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CN109022518A - 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 - Google Patents

用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 Download PDF

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CN109022518A
CN109022518A CN201810960795.9A CN201810960795A CN109022518A CN 109022518 A CN109022518 A CN 109022518A CN 201810960795 A CN201810960795 A CN 201810960795A CN 109022518 A CN109022518 A CN 109022518A
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CN
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cellulosic material
enzyme
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acid
amylase
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CN201810960795.9A
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A.R.加斯帕
徐辉
J.克鲁南伯格斯
J.罗
K.雷恩
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Novozymes North America Inc
Original Assignee
Novozymes North America Inc
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Abstract

本发明涉及用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法。具体地，使纤维素材料如木质生物质与一种或多种酶在再制浆步骤中接触。然后，使所述纤维素材料与一种或多种酶接触以改进纤维素材料的水解。水解还经由淀粉酶和/或甘露聚糖酶的使用而得到酶促增强。

Description

用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法
本发明申请是基于申请日为2010年1月9日，申请号为“201280036120.6”(国际申请号为PCT/US2012/047326)、名称为“用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法”的发明专利申请的分案申请。
提述序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及用于酶法预处理纤维素材料的方法，其使用一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶。所述经预处理的纤维素材料适用于糖化。在水解过程中，一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶的添加改进水解性能。
相关领域的描述
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木素纤维素转化成可发酵的糖例如葡萄糖，所述可发酵的糖容易地由酵母发酵成乙醇。所述糖还可以催化性转化或发酵成乙醇以外的其他化学品。
将含木素纤维素原料转化成糖通常牵涉对纤维素材料的预处理，接着是它的酶促水解，其在将糖转化成发酵产物或催化性转化的产物之前。预处理破坏含木素纤维素材料，因而酶促水解能有效发生。
然而，对纤维素材料的预处理能在经预处理的纤维素材料中产生杂质，该杂质对纤维素酶酶类具有有害影响和/或降低或抑制酶促水解和/或糖化。
能够对所述经预处理的纤维素材料进行改进以用于糖化对本领域会是有利的。例如，通过降低、消除或移出对纤维素酶酶类(cellulose enzymes)具有有害影响的杂质来改进经预处理纤维素材料的酶促水解性能会是有利的。
WO 2009/042622披露了一种用于从含木质材料生成发酵产物的方法，其中所述方法包括以下步骤：i)预处理含木质材料；ii)通过使此经预处理的含木质材料以一种或多种纤维素分解酶处理来水解；iii)使用发酵生物发酵，其中在步骤i)的预处理和/或步骤ii)的水解和/或步骤iii)的发酵之前和/或过程中使该含木质材料以一种或多种酯酶处理。
存在对用于酶法预处理纤维素材料的方法，和用于改进水解性能的方法的持续需要。
发明概述
本公开涉及一种预处理纤维素材料如木质生物质(woody biomass)的方法，其通过使纤维素材料与一种或多种(例如几种)脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料。因此，本公开还涉及依照本公开处理的经预处理的纤维素材料。
本公开还涉及用于在纤维素材料的水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括以下或由以下组成：
(a)使所述纤维素材料与一种或多种(例如几种)脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和
(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料。
本公开进一步涉及用于在纤维素材料的水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括以下或由以下组成：(a)使所述纤维素材料与一种或多种(例如几种)脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和(b)用一种或多种(例如几种)酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料，其中所述水解步骤包括以下或由以下组成：使所述经预处理的纤维素材料与一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触。
本公开进一步涉及用于在纤维素材料如木质生物质的水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括：(a)使所述纤维素材料如木质生物质与一种或多种(例如几种)脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和(b)用一种或多种(例如几种)纤维素酶和/或酶组合物水解所述经预处理的木质生物质纤维素材料。在实施方案中，水解步骤包括使所述经预处理的木质生物质纤维素材料与一种或多种(例如几种)淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触。
本公开还涉及一种用于水解经预处理的纤维素材料的方法，其包括以下或由以下组成：用酶组合物糖化纤维素材料，其中通过使所述纤维素材料与一种或多种(例如几种)脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触来预处理纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料。
本公开还涉及一种用于生成发酵产物的方法，其包括以下或由以下组成：(a)用酶组合物和至少一种选自下组的第二酶来糖化经预处理的纤维素材料：淀粉酶、甘露聚糖酶，及其混合物；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述糖化的经预处理纤维素材料以生成发酵产物；和(c)从所述发酵回收发酵产物，其中所述经预处理的纤维素材料通过依照本公开使纤维素材料与一种或多种蛋白酶、果胶酶和/或脂肪酶接触来预处理。
在一个实施方案中，所述经预处理的纤维素材料是木质生物质底物。
定义
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman№1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and AppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。
就本公开而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解中的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50℃，72小时，通过 HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)测定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH 5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight intothe function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology 15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的步骤来确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可采用Lever等的方法来估测玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用来确定荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)的纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(β-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据由Venturi等,2002,Extracellularβ-D-glucosidase fromChaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本步骤来确定β-葡糖苷酶活性。1个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃pH4.8，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，将在总蛋白重量的2-3％的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3％的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(如WO02/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物用作纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解程度所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，且最优选至少20倍。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的(non-canonical)，且它们无法被视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom和Shoham,2003,Microbialhemicellulases.Current Opinion In Microbiology 6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键结合至植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可指派为由数字标记的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步分类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和更新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752进行测量。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。木聚糖分解酶测定法的最近进展汇总于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann等,1997,Theβ-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctionalβ-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal 321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过测定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦斯佩耳特小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法测定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methodsfor assay of xylanase activity,Journal of Biotechnology 23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-阿拉伯糖木聚糖(arabinoxylan)作为底物在37℃在0.01％TRITON X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中来测定。1个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，使用如Lever,1972,A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates,Anal.Biochem 47:273-279所述对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是用0.2％AZCL-阿拉伯糖木聚糖作为底物在37℃在0.01％Triton X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中测定的。1个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原末端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，1个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
酯酶：术语“酯酶”意指在与水的化学反应(称为水解)中将酯分裂成酸和醇的水解酶。该术语还指称作羧基酯水解酶的酶，其指的是作用于酯键的酶类，且包括依照酶命名法(Enzyme Nomenclature)(可在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme获得或从Enzyme Nomenclature 1992,Academic Press,San Diego,California获得，具有增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5，分别于Eur.J.Biochem.1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.1995,232,1-6；Eur.J.Biochem.1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.1997,250；1-6和Eur.J.Biochem.1999,264,610-650)分类于EC 3.1.1羧基酯水解酶中的酶。酯酶的非限制性实例包括羧基酯酶、芳基酯酶、三酰甘油脂肪酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果胶酯酶、固醇酯酶、叶绿素酶、L-阿拉伯糖内酯酶(arabinonolactonase)、葡糖酸内酯酶(gluconolactonase)、脲内酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕榈酸视黄酯酯酶、羟基丁酸二聚体水解酶、酰基甘油脂肪酶、3-氧代己二酸烯醇内酯酶(oxoadipate enol-lactonase)、1,4-内酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇内酯酶(pyridoxolactonase)、酰基肉碱水解酶、氨酰-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖内酯酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶(phosphogluconolactonase)、磷脂酶A1、6-乙酰葡糖脱乙酰酶、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素脂肪酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶、放线菌素内酯酶、苔色酸缩酚酸水解酶(orsellinate-depside hydrolase)、头孢菌素-C脱乙酰酶、氯原酸(chlorogenate)水解酶、α氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酯酶、羧甲烯丁烯羟酸内酯酶(carboxymethylenebutenolidase)、脱氧柠檬苦素A(limonate A)-环-内酯酶、2-乙酰-1-烃基甘油磷酸胆碱(alkylglycerophosphocholine)酯酶、镰孢氨酸-C鸟氨酸酯酶、芥子碱(sinapine)酯酶、蜡酯水解酶、佛波醇二酯(phorbol-diester)水解酶、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)脱酰酶、唾液酸O-乙酰酯酶、乙酰氧基丁炔基联噻吩(acetoxybutynylbithiophene)脱乙酰酶、乙酰水杨酸(acetylsalicylate)脱乙酰酶、甲基伞形基-乙酸酯脱乙酰酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸酯内酯酶、N-乙酰半乳糖氨基聚糖(acetylgalactosaminoglycan)脱乙酰酶、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酯酶、蛋白质-谷氨酸酯甲基酯酶、11-顺式-棕榈酸视黄酯水解酶、全-反式-棕榈酸视黄酯水解酶、L-鼠李糖-1,4-内酯酶、5-(3,4-双乙酰氧基丁-1-炔基)-2,2'-联噻吩脱乙酰酶、脂肪酰基乙酯合酶、木糖-1,4-内酯酶、N-乙酰葡糖氨基磷脂酰肌醇脱乙酰酶、西曲酸酯苄基酯酶(cetraxate benzylesterase)、乙酰烃基甘油乙酰水解酶、和乙酰木聚糖酯酶。酯酶的非限制性实例包括依照酶命名法(Enzyme Nomenclature)(可在具有地址www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme的网站获得)分类于EC 3.1.1.1至(且包括)EC3.1.1.85的羧基酯水解酶。酯酶具有广泛特异性，且还可以水解维生素A酯。酯酶还可来自亦催化EC 3.1.1.2、EC 3.1.1.5、EC 3.1.1.6、EC 3.1.1.23、EC 3.1.1.28、EC 3.1.2.2、EC 3.5.1.4和EC 3.5.1.13的反应的微粒体。
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(α-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEENTM20的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物测定的。1个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。依照本公开使用的阿魏酸酯酶的非限制性实例列于下文。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物测定的。1个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(α-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249测定的。1个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml 100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，其后通过 HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测定的。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯糖木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume 65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属(miscanthus)。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨(aspen)。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树(poplar)。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是经磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergentplant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，其使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料经预处理。
