JPH10507639A

JPH10507639A - 酵素界面活性剤組成物

Info

Publication number: JPH10507639A
Application number: JP8514259A
Authority: JP
Inventors: ゴルムセン，エリク; 尚子池上; 正信阿保; 忍高木; 紀子堤; ハルキエール，トルベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-10-26
Filing date: 1995-10-26
Publication date: 1998-07-28
Also published as: US5929017A; EP0784675A1; AU3741995A; WO1996013578A1

Abstract

(57)【要約】 Ca²⁺の欠如下でアルカリ性pHで高い活性を有する脂肪分解酵素は、アブシジア属に属する糸状菌の株から得られうる。その脂肪分解酵素は脂肪のよごれに対する界面活性剤の効果を改善するのに有効である。

Description

【発明の詳細な説明】酵素界面活性剤組成物技術分野本発明は、酵素界面活性剤組成物、及び脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤添加物に関する。背景技術脂肪分解酵素は、脂肪染色剤の除去を改善するための界面活性剤に役立つことが知られている。これにより、近年、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyc es lanuginosus) （ヒュミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)とも呼ばれる）から得られる微生ンドに導入されている。他の微生物のリパーゼ、例えばシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepac ia) (US 4,876,024)から、ストレプトマイセーテス(Streptomycetes)(WO 94／149 40)から、及びゴングロネラ・ブトレリ(Gongronella butleri)株NRRL3521（US 3 ,634,195、その株はアブシジア・ブトレリ(Absidia butleri)と以前に命名されている、K．H．Domsch et al.，Compendium of Soil Fungi，Academic Press 19 80，p．381）からのバクテリアのリパーゼも界面活性剤における使用について示唆されている。多くの界面活性剤は溶液中で高いpH（例えば約pH10）のアルカリ性であり、Ca²⁺ イオンに対するビルダーを含み、よって、Ca²⁺の欠如下で高いpHで高い活性を有する脂肪分解酵素の必要性がある。発明の概要驚くことに、我々は、Ca²⁺の欠如下でアルカリ性pHで高い活性を有する脂肪分解酵素が、アブシジア(Absidia)属に属する糸状菌の株から得られうること、並びに脂肪分解酵素が界面活性剤の効果を改善するのに効果的であることを見い出した。従って、本発明は、界面活性剤及びアルカリ性アブシジア脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤組成物を提供する。本発明は、繊維から脂肪汚物を除去するための方法であって、前記界面活性剤組成物を含む水溶液において前記繊維を洗浄することを含むことを特徴とする方法も提供する。本発明は、非散布性粒子、安定な液体、スラリー又は保護された酵素の形態で供される活性構成物としてアブシジア脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤添加物を更に提供する。本発明の他の態様は、株の培養又は組換えDNA 技術のいずれかにより、アブシジア・レフレキサ(Absidia reflexa) 又はアブシジア・スポロホラ−バリアビリス(Absidia sporophora-variabilis) の脂肪分解酵素産生性株から得られたアルカリ性脂肪分解酵素を産生するための方法を提供する。 US 3,634,195は、Ａ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ(rhizomorpha) NRRL2815及びＡ．ブラケスレアナ（A．blakesleeana）NRRL13 05 からのリパーゼの産生を記載する。S．Koritala et al.，J．Am．Oil Chem． Soc．64(4)，509〜13(1987)は、Ａ．コエルラ（A．coerula）NRRL5926及びＡ．ラモサ（A．ramosa） NRRL1309 と共にインキュベートされる場合に大豆油が部分的に加水分解されることを開示する。T．Satyanarayana，Current Science，50( 15)，680〜2(1981)は、Ａ．コリムビフェラ（A．corymbifera）の株によるリパーゼの分泌を開示する。K．Aisaka et a l.，Agric．Biol．Chem.，43(10)，2125〜2129(1979)は、（現在Ａ．ブラケスレアナ(A．blakesleeana) として分類される）アブシジア・ヒアロスポーラ(Absidi a hyalospora) KY303からのリポ蛋白質リパーゼの形成を記載する。しかしながら、先行技術は、アブシジアからの脂肪分解酵素がCa²⁺の欠如下で高いpHで活性であることを開示又は提唱せず、またそれらが界面活性剤に役立つことも開示又は提唱しない。図面の簡単な記載図１〜５は、本発明に従ういくつかの精製された脂肪分解酵素のためのCa²⁺の欠如下での脂肪分解酵素活性対pHのグラフを示す。発明の詳細な記載微生物本発明に用いられる微生物は、M．A．A．Schipper．Persoonia，Vol．14，Par t 2，pp．133〜148(1990)に記載されるようなアブシジア(Absidia)属に属する。この属内において、次の亜属、グループ、種及び株が好ましい。脂肪分解性酵素を産生することができるその変異体も本発明に用いられる。先に認められたいくつかの種の名前はSchipper Op．cit．により再分類され、便利にはいくつかの株の先に用いられる名前も以下に列記されることに注意のこと。先行技術は、Ａ．レフレキサ(reflexa)及びＡ．スポロホラ−バリアビリス(A ．sporophora-variabilis) からの脂肪分解酵素産生を記載しない。それら２つの種はSchipperにより分類される。これらの２つの種による脂肪分解酵素の産生は先に記載され、我々は、これらの種からの脂肪分解酵素が亜属マイコクラドゥス（Mycocladus）及びアブシジア(Absidia)からの脂肪分解酵素から異なることを見い出した。先に言及される株は微生物のための次の寄託機関から自由に利用できる。同じボックス内の複数の数字は、同じ株の複数の寄託を示す。 NRRL : Agricultural Research Service Culture Collection，1815 North Un iversity Street，Peoria，Illinois 61604，USA． ATCC : American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockvil le，Maryland 20852，USA． CBS : Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Oosterstraatl，3740 AG Ba arn，Netherlands． CMI : CAB International Mycological Institute，Ferry Lane，Kew，Surrey TW9 2AF，U.K． IFO : Institute for Fermentation，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogaw a-ku，Osaka 532，Japan．脂肪分解酵素は、適切な栄養培地中で先の微生物のいずれかを培養し、次に任意に、当業者に公知であり、又は本明細書に記載されるような方法に従って回収及び精製することによって、産生され得る。酵素の特性本発明の酵素は脂肪分解酵素である。本文脈において、“脂肪分解酵素”という言葉は、Recommendations（1992）of the International Union of Biochemis try and Molecular Biology（IUBMB）に従って酵素分類番号E.C．3.1.1−（カルボキシルエステルヒドロラーゼ）下に分類された酵素を示すことが意図される。これにより脂肪分解酵素は、E.C．3.1.1の文脈において言及されるエステル結合、例えばモノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質（全てのクラス）、チオエステル、コレステロールエステル、ワックス−エステル、クチン、スベリン、合成エステル等中に存在するエステルの少くとも１つのタイプに対して加水分解活性を示す。例えば、本発明の脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対する活性（リパーゼ活性、E.C．3.1.1.3）、例えば１，３−位置に特異的なリパーゼ活性を有し得る。本発明の脂肪分解酵素は、遊離Ca²⁺の欠如下でさえアルカリ性pH（約pH９〜10 ）において高い活性を有することを特徴とする。更に詳しくは、これらの脂肪分解酵素は、以下に記載されるOPID法により、遊離Ca²⁺の欠如下でテストされた時に約pH９以上において最適活性を有する（pH８よりpH９で高い活性を有する）。いくつかの好ましい脂肪分解酵素は、遊離Ca²⁺なしでpH９において、及び20LU ／mlの脂肪分解酵素濃度（LU及びOPIDは以下に規定される脂肪分解酵素活性単位である）、即ちオリーブオイルとトリブチリンとの間の少くとも0.15OPID／LUの活性比率でテストされた場合に少くとも３OPIDユニット／mlの活性を有する。このような脂肪分解酵素は、アブシジア亜属マイコクラドゥス、例えば先に列記される種及び株から得られうる。好ましい脂肪分解酵素の他の群は、Ca²⁺の欠損下でpH９よりpH10で高い脂肪分解酵素活性を有する。このような脂肪分解酵素は、Ａ．レフレキサ、例えば先に列記される株から得られうる。この脂肪分解酵素は新しく、本発明により供される。好ましい脂肪分解酵素の更なる群は、pH10，45℃における30分のインキュベーションの後に90％超の残存活性を保持する。このような脂肪分解酵素は、Ａ．スポロホラ−バリアビリスの株、例えば先に列記される株から得られうる。この脂肪分解酵素は新しく、本発明により供される。リパーゼ活性測定（LU）１リパーゼ単位（LU）は、30.0℃，pH7.0(リン酸緩衝液)において基質としてのトリブチリン及び乳化剤としてのアラビアゴムで、分当りに滴定脂肪酸１μモルを遊離する酵素の量である。リパーゼ活性測定（OPID） pH７〜10の範囲の遊離Ca²⁺なしでの脂肪分解酵素活性は、特定のpHにおいて、 10分間、40℃におけるオリーブ油：２％PVA 溶液（１：３）の基質エマルションでテストされる。その反応の終りにおいて、その反応混合物は、酸性条件下でクロロホルム：メタノール（１：１）により抽出され、その反応の間に遊離した脂肪酸がTLC-FID 分析(latroscan)により測定される。１単位(OPIDU)は、分当りの脂肪酸のμモルの遊離として与えられる。各々のテストにおいて、200mM の緩衝液（Tris-HCl緩衝液、pH７及び８、ジエタノールアミン緩衝液、pH８，９及び10）と共に、10mM EDTA が用いられる。免疫化学的特性アブシジアの株に対してネイティブである脂肪分解酵素のものと同一又は部分的に同一の免疫化学的特性を有し、先に言及される特性を有する位置的に非特異的な脂肪分解酵素は本発明の範囲内である。免疫化学的特性は、免疫学的交差反応同定テストにより測定され得る。