DE3854249T2

DE3854249T2 - Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.

Info

Publication number: DE3854249T2
Application number: DE3854249T
Authority: DE
Inventors: Esper Boel; Ida Birgitte Huge-Jensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2008-08-27
Also published as: EP0305216A1; EP0305216B1; ES2076939T3; JPH0438394B2; DE3854249D1; JPH01157383A; ATE125865T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten DNA-Produktion von Humicola-Lipasen und eine rekombinante Humicola-Lipase.
Humicola-Lipasen sind erhältlich aus Stämmen von thermophilem Humicola sp., einschließlich thermophilem Thermomyces sp., wie etwa H. lanuginosa (Griffon and Maublanc) Bunce, H. stellata Bunce, H. grisea var. thermoidea, Cooney & Emerson, H. insolens, Cooney & Emerson, Thermomyces ibadanensis Apinis & Eggins, H. hyalothermophila Moubasher, Mazen and Abdel-Hafez, H. grisea var. indica Subrahmanyam, H. brevis var. thermoidea, Subrahmanyam and Thirumalachar, und H. brevispora Subrahmanyam and Thirumalachar.
H. lanuginosa ist auch unter den Synonymen Thermomyces langinosus Tsiklinsky, Sepedonium lanuginosum Griffon and Maublanc, Sepedonium thermaphilum cyclosporum and S. thermaphilum ovosporum Velich, Acremoniella sp. Rege, Acremoniella thermophila Curzi und Monotospora lanuginosa (Griffon and Maublanc) Mason beschrieben werden.
Überdies wurde die Spezies Scytalidium thermophilum (Cooney & Emerson) Austwich von Hedger (1975, The ecology of thermophilic fungi in Indonesia. In Biodegradation et Humification. Rapport du 1er Colloque Internationel - Nancy 1974 (Hrg. G. Kilbertius, O. Reisinger, A. Mourey & J.A. Cancela Da Fonseca), Sarreguemines: Pierron Editeur - 57206) als zu Humicola insolens gehörend angesehen.
Die Herstellung einer Humicola lanuginosa-Lipase ist in der japanischen nicht-geprüften Patentveröffentlichung Nr. 48-62990 und in der EP-Patentanmeldung Nr. 87 307 684.8 beschrieben. Die letztere lehrt auch die Verwendung dieser Lipase in lipolytischen Reinigungsmittelzusätzen.
Wegen der weltweiten Verwendung von Enzymzusätzen in Reinigungsmitteln und wegen der Tatsache, daß Humicola-Lipasen sich als bekannte Reinigungsmittel-Lipasen sowohl im Hinblick auf Reinigungskraft als auch Stabilität als überlegen erwiesen haben, ist das kommerzielle Interesse an solchen Lipasen hoch.
Bei der Herstellung industrieller Enzyme sind Ausbeuten immer schon wichtig für die Rentabilität des Herstellungsverfahrens gewesen. Der traditionelle Weg zur Verbesserung ist, den Wildstamm zu mutieren, um Mutanten mit höheren Ausbeuten zu erhalten. Mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie ist eine weitere Möglichkeit, das Gen für das gewünschte Produkt in einen Wirtsmikroorganismus zu transformieren, der in der Lage ist, höhere Ausbeute zu produzieren als der Wildstamm, oder mit anderen günstigen Eigenschaften.
Demgemäß ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Humicola-Lipasen durch rekombinante DNA-Technologie zu entwickeln.
In der Vergangenheit sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden oder Proteinen mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie entwickelt worden. Das Hauptinteresse ist auf Bakterien und Hefen konzentriert worden, wobei z.B. E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae gut charakterisierte Spezies im Hinblick auf z.B. Expressions- und Selektionssysteme sind.
Neben den oben erwähnten Mikroorganismen sind Fadenpilze, insbesondere Aspergillus sp., wie etwa Aspergillus niger und Aspergillus oryzae, die gut charakterisierte und in weitem Umfang verwendete Mikroorganismen für die kommerzielle Herstellung von Enyzmen sind, attraktive Kandidaten als Wirtsmikroorganismen für rekombinante DNA-Vektoren.
In den letzten paar Jahren sind verschiedene Selektionsmarker für die Transformation von Asoeraillus nidulans beschrieben worden und Verfahren sind kürzlich entwickelt worden zur integrativen Transformation des Fadenpilzes Aspergillus nidulans zum Zwecke der Erforschung der genetischen und molekularen Prozesse, die die Differenzierung der Pilzzelle steuern.
Transformation von A. nidulans ist gezeigt worden unter Verwendung von Plasmiden, die das Neurospora crassa-pyr-4-Gen (Ballance, D.J. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983) 284-289), das A. nidulans-amdS-Gen (Tilburn, J.G. et al., Gene 26 (1983) 205-221), das A. nidulans trpC-Gen (Yelton M.M. et al., Proc.Nati.Acad.Sci. U.S.A., 81 (1984) 1470-1474) und das A. nidulans-argB-Gen (John, M.A. und Peberdy J., Microb.Technol. 6 (1984) 386-389) enthalten. Es wurde festgestellt, daß die transformierende DNA in das Wirtsgenom mit ziemlich niedrigen Häufigkeiten integriert wurde (typischerweise < 1000 Transformanten/ug DNA).
Transformation von Aspergillus niger mit dem amdS-Gen von A. nidulans wurde beschrieben (Kelly, J.M. und Hynes, M.J., EMBO Journal 4 (1985), 475-479) und es wurde gezeigt, daß amdS ein potentieller Selektionsmarker zur Verwendung bei der Transformation von Aspergillus niger ist, der auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle nicht stark wachsen kann. Transformation von Aspergillus niger unter Verwendung des argB-Gens von Aspergillus nidulans ist ebenfalls beschrieben worden (Buxton F.P. et al., Gene 37 (1985), 207-214).
Ein Verfahren zur Herstellung von Transformanten von Aspergillus niger ist in EP No. 0 184 438A beschrieben und EP No. 0 215 594 und 0 249 350 beschreiben die Expression heterologer Polypeptide in Fadenpilzen. Schließlich beschreibt WO87/04464 die Expression höherer eukaryontischer Gene in Aspergillus.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nunmehr gezeigt worden, daß es möglich ist, ein hohes Expressionsniveau für die Humicola sp.-Lipase in Aspergillus sp.-Stämmen zu erhalten oder die Produktion der Lipase in Humicola-Stämmen zu erhöhen.
In ihrem breitesten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Humicola-Lipasen bereit, welches die Schritte umfaßt
(a) Bereitstellen eines geeigneten rekombinanten DNA- Klonierungsvektors, der DNA-Sequenzen umfaßt, die funktionen kodieren, die die Genexpression erleichtern, und eine DNA-Sequenz, die die Humicola-Lipase kodiert;
b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (a);
c) Kultivieren des transformierten Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und fakultativ Gewinnen der Lipase aus dem Kulturmedium.
In einem engeren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Humicola-Lipasen in Aspergillus bereitgestellt, welches die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystems, das zur Integration in das Genom eines Aspergillus-Wirtes in einer oder mehreren Kopien in der Lage ist und umfaßt: DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die die Genexpression erleichtern; einen geeigneten Marker zur Selektion von Transformanten; und eine DNA-Sequenz, die die Humicola-Lipase kodiert;
b) Transformieren des Aspergillus-Wirtes, der kein funktionales Gen für den ausgewählten Selektionsmarker enthält, mit dem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem aus Schritt a; und
c) Kultivieren des transformierten Aspergillus-Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und fakultativ Gewinnen der Lipase aus dem Kulturmedium.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Humicola-Lipasen in Aspergillus bereitgestellt, wobei durch dieses Verfahren ein Aspergillus- Stamm, der mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem wie oben beschrieben, transformiert worden ist, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und die Lipase aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein neuartiges rekombinantes Humicola-Lipaseprodukt bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch einen Unterschied in der Glykosylierung von den bisher bekannten nativen Humicola- Lipasen. Das heißt daß die Natur und fakultativ das Ausmaß der Glykosylierung der rekombinanten Humicola-Lipase der vorliegenden Erfindung verschieden ist von der Lipase, die aus den natürlich vorkommenden Humicola-Stämmen gewonnen wird. Das Humicola-Lipaseprodukt dieser Erfindung ist außerdem gekennzeichnet durch eine verbesserte Thermostabilität, verglichen mit der entsprechenden nativen Humicola-Lipase.
Noch spezifischer ist die neuartige rekombinante Humicola- Lipase dadurch gekennzeichnet, daß der Kohlehydratgehalt auf etwa dem gleichen Niveau wie oder höher als der Kohlehydratgehalt in der nativen Lipase ist, wohingegen die Natur der Glykosylierung verschieden ist von der nativen Humicola-Lipase, d.h. die neuartige Humicola-Lipase enthält andere Kohlehydrate als die native Lipase. Der Kohlehydratgehalt kann typischerweise von etwa 5 bis etwa 30 % (w/w) liegen, wohingegen der Kohlehydratgehalt in der nativen Lipase etwa 4,9 % (w/w) beträgt. Spezifischer kann der Kohlehydratgehalt im Bereich von etwa 5 bis 15 % (w/w) liegen und sogar noch spezifischer kann er im Bereich von etwa 7,5 % bis etwa 8,5 % (w/w) liegen.
