DE69628642T2

DE69628642T2 - Alkalisches lypolitsches enzym

Info

Publication number: DE69628642T2
Application number: DE69628642T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Nagareyama HIRAYAMA; Torben Halkier
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: EP0817838B1; WO1996030502A1; DE69628642D1; AU5002096A; JPH11502411A; EP0817838A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft ein alkalisches lipolytisches Enzym, einen lipolytisches Enzym herstellenden mikrobiellen Stamm, Verfahren für die Produktion des lipolytischen Enzyms und eine Detergenszusammensetzung umfassend das lipolytische Enzym.
STAND DER TECHNIK
Für etliche Jahre wurden lipolytische Enzyme als Detergenszusätze verwendet, um Lipid- oder Fettflecken aus Kleidern oder anderen Textilien zu entfernen.
Daher schlägt der Stand der Technik die Verwendung verschiedener mikrobieller Lipasen als Detergenszusätze vor. Beispiele schließen Lipasen ein, die von Humicola lanuginosa (auch bezeichnet als Thermomyces lanuginosus, EP 258 068 und EP 305 216 ), Rhizomucor miehei ( EP 238 023 ), Candida antarctica ( EP 214 761 ), verschiedene Arten von Pseudomonas wie P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 ), P. cepacia ( EP 331 376 ), Bacillus, z. B. B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica Acta 1131, 253–260), B. stearothermophilus (JP-A 64-74992) und B. pumilus (WO 91/16422) erhalten werden.
Zur kommerziellen Herstellung von Enzymen, wie Lipasen, ist es bevorzugt, die Enzyme für eine höhere Ausbeute in einem geeigneten Wirtsorganismus zu exprimieren. Es sind verschiedene Expressionssysteme zugänglich, einschließlich der Expression von Enzymen von Ascomycetes in Aspergillus ( EP 238 023 ).
Viele Detergenzien sind alkalisch mit einem hohen pH in Lösung (z. B. um pH 10 herum), daher ist dort ein Bedarf für lipolytische Enzyme mit hoher Aktivität bei hohem pH. Das lipolytische Enzym sollte von einem Mikroorganismustyp erhalten werden, für welchen geeignete Expressionssysteme zugänglich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise haben wir gefunden, dass ein alkalisches lipolytisches Enzym von Pilzstämmen von Botryosphaeria oder Guignardia, zwei nahe verwandte Gattungen, von denen zuvor nicht berichtet wurde, dass sie ein lipolytisches Enzym herstellen, erhalten werden kann. Das neue lipolytische Enzym hat eine optimale Aktivität um pH 10 herum, die es sehr geeignet zur Verwendung in Detergenzien machen. Vorteilhafterweise sind die Mikroorganismen Ascomyceten, für welche geeignete Expressionssysteme gut entwickelt sind.
Demgemäß stellt die Erfindung ein lipolytisches Enzym bereit, welches von einem Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia erhalten wird oder immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen ein gereinigtes lipolytisches Enzym gerichtet ist, das von einem solchen Stamm hergestellt wird, und eine optimale Aktivität bei einem pH in dem Bereich 9–11 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ hat.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein alkalisches lipolytisches Enzym bereit, welches eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 und 5.
Die Erfindung stellt ebenfalls das neue lipolytische Enzym herstellende Stämme von Botrosphaeria als eine biologische Reinkultur bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines alkalischen lipolytischen Enzyms bereit, umfassend die Kultivierung eines lipolytisches Enzym produzierenden Stammes von Botryosphaeria oder Guignardia in einem geeigneten Nährmedium, gefolgt von der Gewinnung des alkalischen lipolytischen Enzyms.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines alkalischen lipolytischen Enzyms bereit, umfassend:

a) Isolieren eines DNA-Fragments, kodierend das lipolytische Enzym von einem lipolytisches Enzym herstellenden Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia,
b) Kombinieren des DNA-Fragments mit passenden Expressionssignal(en) in einem passenden Vektor,
c) Einführen des Vektors oder Teilen hiervon in einen passenden Wirt,
d) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression des lipolytischen Enzyms führen, und
e) Gewinnen des lipolytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.

Schließlich stellt die Erfindung eine Detergenszusammensetzung bereit, umfassend einen oberflächenaktiven Stoff zusammen mit einer effektiven Menge des lipolytischen Enzyms.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 und 2 zeigen Graphen der lipolytischen Enzymaktivität gegen den pH für lipolytische Enzyme, die von Botryosphaeria sp. CBS 102.95 beziehungsweise B. ribis CBS 504.94 hergestellt wurden.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Mikroorganismen
Die mikrobiellen Stämme, die in dieser Erfindung verwendet werden, gehören den Gattungen Botryosphaeria oder Guignardia an. Die beiden Gattungen sind eng verwandt und werden von M. E. Barr (Contrib. Univ. Mich. Herb., 9:523–638, 1972) als Synonyme betrachtet, die meisten Autoren betrachten sie jedoch als separate Gattungen – siehe beispielsweise A. Sivanesan, J. Cramer, Vaduz, 701 pp, 1984.
