BE1008998A3 - Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une lipase provenant d'une souche de Pseudomonas. Cette lipase est active dans une large gamme de pH alcalin. L'invention concerne également des nouvelles souches de microorganismes produisant cette lipase et des procédés de préparation de cette lipase. L'invention concerne également des utilisations celle-ci et les compositions contenant celle-ci.
Description
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Lipase. microorganisme la produisant. procédé de préparation de cette lipase et utilisations de celle-ci
L'invention concerne une nouvelle lipase. L'invention concerne également une nouvelle souche de microorganisme produisant cette lipase.
L'invention concerne également les procédés de préparation de cette lipase, les utilisations de celle-ci et les compositions comprenant celle-ci. n est connu d'inclure des lipases dans les compositions détergentes en vue d'éliminer les dépôts gras des tissus (Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645). Ces dépôts gras contiennent des triglycérides apportés, par exemples, par le sébum, les différents produits alimentaires (huile, sauce, beurre, matières grasses), les produits cosmétiques. Les lipases hydrolysent les triglycérides en formant des produits plus solubles dans l'eau, mono-et di-glycérides, glycérol et acides gras libres.
Des lipases utilisables dans des compositions détergentes sont connues, telles que notamment des lipases provenant de souches de Pseudomonas, par exemples la lipase produite par la souche de Pseudomonas stutzeri (demande de brevet britanique 1372034), la lipase produite par la souche de Pseudomonas mendocina (demande de brevet européen 0 571 982), la lipase produite par la souche de Pseudomonas alcaligenes (brevet US 5,063, 160), et la lipase produite par la souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes (demande de brevet européen 0 218 272). Cependant, malgré les propriétés de ces lipases, les compositions détergentes contenant ces enzymes sembleraient peu efficaces.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour une lipase utilisable dans le domaine de la détergence, très stable et également très active dans une large gamme de pH et de température. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses, et cela à faible dose d'enzyme. De plus, il y a également un besoin pour une lipase particulièrement efficace sur les taches grasses dès les premiers cycles de lavage.
La présente invention a pour but de fournir une nouvelle lipase, active dans une large gamme de température, active dans une large gamme de pH alcalin, et efficace dès le premier cycle de lavage.
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La présente invention a également pour but d'identifier, isoler et fournir une souche, en particulier une souche de Pseudomonas, qui produit naturel- lement ladite lipase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir une composition contenant cette lipase, et en particulier une composition détergente.
A cet effet, la présente invention concerne une lipase, isolée et purifiée, provenant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. La présente invention concerne également une lipase, isolée et purifiée, provenant d'un dérivé ou d'un mutant d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis capable de produire cette lipase. De préférence la lipase de l'invention provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase. La lipase de l'invention est dérivée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. La lipase est classifiée dans le système international sous le numéro E. C. 3.1. 1.3. ; il s'agit d'une glycérol ester hydrolase.
De préférence, la lipase, isolée et purifiée, a un poids moléculaire d'environ 30 kDa. Elle est essentiellement extracellulaire.
La séquence N-terminale d'acides aminés (SEQ ID NO : 1) de la lipase de l'invention est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly 1 5 10 15 Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20
L'invention concerne une lipase qui provient d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose.
L'invention concerne une lipase, isolée et purifiée, comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 286 acides aminés (SEQ ID NO : 4) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3), est donnée à la figure 1 (figures la et lb).
La lipase de l'invention est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur contient 308 acides aminés (SEQ ID NO : 7). On identifie la
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séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la lipase, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6). La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
Le précurseur contient la séquence de 286 acides aminés (SEQ ID NO : 4) de la lipase mature et la séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10) de la préséquence.
La séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence. Il s'agit d'une séquence additionnelle de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10).
On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO : 8), ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 9). Cette préséquence code pour le peptide signal de la lipase de l'invention.
De manière préférée, ladite lipase a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,8 et environ 10,1. De manière particulièrement préférée, ladite lipase a un point isoélectrique estimé égal à environ 9,95.
La lipase de l'invention est active dans une large gamme de température. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température supérieure à environ 40 C. La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température inférieure à environ 60 C. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température comprise entre environ 40 C et environ 60 C. De manière particulièrement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH d'environ 9,5,
à une température d'environ 55 OC.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 C et environ 60 C pour un pH d'environ 9,5, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une
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température de 55 C et à un pH de 9, 5.
La lipase de l'invention est active dans une large gamme de pH alcalin.
Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C,
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dans une gamme de pH supérieur ou égal à environ 8. Habituellement, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH inférieur ou égal à environ 10. Plus particulièrement, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ
8 et environ 10.
De manière particulièrement préférée, la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ
8 et environ 9,5.
La lipase, isolée et purifiée, de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 85 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 oC, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 30 C et à un pH de 9,5.
La lipase de l'invention est thermostable à un pH alcalin. En effet, la lipase, isolée et purifiée, de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions.
Par activité enzymatique relative, on entend le rapport entre l'activité enzymatique, mesurée au cours d'un essai réalisé dans des conditions données de pH, température, substrat et durée, et l'activité enzymatique maximale mesurée au cours de ce même essai, l'activité enzymatique étant mesurée à partir de l'hydrolyse de la trioléine et l'activité enzymatique maximale étant fixée arbitrairement à la valeur de 100.
L'invention concerne également une lipase modifiée, c'est-à-dire une enzyme dont la séquence en acides aminés diffère de celle de l'enzyme sauvage par au moins un acide aminé. Ces modifications peuvent être obtenues par des techniques classiques de mutagénèse sur l'ADN, telles que l'exposition à des rayonnements ultra-violets, à des produits chimiques, tels
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que l'éthyl méthane sulfonate (EMS), te N-méthyl-N-nitro-N-mtrosoguanidine (MNNG), le nitrite de sodium ou l'O-méthylhydroxylamine ou par des techniques de génie génétique, comme, par exemple, la mutagénèse dirigée
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ou la mutagénèse aléatoire.
Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition,
1989, chapitre 15.
L'invention concerne également une lipase mutée obtenue par modification de la séquence de nucléotides du gène qui code pour la lipase. Les techniques d'obtention de telles lipases mutées sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, chapitre 15.
L'invention concerne également une lipase ayant des propriétés immunochimiques identiques ou partiellement identiques à la lipase obtenue à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. Les propriétés immunochimiques peuvent être déterminées de façon immunologique par des tests d'identité, notamment en utilisant des anticorps spécifiques, polyclonaux ou monoclonaux. Des tests d'identité sont connus de l'homme du métier, tels que notamment la méthode d'immunodiffusion d'Ouchterlony, ou la méthode d'immunoélectrophorèse. Des exemples de telles méthodes sont décrits par Axelsen N.
H., Handbook of Immunoprecipitation Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, 1983, chapitres 5 et 14, les termes"identité antigénique"et"identité antigénique partielle"sont décrits dans ce document aux chapitres 5,19 et 20. Un sérum contenant l'anticorps spécifique est préparé selon la méthode décrite en immunisant des animaux (par exemples souris, lapin ou chèvre) avec une préparation de lipase purifiée. Cette préparation peut être mélangée avec un additif, tel que l'adjuvant de Freund, et le mélange obtenu est injecté à des animaux. L'anticorps polyclonal est obtenu après une ou plusieurs immunisations. Un exemple consiste à injecter, de façon sous cutanée à deux semaines d'intervalle, quatre fractions contenant chacune 150 microgrammes de lipase purifiée, l'immunisation dure alors 8 semaines.
Le sérum est prelevé après la période d'immunisation et l'immunoglobuline peut être isolée selon la méthode décrite par Axelsen N. H. (1983).
La présente invention concerne également l'isolement, l'identification et la fourniture d'une nouvelle bactérie produisant la lipase. Cette bactérie aérobie a été isolée et purifiée. Généralement elle appartient à la famille des
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Pseudomonadaceae. De préférence elle appartient au genre Pseudomonas.
De manière particulièrement préférée, il s'agit d'une souche de Pseudo- monas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus avec la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche.
Par dérivé de cette souche, on entend toute bactérie modifiée naturellement, c'est-à-dire par sélection naturelle. Par mutant de cette souche, on entend toute bactérie modifiée artificiellement. Les mutants de cette souche peuvent être obtenus par les techniques connues de modification, telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique.
Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15. Des exemples d'agents mutagènes sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie-K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994. L'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis et une culture dérivée ou mutée de celle-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et une culture dérivée ou mutée de celle-ci.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques. Il s'agit d'une bactérie Gram négatif, aérobie. Elle ne se développe pas en anaérobiose. Aucune spore n'est formée. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tétraméthyl-l, 4-phénylène-diammoniumdichlorure. Cette bactérie n'est pas thermophile. Elle ne produit pas de gaz à partir de glucose.
L'invention concerne également l'isolement et la fourniture d'une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
Par séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN, on entend toute molécule d'ADN obtenue par modification d'un ou de plusieurs nucléotides
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du gène qui code pour la lipase de l'invention. Les techniques d'obtention de telles séquences sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-
SAMBROOK, FRISCH, MANIATIS - second edition, 1989, chapitre 15.
Habituellement, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 70 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) du gène qui code pour la lipase de l'invention, c'est-à-dire au moins 70 % de nucléotides identiques et ayant la même position dans la séquence. De préférence, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 80 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) du gène qui code pour la lipase de l'invention.
De manière particulièrement préférée, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 90 % d'homologie avec la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) du gène qui code pour la lipase de l'invention.
Habituellement, la molécule d'ADN, selon l'invention, comprend au moins la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) qui code pour le précurseur de la lipase ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. Cette séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et sa séquence signal (préséquence) (SEQ ID NO : 8). De préférence, cette molécule d'ADN comprend tout le gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une lipase. Ce procédé comprend la culture d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la lipase ainsi obtenue. Ce milieu de culture peut être solide ou liquide. De préférence le milieu de culture est liquide. Habituellement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase. Plus particulièrement, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wisconsinensis ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.
De préférence, la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.
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Les conditions de culture de ces bactéries, qui permettent d'obtenir la lipase de l'invention, telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples de conditions de culture sont notamment décrits dans la demande de brevet européen 0 571 982.
Les techniques de récolte de la lipase sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la lipase. Habi- tellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La lipase peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées. Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La lipase peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant la lipase selon l'invention et au moins un additif. Selon les utilisations envisagées, les compositions enzymatiques comprenant la lipase de la présente invention peuvent être sous forme solide ou liquide.
Les additifs, compris dans la composition selon l'invention, sont connus de l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition. Ils doivent êtr compatibles avec la lipase et ne pas affecter l'activité enzymatique de la lipase. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants de l'enzyme, des agents de conservation et des agents de formulation. Des exemples d'additifs sont notamment décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272. Comme exemples d'additifs, on peut citer l'éthylène glycol, le glycérol, le 1,2-propanediol, l'amidon, un sucre tel que glucose et sorbitol, un sel tel que chlorure de sodium, chlorure de calcium, sorbate de potassium et benzoate de sodium ou un mélange de deux ou
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plusieurs de ces produits. De bons résultats ont été obtenus avec le
1,2-propanediol.
De bons résultats ont également été obtenus avec le sorbitol.
La lipase selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La lipase peut notamment être utilisée en détergence. La présente invention concerne également l'utilisation de la lipase, telle que définie ci-dessus, en détergence. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans la demande de brevet britannique 1372034 et dans la demande de brevet européen 0 218 272. Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence. La présente invention concerne donc également les compositions de détergence contenant la lipase. Les composants des compositions de détergence sont connus de l'homme du métier et sont adaptés selon l'utilisation envisagée de la composition.
De tels composants sont notamment des enzymes, telles que par exemple des protéases, amylases et/ou cellulases ; des agents de charge, tels que du tripolyphosphate de sodium ; des agents de blanchiment, tels que du perborate ; des additifs de formulation ; des tensioactifs. Les compositions de détergence de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de vieux papiers en vue d'enlever les encres à base d'huile. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le résumé Chemical Abstract 113/154607.
La lipase peut notamment être utilisée lors du traitement de pâte à papier pour éviter les dépôts collants connus sous le nom de"pitch". Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit ans le document Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
La lipase peut notamment être utilisée en industrie alimentaire pour développer l'arôme de certains produits alimentaires, tels que des fromages ; lors de la fabrication de margarines spéciales. Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans le document Enzyme Microb.
Technol., 1993 (3), pages 634-645.
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La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
La figure 1 (figures la et Ib) représente la séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3).
La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
Exemple 1 Isolement et caractérisation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 a été isolée d'un échantillon de terre, prélevé aux Etats-Unis dans l'état du Wisconsin.
1 g de terre est mis en suspension dans 10 ml d'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl. Cette suspension est diluée 10 fois avec de l'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl.
1 ml de la suspension de terre diluée est étalée sur un milieu nutritif gélosé A.
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Le milieu A contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl, 20 g/l d'agar, 2, 5 g/l de NaHCO 7, 5 g/l de Na2COg, 10 g/1 d'huile d'olive, 1 g/l d'alcool polyvinylique (25/140) et 0,01 g/l de rhodamine B (Sigma 6626).
Le milieu A se prépare comme suit.
Une émulsion d'huile d'olive est d'abord préparée comme suit. 50 ml d'eau distillée est chauffée à 80 C. On ajoute 1 g d'alcool polyvinylique par petites fractions à cette eau chauffée. Puis, on ajoute 10 g d'huile d'olive à la suspension d'alcool polyvinylique. On émulsionne ensuite au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
EMI10.2
On stérilise l'émulsion obtenue à 121 C durant 30 minutes.
Une gélose est ensuite préparée comme suit. 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl, 20 g d'agar sont ajoutés dans 850 ml d'eau distillée. La suspension de gélose obtenue est stérilisée à 121 C durant 30 minutes.
EMI10.3
1 1 de tampon carbonate (pH 9, 5), contenant 25 g/l de NaHC03 et 75 g/l de NaCOg, est préparé, puis stérilisé à 121 C durant 30 minutes.
Puis, on prépare 1 ml d'une solution aqueuse de [0, 01 % (p/v)] rhodamine B (Sigma 6626). Cette solution est stérilisée par filtration sur une
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membrane de stérilisation (MILLIPORE) de 0,45 u.
L'émulsion d'huile d'olive stérilisée et la gélose stérilisée sont refroidies à 60 C, puis mélangées stérilement. Ensuite, on y ajoute la solution stérilisée de rhodamine. Puis, on ajoute 100 ml de tampon carbonate stérilisé de façon à obtenir un pH de 9,5. On émulsionne, ensuite, la suspension, ainsi obtenue, au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
Le milieu A sur lequel la suspension de terre a été étalée, est incubé 48 heures à 30 C. Les microorganismes produisant une lipase sont détectés à l'aide d'une lumière ultra-violette, ils sont entourés d'un halo fluorescent.
Les microorganismes détectés comme produisant une lipase, sont mis en culture sur un milieu nutritif gélosé B.
Le milieu B contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de
EMI11.1
levure, 5 g/l de NaCl, 20 g/1 d'agar, 2, 5 g/l de NaHC03, 7, 5 g/l de NaCOo. Tryptone, extrait de levure, NaCl, agar, qui composent le milieu B, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 OC durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9,5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/l de NaHC03 et 75 g/1 de Na2C03)'
Le microorganisme a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram négatif, aérobie. Aucune spore n'est formée.
La taille des cellules végétatives est de 0,5-0, 7 p. m x 1,5-4, 0 pm. La mobilité des cellules végétatives est positive. Le test de la lyse par 3 % (p/v) de KOH est positif. Le test de la catalase est positif en présence de 10 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) detétraméthyl-l, 4-phénylène-diammoniumdichlorure.
Le test de l'uréase est négatif. Le test de la réduction du nitrate est positif.
Des tests comparables ont notamment été décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272.
Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose.
Elle ne se développe pas en anaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 84 % (v/v) N2, 8 % (v/v) CO2, 8 % (v/v) H2 à 37 C.
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume. L'abréviation % (p/p) représente un pourcen-
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EMI12.1
tage exprimé en poids par poids.