Das rekombinante Humicola-Lipaseprodukt dieser Erfindung kann als ein enzymatischer Reinigungsmittelzusatz zur Verwendung in Reinigungsmitteln in einer ähnlichen Art und Weise wie die native Lipase, d.h. wie beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 87 307 684.8, verwendet werden.
Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, wird der Begriff "rekombinante Humicola-Lipase" auf Humicola-Lipase angewendet, die hergestellt ist durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit der cDNA tränsformiert ist, die die native Humicola-Lipase kodiert. Der Begriff "native Humicola- Lipase" wird auf die Humicola-Lipase angewendet, die aus natürlichen Quellen von thermophilem Humicola sp. gewonnen ist, einschließlich thermophilem Thermomyces sp., beschrieben im Einleitungsteil der vorliegenden Beschreibung.
Es ist festgestellt worden, daß rekombinante Humicola-Lipase aus A. oryzae nicht identisch mit nativer Humicola-Lipase ist, ungeachtet der Tatsache, daß die Peptidsequenz dieselbe ist, Offensichtlich glykosyliert der Wirtsorganismus das exprimierte Polypeptid in anderem Umfang als der Donor- Mikroorganismus und mit unterschiedlichen Zuckereinheiten. In A. niger scheint der Umfang der Glykosylierung auf dem gleichen Niveau zu liegen, wohingegen die Zuckereinheiten von derselben Art zu sein scheinen wie in A. oryzae. Differenzierung und Identifizierung der nativen Lipase und der rekombinanten Lipase ist möglich durch Messung ihrer Glykosylierung. So sind, wenn man als beispielhaft die nativen Humicola lanuginosa-Lipase und die rekombinante Form dieser Lipase aus einem A. oryzae-Transformanten nimmt, beide Lipasen N-glykosyliert, aber mit unterschiedlichen Zuckerresten. Die native Lipase weist keinerlei Galactose auf und weist weniger Mannose als die rekombinante Lipase auf und ist auch in einem anderen Ausmaß glykosyliert, wobei die native Lipase Kohlehydrateinheiten aufweist, die ungefähr 1.500 Daltons zu ihrem Molekulargewicht (etwa 5 %) hinzufügen, und die rekombinante Lipase Einheiten aufweist, die etwa 2.600 Daltons (etwa 8 %) hinzufügen. Zu Details, siehe Beispiel 5 im folgenden.
Die neuartige rekombinante Humicola-Lipase gemäß der vorliegenden Erfindung kann von etwa 1 bis etwa 12 mol Galactose pro mol Lipase-Protein und spezifischer von etwa 1 bis etwa 6 mol Galactose pro mol Lipase-Protein umfassen. Der Gehalt an Mannose kann von etwa 3 bis etwa 20 und spezifischer von etwa 3 bis etwa 12 mol Mannose pro mol Lipase-Protein liegen. Die rekombinante Humicola-Lipase wird typischerweise etwa 2 mol N-Acetylglucosamin, von etwa 3 bis etwa 20 mol Mannose und von etwa 1 bis etwa 12 Mol Galactose pro mol Lipase-Protein umfassen. Spezifischer wird die rekombinante Humicola-Lipase etwa 2 mol N-Acetylglucosamin, etwa 3 bis etwa 12 mol Mannose und etwa 1 bis etwa 6 mol Galactose pro mol Lipase-Produkt enthalten. Sogar noch spezifischer wird die rekombinante Humicola-Lipase etwa 2 Mol N-Acetylglucosamin, etwa 6 bis etwa 9 mol Mannose und etwa 2 bis etwa 4 mol Galactose pro mol Lipase-Protein enthalten.
Die Unterschiede in der Glykosylierung haben eine gewisse Wirkung auf die Enzymeigenschaften. Insbesondere ist die thermische Stabilität von hochgereinigter rekombinanter H. lanuginosa-Lipase überlegen gegenüber der thermischen Stabilität von vergleichbar gereinigter nativer Lipase. Zusätzlich ist die Stabilität der reinen rekombinanten Lipase in der Gegenwart einer alkalischen Bacillus-Protease (Esperase ), getestet bei 40ºC und bei 55ºC, überlegen gegenüber vergleichbar reiner nativer Lipase.
Charakteristischerweise enthalten Enzym-Produkte, hier Lipase- Produkte, insbesondere extrazelluläre Lipase-Produkte, andere Enzymaktivitäten, insbesondere proteolytische Aktivität, und nicht-enzymatisch aktive Peptide und Aminosäuren, die abgeleitet sind aus Kulturbrühen-Bestandteilen.
Im Falle der Humicola sp.-Lipase ist festgestellt worden, daß das rekombinante Lipase-Produkt thermisch stabiler als das vergleichbare native Lipase-Produkt ist. Gemäß den Daten der Erfinder hiervon kann ein Teil der Verbesserung in der thermischen Stabilität der unterschiedlichen Glykosylierung zugeschrieben werden und ein anderer Teil kann der Abwesenheit der proteolytischen Humicola-Aktivität im rekombinanten Lipase-Produkt zugeschrieben werden. Im Fall der Lipase, die für H. lanuginosa nativ ist, berichtet eine kurze Beschreibung derselben in U.S.-Patent 4,707,291, daß ein kommerziell verfügbares H. lanuginosa-Lipase-Produkt (Amano CE) einen beträchtlichen Gehalt an proteolytischer Aktivität enthielt. Das native H. lanuginosa-Lipase-Produkt der Erfinder enthielt einen vergleichbaren Gehalt an proteolytischer Aktivität. Bei erhöhten Temperaturen kann insbesondere von der Protease erwartet werden, daß sie andere Enzyme abbaut. Die Verbesserung in der thermischen Stabilität, die der Abwesenheit der Protease zuzuschreiben ist, ist kumulativ zur Verbesserung, die der unterschiedlichen Glykosylierung zuzuschreiben ist (siehe Beispiel 6).
Wie bereits betont worden ist, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung hoher Ausbeuten der Humicola-Lipasen durch Kultivierung transformierter Aspergillus-Stämme und in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung der Humicola lanuginosa-Lipase durch Kultivierung einer transformanten A. oryzae- oder A. niger-Wirtszelle bereit. A. oryzae ist der bevorzugteste Wirtsmikroorganismus.
A. oryzae ist seit Jahren in kommerziellem Maßstab für die Herstellung des TAKA-Amylase-Enzyms und proteolytischer Enzyme verwendet worden, und dementsprechend ist die Fermentationstechnologie zur Kultivierung dieses Mikroorganismus gut entwickelt und der Mikroorganismus selbst ist zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie zugelassen. Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit zur Verwendung von A. orvzae für die industrielle Herstellung großer Mengen rekombinanter Humicola-Lipasen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein rekombinantes Humicola-Lipase-Produkt bereit, das gegenüber der nativen Humicola-Lipase insofern überlegen ist, als es erhöhte Thermostabilität und erhöhte Stabilität in der Gegenwart alkalischer Bacillus-Proteasen aufweist, siehe Figuren 6 und 9 hierin.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
Fig. 1 die DNA-Sequenz des TAKA-Amylase-Promotors und der flußaufwärtigen Promotorregionen, der Präregion und des 5'-Teils des Strukturgens für die TAKA-Amylase zeigt.
Fig. 2 zeigt eine Endonucleaserestriktionskarte von Plasmid pTAKA17,
Fig. 3 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pHLL,
Fig. 4 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid p960,
Fig. 5a und 5b zeigt die DNA-Sequenz von Präpro-Humicola lanuginosa-Lipase-cDNA, zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, angegeben durch 3- Buchstaben-Abkürzungen,
Fig. 6 zeigt die Restaktivität des rekombinanten Humicola- bipase-Produktes, verglichen mit der Restaktivität des nativen Humicola-Lipase-Produktes bei 55ºC und 60ºC bei unterschiedlichem pH,
Fig. 7 zeigt ein SDS-PAGE-Gradientengel,
Fig. 8 zeigt die Restaktivität bei 55ºC des rekombinanten Humicola-Lipase-Produktes und des nativen Humicola- Lipase-Produktes, zusammen mit der Restaktivität der nativen Humicola-Lipase, die einen Protease- Inhibitor (PMSF) enthält, und
Fig. 9 zeigt die Restaktivität bei 40ºC und bei 55ºC von nativer und rekombinanter Humicola-Lipase in der Gegenwart eines alkalischen Bacillus-Protease- Produktes (Esperase ).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Transformationstechnik, die für die Transformation von Aspergillus-Stämmen verwendet wurde, war ein Verfahren, das adaptiert worden war von den Verfahren zur Transformation von A. nidulans (Ballance et al. Biochem.Biophys.Res.Commun., 112, (1983), 284-289; Tilburn et al., Gene 26 (1983), 205-221, Yelton et al., Proc.Natl.Sci. USA, 81 (1984), 1470-1474) und ähnlich zu dem Verfahren von Buxton et al. (Gene 37 (1985), 207-214) zur Transformation von A. niger. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Aspergillus-Stamm mit einem Vektorsystem transformiert, das einen Selektionsmarker enthält, der in das Genom des Wirtsstammes eingebaut werden kann, aber vor der Transformation nicht im Wirtsstamm enthalten ist. Transformanten können dann auf der Grundlage des eingebauten Selektionsmarkers selektioniert und von Nicht- Transformanten isoliert werden.
