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Procédé de récolte d'une protéine
L'invention concerne un procédé de récolte d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine.
L'invention concerne également une composition contenant la protéine microbienne obtenue par le procédé de récolte.
Industriellement, les protéines microbiennes sont produites par culture d'un microorganisme dans un fermenteur contenant un milieu nutritif liquide adéquat. La culture obtenue en fin de fermentation contient une certaine quantité de la protéine voulue, mais également d'autres protéines, ainsi que la biomasse cellulaire, des impuretés diverses et des produits de dégradation du milieu nutritif.
La fermentation terminée, il est donc nécessaire de séparer ces divers produits en vue de récupérer la protéine voulue. De plus, la protéine est traitée de façon à obtenir une préparation commerciale répondant aux critères de pureté et de stabilité souhaités. Ces traitements sont des opérations connues telles que centrifugation, filtration, évaporation, précipitation, séchage. Ces traitements sont adaptés en fonction des caractéristiques de la protéine voulue.
Dans ce contexte, divers procédés de récolte ont déjà été proposés. Ainsi, un procédé de récolte d'une enzyme à partir de la culture d'un microorganisme est décrit dans le brevet U. S. 4,673, 647. Un agent de précipitation est ajouté à la culture en fin de fermentation. Au précipité formé qui contient l'enzyme, est ajouté un polyol. Une solution contenant le polyol et l'enzyme est obtenue.
Un procédé de récolte d'une lipase produite par une souche de Fusarium oxysporum est également décrit dans la demande de brevet européen 0 130 064.
Le pH de la culture, obtenue en fin de fermentation, est ajusté à 8,0. Puis, la culture est floculée par l'addition de chlorure de calcium, d'agents floculants et de Triton X-100 (0,5 % poids/volume). La culture floculée est centrifugée. Puis, le culot de centrifugation est remis en suspension, le pH de cette suspension est ajusté à 4,5. Un précipité est formé. On centrifuge de nouveau, puis on ajoute au surnageant de centrifugation du Triton X-100. On centrifuge de nouveau. Le culot de centrifugation est remis en suspension, puis diafiltré. La suspension obtenue est ensuite ultrafiltrée et concentrée. Le filtrat obtenu est de nouveau filtré, puis précipité par de l'acétone. Ce procédé est relativement compliqué.
Les très nombreuses étapes entraînent de façon inévitable des pertes de produits, donc
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un rendement faible, mais également des altérations de la lipase, telles que des altérations de la structure de la protéine et des propriétés de la lipase. Le produit final obtenu a donc une activité enzymatique faible et détériorée et est, de plus, instable.
De même, un autre procédé de récolte d'une enzyme à partir de la culture d'un microorganisme, qui produit cette enzyme, est décrit dans une demande de brevet européen 0 574 050. A la culture en fin de fermentation sont ajoutés au moins deux tensioactifs nonioniques, tel que le Triton X-114, un agent floculant, et un sel, tel que chlorure, sulfate ou phosphate de magnésium, de calcium ou de sodium. Trois phases sont obtenues : une phase aqueuse, une phase détergente contenant l'enzyme et une phase solide contenant la biomasse. Pour séparer ces phases, il est nécessaire d'être en possession d'un appareil de séparation spécial capable de séparer trois phases, tel qu'un décanteur équipé de deux sorties liquides et d'une sortie solide.
De plus, la phase détergente contenant l'enzyme et les tensioactifs est particulièrement visqueuse, car elle contient une grande quantité de tensioactifs (plus de 50 gll de tensioactifs sont en effet mis en oeuvre), elle est donc difficile à traiter. Ce procédé est nécessairement suivi par d'autres étapes de séparation en vue d'obtenir une composition enzymatique industriellement acceptable. Par ailleurs, ce procédé présente le désavantage de
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générer des volumes importants de rejets, contenant des quantités non c négligeables de matière utile, telle que notamment les tensioactifs et des solvants organiques. De ce fait, ce procédé ne permet pas de produire, de manière économique et écologique, une composition riche en enzyme.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour un procédé de récolte d'une protéine microbienne qui soit simple à mettre en oeuvre, économique, rapide, et qui permette d'obtenir un rendement élevé en protéine. Il y a également un besoin pour un procédé de récolte d'une protéine microbienne qui permette d'obtenir cette protéine microbienne sans altération de sa structure et de ses propriétés et avec une activité élevée, et notamment, dans le cas d'une enzyme, avec une activité enzymatique élevée.
