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CN119677844A - 甘露聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

甘露聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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CN119677844A
CN119677844A CN202380047721.5A CN202380047721A CN119677844A CN 119677844 A CN119677844 A CN 119677844A CN 202380047721 A CN202380047721 A CN 202380047721A CN 119677844 A CN119677844 A CN 119677844A
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CN202380047721.5A
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田鹏飞
R·T·伦哈德
A·G·桑德斯特伦
J·U·范格尔
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Novozymes AS
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Novozymes AS
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Abstract

本发明涉及具有改善的稳定性的甘露聚糖酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

甘露聚糖酶变体以及编码它们的多核苷酸
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及甘露聚糖酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。本发明的变体适合用于在清洁过程和洗涤剂组合物(如衣物洗涤组合物和餐具洗涤组合物)中使用。特别地，本发明的甘露聚糖酶变体显示出改善的洗涤剂内稳定性和/或蛋白酶稳定性。
背景技术
甘露聚糖是具有β-1,4-连接的D-吡喃甘露糖基残基的主链的多糖，它可以包含半乳糖或乙酰基取代，并且可以在主链中具有葡萄糖残基。参与甘露聚糖降解的主要酶类型是内切-1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，它水解在甘露聚糖主链中的内部糖苷键。
甘露聚糖是占软木中高达25％的木材干重的一类半纤维素，但是还发现于其他植物材料中，尤其是各种种子中。含甘露聚糖的瓜尔胶在许多食品中用作稳定剂。
因此，在其中需要降解甘露聚糖的应用中使用内切甘露聚糖酶可能是有利的。其中可以使用甘露聚糖酶的实例是在洗涤剂中，以去除含有甘露聚糖的污渍；在由软木(Várnai等人,(2011)“Synergistic action of xylanase and mannanase improves thetotal hydrolysis of softwood[木聚糖酶和甘露聚糖酶的协同作用改善了软木的完全水解]”,Bioresource tech.[生物资源技术],102(19),第9096-9104页)和棕榈仁滤饼(等人,(2010)“Production of ethanol and feed by high dry matterhydrolysis and fermentation of palm kernel press cake[通过棕榈仁滤饼的高干物质水解和发酵生产乙醇和饲料]”,Applied Biochem.Biotech.[应用生物化学和生物技术],161(1-8),第318-332页)生产生物乙醇中，以用于改善动物饲料(Cai等人,(2011),“Acidicβ-mannanase from Penicillium pinophilum C1:Cloning,characterizationand assessment of its potential for animal feed application[来自嗜松青霉C1的酸性β-甘露聚糖酶：克隆、表征及对其用于动物饲料应用的潜力的评估]”,J.Biosci.Bioeng.[生物科学与生物工程杂志],112(6),第551-557页)；以及在咖啡提取物的水解中(Nunes等人,(2006),“Characterization of Galactomannan Derivatives inRoasted Coffee Beverages[烘焙咖啡饮料中半乳甘露聚糖衍生物的表征]”,J.Agricultural Food Chem.[农业化学与食品化学杂志],54(9),第3428-3439页)。
在家用护理工业中，已知在例如衣物洗涤剂中使用甘露聚糖酶。在WO 1999/064619中，披露了一种碱性甘露聚糖酶，当应用于清洁组合物中时，该碱性甘露聚糖酶在碱性pH范围内也表现出甘露聚糖酶活性。
根据CAZy(cazy.org)，内切-1,4-β-甘露聚糖酶已经发现于糖苷水解酶家族5、26和113中。在WO 2019/068713、WO 2019/068715、WO 2021/152120和WO 152123中，披露了表现出β-甘露聚糖酶活性的GH 26家族甘露聚糖酶。WO 152123还披露了SEQ ID NO:2在蛋白酶存在下具有改善的稳定性(第370页，倒数第二行)。
发明内容
在与最终用途(即客户使用)相关的条件下的稳定性是酶(包括甘露聚糖酶)的性能和有用性的关键。甘露聚糖酶对于例如如上所讨论的洗涤剂生产工业来说是希望的并且是具有工业实用性的。本发明提供了与上述具有SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶变体相比具有进一步改善的稳定性的甘露聚糖酶变体，特别是在如实例3中所披露的包含蛋白酶的洗涤剂组合物中，甘露聚糖酶具有改善的稳定性(即，改善的半衰期)。
本发明涉及分离的甘露聚糖酶变体，这些变体包含在SEQ ID NO:2的位置490和491处的缺失，以及任选地在对应于如下位置的位置处的一个或多个缺失或取代，这些位置是SEQ ID NO:2的多肽的位置16、20、26、30、36、46、48、53、61、64、65、69、70、74、76、78、82、101、103、109、111、112、118、120、126、137、139、141、143、155、160、161、162、163、164、165、166、167、168、171、172、176、178、181、182、183、190、197、214、215、219、239、244、248、253、258、271、276、280、283、286、299、315、324、366、378、385、408、410、413、473、485、486，以及任选地在对应于如下位置的位置处的缺失，这些位置是SEQ ID NO:2的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15，其中这些变体与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、22、23、24、25、26、27、28或29的多肽具有至少60％的序列同一性，并且其中这些变体具有甘露聚糖酶活性。
在另外的方面，本发明涉及SEQ ID NO:2的多肽的变体，其中在位置490和491处的氨基酸缺失，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％的序列同一性，并且其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
本发明还涉及包含如本文披露的变体的组合物，这样的组合物在家庭或工业清洁过程中的用途，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法，连同使用本文披露的组合物进行洗涤的方法。
附图说明
图1是SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6和7的多肽的比对。
序列表综述
SEQ ID NO:1是获得自伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)的成熟甘露聚糖酶多肽
SEQ ID NO:2是获得自伊利诺类芽孢杆菌的成熟甘露聚糖酶多肽，该甘露聚糖酶多肽是SEQ ID NO:1的变体
SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:16以及SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:29是SEQ ID NO:2的变体
SEQ ID NO:8是来自博戈里亚芽孢杆菌(Bacillus bogoriensis)的GH5甘露聚糖酶
SEQ ID NO:17是来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的蛋白酶
SEQ ID NO:18是来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的甘露聚糖酶
SEQ ID NO:19是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的甘露聚糖酶
SEQ ID NO:20是来自迟缓芽孢杆菌的甘露聚糖酶
SEQ ID NO:21是来自类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)的甘露聚糖酶
SEQ ID NO:30是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶裂解酶
SEQ ID NO:31是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶内切葡聚糖酶
SEQ ID NO:32是来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶
定义
根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
甘露聚糖酶活性：为了估计在底物水解后的甘露糖产率，使用了由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279开发的还原端测定。该测定是基于4-羟基苯甲酸酰肼，它在碱性条件下与糖的还原端反应。产物是强黄色阴离子，在410nm处吸收。
如实例1中所述确定变体的甘露聚糖酶活性。
辅助材料：术语“辅助材料”或“辅助成分”意指针对所希望的特定类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒、糊、喷雾、片剂、凝胶、或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选地与用于该组合物中的甘露聚糖酶变体酶相容。下文进一步提供了关于辅助材料的更详细信息。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG、或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG、或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指涉及在特定生物体内或体外调节多核苷酸表达的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，并且相对于彼此是天然的或异源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前原肽、前肽、信号肽、启动子、终止子、增强子以及转录或翻译起始子和终止子序列。最少，这些控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
洗涤剂组合物：除非另有说明，否则术语“洗涤剂组合物”(或“清洁组合物”)包括任何形式的洗涤剂或清洁组合物。这些包括颗粒或粉末形式的通用或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)类型；具有一个或多个腔室的单个单位剂量(SUD)组合物，如荚状物(pod)、胶囊、片剂等；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和冲洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条、皂条、漱口水、义齿清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和头发冲洗剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁辅剂(如漂白添加剂)和“去污棒(stain-stick)”或预处理型。就旨在用于污物清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在可替代的实施例中，该术语是指如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。并不旨在使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于含有表面活性剂的组合物。旨在除根据本发明的变体之外，该术语涵盖了可能含有以下的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
酶的有效量：术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中实现所需的酶活性所必需的酶的量。这样的有效量由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于许多因素，如使用的特定酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、棒)组合物等。术语甘露聚糖酶变体的“有效量”是指实现所希望水平的酶活性(例如在定义的洗涤剂组合物中)的前述甘露聚糖酶变体的量。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：“表达载体”是指包含编码变体的DNA序列的线性或环状DNA构建体，该编码序列可操作地连接到能够影响DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
织物：术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，以及织物、纱线、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织材料。
延伸：术语“延伸”意指在变体的氨基和/或羧基末端添加一个或多个氨基酸，其中该“延伸的”变体具有甘露聚糖酶活性。
片段：术语“片段”意指在变体的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的变体；其中该片段具有甘露聚糖酶活性。在一方面，该片段包含SEQ ID NO:5的至少氨基酸13至489，例如SEQ ID NO:5的至少氨基酸14至489，例如SEQ ID NO:5的至少氨基酸15至489。在另一方面，该片段包含SEQ ID NO:6的至少氨基酸13至489，例如SEQ ID NO:6的至少氨基酸14至489，例如SEQ ID NO:6的至少氨基酸15至489。在又另一方面，该片段包含SEQ IDNO:7的至少氨基酸13至489，例如SEQ ID NO:7的至少氨基酸14至489，例如SEQ ID NO:7的至少氨基酸15至489。
硬表面清洁：术语“硬表面清洁”在本文中定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗和刀具(如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，几种)酶。参见例如，Shallom和Shoham，Current Opinion In Microbiology[微生物学当前观点]，2003,6(3):219-228。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、和木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和直链多糖的异质性组，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，从而将它们交联成稳健的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性，可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步分组为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最详实和最新的分类。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.[纯粹与应用化学]59:1739-1752在适合温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下测量。
异源的：对于宿主细胞，术语“异源的”意指多肽或核酸不是宿主细胞中天然存在的。对于多肽或核酸，术语“异源的”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子)不与该多肽或核酸天然相关联，即，控制序列是来自编码成熟多肽的基因以外的基因。
宿主菌株或宿主细胞：“宿主菌株”或“宿主细胞”是指其中已引入表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码变体的多核苷酸)的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。这样的改善的特性包括但不限于洗涤剂内稳定性、热稳定性、蛋白酶稳定性、表面活性剂稳定性、pH稳定性。
改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”可以定义为与具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的甘露聚糖酶相比，根据本发明的甘露聚糖酶变体的改善的清洁效果。洗涤性能可以被表示为染污的小块布样的反射值。在洗涤并冲洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤的小块布样。使用具有非常小孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的条件下进行测量，并提取460nm下的反射值。
洗涤剂内稳定性：术语“洗涤剂内稳定性”或“洗涤剂稳定性”是指在洗涤剂中孵育的甘露聚糖酶(无论是野生型、亲本或变体)的稳定性。出于本发明的目的，可以如实例3中所示确定洗涤剂内稳定性。
引入：在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，如本领域已知的。
分离的：术语“分离的”意指与至少一种其他材料或组分(包括但不限于其他蛋白质、核酸、细胞等)分离的变体、核酸、细胞或其他指定材料或组分。因此，分离的多肽、核酸、细胞或其他材料呈自然界中不存在的形式。分离的多肽包括但不限于含有在宿主细胞中表达的分泌的变体的培养液。
衣物洗涤：术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者并且意指用含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。衣物洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行，或可以手动进行。
甘露聚糖酶：术语“甘露聚糖酶”意指具有催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的水解的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶活性(EC3.2.1.78)的多肽。甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶的可替代的名称是：1,4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶；内切-1,4-β-甘露聚糖酶；内切-β-1,4-甘露聚糖酶；β-甘露聚糖酶B；β-1,4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶；内切-β-甘露聚糖酶；和β-D-甘露聚糖酶。
根据CAZy(www.cazy.org)甘露聚糖酶可以在以下两组中发现：糖苷水解酶家族5(GH5)和糖苷水解酶家族26(GH26)。两组的底物特异性不同，并且因此GH5和GH26的组合可以是有利的。
属于GH5家族的甘露聚糖酶披露于WO2018/206300和WO2018/206302中。
属于GH26家族的甘露聚糖酶披露于WO2019/068715、WO2021/152120和WO152123中。