Bevorzugte Selektionsmarker sind die argB-(A. nidulans oder A. niger), trpC-(A. nidulans), amdS-(A. nidulans) oder pyr4- (Neurospora crassa)-Gene oder das DHFR(Dihydrofolatreduktase oder Mutanten hiervon)-Gen. Bevorzugtere Selektionsmarker sind das argB- oder das amdS-Gen. Wildtyp-A. oryzae-Stämme sind normalerweise argB&spplus; (d.h. das argB-Gen ist in A. oryzae funktional). Wenn argB als der Selektionsmarker ausgewählt wird, muß ein argB-Mutantenstamm von A. oryzae, der in dem Gen für diesen Marker einen Defekt aufweist, als Wirtsstamm verwendet werden. A. oryzae-argB-Mutanten können hergestellt werden, wie beschrieben von F.P. Buxton et al. (Gene 37 (1985), 207-214) . Der argB-Mutant ist definiert als ein Mutant mit einem Defekt im Ornithin-Transcarbamylase-Gen. Andererseits kann das amdS-Gen als Selektionsmarker für die Transformation von Wildtyp-A. oryzae verwendet werden, da die Wildtyp-Stämme dieses Gen nicht enthalten.
DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, welche die Genexpression erleichtern, sind typischerweise Promotoren, Transkriptionsterminatoren und Polyadenylierungssignale.
Der Promotor, dem flußaufwärtige Aktivierungssequenzen und Verstärkersequenzen vorangehen könnten, wie gut bekannt auf diesem Gebiet, kann jede DNA-Sequenz sein, die starke Transkriptionsaktivität in Aspergillus zeigen kann, und kann abgeleitet sein von Genen, die sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine kodieren, wie etwa Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Lipasen, Cellulasen und glykolytische Enzyme. Geeignete Promotoren können abgeleitet sein von Genen für A. oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei- Asparaginsäure-Proteinase, A. niger-Glucoamylase, neutrale A. niger-alpha-Amylase, säurestabile A. niger-alpha-Amylase und Rhizomucor miehei-Lipase. Beispiele für Promotoren aus Genen für glykolytische Enzyme sind TPI, ADH und PGK.
Ein bevorzugter Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung ist der A. oryzae-TAKA-Amylase-Promotor. Die TAKA-Amylase ist eine gut bekannte alpha-Amylase (Toda et al., Proc.Japan Acad. 58 Ser. B (1982) 208-212). DNA, die die Promotorregion kodiert, wurde abgeleitet von dem TAKA-Amylase-Genomklon, wie beschrieben in EP-Patentanmeldung Nr. 87 103 806.3. Die Sequenz des Promotors und der Regionen flußaufwärts des Promotors zusammen mit der Präregion und dem 5'-Ende des Strukturgens für die TAKA-Amylase ist in Fig. 1 veranschaulicht.
Der TAKA-Amylase-Promotor ist erhältlich aus Plasmid pTAKA17, der im Zusammenhang mit EP-Patentanmeldung Nr. 87 103 806.3 hinterlegt worden ist. Die Endonucleaserestriktionskarte von Plasmid pTAKA17 ist in Fig. 2 dargestellt.
Aus pTAKA17 kann die vollständige Promotorsequenz, einschließlich der Sequenzen flußaufwärts des Promotors, oder funktionelle Teile derselben mit Mitteln, die dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sind, abgeleitet werden. Die Promotorsequenz kann mit Linkern versehen werden, mit dem Zweck, spezifische Restriktionsstellen einzuführen, die die Ligation der Promotorsequenz mit weiterer DNA erleichtern, z.B. dem Gen, das das gewünschte Protein-Produkt kodiert, oder verschiedenen Präregionen (Signalpeptiden).
Im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Sequenz von Nucleotid -1144 (siehe Fig. 1) (das eine SalI-Stelle darstellt) bis Nucleotid -10 als ein Beispiel eines gut funktionierenden Teils der Promotorregion verwendet worden. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ging der Nucleotidsequenz von Nucleotid -1176 bis -1 das noch nicht sequenzierte 1,05 kb lange Fragment aus pTAKA17 voran. Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, daß verschiedene Fragmente verwendet werden können.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen die folgende Sequenz oder eine funktional äquivalente Nucleotidsequenz:
was die Sequenz von Nucleotid -1144 bis -10 in Fig. 1 darstellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform haben der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen die folgende Sequenz oder eine funktional äquivalente Nucleotidsequenz:
was die Sequenz von Nucleotid -1176 bis -1 in Fig. 1 darstellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der letzteren Sequenz die 1,05 kb lange nicht-sequenzierte flußaufwärtige Region aus pTAKA17 vorangehen (Position 0 bis 1,05 in Fig. 2).
Die Terminatoren und Polyadenylierungssequenzen können aus denselben Quellen wie die Promotoren gewonnen werden. Verstärkersequenzen können ebenfalls in die Konstruktion inseriert werden.
Das exprimierte Produkt kann innerhalb der Zellen akkumuliert werden, was das Aufbrechen der Zellen erforderlich macht, um das Produkt zu isolieren. Um diesen weiteren Verfahrensschritt zu vermeiden und auch die Menge an möglichem Abbau des exprimierten Produktes innerhalb der Zellen minimieren, ist es bevorzugt, daß das Produkt aus den Zellen sekretiert wird. Zu diesem Zweck wird das Gen für das gewünschte Produkt mit einer Präregion versehen, die eine effektive Leitung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zellen sicherstellt. Diese Präregion, die ein natürlich vorkommendes Signal- oder Leader-Peptid oder funktionale Teile derselben oder eine synthetische Sequenz, die Sekretion bereitstellt, sein könnte, wird im allgemeinen vom gewünschten Produkt während der Sekretion abgespalten, was das reife Produkt zurückläßt, das zur Isolation aus der Kulturbrühe bereit ist. Die Präregion kann von Genen für sekretierte Proteine aus jeder Organismenquelle abgeleitet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Präregion von einem Glukoamylase- oder einem Amylase-Gen aus einer Aspergillus- Spezies, einem Amylase-Gen aus einer Bacillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor aus S. cerevisiae oder einem Humicola-Lipase-Gen abgeleitet sein. Bevorzugter kann die Präregion von dem Gen für die Humicola lanuginosa-Lipase, A. oryzae-TAKA-Amylase, neutralen A. niger-α-Amylase, säurestabile A. niger-α-Amylase, B. licheniformis-α-Amylase, die maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus-α-Amylase oder B. licheniformis subtilisin abgeleitet werden. Das Humicola lanuainosa-Signalpeptid hat die folgende Sequenz
Das TAKA-Amylasesignal hat die folgende Sequenz
Das Gen für das gewünschte Produkt, das funktionell verknüpft ist mit Promotor- und Terminator-Sequenzen, kann in einen Vektor eingebaut werden, der den Selektionsmarker enthält, oder kann auf einem separaten Vektor oder Plasmid angeordnet werden, der (das) in das Genom des Wirtsstammes integriert werden kann. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Vektorsystem" einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide ein, die zusammen die gesamte DNA-Information enthalten, die in das Wirtsgenom integriert werden soll. Vektoren oder Plasmide können lineare oder geschlossene zirkuläre Moleküle sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Wirtsorganismus mit zwei Vektoren cotransformiert, wobei einer den Selektionsmarker einschließt und der andere die restliche fremde DNA, die in den Wirtsstamm eingeführt werden soll, einschließlich Promotor, dem Gen oder der cDNA für das gewünschte Produkt und Transkriptionsterminator und Polyadenylierungssequenzen, umfaßt.
Normalerweise sind die Transformanten stabil und können in der Abwesenheit eines Selektionsdruckes kultiviert werden. Wenn die Transformanten sich als instabil herausstellen, kann der Selektionsmarker für die Selektion während der Kultivierung verwendet werden. Die transformierten Zellen werden dann unter einem Selektionsdruck kultiviert, der dem fraglichen Marker entspricht.
Plasmide, die als Ausgangsmaterialien in den folgenden Beispielen verwendet werden, sind wie folgt
p285: (ATCC Nr. 20681)
pSa143: Berse et al. Gene 25 (1983), 109-117 John & Peberdy, Enyzme Microb. Technol. 6 (1984), 386-389.
p3SR2: J.M. Kelly und M.J. Hynes, EMBO Journal 4 (1985), 475-479.
pSP62-K2 und pCDVI-PL: Noma et al. Nature, 319, (1986), 640- 646.
p775: Europäische Patentanmeldung Nr. 87 103 806.3,
pUC19: Vieira et al., Gene 19 (1982), 259- 268 und Messing, Meth. in Enzymology 101 (1983), 20-27.
Die verwendeten Stämme sind wie folgt:
A. oryzae*: ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCC 11601 und ATCC 12892.
E. coli: MC1000 (Casabadan, M.J. und Cohen, S.N., J.Mol.Biol. 138, 179-207) (NCIB 11956)
H. lanuginosa: DSM 4109
A. niger*: ATCC 1015, ATCC 10582.
* Argb-Mutanten dieser Stämme können hergestellt werden, wie von F.P. Buxton et al. beschrieben (Gene 37 (1987) 207-214). Ein ArgB-Mutant ist definiert
als ein Mutant mit einem Defekt im Ornithin- Transcarbamylase-Gen.

