JP2001526523A - 脂肪分解活性を有する修飾された酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、親酵素に比較して、Ｎ−末端及び／又はＣ−末端で１又は複数のペプチド付加物を有する糸状菌又は細菌から回収された、脂肪分解活性を有する修飾された酵素に関する。さらに、本発明は、前記修飾された酵素をコードするDNA配列、前記DNA配列を含んで成るベクター、前記DNA配列又は前記ベクターを有する宿主細胞、及び脂肪分解活性を有する前記修飾された酵素を生成するための方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 脂肪分解活性を有する修飾された酵素 発明の分野 本発明は、脂肪分解活性を有する修飾された酵素、前記修飾された酵素をコー ドするDNA配列、前記DNA配列を含んで成るベクター、前記DNA配列又は前記ベク ターを有する宿主細胞、及び脂肪分解活性を有する前記修飾された酵素を製造す るための方法に関する。 さらに、本発明は、脂肪分解活性を有する親酵素へのペプチド付加を適用する ための方法、本発明の脂肪分解活性を有する修飾された酵素を含んで成る組成物 、洗剤組成物への本発明の修飾された酵素の有利な使用、及び洗剤組成物の洗浄 性能を改良するための方法にも関する。 発明の背景 洗剤酵素は20年以上もの間、市販されており、そして全世界で粉末及び液体洗 剤において通常の洗剤成分として今日、十分に確立されている。 洗剤組成物は多くの異なった酵素を含んで成り、それらの酵素のうち、プロテ アーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼが今日、最とも重要な ものである。脂肪分解酵素 脂肪分解酵素（すなわち、the International Union of Biochemistry and Mo lecular Biology（IUBMB）の推薦（1992）に従って酵素分類番号Ｅ．Ｃ．３．１ ．１（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）として分類される酵素）は、布及び他 の織物から脂質又は脂肪の 染色を除去するために使用され得る酵素である。 種々の微生物リパーゼが洗剤酵素として提案されている。そのようなリパーゼ の例は、ヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載されるヒュミコラ・ラ ヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ、ヨーロッパ特許第238023号に記載さ れるようなリゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、アブシジアsp ．(Absidia sp.)脂肪分解酵素（WO96/13578）、ヨーロッパ特許第214761号に記 載されるカンジダ(Candida)リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカ(C．antarct ica)リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカ リパーゼＡ又はＢ、シュードモナ ス(Pseudomonas)リパーゼ、たとえばヨーロッパ特許第218272号に記載されるよ うなＰ．アルカリゲネス（P．alcaligenes）及びＰ．シュードアルカリゲネス(P ．pseudo alcaligenes)リパーゼ、ヨーロッパ特許第331376号に記載されるよう なＰ．セパシア（P．cepacia）リパーゼ、WO95/14783に開示されるようなシュー ドモナスsp．リパーゼ、バシラス（Bacillus）リパーゼ、たとえばＢ．サブチリ ス(B．subtilis)リパーゼ(Dartoisなど.，(1993)Biochemica et Biophysica act a 1131，253-260)、Ｂ．ステアロサーモフィラス(B．stearothermophilus)リパ ーゼ(日本特許64/744992)及びＢ．プミラス（P．pumilus）リパーゼ（WO91/1642 2）を包含する。 さらに、次のような多くのクローン化されたリパーゼが記載されている：ペニ シリアム・カメムベルチ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Yamaguchiなど .，(1991)，Gene 103，61-67）、ゼオチカム・カンジダム（Geotricum candidum ）リパーゼ（Schimada，Y．など.，(1989)，J．Biochem.，106，383-388）、及 び種々のリゾパス（Rhizopus）リパーゼ、たとえばＲ．デレマル（R．delemar） リパーゼ(Hass，M．J．など.，(1991)，Gene 109，113-117)，Ｒ． ニベウム(R．niveus)リパーゼ(Kugimiyaなど.，(1992)，Biosci．Biotech．Bioc hem．56，716-719)及びＲ．オリザエ(R．oryzae)リパーゼ。 洗剤酵素として示唆されている他のタイプの脂肪分解酵素は、たとえばWO88/0 9367に記載されるようなシュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina) に由来するクチナーゼ、又はフサリウム ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi ）に由来するクチナーゼ（WO90/09446に記載される）を包含する。 最近、修飾された脂肪分解酵素、たとえば洗浄目的のための改良された性質を 有する変異体(Variant)及び突然変異体（mutant）を製造する試みが行なわれて 来た。 ほとんどの場合、改良された洗浄性能を有する脂肪分解酵素が、成熟酵素の二 次又は三次構造におけるそれらのタイプ又はそれらの位置のいづれかに基づいて 選択された特定のアミノ酸残基の置換に起因する特定部位の突然変異誘発により 構成されて来た。 タンパク質及び酵素を修飾するための他の一般的なアプローチは、たとえばア メリカ特許第4,894,331号、WO93/01285及びWO95/22615に記載されるようなラン ダム突然変異誘発に基いている。従来技術に対するコメント 脂肪分解酵素の改良された性能、特に洗浄性能を得るために特定部位の突然変 異誘発により脂肪分解酵素を修飾することは従来技術から知られている。一般的 に使用される概念は、問題の親脂肪分解酵素のアミノ酸鎖の構造部分内のアミノ 酸を挿入し、欠失し、又は置換することであった。有意に改良された洗浄性能を 有する脂肪分解酵素はこの手段で達成されて来た。 しかしながら、それらの従来技術の方法により調製された脂肪分解酵素よりも 一層さらなる改良された性能、たとえば洗浄性能及び ／又はさらに改良された皿洗い特性を有する脂肪分解酵素を改良するための必要 性が存在する。 発明の要約 従って、本発明の目的は、脂肪分解活性を有する酵素の性質を改良することで あり、特に、そのような酵素の洗浄性能を改良することである。 驚くべきことには、脂肪分解酵素のＮ−及び／又はＣ−末端にペプチド付加を 適用することによってその脂肪分解酵素の洗浄性能を有意に高めることが可能で あることが見出された。 従って、第１の観点においては、本発明は、親酵素に比較して、そのＣ−末端 及び／又はＮ−末端に１又は複数のペプチド付加を有する、脂肪分解活性を有す る修飾された酵素に関する。 本発明において、用語“ペプチド付加”とは、一連の１又は複数の連続するア ミノ酸残基が、親酵素のＮ−及び／又はＣ−末端のいづれか又は両者に付加され ているか、又は親酵素のＮ−及び／又はＣ−末端の非構造部分(non-structural part)内に挿入されていることを示すことを意図する。 用語“非構造部分”とは、折りたたまれた成熟酵素の最初又は最後の構造要素 、たとえばα−ヘリックス又はβ−シート構造の外部である、それぞれＮ−及び Ｃ−末端の部分を意味する。その非構造部分は、問題の酵素の三次元構造又はモ デルにおいて容易に同定され得る。典型的には、その非構造部分は、酵素を構成 するアミノ酸配列の最初又は最後の約１〜20個のアミノ酸残基を含んで成る。 用語“成熟酵素”は、その従来の意味において用いられる。すなわち、注目の 生産生物(producer organism)による発現及び翻訳後プロセッシング（プロ及び ／又はプレ−配列を除去するために）の 後に得られる酵素の活性形を示すために使用される。酵素が分泌された酵素であ る場合、成熟酵素は通常、分泌の後に得られる酵素の形であろう。より特定には 、これは、存在するなら、プレー及びプロ−ペプチド配列が始めに翻訳された酵 素、すなわちプロセッシングされていない酵素から除去されていることを意味す る。 用語“親”酵素とは、本発明に従って修飾されるべき酵素を示すことを意図す る。親酵素は、天然に存在する（又は野生型）酵素であり、又はいづれか適切な 手段により調製されるその変異体でもあり得る。たとえば、親酵素は、１又は複 数のアミノ酸残基の置換、欠失又は末端除去（truncation）により、あるいは天 然に存在する酵素、典型的にはその酵素の構造部分におけるアミノ酸配列への１ 又は複数のアミノ酸残基の付加又は挿入により修飾された、天然に存在する酵素 の変異体でありうる。 他の観点において、本発明は、上記で定義された修飾された脂肪分解酵素をコ ードするDNA配列、本発明のDNA配列を含んで成る組換えベクター又は形質転換ビ ークル、本発明のDNA配列又は本発明のベクターを有する宿主細胞、及び前記宿 主細胞の培養による修飾された脂肪分解酵素の製造方法に関する。 本発明の修飾された脂肪分解酵素は、便利には、洗剤酵素として使用され得、 そして従って、最終的観点においては、本発明は、本発明の修飾された脂肪分解 酵素を含んで成る洗剤添加物又は洗剤組成物に関する。 図面の簡単な説明 図１は、酵母発現ベクターpJSO37に存在するようなヒュミコラ・ラヌギノサ(H umicola lanuginosa)リパーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列及びアミ ノ酸配列を示す。シグナル配列（アミノ 酸１〜17）は、ヒュミコラ・ラヌギノサからのシグナル配列である。SPIRRペプ チド付加は、アミノ酸18〜22に位置する。アミノ酸残基23（Ｅ）は、アスペルギ ラス・オリザエに発現される親リパーゼの最初のアミノ酸残基である。 図２は、Ｅ．コリ発現ベクターpJSO215に存在するようなヒュミコラ・ラヌギ ノサ リパーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す 。シグナル配列（アミノ酸１〜20）は、Ａ．ライチカス（A．lyticus）プロテア ーゼＩ シグナル（WO96/17943）である。SPIRRペプチドは、アミノ酸残基20の 後に付加される。アミノ酸残基26（Ｅ）は、アスペルギラス・オリザエに発現さ れる親リパーゼの最初のアミノ酸残基である。 図３は、Ｅ．コリ発現ベクターpSX581に存在するようなヒュミコラ・ラヌギノ サ リパーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。シグ ナル配列（アミノ酸１〜20）は、Ａ．ライチカス プロテアーゼＩ シグナル配 列（WO96/17943）である。アミノ酸残基21（Ｅ）は、親リパーゼの最初のアミノ 酸残基である。 図４は、pSX164の作製を示し； 図５は、pSX578の作製を示し； 図６は、pSX581の作製を示し； 図７は、プラスミドpSX581を示し； 図８は、プラスミドpJSO37を示し； 図９は、アスペルギラスのベクターpCaHj485の作製を示す。 発明の詳細な記載 ペプチド付加 上記で言及されたように、驚くべきことには、適切なペプチド付 加物がその成熟形酵素の非構造部分に又は成熟酵素のＣ−末端及び／又はＮ−末 端で適用される場合に、脂肪分解酵素の有意に改良された洗浄性能が達成され得 ることが見出された。 用語“改良された洗浄性能”とは、本発明の修飾された酵素が、洗浄のような 条件下で試験される場合、修飾されていない親酵素よりも良好な脂肪土壌除去能 力を有することを意味する。改良はしばしば、“改良係数”（ｆ_improve）によ り示される（さらに、下記の材料及び方法のセクションを参照のこと）。ペプチ ド付加及び成熟酵素に依存して、１〜５の範囲、又はさらに、10までの範囲（た とえば１〜10の範囲）の改良係数（ｆ_improve）が得られる。さらに高い改良因 子、たとえば20までの、30までの、又はさらに50までの、たとえば30〜50、又は それよりも高い改良因子が本発明に従って達成され得ると思われる。 用語“適切なペプチド付加”とは、使用されるペプチド付加が改良された洗浄 性能をもたらすことができる付加であることを示すために用いられる。そのペプ チドの付加の“適切さ”は、ペプチド付加が適用されている修飾された酵素及び その対応する親酵素のそれぞれの洗浄性能の比較分析により調べられ得る。洗浄 性能は、たとえば、いづれか適切な技法、たとえば本明細書に記載される洗浄性 能アッセイのいづれかにより決定され得る。 ペプチド付加によりもたらされる改良された洗浄性能は、その脂肪基質に対す る修飾された脂肪分解酵素の高められた親和性に少なくとも部分的に依存すると 思われる（但し、これは唯一の理由ではない）。 本発明は、親脂肪分解酵素の洗浄性能を改良することに限定されない。親脂肪 分解酵素の他の性能もまた、本発明に従って、すなわち、親酵素のＣ−末端及び ／又はＮ−末端の非構造部分での又はそ の部分内への適切なペプチド付加の適用により改良され得る。さらに、特定には 、紙及びパルプ産業におけるピッチの除去に、皮産業における獣皮の脂肪に、有 機合成における触媒としての作用等における親脂肪分解酵素の活性は、脂肪分解 酵素のＮ−末端又はＣ−末端での又はその内部への適切なペプチド付加、すなわ ち所望する機能を示すことができるペプチド付加の適用により有意に改良され得 る。また、それらに関して、改良された活性は、問題の基質に対する改良された 親和性に少なくとも部分的に依存すると思われる。 改良された活性の結果として、修飾されていない親酵素の必要とされる用量に 比較して、一定の目的のために必要とされる酵素の用量を相当に減じることが可 能である。 本発明において、用語“修飾された酵素”とは、親酵素に比較して、Ｃ−末端 及び／又はＮ−末端で（親酵素の最初の及び／又は最後のアミノ酸残基に融合さ れる）及び／又は親酵素のＣ−及び／又はＮ−末端の非構造部分内にペプチド付 加を含んで成る、親酵素の誘導体又は変異体を意味する。従って、たとえば、修 飾された酵素は、親脂肪分解酵素のＮ−末端もしくはＣ−末端のいづれかで、又 はＮ−及びＣ−末端の両者においてペプチド付加を含んで成る。 所望する効果（たとえば、改良された洗浄性能、獣の皮の脱脂における改良さ れた性能、等）を提供するペプチド付加の能力は、たとえば修飾される親酵素の 独自性、ペプチド付加物の構造（長さを包含する）、完全な脂肪分解酵素の構造 に対するペプチド付加の衝撃、ペプチド付加物のアミノ酸残基の性質又は官能性 、等に依存すると現在、思われている。もちろん、所望する効果を提供すること ができるペプチド付加のための先行必要条件は、ペプチド付加を含む修飾された 酵素が適切な宿主生物において発現できることである。次の一般的な考慮は、適 切なペプチド付加の企画のために適切な ものである： ペプチド付加物の長さ：種々の数のアミノ酸残基を含むペプチド付加物が所望 する効果を提供できることが見出されており、本発明に従って使用されるペプチ ド付加物に存在するアミノ酸残基の正確な数を特定することは不可能である。ア ミノ酸残基の数の上限は、その得られる修飾された酵素の発現、構造及び／又は 活性に対するペプチド付加の衝撃に基づいて決定されると思われる。ペプチド付 加物は、実質的な数のアミノ酸残基を含んで成るが、しかしながら、それらのア ミノ酸残基のすべてが所望する効果に寄与する必要はないと思われる（ペプチド 付加物が実質的な数のアミノ酸残基を含んでいるとしても、それらの少数のみが 、所望する機能を提供するために必要であり、この少数がペプチド付加物の機能 的部分と呼ばれる。ペプチド付加物のアミノ酸残基の数の下限に関する主な考慮 は通常、その数が所望する効果を提供するのに十分であるべきであることであろ う。 従って、ペプチド付加物は、単一のアミノ酸残基、又は２〜500個のアミノ酸 、たとえば１〜200個又は２〜100個、好ましくは２〜50個、たとえば３〜50個、 さらにより好ましくは７〜45個及びさらに一層好ましいことには１〜15個、たと えば１〜10個又は１〜７個、特に４〜10個、たとえば４〜７個のアミノ酸のアミ ノ酸鎖を含んで成る。 安定性：ペプチド付加は好ましくは、許容できる安定性（たとえは構造安定性 及び／又は発現安定性）を有する修飾された脂肪分解酵素を供給するために、又 は親酵素の構造安定性を有意に減じないよう選択されるべきである。多くのペプ チド付加は得られる修飾された酵素に対していづれの実質的な構造不安定性も付 与するとは思われないが、ある場合、及びある親酵素に関しては、修飾された脂 肪分解酵素に構造安定性を本質的に付与することができるペプチド付加物を選択 することが適切である。たとえば、構造要素、たとえばα−ヘリックス又はβ− シートを実質的に形成するペプチド付加物は、その得られる修飾された酵素を安 定化し、そして従って、本発明に使用され得る。そのような構造を形成すること ができるペプチド配列は当業界において知られている。他方、改良された構造安 定性は、本発明の修飾された脂肪分解酵素にシステイン架橋の導入により提供さ れ得る。たとえば、ペプチド付加物と酵素の成熟部分との間のシステイン架橋は 、ペプチド付加物のアミノ酸残基の少なくとも１つが酵素の成熟部分におけるシ ステイン残基に対して共有結合を形成することができるよう配置されるシステイ ン残基である場合に確立され得る。システイン架橋を導入する陽性効果は例19に 示される。適切なシステインが成熟酵素に存在しない場合、システインが、前記 親酵素の適切な位置で、便利には、活性のためには重要でないと思われる親酵素 のアミノ酸を置換することによって挿入され得る。 さらに、ペプチド付加物のアミノ酸残基の少なくとも１つが、修飾された脂肪 分解酵素を発現するために使用される宿主のタンパク質分解酵素によるタンパク 質分解変性に対して低い感受性にペプチド付加物をするために選択されることが 所望される。たとえば、ペプチド付加物は、１〜５個、たとえば１〜４個又は１ 〜３個又は２個又は１個のプロリン残基を含んで成る。プロリン残基は好ましく は、タンパク質分解切断部位又はそれに隣接する部位に配置される。他方、ペプ チド付加は、たとえばヨーロッパ特許第407225号又はWO93/11254に記載されるよ う、修飾されたリパーゼに対してプロテアーゼ安定性ループを付与するものであ り得る。 ペプチド付加物のアミノ酸残基の性質：上記で言及されたように 、及びいづれの理論にも制限されないが、改良された性能は、ペプチド付加によ り供給される基質に対する修飾された脂肪分解酵素の高められた親和性に少なく とも部分的に依存すると思われる。特に、洗浄性能に関しては、好ましい静電相 互作用が、負に荷電された脂質表面と修飾された酵素に存在する正に荷電された 及び／又は疎水性アミノ酸残基との間で得られると思われる。従って、本発明の 修飾された酵素は少なくとも１つの正の電荷、たとえば少なくとも２，３，４又 はそれ以上の正の電荷を有するペプチド付加物、又はペプチド付加物の実質的な 数のアミノ酸残基が正に荷電され、そして／又は疎水性である異なって発現され たペプチド付加物を含んで成ることが特に好ましい。 同様に、及び親酵素の非構造端における負の電荷を減じるためには、選択され た親酵素の非構造Ｎ−末端又はＣ−末端部分から、特に１〜５個、たとえば１〜 ４個、又は１〜３個、もしくは１〜２個の最初又は最後のＮ−末端又はＣ−末端 アミノ酸残基から構成される親リパーゼの部分から、少なくとも１つ、たとえば ２又はそれ以上の負に荷電されたアミノ酸残基を除去することが好ましい。負に 荷電されたアミノ酸残基は、除去され得、あるいは中性の、正に荷電された又は 疎水性のアミノ酸残基により置換され得る。たとえば、除去されるべき負に荷電 されたアミノ酸残基は、正の荷電されたアミノ酸残基Ｒ，ＫもしくはＨ、中性の アミノ酸残基Ｓ，Ｔ，ＧもしくはＱ、又は疎水性アミノ酸残基Ａ，Ｉ，Ｗ，Ｆも しくはＬのいづれかにより置換され得るＥ又はＤであり得る。同様に、親酵素の 非構造Ｎ−末端又はＣ−末端部分の中性アミノ酸残基は、上記で定義されたよう に正の荷電された又は疎水性のアミノ酸残基により置換され得る。 従って、Ｎ−末端及び／又はＣ−末端延長の他に、あるいはその 代替としての本発明の修飾された脂肪分解酵素は、親酵素の非構造Ｃ−末端及び ／又はＮ−末端における突然変異を含んで成り、ここで前記突然変異は前記非構 造部分の負に荷電されたアミノ酸残基の欠失、あるいは正の荷電されたもしくは 中性のアミノ酸残基、又は疎水性アミノ酸残基による置換を包含している。 ペプチド付加が親酵素のＮ−及びＣ−末端の両者に存在する場合、個々の末端 での又はその末端内でのペプチド付加物は同じか又は異なったアミノ酸配列を有 することができる。 ペプチド付加物の安定性の試験：たとえば上記原理に基づいて企画された、与 えられたペプチド付加物を用いる効果は、ペプチド付加物を含む修飾された脂肪 分解酵素を構成し、そして所望の酵素の用途、たとえば洗浄、ピッチ除去、皮の 脱脂、等について得られる酵素の性質を、十分な規模の試験で、又は問題の酵素 用途と十分に相互関係を有するアッセイにおいて試験することによって、試験さ れ得る。 ペプチド付加は次の手段で一般化され得る： 最初の残基（外側の残基から計数される）は“ａ”と命名され、第２の残基は “ｂ”と命名され、第３の残基は“ｃ”と命名される。従って、Ｎ−末端付加の 場合、最初のアミノ酸残基は“ａ”と命名され、Ｃ−末端付加の場合、最後のア ミノ酸残基は“ａ”と命名される。 本発明の重要な態様において、ペプチド付加物は１〜７個のアミノ酸から成る 。親酵素のＮ−及び／又はＣ−末端の両者に適用され得るそのようなペプチド付 加は、下記のように言及され得る： a（１つのアミノ酸ペプチド付加） a-b（２個のアミノ酸ペプチド付加） a-b-c（３個のアミノ酸ペプチド付加） a-b-c-d（４個のアミノ酸ペプチド付加） a-b-c-d-e（５個のアミノ酸ペプチド付加） a-b-c-d-e-f（６個のアミノ酸ペプチド付加） a-b-c-d-e-f-g（７個のアミノ酸ペプチド付加） 個々の文字は次のようなアミノ酸残基を定義する： ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ及びｇは、独立して、次のアミノ酸のいづれかであり得 る：アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プ ロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（ Ｍ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、 チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ ）。 特定の態様においては、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ及びｇは独立して、次のアミ ノ酸の１つである： ａ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Arg，Cys，又はLys， ｂ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Pro，Arg，Lys，Cys，又はHis， ｃ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Pro，Arg，Cys,又はLys。 ｄ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Pro，Arg，Cys,又はLys。 ｅ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Ala，Glu，Cys,又はAsp， ｆ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Ala，Glu，Cys,又はAsp， ｇ：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Cys,又はMet。 好ましい態様において、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ又はｇのうち少なくとも１個 、たとえば１，２，３又は４個が正に荷電されたアミ ノ酸、すなわちArg（Ｒ）、又はLys（Ｋ）、又は疎水性アミノ酸、すなわちLeu ，Ile，Val，Trp又はPheである。 上記で言及されたように、及び選択される宿主細胞に依存して、ペプチド付加 物は、選択される宿主細胞による酵素のプロセッシングの間、タンパク質分解性 の分解に対して修飾された脂肪分解酵素を保護するために少なくとも１つのプロ リン残基を含むことが重要であると一般的に思われる。プロリン残基は、ペプチ ド付加の位置２（すなわち、ｂ）及び／又は３（すなわち、ｃ）、又は所望する 切断点（すなわち、注目の宿主細胞によるプロセッシングが生じると思われる点 ）に隣接する位置を占有することが所望される。従って、１つの態様においては 、ペプチド付加物のｂ、及び任意には、ｃはProである。 本発明の他の態様においては、ａ−ｂはSP(Ser-Pro)，Ａ−Ｐ又はＱ−Ｐであ る。ペプチド付加物が複数のアミノ酸残基、たとえば４〜７個のアミノ酸を含む 場合、そのペプチド付加物は一般式SPcd，SPcde，SPcdef，SPcdefg又はAPcd，AP cde，APcdef，APcdefg、又はQPcd，QPcde，QPcdef又はQPcdefgを有する。それら の個々の式において、ｃ，ｄ，ｅ，ｆ及びｇはいづれかのアミノ酸であり得る。 しかしながら、上記アミノ酸のグループが好ましい。 他の態様においては、ａ−ｂは、少なくとも１つの正のアミノ酸(すなわちArg 及びLys)、又は疎水性アミノ酸残基(すなわち、Leu，Ile，Val，Trp及びPhe)を 含んで成る。 特に、親脂肪分解酵素に適用されるペプチド付加は、好都合には、次のアミノ 酸残基又はペプチドの１つであり得る： また本発明によれば、７個以上のアミノ酸、たとえば８〜15個のアミノ酸を含 んで成る付加物も企画される。 そのようなペプチドは次のように一般化され得る。 a-b-c-d-e-f-g-h（８個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i（９個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j（10個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k（11個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l（12個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m（13個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m-n（14個のアミノ酸ペプチド） a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m-n-o(15個のアミノ酸ペプチド) ａ〜ｏは、前記20個のアミノ酸のいづれかであり得る。 ａ〜ｇストレッチは、１〜７個のアミノ酸残基を含んで成るペプチド付加物に 関して上記で定義された通りであり得る。 ｈ，ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏは、上記のいづれかのアミノ酸であり得、好 ましくは、次のアミノ酸のいづれかであり得る：Arg，Lys，Ala，Val，Trp，Ile ，Phe，Ser又はPro。 そのような付加物の特定の例は、下記に列挙される： 位置“ａ”がSer，Ala，Arg，Lys又はProである上記特定されたペプチド付加 物（１〜７個又は１〜15個のアミノ酸残基を含んで成る）のいづれかにおいては 、SerはAla，Arg，Lys又はProにより、AlaはSer，Arg，Lys又はProにより、そし てArg，Lys又はProはAla又はSerにより置換され得る。 上記ペプチド付加は、Ｎ−末端及び／又はＣ−末端のいづれかで存在できるこ とが強調されるべきである。Ｎ−及びＣ−末端ペプチド付加の両者を有する修飾 された脂肪分解酵素の例は、上記で特定されたペプチド付加のすべての組合せを 包含する。そのような２つの特定の例は、Ｎ−末端付加物SPIRPRP、及びＣ−末 端付加物RRP又はRRである。 ペプチド付加物が親酵素の非構造部分中に挿入される場合、それ は前記非構造部分の１又は複数のアミノ酸残基を置換することができる。たとえ ば、ペプチド付加は、最初の、たとえばＮ−末端の１〜５個のアミノ酸残基、及 び／又は最後の、たとえば酵素の１〜５個のアミノ酸（すなわち、Ｃ−末端の１ 〜５個のアミノ酸）を占有する１又は複数のアミノ酸残基を置換することができ る。たとえば、ペプチド付加は、親酵素のいづれかの端から、アミノ酸残基１、 及び／又は２、及び／又は３、及び／又は４、及び／又は５、等を置換すること ができる。親酵素がＨ．ラヌギノサ リパーゼである場合、親残基１（１Ｅ）の 欠失と、上記ペプチド付加（Ｎ−末端に適用される）のいづれかとを組合すこと が特に興味の対象であった。 本発明によれば、修飾された酵素に、その修飾された酵素の効果的な精製を可 能にする１又は複数の荷電されたアミノ酸を適用することがまた、企画される。 これを行なうための技法は、分子生物学の分野における当業者に良く知られてい る。 親脂肪分解酵素へのペプチド付加の適用の方法 本発明の修飾された酵素は、合成的に生成されたペプチド付加物を注目の親脂 肪分解酵素中に添加（融合又は挿入）することによって得られるが、本発明の修 飾された酵素は、ｉ）親酵素のＮ−及び／又はＣ−末端に適用される所望のペプ チド付加をコードするよう、親酵素をコードするヌクレオチド配列、好ましくは DNA配列を修飾し（たとえば、親酵素をコードする核酸(好ましくはDNA)配列にお ける適切な位置で、ペプチド付加物をコードする核酸(好ましくはDNA)配列を挿 入することによって）、ii）得られる修飾された核酸(好ましくはDNA)配列を適 切な発現系において発現し、そしてiii）その得られる修飾された酵素を回収す ることによって調製される。 本発明において、用語“適用される”とは、付加物が成熟酵素のＮ−及び／又 はＣ−末端（たとえば最初又は最後のアミノ酸残基に）融合されるか又は成熟酵 素のＮ−末端及び／又はＣ−末端の非構造部分中に挿入されることを示すことを 意図する。 多くの酵素は、“プレプロ−酵素”として、すなわち成熟酵素、分泌シグナル ペプチド（すなわちプレペプチド）及びプロ−ペプチドから成る酵素として発現 される。プレプロ−酵素は発酵培地中に分泌されるよう細胞内でプロセスされ、 これから成熟酵素が単離され、そして／又は精製され得る。親酵素へのペプチド の付加は、所望するペプチド付加物をコードする核酸配列を、親酵素をコードす るDNA配列の上流（Ｎ−末端ペプチド付加のためには）及び／又は下流（Ｃ−末 端ペプチド付加のためには）に適用することによって実施され得る。 前記挿入は、所望の修飾された酵素（すなわち、所望するペプチド付加物を有 する）が、その酵素の転写、翻訳及びプロセッシングの後、発現されそして分泌 されるような態様で実施されるべきである。用語“プロセッシング”とは、プレ −及びプロ−ペプチドの除去を意味する（但し、もちろん、プロ−ペプチドが所 望するペプチド付加物と同一である場合は除く）。これは下記にさらに示される であろう。 下流の配列（Ｃ−末端付加物をコードする）は、親酵素をコードするDNA配列 と停止コドンとの間に挿入され得る。しかしながら、プロセッシングされていな いDNA配列がＣ−末端でプロ−ペプチドをコードするDNAを含んで成る場合、ペプ チド付加物をコードするDNA配列の挿入／付加はまた、それぞれ、プロ−ペプチ ドをコードするDNA配列と成熟酵素をコードするDNAとの間で生じ得る。 ほとんどの場合、ペプチドをコードするDNA配列を、プロ−ペプ チド又はプレ−ペプチド（プロ配列が存在しない場合）をコードするDNA配列と 、成熟酵素をコードするDNA配列との間に挿入することによって、親酵素を上流 に延長することが可能である。 ペプチド付加をコートするDNA配列の挿入／付加は、分子生物学の分野におけ る当業者により知られているいづれかの標準的技法により実施され得る（たとえ ば、Sambrookなど.，1989を参照のこと）。これは、たとえばアメリカ特許第4,6 83,202号又はR．K．Saikiなど.，(1988)，Science，239，487-491に記載される 、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を包含する。隣接す るDNA配列の発現及び分泌をいかにして提供するかは、下記に記載されるであろ う。 本発明に関して、いくつかの宿主細胞は、ペプチド付加物の一部又はすべてが 宿主細胞により行なわれる翻訳後プロセッシング又は他のプロセッシングの間に 切断され得ることにおいて、所望する修飾された酵素の生成のためにほとんど適 切でないことが見出された。従って、用語“適切な発現系”とは、損なわれてい ない所望の修飾された酵素の少なくとも一部の生成を可能にする発現系（宿主細 胞及び任意には、発現ベクター）、すなわち選択された宿主細胞による翻訳後プ ロセッシング又は他のプロセッシングの一部として、ペプチド付加物の一部又は すべてを除去しない（そして、それにより、所望するペプチド付加物なしでは酵 素を生成しない）発現系を示すことを意図する。典型的には、使用される発現系 は、所望しない翻訳後プロセッシングを発揮するｌ又は複数のタンパク質分解活 性を欠いている。発現系及び従って、宿主細胞の選択は、下記で詳細に論ぜられ るように、生成される脂肪分解酵素に依存するであろう。 本発明の修飾された酵素を生成するために適切な発現系を選択す ることに注意が払われるべきであるが（特に、修飾されたDNA配列がその生成の ために使用される場合）、本発明の修飾された脂肪分解酵素（改良された洗浄性 能を有する）は、通常の態様で、翻訳されたポリペプチドをプロセッシングする ことができず、そしてそれにより、そのプロセッシングの前、完全なポリペプチ ドの一部又は成熟タンパク質に関連する類似するペプチド配列を含んで成る酵素 の生成をもたらす発現系において、注目の親脂肪分解酵素をコードするDNA配列 を発現することによって得られる。この場合、プロペプチド又は類似するペプチ ド配列が、ペプチド付加物を構成する。そのプロ−ペプチド又は類似するペプチ ド配列は、親酵素に対して非相同（heterologous）又は相同（homologous）であ り、そして親酵素のＮ−及びＣ−末端の両者に存在することができる。この後者 の技法を用いての本発明の修飾された脂肪分解酵素の生成がさらに下記に記載さ れる。 従って、アミノ酸の適切な延長が親酵素のプレプロ形においてすでにコードさ れ、そしてこのアミノ酸の延長が与えられた発現系による酵素のプロセッシング において切断される場合、ペプチド付加物は、前記アミノ酸の延長部の前記プロ セッシングが生じないシステムに発現宿主システムを変えることによって適用さ れ得る。そのような場合、分泌シグナルプレ−ペプチドが分泌の間又はその後に 切断され、プロ−ペプチドもしくはその一部、又はその対応するDNA配列により コードされる類似するペプチド配列を含んで成る、親酵素から成る修飾された酵 素、すなわちそのＮ−末端又はＣ−末端のいづれかで延長された脂肪分解酵素を もたらす。 換言すれば、さらなる観点において、本発明は、親酵素の洗浄性能又は他の活 性を高めるための方法に関し、ここで前記方法は、 ａ）親脂肪分解酵素をコードするDNA配列を発現ベクター中に導 入し、 ｂ）前記DNA配列又は発現ベクターを、成熟酵素へのその発現されたプロ−酵 素のプロセッシングができないか又は非効率的／である宿主細胞中に導入し、 ｃ）前記宿主細胞を、完全なプロ（プレ）−配列の一部を含んで成る酵素の生 成のために適切な条件下で培養し、そして ｄ）得られる修飾された酵素を回収し、そして場合によっては、精製すること を含んで成る。酵母細胞は、親菌類脂肪分解酵素、特にＨ．ラヌギノサ リパー ゼ酵素にペプチド付加（プロペプチド又はその一部の形での）を適用するために 特に使用されて来た。 他の及び非常に好ましい態様においては、ペプチド付加は、次の原理に従って ランダム突然変異誘発により企画され、そして適用される： ａ）ペプチド付加物を有する親脂肪分解酵素をコードするDNA配列を、そのペ プチド付加物における又は親酵素のＣ−末端もしくはＮ−末端の非構造部分にお ける局在化されたランダム突然変異誘発にゆだね、 ｂ）段階ａ）で得られた、変異誘発されたDNA配列を宿主細胞において発現し 、そして ｃ）親脂肪分解酵素に比較して、改良された性能を有する変異誘発された脂肪 分解酵素を発現する宿主細胞についてスクリーンすることを含んで成る。 このアプローチによれば、多くの非常に好都合なペプチド付加物が創造された 。局在化されたランダム突然変異誘発は、WO95/22615に実質的に記載されるよう にして行なわれ得る。より特定には、突然変異誘発は、１又は複数の上記領域の みが突然変異誘発にゆだねられる条件下で実施される。特に、大きなペプチド付 加を突然変異 誘発するためには、突然変異誘発されるべき領域を端に有する１又は複数の適切 なオリゴヌクレオチドプローブが使用される、PCR生成の突然変異誘発（たとえ ば、Deshler 1992又はLeungなど.，1989により記載されるような）を用いること が適切である。短いペプチド付加の突然変異誘発のためには、ドープ処理された 又はスパイクされたオリコヌクレオチドの使用によりその局在化されたランダム 突然変異誘発を行なうことが最とも好ましい。