Beide Gattungen werden von Richard T. Hanlin, Illustrated Genera of Ascomycetes, APS Press, The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, 1990, S. 46–49, beschrieben. Die Gattung Botryosphaeria wird ebenfalls von Punithalingam, E. & Holliday, P. (1973) CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria No. 395, beschrieben. Wenn sie kultiviert werden, können sich die Stämme zu dem Fusicoccum-Stadium oder zu dem Mikroconidie-Stadium entwickeln.
Es wurden zwei Stämme isoliert und von den Erfindern nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren beim Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Niederlande hinterlegt. Die beiden Stämme wurden durch Standard-taxonomische Verfahren klassifiziert.
Die Hinterlegungsdaten und die taxonomische Identifizierung der Stämme waren wie folgt:
Ebenfalls können die öffentlich zugänglichen Stämme in der Erfindung verwendet werden:
Die oben erwähnten Stämme sind frei erhältlich von den folgenden Hinterlegungsinstitutionen für Nlikroorganismen:
MAFF: Ministry of Agniculture, Forestry and Fisheries, National Institute of Agro-Biological Research, 1–2 Kannon-dai 2-chome, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan.
JCM: Japan Collection of Microorganisms, RIKEN, Wako, Saitama 351-01, Japan.
IFO: Institute for Fermentation, Osaka, 17–85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan.
CBS Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Niederlande.
ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.
Varianten und Mutanten dieser Stämme, die zum Herstellen des lipolytischen Enzyms imstande sind, können ebenfalls in der Erfindung verwendet werden.
Herstellung des lipolytischen Enzyms
Das lipolytische Enzym kann durch Kultivieren eines beliebigen der oben beschriebenen Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium hergestellt werden, wahlweise gefolgt von der Gewinnung und der Reinigung nach Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind oder wie in den Beispielen dieser Beschreibung beschrieben.
Das lipolytische Enzym kann ebenfalls durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden, durch Methoden, die im Stand der Technik per se bekannt sind, z. B. Isolieren eines DNA-Fragments, kodierend das lipolytische Enzym, Kombinieren des DNA-Fragments mit passenden Expressionssignal(en) in einem passenden Vektor, Einführen des Vektors oder Teilen hiervon in einen passenden Wirt (z. B. einen filamentösen Pilz, vorzugsweise ein Mitglied der Gattung Aspergillus), entweder als ein sich autonom replizierendes Plasmid oder integriert in das Chromosom, Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression des lipolytischen Enzyms führen, und Gewinnung des lipolytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.
Die Isolierung einer DNA-Sequenz kann durch so genanntes Expressionsklonieren erfolgen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Klonieren, in geeigneten Vektoren, einer cDNA-Bibliothek von einem lipolytisches Enzym herstellenden Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia,
b) Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit den Vektoren,
c) Kultivieren der transformierten Hefewirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um das alkalische lipolytische Enzym zu exprimieren,
d) Durchsuchen nach positiven Klonen durch Bestimmen der Aktivität des in Schritt (c) exprimierten lipolytischen Enzyms.

Das Expressionsklonieren kann erfolgen, wie in WO 93/11249 oder in H. Dalb∅ge und H. P. Heldt-Hansen, Mol. Gen. Genet. (1994) 243: 253–260 beschrieben. Eine bevorzugte heterologe Wirtszelle ist ein Stamm von Aspergillus, z. B. A. oryzae oder A. niger, z. B. unter Verwenden des in EP-A-0 238 023 beschriebenen Expressionssystems.
Nach der Kultivierung kann das lipolytische Enzym aus der Kulturbrühe gewonnen und gereinigt werden durch herkömmliche Verfahren, wie hydrophobe Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Kombinationen hiervon.
Lipolytische Enzyme
Die Enzyme dieser Erfindung sind lipolytische Enzyme. In dem vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff „lipolytisches Enzym" bestimmt, um ein Enzym anzuzeigen, das klassifiziert ist unter der Enzymklassifikationsnummer E. C. 3.1.1.- (Carboxylesterhydrolasen) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der Internationalen Union der Biochemie und Molekularbiologie („International Union of Biochemistry and Molecular Biology") (IUBMB). Lipolytische Enzyme zeigen daher hydrolytische Aktivität gegen mindestens einen der Typen von Esterbindungen, die in dem Zusammenhang von E. C. 3.1.1. erwähnt werden. Die lipolytischen Enzyme der Erfindung haben vorzugsweise Lipaseaktivität (mit Triglyceriden als Substrat).