经预处理的纤维素材料：术语经预处理的纤维素材料意指任何已在准备进一步加工时经过处理的纤维素材料。经预处理的纤维素材料的非限制性实例包括通过在准备酶促水解时的一种或多种化学、酶法、机械或物理预处理步骤处理的纤维素材料。在另一个方面，预处理包括木质生物质的再制浆。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。在实施方案中，用热处理的源自玉米秸秆的纤维素材料还用稀酸处理。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地从一种或多种或全部与其天然结合的天然存在的成分移出的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于见于自然界的该物质经人为修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其自然结合的其他组分增加该物质的量(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然结合的启动子更强的启动子)而修饰的物质。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序预测(Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物学活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序预测(Nielsen等,1997，见上)。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的选项参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定。使用的选项参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
多肽片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有生物学活性。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物学活性的片段。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以ATG起始密码子或备选的起始密码子如GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA:术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。术语核酸构建体在包含表达编码序列所需的调控序列时与“表达盒”同义。
调控序列：术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码多肽的多核苷酸可为天然的或外来的，或各个调控序列对于彼此可为天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子、和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特定限制性位点的接头一起提供，所述特定限制性位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的另外的核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含一个或多个(几个)氨基酸残基的改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接占据某位置的氨基酸处添加一个或多个(几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。
脂肪酶：术语脂肪酶意指具有脂肪酶活性的多肽。如本文中使用的，术语“脂肪酶活性”意指一种羧基酯水解酶活性，其催化三酰甘油在形成二酰甘油和羧酸下的水解。在另一个方面，如本文中使用的，术语“脂肪酶活性”还可意指一种羧基酯水解酶活性，其催化二酰甘油在形成单酰甘油和羧酸下的水解。在另一个方面，如本文中使用的，术语“脂肪酶活性”还可意指一种羧基酯水解酶活性，其催化单酰甘油在形成甘油和羧酸下的水解。
蛋白酶：术语“蛋白酶”意指具有蛋白酶活性的多肽。术语“蛋白酶活性”在本文中定义为催化连接肽中两个氨基酸的肽键水解的蛋白水解活性。蛋白酶活性可使用任意测定法测量，其中采用包含与所论述蛋白酶的特异性有关的肽键的底物。术语蛋白酶还包括属于EC 3.4酶组(包括其第13亚类的每一种，这些酶在下文中称为“属于EC 3.4.-.-组”)的任何酶。EC编号指来自NC-IUBMB,Academic Press,San Diego,California的EnzymeNomenclature 1992，包括出版在分别为Eur.J.Biochem.1994,223:1-5；Eur.J.Biochem.1995,232:1-6；Eur.J.Biochem.1996,237:1-5；Eur.J.Biochem.1997,250:1-6；和Eur.J.Biochem.1999,264:610-650中的增补1-5。该命名法定期补充并更新；参见例如万维网上www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
果胶酶：术语果胶酶意指一种具有果胶酶活性从而其能够水解果胶物质的多肽。就本发明而言，该术语还包括任一种如记载于Jayani等,2005,Microbial pectinolyticenzymes:a review,Process Biochemistry 40:2931-2944(通过提述以其整体并入本文)的果胶分解酶。用于测定果胶酶活性的各种测定方法在Jayani等,2005,Microbialpectinolytic enzymes:a review,Process Biochemistry 40:2931-2944中列出。
甘露聚糖酶：术语“甘露聚糖酶”或“半乳甘露聚糖酶”指称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶且具有另外的名称β-甘露聚糖酶和内切-1,4-甘露聚糖酶，并催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷连接水解的甘露聚糖酶，该酶依照Enzyme Nomenclature分类为EC 3.2.1.78(参见，例如网站地址www.expasy.ch/enzyme)。可依照本领域中已知的标准测试步骤来测试本公开的具有甘露聚糖酶活性的多肽的甘露聚糖酶活性，如例如通过将待测试溶液施加于在含0.2％AZCL半乳糖甘露聚糖(长豆角)的琼脂板中打孔的4mm直径孔中，所述AZCL半乳糖甘露聚糖即为用于测定内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶的底物，该酶可作为目录号I-AZGMA从Megazyme公司获得(Megazyme的网址：www.megazyme.com)。
发明详述
本公开的一个方面涉及一种用于酶法处理纤维素材料如木质生物质的方法，包括：(a)使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料。
本公开的另一个方面涉及一种用于在经预处理的纤维素材料如木质生物质的水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括以下或由以下组成：(a)使所述经预处理的纤维素材料如木质生物质与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料。
本公开的另一个方面涉及一种用于在经预处理的纤维素材料的水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括以下或由以下组成：(a)使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料，其中所述水解步骤包括使所述经预处理纤维素材料与一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶或其混合物接触。
本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，其包括：在存在具有本发明淀粉酶(包括但不限于葡糖淀粉酶)和甘露聚糖酶活性的多肽的情况下用酶组合物处理所述纤维素材料。在一个方面，所述方法还包括回收降解或转化的纤维素材料。可使用本领域中已知的方法，如例如离心、过滤或重力沉降从不溶性纤维素材料分离该纤维素材料的降解或转化的可溶性产物。
纤维素材料的预处理
在实施方案中，在水解和发酵之前，可依照本公开预处理纤维素材料和/或含木素纤维素材料。以本领域中已知的任何合适方法来预处理适于依照本公开使用的纤维素材料。预处理的目标是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，这样会改善酶促水解的速率。
不希望受本公开束缚，认为常规预处理在经预处理的纤维素材料中产生杂质，且其可对纤维素酶和/或酶水解产生有害影响。
纤维素材料的预处理包括本领域中已知的任何常规预处理步骤。预处理可发生在水性浆体中，或者可直接应用于原始形式的纤维素材料。在实施方案中，含纤维素材料在预处理过程中可以以预处理反应总重的2-80wt.％，例如20-50wt.％的量存在。在实施方案中，通过纳入依照本公开的预处理，例如使纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料而使常规预处理得到改进。
化学、机械和/或生物预处理
依照本公开对纤维素材料预处理的非限制性实例包括在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行化学、机械和/或生物预处理。机械处理(通常称作物理预处理)可单独使用或与后续或同时的水解特别是酶促水解组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在实施方案中，在水解和/或发酵之前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，如同时添加一种或多种纤维素分解酶或下文提及的其他酶活性，以释放可发酵的糖如葡萄糖和/或麦芽糖。
在本公开的一个实施方案中，在水解步骤之前、过程中或之后依照本公开将经预处理的纤维素材料洗涤和/或解毒。这可改善例如经稀酸水解的含木素纤维素材料如玉米秸秆的可发酵性。
在依照本公开的实施方案中，通过使经预处理的纤维素材料与酶或酶组合物(包括脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或这些的混合物)接触以形成经酶法预处理的纤维素材料来实施解毒。
化学预处理
根据本公开，“化学预处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的非限制性实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。此外，湿氧化和pH控制的水热解亦是涵盖的化学预处理。
在实施方案中，所述预处理是酸预处理，例如连续稀酸处理和/或弱酸(mildacid)处理，如用硫酸或另一种有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物的处理。亦可使用其它酸。弱酸处理在本公开的上下文中意指处理pH在1-5，例如pH 1-3的范围。在一个特定的实施方案中，酸浓度在0.1至2.0wt.％酸，例如硫酸的范围内。在实施方案中，酸浓度在0.1至70.0wt％酸的范围内。非限制性实例包括10、20、30、40、50、60、70wt％的酸，包括但不限于高度浓缩的盐酸。可将所述酸与依照本公开的待发酵的材料混合或接触，并可将混合物保持在160-220℃，例如165-195℃的范围，进行数分钟至数秒，例如1-60分钟，例如2-30分钟或3-12分钟的时间。可应用强酸如硫酸的添加以去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。
已显示，根据本公开亦涵盖的纤维素溶剂处理将约90％的纤维素转化为葡萄糖。亦显示当木素纤维素结构受破坏时，酶水解可大为增强。碱性H2O2、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl3，(Al)2SO4)、甘油、二噁烷、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686)。
用碱，例如NaOH、Na2CO3和/或氨等进行的碱性化学预处理亦在本公开的范围内。使用氨的预处理方法描述于例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO2006/110901，其通过提述以其整体并入。
湿法氧化技术涉及氧化剂如基于过氧化物的氧化剂等的使用。湿法氧化技术还可涉及还原剂如基于亚硫酸盐的还原剂等的使用。溶剂预处理的非限制性实例包括用DMSO(二甲亚砜)等进行的处理。化学预处理通常进行1至60分钟如5至30分钟，但可根据待预处理的材料进行更短或更长的时间。
合适预处理方法的其他非限制性实例描述于Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686,以及美国公开no.2002/0164730，其均通过提述以其整体并入本文。
依照本公开的实施方案，通过使经预处理的纤维素材料与酶或酶组合物(包含脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或这些的混合物)接触以形成经预处理的纤维素材料来使经化学预处理的纤维素材料解毒。
机械预处理
如用于本公开的上下文中，术语“机械预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理预处理。机械预处理的非限制性实例包括多种类型的磨制、辐照、汽蒸/蒸汽爆炸、制浆和水热解。
机械预处理包括粉碎(机械减小粒度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本公开的一个实施方案中，高压意指压强在300到600psi，例如400到500psi量的范围内，或例如约450psi的压强。在本公开的一个实施方案中，高温意指在约100到300℃，例如约140到235℃的范围内的温度。在实施方案中，机械预处理是分批过程的蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。可为此使用Sunds Hydrolyzer(可从Sunds Defibrator AB(Sweden)获得)。
依照本公开的实施方案，通过使经预处理的纤维素材料与酶或酶组合物(包含脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或这些的混合物)接触以形成经预处理的纤维素材料来使经机械预处理的纤维素材料解毒。
组合的化学和机械预处理
在本公开的实施方案中，进行了化学和机械预处理两者，其涉及例如，稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。
相应地，在实施方案中，对含纤维素材料进行化学和机械预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
依照本公开的实施方案，通过使经预处理的纤维素材料与酶或酶组合物(包含脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或这些的混合物)接触以形成经预处理的纤维素材料来使经过组合的化学和机械预处理的纤维素材料解毒。
生物预处理
如本公开中使用的，术语“生物预处理”指促进从含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACS Symposium Series 566,AmericanChemical Society,Washington,DC,chapter 15；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,in Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosicmaterials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
在实施方案中，生物预处理涉及对木素或经预处理的材料施用木素降解酶。合适的木素降解酶的非限制性实例包括一种或多种木素分解酶、一种或多种氧化还原酶及其组合。木素分解酶的非限制性实例包括锰过氧化物酶、木素过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶及其组合。合适的预处理酶的非限制性实例还包括一种或多种漆酶、纤维二糖脱氢酶及其组合。
在实施方案中，木素过氧化物酶如“木质素酶(ligninase)”(EC号1.14.99)适于依照本公开使用。
在一个实施方案中，可从Zymetis获得的EthazymeTM Pre适用于依照本公开的预处理。
依照本公开的实施方案，通过使纤维素材料与酶和/或酶组合物(包含脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或这些(酶)的混合物)接触以形成经预处理的纤维素材料来使经生物预处理的纤维素材料解毒。
依照本公开的预处理实施方案
本公开涉及预处理和经预处理的组合物。所述预处理适合用作独立的预处理方法，或用于改进本领域中已知的预处理方法。更具体地，本公开涉及一种预处理纤维素材料如木质生物质的方法，其通过使纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶、果胶酶或其混合物接触以形成经预处理的纤维素材料。不希望受本公开的束缚，认为对纤维素材料的常规预处理增加纤维素材料中的杂质，该杂质能减损材料的酶水解。例如，脂肪、酯、蛋白质和果胶可以足以对水解中使用的酶如纤维素酶具有负面影响的量存在于纤维素材料或经预处理的纤维素材料中。本公开提供用于处理、移出、或消除纤维素材料中毒素的酶和酶组合物以及方法。所述方法包括将预定量的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶、或这些的混合物应用于需要处理的纤维素材料，包括其中具有纤维素酶抑制量的毒素的纤维素材料。
因此，依照本公开的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶、或混合物和/或组合物提供对一种或多种抑制纤维素酶的物质的处理，其中主要活性成分是脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶。在实施方案中，依照本公开的组合物包括商业上可用形式的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶。
在实施方案中，可将依照本公开的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶、或其组合物施用于需要改进的纤维素材料，所述改进例如如减少或消除不合意的抑制纤维素酶的物质，如一种或多种酯、蛋白质或果胶。如本文中使用的，词“处理”指预防性使用本公开的一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或其组合物来防止抑制纤维素酶的物质在纤维素材料或经预处理的纤维素材料中积累，或改善现有条件，和/或促进或延长用于水解经预处理纤维素材料的纤维素酶或酶组合物的纤维素酶活性。现可进行大量的不同处理，其从纤维素材料如木质生物质减少和/或消除抑制纤维素酶的物质。
依照本公开的处理使纤维素材料如木质生物质与有效量的依照本公开的一种或多种活性脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以改善毒性状况。施用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶成分或组合物直至达到处理目标。然而，处理持续时间可随着毒性状况的严重程度或样品中存在的毒素量而变化。例如，取决于处理的目标是降低还是消除纤维素酶抑制条件，处理可持续数分钟(非限制性实例包括5、10、15、20、30、60、120分钟)至数天(非限制性实例包括1天、2天、3天、4天、5天)。
在实施方案中，脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或其组合物包含或组成为一种或多种(几种)选自下组的酶：脂肪酶、蛋白酶、果胶酶及其混合物。脂肪酶、蛋白酶、果胶酶组合物可包含任何可用于将纤维素材料如木质生物质解毒的脂肪酶、蛋白酶、果胶酶蛋白。
在实施方案中，适于依照本公开使用的脂肪酶一般指任何具有脂肪酶活性的酶或多肽。在实施方案中，本公开的脂肪酶可以是羧基酯水解酶EC 3.1.1.-，其包含活性如EC3.1.1.3三酰甘油脂肪酶、EC 3.1.1.4磷脂酶A2、EC 3.1.1.5溶血磷脂酶、EC 3.1.1.26半乳糖脂肪酶、EC 3.1.1.32磷脂酶A1、EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶、和/或EC 3.1.1.74角质酶(cutinase)。
如本文中使用的，EC编号指来自NC-IUBMB,Academic Press,San Diego,California的Enzyme Nomenclature 1992，包括在分别为Eur.J.Biochem.1994,223:1-5；Eur.J.Biochem.1995,232:1-6；Eur.J.Biochem.1996,237:1-5；Eur.J.Biochem.1997,250:1-6；和Eur.J.Biochem.1999,264:610-650中出版的增补1-5。该命名法定期补充并更新；参见，例如，万维网上www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
在一个具体的实施方案中，适于依照本公开使用的脂肪酶包括一种或多种角质酶，其为能够水解底物角质的脂肪分解酶。已知来自各种真菌的角质酶(P.E.Kolattukudy于“Lipases”,Ed.B.和H.L.Brockman,Elsevier 1984,471-504)。已描述豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶的氨基酸序列和晶体结构(Longhi等,Journalof Molecular Biology,268(4),779-799(1997))。来自特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶的氨基酸序列亦已公开在美国专利No.5,827,719(通过提述以其整体并入本文)。已公开适于依照本公开使用的豌豆腐皮镰孢角质酶的许多变体：WO 94/14963；WO 94/14964；WO 00/05389；Appl.Environm.Microbiol.64:2794-2799,1998；Proteins:Structure,Function and Genetics 26:442-458,1996；J.of Computational Chemistry17:1783-1803,1996；Protein Engineering 6:157-165,1993；Proteins:Structure,Function,and Genetics 33:253-264,1998；J.of Biotechnology 66:11-26,1998；Biochemistry 35:398-410,1996；Chemistry and Physics of Lipids 97:181-191,1999；Proteins:Structure,Function,and Genetics 31:320-333,1998；Biochimica etBiophysica Acta 1441:185-196,1999；Appl.Environm.Microbiol.64:316-324,1998；BioTechniques 27:1102-1108,1999。