その同定テストは、公知のオクタロニー二重免疫拡散法により、又はI ．M．Roitt ; Im munology，Gower Medical Publishing（1985）及びN ．H．Axelsen ; Handbook o f Immunopreciptitation-in-Gel Techniques，Blackwell Scientific Publicati ons（1983）Chapter 5 and 14 に従う双頭交差免疫電気泳動により行われ得る。免疫化学的同定（抗原同定）及び部分的免疫化学同定（部分的抗原同定）が、Ax elsen、前掲、Chapters 5，19及び20 and Roit、前掲、Chapter 6 に記載される。免疫学的テストに用いるための単一特異性抗血清は、例えばN．H．Axelsen、前掲のChapter 41又はN．H．Axelsen et al.，A Manual of Quantitative Immun oelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications(1973)のChapter 23に記載されるように、精製された脂肪分解酵素に対して例えばウサギにおいて作られ得る。脂肪分解酵素の産生本発明の脂肪分解酵素は、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で先に記載される微生物の１つを培養し、次にその脂肪分解酵素を回収することにより作られ得る。培養の後、脂肪分解酵素は、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せのような慣用的方法により培養物から回収され、精製され得る。便利な精製方法は、任意的なバッチ精製及び次の２段階クロマトグラフィーからなる。任意的なバッチ精製は、DEAE Streamline（Pharmaciaの製品）、Super- Q Toyopearl、陰イオン交換樹脂又はMa croprep HIC Support hydrophobic（Biorad の製品）により行われ得る。２段階クロマトグラフィーの１部は、例えばPhenyl Toyopearl，Butyl Toyopearl 又は Macroprep HIC Support hydrophobic での疎水クロマトグラフィーからなる。２段階クロマトグラフィーの他の部分は、陰イオン交換樹脂、例えばDEAE Toyopea rl又はSuper-Q Toyopearl で行われ得る。その２段階はいずれかの順番で行われ得る。脂肪分解酵素の適用本発明の脂肪分解酵素は、例えば、施設及び工業的クリーリングにおける並びに皮の処理における洗濯及び皿洗いの界面活性剤中での、特に高いpHにおける脂肪分解酵素の慣用的な適用に用いられ得る。本発明の脂肪分解酵素は、脂肪及び油の全体の加水分解のために、並びに光学異性体分解処理において、相互エステル化のためにも用いられ得る。界面活性剤添加物本発明によれば、脂肪分解酵素は、界面活性剤組成物における添加物として典型的に用いられ得る。この添加物は、便利には、非散布性粒子、安定な液体、スラリー又は保護された酵素として製剤化される。本発明の脂肪分解酵素を含む界面活性剤添加物についての適切な活性範囲は 5 ,000〜 100,000 OPIDU／ｇ（pH９で測定されたOPID）又は添加物のｇ当り0.01〜 100mg の純粋な酵素蛋白質である。界面活性剤有利には、本発明の脂肪分解酵素は遊離Ca²⁺の欠如下でさえアルカリ性pH（約 pH９〜10）で高い活性を有する。これは、遊離Ca²⁺に結合するための高い含有量のビルダーを有する界面活性剤中でさえ、これらの脂肪分解酵素を広範囲の界面活性剤において用いるのに十分に適したものにする。本発明の脂肪分解酵素は、界面活性剤中で便利に用いられる濃度で組み込まれ得る。本発明の界面活性剤組成物は、界面活性剤のグラム当り10〜50,000LU、好ましくは20〜5,000LU／ｇに相当する量の脂肪分解酵素を含み得る。その界面活性剤は水に溶かされて、洗浄液のリッター当り25〜15,000LUに相当する量の脂肪分解酵素を含む洗浄液を形成する。脂肪分解酵素蛋白質の量は、界面活性剤のグラム当り 0.001〜10mg又は洗浄液のリッター当り 0.001〜100mg であり得る。界面活性剤組成物本発明によれば、脂肪分解酵素は、典型的に界面活性剤組成物の構成物であり得る。このような場合、それは非散布性粒子、安定な液体、又は保護された酵素の形態で界面活性剤組成物内に含まれ得る。非散布性粒子は、例えばUS 4,106,9 91及び4,661,452(両方ともNovo Industri A/S)に開示されるように作られ得、当該技術で周知である方法により任意に被覆され得る。ろう状被覆材料の例は、平均分子量 1,000〜20,000を有するポリ（エチレンオキシド）製品(ポリエチレングリコール、PEG)；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコールが12〜20炭素原子を含み、15〜80エチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ −及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフイルム形成性被覆材料の例は、特許GB 1483591に供される。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのような多価アルコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることによって安定化され得る。他の酵素安定化剤は当該技術において公知である。保護された酵素は、EP 238,216に開示される方法に従って調製され得る。本発明の界面活性剤組成物は、例えば粉体、粒子、ペースト又は液体として、いずれかの便利な形態であり得る。液体界面活性剤は70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を典型的に含む水性又は非水性であり得る。界面活性剤組成物は、その各々が陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、又は双性イオン性であり得る１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第２アルカンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルもしくはアルケニルコハク酸、又はセッケンのような陰イオン性界面活性剤を０〜50％含むであろう。それは、アルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又は（例えば WO 92／06154 に記載されるような）ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドのような非イオン性界面活性剤も０〜40％含み得る。界面活性剤組成物は、アミラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼのような１以上の他の酵素を更に含み得る。界面活性剤は、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、クエン酸、ニトリロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTM PA)、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートもしくは層状シリケート（例えばHoechst からの SKS−６）のような１〜65％の界面活性剤ビルダー又は複合剤を含み得る。界面活性剤は、洗浄増進されなくても、即ち界面活性剤ビルダーが本質的になくてもよい。界面活性剤は、１以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG )、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリアクリレートのようなポリカルボキシレート、マレイン／アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーがある。界面活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）のような過酸形成性漂白活性剤と組み合わせられ得るペルボレート又はペルカルボネートのようなH₂O₂ソースを含み得る漂白システムを含み得る。あるいは、漂白システムは、例えばアミド、イミド、又はスルホンタイプの過酸を含み得る。本発明の界面活性剤組成物の酵素は、慣用的な安定化剤、例えばプロピレングリコールもしくはグリセリンのような多価アルコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体を用いて安定化され得、本組成物は例えば WO 92／19709 及び WO 92／19708 に記載されるように製剤化され得る。界面活性剤は、例えばクレー、泡ブースター、セッケン泡サプレッサー、防食剤、汚れ懸濁剤、抗汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤、視覚的光沢剤、又は香料のような他の慣用的界面活性剤成分も含み得る。（使用濃度において水溶液中で測定された）pHは、通常例えば７〜11の範囲内で中性又はアルカリ性であるだろう。本発明の範囲内の界面活性剤の特定の形態は以下のものを含む。１）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物２）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物３）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物４）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物５）次のものを含む水溶液界面活性剤組成物６）次のものを含む水性構造液界面活性剤組成物７）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物８）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性剤組成物９）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 10）次のものを含む水溶液組成物 11）次のものを含む水溶液界面活性剤組成物 12）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全て又は一部分が（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェートにより置換されている１）〜12）に記載の界面活性剤製剤 14）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 15）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 16）更なる構成物として又は既に特定された漂白システムのかわりとしてのいずれかの安定化又はカプセル化過酸を含む１）〜15）に記載の界面活性剤製剤 17）ペルボレートがペルカルボネートにより置換されている１），３），７），９）及び12）に記載の界面活性剤組成物 18）マンガン触媒を更に含む１），３），７），９），12），14）及び15）に記載の界面活性剤組成物。マンガン触媒は、例えば、“Efficient manganese ca talysits for low-temperature bleaching”，Nature 369，1994，pp．637 〜63 9 に記載される化合物の１つであり得る。 