C >
Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation sur le milieu B gélosé à 20 C, 30 oC, 37 oC et 41 C.
La souche ne produit pas de gaz à partir de glucose.
La souche utilise azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-argi- nine, L-histidine, bétaine et geraniol. La souche n'utilise pas adipate, phenylacétate, L-arabinose et maltose. Elle n'hydrolyse pas la gélatine, l'amidon et l'esculine.
La souche appartient au genre Pseudomonas et au groupe RNA-I.
Les caractéristiques biochimiques différencient nettement la souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1, d'une souche de Pseudomonas mendocina, d'une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes, d'une souche de Pseudomonas alcaligenes et d'une souche de Pseudomonas stutzeri. Ceci apparaît clairement à la lecture du tableau 1 rassemblant les caractéristiques biochimiques principales de ces 5 souches.
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Tableau 1
EMI13.1
<tb>
<tb> Caractéristiques <SEP> Pseudomonas
<tb> wisconsinensis <SEP> stutzeri <SEP> mendo- <SEP> alcali <SEP> - <SEP> pseudoalcaT <SEP> 92.677/1 <SEP> cina <SEP> genes <SEP> ligenes
<tb> Taille <SEP> #m <SEP> x <SEP> 0,5-0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7-0, <SEP> 8 <SEP> 0,7-0, <SEP> 8 <SEP> 0,5 <SEP> 0, <SEP> 7-0, <SEP> 8
<tb> /tu <SEP> 1, <SEP> 5-4,0 <SEP> 1, <SEP> 4-2, <SEP> 8 <SEP> 1,4-2, <SEP> 8 <SEP> 2,0-3, <SEP> 0 <SEP> 1,2-2,
<SEP> 5
<tb> Pigment <SEP> jaune <SEP> +-+ <SEP> dhydrolyse <SEP> +
<tb> l'amidon
<tb> Arginin--+ <SEP> + <SEP> d
<tb> déhydrolase
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glucose
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> d <SEP> + <SEP> d
<tb> Gluconate
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> +-+-Géraniol
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> d <SEP> d
<tb> L-histidine
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> L-arginine
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Bétaine
<tb>
+ = test positif pour 90 % ou plus des souches - = test négatif pour 90 % ou plus des souches d = test positif pour plus de 10 %, mais moins de 90 % des souches
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La bactérie isolée appartient donc au genre Pseudomonas,
aucune espèce connue n'a pu être déterminée.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994.
Exemple 2 Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu B gélosé à 30 C durant 24 heures.
Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide C. Le milieu C contient 10 gll de tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de levure, 10 g/1 de NaCl, le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec NaOH O, 1N, le milieu est stérilisé à 121 C durant 30 minutes. La culture est réalisée à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide D stérilisé.
Le milieu D contient K2HPO4 2,5 gll, KH2P04 2,5 gll, MgSO4. 7H20 1 gel, (NH4) 2SO4 2 g/1, (NH2) 2CO 2 g/l, CaC12 1 g/l, farine de soja 20 g/l, extrait de levure 2 g/l, glucose 20 gll, antimousse Mazuôl (Mazes Chemicals) 5 gel. Le pH est ajusté à 7,4 (par de l'acide phosphorique normal et de la soude caustique normale) avant et après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 C). Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à 121 C. Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121 C.
La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 3 C, sous une pression de 0,15. 10" Pa (Pa = Pascal) (0, 15 bar), avec une aération de 0,3 VVM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) par régulation de la vitesse d'agitation.
Après 24 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique suivante.
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L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0,01 N.
Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après.
On mélange 10 g de Trioléine (Roth 5423.1) et 10 g de gomme arabique (Fluka 51200) dans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur Ultra-Turrax à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/l de NaCl, 2,94 g/l de CaC12. 2H20 et 0,61 g/l de Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propanediol).
On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0, 01N, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30 C, on introduit un barreau magnétique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH O, IN. Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU. On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH O, OIN. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en 1).
Ensuite, on réalise le même essai en remplacant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en 1).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit :
1 LU/ml = (VI-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture.
Exemple 3 Préparation d'une solution concentrée de lipase
On ajuste le pH de la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à
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l'exemple 2, à un pH de 8 avec de la soude caustique concentrée 10 N.
Puis, on ajoute à cette culture 1 % (v/v) de Triton X-114 (SERVA
37214). Le mélange est agité doucement pendant 2 heures à 15 C.
Ensuite, on ajoute au mélange 1 % (v/v) d'Optifloc FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (v/v). Le mélange est agité doucement pendant 1 heure à 15 C.
On centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On chauffe le surnageant de centrifugation à 40 C pendant 5 minutes.
On observe une séparation de phases. On élimine la phase supérieure. On ajoute à la phase inférieure 35 % (v/v) d'acétone à 4 C. On incube la suspension 15 minutes à 4 C sous agitation modérée.
Puis, on centrifuge la suspension 15 minutes à 9000 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On ajoute de l'acétone au surnageant de centrifugation à 4 C jusqu'à l'obtention d'une concentration en acétone de 65 % (v/v). On incube le mélange 16 heures à 4 C.
Ensuite, on centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On conserve le précipité de centrifugation, que l'on met en suspension dans 150 ml d'un tampon (pH 7) contenant 5 mM de Brij 58 (ICI), 25 mM CaC12 et 20 mM Tris.
Puis, on centrifuge la suspension, contenant le précipité, 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JAI0) à une température de 4 C. On conserve le surnageant de centrifugation, qui forme une solution concentrée de lipase.
Exemple 4 Purification de la lipase
Pour purifier la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, on utilise la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie d'interaction hydrophobe, suivie de la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie de tamisage moléculaire.
En suivant les indications d'utilisation prescrites par le fournisseur (Pharmacia) au sujet de la colonne de chromatographie d'interaction hydro-
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phobe, on charge une colonne Phannacia Hiload 16/10 Phenyl-Sepharose (réf 17-1085-01) avec 140 ml de la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3.
On utilise, comme tampon d'équilibre, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 ; comme tampon d'élution, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 contenant 30 % (v/v) d'isopropanol. Le débit est fixé à 1,5 ml par minute.
On récupère la lipase avec la fraction éluée avec le tampon phosphate contenant l'isopropanol.
On mesure l'activité enzymatique de la fraction selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On diaf1ltre la fraction éluée, contenant la lipase, dans une cellule
EMI17.1
Amicon, munie d'une membrane Yam10, avec 10 volumes d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaC12 et 20 mM Tris.
Puis, on concentre la fraction diaflltrée jusqu'à 0,5 ml par ultrafiltration à l'aide de la même cellule Amicon, munie d'une membrane Yam10.
Ensuite, on injecte la fraction concentrée (0,5 ml) sur une colonne de chromatographie de tamisage moléculaire (colonne Superdex 75 HR 10/30 Pharmacia référence 17-1047-01). La séparation est initiée par un débit de 0,5 ml par minute d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaC12 et 20 mM Tris.
Trois pics d'absorption à 280 nm sont séparés. La lipase correspond au
EMI17.2
premier pic d'absorption à 280 nm. On conserve la fraction correspondante qui contient la lipase purifiée.
Exemple 5 Détermination de la séquence N-terminale
On utilise la méthode décrite par Vandekerkhove J. et al., Eur. J.
Biochemistry, 152,9 (1985), pour déterminer la séquence N-terminale de la lipase.
On met en oeuvre la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
La séquence N-terminale (SEQ ID NO : 1) est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr Gly 1 5 10 15
Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20
Cette séquence diffère des séquences N-terminales des autres lipases
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sécrétées par des autres souches de Pseudomonas, séquences notamment publiées dans Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645.
Exemple 6
Séquence d'acides aminés
La séquence d'acides aminés de la lipase de la présente invention est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) du gène qui code pour cette lipase, dont l'obtention est décrite à l'exemple 17. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA.
La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) de la partie codante de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
La lipase est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur de la lipase contient 308 acides aminés (SEQ ID NO : 7). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la lipase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
On identifie la préséquence de la lipase synthétisée sous forme d'un précurseur. n s'agit d'une séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10) qui constitue le peptide signal. On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO : 8).
Ensuite, on identifie la séquence en acides aminés de la lipase mature.