适于依照本公开使用的脂肪酶包括可从Novozymes A/S获得的STICKAWAYTM牌酶。
在适于依照本公开使用的各个实施方案中，亲本酶是依照Enzyme Nomenclature分类为EC 3.1.1.74的角质酶(参见例如，可在www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme获得的网站)。这类实施方案包括真菌角质酶，如丝状真菌角质酶，例如对于腐质霉属(Humicola)或镰孢属(Fusarium)，特别是特异腐质霉或豌豆腐皮镰孢的菌株，更特别是特异腐质霉菌株DSM 1800为天然的角质酶。美国专利No.6,960,459的SEQ ID NO:1显示特异腐质霉菌株DSM 1800的角质酶的氨基酸序列(成熟肽)和本文中对于特异腐质霉角质酶使用的编号系统。氨基酸序列及编码其的DNA序列先前公开为美国专利No.5,827,719的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1，其通过提述并入本文。
豌豆腐皮镰孢角质酶的氨基酸序列显示为WO 94/14964的图1D中的成熟肽，其通过提述以其整体并入本文。用于豌豆腐皮镰孢角质酶的编号系统是在WO 94/14964中使用的；它包括在所述图1D中显示的原序列(pro-sequence)；如此，成熟角质酶在位置16-215处。
在各个实施方案中，适用于本文地，亲本角质酶可具有与特异腐质霉菌株DSM1800的角质酶至少50％(特别是至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)同源的氨基酸序列。亲本角质酶具体可为能与特异腐质霉菌株DSM 1800的角质酶比对的角质酶。
在实施方案中，真菌角质酶的变体适合依照本公开使用。例如，适于依照本公开使用的变体包括记载于通过提述以其整体并入本文的美国专利No.6,960,459的变体。具体地，适于依照本公开使用的变体角质酶包括在美国专利No.6,960,459的第4栏中鉴定的变体。在实施方案中，角质酶包括那些与美国专利No.6,960,459的第4栏中鉴定的任何变体展现出高序列同一性，例如，与成熟的酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，如美国专利No.7,833,771(通过提述以其整体并入本文)中的测定角质酶活性。
在实施方案中，将使用三丁精(tributyrin)作为底物测定的脂肪分解活性确定为角质酶活性。此方法基于该酶对三丁精的水解，且碱消耗被记录为时间的函数。1个脂肪酶单位(LU)定义为在标准条件下(例如在30℃；pH 7；以Gum Arabic(阿拉伯胶)作为乳化剂和三丁精作为底物)每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。
在实施方案中，依照本公开的脂肪酶包括微生物脂肪酶。如此，所述脂肪酶可选自酵母，例如假丝酵母属(Candida)；细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)或芽孢杆菌属(Bacillus)；或丝状真菌，例如腐质霉属或根毛霉属(Rhizomucor)。更具体地，合适的脂肪酶可为曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(例如，如EP 238 023中所述制备)、细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginose)脂肪酶(例如，如EP 305 216中所述制备)、特异腐质霉脂肪酶、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)脂肪酶、洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A或B、或来自以下的脂肪酶：rGPL、Absidia blakesleena、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、腐皮镰孢(Fusariumsolani)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、圆弧青霉(Penicillum cyclopium)、皮壳青霉(Penicillum crustosum)、扩展青霉(Penicillum expansum)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、Thiarosporella phaseolina、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、Sporobolomyces shibatanus、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、潘氏地霉(Geotricum penicillatum)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosohata)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)、哈茨木霉(Trichoderma harzanium)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)、或植物假单胞菌(Pseudomonas plantari)。合适脂肪酶的其他非限制性实例可以是上文提述的任一种脂肪酶的变体，例如如WO 92/05249或WO 93/11254中所述的。
商业上可得到的脂肪酶的非限制性实例包括LipexTM,LipoprimeTM,LipopanTM,Lipopan FTM,Lipopan XtraTM,LipolaseTM,LipolaseTM Ultra,LipozymeTM,PalataseTM,ResinaseTM,NovozymTM 435和LecitaseTM(均可从Novozymes A/S获得)。其他商业上可得到的脂肪酶包括LumafastTM(来自Genencor International Inc.的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)脂肪酶)；LipomaxTM(来自Genencor International Inc.的类产碱假单胞菌(Ps.Pseudoalcaligenes)脂肪酶)；和来自Solvay Enzymes的芽孢杆菌属菌种脂肪酶。别的脂肪酶可从其他供应商获得，如Lipase P“Amano”(Amano PharmaceuticalCo.Ltd.)。
在实施方案中，依照本公开使用的脂肪酶是记载于美国专利公开No.2010/0034797,2009/0029440,2011/0053822和/或2010/0279915的脂肪酶(所有均通过提述以其整体并入本文)。
在实施方案中，依照以下步骤测定脂肪酶活性：通过使用阿拉伯胶作为乳化剂乳化三丁精(甘油三丁酸酯(盐))来制备脂肪酶的底物。在pH稳态滴定实验中追踪三丁精在30℃在pH 7或9的水解。1个脂肪酶活性单位(1LU)定义为能够在30℃，pH 7每分钟释放1微摩尔丁酸的酶量。
在实施方案中，脂肪酶包括与任一种上述脂肪酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，依照本公开使用的角质酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽及其具有角质酶活性的片段。在实施方案中，角质酶包括与SEQ ID NO:1展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
蛋白酶适合依照本公开使用。例如，可在预处理纤维素材料如木质生物质的过程中添加蛋白酶。蛋白酶可为任何蛋白酶。在实施方案中，蛋白酶是微生物来源，例如真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。在实施方案中，酸性真菌蛋白酶适合依照本公开使用，但也可使用其他蛋白酶。
合适蛋白酶的非限制性实例包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。在实施方案中，蛋白酶是酸性蛋白酶，例如以在pH 7以下的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶的非限制性实例包括源自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。其他非限制性实例包括源自以下的蛋白酶：黑曲霉(Aspergillus niger)(参见，例如Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan 28:216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan 28:66)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Hayashida等,1977,Agric.Biol.Chem.42(5):927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)，或米曲霉如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
蛋白酶的其他非限制性实例包括中性或碱性蛋白酶，例如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。本公开涵盖的一种具体的蛋白酶是源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的蛋白酶，且具有可在Swissprot作为登录号P06832获得的序列。还涵盖的是与可在Swissprot以登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或具体地至少99％的序列同一性的蛋白酶。
蛋白酶的非限制性实例还包括与WO 2003/048353中作为SEQ.ID.NO:1披露的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或具体地至少99％的序列同一性的蛋白酶。
蛋白酶的非限制性实例还包括木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在实施方案中，蛋白酶是源自曲霉属，例如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，蛋白酶源自根毛霉属，例如曼赫根毛霉(Rhizomucor mehei)的菌株。在另一个实施方案中，蛋白酶是蛋白酶制备物，例如源自曲霉属(例如米曲霉)菌株的蛋白水解制备物和源自根毛霉属(例如曼赫根毛霉)菌株的蛋白酶的混合物。
其他合适的蛋白酶包括天冬氨酸蛋白酶，例如Hand-book of ProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,Chapter 270)中记载的那些。天冬氨酸蛋白酶的非限制性实例包括，例如披露于Berka等,1990,Gene 96:313；Berka等,1993,Gene 125:195-198；和Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100的那些，所述文件通过提述以其整体并入本文。
商业上可得到的蛋白酶产品的非限制性实例包括ESPERASETM,FLAVOURZYMETM,PROMIXTM, NOVOZYMTM FM 2.0L和NOVOZYMTM 50006(可从Novozymes A/S,Denmark获得)以及GC106TM和SPEZYMETM FAN(来自Genencor Int.,Inc.,USA)。其他酶包括FERMGENTM和GC 212(来自Genencor)。
在实施方案中，丝氨酸蛋白酶可适于依照本公开使用。合适的丝氨酸蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。它可为丝氨酸蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(记载于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270中描述的镰孢属蛋白酶。
商业上可得到的丝氨酸蛋白酶(肽酶)的非限制性实例包括KannaseTM,EverlaseTM,EsperaseTM,AlcalaseTM,NeutraseTM,DurazymTM,SavinaseTM,SavinaseTMUltra,OvozymeTM,LiquanaseTM,PolarzymeTM,PyraseTM,Pancreatic Trypsin NOVO(PTN),Bio-FeedTM Pro和Clear-LensTM Pro(均可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得)。优选的丝氨酸蛋白酶包括记载于WO 1998/020115,WO 01/44452,WO 01/58275,WO 01/58276,WO2003/006602和WO 2004/099401的那些。其他商业上可得到的丝氨酸蛋白酶包括RonozymeTMPro,MaxataseTM,MaxacalTM,MaxapemTM,OpticleanTM,ProperaseTM,PurafectTM,PurafectOxTM和Purafact PrimeTM(可从Genencor International Inc.,BASF，或DSM NutritionalProducts获得)。
非限制性蛋白酶实施方案包括记载于美国专利公开No.2011/0028378、2010/0322915和/或2010/0304433的那些(所述文件均通过提述以其整体并入本文)。
在实施方案中，蛋白酶包括与上述任一种蛋白酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，依照Sawada等,1983,Experientia 39:377描述的步骤来测定蛋白酶活性。1个蛋白酶活性单位定义为在25℃，pH 8每分钟从底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(可在Peptide Inc.(Osaka,Japan)获得，产品码：3120-v)释放出1.0微摩尔7-氨基-4-甲基香豆素。在实施方案中，使用本领域中已知的方法来测定蛋白酶活性，所述方法包括但不限于记载于美国公开专利申请号2011/0158976的那些，该文件通过提述以其整体并入本文。
在实施方案中，依照本公开使用的蛋白酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽及其具有蛋白酶活性的片段。在实施方案中，蛋白酶包括与SEQ ID NO:2展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，蛋白酶可以稳定化的组合物提供，如记载于美国专利No.5,972,873和美国专利公开No.20070060493的那些，两者均通过提述以其整体并入本文。
在实施方案中，适于依照本公开使用的果胶酶一般指任何果胶酶，特别是微生物来源的，特别是细菌来源的，如源自芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和欧文氏菌属(Erwinia)内菌种的果胶酶，或者是真菌来源的，如源自曲霉属内菌种，特别是黑曲霉和棘孢曲霉菌种内菌株的果胶酶。涵盖的非限制性商业上可得到的果胶酶包括BIOPREPTM,NOVOZYMTM 863,PEXTINEXTM 3XL,PECTINEXTM SMASH和PECTINEXTM SMACH XXL,BIOCIPTM MEMBRANE及这些的组合(均可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
在一个实施方案中，果胶酶是来自Novozymes A/S,Denmark的PECTINEXTM ULTRASP-L(包含棘孢曲霉果胶酸裂合酶)，其适合依照本发明使用。
在实施方案中，所述果胶酶是多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、果胶酯酶(EC3.2.1.11)、或果胶裂合酶(EC4.2.2.10)。果胶酶的合适来源生物可为黑曲霉。
果胶裂合酶为催化(1.4)-α-D-半乳醛聚糖甲酯的消除性切割以提供在其非还原端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-enuronosyl基团的寡糖的果胶酶。其亦称作果胶裂合酶(pectolyase)，聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶(polymethylgalacturonictranseliminase)，果胶甲基反式消除酶(pectin methyltranseliminase)，果胶反式消除酶(pectin trans-eliminase)等。
果胶裂合酶酶促反应由裂解α-1-4半乳糖醛酸糖苷(α-1-4galacturonosidyl)键产生不饱和的Δ-4,5糖醛(delta-4,5uronide)组成。在C6中具有羰基功能的双键在UV具有吸收。在235nm的光密度测定果胶裂合酶活性。
1个果胶裂合酶(PL)单位是根据45℃和pH 5.5的所述条件，在一分钟内催化结合的内-α-1-4半乳糖醛酸糖苷(C6甲基酯)的裂解而形成1微摩尔的Δ-4,5不饱和产物的酶量。
就本公开而言，包括果胶裂合酶、果胶酸裂合酶和果胶酯酶的上述酶的来源并不重要，例如，所述酶可从植物、动物或微生物如细菌或真菌，例如丝状真菌或酵母获得。例如，通过使用本领域中已知的重组DNA技术可从这些来源获得酶。所述酶可为天然或野生型酶，或其展现出相关酶活性的任何突变体、变体或片段，以及合成的酶，如改组的酶和共有酶。可以如本领域中一般已知的来制备这类遗传工程化的酶，例如通过定点诱变、通过PCR(使用含有期望突变的PCR片段作为PCR反应中引物之一)、或通过随机诱变。共有蛋白质的制备记载于例如EP 897985。
所述果胶酶可以是存在于由给定微生物产生的酶系统中的组分，这类酶系统在大多数情况下包含几种不同的果胶酶组分，包括上文鉴定的那些。
或者，果胶酶可为单一组分，即，基本没有可存在于由给定微生物产生的酶系统中其他果胶酶的组分，所述单一组分通常为重组组分，即，通过克隆编码所述单一组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达产生的。这类可用的重组酶，特别是果胶酶、果胶裂合酶和多聚半乳糖醛酸酶详细记载于例如WO 93/20193、WO 02/092741、WO 03/095638和WO 2004/092479(来自Novozymes A/S)，其通过提述以其整体(包括序列表)并入。宿主优选为异源宿主，但该宿主在一定条件下也可为同源宿主。
在一个优选的实施方案中，依照本发明使用的果胶酶源自曲霉属。
在又一个优选的实施方案中，所述果胶酶是具有JP 11682877的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的原果胶酶(protopectinase)，或者原果胶酶，其具有通过在氨基酸序列中缺失、取代或插入一个氨基酸或几个氨基酸生成的氨基酸序列且具有与有JP 11682877的SEQ IDNO:1氨基酸序列的原果胶酶的活性水平相同或更高水平的活性。
在实施方案中，果胶酶包括与上述任一种果胶酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，用于依照本公开使用的果胶酸裂合酶包括SEQ ID NO:3的成熟多肽及其具有果胶酸裂合酶活性的片段。在实施方案中，果胶酸裂合酶包括与SEQ ID NO:3展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
依照本公开的脂肪酶、蛋白酶和果胶酶可包括性质上较不重要的(of a minornature)氨基酸变化，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的规程，例如定点诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且就纤维素分解增强活性测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性位点或其它生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见，例如，de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与亲本多肽相关的多肽身份的分析来推断。