L'invention vise à remédier aux inconvénients des procédés connus décrits ci-dessus, en fournissant un procédé amélioré permettant d'obtenir, de manière économique, à partir de la culture d'un microorganisme une protéine microbienne, sans engendrer des rejets volumineux de matières, ni des pertes prohibitives de matière utile.
La présente invention a pour premier but de fournir un procédé de récolte
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d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine, ce procédé étant simple à mettre en oeuvre et ne nécessitant aucun appareil spécial de séparation.
La présente invention a pour autre but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir la protéine avec un rendement élevé.
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne, procédé qui soit économique, ne nécessitant pas de recyclage compliqué et mettant en oeuvre une quantité de produits industriellement et économiquement raisonnable.
La présente invention a pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne, qui est, en même temps, un procédé de concentration et de purification pour la protéine.
La présente invention a, de plus, pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir une protéine microbienne pratiquement pure, c'est-à-dire ne contenant pratiquement plus de protéines contaminantes.
La présente invention a pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir directement une composition protéinique stabilisée et concentrée.
La présente invention a également pour but important de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir directement un produit fini, c'est-à-dire une composition protéinique vendable en l'état sans traitement ultérieur.
La présente invention a pour but de préparer et de fournir une composition protéinique obtenue par le procédé de récolte décrit ci-dessus.
A cet effet, l'invention concerne un procédé de récolte d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine, caractérisé en ce que ce procédé comprend : a) une première étape dans laquelle on élimine, de la culture du microorganisme, au moins une partie de la fraction aqueuse et une partie des impuretés solubles que contient la culture, et on obtient une suspension contenant les microorganismes et la protéine, b) une deuxième étape dans laquelle on ajoute au moins un tensioactif nonionique et un alcool à la suspension obtenue à la première étape, et on obtient une suspension contenant les microorganismes, la protéine, le tensioactif
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nonionique et l'alcool, et c) une troisième étape dans laquelle on élimine les microorganismes, de la suspension obtenue à la deuxième étape,
et on obtient une composition contenant la protéine microbienne, le tensioactif nonionique et l'alcool.
L'invention permet ainsi d'obtenir la protéine microbienne purifiée et concentrée.
Par protéine microbienne, on entend toute protéine produite par un microorganisme. Généralement, la protéine microbienne est une protéine hydrophobe. Habituellement, la protéine microbienne est une enzyme. De préférence, la protéine microbienne est une enzyme choisie parmi les hydrolases, les transferases, les oxidoréductases et les isomerases. De manière particulièrement préférée, la protéine microbienne est une hydrolase. De manière tout particulièrement préférée, la protéine microbienne est une estérase, telle qu'une lipase, une phosphatase, une cutinase, une lipoprotéinelipase ; une glycosidase, telle qu'une glucosidase, une dextranase, une cellulase, une amylase, une galactosidase, une pullulanase, une xylanase ; une peptidase, telle qu'une protéase. D'excellents résultats ont été obtenus avec une lipase.
Cette définition inclut les protéines naturelles et les protéines modifiées, telles que les protéines dont la séquence de nucléotides ou d'acides aminés a été modifiée par des techniques de génie génétique ou par des techniques de mutagénèse.