Enzymatische Eigenschaften
Die lipolytischen Enzyme dieser Erfindung sind durch eine hohe Aktivität bei alkalischem pH gekennzeichnet. Genauer haben sie eine optimale Aktivität bei einem pH höher als 9, insbesondere in dem Bereich 9–11, in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺.
1 und 2 zeigen Graphen der lipolytischen Enzymaktivität gegen den pH für lipolytische Enzyme, die von Botryosphaeria sp. CBS 102.95 beziehungsweise B. ribis CBS 504.94 hergestellt wurden. Beide lipolytischen Enzyme haben optimale Aktivität bei ungefähr pH 10.
Der isoelektrische Punkt beträgt 3,8 für das lipolytische Enzym von CBS 102.95 und 3,4 für das lipolytische Enzym von CBS 504.94. Das Molekulargewicht beträgt 55.000 Dalton für das lipolytische Enzym von CBS 102.95 und 64.000 für das lipolytische Enzym von CBS 504.94. Die spezifische lipolytische Enzymaktivität beträgt 400 LU/A₂₈₀ für das lipolytische Enzym von CBS 102.95 und 300 LU/A₂₈₀ für das lipolytische Enzym von CBS 504.94 (A₂₈₀ = mg Protein, bestimmt von der Extinktion bei 280 nm).
Eine lipolytische Enzym-Einheit (LU) ist die Menge Enzym, die unter Standardbedingungen (d. h. bei 30,0°C; pH 7,0; und Tributyrinsubstrat) 1 μmol titrierbare Buttersäure pro Minute freisetzt.
Immunochemische Eigenschaften
Alkalische lipolytische Enzyme, die immunochemische Eigenschaften haben, die identisch oder teilweise identisch sind mit denen eines lipolytischen Enzyms, das nativ von einem Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia ist und die genannten Eigenschaften besitzt, liegen im Schutzbereich der Erfindung.
Die immunochemischen Eigenschaften können durch immunologische Kreuzreaktions-Identitätstests bestimmt werden. Die Identitätstests können mit der gut bekannten Ouchterlony Doppelimmunodiffusionsvorgehensweise („Ouchterlony double immunodiffusion procedure") durchgeführt werden oder durch eine Reihenkreuzimmunoelektrophorese („tandem crossed immunoelectrophoresis") nach I. M. Roitt; Immunology, Gower Medical Publishing (1985) und N. H. Axelsen; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications (1983), Kapitel 5 und 14. Die Begriffe immunochemische Identität (Antigenidentität) und teilweise immunochemische Identität (teilweise Antigenidentität) sind beschrieben in Axelsen, supra, Kapitel 5, 19 und 20, und Roitt, supra, Kapitel 6.
Ein monospezifisches Antiserum zur Verwendung in immunologischen Tests gegen ein gereinigtes lipolytisches Enzym, kann z. B. in Kaninchen beschafft werden, z. B. wie beschrieben in Kapitel 41 von N. H. Axelsen, supra, oder Kapitel 23 von N. H. Axelsen et al., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications (1973).
Detergenszusatz
Gemäß der Erfindung kann das lipolytische Enzym typischerweise als ein Zusatz in einer Detergenszusammensetzung verwendet werden. Dieser Zusatz ist herkömmlich als ein nicht-staubendes Granulat, eine stabilisierte Flüssigkeit, ein Schlamm oder ein geschütztes Enzym formuliert.
Ein geeigneter Aktivitätsbereich für einen Detergenszusatz, der das lipolytische Enzym dieser Erfindung enthält, ist 0,01–100 mg reines Enzymprotein pro g Detergenszusatz.
Detergens
Das lipolytische Enzym der Erfindung kann in Konzentrationen, die herkömmlich in Detergenzien angewendet werden, eingebaut werden. Die Menge des lipolytischen Enzymproteins kann 0,001–10 mg pro Gramm Detergens oder 0,001–100 mg pro Liter Waschlösung sein.
Detergenszusammensetzungen
Gemäß der Erfindung kann das lipolytische Enzym typischerweise eine Komponente einer Detergenszusammensetzung sein. Als solches kann es in die Detergenszusammensetzung in Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms eingefügt sein. Nicht-staubende Granulate können, wie z. B. in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide von Novo Industri A/S) hergestellt werden und können wahlweise beschichtet werden durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000; ethoxylierte Nonylphenole mit von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorhanden sind; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele von Film bildenden Beschichtungsmaterialien, die für eine Anwendung durch Fließbetttechniken geeignet sind, sind in dem Patent GB 1483591 gegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können beispielsweise durch das Hinzufügen eines Polyols, wie Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure oder Borsäure nach etablierten Methoden stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisierer sind im Stand der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können nach dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren zubereitet werden.