可以进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，并使用已知的诱变、重组和/或改组方法继之以相关筛选规程来测试，所述规程如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域-定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可与高通量、自动化筛选方法组合来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子并使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在实施方案中，依照本公开的脂肪酶、蛋白酶或果胶酶的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在实施方案中，适于依照本公开使用的脂肪酶酶组合物包含以下或由以下组成：来自Novozymes A/S Denmark的牌酶，或其具有脂肪酶活性的片段。在实施方案中，脂肪酶包括与上述任一种脂肪酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，适于依照本公开使用的蛋白酶酶组合物包含以下或由以下组成：来自Novozymes A/S Denmark的 Ultra 16XL牌酶，或其具有蛋白酶活性的片段。在实施方案中，蛋白酶包括与上述任一种蛋白酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，适于依照本公开使用的果胶酶酶组合物包含以下或由以下组成：来自Novozymes A/S Denmark的Pectinex Ultra SP-L牌酶，或其具有果胶酶活性的片段。在实施方案中，果胶酶包括与上述任一种果胶酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，可将一种或多种脂肪酶、蛋白酶和果胶酶的组合与纤维素材料，包括经预处理的纤维素材料接触。例如，在实施方案中，可将一种或多种包括SEQ ID NO:1、2和3的成熟多肽的合适组合与纤维素材料或经预处理的纤维素材料接触。合适的组合还包括与SEQ ID NO:1、2和3展现出高序列同一性，例如与成熟的脂肪酶、蛋白酶和果胶酶酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的成熟多肽。所述酶组合以足以对纤维素材料提供益处的量添加。
依照本公开使用的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，该细胞被用作宿主细胞以重组表达脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶可为任何适用的形式，如例如移除或未移除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶的来源。所述脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体，或稳定化受保护的酶。液体脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶制备物可根据确立的方法，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
所述脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶可从天然产生脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶作为天然酶的生物体分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶对于宿主生物是天然的或外来的，或具有经修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即，重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
依照本公开的处理不限于直接处理纤维素材料。依照本公开的方法包括、包含或组成为处理和/或后处理(post-treating)经预处理的纤维素材料，其进行其他酶促预处理、化学预处理、机械预处理和/或物理预处理或这些的组合。
在实施方案中，用酶或酶组合物如脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶及其混合物的接触或处理以每(g)纤维素材料充足量的酶进行。在实施方案中，用于依照本发明使用的组合物含有有效量的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶以改进纤维素材料如木质生物质的水解。如本文中使用的，“有效量”指依照本公开的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶，或具有脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组分的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物的量足以对纤维素材料或其部分引入特定的积极益处。所述积极益处可涉及纤维素酶抑制，或者其可更多地涉及酶水解的性质，或者其可以是两者的组合。在实施方案中，所述积极益处通过使纤维素材料或其部分与一种或多种脂肪酶、一种或多种蛋白酶和/或一种或多种果胶酶或其组合物接触以改进纤维素材料状况从而改进其水解性能来实现。举例而言，依照本公开添加的脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶的量包括足以将经预处理的纤维素材料解毒的量，从而能改进其水解。改进的非限制性实例包括减少纤维素材料如木质生物质中的毒素和/或增加水解材料过程中形成的糖的量。在实施方案中，将经预处理的纤维素材料中毒素的量降低1-10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。毒素的降低可通过本领域中已知的任何合适分析方法如HPLC进行。在实施方案中，将纤维素材料中毒素的量降低：存在毒素总量的10-30％、存在毒素总量的20-40％、存在毒素总量的40-50％、存在毒素总量的50-60％、存在毒素总量的60-70％、存在毒素总量的70-80％、存在毒素总量的80-90％或存在毒素总量的90-100％。在实施方案中，所述改进可指水解产物如糖的增加的量，其大于相比于使用经水解但未依照本公开处理的纤维素材料生成的水解产物的量。在实施方案中，将水解产物或糖的量相比于使用经水解但未依照本公开处理的纤维素材料生成的水解产物的量增加为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍。在实施方案中，将水解产物或糖的量相比于使用经水解但未依照本公开处理的纤维素材料生成的水解产物的量增加为3、4、5、6、7、8、8、9或10倍。依照本公开使用的酶如脂肪酶的非限制性合适量包括以每g纤维素材料约0.0005至约5mg、例如约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg，或约0.1至约1mg脂肪酶来接触脂肪酶。依照本公开使用的酶如蛋白酶的非限制性合适量包括以每g纤维素材料约0.0005至约5mg、例如约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg，或约0.1至约1mg蛋白酶来接触蛋白酶。依照本公开使用的酶如果胶酶的非限制性合适量包括以每g纤维素材料约0.0005至约5mg、例如约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg，或约0.1至约1mg果胶酶来接触果胶酶。包含这些量的组合的酶混合物也适合依照本公开使用。
在实施方案中，依照本发明的处理包含、组成为或包括足以有用的纤维素材料的量。举例而言，处理包括接触纤维素材料，其中纤维素材料的量使得处理以约1％至约50％例如约2％至约40％、约2％至约35％、约3％至约30％、约3％至约25％、约4％至约20％，或约5％至约10％的总固体(TS)进行。在实施方案中，处理以约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的总固体(TS)进行。总固体(TS)可指反应中的生物质或滤出物。
在实施方案中，用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶组合物来接触或处理纤维素材料在适合所述脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶的pH进行。合适pH的非限制性实例包括在约2至约9、例如约3至约8、约3至约7.5、约3.5至约7、约4至约6.5、约4.5至约6.5、约4.5至约6.0、约5至约6.0，或约5至约5.5的pH用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触或处理。在实施方案中，pH是2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。在实施方案中，合适pH的实例包括在2至9、例如3至8、3至7.5、3.5至7、4至6.5、4.5至6.5、4.5至6.0、5至6.0，或5至5.5的pH用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶酶组合物接触或处理。
在实施方案中，用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶酶组合物来接触或处理纤维素材料在适合脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶的温度进行。合适温度的非限制性实例包括范围在约20℃至约70℃、例如约25℃至约65℃、约30℃至约65℃、约35℃至约65℃、约40℃至约60℃、约45℃至约55℃，或约45℃至约50℃的温度。在实施方案中，合适的温度是46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃。
在实施方案中，用一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶酶组合物来接触或处理经预处理的纤维素材料以适合所述一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶在纤维素材料如木质生物质中毒素上反应的持续时间进行。如本文中使用的，毒素一般指抑制纤维素酶和/或水解的物质。合适的持续时间的非限制性实例包括5分钟至35小时、例如10分钟至15小时、10小时至15小时、10小时至20小时、10小时至20小时、20小时至24小时、24小时至30小时、1小时至72小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时的时间段。
在实施方案中，用一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触以6％的总固体(TS)、pH 7、温度为50℃进行约16小时。TS指反应中使用的生物质或滤出物。
所述脂肪酶、蛋白酶、果胶酶处理一般在如本文中描述的受控pH、温度和条件下在池(tank)中进行。在实施方案中，用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或组合物接触或处理纤维素材料以本文中描述的纤维素材料量，本文中描述的酶如脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶的量，在依照本公开的pH、温度和持续时间进行。在去除毒素和/或增加酶水解产率方面，可使用对本文中使用量的各种修改来优化脂肪酶、蛋白酶、果胶酶的性能。在实施方案中，脂肪酶、蛋白酶、果胶酶处理优选在合适的水性环境中在能由本领域技术人员容易确定的条件下进行。在一个优选的方面，脂肪酶、蛋白酶、果胶酶处理在适合脂肪酶、蛋白酶,果胶酶活性的条件下，即对酶及其混合物最优的条件下进行。所述处理可以以补料分批或连续的过程进行，其中将纤维素材料(底物)逐渐补入，例如，含脂肪酶、蛋白酶、果胶酶的溶液中。
在实施方案中，本公开涉及一种用于水解经预处理的纤维素材料的方法，包括以下或由以下组成：将纤维素材料用酶组合物糖化，其中预处理所述纤维素材料，即，将所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触来以形成经预处理的纤维素材料。在实施方案中，使用酶组合物，包括一种或多种(几种)选自下组的酶进行水解：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素(expansin)、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素(swollenin)。在实施方案中，纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。在实施方案中，半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、β-木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。在依照本公开的实施方案中，所述酶组合物包含以下或由以下组成：一种或多种淀粉酶或甘露聚糖酶，其在本文中可称为次级酶(secondary enzyme)。
在实施方案中，本公开的方法还包括以下步骤，该步骤包括或组成为：从糖化回收糖化的经预处理的纤维素材料。在实施方案中，糖化的纤维素材料是糖。糖的非限制性实例包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
在实施方案中，本公开涉及一种用于产生发酵产物的方法，其包括以下或由以下组成：(a)糖化经预处理的纤维素材料，用一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或其组合物依照本公开来处理。这里，使用适合糖化的酶组合物来进行糖化。在实施方案中，适合糖化的酶包括一种或多种(几种)选自下组的酶：淀粉酶、纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在实施方案中，纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。在实施方案中，半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。下一步包括(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述糖化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从所述发酵回收发酵产物。在实施方案中，步骤(a)糖化经预处理的纤维素材料(其中使用一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或其组合物依照本公开来接触、处理或精化经预处理的纤维素材料)和(b)(用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述糖化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物)在同时的糖化和发酵中同时进行。在实施方案中，通过在反应中纳入有益量的一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶或其组合物来进行糖化。在实施方案中，发酵产物是是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物(polyketide)。
本公开还涉及一种用于发酵经预处理的纤维素材料的方法，包括以下或由以下组成：用一种或多种(几种)发酵微生物来发酵经预处理纤维素材料，其中依照本公开来处理和/或糖化所述经预处理的纤维素材料。例如，依照本公开通过用脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶或其组合物接触材料来预处理纤维素材料，且糖化步骤包含甘露聚糖酶和淀粉酶或其组合物。在实施方案中，经预处理的纤维素材料的发酵产生发酵产物。在实施方案中，所述方法包括以下或由以下组成：从发酵回收发酵产物的步骤。在实施方案中，所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
在实施方案中，本公开的方法优选在木质生物质上使用。木质纤维素材料的非限制性实例包括树木和木质植物，包括枝干(limb)、针叶、叶和其他木质部分。木质生物质可包括在森林、林地(woodland)或山脉环境(range environment)中生长的物质，其为环境和森林管理的副产物。在一个方面，所述纤维素材料是木质材料。在另一个方面，所述纤维素材料是木质森林副产物。在一个方面，木质生物质源自社区、地区或国家的木材废料流(wood waste stream)或木材输出。此木材废料可包括完整树木、修剪的分支、伐根(stump)、用过的成材(used lumber)、住房装饰(housing trim)、建筑碎片和船运货盘(shipping pallet)、或木质办公室废物如木桌或木椅。在一个方面，所述纤维素材料是木质能量作物。在一个方面，木质生物质源自木纤维产品，如纸、纸板和衍生的材料。在一个方面，木质生物质源自木纤维，如再生纸和纸板。在一个方面，木质生物质源自一次干燥(oncedried)的木纤维产品，如原始纸(virgin paper)或再生纸。在一个方面，所述纤维素材料含有木质生物质的至少一部分。在本发明的一个方面，将完全100％的非木质原料从依照本公开用作合适的原料或纤维素材料排除。
糖化
在水解步骤(也称为糖化)中，将纤维素材料(即经预处理的)水解以将纤维素或者还有半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在存在一种或多种(几种)具有本发明的淀粉酶和/或甘露聚糖酶活性的多肽的情况下以酶法进行。可顺序加入组合物的酶和蛋白质组分。
优选地，酶水解在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将纤维素材料逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，且更优选约40℃至约60℃的范围，特别是约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，且最优选约4至约6的范围，特别是约pH 5。干固体含量优选约5至约50wt.％，更优选约10至约40wt.％，且最优选约20至约30wt.％。
酶的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和发酵生物体的包含(例如，用于同时的糖化和发酵的酵母)。
所述酶组合物可包含任何可用于降解纤维素材料的蛋白质。
在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶蛋白对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对于纤维素分解酶蛋白的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.5g，并且最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶蛋白。
在本公开的另一个方面，水解步骤包括以下或由以下组成：使经预处理的纤维素材料与一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触。在实施方案中，可将这些酶单独地或组合地加入如下文详细列出的水解酶组合物。
依照本公开使用的非限制性的合适淀粉酶包括，α-淀粉酶、细菌α-淀粉酶、细菌杂合α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、真菌杂合α-淀粉酶、本领域中已知的商业α-淀粉酶、糖源生成酶如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶及其组合。
依照本公开可使用任意α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的。例如，α-淀粉酶可为酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加时在3至7，或在实施方案中3.5至6，或在实施方案中4-5的pH范围内具有最适活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
在实施方案中，依照本公开使用的合适的细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属的那些。
在实施方案中，芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的菌株，但还可源自其他芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的非限制性实例包括WO99/19467中SEQ IDNO:4中显示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中SEQ ID NO:5中显示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中SEQ ID NO:3中显示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列均通过提述以其整体并入本文)。在实施方案中，α-淀粉酶可为与WO 99/19467中SEQ IDNO:1,2或3中分别显示的任一个序列具有至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％或至少99％的序列同一性的酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体，特别是在WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文档均通过提述以其整体并入本文)的任一个中描述的α-淀粉酶。特定涵盖的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述以其整体并入本文)，而且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，其具有位置R179到G182中一个或两个氨基酸的缺失，或WO 96/23873中披露的双缺失-参见例如第20页1-10行(通过提述以其整体并入本文)，例如相比于WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3中列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列对应于Δ(181-182)，或缺失氨基酸R179和G180，其使用WO 99/19467中的SEQ IDNO:3的编号(该参考通过提述以其整体并入本文)。其他非限制性实例包括芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，相比于WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3中列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列，其具有对应于Δ(181-182)的双缺失且进一步包含N193F取代(亦表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶适合依照本公开使用。例如，特定涵盖的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C末端氨基酸残基(显示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4)和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N末端氨基酸残基(显示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5)，其具有一个或多个，尤其是全部的以下取代：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号)。其他非限制性实例包括具有一个或多个以下突变(或在其他芽孢杆菌属α-淀粉酶主链中的相应突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或缺失位置176和179之间的两个残基，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5编号)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS，或0.001-1KNU每gDS，或在实施方案中约0.050KNU每g DS的量剂量添加。