出于本发明的目的，可以使用如本文实例1中所述的还原端测定来确定甘露聚糖酶活性。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工和/或C-末端加工(例如，信号肽的去除)后呈其成熟形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至474。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至474。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至489。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至489。在一方面，成熟多肽是SEQ IDNO:7的氨基酸1至489。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有甘露聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
修饰：在本发明的多肽的上下文中，术语“修饰”意指通过用不同的氨基酸取代、通过插入氨基酸、或通过缺失(优选地通过至少一个缺失)而改变在参考氨基酸序列(即SEQID NO:1或2)内的一个或多个氨基酸。术语“修饰”、“改变”和“突变”可以互换地使用并且构成相同的含义和目的。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
天然：术语“天然”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。
核酸：术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码变体的合成分子。核酸可以是单链或双链，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可使用多于一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'取向呈现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指分离自天然存在的基因或以原本不存在于自然界中的方式被修饰以含有核酸的区段或是合成的并且包含可操作地连接到核酸序列的一个或多个控制序列的单链或双链核酸分子。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调节序列可操作地连接到编码序列，使得编码序列的表达处于调节序列的控制之下。
亲本或亲本甘露聚糖酶：术语“亲本”或“亲本甘露聚糖酶”意指对其进行改变以产生本发明的酶变体的甘露聚糖酶。具有SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶是亲本甘露聚糖酶。
蛋白酶稳定性：术语“蛋白酶稳定性”是指在蛋白酶的存在下，任选地在洗涤剂中孵育的甘露聚糖酶(无论是野生型、亲本或变体)的稳定性。出于本发明的目的，可以如实例4中所示确定蛋白酶稳定性。
纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸、变体或细胞，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经受密度梯度离心的培养基中，纯化的变体或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或变体是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，重量百分比或以摩尔计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度大幅度增加时，组合物富集了该分子。术语“富集”是指化合物、变体、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
在一个方面，如本文所用的术语“纯化的”是指变体或细胞基本上不含来自生产生物体的组分(尤其是不溶性组分)。在其他方面，术语“纯化的”是指变体基本上不含来自从中获得其的天然生物体的不溶性组分(尤其是不溶性组分)。在一方面，将变体与从中回收其的生物体和培养基的一些可溶性组分分离。可通过单元操作过滤、沉淀或色谱法中的一种或多种来纯化(即，分离)变体。
相应地，可纯化变体，使得仅存在少量的其他蛋白，特别是其他多肽。如本文所用的术语“纯化的”可指去除存在于多肽来源的细胞中的其他组分，特别是其他蛋白并且最特别是其他酶。变体可以是“基本上纯的”，即不含来自产生其的生物体(例如，用于重组产生变体的宿主生物体)的其他组分。在一方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少40％纯的。在一方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少50％、60％、70％、80％或90％纯的。如本文所用，“基本上纯的多肽”可表示含有按重量计至多10％、优选地至多8％、更优选地至多6％、更优选地至多5％、更优选地至多4％、更优选地至多3％、甚至更优选地至多2％、最优选地至多1％并且甚至最优选地至多0.5％的与该多肽天然或重组缔合的其他多肽材料的多肽制剂。
因此，优选的是按制剂中存在的总多肽材料的重量计，基本上纯的变体是至少92％纯的、优选地至少94％纯的、更优选地至少95％纯的、更优选地至少96％纯的、更优选地至少97％纯的、更优选地至少98％纯的、甚至更优选地至少99％纯的、最优选地至少99.5％纯的。本发明的变体优选为基本上纯的形式(即，制剂基本上不含与其天然或重组相关的其他多肽材料)。例如，这可通过经由熟知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
重组：术语“重组”以其常规含义使用，是指对核酸序列进行操纵(例如，切割和重接)以形成与在自然界中发现的序列群不同的序列群。术语重组是指已从其天然状态修饰的细胞、核酸、变体或载体。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
回收：术语“回收(recover或recovery)”意指从选自细胞、核酸或其他指定材料的列表的至少一种发酵液组分中去除多肽，例如通过以下方法从全发酵液或从无细胞发酵液中回收多肽：通过多肽晶体收获、通过过滤(例如，深度过滤(通过使用助滤剂或填充过滤介质、箱式过滤器中的布过滤、转鼓过滤、鼓过滤、旋转真空鼓过滤、烛式过滤器、水平叶过滤器或类似物、在框架式或模块化装置中使用片状或垫式过滤)或膜过滤(使用板过滤，模块过滤，烛式过滤，微过滤，横流、动态横流或死端操作中的超滤))或者通过离心(使用卧式离心机、圆盘堆式离心机、水式漩涡分离器(hyrdo cyclone)或类似物)或者通过沉淀多肽并使用相关的固-液分离方法以通过使用粒度分级分离从肉汤培养基中收获多肽。回收涵盖多肽的分离和/或纯化。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(-nobrief)选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)
信号肽：“信号肽”是附接至蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列，其促进蛋白质分泌到细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号肽，该信号肽在分泌过程中被切除。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有甘露聚糖酶活性的片段。
表面活性剂稳定性：术语“表面活性剂稳定性”是指在表面活性剂的存在下，例如在洗涤剂中的表面活性剂的存在下孵育的甘露聚糖酶(无论是野生型、亲本或变体)的稳定性。示例性表面活性剂是下文详细描述的那些，并且在特别的实施例中，表面活性剂稳定性是指在阴离子表面活性剂(如LAS)的存在下的稳定性。出于本发明的目的，可以如实例中所示确定表面活性剂稳定性。
纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织材料，该任何纺织材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织材料，由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物(woven)、牛仔布(denim)、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。该纺织品可以是基于纤维素的，如天然纤维素，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。该纺织品或织物还可以是基于非纤维素的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳香族聚酰胺、聚酯、丙烯酸酯、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)；或其共混物连同基于纤维素和基于非纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如有污渍的家用衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。
热稳定性：术语“热稳定性”是指在升高的温度的存在下孵育的甘露聚糖酶(无论是野生型、亲本或变体)的稳定性。出于本发明的目的，可以使用nDSF(Prometheus，纳米温度公司(Nanotemper))通过在洗涤剂(例如，表1的标准洗涤剂)的存在下测量变体的解链温度(Tm)来确定热稳定性。制备样品以达到表1的标准洗涤剂的10％的浓度和200ppm的蛋白质浓度。简单混合之后，将样品加载到毛细管中并且置于nDSF样品盘中。样品在Tm估计模式下运行，温度范围为25℃-85℃，升温速度为1℃/min。运行完成后，在软件中使用350nm信号估计Tm。
变体：术语“变体”意指具有甘露聚糖酶活性的、在一个或多个位置处包含取代、插入(包括延伸)和/或缺失(例如截短)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻并紧接其后添加1-5个氨基酸(例如，1-3个氨基酸，特别是1个氨基酸)。
洗涤液：术语“洗涤液”是指包含本发明的甘露聚糖酶变体的水溶液。洗涤液是含有水和包含甘露聚糖酶的洗涤剂组合物的例如洗衣机或洗碗机中的溶液。在洗涤剂组合物与水混合以形成洗涤液之前，洗涤剂组合物可以呈如本文其他地方所述的任何形式，例如液体或粉末。
水硬度：如本文所用，术语“水硬度”或“硬度”(degree of hardness)或“dH”或“°dH”是指德国硬度(German degrees of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的多肽用于确定另一种甘露聚糖酶中的对应氨基酸位置。另一种甘露聚糖酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中披露的多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这样的情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变.包含多个改变的变体通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及分离的甘露聚糖酶变体，这些变体包含在SEQ ID NO:2的位置490和491处的缺失，以及任选地在对应于如下位置的位置处的一个或多个缺失或取代，这些位置是SEQ ID NO:2的多肽的位置16、20、26、30、36、46、48、53、61、64、65、69、70、74、76、78、82、101、103、109、111、112、118、120、126、137、139、141、143、155、160、161、162、163、164、165、166、167、168、171、172、176、178、181、182、183、190、197、214、215、219、239、244、248、253、258、271、276、280、283、286、299、315、324、366、378、385、408、410、413、473、485、486，以及任选地在对应于如下位置的位置处的缺失，这些位置是SEQ ID NO:2的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15，其中这些变体与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、22、23、24、25、26、27、28或29的多肽具有至少60％的序列同一性，并且其中这些变体具有甘露聚糖酶活性。
在另外的方面，本发明涉及SEQ ID NO:2的多肽的变体，其中在位置490和491处的氨基酸缺失，其中该变体具有甘露聚糖酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽、SEQID NO:4的多肽、SEQ ID NO:5的多肽、SEQ ID NO:6的多肽、SEQ ID NO:7的多肽、SEQ IDNO:22的多肽、SEQ ID NO:23的多肽、SEQ ID NO:24的多肽、SEQ ID NO:25的多肽、SEQ IDNO:26的多肽、SEQ ID NO:27的多肽、SEQ ID NO:28的多肽、或SEQ ID NO:29的多肽具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、至少90.6％、至少90.7％、至少90.8％、至少90.9％，例如至少91％、至少91.1％、至少91.2％、至少91.3％、至少91.4％、至少91.5％、至少91.6％、至少91.7％、至少91.8％、至少91.9％，例如至少92％、至少92.1％、至少92.2％、至少92.3％、至少92.4％、至少92.5％、至少92.6％、至少92.7％、至少92.8％、至少92.9％，例如至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％、至少93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％，例如至少94％、至少94.1％、至少94.2％、至少94.3％、至少94.4％、至少94.5％、至少94.6％、至少94.7％、至少94.8％、至少94.9％，例如至少95％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％，例如至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％，例如至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％，例如至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％的序列同一性或者甚至100％的序列同一性，并且其中这些变体具有甘露聚糖酶活性。在特别的实施例中，这些变体包含在N-末端处的一个或多个氨基酸的截短。
变体
在下文中，除非另有明确说明，否则变体的氨基酸编号是指当与SEQ ID:2进行比对时获得的编号。
在一个实施例中，本发明的甘露聚糖酶变体包含SEQ ID NO:2的缺失W490*和R491*。
在某个优选的实施例中，除了对应于位置W490*和R491*的氨基酸的氨基酸缺失，该变体还包含来自具有SEQ ID NO:2的多肽的N-末端的至少11个但少于16个氨基酸缺失。该缺失可以包含来自具有SEQ ID NO:2的多肽的N-末端的11-15(例如11、12、13、14或15)个氨基酸。在某个优选的实施例中，该变体包含以下缺失：SEQ ID NO:2的A1*+I2*+G3*+V4*+P5*+G6*+G7*+V8*+A9*+E10*+P11*+H12*+T13*+S14*+Q15*。特别地，当具有SEQ ID NO:2的多肽的N-末端缺失15个氨基酸时，该变体可以进一步包含取代D16A。
在另一个实施例中，除了上述实施例中披露的缺失和取代之外，该变体还包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰：SEQ ID NO:2的I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、H276C、R280K、F286C、G366N和D486E。
在实施例中，该变体包含取代H276C+R280K+F286C，以及任选地选自以下的一个或多个取代：SEQ ID NO:2的I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、G366N和D486E，例如取代D48P+H276C+R280K+F286C、T167P+H276C+R280K+F286C、Q215E+H276C+R280K+F286C、D48P+T167P+H276C+R280K+F286C、D48P+Q215E+H276C+R280K+F286C、T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C或D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代D48P、T167P和Q215E中的至少两个，例如D48P+T167P，以及任选地选自以下的一个或多个取代：I30L、Y155H、H276C、R280K、F286CG366N和D486E。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代D48P、T167P和Q215E中的至少两个，例如D48P+Q215E，以及任选地选自以下的一个或多个取代：I30L、Y155H、H276C、R280K、F286CG366N和D486E。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代D48P、T167P和Q215E中的至少两个，例如T167P+Q215E，以及任选地选自以下的一个或多个取代：I30L、Y155H、H276C、R280K、F286CG366N和D486E。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代D48P、T167P和Q215E中的至少两个，例如D48P+T167P+Q215E，以及任选地选自以下的一个或多个取代：I30L、Y155H、H276C、R280K、F286C G366N和D486E。