19）直鎖アルコキシル化第１アルコール、ビルダーシステム（例えばホスフェート）、酵素及びアルカリのような液状非イオン性界面活性剤を含む非水性界面活性剤液として製剤化された界面活性剤組成物。その界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤及び／又は漂白システムも含み得る。実施例培養培地以下の表に示される培地を本実施例に用いた。実施例１Ａ．コリムビフェラ（A．corymbifera）からの脂肪分解酵素の産生Ａ．コリムビフェラ株NN100062を、100ml のRS-G培地を含む振とうフラスコ内で30℃で３日間、培養した。2,500ml の無細胞ブイヨンを、細胞量を除去した後に50振とうフラスコから回収した。これを凍結乾燥して以下の実施例に用いられる 379LU／ｇの脂肪分解酵素活性を有する58ｇの粉体サンプルを得た。実施例２Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の洗浄効果脂肪分解酵素（先の実施例からの粉体調製物）の洗浄効果を、pH10において、陰イオン性界面活性剤(LAS)を含む界面活性剤中で汚れた繊維を洗浄することにより測定した。テストは、次の条件下でTerg-O-tometer研究用洗浄機内で行った。温度 30℃ 時間 30分撹拌 100rpm 界面活性剤 0.25ｇ／ｌ of LAS(直鎖アルキルベンゼンスルホネート、製品名 Nansa HS 80／Ｓ) ＋1.0ｇ／ｌ of Na₂CO₃ 水 Tap 水（約18°German hardness） pH 10.0 脂肪分解酵素投与量 2,000 LU／ｌテスト材料各々85μＬのオリーブ油で染色した綿布７×７cm 布／液体比７きれ／500ml 洗浄後、ソックスレー抽出し、残りの油の量を重量で測定した。残った油の組成を TLC／FID 分析により測定した。脂肪分解酵素を含まない対照実験を同様に行った。結果は次の通りである。脂肪分解酵素が、全量の残った油を減少させるのに、特にLAS の存在下でpH10 .0で洗浄することにおいてトリグリセリドの量を減らすのに有効であることが見られる。実施例３Ａ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)からの脂肪分解酵素の産生及び精製本実施例において、アラビアゴムで乳化されたオリーブ油を用いて脂肪分解酵素活性を測定した。条件は、40℃，pH10(100mMグリシン緩衝液)である。１単位は、分当りに１μモルのNaOHと当量の脂肪酸の滴定量を遊離する酵素の量に従う。Ａ．ブラケスレアナ株NN100826を100ml のOM培地を含む振とうフラスコ中で30 ℃で３日間、培養した。脂肪分解酵素産物は41ユニット／mlであった。培養ブイヨンを50の振とうフラスコから収集し、２Ｌの脱イオン水で洗浄した後、限外ろ過することにより２Ｌに濃縮した。冷却チャンバー内で撹拌しながら、その濃縮ブイヨンに粉砕硫酸アンモニウムを40％飽和まで加え、４℃で１時間、放置した。遠心により沈殿を除いた。硫酸アンモニウムを50％飽和まで更に加え、その沈殿を除いた。その上清を180m l に濃縮して、４℃において 20mM Tris／HCl 緩衝液(pH8.5)中でセルロースチューブを用いて一晩透析し、凍結乾燥した。1,500ユニット／ｇの活性を有する 9.8ｇの粉状脂肪分解酵素調製物を得た。冷却したアセトンを培養ブイヨンに加え、その調製物を凍結乾燥することにより更なる粉状脂肪分解酵素調製物を得た。実施例４Ａ．ブラケスレエアナ脂肪分解酵素の洗浄効果先の実施例からの粉状脂肪分解酵素調製物を、以下の変更を伴って先の洗浄例と同じ方法でテストした：洗浄時間を20分とした；各々の布きれを50μＬの油で染色した；洗浄テストの前に室温で２日間、その布きれをおいた；そしてpH、界面活性剤及び脂肪分解酵素投与量を以下に示す。分析データを用いて残ったエステル結合（μモル）及び加水分解の程度を計算した。脂肪分解酵素は残った油の量を減らし、加水分解の割合を増加させ、これにより残ったエステル結合の数を減らすのに有効であった。実施例５Ａ．ブラケスレアナからの脂肪分解酵素の産生Ａ．ブラケスレアナ株NN100826を、水中39ｇ／ｌのPDA（Difcoの製品）及び10 ｇ／ｌの寒天の斜面上で５週間、胞子形成させた。水中Tween の 0.1％溶液９mlを斜面上に注いで胞子懸濁液とした。３mlの胞子懸濁液を100ml のYS-2S0培地を含む500ml のじゃま板付振とうフラスコ（２のじゃま板）内に接種して、そのフラスコを、24時間、34℃で振とう（ 230rpm）しながらインキュベートして種培養物を調製した。種培養物をホモジナイズしてペレット形状の菌糸体に分け、２mlのホモジナイズされた培養物を、100ml のOMM 培地及び２％の大豆レシチンを含む振とうフラスコ内に接種した。そのフラスコを30℃で振とう（230rpm）しながらインキュベートした。２日の培養後、そのブイヨンは、17.0LU／mlの脂肪分解活性及び6.7 のpHを有していた。実施例６脂肪分解酵素の精製Ａ．ブラケスレエアナ株NN100826からの脂肪分解酵素を、以下の通り３ステップのクロマトグラフィー、即ちStreamline DEAE、フェニル−及びDEAE-Toyopear lにより精製した。 Streamline DEAE カラムクロマトグラフィー。先の実施例で調製された50の振とうフラスコからの培養ブイヨンを遠心して無細胞ブイヨン 2.8Ｌを得た。これを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH10で予め平衡化されたStreamline DEAE 600m l に適用した。流速は 100 ml／分であった。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、結合した脂肪分解酵素を、 0.6Ｍ NaCl を含む50mM Tris 緩衝液、pH7.2 により溶出した。開始脂肪分解酵素活性の38％及び36％を各々その溶出液及び通過画分中で回収した。即ち全回収率は74％であった。更なる精製のために、樹脂に結合した脂肪分解酵素を用いた。その脂肪分解酵素溶液を中和し、次にUFモジュール、3,000 NMWLにより濃縮した。回収率は47％であった。遠心した後、脂肪分解酵素を 0.2μｍ膜を通してろ過した。フェニルToyopearl カラムクロマトグラフィー。勾配溶出において、脂肪分解酵素活性は、検出するのが難しい極めて広いピークを供した。かわりに、1.4Ｍ酢酸アンモニウムの60分、純水の30分及び20％エタノールの30分でのステップ溶出を用いた。脂肪分解酵素活性は２つのピークを供した。１つは水により溶出され（“脂肪分解酵素Ａ”）、そして他方は20％EtOHにより溶出された（“脂肪分解酵素Ｂ”）。回収率は、脂肪分解酵素Ａについて41％、脂肪分解酵素Ｂについて33％であった。各々の脂肪分解酵素を濃縮してUFモジュール、3,000 NMWLにより脱イオン化した。回収率は各々94％及び91％であった。 DEAE Toyopearlカラムクロマトグラフィー。脂肪分解酵素Ａを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）から50mM Tris 緩衝液(pH7.2)＋ 0.6Ｍ NaCl への勾配溶出により精製した。高脂肪分解酵素活性を有する画分をプールした。収率は66％であった。脂肪分解酵素を濃縮して、UFモジュール、3,000 NMWLにより脱イオン化した。回収率は69％であった。 SDS-PAGEは、単一蛋白質バンドの純粋である脂肪分解酵素を示した。pH8.0 における等電点及び25,400の分子量を有することが見い出された。純粋な脂肪分解酵素の特異活性は3,300 〜 4,100LU／mg であることが見い出された。脂肪分解酵素Ｂを同様に精製し、SDS-PAGEによりそれが脂肪分解酵素Ａと同一であることを確認した。実施例７種々のアブシジア株からの脂肪分解酵素の産生以下の表に示される各々のアブシジア株を、以下のステップによる脂肪分解酵素産生のために用いた。種培養。（NN100826が除かれた）YS-2培地で27℃で２日間、主培養。27℃（示されるように１つの場合に30℃）で示される培地を用いる振とうフラスコ内。その培養時間及び得られた脂肪分解酵素収率も表２に示す。回収及び精製。無細胞サンプルを得るために遠心し、次に粉状サンプルを作るために凍結乾燥。培養条件及び結果の収率を以下に示す。実施例８アブシジア脂肪分解酵素に対するpH及びCa²⁺の効果 20LU／mlの脂肪分解酵素量を用いる先に記載のOPID法により、Ca²⁺なしでpH７〜10の範囲において脂肪分解酵素活性をテストした。次の株からの本発明に従う精製された酵素をテストした：Ａ．ブラケスレエアナ NN000591 Ａ．ブラケスレエアナ NN000987 Ａ．ブラケスレエアナ NN100826 Ａ．コリムビフェラ NN100062 Ａ．レフレキサ NN102424 結果を添付の図面に示す。 Ca²⁺の欠如下において、テストされた全てのアブシジア脂肪分解酵素は、pH８よりpH９においてより高い活性を示し（約pH９以上で最適）、Ａ．レフレキサからの脂肪分解酵素はpH９よりpH10においてより高い活性を示す（約pH10以上で最適）。（Ａ．ブラケスレエアナ及びＡ．コリムビフェラにより供される）アブシジア亜属マイコクラドゥスからの脂肪分解酵素は、Ca²⁺の欠如下でpH９において、20LU／mlの脂肪分解酵素投与量について３ OPIDU／ml超、即ち0.15 OPIDU／LU 超の比率で活性を示す。実施例９ pH10における脂肪分解酵素活性についてのプレートテスト (JP-W 1-501120に相当する)WO 88／02775 の実施例11に記載されるプレートテストを用いてCa²⁺あり及びなしでのpH10での脂肪分解酵素活性についてチェックした。実施例７に列記される全ての株からの脂肪分解酵素調製物は、Ca²⁺の添加があるもの及びないものの両方で、pH10において脂肪分解酵素活性を示すことが見い出された。実施例10 脂肪分解酵素のpI及びMW いくつかの株からの精製された脂肪分解酵素を用いて、分取等電点電気泳動により等電点（pI）を、SDS-PAGEにより分子量（MW）を測定した。結果は次の通りであった。Ａ．ブラケスレエアナNN100826からのリパーゼの分離精製は、サイズが31〜32 kDa であることを示唆する。それゆえ、25kDa リパーゼはおそらく少し端が切り取られたリパーゼ分子をおそらく示す。実施例11 Ａ．ブラケスレエアナ脂肪分解酵素の構造的特徴Ａ．ブラケスレアナNN000591及びNN000987からの脂肪分解酵素のＮ末端配列を、エレクトロブロッティングに従って決定した。両方の脂肪分解酵素は、約30kD a の分子量を有する。 NN000987からの脂肪分解酵素のＮ末端アミノ酸配列決定は、添付の配列表における配列番号：１として示される配列を供した。 NN000591からの脂肪分解酵素のＮ末端配列決定は、配列番号：２及び配列番号：３として示される２つの配列を供した。 NN000591について、配列番号：３として示されるＮ末端配列は、配列番号：２として示されるＮ末端配列のアミノ酸残基６で開始することが見られた。これにより、２つの配列は、合成又は精製のいずれかの間の同じ蛋白質の可変性の過程を示す。更に、NN000987についての配列番号：１及びNN000591についての配列番号：２は同じＮ末端配列を表すことが明らかであり、２つの脂肪分解酵素はほぼ同一であると確信される。これにより、３つの先のＮ末端配列に基づき、成熟脂肪分解酵素は配列番号：４として示されるＮ末端配列を有すると結論づけられる。 NN000591調製物中の30kDa 脂肪分解酵素に加えて、約21kDa の分子量のバンドが見られた。エレクトロブロッティングの後のこの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列決定は、配列番号：５として示される配列を供した。