Die Detergenszusammensetzung der Erfindung kann eine beliebige zweckmäßige Form haben, z. B. als Pulver, Körnchen, Paste oder Flüssigkeit. Ein flüssiges Detergens kann wässrig, typischerweise bis zu 70% Wasser und 0–30% organisches Lösungsmittel enthaltend, oder nicht-wässrig sein.
Die Detergenszusammensetzung umfasst einen oder mehrere oberflächenaktive(n) Stoff(e), von denen jeder anionisch, nicht-ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Detergens enthält gewöhnlich 0–50% anionischen oberflächenaktiven Stoff, wie lineares Alkylbenzensulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure oder Seife. Es kann ebenso 0–40% nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff enthalten, wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B. wie in WO 92/06154 beschrieben).
Die Detergenszusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme umfassen, wie Amylase, Cutinase, Protease, Zellulase, Peroxidase und Oxidase, z. B. Laccase.
Das Detergens kann 1–65% eines Detergensbuilders oder eines Komplexbildners, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure, lösliche Silikate oder geschichtete Silikate (z. B. SKS-6 von Hoechst). Das Detergens kann ebenso ungebaut sein, d. h. im Wesentlichen frei von Detergensbuildern.
Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäurecopolymere und Laurylmethacrylat-/Acrylsäurecopolymere.
Das Detergens kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H₂O₂-Quelle umfassen kann, wie Perborat oder Percarbonat, welches mit einem Persäurebildenden Bleichaktivator kombiniert werden kann, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzensulfonat (NOBS). Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren z. B. des Amid-, Imid- oder Sulfontyps umfassen.
Die Enzyme der Detergenszusammensetzung der Erfindung können unter Verwenden herkömmlicher Stabilisierungswirkstoffe stabilisiert werden, z. B. einem Polyol, wie Propylenglycol oder -glycerol, einem Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder einem Borsäurederivat, wie z. B. einem aromatischen Boratester, und die Zusammensetzung kann formuliert werden, wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben.
Das Detergens kann ebenso andere herkömmliche Detergensbestandteile enthalten, wie z. B. Gewebekonditionierer, einschließlich Lehme („clays"), Schaumver stärker, Seifenlaugenunterdrücker, Antikorrosionswirkstoffe, Schmutzsuspendierende Wirkstoffe, Anti-Schmutz-Rückablagerungswirkstoffe, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller oder Duftstoffe.
Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei Verwendungskonzentration) ist gewöhnlich neutral oder alkalisch, z. B. in dem Bereich von 7–11.
Einzelne Formen von Detergenszusammensetzungen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung schließen ein:

1) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte (bulk density) von mindestens 600 g/l, umfassend
2) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
3) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
4) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
5) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend
6) Eine wässrige strukturierte flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend
7) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
8) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend
9) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat, umfassend
10) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend
11) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend
12) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
13) Detergensformulierungen wie in 1)–12) beschrieben, wobei das ganze oder ein Teil des linearen Alkylbenzensulfonats durch (C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat ersetzt ist.
14) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
15) Eine Detergenszusammensetzung, formuliert als ein Granulat mit einer Rohdichte von mindestens 600 g/l, umfassend
16) Detergensformulierungen wie in 1)– 15) beschrieben, welche eine stabilisierte oder verkapselte Persäure enthalten, entweder als eine zusätzliche Komponenten oder als ein Ersatz für bereits spezifizierte Bleichsysteme.
17) Detergenszusammensetzungen wie in 1), 3), 7), 9) und 12) beschrieben, wobei Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
18) Detergenszusammensetzungen wie in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15) beschrieben, welche zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z. B. eine der in „Efficient manganese catalysts for lowtemperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639, beschriebenen Verbindungen sein.
19) Detergenszusammensetzung, formuliert als eine nicht-wässrige Detergensflüssigkeit, umfassend einen flüssigen nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff, wie z. B. linear alkoxylierten primären Alkohol, ein Buildersystem (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Detergens kann ebenfalls einen anionischen oberflächenaktiven Stoff und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Das lipolytische Enzym der Erfindung kann in Konzentrationen eingebaut werden, die herkömmlich in Detergenzien verwendet werden. Es wird gegenwärtig in Erwägung gezogen, in der Detergenszusammensetzung der Erfindung das lipolytische Enzym in einer Menge hinzuzufügen, die 0,00001–1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) des lipolytischen Enzyms pro Liter Deckflüssigkeit („wash liquor") entspricht.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung des lipolytischen Enzyms von Botryosphaeria sp.
Die nachfolgenden Medien wurden in diesem Beispiel verwendet:
Es wurde eine Saatkultur hergestellt durch Inokulieren des Stammes CBS 102.95 aus einem Schrägröhrchen von PDA (Produkt von Difco) in zwei Schüttelflaschen, die 100 ml YS-2-Medium enthielten, und Inkubieren der Schüttelflaschen unter Schütteln für 2 Tage bei 27°C. Der End-pH betrug 7,5.
