilbert HJ，Davies GJ(2004)Carbohydrate-binding modules：fine-tuning polysaccharide recognition[碳水化合物-结合模块：微调多糖识别]Biochem.J[生物化学期刊]382:769-781)。CBM18模块的已知特性是与壳多糖的相互作用)。使用以下示出的引物(实例3)通过PCR，从致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)基因组DNA克隆整个编码区的多肽编码序列。

实例2：致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)碳水化合物氧化酶的克隆和表达

编码全长致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)碳水化合物氧化酶肽(SEQ IDNO:2中的氨基酸残基1至632)的基因序列(SEQ ID NO:1中的DNA位置1至1948)被鉴别并插入大肠杆菌中。从大肠杆菌转化体纯化含有插入片段的表达质粒，并转化到米曲霉宿主细胞中。使经转换的宿主细胞在液体培养物中生长，并收获上清液。通过疏水相互作用层析、凝胶过滤和阴离子交换层析的组合来纯化酶。

实例2：致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)基因组DNA提取

将致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)在含有100ml YP+2％葡萄糖的500ml锥形摇瓶中培养。将培养物在旋转式摇床上以100rpm在26℃下摇动4天。在Miracloth(目录号475855-1R，Millapore公司)上收获菌丝体，并在-20℃下冷冻直到使用。

将冷冻的菌丝体在具有石英砂和液氮的预冷研钵中研磨成细粉末。凯杰公司(Qiagen)的DNeasy Plant Mini试剂盒用于从该菌丝体中提取和纯化DNA(目录号号69104，凯杰公司)。

实例3：含有编码氧化酶多肽的致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)基因组序列的米曲霉表达载体的构建

设计以下所示的两个合成寡核苷酸引物以从实例2中制备的基因组DNA来PCR扩增致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)DeCOx基因。使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(克罗泰克公司(Clontech)，Mountain View[山景]，加州，美国)将该片段直接克隆进表达载体pDau109中(WO 2005/042735)。

引物-F

ACACAACTGGGGATCCACC(SEQ ID NO:3)。

引物-R AGATCTCGAGAAGCTTA(SEQ ID NO:4)。

粗体字母代表编码序列。加下划线的序列与pDau109的插入位点是同源的。

Pfusion DNA多聚酶(来自New England Biolabs[新英格兰生物实验室]目录号ML0530L)用于片段扩增。该NE Biolabs Pfusion方案与所得混合物一起用于50uls

HF缓冲液(5X)10μL

水29.5μL

dNTP(10mM)1μL

Phusion pol.0.5μL

4μL的2.5μM浓度的引物-F正向克隆引物

4μL的2.5μM浓度的引物-R反向克隆引物

1μL gDNA

将反应置于BioRad Dyad PCR热循环仪中：运行以下程序：

·2min.98℃

·15sec.98℃

·15sec.60℃

·60sec.72℃

·转到步骤2进行35次

·5min.72℃

·保持10℃

使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1068bp产物带，并且根据厂商说明书，使用illustraPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences)，布隆德比，丹麦)进行纯化。然后使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒将该片段克隆进Hind III和Bam HI消化的pDau109中，生成质粒pDeCOx。根据制造商的方案，将处理的质粒和插入片段转化进Fusion Blue^TM大肠杆菌细胞(克罗泰克公司，山景，加州，美国)中，并且将其铺板在补充有50μg的氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，看到菌落在LB氨苄青霉素板上在选择下生长。将用构建体转化的10个菌落在补充有50μg的氨苄青霉素/ml的LB培养基中进行培养并且根据生产厂商的说明书，用JETQUICK^TM质粒纯化旋转试剂盒(Plasmid Purification Spin Kit)(GENOMED GmbH公司，勒讷德国)分离质粒。

将DeCOx基因克隆到Hind III-Bam HI消化的pDau109中，导致致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)DeCOx基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。NA2-tpi是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导子替换了未翻译的前导子。

将纯化的pDeCOx质粒DNA转化为米曲霉MT3568的原生质体，其根据Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422的方法进行制备。选择板由以下各项组成：COVE蔗糖+10mM乙酰胺+15mM CsCl+X-100(50μl/500ml)。在37℃下孵育这些平板。选择8个转化体并且将其接种到96微量滴定深孔板(Nunc A/S，罗斯基勒，丹麦)的独立的孔中，其中每个孔包含750μl的YP+2％葡萄糖培养基或750μl的YP+2％麦芽糊精。将该板用Nunc预锉刻痕(pre scored)的乙烯基密封带(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，罗斯基勒，丹麦)覆盖，并在26℃下静置孵育4天。选择板上的菌落也在COVE蔗糖(+10mM乙酰胺+15mM CsCl+X-100(50μl/500ml))上再划线。将这些板在37℃孵育，并重复此选择程序以使这些转化体稳定化。