前記ドーピング又はスパイキング は、たとえば所望しないアミノ酸残基のためのコドンを回避するために、又は特 定タイプのアミノ酸残基、たとえば正に荷電された又は疎水性のアミノ酸残基が 所望する位置で導入される見込みを高めるために使用される。 突然変異誘発に続いて、その突然変異誘発されたDNAは、そのDNA配列を担持す る適切な宿主細胞を、発現の発生を可能にする条件下で培養することによって発 現される。この目的のために使用される宿主細胞は、任意には、ベクター上に存 在する突然変異誘発されたDNA配列により形質転換されたもの、又は突然変異誘 発処理の間、親酵素をコードするDNA配列を担持するものであり得る。適切な宿 主細胞の例は下記に与えられており、そして好ましくは、突然変異誘発された酵 素を分泌できる（容易なスクリーニングを可能にする）宿主細胞である。酵母細 胞、たとえばＳ．セレビシアエの細胞は、適切な宿主細胞であることが見出され た。 段階ｃ）のスクリーニング基準は、修飾された脂肪分解酵素の所望する性質に 依存して選択されるべきであろう。改良された洗浄性能を有する修飾された脂肪 分解酵素を構成することが所望される場合、スクリーニングは便利には、カルシ ウムに対する減じられた依存性及び／又は洗剤又は洗剤成分に対する改良された 耐性のために行なわれる。前記洗剤又は洗剤成分は、下記の洗剤組成物セクショ ンに言及される特定の成分のいづれかであり得る。好ましい洗剤成分は、非イオ ン性又はアニオン性界面活性剤、たとえばアルコールエトキシレート又はLASで あり、好ましい洗剤は、下記の材料及び方法に記載される洗剤PCSである。非イ オン性界面活性剤は、Ｈ．ラヌギノサタイプのリパーゼ（たとえば菌類リパーゼ ）のスクリーニングのために特に興味あるものであり、そしてアニオン性界面活 性剤は、シュードモナスタイプのリパーゼのスクリーニングのために興味あるも のである。 段階ｃ）のスクリーニングは便利には、次の原理に基づいてフィルターアッセ イの使用により行なわれる： 興味ある修飾された脂肪分解酵素を発現することができる微生物が、適切な培 地上で及び分泌される酵素のための適切な条件下でインキュベートされ、ここで 前記培地は、第１のタンパク質結合フィルター及びその上部に、低いタンパク質 能力を示す第２フィルターを含んで成る二重フィルターを有する。微生物は第２ フィルター上に位置する。インキュベーションに続いて、微生物から分泌される 酵素を含んで成る第１フィルターが、微生物を含んで成る第２フィルターから分 離される。前記フィルターが所望の酵素活性についてのスクリーニングにゆだね られ、そして第２フィルター上に存在するその対応する微生物コロニーが同定さ れる。 酵素活性を結合するために使用されるフィルターは、いづれかのタンパク質結 合フィルター、たとえばナイロン又はニトロセルロースであり得る。発現生物の コロニーを担持する上部フィルターは、タンパク質結合のための親和性を有さな いか又は低い親和性を有するいづれかのフィルター、たとえば酢酸セルロース又 はDurapore^TMであり得る。前記フィルターは、スクリーニングのために使用され るいづれかの条件により予備処理され得、又は酵素活性の検出の間 、処理され得る。 酵素活性は、色素、螢光、沈殿、pHインジケーター、IR−吸光度、又は酵素活 性の検出のためのいづれか他の既知の技法により検出され得る。 検出化合物は、いづれかの固定化剤、たとえばアガロース、寒天、ゼラチン、 ポリアクリルアミド、スターチ、フィルター紙、布、又は固定化剤のいづれかの 組合せにより固定され得る。 リパーゼ活性は、脂質、たとえばオリーブ油又はラーゼと組合して、ブリリア ントグリーン、ローダミンＢ又はスダンブラックにより検出され得る。改良され た洗浄性能を有する修飾された脂肪分解酵素を同定するためのスクリーニング基 準は、酵素活性の上記検出器の１つと組合せて、たとえばEGTA，EDTA、非イオン 性又はアニオン性テンシド、アルカリ性pH又はいづれかの洗剤組成物であり得る 。 本発明のフィルターアッセイに使用されるスクリーニング基準は、スクリーニ ングされるべき酵素の所望する性質又は用途に応ずるよう選択され得ることが理 解されるであろう。たとえば、紙及びパルプ産業における特定の用途の脂肪分解 酵素についてのスクリーニングのためには、高められた温度安定性を有する酸性 酵素についてスクリーンすることが適切である。これは、酸性pH（たとえばpH４ ）の緩衝液を用い、そして／又はアッセイの前、又はアッセイ下でより高い温度 下でインキュベートすることによって行なわれ得る。 他方、スクリーニングは、段階ｂ）に起因する突然変異誘発された脂肪分解酵 素を単離し、そしてその洗浄性能（又はいづれか他の相当の性質）を試験するこ とによって実施され得る。また、後者の“インビボ”試験は、スクリーニングア ッセイにおいて選択される突然変異誘発された脂肪分解酵素の最良のものを同定 するためにス クリーニングアッセイに加えて使用され得る。最終的に、得られる修飾された脂 肪分解酵素のアミノ酸配列決定が、ペプチド付加物のアミノ酸配列を確かめるた めに使用され得る。 性質の改良方法 上記親脂肪分解酵素の性質を改良し、特に洗浄性能を改良することもまた本発 明の目的である。本発明の方法により得られる改良された性質は、脂質基質に対 して高められた親和性の結果であると思われる。 本発明の方法は、その成熟形の親酵素のＮ−末端又はＣ−末端にペプチド付加 を適用することを含んで成る。本発明の態様において、これは、親脂肪分解酵素 のプレ、プロ又はプレプロー形をコードするDNA配列を含んで成る宿主細胞を培 養することによって親酵素にペプチド付加を適用することにより行なわれる。任 意には、前記DNA配列は、ベクター上に存在する。得られる修飾された脂肪分解 酵素の回収、宿主細胞、培養条件及び／又は回収条件は、少なくとも５％、たと えば少なくとも10％、たとえば少なくとも15％、たとえば少なくとも20％、たと えば少なくとも25％、たとえば少なくとも50％、たとえば少なくとも75％の生成 された修飾酵素分子が所望するペプチド付加、たとえば完全なプロー配列又はそ の実質的な部分を含んで成ることをもたらす、親酵素のプレ、プロ又はプレプロ −形の部分的プロセッシングが生じるように選択される。 宿主細胞は、親酵素以外の異なった起源のもの、たとえば親酵素が由来する属 以外の他の属のものであり得、又は親酵素の源よりも他の翻訳後プロセッシング 機構を有することができる。 親脂肪分解酵素は好ましくは、糸状菌、たとえばヒュミコラsp.の株、特に、 Ｈ．ラヌギノサ、又は細菌、たとえばシュードモナスsp.の株に由来し、そして 宿主細胞は酵母細胞、たとえばサッカロ ミセスsp.の株、特にサッカロミセス・セレビシアエ、又はハンセヌラsp．(Hans enula sp.)の株である。 本発明の態様において、親脂肪分解酵素にペプチド付加を適用するために使用 される宿主細胞の固有のタンパク質分解酵素生成能力は、その宿主細胞により１ 又は複数のタンパク質分解酵素の生成を破壊することによって減じられて来た。 本発明の方法は、 ａ）ペプチド付加を有する親脂肪分解酵素をコートするDNA配列、たとえば本 発明のDNA配列を、前記ペプチド付加をコードするDNA配列の部分又は親酵素のＣ −末端又はＮ−末端の非構造部分における局在化されたランダム突然変異誘発に ゆだね、 ｂ）段階ａ）で得られた、変異誘発されたDNA配列を宿主細胞において発現し 、そして ｃ）親脂肪分解酵素に比較して、改良された性能を有する変異誘発された脂肪 分解酵素を発現する宿主細胞についてスクリーンする、 ことを含んで成る。 １つの態様において、前記DNA配列は、そのプロ又はプレプロ−形で親酵素を コードする遺伝子又はcDNA配列である。 非構造部分の負に荷電されたアミノ酸残基を欠失するか、あるいは中性もしく は正に荷電されたアミノ酸残基、又は疎水性アミノ酸残基により置換するか、又 は中性アミノ酸残基を正に荷電されたアミノ酸残基により置換することによって 、その成熟形で親酵素のＣ−末端又はＮ−末端の非構造部分に突然変異を導入す ることもまた、本発明に従って企画される。 親脂肪分解酵素 本発明の修飾された脂肪分解酵素は、微生物起源、好ましくは細 菌又は菌類（すなわち、糸状菌又は酵母）起源のいづれかの親脂肪分解酵素から 作製され得る。 本発明によれば、本発明の酵素は、脂肪分解酵素、たとえばリパーゼ、ホスホ リパーゼ、エステラーゼ及びクチナーゼ（従来の用語法によれば）であり得る。 プロ−及び／又はプレ−ペプチドをそれらのプロセッシングされていない状態 で通常含んで成る脂肪分解酵素、及びそれらを含まない酵素か本発明の修飾のた めの親酵素として作用するよう企画されることが理解されるべきである。 適切な親脂肪分解酵素の例は、次の微生物に由来する酵素を包含する： ヒュミコラ、たとえばＨ．ブレビスポラ(H．brevispora)、Ｈ．ラヌギノサ、 Ｈ．ブレビスvar．サーモイデア(H．brevis var．thermoidea)及びＨ．インソレ ンス（H．insolens）(アメリカ特許第4,810,414号又はWO96/13580)； シュードモナス、たとえばPs．フラギ(Ps．fragi)、Ps．スチュテゼリ（Ps．s tutzeri）、Ps．セパシア(Ps．cepacia)及びPs．フルオレスセンス（Ps．fluore scens）(WO89/04361)、又はPs．プランタリ(Ps．plantarii)又はPs．グラジオリ （Ps．gladioli）（アメリカ特許第4,950,417号（Solvay酵素））、又はPs．ア ルカリゲネス及びPs．シュードアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号又は WO94/25578）、又はPs．メンドシナ（Ps．mendocina）(WO88/09367及びアメリカ 特許第5,389,536号)； フサリウム、たとえばＦ．オキシスポラム（F．oxysporum）（ヨーロッパ特許 第130,064号）又はＦ．ソラニ ピシ（WO90/09446）； ムコール（Mucor）(また、リゾムコル（Rhizomuror）とも呼ばれ る)、たとえばＭ．ミエヘイ（M．miehei）(ヨーロッパ特許第238023号)； アビシジアsp．(Absidiasp.)(WO96/13578)； クロモバクテリウム（Chromobacterium）(特にＣ．ビスコサム(C．viscosum)) ； アスペルギラス（特に、Ａ．ニガー）； カンジダ、たとえばＣ．シリンドラセア（C．cylindracea）（また、Ｃ．ルゴ サ(C．rugosa)とも呼ばれる）、又はＣ．アンタルクチカ（WO88/02775）、又は Ｃ．アンタルクチカ リパーゼＡ又はＢ（WO94/01541及びWO89/02916）； ゼオトリカム(Geotricum)、たとえばＧ．カンジダム（G．candidum）(Schimad aなど.，(1989)，J．Biochem.，106，383-388)； ペニシリウム、たとえばＰ．カメムベルチ（P．camlmbertii）（Yamaguchiな ど.，(1991)，Gene 103，61-67）； リゾプス（Rhizopus）、たとえばＲ．デレマー（R．delemer）（Hassなど.，( 1991)，Gene 109，107-113）、又はＲ．ニベウス（R．niveus）(Kugimiyaなど. ，（1992）Biosci．Biotech．Biochem 56，716-719)、又はＲ．オリザエ；及び バシラス、たとえばＢ．サブチリス(Dartoisなど.，（1993）Biochemica et B iophysica acta 1131，253-260)、又はＢ．ステアロサーモフィラス（B．stearo themophirus）（JP64/7744992）又はＢ．プミラス（B．pumilus）（WO91/16422 ）。 一般的な名称サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)は、 １つの種、サーモマイセス・ラヌギノサスについてTsiklinskyにより1899年に紹 介された。この種は、形態学的及び生理学的に非常に特徴的であり、そしてTsik linskyのサーモマイセス・ラヌギノサスはのちの研究者（たとえば、Bunce(1961 )及びCooney & Emerson（1964）により単離され、そして記載されるヒュミコラ・ラヌギノサ と同じであることは疑う余地がない。 The International Code of Botanical Nomenclatureによれば、正しい名称は 、最初の正当な名称である。従って、サーモマイセス・ラヌギノサスは正しい名 称であるべきである。しかしながら、この種についてのTsiklinskyの不完全な説 明のために、この合法性は多くの菌学者により問題化されて来た。従って、分類 学的な混乱についての主な理由は、Tsiklinskyの説明が根拠の確実な出版のため の必要条件を満たすかどうかについての異なった観点に関係する。 しかしながら、名称ヒュミコラ・ラヌギノサは、たぶん、そのヒュミコラ・ラ ヌギノサの名称の使用を推薦する、Cooney & Emerson（1964）“The Thermophil ic Fungi”の本の人気のために、まだ文献に見られる。 サーモマイセス・ラヌギノサスからの18Ｓリボソーム遺伝子の一部をコードす るDNAの配列決定を行なった。18Ｓ配列がGen Bankのデータベースにおける他の1 8Ｓ配列と比較され、そして極度の倹約を用いての系統発生分析（PAUP，Version 3.1.1，Smithsonian Institution，1993）もまた行なわれた。これは、サーモ マイセス・ラヌギノサスをプレクトマイセテス(Plectomycetes)の種類、たぶん ユーロチアレス（Eurotiales）図に明確に割り当てる。NCBI(National Center f or Biotechnology Information)でのEntrez Browserによれば、これはサーモマ イセス・ラヌギノサスを、エレマスカセアエ（Eremascaceae）、モノアスカセア エ（Monoascaceae）、シュードエウロチアセアエ(Pseudoeurotiaceae)及びトリ ココマセアエ（Trichocomaceae）のような科に関連づけており、ここで後者は、 エメリセラ（Emericella）、アスペルギラス(Aspergillus)、ペニシリアム(Peni cillium)、ユーペニシリアム(Eupenicillium)、パ エシロマイセス（Paecilomyces）、タラロマイセス(Talaromyces)、サーモアス カス(Thermoascus)及びスクレロクレイスタ(Sclerocleista)のような属を包含す る。 本発明に関しては、名称ヒュミコラ・ラヌギノサが使用されるであろう。 シュードモナスsp.リパーゼに関しては、次の生物からのリパーゼが同じ科の リパーゼと高い程度の相同性を有し、そして従って、それらの科に属するように 企画される：Ps．ATCC 21808、Ps．アエルギノサEF２、Ps．アエルギノサPAC1R 、Ps．アエルギノサPAO1、Ps．アエルギノサTE3285、Ps．sp．109、Ps．シュー ドアルカリゲネスＭ１、Ps．グルマエ（Ps．glumae）、Ps．セパシアDSM3959、P s．セパシアＭ−12−33、Ps．sp．KWI-56、Ps．プチダIFO3458、Ps．プチダIFO1 2049（Gilbert，E．J.，(1993)，Pseudomonas lipases:Biochemical properties and molecular cloning．Enzyme Microb．Technol.，15，634-645）。 本発明に従って修飾され得る容易に入手できる市販のリパーゼの から入手できる）である。 本発明に従って特別に企画される他の脂肪分解酵素の例は、Luma ス リパーゼ）；Unileverからのフサリウム・ソラニ リパーゼ（クチナーゼ） ；Solvay酵素からのバシラスsp.リパーゼ；及びLip 配列決定されており、そして配列番号93に示されるアミノ酸配列を有することが 見出されている、WO95/06720に記載されるシュードモナスsp.リパーゼである。 本発明の修飾された酵素か構成される親脂肪分解酵素は、上記脂肪分解酵素、 及びそのいづれかの変異体、修飾体及び末端切除体を包含することが強調される べきである。 特別に企画されるそのような親酵素の例は、WO92/05249，WO94/01541，WO94/1 4951，WO94/25577，WO95/22615に記載されるような酵素及びヨーロッパ特許第40 7,225号に記載されるようなタンパク質工学的に処理されたリパーゼ変異体；ア メリカ特許第5,352,594号に記載されるようなタンパク質工学的に処理されたPs ．メンドシナ(Ps．mendocina)リパーゼ；WO94/14964に記載されるようなクチナ ーゼ（cutinase）変異体；ヨーロッパ特許第167,309号に記載されるようなアス ペルギラス脂肪分解酵素の変異体；及びWO95/06720に記載されるシュードモナス sp.リパーゼを包含する。 最とも好ましい態様においては、親酵素は、ヒュミコラsp.又はシュードモナ スsp.の株、又はシュードモナス科に属すると思われる属に由来する。 本発明の特定の態様においては、脂肪分解活性を有する親酵素（本発明の修飾 された酵素にプロセッシングされる）をコードするDNA配列は、ヨーロッパ特許 第305216号に記載される糸状菌ヒュミコラ・ラヌギノサに由来する、脂肪分解活 性を有する酵素をコードするDNA配列である。この場合、親酵素のアミノ酸配列 は、分泌された成熟酵素の配列である。 本発明の修飾された酵素の洗浄性能及び／又は熱安定性は、酵素がグリコシル 化される場合、さらに改良されことが現在予期されている。従って、本発明の態 様において、修飾された酵素がグリコシル化され得る。そのアミノ酸配列は、い づれかの程度のグリコシル化を有することができる。 本発明のDNA配列 もう１つの観点において、本発明は、本発明の脂肪分解活性を有する前記修飾 された酵素をコードするDNA配列に関する。 本発明の修飾された酵素をコードするDNA配列は通常、当業界において知られ ているいづれか適切な方法による（たとえば、上記に言及されたようなPCRの使 用による）、問題の親脂肪分解酵素をコードするDNA配列の修飾により調製され るが、しかしまた、確立された標準の方法、たとえばBeaucage and Caruthers， (1981)，Tetrahedron Letters 22，1859-1869により記載されるホスホアミジッ ト法、又はMatthesなど.，(1984)，EMBO Joarnal 3，801-805により記載される 方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット法によれば、オリゴヌクレ オチドが、たとえば自動DNA合成機において合成され、精製され、アニールされ 、連結され、そして適切なベクターにクローン化される。 選択された親脂肪分解酵素をコードするDNA配列は、従来の技法の使用により 得られる。たとえば、そのDNA配列は相当する生物から調製されたゲノム又はDNA ライブラリーから単離され得、又はたとえばWO93/11249に記載されるようにして 発現クローニングにより得られ、又は合成的に生成され得る。 現在好ましい態様においては、本発明の修飾された脂肪分解酵素をコードする DNA配列は、ヨーロッパ特許第305216号に記載される、ヒュミコラ・ラヌギノサ に由来する脂肪分解酵素をコードするDNA配列から調製される。もう１つの好ま しい態様においては、DNA配列は、シュードモナスsp.の株、特にPs．アルカリゲ ネス又はPs．シュードアルカリゲネスの株に由来する。 本発明の修飾された脂肪分解酵素をコードする、単離された核酸配列は、酵素 の発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の 前、修飾された脂肪分解酵素をコードす る核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望され、又は必要とされる。 クローニング法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業界において良く知られて いる。 用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか又 は好都合であるすべての成分を包含するよう、本明細書においては、定義される 。個々の制御配列は、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列に対して生 来のものであるか又は外来性のものであり得る。そのような制御配列は、リーダ ー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び 転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、 制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配 列は、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列のコード領域を有する制御 配列の連結を促進する特定の制限部位を導入するためのリンカーを供給され得る 。 制御配列は、適切なプロモーター配列であり得、この核酸配列はその核酸配列 の発現のために宿主細胞により認識される。プロモーター配列は、修飾された脂 肪分解酵素の発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。プロモーターは、選 択の宿主細胞において転写活性を示すいづれかの核酸配列であり得、そして宿主 細胞に対して相同であるか又は非相同である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコ ードする遺伝子から得られる。特に、細菌宿主細胞において本発明の核酸構造体 の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、Ｅ．コリlacオペロン、 ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝 子（dagA）、Ｂ．サズチリス レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）又はアルカリプ ロテアーゼ遺伝子、Ｂ．リケニホルミス α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、Ｂ． ステアロサーモフィラス マルトジェニック アミラーゼ遺伝子（ amyM）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B．amyloliquefaciens）α−アミラー ゼ遺伝子（amyQ）、Ｂ．リケニホルミス（B．licheniformis）ペニシリナーゼ遺 伝子（penP）、Ｂ．サブチリスxy1A及びxy1B遺伝子、Ｂ．ピュミラス（P．pumil us）キシロシダーゼ遺伝子、及び原核性β−ラクタマーゼ又はトリプトファン遺 伝子(Villa-Kamaroffなど.，1978，Proceedings of the National Academy of S ciences USA 75：3727-3731)、並びにtac遺伝子(DeBoerなど.，1983，Proceedin gs of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)から得られるプロモ ーターである。さらなるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American，1980，242：74-94；及びSambrookなど.， 1989、前記に記載される。糸状菌宿主細胞における本発明の核酸構造体の転写を 指図するための適切なプロモーターの例は、Ａ．オリザエTAKAアミラーゼ、Ａ． オリザエ トリオース ホスフェート イソメラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロティナーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸 安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー又はＡ．アワモリ（A．awamori）グルコアミ ラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ リパーゼ、Ａ．オリザエ アルカリ プロテアーゼ、Ａ．オリザエ トリオース フォスフェート イソメラーゼ、Ａ ．ニドランス(A．nidulans)アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム トリプシン様プロテアーゼ（アメリカ特許第4,288,627号に記載されるような； これは引用により本明細書に組込まれる）、又はADH−３プロモーター(McKnight など.，(1985)，The EMBO J．4，2093-3099)、及びそれらのハイブリッドをコー ドする遺伝子から得られたプロモーターである。糸状菌宿主細胞に使用するため の特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ及びglaAプロモーターである。 酵母宿主においては、酵 母解糖遺伝子（Hitzemanなど.，(1980)，J．Biol．Chem．255，12073-12080；Al ber and Kawasaki，(1982)，J．Mol．Appl．Gen．1,419-434）、又はアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngなど.，Genetic Engineering of Microorgani sms for Chemicals(Hollaenderなど.，eds.)，Plenum Press，New York，1982） からのプロモーター、又はTPI1（アメリカ特許第4,599,311号）又はADH2−４ｃ （Russellなど.，(1983)，Nature 304，652-654）プロモーターが好ましい。有 用なプロモーターは、Ｓ．セレビシアエ エノラーゼ(ENO−１)遺伝子、Ｓ．セ レビシアエ ガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、Ｓ．セレビシアエ アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (ADH2／GAP)及びＳ．セレビシアエ ３−ホスホグリセレート キナーゼ遺伝子 から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanosなど. ，1992，Yeast ８：423-488により記載される。 制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を停止するた めに宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、修飾 された脂肪分解酵素をコードする核酸配列の３’末端に操作可能的に連結される 。ターミネーター配列は、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列に対し て生来のものであり、又は外来性源から得られる。選択の宿主細胞において機能 的であるいづれかのターミネーターが本発明において使用され得る。糸状菌宿主 細胞のための好ましいターミネーターは、Ａ．オリザエTAKAアミラーゼ、Ａ．ニ ガー グルコアミラーゼ、Ａ．ニジランス アントラニレート シンターゼ、Ａ ．ニガー α−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスホラム トリプシン 様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための好まし いターミネーターは、Ｓ．セレビシアエ エノラーゼ、Ｓ．セレ ビシアエ チトクロームC(CYC1)、又はＳ．セレビシアエ グリセルアルデヒド −３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞 のための他の有用なターミネーターは、Romanosなど.，1992、前記により記載さ れる。 制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために 重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。そのリーダー配列は、修飾された脂 肪分解酵素をコードする核酸配列の５’末端に操作可能的に連結される。リーダ ー配列は、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列に対して生来のもので あり得、又は外来性源から得られる。選択の宿主細胞において機能的であるいづ れかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための 好ましいリーダーは、Ａ．オリザエTAKAアミラーゼ及びＡ．オリザエ トリオー スリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための 適切なリーダーは、Ｓ．セレビシアエ エノラーゼ(ENO−１)遺伝子、Ｓ．セレ ビシアエ３−ホスホグリセレート キナーゼ遺伝子、Ｓ．セレビシアエ α−因 子、Ｓ．セレビシアエ アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド− ３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2／GAP）から得られる。 制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’端に操作可 能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基 を付加するためのシグナルとして宿主細胞により認識される配列である。ポリア デニル化配列は、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列に対して生来の ものであり得、又は外来性源から得られる。選択の宿主細胞において機能的であ るいづれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主 細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オ リザエTAKAアミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ、Ａ．ニジュランス アン トラニレート シンターゼ、及びＡ．ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺 伝子から得られる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo an d Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990により記載され る。ポリアデニル化配列は、哺乳類宿主細胞のためには当業界において良く知ら れている。 制御配列はまた、細胞の分泌路中に発現された、修飾された脂肪分解酵素を向 けることができる、修飾された脂肪分解酵素のアミノ末端に連結されるアミノ酸 配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもあり得る。そのシグナルペプ チドコード領域は、本発明の修飾された脂肪分解酵素に対して生来のものであり 、又は外来性源から得られる。核酸配列のコード配列の５’端は本来、分泌され 、修飾された脂肪分解酵素をコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り 枠を整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことが できる。他方、前記コード配列の５’端は、分泌され、修飾された脂肪分解酵素 をコードするコード配列のその部分に対して外来性であるシグナルペプチドコー ド領域を含むことができる。シグナルペプチドコード領域を通常、含まない外来 性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方、前記外来性シグナルペプ チドコード領域は、そのコード配列に通常、関連する天然のシグナルペプチドコ ード領域に関して酵素の増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチド コード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、ア スペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコル種か らのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝子、サッカロミセス セレビシアエからの α−因子のための遺伝子、バシラス種からのアミラー ゼ又はプロテアーゼ遺伝子、又はウシ プレプロキモシン遺伝子から得られる。 細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バシラスNCIB 1 1837からのマルトジエン性アミラーゼ遺伝子、Ｂ．ステアロサーモフィラス α −アミラーゼ遺伝子、Ｂ．リケニホルミス スブチリシン遺伝子、Ｂ．リケニホ ルミス β−ラクタマーゼ遺伝子、Ｂ．ステアロサーモフィラス中性プロテアー ゼ遺伝子（nprT，nprS，nprM）、及びＢ．サブチリスPrsA遺伝子から得られるシ グナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva，1993，Microbiology Reviews 57：109-137により記載されている。糸状 菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、Ａ．オリザエTAKA アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸 プロティナーゼ遺伝子、Ｈ．ラヌギノサ セルラーゼ遺伝子、 又はリゾムコル・ミエヘイ リパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコー ド領域である。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓ．セレビシ アエ α−因子及びＳ．セレビシアエ インバーターゼのための遺伝子から得ら れる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanosなど.，1992、前記に より記載される。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌路中に発現された酵素を 方向づけることができるいづれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使 用され得る。 本発明の核酸構造体はまた、修飾された脂肪分解酵素の発現において好都合で ある１又は複数の因子、たとえば活性化因子（たとえばトランス−作用因子）、 シャペローン及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配 列を含んで成る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、修飾された脂 肪分解酵素をコードする核酸配列と組をなす必要はない。活性化因子は、修飾さ れた脂肪分解酵素をコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である(K udlaなど.，1990，EMBO Journal ９：1355-1364；Jarai and Buxton，1994，Cur rent Genetics 26：2238-244；Verdier，1990，Yeast ６：271-297)。活性化因 子をコードする核酸配列は、Ｂ．ステアロサーモフィラスNprA(nprA)、Ｓ．セレ ビシアエ ヘム活性化因子タンパク質１（hap1）、Ｓ．セレビシアエ ガラクト ース代謝タンパク質４（gal4）、及びＡ．ニジュランス アンモニア調節タンパ ク質（areA）をコードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Verdie r，1990、前記及びMackenzieなど.，1993，Journal of General Microbiology 1 39：2295-2307を参照のこと。シャペローンは、もう１つのポリペプチドの折り たたみを適切に助けるタンパク質である（Hartlなど.，1994，TIBS 19：20-25； Bergeronなど.，1994，TIBS 19：124-128；Demolderなど.，1994，Journal of B iotechnology 32：179-189；Craig，1993，Science 260：1902-1903；Gething a nd Sambrook，1992，Nature 355：33-45；Puig and Gilbert，1994，Journal of Biological Chemistry 269：7764-7771；Wang and Tsou，1993，The FASEB Jou rnal ７：1515-11157；Robinsonなど.，1994 Bio/Technology １：381-384）。 シャペローンをコードする核酸配列は、Ｂ．サブチリスGroEタンパク質、Ａ．オ リザエ タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、Ｓ．セレビシアエ カルネキシ ン、Ｓ．セレビシアエBip/GRP78及びＳ．セレビシアエHsp70をコードする遺伝子 から得られる。さらなる例のためには、Gething and Sambrook，1992、前記及び Hartlなど.，1994、前記を参照のこと。