Identifizierung der Aminosäuresequenz von Humicola lanuginosa- Lipase (HLL)

Um Information zu erhalten, die die Konstruktion einer spezifischen Oligonucleotidsonde erlaubt, wurde ein partielle Sequenzbestimmung an der gereinigten Humicola lanuginosa- Lipase durchgeführt. Der Überstand aus einer Kulturbrühe von Humicola lanuginosa, aus dem Mycele und Substanzen mit niedriger relativer Molekülmasse entfernt worden waren, wurde einer Säulenchromatographie unterzogen, die durch Verwendung von DEAE-Sepharose (Anionenaustauschchromatographie), Phenylsepharose (hydrophobe Wechselwirkungschromatographie), gefolgt von Gelfiltration auf TSK G3000 SW, ausgeführt wurde. Die Sequenzbestimmung wurde ausgeführt mit einem Gasphasen- Sequenzer (Applied Biosystems Model 470A), wie beschrieben von Thim, L. et al. (FEBS Lett. 212, 307-312 (1987).
Die folgende N-terminale Sequenz wurde gefunden:
Diese Sequenz ermöglicht die Konstruktion von zwei spezifischen gemischten Oligonucleotidsonden, die die Sequenzen von Aminosäurerest Nr. 7 - Nr. 11 (Phe-Asn-Gln-Phe-Asn) bzw. Aminosäurerest Nr. 13 - Nr. 16 (Phe-Ala-Gln-Tyr) umfassen. Das Screening einer Humicola lanuginosa-cDNA-Bibliothek durch Verwendung von HLL-spezifischen Cligonucleotidmischungen, die den obigen Sequenzen entsprechen, ist beschrieben in Beispiel 1.