真菌α-淀粉酶适合依照本公开用作酶。非限制性实例包括源自曲霉属的菌株的α-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉和川地曲霉α-淀粉酶。
在实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶包括源自米曲霉菌株的Fungamyl样α-淀粉酶。依照本公开，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指与WO 96/23874中SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的成熟部分展现出高序列同一性，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％序列同一性的α-淀粉酶。
酸性α-淀粉酶的另一个非限制性实例源自黑曲霉菌株。在实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是一种来自黑曲霉的α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并记载于WO89/01969(实施例3，其通过提述以其整体并入本文)。在实施方案中，一种源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S,Denmark获得)，其适合依照本公开使用。
涵盖的野生型α-淀粉酶的其它非限制性实例包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(参见WO 2004/055178，其通过提述以其整体并入本文)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)的菌株的那些α-淀粉酶。
在实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉并公开于Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298,“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stableα-amylase fromAspergillus kawachii”；并进一步为EMBL:#AB008370。
在实施方案中，所述真菌α-淀粉酶还可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域(例如非杂合)的野生型酶或其变体。在实施方案中，野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶适合依照本公开使用。在实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶是杂合的α-淀粉酶。依照本公开使用的真菌杂合α-淀粉酶的非限制性实例包括WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请号60/638,614(Novozymes)中披露的杂合α-淀粉酶，所述文件通过提述以其整体并入本文。杂合α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)如淀粉结合域，和任选的接头。
涵盖的杂合α-淀粉酶的非限制性实例包括在美国专利申请号60/638,614中实施例的表1至5中披露的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其在表5中披露为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290中表5中的V039，以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ IDNO:102)。杂合α-淀粉酶的其他非限制性实例是美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(通过提述以其整体并入本文)的实施例4中列于表3、4、5和6的那些中的任一种。
涵盖的杂合α-淀粉酶的其他非限制性实例包括在美国专利公开号2005/0054071中披露的那些，包括在第15页表3中披露的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
在实施方案中，α-淀粉酶包括与上述任一种α-淀粉酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
依照本公开可以0.001至10AFAU/g DS，或在实施方案中0.01至5AFAU/g DS，或0.3至2AFAU/g DS或0.001至1FAU-F/g DS，或在实施方案中0.01至1FAU-F/g DS的量添加酸性α-淀粉酶。
商业的α-淀粉酶适合依照本公开使用。包含α-淀粉酶的商业组合物的非限制性实例包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASETM，BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X、LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，FUELZYMETM(来自Verenium Corp、USA)，及以商标名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
在实施方案中，用于依照本公开使用的淀粉酶包括SEQ ID NO:4的成熟多肽及其具有淀粉酶活性的片段。在实施方案中，淀粉酶包括与SEQ ID NO:4展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，使用本领域中已知的方法来测定淀粉酶活性，包括但不限于记载于美国公开专利申请号2011/0158976(其通过提述以其整体并入本文)中的那些。
如本文中使用的，术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生成者)以及普鲁兰酶(pullulanase)和α-葡糖苷酶，其均适合依照本公开使用。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本公开的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，例如乙醇。根据本公开，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(例如酸性淀粉酶，或酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比率(例如AGU每FAU-F)在本公开的实施方案中可为0.1至100AGU/FAU-F，或者在实施方案中是2至50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的量，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解-RSH)时，例如当步骤(a)中的糖化和步骤(b)中的发酵同时进行时(例如无液化步骤)。
在常规的淀粉至乙醇方法(例如包括液化步骤(a))中，所述比率可如EP 140,410-B1中定义，特别是当步骤ii)中的糖化和步骤iii)中的发酵同时进行时。
葡糖淀粉酶适合依照本公开使用。非限制性实例包括源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶的非限制性实例是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.,55(4):941-949(1991))，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在位置A435和S436导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
葡糖淀粉酶的其它非限制性实例包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等，(1998),“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii,Appl Microbiol Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。
细菌葡糖淀粉酶的非限制性实例包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)，和瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)；及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)(均在WO2006/069289中披露)；或PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合葡糖淀粉酶也可适合依照本公开使用。非限制性实例包括在WO 2005/045018中公开的杂合葡糖淀粉酶和在实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述以其整体并入本文)。
在实施方案中，适于依照本公开使用的葡糖淀粉酶包括与任何上面提及的葡糖淀粉酶展现出高序列同一性程度，例如与上面提及的成熟酶序列有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，用于依照本公开使用的葡糖淀粉酶包括SEQ ID NOS:6和7的成熟多肽及其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在实施方案中，葡糖淀粉酶包括与SEQ ID NOS:6和7展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
包含葡糖淀粉酶的商业上可得到的组合物的非限制性实例包括AMG200L；AMG300L；SANTM SUPER,SANTM EXTRA L,SPIRIZYMETM PLUS,SPIRIZYMETM FUEL,SPIRIZYMETMB4U,SPIRIZYME ULTRATM和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300,GC480TM和GC147TM(来自Genencor Int.,USA)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900,G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。在实施方案中，葡糖淀粉酶包括与任何上面提及的葡糖淀粉酶展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在一个方面，葡糖淀粉酶蛋白对纤维素材料的有效量是每g纤维素材料约0.05至约50mg，优选约0.05至约40mg，更优选约0.05至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.05至约10mg，且最优选约2.5至约10mg。
β-淀粉酶适合依照本公开使用。β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly,1979,Progressin Industrial Microbiology,15,112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。适于依照本公开使用的β-淀粉酶的非限制性实例包括来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶，其为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYMETM BBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶是适于依照本公开使用的一种酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。产麦芽糖淀粉酶的非限制性实例包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的那些，其为从Novozymes A/S商业上可得到的。产麦芽糖α-淀粉酶的其他实例包括美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628描述的那些，所述文件通过提述以其整体并入本文。
在实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以每g纤维素材料0.05至约50mg酶蛋白的量添加。在实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以每g纤维素材料0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg和约2.5至约10mg的量添加。
在实施方案中，淀粉酶如美国专利公开2011/0076741(通过提述并入本文中)描述的那些适合依照本公开使用。
甘露聚糖酶适用于如本文中描述的本公开的水解步骤中。甘露聚糖酶是分类为EC3.2.1.78并称为内切-1,4-β-甘露糖苷酶的半纤维素酶。甘露聚糖酶包括β-甘露聚糖酶、内切-1,4-甘露聚糖酶和半乳甘露聚糖酶。甘露聚糖酶优选能够催化甘露聚糖，包括葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷连接的水解。甘露聚糖是主要或完全由D-甘露糖单元构成的多糖。甘露聚糖酶可为任何来源的，如细菌或真菌生物来源。
在一个特定的实施方案中，所述甘露聚糖酶源自丝状真菌曲霉属，优选黑曲霉或棘孢曲霉的菌株(WO 94/25576)。WO 93/24622披露了一种从里氏木霉分离的可用于漂白木素纤维素浆体的甘露聚糖酶。
已在几种芽孢杆菌属生物体中鉴定出甘露聚糖酶。举例而言，Talbot等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56(11):3505-3510描述了一种源自嗜热脂肪芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。Mendoza等,1994,World J.Microbiol.Biotech.10(5)；551-555描述了一种源自枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。JP-A-03047076披露了一种源自芽孢杆菌属菌种的β-甘露聚糖酶。JP-A-63056289描述了碱性、热稳定性β-甘露聚糖酶的生成。JP-A-63036775涉及芽孢杆菌属微生物FERM P-8856，其生成β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶。JP-A-08051975披露了来自嗜碱性芽孢杆菌属菌种AM-001的碱性β-甘露聚糖酶。一种来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的甘露聚糖酶披露在WO 97/11164中。WO 91/18974描述了半纤维素酶如葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。
商业上可得到的甘露聚糖酶的实例包括可从Novozymes A/S Denmark获得的GAMANASETM。
适于依照本公开使用的甘露聚糖酶的非限制性实例还包括MannawayTM(Novozymes的产品)和MannaStar(Genencor的产品)。
甘露聚糖酶的非限制性实例还包括WO 99/064573、美国专利Nos.7,183,093、6,060,299、6,376,445中描述的那些(其均通过提述并入本文)。
在实施方案中，甘露聚糖酶包括与任何上面提及的甘露聚糖酶展现出高序列同一性程度，例如与成熟酶序列有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在实施方案中，用于依照本公开使用的甘露聚糖酶包括SEQ ID NO:5的成熟多肽及其具有甘露聚糖酶活性的片段。在实施方案中，甘露聚糖酶包括与SEQ ID NO:5展现出高序列同一性，例如与成熟酶序列有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
可使用美国专利号5,795,764(通过提述以其整体并入本文)中列出的方法测定甘露聚糖酶活性。举例而言，可将AZCL-甘露聚糖的0.4％悬液(Megazyme,Australia)以1:1与0.1M缓冲液(柠檬酸钠/磷酸三钠)混合，添加酶，并可在30℃进行温育15min，接着将酶在95℃失活20min。离心后，在620nm处在微滴板中测量蓝色到上清液中的释放。为了确定最适pH，在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中从pH 2.5至9进行酶促反应。为了确定最适温度，在pH 5.0将酶与底物于30至80℃的温度温育。测量Km和比活性，其通过在0.1M柠檬酸盐缓冲液pH5.0中以范围从0.025至1％角豆(carob)半乳甘露聚糖(Megazyme,Austrailia)的底物浓度进行温育。结果可绘于“Hanes图”，其中斜率为1/V最大而截距为Km/V最大。
在一个方面，甘露聚糖酶蛋白对纤维素材料的有效量为每g纤维素材料约0.05至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，且最优选约2.5至约10mg。
适于依照本公开使用的酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：淀粉酶、纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素及其混合物。
在本公开的实施方案中，水解步骤以对反应充足的总固体(TS)进行。用于依照本公开使用的总固体的非限制性量包括约1％至约50％、例如约2％至约40％、约2％至约35％、约3％至约30％、约3％至约25％、约4％至约20％、约5％至约10％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％，或约10％的量。TS可指反应中使用的总生物质和/或滤出物。
在本公开的实施方案中，水解步骤在适于水解步骤的pH进行。合适pH的非限制性实例包括约2至约9、例如约3至约7.5、约3.5至约7、约4至约6.5、约4.5至约6.5、约4.5至约6.0、约5至约6.0、约5至约5.5、5、约5、6、约6、7、约7的pH。
在本公开的实施方案中，水解步骤在适于水解步骤的温度进行。非限制性的合适温度包括约20℃至约70℃、例如约25℃至约65°、约30℃至约65℃、约35℃至约65℃、约40℃至约60℃、约45℃至约55℃，或约45℃至约50℃的温度。
在本公开的实施方案中，水解步骤进行达充足的时间段。非限制性的时间段包括5分钟至35小时的时间段，例如10分钟至15小时、10小时至15小时、10小时至20小时、10小时至20小时、20小时至24小时、24小时至30小时、1小时至72小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、24小时、48小时、72小时，或96小时。
在实施方案中，水解使用如本文中列出的TS、pH、温度和持续时间进行。一个非限制性实例是，其中水解步骤以5.3％的总固体(TS)、pH 5、50℃的温度进行72小时。
在实施方案中，本公开涉及一种用于水解经预处理的纤维素材料的方法，包括将纤维素材料用酶组合物糖化，其中通过使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触来预处理所述纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料。在实施方案中，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶或由其组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素、淀粉酶和甘露聚糖酶。在实施方案中，纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。在实施方案中，半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。在实施方案中，本公开的方法进一步包括从糖化回收经糖化的材料。所述经糖化的材料可以是糖。糖的非限制性实例包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
发酵
可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis的菌株；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物可通过本领域已知的方法经遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis，1996，见上文)。