La lipase mature contient 286 acides aminés (SEQ ID NO : 4).
La figure 1 (figure la et figure Ib) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la lipase mature ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3).
Exemple 7 Distribution en acides aminés
La distribution en acides aminés de la lipase mature, déterminée à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 4) de la lipase (exemple 6), est résumée dans le tableau 2.
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TABLEAU 2
EMI19.1
<tb>
<tb> Symbole <SEP> Acides <SEP> aminés <SEP> Nombre <SEP> % <SEP> mole
<tb> (en <SEP> poids <SEP> moléculaire)
<tb> A <SEP> alanine <SEP> 28 <SEP> 9,790
<tb> B <SEP> acide <SEP> aspartique <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C <SEP> cystéine <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 699
<tb> D <SEP> acide <SEP> aspartique <SEP> 10 <SEP> 3, <SEP> 497
<tb> E <SEP> acide <SEP> glutamique <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 448
<tb> F <SEP> phénylalanine <SEP> 7 <SEP> 2,448
<tb> G <SEP> glycine <SEP> 35 <SEP> 12,238
<tb> H <SEP> histidine <SEP> 10 <SEP> 3,497
<tb> 1 <SEP> isoleucine <SEP> 14 <SEP> 4,895
<tb> K <SEP> lysine <SEP> 9 <SEP> 3,147
<tb> L <SEP> leucine <SEP> 22 <SEP> 7,692
<tb> M <SEP> méthionine <SEP> 1 <SEP> 0,350
<tb> N <SEP> asparagine <SEP> 25 <SEP> 8,741
<tb> P <SEP> proline <SEP> 11 <SEP> 3,846
<tb> Q <SEP> glutamine <SEP> 6 <SEP> 2,098
<tb> R <SEP> arginine <SEP> 13 <SEP> 4,
545
<tb> S <SEP> serine <SEP> 24 <SEP> 8,392
<tb> T <SEP> thréonine <SEP> 18 <SEP> 6,294
<tb> V <SEP> valine <SEP> 29 <SEP> 10, <SEP> 140
<tb> W <SEP> tryptophane <SEP> 5 <SEP> 1,748
<tb> X <SEP> inconnu <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> y <SEP> tyrosine <SEP> 10 <SEP> 3,497
<tb> Z <SEP> glutamine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> acide <SEP> glutamique
<tb>
EMI19.2
Exemple 8 Estimation du poids moléculaire
On estime, par calcul, le poids moléculaire de la lipase à partir de la séquence en acides aminés de la forme mature de la lipase et à partir de la séquence en acides aminés de la lipase y compris le peptide signal, comme décrit à l'exemple 6.
On déduit par calcul un poids moléculaire de 30093 Daltons pour la forme mature et un poids moléculaire de 32365 Daltons pour la forme comprenant le peptide signal.
Exemple 9 Détermination du poids moléculaire de la lipase par analyse SDS-PAGE
On effectue sur la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, une électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Le système de gel utilisé est le système PHASTSYSTEM de PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY (dossier
<Desc/Clms Page number 20>
d'utilisation NO 110), avec des gels contenant un gradient de polyacrylamide de 10-15 % (v/v). Les conditions d'électrophorèse sont celles prescrites par le fournisseur. On utilise comme témoin les marqueurs de poids moléculaire
PHARMACIA LMW (Low Molecular Weight), référence 17-0446-01.
Les marqueurs mis en oeuvre sont la phosphorylase b (94 kD), l'albumine (67 kD), l'ovalbumine (43 kD), la carboanhydrase (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD).
Le gel, ainsi obtenu, montre que la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, est pure.
Une coloration au bleu de Coomassie (Fast Coomassie staining, Phannacia, dossier d'utilisation n 200) du gel fait apparaître un polypeptide d'un poids moléculaire d'environ 30 (+/-0, 5) kD.
Exemple 10 Estimation du point isoélectrique
On estime le point isoélectrique de la lipase à partir de la séquence en acides aminés de la forme mature de la lipase et à partir de la séquence en acides aminés de la lipase y compris le peptide signal, comme décrit à l'exemple 6.
On déduit un point isoélectrique de 9,95 pour la forme mature et de
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10, 12 pour la forme comprenant le peptide signal.
Exemple 11 Détermination de l'optimum de pH de la lipase
On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différents pH selon la méthode décrite à l'exemple 2. On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différents pH, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à une température de 30 C et une durée de deux minutes.
On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3.
<Desc/Clms Page number 21>
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Tableau 3
EMI21.2
<tb>
<tb> Température <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> oc <SEP> %
<tb> 18 <SEP> 19
<tb> 24 <SEP> 26
<tb> 30 <SEP> 41
<tb> 34 <SEP> 45
<tb> 40 <SEP> 56
<tb> 45 <SEP> 52
<tb> 49 <SEP> 91
<tb> 55 <SEP> 100
<tb> 60 <SEP> 54
<tb> 76 <SEP> 43
<tb>
Au cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9,5 et à une température d'environ 55 C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
Cet exemple montre que la lipase de l'invention présente une activité enzymatique optimale mesurée à un pH de 9,5 dans une gamme de température comprise entre environ 40 et environ 60 C.
Cet exemple montre également que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, à une température d'environ 55 C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 et 60 C pour un pH d'environ 9,5.
Exemple 12 Détermination de l'optimum de pH de la lipase
On mesure l'activité enzymatique de la lipase à différents pH selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On détermine donc l'hydrolyse du substrat (émulsion de trioléine) suite à l'action de la lipase à différents pH, toutes les autres conditions étant identiques aux conditions standards, telles que décrites à l'exemple 2, c'est-à-dire à une température de 30 C et une durée de deux minutes.
On utilise la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à
<Desc/Clms Page number 22>
l'exemple 4.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4.
Tableau 4
EMI22.1
<tb>
<tb> pH <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> %
<tb> 7,0 <SEP> 17
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 9,0 <SEP> 100
<tb> 9, <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> 10,0 <SEP> 91
<tb> 10,5 <SEP> 71
<tb> 11,0 <SEP> 72
<tb> 12,0 <SEP> 47
<tb>
EMI22.2
Cet exemple montre que la lipase de l'invention développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et 10.
Au cours de l'essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 9, 5 et à une température d'environ 30 C. Par définition, on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 90 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température d'environ 30 C.
La lipase de l'invention développe une activité enzymatique de plus d'environ 70 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 11 pour une température d'environ 30 C.
Exemple 13 Stabilité de la lipase vis-à-vis de la température On incube la partie de la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4, à pH 10 et à 55 C dans un tampon aqueux de dureté 15 (tampon contenant du chlorure de calcium 1, 98 mM, du chlorure de magnésium 0, 69 mM et du bicarbonate de sodium 2, 5 mM).
A intervalles réguliers, tels que précisés dans le tableau 4 (temps d'incubation en minutes), on préleve un échantillon dont on mesure l'activité enzymatique selon la méthode décrite à l'exemple 2.
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Les résultats sont rassemblés dans le tableau 5.
Tableau 5
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<tb>
<tb> Temps <SEP> d'incubation <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> minutes <SEP> %
<tb> 0 <SEP> 100
<tb> 10 <SEP> 84
<tb> 20 <SEP> 81
<tb> 30 <SEP> 79
<tb> 40 <SEP> 93
<tb> 50 <SEP> 86
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> 80 <SEP> 72
<tb> 100 <SEP> 59
<tb> 120 <SEP> 59
<tb> 130 <SEP> 60
<tb> 140 <SEP> 61
<tb> 160 <SEP> 61
<tb> 260 <SEP> 39
<tb> 1140 <SEP> 25
<tb>
La constante de désactivation (k) sur l'intervalle 0-260 minutes est de 0.000333 min-l. [On obtient la constante de désactivation k selon la définition In (AAo) =-k. t, t étant le temps d'incubation, Ao l'activité relative au temps d'incubation 0 et At l'activité relative au temps d'incubation t.]
Au cours de cet essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon au temps 0.
Par définition on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
De cet exemple on conclut que la lipase de l'invention montre une
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activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de dureté 15. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 80 minutes sous ces mêmes conditions.