Es wurde eine Hauptkultur durch Verwenden der Saatkultur zubereitet, um 50 Schüttelflaschen mit 100 ml YS-25-Medium zu inokulieren und für 2 Tage bei 27°C unter Schütteln zu inkubieren. Der End-pH betrug 7,3.
2.900 ml zellfreier Brühe mit einer Aktivität des lipolytischen Enzyms von 17 LU/ml wurde nach dem Entfernen der Zellmasse zurückerlangt. Diese wurde deionisiert und gefriergetrocknet, um 11,9 g einer Pulverprobe mit einer Aktivität des lipolytischen Enzyms von 3.540 LU/g zu erhalten.
Beispiel 2
Herstellung des lipolytischen Enzyms von Botryosphaeria ribis
Das lipolytische Enzym wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass der Stamm CBS 504.94 verwendet wurde und dass 3 Tage für die Hauptkultur verwendet wurden. Es wurde eine zellfreie Brühe mit einer Aktivität des lipolytischen Enzyms von 10 LU/ml nach dem Entfernen der Zellmasse zurückgewonnen. Diese wurde deionisiert und gefriergetrocknet, um 17,8 g einer Pulverprobe mit einer Aktivität des lipolytischen Enzyms von 3.050 LU/g zu erhalten.
Beispiel 3
Reinigung und Charakterisierung des lipolytischen Enzyms aus Botryosphaeria sp.
Reinigusvorgehensweise
Es wurde rohes lipolytisches Enzym von Botryosphaeria sp. CBS 102.95 gereinigt wie folgt unter Verwenden eines 2-Schritt-Protokolls, unter Verwendung einer Anionenaustausch- und einer hydrophoben Chromatographie.
Anionenaustauschchromatographie
6,2 g der Zubereitung des lipolytischen Enzyms aus Beispiel 1 wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 7 aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die Lösung wurde auf eine Säule aufgebracht, die mit Q Sepharose (Produkt von Pharmacia) gepackt war, mit dem gleichen Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min equilibriert. Ungebundenes Material wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das lipolytische Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl-Konzentration in dem gleichen Puffer eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf die Aktivität des lipolytischen Enzyms hin geprüft und gesammelt. Der Ertrag dieses Schrittes betrug 54%.
Hydrophobe Chromatogrraphie
Zu dem Pool des lipolytischen Enzyms wurde Ammoniumacetat hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,8 M zu ergeben. Die Lösung wurde auf eine Säule, die mit Butyl Sepharose (Produkt von Pharmacia) gepackt war, aufgebracht, zuvor mit 0,8 M Ammoniumacetat equilibriert. Nach gründlichem Waschen mit einer großen Menge des gleichen Puffers wurde die Elution erstens mit Milli-Q-Wasser und zweitens mit 30% Isopropanol durchgeführt. Die Wasser-Fraktion enthielt 59% der aufgebrachten Aktivität und die Isopropanol-Fraktion enthielt 27%.
Zusammenfassung der Reinigung
Charakterisierung
Die Reinheit und das Molekulargewicht des lipolytischen Enzyms wurden analysiert unter Verwenden eines 4,20%-Gradient SDS-PAGE Gels (Novex) unter Standardbedingungen. Molekulargewichts-Markerproteine wurden von Pharmacia erworben. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine mit Coomassie-Brillant-Blau angefärbt. Das Molekulargewicht des lipolytischen Enzyms wurde sowohl für den Wasser-Pool als auch den Isopropanol-Pool mit 55.000 ermittelt.
Der pI des lipolytischen Enzyms wurde gemessen unter Verwenden einer Ampholin-PAG-Platte, pH 3,5–9,5 (Produkt von Pharmacia). Es wurden pI-Markerproteine von Pharmacia verwendet. Der pI des lipolytischen Enzyms von beiden Pools betrug pI 3,8.
Diese Ergebnisse zeigten an, dass das lipolytische Enzym von den zwei Pools, die von Butyl Sepharose erhalten wurden, das gleiche ist. Das lipolytische Enzym des Wasser-Pools wurde aufgrund der höheren Reinheit für die Verwendung in der Charakterisierung ausgewählt.
Die spezifische Aktivität des lipolytischen Enzyms wurde bei ungefähr 400 LU/A₂₈₀ (Proteingehalt bestimmt durch Absorption bei 280 nm) ermittelt.
Beispiel 4
Reinigung und Charakterisierung des lipolytischen Enzyms von Botryosphaeria ribis
Reinigungsvorgehensweise
Rohes lipolytisches Enzym von Botryosphaeria ribis CBS 504.94 wurde wie folgt durch 3 Schritte gereinigt.