選択の宿主細胞において機能するいづれ かの因子が、本発明において使用され得る。 宿主細胞の増殖に関して修飾された脂肪分解酵素の発現の調節を 可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調 節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応じて遺伝子の発現のター ン−オン又はターン−オフを引き起こすものである。原核システムにおける調節 システムは、lac，tac及びtrpオペレーターシステムを包含する。酵母において は、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。糸状菌においては、TAKAα −アミラーゼプロモーター、Ａ．ニガー グルコアミラーゼ プロモーター及び Ａ．オリザエ グルコアミラーゼ プロモーターが、調節刺激として使用され得 る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核システムに おいては、それらは、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダ クターゼ遺伝子、及び重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含す る。それらの場合、修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列は、調節配列 と組をなして配置されるであろう。 発現ベクター 本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグ ナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配 列は、一緒に連結され、１又は複数の便利な制限部位で修飾された脂肪分解酵素 をコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそのような部位を含む ことができる組換え発現ベクターが生成される。他方、本発明の核酸配列は、発 現のための適切なベクター中に、前記核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構 造体を挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コー ド配列は、そのコード配列が発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列により 操作可能的に連結されるようベクターに配置される。 組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、 そして核酸配列の発現をもたらすことができるいづれかのベクターであり得る。 ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞と前記 ベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉じられた環状 プラスミドであり得る。ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち染色 体外実在物（この複製は染色体複製とは無関係である）、たとえばプラスミド、 染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体として存在するベクターであり得る 。ベクターは、自己複製を確かにするためのいづれかの手段を含むことができる 。他方、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込まれ、そし てそれが組込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。ベクタ ーシステムは、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA、又はトランスポゾンを 一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミ ドであり得る。 本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にす る１又は複数の選択可能マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物剤又はウィル ス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性、及び同様のものを提供す る生成物の遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、Ｂ．サブチリス又はＢ ．リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン 、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマ ーカーである。ときおり使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクター ゼ遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2，HIS3，LEU2， LYS2，MET3，TRP1及びURA3である。糸状菌宿主細胞への使用のための選択可能マ ーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランス フェラーゼ）、bar(ホスフィノトリシン アセチルトランスフェラ ーゼ)、hygB（ヒグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ）、niaD（ニトレー ト レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、 sC（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、trpC（アントラニレート シ ンターゼ）及びグルホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの同等物を包含 する群から選択され得るが、但しこれらだけには、限定されない。アスペルギラ ス細胞への使用のためには、Ａ．ニジュランス又はＡ．オリザエのamdS及びpyrG マーカー、及びストレプトマイセス ヒグロスコピカス（Streptomyces hygrosc opicus）のbarマーカーが好ましい。さらに、選択は、たとえばWO91/17243に記 載されるように、選択マーカーが別のベクター上に存在する、同時形質転換によ り達成され得る。 本発明のベクターは、宿主細胞ゲノム中へのそのベクターの安定した組込み、 又は細胞のゲノムに無関係な細胞におけるベクターの自主的な複製を可能にする 要素を含む。 本発明のベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込 まれ得る。組込みのためには、ベクターは、修飾された脂肪分解酵素をコードす る核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した 組込みのためのベクターのいづれか他の要素に依存する。他方、ベクターは、宿 主細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを指図するために追加の核酸配列 を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿 主細胞ゲノム中へのベクターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの見 込みを高めるためには、組込み要素は好ましくは、相同組換えの確率を増強する ためにその対応する標的配列に対して高い相同性である、十分な数の核酸、たと えば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最とも 好ましくは、800〜1,500個の塩基対を含むべきである。その組込み要素は、宿主 細胞のゲノムにおける標的配列に対して相同であるいづれかの配列であり得る。 さらに、その組込み要素は、非コード、又はコードの核酸配列であり得る。他方 、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組込まれ得る。それら の核酸配列は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいづれかの配列 であり得、又はさらに、非コード又はコードの配列であり得る。 自主複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの 自主的複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の細菌起点の例は、プラ スミドpBR322，pUCI9，pACYC177，pACYC184，pUB110，pE194，pTA1060及びpAMβ １の複製の起点である。酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製 の２ミクロン起点、CEN6及びARS4の組合せ、及びCEN3及びARS1の組合せである。 複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有するもの であり得る（たとえば、Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433を参照のこと）。 本発明の修飾された脂肪分解酵素をコードする核酸配列の１つ以上のコピーが 、核酸配列の発現を増幅するために宿主細胞中に挿入され得る。核酸配列の安定 した増幅は、当業界において良く知られた方法を用いて、宿主細胞ゲノム中に前 記配列の少なくとも１つの追加のコピーを組込み、そして形質転換体について選 択することによって得られる。 本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用 される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど.，1989、 前記を参照のこと）。 宿主細胞 本発明はまた、修飾された脂肪分解酵素の組換え生成に都合良く使用される、 本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主細胞にも関する。細胞は好ましくは、 本発明の核酸配列を含んで成るベクターにより形質転換され、続いて宿主染色体 中へのそのベクターの組込みを包含する。“形質転換”とは、宿主細胞中への本 発明の核酸配列を含んで成るベクターの導入を意味し、その結果、前記ベクター は染色体組込み体として又は自己複製する染色体外ベクターとして維持される。 組込みは一般的に、核酸配列が細胞に安定して維持される場合、好都合であると 思われる。宿主染色体中へのベクターの組込みは、上記のような相同又は非相同 組換えにより生じることができる。 宿主細胞の選択は、修飾された脂肪分解酵素をコードする遺伝子及びその源に ひじょうに依存するであろう。さらに、宿主細胞の選択は、しばしば、宿主細胞 のタンパク質分解酵素系、及び本発明の修飾された脂肪分解酵素の生成に対する その影響に依存するであろう。従って、１又は複数のタンパク質分解酵素又は他 の酵素プロセッシング手段を欠失している宿主細胞を用いることが所望される。 プロテアーゼ欠失の細菌及び菌類（糸状菌及び酵母）宿主細胞は、当業界におい て良く知られている。 宿主細胞は単細胞微生物、又は非単細胞微生物であり得る。有用な単細胞は、 細菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細胞、たとえばＢ．サブ チリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサー モフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．コア グランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．メガテリウム、及びＢ．ト リンギエンシス、又はストレプトマイセス細胞、たとえばＳ．リビダンス又はＳ ．ムリナス、又はグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ 及びシュードモナスsp.（特に、細菌性脂肪分解酵素、たとえばシュードモナスs p.酵素が生成される予定である場合）であるが、但しそれらだけには限定されな い。細菌宿主の形質転換は、たとえばプロトプラスト形質転換(たとえば、Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)により、コンピ テント細胞の使用（たとえば、Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteri ology 81：823-829、又はDubnar and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Mol ecular Biology 56：209-221）により、エレクトロポレーション（たとえば、Sh igekawa and Dower，1988，Biotechniques ６：742-751）により、又は接合(た とえば、Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278 )によりもたらされ得る。 宿主細胞は、真核生物であり、そして好ましくは菌類、すなわち特に真核起源 の修飾された脂肪分解酵素の生成のためには、酵母細胞又は糸状菌細胞であり得 る。 “酵母”とは、本明細書において使用される場合、子ノウ胞子性酵母（エンド マイセタール(Endomycetales)）、担子胞子性酵母、及び不完全菌類（ブラスト マイセテス(Blastomycetes)）に属する酵母を包含する。子ノウ胞子性酵母は、 ２種のスペルモプソラセアエ(Spermophthoraceae)及びサッカロミセタセアエ（S accharomycetaceae）科に分割される。後者は、４種の亜科、すなわちシゾサッ カロミコイデアエ（Schizosaccharomycoideae）（たとえば、シゾサッカロミセ ス(Schizosaccharomyces)属)、ナドソニオイデアエ(Nadsonioideae)、リポマイ コイデアエ(Lipomycoideae)及びサッカロマイコイデアエ（Saccharomycoideae） (たとえばピチア（Pichia）、クルイベロミセス(Kluyveromyces)及びサッカロミ セス(Saccharomyces)属)から成る。担子胞子性酵母は、ロイコスポリジム(L eucosporidim)、ロードスポリジアム（Rhodosporidium）、スポリジオボラス(Sp oridiobolus)、フィロバシジアム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ（Filo basidiella）属を包含する。不完全菌類に属する酵母は、２種の科、すなわちス ポロボロマイセタセアエ（Sporobolomycetaceae）(たとえばソロボロマイセス(S orobolomyces)及びブレラ(Bullera)属)及びクリプトコカセアエ(Cryptococcacea e)（たとえばカンジダ(Candida)属）に分割される。酵母の分類は未来において は変化するので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeas t（Skinner，F．A.，Passmore，S．M.，and Davenport，R．R.，eds，Soc．App ．Bacteriol．Symposium Series No.9，1989）に記載されるように定義されるで あろう。酵母の生物学及び酵母遺伝学の操作は当業界において良く知られている （たとえば、Biochemistry and Genetics of Yeast，Bacil，M.，Horecker，B． J.，and Stopani，A．O．M.，editors，2nd edition，1987；The Yeasts，Rose ，A．H.，and Harrison，J．S.，editors，2nd editoon，1987;及びThe Moleaul ar Biology of the Yeast Saccharomyces，Strathernなど.，editors，1981を参 照のこと）。本発明に関して、もう１つのタンパク質分解酵素プロセッシング系 、たとえば細菌及び糸状菌を典型的には有する酵母細胞の使用は、問題の親脂肪 分解酵素の天然のプロ配列の一部又はすべてを、ペプチド付加物として含んで成 る修飾された脂肪分解酵素を調製するために特に好都合である。菌類宿主細胞が 酵母細胞（たとえば、親酵素のプロ配列の一部又は完全な形でペプチド付加物を 適用することに使用されるべき）である場合、その酵母細胞は、カンジダ、クル イベロミセス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ピチア、又はヤロウィア （Yarrowia）の種の細胞、たとえばＳ．セレビシアエ細胞、Ｓ．スカルスベルゲ ンシス（S．scarlsbergensis） 細胞、Ｓ．ジアスタチカス（S．diastaticus）細胞、Ｓ．ドウグラシ（S．dougl asii）細胞、Ｓ．クルイビリ(S．Kluyveri)細胞）、Ｓ．ノルベンシス（S．norb ensis）細胞、又はＳ．オビホルミス（S．oviformis）細胞であり得る。 本明細書において使用されるような“菌類”(Fungi)とは、アスコマイコタ（A scomycota）、バシジオマイコタ(Basidiomycota)、キトリジオマイコタ(Chytrid iomycota)、及びズイゴマイコタ（Zygomycota）(Hawksworthなど.，In，Ainswor th and Bisby's Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB Internati onal，University Press，Cambridge，UKにより定義されるような)、並びにオー マイコタ（Oomycota）（Hawksworthなど.，1995、前記、171pに引用されるよう な）、及びすべての栄養胞子菌類（Hawksworthなど.，1995、前記）を包含する 。アスコマイコタの代表的なグループは、たとえばニューロスポラ（Neurospora ）、ユーペニシリアム(Eupenicillium)（＝ ペニシリアム）、エメリセラ（Eme ricella）（＝ アスペルギラス）、ユーロチアム（Eurotium）（＝ アスペル ギラス）、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシジオマイコタの例は 、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂菌を包含する。キトリジオマイコタの代表的 なグループは、たとえばアロマイセス(Allomyces)、ブラストクラジエラ(Blasto cladiella)、コエロモマイセス（Coelomomyces）及び水性菌を包含する。オーマ イコタの代表的なグループは、たとえばサブロレグニオマイセトアス(Saprolegn iomycetous)水性菌（水カビ）、たとえばアキリヤ（Achlya）を包含する。栄養 胞子菌の例は、アスペルギラス、ペニシリアム、カンジダ及びアルテルナリアを 包含する。ズイゴマイコタの代表的なグループは、たとえばリゾパス及びムコル を包含する。 “糸状菌”(Filamentous fungi)は、ユーマイコタ（Eumycota） 及びオーマイコタのすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど.，1995、前記 により定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサ ン、マンナン及び他の複雑な多糖類から構成される活性菌糸体により特徴づけら れる。栄養増殖(vegetutive growth)は、菌糸の伸長によってであり、そして炭 素異化は通性好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビ シアエによる栄養増殖は、単細胞性葉状体（unicellular thallus）の出芽によ ってであり、そして炭素異化は発酵的であり得る。 好ましい態様において、菌類宿主細胞は、糸状菌細胞である。より好ましい態 様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニアム、アスペルギラス、フサリウ ム、ヒュミコラ、マイセリオプソラ、ムコル、ニューロスポラ、ペニシリアム、 チエラビア、トリポクラジアム及びトリコダーマの種の細胞であるが、但し、こ れらだけには限定されない。さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細 胞はアスペルギラス細胞である。さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿 主細胞はフサリウム細胞である。最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細 胞は、Ａ．オリザエ細胞、Ａ．ニガー細胞、Ａ．フォエチダス(A．foetidus)細 胞又はＡ．ジャポニカス（A．japonicus）細胞である。さらに最とも好ましい態 様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム オキシスポラム細胞又はＦ．グ ラミネアラム（F．graminearum）細胞である。 菌類細胞は、プロトプラスト形成、前記プロトプラストの形質転換、及び細胞 壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形 質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYeltonなど.，198 4，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474に記 載されている。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、Malardierなど.， 1989，Gene 78：147-156又はWO96/00787により記載されている。酵母は、Becker and Guarente，In Abelson，J．N．andSimon，M．I.，editors，Guide to Yeas t Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Itoなど.，1983，Journal of Bact eriology 153：163；及びHinnenなど.，1978，Proceedings of the National Ac ademy of Sciences USA 75：1920により記載される方法を用いて形質転換され得 る。哺乳類細胞は、Graham and Van der Eb（1978，Virology 52：546）のリン 酸カルシウム沈殿法を用いての直接的な取込みにより形質転換され得る。 本発明に従って使用される宿主細胞は好都合には、プロテアーゼ欠失又はプロ テアーゼ陰性株（又は同様のもの）、たとえばプロテアーゼを欠いている株、特 にペプチド付加物（ある場合、プロペプチドである）に隣接する部位で修飾され た脂肪分解酵素を切断することができるエキソプロテアーゼであり得る。特に適 切な宿主細胞は、トリペプチジル−アミノペプチダーゼ（TPAP）を欠いている（ たとえば、Novo Nordisk A/SからのWO96/14404を参照のこと）、ジペプチジル− アミノペプチダーゼ（DPAP）を欠いている宿主細胞、又はKex2プロテアーゼ又は Kex2−様プロテアーゼを欠いており、そして従って、二塩基部位、たとえばArg- Arg(RR)で切断することができない宿主細胞である。 宿主細胞の他の例は、ヨーロッパ特許第429490（Genencor Inc．からの）に記 載されるアスパラギン酸プロティナーゼ欠失宿主細胞、タンパク質分解酵素を欠 いている宿主細胞、たとえばWO93/00925(Amgen)，WO92/17595(Salk Inst Biotec h)、ヨーロッパ特許第341215号、ヨーロッパ特許第574347号及びPCT/DK96/00111 （Novo Nordisk A/S）に記載される宿主細胞を包含する。 下記例においては、欠失されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を有するアスペル ギラス オリザエ宿主細胞が使用された。 製造方法 本発明はまた、（ａ）本発明の修飾された脂肪分解酵素の発現の助けとなる条 件下で前記酵素をコードするDNA配列により形質転換された宿主細胞を培養し、 そして（ｂ）前記修飾された脂肪分解酵素を回収することを含んで成る、本発明 の修飾された脂肪分解酵素を製造するための方法にも関する。 宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて修飾された脂肪分解酵 素の生成のために適切な栄養培地において培養され得る。たとえば、前記細胞は 、修飾された脂肪分解酵素の発現及び／又は単離を可能にする条件下で及び適切 な培地において実施される実験室用又は産業用発酵器における振盪フラスコ培養 、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固体状態発酵を包含 する）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて 、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行なわれる （たとえば、細菌及び酵母についての文献；Bennett，J．W．and La Sure，L.， editors，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991を参 照のこと）。適切な培地は商業的な供給者から入手でき、又は公開された組成に 従って調製され得る（たとえば、American Type Culture Collectionのカタログ における）。修飾された脂肪分解酵素が栄養培地中に分泌される場合、その修飾 された脂肪分解酵素は培地から直接的に回収され得る。修飾された脂肪分解酵素 が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。 得られる修飾された脂肪分解酵素は当業界により知られている方法により回収 され得る。たとえば、修飾された脂肪分解酵素は、従 来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、こ れらだけには限定されない）により栄養培地から回収され得る。次に、回収され た、修飾された脂肪分解酵素は、種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオ ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロ マトグラフィー又は同様のものにより、さらに精製され得る。 本発明の修飾された脂肪分解酵素は、当業界において知られている種々の方法 、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水 性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動法（たとえば分離用等 電点電気泳動(IEF)、示差溶解性（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽 出（但し、これらだけには限定されない）により精製される（たとえば、Protei n Purification，J.-C．Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，Ne w York，1989を参照のこと）。 本発明の好ましい態様において、ペプチド付加物は、親脂肪分解酵素のプレ、 プロ又はプレプロ−形をコードする、任意にはベクター上に存在するDNA配列を 含んで成る宿主細胞を培養し、そして得られる修飾された脂肪分解酵素を回収す ることによって、親酵素に適用される。宿主細胞、培養条件、及び／又は回収条 件が選択され、その結果、親酵素のプレ、プロ又はプレプロー形の部分的プロセ ッシングが生ぜしめられ、その結果、生成された、修飾された酵素分子の少なく とも５％、たとえば少なくとも10％、たとえば少なくとも15％、たとえば少なく とも20％、たとえば少なくとも25％、たとえば少なくとも50％又は少なくとも75 ％が、所望の、たとえば完全なプレ配列又はその実質的な部分を含んで成る。 本発明の酵素組成物 さらなる観点において、本発明は、本発明の脂肪分解活性を有す る酵素を含んで成る酵素組成物に関する。 本明細書で定義される場合、“実質的に純粋な”酵素は、SDS−PAGEにより決 定される場合、他の相同汚染物（修飾された脂肪分解酵素と同じ源に起因する） を実質的に有さない、たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも 約40％の純度、より好ましくは約60％の純度、さらにより好ましくは約80％の純 度、最とも好ましくは約90％の純度、及びさらに最とも好ましくは約95％の純度 を有する酵素である。 ある場合、宿主細胞は、同じ切断部位でその宿主により発現される修飾された 脂肪分解酵素分子のすべてを処理するとは限らず、十分な長さのペプチド付加物 を有する部分、及びペプチド付加物の一部のみを有する１又は複数の他の部分か ら成る修飾された酵素生成物をもたらす。発明者は、これが洗浄性能に有意に影 響を及ぼさないことを見出した。従って、本発明の酵素組成物中の脂肪分解酵素 のすべてが十分な長さのペプチド付加物を保持するとは限らない場合でさえ、そ の酵素組成物は所望する効果、たとえば改良された洗浄性能を発揮することがで きる。実際、与えられた目的のために使用されるべき本発明の修飾された脂肪分 解酵素の合計量の少なくとも約５％が上記のように損なわれていないペプチド付 加物を有する限り、これが所望する効果を付与するために十分であることが見出 された。次に、修飾された脂肪分解酵素分子の残る部分は、意図されるものより も短いペプチド付加物（たとえば、１又は複数のアミノ酸が宿主生物による酵素 のプロセッシングの間、切断されている結果として）を有することができるか、 又はペプチド付加物をまったく有することができない。従って、本発明の酵素組 成物は、その十分な長さの付加物を有する修飾された脂肪分解酵素の少なくとも 約５％、好ましくは少なくとも約10％、たとえば少なくとも約25％ 、良好には少なくとも約50％、特に少なくとも約75％を含むことを単に必要とす る。 前記酵素組成物はさらに、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ク チナーゼ、アミラーゼ及び／又はリパーゼの群から選択された酵素、及び洗浄の ために意図される場合、洗剤組成物に通常使用される成分を含んで成ることがで きる。 本発明の修飾された脂肪分解酵素は、洗剤組成物、たとえば次のセクションに おいて詳細に記載されるであろう洗浄粉末又は皿洗い組成物における成分として 特に興味あるものであることが見出された。さらに、それらの改良された性質に より、本発明の修飾された脂肪分解酵素は、たとえばベーキング産業において、 有機合成（たとえばエステル化、エステル交換又はエステル加水分解反応）にお ける触媒として、及び皮、毛及び関連する産業において（たとえば、動物の皮、 羊の皮又は毛の脱脂のための）、並びに脱脂／脱脂肪を包含する他の用途のため に有用である。 洗剤の開示界面活性剤系 本発明の洗剤組成物は、非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン 性及び／又は両性及び／又は両性イオン性及び／又は半極性界面活性剤から選択 され得る界面活性剤系を含んで成る。 界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。 界面活性剤は、好ましくは、組成物に存在する酵素成分と適合できるように配 合される。液体又はゲル組成物において、界面活性剤は最とも好ましくは、それ がそれらの組成物におけるいづれかの酵素の安定性を促進し、又は少なくとも分 解しないように配合される。 本発明に従って使用されるべき好ましい界面活性剤系は、本明細 書に記載される１又は複数の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を界面 活性剤として含んで成る。 非イオン性洗剤界面活性剤は通常、たとえばアルキル基が約６〜約12個の炭素 原子を含むアルキルフェノール、個々のアルキル基が６〜12個の炭素原子を含む ジアルキルフェノール、好ましくは８〜20個の炭素原子を有する第一、第二又は 第三脂肪族アルコール（又はそのアルキル−キャップド誘導体）、アルキル基に 10〜約24個の炭素原子を有するモノカルボン酸、及びポリプロキシレンに由来す る有機疎水性グループと化学的組合しての水可溶性ポリアルコキシレン又はモノ −又はジアルカノールアミドグループから成る。脂肪酸基のアルキル基が10〜約 20個の炭素原子を含み、そしてアルキロイル基が１〜３個の炭素原子を有する脂 肪酸モノ−及びジアルカノールアミドもまた通常である。任意には、モノ−及び ジアルカノールアミド誘導体のいづれかにおいて、後者のグループ及び分子の疎 水性部分を連結するポリオキシアルキレン成分が存在することができる。すべて のポリアルコキシレン含有界面活性剤においては、ポリアルコキシレン成分は好 ましくは、２〜20個のグループの酸化エチレン、又は酸化エチレン及び酸化プロ ピレングループから成る。 アルキルフェノールの酸化ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレン縮 合物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適 切であり、そして酸化ポリエチレン縮合物が好ましい。それらの化合物は、約６ 〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を含むアルキル基を直 鎖又は枝分れ鎖の形状で有するアルキルフェノールとアルキレンオキサイドとの 縮合生成物を包含する。好ましい態様においては、酸化エチレンは、アルキルフ ェノール１モル当たり、約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルの酸化 エチレンに等しい量で存在する。このタ イプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporationから市販されているIge pal^TM CO-630；及びRohm & Haas Companyから市販されている、Triton^TM Ｘ−4 5，Ｘ−114，Ｘ−100及びＸ−102を包含する。それらの界面活性剤は、通常、ア ルキルフェノールアルコキシレート（たとえば、アルキルフェノールエトキシレ ート）として言及される。 第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約25モルの酸化エチレンとの縮合生成 物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用の ために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分れ鎖、一次 又は二次のいづれかであり得、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含 む。約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むア ルキル基を有するアルコールと、アルコール１モル当たり約２〜約10モルの酸化 エチレンとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり約２〜約７モルの 酸化エチレン及び最とも好ましくは、２〜５モルの酸化エチレンが、前記縮合生 成物に存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、Tergitol^TM 15−Ｓ−９（Ｃ₁₁−Ｃ₁₅の線状アルコールと９モルの酸化エチレンとの縮合生 成物）、Tergitol^TM 24−Ｌ−６NMW（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄の一次アルコールと狭い分子 量分布を有する６モルの酸化エチレンとの縮合生成物）、両者ともUnion Carbid e Corporationにより市販されている；Neodol^TM 45−９（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅の線状ア ルコールと９モルの酸化エチレンとの縮合生成物）、Neodol^TM 23−３（Ｃ₁₂− Ｃ₁₃の線状アルコールと３モルの酸化エチレンとの縮合生成物）、Neodol^TM 45 −７（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅の線状アルコールと７モルの酸化エチレンとの縮合生成物）、 Neodol^TM 45−５（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅の線状アルコールと５モルの酸化エチレンとの縮 合生成物）、これらはShell Chemical C ompanyにより市販されている；Kyro^TM EOB（Ｃ₁₃−Ｃ₁₅のアルコールと９モルの 酸化エチレンとの縮合生成物）、The Procter & Gamble Companyにより市販され ている；及びGenapol LA 050（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄のアルコールと５モルの酸化エチレン との縮合生成物）、Hoechstにより市販されている；を包含する。