CN115725636A - 一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株及其应用。所述突变菌是通过紫外诱变的方法获得的，脂肪酶得到产量显著提高，命名为毕赤酵母ZT‑42（Pichia pastoris ZT‑42），保藏编号为CCTCC NO：M 20221118。所述突变菌摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活高达19610U/ml，比出发菌提高了127%，可广泛应用于脂肪酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。

Description

一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株及其在脂肪酶生产中的应用。

背景技术

脂肪酶（Lipase）又称三酰基甘油酰基水解酶，属于羧基酯水解酶类，是酯酶的一个分类，具有水解甘油三酯（TG）使之成为甘油和脂肪酸（FA）的能力。脂肪酶在自然界中来源广泛，动物、植物及微生物均具有生产脂肪酸的能力，其中细菌、真菌和酵母产生的脂肪酶活力很高，而且微生物繁殖迅速，因而具有比动植物源脂肪酶更广泛的作用pH值和温度范围。与动植物来源脂肪酶相比，微生物产生的脂肪酶成本较低、更易分离纯化、生产较为方便等，因而更具有研究价值。

目前，对脂肪酶的研究主要集中于脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceridelipase，ATGL）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）、单酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MGL），这3种酶在机体内脂肪及非脂肪组织中对脂质代谢及分解具有明确的功能。在TG的水解过程中，这3种酶表现出“顺序”催化的功能，即ATGL首先将TG水解为二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和1分子FA；再由HSL继续催化，将DAG转化为单酰甘油（monoacylglycerol，MAG）和1分子FA；最后由MGL发挥催化作用，将MAG分解为甘油和FA；为保证机体内水解平衡性，DAG和MAG还可通过二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerolacyltransferase，DGAT）和单酰基甘油酰基转移酶（monoacyglycerol acyltransferases，MGAT）发生酯化过程再次生成TAG。

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于造纸、油脂加工、食品、医药、日化等工业。1. 清洁剂工业：其做为家庭或工业用清洁剂的添加物，是脂肪酶的最大商业应用领域。2. 食品工业：利用脂肪酶生产兼具机能性与保健疗效的新结构油脂及其衍生物，增加油脂的广泛应用性，提升油脂工业的经济效益与发展潜力。3. 纤维及造纸工业：脂肪酶的添加使木棉纤维精炼过程变得简单，且不损伤木棉纤维，去除纸浆中的树脂（三酸甘油酯、蜡），避免造纸过程中会产生严重破裂的情形。4. 生物能源：天然油脂和餐厨废弃油等与柴油的分子量范围较为接近，油脂的主要成分为脂肪酸与甘油形成的酯，用脂肪酶将油脂水解，再经一系列化学转化即可获取生物柴油。5. 制药工业：利用脂肪酶独特的立体镜像选择性，可以有效率地区别具有光学活性的立体异构物，以合成多种药物。6. 造酒：在白酒生产中可以通过脂肪酶催化形成酯类化合物以增添白酒的风味，同时打开被脂肪包埋的淀粉加快发酵速度。

脂肪酶作为生产生活中重要的酶之一，现已有越来越多的研究者对其进行多方面的研究。为满足市场的大量需求，寻求高产稳产脂肪酶菌株具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种毕赤酵母突变菌株及其在脂肪酶生产中的应用。所述突变菌是通过紫外诱变方法筛选获得的脂肪酶高产菌株，可广泛应用于该酶的生产。

本发明一方面涉及一种重组表达载体，其携带有脂肪酶基因。

所述脂肪酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组表达载体。

本发明还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述突变菌株为毕赤酵母ZT-42（Pichia pastoris ZT-42），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221118。

本发明还涉及一种发酵生产脂肪酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。

有益效果

本发明首先构建得到重组表达脂肪酶基因的工程菌毕赤酵母ZT，其摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活最高达到8650U/ml；然后以毕赤酵母ZT为出发菌，通过紫外诱变筛选获得突变菌株毕赤酵母ZT-42，能大幅度提高脂肪酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活高达19610U/ml，比出发菌提高了127%，取得了意料不到的技术效果。