在一方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、H276C、R280K、F286C、G366N、D486E、I30L+D48P、I30L+Y155H、I30L+T167P、I30L+Q215E、I30L+H276C、I30L+R280K、I30L+F286C、I30L+G366N、I30L+D486E、D48P+Y155H、D48P+T167P、D48P+Q215E、D48P+H276C、D48P+R280K、D48P+F286C、D48P+G366N、D48P+D486E、Y155H+T167P、Y155H+Q215E、Y155H+H276C、Y155H+R280K、Y155H+F286C、Y155H+G366N、Y155H+D486E、T167P+Q215E、T167P+H276C、T167P+R280K、T167P+F286C、T167P+G366N、T167P+D486E、Q215E+H276C、Q215E+R280K、Q215E+F286C、Q215E+G366N、Q215E+D486E、H276C+R280K、H276C+F286C、H276C+G366N、H276C+D486E、R280K+F286C、R280K+G366N、R280K+D486E、F286C+G366N、F286C+D486E、G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H、I30L+D48P+T167P、I30L+D48P+Q215E、I30L+D48P+H276C、I30L+D48P+R280K、I30L+D48P+F286C、I30L+D48P+G366N、I30L+D48P+D486E、I30L+Y155H+T167P、I30L+Y155H+Q215E、I30L+Y155H+H276C、I30L+Y155H+R280K、I30L+Y155H+F286C、I30L+Y155H+G366N、I30L+Y155H+D486E、I30L+T167P+Q215E、I30L+T167P+H276C、I30L+T167P+R280K、I30L+T167P+F286C、I30L+T167P+G366N、I30L+T167P+D486E、、30L+Q215E+H276C、I30L+Q215E+R280K、I30L+Q215E+F286C、I30L+Q215E+G366N、I30L+Q215E+D486E、I30L+H276C+R280K、I30L+H276C+F286C、I30L+H276C+G366N、I30L+H276C+D486E、I30L+R280K+F286C、I30L+R280K+G366N、I30L+R280K+D486E、I30L+F286C+G366N、I30L+F286C+D486E、I30L+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P、D48P+Y155H+Q215E、D48P+Y155H+H276C、D48P+Y155H+R280K、D48P+Y155H+F286C、D48P+Y155H+G366N、D48P+Y155H+D486E、D48P+T167P+Q215E、D48P+T167P+H276C、D48P+T167P+R280K、D48P+T167P+F286C、D48P+T167P+G366N、D48P+T167P+D486E、D48P+Q215E+H276C、D48P+Q215E+R280K、D48P+Q215E+F286C、D48P+Q215E+G366N、D48P+Q215E+D486E、D48P+H276C+R280K、D48P+H276C+F286C、D48P+H276C+G366N、D48P+H276C+D486E、D48P+R280K+F286C、D48P+R280K+G366N、D48P+R280K+D486E、D48P+F286C+G366N、D48P+F286C+D486E、D48P+G366N+D486E、Y155H+T167P+Q215E、Y155H+T167P+H276C、Y155H+T167P+R280K、Y155H+T167P+F286C、Y155H+T167P+G366N、Y155H+T167P+D486E、Y155H+Q215E+H276C、Y155H+Q215E+R280K、Y155H+Q215E+F286C、Y155H+Q215E+G366N、Y155H+Q215E+D486E、Y155H+H276C+R280K、Y155H+H276C+F286C、Y155H+H276C+G366N、Y155H+H276C+D486E、Y155H+R280K+F286C、Y155H+R280K+G366N、Y155H+R280K+D486E、Y155H+F286C+G366N、Y155H+F286C+D486E、Y155H+G366N+D486E、T167P+Q215E+H276C、T167P+Q215E+R280K、T167P+Q215E+F286C、T167P+Q215E+G366N、T167P+Q215E+D486E、T167P+H276C+R280K、T167P+H276C+F286C、T167P+H276C+G366N、T167P+H276C+D486E、T167P+R280K+F286C、T167P+R280K+G366N、T167P+R280K+D486E、T167P+F286C+G366N、T167P+F286C+D486E、T167P+G366N+D486E、Q215E+H276C+R280K、Q215E+H276C+F286C、Q215E+H276C+G366N、Q215E+H276C+D486E、Q215E+R280K+F286C、Q215E+R280K+G366N、Q215E+R280K+D486E、Q215E+F286C+G366N、Q215E+F286C+D486E、Q215E+G366N+D486E、H276C+R280K+F286C、H276C+R280K+G366N、H276C+R280K+D486E、H276C+F286C+G366N、H276C+F286C+D486E、H276C+G366N+D486E、R280K+F286C+G366N、R280K+F286C+D486E、R280K+G366N+D486E、F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P、I30L+D48P+Y155H+Q215E、I30L+D48P+Y155H+H276C、I30L+D48P+Y155H+R280K、I30L+D48P+Y155H+F286C、I30L+D48P+Y155H+G366N、I30L+D48P+Y155H+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E、I30L+D48P+T167P+H276C、I30L+D48P+T167P+R280K、I30L+D48P+T167P+F286C、I30L+D48P+T167P+G366N、I30L+D48P+T167P+D486E、I30L+D48P+Q215E+H276C、I30L+D48P+Q215E+R280K、I30L+D48P+Q215E+F286C、I30L+D48P+Q215E+G366N、I30L+D48P+Q215E+D486E、I30L+D48P+H276C+R280K、I30L+D48P+H276C+F286C、I30L+D48P+H276C+G366N、I30L+D48P+H276C+D486E、I30L+D48P+R280K+F286C、I30L+D48P+R280K+G366N、I30L+D48P+R280K+D486E、I30L+D48P+F286C+G366N、I30L+D48P+F286C+D486E、I30L+D48P+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E、I30L+Y155H+T167P+H276C、I30L+Y155H+T167P+R280K、I30L+Y155H+T167P+F286C、I30L+Y155H+T167P+G366N、I30L+Y155H+T167P+D486E、I30L+Y155H+Q215E+H276C、I30L+Y155H+Q215E+R280K、I30L+Y155H+Q215E+F286C、I30L+Y155H+Q215E+G366N、I30L+Y155H+Q215E+D486E、I30L+Y155H+H276C+R280K、I30L+Y155H+H276C+F286C、I30L+Y155H+H276C+G366N、I30L+Y155H+H276C+D486E、I30L+Y155H+R280K+F286C、I30L+Y155H+R280K+G366N、I30L+Y155H+R280K+D486E、I30L+Y155H+F286C+G366N、I30L+Y155H+F286C+D486E、I30L+Y155H+G366N+D486E、I30L+T167P+Q215E+H276C、I30L+T167P+Q215E+R280K、I30L+T167P+Q215E+F286C、I30L+T167P+Q215E+G366N、I30L+T167P+Q215E+D486E、I30L+T167P+H276C+R280K、I30L+T167P+H276C+F286C、I30L+T167P+H276C+G366N、I30L+T167P+H276C+D486E、I30L+T167P+R280K+F286C、I30L+T167P+R280K+G366N、I30L+T167P+R280K+D486E、I30L+T167P+F286C+G366N、I30L+T167P+F286C+D486E、I30L+T167P+G366N+D486E、I30L+Q215E+H276C+R280K、I30L+Q215E+H276C+F286C、I30L+Q215E+H276C+G366N、I30L+Q215E+H276C+D486E、I30L+Q215E+R280K+F286C、I30L+Q215E+R280K+G366N、I30L+Q215E+R280K+D486E、I30L+Q215E+F286C+G366N、I30L+Q215E+F286C+D486E、I30L+Q215E+G366N+D486E、I30L+H276C+R280K+F286C、I30L+H276C+R280K+G366N、I30L+H276C+R280K+D486E、I30L+H276C+F286C+G366N、I30L+H276C+F286C+D486E、I30L+H276C+G366N+D486E、I30L+R280K+F286C+G366N、I30L+R280K+F286C+D486E、I30L+R280K+G366N+D486E、I30L+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E、D48P+Y155H+T167P+H276C、D48P+Y155H+T167P+R280K、D48P+Y155H+T167P+F286C、D48P+Y155H+T167P+G366N、D48P+Y155H+T167P+D486E、D48P+Y155H+Q215E+H276C、D48P+Y155H+Q215E+R280K、D48P+Y155H+Q215E+F286C、D48P+Y155H+Q215E+G366N、D48P+Y155H+Q215E+D486E、D48P+Y155H+H276C+R280K、D48P+Y155H+H276C+F286C、D48P+Y155H+H276C+G366N、D48P+Y155H+H276C+D486E、D48P+Y155H+R280K+F286C、D48P+Y155H+R280K+G366N、D48P+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C+F286C+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N、D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N、D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+D486E、D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+H276C+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、D48P+Y155H+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、D48P+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、D48P+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N、I30L+D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+H276C+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、I30L+D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、I30L+D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、I30L+D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、I30L+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E、I30L+D48P+Y155H+T167P+Q215E+H276C+R280K+F286C+G366N+D486E。
在实施例中，该变体包含对应于SEQ ID NO:2的位置490和491处的氨基酸的上述氨基酸的缺失，任选地取代D16A以及选自由以下组成的组的一个或多个取代(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、24或25个取代)：G20P、I30L、D48P、A101L、A111P、A118E、S137A、Q143R、Y155H、R160L、E162D、T167P、M171I、N176S、P182R、Q183E、Q215E、V244A、H276C、R280K、F286C、H324K、G366N、D385H和D486E。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、H276C、R280K、F286C、G366N和D486E，以及缺失W490*和R491*。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代G20P、I30L、D48P、A101L、A111P、A118E、S137A、Q143R、Y155H、R160L、E162D、T167P、M171I、N176S、P182R、Q183E、Q215E、V244A、H276C、R280K、F286C、H324K、G366N、D385H和D486E，以及缺失W490*和R491*。
在实施例中，SEQ ID NO:2的变体包含取代G20P、I30L、D48P、A101L、A111P、A118E、S137A、Q143R、Y155H、R160L、E162D、T167P、M171I、N176S、P182R、Q183E、Q215E、V244A、H276C、R280K、F286C、H324K、G366N、D385H和D486E，以及缺失W490*和R491*以及选自由以下组成的组的至少一个取代：V161A、R164S、R164P、R164A、R164K、I165G、I165A、I165P、I165T和I165E。
在实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的多肽、SEQ ID NO:4的多肽、SEQ ID NO:5的多肽、SEQ ID NO:6的多肽、SEQ ID NO:7的多肽、SEQ ID NO:22的多肽、SEQ ID NO:23的多肽、SEQ ID NO:24的多肽、SEQ ID NO:25的多肽、SEQ ID NO:26的多肽、SEQ ID NO:27的多肽、SEQ ID NO:28的多肽、或SEQ ID NO:29的多肽具有至少90％、至少90.1％、至少90.2％、至少90.3％、至少90.4％、至少90.5％、至少90.6％、至少90.7％、至少90.8％、至少90.9％，例如至少91％、至少91.1％、至少91.2％、至少91.3％、至少91.4％、至少91.5％、至少91.6％、至少91.7％、至少91.8％、至少91.9％，例如至少92％、至少92.1％、至少92.2％、至少92.3％、至少92.4％、至少92.5％、至少92.6％、至少92.7％、至少92.8％、至少92.9％，例如至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％、至少93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％，例如至少94％、至少94.1％、至少94.2％、至少94.3％、至少94.4％、至少94.5％、至少94.6％、至少94.7％、至少94.8％、至少94.9％，例如至少95％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％，例如至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％，例如至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％，例如至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或99.9％的序列同一性或者甚至100％的序列同一性，其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
在另外的实施例中，氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
这些变体可以由474至489个氨基酸，例如474至485个氨基酸，例如474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488或489个氨基酸组成。
在实施例中，与如实例3中所述的亲本酶相比，该变体在储存条件下在洗涤剂中具有改善的稳定性。
使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法优选地分离本发明的甘露聚糖酶变体，更优选地纯化这些变体。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有甘露聚糖酶活性的、具有本文披露的取代和缺失的变体的方法。在一个实施例中，该方法包括：(a)在位置490和491处向亲本甘露聚糖酶引入缺失，以及在对应于如下位置的一个或多个位置处向亲本甘露聚糖酶引入缺失或取代，这些位置选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2的多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、26、30、36、46、48、53、61、64、65、69、70、74、76、78、82、101、103、109、111、112、118、120、126、137、139、141、143、155、160、161、162、163、164、165、166、167、168、171、172、176、178、181、182、183、190、197、214、215、219、239、244、248、253、258、271、276、280、283、286、299、315、324、366、378、385、408、410、413、473、485和486，其中该变体具有甘露聚糖酶活性；以及(b)回收该变体。
特别地，本发明涉及用于获得上述段落变体中披露的具有甘露聚糖酶活性的变体的方法。
在另一个特别的实施例中，本发明涉及用于获得具有甘露聚糖酶活性的变体的方法，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽、SEQ ID NO:4的多肽、SEQ ID NO:5的多肽、SEQ IDNO:6的多肽、SEQ ID NO:7的多肽、SEQ ID NO:22的多肽、SEQ ID NO:23的多肽、SEQ ID NO:24的多肽、SEQ ID NO:25的多肽、SEQ ID NO:26的多肽、SEQ ID NO:27的多肽、SEQ ID NO:28的多肽、或SEQ ID NO:29的多肽具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、至少90.6％、至少90.7％、至少90.8％、至少90.9％，例如至少91％、至少91.1％、至少91.2％、至少91.3％、至少91.4％、至少91.5％、至少91.6％、至少91.7％、至少91.8％、至少91.9％，例如至少92％、至少92.1％、至少92.2％、至少92.3％、至少92.4％、至少92.5％、至少92.6％、至少92.7％、至少92.8％、至少92.9％，例如至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％、至少93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％，例如至少94％、至少94.1％、至少94.2％、至少94.3％、至少94.4％、至少94.5％、至少94.6％、至少94.7％、至少94.8％、至少94.9％，例如至少95％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％，例如至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％，例如至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％，例如至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％的序列同一性或者甚至100％的序列同一性。
可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以实现体外定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法实现体内定点诱变。参见，例如US 2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人,2004,Nature[自然]432:1050-1054所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序做出单氨基酸或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程与PCR技术的组合。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、合成RNA、mRNA或它们的组合。
在一方面，该多核苷酸是分离的。
在另一方面，该多核苷酸是纯化的。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
启动子
控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于指导本发明的多核苷酸在细菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例描述于Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Lab.[冷泉港实验室],纽约，Davis等人,2012,Basic Methodsin Molecular Biology[分子生物学的基本方法],Elsevie[爱思唯尔出版公司]，以及Song等人,2016,PLOS One[公共科学图书馆综合]11(7):e0158447中。
终止子
控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子可从以下项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌(Escherichia coli)核糖体RNA(rrnB)。
mRNA稳定剂
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区域的实例获得自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177:3465-3471)。