このＮ末端配列は、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei) からのリパーゼについての周知の配列の通りにアラインされ得、それが全長の30kDa 脂肪分解酵素のフラグメントであることが結論づけられた。 NN000591脂肪分解酵素を、リシル特異的プロテアーゼでのデグラデーションの前に還元し、Ｓ−カルボキシメチル化した。その結果生ずるペプチドを分別して、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行う前に逆相HPLCを用いて再精製した。配列番号：６〜10として示されるペプチド配列を得た。その配列を、リゾムコール・ミエヘイ及びリゾプス・デレマール（Rhizopus d elemar）からのリパーゼの周知の配列とアラインすることにより、全長の脂肪分解酵素がこの順番で配列番号：４〜10の配列を含むことが結論づけられた。これらの配列において、Xaa は、同定され得なかったアミノ酸を表す。Asx はAsp と Asn とが区別できなかった位置を指す。配列番号：５の位置１及び９のアミノ酸は不確かである。実施例12 Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の精製Ａ．コリムビフェラ株NN100062からの脂肪分解酵素を次の通り精製した。ストリームライン。株の培養により得られた粗酵素粉体を50mM炭酸ナトリウム緩衝液中に溶かした。遠心後、脂肪分解酵素サンプルを同緩衝液で平衡化された膨潤されたDEAE樹脂上に吸着させ、次に樹脂を同緩衝液で洗浄した。その脂肪分解酵素を 0.5Ｍ NaCl を含むTris-HCl緩衝液(pH7.6)で溶出した。このステップの収率は52％であった。ブチルToyopearl 第２のステップは、予め充填されたブチルToyopearl 及びHPLCを用いるクロマトグラフィーである。濃縮脂肪分解酵素を１Ｍ酢酸アンモニウムの塩濃度に調節し、次に１Ｍ酢酸アンモニウムで平衡化されたカラム上に吸着させた。１〜０Ｍ硫酸アンモニウム及び20％エタノールの直線勾配で溶出を行った。各々の画分の脂肪分解酵素活性を測定し、高脂肪分解酵素活性の画分を集めて、マイクロアシライザー(micro asilizer)(Asahi Kaseiの製品)で脱塩した。 DEAE Toyopearlカラムクロマトグラフィー。第３のステップは予め充填されたDEAE Toyopearl及びHPLC（Watersの製品）を用いる陰イオンカラムクロマトグラフィーである。脂肪分解酵素をpH8.5 に調節した。これを、50mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.5)で平衡化されたカラムに適用し、脂肪分解酵素を０〜 0.5Ｍ NaCl の直線勾配で溶出した。高脂肪分解活性の画分を集めて、得られた脂肪分解酵素を濃縮した。このステップの収率は66％であった。ゲルろ過最終ステップはゲルろ過である。用いられる緩衝液は0.15Ｍ NaCl を含む50mM Tris-HCl であった。再び高脂肪分解酵素活性の画分を集めた。精製を次の表に要約する。実施例13 Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の構造的キャラクタリゼーションＡ．コリムビフェラNN100062の脂肪分解酵素の構造を実施例11と同じ様に研究した。Ｎ末端配列決定は、配列番号：11として示される配列を供した。デグラデーションの後に得られたペプチドが、配列番号：12〜16及び18〜19として示される配列を有することが見い出された。配列番号：12の残基Asn 20がグリコシル化されていることが見い出された。比較することにより、配列番号：15のＣ末端における22アミノ酸が配列番号： 16のＮ末端におけるそれと同一であることが示され、これら２つの配列が配列番号：17として示されるより大きなフラグメントの一部分を形成することが結論づけられた。リゾムコール・ミエヘイ及びリゾプス・デレマールからのリパーゼの周知の配列とのアラインメントにより、全長の脂肪分解酵素が、配列番号：11〜 14及び17〜19の配列をこの順番で含むことが結論づけられた。実施例14 Ａ．スポロホーラ−バリアビリスからの脂肪分解酵素のアルカリ安定性 pH10における50mMグリシン緩衝液中のＡ．スポロホーラ−バリアビリスから、約10LU／mlの脂肪分解酵素を含む酵素溶液を調製した。この溶液の一部を45℃で 30分、インキュベートして迅速に冷却した。脂肪分解酵素活性を、インキュベーションの前及び後に測定した。その結果は、97％の残存活性がインキュベーションの後に残っていることを示した。実施例15 Ａ．スポロホーラ−バリアビリスからの脂肪分解酵素の基質アフィニティー非イオン性界面活性剤Dobanol 25-7（2,500ppm）の存在下でアルカリ性pH(pH9 .0)において基質相（オリーブオイル）上／中で脂肪分解酵素が蓄積する能力の簡単な測定のために次の手順を用いた。非イオン性界面活性剤を有する緩衝液中の脂肪分解酵素の２つの同一の溶液を密閉可能バイアル内で調製し、その溶液の１つに基質を加えた。両方の溶液を激しく振とうしながらインキュベートし、残存脂肪分解酵素活性を、基質の分離及び除去の後に（先に規定されるLUにおいて）測定した。次の組成を用いた：緩衝液： 100mM グリシン(pH9.0) 非イオン性界面活性剤 100ppmアルコールエトキシレート (Dobanol^TM25-7) 基質：オリーブ油緩衝液：基質 50：50 v／v インキュベーション温度４℃ 開始脂肪分解酵素活性５−10LU／ml インキュベーション時間一晩（24−26時間）結果は、基質なしでの活性に対する基質と共にインキュベートされた後の残存活性として供される。Ａ．スポロホーラ−バリアビリス脂肪分解酵素 39％結果は、Lipolaseが、用いられた条件下で水相に全体的に残る傾向があるのに対して、Ａ．スポロホーラ−バリアビリスからの脂肪分解酵素は、一晩のインキュベーションの後に水相中で添加された活性の50％未満を残すオリーブ油のためのより高いアフィニティーを有することを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年５月１５日【補正内容】酵素界面活性剤組成物技術分野本発明は、酵素界面活性剤組成物、及び脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤添加物に関する。背景技術脂肪分解酵素は、脂肪染色剤の除去を改善するための界面活性剤に役立つことが知られている。これにより、近年、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyc es lanuginosus) （ヒュミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)とも呼ばれる）から得られる微生ンドに導入されている。他の微生物のリパーゼ、例えばシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepac ia) (US 4,876,024)から、ストレプトマイセーテス(Streptomycetes)(WO 94／149 40)から、及びゴングロネラ・ブトレリ(Gongronella butleri)株NRRL352l（US 3 ,634,195、その株はアブシジア・ブトレリ(Absidia butleri)と以前に命名されている、K．H．Domsch et al.，Compendium of Soil Fungi，Academic Press 19 80，p．381）からのバクテリアのリパーゼも界面活性剤における使用について示唆されている。多くの界面活性剤は溶液中で高いpH（例えば約pH10）のアルカリ性であり、Ca²⁺ イオンに対するビルダーを含み、よって、Ca²⁺の欠如下で高いpHで高い活性を有する脂肪分解酵素の必要性がある。発明の概要驚くことに、我々は、Ca²⁺の欠如下でアルカリ性pHで高い活性を有する脂肪分解酵素が、アブシジア(Absidia)属に属する糸状菌の株から得られうること、並びに脂肪分解酵素が界面活性剤の効果を改善するのに効果的であることを見い出した。従って、本発明は、界面活性剤及びアルカリ性アブシジア脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤組成物を提供する。本発明は、繊維から脂肪汚物を除去するための方法であって、前記界面活性剤組成物を含む水溶液において前記繊維を洗浄することを含むことを特徴とする方法も提供する。本発明は、非散布性粒子、安定な液体、スラリー又は保護された酵素の形態で供される活性構成物としてアブシジア脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤添加物を更に提供する。本発明の他の態様は、アブシジア・レフレキサ(Absidia reflexa)の株から得られ、Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10でより高い脂肪分解酵素活性を有する脂肪分解酵素を提供する。 US 3,634,195は、Ａ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ(rhizomorpha) NRRL2815及びＡ．ブラケスレエアナ（A．blakesleeana）NRRL 1305 からのリパーゼの産生を記載する。S．Koritala et al.，J．Am．Oil Chem ．Soc．64(4)，509〜13(1987)は、Ａ．コエルラ（A．coerula）NRRL5926及びＡ．ラモサ（A．ramosa） NRRL1309 と共にインキュベートされる場合に大豆油が部分的に加水分解されることを開示する。T．Satyanarayana，Current Science，5 0(15)，680〜2(1981)は、Ａ．コリムビフェラ（A．corymbifera）の株によるリパーゼの分泌を開示する。K．Aisaka et al.，Agric．Biol．Chem.，43(10)，21 25〜2129(1979)は、（現在Ａ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)として分類される）アブシジア・ヒアロスポーラ(Absidia hyalospora) KY303からのリポ蛋白質リパーゼの形成を記載する。しかしながら、先行技術は、アブシジアからの脂肪分解酵素がCa²⁺の欠如下で高いpHで活性であることを開示又は提唱せず、またそれらが界面活性剤に役立つことも開示又は提唱しない。図面の簡単な記載図１〜５は、本発明に従ういくつかの精製された脂肪分解酵素のためのCa²⁺の欠如下での脂肪分解酵素活性対pHのグラフを示す。発明の詳細な記載微生物本発明に用いられる微生物は、M．A．A．Schipper．Persoonia，Vol．14，Par t 2，pp．133〜148(1990)に記載されるようなアブシジア(Absidia)属に属する。この属内において、次の亜属、グループ、種及び株が好ましい。脂肪分解性酵素を産生することができるその変異体も本発明に用いられる。先に認められたいくつかの種の名前はSchipper Op．cit．により再分類され、便利にはいくつかの株の先に用いられる名前も以下に列記されることに注意のこと。先行技術は、Ａ．レフレキサ(reflexa)からの脂肪分解酵素産生を記載しない。その種はSchipperにより分類される。この種による脂肪分解酵素の産生は先に記載され、我々は、この種からの脂肪分解酵素が亜属マイコクラドゥス（Mycocl adus）及びアブシジア(Absidia)からの脂肪分解酵素から異なることを見い出した。先に言及される株は微生物のための次の寄託機関から自由に利用できる。同じボックス内の複数の数字は、同じ株の複数の寄託を示す。 