Généralement, la protéine microbienne provient d'une bactérie, d'un champignon ou d'un virus. Habituellement, la protéine microbienne provient d'une bactérie ou d'un champignon. De préférence, la protéine provient d'une bactérie choisie parmi les Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Streptococcus et Streptomyces, ou d'un champignon choisi parmi les Aspergillus, Geotrichum, Humicola, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus et Fusarium. De manière particulièrement préférée, la protéine provient d'une bactérie choisie parmi les Bacillus, Pseudomonas et Alcaligenes. De bons résultats ont été obtenus lorsque la protéine microbienne provient d'un Pseudomonas. D'excellents résultats ont été obtenus lorsque la protéine microbienne provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 (LMG P-15151).
Cette définition inclut les protéines microbiennes provenant de microorganismes qui sont des dérivés ou des mutants. Par dérivé d'un microorganisme, on entend tout microorganisme modifié naturellement, c'est-à-
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dire par sélection naturelle. Par mutant d'un microorganisme, on entend tout microorganisme modifié artificiellement. Les mutants peuvent être obtenus par les techniques connues de modification, telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15. Des exemples d'agents mutagènes sont notamment décrits par R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368.
Généralement, la protéine microbienne est extracellulaire, intracellulaire ou liée à la membrane de la cellule. Habituellement, la protéine microbienne est liée à la membrane de la cellule.
Selon l'invention, la première étape comprend l'élimination d'au moins une partie de la fraction aqueuse et une partie des impuretés solubles que contient la culture du microorganisme.
Cette première étape permet d'éliminer une grande partie de la fraction aqueuse, et de préférence la majorité de la fraction aqueuse.
Cette première étape permet d'éliminer une grande partie des impuretés solubles, et de préférence la majorité des impuretés solubles.
La suspension obtenue lors de la première étape se présente sous la forme d'un culot ou d'un gâteau selon la technique mise en oeuvre.
Cette première étape peut être réalisée par des techniques connues de l'homme du métier telles que centrifugation, filtration, précipitation, séchage ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
Généralement, la première étape est réalisée par une technique choisie parmi centrifugation, filtration, précipitation, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. Habituellement, la première étape est réalisée par une technique choisie parmi centrifugation, filtration qui inclut l'ultrafiltration, la microfiltration et/ou la diafiltration, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. De préférence, la première étape est réalisée par centrifugation ou filtration.
De façon avantageuse, la première étape comprend l'addition d'un agent floculant à la culture. Généralement, l'agent floculant est choisi parmi les polymères d'acrylamide, les copolymères d'acrylamide et d'acrylate, les polyamines quaternaires et les polysaccharides. Habituellement, l'agent floculant
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est choisi parmi les polyamines quaternaires. De préférence, l'agent floculant est choisi parmi les polyamines quaternaires vendues sous la marque OPTIFLOC De bons résultats ont été obtenus avec l'agent floculant vendu sous la marque OPTIFLOC FC205 (SOLVAY).
Selon l'invention, la deuxième étape comprend l'addition d'au moins un tensioactif nonionique et un alcool à la suspension obtenue à la première étape.
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Par tensioactif nonionique, on entend un composé amphiphile qui ne se dissocie pas en ions dans une solution aqueuse. Le tensioactif nonionique est choisi parmi les éthoxylates, les esters d'acides gras et de composés polyhydroxylés, et les oxydes d'amine. Généralement, le tensioactif nonionique est choisi parmi les éthoxylates.
Les éthoxylates sont également connus sous le nom d'alcools aliphatiques polyéthoxylés (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1994,5e édition, Vol A25, pages 785-787) ou d'alcools gras éthoxylés.
Habituellement, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 10 à environ 20 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 2 et environ 40. De préférence, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 10 à environ 18 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 2 et environ 20. De manière particulièrement préférée, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 3 et environ 11.
De manière tout particulièrement préférée, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 3 et environ 9.
De bons résultats ont été obtenus avec un tensioactif nonionique choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 3, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/30 par Hüls AG ; les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 6, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/60 par Hüls AG ; les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 7, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/70 par Huis AG ;
et les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone
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et ayant un degré d'éthoxylation de 9 tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 par Hüls AG.
D'excellents résultats ont été obtenus avec les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 9 tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 par Hüls AG.