真菌细胞的mRNA稳定子区域的实例描述于Geisberg等人,2014,Cell[细胞]156(4):812-824以及Morozov等人,2006,Eukaryotic Cell[真核细胞]5(11):1838-1846中。
前导序列
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5'-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
细菌宿主细胞的合适前导序列由Hambraeus等人,2000,Microbiology[微生物学]146(12):3051-3059以及Kaberdin和2006,FEMS Microbiol.Rev.[FEMS微生物学综述]30(6):967-979描述。
多腺苷酸化序列
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即，与多核苷酸的3’-末端可操作地连接并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
信号肽
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
前肽
控制序列也可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成活性变体。前肽编码序列可从以下项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)虫漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-因子。
在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，将前肽序列紧邻变体的N-末端定位并且将信号肽序列紧邻该前肽序列的N-末端定位。
调节序列
还令人希望的可以添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。
转录因子
控制序列也可以是转录因子，即编码多核苷酸特异性DNA结合多肽的多核苷酸，其通过与特定多核苷酸序列结合来控制遗传信息从DNA到mRNA的转录速率。转录因子可单独发挥作用和/或与复合物中的一种或多种其他多肽或转录因子一起通过促进或阻断RNA聚合酶的募集而发挥作用。转录因子的特征在于包含至少一个DNA结合结构域，该结合结构域通常附接到与由转录因子调节的遗传元件相邻的特定DNA序列。转录因子可直接(即通过与其启动子结合来激活编码目的蛋白的基因的转录)或间接(即诸如通过与另外的转录因子(其调节编码目的蛋白的基因的转录)的启动子结合来激活另外的转录因子的转录)调节目的蛋白的表达。真菌宿主细胞的合适转录因子描述于WO 2017/144177中。原核宿主细胞的合适转录因子描述于Seshasayee等人,2011,Subcellular Biochemistry[亚细胞生物化学]52:7-23以及Balleza等人,2009,FEMS Microbiol.Rev.[FEMS微生物学综述]33(1):133-151中。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的至少一个元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖于编码多肽的多核苷酸序列或用于通过同源重组(诸如同源定向修复(HDR))或非同源重组(诸如非同源末端连接(NHEJ))整合到基因组中的载体的任何其他元件。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体能够在讨论中的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
可将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。例如，将2个或3个或4个或5个或更多个拷贝插入宿主细胞。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至指导本发明变体的产生的一个或多个调控序列的本发明的多核苷酸。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。重组宿主细胞可包含本发明的多核苷酸的单拷贝或至少两个拷贝，例如三个、四个、五个或更多个拷贝。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的变体的任何细胞，例如原核细胞或真菌细胞。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何微生物细胞，例如原核细胞或真菌细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。在实施例中，芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞。
出于本发明的目的，芽孢杆菌类/属/种应如Patel和Gupta,2020,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志]70:406-438中所述的进行定义。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
用于将DNA引入原核宿主细胞中的方法是本领域熟知的，并且可以使用任何合适的方法，包括但不限于原生质体转化、感受态细胞转化、电穿孔、接合、转导，其中DNA作为线性化或环状多核苷酸引入。本领域技术人员将能够容易地根据例如属来确定用于将DNA引入给定原核细胞中的合适方法。用于将DNA引入原核宿主细胞中的方法例如描述于Heinze等人,2018,BMC Microbiology[BMC微生物学]18:56，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]64:391-397以及Donald等人,2013,J.Bacteriol.[细菌学杂志]195(11):2612-2620中。
在一方面，宿主细胞是分离的，优选地该宿主细胞是纯化的。
生产方法
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适用于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在合适的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体，包括但不限于使用特异性抗体、酶产物形成、酶底物消失或者确定变体的相对活性或比活性的酶测定法。
可使用本领域已知的方法从培养基中回收变体，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一方面，回收全发酵液。在另一方面，回收包含多肽的无细胞发酵液。
变体可以通过本领域已知的多种程序来纯化，以获得基本上纯的变体和/或片段(参见例如，Wingfield,2015,Current Protocols in Protein Science[蛋白质科学的最新方案]；80(1):6.1.1-6.1.35；Labrou,2014,Protein Downstream Processing[蛋白质下游加工],1129:3-10)。
在可替代的方面，不回收变体。
甘露聚糖酶颗粒
本发明还涉及包含本发明的变体的酶颗粒/粒子。在实施例中，颗粒包含核心以及任选地包围该核心的一个或多个包衣(外层)。
核心的直径(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。可以使用激光衍射诸如使用马尔文帕纳科公司(Malvern)Mastersizer和/或在ISO13320(2020)下描述的方法来测定作为当量球径测量的核心直径。
在实施例中，核心包含本发明的变体。
核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。
核心可以包括粘合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。
核心典型地作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。
核心可以包括惰性粒子，其中变体被吸附到该惰性粒子中，或者被施加(例如，通过流化床包衣)到表面上。
核心的直径可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。
核心可被至少一个包衣包围，例如以改善储存稳定性、减少处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一种或多种包衣可包括盐包衣或其他合适的包衣材料，诸如聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。
可按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％或至少15％)的量施加包衣。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。
包衣优选地是至少0.1μm厚，特别是至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在一些实施例中，包衣的厚度低于100μm，诸如低于60μm或低于40μm。
包衣应通过形成基本上连续的层来密封核心单元。基本上连续的层应被理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。
包衣可以进一步含有如本领域已知的其他材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，诸如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。
盐包衣可包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
为了提供可接受的保护，盐包衣优选地是至少0.1μm厚，例如至少0.5μm、至少1μm、至少2μm、至少4μm、至少5μm或至少8μm。在特别的实施例中，盐包衣的厚度低于100μm，诸如低于60μm或低于40μm。
盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中这些细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。
盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。
盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(小于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。
包衣中的盐在20℃下可具有60％以上、特别是70％以上、80％以上或85％以上的恒定湿度，或者它可以是这样的盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。盐包衣可以如WO00/01793或WO 2006/034710中所述。
合适的盐的特定实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2和乙酸镁。
盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。特定实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠和四水乙酸镁。
优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。
包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
颗粒可任选地具有一个或多个另外的包衣。合适的包衣材料的实例是聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。具有多种包衣的酶颗粒的实例描述于WO 93/07263和WO 97/23606中。
该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。
用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔出版公司]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：
(a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含酶的微粒状材料。用这种方法可以产生非常小的粒子(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant ScienceSeries[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。
(b)层状产品，其中酶在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液典型地在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有希望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有希望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于，例如，WO 97/23606中。
(c)吸收的核心粒子，其中不是将该变体在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。
(d)挤出或丸粒化的产品，其中将含变体糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些丸粒。这样的粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的(MichaelS.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。
(e)喷射造粒产品，其中将含变体粉末悬浮于熔化的蜡中，并将悬浮液喷射(例如通过转盘喷雾器)到冷却室中，在此冷却室中液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。所获得的产品是变体均匀分布在整个惰性材料中而不是集中在其表面上的产品。US 4,016,040和US 4,713,245描述了这种技术。
(f)混合器造粒产品，其中将含变体液体添加到常规造粒组分的干燥粉末组合物中。将液体和粉末以合适的比例混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。这样的方法描述于US 4,106,991、EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在该过程的特定方面，各种高剪切混合器可以用作造粒机。将由变体、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，从而产生所谓的T-颗粒。经强化的粒子更加坚固，并释放更少的酶粉尘。
(g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社]中。
(h)流化床造粒。流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流体化粒子上。被喷射的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着到其上以形成颗粒。
(i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用在饲料或酶工业中用于干燥颗粒的其他已知的方法。干燥优选地在从25℃至90℃的产品温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含变体的核心在用盐包衣之前含有少量的水。如果在去除过量的水之前用盐包衣水敏性酶，则过量的水将被截留在核心中并且可能对酶的活性产生负面影响。干燥之后，这些核心优选地含有0.1％w/w-10％w/w的水。
无粉尘颗粒可例如如US 4,106,991和US 4,661,452中所披露产生，并且可任选地通过本领域已知的方法被包衣。
该颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com披露内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露于WO 2013/188331中。
本发明还涉及根据EP 238216中披露的方法制备的受保护的酶。
在实施例中，颗粒进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、半纤维素酶、黄原胶内切葡聚糖酶、黄原胶裂解酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、虫漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、角叉菜胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、木聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、多半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、地衣多糖酶、昆布多糖酶和DNA酶或其任何组合。
液体配制品
本发明还涉及包含本发明的变体的液体组合物。该组合物可包含酶稳定剂(该酶稳定剂的实例包括多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸)。
在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种载剂材料以增加这样的组合物的体积。合适的填料或载剂材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的合适的填料或载剂材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。这样的醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有从约5％至约90％的这样的材料。
在一方面，液体配制品包含20％-80％w/w的多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％-2％w/w防腐剂。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％-25％w/w的本发明的变体；
(B)20％-80％w/w的多元醇；
(C)任选地0.001％-2％w/w防腐剂；以及
(D)水。
在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：
(A)0.001％-25％w/w的本发明的变体；
(B)0.001％-2％w/w防腐剂；
(C)任选地20％-80％w/w的多元醇；以及
(D)水。
在另一个实施例中，液体配制品包含一种或多种配制剂，如选自由以下组成的组的配制剂：多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自由以下组成的组：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。在一个实施例中，多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。
在另一个实施例中，防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，液体配制品包含0.02％-1.5％w/w防腐剂，例如0.05％-1％w/w防腐剂或0.1％-0.5％w/w防腐剂。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％-2％w/w防腐剂(即防腐剂的总量)，例如0.02％-1.5％w/w防腐剂、0.05％-1％w/w防腐剂或0.1％-0.5％w/w防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。
在另一个实施例中，液体配制品进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、氧化还原酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、半纤维素酶、黄原胶内切葡聚糖酶、黄原胶裂解酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、虫漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、角叉菜胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、木聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、多半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、地衣多糖酶、昆布多糖酶和DNA酶或其任何组合。