Beispiel 1

Konstruktion einer Humicola lanuginosa-cDNA-Bibliothek in E. coli
Gesamt-RNA wurde aus homogenisiertem H. lanuginosa-Mycel unter Verwendung der Verfahren extrahiert, wie sie beschrieben sind von Boel et al. (EMBO J., 3: 1097-1102, 1984) und Chirgwin et al., (Biochemistry (Wash.), inl, 5294-5299, 1979). Poly(A)haltige RNA wurde durch zwei Zyklen Affinitätschromatographie auf oligo(dt)-Cellulose erhalten, wie beschrieben von Aviv und Leder (PNAS, USA, 69, 1408-1412, 1972). cDNA wurde synthetisiert unter Verwendung der Verfahren, die von Okayama und Berg (Molec.Cell.Biol., 2: 161-170, 1982) beschrieben sind, und mit den Vektoren pSP62-K2 und pCDVI-PL, die von Noma et al. (Nature, 319:640-646, 1986) beschrieben sind. Die synthetisierte cDNA wurde in ein hsdR&supmin;, M&spplus;-Derivat von E. coli MC1000 (Casadaban und Cohen, J.Mol.Biol., 138, 179-207, 1980) transformiert, um rekombinante Klone zu erzeugen.

Identifizierung von spezifischen cDNA-Rekombinanten von Humicola lanuginosa-Lipase (HLL)

Eine Mischung von 32 pentadecameren Oligodesoxyribonucleotiden von denen eines komplementär zu HLL-mRNA in der Region, die für Phe-Asn-Gln-Phe-Asn kodiert, ist, wurde auf einem DNA- Synthesizer von Applied Biosystems, Inc. synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ungefähr 10.000 E. coli-Rekombinante aus der Humicola lanuginosa-cDNA- Bibliothek wurde auf Papierfilter Whatman 540 überführt. Die Kolonien wurde lysiert und immobilisiert, wie beschrieben von Gergen et al. (Nucleic Acids Res. 7, 2115-2135, 1979). Die Filter wurden mit der mit ³²P markierten HLL-spezifischen Pentadecamer-Mischung hybridisiert, wie beschrieben von Boel et al. (EMBO J. 3, 1097-1102, 1984). Hybridisierung und Waschen der Filter wurde bei 37ºC bzw. 43ºC durchgeführt, gefolgt von Autoradiographie für 24 Stunden mit einem Verstärkerschirm. Miniprep-Plasmid-DNA wurde aus zwei hybridisierenden Kolonien, pHLL 702,3 und pHLL 702,4, mit Standardverfahren isoliert (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, 1979), und die DNA-Sequenz des cDNA- Inserts wurde mit dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Methods Enzymol. 65, 499-560, 1980) festgestellt.
Um weitere Konstruktionsarbeit mit der HLL-cDNA zu erleichtern, wurden DNA-Sequenzen, die einzeln vorliegende Restriktionsstellen enthalten, zu den 5'- und 3'-Enden der cDNA hinzugefügt, wie folgt. pHLL 702,3 wurde mit Sau96I verdaut, das HLL-cDNA in der 3' nicht-translierten Region verdaut, und die resultierenden Enden wurden mit E. coli-DNA- Polymerase (Klenow-Fragment) und den vier dNTPS eingefüllt. Diese DNA wurde anschließend mit SacI verdaut, das die HLL- cDNA einmal unmittelbar 3' zum einleitenden Methionin-Codon schneidet. Das resultierende 0,9 kb lange HLL-cDNA-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, elektroeluiert und für Ligationsreaktionen bereitgemacht. Als ein 5'-Adaptor wurden zwei Oligonukleotide, 927 und 928, synthetisiert. Die Sequenz des Adaptors ist in Fig. 3 dargestellt. Dieser Adaptor wurde konstruiert, um eine HindIII- und eine BamHI-Stelle unmittelbar 5' zum einleitenden Met-Codon von HLL-cDNA hinzuzufügen. Die zwei Oligos wurden mit ATP und T&sub4;-Polynucleotidkinase kinasiert, aneinander anneliert und an die gereinigte 0,9 kb lange HLL-cDNA-Sequenz in einem pUC19-Vektor ligiert, der mit HincIII und HindII verdaut worden war, und auf einem 0,7 % Agarosegel gereinigt. Das resultierende Plasmid pHLL trug die HLL-cDNA als ein portables 0,9 kb langes BamHI-Fragment. Die Konstruktion von pHLL ist in Fig. 3 dargestellt.
Nach BamHI-Verdauung und Reinigung des 0,9 kb langen HLL-cDNA- Fragmentes auf einem Agarosegel wurde es an mit BamHI verdauten und phosphatasierten p775 ligiert, um p960 zu erzeugen, in dem HLL-cDNA unter Transkriptionkontrolle des TAKA-Promotors aus Aspergillus oryzae und des AMG-Terminators aus Aspergillus niger steht. Die Konstruktion von p960 ist in Fig. 4 dargestellt.
Die Konstruktion von p775 ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 87 103 806.3 beschrieben.
p775 enthält den TAKA-Promotor und AMG-Terminator und hat eine einzelne BamHI-Stelle als eine Klonierungsstelle.
Figur 5a und b gibt die Sequenz von Präpro-HLL-cDNA mit ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz an. Die Nucleotide sind numeriert von der ersten Base in der klonierten cDNA an. Aus dieser cDNA-Sequenz kann geschlossen werden, daß HLL als ein 291 Aminosäurereste langer Precursor mit einem Signalpeptid mit 17 Resten und einem kurzen Propeptid mit 5 Resten synthetisiert ist. Die mutmaßliche Signalpeptidase- Verarbeitungsstelle (von Heijne, Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) ist mit einem Pfeil angegeben der auf die Peptidbindung zwischen einem Ala- und einem Ser-Rest zeigt. Der Amino- Terminus des reifen Enzyms, wie identifiziert durch aminoterminale Aminosäuresequenzierung, ist angegeben.