NRRL : Agricultural Research Service Culture Collection，1815 North Un iversity Street，Peoria，Illinois 61604，USA． ATCC : American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockvil le，Maryland 20852，USA． CBS : Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Oosterstraatl，3740 AG Ba arn，Netherlands． CMI : CAB International Mycological Institute，Ferry Lane，Kew，Surrey TW9 2AF，U.K． IFO : Institute for Fermentation，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogaw a-ku，Osaka 532，Japan．脂肪分解酵素は、適切な栄養培地中で先の微生物のいずれかを培養し、次に任意に、当業者に公知であり、又は本明細書に記載されるような方法に従って回収及び精製することによって、産生され得る。酵素の特性本発明の酵素は脂肪分解酵素である。本文脈において、“脂肪分解酵素”という言葉は、Recommendations（1992）of the International Union of Biochemis try and Molecular Biology（IUBMB）に従って酵素分類番号E.C．3.1.1−（カルボキシルエステルヒドロラーゼ）下に分類された酵素を示すことが意図される。これにより脂肪分解酵素は、E.C．3.1.1の文脈において言及されるエステル結合、例えばモノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質（全てのクラス）、チオエステル、コレステロールエステル、ワックス−エステル、クチン、スベリン、合成エステル等中に存在するエステルの少くとも１つのタイプに対して加水分解活性を示す。例えば、本発明の脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対する活性（リパーゼ活性、E.C．3.1.1.3）、例えば１，３−位置に特異的なリパーゼ活性を有し得る。本発明の脂肪分解酵素は、遊離Ca²⁺の欠如下でさえアルカリ性pH（約pH９〜10 ）において高い活性を有することを特徴とする。更に詳しくは、これらの脂肪分解酵素は、以下に記載されるOPID法により、遊離Ca²⁺の欠如下でテストされた時に約pH９以上において最適活性を有する（pH８よりpH９で高い活性を有する）。いくつかの好ましい脂肪分解酵素は、遊離Ca²⁺なしでpH９において、及び20LU ／mlの脂肪分解酵素濃度（LU及びOPIDは以下に規定される脂肪分解酵素活性単位である）、即ちオリーブオイルとトリブチリンとの間の少くとも0.15OPID／LUの活性比率でテストされた場合に少くとも３OPIDユニット／mlの活性を有する。このような脂肪分解酵素は、アブシジア亜属マイコクラドゥス、例えば先に列記される種及び株から得られうる。好ましい脂肪分解酵素の他の群は、Ca²⁺の欠損下でpH９よりpH10で高い脂肪分解酵素活性を有する。このような脂肪分解酵素は、Ａ．レフレキサ、例えば先に列記される株から得られうる。この脂肪分解酵素は新しく、本発明により供される。リパーゼ活性測定（LU）１リパーゼ単位（LU）は、30.0℃，pH7.0(リン酸緩衝液)において基質としてのトリブチリン及び乳化剤としてのアラビアゴムで、分当りに滴定脂肪酸１μモルを遊離する酵素の量である。リパーゼ活性測定（OPID） pH７〜10の範囲の遊離Ca²⁺なしでの脂肪分解酵素活性は、特定のpHにおいて、 10分間、40℃におけるオリーブ油：２％PVA 溶液（１：３）の基質エマルションでテストされる。その反応の終りにおいて、その反応混合物は、酸性条件下でクロロホルム：メタノール（１：１）により抽出され、その反応の間に遊離した脂肪酸がTLC-FID 分析(latroscan)により測定される。１単位(OPIDU)は、分当りの脂肪酸のμモルの遊離として与えられる。各々のテストにおいて、200mM の緩衝液（Tris-HCl緩衝液、pH７及び８、ジエタノールアミン緩衝液、pH８，９及び10）と共に、10mM EDTA が用いられる。免疫化学的特性アブシジアの株に対してネイティブである脂肪分解酵素のものと同一又は部分的に同一の免疫化学的特性を有し、先に言及される特性を有する位置的に非特異的な脂肪分解酵素は本発明の範囲内である。免疫化学的特性は、免疫学的交差反応同定テストにより測定され得る。その同定テストは、公知のオクタロニー二重免疫拡散法により、又はI ．M．Roitt ; Immunology，Gower Medical Publishing（1985）及びN ．H．Axelsen ; Handbook of Immunopreciptitation-in-Gel Techniques，Black well Scientific Publications（1983）Chapter 5 and 14 に従う双頭交差免疫電気泳動により行われ得る。免疫化学的同定（抗原同定）及び部分的免疫化学同定（部分的抗原同定）が、Axelsen、前掲、Chapters 5，19及び20 and Roit、前掲、Chapter 6 に記載される。免疫学的テストに用いるための単一特異性抗血清は、例えばN．H．Axelsen、前掲のChapter 41又はN．H．Axelsen et al.，A Manual of Quantitative Immun oelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications(1973)のChapter 23に記載されるように、精製された脂肪分解酵素に対して例えばウサギにおいて作られ得る。脂肪分解酵素の産生本発明の脂肪分解酵素は、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で先に記載される微生物の１つを培養し、次にその脂肪分解酵素を回収することにより作られ得る。培養の後、脂肪分解酵素は、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せのような慣用的方法により培養物から回収され、精製され得る。便利な精製方法は、任意的なバッチ精製及び次の２段階クロマトグラフィーからなる。任意的なバッチ精製は、DEAE Streamline（Pharmaciaの製品）、Super- Q Toyopearl、陰イオン交換樹脂又はMacroprep HIC Support hydrophobic（Bior ad の製品）により行われ得る。２段階クロマトグラフィーの１部は、例えばPhe nyl Toyopearl，Butyl Toyopearl 又はMacroprep HIC Support hydrophobic での疎水クロマトグラフィーからなる。２段階クロマトグラフィーの他の部分は、陰イオン交換樹脂、例えばDEAE Toyopearl又はSuper- Q Toyopearl で行われ得る。その２段階はいずれかの順番で行われ得る。脂肪分解酵素の適用本発明の脂肪分解酵素は、例えば、施設及び工業的クリーリングにおける並びに皮の処理における洗濯及び皿洗いの界面活性剤中での、特に高いpHにおける脂肪分解酵素の慣用的な適用に用いられ得る。本発明の脂肪分解酵素は、脂肪及び油の全体の加水分解のために、並びに光学異性体分解処理において、相互エステル化のためにも用いられ得る。界面活性剤添加物本発明によれば、脂肪分解酵素は、界面活性剤組成物における添加物として典型的に用いられ得る。この添加物は、便利には、非散布性粒子、安定な液体、スラリー又は保護された酵素として製剤化される。本発明の脂肪分解酵素を含む界面活性剤添加物についての適切な活性範囲は 5 ,000〜 100,000 OPIDU／ｇ（pH９で測定されたOPID）又は添加物のｇ当り0.01〜 100mg の純粋な酵素蛋白質である。界面活性剤有利には、本発明の脂肪分解酵素は遊離Ca²⁺の欠如下でさえアルカリ性pH（約 pH９〜10）で高い活性を有する。これは、遊離Ca²⁺に結合するための高い含有量のビルダーを有する界面活性剤中でさえ、これらの脂肪分解酵素を広範囲の界面活性剤において用いるのに十分に適したものにする。本発明の脂肪分解酵素は、界面活性剤中で便利に用いられる濃度で組み込まれ得る。本発明の界面活性剤組成物は、界面活性剤のグラム当り10〜50,000LU、好ましくは20〜 5,000LU／ｇに相当する量の脂肪分解酵素を含み得る。その界面活性剤は水に溶かされて、洗浄液のリッター当り25〜15,000LUに相当する量の脂肪分解酵素を含む洗浄液を形成する。脂肪分解酵素蛋白質の量は、界面活性剤のグラム当り 0.001〜10mg又は洗浄液のリッター当り 0.001〜100mg であり得る。界面活性剤組成物本発明によれば、脂肪分解酵素は、典型的に界面活性剤組成物の構成物であり得る。このような場合、それは非散布性粒子、安定な液体、又は保護された酵素の形態で界面活性剤組成物内に含まれ得る。非散布性粒子は、例えばUS 4,106,9 91及び4,661,452(両方ともNovo Industri A/S)に開示されるように作られ得、当該技術で周知である方法により任意に被覆され得る。ろう状被覆材料の例は、平均分子量 1,000〜20,000を有するポリ（エチレンオキシド）製品(ポリエチレングリコール、PEG)；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコールが12〜20炭素原子を含み、15〜80エチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ −及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフイルム形成性被覆材料の例は、特許GB 1483591に供される。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのような多価アルコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることによって安定化され得る。他の酵素安定化剤は当該技術において公知である。保護された酵素は、EP 238,2 16に開示される方法に従って調製され得る。本発明の界面活性剤組成物は、例えば粉体、粒子、ペースト又は液体として、いずれかの便利な形態であり得る。液体界面活性剤は70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を典型的に含む水性又は非水性であり得る。界面活性剤組成物は、その各々が陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、又は双性イオン性であり得る１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第２アルカンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルもしくはアルケニルコハク酸、又はセッケンのような陰イオン性界面活性剤を０〜50％含むであろう。それは、アルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又は（例えば WO 92／06154 に記載されるような）ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドのような非イオン性界面活性剤も０〜40％含み得る。界面活性剤組成物は、アミラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼのような１以上の他の酵素を更に含み得る。