如通过SDS-PAGE分析判断，若干米曲霉转化体产生SEQ ID NO:2的重组体DeCOx氧化酶。

实例4：含有编码碳水化合物氧化酶FgCOx的禾谷镰孢菌基因组序列的米曲霉表达载体的构建

为了比较的目的，也被报道使用GlcNAc作为底物(Heuts等人，2007，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]581,4905-4909)的禾谷镰孢菌碳水化合物氧化酶(FgCOx)被克隆并表达(SEQ ID NO:5)。用于克隆和表达的方法与实例3的DeCOx克隆一样，除了以下例外：从可从若干来源(包括Fungal Genetic Stock Center[真菌基因储存中心](堪萨斯城，MO 64110美国))获得的禾谷镰孢菌PH-1中分离DNA。

FgCOx的PCR克隆中使用的引物是从禾谷镰孢菌全基因组鸟枪法测序(The BroadInstitute[博德研究院])，蛋白质编码序列：EMBL：ESU17750.1设计的。设计的引物如下：

FgCOx-F 5’-

ACACAACTGGGGATCCACC(SEQ ID NO:6)。

FgCOx-R 5’-

CTAGATCTCGAGAAGCTT(SEQ ID NO:7)。

粗体字母代表编码序列。加下划线的序列与pDau109的插入位点是同源的。

实例5：FgCOx氧化酶的纯化和表征

使用PALL Ultrasette 10K截留悬浮筛通过超滤洗涤FgCOx的无菌过滤发酵液，以便获得低于3mS的电导率。将样品的pH调节至6，然后将其加载到具有在25mM MES(pH 6)中预平衡的20ml SP琼脂糖高性能培养基的XK16柱上。然后将该柱用缓冲液以10mL/min洗涤直到达到稳定的基线。使用从0至0.5M NaCl在25mM MES(pH 6)的线性梯度经10柱体积洗脱结合的蛋白质。收集10ml分馏物。将如通过SDS-PAGE、光谱法和活性测定法估计的含有纯氧化酶的分馏物合并并浓缩。将酶的浓缩溶液储存在-20℃下直到使用。所有纯化步骤均在室温下进行。

实例6：DeCOx氧化酶的纯化和表征

制备2升培养液用于纯化DeCOx酶。将命名为EXP9340的菌株划线到PDA平板上并在34℃下孵育2周。在5ml的0.01％20中去除孢子并且将4ml孢子悬浮液接种到3000ml(以全部DAP2C-1)中。使用500ml锥形摇瓶，其中每个烧瓶100ml的培养基体积。将接种过的摇瓶在26℃下以150rpm摇动孵育4天。通过经由0.22μm过滤器过滤收获上清液。

将无菌过滤的发酵液在硫酸铵中制成1.2M，并将pH调节至7.5，然后将其加载到具有在25mM Tris-HCl(pH 7.5)中与1.2M硫酸铵预平衡的20ml Phenyl ToyoPearl培养基的XK16柱上。然后将该柱用1.2M硫酸铵以10mL/min洗涤直到达到稳定的基线。将结合的蛋白用25mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱。收集10mL分馏物。合并了表明氧化酶的亮黄色分馏物。将合并的分馏物针对25mM Tris-HCl(pH 8.5)在5℃下透析过夜。将透析过的材料加载到具有用25mM Tris-HCl(pH 8.5)预平衡的20ml Q琼脂糖高性能的XK16柱上。将该柱用相同的缓冲液洗涤直到达到稳定的基线。使用从0至0.5M NaCl在25mM Tris-HCl(pH 8.5)的线性梯度经15柱体积洗脱结合的蛋白质。收集10ml分馏物。将如通过SDS-PAGE、光谱法和活性测定法估计的含有纯氧化酶的分馏物合并并浓缩。将酶的浓缩溶液储存在-20℃下直到使用。所有纯化步骤，除了透析之外，均在室温下进行。

使用用于检测由氧化酶反应产生的过氧化氢的用过氧化物酶的偶联测定法分光光度法地确定酶活性。测定在室温下在含有100μl 0.1M Britton-Robinson缓冲液(pH 3-10)、20μl 0.1M碳水化合物底物、20μl 6mM 4-氨基安替比林、20μl 15mM TOPS、40PODU/mlrCiP的96孔微量滴定板中进行。通过加入稀释至0.05g/L的20μl氧化酶溶液开始反应。使用来自Molecular Devices[分子设备公司]的现成的Vmax微升板在550nm下作为时间的函数在5分钟内测量吸收，并且将活性取为线性增加的斜率。