Exemple 14 Utilisation d'une composition détergente contenant la lipase
On prépare un morceau de tissu blanc (R. Hoppe Gmbh) à base de coton (65 %) et de polyester (35 %) de 10 cm sur 10 cm, imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan. L'imprégnation du tissu est réalisée comme suit.
On prépare une solution homogène de rouge Soudan 7B (SIGMA cat.
N F 1000) et de graisse de lard (Laru Gmbh) en ajoutant 0,1 % (p/p) de
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rouge Soudan à la graisse de lard. Le mélange est chauffé à 90 C jusqu'à complète dissolution du rouge Soudan. Un rouleau de tissu est plongé dans la solution de rouge Soudan et de graisse de lard maintenue à 90 C et déplacé en continu dans cette solution à la vitesse de 0,5 m/minute. Ensuite, le tissu est essoré sous une pression linéaire constante entre deux rouleaux.
Le tissu ainsi imprégné contient 31,5 % (p/p) de matières grasses. Le tissu imprégné est placé à-18 C durant 22 heures jusqu'à complète cristallisation de la matière grasse. Le tissu est découpé en morceaux de 10 cm sur
10 cm. Ensuite, les morceaux de tissu imprégné sont stockés à-18 C dans le noir.
On prépare une composition détergente liquide contenant 4 g/l d'une poudre compacte lessivielle (poudre Eurocompact d'UNILEVER) et diverses concentrations de lipase équivalentes à 500,1000 et 2000 LU/1, dans une eau de dureté 15 (eau contenant du chlorure de calcium 1,98 mM, du chlorure de magnésium 0,69 mM et du bicarbonate de sodium 2,5 mM). Le pH initial de la composition détergente liquide est d'environ 10. On met en oeuvre la lipase telle qu'obtenue à l'exemple 4, que l'on dilue avec de l'eau de dureté 15 en vue d'obtenir les concentrations souhaitées.
Puis, on lave le tissu imprégné de graisse de lard et de rouge Soudan avec 200 ml de la composition détergente liquide dans un réacteur de 250 ml. Le lavage a lieu à 35 C durant 45 minutes sous une agitation de 40 RPM (agitation va et vient de 20 secondes). Après le lavage, le tissu est rincé trois fois avec 200 ml d'eau distillée, puis séché à 22 C entre deux papiers durant 24 heures.
Ensuite, on détermine la réflectance (RL) à 460 nm du tissu séché à l'aide d'un colorimètre (Tricolor LFM 3).
On reproduit ce test trois fois, c'est-à-dire on effectue ensuite trois fois le cycle de lavage avec la composition détergente liquide contenant la lipase et le cycle de rinçage su, le même échantillon de tissu sans l'imprégner de rouge Soudan et de graisse de lard entre chaque cycle. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance à 460 nm du tissu séché.
Un essai strictement identique est réalisé avec une composition détergente ne contenant pas de lipase. A chaque fin de cycle, on détermine la réflectance (RO) à 460 nm du tissu séché.
On définit la performance de lavage en % comme la différence entre la réflectance (RL) obtenue avec la lavage en présence de lipase et la réflec-
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tance (RO) obtenue avec la lavage en absence de lipase, c'est-à-dire RL-
RO exprimé en %.
Les résultats de cet exemple montrent que la lipase de l'invention est efficace à faible dose d'enzyme dans la composition détergente.
Les résultats de cet exemple montrent également que la lipase de l'invention est particulièrement efficace dès le second cycle de lavage et qu'elle conserve une efficacité accrue après trois et quatre cycles de lavage.
Notamment, la lipase est particulièrement efficace à la concentration de 500 LU/1 après trois cycles de lavage.
De plus, la lipase se montre tout particulièrement efficace à la concentration de 1000 LU/1 dès le premier cycle de lavage. La lipase se montre tout particulièrement efficace à la concentration de 1000 LU/1 durant tous les cycles de lavage.
Exemple 15 Clonage du gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 1. Extraction de l'ADN chromosomique à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
L'ADN génomique est préparé en suivant la technique décrite par WILSON, 1990, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (Unit 2.4), avec les modifications décrites ci-après.
A partir de la culture, telle qu'obtenue à l'exemple 2, une culture de 200 ml de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est réalisée en milieu de croissance LB durant 16 heures à 37 C. La composition du milieu de croissance LB est la suivante : TRYPTOSE (DIFCO) 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 10 g/l.
La culture obtenue est centrifugée (centrifugeuse SORVALL RC 5C Plus, rotor SS-34) à 2000 G pendant 15 minutes. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est repris dans une solution contenant 9,5 ml de tampon TE à un pH de 8,0 ; 500 jil d'une solution de SDS (sodium dodécyl sulfate) à 10 % (p/v) ; et 50 tl d'une solution de protéinase J. : (vendue par BOEHRINGER Mannheim) à 20 mg/ml (préparée extemporanément).
Le tampon TE (pH 8,0) est constitué de 10 mM TRIS-HC1 (TRIS-HC1 = Tris (hydroxyméthyl) aminométhanc)-HCl) et ImM EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique).
La suspension ainsi obtenue, contenant le culot de centrifugation, est incubée 90 minutes à 65 C.
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Puis, on ajoute à cette suspension 1,8 ml d'une solution de NaCl 5 M et 15 ml d'une solution de CTAB/NaCl à 10 % (p/v) (CTAB = bromure
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d'ammonium cetyltriméthyle, NaCI à 0, 7 M). La suspension ainsi obtenue est incubée 20 minutes à 65 oC. Un lysat est obtenu.
On effectue à partir de ce lysat une extraction avec 15 ml d'un mélange chloroforme/alcool isoamylique (3-méthyl-l-butanol) 24/1 sous les conditions et en suivant les procédures décrites dans Molecular Cloning-a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIA TIS - second edition,
1989, à la page E. 3, jusqu'à l'obtention d'une interface propre, comme cela y est décrit.
A la phase aqueuse récupérée, on ajoute 0,6 volumes (v/v) d'isopropanol, une suspension visqueuse est obtenue.
On précipite l'ADN contenu dans la suspension visqueuse selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p. 9.18. L'ADN précipité est enroulé autour d'une pipette Pasteur, puis est lavé trois fois avec 70 % (v/v) d'éthanol. L'ADN lavé est séché 5 minutes à l'air à température ambiante. L'ADN séché est mis en suspension dans 2,5 ml de tampon TE à pH 8,0.
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2. Construction d'une banque génomique de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 A partir de la suspension obtenue ci-dessus, l'ADN chromosomique (15 gg) de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. On met en oeuvre la méthode par dilution successive de l'enzyme de restriction et les conditions de restriction sont celles décrites dans SAMBROOK et al., 1989, pages 5.28-5. 32.
Le clivage est partiellement inhibé par l'addition d'11 d'EDTA 0,5 M à pH 8,0 en présence de glace.
On détermine sur gel d'agarose les fractions, obtenues après le clivage, qui contiennent des fragments ayant une taille comprise entre 20 et 40 kpb.
L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une précipitation selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p.
9.18.
Les fragments d'ADN sont ensuite ligaturés selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1. 69, avec le plasmide pRG930 (750 ng), préalablement coupé au site BamID comme décrit par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.60-1. 61. On obtient une collection de
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plasmides que l'on dénomme pRG930 : : WI.
Le procédé d'obtention du plasmide pRG930 est décrit dans Molecular
Plant-Microbe Interactions, 1992, vol. 5 (3), pages 228-234.
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transfecter des cellules de E. coli HBIOI (PROMEGA) en utilisant le kit vendu sous le nom de GIGAPACK Il PACKAGING EXTRACT KIT (STRATAGEM et en suivant les recommandations d'utilisation du fabricant.
Les cellules transfectées d'E. coli HB101 sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25 g/ml de streptomycine et 50 pglml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 oC. On obtient ainsi une collection de souches transfectées que l'on dénomme E. coli HB101 (pRG930 : : WI).
A partir de 12 colonies d'E. coli HBI01 (pRG930 : : WI) choisies au hasard, on isole des fragments d'ADN selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.85.
On effectue une analyse par restriction de ces fragments d'ADN (SAMBROOK et al., 1989, page 1.85) après un clivage avec les enzymes de restriction EcoRI et Pstl.