其它发酵生物包括如下的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candida sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.latic)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridium phytofermentans。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTM AFT和XR(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA)，ETHANOL REDTM酵母(Red Star/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc.，USA)，FERMIOLTM(DSMSpecialties)，GERT STRANDTM(Gert Strand AB，Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已导致构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentationby Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressingthe TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research 4:655-664；Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science 267:240-243；Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strainby metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO 2003/062430，Xylose Isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如，约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，例如约pH 4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x 108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press,UnitedKingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物
发酵产物可以是源自发酵的任何物质。
发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production fromrenewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65:207-241；Silveira和Jonas，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam，P.和Singh，D.，1995，Processes forfermentative production of xylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2):117-124；Ezeji等，2003，Production of acetone，butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping，WorldJournal of Microbiology and Biotechnology 19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard和Margaritis，2004，Empirical modeling of batch fermentation kineticsfor poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka等，1997，Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria，Water Science and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan,1997,Biomassand Bioenergy 3(1-2):83-114,Anaerobic digestion of biomass for methaneproduction:a review。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮基团的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。
可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
水解酶组合物
酶组合物可包含可用于糖化纤维素材料的任何蛋白质。
在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白质：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶和一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶以及具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木素分解酶。在一个优选的方面，所述木素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木素分解酶是木素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木素分解酶是产生H2O2的酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素。
在另一个方面，所述酶组合物包含单独或组合的淀粉酶和甘露聚糖酶，如上文描述的。非限制性实例包括以下的组合：SEQ ID NO:4的微小根毛霉(Rhizomucer pusillus)淀粉酶、埃莫森踝节菌(Talaromices emersoni)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)和瓣环栓菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:7)。黑曲霉甘露聚糖酶如SEQ ID NO:5也适合依照本公开使用。在实施方案中，淀粉酶和甘露聚糖酶包括与上述任一种淀粉酶和甘露聚糖酶展现出高序列同一性，例如与成熟的酶序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的那些。
在本发明的方法中，可在发酵之前或过程中添加酶，例如可在糖化过程中或发酵微生物的增殖过程中或之后添加。
酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，该细胞被用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适用的形式，如例如移除或未移除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的方法，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
所述酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物体分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有经修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
在一个方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomidium、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有酶活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulfureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉(嗜热毁丝霉)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外来的)，但该宿主在一定条件下也可为同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性纤维素分解酶制备物的实例包括，例如， CTec(Novozymes A/S)、 CTec2(Novozymes A/S)、CELLICTM CTec3(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM 188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(NovozymesA/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)、ACCELERASETM(GenencorInt.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETM CP(Genencor Int.)， NL(DSM)； S/L 100(DSM)，ROHAMENTTM 7069W( GmbH)， LDI(Dyadic International,Inc.)、 LBR(DyadicInternational,Inc.)或150L(Dyadic International,Inc.)。所述纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt％，例如固体的约0.025至约4.0wt％，或固体的约0.005至约2.0wt％的有效量添加。
在本发明的方法中，可使用具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽，如在上文所描述的那些多肽。
可用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利No.5,275,944；WO 96/02551；美国专利No.5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene 45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene 63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563，GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology 13:219-228，GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research 18:5884)，川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics 27:435-439)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)，尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)，灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)，Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)，粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)，特异腐质霉内切葡聚糖酶V，嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶，担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶，担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶，土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶，土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6C内切葡聚糖酶，土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶，土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7E内切葡聚糖酶，土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶，Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶，以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO 2010/141325)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A,WO 2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II和褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。
可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于，来自棘孢曲霉(Kawaguchi等,1996,Gene 173:287-288)、烟曲霉(WO 2005/047499)、黑曲霉(Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980)、米曲霉(WO 2002/095014)、巴西青霉IBT 20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、土生梭孢霉(WO 2011/035029)和褐孢长毛盘菌(WO 2007/019442)的β-葡糖苷酶。
β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO 2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。在一个方面，β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其披露在WO2012/044915中的变体，如具有以下一种或多种取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶披露在使用根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶记载于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263和美国专利No.5,686,593。
在本发明的方法中，可以使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
可用于本发明的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于来自以下的GH61多肽，土生梭孢霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO2009/085868)、烟曲霉(WO 2010/138754)、来自以下的GH61多肽：嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)(WO 2011/005867)、嗜热子囊菌属菌种(WO 2011/039319)、青霉属菌种(WO2011/041397)和甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在依照WO 2008/151043存在可溶性激活二价金属阳离子例如硫酸锰的情况下使用。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在存在二氧化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料如经预处理的玉米秸秆(PCS)获得的液剂存在的情况下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acroleinacetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个方面，此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素的糖基单元的摩尔比例为约10-6至约10，例如约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理木素纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液从剩余固体分离来产生。此类条件确定在通过纤维素酶制备物水解纤维素底物过程中，通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约10-3至约10-2g每g纤维素。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业性半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、CELLICTM HTec(Novozymes A/S)、CELLICTM HTec2(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、 Xylanase(Genencor)、 XY(Genencor)、 XC(Genencor)、 TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000Xylanase(DSM)、DEPOLTM 333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOLTM 740L(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOLTM 762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉(WO 2011/041405)、青霉属菌种(WO 2010/126772)、土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/079210)和褐孢长毛盘菌GH10(WO 2011/057083)。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)和埃默森踝节菌(SwissProt登录号Q8X212)。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(WO 2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)和土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于来自特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischer)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO 2009/127729)和土生梭孢霉(WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)和巨多孔菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO 2010/014706)、橘灰青霉(WO 2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)和里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)的α-葡糖醛酸糖苷酶。用于本发明方法的具有酶活性的多肽可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),More GeneManipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据公开的组成制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill BookCompany,NY,1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶或蛋白表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
核酸构建体
可用许多方式来操作编码多肽(例如脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等)的分离的多核苷酸以提供该多肽的表达，其通过构建核酸构建体，所述构建体包含与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接的编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述调控序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下的表达。
可用许多方式来操作多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子，其为由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,MolecularMicrobiology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO 99/43835。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中不翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的不翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中不翻译的前导序列已由来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的不翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。本发明中可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471)。