实例7：致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)氧化酶的抗微生物活性，RDA

如早先由Lehrer等人(Lehrer RI，Rosenman M，Harwig SS等人(1991)，“Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides[用于内源性抗微生物多肽的超灵敏测定]”，J Immunol Methods[免疫学方法杂志]137:167-73)所描述的，但在若干修改下，使用径向扩散测定法(RDA)测试DeCOx针对肉葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性。在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)(Oxoid，CM 131)板上划线来自冷冻原料的肉葡萄球菌(ATCC51365)或大肠杆菌(ATCC 10536)的接种物，并在37℃下孵育过夜。将菌落悬浮在0.9％NaCl中，并且将悬浮液调节至McFarland std 1(1.0ml BaCl2(1.175％)+99.0mlH2SO4(1％)，浊度相当于3x 10e8CFU/ml)。加入87％无菌甘油至终浓度为20％，并且细胞在-80℃下冷冻直至使用。在0.9％NaCl中制备冷冻原料的10倍稀释系列，并将100μl稀释液接种在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)(Oxoid，CM 131)板上用于估计每毫升的菌落形成单位。当制备RDA板时，将30mL具有1％琼脂糖的融化的1/10米勒-辛顿肉汤(Mueller-Hintonbroth)(MHB)(Sigma/Fluka[西格玛/Fluka公司]，90922)冷却至40℃，用肉葡萄球菌或大肠杆菌补充至约5.0×10⁵cfu/mL并且加入N-乙酰基-D-葡萄糖胺(Sigma Aldrich[西格玛奥德里奇公司]A4106)(GlcNAc)，然后倒入单孔Omnitray(Nunc)板中。该Omnitray板覆盖有一个TSP盖(Nunc)(带有96个附接的引脚)，并留待固化。去除TSP盖；留下96孔，其中可以测试10μL感兴趣的化合物。

每孔点10μl的测试溶液，并且将板在37℃下孵育过夜。第二天，透明区指示测试细菌不生长，由此指示抗微生物活性。通过用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑，一种黄色的四唑)着色将透明区可视化，MTT在活细胞中被还原为紫色的甲臜(Mosmann，Tim(1983),“Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival:application to proliferation and cytotoxicity assays[用于细胞生长和存活的快速比色测定：对增殖和细胞毒性分析的应用]”，Journal of ImmunologicalMethods[免疫学方法杂志]65(1-2):55-63)。这一着色为活细胞提供黑色着色并且不为没有活细胞的透明区提供着色。

10μl庆大霉素(100μg/ml)被包括作为阳性对照。观察到生长抑制，如表2中所列。

RDA测定显示在仅1mM GlcNAc存在下，检测到DeCOx针对肉葡萄球菌的显著的抗微生物活性。接种10μl的10-400μg/ml DeCOx防止所有测试浓度的肉葡萄球菌生长，并且从而导致大的透明区。透明区的大小与加入的GlcNAc和DeCOx的更高浓度成比例地增加。对于大肠杆菌，在10mM和50mM的GlcNAc以及测试的DeCOx的所有浓度(10-400μg/ml)的存在下观察到生长抑制。当在大肠杆菌径向扩散测定中加入1mM GlcNAc时，在接种物周围观察到仅非常小的透明区(<10mm)。因此，肉葡萄球菌(ATCC51365)比大肠杆菌(ATCC 10536)对DeCOx的抗微生物活性更敏感。

实例8.致命亚隔孢壳菌(Didymella exitialis)氧化酶的杀细菌作用

将肉葡萄球菌(ATCC 51365)和大肠杆菌(ATCC 10536)接种到米勒-辛顿肉汤(MHB)(Sigma/Fluka[西格玛/Fluka公司]，90922)中至约5.0×10⁵cfu/mL。细菌在37℃下在MHB、MHB+10mM N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、MHB+100μg/ml DeCOx或MHB+10mM GlcNAc和100μg/ml DeCOx中生长。在0h、2h、4h和24h时取出样品，并且制备在0.9％NaCl中的10倍稀释系列至10^-5。将来自每个稀释系列的100μl接种在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)(Oxoid，CM131)板上，并在37℃下孵育过夜。

CFU计数显示，在测试条件下，在GlcNAc和DeCOx的存在下，肉葡萄球菌和大肠杆菌都被杀死。孵育24h后，两种菌株的细胞量都低于100cfu/ml的检测限。相比之下，单独的DeCOx或GlcNAc的存在都对两种菌株的生长没有任何影响。

实例9.真菌杀孢子测定

将两种真菌菌株——碳黑曲霉BR00732(CBS 139193)和黑曲霉菌株BR00883(检索号CBS 139194)在26℃下的PDA培养基皮氏平板(petri plate)上生长，并允许其形成孢子持续若干天。向板中加入5ml具有0.1％Tween 80的去离子水，并且将孢子悬浮于该溶液中，然后转移至Falcon 2059管中。将甘油增加到10％作为深冷保存剂，并将孢子悬浮液在-20℃下等份冷冻直至进一步使用。