Aminosäurezusammensetzung von Humicola lanuginosa (HLL)

Aminosäureanalyse wurde mit Hilfe eines Aminosäureanalysators von Beckman (Model JL1 MB) an Proben (40 ug) durchgeführt, die zuvor in zugeschmolzenen Ampullen in 6 M HCl oder 4 M Methansulfonsäure bei 110ºC für 24, 48 und 96 Stunden hydrolysiert worden waren. Halb-Cystin wurde bestimmt als s-β- (4-Pyridylethyl)-cystein nach Reduktion mit Tributylphosphin, gefolgt von Kopplung mit 4-Vinylpyridin. Alle Chemikalien besaßen höchste Reinheit.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt und verglichen mit der Aminosäurezusammensetzung, die aus der cDNA-Sequenzierung bestimmt ist. Aminosäure Gefunden nächstkommende ganze Zahl a) Extrapolierter Wert auf Hydrolysezeit Null b) Extrapolierter Wert auf Hydrolysezeit Unendlich c) Bestimmt als s-β-(4-Pyridylethyl)-cystein.

Beispiel 2

Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger (allgemeine Vorgehensweise)

100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wurde mit Sporen von A. oryzae, A. niger oder argB-Mutanten hiervon beimpft und unter Schütteln bei 37ºC für etwa 2 Tage inkubiert. Das Mycel wurde durch Filtration durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO&sub4; gewaschen. Das Mycel wurde in 15 ml 1,2 M MgSO&sub4;, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH = 5,8, suspendiert. Die Suspension wurde auf Eis gekühlt und 1 ml Puffer, der 120 mg Novozym 234, Charge 1687, enthielt, wurde zugegeben. Nach 5 Min. wurde 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma Typ H25) zugegeben und die Inkubation wurde mit sanfter Bewegung für 1,5-2,5 Stunden bei 37ºC fortgesetzt bis eine große Anzahl von Protoplasten in einer unter dem Mikroskop untersuchten Probe sichtbar war.
Die Suspension wurde durch Miracloth filtriert, das Filtrat in ein steriles Röhrchen überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mm Tris-HCl, pH = 7,0, überschichtet. Zentrifugation wurde für 15 Min. bei 1.000 g durchgeführt und die Protoplasten wurde von der Oberseite des MGSO&sub4;-Kissens abgesammelt. Zwei Volumenteile STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) wurden zur Protoplastensuspension hinzugegeben und die Mischung wurde für 5 Min. bei 1.000 g zentrifugiert. Der Protoplastenpellet wurde in 3 ml STC erneut suspendiert und erneut pelletiert. Dies wurde wiederholt. Schließlich wurden die Protoplasten in 0,2-1 ml STC erneut suspendiert.
100 ul Protoplastensuspension wurden mit 5-25 ug der geeigneten DNA in 10 ul STC vermischt. Protoplasten aus den argB-Stämmen wurden mit pSa143-DNA (ein Plasmid, das das argB- Gen aus A. nidulans trägt) vermischt und Protoplasten aus den argb+-Stämmen wurden mit p35R2 (einem Plasmid, das das amds-Gen aus A. nidulans trägt) vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 25 Min. stehengelassen. 0,2 ml 60 % PEG 4.000 (BDH 29576), 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl pH = 7,5 wurden zugegeben und vorsichtig vermischt (zweimal) und schließlich wurden 0,85 ml derselben Lösung zugegeben und vorsichtig vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 25 Min. stehengelassen, bei 2.500 g für 15 Min. geschleudert und der Pellet wurde in 2 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation wurden die Protoplasten auf den geeigneten Platten verteilt. Protoplasten aus den argB-Stämmen, die mit pSA143 transformiert sind, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem.Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) verteilt, mit Glucose und Harnstoff als Kohlenstoff- bzw Stickstoffquellen und enthaltend 1,2 M Sorbit für osmotische Stabilisierung. Protoplasten aus den argB&spplus;-Stämmen, die mit p3SR2 transformiert sind, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem.Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) verteilt, die 1,0 M Saccharose, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zur Hemmung des Hintergrundwachstums enthielten. Nach Inkubation für 4-7 Tage bei 37ºC wurde Sporen abgenommen, in sterilem Wasser suspendiert und für Einzelkolonien verteilt. Dieses Verfahren wurde wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolation wurden als ein definierter Transformant aufbewahrt.

Beispiel 3

Expression von rekombinanter Humicola-Lipase (RHL) in einem A. oryzae-Stamm

p960 wird in A. oryzae IFO 4177 durch Co-Transformation mit p3SR2, der das amdS-Gen aus A. nidulans enthält, wie beschrieben in Beispiel 2, transformiert. Protoplasten, die hergestellt sind wie beschrieben, wurden mit einer Mischung aus gleichen Mengen p960 und p3SR2 (jeweils ungefähr 5 ug) inkubiert. Transformanten, die Acetamid als einzige Stickstoffquelle verwenden können, werden zweimal reisoliert. Nach Wachstum auf YPD (Sherman et al., 1981) für drei Tage werden Kulturüberstände durch SDS-PAGE analysiert. Die Gele werden mit Coomassie-Brillantblau R angefärbt. Die besten Transformanten werden für weitere Studien ausgewählt und in einem 2-Liter-Kieler-Fermenter auf 4 % Sojabohnen-Schrotmehl gezüchtet und während des Wachstums mit Glucose versorgt. Die Kultur wird während der Fermentation heftig bewegt. Das rekombinante Humicola-Lipase-Produkt (RHL) wurde aus der Kulturbrühe durch Entfernung der Zellen durch Zentrifugation, Ultrafiltration des Überstandes und Gefriertrocknung isoliert.

Beispiel 4

Expression von Humicola-Lipase in einem A. niger-Stamm

p960 wurde in A. niger argB durch Co-Transformation mit pSa143, das das argB-Gen aus A. nidulans enthielt, wie beschrieben in Beispiel 2, transformiert. Protoplasten wurden mit gleichen Mengen, ungefähr 5 ug, von jedem Plasmid inkubiert. Transformanten wurden auf Minimalplatten (Cove Biochim.Biophys.Acta 113 (1966), 55-56) durch Erleichterung der Argininanforderung selektioniert.
Nach zwei Reisolationen von Conidiosporen wurden die Transformanten für sieben Tage in YPD (Sherman et al., 1981) bei 30ºC kultiviert. Die Kulturüberstände wurden durch SDS- PAGE analysiert. Die meisten Transformanten produzierten Humicola-Lipase in ihren Überständen.
Der Kohlehydratgehalt wurde durch Endo H-Behandlung analysiert, wie beschrieben in Beispiel 5. Es wurde festgestellt, daß der Kohlehydratgehalt etwa dieselbe Größenordnung hat wie für die native Humicola-Lipase. Die Endo H-Empfindlichkeit war dieselbe wie für die rekombinante Humicola-Lipase aus A. oryzae. Es wurde daher angenommen, daß die Natur der Glykosylierung in A. oryzae und A. niger dieselbe ist.