调控序列还可以是前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外来的信号肽编码序列。外来的信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外来的信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可以从如下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子。
当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两种或更多种载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。
所述载体优选地含有一个或多个可选择标志，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。可选择标志是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌可选择标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标志，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标志包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的可选择标志基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有可选择标志基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023、Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,NewYork；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
以下非限制性实例进一步例示了依照本公开的组合物、方法和处理。应注意本公开不受实施例中体现的具体细节的限制。
本发明进一步由以下段落限定：
1.一种用于在纤维素材料水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括：
(a)使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和
(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料。
2.依照段落1的方法，其中所述水解步骤包括使所述经预处理的纤维素材料与一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触。
3.依照段落1或2的方法，其中所述脂肪酶是细菌或真菌起源的。
4.依照段落1-3中任一段的方法，其中所述蛋白酶是细菌或真菌起源的。
5.依照段落1-4中任一段的方法，其中所述果胶酶是细菌或真菌起源的。
6.依照段落2的方法，其中所述淀粉酶选自细菌或真菌来源的。
7.依照段落2的方法，其中所述甘露聚糖酶是细菌或真菌来源的。
8.依照段落1-7中任一段的方法，其还包括在使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触的步骤之前或过程中将所述纤维素材料再制浆，其中所述纤维素材料是木质生物质。
9.依照段落1-8中任一段的方法，其包括：回收所述经预处理的纤维素材料。
10.依照段落1-9中任一段的方法，其包括从所述经预处理的纤维素材料分离出液剂。
11.依照段落1-10中任一段的方法，其还包括使所述液剂与淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触并将所述液剂再循环，从而使其与经预处理的纤维素材料接触。
12.依照段落1-11中任一段的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、淀粉酶、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素、及其混合物。
13.依照段落1-12中任一段的方法，其包括用酶法预处理、化学预处理、机械预处理和/或物理预处理来后处理所述经预处理的纤维素材料。
14.依照段落1-13中任一段的方法，其包括回收所述经预处理的纤维素材料。
15.依照段落1-14中任一段的方法，其中所述与脂肪酶接触是使用每g纤维素材料约0.0005至约5mg、约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg、或约0.1至约1mg脂肪酶进行的。
16.依照段落1-15中任一段的方法，其中所述与蛋白酶接触是使用每g纤维素材料约0.0005至约5mg、约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg、或约0.1至约1mg蛋白酶进行的。
17.依照段落1-16中任一段的方法，其中所述与果胶酶接触是使用每g纤维素材料约0.0005至约5mg、约0.001至约5mg、约0.0025至约5mg、约0.005至约5mg、约0.005至约4.5mg、约0.005至约4mg、约0.005至约3.5mg、约0.005至约3mg、约0.005至约2mg、约0.005至约1mg、约0.075至约1mg、或约0.1至约1mg果胶酶进行的。
18.依照段落1-17中任一段的方法，其中所述与一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触是使用约1％至约50％、约2％至约40％、约2％至约35％、约3％至约30％、约3％至约25％、约4％至约20％、约5％至约10％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％的总固体(TS)进行的。
19.依照段落1-18中任一段的方法，其中所述与一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触是在约2至约9、约3至约7.5、约3.5至约7、约4至约6.5、约4.5至约6.5、约4.5至约6.0、约5和约6.0、约5至约5.5、5、约5、6、约6、7、约7的pH进行的。
20.依照段落1-19中任一段的方法，其中所述与一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触是在范围为约20℃至约70℃，例如约25℃至约65℃、约30℃至约65℃、约35℃至约65℃、约40℃至约60℃、约45℃至约55℃、或约45℃至约50℃的温度进行的。
21.依照段落1-20中任一段的方法，其中所述与一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触进行5分钟至35小时，例如10分钟至15小时、10小时至15小时、10小时至20小时、10小时至20小时、20小时至24小时、24小时至30小时、1小时至72小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时的时间段。
22.依照段落1-21中任一段的方法，其中所述与一种或多种脂肪酶、蛋白酶或果胶酶接触以6％的总固体(TS)、pH 7，在50℃的温度进行约16小时。
23.依照段落1-22中任一段的方法，其中所述水解以约1％至约50％，例如约2％至约40％、约2％至约35％、约3％至约30％、约3％至约25％、约4％至约20％、约5％至约10％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％的总固体(TS)进行。
24.依照段落1-23中任一段的方法，其中所述水解以约2至约9，例如约3至约7.5、约3.5至约7、约4至约6.5、约4.5至约6.5、约4.5至约6.0、约5和约6.0、约5至约5.5、5、约5、6、约6、7、约7的pH进行。
25.依照段落1-24中任一段的方法，其中所述水解在范围为约20℃至约70℃、例如约25℃至约65℃、约30℃至约65℃、约35℃至约65℃、约40℃至约60℃、约45℃至约55℃、或约45℃至约50℃的温度进行。
26.依照段落1-25中任一段的方法，其中所述水解进行达5分钟至35小时，例如10分钟至15小时、10小时至15小时、10小时至20小时、10小时至20小时、20小时至24小时、24小时至30小时、1小时至72小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、24小时、48小时、72小时、或96小时的时间段。
27.依照段落1-26中任一段的方法，其中所述水解以5.3％的总固体(TS)、pH 5，在50℃的温度进行72小时。
28.一种用于水解经预处理的纤维素材料的方法，包括将纤维素材料用酶组合物糖化，其中通过使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触来预处理所述纤维素材料以形成经预处理的纤维素材料。
29.依照段落27或28的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素、淀粉酶和甘露聚糖酶。
30.依照段落29的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
31.依照段落30的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
32.依照段落28-31中任一段的方法，其进一步包括从所述糖化回收经糖化的材料。
33.依照段落32的方法，其中所述经糖化的材料是糖。
34.依照段落33的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
35.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用酶组合物和至少一种选自由淀粉酶、甘露聚糖酶及其混合物组成的组的第二酶来糖化经预处理的纤维素材料；
(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述糖化的经预处理纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从所述发酵回收所述发酵产物，其中通过使纤维素材料与一种或多种蛋白酶、果胶酶和/或脂肪酶接触来预处理所述经预处理的纤维素材料。
36.依照段落35的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
37.依照段落36的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
38.依照段落36的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
39.依照段落35-38中任一段的方法，其中步骤(a)和(b)在同时的糖化和发酵中同时进行。
40.依照段落35-39中任一段的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
41.一种用于发酵经预处理的纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中所述经预处理的纤维素材料是依照段落1-40中的任一段处理和/或糖化的。
42.依照段落41的方法，其中所述经预处理的纤维素材料的发酵生成发酵产物。
43.依照段落42的方法，其进一步包括从发酵回收发酵产物。
44.依照段落43的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
实施例
实施例1：脂肪酶、蛋白酶和果胶酶作为再制浆辅助酶来加强生物质水解
将旧报纸加杂志以80:20的比率(“ONP”)用作生物质底物。将ONP弄碎并磨制成小颗粒。用磨制的ONP以6％总固体(TS)制备浆体。将ONP浆体在Lab-O-Mat(LABOMAT<<BFA-24>>,Werner Mathis U.S.A.Inc.,Concord,N.C.,USA)中，有或无酶地，在下列条件下处理：
·6％TS，pH 7，50℃并过夜(16小时)(ONP对照)；
·6％TS，pH 7，50℃并过夜(16小时)，有脂肪酶、蛋白酶和果胶酶(10:1:10)(500ppm脂肪酶(SEQ ID NO:1)+50ppm蛋白酶(SEQ ID NO:2)+500ppm果胶酶(SEQ ID NO:3)(ONP-Enz)。
处理后，在5.3％TS，pH 5.0，50℃与纤维分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)一起以总计3mg蛋白/g底物实施水解达3天。
将收集的样品使用0.20μm注射滤器(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤并如下文描述的分析滤出物的糖含量。当不立即使用时，将滤出的等分试样冷冻在-20℃。在0.005MH2SO4中稀释的样品的糖浓度使用4.6x 250mm HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)测量，其通过用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H2SO4在65℃以每分钟0.6ml的流速洗脱，并通过将来自由纯糖样品校正的折光率检测( 1100HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号的积分来定量。使用所得葡萄糖和纤维二糖当量来计算对于每个反应纤维素转化的百分比。
分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。将测量的糖浓度针对适宜的稀释因子进行调整。测定酶法生成的糖的净浓度，其通过将测量的糖浓度针对在0时间点时未洗涤生物质中的相应的背景糖浓度进行调整。所有HPLC数据处理均使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft,Richland,WA,USA)实施。
依照以下等式计算每份底物释放的葡萄糖：
释放的葡萄糖(g)＝葡萄糖浓度/水解中的％总固体。
结果呈现在表1中，其显示依照本公开在5.3％TS，pH 5.0，50℃以3mg蛋白/g底物的纤维素分解酶进行3天，对酶法处理的ONP和OPN的水解性能。
表1.
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
ONP-对照 92
ONP-依照本公开酶法处理 104
实施例2：将淀粉酶作为加强剂用于生物质水解
将起皱的旧纸板(OCC)用作生物质底物。将OCC弄碎并磨制成小颗粒。用磨制的OCC在6％总固体(TS)制备浆料并在pH 7、50℃在Lab-O-Mat(LABOMAT<<BFA-24>>,WernerMathis U.S.A.Inc.,Concord,N.C.,USA)中过夜(16小时)再制浆。
在再制浆后，水解在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天，其使用总计3mg蛋白/g底物及2种不同的酶组合物：
·(C+H)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)；
·(C+H+S)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)，加上微小根毛霉淀粉酶(SEQID NO:4)、埃莫森踝节菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)和瓣环栓菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:7)以8:2:1比率的混合物。
按照实施例1中描述的进行样品收集、糖测量和葡萄糖释放计算。
结果呈现在表2中，其显示除了纤维素分解酶以外，在有(C+H+S)和无(C+H)淀粉酶的情况下，以总计3mg蛋白/g底物，在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天对OCC的水解性能。
表2：
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
OCC-对照 232
OCC-有淀粉酶 245
实施例3：将淀粉酶作为加强剂用于生物质水解
实验
将混合的办公室废物(MOW)用作生物质底物，如实施例2中的弄碎、磨制并再制浆。
在再制浆后，水解在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天，其使用总计3mg蛋白/g底物和2种不同的酶组合物：
·(C+H)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)；
·(C+H+S)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)，加上微小根毛霉淀粉酶(SEQID NO:4)、埃莫森踝节菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)和瓣环栓菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:7)以分别为8:2:1比率的混合物。
按照实施例1中描述的进行样品收集、糖测量和葡萄糖释放计算。
结果呈现在表3中，其显示除了纤维素分解酶以外，在有(C+H+S)和无(C+H)淀粉酶的情况下，以3mg蛋白/g底物，在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天对MOW的水解性能。
表3:
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
MOW-对照 316
MOW-有淀粉酶 347
实施例4：将淀粉酶作为加强剂用于生物质水解
实验
将TetraPack包装材料(TetraPack)用作生物质底物，如实施例1中的弄碎、磨制并再制浆。
在再制浆后，水解在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天，其使用总计3mg蛋白/g底物和2种不同的酶组合物：
·(C+H)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)；
·(C+H+S)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以4:1的比率)，加上微小根毛霉淀粉酶(SEQID NO:4)、埃莫森踝节菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)和瓣环栓菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:7)以8:2:1比率的混合物。
按照实施例2中描述的进行样品收集、糖测量和葡萄糖释放计算。
结果呈现在表4中，其显示除了纤维素分解酶以外，在有(C+H+S)和无(C+H)淀粉酶的情况下，以3mg蛋白/g底物，在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天对TetraPack的水解性能。
表4：
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
TetraPack-对照 345
TetraPack-有淀粉酶 361
实施例5：将甘露聚糖酶作为加强剂用于生物质水解
实验
将具有一定含量甘露聚糖的再生纤维材料(RecycFiber)用作生物质底物。
用RecycFiber在6％总固体(TS)制备浆料并在pH 7、50℃在Lab-O-Mat(LABOMAT<<BFA-24>>,Werner Mathis U.S.A.Inc.,Concord,N.C.,USA)中过夜(16小时)再制浆。
在再制浆后，水解在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天，其使用总计3mg蛋白/g底物及2种不同的酶组合物：
·(再生纤维-对照)纤维素分解酶溶液(棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)与含有烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物的混合物)；
·(再生纤维-有甘露聚糖酶)纤维素分解酶溶液(棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)与含有烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物的混合物)，加上黑曲霉甘露聚糖酶。
按照实施例1中描述的进行样品收集、糖测量和葡萄糖释放计算。
结果呈现在表5中，其显示除了纤维素分解酶以外，在有(C+H+M)和无(C+H)甘露聚糖酶的情况下，以3mg蛋白/g底物，在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天对再生纤维的水解性能。
表5：
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
再生纤维-对照 176
再生纤维-有甘露聚糖酶 196
实施例6：将甘露聚糖酶作为加强剂用于生物质水解
实验
将具有一定含量甘露聚糖的再生纤维材料(RecycFiber)用作生物质底物，如实施例5中的进行再制浆。
在再制浆后，水解在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天，其使用总计3mg蛋白/g底物和2种不同的酶组合物：
·(再生纤维-对照)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物，以及棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物，以90:10的比率)；
·(再生纤维-有甘露聚糖酶)纤维素分解酶溶液(含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物；棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/21785)制备物；和SEQ ID NO:5的甘露聚糖酶)。
按照实施例1中描述的进行样品收集、糖测量和葡萄糖释放计算。
结果呈现在表6中，其显示除了纤维素分解酶以外，在有(C+H’+M)和无(C+H’)甘露聚糖酶的情况下，以3mg蛋白/g底物，在5.3％TS，pH 5.0，50℃进行3天对再生纤维的水解性能。
表5：
3天水解(g-葡萄糖/kg-给料)
再生纤维-对照 173
再生纤维-有甘露聚糖酶 194
会理解的是可对本文中公开的实施方案进行各种修改。因此，上述内容不应解释为限制性的，而是仅作为实施方案的例示。本领域技术人员会想到在所附权利要求的范围和精神内的其他修改。
序列表
<110> 诺维信北美公司(Novozymes North America, Inc.)