具有1％葡萄糖的Cove-N琼脂和具有1％葡萄糖和100mM GlcNAc的Cove-N琼脂在51mm皮氏平板中制备，每板5ml。

在以下缓冲液中制备纯化的DeCOx酶：25mM Tris pH 8.5 200mM NaCl。如通过OD280计算方法估计，浓度为10.48mg/l或163.47μM。

通过在液体Cove-N培养基中稀释制备DeCOx酶的100μM备料。将100μl的此备料施加到上述51mm皮氏平板上。溶液用无菌玻璃Drigalski刮刀均匀展开。允许酶在施加真菌孢子之前扩散至培养基中持续3小时。通过在PDA培养基上以在蒸馏水中的多种稀释液平板接种冷冻的孢子备料的稀释液，来估计在10％甘油中的真菌孢子悬浮液的每ml的能生存的孢子。使用500个-1000个孢子/ml的孢子稀释液，并且将100μl该稀释液接种到酶处理过的板上。

然后将板在30℃下孵育两天。

数据显示，与N-乙酰基-N-葡萄糖胺组合的DeCOx酶是杀孢子的，或使得两种真菌的孢子在所测试的条件下不能发芽。

实例10：在缺氧条件下选择性控制罗伊氏乳杆菌

使用啤酒酵母菌株和罗伊氏乳杆菌菌株。酿酒酵母CBS1171可从Centraalbureauvoor Schimmelcultures，Ultrect，荷兰获得。罗伊氏乳杆菌DSM20016可从The LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures[莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心]，Braunschweig[布伦瑞克]，德国获得。

微好氧的条件，其中可获得非常少的氧气，用Oxoid CampyGen(编号CN0025)在Oxoid 2.5升AnaeroJar(编号AG0025)中实现。

如实例9中制备DeCOx纯化的酶样品。通过用0.9％NaCl稀释全强度MRS培养基来制备具有5mM N-乙酰基-D-葡萄糖胺(Sigma Aldrich[西格玛奥德里奇公司]A4106)的3/4强度MRS培养基。

通过将来自新鲜皮氏平板培养物(PDA板，30℃孵育24小时)的酿酒酵母细胞悬浮在0.9％NaCl溶液中至约1.0的OD480来制备酿酒酵母起子培养物。

通过将细菌接种在Falcon 2059，12ml塑料管中的10ml MRS培养基中并用Parafilm^tm(Fischer Scientific公司，丹麦)密封盖子来制备罗伊氏乳杆菌起子培养物。将该管在30℃下静置孵育24小时。

将200μl的3/4MRS培养基(含或不含5mM GlcNAc)加入到无菌NUNC 96深孔培养板(Nunc 278752)中。在指示的孔中测试从0、6.35μM、12.7μM、25.4μM、50.8μM或101.6μM的酶的最终浓度。最后，将10μl的酵母或乳酸杆菌悬浮液根据下面所示的方案(表5)接种到深孔培养板(Nunc 278752)中。将该板置于2.5升Oxoid Anaero罐中，并在密封容器之前加入CampyGen体系。将Anaero罐在30℃下孵育24小时。将该深孔板中的细胞通过摇动重新悬浮持续1min，将100μl转移到平底MTW；COSTAR 3635微量滴定板上，并在VersaMax酶标仪(Molecular Devices Inc[分子设备公司])上在OD 480下测量。表5中所示的OD480值是其中已经减去MRS背景的校正值。

在N-乙酰基-D-葡萄糖胺的存在下，DeCOx酶强烈影响罗伊氏乳杆菌菌株。另一方面，酵母菌似乎不同样强烈地受DeCOx酶和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的组合作用的影响。此外，如通过抑制在OD 480下的光密度所判断的，为了实现抑制乳酸杆菌生长所需的酶量在6.35至超过100μM DeCOx之间的范围内。

序列表

<110> 诺维信A/S

<120> 具有N-乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽

<130> 12958-WO-PCT

<160> 7

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1948

<212> DNA

<213> 致命亚隔孢壳菌（Didymella exitialis）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(141)

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(57)

<223> 信号肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (58)..(1945)

<223> 成熟肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (82)..(144)

<223> 结合结构域

<220>

<221> 内含子

<222> (142)..(190)

<220>

<221> CDS

<222> (191)..(1945)

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (350)..(481)

<223> 结合结构域

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (509)..(1945 )

<223> 催化结构域

<400> 1

atg aaa ctc ttc ctc tct ctc gcg gcg agc gcc ctc gct ttc ggg gct 48

Met Lys Leu Phe Leu Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ala Phe Gly Ala

1 5 10 15

gtg acc gct gcg act gtc tcg cca gat ggc tcg tgt gct ggt act agc 96

Val Thr Ala Ala Thr Val Ser Pro Asp Gly Ser Cys Ala Gly Thr Ser

20 25 30

aag tac acc tgt gcg ggt agt ggc tat ggc aac tgt tgt tcg cag 141

Lys Tyr Thr Cys Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Asn Cys Cys Ser Gln