Beispiel 5

Bestimmung des Kohlehydratgehaltes in RHL (rekombinantes Lipase-Produkt aus Beispiel 3) und HLL (natives Lipase-Produkt aus der Kultivation von DSM 4109).
Behandlung mit Enzymen, die Kohlehydrat-Seitenketten abspalten können (Endo H und Glykopeptidase F).
RHL und HLL wurden mit Glykopeptidase F (Boehringer No. 91378, 100 Einheiten. Eine Ampulle, gelöst in 500 ul Wasser) und Endo H (Sigma No. E6878, gelöst in Citratpuffer pH 5,5) behandelt.
HLL und RHL wurden jeweils in 10 mM Tris pH 7,5 (1 mg/ml) gelöst. Zu 100 Pl HLL bzw. RHL wurden 2 ul Glykopeptidase F zugegeben und die Proben wurden bei 37ºC für 20 Stunden inkubiert.
HLL und RHL wurden ferner in jeweils in 10 mM Tris pH 7,5 (1 mg/ml) gelöst und 25 ul Endo H und 50 ul 0,1 M Natriumacetat pH 5,0 wurden zu 25 ul HLL bzw. RHL zugegeben. Die Proben bei 37ºC für 20 Stunden inkubiert.
Die Proben ließ man auf SDS-PAGE-Gradientengelen 7,5-20 % zusammen mit unbehandelter HLL und RHL laufen. Das SDS-PAGE- Gradientengel ist in Fig. 7 dargestellt. Die Proben in Fig. 7 sind wie folgt:
1) Standard: 92K, 67K, 43K, 30K, 20,1K, 14,4K
2) HLL, 1 mg/ml in 10 mM Tris pH 7,5.
3) HLL + Endo H
4) RHL + Endo H
5) RHL + Glykopeptidase F
6) HLL + Glykopeptidase F
7) RHL + Endo H
8) RHL + Glykopeptidase F
9) RHL, 1 mg/ml in 10 mM Tris pH 7,5.
Aus Fig. 7 wird deutlich, daß Glykopeptidase F den Kohlehydratteil von sowohl HLL aus auch RHL abspalten kann und daß das übrigbleibende Protein dieselbe Größe hat. Endo H kann andererseits nur Kohlehydrate von RHL abspalten, wohingegen Endo H-Behandlung von HLL keinerlei Wirkung besitzt.
Demgemäß sind sowohl HLL als auch RHL N-glykosyliert. Die Glykosylierung ist jedoch von unterschiedlicher Natur.
Kohlehydratanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung von Verfahren, die von Thim et al. beschrieben sind, vorgelegt zur Veröffentlichung in Biochemistry, Chaplin, M.F. (1982), Anal.Biochem. 123, 336-341, and Jentoft, N. (1985), Anal.Biochem. 148, 424-433.
Kurzgesagt wurden Proben, die Lipase enthielten, einer Methanolyse unterzogen, gefolgt von Re-N-Acetylierung der Aminozucker und Eliminierung von O-Acetylgruppen durch einen zweiten, milden Methanolyseschritt. Derivate, die für Analyse durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie geeignet sind, wurden durch Perbenzoylierung der Methylglykoside erhalten.
Das Ergebnis der Analyse ist in der folgenden Tabelle dargestellt:
1) Standard: 92K, 67K, 43K, 30K, 20.1K, 14.4K
2) HLL, 1 mg/ml in 10 mM Tris pH 7.5.
3) HLL + Endo H
4) RHL + Endo H
5) RHL + Glycopeptidase F
6) HLL + Glycopeptidase F
7) RHL + Endo H
8) RHL + Glycopeptidase F
9) RHL, 1 mg/ml in 10 mM Tris pH 7.5. Native Humicola-Lipase HLL mol/mol Rekombinante Humicola-Lipase RHL mol/mol N-Acetylglucosamin Mannose Galactose
Die Kohlehydrateinheit der nativen Humicola-Lipase, HLL, besteht aus den zwei Monosacchariden, die in N-Glykosylierungen vom Typ mit hohem Mannosegehalt anzutreffen sind (Montrenil, J. et al., (1986) in "Carbohydrate analysis: a practical approach", Chaplin, M.F. und Kennedy, J.F. (Hrg.), IRL Press, Oxford, S. 143). Das Ergebnis für N-Acetylglucosamin (< 2 mol/mol) zeigt, daß die primäre Sequenz nur eine einzige N-Glykosylierung enthält. Dies konnte außerdem aus der cDNA-Sequenz (Fig. 5a + 5b) abgeleitet werden. Zusätzlich könnte Mannose O-glykosidisch mit Serin- oder Threoninresten verknüpft sein.
Neben N-Acetylglucosamin und Mannose umfaßt die rekombinante Humicola-Lipase, RHL, Galactose in beträchtlicher Menge. Wie für die native Lipase zeigt der Gehalt an N-Acetylglucosamin das Vorhandensein einer einzigen N-Glykosylierung, obgleich diese vom komplexen oder hybriden Typ ist, wenn Galactose Teil hiervon ist. O-Glykosylierung an Serin- oder Threoninresten muß verantwortlich für das Vorhandensein von Galactose sein, wenn die N-Glycosylierung der rekombinanten RHL-Lipase vom Typ mit hohem Mannosegehalt ist, wie dies der Fall für die native HLL-Lipase war.
Im Mittel fügen die Kohlehydrateinheiten ungefähr 1.500 D bis 2.600 D zum Molekulargewicht der nativen Humicola-Lipase HLL bzw. der rekombinanten Humicola-Lipase RHL hinzu. Dies entspricht einem Kohlehydratgehalt von etwa 4,9 % bzw. 8,1 %.

Beispiel 6

Wirkung von pH und Temperatur auf die Stabilität RHL und HLL
RHL (1,4 x 10&sup6; LU/g) bzw. HLL (0.2 x 10&sup6; LU/g) wurden in Pufferlösungen mit unterschiedlichem pH gelöst und für zwei Stunden bei Temperaturen von 55º und 60ºC inkubiert.
Die Pufferlösungen wurden hergestellt aus 47,5 mM Na-Acetat, MOPS (3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure) und Borsäure, mit pH-Einstellungen auf 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH. Zusätzlich wurde zu der Pufferlösung, die in einem separaten Test einer HLL-Probe verwendet wurde, die auf 1,5 x 10&sup6; LU/g gereinigt worden war, PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) zugegeben, um den Proteasegehalt in diesem nativen Lipase-Produkt zu inhibieren.
Lipasekonzentrationen in den Lösungen wurden eingestellt auf ungefähr 10-15 LU/ml.
Unmittelbar nach den Inkubationen wurden die Lipaselösungen in einem Eiswasserbad heruntergekühlt und dort gehalten bis zur Analyse am selben Tag (LU-Methode, AF 95).
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 und in Fig. 8 angegeben.
Aus Fig. 6 wird deutlich, daß die Thermostabilität von RHL größer als diejenige von HLL bei pH 5-10 sowohl bei 55ºC als auch bei 60ºC ist.
Aus Fig. 8 wird deutlich, daß größere Thermostabilität nur teilweise auf dem Fehlen der H. lanuginosa-Proteaseaktivität beruht.