界面活性剤は、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、クエン酸、ニトリロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートもしくは層状シリケート（例えばHoechst からの SKS −６）のような１〜65％の界面活性剤ビルダー又は複合剤を含み得る。界面活性剤は、洗浄増進されなくても、即ち界面活性剤ビルダーが本質的になくてもよい。界面活性剤は、１以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG )、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリアクリレートのようなポリカルボキシレート、マレイン／アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーがある。界面活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）のような過酸形成性漂白活性剤と組み合わせられ得るペルボレート又はペルカルボネートのようなH₂O₂ソースを含み得る漂白システムを含み得る。あるいは、漂白システムは、例えばアミド、イミド、又はスルホンタイプの過酸を含み得る。本発明の界面活性剤組成物の酵素は、慣用的な安定化剤、例えばプロピレングリコールもしくはグリセリンのような多価アルコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体を用いて安定化され得、本組成物は例えば WO 92／19709 及び WO 92／19708 に記載されるように製剤化され得る。界面活性剤は、例えばクレー、泡ブースター、セッケン泡サプレッサー、防食剤、汚れ懸濁剤、抗汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤、視覚的光沢剤、又は香料のような他の慣用的界面活性剤成分も含み得る。（使用濃度において水溶液中で測定された）pHは、通常例えば７〜11の範囲内で中性又はアルカリ性であるだろう。本発明の範囲内の界面活性剤の特定の形態は以下のものを含む。１）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物２）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物３）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物４）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物５）次のものを含む水溶液界面活性剤組成物６）次のものを含む水性構造液界面活性剤組成物７）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物８）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性剤組成物９）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 10）次のものを含む水溶液組成物 11）次のものを含む水溶液界面活性剤組成物 12）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全て又は一部分が（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェートにより置換されている１）〜12）に記載の界面活性剤製剤 14）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 15）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性剤組成物 16）更なる構成物として又は既に特定された漂白システムのかわりとしてのいずれかの安定化又はカプセル化過酸を含む１）〜15）に記載の界面活性剤製剤 17）ペルボレートがペルカルボネートにより置換されている１），３），７），９）及び12）に記載の界面活性剤組成物 18）マンガン触媒を更に含む１），３），７），９），12），14）及び15）に記載の界面活性剤組成物。マンガン触媒は、例えば、“Efficient manganese ca talysits for low-temperature bleaching”，Nature 369，1994，pp．637 〜63 9 に記載される化合物の１つであり得る。 19）直鎖アルコキシル化第１アルコール、ビルダーシステム（例えばホスフェート）、酵素、及びアルカリのような液状非イオン性界面活性剤を含む非水性界面活性剤液として製剤化された界面活性剤組成物。その界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤及び／又は漂白システムも含み得る。実施例培養培地以下の表に示される培地を本実施例に用いた。実施例１Ａ．コリムビフェラ（A．corymbifera）からの脂肪分解酵素の産生Ａ．コリムビフェラ株NN100062を、100ml のRS-G培地を含む振とうフラスコ内で30℃で３日間、培養した。2,500ml の無細胞ブイヨンを、細胞量を除去した後に50振とうフラスコから回収した。これを凍結乾燥して以下の実施例に用いられる 379LU／ｇの脂肪分解酵素活性を有する58ｇの粉体サンプルを得た。実施例２Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の洗浄効果脂肪分解酵素（先の実施例からの粉体調製物）の洗浄効果を、pH10において、陰イオン性界面活性剤(LAS)を含む界面活性剤中で汚れた繊維を洗浄することにより測定した。テストは、次の条件下でTerg-O-tometer研究用洗浄機内で行った。温度 30℃ 時間 30分撹拌 100rpm 界面活性剤 0.25ｇ／ｌ of LAS(直鎖アルキルベンゼンスルホネート、製品名 Nansa HS 80／Ｓ) ＋ 1.0ｇ／ｌ of Na₂CO₃ 水 Tap 水（約18°German hardness） pH 10.0 脂肪分解酵素投与量 2,000 LU／ｌテスト材料各々85μＬのオリーブ油で染色した綿布７×７cm 布／液体比７きれ／500ml 洗浄後、ソックスレー抽出し、残りの油の量を重量で測定した。残った油の組成を TLC／FID 分析により測定した。脂肪分解酵素を含まない対照実験を同様に行った。結果は次の通りである。脂肪分解酵素が、全量の残った油を減少させるのに、特にLAS の存在下でpH10 .0で洗浄することにおいてトリグリセリドの量を減らすのに有効であることが見られる。実施例３Ａ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)からの脂肪分解酵素の産生及び精製本実施例において、アラビアゴムで乳化されたオリーブ油を用いて脂肪分解酵素活性を測定した。条件は、40℃，pH10(100mMグリシン緩衝液)である。１単位は、分当りに１μモルのNaOHと当量の脂肪酸の滴定量を遊離する酵素の量に従う。Ａ．ブラケスレアナ株NN100826を100ml のOM培地を含む振とうフラスコ中で30 ℃で３日間、培養した。脂肪分解酵素産物は41ユニット／mlであった。培養ブイヨンを50の振とうフラスコから収集し、２Ｌの脱イオン水で洗浄した後、限外ろ過することにより２Ｌに濃縮した。冷却チャンバー内で撹拌しながら、その濃縮ブイヨンに粉砕硫酸アンモニウムを40％飽和まで加え、４℃で１時間、放置した。遠心により沈殿を除いた。硫酸アンモニウムを50％飽和まで更に加え、その沈殿を除いた。その上清を180m l に濃縮して、４℃において 20mM Tris／HCl 緩衝液(pH8.5)中でセルロースチューブを用いて一晩透析し、凍結乾燥した。1,500ユニット／ｇの活性を有する 9.8ｇの粉状脂肪分解酵素調製物を得た。冷却したアセトンを培養ブイヨンに加え、その調製物を凍結乾燥することにより更なる粉状脂肪分解酵素調製物を得た。実施例４Ａ．ブラケスレエアナ脂肪分解酵素の洗浄効果先の実施例からの粉状脂肪分解酵素調製物を、以下の変更を伴って先の洗浄例と同じ方法でテストした：洗浄時間を20分とした；各々の布きれを50μＬの油で染色した；洗浄テストの前に室温で２日間、その布きれをおいた；そしてpH、界面活性剤及び脂肪分解酵素投与量を以下に示す。分析データを用いて残ったエステル結合（μモル）及び加水分解の程度を計算した。脂肪分解酵素は残った油の量を減らし、加水分解の割合を増加させ、これにより残ったエステル結合の数を減らすのに有効であった。実施例５Ａ．ブラケスレアナからの脂肪分解酵素の産生Ａ．ブラケスレアナ株NN100826を、水中39ｇ／ｌのPDA（Difcoの製品）及び10 ｇ／ｌの寒天の斜面上で５週間、胞子形成させた。水中Tween の 0.1％溶液９mlを斜面上に注いで胞子懸濁液とした。３mlの胞子懸濁液を100ml のYS-2S0培地を含む500ml のじゃま板付振とうフラスコ（２のじゃま板）内に接種して、そのフラスコを、24時間、34℃で振とう（ 230rpm）しながらインキュベートして種培養物を調製した。種培養物をホモジナイズしてペレット形状の菌糸体に分け、２mlのホモジナイズされた培養物を、100ml のOMM 培地及び２％の大豆レシチンを含む振とうフラスコ内に接種した。そのフラスコを30℃で振とう（230rpm）しながらインキュベートした。２日の培養後、そのブイヨンは、17.0LU／mlの脂肪分解活性及び6.7 のpHを有していた。実施例６脂肪分解酵素の精製Ａ．ブラケスレエアナ株NN100826からの脂肪分解酵素を、以下の通り３ステップのクロマトグラフィー、即ちStreamline DEAE、フェニル−及びDEAE-Toyopear lにより精製した。 Streamline DEAE カラムクロマトグラフィー。先の実施例で調製された50の振とうフラスコからの培養ブイヨンを遠心して無細胞ブイヨン 2.8Ｌを得た。これを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH10で予め平衡化されたStreamline DEAE 600m l に適用した。流速は 100 ml／分であった。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、結合した脂肪分解酵素を、 0.6Ｍ NaCl を含む50mM Tris 緩衝液、pH7.2 により溶出した。開始脂肪分解酵素活性の38％及び36％を各々その溶出液及び通過画分中で回収した。即ち全回収率は74％であった。更なる精製のために、樹脂に結合した脂肪分解酵素を用いた。その脂肪分解酵素溶液を中和し、次にUFモジュール、3,000 NMWLにより濃縮した。回収率は47％であった。遠心した後、脂肪分解酵素を 0.2μｍ膜を通してろ過した。フェニルToyopearl カラムクロマトグラフィー。勾配溶出において、脂肪分解酵素活性は、検出するのが難しい極めて広いピークを供した。かわりに、1.4Ｍ酢酸アンモニウムの60分、純水の30分及び20％エタノールの30分でのステップ溶出を用いた。脂肪分解酵素活性は２つのピークを供した。１つは水により溶出され（“脂肪分解酵素Ａ”）、そして他方は20％EtOHにより溶出された（“脂肪分解酵素Ｂ”）。回収率は、脂肪分解酵素Ａについて41％、脂肪分解酵素Ｂについて33％であった。各々の脂肪分解酵素を濃縮してUFモジュール、3,000 NMWLにより脱イオン化した。回収率は各々94％及び91％であった。 DEAE Toyopearlカラムクロマトグラフィー。脂肪分解酵素Ａを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）から50mM Tris 緩衝液(pH7.2)＋ 0.6Ｍ NaCl への勾配溶出により精製した。高脂肪分解酵素活性を有する画分をプールした。収率は66％であった。脂肪分解酵素を濃縮して、UFモジュール、3,000 NMWLにより脱イオン化した。回収率は69％であった。 SDS-PAGEは、単一蛋白質バンドの純粋である脂肪分解酵素を示した。