35 40 45

gtaagtttct gcccctcacc ccatctgtgt tggaaactga ttcttacag tat ggt tgg 199

Tyr Gly Trp

50

tgt ggt tct tca gac gcc cac tgt aag gct ggc tgc aac tct gct ttt 247

Cys Gly Ser Ser Asp Ala His Cys Lys Ala Gly Cys Asn Ser Ala Phe

55 60 65

ggc acc tgt gcc ggc gct gct tct tcg act ttg tct acc cgt tcc tcg 295

Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ser Ser Thr Leu Ser Thr Arg Ser Ser

70 75 80

act cgc cta gct cct tcg cct aca ccg tcc aag att gtc acc ccg gat 343

Thr Arg Leu Ala Pro Ser Pro Thr Pro Ser Lys Ile Val Thr Pro Asp

85 90 95

gct aca tgt ggt ggt agc aaa ggc tac aca tgc gct ggc agc tcg ttc 391

Ala Thr Cys Gly Gly Ser Lys Gly Tyr Thr Cys Ala Gly Ser Ser Phe

100 105 110

gga aac tgc tgc agc agc agc ggg tac tgc ggc act act aat gcc tac 439

Gly Asn Cys Cys Ser Ser Ser Gly Tyr Cys Gly Thr Thr Asn Ala Tyr

115 120 125 130

tgc gga tca ggg tgc cag tct gca ttc ggg agc tgt ggc aat ggt ggc 487

Cys Gly Ser Gly Cys Gln Ser Ala Phe Gly Ser Cys Gly Asn Gly Gly

135 140 145

acc gtc acg agc aaa act acc tct gct tct gct tct gcg tct gcg acc 535

Thr Val Thr Ser Lys Thr Thr Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Thr

150 155 160

ccg tct ggc tcg gtc ctt cag tgc ttg aat gga aag aat gtg ccg tac 583

Pro Ser Gly Ser Val Leu Gln Cys Leu Asn Gly Lys Asn Val Pro Tyr

165 170 175

aag atg acg tct gac ggc gag tac gac gcg ctt gtg agg cct tac aat 631

Lys Met Thr Ser Asp Gly Glu Tyr Asp Ala Leu Val Arg Pro Tyr Asn

180 185 190

ctc gcc atc tcg ttc aag cca tcc gtg gtc gtg ctc ccg cag acc cag 679

Leu Ala Ile Ser Phe Lys Pro Ser Val Val Val Leu Pro Gln Thr Gln

195 200 205 210

cag aac atc cag gac gct gtc gta tgc gcc ggg cag tct ggc ctc aag 727

Gln Asn Ile Gln Asp Ala Val Val Cys Ala Gly Gln Ser Gly Leu Lys

215 220 225

gtc cag gcc aag tcg ggc ggc cat tct tac gcc agc ttc agc tct ggc 775

Val Gln Ala Lys Ser Gly Gly His Ser Tyr Ala Ser Phe Ser Ser Gly

230 235 240

ggt aaa gac ggc tcc atg atg atc agc ctc cag acg ttt cag aag gtc 823

Gly Lys Asp Gly Ser Met Met Ile Ser Leu Gln Thr Phe Gln Lys Val

245 250 255

gag ctc aac gcc aac acc ggc att gcc aag gtc ggt ggt ggt gtg cgt 871

Glu Leu Asn Ala Asn Thr Gly Ile Ala Lys Val Gly Gly Gly Val Arg

260 265 270

ctc gga aac ctc gct gat ggc atc tat act caa ggc cag aag ggt ctg 919

Leu Gly Asn Leu Ala Asp Gly Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Lys Gly Leu

275 280 285 290

tct cac gga act tgc cct ggt gtc gga atc gga ggc cac ttc acg cac 967

Ser His Gly Thr Cys Pro Gly Val Gly Ile Gly Gly His Phe Thr His

295 300 305

ggc ggc tac ggc cac aca tcg cgg cat tgg ggt ctt gcc atg gat cag 1015

Gly Gly Tyr Gly His Thr Ser Arg His Trp Gly Leu Ala Met Asp Gln

310 315 320

atc gtg tct gcg gac gtt gtg ctg gca gat ggc tcc ctc gtg aca gca 1063

Ile Val Ser Ala Asp Val Val Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val Thr Ala