STREAM LINS^TM-Säulenchromatographie
Der erste Schritt war eine STREAM LINE-Säulenchromatographie. 14,3 g des gefriergetrockneten Pulvers aus Beispiel 2 und 3,5 g eines anderen gefriergetrockneten Pulvers (im Wesentlichen in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 hergestellt und mit einer lipolytischen Aktivität von 1780 LU/g) wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) aufgelöst. Das lipolytische Enzym wurde an einer Säule von DEAE-Granulat adsorbiert, mit dem gleichen Puffer equilibriert, und die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen. Das lipolytische Enzym wurde mit dem gleichen Puffer, einschließlich 0,5 M NaCl, eluiert. Der Ertrag dieses Schrittes betrug 45%.
Hydrophobe Säulenchromatographie
Der zweite Schritt war eine hydrophobe Säulenchromatographie unter Verwendung von vorgepacktem Butyl Toyopearl (Produkt von Toyo Soda) und HPLC. Das konzentrierte lipolytische Enzym wurde auf eine Salzkonzentration von 1 M Ammoniumacetat eingestellt. Die Elution wurde bei einem linearen Gradienten von 1–0 M Ammoniumacetat und 20% Ethanol ausgeführt. Die Fraktionen, die eine Aktivität des lipolytischen Enzyms zeigten, wurden erfasst. Es wurde eine Ultrafiltration durchgeführt, um zu konzentrieren und zu entsalzen. Der Ertrag dieses Schrittes betrug 89%.
Anionenaustauschsäulenchromatographie
Der dritte Schritt war eine Anionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwenden von vorgepacktem DEAE Toyopearl (Produkt von Toyo Soda). Das lipolytische Enzym wurde auf pH 7,6 und 0,1 M NaCl eingestellt. Dies wurde auf die Säule aufgebracht, mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), einschließlich 0,1 M NaCl equilibriert, und das lipolytische Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 0,1–2 M NaCl eluiert. Das Chromatogramm zeigte zwei Peaks mit einer Aktivität des lipolytischen Enzyms. Die Fraktionen, die dem ersten Peak entsprachen, wurden zur Verwendung in der Charakterisierung des lipolytischen Enzyms erfasst und dialysiert.
Zusammenfassung der Reinigung
Molakulargewicht
Das Molekulargewicht des gereinigten lipolytischen Enzyms wurde durch SDS-PAGE und Gelfiltrationssäulenchromatographie berechnet. SDS-PAGE wurde unter Verwenden eines 10–15 Gradient-Gels (Produkt von Pharmacia) und Phast System unter Standardbedingungen durchgeführt. Molekulargewichts-Markerproteine wurden von Pharmacia erworben. Nach der Hydrolyse wurden die Proteine mit Coomassie-Brillant-Blau angefärbt. Das Molekulargewicht des lipolytischen Enzyms wurde mit 64.000 ermittelt.
Eine Gelfiltrationschromatographie wurde mit Superdex 200pg 26/60 (Produkt von Pharmacia) und HPLC durchgeführt. 2 ml des gereinigten lipolytischen Enzyms wurden auf eine Säule aufgebracht, equilibriert mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, einschließlich 0,1 M NaCl, und das lipolytische Enzym wurde mit dem gleichen Puffer eluiert. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 3 ml/min. Es wurde ein Gelfiltrationskalibrierungskit (Produkt von Pharmacia) als Standardproteine verwendet. Das Molekulargewicht wurde mit 54.000 ermittelt.
Isoelektrischer Punkt
Der pI des lipolytischen Enzyms wurde durch IEF-PAGE unter Verwenden eines 3–9 Gradient-Gels und Phast System bestimmt. Es wurden pI-Markerproteine von Pharmacia verwendet. Nach der Elektrophorese ergab sich ein Band unter pH 3,5 mit Coomassie-Brillant-Blau-Anfärbung. Die Aktivität des lipolytischen Enzyms wurde an der gleichen Position unter Verwendung von Olivenölemulsion und Brillant-Grün ermittelt.
Spezifische Aktivität
Die spezifische Aktivität wurde mit ungefähr 300 LU/mg ermittelt. Die Proteinmenge wurde durch ein Proteinprüfungskit („protein assay kit") gemessen und lyophilisiertes Rinderplasmaglobulin („Bovine Plasma Globulin Lyophilized") wurde als Standard verwendet (Produkt von Bio-Rad).
Beispiel 5
Herstellung des lipolytischen Enzyms von verschiedenen Stämmen
Jeder der unten aufgelisteten Stämme wurde in Agar-Schrägröhrchen kultiviert. Ungefähr 1 cm² der Schrägkultur wurde hiervon ausgesondert und verwendet, um 100 ml YS-2-Medium in 500 ml-Schüttelflaschen mit zwei Baffles zu inokulieren. Diese Saatkultur wurde bei 30°C unter Schütteln (ungefähr 220 rpm) für 2 Tage inkubiert.