Cette analyse indique que la taille des fragment insérés présents dans les plasmides pRG930 : : WI est comprise entre environ 20 et 30 kpb (kpb = 1000 paires de bases) et que ces fragments sont différents les uns des autres.
Ceci indique que la banque génomique qui a été constituée est représentative.
1500 colonies d'E. coli HB101 (pRG930 : : WI) sont alors mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25 g/ml de streptomycine et 50 g/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 C. Ces 1500 colonies d'E. coli HBIOI (pRG930 : : WI) constituent la banque génomique.
3. Obtention d'un fragment chromosomique contenant le gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
Enfin d'établir la séquence nucléotidique d'une sonde apte à cribler la banque génomique, on prend comme base de référence initiale la séquence N-terminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, telle qu'obtenue à l'exemple 5.
Pour lever le maximum d'ambiguïté dans la traduction des acides aminés vers les nucléotides, on prend en compte d'une part les séquences de
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nucléotides de plusieurs lipases produites par différentes souches de
Pseudomonas et publiées dans Gilbert J. et al., Enzyme Microbiological
Technology, 1993,15, p. 634-645, et, d'autre part, la propriété connue sous le nom de"codon usage"de la souche de Pseudomonas aeruginosa et publiée dans West S. et al., Nucleic Acid research, 1988,16, p. 9323-9335.
Sur base de ces éléments on établit la séquence d'un oligonucléotide synthétique de 72 pb (pb = paire de bases). Cet oligonucléotide synthétique est préparé selon la technique décrite dans BEAUCAGE et al.
(1981), Tetrahedron Letters, 22, pages 1859-1882 et en utilisant des ss-cyanoéthyl phosphoramidites dans un appareil de BIOSEARCH
CYCLONE SYNTHESIZER.
La séquence de cet oligonucléotide synthétique est la suivante : SEQIDNO : ! ! '-AACTACACCAAGACCAAATACCCCATCGTGCTGGTCCA- - CGGCGTGACCGGCTTCAACACTATCGGCGGGCTC-3'
Cet oligonucléotide synthétique est marqué à sa terminaison au moyen de T P ATP avec une enzyme T4 polynucléotide kinase en suivant la technique décrite dans le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BYOZYME).
Un criblage est effectué sur la banque génomique par la technique dite de"colony Mot" (AMERSHAM) en utilisant comme sonde l'oligonucléotide synthétique tel que préparé ci-dessus.
Les 1500 colonies de la banque génomique (E. coli HBIOI (pRG930 : : WI)) sont mises en culture durant 18 heures à 37 C sur des membranes dites"hybond-N+" (AMERSHAM) en suivant la technique indiquée par le fabricant.
Les membranes (400 cm2) sont placées dans des sacs plastiques contenant 45 ml de solution de préhybridisation.
La solution de préhybridisation contient 15 ml de 20X SSC (3 M NaCl et 0,3 M de citrate de sodium, pH de 7,0), 5 ml de la solution de Denhardt et 500 ug d'ADN de sperme de saumon dénaturé et fragmenté (AMERSHAM).
500 ml de solution de Denhardt contient 5 g de FICOLL de type 400 (PHARMACIA), 5 g de polyvinylpyrrolidone et 5 g d'albumine de sérum bovin.
Les membranes placées dans des sacs plastiques sont incubées à 68 C
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dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 4 heures.
Les membranes sont alors incubées avec une solution d'hybridisation à 68 C dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 18 heures.
La solution d'hybridisation est préparée en mélangeant 5 ml de la solution de préhybridisation préchauffée à 68 C et l'oligonucléotide synthétique marqué, et ayant été incubé au bain-marie durant 5 minutes, la concentration finale de l'oligonucléotide synthétique est de 0,3 pMol.
Les membranes sont ensuite récupérées. Les membranes sont alors lavées avec une solution contenant 100 ml de 2X SSC (0,3 M NaCl et 0,03 M de citrate de sodium, pH de 7,0) et 0,1 % (p/v) de SDS durant 5 minutes à température ambiante.
Puis, les membranes lavées sont séchées entre deux papiers absorbants.
Les membranes séchées sont couvertes d'une feuille plastique transparente de qualité alimentaire. Elles sont alors soumises à une autoradiographie aux rayons X (AMERSHAM).
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 est utilisée comme contrôle positif et les souches d'E. coli HB101 et d'E. coli HB101 (pRG930) sont utilisées comme contrôle négatif.
La souche d'E. coli HB101 (pRG930) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans Molecular Cloning, a laboratory ManualMANIAIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 150-151, en mettant en oeuvre la souche d'E. coli HB101 et le plasmide pRG930.
On observe un signal clair et fort pour la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 et aucun signal pour les souches d'E. coli HB101 et d'E. coli HB101 (pRG930). Le criblage de la banque génomique met en évidence 80 colonies donnant un signal.
Ceci est confirmé par un nouvel essai d'hybridisation.
Une colonie de la banque génomique présentant un signal fort est isolée et mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25 ILg/ml de streptomycine et 50 ug/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 C. Cette colonie est dénommée E. coli HB101 (pRG930 : : WI12).
Un essai d'hybridisation est de nouveau effectué avec la colonie d'E. coli HB101 (pRG930 : : WI12) en vue de confirmer les résultats obtenus.
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Exemple 16 Analyse du plasmide pRG930 : : WI12 présent dans la souche d'B. coli
HB101 (pRG930 : : WI12) - Analyse par la technique dite du Southem Blot
On isole l'ADN à partir de la souche d'E. coli HB101 (pRG930 : : WI12), obtenu à l'exemple 15, selon le technique décrite par
SAMBROOK et al., 1989, pages 1.25-1. 28, et on effectue une analyse par restriction en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6. 19.
Cette analyse montre que le fragment d'ADN inséré dans le plasmide pRG930 : : WI12 a une taille d'environ 27 kpb.
Puis, l'ADN est transféré sur une membrane dite"hybond-N+" (AMERSHAM) et on effectue une hybridisation en suivant la technique indiquée par le fabricant comme illustrée à l'exemple 15. Comme contrôle négatif, on utilise le plasmide pRG930.
On observe une seule bande donnant un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : 11) sur le gel d'électrophorèse.
Le fragment porté par cette bande a une taille d'environ 24,5 kpb, il est lié au vecteur pRG930.
Exemple 17 Séquence de nucléotides du gène complet qui code pour la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 1. Obtention de la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC13
On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930 : : WI12 en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose.
On effectue une analyse selon la technique du Southem Blot, telle que décrite à l'exemple 16.
Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930 : : WI12 est formé, d'une part, de 4 fragments qui ont ensemble une taille d'environ 18,5 kpb et, d'autre part, d'un fragment attaché au vecteur pRG930. Ce fragment a une taille d'environ 8,5 kpb.
Le fragment de 8,5 kpb, attaché au vecteur pRG930, donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : les 4 autres fragments ne donnent aucun signal.
Le fragment de 8,5 kpb attaché au vecteur pRG930 est ensuite ligaturé
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sur lui-même selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages
1.68-1. 69. On obtient le plasmide pRG930 : : WI13.
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transformer des cellules de E. coli DH5a (GIBCO) comme décrit dans SAMBROOK et al., 1989, page
1.82-1. 84.
On obtient une colonie d'E. coli DH5a (pRG930 : : WI13) que l'on isole et met en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 25 g/ml de streptomycine et 50 #, g/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37"C.
On établit une carte de restriction partielle du plasmide pRG930 : : WI13 en utilisant la technique décrite dans Molecular Cloning, a laboratory Manual-MANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 374-379, et en mettant en oeuvre les enzymes de restriction ClaI, EcoRI, NcoI, Sali, HindIn, Bgin, XhoI, BamHI, Smal, Sacl, Sacn, KpnI, SphI, XbaI, EcoRV et Spel.
2. Identification de la séquence de nucléotides de la lipase
On effectue une analyse par restriction du plasmide pPRG930 : : WI13, en utilisant l'enzyme de restriction Pst. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose.
On effectue une analyse selon le technique du Southem Blot, telle que décrite à l'exemple 16.
Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930 : : WI13 est formé, d'une part, de 5 fragments et, d'autre part, d'un petit fragment. Ce petit fragment a une taille d'environ 2,5 kpb.
Le fragment de 2,5 kpb donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ ID NO : 11), les 5 autres fragments ne donnent aucun signal.
Le fragment de 2,5 kpb est ligaturé avec le vecteur pPRG930 selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1. 69. On obtient le plasmide pRG930 : : WI14.
A partir du plasmide pRG930 : : WI14, le fragment de 2,5 kpb est inséré dans le plasmide pBLUESCRIPT.
Le plasmide pBLUESCRIPT peut être obtenu auprès de la société STRATAGENE.
On obtient le plasmide pBLUESCRIPT : : WI14.
La séquence de fragment de 2,5 kpb inséré dans le plasmide
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pBLUESCRIPT : : WI14 est obtenue en mettant en oeuvre le kit
SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BIOZYM) et en suivant la technique préconisée par le fabricant.
Pour compléter et vérifier la séquence de nucléotides obtenue, on répète l'exemple ci-dessus avec la modification suivante. On effectue l'analyse par restriction du plasmide pPRG930 : : WI14, en mettant en oeuvre successivement les enzymes de restriction SalI, KpnI ou SacII en lieu et place de l'enzyme de restriction PstI.
On identifie la séquence de nucléotides de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la lipase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3), est donnée à la figure 1 (figures la et Ib).
On vérifie que les premiers acides aminés de la séquence de la lipase, ainsi identifiés, correspondent à la séquence N-terminale déterminée à l'exemple 5.
* La lipase est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur contient 308 acides aminés (SEQ ID NO : 7). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la lipase, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
Le précurseur contient la séquence de 286 acides aminés (SEQ ID NO : 4) de la lipase mature et la séquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10) de la préséquence.
La séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence. Il s'agit d'une séquence additionnelle de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10).
On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO : 8), ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 9). Cette préséquence code pour le peptide signal de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT : (A) NOM : SOLVAY (Société anonyme) (B) RUE : rue du Prince Albert, 33 (C) VILLE : Bruxelles (E) PAYS : Belgique (F) CODE POSTAL : 1050 (ii) TITRE DE L'INVENTION : Lipase, microorganisme la produisant, procédé de préparation de cette lipase et utilisations de celle-ci (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 11 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL : Patenten Release #1. 0, Version #1. 30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 24 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (v) TYPE DE FRAGMENT : N-terminal (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME :
Pseudomonas (B) SOUCHE : Pseudomonas wisconsinensis (C) INDIVIDU/ISOLE : T 92.677/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 :
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 861 paires de bases (B) TYPE : nucléotide
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(C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (v) TYPE DE FRAGMENT : interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Pseudomonas (B) SOUCHE : Pseudomonas wisconsinensis (C) INDIVIDU/ISOLE : T 92.677/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 2 :
AACTACACCA AGACCAAGTA TCCGATCGTG CTGGTACACG GCGTGACCGG GTTCAATACC 60 ATCGGCGGGC TGGTCAATTA CTTCCATACC ATTCCCTGGA ACCTAGAGCG CGATGGCGCC 120 CGGGTGCACG TCGCCAGTGT CGCTGCCTTC AATGACAGCG AGCAGCGCGG CGCCGAGCTG 180 GCCCGGCAGA TCGTGCCCTG GGCCGCAGGC GGAGGCGGCA AGGTCAACCT GATCGGCCAC 240 AGTCAGGGCT CGCCGACCTC GCGCGTGGCG GCTTCGTTGC GGCCGGATCT GGTGGCATCG 300 GTGACCTCGA TCAACGGCGT CAACAAGGGC TCCAAGGTCG CCGATGTGGT GCGCGGCGTG 360 CTGCCACCGG GTAGCGGTAT CGAAGGCGGC GCCAATGCCA TCGCCAACGC CCTCGGTGCG 420 GTGATCAATC TGCTGTCTGG CTCAAGCAAC CCGCAAAACG GTATCAACGC GCTAGGCACC 480 CTGACCACCG CGGGCACCAG TGCGCTGAAC AGTCGCCACC CGTGGGGCGT CAACACCAGC 540 AGCTACTGCG CCAAGTCCAC CGAAGTGCAC AATGTGCGCG GTCACAGCAT CCGCTACTAC 600 TCCTGGACCG GTAATGCCGC CTATACCAAC GTGCTCGATG CGGCCGATCC CTTCCTGGCC 660 TTCACCGGCC TGGTGTTCGG CAGCGAGAAG AACGACGGTC TGGTGGGCGT ATGTTCCACC 720 TATCTGGGGC AGGTGATCGA CGACAGCTAC AACATGAACC ACGTCGATGC
GATCAACCAC 780 CTGTTCGGCA TTCGTGGCTG GACCGAACCG GTGTCGCTGT ATCGCCAGCA CGCCAACCGC 840 CTGAAGAACA AGGGCGTCTG A 861 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3 : dz CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 861 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (il) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique)
<Desc/Clms Page number 35>
(ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 858 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 3 :
AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG CTG GTA CAC GGC GTG ACC 48 Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT TAC TTC CAT ACC ATT CCC 96 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro
20 25 30 TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG CAC GTC GCC AGT GTC GCT 144 Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala
35 40 45 GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC GAG CTG GCC CGG CAG ATC 192 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gln Ile
50 55 60 GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG GTC AAC CTG ATC GGC CAC 240 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His
65 70 75 80 AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG GCT TCG TTG CGG CCG GAT 288 Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp
85 90 95 CTG GTG GCA TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC GTC
AAC AAG GGC TCC AAG 336 Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys
100 105 110 GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA CCG GGT AGC GGT ATC GAA 384 Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu
115 120 125 GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC GGT GCG GTG ATC AAT CTG 432 Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu
130 135 140 CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA AAC GGT ATC AAC GCG CTA GGC ACC 480 Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160 CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC AGT CGC CAC CCG TGG GGC 528 Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly
165 170 175 GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC ACC GAA GTG CAC AAT GTG 576 Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val
180 185 190
<Desc/Clms Page number 36>
CGC GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC
TGG ACC GGT AAT GCC GCC TAT 624 Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr
195 200 205 ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC CTG GCC TTC ACC GGC CTG 672 Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu
210 215 220 GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG GTG GGC GTA TGT TCC ACC 720 Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240 TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC AAC ATG AAC CAC GTC GAT 768 Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp
245 250 255 GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC TGG ACC GAA CCG GTG TCG 816 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser
260 265 270 CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG AAC AAG GGC GTC TGA 861 Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val
275 280 285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 286 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 4 : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr
1 5 10 15 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro
20 25 30 Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala
35 40 45 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gln Ile
50 55 60 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His
65 70 75 80 Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp
85 90 95
<Desc/Clms Page number 37>
Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys
100 105 110
Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu
115 120 125
Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile
Asn Leu
130 135 140
Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr
145 150 155 160
Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly
165 170 175 Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val
180 185 190 Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr
195 200 205 Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu
210 215 220 Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp
245 250 255 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser
260 265 270 Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val
275 280 285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 927 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 5 : ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 CAGGCCAACT ACACCAAGAC CAAGTATCCG ATCGTGCTGG TACACGGCGT GACCGGGTTC 120 AATACCATCG GCGGGCTGGT CAATTACTTC CATACCATTC CCTGGAACCT AGAGCGCGAT 180
<Desc/Clms Page number 38>
GGCGCCCGGG TGCACGTCGC CAGTGTCGCT GCCTTCAATG ACAGCGAGCA GCGCGGCGCC 240
GAGCTGGCCC GGCAGATCGT GCCCTGGGCC GCAGGCGGAG GCGGCAAGGT CAACCTGATC 300
GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360
GCATCGGTGA CCTCGATCAA CGGCGTCAAC AAGGGCTCCA AGGTCGCCGA TGTGGTGCGC 420
GGCGTGCTGC CACCGGGTAG CGGTATCGAA GGCGGCGCCA ATGCCATCGC CAACGCCCTC 480
GGTGCGGTGA TCAATCTGCT GTCTGGCTCA AGCAACCCGC
AAAACGGTAT CAACGCGCTA 540
GGCACCCTGA CCACCGCGGG CACCAGTGCG CTGAACAGTC GCCACCCGTG GGGCGTCAAC 600
ACCAGCAGCT ACTGCGCCAA GTCCACCGAA GTGCACAATG TGCGCGGTCA CAGCATCCGC 660
TACTACTCCT GGACCGGTAA TGCCGCCTAT ACCAACGTGC TCGATGCGGC CGATCCCTTC 720
CTGGCCTTCA CCGGCCTGGT GTTCGGCAGC GAGAAGAACG ACGGTCTGGT GGGCGTATGT 780 TCCACCTATC TGGGGCAGGT GATCGACGAC AGCTACAACA TGAACCACGT CGATGCGATC 840 AACCACCTGT TCGGCATTCG TGGCTGGACC GAACCGGTGT CGCTGTATCG CCAGCACGCC 900 AACCGCCTGA AGAACAAGGG CGTCTGA 927 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 927 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : sig-peptide (B) EMPLACEMENT : 1.. 66 (ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : mat-peptide (B) EMPLACEMENT : 67.. 924 (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 924 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 6 : ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48 Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly - 22-20-15-10