325 330 335

tca gca aca cag aac agt gaa att ttc tgg gcg atc cgg ggc gcc gcc 1111

Ser Ala Thr Gln Asn Ser Glu Ile Phe Trp Ala Ile Arg Gly Ala Ala

340 345 350

gac tcg ttc ggt atc gtg acc aac ttc tac ctg cag aca caa gca gca 1159

Asp Ser Phe Gly Ile Val Thr Asn Phe Tyr Leu Gln Thr Gln Ala Ala

355 360 365 370

ccc tcg agc atc aca tac ttt gcg ttt gca ttc cca gcc gta tgg aac 1207

Pro Ser Ser Ile Thr Tyr Phe Ala Phe Ala Phe Pro Ala Val Trp Asn

375 380 385

acg aag gcg acc ttc acc aac tcg ttc ctg cac atc cag gac ttc gcc 1255

Thr Lys Ala Thr Phe Thr Asn Ser Phe Leu His Ile Gln Asp Phe Ala

390 395 400

acc aac gcg agt gtc att gac aac cgc atc tca ttc ggc atc tac atg 1303

Thr Asn Ala Ser Val Ile Asp Asn Arg Ile Ser Phe Gly Ile Tyr Met

405 410 415

gac aac tac ggc acc tac agc ctc agt ggc gcc ttt ttc ggc tcc gtc 1351

Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Ala Phe Phe Gly Ser Val

420 425 430

gac gag ttc aac tcg aag atc aag ccc gag ctc ctc cgc acg ctc ccc 1399

Asp Glu Phe Asn Ser Lys Ile Lys Pro Glu Leu Leu Arg Thr Leu Pro

435 440 445 450

aca cca acg gac ccc acc gtc aaa gcc tac agc tgg gtc gac tac ctc 1447

Thr Pro Thr Asp Pro Thr Val Lys Ala Tyr Ser Trp Val Asp Tyr Leu

455 460 465

gtc ctc gta tcc ggc aag aac acg atc aaa gtc cca ctg acc aac tac 1495

Val Leu Val Ser Gly Lys Asn Thr Ile Lys Val Pro Leu Thr Asn Tyr

470 475 480

gac gac cac gaa gac ttc ttt gcg aaa tcc atc aca gtc ccc gag tcg 1543

Asp Asp His Glu Asp Phe Phe Ala Lys Ser Ile Thr Val Pro Glu Ser

485 490 495

acc ggc ctc aca gca tcg gcc ctc aac gcc ttc tac gac aaa gtc cgc 1591

Thr Gly Leu Thr Ala Ser Ala Leu Asn Ala Phe Tyr Asp Lys Val Arg

500 505 510

ggc aca agc acc gag ttc ttc acc atc atc aac cta tac ggt gga ccc 1639

Gly Thr Ser Thr Glu Phe Phe Thr Ile Ile Asn Leu Tyr Gly Gly Pro

515 520 525 530

ggc agc gcc atc aac gcg cgc gac acc gac ttt gcg gcc tac tcg gac 1687

Gly Ser Ala Ile Asn Ala Arg Asp Thr Asp Phe Ala Ala Tyr Ser Asp

535 540 545

cgc gac agc ctg tgg gtg ttc cag aac tac gga tac acg tcg tcg aca 1735

Arg Asp Ser Leu Trp Val Phe Gln Asn Tyr Gly Tyr Thr Ser Ser Thr

550 555 560

aag gat ttc gtc aac ggc atc aac agc gcc att atc aac gcg cag cca 1783

Lys Asp Phe Val Asn Gly Ile Asn Ser Ala Ile Ile Asn Ala Gln Pro

565 570 575

cag acg gcg ttt ggc gcg tac ctt aac tac gtc gat ccc tcg tat gat 1831

Gln Thr Ala Phe Gly Ala Tyr Leu Asn Tyr Val Asp Pro Ser Tyr Asp

580 585 590

gca gcg acg gcg cat cgg ctg tac tat ggt gat gcg ttg tat gcg cgt 1879

Ala Ala Thr Ala His Arg Leu Tyr Tyr Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Arg

595 600 605 610

ctt gct gca ctg aag aag aag gtc gat ccc aag gcg gtc ttt tgg aac 1927

Leu Ala Ala Leu Lys Lys Lys Val Asp Pro Lys Ala Val Phe Trp Asn

615 620 625

ccg cag gcc att ggc gcg tag 1948

Pro Gln Ala Ile Gly Ala

630

<210> 2

<211> 632

<212> PRT

<213> 致命亚隔孢壳菌（Didymella exitialis）

<400> 2

Met Lys Leu Phe Leu Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ala Phe Gly Ala

1 5 10 15

Val Thr Ala Ala Thr Val Ser Pro Asp Gly Ser Cys Ala Gly Thr Ser

20 25 30

Lys Tyr Thr Cys Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Asn Cys Cys Ser Gln Tyr

35 40 45

Gly Trp Cys Gly Ser Ser Asp Ala His Cys Lys Ala Gly Cys Asn Ser

50 55 60

Ala Phe Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ser Ser Thr Leu Ser Thr Arg