Eine Hauptkultur wurde durch Inkubieren von 3 ml der Saatkultur in 100 ml YS-25 in 500 ml-Schüttelflaschen mit zwei Baffles und Kultivieren und bei 30°C unter Schütteln (ungefähr 220 rpm) zubereitet. Die Kultivierung wurde für 3 Tage fortgesetzt, mit Ausnahme, dass sie für die Stämme NN102563 und NN102564 auf 6 Tage ausgedehnt wurde, da beobachtet wurde, dass sie langsamer wachsen als die anderen Stämme. Am Ende der Kultivierung wurde die Aktivität des lipolytischen Enzyms der Brühe gemessen.
Jedes Experiment wurde zwei Mal ausgeführt und die Ergebnisse (der Durchschnitt der beiden Experimente) waren wie folgt:
Es war zu sehen, dass das lipolytische Enzym von allen getesteten Stämmen erhalten werden kann. Es war ferner zu sehen, dass der Ertrag mit dem Stamm Botryosphaeria NN143554 (CBS 102.95), welcher von den Erfindern isoliert wurde, auffallend höher war als der mit anderen Stämmen.
Beispiel 6
Plattentest für die Aktivität des lipolytischen Enzyms bei pH 10
Der in Beispiel 11 der WO 88/02775 (entsprechend zu JP-W 1-501120) beschriebene Plattentest wurde verwendet, um die Aktivität des lipolytischen Enzyms bei pH 10 mit und ohne die Zugabe von Ca⁺⁺ unter Verwenden der Kulturbrühe des vorangegangenen Beispiels zu überprüfen. Für die Proben aller in Beispiel 5 getesteten Stämme wurde ermittelt, dass sie eine Aktivität des lipolytischen Enzyms bei pH 10, sowohl mit als auch ohne Ca⁺⁺-Zugabe aufwiesen.
Beispiel 7
Bestimmung von Teilaminosäuresequenzen
Gereinigte Lipasen von B. ribis NN 115210 und Botryosphaeria sp. NN143554 wurden der Sequenzierung unterworfen.
Bei der direkten Sequenzierung der zwei Lipasen wurden keine N-terminalen Aminosäuresequenzen erhalten. Dies zeigt, dass die N-terminale Aminogruppe blockiert ist.
Die zwei Lipasen wurden reduziert und S-carboxymethyliert vor der Degradierung mit einer Lysyl-spezifischen Protease. Die resultierenden Peptide wurden fraktioniert und neu gereinigt unter Verwenden einer reversen Phasen-HPLC, bevor sie der N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterworfen wurden.
Es wurden von der NN115210 Lipase 5 Peptidsequenzen erhalten. Sie sind in den Sequenzlisten als SEQ ID NO: 1 bis 5 dargestellt.
Der Xaa-Rest in SEQ ID NO: 4 ist vermutlich ein glycosylierter Asn-Rest.
Von der NN143554 Lipase wurde eine Peptidsequenz erhalten. Diese Aminosäuresequenz war identisch zu der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz von der NN115210 Lipase.
Die Peptidsequenzen wurden mit der bekannten Sequenz der Lipase LIP 1 von Candida cylindracea CBS 6330, welche 534 Aminosäuren aufweist, abgeglichen. Für die fünf Peptide wurde ein Abgleichen der folgenden Positionen von LIP 1 ermittelt. Die Anzahl der passenden („matching") Aminosäuren und die Gesamtzahl der Aminosäuren in dem Peptid sind in Klammern angegeben. Eine Lücke wurde zwischen den Positionen 373–374 der LIP 1-Sequenz eingefügt, um den Abgleich zu verbessern.
SEQ ID NO: 1: Positionen 35–47 (12/13)
SEQ ID NO: 2: Positionen 148–187 (22/40)
SEQ ID NO: 3: Positionen 255–276 (7/22)
SEQ ID NO: 4: Positionen 296–331 (11/36)
SEQ ID NO: 5: Positionen 365–403 (18/40, Lücke eingefügt)
Basierend auf diesem Abgleich, wird angenommen, dass die 5 Peptide Teilsequenzen sind, die in dieser Reihenfolge auftreten.
SEQUENZPROTOKOLL
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MICROORGANISMUS (Regel 13^bis PCT)
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MICROORGANISMUS (Regel 13^bis PCT)

Claims

Alkalisches lipolytisches Enzym, welches a) von einem Stamm von Botrysphaeria oder Guignardia erhältlich ist, b) eine optimale Aktivität bei einem pH in dem Bereich 9–11 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ hat, und c) eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ II) NO:2, 3, 4 und 5, enthält.