其他酶
在一个实施例中，将本发明的甘露聚糖酶变体与一种或多种酶，如至少两种酶，更优选地至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白水解活性、淀粉分解活性、脂肪分解活性、半纤维素分解活性、甘露聚糖酶活性或果胶分解活性。
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、另外的甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，虫漆酶)和/或过氧化物酶、地衣多糖酶、昆布多糖酶、DNA酶。
通常，一种或多种所选酶的特性应与所选的洗涤剂相容(即，最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：
合适的纤维素酶包括动物、植物或微生物来源的那些。特别合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和WO 1999/001544中的那些纤维素酶变体。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶：
合适的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如微生物或植物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，如描述于US7262042和WO09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)；和描述于WO89/06279中的迟缓枯草杆菌(subtilisin lentus)蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO92/175177、WO01/016285、WO02/026024和WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO05/040372中)、以及源自纤维单胞菌属(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。
另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO95/23221中)及其变体(描述于WO92/21760、WO95/23221、EP1921147以及EP1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如WO07/044993(杰能科国际公司)中所述的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO92/19729、WO96/034946、WO98/20115、WO98/20116、WO99/011768、WO01/44452、WO03/006602、WO04/03186、WO04/041979、WO07/006305、WO11/036263、WO11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选的蛋白酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
合适的可商购的蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTM、DurazymTM、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTM、PurafectPurafectPurafectEffectenzTM、 和(丹尼斯克公司(Danisco)/杜邦公司(DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(US5352604的图29中所示的序列)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶：
合适的脂肪酶包括动物、植物或微生物来源的那些。特别合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(与嗜热丝孢菌属(Thermomyces)同义)，例如来自如EP 258 068和EP 305216中描述的疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))或来自如WO 96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种(Pseudomonassp.)菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人,1993,Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报],1131:253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。
优选的可商购的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和LipexTM(诺维信公司)。
淀粉酶：
可以与本发明的甘露聚糖酶一起使用的合适的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。合适的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。不同的合适的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的其变体。SEQ IDNO:6的优选的变体是在位置181和182处具有缺失并且在位置193处具有取代的那些。其他合适的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209、和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的变体：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的合适的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQ IDNO:6具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失、或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304、和476中的一个或多个位置处具有取代的那些。可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ IDNO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10，或与WO 08/153815的SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的其变体，或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的其变体的淀粉酶。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211、和264。另外的合适的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444、和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E、以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。其他合适的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345、和A339，最优选的是另外地在所有这些位置处具有取代的变体。其他实例是淀粉酶变体，例如WO2011/098531、WO2013/001078和WO2013/001087中所述的那些。可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase以及Preferenz S100(来自杰能科国际公司/杜邦公司)。
过氧化物酶/氧化酶：
合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌、或真菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
果胶酶
果胶裂解酶(果胶酶)可以根据它们的优选底物(高度甲基酯化的果胶或低甲基酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及它们的反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位点切割聚合物以产生寡聚物混合物；或者它们可以是外切作用，即从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)提供的酶分类中包括了几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，如果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.82)。
已经从不同的细菌属如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和黄单孢菌属(Xanthomonas)克隆了果胶裂解酶。还描述了从枯草芽孢杆菌(Nasser等人(1993)FEBS 335:319-326)和芽孢杆菌属物种YA-14(Kim等人(1994)Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学生物技术和生物化学]58:947-949)克隆果胶裂解酶。果胶裂解酶通常特征在于碱性最适pH和对二价阳离子的绝对需要，Ca2+最有刺激性。
来自枯草芽孢杆菌的果胶裂解酶的变体尤其在专利申请WO 2002/092741、WO2003/095638和WO 2018/007435中进行了披露。
黄原胶内切葡聚糖酶
黄原胶内切葡聚糖酶是表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶，该酶能够与合适的黄原胶裂解酶一起催化黄原胶的1,4-连接的β-D-葡萄糖聚合主链的水解。这样的内切葡聚糖酶披露于WO 2018/037062中。可以使用由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279,1972开发的比色测定来确定黄原胶内切葡聚糖酶活性。
黄原胶内切葡聚糖酶的实例是具有SEQ ID NO:31的多肽。
黄原胶裂解酶
黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶并且已被描述于文献中。黄原胶裂解酶在本领域中是已知的，例如已经分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)XL-1的两种黄原胶裂解酶(例如，Ruijssenaars等人(1999)‘Apyruvated mannose-specific xanthan lyase involved in xanthandegradation by Paenibacillus alginolyticus XL-1[一种涉及溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶的丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]65(6):2446-2452，和Ruijssenaars等人(2000),‘Anovel gene encodingxanthan lyase ofPaenibacillus alginolyticus strain XL-1[一种编码溶藻弧菌类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶裂解酶的新颖基因]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]66(9):3945-3950)。
黄原胶裂解酶根据酶命名法分类为EC 4.2.2.12。该酶属于裂解酶家族，特别是那些作用于多糖的碳-氧裂解酶。
WO 2017/046260披露了具有黄原胶降解活性的多肽。
黄原胶裂解酶的实例是具有SEQ ID NO:30的多肽。
木葡聚糖酶
木葡聚糖酶能够催化木葡聚糖溶解为木葡聚糖寡糖。一些木葡聚糖酶仅表现出木葡聚糖酶活性，而其他木葡聚糖酶表现出木葡聚糖酶活性和纤维素酶活性两者。木葡聚糖酶可分类为EC 3.2.1.4或EC.3.2.1.151。具有木葡聚糖酶活性的酶例如在Vincken等人.(1997)Carbohydrate Research[碳水化合物研究]298(4):299-310中描述，其中表征了来自绿色木霉(Trichoderma viride)(类似于里氏木霉(T.reesei))的三种不同的内切葡聚糖酶EndoI、EndoV和EndoVI。EndoI、EndoV和EndoVI分别属于糖基水解酶家族5、7和12，参见Henrissat,B.(1991)Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316以及Henrissat,B.和Bairoch,A.(1993)Biochem.J.[生物化学杂志]293:781-788。WO 94/14953披露了从真菌棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)克隆的家族12木葡聚糖酶(EG II)。WO 99/02663披露了分别从地衣芽孢杆菌和黏琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)克隆的家族12和家族5木葡聚糖酶。WO 01/062903披露了家族44木葡聚糖酶。
WO 2009/147210披露了木葡聚糖酶变体。WO 99/02663和WO 01/062903表明木葡聚糖酶可用于洗涤剂中。
地衣聚糖酶/β-葡聚糖酶：
合适的地衣聚糖酶(地衣多糖酶)包括细菌或真菌来源的那些。它们可以经化学修饰或蛋白质工程化。有用的β-葡聚糖酶的实例包括WO 2015/144824(诺维信公司)和WO 99/06516(德国汉高公司(Henkel KGAA))中描述的那些。
核酸酶：
合适的核酸酶包括脱氧核糖核酸酶(DNA酶)和核糖核酸酶(RNA酶)，它们是分别催化DNA或RNA主链中磷酸二酯键的水解切割从而降解DNA和RNA的任何酶。根据活性的位点有两种主要的分类。外切核酸酶从末端消化核酸。内切核酸酶作用于靶分子中间的区域。核酸酶优选为DNA酶，其优选可获自微生物，优选真菌或细菌。特别地，可获自芽孢杆菌属的物种的DNA酶是优选的；特别地，可获自食物芽孢杆菌(Bacillus cibi)、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的DNA酶是优选的。这样的DNA酶的实例在WO 2011/098579、WO2014/087011和WO2017/060475中描述。还特别优选的是可获自曲霉属物种的DNA酶；特别是可获自米曲霉的DNA酶，如WO 2015/155350中描述的DNA酶。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是如以上所描述的非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆料。
甘露聚糖酶
合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是来自黏琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌、或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。其他可商购的甘露聚糖酶是披露于SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的甘露聚糖酶。
黄原胶酶
黄原胶的完全酶降解需要酶活性，其包括如上所述的黄原胶裂解酶活性和黄原胶内切葡聚糖酶活性。用于降解黄原胶的黄原胶裂解酶和内切葡聚糖酶以及这样的酶用于清洁目的(例如去除含有黄原胶的污渍)以及在钻探和石油工业中的用途是本领域已知的，例如，来自WO 2013/167581 A1。
在本发明的上下文中，术语黄原胶酶(Xanthanase或xanthanase)意指包括黄原胶裂解酶活性和黄原胶内切葡聚糖酶活性的酶活性的组合。
可商购的黄原胶酶是来自诺维信公司的产品Caledonia 100L。
在本发明的优选的方面，本发明的甘露聚糖酶变体可以与至少一种另外的酶(例如至少两种、三种、四种或五种酶)组合，这些另外的酶详细描述于“其他酶”部分中。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性、蛋白水解活性、淀粉分解活性、脂肪分解活性、半纤维素分解活性、果胶分解活性，或与本发明的甘露聚糖酶变体相比具有不同底物特异性的甘露聚糖酶，例如GH5甘露聚糖酶。酶组合可以例如是本发明的甘露聚糖酶与另一种去污酶，例如本发明的甘露聚糖酶与蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶)、本发明的甘露聚糖酶与淀粉酶、本发明的甘露聚糖酶与纤维素酶、本发明的甘露聚糖酶与脂肪酶、本发明的甘露聚糖酶与角质酶、本发明的甘露聚糖酶与果胶酶。更特别优选的是本发明的甘露聚糖酶与具有碳水化合物分解活性的另一种酶，例如纤维素酶，例如内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶。
更优选地，本发明的甘露聚糖酶与至少两种其他去污酶组合，例如本发明的甘露聚糖酶、脂肪酶及淀粉酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及淀粉酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及脂肪酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及纤维素酶如内切葡聚糖酶或β-葡聚糖酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及半纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶如内切葡聚糖酶或β-葡聚糖酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶及半纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、脂肪酶及纤维素酶如内切葡聚糖酶或β-葡聚糖酶；或本发明的甘露聚糖酶、脂肪酶及半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的甘露聚糖酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及半纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶及半纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶及半纤维素酶。根据本发明的甘露聚糖酶可以与选自包含以下的非穷尽性列表的任何酶组合：糖酶，如淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、黄原胶内切葡聚糖酶或支链淀粉酶、肽酶、蛋白酶或脂肪酶。
在优选的实施例中，本发明的甘露聚糖酶与丝氨酸蛋白酶例如S8家族蛋白酶(如)组合。
在本发明的另一个实施例中，本发明的甘露聚糖酶可以与一种或多种金属蛋白酶(如M4金属蛋白酶，包括或嗜热菌蛋白酶)组合。这样的组合可以进一步包含如上概述的其他洗涤剂酶的组合。
在特别优选的实施例中，本发明的甘露聚糖酶与GH5甘露聚糖酶、特别是选自下组的GH5甘露聚糖酶组合，该GH5甘露聚糖酶是与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少60％，例如至少70％或至少80％的同一性的甘露聚糖酶，例如与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少85％、至少90％、至少95％或者甚至100％的同一性的甘露聚糖酶。
在更特别的实施例中，甘露聚糖酶变体与GH5甘露聚糖酶组合，该甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者甚至100％的同一性，该GH5甘露聚糖酶选自下组：与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少80％的同一性的甘露聚糖酶，例如与SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性的甘露聚糖酶。