Généralement, on met en oeuvre moins de 10 g de tensioactif nonionique par litre de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 5 g de tensioactif nonionique par litre de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
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Généralement, on met en oeuvre plus de 0, 01 g de tensioactifnonionique par litre de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 0, 05 g de tensioactif nonionique par litre de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 0, 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 0, 1 g à 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
Par alcool, on entend un composé comportant au moins un groupement fonctionnel-OH. Généralement, on met en oeuvre un alcool aliphatique.
Habituellement, on met en oeuvre un polyol. De préférence on met en oeuvre un diol ou un triol. De manière particulièrement préférée, on met en oeuvre le 1,2- éthanediol, le 1, 2-propandiol, le 1,3-butanediol ou le glycérol.
D'excellents résultats ont été obtenus avec le 1,2-propanediol (propylène glycol).
Généralement, on met en oeuvre moins de 75 % (volume) d'alcool par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 60 % (volume) d'alcool par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 50 % (volume) d'alcool par volume de culture.
Généralement, on met en oeuvre plus de 5 % (volume) d'alcool par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 10 % (volume) d'alcool par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 15 % (volume) d'alcool par volume de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 10 à 50 % (volume) d'alcool par volume de culture.
Dans une variante préferée de l'invention, on ajoute au moins un sel au cours de la deuxième étape du procédé.
Par sel, on entend un composé formé d'un anion et d'un cation.
Généralement, le sel est un sel minéral.
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Habituellement, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les cations sont le sodium, le potassium, le magnésium et l'ammonium De préférence, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les cations sont le sodium et le magnésium.
Habituellement, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les anions sont des sulfates, des chlorures, des phosphates, des carbonates, des citrates et un mélange de ceux-ci. De préférence, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les anions sont des sulfates, des chlorures, des phosphates, et un mélange de ceux-ci.
De manière particulièrement préférée, le sel est un chlorure de calcium, un chlorure de sodium ou un mélange de ceux-ci. D'excellents résultats ont été obtenus avec un mélange de chlorure de calcium et de chlorure de sodium.
Généralement, on met en oeuvre moins de 100 mM de sel par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 80 mM de sel par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 70 mM de sel par volume de culture.
Généralement, on met en oeuvre plus de 5 mM de sel par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 10 mM de sel par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 20 mM de sel par volume de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 20 à 70 mM de sel par volume de culture. De bons résultats ont été obtenus en mettant en oeuvre de 20 à 40 mM de chlorure de sodium et de 10 à 20 mM de chlorure de calcium par volume de culture.
Dans une variante préférée de l'invention, on ajoute au moins un tampon au cours de la deuxième étape du procédé. Généralement, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 7 et environ 12. Habituellement, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 7,5 et environ 11. De préférence, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 8 et environ 10,5. De manière particulèrement préférée, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 8,5 et environ 10. De bons résultats ont été obtenus avec un tampon ayant un pH d'environ 9,5. D'excellents résultats ont été obtenus avec du 2-amino-2-hydroxyméthyl-l, 3-propanediol (Tris à pH 9,5).
Dans la variante particulièrement préférée de l'invention, on ajoute, au cours de la deuxième étape du procédé, un tensioactif nonionique, un alcool, un sel et un tampon. De préférence, le tensioactif nonionique est un alcool
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aliphatique polyéthoxylé contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 9. De préférence, l'alcool est le 1,2propanediol. De préférence, le sel est le chlorure de calcium et le chlorure de sodium. De préférence, le tampon est un tampon à pH 9,5, tel que le 2-amino-2- hydroxyméthyl-l, 3-propanediol.
Au cours de la deuxième étape, la suspension peut être agitée ou non.
Si la suspension est agitée, l'agitation est de préférence une agitation axiale. Habituellement, l'agitation est une agitation d'environ 5 à 200 tours par minute. De préférence, l'agitation est une agitation d'environ 10 à 100 tours par minute.