それらの生成 物におけるHLBの好ましい範囲は、８〜11であり、そして最とも好ましくは、８ 〜10である。 本発明の洗剤組成物は、少なくとも25個の酸化アルキレン基、好ましくは少な くとも50個の酸化アルキレン基、及びより好ましくは少なくとも80個の酸化アル キレン基を含むアルコキシル化された脂肪族アルコールである非イオン性材料を 含んで成る。約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含 む疎水性基、及び多糖類、たとえば約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最と も好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリド単位を含むポリグリコシド親水性基を有 する、アメリカ特許第4,565,647号に開示されるアルキルポリサッカリドである 。５又は６個の炭素原子を含むいづれかの還元サッカリドが使用され得、たとえ ばグルコース、ガラクトース及びガラクトシル成分がグルコシル成分により置換 され得る（任意には、疎水性基が２−，３−，４−、等の位置で結合され、従っ て、グルコシド又はガラクトシドとは対照的にグルコース又はガラクトースを付 与する）。サッカリド間結合は、たとえば、追加のサッカリド単位の１つの位置 と前方のサッカリド単位上の２−，３−，４−及び／又は６−位置との間で存在 することができる。 もう１つの有用な非イオン性界面活性剤は、WO95/10524に記載されるように、 ６〜24個の炭素原子の直鎖又は枝分れ鎖の飽和又は不飽和脂肪族鎖を有し、任意 には芳香族、脂環式、混合された芳香族−脂肪族又はポリアルキルオキシアルキ ル基を含む、ウロン酸、ウ ロン酸塩、又はウロン酸ラクトン又はポリウロン酸のグリコシドである。 好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式： R²O(C_nH_2nO)_t（グリコシル）_x 〔式中、Ｒ²はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ アルキルフェニル、及びそれらの混合物から選択され、ここで前記アルキル基は 約10〜約18個、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ま しくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてｘは約1.3〜約10 、好ましくは約1.3〜約３、最とも好ましくは約1.3〜約2.7である〕を有する。 グリコシルは好ましくは、グルコースから誘導される。それらの化合物を調製す るためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールがまず形成され、 そして次に、グルコース、又はグルコースの源と反応せしめられ、グルコシド（ １−位置での結合）が形成される。次に、追加のグリコシル単位は、それらの１ −位置と前方のグリコシル単位２−，３−，４−及び／又は６−位置、好ましく は優先的には２−位置との間に結合され得る。 酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基材 と酸化エチレンとの縮合生成物はまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系 としての使用のために適切である。それらの化合物の疎水性部分は好ましくは、 約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部 分へのポリオキシエチレン成分の付加は、分子の水溶解性を全体として高める傾 向があり、そして生成物の流体特徴は、ポリオキシエチレン含有率が縮合生成物 の合計重量の約50％である点まで（これは、約40モルまでの酸化エチレンとの縮 合に対応する）保持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されて いるPluronic^TM界面活性剤 を包含する。 酸化プロピレンとエチレンジアミンとの反応に起因する生成物と酸化エチレン との縮合生成物もまた、本発明の非イオン性界面活性剤系中の非イオン性界面活 性剤としての使用のために適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレ ンジアミン及び過剰の酸化プロピレンの反応生成物から成り、そして一般的には 、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、その縮合生成物が約40 〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,000の分子量 を有する程度まで酸化エチレンにより縮合される。このタイプの非イオン性界面 活性剤の例は、BASFにより市販されているTetronic^TM化合物を包含する。 アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一及び第二脂肪族アルコー ルと約１〜約25モルの酸化エチレンとの縮合生成物、アルキルポリサッカリド、 及びそれらの混合物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての 使用のために適切である。３〜15個のエトキシ基を有するＣ₈−Ｃ₁₄のアルキル フェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するＣ₈−Ｃ₁₈のア ルコールエトキシレート（好ましくは平均10個の炭素原子）、及びそれらの混合 物が最とも好ましい。ひじょうに好ましい非イオン性界面活性剤は、下記一般式 ： 〔式中、Ｒ¹はＨであり、又はＲ¹はＣ_1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチ ル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、Ｒ²はＣ_5-31ヒドロカ ルビルであり、Ｚは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個 のヒドロキシルを有する前記鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、又はそ のアルコキ シル化された誘導体である〕で表わされるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性 剤である。好ましくは、Ｒ¹はメチルであり、Ｒ²は直鎖のＣ_11-15アルキル又は Ｃ_16-18アルキル又はアルケニル鎖、たとえばココナッツアルキル、又はそれら の混合物であり、そしてＺは還元性アミノ化反応において還元糖、たとえばグル コース、フルクトース、マルトース、ラクトースから誘導される。 少なくとも６の平均アルコキシル化程度を有するアルコキシル化された非イオ ン性界面活性剤及びANR₁R₂（ここで、Ａはアルドビオン酸である糖成分であるが 、但し、それはアルドン酸上のカルボニル基から通常延長するOH基を含まない） の構造のアルドビオンアミドを含んで成る非イオン性界面活性剤系は本発明にお いて適切である。NR₁R₂は、アルドビオン酸上のヒドロキシル基が通常見出され る場所に結合される。R₁R₂は、同じであっても又は異なっていても良く、水素原 子、脂肪族炭化水素基、芳香族基、脂環式基、アミノ酸エステル、又はエーテル アミンである。Ｒ₁及びＲ₂は、WO95/2770に記載されるように両者とも水素原子 ではあり得ない。 他のいわゆる非イオン性洗剤化合物は、長鎖の第三アミンオキシド、長鎖の第 三オスフィンオキシド及びジアルキルスルホキシドを包含する。 非常に好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化されたスル フェート界面活性剤を包含し、式RO(A)_mSO₃M（ここでＲは置換されていないＣ₁₀ −Ｃ₂₄アルキル、又はＣ₁₀−Ｃ₂₄アルキル成分、好ましくはＣ₁₂−Ｃ₂₀アルキル 又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシル アルキルを有するヒドロキシアルキル基であり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単 位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的には約0.5〜約６、より好ましくは約0 .5〜約３であり、そしてＭはＨ又はカチオン、た とえば金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム 、マグネシウム、等）、アンモニウム又は置換されたアンモニウムカチオンであ る）で表わされる水可溶性塩又は酸である。アルキルエトキシル化されたスルフ ェート及びアルキルプロポキシル化されたスルフェートが本明細書において企画 される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル− 、トリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえば テトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキ ルアミンから誘導されたもの、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエ チルアミン、それらの混合物、及び同様のものを包含する。代表的な界面活性剤 は、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート(1.0)スルフエート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ （1.0）Ｍ）、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（ Ｃ₁₂−Ｃ₁₈（2.25）Ｍ）、及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート(3.0)ス ルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ(3.0)Ｍ）、並びにＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシ レート(4.0)スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ(4.0)Ｍ）（ここで、Ｍは便利には、ナ トリウム及びカリウムから選択される）である。使用される適切なアニオン性界 面活性剤は、アルキルエステルスルホネート界面活性剤、たとえば“The Journa l of the American Oil Chemists Society”，52（1975），pp．323-329に従っ て、気体SO₃によりスルホン化されるＣ₈−Ｃ₂₀カルボン酸（すなわち、脂肪酸） の線状エステルである。適切な開始材料は、牛脂、ヤシ油、等に由来する天然の 脂肪物質を包含する。 特に洗濯用途のための好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、 下記構造式： 〔式中、Ｒ³はＣ₈−Ｃ₂₀ヒトロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組 合せであり、Ｒ⁴はＣ₁−Ｃ₆ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれら の組合せであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成す るカチオンである〕で表わされるアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含 んで成る。適切な塩形成カチオンは、金属、たとえばナトリウム、カリウム、及 びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、たと えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包 含する。好ましくは、Ｒ³はＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであり、そしてＲ⁴はメチル、エ チル又はイソプロピルである。Ｒ³がＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであるメチルエステル スルホネートが特に好ましい。 他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO₃M（式中、Ｒは好ましくは、Ｃ₁₀ −Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はＣ₁₀−Ｃ₂₀アルキル成分を有す るヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアル キルであり、そしてＭはＨ又はカチオン、たとえばアルカリ金属カチオン（たと えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム又は置換されたア ンモニウム（たとえば、メチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウムカチ オン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及び ジメチルピペリジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン 、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物に由来する第四アン モニウムカチオン、及び同様のもの）である）で表わされる水溶性塩又は酸であ るアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、Ｃ₁₂−Ｃ₁₆のアル キル鎖が低い洗浄温度（たとえば約50℃以下）のために好ましく、そしてＣ₁₆− Ｃ₁₈のアルキル鎖が高い洗浄温度（たとえば約50℃以上）のために好ましい。 洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤 組成物に含まれ得る。それらは、石鹸の塩（たとえば、ナトリウム、カリウム、 アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、たとえばモノ−、ジ−、及びト リエタノールアミン塩）、Ｃ₈−Ｃ₂₂第一又は第二アルカンスルホネート、Ｃ₈− Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179に記載されるようにし てアルカリ土類金属シトレートの熱分解された生成物のスルホン化により調製さ れたスルホン化されたポリカルボン酸、Ｃ₈−Ｃ₂₄アルキルポリグリコールエー テルスルフェート（10モルまでの酸化エチレンを含む）；アルキルグリセロール スルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロー ルスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、 パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イセチオネート、たとえばア シルイセチオネート、アルコキシカルボン酸のイセチオネートエステル（WO95/1 4661に記載されるような）、Ｎ−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及 びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に飽和及び不飽 和Ｃ₁₂−Ｃ１₁₈モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に飽和 及び不飽和Ｃ₆−Ｃ₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、オレオイルサルコ シネート、アルキルポリサッカリドのスルフェート、たとえばアルキルポリグル コシドのスルフェート（その非イオン性非スルホネート化合物は下記に記載され る）、枝分れした第一アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボ キシレート、 たとえば式RO(CH₂CH₂O)_k−CH₂COO^-M⁺（式中、ＲはＣ₈−Ｃ₂₂アルキルであり、ｋ は１〜10の整数であり、そしてＭは可溶性塩形成カチオンである）で表わされる ものを包含することができる。樹脂酸及び水素化された樹脂酸、たとえばロジン 、水素化されたロジン、及びタル油に存在するか又はタル油から誘導された樹脂 酸及び水素化された樹脂酸もまた適切である。アルキルベンゼンスルホネート、 特に線状アルキルベンゼンスルホネート(LAS)（ここで、アルキル基は10〜18個 の炭素原子を含む）がひじょうに好ましい。 さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”(Vol．I and II by Schwartz，Perry and Berch)に記載されている。種々のそのような界面活性 剤はまた一般的にアメリカ特許第3,929,678号（第23欄第58行〜第29欄第23行） に開示される。 本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約 40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含 んで成る。 本発明の洗濯洗剤組成物はまた、カチオン性、両性、両性イオン、及び半極性 界面活性剤、及び本明細書にすでに記載された以外の非イオン性及び／又はアニ オン性界面活性剤を含むことができる。 本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗浄界面活性剤は 、１つの長鎖のヒドロカルビル基を有するものである。そのようなカチオン性界 面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、たとえばアルキルトリメチルアンモ ニウムハロゲニド、及び下記式： 〔R²(OR³)_y〕〔R⁴(OR³)_y〕₂R⁵N⁺X^- 〔式中、Ｒ²はアルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキル又はアル キルベンジル基であり、個々のＲ³は、−CH₂CH₂−，CH₂CH(CH₃)−，−CH₂CH(CH₂ OH)−，−CH₂CH₂CH₂−及びそれらの混 合物から成る群から選択され；個々のＲ⁴はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロ キシアルキル、２つのＲ⁴基を連結することにより形成されるベンジル環構造体 、 −CH₂CHOHCHO HCOR⁶CHOHCH₂OH（ここでＲ₆はいづれかのヘキソース又は1000以下 の分子量を有するヘキソースポリマーである）、及びｙが０でない場合、水素か ら成る群から選択され；Ｒ⁵はＲ⁴と同じであるか、又はアルキル鎖（ここで炭素 原子の合計数又はＲ²＋Ｒ⁵が約18個よりも多くない）であり；個々のｙは０〜約 10であり、そしてｙ値の合計は０〜約15であり；そしてＸはいづれかの適合性ア ニオンである〕で表わされるそれらの界面活性剤を包含する。 ひじょうに好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式： R₁R₂R₃R₄N⁺X^- （ｉ） 〔式中、Ｒ¹はＣ₈−Ｃ₁₆アルキルであり、Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄の個々は独立して、 Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロキシアルキル、ベンジル及び−(C₂H₄₀)_xH（ ここで、ｘは２〜５の値である）であり、そしてＸはアニオンである〕を有する 、本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。１つよ りも多くのＲ₂，Ｒ₃又はＲ₄はベンジルであるべきではない。 Ｒ₁のための好ましいアルキル鎖長はＣ₁₂−Ｃ₁₅であり、特にこの場合、アル キル基はヤシ又はヤシの仁の脂肪に由来する鎖長の混合物であり、又はオレフィ ン構成又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される。 Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄についての好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基で あり、アニオン性基のＸは、ハリド、メトスルフェート、アセテート及びホスフ ェートイオンから選択され得る。本発明において使用するための式（ｉ）の適切 な第四アンモニウム化合 物の例は、下記のものである： ヤシトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド； ヤシメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド； デシルトリエチルアンモニウムクロリド； デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド； Ｃ_12-15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド； ヤシジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド； ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート； ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はブロミド； ラウリルジメチル（エテノキシ）₄アンモニウムクロリド又はブロミド； コリンエステル（式（ｉ）の化合物、式中、Ｒ₁はCH₂−CH₂− ； ジアルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕。 本発明において有用な他のカチオン性界面活性剤はまた、アメリカ特許第4,22 8,044号及びヨーロッパ特許第000224号にも記載される。 本発明に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25 重量％、好ましくは約１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含ん で成る。 両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のため に適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又 は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体（ここで、脂肪族基は直鎖又は枝 分れ鎖である）として広く記載され得る。脂肪族置換基の１つは、少なくとも８ 個の炭素原子、典型的には約８〜約18個の炭素原子を含み、そしてその少なくと も１つは、アニオン性水溶性基、たとえばカルボキシ、スルホネート、スルフェ ートを含む。両性界面活性剤の例については、アメリカ特許第3,929,678号（第1 9欄第18〜35行）を参照のこと。 本発明に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15 重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る 。 両性イオン界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のために適切である。 それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二又は第三ア ミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第四スルホニウム 化合物の誘導体として広く記載され得る。両性イオン界面活性剤の例については 、アメリカ特許第3,929,678号（第19欄第38行〜第22欄第48行）を参照のこと。 本発明に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15 重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン界面活性剤を含ん で成る。 半極性非イオン性界面活性剤は、特定のカテゴリーの非イオン性界面活性剤で あり、次のものを包含する：約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及 びアルキル基及び約１〜約３個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル基から成る 群から選択された２種の成分を含む水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素 原子の１つのアルキル成分、及びアルキル基及び約１〜約３個の炭素原子を含む ヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２種の成分を含む 水溶性ホスフィンオキシド；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分 、及びアルキル基、及び約１〜約３個の炭素原子のヒドロキシアルキル基から成 る群から選択された成分を含む水溶性スルホキシド。 半極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式： 〔式中、Ｒ³は約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル 又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；Ｒ⁴は約２〜約３個の炭 素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基又はそれらの混合物であり ；ｘは０〜約３であり；そしてＲ⁵は約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又 はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個の酸化エチレン基を含むポリ酸化エ チレンである〕で表わされる酸化アミン界面活性剤を包含する。前記Ｒ⁵基はた とえば環構造体を形成するために、酸素又は窒素原子を通してお互い結合され得 る。 それらの酸化アミン界面活性剤は、Ｃ₁₀−Ｃ₁₈アルキルジメチルアミンオキシ ド及びＣ₈−Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを包含す る。 本発明に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約1 5重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半極性非イオン性界面活性 剤を含んで成る。ビルダー系 本発明の組成物は、さらにビルダー系を含むことができる。いづれかの従来の ビルダー系、たとえばアミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレー ト及び脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸のような材料、金属イオン封鎖剤、たと えばアミノポリホスホネー ト、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、及びジエチレントリアミ ンペンタメチレンホスホン酸は、本発明への使用のために適切である。ホスフェ ートビルダー、たとえばピロホスフェート、オルトホスフェート又はポリホスフ ェートがまた、本発明において使用され得る。 適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、無機の水和化されたアルミノ シリケート材料、より特定には、水和化された合成ゼオライト、たとえば水和化 されたゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，HS又はMAPである。他の適切な無機ビルダー材料 は、積層されたシリケート、たとえばSKS−6（Hoechst）である。SKS−６は、珪 酸ナトリウム（Na₂Si₂O₅）から成る結晶性の積層されたシリケートである。 １つのカルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、BE831，368，BE82 1,369及びBE821,370に開示されるような乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテ ル誘導体を包含する。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀 酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒 石酸、タルトロン酸及びフマル酸の水溶性塩、及びデンマーク特許第2,446,686 号、デンマーク特許第2,446,487号、アメリカ特許第3,935,257号に記載されるエ ーテルカルボキシレート、並びにBE840,623に記載されるスルフィニルカルボキ シレートを包含する。３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、特に 水溶性シトレート、アコニトレート及びシトラコネート、並びにそれらのスクシ ネート誘導体、たとえばイギリス特許第1,379,241号に記載されるカルボキシメ チルオキシスクシネート、ニュージーランド特許出願第7205873号に記載される ラクトキシスクシネート、及びオキシポリカルボキシレート材料、たとえばイギ リス特許第1,387,447号に記載される２−オキサ−１，１，３−プロパントリカ ルボキシレートを包含 する。 ４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,261,82 9号に開示されるオキシジスクシネート、１，１，２，２−エタンテトラカルボ キシレート及び１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレートを包含する。 スルホ置換基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,398,421号及び 第1,398,422号、及びアメリカ特許第3,936,448号に開示されるスルホスクシネー ト誘導体、及びイギリス特許第1,082,179号に記載されるスルホン化された熱分 解シトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートは、 イギリス特許第1,439,000号に開示される。 脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、シクロペンタン−シス、シス、 シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニド ペンタカルボキシレー ト、２，３，４，５−テトラヒドロ−フラン−シス、シス、シス−テトラカルボ キシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−シス、ジカルボキシレート、２， ２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４， ５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート、及び多価アルコール、たとえばソ ルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体を包含す る。 芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,425,343号に開示されるメ リット酸、ピロメリット酸及びフタル酸誘導体を包含する。上記のうち、好まし いポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキ シカルボキシレート、より好ましくはシトレートである。 本発明に使用するための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケート ビルダー、たとえばゼオライトＡ、積層されたシリケ ート(SKS−６)、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸 の混合物を包含する。 本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレート化剤は、エチレンジアミ ン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸（EDDS）、又はそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、 アンモニウム、又は置換アンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましい EDDS化合物は、遊離酸形、及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDS のそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na₂EDDS及びNa₄EDDSを包含する。ED DSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg₂EDDSを包含する 。前記マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最とも好ましいもの である。 好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオ ライトＡ、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合 物を包含する。 粒状組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成できる他のビルダー材料 は、無機材料、たとえばアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機 材料、たとえば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミ ノポリカルボキシレートを包含する。 他の適切な水溶性有機塩は、ホモ−又はコ−ポリマー酸又はそれらの塩であり 、ここでポリカルボン酸は、２つよりも多くない炭素原子によりお互い分離され る少なくとも２つのカルボキシル基を含んで成る。 このタイプのポリマーはイギリス特許出願第1,596,756号に開示されている。 そのような塩の例は、MW 2000〜5000のポリアクリレート、及び無水マレイン酸 とのそれらのコポリマー、たとえば20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有 するコポリマーである。 洗剤ビルダー塩は通常、組成物において５〜80重量％の量で含まれる。液体洗 剤のためのビルダーの好ましいレベルは、５〜30重量％である。酵 素 好ましい洗剤組成物は、本発明の酵素の他に、洗浄性能及び／又は布用保護利 点を提供する他の酵素を含んで成る。そのような酵素は、プロテアーゼ、リパー ゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（ たとえばラッカーゼ）を包含する。 プロテアーゼ：アルカリ性溶液における使用のために適切ないづれかのプロテ アーゼが使用され得る。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のも のを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された突然 変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカ リ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプ ロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバシラスに由来するもの、たとえばスブ チリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及 びスブチリシン168（WO89/06279に記載される）。トリプシン様プロテアーゼの 例は、トリプシン（たとえば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270に記 載されるフサリウムプロテアーゼである。