在另一个实施例中，本发明的甘露聚糖酶变体与黄原胶裂解酶或黄原胶内切葡聚糖酶、或者黄原胶裂解酶和黄原胶内切葡聚糖酶两者组合。优选的黄原胶裂解酶与SEQ IDNO:30具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:30的黄原胶裂解酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性。优选的黄原胶内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:31具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:31的黄原胶内切葡聚糖酶具有至少85％、至少90％、至少95％或者甚至100％的同一性。
在更特别的实施例中，甘露聚糖酶变体与黄原胶裂解酶组合，该甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该黄原胶裂解酶与SEQ ID NO:30具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:30的黄原胶裂解酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性。
在另一个特别的实施例中，甘露聚糖酶变体与黄原胶内切葡聚糖酶组合，该甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该黄原胶内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:31具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:31的黄原胶裂解酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性。
在更特别的实施例中，甘露聚糖酶变体与黄原胶裂解酶和黄原胶内切葡聚糖酶组合，该甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶具有至少80％的同一性，例如与SEQ IDNO:3的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该黄原胶裂解酶与SEQ ID NO:30具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:30的黄原胶裂解酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性，该黄原胶内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:31具有至少80％的同一性，例如与SEQ ID NO:31的黄原胶内切葡聚糖酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性。
洗涤剂成分
表面活性剂
典型地，洗涤剂组合物包含(按该组合物的重量计)在以下范围内的一种或多种表面活性剂：0％至50％，优选地2％至40％，更优选地5％至35％，更优选地7％至30％，最优选地10％至25％，甚至最优选地15％至20％。在优选的实施例中，洗涤剂是液体或粉末洗涤剂，其包含按重量计小于40％，优选地小于30％，更优选地小于25％，甚至更优选地小于20％的表面活性剂。组合物可以包含1％至15％，优选地2％至12％、3％至10％，最优选地4％至8％，甚至最优选地4％至6％的一种或多种表面活性剂。优选的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂及其混合物。优选地，表面活性剂的主要部分是阴离子的。合适的阴离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包含脂肪酸羧酸酯(皂)，支链、直链和随机链烷基硫酸酯或脂肪醇硫酸酯或伯醇硫酸酯或烷基苯磺酸酯(如LAS和LAB)或苯基链烷磺酸酯(phenylalknesulfonate)或烯基磺酸酯或烯基苯磺酸酯或烷基乙氧基硫酸酯或脂肪醇醚硫酸酯或α-烯烃磺酸酯或十二烯基/十四烯基(tetradecnyl)琥珀酸。阴离子表面活性剂可以被烷氧基化。洗涤剂组合物还可以包含1wt％至10wt％的非离子表面活性剂，优选地2wt％至8wt％，更优选地3wt％至7wt％，甚至更优选地小于5wt％的非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包含醇乙氧基化物、和/或烷基乙氧基化物、和/或烷基酚乙氧基化物、和/或葡糖酰胺(如脂肪酸N-葡糖基N-甲基酰胺)、和/或烷基多聚葡糖苷和/或单-或二乙醇酰胺或脂肪酸酰胺。洗涤剂组合物还可以包含0wt％至10wt％的阳离子表面活性剂，优选地0.1wt％至8wt％，更优选地0.5wt％至7wt％，甚至更优选地小于5wt％的阳离子表面活性剂。合适的阳离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包含烷基季铵化合物、和/或烷基吡啶化合物和/或烷基季磷鎓化合物和/或烷基三元硫化合物。组合物优选包含在衣物洗涤过程中于洗涤液中提供100ppm至5,000ppm表面活性剂的量的表面活性剂。组合物与水接触后典型地形成洗涤液，该洗涤液包含0.5g/l至10g/l洗涤剂组合物。许多合适的表面活性化合物是可获得的并且于文献中充分描述，例如由Schwartz、Perry和Berch描述于“Surface-Active Agents and Detergents[表面活性剂与洗涤剂]”，第I卷和第11卷中。还优选的是生物基表面活性剂，其可以整体是生物基的(根据欧洲标准EN 17035，生物基碳在总碳中>95％)。如本文所用，生物基表面活性剂是全部或大部分由生物产品或可再生农业材料或林业材料组成和/或由欧洲标准EN 16575:2014确立的商业或工业产品(除了食品或饲料)。特别地，鼠李糖脂和槐糖脂可以用作洗涤剂成分。
助洗剂
助洗剂的主要作用在于从洗涤溶液中螯合二价金属离子(如钙离子和镁离子)，该洗涤溶液否则将与表面活性剂系统消极地相互作用。助洗剂还可有效从织物表面去除金属离子和无机污垢，从而改善地去除微粒和饮料污渍。助洗剂也是一种碱度来源并且将洗涤水的pH缓冲至9.5至11的水平。缓冲能力也叫做储备碱度并且应该优选地大于4。
本发明的洗涤剂组合物可以包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。许多合适的助洗剂系统描述于文献中，例如描述于Powdered Detergents[粉状洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,Marcel Dekker,Inc[马塞尔·德克尔公司]中。按主题组合物的重量计，助洗剂可以包含0％至60％，优选地5％至45％，更优选地10％至40％，最优选地15％至35％，甚至更优选地20％至30％的助洗剂。按主题组合物的重量计，组合物可以包含0％至15％，优选地1％至12％、2％至10％，最优选地3％至8％，甚至最优选地4％至6％的助洗剂。
助洗剂包括但不限于聚磷酸盐的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐(例如，三聚磷酸盐STPP)，碱金属硅酸盐，碱土金属盐和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐助洗剂(例如，沸石)以及聚羧酸化合物，醚羟基聚羧酸酯，马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，和羧基甲氧基琥珀酸，聚乙酸的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)，连同聚羧酸酯，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶性盐。乙醇胺(MEA、DEA和TEA)也可以有助于液体洗涤剂中的缓冲能力。
漂白剂
本发明的洗涤剂组合物可以包含一种或多种漂白剂。特别地，粉状洗涤剂可以包含一种或多种漂白剂。合适的漂白剂包括其他光漂白剂、预形成的过酸、过氧化氢源、漂白活化剂、过氧化氢、漂白催化剂及其混合物。通常，当使用漂白剂时，本发明的组合物可以包含按主题清洁组合物的重量计约0.1％至约50％、或甚至约0.1％至约25％的漂白剂。合适的漂白剂的实例包括：
(1)其他光漂白剂，例如维生素K3；
(2)预形成的过酸：合适的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：过氧化羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone))及其混合物。合适的过氧化羧酸包括具有式R-(C＝O)O-O-M的疏水性和亲水性过酸，其中R是烷基(任选地是支链的)，当该过酸是疏水性的，具有6至14个碳原子或8至12个碳原子，并且当该过酸是亲水性的，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且M是平衡离子，例如钠、钾或氢；
(3)过氧化氢源，例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面中，无机过氧化氢合物盐选自由以下组成的组：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在，并且典型地被掺入这样的组合物中作为可以被包衣的结晶固体。合适的包衣包括无机盐，如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。有用的漂白组合物描述于美国专利号5,576,282和6,306,812中；
(4)具有R-(C＝O)-L的漂白活化剂，其中R是烷基(任选地是支链的)，当该漂白活化剂是疏水性的，具有6至14个碳原子或8至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水性的，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且L为离去基团。合适的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。合适的漂白活化剂包括十二烷酰基羟苯磺酸盐(dodecanoyl oxybenzene sulphonate)、癸酰基羟苯磺酸盐、癸酰基羟苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基羟苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰基羟苯磺酸盐(NOBS)。合适的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可采用任何合适的漂白活化剂，但在本发明的一方面，主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物；以及
(5)能够接受来自过氧酸的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化底物的漂白催化剂描述于WO 2008/007319中。合适的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。漂白催化剂将典型地以按重量计0.0005％至0.2％、0.001％至0.1％、或甚至0.005％至0.05％的水平被包含在洗涤剂组合物中。
当存在时，基于组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以约0.1wt％至约60wt％、约0.5wt％至约40wt％、或甚至约0.6wt％至约10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水过酸或其前体与一种或多种亲水过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
辅助材料
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。特别地，粉状洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚的或共聚的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制试剂能够以按该组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些另外的组分可以给正在清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。在本发明的组合物中可以使用合适的用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和双苯基-联苯乙烯基衍生物。
优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。
还优选的荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)供应。
适合用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的荧光增亮剂水平包括约0.01wt％、0.05wt％、约0.1wt％或甚至约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
织物调色剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收来改变所述织物色彩的染料或颜料。荧光增白剂发射至少一些可见光。相反，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土缀合物，并且还可以包括颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1 876 226中。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物呈单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。
污垢释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，如棉和基于聚酯的织物上去除污垢，特别是从基于聚酯的织物上去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子或阴离子对苯二甲酸盐的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉状洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷,第7章,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔·德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细所述的。此外，任意接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1 867 808或WO2003/040279中描述的那些。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素、及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
其他合适的辅助材料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载剂、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填料、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹力剂。
在一方面，洗涤剂是压缩流体衣物洗涤剂组合物，其包含：a)按该组合物的重量计，至少约10％，优选地20％至80％的表面活性剂，该表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、皂及其混合物；b)按该组合物的重量计，约1％至约30％，优选地5％至30％的水；c)按该组合物的重量计，约1％至约15％，优选地3％至10％的非氨基官能溶剂；以及d)按该组合物的重量计，约5％至约20％的性能添加剂，该性能添加剂选自螯合剂、污垢释放聚合物、酶及其混合物；其中该压缩流体衣物洗涤剂组合物包含以下中的至少一种：
(i)该表面活性剂具有的阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的重量比为约1.5:1至约5:1，该表面活性剂包含按该组合物的重量计约15％至约40％的阴离子表面活性剂并且包含按该组合物的重量计约5％至约40％的皂；(ii)包含按该组合物的重量计约0.1％至约10％的泡沫促进剂，该泡沫促进剂选自泡沫促进聚合物、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、胺氧化物表面活性剂、两性表面活性剂、及其混合物；以及(ii)(i)和(ii)两者。所有成分都描述于WO 2007/130562中。可用于洗涤剂配制品中的另外的聚合物描述于WO 2007/149806中。
在另一方面，洗涤剂是压缩颗粒状(粉状)洗涤剂，其包含：a)按该组合物的重量计，至少约10％、优选地15％至60％的表面活性剂，该表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、皂及其混合物；b)按该组合物的重量计，约10％至80％、优选地20％至60％的助洗剂，其中该助洗剂可以是选自以下的助洗剂的混合物：i)磷酸盐助洗剂，优选地少于20％、更优选地少于10％、甚至更优选地少于5％的总助洗剂是磷酸盐助洗剂；ii)沸石助洗剂，优选地少于20％、更优选地少于10％、甚至更优选地少于5％的总助洗剂是沸石助洗剂；iii)柠檬酸盐，优选地0至5％的总助洗剂是柠檬酸盐助洗剂；iv)聚羧酸盐，优选地0至5％的总助洗剂是聚羧酸盐助洗剂；v)碳酸盐，优选地0至30％的总助洗剂是碳酸盐助洗剂以及vi)硅酸钠，优选地0至20％的总助洗剂是硅酸钠助洗剂；c)按该组合物的重量计，约0％至25％的填料，如硫酸盐，按该组合物的重量计，优选地1％至15％、更优选地2％至10％、更优选地3％至5％的填料；以及d)按该组合物的重量计，约0.1％至20％的酶，按该组合物的重量计，优选地1％至15％、更优选地2％至10％的酶。
对于洗涤剂配制者而言重要的污垢和污渍由许多不同物质构成，并且已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶以用于在涉及衣物洗涤和硬表面清洁(如餐具洗涤)两者的洗涤剂中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的清洁过程相比，它们在其应用至其中的同一过程中特异性地改善污渍去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。
清洁过程或纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽和脸盆清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或服装的方法，其中该方法包括用含有洗涤剂组合物和本发明的至少一种甘露聚糖酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以是例如含有洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。
经过本发明的洗涤、清洁或者纺织品护理过程的织物和/或服装可以是常规的可洗涤衣物，例如家用衣物。优选地，衣物的主要部分是服装和织物，包括针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布。这些织物可以是基于纤维素的，如天然纤维素，包括棉、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维或其共混物。这些织物还可以是基于非纤维素的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳香族聚酰胺、聚酯、丙烯酸酯、聚丙烯和氨纶/弹性纤维；或其共混物连同基于纤维素和基于非纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻、亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变时，需要与常用的洗涤剂酶(如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)相比具有可替代的和/或改善特性的新酶活性或新酶，以实现当与传统洗涤剂组合物相比时相似的或改善的洗涤性能。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正在清洁的污渍被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化去除颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。还有其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中去除金属离子来软化洗涤水。
在特别的实施例中，本发明涉及包含本发明的甘露聚糖酶的组合物在衣物洗涤或餐具洗涤中的用途，其中所述组合物进一步包含以下中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。