Beispiel 7

Stabilität von RHL und HLL mit vergleichbaren Einheitsaktivitätsniveaus von 4 x 10&sup6; LU/g in der Gegenwart einer typischen alkalischen Bacillus sp.-Protease (hier das kommerziell verfügbare Reinigungsmittelenzym Esperase ).
Die Inkubationsbedingungen waren 0,1 M Borsäure, pH 9,5 und 40ºC oder 55ºC unter Verwendung von Konzentrationen von 3.600 LU/Liter und 0,057 AU/Liter (AU/LU = 0,016 x 10&supmin;³). Die Restaktivitäten wurden auf der Grundlage von Referenzinkubationen berechnet.
Die Ergebnisse sind in Figur 9 angegeben.
Aus Fig. 9 wird deutlich, daß die Thermostabilität von RHL in Gegenwart einer alkalischen Bacillus-Protease überlegen zu derjenigen von HLL ist, wodurch Unterschiede in ihrer Empfindlichkeit gegenüber einem Angriff durch Proteasen gezeigt wird.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen sein.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Humicola- Lipase in einem Aspergillus-Stamm, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt

a) Kultivieren eines Aspergillus sp.-Wirtes, der mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem transformiert worden ist, wobei besagtes Vektorsystem DNA-Sequenzen, die einen Promotor, Transkriptionsinitiationsstellen und Transkriptionsterminator- und Polyadenylierungsfunktionen einschließen, und eine DNA-Sequenz, die die Humicola sp.- Lipase kodiert, umfaßt, und

b) Gewinnen besagter rekombinanten Lipase aus der Kultur.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei dem Promotor flußaufwärtige aktivierende Sequenzen vorangehen.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Vektorsystem ferner eine DNA-Sequenz umfaßt die einen geeigneten Marker für die Selektion von Transformanten kodiert.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Selektionsmarker abgeleitet ist vom Gen für A. nidulans oder A. niger argB, A. nidulans trpC, A. nidulans amdS, Neurospora crassae Pyr4 oder DHFR.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Selektionsmarker das argB-Gen, das von A. nidulans oder A. niger abgeleitet ist, oder das amdS-Gen, das von A. nidulans abgeleitet ist, ist.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen abgeleitet sind von einem Gen, das ein extrazelluläres oder intrazelluläres Protein kodiert, wie etwa eine Amylase, eine Glucoamylase, eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase oder ein glykolytisches Enzym.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen abgeleitet sind vom Gen für A. oryzae, TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei, Asparaginsäure-Proteinase, neutrale A. niger-α-Amylase, säurestabile A. niger-α-Amylase, A. niger-Glukoamylase oder Rhizomucor miehei-Lipase

8. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aspergillus-Wirt ein Aspergillus oryzae-Stamm ist.

9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Promotor der A. oryzae-TAKA-Amylase-Promotor ist.

10. Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen die folgende Sequenz besitzen:

oder einen funktionellen Teil derselben.

11. Ein Verfahren nach Anspruch 9 wobei der Promotor und die flußaufwärtigen aktivierenden Sequenzen folgende Sequenz besitzen:

oder einen funktionellen Teil derselben.

12. Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Sequenz in Anspruch 10 die 1,05 kb nicht-sequenzierte flußaufwärtige Region von Position 0 bis 1.05 in Plasmid pTAKA17 vorangeht.

13. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem ferner eine Signalsequenz umfaßt die operativ verknüpft ist mit der DNA-Sequenz, die besagte Humicola-Lipase kodiert.

14. Ein Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Signalsequenz abgeleitet ist von einem Glucoamylase- oder einem Amylase-Gen aus einer Aspergillus-Spezies, einem Amylase-Gen aus einer Bacillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor aus S. cerevisiae oder einem Humicola-Lipase-Gen.

15. Ein Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Signalsequenz abgeleitet ist vom Gen für die Lipase in Humicola lanuginosa, dem Gen für A. oryzae-TAKA-Amylase, neutrale A. niger-α- Amylase A. niger, säurestabile A. niger-α-Amylase, B. licheniformis-α-Amylase, die maltogene Amylase aus Bacillus licheniformis subtilisin.

16. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Vektorsystem zwei Vektoren umfaßt, von denen einer den Selektionsmarker enthält und der andere DNA-Sequenzen, die einen Promotor, Transkriptionsinitiationsstellen und Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsfunktionen umfassen, und eine DNA-Sequenz, die die Humicola-Lipase kodiert, enthält.

17. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die eine Humicola-Lipase kodiert, eine Humicola lanuginosa-Lipase kodiert.

18. Eine rekombinante Humicola sp.-Lipase, wobei der Kohlehydratgehalt von 5 bis 30 % (w/w) beträgt.

19. Eine rekombinante Humicola sp.-Lipase gemäß Anspruch 18, wobei der Kohlehydratgehalt von 5 bis 15 % (w/w) beträgt.

20. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 19, wobei der Kohlehydratgehalt von etwa 6 bis etwa 10 % (w/w) beträgt.

21. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 20, wobei der Kohlehydratgehalt von etwa 7,5 bis etwa 8,5 % (w/w) beträgt.

22. Eine rekombinante Humicola sp.-Lipase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Galactose umfaßt.

23. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie N-Acetylglucosamin, Mannose und Galactose umfaßt.

24. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie von etwa 1 bis etwa 12 mol Galactose pro mol Lipase-Protein umfaßt.

25. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie von etwa 1 bis etwa 6 mol Galactose pro mol Lipase-Protein umfaßt.

26. Rekombinante Humicola sp.-Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß sie von etwa 3 bis etwa 20 mol Mannose pro mol Lipase- Protein umfaßt.

27. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie von etwa 3 bis etwa 12 mol Mannose pro mol Lipase-Protein umfaßt.

28. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach den Ansprüchen 18- 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie pro mol Lipase-Protein etwa 2 mol N-Acetylglucosamin, von etwa 3 bis etwa 20 mol Mannose und von etwa 1 bis etwa 12 mol Galactose umfaßt.

29. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie pro mol Lipase-Protein etwa 2 mol NAcetylglucosamin, etwa 3 bis etwa 12 mol Mannose und etwa 1 bis 6 mol Galactose umfaßt.

30. Rekombinante Humicola sp.-Lipase nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie pro mol Lipase-Protein etwa 2 mol N- Acetylglucosamin, von etwa 6 bis etwa 9 mol Mannose und von etwa 2 bis etwa 4 mol Galactose umfaßt.

31. Rekombinante Humicola sp.-Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Restaktivität nach 2 Stunden bei 60ºC von wenigstens 90 % bei einem pH von etwa 6 bis etwa 9; oder eine Restaktivität nach 2 Stunden bei 60ºC von wenigstens 80 % bei einem pH von etwa 5,5 bis etwa 9,2; oder eine Restaktivität nach 2 Stunden bei 55ºC von wenigstens 95 % bei einem pH von etwa 6 bis etwa 9,5; oder eine Restaktivität bei 55ºC bei pH 9 von wenigstens 99 % oder eine Restaktivität bei 55ºC bei pH 10 von wenigstens 85 % besitzt.

32. Eine rekombinante Humicola sp.-Lipase nach einem der Ansprüche 18-31, die eine Humicola lanuginosa-Lipase ist.