La deuxième étape est réalisée à une température qui n'altère pas la protéine microbienne. Généralement, la deuxième étape est réalisée à une
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température comprise entre environ 2 C et environ 40 C Habituellement, la deuxième étape est réalisée à une température comprise entre environ 5 C et environ 30 C. De préférence, la deuxième étape est réalisée à une température comprise entre environ 10 C et environ 20 C.
Selon l'invention, la troisième étape comprend l'éliminination des microorganismes, de la suspension obtenue à la deuxième étape, une composition contenant la protéine microbienne, le tensioactif nonionique et l'alcool étant obtenue.
Au cours de cette troisième étape, on soumet la suspension obtenue à la deuxième étape à un traitement permettant d'éliminer les microorganismes. Un tel traitement de séparation solide-liquide est connu de l'homme du métier. Des exemples de traitement sont notamment la centrifugation, la filtration, ou une combinaison de ces techniques. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
Ce traitement peut être réalisé par une technique choisie parmi centrifugation, filtration qui inclut l'ultrafiltration, la filtration sur filtre presse, la microfiltration et/ou la diafiltration, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. De préférence, ce traitement est réalisé par centrifugation ou filtration.
L'invention concerne également une composition contenant la protéine microbienne obtenue par le procédé de récolte.
La composition selon l'invention contient de plus des additifs.
Les additifs, compris dans la composition selon l'invention, sont connus de
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l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition.
Ils doivent être compatibles avec la protéine microbienne et ne pas affecter son activité. Dans le cas d'une enzyme, ils ne doivent pas affecter l'activité enzymatique de cette enzyme. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants, des agents de conservation et des agents de formulation.
Cependant, dans la plupart des cas, il n'est plus nécessaire d'ajouter des stabilisants. En effet, un des avantages de l'invention réside dans l'obtention d'une composition déjà stabilisée, puisque contenant un tensioactif nonionique, un alcool et des sels, ceux-ci sont connus pour être des composés qui stabilisent les protéines.
Des exemples d'additifs, ajoutés à des compositions détergentes, sont en particulier décrits dans la demande de brevet britannique 1372034, dans la
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demande de brevet européen 0218272, dans la demande de brevet européen 0 430 315, la demande de brevet européen 0 341 999, la demande de brevet international WO 94/03578, la demande de brevet international WO 94/25556 et la demande de brevet international WO 91/00910.
La composition selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La composition selon l'invention contenant la lipase peut notamment être utilisée en détergence. La présente invention concerne également l'utilisation de la composition contenant la lipase, telle que définie ci-dessus, en détergence. Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence.
La présente invention concerne donc également les compositions de détergence contenant la lipase. Les composants des compositions de détergence sont connus de l'homme du métier et sont adaptés selon l'utilisation envisagée de la composition. De tels composants sont notamment des enzymes, telles que par exemple des protéases, amylases et/ou cellulases ; des agents de charge, tels que du tripolyphosphate de sodium ; des agents de blanchiment, tels que du perborate ; des additifs de formulation ; des tensioactifs. Les compositions de détergence de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
Les compositions détergentes selon l'invention peuvent également contenir d'autres substances choisies en fonction du domaine spécial d'application de la
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composition détergente. Parmi celles-ci, on peut citer les azurants optiques, les inhibiteurs de ternissement, les agents d'antiredéposition des salissures, les
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désinfectants, les inhibiteurs de corrosion, les parfums, les colorants, les agents régulateurs de pH.
Les compositions détergentes de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 : Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu A gélosé à 30 C durant 24 heures.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994.
Le milieu A gélosé contient 10 g/1 de tryptone (DIFCO), 5 g/l d'extrait de
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levure, 5 g/l de NaCI, 20 g/1 d'agar, 2, 5 g/l de NaHC03, 7, 5 g/1 de Na2C03.
Tryptone, extrait de levure, NACI, agar, qui composent le milieu A, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 C durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9, 5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/l de NaHC03 et 75 g/l de Na2C03).
Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide B.
Le milieu B contient 10 g/l de tryptone (DIFCO), 5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de NaCI. Le milieu est stérilisé à 121 C durant 30 minutes. Le pH du milieu est ajusté à 9,5 en ajoutant 10 % (v/v) d'un tampon carbonate qui contient 53 g/1 de Na2C03 et 42 g/l de NaHC03.