pH8.0 における等電点及び25,400の分子量を有することが見い出された。純粋な脂肪分解酵素の特異活性は3,300 〜 4,100LU/mg であることが見い出された。脂肪分解酵素Ｂを同様に精製し、SDS-PAGEによりそれが脂肪分解酵素Ａと同一であることを確認した。実施例７種々のアブシジア株からの脂肪分解酵素の産生以下の表に示される各々のアブシジア株を、以下のステップによる脂肪分解酵素産生のために用いた。種培養。（NN100826が除かれた）YS-2培地で27℃で２日間、主培養。27℃（示されるように１つの場合に30℃）で示される培地を用いる振とうフラスコ内。その培養時間及び得られた脂肪分解酵素収率も表２に示す。回収及び精製。無細胞サンプルを得るために遠心し、次に粉状サンプルを作るために凍結乾燥。培養条件及び結果の収率を以下に示す。実施例８アブシジア脂肪分解酵素に対するpH及びCa²⁺の効果 20LU／mlの脂肪分解酵素量を用いる先に記載のOPID法により、Ca²⁺なしでpH７〜10の範囲において脂肪分解酵素活性をテストした。次の株からの本発明に従う精製された酵素をテストした：Ａ．ブラケスレエアナ NN000591 Ａ．ブラケスレエアナ NN000987 Ａ．ブラケスレエアナ NN100826 Ａ．コリムビフェラ NN100062 Ａ．レフレキサ NN102424 結果を添付の図面に示す。 Ca²⁺の欠如下において、テストされた全てのアブシジア脂肪分解酵素は、pH８よりpH９においてより高い活性を示し（約pH９以上で最適）、Ａ．レフレキサからの脂肪分解酵素はpH９よりpH10においてより高い活性を示す（約pH10以上で最適）。（Ａ．ブラケスレエアナ及びＡ．コリムビフェラにより供される）アブシジア亜属マイコクラドゥスからの脂肪分解酵素は、Ca²⁺の欠如下でpH９において、20LU／mlの脂肪分解酵素投与量について３ OPIDU／ml超、即ち0.15 OPIDU／LU 超の比率で活性を示す。実施例９ pH10における脂肪分解酵素活性についてのプレートテスト (JP-W 1-501120に相当する)WO 88／02775 の実施例11に記載されるプレートテストを用いてCa²⁺あり及びなしでのpH10での脂肪分解酵素活性についてチェックした。実施例７に列記される全ての株からの脂肪分解酵素調製物は、Ca²⁺の添加があるもの及びないものの両方で、pH10において脂肪分解酵素活性を示すことが見い出された。実施例10 脂肪分解酵素のpI及びMW いくつかの株からの精製された脂肪分解酵素を用いて、分取等電点電気泳動により等電点（pI）を、SDS-PAGEにより分子量（MW）を測定した。結果は次の通りであった。Ａ．ブラケスレエアナNN100826からのリパーゼの分離精製は、サイズが31〜32 kDa であることを示唆する。それゆえ、25kDa リパーゼはおそらく少し端が切り取られたリパーゼ分子をおそらく示す。実施例11 Ａ．ブラケスレエアナ脂肪分解酵素の構造的特徴Ａ．ブラケスレアナNN000591及びNN000987からの脂肪分解酵素のＮ末端配列を、エレクトロブロッティングに従って決定した。両方の脂肪分解酵素は、約30kD a の分子量を有する。 NN000987からの脂肪分解酵素のＮ末端アミノ酸配列決定は、添付の配列表における配列番号：１として示される配列を供した。 NN000591からの脂肪分解酵素のＮ末端配列決定は、配列番号：２及び配列番号：３として示される２つの配列を供した。 NN000591について、配列番号：３として示されるＮ末端配列は、配列番号：２として示されるＮ末端配列のアミノ酸残基６で開始することが見られた。これにより、２つの配列は、合成又は精製のいずれかの間の同じ蛋白質の可変性の過程を示す。更に、NN000987についての配列番号：１及びNN000591についての配列番号：２は同じＮ末端配列を表すことが明らかであり、２つの脂肪分解酵素はほぼ同一であると確信される。これにより、３つの先のＮ末端配列に基づき、成熟脂肪分解酵素は配列番号：４として示されるＮ末端配列を有すると結論づけられる。 NN000591調製物中の30kDa 脂肪分解酵素に加えて、約21kDa の分子量のバンドが見られた。エレクトロブロッティングの後のこの蛋白質のＮ末端アミノ酸配列決定は、配列番号：５として示される配列を供した。このＮ末端配列は、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei) からのリパーゼについての周知の配列の通りにアラインされ得、それが全長の30kDa 脂肪分解酵素のフラグメントであることが結論づけられた。 NN000591脂肪分解酵素を、リシル特異的プロテアーゼでのデグラデーションの前に還元し、Ｓ−カルボキシメチル化した。その結果生ずるペプチドを分別して、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行う前に逆相HPLCを用いて再精製した。配列番号：６〜10として示されるペプチド配列を得た。その配列を、リゾムコール・ミエヘイ及びリゾプス・デレマール（Rhizopus d elemar）からのリパーゼの周知の配列とアラインすることにより、全長の脂肪分解酵素がこの順番で配列番号：４〜10の配列を含むことが結論づけられた。これらの配列において、Xaa は、同定され得なかったアミノ酸を表す。Asx はAsp と Asn とが区別できなかった位置を指す。配列番号：５の位置１及び９のアミノ酸は不確かである。実施例12 Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の精製Ａ．コリムビフェラ株NN100062からの脂肪分解酵素を次の通り精製した。ストリームライン。株の培養により得られた粗酵素粉体を50mM炭酸ナトリウム緩衝液中に溶かした。遠心後、脂肪分解酵素サンプルを同緩衝液で平衡化された膨潤されたDEAE樹脂上に吸着させ、次に樹脂を同緩衝液で洗浄した。その脂肪分解酵素を 0.5Ｍ NaCl を含むTris-HCl緩衝液(pH7.6)で溶出した。このステップの収率は52％であった。ブチルToyopearl 第２のステップは、予め充填されたブチルToyopearl 及びHPLCを用いるクロマトグラフィーである。濃縮脂肪分解酵素を１Ｍ酢酸アンモニウムの塩濃度に調節し、次に１Ｍ酢酸アンモニウムで平衡化されたカラム上に吸着させた。１〜０Ｍ硫酸アンモニウム及び20％エタノールの直線勾配で溶出を行った。各々の画分の脂肪分解酵素活性を測定し、高脂肪分解酵素活性の画分を集めて、マイクロアシライザー(micro asilizer)(Asahi Kaseiの製品)で脱塩した。 DEAE Toyopearlカラムクロマトグラフィー。第３のステップは予め充填されたDEAE Toyopearl及びHPLC（Watersの製品）を用いる陰イオンカラムクロマトグラフィーである。脂肪分解酵素をpH8.5 に調節した。これを、50mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.5)で平衡化されたカラムに適用し、脂肪分解酵素を０〜 0.5Ｍ NaCl の直線勾配で溶出した。高脂肪分解活性の画分を集めて、得られた脂肪分解酵素を濃縮した。このステップの収率は66％であった。ゲルろ過最終ステップはゲルろ過である。用いられる緩衝液は0.15Ｍ NaCl を含む50mM Tris-HCl であった。再び高脂肪分解酵素活性の画分を集めた。精製を次の表に要約する。実施例13 Ａ．コリムビフェラ脂肪分解酵素の構造的キャラクタリゼーションＡ．コリムビフェラNN100062の脂肪分解酵素の構造を実施例11と同じ様に研究した。Ｎ末端配列決定は、配列番号：11として示される配列を供した。デグラデーションの後に得られたペプチドが、配列番号：12〜16及び18〜19として示される配列を有することが見い出された。配列番号：12の残基Asn 20がグリコシル化されていることが見い出された。比較することにより、配列番号：15のＣ末端における22アミノ酸が配列番号： 16のＮ末端におけるそれと同一であることが示され、これら２つの配列が配列番号：17として示されるより大きなフラグメントの一部分を形成することが結論づけられた。リゾムコール・ミエヘイ及びリゾプス・デレマールからのリパーゼの周知の配列とのアラインメントにより、全長の脂肪分解酵素が、配列番号：11〜 14及び17〜19の配列をこの順番で含むことが結論づけられた。実施例14 Ａ．スポロホーラ−バリアビリスからの脂肪分解酵素の基質アフィニティー非イオン性界面活性剤Dobanol 25-7（2,500ppm）の存在下でアルカリ性pH(pH9 .0)において基質相（オリーブオイル）上／中で脂肪分解酵素が蓄積する能力の簡単な測定のために次の手順を用いた。非イオン性界面活性剤を有する緩衝液中の脂肪分解酵素の２つの同一の溶液を密閉可能バイアル内で調製し、その溶液の１つに基質を加えた。両方の溶液を激しく振とうしながらインキュベートし、残存脂肪分解酵素活性を、基質の分離及び除去の後に（先に規定されるLUにおいて）測定した。次の組成を用いた：緩衝液： 100mM グリシン(pH9.0) 非イオン性界面活性剤 100ppmアルコールエトキシレート (Dobanol^TM25-7) 基質：オリーブ油緩衝液：基質 50：50 v／v インキュベーション温度４℃ 開始脂肪分解酵素活性５−10LU／ml インキュベーション時間一晩（24−26時間）結果は、基質なしでの活性に対する基質と共にインキュベートされた後の残存活性として供される。Ａ．スポロホーラ−バリアビリス脂肪分解酵素 39％結果は、Lipolaseが、用いられた条件下で水相に全体的に残る傾向があるのに対して、Ａ．スポロホーラ−バリアビリスからの脂肪分解酵素は、一晩のインキュベーションの後に水相中で添加された活性の50％未満を残すオリーブ油のためのより高いアフィニティーを有することを示す。請求の範囲１．界面活性剤及びアルカリ性アブシジア(Absidia)脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤組成物。２．前記脂肪分解酵素が、遊離Ca²⁺の欠如下でpH８よりpH９においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。３．前記脂肪分解酵素がアブシジア亜属マイコクラドゥス（Mycocladus）の株から得られ、LU当り少くとも0.15OPID（遊離Ca²⁺なしでpH９）の脂肪分解酵素活性比を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。４．前記株がＡ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。５．前記株がＡ．ブラケスレアナ変種アトロスポーラ(atrospora)に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。６．前記株がＡ．コリムビフェラ(A．corymbifera)に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。７．前記脂肪分解酵素が、アブシジア亜属アブシジアグループＢの株から得られることを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。８．前記株がＡ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ (rhizomorpha) 又はＡ．シュードシリンドロスポーラ（A．pseudocylindrospora ）に属することを特徴とする請求項７に記載の界面活性剤組成物。９．前記脂肪分解酵素が、Ａ．レフレキサ(A．reflexa)の株から得られ、遊離 Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10でより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。 10．