Lipolytisches Enzym nach Anspruch 1, wobei der Stamm Botryosphaeria angehört, vorzugsweise B. berengeriana, B. berengeriana f. sp. pilicola, B. dothidea, B. parva, B. ribis, B. ribis var. chromogena oder B. xanthocephala.
Lipolytisches Enzym nach Anspruch 2, wobei der Stamm B. berengeriana MAFF 06-45001, B. berengeriana f. sp. pilicola MAFF 06-45002, B. dothidea JCM 2733, JCM 2735, JCM 2736, JCM 2737, JCM 2738, B. parva ATCC 58191, B. ribis CBS 504.94, ATCC 56125, B. ribis var. chromogena CBS 121.26, B. xanthocephala ATCC 60638 oder Botryosphaeria sp. CBS 102.95 ist.
Lipolytisches Enzym nach Anspruch 1, wobei der Stamm Guignardia angehört, vorzugsweise G. laricina oder G. paulowniae.
Lipolytisches Enzym nach Anspruch 4, wobei der Stamm G. laricina IFO 7887, IFO 7888 oder G. paulowniae MAFF 03-05151 ist.
Lipolytisches Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 1–5, wobei die Sequenz alle Sequenzen enthält, vorzugsweise in der angegebenen Reihenfolge.
Lipolytisches Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 1–6, bereitgestellt als ein Detergenszusatz in der Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit, eines Schlamms oder eines geschützten Enzyms.
Biologische Reinkultur von Botryosphaeria sp. CBS 102.95 oder einer lipolytisches Enzym herstellenden Mutante hiervon.
Verfahren zur Herstellung des lipolytischen Enzyms nach Anspruch 1 umfassend die Kultivierung eines lipolytisches Enzym herstellenden Stamms von Botryosphaeria oder Gcuignardia in einem geeigneten Nährmedium, gefolgt von der Gewinnung des alkalischen lipolytischen Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das lipolytische Enzym ein alkalisches lipolytisches Enzym mit einer optimalen Aktivität bei einem pH in dem Bereich 9–11 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Stamm B. berengeriana MAFF 06-45001, B. berengeriana f. sp. pilicola MAFF 06-45002, B. dothidea JCM 2733, JCM 2735, JCM 2736, JCM 2737, JCM 2738, B. parva ATCC 58191, B. ribis CBS 504.94, ATCC 56125, B. ribis var. chromogena CBS 121.26, B. xanthocephala ATCC 60638, Botryosphaeria sp. CBS 102.95, G. laricina IFO 7887, IFO 7888 oder G. paulowniae MAFF 03-05151 ist.
Verfahren zur Herstellung des lipolytischen Enzyms nach Anspruch 1 umfassend: a) Isolieren einer DNA-Sequenz kodierend das lipolytische Enzym von einem lipolytisches Enzym herstellenden Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia, b) Kombinieren des DNA-Fragments mit passendem/n Expressionssignal(en) in einem passenden Vektor, c) Transformieren eines geeigneten heterologen Wirtsorganismus mit dem Vektor, d) Kultivieren des transformierten Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression des lipolytischen Enzyms führen, und e) Gewinnen des lipolytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das lipolytische Enzym ein alkalisches lipolytisches Enzym mit einer optimalen Aktivität bei einem pH in dem Bereich 9–11 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der lipolytisches Enzym herstellende Stamm B. berengeriana MAFF 06-45001, B. berengeriana f. sp. pilicola MAFF 06-45002, B. dothidea JCM 2733, JCM 2735, JCM 2736, JCM 2737, JCM 2738, B. parva ATCC 58191, B. ribis CBS 504.94, ATCC 56125, B. ribis var. chromogena CBS 121.26, B. xanthocephala ATCC 60638, Botryosphaeria sp. CBS 102.95, G. laricina IFO 7887, IFO 7888 oder G. paulowniae MAFF 03-05151 ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12–14, wobei der Wirtsorganismus ein filamentöser Pilz ist, vorzugsweise ein Stamm der Gattung Aspergillus.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12–15, wobei die DNA-Sequenz isoliert wird durch ein Verfahren umfassend: a) Klonieren, in geeigneten Vektoren, einer cDNA-Bibliothek von dem lipolytisches Enzym herstellenden Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia, b) Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit den Vektoren, c) Kultivieren der transformierten Hefewirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um das alkalische lipolytische Enzym zu exprimieren, d) Durchsuchen nach positiven Klonen durch Bestimmen der Aktivität des in Schritt (c) exprimierten lipolytischen Enzyms.
Detergenszusammensetzung umfassend einen oberflächenaktiven Stoff und ein alkalisches lipolytisches Enzym, welches a) von einem Stamm von Botryosphaeria oder Guignardia erhältlich ist, b) eine optimale Aktivität bei einem pH in dem Bereich 9–11 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ hat, und c) eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 und 5, enthält.