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、 Alcalase，Savinase，Primase，Durazym及びEsperaseとしてNovo Nordisk A/S(D enmark)により市販されているもの、Maxatase，Maxacal，Maxapem及びProperase としてGist-Bracades/Genencorにより市販されているもの、及びOpticlean及びO ptimaseとしてSolvay Enzymesにより市販されているものを包含する。プロテア ーゼ酵素は、組成物の酵素タンパク質の0.0001〜２重量％のレベルで、特に 組成物の酵素タンパク質の0.001〜0.1重量％のレベルで本発明の組成物中に導入 され得る。 リパーゼ：アルカリ溶液における使用のために適切ないづれかのリパーゼが使 用され得る。適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のもの及び化学的に又は遺伝 子的に修飾されたリパーゼ突然変異体を包含する。 有用なリパーゼの例は、ヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載され るようなヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼ、及びWO92/05249，WO94/25577及び WO95/22615に記載されるようなそれらの変異体、ヨーロッパ特許第238023号に記 載されるようなリゾムコル・ミエヘイ リパーゼ、カンジダ リパーゼ、たとえ ばＣ．アンタルクチカ リパーゼ、たとえばヨーロッパ特許第214761号に記載さ れるＣ．アンタルクチカ リパーゼＡ又はＢ、シュードモナス リパーゼ、たと えばヨーロッパ特許第218272号に記載されるようなＰ．アルカリゲネス及びＰ． シュードアルカリゲネス リパーゼ、又は前記シュードモナス リパーゼのいづ れかの変異体、ヨーロッパ特許第331376号に記載されるようなＰ．セパシア リ パーゼ、BP第1,372,034号に開示されるようなＰ．スチュテゼリ リパーゼ、Ｐ ．フルオレスセンス リパーゼ、バシラス リパーゼ、たとえばＢ．スブチリス リパーゼ（Dartoisなど.，(1993)，Biochemica et Biophysica acta 1131，25 3-260）、Ｂ．ステアロサーモフィラス リパーゼ(日本特許64/744992)及びＢ． プミラス リパーゼ（WO91/16422）を包含する。さらに、多くのクローン化され たリパーゼ、たとえばYamaguchiなど.，(1991)，Gene 103，61-67に記載される ようなペニシリアム カメムベルチ リパーゼ、ゼオトリカム カンジダム リ パーゼ（Schimada，Y.など.，(1989)，J．Biochem.，106，383-388）、及び種々 のリゾパス リパーゼ、たとえばＲ． デルマル リパーゼ（Hass，M．J．など.，(1991)，Gene 109，117-113）、Ｒ． ニベウス リパーゼ（Kugimiyaなど.，(1992)，Biosci．Biotech．Biochem．56 ，716-719）及びＲ．オリザエ リパーゼはまた、有用である。 他のタイプの脂肪分解酵素、たとえばクチナーゼ、たとえばWO88/09367に記載 されるようなシュードモナス・メンドシナに由来するクチナーゼ、又はフサリウ ム ソラニ ピシに由来するクチナーゼ（たとえば、WO90/09446に記載される） もまた有用である。特に適切なリパーゼは、Ｍ１ Lipase^TM，Luma fast^TM及び Lipomax^TM（Gist-Brocades/Genencor），Lipolase^TM及びLipolase Ultra^TM（Nov o Nordisk A/S）、及びLipase P“Amano”（Amano Pharmaceutical Co．Ltd）の ようなリパーゼである。 リパーゼは通常は、洗剤組成物の酵素タンパク質の0.0001〜２重量％のレベル で、特に組成物の酵素タンパク質の0.001〜0.1重量％のレベルで洗剤組成物に導 入される。 アミラーゼ：アルカリ溶液における使用のために適切ないづれかのアミラーゼ （α及び／又はβ）が使用され得る。適切なアミラーゼは、細菌又は菌類起源の ものを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された突然変異体も包含される。 アミラーゼは、たとえばイギリス特許第1,296,839号に、より詳細に記載される 、Ｂ．リケニホルミスの特定株から得られるα−アミラーゼを包含する。市販の アミラーゼは、Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fungamyl^TM及びBAN^TM（Novo Nordisk A /Sから入手できる）、及びRapidase^TM及びMaxamylP^TM（Gist-Brocades/Genencor から入手できる）である。 アミラーゼは通常、洗剤組成物の酵素タンパク質の0.0001〜２重量％のレベル で、特に組成物の酵素タンパク質の0.001〜0.1重量％のレベルで洗剤組成物に導 入される。セルラーゼ：アルカリ溶液における使用のために適切ないづれかのアミラーゼ が使用され得る。適切なアミラーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化 学的に又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。適切なセルラーゼは 、ヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)から生成される菌類セルラー ゼを開示するアメリカ特許第4,435,307号に開示される。特に適切なセルラーゼ は、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、公 開されたヨーロッパ特許出願第0495257号に記載されるセルラーゼである。市販 のセルラーゼは、ヒュミコラ・インソレンスの株により生成されるCelluzyme^TM （Novo Nordisk A/S）及びKAC-500(B)^TM(Kao Corporation)である。 前記セルラーゼは通常、洗剤組成物の酵素タンパク質の0.0001〜２重量％のレ ベルで、特に組成物の酵素タンパク質の0.001〜0.1重量％のレベルで洗剤組成物 に導入される。 ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ は、過酸化水素又は酸素源、たとえばペルカーボネート、ペルボレート、ペルス ルフェート、等と一緒に使用される。それらは“溶液漂白”のために、すなわち 染色された布がWO94/12621及びWO95/01426に記載されるように、洗液において一 緒に、好ましくは増強剤と一緒に洗浄される場合、前記布から他の布への織物用 染料の移行を妨げるために使用される。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼ は、植物、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾さ れた突然変異体が包含される。 前記ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素は通常、洗剤組成物の酵素 タンパク質の0.0001〜２重量％のレベルで、特に組成物の酵素タンパク質の0.00 1〜0.1重量％のレベルで洗剤組成物に導入される。 上記酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセル ラーゼの混合物が本発明において包含される。任意の洗剤成分 漂白剤：本発明の洗剤組成物に含まれ得る追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、 たとえばPB1，PB4及び400〜800ミクロンの粒子サイズを有するペルカーボネート を包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の酸素漂白剤、及び選択される 漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤を含むことができる。存在する場 合、酸素漂白化合物は典型的には、約１〜約25％のレベルで存在するであろう。 本発明に使用するための漂白剤成分は、洗剤組成物のために有用な漂白剤、た とえば酸素漂白剤及び当業界において知られている他のもののいづれかであり得 る。 本発明のために適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤 であり得る。 使用され得る酵素漂白剤の１つのカテゴリーは、ペルカルボン酸漂白剤、及び その塩を包含する。このクラスの剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシ フタレート六水和物、メタ−クロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルア ミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸を包含する 。そのような漂白剤は、アメリカ特許第4,483,781号、アメリカ特許第740,446号 、ヨーロッパ特許第0133354号及びアメリカ特許第4,412,934号に開示される。ひ じょうに好ましい漂白剤はまた、アメリカ特許第4,634,551号に開示されるよう な６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸を包含する。 使用される漂白剤のもう１つのカテゴリーは、ハロゲン漂白剤を包含する。ヒ ポハライト漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸 、及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート、及びＮ−クロロ及び Ｎ−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終生 成物の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。 過酸化水素開放剤は、漂白活性化剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミ ン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンイルホネート（NOBS、アメリカ特許第4, 412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンス ルホネート（ISONOBS、ヨーロッパ特許第120591号に記載される）又はペンタア セチルグルコース(PAG)（それらは、過加水分解され、活性標的種としての過酸 が形成され、改良された漂白効果が導びかれる）と組合して使用され得る。さら に、漂白活性化剤Ｃ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼンスル ホネート、Ｃ９（６−ノナンアミド カプロイル）オキシベンゼンスルホネート 、及びＣ10（６−デカンアミド カプロイル）オキシベンゼンスルホネート、又 はそれらの混合物がひじょうに適切である。また適切な活性化剤は、ヨーロッパ 特許出願第91870207.7号に開示されるようなアシル化されたクエン酸エステルで ある。 有用な漂白剤、たとえば本発明の洗浄組成物への使用のための漂白活性化剤及 び過酸素漂白化合物を含んで成るペルオキシ酸及び漂白システムは、USSNO8/136 ,626号に記載される。 第四イミン塩は、WO95/13352に記載されるように過酸素化合物と一緒に漂白触 媒として使用され得る。 過酸化水素はまた、洗浄及び／又はすすぎ工程の開始で又はその工程の間、過 酸化水素を発生せしめることができる酵素システム（すなわち、酵素及びそのた めの基質）を添加することによっても存在することができる。そのような酵素シ ステムは、公開されたヨー ロッパ特許出願第0537381号に開示される。 過酸素漂白源からの過酸の開放は、本発明のリパーゼの使用により活性化され 得る。酵素加水分解システムのための必要な成分は次の過酸前駆体基質である： 過酸化ジアシルＲ₁−CO−Ｏ−Ｏ−CO−Ｒ（ここで、Ｒ及びＲ₁は飽和又は不飽和 アルキル、アリール基又はアルカリールであり得る）。リパーゼは、前記基質と 反応し、そして洗浄において過酸を開放する。 非水性液体洗剤組成物は、ペルオキシ酸材料、たとえばＮ，Ｎ’−ジ（４−ペ ルカルボキシベンゾイル）エチレンジアミン(PCBED)、Ｎ，Ｎ’−テレフタロイ ル−ジ（６−アミノペルカルボキシカプロン酸）(TPCAP)、Ｎ，Ｎ’−ジ（４− ペルカルボキシベンゾイル）ピペラジン（PCBP1P）、Ｎ，Ｎ’−ジ（４−ペルカ ルボキシベンゾイル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン（PCBHEX）、Ｎ，Ｎ’ −ジ（４−ペルカルボキシベンゾイル）−１，４−ブタンジアミン（PCBBD）、 Ｎ，Ｎ’−ジ（４−ペルカルボキシアニリン）−テレフタレート(DPCAT)、Ｎ， Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−１，２，４，５−テトラ−カルボキシベンゾイルージ（６−ア ミノペルカルボキシカプロン酸）（Di PAP）、Ｎ，Ｎ’−ジ（ペルカルボキシア ジポリ）フェニレンジアミン(DPAPD)、Ｎ，Ｎ’−スクシノイル−ジ（４−ペル カルボキシ）アニリン(SDPCA)、WO95／06104に記載されるようなＮ，Ｎ’−テレ フタロイル−ジ−（８−アミノペルオキシオクタン酸）(TPOCT)のＣ₃類似体から 成るペルオキシ酸を含んで成る。 酸素漂白剤以外の漂白剤はまた当業界において良く知られており、そして本発 明において利用され得る。特に興味ある非酸素漂白剤の１つの型は、光活性化さ れた漂白剤、たとえばスルホン化された亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシア ニンを包含する。それらの材料は、洗浄工程の間、支持体上に付着され得る。酵 素の存在下で の光による照射に基づいて、たとえば布を日光下に干すことによって、スルホン 化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして従って、支持体が漂白される 。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白剤工程は、アメリカ特許 第4,033,718号に記載される。典型的には、洗剤組成物は、約0.025〜約1.25重量 ％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。 漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。そのマンガン触媒は、たと えば“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleachnig”，Nat ure 369 ，1994，pp．637-639に記載される化合物の１つであり得る。 泡抑制剤：他の任意の成分は、シリコーン、及びシリカ−シリコーン混合物に より例示される泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリ シロキサン材料により示され得、そしてシリカは通常、種々の型のシリカエーロ ゲル及びキセロゲル、及び疎水性シリカにより例示される細かく分類された形で 使用される。それらの材料は、泡抑制剤が好都合には、水溶性又は水分散性で実 質的に非界面活性洗剤不透過性のキャリヤーに開放的に組込まれる粒状物として 組込まれ得る。他方では、泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され、又は分散さ れ、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用される。 好ましいシリコーン泡調節剤は、アメリカ特許第3,933,672号に開示されてい る。他の特に有用な泡抑制剤は、デンマーク特許第２,646,126号に記載される自 己乳化シリコーン泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリ コールのコポリマーである、Dow Corningから市販されているDC−544である。特 に好ましい泡調節剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルカノールの混合物 を含んで成る泡抑制剤システムである。適切な２−アルキル−ア ルカノールは、商標名Isofol 12Rとして市販されている２−ブチル−オクタノー ルである。 そのような泡抑制剤システムは、公開されたヨーロッパ特許出願第0593841号 に記載されている。 特に好ましいシリコーン泡調節剤は、公開されたヨーロッパ特許出願第057369 9号に記載される。前記組成物は、非多孔性のヒュームドシリカ、たとえばAeros il^Rと組合してシリコーン／シリカ混合物を含んで成る。 上記泡抑制剤は通常、組成物中、0.001〜２重量％、好ましくは0.01〜１重量 ％のレベルで使用される。 他の成分：洗剤組成物に使用される他の成分、土壌−懸濁剤、土壌−開放剤、 螢光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇りインヒビター、着色剤及び封入された又は封 入されていない香料が使用され得る。 特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、ポ リサッカリド及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセル である。 他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第3,455,838号に記載されるよう な、置換されたジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来す るデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは、好ましく は、ロウ状トウモロコシ、ロン状サトウモロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイ モのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Sta rchにより製造されるＮ−Lokを包含する。そのＮ−Lok封入材料は、修飾された トウモロコシスターチ及びグルコースから成る。スターチは、一官能置換基、た とえばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって修飾される。 本発明において適切な抗再沈着剤及び土壌懸濁剤は、セルロース 誘導体、たとえばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキ シエチルセルロース及びホモ−又はコ−ポリマー性ポリカルボン酸又はそれらの 塩を包含する。このタイプのポリマーは、ポリアクリレート及び無水マレイン酸 −アクリル酸のコポリマー、たとえば前でビルダーとして言及されたSokalan CP ５、及び無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸と のコポリマー（前記無水マレイン酸は前記コポリマー中において少なくとも20モ ル％を構成する）を包含する。それらの材料は、組成物において、0.5〜10重量 ％、より好ましくは0.75〜８重量％、最とも好ましくは１〜６重量％のレベルで 使用される。 好ましい螢光増白剤は特徴的にはアニオン性であり、その例としては、二ナト リウム４，４’−ビス（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジ ン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’ジスルホネート、二ナトリウム４， ４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミ ノ）スチルベン−２：２’ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２ ，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’ジ スルホネート−ナトリウム４’，４”−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリ アジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４ ’−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミ ノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネー ト、二ナトリウム４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール −２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’− ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ −トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、ナト リウム−２（ スチルビル−４”−（ナフト−１’，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾー ル−２”−スルホネート、及び４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニ ルを挙げることができる。 他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に分子量1000〜1000 0、より好ましくは2000〜8000及び最とも好ましくは約4000のものである。それ らは、0.20〜５重量％、より好ましくは0.25〜2.5重量％のレベルで使用される 。それらのポリマー及び前で言及されたホモ−又はコーポリマー性ポリカルボキ シレート塩は、白色度の維持、布への灰の付着、及び粘土、タンパク質性及び酸 化可能な土壌に対する洗浄性能を遷移金属不純物の存在下で改良するために価値 あるものである。 WO95/22593に記載されるようなグラフトポリマーもまた使用され得る。 本発明の組成物において有用な土壌開放剤は、テレフタル酸とエチレングリコ ール及び／又はプロピレングリコール単位との種々の配置でのコポリマー又はタ ーポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第4,116,885号、 アメリカ特許第4,711,730号及びヨーロッパ特許第0272033号に開示される。ヨー ロッパ特許第0272033号の特に好ましいポリマーは、下記式： (CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[(T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_{0. 75} 〔式中、PEGは−(OC₂H₄)O−であり、POは（OC₃H₆O）であり、そしてＴは(pcOC₆H₄ CO)である〕を有する。 ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコー ル及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーのような修飾されたポリ エステルもまた、ひじょうに有用であり、ここで前記末端基は第１に、スルホベ ンゾエート及び第２に、エ チレングリコール及び／又はプロパン−ジオールのモノエステルから成る。その 標的は、本発明においてはスルホベンゾエート基によりその両端でキャップされ たポリマーを得ることであり、“第１に”本明細書においては、前記コポリマー のほとんどはスルホベンゾエート基により末端キャップされるであろう。しかし ながら、いくつかのコポリマーは十分にキャップされておらず、そして従って、 それらの末端基はエチレングリコール及び／又はプロパン１，２−ジオールのモ ノエステルから成り、それゆえ、“第２には”、そのような種から成る。 本発明における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル 酸、約16重量％のプロパン−１，２ジオール、約10重量％のエチレングリコール 、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を 含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は 、ヨーロッパ特許第311342号に詳細に記載される。 軟化剤：布用軟化剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物中に組込まれ得る。それ らの剤は、無機又は有機タイプのものであり得る。無機軟化剤は、イギリス特許 出願第1400898号及びアメリカ特許第５,019,292号に開示されるスメクチルクレ ーにより例示される。布用有機軟化剤は、イギリス特許出願第1514276号及びヨ ーロッパ特許第0011340号に開示されるような水不溶性第三アミンを含み、そし てモノＣ₁₂−Ｃ₁₄第四アンモニウム塩とのそれらの組合せがヨーロッパ特許第02 6528号に開示され、そして二長鎖アミドがヨーロッパ特許第0242919号に開示さ れる。布用軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0299575号 及び第0313146号に開示されるような高分量ポリ酸化エチレン材料を包含する。 スメクチルクレーのレベルは通常、５〜15重量％、より好ましく は８〜12重量％であり、そしてその材料は配合物の残りに乾燥混合された成分と して添加される。布用有機軟化剤、たとえば水不溶性第三アミン又は二長鎖アミ ド材料は、0.5〜5重量％、通常１〜３重量％のレベルで組込まれ、そして高分子 量ポリ酸化エチレン材料及び水可溶性カチオン性材料は0.1〜２重量％、通常0.1 5〜1.5重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥さ れた部分に添加されるが、但し、多くの場合、乾燥混合された粒状物としてそれ らを添加し、又は組成物の他の固形成分上に溶融された液体としてそれらを添加 することがより便利である。 ポリマー性染料移行阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、0.001〜10重量％、 好ましくは0.01〜２重量％、より好ましくは0.05〜１重量％のポリマー性染料移 行阻害剤を含むことができる。前記ポリマー性染料移行阻害剤は通常、着色され た布からの染料の、それらにより洗浄された布上への移行を阻害するために洗剤 組成物中に組込まれる。それらのポリマーは、染料が洗浄において他の製品に結 合するようになる機会を有する前、染色された布から洗浄されるあせやすい染料 を複合体化し又は吸着する能力を有する。 特に適切なポリマー性染料移行阻害剤は、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、 Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピ ロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又は それらの混合物である。そのようなポリマーの付加はまた、本発明の酵素の性能 を高める。 本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒又は粒質形で存在すること ができる。非ダスチング粒質物は、たとえばアメリカ特許第4,106,991号及び第4 ,661,452号（両者ともNovo Industri A/Sのもの）に開示されるようにして生成 され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る 。ロウ質被 覆材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（酸化エチレン）生成物 （ポリエチレングリコール、PEG）;16〜50個の酸化エチレン単位を有するエトキ シル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そし て15〜80個の酸化エチレン単位を有するエトキシル化された脂肪アルコール；脂 肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−及びジ−、並びにトリグリセリドで ある。流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギ リス特許第1483591号に与えられる。 本発明の粒質組成物はまた“圧縮形”でも存在することができ、すなわち、そ れらは従来の粒質洗剤よりも比較的高い密度を有することができ、すなわち、55 0〜950ｇ／ｌを形成することができ；そのような場合、本発明の粒質洗剤組成物 は、従来の顆質洗剤に比較して、少量の“無機充填剤塩”を含み；典型的な充填 剤塩はスルフェート及びクロリドのアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリ ウムであり；“圧縮”洗剤は典型的には10％よりも多くない充填剤塩を含んで成 る。本発明の液体組成物はまた、“濃縮された形”で存在することができ、その ような場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤に比較して、少量の水 を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の水の含有率は、洗剤組成物 30重量％以下、より好ましくは20重量％以下、最とも好ましくは10重量％以下で ある。 本発明の組成物は、手動及び機械用洗濯洗剤組成物、たとえば洗濯添加剤組成 物、及び染色された布の予備処理への使用のために適切な組成物、すすぎのため に添加される布用軟化剤組成物、及び一般的な家庭用ハードウェア表面洗浄操作 及び皿洗い操作への使用のための組成物として配合され得る。 本発明内の洗濯洗剤組成物の特定の形は次のものを包含する： １）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： ２）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： ３）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： ４）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： ５）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： ６）下記成分を含んで成る構造体化された水性液体洗剤組成物： ７）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： ８）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： ９）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 10）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 11）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 12）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 13）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 14）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 15）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 16）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 17）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 18）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 19）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 20）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 21）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 22）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 23）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 24）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 25）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 26）濃縮された液体として配合される洗剤組成物： 27）濃縮された液体として配合される洗剤組成物： 28）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と して配合される洗剤組成物： 29）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 30）下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 次の特定の組成が本発明のための組成物を例示するために使用されるが、しか し必ずしも限定するものではなく、又は本発明の範囲内に定義される。 