前記脂肪分解酵素が、配列番号：４，５，６，７，８，９及び10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。 11．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項10に記載の界面活性剤組成物。 12．前記脂肪分解酵素が、配列番号：11，12，13，14，17，18及び19からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。 13．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項12に記載の界面活性剤組成物。 14．５〜40重量％の界面活性剤ビルダーを更に含み、水溶液中で測定して８〜 10.5のpHを有することを特徴とする請求項１〜13のいずれかに記載の界面活性剤組成物。 15．請求項１〜14のいずれかに記載の界面活性剤組成物を含む水溶液で、繊維を洗浄することを含むことを特徴とする繊維から脂肪のよごれを除去するための方法。 16．前記水溶液が、遊離Ca²⁺イオンを本質的に含まないか、又は１mM未満、好ましくは0.2mM 未満の量で遊離Ca²⁺イオンを含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．活性成分としてアブシジア脂肪分解酵素を含む非散布性粒子、安定化溶液、スラリー、又は保護された酵素の形態における酵素界面活性剤添加物。 18．前記脂肪分解酵素が、遊離Ca²⁺の欠如下でpH８よりpH９においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする請求項17 に記載の酵素界面活性剤添加物。 19．前記脂肪分解酵素がアブシジア亜属マイコクラドゥス（Mycocladus）に属する株から得られ、LU当り少くとも0.15OPID（遊離Ca²⁺なしでpH９）の脂肪分解酵素活性比を有することを特徴とする請求項17又は18に記載の酵素界面活性剤添加物。 20．前記株がＡ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)に属することを特徴とする請求項19に記載の酵素界面活性剤添加物。 21．前記株がＡ．ブラケスレアナ変種アトロスポーラ(atrospora)に属することを特徴とする請求項19に記載の酵素界面活性剤添加物。 22．前記株がＡ．コリムビフェラ(A．corymbifera)に属することを特徴とする請求項19に記載の酵素界面活性剤添加物。 23．前記脂肪分解酵素が、アブシジア亜属アブシジアグループＢの株から得られることを特徴とする請求項17又は18に記載の酵素界面活性剤添加物。 24．前記株がＡ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ (rhizomorpha) 又はＡ．シュードシリンドロスポーラ（A．pseudocylindrospora ）に属することを特徴とする請求項23に記載の酵素界面活性剤添加物。 25．前記脂肪分解酵素が、Ａ．レフレキサ(A．reflexa)の株から得られ、遊離 Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10でより高い脂肪分解活性を有することを特徴とする請求項17又は18に記載の酵素界面活性剤添加物。 26．前記脂肪分解酵素が、配列番号：４，５，６，７，８，９及び10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の酵素界面活性剤添加物。 27．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項26に記載の酵素界面活性剤添加物。 28．前記脂肪分解酵素が、配列番号：11，12，13，14，17，18及び19からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の酵素界面活性剤添加物。 29．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項28に記載の酵素界面活性剤添加物。 30．アブシジア・レフレキサの株から得られ、Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする脂肪分解酵素。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者高木忍千葉県市川市須和田２丁目５番地８号カーサデアキ 202号室 (72)発明者堤紀子千葉県市川市東菅野３丁目２番地16号 (72)発明者ハルキエール，トルベンデンマーク国，デーコー−3460 ビルケロエド，ヘストコエブバイ 11エー

Claims

【特許請求の範囲】１．界面活性剤及びアルカリ性アブシジア(Absidia)脂肪分解酵素を含む酵素界面活性剤組成物。２．前記脂肪分解酵素が、遊離Ca²⁺の欠如下でpH８よりpH９においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。３．前記脂肪分解酵素がアブシジア亜属マイコクラドゥス（Mycocladus）の株から得られ、LU当り少くとも0.150PID（遊離Ca²⁺なしでpH９）の脂肪分解酵素活性比を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。４．前記株がＡ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。５．前記株がＡ．ブラケスレアナ変種アトロスポーラ（atrospora）に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。６．前記株がＡ．コリムビフェラ(A．corymbifera)に属することを特徴とする請求項３に記載の界面活性剤組成物。７．前記脂肪分解酵素が、アブシジア亜属アブシジアグループＢの株から得られることを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。８．前記株がＡ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ (rhizomorpha) 又はＡ．シュードシリンドロスポーラ（A．pseudocylindrospora ）に属することを特徴とする請求項７に記載の界面活性剤組成物。９．前記脂肪分解酵素が、Ａ．レフレキサ(A．reflexa)の株から得られ、遊離 Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10でより高い脂肪分解活性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。 10．前記脂肪分解酵素が、Ａ．スポロホーラ−バリアビリス(A．sporophora-v ariabilis) の株から得られ、pH10，45℃での30分のインキュベーションの後に90 ％超の残存活性を保持することを特徴とする請求項１又は２に記載の界面活性剤組成物。 11．前記脂肪分解酵素が、配列番号：４，５，６，７，８，９及び10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。 12．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項11に記載の界面活性剤組成物。 13．前記脂肪分解酵素が、配列番号：11，12，13，14，17，18及び19からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤組成物。 14．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項13に記載の界面活性剤組成物。 15．５〜40重量％の界面活性剤ビルダーを更に含み、水溶液中で測定して８〜 10.5のpHを有することを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載の界面活性剤組成物。 16．請求項１〜15のいずれかに記載の界面活性剤組成物を含む水溶液で、繊維を洗浄することを含むことを特徴とする繊維から脂肪のよごれを除去するための方法。 17．前記水溶液が、遊離Ca²⁺イオンを本質的に含まないか、又は１mM未満、好ましくは0.2mM 未満の量で遊離Ca²⁺イオンを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．活性成分としてアブシジア脂肪分解酵素を含む非散布性粒子、安定化溶液、スラリー、又は保護された酵素の形態における酵素界面活性剤添加物。 19．前記脂肪分解酵素が、遊離Ca²⁺の欠如下でpH８よりpH９においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする請求項18に記載の酵素界面活性剤添加物。 20．前記脂肪分解酵素がアブシジア亜属マイコクラドゥス（Mycocladus）に属する株から得られ、LU当り少くとも0.150PID（遊離Ca²⁺なしでpH９）の脂肪分解酵素活性比を有することを特徴とする請求項18又は19に記載の酵素界面活性剤添加物。 21．前記株がＡ．ブラケスレエアナ(A．blakesleeana)に属することを特徴とする請求項20に記載の酵素界面活性剤添加物。 22．前記株がＡ．ブラケスレアナ変種アトロスポーラ(atrospora)に属することを特徴とする請求項20に記載の酵素界面活性剤添加物。 23．前記株がＡ．コリムビフェラ(A．corymbifera)に属することを特徴とする請求項20に記載の酵素界面活性剤添加物。 24．前記脂肪分解酵素が、アブシジア亜属アブシジアグループＢの株から得られることを特徴とする請求項18又は19に記載の酵素界面活性剤添加物。 25．前記株がＡ．シリンドロスポーラ（A．cylindrospora）変種リゾモルファ (rhizomorpha) 又はＡ．シュードシリンドロスポーラ（A．pseudocylindrospora ）に属することを特徴とする請求項24に記載の酵素界面活性剤添加物。 26．前記脂肪分解酵素が、Ａ．レフレキサ(A．reflexa)の株から得られ、遊離 Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10でより高い脂肪分解活性を有することを特徴とする請求項18又は19に記載の酵素界面活性剤添加物。 27．前記脂肪分解酵素が、Ａ．スポロホーラ−バリアビリス(A.sporophora-va riabilis) の株から得られ、pH10，45℃での30分のインキュベーションの後に90 ％超の残存活性を保持することを特徴とする請求項18又は19に記載の酵素界面活性剤添加物。 28．前記脂肪分解酵素が、配列番号：４，５，６，７，８，９及び10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項18に記載の酵素界面活性剤添加物。 29．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項28に記載の酵素界面活性剤添加物。 30．前記脂肪分解酵素が、配列番号：11，12，13，14，17，18及び19からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項18に記載の酵素界面活性剤添加物。 31．前記脂肪分解酵素が、前記配列の２以上を含み、好ましくは前記配列の全てを含むことを特徴とする請求項30に記載の酵素界面活性剤添加物。 32．Ａ．スポロホーラ−バリアビリスの株から得られ、pH10，45℃における30 分のインキュベーションの後に90％超の残存活性を保持することを特徴とする脂肪分解酵素。 33．Ａ．レフレキサの株から得られ、Ca²⁺の欠如下でpH９よりpH10においてより高い脂肪分解酵素活性を有することを特徴とする脂肪分解酵素。