65 70 75 80

Ser Ser Thr Arg Leu Ala Pro Ser Pro Thr Pro Ser Lys Ile Val Thr

85 90 95

Pro Asp Ala Thr Cys Gly Gly Ser Lys Gly Tyr Thr Cys Ala Gly Ser

100 105 110

Ser Phe Gly Asn Cys Cys Ser Ser Ser Gly Tyr Cys Gly Thr Thr Asn

115 120 125

Ala Tyr Cys Gly Ser Gly Cys Gln Ser Ala Phe Gly Ser Cys Gly Asn

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Ser Lys Thr Thr Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ala Thr Pro Ser Gly Ser Val Leu Gln Cys Leu Asn Gly Lys Asn Val

165 170 175

Pro Tyr Lys Met Thr Ser Asp Gly Glu Tyr Asp Ala Leu Val Arg Pro

180 185 190

Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Phe Lys Pro Ser Val Val Val Leu Pro Gln

195 200 205

Thr Gln Gln Asn Ile Gln Asp Ala Val Val Cys Ala Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Leu Lys Val Gln Ala Lys Ser Gly Gly His Ser Tyr Ala Ser Phe Ser

225 230 235 240

Ser Gly Gly Lys Asp Gly Ser Met Met Ile Ser Leu Gln Thr Phe Gln

245 250 255

Lys Val Glu Leu Asn Ala Asn Thr Gly Ile Ala Lys Val Gly Gly Gly

260 265 270

Val Arg Leu Gly Asn Leu Ala Asp Gly Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Lys

275 280 285

Gly Leu Ser His Gly Thr Cys Pro Gly Val Gly Ile Gly Gly His Phe

290 295 300

Thr His Gly Gly Tyr Gly His Thr Ser Arg His Trp Gly Leu Ala Met

305 310 315 320

Asp Gln Ile Val Ser Ala Asp Val Val Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val

325 330 335

Thr Ala Ser Ala Thr Gln Asn Ser Glu Ile Phe Trp Ala Ile Arg Gly

340 345 350

Ala Ala Asp Ser Phe Gly Ile Val Thr Asn Phe Tyr Leu Gln Thr Gln

355 360 365

Ala Ala Pro Ser Ser Ile Thr Tyr Phe Ala Phe Ala Phe Pro Ala Val

370 375 380

Trp Asn Thr Lys Ala Thr Phe Thr Asn Ser Phe Leu His Ile Gln Asp

385 390 395 400

Phe Ala Thr Asn Ala Ser Val Ile Asp Asn Arg Ile Ser Phe Gly Ile

405 410 415

Tyr Met Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Ala Phe Phe Gly

420 425 430

Ser Val Asp Glu Phe Asn Ser Lys Ile Lys Pro Glu Leu Leu Arg Thr

435 440 445

Leu Pro Thr Pro Thr Asp Pro Thr Val Lys Ala Tyr Ser Trp Val Asp

450 455 460

Tyr Leu Val Leu Val Ser Gly Lys Asn Thr Ile Lys Val Pro Leu Thr

465 470 475 480

Asn Tyr Asp Asp His Glu Asp Phe Phe Ala Lys Ser Ile Thr Val Pro

485 490 495

Glu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Ser Ala Leu Asn Ala Phe Tyr Asp Lys

500 505 510

Val Arg Gly Thr Ser Thr Glu Phe Phe Thr Ile Ile Asn Leu Tyr Gly

515 520 525

Gly Pro Gly Ser Ala Ile Asn Ala Arg Asp Thr Asp Phe Ala Ala Tyr

530 535 540

Ser Asp Arg Asp Ser Leu Trp Val Phe Gln Asn Tyr Gly Tyr Thr Ser

545 550 555 560

Ser Thr Lys Asp Phe Val Asn Gly Ile Asn Ser Ala Ile Ile Asn Ala

565 570 575

Gln Pro Gln Thr Ala Phe Gly Ala Tyr Leu Asn Tyr Val Asp Pro Ser

580 585 590

Tyr Asp Ala Ala Thr Ala His Arg Leu Tyr Tyr Gly Asp Ala Leu Tyr

595 600 605

Ala Arg Leu Ala Ala Leu Lys Lys Lys Val Asp Pro Lys Ala Val Phe

610 615 620

Trp Asn Pro Gln Ala Ile Gly Ala

625 630

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-F

<400> 3

acacaactgg ggatccacca tgaaactctt cctctctctc gcgg 44

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-F

<400> 4

agatctcgag aagcttacgc gccaatggcc tgcgg 35

<210> 5

<211> 492

<212> PRT

<213> 禾谷镰孢菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(19)

<223> 信号肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (20)..(492)