洗剤組成物においては、短縮された成分は次の意味を有する： LAS：ナトリウム線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホネート、 TAS：ナトリウム牛脂アルキルスルフェート XYAS：ナトリウムＣ_1X−Ｃ_1Yアルキルスルフェート SS：２−ブチルオクタン酸の第２の石鹸界面活性剤 25EY：平均Ｙモルの酸化エチレンにより縮合されるＣ_12-15の主な線状第一アル コール 45EY：平均Ｙモルの酸化エチレンにより縮合されるＣ₁₄−Ｃ₁₅の主な線状第一ア ルコール XYEZS：モル当たり平均Ｚモルの酸化エチレンにより縮合されるＣ_1X−Ｃ_1Yのナ トリウムアルキルスルフェート 非イオン性物質：BASF GmbHにより商品名Plurafax LF404として市販されている 、平均3.8のエトキシル化の程度及び平均4.5のプロポキシル化の程度を有するＣ₁₃ −Ｃ₁₅の混合されたエトキシル化された／プロポキシル化された脂肪アルコー ル CFAA：Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルキルＮ−メチルグルカミド TFAA：Ｃ₁₆−Ｃ₁₈アルキルＮ−メチルグルカミド 珪酸塩：非晶性珪酸ナトリウム（SiO₂：Na₂Oの比＝2.0） NaSKS−６：式ｄ−Na₂Si₂O₅の結晶性積層シリケート 炭酸塩：非晶性炭酸ナトリウム リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム MA／AA：約80,000の平均分子量を有する、１：４の比でのマレイン酸／アクリル 酸のコポリマー ポリアクリレート：BASF GmbHにより商品名PA30として市販されている、8,000の 平均分子量を有するポリアクリレートホモポリマー ゼオライトＡ：１〜10μの範囲の一次粒子サイズを有する、式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂ ・27H₂Oの水和化されたナトリウムアルミノシリケート クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム二水和物 クエン酸：クエン酸 過硼酸塩：実験式NaBO₂・H₂O₂を有する非晶性過硼酸ナトリウム一水和物漂白剤 PB4：非晶性過硼酸ナトリウム四水和物 過炭酸塩：実験式２Na₂CO₃・３H₂O₂を有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤 TAED：テトラアセチルエチレンジアミン CMC：ナトリウムカルボキシメチルセルロース DETPMP：商品名Dequest 2060としてMonsantoにより市販されているジエチレント リアミンペンタ（メチレンホスホン酸） PVP：ポリビニルピロリドンポリマー EDDS：ナトリウム塩の形でのエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸、〔Ｓ，Ｓ 〕異性体 泡抑制剤：25％パラフィンワックス（Mpt 50℃）、17％疎水性シリカ、58％パラ フィン油 粒状泡：粒状形での12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％ スターチ 硫酸塩：非晶性硫酸ナトリウム HMWPEO：高分子量ポリ酸化エチレン TAE25：牛脂アルコールエトキシレート（25）組成物１ 本発明の粒状布用洗浄組成物を、次の通りに調製することができる： ナトリウム線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホネート 6.5 硫酸ナトリウム 15.0 ゼオライトＡ 26.0 ナトリウムニトリロトリアセテート 5.0 本発明の酵素 0.1 PVP 0.5 TAED 3.0 硼酸 4.0 過硼酸塩 18.0 フェノールスルホネート 0.1 微成分 100％まで組成物２ 本発明の圧縮粒状布用洗浄組成物（密度800／ｌ）を、次の通りに調製するこ とができる： 45AS 8.0 25E3S 2.0 25E5 3.0 25E3 3.0 TFAA 2.5 ゼオライトＡ 17.0 NaSKS−６ 12.0 クエン酸 3.0 炭酸塩 7.0 MA／AA 5.0 CMC 0.4 本発明の酵素 0.1 TAED 6.0 過硼酸塩 22.0 EDDS 0.3 粒状泡抑制剤 3.5 水／微成分 100％まで組成物３ 着色された布の洗濯に特に有用である本発明の粒状布用洗浄組成物を次の通り に調製した： Ｉ II LAS 10.7 − TAS 2.4 − TFAA − 4.0 45AS 3.1 10.0 45E7 4.0 − 25E3S − 3.0 68E11 1.8 − 25E5 − 8.0 クエン酸塩 15.0 7.0 炭酸塩 − 10 クエン酸 2.5 3.0 ゼオライトＡ 32.1 25.0 Na−SKS−６ − 9.0 MA／AA 5.0 5.0 DETPMP 0.2 0.8 本発明の酵素 0.10 0.05 珪酸塩 2.5 − 硫酸塩 5.2 3.0 PVP 0.5 − ポリ（４−ビニルピリジン）−Ｎ− − 0.2 オキシド／ビニルイミダゾール及び ビニルピロリドンのコポリマー 過硼酸塩 1.0 − フェノールスルホネート 0.2 − 水／微成分 100％まで組成物４ “洗浄を通しての軟化”能力を提供する本発明の粒状布用洗浄組成物を次の通 りに調製することができる： 45AS − 10.0 LAS 7.6 − 68AS 1.3 − 45E7 4.0 − 25E3 − 5.0 Coco−アルキル−ジメチルヒドロキシ− 1.4 1.0 エチルアンモニウムクロリド クエン酸塩 5.0 3.0 Na−SKS−６ − 11.0 ゼオライトＡ 15.0 15.0 MA／AA 4.0 4.0 DETPMP 0.4 0.4 過硼酸塩 15.0 − 過炭酸塩 − 15.0 TAED 5.0 5.0 スメクチッククレー 10.0 10.0 HMWPEO − 0.1 本発明の酵素 0.10 0.05 珪酸塩 3.0 5.0 炭酸塩 10.0 10.0 粒状泡抑制剤 1.0 4.0 CMC 0.2 0.1 水／微成分 100％まで組成物５ 本発明の強力液体布用洗浄組成物を次の通りに調製することができる： Ｉ II LAS酸形 − 25.0 クエン酸 5.0 2.0 25AS酸形 8.0 − 25AE2S酸形 3.0 − 25AE7 8.0 − CFAA ５ − DETPMP 1.0 1.0 脂肪酸 ８ − オレイン酸 − 1.0 エタノール 4.0 6.0 プロパンジオール 2.0 6.0 本発明の酵素 0.10 0.05 ココ−アルキルジメチル − 3.0 ヒドロキシエチルアンモニウム クロリド スメクチッククレー − 5.0 PVP 2.0 − 水／微成分 100％まで組成物６ 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物７ 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される漂白剤含有洗剤組成物： ＊：WO95／22593に記載されるようなグラフトポリマー組成物８ 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される非漂白剤含有洗剤組成物： ＊：WO95／622593に記載されるようなグラフトポリマー組成物９ 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物10 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物11 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物12 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物13 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物14 下記成分を含んで成る、粒質物として配合される洗剤組成物： 組成物15 下記成分を含んで成る粉末化された組成物： ＊：アメリカ特許第5,308,530号に記載されるような組成物16 下記成分を含んで成る水性液体洗浄剤： 組成物17 下記成分を含んで成る液体洗剤組成物： 組成物18 下記成分を含んで成る、非水性液体洗剤として配合される洗剤組成物： ＊：WO95／06104に記載されるような組成物19 下記成分を含んで成る、非水性液体洗剤として配合される洗剤組成物： 組成物20 下記成分を含んで成る、水性液体洗剤として配合される洗剤組成物： 組成物21 下記成分を含んで成る液体洗剤組成物： ＊アメリカ特許第5,308,530号に記載されるような。組成物22 下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物：皿洗い組成物 皿洗い洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性またはそれ らのタイプの混合物であり得る界面活性剤を含んで成る。前記洗剤は、０〜90％ の非イオン性界面活性剤、たとえば低い〜非発泡性のエトキシル化されたプロポ キシル化直鎖アルコールを含むであろう。 洗剤組成物は、無機及び／又は有機タイプの洗剤ビルダー塩を含む ことができる。洗剤ビルダーは、リン含有及び非リン含有タイプに細分され得る 。洗剤組成物は通常、１〜90％の洗剤ビルダーを含む。 リン含有無機アルカリ洗剤ビルダーの例は、存在するなら、水溶性塩、特にア ルカリ金属のピロリン酸塩、オルトリン酸塩、ポリリン酸塩及びホスホン酸塩を 包含する。非リン含有無機ビルダーの例は、存在するなら、水溶性アルカリ金属 炭酸塩、硼酸塩及び珪酸塩、並びに種々のタイプの水不溶性結晶性又は非晶性ア ルミノ珪酸塩（このゼオライトは最良の知られている保存剤である）を包含する 。 適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム及び置換されたアン モニウムのクエン酸塩、琥珀酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキ シメトキシ琥珀酸塩、アンモニウムポリ酢酸塩、カルボン酸塩、ポリカルボン酸 塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩及びポリヒドロキシス ルホン酸塩を包含する。 他の適切な有機ビルダーは、ビルダー性質を有することが知られている高分子 量ポリマー及びコポリマー、たとえば適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸及 びポリアクリル酸／ポリマレイン酸のコポリマー及びそれらの塩を包含する。 皿洗い洗剤組成物は、塩素／臭素型又は酵素型の漂白剤を含むことができる。 無機塩素／臭素型漂白剤の例は、ナトリウム又はカルシウム次亜鉛素酸塩、及び 塩素化されたリン酸三ナトリウムである。有機塩素／臭素タイプの漂白剤の例は 、複素環式Ｎ−ブロモ及びＮ−クロロイミド、たとえばトリクロロイソシアヌル 酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシア ヌル酸、及び水溶性カチオン、たとえばカリウム及びナトリウムとのそれらの塩 である。ヒダントイン化合物もまた適切である。 酵素漂白剤は、たとえば無機過酸塩の形で、好ましくは漂白剤前駆体と共に又 はペルオキシ酸化合物として好ましい。適切なペルオキシ 漂白化合物の典型的な例は、アルカリ金属の過硼酸塩（４及び１水和物）、アル カリ金属の過炭酸塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。好ましい活性剤材料は、 TAED及びグリセロールトリアセテートである。 本発明の皿洗い洗剤組成物は、酵素のための従来の安定剤、たとえばポリオー ル、たとえばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼 酸誘導体、たとえば芳香族硼酸エステルを用いて安定化され得る。 皿洗い洗剤組成物はまた、他の酵素、特にアミラーゼ、プロテアーゼ及び／又 はセルラーゼも含むことができる。 本発明の皿洗い洗剤組成物はまた、他の従来の洗剤成分、解凝集材料、充填剤 材料、泡抑制剤、耐腐蝕剤、土壌−懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗−土壌再付着 剤、脱水剤、染色、殺菌剤、螢光剤、増粘剤、及び香料を含むことができる。 本発明の最初の洗浄脂肪分解酵素は、洗剤において従来使用される濃度で導入 され得る。本発明の洗剤組成物においては、脂肪分解酵素は、洗浄液体１ｌ当た り脂肪分解酵素0.00001〜１mg（純粋な酵素タンパク質として計算される）に対 応する量で添加され得る。 下記に特に好ましい皿洗い組成物が例示される： １）粉末自動皿洗い組成物： ２）粉末自動皿洗い組成物：３）粉末自動皿洗い組成物：４）粉末自動皿洗い組成物： ５）粉末自動皿洗い組成物： ６）洗浄界面活性剤系を含む粉末及び液体皿洗い組成物：７）非水性液休自動皿洗い組成物：８）非水性液体皿洗い組成物： ９）チキソトープ液体自動皿洗い組成物：10）液体自動皿洗い組成物：11）保護された漂白剤粒子を含む液体自動皿洗い組成物： 11）１),２),３),４),６)及び10）に記載されるような自動皿洗い組成物（ここ で、過硼酸塩が過炭酸塩により置換されている）。 12）１）〜６）に記載されるような自動皿洗い組成物（ここで、さら にマンガン触媒が含まれる）。前記マンガン触媒は、“Efficient manganese Ca talysts for low-temperatare bleaching”，Natune 369，1994，pp.637-639に 記載される化合物の１つであり得る。 さらに、本発明の第１の洗浄脂肪分解酵素は、軟化組成物に使用され得る。 本発明の脂肪分解酵素は、Surfactant and Consumer Products，Ed，by J.Fal be，1987，pp.295-296;Tenside Surfactants Detergents，30(1993)，6，pp.394 -399;JAOCS，Vol.61(1984)，2，pp.367-376;ヨーロッパ特許第517762号；ヨーロ ッパ特許第123400号；WO92/19714;WO93/19147;アメリカ特許第5,082,578号；ヨ ーロッパ特許第494769号；ヨーロッパ特許第544493号；ヨーロッパ特許第543562 号；アメリカ特許第5,235,082号；ヨーロッパ特許第568297号；ヨーロッパ特許 第570237号に記載されるように、布用軟化剤に使用され得る。 最終的に、本発明は、本発明の組成物を用いての異なった対象の物質を洗浄し 、又は清浄するための方法に関する。前記組成物を用いることによって、前記対 象の物質、たとえば布、織物又は皿から液体付着物をより効果的に除去すること が可能である。 親脂肪分解酵素を含んで成る洗剤組成物と同じ洗浄性能を得るために洗剤組成 物に存在すべきである脂肪分解酵素の量を減じることがまた可能である。 本発明の１つの態様においては、本発明は、 ａ）水性媒体に対象物質をソーキンクし、 ｂ）段階ａ）の前、その間又はその後、水性媒体に溶解された、 本発明の脂肪分解活性を有する修飾された酵素を含んで成る洗剤組成物に対象物 質を一定時間、接触せしめ、 ｃ）前記対象物質をすすぎ、 ｄ）前記対象物質から前記すすぎ水を除去することを含んで成る。 材料及び方法材料 プラスミド ： pYES 2.0（Invitrogen Corp.，UK） p960 Ａ．オリザエ発現プラスミド（Novo Nordisk AISからのヨーロッパ特許第 305216号に記載される） pSX581(Ｅ．コリ発現プラスミド)(図７を参照のこと) pJSO37(Ｓ．セレビシアエ発現プラスミド)(Okkels J.S.，Annals of the New Yo rk Academy of Sciences(in press 1995)(また図８を参照のこと) pSX167（図４を参照のこと） pSX92（WO89/06279） pUC19（Yanish-Perron et al．(1985)Gene 33，103-119） pHD414（アスペルギラス発現ベクターは、ヨーロッパ特許第238023号に記載され るプラスミドp775の誘導体である。pHD414の構成はさらに、WO93/11249に記載さ れている。） PJVi245（図９を参照のこと） pCaHj383（図９を参照のこと） pCaHj385（図９を参照のこと） T.,Diderichsen，B..and McConnell，D.J．(1993)．Activation of a bacterial lipase by its chaperone．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，p.5682-5686)．微生物 ： サッカロミセス セレビシアエYNG318:MATa Dpep⁴[cir⁺]ura3-52 ，leu2-D2，his 4-539 アスペルギラスオリザエIFO4177 Ａ．オリザエJaL125：Ａ．オリザエpyrG遺伝子をマーカーとして用いて、１段 階遺伝子置換法（G.May“Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi” (1992)，p.1-25，Eds.J.R.Kinghorn and G.Turner；Blackie Academic and Prof essionalにより記載される）により欠失された“alp”（Murakami Kなど.，(199 1)，Agric.Biol.Chem.55，p.2807-2811により記載される）と称するアルカリプ ロテアーゼ遺伝子を有する。Institute for Fermentation，Osaka;17-25 Juso H ammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，Japanから入手できるアスペルギラスオ リザエIFO4177。 Ｅ．コリＷ3110 lacＩ^q（Ｅ．コリＷ3110は、Ｋ−12株（Bachman,(1972)，Bac teriol.Rev.36）のための祖先ストックトとして使用される初期単離物である） 。そのW3110株は、placからの発現をより完全に止めるLacリプレッサーを過剰生 成するためにlacＩ^qを製造されている。 Ｅ．コリSJ6：Diderichsen，B.,Wedsted，U.,Hedegaard，L.,Je キシラーゼ（バシラス ブレビス(Bacillus brevis)からの細胞外酵素）をコー ドするaldＢのクローニング，J.Bacteriol.，172，p.4315-4321。 SJ1503株は、プラスミドpAHE2を含むＥ．コリJA221である：Ho erichsen，B.，and McConnell，D.J．(1993)．Activation of a bacterial lipa se by its chaperone．Proc．natl．Acad．Sci．USA，90，p.5682-5686。ドナー生物 ： ヒュミコラ ラヌギノサDSM4109（ヨーロッパ特許第305,216号） ヒュミコラ インソレンスDSM1800（WO96/13580） シュードモナス セパシアSB10，DSM3959は、WO89/01032に記載される。酵素 ： ウシトリプシン（Boehringer Mannheim） 次のリパーゼは、本発明において親酵素として使用されるか、又は本発明の修 飾された酵素を構成するヒュミコラ ラヌギノサDSM4109リパーゼ（ヨーロッパ 特許第305216号）の変異体である。 表 Ｍ１ 次のリパーゼは、Ｎ−末端付加が本発明に従って適用されているＢ．セパシア （以前は、シュードモナス セパシアである）リパーゼの変異体である。 表 Ｍ２ 次のリパーゼは、ヒュミコラ インソレンスDSM 1800脂肪分解酵素の変異体で ある。 表 Ｍ３ 酵素インヒビター： ダイズ トリプシンインヒビター（Boehringer Mannheim）培地 ： YPD：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、810mlまでの水をオートクレーブし 、20％グルコース90ml（フィルター殺菌された）を添加した。 LB−培地：10ｇのBacto−トリプシン、５ｇのBacto酵母抽出物、10ｇのNaCl及 び１ｌの水。 FG４培地：３％のダイズミール、３％のマルトデキストリン、１％のペプトン 、４ＭのNaOHによるpH７への調節。 Litex Agarose HSB 2000（カタログ番号：F90472） BG−試薬：水に溶解された４mg／mlのブリリアントグリーン（BG） 基質１： 10mlのオリーブ油（Sigmaカタログ番号０−1500） 20mlの２％ポリビニルアルコール（PVA） 前記基質は15〜20分間、均質化される。PCS 洗剤 ： 10ｇ／ｌ： SDS 0.52ｇ Dobanol 25−３ 0.60ｇ Dobanol 25−７ 0.58ｇ NaBO₃H₂O 1.50ｇ １ｌの0.1Ｍトリス−緩衝液（pH９）を添加し、そしてPCSプレート上で所望す る濃度の２倍の濃度にトリス緩衝液によりさらに希釈する。PCS −プレート ： PCS−プレートを製造するための溶液 ブリリアントグリーン（BG−試薬） 10ml 基質１ 24ml pCS洗剤 500ml ２％アガロース（トリス緩衝液（pH９）において） 500ml リパーゼ基質（Sigmaカタログ番号800−１） ブリリアントグリーン（Merck、物品番号1.01310）見本の布ぎれ ： ラード／スーダンレッドにより染色された3.5×3.5cm及び９×９cmの綿の布ぎ れ(Test Fabrics，Inc．(New Jersey)からのスタイル＃400)。ラード ： ラード１ｇ当たり0.75mgのスーダンヒッドにより着色されたラード。洗剤Ｉ ： 1.17ｇ／ｌのLAS（Nansa 1169／ｐ，30％ ａ．ｍ．） 0.15ｇ／ｌのAEO（Dobanol 25−７） 1.25ｇ／ｌの三リン酸ナトリウム 1.00ｇ／ｌの硫酸ナトリウム 0.45ｇ／ｌの炭酸ナトリウム 0.15ｇ／ｌの珪酸ナトリウム pHを10に調節する。 不活性化されたAriel Futar（Procter and Gamble）(市販のバッチ番号4279B2 3：35)：洗剤における酵素は熱により不活性化された（マイクロオーブンにおい て85℃で４分間）。 水：3.2mMのCa²⁺⁺／Mg²⁺⁺（５：１） Chameleon二本鎖特定部突然変異誘発キット（カタログ番号200509）(Stratage ne，Lajolle，CA)装置 ： 473A Protein Sequencer（Applied Biosystems） Toyopearl Butylカラム（XK16/10）(Pharmacia，Sweden) Q−Sepharoseカラム（HPQ XK26/10）(Pharmacia，Sweden) MonoQカラム（１ml）(Pharmacia，Sweden) Spin 100カラム（Clontech Lab．Inc.，CA，USA）方法 ：ハイブリダイゼーション条件 中ぐらいから高い緊縮性： ５×SSCにおいて予備ソーキングし、そして20％ホルムアミド、５×Denhardt' s溶液、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)及び50mgの修飾され、音波処理されたウ シ胸腺DNAを含む溶液において約40℃で１時間、予備ハイブリダイズし、続いて 、100mMのATPにより補充された前記同じ溶液において、約40℃で18時間、ハイブ リダイズし、続いて、約45℃の温度で0.4×SSCにより洗浄する。酵母発現ベクターの構成 発現プラスミドpJSO37は、pYES2.0に由来する。pYES2.0の誘発できるGAL1−プ ロモーターを、サッカロミセス セレビシアエから の構造的に発現されたTPI(トリオース ホスフェート イソメラーゼ)−プロモ ーターにより置換し（Albert and Karwasaki，(1982)，J．Mol．Appl．Genet.， 1，419-434）、そしてURA3プロモーターを欠失した。pJSO37の制限地図は、図８ に示される。脂肪分解変異体を構成するための方法 本発明の修飾された脂肪分解酵素を構成するために親脂肪分解酵素の非構造Ｎ −末端及び／又はＣ−末端におけるペプチド付加及び／又は突然変異誘発を、特 定部位突然変異誘発又はランダム突然変異誘発により行なった。特定部位突然変異誘発 Ｈ．ラヌギノサ脂肪分解酵素の変異体の構成のためには、市販のキット、すな わちChameleon二本鎖特定部位突然変異誘発キットを、その製造業者の説明書に 従って用いることができる。 問題の脂肪分解酵素をコードする遺伝子を、プラスミドpHD414中に挿入した。 製造業者の説明書に従って、pHD414のアンピシリン遺伝子のScaＩ部位を、次の プライマーの使用によりMlu1部位に変更する：プライマー３：AGAAATCGGGTATCCT TTCAG(配列番号６)。 次に、問題の脂肪分解遺伝子を含んで成るpHD414ベクターを、DNAポリメラー ゼ及びオリゴ7258及び7770のための鋳型として使用する。所望する突然変異誘発 （たとえば、脂肪分解遺伝子のＮ−末端における）を、所望する突然変異を含ん で成る適切なオリゴの付加により問題の脂肪分解遺伝子中に導入する。 PCR反応は、製造業者の推薦に従って行なわれる。ランダム突然変異誘発 WO95/22615に記載されるようにして実質的に行なわれ得る。より特定には、短 いDNA拡張、たとえばペプチド付加におけるランダム突然変異誘発を行なうため には、ランダム突然変異誘発を、ドーピ ングされた又はスパイクされたオリゴヌクレオチドプローブの使用により行なう 。より大きなDNA拡張のためには、PCRに起因する突然変異誘発を用いることがで きる。 低カルシウムフィルターアッセイ方法 １）第１のタンパク質結合フィルター（サイロン膜）及び第２の低いタンパク 質結合フィルター（酢酸セルロース）を、SC Uraレプリカプレートの上部に供給 する。 ２）前記二重フィルター上に親リパーゼ遺伝子又は突然変異誘発されたリパー ゼ遺伝子を含む酵母細胞を広げ、そして30℃で２又は３日間インキュベートする 。 ３）上部フィルターを新しいプレートに移すことによってその上部フィルター 上にコロニーを維持する。 ４）タンパク質結合フィルターを空のペトリ皿に移動する。 ５）ブルーグリーンスポットの形で、リパーゼが活性を発現するコロニーを同 定するために、オリーブ油エマルジョン（2％ P.V.A.:オリーブ油＝３：１）、 ブリリアントグリーン（インジケーター、0.004％）、100mMのトリス緩衝液(pH9 )及びEGTA（最終濃度５mM）を含んで成るアガロース溶液を底部フィルター上に 注ぐ。 ６）親リパーゼに比較して、カルシウムに対して減じられた依存性を有する、 段階５）に見出されるコロニーを同定する。 洗剤成分に対しての改良された耐性についてのスクリーニングを、蒸気流アッ セイに対応するフィルターアッセイの使用により行な 25-7を含み、そして任意には、いづれのEGTAを含まない。他のスクリーニングアッセイは次の通りである ：方法 １）タンパク質結合フィルター（酢酸セルロース）も、SC Ura-プレート（発 現ベクターを担持する株を選択するために有用である）の上部に供給する。 ２）前記フィルター上に親リパーゼ遺伝子又は突然変異誘発されたリパーゼ遺 伝子を含む酵母細胞を広げ、そして30℃で３又は４日間インキュベートする。 ３）その上部フィルターを新しいプレートに移すことによって、その上部フィ ルター上にコロニーを維持する。 ４）下記成分を含むパトリ皿にタンパク質結合フィルターを移動する：オリー ブ油エマルジョン（２％ P.V.A.:オリーブ油＝２：１）、ブリリアントグリーン （インジケーター、0.004％）、100mMのトリス緩衝液（pH10）及び洗剤又は洗浄 成分、たとえばPCS-プレートを含んで成るアガロース溶液。 ５）段階４）で見出されるブルーグリーンスポットの形でリパーゼ活性を発現 するコロニーを同定する。酵母における発酵 ： SC-ura培地10mlを、Ｓ．セレビシアエコロニーにより接種し、そして30℃で２ 日間、増殖せしめる。得られる培養物10mlを、30℃で３日間、増殖せしめられる SC-ura培地300mlを含む振盪フラスコを接種するために使用する。その300mlが、 次のＧ−基質５ｌを接種するために使用される： 400ｇ アミカーゼ 6.7ｇ 酵母抽出物質（Difco） 12.5ｇ Ｌ−ロイシン（Fluka） 6.7ｇ (NH₄)₂SO₄ 10ｇ MgSO₄・7H₂O 17ｇ K₂SO₄ 10ml 微量化合物 ５ml ビタミン溶液 6.7ml H₃PO₄ 25ml 20％ Pluronic(消泡剤) （5000mlの合計体積における）。 酵母細胞を30℃で５日間、発酵せしめる。それらは、開始用量の100mlの70％ グルコースを与えられ、そして１日当たり70％グルコース400mlが添加される。5 .0のpHを、10％ NH₃溶液の添加により維持する。撹拌を最初の22時間、300rpmで 行ない、続いて発酵の残りの間、900rpmで行なう。空気は、最初の22時間、１ｌ の空気／ｌ／分で与えられ、続いて、発酵の残りの間、1.5ｌの空気／ｌ／分で 与えられる。微量化合物 ：合計体積１ｌにおいて、6.8ｇのZnCl₂，54.0ｇのFeCl₂・6H₂O，19. 1ｇのMnCl₂・4H₂O，2.2ｇのCuSO₄・5H₂O，2.58ｇのCaCl₂，0.62ｇのH₃BO₃，0.02 4ｇの(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O，0.2ｇのKI，100mlのHCl(濃)。ビタミン溶液 ：合計体積１ｌにおいて、250mgのビオチン、３ｇのチアミン、10 ｇのＤ−カルシウムパンテトネート、100ｇのMyo-イノシトール、50ｇのコリン クロリド、1.6ｇのピリドキシン、1.2ｇのナイアシンアミド、0.4ｇの葉酸、0.4 ｇのリボフラビン。アスペルギラスオリザエの形質転換（一般的な方法） 100mlのYPD(Shermanなど.，(1981)，Methods in Yeast Genetics，Cold Sprin g Harbor Laboratory)を、Ａ．オリザエの胞子により接種し、そして振盪しなが ら約24時間インキュベートする。菌糸体をミラクロス(miracloth)を通しての濾 過により収穫し、そして200mlの0.6ＭのMgSO₄により洗浄する。菌糸体を、1.2Ｍ のMgSO ₄ ,10mMのNaH₂PO₄の溶液（pH5.8）15mlに懸濁する。その懸濁液を氷上で冷却し、 そして120mgのNovozym 234(バッチ1687)を含む緩衝液１mlを添加する。５分後、 12mg／mlのBSA(SigmaタイプH25)1mlを添加し、そして軽く撹拌しながら、インキ ュベーションを、多数のプロトプラストが顕微鏡下で観察されるサンプルに見え るようになるまで、37℃で1.5〜2.5時間、続ける。 懸濁液を、ミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌の管に移し、そして0.6Ｍ のソルビトール、100mMのトリス−HCl（pH7.0）の溶液５mlを被覆する。遠心分 離を1000ｇで15分間、行ない、そしてプロトプラストをMgSO₄クッションの上部 から収集する。２体積のSTC(1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス−HCl，pH7.5 ，10mMのCaCl₂)を、プロトプラスト懸濁液に添加し、そしてその混合物を1000ｇ で５分間、遠心分離する。プロトプラストペレットを、STC ３mlに再懸濁し、そ して再ペレット化する。これをくり返す。最後に、プロトプラストを、STC 0.2 〜１mlに再懸濁する。 プロトプラスト懸濁液100μｌを、STC 10μｌにおいて、５〜25μｇのP3SR2（ Hynesなど．，Mol．and Cel．Biol.，Vol.3，No.8，1430-1439，Aug．1983に記 載される、Ａ．ニジュランスand Ｓ遺伝子担持のプラスミド）と共に混合する 。その混合物を室温で25分間、放置し、60％ PEG 4000(BDH29576)，10mMのCaCl₂ 及び10mMのトリス−HCl（pH7.5）の溶液0.2mlを添加し、そして注意して混合し （２度）、そして最後に、その同じ溶液0.85mlを添加し、そして注意して混合す る。その混合物を室温で25分間、放置し、2,500ｇで15分間、回転せしめ、そし てペレットを1.2Ｍのソルビトール２mlに再懸濁する。さらにもう１回の沈降の 後、プロトプラストを、1.0Ｍのスクロース、pH7.0、窒素源としての10mMのアセ トアミド及び20mMのCsClを含む最少プレート(Cove，(1966)，Biochem．Bio phys．Acta 113，51-56)上に広げ、そしてバックグランド増殖を阻害する。37℃ で４〜７日間のインキュベーションの後、胞子を取り、無菌水に懸濁し、そして 単一コロニーについて広げる。この工程を返復し、そして２回目の再単離の後、 単一コロニーの胞子を、定義される形質転換体として貯蔵する。供給バッチ発酵 供給バッチ発酵を、炭酸源としてのマルトデキストラン、窒素源としての尿素 及び酵母抽出物を含んで成る培地において実施する。供給バッチ発酵を、炭素源 3.5％及び窒素源0.5％を含んで成る培地中に問題のＡ．オリザエ宿主細胞の振盪 フラスコ培養物を接種することによって行なった。pH5.0及び34℃での24時間の 培養の後、追加の炭素及び窒素源の連続した供給を開始する。炭素源を制限因子 として保持し、そして酸素が過剰に存在することか確保される。この供給バッチ 培養を４日間、続け、この後、酵素を、遠心分離、限外濾過、透明濾過及び菌類 濾過により回収することができる。さらなる精製は、当業界において知られてい るアニオン交換クロマトグラフィーにより行なわれ得る。リパーゼ活性（LU−リパーゼ単位） リパーゼ活性を、基質としてグリセリントリブチレート及び乳化剤としてアラ ビアゴムを用いてアッセイする。１LU（リパーゼ単位）は、30℃、pH7.0で１分 当たり１μモルの滴定可能な酪酸を生成する酵素の量である。リパーゼ活性は、 Radiometer滴定機VTT90，Radiometer，Copenhagenを用いて、pH−安定装置によ りアッセイされる。布ぎれ上へのラードの適用 70℃に加熱された染色されたラード６mlを、個々の布ぎれの中央に適用する。 この染料の適用の後、布ぎれを75℃で25分間、オーブ ンにおいて加熱し、そして最初の洗浄の前、室温で一晩、貯蔵する。３−循環洗浄性能 本発明の修飾された脂肪分解酵素の３−循環洗浄性能を、親脂肪分解酵素に比 較して、１ｌ当たりのタンパク質（又はLU）のmgでの酵素用量に基づいて評価す ることができる。洗浄試験を、温度調節された水槽に配置された150mlのビーカ ーにおいて実施する。ビーカーを、三角磁気棒により撹拌する。 実験条件は次の通りである： 方法：個々の循環の間、一晩の乾燥を伴っての３回の循環 洗浄液体：ビーカー当たり100ml 布ぎれ：ビーカー当たり６枚の布ぎれ（ラード１ｇ当たり0.75mgのスーダンレッ ドにより着色されたラードにより染色された3.5×3.5cm） 洗剤：10.2にpH調節された洗剤Ｉ 酵素濃度：１ｌ当たり0.075，0.188，0.375，0.75及び2.5mgのリパーゼタンパク 質 時間：20分 温度：300C すすぎ：水道水下で15分 乾燥：室温で一晩（20℃、30〜50％のRH） 評価：３回の洗浄の後、460nmでの反射率を測定した。洗浄結果の評価 用量−反応曲線を、修飾された脂肪分解酵素及び親脂肪分解酵素について比較 する。用量−反応曲線は、次の等式に測定されたデータを当てはめることによっ て計算される： 式中、DRは反射率単位で表わされる効果であり、Ｃは酵素濃度（mg／ｌ）であり 、DR_maxは最大効果を表わす定数であり、Ｋは定数であり；Ｋ²は、最大効果の半 分が得られる酵素濃度を表わす。 特徴的な定数DR_max及び個々の修飾された脂肪分解酵素及び親脂肪分解酵素に ついて見出されたＫに基づけば、改良因子が計算される。f_improve＝Ｃ_parent／ Ｃ（II）として定義される改良因子は、対照の親タンパク質（Ｃ_parent）0.25mg ／ｌにより得られる効果と同じ効果を得るのに必要とされる修飾されたリパーゼ タンパク質の量を表わす。 従って、改良因子を計算するための工程は次の通りである： １）0.25mg／ｌでの親タンパク質の効果（Ｄ_parent）が等式（Ｉ）により計算 され： ２）0.25mg／ｌで親酵素と同じ効果をもたらす修飾された脂肪分解酵素の濃度 が次の等式により計算され： ３）改良因子が等式（III）により計算された。１循環洗浄性能 １循環洗浄試験を、温度調節されたTerg−Ｏ−to−Meter（TOM）により実施す る。 方法：１循環洗浄、続くラインドライング（line drying） 洗浄液体：ビーカー当たり1000ml 布ぎれ：ラード１ｇ当たり0.75mgのスーダンレッドにより着色されたラードによ り染色された９×９cmの７枚の布ぎれ 水:3.2mMのCa²⁺／Mg²⁺（５：１） 洗剤：約10.3のpHを有する、５g／ｌの不活性化されたAriel Futur^TX（バッチ番 号4279 B23：35から入手できる） リパーゼ濃度：０，1250，12500LU／ｌ 時間：20分 温度：30℃ すすぎ：水道水下で15分間 乾燥：室温で一晩（20℃，30〜40％のRH） 評価：脂肪物質をリックスレー抽出法を用いて抽出し、そして脂肪物質の量を重 量測定的に決定する。 例例１ ．酵母における野生型ヒュミコラ ラヌギノサ リパーゼの生成 酵母サッカロミセス セレビシアエ YNG318におけるヒュミコラ ラヌギノサ リパーゼの発現のために、酵母発現ベクターpJSO37（図８を参照のこと）を、 上記材料及び方法のセクションに記載されるようにして構成した。pJSO37は、親 リパーゼをコードするDNA配列を含んで成り、そしてシグナルペプチド及びプロ ペプチドをコードするDNA配列を含む（図１を参照のこと）。このプラスミドを 用いて、標準の方法(たとえば、Sambrooksなど.，(1989)，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor)により酵母を形質転換し た。酵母を、上記材料及び方法セクションに記載されるようにして培養した。Ｓ．セレビシアエにおいて発現されるＨ．ラヌギノサ リパーゼの精製 酢酸アンモニウム（92ｇ）を発酵ブイヨン（1400ml）に添加し、酢酸アンモニ ウムの0.8Ｍ溶液を得た。その溶液を、Toyopearl Butylカラム(XK16/10)上に添 加した。カラムを0.8Ｍの酢酸アンモ ニウムにより洗浄し、そしてリパーゼを、５ml／分の流速で水に溶離する。10ml の画分を集め、そしてリパーゼ含有画分を、標準のリパーゼ滴定アッセイにおけ る活性に従って、プールした。そのリパーゼ含有プールを濾過し、そしてpHを、 7.6に調節し、そしてQ−Sepharoseカラム(HPQ XK26/10)上に添加した。カラムを 0.1Ｍのトリス−HCl（pH7.25）200mlにより洗浄し、そしてリパーゼを、５ml／ 分の流速で、0.1Ｍのトリス−HCl（pH7.25）400ml中、０〜0.３ＭのNaClの線状 グラジエントに溶離した。10mlの画分を集め、そしてリパーゼ含有画分を、標準 のリパーゼ滴定アッセイにおける活性に従ってプールした。リパーゼ含有プール を、水により希釈し、そして１ml／分の流速で１mlのMonoQカラム上に添加した 。カラムを水30m1により洗浄し、そしてリパーゼを、40ml中、０〜0.25ＭのNaCl 線状グラジエントに溶離した。リパーゼを、280nmでの吸光度に従って、手動的 に収集した。酵母において発現されたＨ．ラヌギノサ リパーゼのＮ−末端アミノ酸配列決定 Ｎ−末端アミノ酸配列決定を、製造業者の説明書に従って、473AProtein Sequ encerを用いて、Ｓ．セレビシアエ発現リパーゼに対して行なった。 Ｓ．セレビシアエ発現リパーゼのＮ−末端アミノ酸配列がＡ．オリザエにおい て発現された同じリパーゼのＮ−末端アミノ酸配列（ヨーロッパ特許第305216号 に記載されるような）に比較される場合、Ｓ．セレビシアエ発現の酵素の主要部 分がＡ．オリザエ発現のリパーゼについてのその対応する情報を含むＮ−末端（ 表Ｅ１を参照のこと）で５個の余分なアミノ酸残基(SPIRR−)を含むような差異 が観察された。 表 Ｅ１ 前記表に見られるように、Ｓ．セレビシアエにおいて発現された、分泌性リパ ーゼの主要部分は、５個のアミノ酸SPIRRにより拡張されている（プロ−ペプチ ドから）。余分なアミノ酸残基を含む酵素の相対量は、アミノ酸配列決定におい てPTH−アミノ酸の収量から確立され得る。例２．Ｓ．セレビシアエにおいて発現されるＨ．ラヌギノサ リパーゼのＮ−末 端からのSPIRR−ペプチドの除去 Ｓ．セレビシアエにおいて発現された、上記精製された修飾（“SPIRR”含有 ）リパーゼ4.5mg（0.05ＭのNH₄HCO₃ 1.8mlにおける）に、50mgのウシトリプシン （配列決定品種）を添加し、そしてその混合物を37℃で１時間インキュベートし た。インキュベーション後、トリプシン消化を、50mgよりも多くのダイズトリプ シンインヒビターの添加により停止した。 Ｎ−末端SPIRR−ペプチド付加物の除去は、SPIRRを含む画分が75％から13％に 減じられる場合、Ｎ−末端アミノ酸配列決定により観察された（表Ｅ２を参照の こと）。 表 Ｅ２ 軽いトリプシン処理は、内部アミノ酸配列がアミノ酸配列決定により観察され ないので、その修飾されたリパーゼにおける内部切断をもたらさなかった。また 、トリプシン処理されたリパーゼの比活性は未処理のリパーゼの比活性に匹敵し 、このことは、トリプシン処理が標準のアッセイにおいて酵素活性に影響を及ぼ さないことを示す（表Ｅ３を参照のこと）。 表 Ｅ３ 例３．アスペルギラス・オリザエにおける野生型Ｈ．