所述突变菌株可作为脂肪酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

菌株与载体：毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、G418购自Invitrogen公司。

试剂：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司。其余试剂均为国产分析纯。

本发明实施例中所述脂肪酶的酶活测定方法如下：

（1）酶活定义：在40℃、pH值为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

（2）底物溶液：秤取聚乙烯醇（PVA：聚合度1750±50）40g，加水800ml，浸泡4-6h，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，搅拌冷却后定容至1000ml，用干净的6-8层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理10min（分4次处理，间隔5min，每次处理2-3min），即得乳白色PVA乳化液。现用现配。

（3）测定方法：取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4ml和pH 7.5磷酸缓冲液5ml，再于空白瓶（A）中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中预热5min；向空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入待测酶液1ml，立即混匀计时，准确反应15min后，使用分样移液器于样品瓶（B）中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出；将上述反应液倒入50ml烧杯中，向三角瓶中加入5ml纯水，摇匀后倒入50ml烧杯中，加入2滴酚酞指示剂；使用校正过碱性条件的pH计，在搅拌的条件下向烧杯中加入0.05mol/L的氢氧化钠溶液，滴定至pH值为9.92；滴定至pH值在20s不再变化为终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

酶活力计算公式：X=

。

X——碱性脂肪酶活力，U/ml；

V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1ml相当于脂肪酸50μmol；

n——酶液稀释倍数；

0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

15——时间换算系数。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。

实施例1 基因克隆

以脂肪酶基因（GenBank号为AOE45082.1）的氨基酸序列为基础，分析该脂肪酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。申请人将该脂肪酶基因命名为ZT，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

采用PCR反应克隆脂肪酶基因ZT片段，引物和反应条件如下：

引物1(F)：GCGCGAATTCTCTCCAATTAGAAGAGAAGTTTCTC（下划线处为EcoR I的酶切位点）；

引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTACAAACAAGTACCAATCAAACCA（下划线处为Not I的酶切位点）。

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温10min。ZT基因全长825bp。

实施例2 毕赤酵母工程菌的构建

1、重组表达载体的构建

将克隆得到的脂肪酶ZT基因成熟蛋白编码序列经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点，位于α-因子信号肽序列的下游，得到重组质粒pPIC9K-ZT，并对该质粒进行测序鉴定。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0）中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达载体pPIC9K-ZT。

2、转化、筛选和摇瓶发酵

将重组酵母表达载体pPIC9K-ZT用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油、2%琼脂糖）上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）上筛选多拷贝的转化子。

挑取高浓度平板上的单克隆分别接入BMGY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油）中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇）中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心取上清液进行脂肪酶酶活力测定。

结果显示，本发明构建的毕赤酵母工程在摇瓶条件下发酵，其发酵上清液中脂肪酶酶活最高达到8650U/ml。将酶活水平最高的转化子命名为毕赤酵母ZT（Pichia pastoris ZT）。

实施例3、脂肪酶高产菌株的诱变筛选

诱变育种是指在人为的条件下，利用物理、化学等因素，诱发生物体产生突变，从中选择，培育成动植物和微生物的新品种。具体方法包括物理诱变和化学诱变。

诱变育种的优缺点在于可在较短时间内获得优良品种，大幅度地改变某些性状。但是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母ZT为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其脂肪酶的产量。

将出发菌毕赤酵母ZT接种于YPD平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约100个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得上清液；检测发酵上清液中脂肪酶酶活。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中脂肪酶酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了52轮诱变筛选，最终获得1株脂肪酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名毕赤酵母ZT-42（Pichia pastoris ZT-42）。

所述突变菌株在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中脂肪酶酶活力高达19610U/ml，比出发菌提高了127%，取得了意料不到的技术效果。

综上，本发明提供了的毕赤酵母突变菌可作为发酵菌株应用于脂肪酶的生产中，有利于降低脂肪酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。

Claims (6)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有脂肪酶基因。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述脂肪酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1或2所述的重组表达载体。

4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求3所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述突变菌为毕赤酵母ZT-42（Pichia pastoris ZT-42），已于2022年7月15日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221118。

6.一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求4或5所述的毕赤酵母突变菌为发酵菌株。