<223> 成熟肽

<400> 5

Met His Phe Asn Thr Leu Thr Cys Val Leu Val Gly Leu Val Ala His

1 5 10 15

Thr Ser Ala Val Pro Thr Lys Arg Glu Ala Val Asn Ser Cys Leu Thr

20 25 30

Gln Ala Lys Val Pro Thr Asp Ala Gln Gly Ser Gln Ser Trp Lys Glu

35 40 45

Asp Gly Thr Ala Tyr Asn Leu Arg Leu Pro Phe Glu Pro Ala Ala Ile

50 55 60

Ala Val Pro Thr Thr Val Ala Gln Val Ser Ala Ala Val Glu Cys Gly

65 70 75 80

Ala Lys His Gly Val Ala Ile Ser Ala Lys Ser Gly Gly His Ser Tyr

85 90 95

Thr Ser Leu Gly Phe Gly Gly Glu Asp Gly His Leu Met Ile Glu Leu

100 105 110

Asp Arg Met Tyr Ser Val Lys Leu Ala Lys Asp Gly Thr Ala Lys Ile

115 120 125

Gln Pro Gly Ala Arg Leu Gly His Val Ala Thr Glu Leu Trp Asn Gln

130 135 140

Gly Lys Arg Ala Leu Ala His Gly Thr Cys Pro Gly Val Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly His Ala Leu His Gly Gly Tyr Gly Met Val Ala Arg Lys His Gly

165 170 175

Leu Thr Leu Asp Leu Met Ile Gly Ala Thr Val Val Leu Pro Thr Gly

180 185 190

Lys Val Val His Cys Ser Lys Thr Glu Asn Ser Asp Leu Phe Trp Gly

195 200 205

Ile Arg Gly Ala Gly Ala Asn Phe Gly Val Val Val Glu Leu Glu Phe

210 215 220

Gln Thr Phe Ala Ala Pro Glu Lys Ile Thr Tyr Phe Asp Ile Gly Leu

225 230 235 240

Asn Trp Asp Gln Asn Thr Ala Pro Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gln Glu

245 250 255

Phe Gly Lys Gly Met Pro Ala Glu Ile Thr Met Gln Met Gly Val Ser

260 265 270

Lys Asn Gly Tyr Ser Val Asp Gly Ala Tyr Ile Gly Asp Glu Ala Ser

275 280 285

Leu Arg Lys Ala Leu Gln Pro Leu Val Gln Lys Phe Gly Gly Val Gln

290 295 300

Val Thr Ala Thr Thr Val Asp Trp Met Gly Leu Val Thr His Phe Ala

305 310 315 320

Gly Ala Gly Val Asn Val Asn Pro Thr Ser Ala Ser Tyr Asp Ala His

325 330 335

Asp Asn Phe Tyr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Pro Ala Leu Thr Leu Ala

340 345 350

Glu Phe Lys Ser Phe Val Asn Phe Val Ser Thr Thr Gly Lys Ser Ser

355 360 365

Ser His Ser Trp Trp Leu Gln Met Asp Ile Thr Gly Gly Thr Tyr Ser

370 375 380

Ala Val Ser Lys Pro Lys Pro Ser Asp Thr Ala Tyr Val His Arg Asp

385 390 395 400

Thr Leu Leu Leu Phe Gln Phe Tyr Asp Ser Val Ala Ala Thr Ala Gln

405 410 415

Tyr Pro Ser Asp Gly Phe Asn Leu Ile Lys Gly Leu Arg Gln Ser Ile

420 425 430

Ser Ser Ser Leu Lys Ala Gly Thr Trp Gly Met Tyr Ala Asn Tyr Pro

435 440 445

Asp Ser Gln Ile Lys Asn Asp Arg Ala Thr Glu Met Tyr Trp Gly Ser

450 455 460

Asn Val Ala Lys Leu Glu Ala Val Lys Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Asn

465 470 475 480

Leu Phe Arg Asn Pro Gln Ser Ile Lys Pro Lys Ala

485 490

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-F

<400> 6

acacaactgg ggatccacca tgcatttcaa tactttgaca tg 42

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-R

<400> 7

ctagatctcg agaagcttct aagccttagg cttaatagac 40

Claims (15)

1.一种具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；以及

(d)具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。

3.如权利要求1或2中任一项所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至632。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的抗微生物活性。

5.如权利要求4所述的多肽，其中使用选自实例6、7、8或9中的方法的方法来评估该抗微生物活性。

6.如权利要求4或5所述的多肽，其中该抗微生物活性被评估为对真菌菌株炭黑曲霉BR00732(CBS 139193)和黑曲霉菌株BR00883(检索号CBS 139194)中任一种的杀真菌或杀芽孢作用。

7.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽。

8.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求7所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导如权利要求1-6中任一项所述的多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

9.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求7所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导如权利要求1-6中任一项所述的多肽的产生的一个或多个控制序列。

10.一种产生具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求9所述的宿主细胞。

11.如权利要求10所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

12.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-6中任一项所述的多肽。

13.一种清洗和/或消毒的方法，该方法包括应用如权利要求12所述的组合物。

14.如权利要求13所述的方法，该方法是就地清洗。

15.一种清洗组合物，该清洗组合物由如权利要求1-6中任一项所述的多肽和一种或多种在清洗组合物中使用的成分例如表面活性剂组成。