<Desc/Clms Page number 39>
GCC GTC GAG GCC CAG GCC AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG 96 Ala Val Glu Ala Gln Ala Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val - 5 1 5 10 CTG GTA CAC GGC GTG ACC GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT 144 Leu Val His Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn
15 20 25
EMI39.1
TAC TTC CAT ACC ATT CCC TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG 192 Tyr Phe His Thr Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val
30 35 40 CAC GTC GCC AGT GTC GCT GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC
240 His Val Ala Ser Val Ala Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala
45 50 55 GAG CTG GCC CGG CAG ATC GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG 288 Glu Leu Ala Arg Gln Ile Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys
60 65 70 GTC AAC CTG ATC GGC CAC AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG 336 Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala
75 80 85 90 GCT TCG TTG CGG CCG GAT CTG GTG GCA TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC 384 Ala Ser Leu Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly
95 100 105 GTC AAC AAG GGC TCC AAG GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA 432 Val Asn Lys Gly Ser Lys Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro
110 115 120 CCG GGT AGC GGT ATC GAA GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC 480 Pro Gly Ser Gly Ile Glu Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu
125 130 135 GGT GCG GTG ATC AAT CTG CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA AAC GGT 528 Gly Ala Val
Ile Asn Leu Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly
140 145 150 ATC AAC GCG CTA GGC ACC CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC 576 Ile Asn Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn 155 160 165 170 AGT CGC CAC CCG TGG GGC GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC 624 Ser Arg His Pro Trp Gly Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser
175 180 185 ACC GAA GTG CAC AAT GTG CGC GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC TGG 672 Thr Glu Val His Asn Val Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp
190 195 200
<Desc/Clms Page number 40>
ACC GGT AAT GCC GCC TAT ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC 720
Thr Gly Asn Ala Ala Tyr Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe
205 210 215
CTG GCC TTC ACC GGC CTG GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG 768
Leu Ala Phe Thr Gly Leu Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu
220 225 230
GTG GGC GTA TGT TCC ACC TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC 816
Val
Gly Val Cys Ser Thr Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr
235 240 245 250 AAC ATG AAC CAC GTC GAT GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC 864 Asn Met Asn His Val Asp Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly
255 260 265 TGG ACC GAA CCG GTG TCG CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG 912 Trp Thr Glu Pro Val Ser Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys
270 275 280 AAC AAG GGC GTC TGA 927 Asn Lys Gly Val
285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 308 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 7 :
Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly - 22-20-15-10 Ala Val Glu Ala Gln Ala Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val - 5 1 5 10 Leu Val His Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn
15 20 25 Tyr Phe His Thr Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val
30 35 40 His Val Ala Ser Val Ala Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gln Arg Gly Ala
45 50 55 Glu Leu Ala Arg Gln Ile Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys
60 65 70
<Desc/Clms Page number 41>
Val Asn Leu Ile Gly His Ser Gln Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala
75 80 85 90 Ala Ser Leu Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly
95 100 105 Val Asn Lys Gly Ser Lys Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro
110 115 120
Pro Gly Ser Gly Ile Glu Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu
125 130 135 Gly Ala Val Ile Asn Leu Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gln Asn Gly
140
145 150 Ile Asn Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn 155 160 165 170 Ser Arg His Pro Trp Gly Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser
175 180 185 Thr Glu Val His Asn Val Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp
190 195 200 Thr Gly Asn Ala Ala Tyr Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe
205 210 215 Leu Ala Phe Thr Gly Leu Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu
220 225 230 Val Gly Val Cys Ser Thr Tyr Leu Gly Gln Val Ile Asp Asp Ser Tyr 235 240 245 250 Asn Met Asn His Val Asp Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly
255 260 265 Trp Thr Glu Pro Val Ser Leu Tyr Arg Gln His Ala Asn Arg Leu Lys
270 275 280 Asn Lys Gly Val
285 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 66 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE :
ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 8 :
<Desc/Clms Page number 42>
ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60
CAGGCC 66 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 66 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT : 1.. 66 (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : sig-peptide (B) EMPLACEMENT : 1.. 66 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 9 :
ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48 Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15 GCC GTC GAG GCC CAG GCC 66 Ala Val Glu Ala Gln Ala
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 22 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 10 : Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15 Ala Val Glu Ala Gln Ala
20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11 :
<Desc/Clms Page number 43>
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 72 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE :
Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION :/desc ="oligonucléotide synthétique" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 11 : AACTACACCA AGACCAAATA CCCCATCGTG CTGGTCCACG GCGTGACCGG CTTCAACACT 60 ATCGGCGGGC TC 72
Claims (1)
- REVENDICATIONS 1-Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis ou d'un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase.2 - Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) ou d'un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire cette lipase.3-Lipase, caractérisée en ce que sa séquence N-terminale d'acides aminés (SEQ ID NO : 1) est la suivante : Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His 1 5 10 Gly Val Thr Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 15 20 4-Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés de 1 à 286 acides aminés (SEQ ID NO : 4) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.S-Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce que la séquence de la lipase mature est précédée d'une préséquence de 22 acides aminés (SEQ ID NO : 10) qui code pour le peptide signal de la lipase.6-Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 30 kDa. EMI44.17-Lipase, isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,8 et environ 10,1.8-Lipase, caractérisée en ce qu'elle provient d'une bactérie aérobie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose.9-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de température supérieure à environ 40 C. <Desc/Clms Page number 45>10-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, dans une gamme de EMI45.1 température inférieure à environ 60 C.11-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9, 5, dans une gamme de température comprise entre environ 40 C et environ 60 C.12-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH de 9,5, à une température d'environ 55 C.13-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique de plus de 50 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de température comprise entre environ 40 C et environ 60 C pour un pH d'environ 9,5, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 55 C et à un pH de 9,5.14-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH supérieur ou égal à environ 8. EMI45.215-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH inférieur ou égal à environ 10.16-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique optimale, mesurée à une température d'environ 30 C, dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10.17-Lipase, caractérisée en ce qu'elle développe une activité enzymatique de plus de 85 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 8 et environ 10 pour une température EMI45.3 d'environ 30 oC, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 30 C et à un pH de 9, 5.18-Lipase, caractérisée en ce qu'elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 160 minutes à une température de 55 C et à un pH de 10 dans une solution tamponnée de <Desc/Clms Page number 46> dureté 15.19-Une culture isolée et purifiée de Pseudomonas wisconsinensis et culture dérivée ou mutée de celle-ci.20-Une culture isolée et purifiée de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) et culture dérivée ou mutée de celle-ci.21-Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.22-Molécule d'ADN selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) qui code pour le précurseur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.23-Procédé pour la production d'une lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie capable de produire la lipase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux et la récolte de la lipase ainsi obtenue.24-Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la bactérie aérobie est une souche de Pseudomonas.25-Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la bactérie aérobie est la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) et un dérivé ou mutant de cette souche capable de produire la lipase.26-Une composition enzymatique contenant la lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 et au moins un additif.27-La composition enzymatique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition de détergence.28-Utilisation de la lipase selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 en détergence.
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Family Applications (1)
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