ラヌギノサリパーゼの製造 ヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼのクローニングは、ヨーロッパ特許第305, 216号に記載されており、これはまた、発現プラスミドp960の使用によるアスペ ルギラス・オリザエにおけるリパーゼの発現及び特徴化を記載する。前記プラス ミドは、ヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼをコードする遺伝子、及びSPIRRペ プチド付加物（リパーゼ遺伝子の一部をコードするペプチドの一部である）をコ ードするDNA配列を含んで成る。Ａ．オリザエ(株IFO4177)におけ る野生型リパーゼの発現は、p960に比較して、わずかに修飾された発現ベクター を用いて、WO95/22615に記載されるようにして実質的に行なわれた（WO95/22615 を参照のこと）。Ａ．オリザエにおいて発現された野生型Ｈ．ラヌギノサ リパーゼの精製 アスペルギラス・オリザエIFO4177からの発酵上清液を遠心分離し、そして細 胞残骸を捨てた。上清液を、0.45ミルの孔サイズのフィルターを通して濾過した 。 次に、上清液を60％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿せしめた。沈殿物を水に 溶解し、そして固体酢酸アンモニウムを添加し、0.8Ｍの最終濃度にした。その 溶液を、0.8Ｍの酢酸アンモニウムにより予備平衡化されたButyl Toyopearlカラ ム上に適用した。結合された酵素を、溶離剤として水及び50％エタノールを用い てのグラジエントにより溶離した。 次に、酵素活性を含む画分をプールし、そしてコンダクタンスを、それが５mS iよりも低くなるように調節し、そしてpHを7.5に調節する。 次に、活性を含む画分を、25mMのトリス−酢酸塩緩衝液(pH7.5)により予備平 衡化されたアニオン交換カラム（たとえば、High pe 緩衝液及び0.5Ｍの塩化ナトリウムを用いての線状グラジエントにより溶離した 。高いリパーゼ活性を含む画分をプールした。例４．親ヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼ発現ベクターの構成及びＥ．コリに おける発現 pSX92(図４を参照のこと)を、HindIIIにより切断し、クレノウポリメラーゼに よりブラント末端化し、そして次に、ClaＩにより切断した。大きなフラグメン トを単離した（Ａ）。pHLL（ヨーロッ パ特許第305,216号、図３及び４を参照のこと）（親リパーゼをコードするDNA配 列を含んで成る）を、BamHＩにより切断し、ブラント末端化し、そしてXhoIIに より切断した。修飾されたリパーゼ遺伝子の成熟部分を含むフラグメントを単離 した（Ｂ）。 Ａ及びＢを、成熟リパーゼの最初の４個のアミノ酸に融合される、スブチリシ ン309シグナルにおける最後の５個のアミノ酸をコードする合成リンカー(KFN 57 5/576)と共に連結した。上方の鎖における前記最後のヌクレオチド“Ａ”は、成 熟リパーゼ遺伝子におけるXhoII部位をBglII部位に変えた。 合成リンカー： KFN 575/576:5'-CGATCGCATCGGCTGCTGAGGTCTCGCAA-3' 3-TAGCGTAGCCGACGACTCCAGAGGCTTCTAG-5' 得られるプラスミド（pSX167）は、成熟リパーゼをコードするDNA配列を含ん でいる。pSX167をPmeＩ及びBamHＩにより切断し、そしてスブチリシン309シグナ ル配列−リパーゼ融合体及び５Ｓターミネーターを含むフラグメントを単離した （1769bp）。このフラグメントを、HincII−BamHＩにより切断されたpUC19中に 連結し、pSX578を創造した。 BstXＩ(pSX167から、654bp)の方の下流の成熟リパーゼをコードするDNAを、PC R技法(“Splicing by Overlap Extension”，Hortonなど.，(1989)，Gene)を用 いて、SphＩからのアクロモバクターリチカス(Achromobacter lyticus)プロテア ーゼＩシグナル配列（図３を参照のこと）に融合した。 プラスミド（pSX578）（図５を参照のこと）を、SphＩ及びBstXＩにより切断 し、そして上記PCR DNAを挿入した（図６）。得られるプラスミドpSX581（図７ を参照のこと）を用いて、Ｅ．コリW3110 lacＩ^qを形質転換した。0.4％ラクト ースを含むLB−培地を含 む振盪フラスコにおいて30℃で72時間、増殖せしめられる場合、その得られる株 は、正常なグリコシル化された親リパーゼ酵素と同じ比活性を有する、グリコシ ル化されていないリパーゼを生成する。例５．Ｅ．コリにおける、ペプチド付加を有するＨ．ラヌギノサリパーゼの作製 pSX581プラスミド（図７を参照のこと）を、BglII／HindIIIにより消化し、そ してベクターフラグメントを、標準の方法を用いてアガロースゲルから精製した 。PCR反応を、鋳型としてpSX581を用いての次のプライマーにより行なった：SPIRR プライマー：プライマー１（配列番号３） ： 5'-AA CAG ATC TTG CGA GAC CTC TCT ACG TAT AGG GCT AGC GAGCGC GGC GCT G AT CG-3'（55-マー）PCR プライマー：プライマー２（配列番号４） ： GTTGTGTGGAATTGTGAGCGG（21-マー） 得られる300bpのフラグメントをSpin 100カラム上で精製し、そしてBglII／Hi ndIIIにより消化し、そして再び、Spin 100により精製した。このフラグメント を、上記ベクターフラグメントに連結した。この得られるプラスミドをpJSO215 と命名し、そしてそれを用いて、Ｅ．コリW3110 lacＩ^qを形質転換した。プラス ミド調製物を形質転換体から製造し、そしてDNA配列決定し、SPIRRペプチド付加 の導入を確証した。例６．アスペルギラス・オリザエJaL125における修飾されたＨ.ラヌギノサ脂肪 分解酵素(HLv9s)の構成及び発現 Ｎ−末端ペプチド付加を、ヨーロッパ特許第305216号から明らかな、それぞれ 、アミノ酸及びDNA配列を有する親Ｈ．ラヌギノサ(DSM4109)脂肪分解酵素に適用 し、そしてさらに、前記DNA配列（ヨーロッパ特許第305216号）におけるその成 熟部分（従来の特定部位 突然変異誘発により挿入された）における次の突然変異、D57G，N94K，D96L，Q2 49Rを行なった。ペプチド付加物SPIRPRPを、次のようにして、親酵素のＮ−末端 に適用した： pIVI220の作製： 前記プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、StratageneからのCham elon二本鎖部位特異的突然変異誘発キットを用いて作製した。 pHL296を、プラスミド鋳型として使用した。前記プラスミドは、pHD464中にク ローン化された上記突然変異(D57G，N94K，D96L，L97M，Q249R)と共に、Ｈ．ラ ヌギノサ脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含む。 プライマー番号7258が、選択プライマーとして使用された。 7258:5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'（配列番号79）（従っ て、耐アンピシリン性遺伝子に見出され、そして切断のために使用されるScaＩ 部位をMluＩ部位に変更する）。 プライマー番号7770が、選択プライマーとして使用された。 7770:5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3'（配列番号80）（アミノ酸配 列を変更しないで、Ｈ．ラヌギノサ リパーゼ遺伝子に見出されるScaＩ部位を 変更する）。 プライマー番号8479が、突然変異誘発プライマーとして使用された。 8479:5'p gcg tgg acg gcc ttg gct agc cct att cgt cct cga ccg gtc tcg cag gat ctg 3（配列番号81）（親Ｈ．ラヌギノサ酵素のプロペプチド及びＮ−末端 Ｅ１を置換する（SPIRPRPによりSPIRREを））。 pIVI245の作製： 前記プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratage neからのChameleon二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号200509) を用いて作製した。 pIVI220をプラスミド鋳型として使用し、そしてプライマー番号7887を選択プ ライマーとして使用した（耐アンピシリン遺伝子に見出され、そして切断のため に使用される、導入されたMluＩ部位をScaＩ部位に変更する）。 7887:5'p-gaa tga ctt ggt tga gta ctc acc agt cac 3'（配列番号77）。 プライマー番号8932を突然変異誘発プライマーとして使用した。 8932:5'p-g aac tgg ata gga aat ttg aag ttc ctg ttg aaa gaa ata aat gac 3 '（配列番号78）（従って、野生型としてＭ97をＬ97に変更し、そして２つの突 然変異N94K及びD96Lを保存する）。２．Ａ．オリザエ発現プラスミドpCaHj483の作製 pCaHj483は図９に示されている。それを、次のフラグメントから構築する： ａ）EcoRＩ及びXbaＩにより切断されたベクターpToC65（WO91/17243）。 ｂ）amdS遺伝子を担持する、Ａ．ニジランスからの2.7KbのXbaＩフラグメント (C．M．Corrickなど.，(1987)，Gene53，p.63-71)。amdS遺伝子は、菌類の形質 転換における選択マーカーとして使用される。amdS遺伝子が修飾され、その結果 、その遺伝子に通常存在するBamHＩ部位が破壊された。これは、サイレント点突 然変異を、プライマー３：AGAAATCGGGTATCCTTTCAG(配列番号６)を用いて導入す ることによって行なわれた。 ｃ）Ａ．ニジランスtpi遺伝子のmRNAの５’未翻訳端をコードする配列の60bp DNAフラグメントに融合されるＡ．ニガー NA2プロモーターを担持する0.6KbのE coRＩ／BamHＩフラグメント。NA２プ ロモーターを、プラスミドpNA２（ヨーロッパ特許第383779号）から単離し、そ してPCRにより60bpのtPi配列に融合した。60bpのtpi配列をコードするプライマ ー（プライマー４：配列番号14）は、次の配列を有した：5'-GCTCCTCATGGTGGATC CCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCA AGCATGGCATCCTTGC-3'。 ｄ）Ａ．ニガー グルコアミラーゼ転写ターミネーターを担持する675bpのXba Ｉフラグメント。このフラグメントは、プラスミドpICAMG/Term(ヨーロッパ特許 第238023号)から単離された。 フラグメントｃ）のBamHＩ部位を、pIC19Rリンカーを通して、フラグメントｄ ）上の転写ターミネーターの前のXbaＩ部位に連結した(XbaＩに対してBamHＩ)。HLv9s 発現プラスミドpCaHj485の作製 プラスミドpJVi245をBamHＩ及びSalＩにより消化し、そしてHLv9s脂肪分解酵 素をコードするその得られる904bpフラグメントを単離した。pCaHj483をBamHＩ 及びSalＩにより消化し、そして大きなベクターフラグメント（6757）を、そのH Lv9sフラグメントに連結した。その連結混合物を用いて、Ｅ．コリDH5α細胞を 形質転換し、そして予測されるプラスミドを有する形質転換体を単離した。その プラスミドを、pCaHj485として命名した。３．JaL125中へのpCaHj485の形質転換 アスペルギラス・オリザエJaL125は、アルカリプロテアーゼを欠いているアス ペルギラス・オリザエIFO4177であり、そしてこれを、ヨーロッパ特許第0531372 号に記載されるようにして、アセトアミドに基づく選択を用いて、pCaHj485によ り形質転換した。形質転換体を２度、胞子再単離した。個々の形質転換体の２回 目の再単離からの胞子を用いて、96ウェルマイクロタイター皿における200 μｌのYPM(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のマルトース)を接種した 。YPM培養物を34℃で４日間、増殖せしめ、そして最高の生成体を、ｐ−ニトロ フェニルブチレートアッセイを用いて選択した： 原溶液：18μｌのｐ−ニトロフェニルブチレートを、１mlのイソプロパノール に溶解した。 実施溶液：0.1mlの原溶液を、50mMのトリス／HCl，pH7.5，10mMのCaCl₂の溶液 10mlと共に混合した。 アッセイ：YPM上清液１μｌを、96ウェルマイクロタイター皿において、実施 溶液200μｌと共に混合し、そして色彩の進行を、ELISA読取り機を用いて450nm で測定した。 １つの形質転換体を、タンク発酵のために選択した。４．JaL125／pCaHj485のタンク形質転換 発酵を、34℃の一定の培地温度及び1.2ｌの開始体積を用いて供給−バッチ発 酵として行なった。培地の初期pHを6.5に設定した。pHが7.0に上昇したらすぐに 、この値を10％ H₃PO₄の添加により維持した。培地における溶解された酸素のレ ベルを、撹拌速度を変え、そして１ｌの空気／培地１ｌ／分の固定されたエアレ ーション速度を用いることによって調節した。供給物添加速度は、全供給−バッ チ相の間、一定レベルで維持された。 バッチ培地は、炭素源としてマルトースシロップ、窒素源として尿素及び酵母 抽出物、及び微量金属及び塩の混合物を含んだ。供給−バッチ相の間、連続して 添加される供給物は、炭素源としてマルトースシロップを含み、そして酵母抽出 物及び尿素は、窒素の十分な供給を確保するために添加された。５．修飾された脂肪分解酵素の精製 １）発酵上清液を、フィルターカタログ番号AP2504700フィルタ ータイプAP25を通して濾過した。 ２）発酵上清液を、Millipore膜タイプGS（0.22ミクロン）からの無菌フィル ターを通してもう１度、濾過した。 ３）次に、発酵上清液を、固体酢酸アンモニウムを添加することによって、0. 8Ｍの酢酸アンモニウムに調整した。 ４）TSKゲルButyl-Toyopearl 650に基づく疎水性クロマトグラフィー。50mlの カラムを、Butyl-Toyopearlマトリックスにより充填した。カラムを0.8Ｍの酢酸 アンモニウムにより洗浄し、そして平衡化した。酢酸アンモニウムにより調節さ れた１ｌの発酵上清液を、Butylカラム上に適用した。カラムを、すべての未結 合材料が洗浄されるまで、0.8Ｍの酢酸アンモニウムにより洗浄した。次に、結 合された材料を、水及び50％エタノールにより連続して溶離した。画分を集め、 そして標準のLUアッセイを用いて、リパーゼ活性について分析した。リパーゼ活 性を含む画分をプールし、そして希釈し、４mSi以下にプールの電導性を調節し 、そしてpHを8.5に調節した。 ５）High performance Q Separose（Pharmacia、コード番号17−1014−01）に 基づくアニオン交換クロマトグラフィー。50mlのカラムを50mMの硼酸緩衝液(pH8 .5)により充填し、そして洗浄した。次に、リパーゼ活性を含むプールを、High performance Q Sepharoseカラム上に適用した。未結合材料を、硼酸緩衝液(pH8. 5)により洗浄した。結合された活性を、１Ｍの塩化ナトリウムを含む硼酸緩衝液 (pH8.5)を用いて線状グラジエントにより溶離した。画分を集め、そしてリパー ゼ活性についてアッセイした。A280及びA260で1.7以上のUV吸光度の割合を有す るリパーゼ活性を含む画分をプールする。例７．ペプチド付加物を有するＨ．ラヌギノサ リパーゼの３循環 洗浄性能 ヨーロッパ特許第305216号に記載されるヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼ及 びその変異体（すなわち、本発明の修飾された脂肪分解酵素）の洗浄性能を、30 ℃で、一定温で20分間のモデル洗浄システムにおいて、赤色に着色されたラード により汚された綿の布ぎれに対しての３−循環洗浄性能試験（上記の材料及び方 法に記載される）を用いて試験した。試験は、１ｌ当たり０，0.075，0.188，0. 375，0.750，2,500mgのリパーゼ濃度で実施された。 4.2ｇ／ｌのヨーロッパタイプの粉末洗剤組成物（上記のような）を、この 試験において使用した。洗剤は、本発明の修飾されたリパーゼの添加の前、いづ れの酵素も含まなかった。洗剤を、約18°dH(German Hardness)の水に溶解した 。洗浄液体のpHは約10であった。６枚の布ぎれを、100mlの洗浄液体において洗 浄した。洗浄に続いて、布ぎれを15分間、水道水において流し、そして次に、室 温で一晩、空気乾燥せしめた。 ３洗浄循環を、個々の洗浄循環の間、一晩の乾燥を伴って実施した。 ３回目の洗浄循環の後、アスペルギラス オリザエにおいて発現される、本発 明の修飾されたリパーゼ及び親リパーゼの性能を評価した。これは、上記のよう にして改良因子（ｆ改良）を計算することによって行なわれた。 それらの試験の結果は、下記表Ｅ４に示される。 表 Ｅ４ 親ヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼに適用されたペプチド付加(すなわち、S PIRR)が洗浄性を少なくとも２倍にすることが表Ｅ４から見出され得る。例８．付加物を含む修飾されたＨ．ラヌギノサ リパーゼの一循環洗浄性能 一循環洗浄性能試験（上記の材料及び方法に記載される）を、５ｇ／ｌの酵素 不活性化されたAriel^TM Futur（Procter and Gamble）において、SPIRR−ペプチ ド付加を有し、及びその付加を有さない、表Ｍ１のヒュミコラ・ラヌギノサ リ パーゼ変異体により行な った。試験は、０，1250，12500 LU／ｌのリパーゼ単位で実施された。 洗剤は、約18°dH(German Hardness)水に溶解された。洗浄液体のpHは約10.3 であった。 布から除去された、ソックスレー抽出された脂肪物質の量を、下記表に示す。 ペプチド付加物を有し、及びそれを有さない対応するリパーゼ変異体が個々に列 挙されている。 表 Ｍ５ nd：測定されなかった。 上記結果は、ペプチド付加を有するリパーゼ変異体が、ペプチド付加物を有さ ないその対応するリパーゼ変異体に比較して有意に改良された一循環洗浄性能を 有することを明白に示す。例９．Ｈ．ラヌギノサ リパーゼのＮ−末端付加物の部位特異的突 然変異誘発 SPIRR Ｎ−末端付加物を有するヒュミコラ・ラヌギノサ リパーゼにおける突 然変異誘発を、上記の材料及び方法セクションに記載される方法を用いて行なっ た。 最初に、リパーゼをコードする遺伝子を、プラスミドpHD414中に挿入した。次 に、pHD414のアンピシリン遺伝子のScaＩ部位を、Mlu１部位に変更した。次に、 リパーゼ遺伝子に存在するユニークScal部位を除去した。 所望の突然変異(すなわち、SPIRPRP)を、所望する突然変異を含んで成る次の オリゴの付加によりリパーゼ遺伝子のＮ−末端に導入した：オリゴ8479（配列番 号５）： 5'-P GCG TGG ACG GCC TTG GCT AGC CCT ATT CGT CCT CGA CCG GTC TCG CAG GAT CTG-3' これは、SPIRPRP Ｎ−末端ペプチド付加物を有するＨ．ラヌギノサ リパーゼ 遺伝子をもたらした。例10．ランダム突然変異誘発によるＮ−末端付加物の作製 成熟Ｈ．ラヌギノサ脂肪分解酵素（DSM4109から得られる）の初めのアミノ酸 残基に付加されるＮ−末端付加SPIRPRPをコードし、そしてその成熟部分に次の 追加の突然変異：D57G＋N94K＋D96L＋L97M＋Q249Rを含むDNA配列の部分のランダ ム突然変異誘発を行なった。親脂肪分解酵素の成熟部分の突然変異は、WO95/262 15に記載される方法を用いて、適切なプライマー配列を用いてのPCR駆動された 特定部位突然変異誘発により行なわれた。そのペプチド付加物SPIRPRPは例９に 記載されるようにして適用された。 SPIRPRPコドンのヌクレオチドドーピングスケムは次の通りであった： オリゴ１：5'-GCG TGG ACG GCC TTG GCC 86(T/A)66(A/T)58(T/A) 67(T/A)66(T/A)57566(T/A) GAG GTC TCG CAG GAT CTG-3'（57-マー）（配列番号8 2）。 数字は、使用される次のフラスコの番号を言及する。フラスコ５ ：80％ Ａ；6.66％ Ｃ；6.66％ Ｇ og 6,66％ Ｔ。フラスコ６ ：80％ Ｃ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｇ og 6,66％ Ｔ。フラスコ７ ：80％ Ｇ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｃ og 6,66％ Ｔ。フラスコ８ ：80％ Ｔ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｃ og 6,66％ Ｇ。 ２段階PCR反応プロトコールが使用された：５’プライマーとして上記プライ マー及び３’プライマーとしてプライマー2056(5’gca cgt aat gtt tgt acc 3' )を有する第１段階は、プラスミド鋳型としてpHL296を用いて行なわれた。第１ 回目のPCRの生成物が、５’プライマー（BamHＩ部位及びコード配列の最初の部 分を導入するための）として4699(5’cgg tac ccg ggg atc cac 3')及び３’プ ライマーとしてPCR生成物を有する新規のPCRに使用された。得られる生成物を、 Spin 100（Clonetech Lab.，Inc.からの）上で精製し、そしてBamHＩ及びPvuII により切断した。得られるDNAフラグメントを、SpinX(Costar)によりアガロース ゲルから精製し、そしてBamHＩ及びPvuIIにより切断されたBamHＩ−XbaＩフラグ メントとしてクローン化されたpHL296からのＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素遺伝子 を含む酵母発現ベクターpJSO37中に連結した。その得られるDNAを用いて、従来 の技法により、DH10／DH12 Ｅ．コリ細胞（Gibco/BRG Lifetechnologies）を電 気形質転換した。 Ｅ．コリの形質転換及び増幅の後、プラスミドを精製し、そしてＳ．セレビシ アエYNG318を形質転換した。得られるＳ．セレビシアエ細胞を、洗剤(３ｇ／ｌ のPCS)を含む他のリパーゼフィルターアッセイにおける良好な実施体についてス クリーンした。陽性体を配列決定し、そして前記材料及び方法セクションにおけ る表１から 明らかなペプチド付加物(HLv10s1−10として同定される)を含むことが見出され た。 個々のHL10s1−６の一循環洗浄性能を、30℃の温度で及び５ｇ／ｌの不活性化 されたAriel Futureを洗剤として用いて、上記の材料及び方法セクション（一循 環洗浄性能）に記載されるようにして試験した。個々の修飾された酵素により除 去される脂肪材料の量が、下記に示される： 良好な実施体がそのＮ−末端付加物により正に荷電されたアミノ酸を有する傾 向が存在した。 同様に、Ｈ．ラヌギノサ リパーゼ変異体Ｅ１^*，D57G，N94K，D96L，L97M，Q 249R及び他の変異体に付加されるＮ−末端付加RPRPRPRPのランダム突然変異誘発 を行なった。RPRPRPRPコドンのヌクレオチドドーピングスケムは、次の通りであ る。 オリゴ２：5'-GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG GCG GCG CCA CCT CCA 67(T/A)66 (T/A)575 66(T/A)67(T/A)66(T/A)57566(T/A)( 6/7)(7/8)(C/G)57(C/G)C57(5/7)5(C/G)CTG TTT AAC CAG TTC AAT CTC-3'（93-マ ー）（配列番号82）フラスコ５ ：80％ Ａ；6.66％ Ｃ；6.66％ Ｇ og 6,66％ Ｔ。フラスコ６ ：80％ Ｃ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｇ og 6,66％ Ｔ。フラスコ７ ：80％ Ｇ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｃ og 6,66％ Ｔ。フラスコ８ ：80％ Ｔ；6.66％ Ａ；6.66％ Ｃ og 6,66％ Ｇ。 APPPを、Ｎ−末端付加物のタンパク質分解に対して保護するために、ランダム 突然変異誘発されたRPRPRPRPのＮ−末端に及びシグナルペプチドの前に付加する 。これは必要とされなくても良い。Ｅ１を、１つの負に荷電されたアミノ酸を除 去するために欠失せしめた。成熟Ｈ．ラヌギノサ リパーゼ配列の位置２〜５に おけるアミノ酸をまた、リパーゼのこの非構造部分における改良された変異体を 見出すために、突然変異誘発した。他方、この方法は、SPIRPRPのランダム突然 変異誘発について上記で言及された通りであった。次のＮ−末端ペプチド付加物 を得た： Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Leu-Leu-Pro-Ile-Ser（APPPR PRLLPIS）（欠失 されたＥ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその非構造Ｎ−末端部分に追 加の突然変異D5Eを担持する）。 Ala-Pro-Pro-Pro-Thr-Arg-Gln-Arg-Gln-Ser-Pro（APPPTRQRQSP）（欠失された Ｅ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその非構造Ｎ−末端部分に追加の突 然変異V2L，S3T及びD5Vを担持する）。 Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Ile-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro（APPPRTIPRSSP）(欠失さ れたＥ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその非構造Ｎ−末端部分に追加 の突然変異V2L，S3R及びD5Eを担持する)。 Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro（APPPRPRPRPRP）(欠失さ れたＥ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその 非構造Ｎ−末端部分に追加の突然変異V2G及びD5Eを担持する)。 Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Ser（APPPRTRPRPRS）(欠失さ れたＥ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその非構造部分に追加の突然変 異V2GL，S3T，Q4P及びD5Eを担持する)。 Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Ala-Ser-Pro-Arg-Gln-Arg-Pro（APPPKASPRQRP）(欠失さ れたＥ１残基の他に、この変異体は、成熟酵素のその非構造部分に追加の突然変 異V2GL，D5Q及びL6Mを担持する)。例11．ペプチド付加物を含んで成るPs．セパシア リパーゼ変異体の作製 ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）として最近、再分類さ れた、WO89/01032（Novo Nordisk A/Sからの）に記載されるシュードモナス・セ パシアSB10，DSM3959からのリパーゼ遺伝子をクローン化し、そしてＥ．コリに おけるリパーゼの温度−誘発性発現を、プラスミドpAHE２の使用により得た。SJ 1503株は、pAHE２を含むＥ．コリJA221である。 Ｎ−末端延長を有する変異体リパーゼを発現するベクターを構成するために、 pAHE２に存在する２つのユニーク制限部位、すなわちリパーゼシグナルペプチド コード配列の数９個のコドンの方におけるユニークBstXＩ部位、及びプロセッシ ング部位から約７個のコドンの下流における、すなわち成熟リパーゼのための配 列の開始部分におけるユニークMluＩ部位が使用された。 PCRプライマーを、この領域を通しての増幅を可能にするよう企画し、そして このプライマーは、Ｎ−末端延長部をコードする配列を包含するMluＩ部位から 上流を読み取る。すべてのプライマーは、それらの最５’端にEcoRＩ部位を組込 んでいる。 次の配列が、Ｎ−末端延長部をコードするよう選択された： PCR増幅のために、プライマーLWN9476を、プライマーLWN9470-LWN9475の個々 及び鋳型としてのpAHE２と組合して使用した。アニーリング温度は70℃であり、 そして反応は２％のDMSOの存在下で行なわれ；他方では、標準の条件及びTaq^TM ポリメラーゼを用いた。 増幅されたフラグメントを２％アガロースゲルから精製し、BstXＩ及びMluＩ により消化し、pAHE２から得られた7.1kbのBstXＩ−MluＩフラグメントに連結し 、そしてその結合混合物を用いて、Ｅ．コリSJ６をエレクトロポレーションによ り耐アンピシリン性に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン(200mg／ml) を含むLBプレート上に、30℃で配置した。 レプリカプレーティングにより、コロニーを、リパーゼスクリーニングプレー ト（寒天１ｌ当たり、20mlのSigna Lipase Substrate（カタログ番号800−１） 及び４mlの１％ Brilliant Green（Merck、商品番号1.01310）溶液を含む）に移 し、これを42℃でインキュベートした。最終的に、リパーゼ活性を示す緑色の輪 が、個々の 形質転換混合物からのいくつかのコロニーのまわりに進行した。 リパーゼ陽性コロニーを再分離し、プラスミドを抽出し、そしてBstXＩ−Mlu Ｉ領域のDNAを配列決定した。次の株が維持された： SJ3606(SJ６／pSJ3606)；これはSPIRPRPコード付加物を含み、そしてまた、ア ラニンからバリンに変更された生来の成熟酵素にその第２コドンを有する。 SJ3608(SJ６／pSJ3608)；これはSPRPコード付加物（挿入体TCT CCG CGC CCGの DNA配列）を含む。STRRPRPコードの付加物を生成する試みにおいて、変異体とし て得られた。 SJ3708(SJ６／pSJ3708)；これは、SPIRRコード付加物を含む。 SJ3717(SJ６／pSJ3717)；これは、SPIRPRPコード付加物を含む。 SJ37l8(SJ６／pSJ3718)；これは、SPIRPRPコード付加物を含む。 SJ3719(SJ６／pSJ3719)；これは、TAIRPRKコード付加物を含む。 SJ3720(SJ６／pSJ3720)；これは、STRRPRPコード付加物を含む。 SJ3721(SJ６／pSJ3721)；これは、GPIRPRPコード付加物を含む。例12．Ps．セパシア リパーゼ変異体の振盪フラスコ発酵 例11において供給される培養物を、TY−アンピシリンプレート（pH７）上で増 殖せしめ、そしてアンピシリン(100mg／ml)を含む、二倍に濃縮されたTY−培地 （pH７）100mlを含む振盪フラスコを接種するために使用した。接種物を、リパ ーゼ生産性（材料及び方法セクションに記載されるようにして）について、イン ジケータープレート上をストリークすることによって調べ：すべての細胞はリパ ーゼ陽性であることが見出された（プレートを、30℃で２日間インキュベートし 、次に40℃に１日間、移した）。 振盪フラスコを、その培養物が2.8〜5.3の光学密度(578nm)に達するまで、30 ℃で275rpmで６時間、振盪しながらインキュベートした。次に、培養物を40℃に さらに17時間、移した。Ps ．セパシア培養物におけるリパーゼ生成の調査 培養物を収穫し、遠心分離（9000rpmで20分間）、上清液を捨て、そしてペレ ットをNaCl(0.9％ NaCl 0.5ml)に再懸濁し、そして音波処理した（氷上で、２分 間、連続して）。その音波処理されたペレットを、pH7.0で基質としてトリブチ レートを用いる滴定法を用いて、リパーゼ単位（LU）を測定するために使用した 。 １つの株（SJ3720）を除く他のすべての８種の株は、下記表に示されるように 、リパーゼ活性を示した。例13Ps ．セパシア リパーゼ変異体の特徴付け 例11に記載される株から生成されるリパーゼを、PCSプレートスクリーニング アッセイを用いて、洗剤の存在下での活性に関して特徴づけた。１組のサンプル を、上記のようにして増殖せしめられ、細胞収穫され、そしてリパーゼを生成す るよう音波処理により溶解された、SJ1503，SJ3606及びSJ3608株から調製した。 １ml当たり約230のLUを含むサンプル15mlを、洗剤を含まないか、又はそれぞれ1 .5及び3.5g／ｌの洗剤を含む、スクリーニングプレートにおけるウェルに適用し た。プレートを、37℃で一晩インキュベートし、そしてウェルのまわりに形成さ れる緑色の領域の直径を測定した。 次の結果が得られた： 株 SJ1503 SJ3606 SJ3608 洗剤 な し 17mm 15mm 16mm 1.5グラム／ｌ 7mm 13mm 10mm 3.5グラム／ｌ 0mm 8mm 6mm 緑色の領域は、高い洗剤濃度では観察されなかった。 もう１組のサンプルを、酢酸セルロースフィルター上にSJ1503，SJ3708、及び SJ3717−SJ3721株をプレートすることによって調製し（個々のフィルターはすべ ての７種の株を含む）、これを37℃で一晩、アンピシリン(200mg／ml)を含むLB プレート上に配置し、次に、フィルターを有するそれらのプレートを42℃で５時 間インキュベートし、この後、フィルターを、37℃で一晩インキュベートされた スクリーニングプレートに移した。 明白な緑色領域が、洗剤を含まないプレート上のすべてのコロニ ー下で進行し；SJ3720は、リパーゼの減じられた発現のために、残りの株よりも 有意に小さな領域を生成した。 緑色の領域はまた、1.5ｇ／ｌの洗剤を含むプレート上のすべてのコロニ一下 に観察された。しかしながら、生来の修飾されていないリパーゼを生成するSJ15 03から生成される領域は、他の株から生成される領域に比較して、有意に減じら れた。 3.5ｇ／ｌの洗剤を含むプレート上において、緑の着色はSJI503からは進行 せず、ところが、緑色がかった株は、修飾されたＢ．セパシア リパーゼを発現 するいくつかの株、特にSJ3717，SJ3718及びSJ3721からまだ識別できた。 従って、上記のように、生来の成熟リパーゼに対してＮ−末端付加物をコード するようＢ．セパシア リパーゼ遺伝子の修飾は、洗剤の存在下で、生来のリパ ーゼに比較して改良された活性を有するリパーゼの生成を可能にする。例14．10ｌのタンクにおけるSJ1503及びSJ3717の発酵 振盪フラスコについて記載される方法を、10ｌ規模での発酵のために使用した 。使用される培地は、バクト トリプトン400ｇ、バクト酵母抽出物200ｇ、グル コース×2H₂O 500ｇ、アンピシリン１ｇ，Pluronic １mlを含んだ。pHは7.1で 一定に維持され；温度は７時間30℃であり、次に40℃に調節された。細胞を16時 間後、遠心分離により収穫し、そして細胞を高圧ホモジナイザー(800バール)を 用いて開放した。Ｅ．コリにおいて発現されたＢ．セパシアの精製 SJ1503及びSJ3717からの10ｌの発酵ブイヨンからのＥ．コリ細胞を、遠心分離 し、そして上清液を捨てた。細胞を、800バールの圧力下で、rannieホモジナイ ザーを用いて開放した。均質化された細胞を、350×ｇで60分間、遠心分離した 。細胞上清液をデカントし た。 １．塩沈殿 活性を含む上清液を、室温で35％の飽和への固体硫酸アンモニウムの添加によ り沈殿せしめた。沈殿は室温で２時間を要し、そして350×ｇで１時間、遠心分 離した。上清液をデカントし、そして捨てた。活性を含む沈殿物を、30％エタノ ールに溶解し、不溶性材料へのリパーゼ活性の疎水性結合を回避した。 30％エタノールに溶解された材料から不溶性材料を除去するために、前記溶液 を遠心分離した。リパーゼ活性を上清液として回収しそして不溶性材料を捨てた 。活性を含む上清液を濃縮し、そして10KDaのカットオフを有するAmicon膜を用 いて限外濾過により、25mMのトリスーアセテート（pH８）に対して透析した。次 に、濃縮されたサンプルを、５倍に希釈し、活性を含む上清液におけるいづれか の残留するエタノールを減じた。 ２．疎水性クロマトグラフィー 活性を含む上記サンプルを、固体酢酸アンモニウムを添加することによって0. 8Ｍの酢酸アンモニウムに調節した。50mlのToyopearl Butylカラム(Tosho Hass ，Japan)を、0.8Ｍの酢酸アンモニウムにより充填し、そして平衡化した。次に 、リパーゼ活性を含む上記段階からのサンプルを0.8Ｍの酢酸アンモニウムに調 節し、そしてToyopearl Butylカラム上に適用した。すべての活性は、マトリッ クスに結合する。未結合材料を、その流出液のUV吸光度が280nmで0.05以下にな るまで、0.8Ｍの酢酸アンモニウムにより洗浄した。結合された活性を、50％エ タノールを含む25mMのトリス酢酸緩衝液により溶離した。リパーゼ活性を含む画 分をプールし、そして25mMのトリス酢酸緩衝液(pH8.5)に対して透析した。 ３．アニオン交換クロマトグラフィー 50mlのカラムを、アニオン交換体High performance Q−セファロース(Pharmac ia)により充填した。カラムを、25mMのトリス酢酸緩衝液(pH8.5)により洗浄し、 そして平衡化した。透析されたサンプルをカラム上に適用した。未結合活性をト リス緩衝液を用いることによって洗浄した。 