在本发明的优选的实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量与在未添加本发明的甘露聚糖酶的情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比有所减少。优选地，作为表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的至少一种组分以这样的量存在，该量比该组分在未添加本发明甘露聚糖酶的系统中的量(如这样的组分的常规量)少1％、例如少2％、例如少3％、例如少4％、例如少5％、例如少6％、例如少7％、例如少8％、例如少9％、例如少10％、例如少15％、例如少20％、例如少25％、例如少30％、例如少35％、例如少40％、例如少45％、例如少50％。在一方面，将本发明的甘露聚糖酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
还优选的是生物基表面活性剂，其可以整体是生物基的(根据欧洲标准EN 17035，生物基碳在总碳中>95％)。如本文所用，生物基表面活性剂是全部或大部分由生物产品或可再生农业材料或林业材料组成和/或由欧洲标准EN 16575:2014确立的商业或工业产品(除了食品或饲料)。
可以使用另外的生物基表面活性剂，例如其中表面活性剂是基于糖的非离子表面活性剂，其可以是己基-β-D-麦芽吡喃糖苷、硫代麦芽吡喃糖苷或环状麦芽吡喃糖苷，例如EP2516606 B1中所述。其他生物基表面活性剂可以包括鼠李糖脂和槐糖脂。
当被包括在洗涤剂中时，生物基表面活性剂的量为1％–25％(和/或低于上文指定的表面活性剂的水平)。
在实施例中，提供了包含如本文所述的甘露聚糖酶变体和另外的甘露聚糖酶的洗涤剂组合物，并且其中该另外的甘露聚糖酶是GH5甘露聚糖酶，例如与SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID:20或SEQ ID NO:21中的任一个具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、95％或者甚至100％的同一性的甘露聚糖酶。优选地本发明的甘露聚糖酶变体与GH5甘露聚糖酶之间的比率在1:3至3:1的范围内。
用途
本发明的甘露聚糖酶变体可以用于其中需要降解甘露聚糖的应用。其中可以使用甘露聚糖酶的实例是在从软木和棕榈仁滤饼生产生物乙醇中，用于改善动物饲料以及在咖啡的水解中。此外，瓜尔胶被用于很多食品中，并且被用于石油和天然气工业中，所以本发明的甘露聚糖酶可以用于洗涤剂中以去除含甘露聚糖污渍，用于水力压裂以产生从钻孔延伸进入岩层的地下压裂，从而增加岩层可以产生的流体的速率或用于清洁钻孔滤饼。因此甘露聚糖可以用于由钻井孔造成的地下地层的压裂中，或甘露聚糖可以被用作钻孔滤饼中的组分。
在一方面，第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品可用于降解甘露聚糖，如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。在一方面，第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品可用于降解甘露聚糖，如直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的过程。
在一方面，第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品可用于控制钻井液的粘度。在一方面，第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品可用于由钻井孔造成的地下地层的压裂中。
本发明的甘露聚糖酶变体可用于防止、减少或去除物品的恶臭。因此，在一个实施例中，第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品可用于防止、减少或去除物品的恶臭。
洗涤方法
本发明的洗涤剂组合物理想地适用于在衣物洗涤应用中使用。相应地，本发明包括用于洗涤织物的方法。该方法包括使有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包含在正常消费者使用条件下能够被洗涤的任何织物。溶液优选地具有约5.5至约8的pH。可以在溶液中按以下浓度使用组合物：约100ppm，优选地500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物的比率典型地是约1:1至约30:1。
在特别的实施例中，在约5.0至约11.5的pH下进行该洗涤方法，或在可替代的实施例中，甚至在约6至约10.5、如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或约7至约8、优选地约5.5至约9、并且更优选地约6至约8的pH下进行该洗涤方法。
在特别的实施例中，在如下硬度下进行该洗涤方法：约0°dH至约30°dH、如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
本发明涉及用包含本发明的甘露聚糖酶变体的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。
优选的实施例涉及清洁方法，所述方法包括以下步骤：在适合于清洁物体的条件下使所述物体与包含本发明的甘露聚糖酶变体的清洁组合物接触。在优选的实施例中，清洁组合物是洗涤剂组合物并且该过程是衣物洗涤或餐具洗涤过程。
仍另一个实施例涉及用于从织物上去除污渍的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下使所述织物与包含本发明的甘露聚糖酶变体的组合物接触。
低温用途
本发明的一个实施例涉及进行衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁的方法，该方法包括使有待清洁的表面与本发明的甘露聚糖酶变体接触，并且其中所述衣物洗涤、餐具洗涤、工业或机构清洁在约40℃或更低的温度下进行。本发明的一个实施例涉及甘露聚糖酶在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的用途，其中衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或更低。
在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明的甘露聚糖酶在蛋白质去除过程中的用途，其中该蛋白质去除过程中的温度是约40℃或更低。
在以上确定的方法和用途的每一者中，洗涤温度是约40℃或更低，例如约39℃或更低、例如约38℃或更低、例如约37℃或更低、例如约36℃或更低、例如约35℃或更低、例如约34℃或更低、例如约33℃或更低、例如约32℃或更低、例如约31℃或更低、例如约30℃或更低、例如约29℃或更低、例如约28℃或更低、例如约27℃或更低、例如约26℃或更低、例如约25℃或更低、例如约24℃或更低、例如约23℃或更低、例如约22℃或更低、例如约21℃或更低、例如约20℃或更低、例如约19℃或更低、例如约18℃或更低、例如约17℃或更低、例如约16℃或更低、例如约15℃或更低、例如约14℃或更低、例如约13℃或更低、例如约12℃或更低、例如约11℃或更低、例如约10℃或更低、例如约9℃或更低、例如约8℃或更低、例如约7℃或更低、例如约6℃或更低、例如约5℃或更低、例如约4℃或更低、例如约3℃或更低、例如约2℃或更低、例如约1℃或更低。
在另一个优选的实施例中，洗涤温度在约5℃-40℃的范围内，例如约5℃-30℃、约5℃-20℃、约5℃-10℃、约10℃-40℃、约10℃-30℃、约10℃-20℃、约15℃-40℃、约15℃-30℃、约15℃-20℃、约20℃-40℃、约20℃-30℃、约25℃-40℃、约25℃-30℃或约30℃-40℃。在特别优选的实施例中，洗涤温度是约20℃、约30℃、或约40℃。
本发明的甘露聚糖酶在防止、减少或去除生物膜方面的用途
当物品上存在微生物并且在物品上粘在一起时，生物膜会在纺织品上发展。一些微生物倾向于粘附至物品(如纺织品)的表面。一些微生物粘附至这样的表面并且在表面上形成生物膜。生物膜可以是粘性的并且粘附的微生物和/或生物膜会是难以去除的。此外，由于生物膜的粘性性质，生物膜粘附污垢。市场上可获得的商业衣物洗涤剂组合物并不去除这样的粘附的微生物或生物膜。
本发明的甘露聚糖酶在食品加工和动物饲料方面的用途
几种抗营养因素可能会限制特定植物材料在制备动物饲料和人类食品中的使用。例如，含有寡甘露聚糖(如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖)的植物材料会降低动物对营养化合物(如矿物质、维生素、糖和脂肪)的可消化性和吸收。特别地，这些负面影响是由于含甘露聚糖的聚合物的高粘度以及含甘露聚糖的聚合物吸收营养化合物的能力。使用降解含甘露聚糖的聚合物的酶，即内切-β-甘露聚糖酶(如本文所述的甘露聚糖酶)，可以降低这些作用，这些酶允许在饲料中包含较高比例的含廉价植物材料的含甘露聚糖的聚合物，从而降低了饲料成本。另外，通过本发明的甘露聚糖酶的活性，含甘露聚糖的聚合物被分解成更简单的糖，这些更简单的糖可以更容易地被同化以提供另外的能量。相应地，本发明进一步涉及将本发明的甘露聚糖酶用于食品或动物饲料的加工和/或制造。
相应地，本发明涉及包含本发明的甘露聚糖酶变体的动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品。
本发明进一步涉及用于制备这样的动物饲料组合物、和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将本发明的甘露聚糖酶变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。
此外，本发明还涉及本发明的甘露聚糖酶变体在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的用途。
本发明的甘露聚糖酶用于发酵饮料的用途
在一方面，本发明涉及制备发酵饮料如啤酒或葡萄酒的方法，该方法包括将第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品与麦芽和/或辅助剂混合。
另一个方面涉及提供发酵饮料的方法，该方法包括使醪液和/或麦芽汁与第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品接触的步骤。
在本发明的上下文中，术语“发酵饮料”意在包括通过以下方法生产的任何饮料，如葡萄酒或啤酒，该方法包括发酵过程，如微生物、细菌和/或酵母发酵。
在本发明的一方面，发酵饮料是啤酒。术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉的植物材料生产的任何发酵的麦芽汁。通常，啤酒是由麦芽或辅助剂或麦芽和辅助剂的任何组合作为含淀粉的植物材料生产的。如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。
如本文所用，术语“辅助剂”是指不是麦芽(如大麦或小麦麦芽)的任何含淀粉和/或糖的植物材料。作为辅助剂的实例，可以提及可用作淀粉来源的材料，如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用碾磨酵母、水稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、黑麦、燕麦、马铃薯、树薯、木薯和糖浆(如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆)等。
如本文所用，术语“醪液”是指任何含淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅助剂或其组合的水性浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和麦糟(spent grain)。
如本文所用，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化(mashing)期间，对谷粉进行提取后，未发酵的液体流出物(run-off)。
本发明的甘露聚糖酶用于处理咖啡提取物的用途
本发明的甘露聚糖酶变体也可以用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖。在某些优选的实施例中，本发明的甘露聚糖酶变体用于在液体咖啡提取物冷冻干燥期间抑制凝胶形成。提取物粘度的降低减少了干燥期间的能量消耗。在某些其他优选的实施例中，为了减少酶的消耗并避免咖啡提取物的污染，本发明的甘露聚糖酶变体以固定化形式应用。这种用途进一步披露于EP 676 145中。
通常，在本发明的分离的甘露聚糖酶变体或其片段或变体的存在下，在适合于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖的条件下孵育咖啡提取物。
因此，在一个实施例中，本发明涉及用于产生咖啡提取物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供经烘烤且研磨的咖啡豆；
(b)向所述咖啡豆中添加水和第一方面或第二方面的多肽、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品；
(c)孵育以制备水性咖啡提取物；以及
(d)从提取的咖啡豆中分离该咖啡提取物。
本发明的甘露聚糖酶在烘焙食品中的用途
在另一方面，本发明涉及制备烘焙产品的方法，该方法包括将第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品添加至面团，然后烘烤该面团。
烘焙产品的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括面包、面包卷、千层饼、甜发酵面团、小圆面包、蛋糕、咸饼干、饼干、小面包、华夫饼、威化饼、墨西哥玉米粉圆饼、早餐谷物、挤出产品等。
本发明的甘露聚糖酶变体可以作为面包改良剂组合物的一部分添加到面团中。面包改良剂是含有多种成分的组合物，其改善了面团特性和烘焙产品(例如面包和蛋糕)的质量。面包改良剂通常由于其有益效果(例如面团稳定性以及面包质地和体积)而被添加到工业烘焙过程中。面包改良剂通常含有脂肪和油连同添加剂(像乳化剂、酶、抗氧化剂、氧化剂、稳定剂和还原剂)。除了本发明的甘露聚糖酶变体之外，面包改良剂中也可能存在其他酶，包括淀粉酶、半纤维素酶、淀粉分解复合物、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶、支链淀粉酶、非淀粉多糖降解酶和氧化还原酶(像葡萄糖氧化酶、脂氧合酶或抗坏血酸氧化酶)。
在一方面，本发明的甘露聚糖酶变体可以作为面包改良剂组合物的一部分添加到面团中，该面包改良剂组合物还包含葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖源，如魔芋胶、瓜尔胶、刺槐豆胶(长角豆(Ceratonia siliqua))、干椰肉粕、象牙坚果甘露聚糖(象牙椰子(Phyteleohas macrocarpa))、海藻甘露聚糖提取物、椰子粕和啤酒酵母的细胞壁(可以是干燥的，或以啤酒酵母提取物的形式使用)。
本发明的另外的方面涉及本发明的甘露聚糖酶变体在面团中用于改善面团耐受性、柔性和粘性的用途。优选地，可以向其中添加本发明的甘露聚糖酶变体的面团不是纯小麦面粉面团，而是除了纯小麦面粉之外或代替纯小麦面粉，还包含麸皮或燕麦、水稻、小米、玉蜀黍或豆类面粉。
本发明的又另外的方面涉及本发明的任何甘露聚糖酶变体在面团中用于改善瓤结构(crumb structure)并延缓最终烘焙产品如面包的老化的用途。
本发明的甘露聚糖酶在乳制食品中的用途
在本发明的一方面，本发明的甘露聚糖酶变体可以添加到乳或还添加了葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的任何其他乳制品中。典型的葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖源在上文在烘焙方面列出，并包括瓜尔胶或魔芋胶。当在大肠或结肠中以有利的种群密度发现时，本发明的甘露聚糖酶变体与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的组合释放甘露聚糖酶水解产物(甘露寡糖(mannooligosaccharide))，该甘露聚糖酶水解产物通过促进通常与良好健康相关的益生菌(特别是双歧杆菌和乳酸杆菌乳酸菌)的选择性生长和增殖来充当可溶性益生元。
在一方面，本发明涉及制备乳或乳制品的方法，该方法包括向乳或乳制品中添加(a)葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖和(b)第一方面或第二方面的甘露聚糖酶变体、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品。
在本发明的一方面，在添加到基于乳品的食品中之前或之后，将本发明的甘露聚糖酶变体与任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖组合使用，以产生包含益生元甘露聚糖水解产物的基于乳品的食品。在本发明的另外的方面，如此生产的含甘露寡糖乳制品能够增加有益人肠道菌群中的种群，并且在本发明的又另外的方面，基于乳品的食品可包含本发明的甘露聚糖酶变体以及葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖的任何来源，并且剂量足以用于接种已知在人类大肠中有益的至少一种细菌菌株(如双歧杆菌或乳酸杆菌)。优选地，所述基于乳品的食品是酸奶或乳饮料。
本发明的甘露聚糖酶用于纸浆漂白的用途
本发明的甘露聚糖酶变体可进一步用于纸浆(如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。因此，本发明涉及漂白纸浆的方法，该方法包括将纸浆与第一方面或第二方面的多肽、第三方面或第四方面的洗涤剂组合物、第五方面或第六方面的颗粒或第七方面或第八方面的液体配制品一起孵育。
在一些实施例中，纸浆是用氧气、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施例中，本发明的甘露聚糖酶变体用于表现出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，本发明的甘露聚糖酶变体单独使用或优选与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合使用。
实施例
通过以下编号的段落进一步定义本发明：
1)一种SEQ ID NO:2的多肽的变体，其中在位置490和491处的氨基酸缺失，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％的序列同一性，并且其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
2)如实施例1所述的变体，其中该变体包含在N-末端和/或C-末端的一个或多个氨基酸的延伸，或在N-末端和/或C-末端的一个或多个氨基酸的截短，其条件是在C-末端的插入不是*490W和*491R。
3)如实施例1或2所述的变体，该变体包含来自N-末端的至少11个氨基酸，例如SEQID NO:2的氨基酸1至12、例如氨基酸1至13、例如氨基酸1至14或例如氨基酸1至15的缺失。
4)如实施例1至3中任一项所述的变体，该变体包含以下缺失：A1*+I2*+G3*+V4*+P5*+G6*+G7*+V8*+A9*+E10*+P11*+H12*+T13*+S14*+Q15*。
5)如实施例1至4中任一项所述的变体，该变体进一步包含取代D16A。
6)如实施例1至5中任一项所述的变体，该变体进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰：I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、H276C、R280K、F286C、G366N和D486E。
7)如实施例6所述的变体，该变体进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰：G20P、A101L、A111P、A118E、S137A、Q143R、R160L、V161A、E162D、R164S、R164P、R164A、R164K、I165G、I165A、I165P、I165T、I165E、M171I、N176S、P182R、Q183E、V244A、H324K和D385H。
8)如实施例1至7中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽、SEQ IDNO:4的多肽、SEQ ID NO:5的多肽、SEQ ID NO:6的多肽或SEQ ID NO:7的多肽、SEQ ID NO:22的多肽、SEQ ID NO:23的多肽、SEQ ID NO:24的多肽、SEQ ID NO:25的多肽、SEQ ID NO:26的多肽、SEQ ID NO:27的多肽、SEQ ID NO:28的多肽、或SEQ ID NO:29的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％，例如至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.5％、至少93.9％、至少94％、至少94.5％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、或99.9％或者甚至100％的序列同一性，其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