<120> 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法
<130> 12045-WO-PCD
<160> 7
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> 特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶
<400> 1
Gln Leu Gly Ala Ile Gln Asn Asp Leu Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala
1 5 10 15
Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly
20 25 30
Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Lys Glu
35 40 45
His Ile Pro Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala
50 55 60
Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile
65 70 75 80
Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe His Leu Ala His Gln Lys Cys Pro Asn
85 90 95
Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala
100 105 110
Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly
115 120 125
Val Val Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile
130 135 140
Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp
145 150 155 160
Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr
165 170 175
Thr Ile Gln Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Val Asp Arg Ile
180 185 190
Arg Ala
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<213> 成熟savinase迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp
100 105 110
Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro
115 120 125
Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp
165 170 175
Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp
180 185 190
Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr
195 200 205
Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly
210 215 220
Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln
225 230 235 240
Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn
245 250 255
Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265 270
<210> 3
<211> 385
<212> PRT
<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400> 3
Lys Thr Ser Met His Leu Asn Thr Thr Leu Leu Val Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ser Val Leu Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala
20 25 30
Pro Pro Thr Ala Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Thr Thr Cys Thr Phe
35 40 45
Ser Gly Ser Asn Gly Ala Ser Ser Ala Ser Lys Ser Lys Thr Ser Cys
50 55 60
Ser Thr Ile Val Leu Ser Asn Val Ala Val Pro Ser Gly Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Leu Thr Lys Leu Asn Asp Gly Thr His Val Ile Phe Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Tyr Lys Glu Trp Ser Gly Pro Leu Ile Ser Val Ser
100 105 110
Gly Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Gly His Ser Ile Asn Gly
115 120 125
Asp Gly Ser Arg Trp Trp Asp Gly Glu Gly Gly Asn Gly Gly Lys Thr
130 135 140
Lys Pro Lys Phe Phe Ala Ala His Ser Leu Thr Asn Ser Val Ile Ser
145 150 155 160
Gly Leu Lys Ile Val Asn Ser Pro Val Gln Val Phe Ser Val Ala Gly
165 170 175
Ser Asp Tyr Leu Thr Leu Lys Asp Ile Thr Ile Asp Asn Ser Asp Gly
180 185 190
Asp Asp Asn Gly Gly His Asn Thr Asp Ala Phe Asp Ile Gly Thr Ser
195 200 205
Thr Tyr Val Thr Ile Ser Gly Ala Thr Val Tyr Asn Gln Asp Asp Cys
210 215 220
Val Ala Val Asn Ser Gly Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Gly Gly Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Arg Ser Asp
245 250 255
Asn Thr Val Lys Asn Val Thr Phe Val Asp Ser Thr Ile Ile Asn Ser
260 265 270
Asp Asn Gly Val Arg Ile Lys Thr Asn Ile Asp Thr Thr Gly Ser Val
275 280 285
Ser Asp Val Thr Tyr Lys Asp Ile Thr Leu Thr Ser Ile Ala Lys Tyr
290 295 300
Gly Ile Val Val Gln Gln Asn Tyr Gly Asp Thr Ser Ser Thr Pro Thr
305 310 315 320
Thr Gly Val Pro Ile Thr Asp Phe Val Leu Asp Asn Val His Gly Ser
325 330 335
Val Val Ser Ser Gly Thr Asn Ile Leu Ile Ser Cys Gly Ser Gly Ser
340 345 350
Cys Ser Asp Trp Thr Trp Thr Asp Val Ser Val Ser Gly Gly Lys Thr
355 360 365
Ser Ser Lys Cys Thr Asn Val Pro Ser Gly Ala Ser Cys Asn Gly Ala
370 375 380
Ser
385
<210> 4
<211> 471
<212> PRT
<213> 微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)淀粉酶
<400> 4
Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys
20 25 30
Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn
50 55 60
Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu
65 70 75 80
Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile
85 90 95
Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe
100 105 110
Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu
115 120 125
Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val
130 135 140
Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp
165 170 175
Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile
180 185 190
Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser
195 200 205
Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val
210 215 220
Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly
245 250 255
Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr
260 265 270
Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val
290 295 300
Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser
305 310 315 320
Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu
325 330 335
Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser
340 345 350
Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr
355 360 365
Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val
370 375 380
Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp
385 390 395 400
Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn
405 410 415
Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys
420 425 430
Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr
435 440 445
Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu
450 455 460
Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala
465 470
<210> 5
<211> 383
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)甘露聚糖酶
<400> 5
Met Lys Leu Ser Asn Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Asn Val Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Ala Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe
35 40 45
Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp
50 55 60
Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asn Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His
65 70 75 80
Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp
85 90 95
Val Thr Ser Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln
100 105 110
Asp Gly Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu
115 120 125
Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile
130 135 140
Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val
145 150 155 160
Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr
165 170 175
Ile Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr
180 185 190
Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg
195 200 205
Cys Pro Ser Cys Asp Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr
210 215 220
Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp His Met Val Cys Ile Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr
245 250 255
Gln Phe Ser Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr
260 265 270
Ile Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser
275 280 285
Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys
290 295 300
Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn
305 310 315 320
His Cys Ser Val Glu Ser Pro Trp Gln Lys Thr Ala Leu Asn Thr Thr
325 330 335
Gly Val Gly Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr
340 345 350
Gly Lys Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp
355 360 365
Tyr Glu Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala
370 375 380
<210> 6
<211> 591
<212> PRT
<213> 埃莫森踝节菌(Talaromices emersoni)葡糖淀粉酶
<400> 6
Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala
1 5 10 15
Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala
20 25 30
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro
35 40 45
Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr
50 55 60
Leu Val Asp Ala Phe Asn Arg Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro
85 90 95
Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val
100 105 110
Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
115 120 125
Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile
130 135 140
Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val
145 150 155 160
Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe
165 170 175
Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val
180 185 190
Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn
195 200 205
His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe
210 215 220
Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His
245 250 255
Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys
260 265 270
Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg
275 280 285
Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala
290 295 300
Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln
325 330 335
Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe
340 345 350
Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly
355 360 365
Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp
370 375 380
Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu
385 390 395 400
Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala
405 410 415
Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln
420 425 430
Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Leu
435 440 445
Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr
450 455 460
Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser
465 470 475 480
Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu
485 490 495
Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile
500 505 510
Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala
515 520 525
Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu
530 535 540
Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp
545 550 555 560
Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro
565 570 575
Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
580 585 590
<210> 7
<211> 574
<212> PRT
<213> 瓣环栓菌(Trametes cingulata)葡糖淀粉酶
<400> 7
Met Arg Phe Thr Leu Leu Thr Ser Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ala
1 5 10 15
Phe Ala Gln Ser Ser Ala Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro
20 25 30
Ile Ala Lys Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Ser Gly Ser Lys
35 40 45
Ser Asn Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser
50 55 60
Asn Pro Asn Tyr Leu Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe
65 70 75 80
Lys Ala Leu Ile Asp Gln Phe Thr Thr Gly Glu Asp Thr Ser Leu Arg
85 90 95
Thr Leu Ile Asp Glu Phe Thr Ser Ala Glu Ala Ile Leu Gln Gln Val
100 105 110
Pro Asn Pro Ser Gly Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys
115 120 125
Phe Asn Ile Asp Glu Thr Ala Phe Thr Asp Ala Trp Gly Arg Pro Gln
130 135 140
Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Asn
145 150 155 160
Trp Leu Leu Asp Asn Lys Asn Thr Thr Tyr Val Thr Asn Thr Leu Trp
165 170 175
Pro Ile Ile Lys Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Ser Asn Trp Asn Gln
180 185 190
Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Ile Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr
195 200 205
Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Asn
210 215 220
Arg Ile Gly Gln Thr Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asn
225 230 235 240
Asn Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Gly Gly Tyr
245 250 255
Ile Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
260 265 270
Val Leu Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala
275 280 285
Val Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val
290 295 300
Tyr Val Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala
305 310 315 320
Ser Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met
325 330 335
Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu Ile Val Trp Asn Lys Leu Gly Ala Leu Asn Val Thr
355 360 365
Ser Thr Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Val
370 375 380
Gly Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Phe Lys Thr Leu Thr Ser Ala
385 390 395 400
Ile Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr
405 410 415
Pro Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Ser Asn Gly Ser
420 425 430
Pro Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr
435 440 445
Ser Phe Ala Ala Arg Ser Gly Lys Thr Tyr Ala Ser Trp Gly Ala Ala
450 455 460
Gly Leu Thr Val Pro Thr Thr Cys Ser Gly Ser Gly Gly Ala Gly Thr
465 470 475 480
Val Ala Val Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn
485 490 495
Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Pro Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp
500 505 510
Asn Ala Leu Ile Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ser Thr
515 520 525
Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Thr Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys
530 535 540
Phe Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr
545 550 555 560
Thr Pro Ala Ser Gly Thr Phe Thr Gln Asn Asp Thr Trp Arg
565 570

Claims (17)

1.一种用于在纤维素材料水解过程中增加纤维素分解酶活性的方法，其包括：
(a)使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触以形成经预处理的纤维素材料；和
(b)用一种或多种酶组合物水解所述经预处理的纤维素材料。
2.依照权利要求1的方法，其中所述水解步骤包括使所述经预处理的纤维素材料与一种或多种淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触。
3.依照权利要求1的方法，其还包括在使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触的步骤之前或过程中将所述纤维素材料再制浆，其中所述纤维素材料是木质生物质。
4.依照权利要求1的方法，其包括从所述经预处理的纤维素材料分离出液剂。
5.依照权利要求4的方法，其还包括使所述液剂与淀粉酶和/或甘露聚糖酶接触并将所述液剂再循环，从而使其与经预处理的纤维素材料接触。
6.依照权利要求1的方法，其包括用酶法预处理、化学预处理、机械预处理和/或物理预处理来后处理所述经预处理的纤维素材料。
7.一种用于水解经预处理的纤维素材料的方法，其包括用酶组合物糖化纤维素材料，其中通过使所述纤维素材料与一种或多种脂肪酶、蛋白酶和/或果胶酶接触来预处理所述纤维素材料以形成所述经预处理的纤维素材料。
8.依照权利要求7的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素、淀粉酶和甘露聚糖酶。
9.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用酶组合物和至少一种选自下组的第二酶来糖化经预处理的纤维素材料：淀粉酶、甘露聚糖酶，及其混合物；
(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述糖化的经预处理的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从所述发酵回收所述发酵产物，其中所述经预处理的纤维素材料是通过使纤维素材料与一种或多种蛋白酶、果胶酶和/或脂肪酶接触而预处理的。
10.依照权利要求9的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
11.依照权利要求10的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
12.依照权利要求10的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
13.依照权利要求9-12中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同时的糖化和发酵中同时进行。
14.依照权利要求9-13中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
15.一种用于发酵经预处理的纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经预处理的纤维素材料，其中所述经预处理的纤维素材料是依照权利要求1-14中的任一项处理和/或糖化的。
16.依照权利要求15的方法，其中所述经预处理的纤维素材料的发酵生成发酵产物。
17.依照权利要求15或16的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
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