結合された活性を、トリス緩衝液（pH８）中、０〜0.5ＭのNaClの線状塩グラ ジエントにより溶離した。流速は２ml/分であり、そして溶離のために使用され る緩衝液の合計量は10カラム体積であった。リパーゼ活性を含む画分をプールし 、そしてPCSプレートアッセイにおいて性能について試験した。 より特定には、回収された修飾リパーゼの個々の３LUを、PCSプレート（この 後の例15を参照のこと）の穴中に添加し、そして37℃で一晩インキュベートした 。18時間後、次の結果が得られた： 株 SJ1503 SJ3717 洗 剤 な し 17mm 13mm 0.5ｇ／ｌ 6mm 10mm 1.0ｇ／ｌ 4mm 7mm 従って、ペプチド付加物の存在が得られる有意に高い洗浄性能をもたらすこと が見出され得る。例15．Ｎ−末端ペプチド付加を有する修飾されたＨ．インソレンス脂肪分解酵素 の作製 親脂肪分解酵素をコードする遺伝子を、WO96/13580に実質的に記載されるよう にして、ヒュミコラ・インソレンスDSM1800から単離した。３種の異なったペプ チド付加物を、プラスミド鋳型としてプラスミドpIVI303を用いて、成熟酵素の Ｎ−末端に適用した。 pIVI303の構成：アミノ酸配列の変化を伴わないで、ATGから304〜369塩基下流 の領域に突然変異を含むＨ．インソレンス脂肪分解酵素変異体をコードし、そし てChameleon二本鎖キットの使用を妨げるかも知れない可能な第２DNA構造体を除 去する。 プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Chameleon二本鎖部位特異 的突然変異誘発キット(Stratagene；カタログ番号200509）を用いて構成した。 pIVI296をプラスミド鋳型として、及びプライマーNo.7258を選択プライマーと して使用した。 7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' （従って、耐アンピシリン性遺伝子に見出され、そして切断のために使用される ScaＩ部位をMluＩ部位に変更する）。 プライマー番号9349を突然変異誘発プライマーとして使用した： 9349：5'p gag tcc cac atc cga aac atc tgg ata caa gga gta gga gga cct ta c gac gcc gcg 3'。 １．変異体：突然変異PPRRPR（生来のＨ．インソレンス プロペプチドにおけ るPELVARの代わりに）を含むHILv4s pIVI335の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Chameleon二本鎖部位特異 的突然変異誘発キット（Stratagene；カタログ番号200509）の使用により作製し た。pIVI303を、プラスミド鋳型として使用した。 プライマーNo.7887を、選択プライマーとして使用した： 7887：5'p-gaa tga ctt ggt tga gta ctc acc agt cac 3'（耐アンピシリン性遺 伝子に見出され、そして切断のために使用される導入されたMlu１部位をScaＩ部 位に変更する）。 プライマー番号19473を突然変異誘発プライマーとして使用した ： 19473：5'p ac cat acc ccg gcc gct cct cct agg cgt cct cgg cag ctg gga gc c 3。 ２．変異体：突然変異SPPRRP（生来のＨ．インソレンス プロペプチドにおけ るELVARQの代わりに）を含むHILv1s pIVI359の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratagene（カタログ番号 200509）からのChameleon二本鎖特定部位突然変異誘発キットの使用により作製 した。pIVI303を、プラスミド鋳型として使用した。プライマー番号7887（上記 を参照のこと）を、選択プライマーとして使用した。プライマー番号21992を、 突然変異誘発プライマーとして使用した： 21992：5'p ac cat acc ccg gcc gct cct agc cct ccg cgg cgg ccg ctg gga gc c atc gag aac ggc 3'。 ３．変異体：突然変異SPPRP（生来のＨ．インソレンス プロペプチドにおけ るELVARQの代わりに）を含むHILv2s pIVI360の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratagene（カタログ番号 200509）からのChameleon二本鎖部位特異的突然変異誘発キットを用いて作製し た。pIVI303をプラスミド鋳型として使用し、そしてプライマー番号7887を選択 プライマーとして使用した。次のプライマーを、選択プライマーとして使用した ： 5'p ac cat acc ccg gcc gct cct agc cct ccg cgg ccg ctg gga gcc atc gag a ac ggc 3'。 ４．変異体：突然変異SPIRK（生来のＨ．インソレンス プロペプチドにおけ るELVARQの代わりに）を含むHILv3s pIVI361の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratagene（カタログ番号 200509）からのChameleon二本鎖特定部位突然変異誘発キットを用いて作製した 。pIVI303をプラスミド鋳型として使用し、そしてプライマー番号7887を選択プ ライマーとして使用した。プライマー番号21994を突然変異誘発マライマーとし て使用した： 21994：5'p ac cat acc ccg gcc gct cct agc cct ata cgt aag ctg gga gcc at c gag aac ggc 3。 ５．Ａ．オリザエ発現ベクターの作製 pA2L79の作製は、WO96/13580の例２に記載される。そのプラスミドは、Ａ．オ リザエ発現プラスミドpD414中に挿入されるＨ．インソレンス脂肪分解酵素cDNA 配列を含む。pA2L79を制限酵素HindIII及びXhoＩにより切断した。cDNA配列をコ ードする脂肪分解酵素を含むフラグメント（1088bp）を、アガロースゲルから精 製した。pHD414を制限酵素HindIII及びXhoＩにより切断し、そしてベクターをア ガロースゲルから精製した。その精製されたベクターフラグメント（pHD414）及 びリパーゼ含有フラグメントを連結し、従ってpIVI29６を創造した。 上記発現ベクターの個々を用いて、上記の材料及び方法セクションに開示され る一般的な形質転換法の使用によりＡ．オリザエIFO4177を形質転換した。個々 のタイプの１つの形質転換体を、それぞれ、HILv1−4sとして単離した。Ｈ．イ ンソレンス形質転換体を、500mlのYPM培地（10ｇ／ｌのバクト酵母抽出物、20ｇ ／ｌのバクトペプトン、20ｇ／ｌのマルトースを含む）における振盪フラスコに おいて30℃で３日間、増殖せしめた。 発酵上清液を、修飾されたＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素について、記載される ようにして濾過した。 精製段階１：１ｌの発酵上清液をpH８に調節し、そして上清液の 伝導性が４mSi以下になるように希釈した。 段階１：アニオン交換体DE-AE50に基づく発酵上清液のバッチ処理。Pharmacia からのDEAE−Sephadex A50を、適切な孔サイズを有する焼結ガラス漏斗を用いて 、25mMのトリス酢酸緩衝液（pH８）により洗浄し、そして平衡化した。次に、発 酵上清液を、焼結ガラス漏斗を用いて、DEAE Sephadex A50上に適用した。Ｈ． インソレンスからの脂肪分解活性はpH８でアニオン交換体に結合せず、そしてDE AE Sephadex A50から流出液として集められた。 段階２：DEAE Sephadexからの流出液のpHを、希酢酸を添加することによって4 .5に調節した。伝導性をまた、水を添加することによって、４mSi以下に調節し た。SP−Sepharoseに基づくカチオン交換クロマトグラフィー。50mlのカラムを 、SP Sepharose Fast Flow Code番号17−0729−01(Pharmacia)により充填した。 次に、カラムを、25mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)により洗浄し、そして平 衡化した。pH4.5に調節され、そして４mSi以下の伝導性に調節された、脂肪分解 活性を含むサンプルを、SP−Sepharoseカラム上に適用した。未結合材料を、25m Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)を用いて洗浄した。次に、SP−Sepharoseに結 合された脂肪分解活性を、１Ｍの塩化ナトリウムを含む25mMの酢酸緩衝液(pH4.5 )における線状塩グラジエントにより溶離した。脂肪分解活性を含み、そして1.8 よりも高いA280／A260でのUV吸光度の割合を有する画分をプールした。サンプル の純度を、SDS−PAGEに基づいて調べた。Ｎ−末端ペプチド付加物の確認 HILv1s脂肪分解酵素のＮ−末端アミノ酸配列を決定した（すなわち、プロペプ チドにおける最後の５つのアミノ酸残基及び成熟酵素における最初のアミノ酸残 基（ELVARQ）がSPPRRPにより置換されている変異体における）。 見出されるＮ−末端アミノ酸配列は、置換された配列における最後の３個のア ミノ酸残基及び置換に続く最初の４個のアミノ酸残基に対応するArg-Arg-Pro-Le u-Gly-Ala-Ile-であった。 HILv2s脂肪分解酵素のＮ−末端アミノ酸配列を決定した（すなわち、プロペプ チドにおける最後の５つのアミノ酸残基及び成熟酵素における最初のアミノ酸残 基（ELVARQ）がSPPRPにより置換されている変異体における）。 見出されるＮ−末端アミノ酸配列は、置換された配列における最後の２つのア ミノ酸残基及び置換に続く最初の６個のアミノ酸残基に対応するArg-Pro-Leu-Gl y-Ala-Ile-Glu-Asnであった。例16．修飾されたヒュミコラ インソレンス脂肪分解酵素の特徴付け それぞれ、HILv1s，HILv2s，HILv3s株により生成された、ペプチド付加物を含 んで成る修飾された脂肪分解酵素（例21に記載される）及び野生型株HILを、0.5 ｇ／ｌ，1.0ｇ／ｌ及び1.5ｇ／ｌのPCS−洗剤を含むPCS−プレート上でのリパー ゼ活性に関して特徴化した。 25μｌ（５LUに対応する）の精製された修飾HILvs1，HILvs2及びHILvs3、及び 野生型HILリパーゼを、ピペット（４mm）によりPCS−プレートに製造された穴中 に入れ、そしてそれぞれ、３及び６時間インキュベートした。 試験の結果は、下記表において示される： FY−洗剤を含むPCS−プレート上での３時間のインキュベーション。 PCS−洗剤を含むPCS−プレート上での６時間のインキュベーション。 前記表から見出され得るように、修飾されたリパーゼ変異体（すなわち、HILv 1s，HILv2s及びHILv3sにより生成された）は一般的に、野生型リパーゼよりもPC S−洗剤の存在下でより高いリパーゼ活性を有する。例17．Ｃ−末端延長部を有する修飾されたＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素の作製 Ｃ−末端ペプチド付加物を、Ｎ−末端ペプチド付加物SPIRPRP及び内部突然変 異D57G，N94K，D96L，Q249Rを含むＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素変異体HLv12sに 付加した。 １．変異体HLv13s（Ｃ−末端ペプチド付加物：270R，271R，272P 、停止コドンを有するHLv12s） プラスミドpS14−１の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratagene（カタログ番号 200509）からのChameleon二本鎖部位特異的突然変異誘発キットを用いて作製し た。pIVI245をプラスミド鋳型として使用し（pIVI245の作製は、例６に記載され る）、そしてプライマー番号7258を選択プライマーとして使用した。 7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'（従って、耐アンピシ リン性遺伝子に見出され、そして切断のために使用されるScaＩ部位をMluＩ部位 に変更する）。 プライマー番号20694を、突然変異誘発プライマーとして使用した： 20694：5'p-gg gac atg tct tcg acg acc gta gcg gct ggg tcg act c 3。 ２．変異体HLv14s（突然変異：270R，271R、停止コドンを有するHLv12s） プラスミドpS20−２の作製： プラスミドを、記載されるプロトコールに従って、Stratagene（カタログ番号 200509）からのChameleon二本鎖部位特異的突然変異誘発キットを用いて作製し た。pIVI245をプラスミド鋳型として使用し、そしてプライマー番号7258を選択 プライマーとして使用した。 7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'（従って、耐アンピシ リン性遺伝子に見出され、そして切断のために使用されるScaＩ部位をMluＩ部位 に変更する）。 プライマー番号20695を、突然変異誘発プライマーとして使用した。 20695：5'p-gg gac atg tct tcg gcg gta ggc gcg gct ggg tcg ac 3'。酵素変異体の生成 酵素を、同時形質転換段階のためにプラスミドpToC(202、及び宿主細胞として Ａ．オリザエJAL125を用いて、例６に記載される態様に類似する態様で生成した 。HLv12s におけるＣ−末端拡張部の存在の確認 Ｃ−末端拡張部Arg-Arg-Pro（RRP）を含むHLv12sのサンプル１mgを、リシル特 異的プロテアーゼによる分解の前、標準の方法を用いてＳ−カルボキシサミドメ チル化した。得られるペプチドを逆相HPLCを用いて分離し、そして集められた画 分を、マトリックス助力のレーザー脱着イオン化運航時間質量分析法（matrix a ssisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry）に ゆだねた。3906.7Daの実験質量を有するペプチドを含む画分が見出された。この 質量は、3906.4DaであるRRP拡張部を含むHLv12sのＣ−末端ペプチドの理論的質 量に同一な実験誤差内にある。 この画分におけるペプチドのアミノ酸配列は、下記の通りであることが決定さ れた： Ile-Glu-Gly-Ile-Asp-Ala-Thr-Gly-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Asn-I1e-Pro-Asp-Il e-Pro-Ala-His-Leu-Trp-Tyr-Phe-Gly-Leu-Ile-Gly-Thr-Cys-Leu-Arg-Arg-Pro、 ここでこの配列は、HLv12sのＣ−末端ペプチドの正しいアミノ酸配列であり、そ してそれはＣ−末端拡張部Arg-Arg-Proを含む。Ｃ−末端延長 ： 洗浄結果：５ｇ／ｌの不活性化されたAriel Future，20分、１循環TOM，30℃ ，18°dH。酵素は、洗浄溶液１ｌ当たりのmgの酵素タンパク質として適量に分け られた。 HLv13s：SPIRPR＋D57G，N94K，D96L，Q249R，270R，271R，272P HLv14s：SPIRPR＋D57G，N94K，D96L，Q249R，270R，271R 例18. HLv15s（これは、Ｎ−末端ペプチド付加物SPIRPR、及びＨ．ラヌギノサ脂肪分 解酵素の成熟部分における次の突然変異：EP，D57G，N94K，D96L，L97M，Q249R を含む）のＮ−末端拡張の部分を、クロストリパイン(clostripain)（EC3．４． 22.8；Sigma番号Ｃ−0888）と共に長時間のインキュベーションにより切断した 。 インキュベーション混合物は次のものを含んだ：2.5mMのDTT及び１mMの塩化カ ルシウムを含む25mMのリン酸ナトリウム溶液(pH7.4)において、HLv15s（１mg／m l）及びClostripain（20μｇ／ml）。 クロストリパインと共にインキュベーションする前、リパーゼの60％は損なわ れていないプロペプチド(Ｎ−末端アミノ酸配列SPIRPRP)を担持するが、ところ がその10％は最初のSer−残基を失ない(Ｎ−末端アミノ酸配列PIRPRPV)、そして 30％はプロペプチドの最初の５個のアミノ酸残基を失なった(Ｎ−末端アミノ酸 配列RPVSQDL)。 周囲温度での62時間のインキュベーションに続いて（HLv15s−Ｃをもたらす） 、リパーゼの60％はプロペプチドの最初の４個のアミノ酸残基を失ない（次のペ プチド拡張部PRPVSQをもたらす）、20％は５個のアミノ酸残基を有さず（従って 、ペプチド拡張部RPVSQDを 有する）、そして残りの20％は６個のアミノ酸残基を失なった（従って、ペプチ ド拡張部PVSQDLを有する）。 プロペプチドプロセッシングを、Ｎ−末端アミノ酸配列決定を用いて決定し、 そして与えられる％はおおよその値であることが注目されるべきである。 クロストリパインにより処理された、修飾された脂肪分解酵素による一循環洗浄 性能 一循環洗浄性能試験（上記の材料及び方法セクションに記載されている）を、 クロストリパインにより処理されたＨ．ラヌギノサリパーゼ変異体HLv15sにより 行なった。洗浄試験は、クロストリパイン処理されたサンプル及び非クロストリ パイン処理の変異体の両者により行なわれた。洗浄試験は、５ｇ／ｌの酵素不活 性化されたAriel Future（Procter and Gamble）において実施された。ラード染 色された布ぎれを、30℃で20分間、洗浄した。この試験は、０，5000LU／ｌ及び 12500 LU／ｌの濃度で行なわれた。 洗剤を約18°dH(German Hardness)水に溶解した。その洗浄液体のpHは約10.3 であった。７枚の布ぎれを1000mlの洗浄溶液により洗浄した。洗浄に続いて、布 ぎれを水道水に15分間、流し、そして次に、室温で一晩、空気乾燥せしめた。 評価：布ぎれの反射率を460nmで測定し、そしてリパーゼ性能（Ｒ）を次のよ うにして計算した：Ｒ ＝デルタ反射率＝（Ｒリパーゼを含む洗剤により洗浄された布ぎれ−Ｒリパー ゼを含まない洗剤により洗浄された布ぎれ）。 リパーゼの突然変異及び付加物は、上記に記載される。 Ｒは下記表に示されている。 結果は、損なわれていないペプチド付加物の存在が最良の洗浄性能を導びくこ とを示す。減じられた（但し、完全に除去されたわけではない）ペプチド付加物 は、特に、正に荷電されたアミノ酸残基がその付加物に存在する場合、改良され た洗浄性能を付与する。例19．システイン架橋を含む修飾されたＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素（HLv16s） 修飾されたＨ．ラヌギノサ脂肪分解酵素HLv16sは次の突然変異を含む：N94K， D96L，E239C及びQ249R、並びにペプチド付加物SCIRR。親酵素HLv16は次の突然変 異を含む：N94K，D96L，Q249R。HLv16sは次の通りにして構成された： １．野生型Ｈ．ラヌギノサ脂肪分解酵素におけるN94K，D96L突然変異の作製： pIVI290の作製： プラスミドを、プラスミド鋳型としてpAHL（WO92/05249の図６を参照のこと） 及び選択プライマーとしてプライマー番号7258及び7770を用いて、記載されるプ ロトコールに従って、Chamelon二本鎖特 定部位突然変異誘発キットを用いて構成した。7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'（従って、耐アンピシリン遺伝子に見出されるScaＩ部 位をMluＩ部位に変更する）(ScaＩは切断のために使用された)。7770：Sequence 5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3（野生型Ｈ．ラヌギノサリパーゼ 遺伝子に見出されるScaＩ部位の変更）。プライマー番号8932が、突然変異誘発 プライマーとして使用された。8932:5'pgaac tgg ata gga aat ttg aag ttc ctg ttg aaa gaa ata aat gac 3'（N94K，D96Lの導入）。 ２．HLv16s(SCIRR，N94K，D96L，E239C，Q249R)の作製： pIVI319の作製： プラスミドを、プラスミド鋳型としてpIVI290及び選択プライマーとしてプラ イマー番号7887を用いて、記載されるプロトコールに従って、Chameleon二本鎖 特定部位突然変異誘発キット（Stratagene；カタログ番号200509）を用いて作製 した。7887：5'p-gaa tga ctt ggt tga gta ctc acc agt cac 3'（耐アンピシリ ン性遺伝子に見出される導入されたMlu１部位をScaＩ部位に変更する）(Mlu１部 位は切断のために使用された）。プライマー番号8829，9639及び9646が突然変異 誘発プライマーとして使用された。8829：5'p-ggc ggc aat aac cgg ccg aac at t ccg gat atc cc 3'（Q249Rの導入）；9639：5'p-at atc gtg aag ata tgc ggc att gat gcc acc 3'（E239Cの導入）；9646：5'p-cg gcc ttg gct agc tgt att cgt cga gag gtc 3'（SPIRRからのプロペプチドをSCIRRに修飾する）。酵素HLv16s及びHLv16の生成 酵素を、宿主細胞としてＡ．オリザエJAL125を用いて、例６に記載される態様 に類似する態様で生成した。続いて、酵素の一循環 洗浄性能を試験した（洗剤として５ｇ／ｌの不活性化されたAriel Future、及び 0.25mgの酵素タンパク質／ｌ及び1.0mgの酵素タンパク質／ｌの酵素用量を用い る）。 次の結果が得られた： dR（0.25mgEP／ｌ） dR（1.0mgEP／ｌ） HLv16s ３ ７ HLv16 １ ２ 有意に改良された洗浄性能が、ペプチド付加物と酵素の成熟部分との間にシス テイン架橋を含むHLv16sに関して得られることが見出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/20 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:19 1:385 1:385 1:07） 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/20 (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:385 Ｃ１２Ｒ 1:385 1:40 1:40 1:01） 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 １０９６／９５ (32)優先日 平成７年９月29日(1995．9．29) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １３０６／９５ (32)優先日 平成７年11月21日(1995．11．21) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ６０／０１１，６３４ (32)優先日 平成８年２月14日(1996．2．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０３７２／９６ (32)優先日 平成８年４月１日(1996．4．1) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ６０／０２０，４６１ (32)優先日 平成８年５月７日(1996．5．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ペテルセン，ドルテ アーベュー デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 パトカル，シャムカン アナン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 テレルセン，マリアン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ビン，ヨェスペル デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ハルティール，トルベーン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ヨェールゲンセン，ステーン トロエルス デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．その親酵素に比較して、ｉ）そのＣ−末端もしくはＮ−末端にペプチド付 加物、又はii）そのＣ−末端及びそのＮ−末端にペプチド付加物を有する、脂肪 分解活性を含む修飾された酵素。 ２．そのＮ−末端にペプチド付加物を含んで成る請求の範囲第１項記載の修飾 された酵素。 ３．前記ペプチド付加物が、親酵素のその基質に対する親和性を高めるために 選択される請求の範囲第１又は第２項記載の修飾された酵素。 ４．前記ペプチド付加物が、前記修飾された脂肪分解酵素に安定性を付与する ために選択される請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の修飾された脂肪分解 酵素。 ５．前記ペプチド付加物が、親酵素の成熟部分に対しての共有結合を形成する ことができるものである請求の範囲第４項記載の修飾された脂肪分解酵素。 ６．前記ペプチド付加物にシステイン残基及び前記親酵素の成熟部分にシステ イン残基を、前記システイン残基が一緒にシステイン架橋を形成するような態様 で含んで成る請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の修飾された酵素。 ７．前記親酵素の成熟部分におけるシステイン残基が挿入され、又は前記親酵 素のアミノ酸残基を置換している請求の範囲第６項記載の修飾された脂肪分解酵 素。 ８．前記ペプチド付加物が、前記脂肪分解酵素を発現するために使用される宿 主細胞のタンパク質分解酵素によるタンパク質分解性退化に対して低い感受性を 有するものである請求の範囲第１〜７のいづれか１項記載の修飾された脂肪分解 酵素。 ９．前記ペプチド付加物が、少なくとも１個のプロリン残基、たとえば２又は ３個のプロリン残基を含んで成る請求の範囲第８項記載の修飾された脂肪分解酵 素。 10．前記ペプチド付加物が、少なくとも１個、たとえば１，２又は３個の陽性 又は疎水性アミノ酸残基を含んで成る請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の 修飾された酵素。 11．前記ペプチド付加物の長さが、１〜500個のアミノ酸、好ましくは１〜200 個、より好ましくは２〜100個、さらに好ましくは２〜50個、そして最とも好ま しくは１〜15個、たとえば１〜10個又は４〜10個のアミノ酸である請求の範囲第 １〜10のいづれか１項記載の修飾された酵素。 12．前記ペプチド付加物が、次のペプチド付加物： の１つである請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載の修飾された酵素。 13．前記ペプチド付加物の他に、前記親酵素のＮ−末端及び／又はＣ−末端の 非構造部分における突然変異、特に、少なくとも１つの負に荷電されたアミノ酸 残基の除去をもたらす突然変異を含んで成る請求の範囲第１〜12のいづれか１項 記載の修飾された酵素。 14．前記非構造部分の負に荷電されたアミノ酸残基が、欠失され、又は中性も しくは正に荷電されたアミノ酸残基により、又は疎水性アミノ酸残基により置換 されており、あるいは中性のアミノ酸残基が、正に荷電されたアミノ酸残基によ り置換されている請求の範囲第13項記載の修飾された酵素。 15．請求の範囲第１〜14のいづれか１項記載のペプチド付加物を含んで成る修 飾された脂肪分解酵素であって、前記ペプチド付加物が、 ａ）ペプチド付加物を有する親酵素をコートするDNA配列を、そのペプチド付 加物をコードするDNA配列の部分、又は任意には、親酵素の成熟形の非構造Ｎ− 末端又はＣ−末端部分におけるランダム突然変異誘発にゆだね、 ｂ）得られる突然変異誘発されたDNA配列を、修飾された脂肪分解酵素を生成 するために、適切な宿主細胞において発現し；そして ｃ）親酵素に比較して、改良された性能を有する、段階ｂ）に起因する修飾さ れた脂肪分解酵素についてスクリーンすることによって適用されていることを特 徴とする修飾された脂肪分解酵素。 16．前記ランダム突然変異誘発が、１又は複数の正に荷電された又は疎水性の アミノ酸残基を、前記ペプチド付加物及び任意には、前記親酵素の非構造部分中 に導入するために行なわれる請求の範囲第14項記載の修飾された脂肪分解酵素。 17．前記酵素が微生物起源のものである請求の範囲第１〜16のいづれか１項記 載の修飾された酵素。 18．前記酵素が細菌、酵母、又は糸状菌起源のものである請求の範囲第17項記 載の修飾された酵素。 19．前記酵素がヒュミコラsp.，たとえばＨ．ラヌギノサ又はＨ．インソレン スに由来する請求の範囲第18項記載の修飾された酵素。 20．Ｈ．ラヌギノサ株DSM4109に起因し、そして図１に示されるアミノ酸配列 を有する請求の範囲第19項記載の修飾された脂肪分解酵素。 21．前記親酵素のＣ−末端又はＮ−末端の非構造部分における突然変異、好ま しくは負に荷電されたアミノ酸残基の除去をもたらしている突然変異をさらに含 んで成る請求の範囲第20項記載の修飾された酵素。 22．前記ペプチド付加物が、前記成熟親酵素における位置１、すなわちＥ１を 占有するアミノ酸残基を置換している請求の範囲第21項記載の修飾された酵素。 23．前記酵素が、シュードモナスsp.，特にPs．セパシア、又はPs．メンドシ ナ、又はPs．アルカリゲネス、又はPs．シュードアルカリゲネス、又はPs．プラ ンタリ、又はPs．グラジオリ、又はPs．プチダ、又はPs．アエルギノサ、又はPs ．グルマエに起因する請求の範囲第18項記載の修飾された酵素。 24．前記親酵素が成熟形で存在する請求の範囲第１〜23のいづれ か１項記載の修飾された酵素。 25．前記親酵素が天然に存在する酵素又はその変異体である請求の範囲第１〜 24のいづれか１項記載の修飾された酵素。 26．前記ペプチド付加物が、前記親酵素の生来のプレ、プロ又はプレプロ配列 とは異なっている請求の範囲第１〜25のいづれか１項記載の修飾された酵素。 27．請求の範囲第１〜26のいづれか１項記載の脂肪分解活性を示す修飾された 酵素をコードするDNA配列であって、但し、前記ペプチド付加物をコードするDNA 配列の部分が、前記親酵素と通常関連し、そしてその親酵素のプロフォーム又は プレプロフォームをコードするDNA配列とは異なっていることを特徴とするDNA配 列。 28．請求の範囲第27項記載のDNA配列を含んで成る組換えベクター又は形質転 換ビークル。 29．前記酵素の発現を可能にするDNA配列をさらに含んで成る発現ベクターで ある請求の範囲第27又は28項記載のベクター。 30．請求の範囲第27項記載のDNA配列、又は請求の範囲第28又は29項記載のベ クターを有する宿主細胞。 31．微生物細胞、たとえば糸状菌、酵母又は細菌細胞である請求の範囲第30項 記載の宿主細胞。 32．アスペルギラスsp.，たとえば、Ａ．ニガー、Ａ．オリザエ、及びＡ．ジ ャポニカスの菌株、又はフサリウムsp.，たとえばＦ．オキシスポラム又はＦ． グラミネアラムの菌株である請求の範囲第31項記載の宿主細胞。 33．グラム陽性細菌株、たとえばバシルス属、たとえばＢ．スブチリス、Ｂ． リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレピス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、 Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリクロファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ ．サーキュランス、Ｂ．ラ ウタス、Ｂ．トリンギエンシスの細胞、又はストレプミセス属の細胞、又はグラ ム陰性細菌株、たとえばＥ．コリの細胞、又はシュードモナス属の細胞である請 求の範囲第31項記載の宿主細胞。 34．修飾されていない宿主細胞に比較して、１又は複数のタンパク質分解酵素 の減じられた生産性を有するように修飾されている宿主細胞、たとえば１又は複 数のタンパク質分解酵素を欠くように製造されている宿主細胞である請求の範囲 第30〜33のいづれか１項記載の宿主細胞。 35．請求の範囲第１〜25のいづれか１項記載の修飾された酵素を調製するため の方法であって、 ａ）修飾された酵素の生成の助けとなる条件下で、請求の範囲第30〜34のいづ れか１項記載の宿主細胞を培養し、そして ｂ）その得られる酵素を回収し、そして場合によっては、精製することを含ん で成る方法。 36．前記宿主細胞、培養条件、及び／又は回収条件が、前記生成される修飾さ れた酵素の少なくとも５％が、前記ペプチド付加物によりコードされるペプチド 付加物を包含するよう選択される請求の範囲第35項記載の方法。 37．親脂肪分解酵素の性質を改良するための、たとえは脂肪基質に対する親和 性を高めるための方法であって、成熟形での親酵素のＮ−末端又はＣ−末端にペ プチド付加を適用することを含んで成る方法。 38．前記改良された性質が、改良された洗浄性能である請求の範囲第37項記載 の方法。 39．前記ペプチド付加が、前記親脂肪分解酵素のプレ、プロ又はプレプロフォ ームをコードする、任意にはベクター上に存在するDNA配列を含んで成る宿主細 胞を培養し、そして得られる修飾された 脂肪分解酵素を回収することによって親酵素に適用され、前記宿主細胞、培養条 件及び／又は回収条件が、前記親酵素のプレ、プロ又はプレプロフォームの多く ても部分プロセッシングが生じ、その生成される修飾された酵素の少なくとも５ ％が所望するペプチド付加物、たとえばその完全なプロ配列又は実質的な部分を 含むよう選択される請求の範囲第37又は38項記載の方法。 40．前記ペプチド付加が、請求の範囲第27項記載のDNA配列、又は請求の範囲 第28又は29項記載のベクターを含んで成る宿主細胞を培養し、そして得られる修 飾された脂肪分解酵素を回収することによって親酵素に適用され、前記宿主細胞 、培養条件及び／又は回収条件が、前記生成される修飾された酵素の少なくとも ５％が前記ペプチドによりコードされるペプチド付加物を含むよう選択される請 求の範囲第37又は38項記載の方法。 41．前記宿主細胞が、親酵素以外の異なった起源のもの、たとえば親酵素が誘 導され、又は親酵素の源以外の後翻訳プロセッシング機構を有する属以外のもう １つの属のものである請求の範囲第40項記載の方法。 42．前記親脂肪分解酵素が、糸状菌又は細菌に由来し、そして前記宿主細胞が 酵母細胞である請求の範囲第41項記載の方法。 43．前記親脂肪分解酵素が、ヒュミコラsp.，たとえばＨ．ラヌギノサの菌株 、又はシュードモナスsp.の菌株に由来する請求の範囲第42項記載の方法。 44．前記宿主細胞が酵母細胞、たとえばサッカロミセスsp.，特にサッカロミ セス・セレビシアエの菌株、又はハンセヌラsp.の菌株である請求の範囲第39〜4 3のいづれか１項記載の方法。 45．前記親脂肪分解酵素へのペプチド付加物の適用のために使用される宿主細 胞の固有のタンパク質分解酵素生成能力が、前記宿主 細胞による１又は複数のタンパク質分解酵素の生成を廃止することによって減じ られる請求の範囲第39〜44のいづれか１項記載の方法。 46．ａ）ペプチド付加物を有する親脂肪分解酵素をコートするDNA配列、たと えば請求の範囲第１〜26のいづれか１項記載のDNA配列を、前記ペプチド付加物 をコードするDNA配列の部分、又は前記親酵素のＣ−末端又はＮ−末端の非構造 部分における局在化されたランダム突然変異にゆだね、 ｂ）段階ａ）で得られる、突然変異誘発されたDNA配列を、宿主細胞において 発現し、そして ｃ）前記親脂肪分解酵素に比較して、改良された性能を有する突然変異誘発さ れた脂肪分解酵素を発現する宿主細胞についてスクリーンすることを含んで成る 請求の範囲第37項記載の方法。 47．前記DNA配列が、そのプロ又はプレプロフォームでの親酵素をコードする 遺伝子又はcDNA配列である請求の範囲第46項記載の方法。 48．その成熟形での親酵素のＣ−末端又はＮ−末端の非構造部分に突然変異を 導入することをさらに包含する請求の範囲第37〜47のいづれか１項記載の方法。 49．前記突然変異が、非構造部分の負に荷電されたアミノ酸残基を、欠失する か、又は中性又は正に荷電されたアミノ酸残基又は疎水性アミノ酸残基により置 換するか、又は中性アミノ酸残基を正に荷電されたアミノ酸残基により置換され ることを包含する請求の範囲第48項記載の方法。 50．請求の範囲第１〜26のいづれか１項記載の脂肪分解活性を有する修飾され た酵素を含んで成る酵素組成物。 51．プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、クチナーゼ 、アミラーゼ及び／又はリパーゼから成る群から選択された少なくとも１つの酵 素をさらに含んで成る請求の範囲第50項記載の組成物。 52．請求の範囲第50又は51項記載の酵素組成物を含んで成る洗剤組成物。 53．洗剤組成物１ｇ当たり0.02〜200mgの修飾された脂肪分解酵素タンパク質 を含む請求の範囲第52項記載の組成物。 54．前記組成物における修飾された脂肪分解酵素の５％以上、好ましくは10％ 以上、たとえば25％、良好には50％、特に75％が十分な長さのペプチド付加物を 有する請求の範囲第50又は52項記載の組成物。 55．洗剤、たとえば洗浄粉末又は皿洗い組成物への請求の範囲第50〜54のいづ れか１項記載の酵素組成物の使用。