9)一种酶组合物，其包含如权利要求1至8中任一项所述的变体和GH5甘露聚糖酶，其中该酶组合物是成粒产品或液体产品，其中该GH5甘露聚糖酶与如实施例1至9中任一项所述的变体之间的比率是基于酶蛋白的重量的1:3至3:1的比率。
10)一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含如实施例1至8中任一项所述的变体和至少一种洗涤剂辅助成分。
11)如实施例10所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包含如实施例9所述的酶组合物。
12)如实施例11所述的洗涤剂组合物，其中该GH5甘露聚糖酶与SEQ ID NO:8、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少60％、70％或80％的同一性，例如与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21中的任一个的甘露聚糖酶具有至少85％、90％、95％或者甚至100％的同一性。
13)如实施例10至12中任一项所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包含与SEQ ID NO:30具有至少80％同一性的黄原胶裂解酶和与SEQ ID NO:31具有至少80％同一性的黄原胶内切葡聚糖酶。
14)如实施例1至8中任一项所述的变体、如实施例9所述的酶组合物或如实施例10至12所述的洗涤剂组合物在清洁过程，如衣物洗涤或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途。
15)一种清洁物品的方法，该方法包括将该物品暴露于包含如实施例1至8中任一项所述的变体、如实施例9所述的酶组合物、或如实施例10或12所述的洗涤剂组合物的洗涤液，例如，其中该物品是纺织品或硬表面。
16)一种用于洗涤纺织品的方法，该方法包括：
a)将该纺织品暴露于包含如实施例1至8中任一项所述的变体、如实施例9所述的酶组合物、或如实施例10或12所述的洗涤剂组合物的洗涤液；
b)完成至少一个洗涤循环；以及任选地
c)冲洗该纺织品。
17)如实施例10至14中任一项所述的洗涤剂组合物、用途或方法，该洗涤剂组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、半纤维素酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、虫漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、角叉菜胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、木聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、多半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、地衣多糖酶、昆布多糖酶和DNA酶或其任何组合。
18)一种多核苷酸、一种核酸构建体或表达载体、或一种重组宿主细胞，该多核苷酸编码如实施例1至8中任一项所述的变体，该核酸构建体或表达载体包含该多核苷酸，该重组宿主细胞用该多核苷酸转化。
19)一种用于产生如实施例1至8中任一项所述的变体的方法，该方法包括：
a)在适合于表达该变体的条件下培养如实施例17所述的重组宿主细胞；以及
b)回收该变体。
实例
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
菌株
编码GH26甘露聚糖酶基因的DNA分离自伊利诺类芽孢杆菌(从2014年在美国弗吉尼亚州收集的土壤样品分离)和类芽孢杆菌属物种(从1991年在美国收集的沙样品分离)并且进行了测序，如在WO 2019/068715中所述。
材料
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
标准洗涤剂系统
表1A：标准洗涤剂1组合物(液体)
表1B：标准洗涤剂2组合物(液体)
小块布样
小块布样包括食物污渍和技术污渍的组合。
材料 来源
DN-33胡芦巴种子 CFT
C-S-43瓜尔胶 CFT
C-S-73刺槐豆胶 CFT
以上商业测试材料可从测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)，Stoomloggerweg 11，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰获得。
洗涤性能
Terg-O-tometer(TOM)洗涤试验
terg-o-tometer是工业标准。在水浴温度受控的环境中孵育1L洗涤溶液。将溶液混合5min，然后向每个烧杯中添加1L。烧杯中的温度经测量为20.0℃。将经洗涤和经冲洗的小块布样在干燥箱中干燥过夜并如下表2所示进行测量。
表2：Terg-O-tometer洗涤试验的条件
洗涤性能表示为Δ反射值(ΔRem)。在洗涤并冲洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。使用具有大孔径的Macbeth Color Eye7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的条件下进行测量，并提取460nm下的反射率。用ColorEye 2测量干燥的小块布样。通过3层(来自同一烧杯的相同类型的小块布样中的3块)进行小孔径测量，在标有烧杯号和小块布样号的正面的每个小块布样上进行2次测量。通过从经洗涤的小块布样的反射值中减去对照的小块布样的反射值来计算单个小块布样的反射值。通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果。将总酶性能计算为单个ΔRem的平均值。
实例1：用于确定甘露聚糖酶活性的还原端测定
为了估计在底物水解后的甘露糖产率，使用了由Lever(1972),Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279开发的还原端测定。该测定是基于4-羟基苯甲酸酰肼，它在碱性条件下与糖的还原端反应。产物是强黄色阴离子，在410nm处吸收。
方法
将4-羟基苯酰肼(PAHBAH)(西格玛公司(Sigma)，H9882)在PAHBAH缓冲液中稀释至15mg/ml的浓度。PAHBAH缓冲液含有：50g/L K-Na-酒石酸盐(默克公司(Merck)，1.08087)和20g/L氢氧化钠(西格玛公司，S8045)。这种PAHBAH混合物是在使用前制作的。
在96孔PCR板(赛默科技公司(Thermo Scientific))中混合70μlPAHBAH混合物和MiliQ水。添加来自水解实验的样品。样品和MiliQ总是达到150μl的总体积，但是样品的稀释度不同。用粘性PCR密封箔片(赛默科技公司)密封该板。在PTC-200热循环仪(MJ研究公司(MJ Research))中将板在95℃孵育10min，冷却并且保持在10℃持续1min。将100μl样品转移至平底96孔微量滴定板(NuncTM)中，并且在SpectraMax 190吸光度酶标仪(分子装置公司(Molecular Devices))上，在405nm处测量显色。将结果与甘露糖标准品进行比较，这些甘露糖标准品已经经历了与其进行比较的样品相同的处理和稀释。
实例2：通过定点诱变生成变体
通过SOE(通过重叠延伸的剪接)同时地向PCR产物添加一个或多个突变、表达调节元件、以及芽孢杆菌属基因组同源性区域以用于定点整合，来产生SEQ ID NO:2的定点变体。用PCR产物转化枯草芽孢杆菌；通过NGS确认正确的基因序列。
实例3：洗涤剂内稳定性的确定
在相关的条件下，测试了如上所述生成的变体的洗涤剂内稳定性。通过在包含490ppm蛋白酶(SEQ ID NO:17)的洗涤剂中孵育变体并随后计算变体的半衰期来确定洗涤剂内稳定性。
应用以下程序(条件示于表3中)：
1)将甘露聚糖酶变体溶解于0.01％ Triton x-100缓冲液(Triton X-100西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)产品号：93426，CAS号9036-19-5)中
2)向含有蛋白酶的标准洗涤剂中添加甘露聚糖酶变体，以获得所希望的最终甘露聚糖酶浓度，并且搅拌30分钟
3)在所希望的温度下孵育该酶/洗涤剂溶液
4)在0小时、24小时、72小时和144小时后分析该酶/洗涤剂溶液的样品的残余甘露聚糖酶活性，并且计算半衰期。
通过使用来自麦格酶公司(Megazyme)的甘露聚糖酶检测片剂(MannazymeTablets)(一种内切-1,4-β-甘露聚糖酶的底物)来测量残余甘露聚糖酶活性。将甘露聚糖酶检测片剂的底物溶解于100mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸，CAS号：1132-61-2)中，并且在室温下与酶/洗涤剂溶液孵育60分钟，伴随以800rpm振荡。以2000rpm旋转沉降2分钟，以允许不溶性底物沉降，并且通过读取在590nm处上清液的光密度来测量甘露聚糖酶活性。
计算半衰期(T1/2)，即保留50％的甘露聚糖酶活性的时间。
通过上文披露的方式获得SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的半衰期，结果提供于表3中。很清楚的是，与具有SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶变体相比，具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的甘露聚糖酶变体显著改善了洗涤剂内稳定性。
表3：本发明的变体的半衰期
实例4：残余活性
向标准洗涤剂1和标准洗涤剂2中添加600ppm蛋白酶(SEQ ID NO:17)和甘露聚糖酶。用于稳定性测试的样品在关闭盖子的情况下在37℃下储存4周，而参考样品在-18℃下储存4周。残余活性计算为：
活性(孵育样品)/活性(参考样品)*100％
对于活性测量，在实例1中所述的还原端测定的原理的应用具有以下特殊性：将5克洗涤剂样品溶解于400mL缓冲液(0.1M NaH2PO4，2H2O和0.05％(w/v)20，pH7.3)中并且进一步于0.05M HEPES缓冲液(pH 8.0)中稀释至相关浓度范围内。
测量残余活性，结果在表4中列出。
表4：储存后的残余活性
从表4中的数据清楚地看出，与现有技术已知的甘露聚糖酶(SEQ ID NO:2)的洗涤剂的储存稳定性相比，具有SEQ ID NO:3至7的甘露聚糖酶变体的洗涤剂的储存稳定性大大改善。
实例5：使用Terg-O-tometer的甘露聚糖酶变体的残余洗涤性能(RWP)
在相关的条件下，测试了如上所述生成的变体的RWP。通过在包含490ppm蛋白酶(SEQ ID NO:17)的洗涤剂中孵育变体并随后使用如上所述的TOM洗涤试验方法评估RWP来确定RWP。RWP计算为
洗涤性能(孵育样品)/洗涤性能(参考样品)*100％
其中参考样品以与孵育样品相同的方式制备，但是在-18℃下储存4周。RWP反映了上述三种类型小块布样的单个ΔREM的平均值。
表5：储存后的RWP
从表5中的数据清楚地看出，相比于现有技术中已知的甘露聚糖酶(SEQ ID NO:2)，具有SEQ ID NO:3至7的甘露聚糖酶变体的洗涤剂在储存后的残余洗涤性能大大改善。
实例6：SEQ ID NO:3的变体的半衰期改善因子
通过将变体在洗涤剂中孵育不同的时间段和温度，并且与在4℃下孵育相同时间段的、具有SEQ ID NO:3的对照的活性进行比较来进行稳定性测试。
对于表6中的变体，应激条件包括将变体在42℃下在标准洗涤剂1和具有SEQ IDNO:32的蛋白酶(1471μM)中孵育24小时。
使用来自麦格酶公司的不溶性偶氮-角豆-半乳甘露聚糖底物，使用甘露聚糖酶测定来测量残余活性。将底物与酶在30℃下一起孵育30min，伴随以800rpm振荡。此后，将反应混合物保持静态10min，以允许不溶性底物沉降。通过读取在590nm处上清液的光密度来测量酶活性。通过取应力响应与无应力响应的比率来计算残余活性(RA)，然后将残余活性用于计算半衰期。根据以下等式计算半衰期，其中RA＝残余活性，t＝以小时为单位的孵育时间，并且半衰期以小时为单位定义：
通过取样品变体与也在重复微量滴定板上生长的具有SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶的半衰期比率来计算半衰期改善因子(HIF)。
表6：SEQ ID NO:3的变体的半衰期改善因子
实例3和4显示具有SEQ ID NO:3的变体与现有技术中已知的甘露聚糖酶(SEQ IDNO:2)相比有所改善。从表6中的数据清楚地看出，SEQ ID NO:3的变体在蛋白酶的存在下的稳定性进一步改善。
实例7：甘露聚糖酶和其他酶在污渍去除方面的协同作用
在洗涤试验测定中，测试了甘露聚糖酶与4种不同的衣物洗涤酶一起时对9种不同的污渍的协同作用。
材料
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
标准洗涤剂系统
使用了如在表1A中所披露的标准洗涤剂1。
酶
表7：测试的酶
*以上商业酶来自诺维信公司
100L包含分别具有SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的黄原胶裂解酶和黄原胶内切葡聚糖酶。
污渍
污渍包括食物污渍和技术污渍的组合。
表8：污渍类型
CFT：测试材料BV中心，Stoomloggerweg 11，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。
Equest：沃里克装备有限公司(Warwick Equest)，英国
经预洗涤的白色压载物
用淀粉酶和纤维素酶预洗涤由50％:50％(聚酯:棉)织物组成的压载物，以减少/去除淀粉、羧甲基纤维素(CMC)和其他纺织品添加剂。将3kg的纺织品压载物在使用水硬度为15°dH[Ca2+:Mg2+:CO3 2-比率，4:1:7.5]的水并且含有以下酶的78.6g的W-ECE-2洗涤剂(wfk测试织物有限公司(wfk Testgewebe GmbH)，德国)中洗涤三次，用于三个预洗涤步骤中每一个。
表9：预洗涤步骤
在Miele Softtronic W1935 WTL机器中，在40℃下，使用标准洗涤程序用13-15升水对3kg纺织品进行预洗涤。在第三次预洗涤步骤后，在去离子水中进行冲洗，并且然后将纺织品织物挂干(line dried)并且切割成5cm x 5cm的小块。
洗涤性能
在上述条件下，在Terg-O-tometer(TOM)洗涤试验中测试酶的协同作用测试，以确定洗涤性能(污渍去除功效)。一般洗涤条件在表2中给出，以指定剂量(表7)添加酶用于用酶洗涤。每种污渍类型的两块污渍(表8)与经预洗涤的压载物一起包括在每个烧杯中，因此总重量为约30g/烧杯。在室温下，将经洗涤和经冲洗的污渍在干燥箱中干燥过夜，并且使用Datacolor800V分光光度计(德塔颜色公司(Datacolor)，劳伦斯维尔，新泽西州，美国)来评估污渍去除。在CIE标准照明体D65和CIE 1964 10度标准观察者下进行污渍的光反射评估。在入射光中没有UV的情况下进行测量，并且记录每块使用酶和不使用酶洗涤的污渍在460nm处的反射值。洗涤性能表示为每种污渍类型的两块污渍在460nm处的平均反射值(REM)。
结果
该实例显示与组合中的对照(“B”、“M”和“X”)相比，当GH26甘露聚糖酶仅与黄原胶酶(表10，“M/X”)一起使用时，总污渍去除功效(表10，“全部9种污渍的总和”)更高。如果将GH26甘露聚糖酶与淀粉酶/蛋白酶(表10，“A/P”)、淀粉酶/蛋白酶/脂肪酶(表10，“A/P/L”)以及/淀粉酶/蛋白酶/脂肪酶/黄原胶酶(表10，“A/P/L/X”)一起用于多酶组合中，当与它们各自的对照相比时，也会观察到总污渍去除功效增加。观察到的GH26甘露聚糖酶和衣物洗涤酶一起在污渍去除方面的协同作用取决于污渍类型，从而取决于污垢底物。例如，在“草/泥”、“熟牛脂”和“熟黄油”上没有检测到GH26甘露聚糖酶与所测试的酶一起的协同作用，而明显的是，某些污渍在证明GH26甘露聚糖酶与特定的酶一起在污渍去除方面的协同作用上更加有效。
表10：在460nm处的反射值(污渍去除功效)
值代表每种类型的两块污渍的平均值。
*总和是每种污渍类型的平均反射值的总和
B：黑色-仅洗涤剂
A：淀粉酶(Amplify100L)M：甘露聚糖酶SEQ ID NO:3
P：蛋白酶(Liquananse3.5L)L：脂肪酶(Lipex200L)X：黄原胶酶(100L)
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述描述而对本领域的技术人员变得显而易见。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (15)

1.一种SEQ ID NO:2的多肽的变体，其中在位置490和491处的氨基酸缺失，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％的序列同一性，并且其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，其中该变体包含在N-末端和/或C-末端的一个或多个氨基酸的延伸，或在N-末端和/或C-末端的一个或多个氨基酸的截短，其条件是在C-末端的插入不是*490W和*491R。
3.如权利要求1或2所述的变体，该变体包含来自N-末端的至少11个氨基酸，例如SEQID NO:2的氨基酸1至12、例如氨基酸1至13、例如氨基酸1至14或例如氨基酸1至15的缺失。
4.如权利要求1至3中任一项所述的变体，该变体进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰：I30L、D48P、Y155H、T167P、Q215E、H276C、R280K、F286C、G366N和D486E。
5.如权利要求4所述的变体，该变体进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个修饰：G20P、A101L、A111P、A118E、S137A、Q143R、R160L、E162D、M171I、N176S、P182R、Q183E、V244A、H324K和D385H。
6.如权利要求1至5中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽、SEQ IDNO:4的多肽、SEQ ID NO:5的多肽、SEQ ID NO:6的多肽、SEQ ID NO:7的多肽、SEQ ID NO:22的多肽、SEQ ID NO:23的多肽、SEQ ID NO:24的多肽、SEQ ID NO:25的多肽、SEQ ID NO:26的多肽、SEQ ID NO:27的多肽、SEQ ID NO:28的多肽、或SEQ ID NO:29的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％，例如至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.5％、至少93.9％、至少94％、至少94.5％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、或99.9％或者甚至100％的序列同一性，其中该变体具有甘露聚糖酶活性。
7.一种酶组合物，该酶组合物包含如权利要求1至6中任一项所述的任何变体以及GH5甘露聚糖酶。
8.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含如权利要求1至6中任一项所述的变体和至少一种洗涤剂辅助成分。
9.如权利要求8所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包含GH5甘露聚糖酶。
10.如权利要求9所述的洗涤剂组合物，其中该GH5甘露聚糖酶与如权利要求1至6中任一项所述的变体之间的比率是基于酶蛋白的重量的1:3至3:1的比率。
11.如权利要求8至10中任一项所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物进一步包含黄原胶裂解酶和黄原胶内切葡聚糖酶，该黄原胶裂解酶与SEQ ID NO:30具有至少80％的同一性，该黄原胶内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:31具有至少80％的同一性。
12.如权利要求1至6中任一项所述的变体或如权利要求8至11所述的洗涤剂组合物在清洁过程，如衣物洗涤或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途。
13.一种清洁物品的方法，该方法包括将该物品暴露于包含如权利要求1至6中任一项所述的变体或如权利要求8至11所述的洗涤剂组合物的洗涤液，例如其中该物品是纺织品或硬表面。
14.一种多核苷酸、一种核酸构建体或表达载体、或一种重组宿主细胞，该多核苷酸编码如权利要求1至6中任一项所述的变体，该核酸构建体或表达载体包含该多核苷酸，该重组宿主细胞用该多核苷酸转化。
15.一种用于产生如权利要求1至6中任一项所述的变体的方法，该方法包括：
a)在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求14所述的重组宿主细胞；以及
b)回收该变体。
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