La culture est réalisée, dans des fioles de 250 ml, à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit 1 ml de cette culture dans un fiole de 2000 ml contenant 200 ml de milieu liquide B stérilisé. La culture est réalisée à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute
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avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide C stérilisé.
Le milieu C contient K2HP04 2,5 g/l, KH2PO4 2,5 g/l, MgS04. 7H20
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1 g/l, (NH4) 2S04 2 g/l, (NHCO 2 g/l, CaC12 1 g/ !, farine de soja 20 g/1, extrait de levure 2 g/l, glucose 10 g/1, antimousse MAZUOL (MAZER CHEMICALS) 1 g/l. Le pH est ajusté à 8, 5 par de l'hydroxyde de sodium 5 N après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 C). Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121 C. Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à 121 C. Le pH du milieu est maintenu à 8,5 par de l'hydroxyde de sodium 5 N.
La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 30 C, sous une pression de 0,15. 105 Pa (Pa = Pascal) (0,15 bar), avec une aération de 0,3 VVM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) de saturation par régulation de la vitesse d'agitation
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume. L'abréviation % (p/p) représente un pourcentage exprimé en poids par poids
Après 50 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique décrite ci-après.
L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0, 01 N.
Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après.
On mélange 10 g de Trioléine (ROTH 5423.1) et 10 g de gomme arabique (FLUKA 51200) dans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur ULTRA-TURAX à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/1 de NaCI, 2,94 g/1 de
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CaC12 2H20 et 0,61 g/l de Tris (2-amino-2-hydroxyméthyl-l, 3-propanediol).
On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0,01 N, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30 C, on introduit un barreau magnétique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH 0,1 N Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU.
On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH 0,01 N. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en ml).
Ensuite, on réalise le même essai en remplacant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en ml).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit : 1 LU/ml = (VI-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture.
Exemple 2 : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On ajoute à la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1, 1 % (p/p) d'agent floculant OPTIFLOC FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (p/p). Le mélange est agité doucement (agitation axiale de 50 tours par minute) pendant 1 heure à 15 C.
On centrifuge le mélange 10 minutes à 8500 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On élimine le surnageant de centrifugation.
On reprend le culot de centrifugation avec un tampon d'élution, 1 ml de culture étant repris avec 1 ml de tampon d'élution. Le tampon d'élution comprend Tris 3 mM, NaCI 24 mM, CaC12 12 mM, alcool aliphatique polyéthoxylé ayant de 12 à 14 atomes de carbone et un degré d'éthoxylation égal à 9 (éthoxylate) (nombre de groupement EO (oxyde d'éthylène) égal à 9) vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 (Société HULS AG) 0,3 g/1 et propylène glycol 40 % (v/v).
Le mélange est agité doucement (agitation axiale de 50 tours par minute) pendant 15 minutes à 15 C, afin de remettre en suspension le culot de
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centrifugation.
Puis, on centrifuge la suspension, ainsi obtenue, 10 minutes à 8500 tours par minutes à une température de 4 C. On élimine le culot de centrifugation. On mesure l'activité enzymatique du surnageant de centrifugation par la technique décrite à l'exemple 1.
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 116 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.
Exemple 3 : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On reproduit exactement le procédé décrit à l'exemple 2 à l'exception du tampon d'élution.
Dans cet exemple, le tampon d'élution utilisé comprend Tris 4 mM, NaCI 32 mM, CaC12 16 mM, MARLIPAL 24/90 0,4 g/1 et propylène glycol 20 % (v/v).
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 98 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.
Exemple 4R (de comparaison) : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On reproduit exactement le procédé décrit à l'exemple 2 à l'exception du tampon d'élution.
Dans cet exemple, le tampon d'élution utilisé comprend Tris 3 mM, NaCI 24 mM, CaC12 12 mM. Il ne contient pas de propylène glycol.
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 14 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.